FcgRIIB a

Die Rolle von FcgRIIB in der
B-Zell-Entwicklung
Dipl. Ing. Anne Bärenwaldt
AG Nimmerjahn
Fc Rezeptoren (FcR)
 Rezeptoren für Immunglobuline
 Expression auf Immunzellen
 Binden konstante Domäne der schweren Kette von Antikörpern
 Verbindung zwischen adaptiven Immunsystem und
Effektorfunktionen des angeborenen Immunsystems
FcR Arten

Für jeden AK Typ gibt es Fc Rezeptoren

Fc Rezeptor für
•
•
•
•
•
IgA  Fc a R
IgG  Fc g R
IgE  Fc e R
IgM  Fc m R
IgD  Fc d R

Maus  4 Gene für
•
•
•
•

FcgRI
FcgRII
FcgRIII
FcgRIV
Mensch  8 Gene für
•
•
•
FcgRI (A, B, C)
FcgRII (A, B, C)
FcgRIII (A, B)
Fc g Rezeptoren
 Größte und am häufigsten vorkommende Gruppe von FcR
 verschiedene Spezifität, Affinität, Struktur, Expression und biochem. Funktion
FcgRI
FcgRIIB
FcgRIII
FcgRIV
g2 a
g2 a
Mouse
ITAM
g2 a
high affinity
FcgRI
ITIM
a
low/medium affinity
FcgRIIB
FcgRIIA
hFcgRIIIA
Human
ITAM
g2 a
ITIM
a
a
g2 a
FcgR
 Aktivierende FcgR
• FcgRI, FcgRIIA, FcgRIII
 Inhibierende FcgR
• FcgRIIB
 werden gemeinsam auf Effektorzellen exprimiert
• Makrophagen, Neutrophile, NK, dendritische Zellen (DC), Mastzellen
 Bindung von Immunkomplexen (IC) aktiviert aktivierenden und
inhibitorischen Signalweg
 Schwellenwert für Aktivierung der Zelle wird gesetzt die Stärke der
Immunantwort bestimmt
 Vielzahl an downstream Antworten wird dadurch reguliert
• Degranulation, Phagozytose, Antigen-Präsentation, antibodydependend cellular cytotoxity (ADCC)
Signalleitung
FcgRI
 Aktivierende FcgR benötigen für Signalleitung
assozierte Adaptermoleküle
ITAM
 Adaptormolekül ist vom Zelltyp abhängig
g2 a
 Am häufigsten ‚common g chain‘
 Adaptor hat immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)
 Inhibitorischer Rezeptor besitzt immunoreceptor tyrosine-based
inhibitory motif (ITIM)
FcgRIIB
 Braucht kein Adaptormolekül
ITIM
a
Signalleitung aktivierender FcgR






downstream signaling pathways (ERK, p38, JNK)
cell activation
-ADCC
-Phagocytosis
-Cytokine release
-Oxidative burst
Src-family Kinase phosphoryliert
ITAM
SH2 Bindedomäne entsteht
Syk bindet
Signalkaskade wird eingeleitet
Ras/Raf/MAP Kinase pathway
wird aktiviert
Kalzium abhängige Signalwege
aktiviert
Signalleitung inhibitorischer + aktivierender FcgR



Co-Ligation beider FcgR führt zu
Phosphorylierung des ITIM vom
FcgRIIB
SHIP bindet an entstandene SH-2
Dömäne
Blockiert Ras Weg und
Kalziumsignalkette (Btk und PLC-γ)
Inhibitorischer FcgRIIB (CD32)
 Größe: 40 kDa
 Aufbau:
• 2 extrazelluläre Domänen
• 1 Transmembranregion
• 1 cytoplasmatischer Schwanz
FcgRIIB
ITIM
a
 geringe Affinität für monomeres IgG
 hohe Avidität für Immunkomplexe
 Signalleitung mittels ITIM (immunoreceptor tyrosine-based
inhibitory motif)
 2 Isoformen
• IIB-1 Signalwirkung
• IIB-2  Signalwirkung + Internalisiert/phagozytotisch
 Einziger FcR auf B-Zellen
FcgRIIB Signalleitung in B-Zellen

Co-Ligation mit:
• Sich selbst  führt zu Apoptose
• BCR  Verminderung des BCR
Aktivierungssignal
 anti-apoptotisches Signal




Co-Ligation mit BCR führt zur
Aktivierung der Kinase Lyn
Lyn phosphoryliert ITIM des
FcgRIIB
Initiation des Signalwegs (SHIP)
Blockiert Ras Weg und Kalziumsignalkette (Btk und PLC-g)
FcgRIIB als Toleranzkontrollpunkt
 FcgRIIB setzt Schwellenwert für Aktivierung von B-Zellen
 Induzierte Apoptose durch Selbst-Ligation
 mögliche Beteiligung an Erhalt der Toleranz
 mögliche Deletion selbst-reaktiven B-Zellen
 FcgRIIB wichtig für B-Zell Toleranz
 Untersuchung von Toleranz:
Autoimmunanfällige Mausstämme (NZB, BXSB, NOD, MRL/lpr)
entwickeln spontan Autoimmunität (z.B. SLE)
FcgRIIB und Toleranz
 Bolland und Ravetch 2000
 Fcgr2b -/- Mäuse
(Balb/C und C57.B6)
 Balb/C
• Wie WT
 B6
• Erhöhte Sterberate
• Entzündungen in Vielzahl von
Organen
• Erhöhter Proteingehalt im Urin
• Glomerulonephritis
• Nierenversagen
 genetischer Hintergrund ist sehr
wichtig
Test auf anti-nucleäre AK



Immunfluoreszenzfärbung von
Hep-2 Zellen
Inkubation mit Serum der Mäuse
Detektion von gebundenem IgG
mit FITC-anti-mouse IgG
 ELISA IgG AK gegen:
• dsDNA
• dsDNA mit Histon 1
• dsDNA mit Histon 2A und 2B
 Toleranzverlust in FcgRIIB-/-
Bolland und Ravetch 2000
Wiederherstellung der Toleranz durch FcgRIIB
 McGaha et al. 2007
 Retroviraler Vektor für Expression von FcgRIIB
Gewinnung von KM-Zellen aus
autoimmunanfälligen und FcgRIIb-/- Mäusen
Fcgr2b
Kontrollvektor
Transduktion mit retroviralem Vektor
Rekonstitution bestrahlter Mäuse
mit autologem tranduziertem KM
FcgRIIB
Mock
Untersuchung der Mäuse
Überlebensrate NZM2410
Indirekter Immunofluoreszenzassay
ANA Reaktivität gegen fixierte HepG2 Zellen
Fcgr2b
Mock
ELISA
 Verbessertes Überleben
 Weniger Auto-AK
McGaha et al.
Schlussfolgerung
 FcgRIIB ist wichtig für den Erhalt der Toleranz
 Bei Fehlen des Rezeptors entsteht
• IgG anti-DNA AK
 Verlust von Toleranz
 Herstellung der Toleranz durch Wiederherstellung des FcgRIIB
Levels
 Ist wichtiger Kontrollpunkt in peripherer Toleranz
Einfluss von FcgRIIB in B-Zell-Entwicklung
Wo genau reguliert er?
Keimzentrum (germinal center)
 Induzierbare lymphoide Mikroumgebung
 Entstehen durch Antwort auf T-abhängige Antigene
 Entstehen durch Einwanderung aktivierter B-Zellen in die
Lymphorgane
 AG wird im GC als Immunkomplex (IC) von folliculären
dendritischen Zellen (FDC) präsentiert
 Hohe Mutationsfrequenz in variabler Region
des BCR in GC-B-Zellen
 Selektion von hoch affinen B Zell Varianten
 Formation von Memory B Zellen
Keimzentrum
 Durch Mutation auch BCR mit verminderte Affinität
 muss Mechanismen geben, die zwischen hoch und niedrig
affinen B-Zellen unterscheiden
 Annahme: B Zellen mit hoch-affinem BCR werden bevorzugt
stimuliert
 Aufnahme von AG und Präsentation für Th Lymphozyten
 Dieses Modell bezieht sich nur auf den BCR
 Ignoriert den Schwellenwert von FcgRIIB bei der B-Zell Selektion
durch IC Interaktion
 FcgRIIB kann durch Apoptosesignal niedrig affine B-Zellen
eliminieren
Rao et al. 2002/Jiang et al. 1999
 Untersuchung der Expression von FcgRIIB in Keimzentrumszellen
Reduzierte FcgRIIB Expression in GC-B-Zellen
Facs
Milzzellen
2.4G2  FcgRIIB
K9.361 FcgRIIB
B220+IgD+GL7- Nicht GC Zellen
B220+IgD-GL7+  GC B-Zellen
Immunisiert mit NP-CGG
Histologie 9 Tage nach Immun.
Histologie
Milz
2.4G2  FcgRIIB
GL7  GC
Chimäre
Mäuse
• Bestrahlte IIB -/- Mäuse
• Rekonstitution mit KM von IIB+/+ Mäusen
 Färbung des IIB Rezeptors im GC
nur bei B-Zellen
 FcgRIIB in GC, auch in FDC reichen Regionen
 reduzierter Schwellenwert für B-Zell Aktivierung
Rao et al. 2002
Verminderte FcgRIIB Expression in GC
B-Zellen von autoimmunanfälligen Mäusen


Milzzellen von 8-Mo. alten immunisierten
Tieren
Autoimmunanfällig (SLE)
•
•

NZB
(NZB x NZW)F1
Nicht-anfällig
•
NZW
 geringere Expression von FcgRIIB auf
GC-B-Zellen in allen Mäusen
 In autoimmunanfälligen Mäusen ist
FcgRIIB Expression auf GC B-Zellen
geringer als bei nicht anfälligen Mäusen
Jiang et al. 1999
Zusammenfassung Rao et al./Jiang
 Expression von FcgRIIB ist in GC B Zellen herunterreguliert
 FcgRIIB Expression in Autoimmunanfällige Mausstämme noch
geringer
Wirkmechanismus von FcgRIIB?
 Aufgabe von FcgRIIB im GC/ bei der Affinitätsreifung?
 Welchen Effekt hat die verringerte FcgRIIB Expression im GC?
 Rolle von FcgRIIB in Toleranzerhaltung?
Modellsystem 3H9 Maus
 Transgenes knock-in Modell für Anti-DNA exprimierende B-Zellen
 Rearrangiertes schweres Kettengen (anti-DNA) wird benutzt
• Aus DNA bindendem Hybridoma aus MRL.lpr Maus
• Insertion im Igh Locus (IgMa Allel)
 Editierung der leichten Kette ist wichtig für den Erhalt von Toleranz
 Durch Kombination mit verschiedenen Leichten Ketten entstehen
autoreaktive AK
 Weiterentwicklung des 3H9 Modells durch Einfügung weiterer
Argininreste  DNA Bindung von AK meist über Arg-Reste
• 3H9/56R  ein Arg Rest
• 3H9/56R/76R  zwei Arg Reste
Modellsystem 3H9 Maus
Mit steigender Arg Anzahl steigt Autoreaktivität der produzierten AK
(je basischer  höhere Autoreaktivität)
Fukuyama et al. 2004
 Verwendung von 3H9 und 3H9 56R Mäusen mit und ohne Fcgr2b
Expression
• Balb/C und C57.B6
 Untersuchung der Toleranzerhaltung
Spezifität des genetischen Hintergrundes
 Balb/C Hintergrund:
• Sowohl bei niedrig-affinem 3H9 Allel als auch beim hoch-affinen 56R
Allel wurde Toleranz in Balb/C Mäusen erhalten
 C57.B6 Hintergrund:
• Höhere IgM und IgG Produktion bei 56R
ELISA
IgM
Anti-DNA
IgG
Serum
C57.B6: 12 Wochen alt
Fukuyama et al.
Mechanismus zum Erhalt der Toleranz
 Untersuchung zur Auswahl der leichten Kette in den Mausstämmen
• Vκ21D  Leichte Kette, die am effektivsten die Autoimmunität der
schweren Kette unterdrückt
• Vκ38c  weniger effizient
Veränderte Benutzung von leichten Ketten in den Mausstämmen
Unabhängig von FcgRIIB
Fukuyama et al.
FcgRIIB Defizienz steigert IgG anti-DNA Produktion
ELISA
Serum
 Fcgr2b Defizienz erhöht Anzahl
von IgG anti-DNA
IgG
Anti-DNA
IgM
 durch erhöhtes Auftreten von
IgG produzierenden
Plasmazellen/Plasmablasten
Splenocyten
Fukuyama et al.
IgG anti-DNA ist pathologisch
Histologie der Niere

C57.B6 Fcgr2b-/- entwickeln nach
6 Mo. starke Glomerulonephritis

Nur 56R Fcgr2b-/- zeigte gleiche
Pathologie wie pos. Kontrolle
(Fcgr2b -/-)
•
•
•
Glomerulonephritis
Immun-Komplex Ablagerung
Komplement C3 Ablagerung
Nach 9 Mo.
Fukuyama et al.
Zusammenfassung Fukuyama et al.
 „Editing“ ist der primäre zentrale Mechanismus um autoreaktive
B-Zellen in unschädliche B-Zellen umzuwandeln
• Nutzung verschiedener leichter Ketten in unterschiedlichen
Mausstämmen
 FcgRIIB Defizienz führt zu Produktion von IgG produzierenden
Plasmablasten
 negatives Feedback-Signal ist gestört
Proliferation autoreaktiver Plasmazellen
Paul et al. 2007
 Rolle von FcgRIIB in der peripheren B-Zell Toleranz
 Prinzip:
follicular exclusion
• Ansammlung von autoreaktiven B-Zellen an der T-B Grenze von
Milzfollikeln
 Hypothese:
folliculare exclusion ist abhängig von normalem FcgRIIB signalling
 Versuchsprinzip:
3H9 Mäuse defizient in FcgRIIB
 wenn FcgRIIB an peripherer Toleranz und follicular exclusion
beteiligt ist, sollte in 3H9FcgRIIB-/- Tieren ein Verlust der folliculärer
Exclusion auftreten
Erhöhte Anzahl autoreaktiver B-Zellen in FcgRIIb -/Milz
Bei Paarung von 3H9 mit λ1
leichter Kette entsteht
autoreaktiver AK
 λ1 B-Zellen exprimieren
transgenen IgMa Allotypen
 FcgRIIb-/- Mäuse haben erhöhte
Frequenz von λ1 B-Zellen
 autoreaktive AK für weitere
Nachweise

Paul et al.
Verlust der follicular exclusion bei FcgRIIb Defizienz
 Histologische Untersuchung der Milz
λ1 B Zellen
B-Zell Zone
T-Zell Zone
• 3H9FcgRIIB+/+B6 Mäuse:
λ1 B Zellen an T-B Grenze von
Milzfollikeln
• 3H9FcgRIIB-/-B6 Mäuse:
λ1 B Zellen in gesamten Follikel
verteilt
• Stärkere Keimzentrumsaktivität
in FcgRIIB-/- Mäusen
• λ1 B-Zellen im Keimzentrum
100-fach
600-fach
Paul et al.
Erhöhte Anzahl von Plasmazellen in 3H9RIIB-/- Tieren
FACS
Milz
B220: B-Zell Marker
CD138: Marker für Plasmazellen

ELISPOT


Kein Unterschied bei IgM antiDNA produzierenden B-Zellen
8x höhere Anzahl an IgG anti-DNA
produzierenden B-Zellen in
3H9RIIB-/- Tieren
Klassenwechsel der autoreaktiven
B-Zellen hat stattgefunden
Anti-DNA
Paul et al.
Erhöhte Anzahl von anti-DNA-AK im Serum
Serum Anti-DNA
 3H9FcgRIIB-/- Mäuse:
• Höhere Anzahl an IgG und IgM
anti-DNA AK
 Alle Beobachtungen waren
Altersabhängig:
• Junge 3H9FcgRIIB-/- Mäusen
(2 Monate alt) zeigten WT
verhalten
• Alte 3H9FcgRIIB-/- Mäusen
(9 Monate) zeigte IgG Anti-DNA
Paul et al.
Zusammenfassung Ergebnisse (Paul et al.)
 FcgRIIB ist notwendig um Zellen aus Keimzentrum auszuschließen
 Klassenwechsel zu IgG wird dadurch verhindert
Keine Plasmazellentwicklung von autoreaktiven B-Zellen
Zusammenfassung: Bedeutung von FcgRIIB
 FcgRIIB hat wichtige Funktion in der peripheren Toleranz
 Ist innerhalb und außerhalb des Keimzentrums unterschiedlich
exprimiert (Rao et al.)
 In autoimmunanfälligen Mäusen im Keimzentrum noch schwächer
exprimiert (Jiang et al.)
 Reguliert Anzahl IgG produzierender Plasmazellen/-blasten
 Verhindert das Einwandern autoreaktiver B-Zellen in die Milzfollikel
(Paul et al.)
Unser Projekt
 Untersuchung der Funktion von humanem FcgRIIB bei
der Toleranzerhaltung
FcgRIIB und Toleranz beim Menschen
 systemischer Lupus Erythematodes (SLE)
• hohe Anzahl von autoreaktiven IgG Antikörpern
 Allele Varianten von FcgRIIB
• Ile232Thr
 Assoziation in verschiedenen Asiatischen Bevölkerungen
 keine Assoziation in Europäern
 Promoter Polymorphismus
• in Europäern
 Verminderte Expression in memory B-Zellen
• in SLE Patienten in der Afrikanisch-Amerikanischen Bevölkerung
 Hohe Heterogenität im Menschen
 Genetischer Hintergrund ist sehr wichtig
 Mensch vs. Maus
• FcgR von Maus und Mensch unterschiedlich
• Bisher nur epidemiologische Assoziationen beim Menschen
 Testsystem notwendig, dass menschliches Immunsystem darstellt
 humanisierte Maus
 Sind Ergebnisse aus Mausstudien auch für das menschliche
Immunsystem gültig?
Versuchsaufbau
Vorbereitung der hHSC:
Promoter
GFP
Reporter
Gen
miRNA
n
Isolation
hHSC
Transduktion mit lentivirus
kodierter miRNA
Vorbereitung der Mäuse:
Bestrahlung
Neugeborenen Rag2-/NOD/SCID
Rekonstitution
mit hHSC
Mäuse entwickeln
menschliches Immunsystem
Untersuchung des Immunstatus
 Gesundheitszustand
• Überleben
• Vitalität
 Veränderte B-Zell Antwort
•
•
•
•
•
•
Schwellenwert
Antikörper-Affinität
Veränderter Klassenwechsel
anti-DNA AK
antinucleäre AK
anti-Chromatin AK
 Untersuchung des Auftretens von SLE
• Entwicklung von Glomerulonephritis
• Nierenfunktion
• Proteingehalt im Urin
• histologische Untersuchung der Leber
Derzeitige Arbeit
 Klonierung von Fc g Rezeptoren (inhibitorisch and aktivierend),
CD22 und CD72
 Stabile Transfektion von CHO Zellen mir diesen Plasmiden
 Zelllinien exprimieren diese Rezeptoren
 Klonierung von miRNA/shRNA
 Stabile Transfektion von CHO Zelllinien und primären B-Zellen
FcgRIIB, CD22, CD72
Effektivitätstest der miRNA/shRNA
(positive Kontrolle)
Aktivierende FcgR
miRNA/shRNA sollten keinen
Einfluss auf diese haben
(negative Kontrolle)
Vielen Dank für die Aufmerksamkeit