und B-Zellen?
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Regulation of acquired immune responses during infection with intracelllular bacteria ”Vaccines” Geschichte der Vakzinierung: eine Erfolgsgeschichte ! Vor und nach Einführung des Impfstoffes (CDC seit 1912) Polio Pocken Masern/Mumps/Röteln Diphtherie Keuchhusten 100 % (USA, Westeuropa) 100 % (weltweit) 99 % (USA) 99 % (USA, Westeuropa) 97 % (USA) Vor und nach Einführung des Impfstoffes (UK seit 1999) Neisseria meningitidis C Salmonella Vi Konjugat 92 % (Kleinkinder) 95 % (Heranwachsende) 90 % (2 - 4 jährige Kinder) Sicherheit ? Masern-Enzephalopathie 1/1000 natürliche Infektion 1/1.000.000 Impfung Die drei größten Killer in Millionen (Jahr 2000) 2.3 AIDS 1,7 TB 0.5 TB/HIV 1.2 Malaria Dringend benötigte Impfstoffe: HIV Tuberkulose Malaria Hepatitis C Chlamydien Helicobacter pylori Leishmaniose Filariose Schistosomiasis (Bilharziose) Papilloma Virus Rotaviren (Durchfallerkrankungen) Respiratorisches Synzytienvirus (RSV), Rhinoviren u.v.a. Nicht nur Infektionskrankheiten Tumorvakzine Alzheimer Neue Ansätze zur Impfstoff-Entwicklung ► Memory/Immuologisches Gedächtnis ► Wirksamkeit von Vakzinen Nachweis von Immunantworten ► Neue Strategien zur Verbesserung alter und zur Entwicklung neuer Vakzine ! Memory/Immunologisches Gedächtnis ► B-Zell-Memory - Antikörper - Memory-B-Zellen - Plasmazellen ► T-Zell-Memory - CD4 Th-Zellen - CD8 T-Zellen B-Zellen/Antikörper ► mit wenigen Ausnahmen beruhen alle zur Zeit verwendeten Impfstoffe auf der Induktion von B-Zellen/Antikörpern ► Antikörper sind relativ leicht induzierbar ► Die Induktion und Wirksamkeit von Antikörpern lässt sich relativ einfach testen. -> Nachweis der Wirksamkeit der Vakzine B-Zell-Memory/Antikörper: Nachweis einer B-Lymphozytenantwort ► Qualitativer und quantitativer Nachweis von spezifischen Antikörpern • ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) • Western-Blot • Neutralisierungstests ► Nachweis der antikörperbildenden Zellen • Plaquetest • ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay) Memory-T-Zellen Verschiedene Memory-T-Zellsubpopulationen ► CD4, CD8 ► CD4 Th-Zellsubpopulationen (Zytokin-Profil) - Th1, Th2, Th17…. ► Memory-T-Zellsubpopulationen - central Memory T-Zellen - effector Memory T-Zellen ► Expression von (hemmenden) Co-Rezeptoren ► Lokalisation der T-Zellen - Lunge, Darm…. Welche dieser Populationen schützt ?? Central vs Effector-Memory T-Zellen CD4 CD4 CD8 Sallusto et al, Science 1999 Central vs Effector-Memory T-Zellen CCR7 CD62L Gewebe Proliferation Effektorfunktion Cosignale Lebensdauer Central ++ ++ Lymphgewebe ++ +/? + Effector +/Peripherie +/++ ? Methoden zur Analyse der erworbenen T-Zellantwort Problem: Kein Antigen-spezifisches, den Antikörpern vergleichbares und einfach messbares Zellprodukt vorhanden! Qualitative Nachweismethoden für T-Zellen (z.T. semi-quantitativ) in vitro • Proliferation und Zytokinproduktion nach Stimulation mit dem Antigen • Zytotoxizität • Limitierende Verdünnungskultur (Limiting Dilution Assay) • T-Zellklonierung und Analyse der individuellen Klone in vivo • DTH Reaktion (Tuberkulin-Test) • Bestimmung der schützenden Immunität “Infektionsexperimente“ Neuere Methoden zur quantitativen und qualitativen Analyse der T-Lymphozyten-Antwort • ELISPOT-Assay • Intrazelluläre Zytokinfärbung nach kurzer Antigenstimulation • MHC/Peptid-Komplexe (Tetramere) Klassisches Beispiel einer Delayed-Type-Hypersensitivity-Reaction: Tuberkulin-Test Zytokintest Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente) 100 naiv 80 immunisiert mit einem attenuierten S. typhimurium-Stamm 60 40 20 0 0 20 40 60 80 Tag nach einer Infektion mit S. typhimurium (400 i.v.) Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente) -> Große Impfstudien können auch als Infektionsexperiment angesehen werden ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay) Methode: * * * * APC* ** APC* * T* T* T * anti-IFNg-Antikörper E EE E Substrat + T-Zellen + APC +Antigen * * * * APC* ** APC* * T* T* T * 24h E EE E anti-IFNg-Antikörper -Enzymkomplex Entfernen der Zellen ELISPOT-Assay Beispiel ohne Antigen mit Antigen IFN-g+ Spots/105 Zellen 250 200 150 100 50 0 - Antigen naiv - Antigen infiziert FACS: Intrazelluläre Zytokinfärbung Prinzip: Blockade der Zytokinsekretion (Brefeldin A) Fixierung und Permeabilisierung der Zellen intrazelluläre Zytokinfärbung mit Antikörpern Intrazelluläre Zytokinfärbung Beispiel: FACS T T T APZ APZ APZ APZ T T T T extra- und intrazelluläre Färbung IFN-g CD8 T CD8 Inkubation APZ APZ APZ APZ 4h IFN-g Multizytokin-Produzenten MHC Klasse I-Tetramere Prinzip H-2Kd Peptid (LLO91-99) b2-Mikroglobulin Streptavidin Biotin CD8 TZR Streptavidin PE PE PE PE Primärinfektion (103 i.v.) Titer Sekundärinfektion (105 i.v.) 0 1 Wochen 2 Primärinfektion 0,02 Tag 4 0,14 Tag 7 2,22 Tag 10 3,11 1,41 Sekundärinfektion Tag 0 0,36 Tag 3 1,48 Tag 5 20,05 Tag 17 Tag 7 9,44 CD62L FITC Epitop: Listeriolysin O Peptid 91-99 Tetramer PE Tag 0 HIV-Infektion 107 3 106 2 105 104 1 103 0 0 100 200 300 Days after HIV infection Viral load (copies per ml) HLA-B27-gag 263-272 staining (%) anti-viral Therapy 102 400 McMichael and Rowland-Jones, Nature 2001 410:908 Akute Infektiöse Mononukleose (Epstein-Barr-Virus) Callan et al. JEM 1998 187:1395 Grundlagenforschung und Vakzine-Entwicklung: Biologie der Immunantwort: • Welche Immunantwort schützt? (Welche führt zu Pathologie?) • Tiermodelle zur Testung • Korrelat für Schutz im Menschen. Biologie des Erregers: • Lokalisation im Wirt, in der Wirtszelle? • Virulenzfaktoren, Attenuierung (Abschwächung) • Impfstoff-Kandidatenauswahl. - Genome, Proteome. - Welche Antigene macht der Erreger im Wirt? Hauptproblem: Wie sieht eine schützende Immunantwort überhaupt aus? “Correlates of protection“ Correlates of protection Für wichtige Krankheitserreger ist unklar wie eine schützende Immunantwort aussieht! ► B-Zellen und/oder T-Zellen? ► Zielstrukturen/Antigene für T- und B-Zellen? ► Quantität der Memory-T-Zellen? ► Qualität der Memory-T-Zellen? - Zytokinprofil (multi-Zytokinproduzenten) - Oberflächenmoleküle - Langlebigkeit - Effektorfunktionen/Proliferation Neue Strategien: 1. Subunit-Vakzine: - rekombinante Proteine - Peptide, Peptide-Agglomerate 2. Lebend attenuiert: gezielte Eliminierung von Virulenzfaktoren 3. Lebend rekombinant: - Antigene (Eigen-, Fremd-) - Zytokine (IL-12, GM-CSF) - Zytolysine (Listeriolysin) 4. DNA: Antigene, Zytokine, CpG-Motive 5. Neue Adjuvantien 6. Prime-Boost-Ansätze Subunit-Vakzine + rekombinante Proteine sicher, definiert, stabil richtige Konformation (B-Zellen) wenig immunogen keine CD8 T-Zellen -> Lipoproteine, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate Peptide sicher, definiert, stabil billig wenig immunogen keine CD8 T-Zellen Konformation (B-Zellen) MHC (Impflöcher) -> Lipopeptide, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate, Choleratoxoid-Konjugate, Polypeptide mit Schnittstellen für Proteasomen Attenuierte (rekombinante) Lebend-Vakzine + Lebend/ attenuiert ähnlich der Infektion, immunogen, Gedächtnis, mukosale Immunität, Persistenz, multivalent immunstimulatorisch lange Erfahrung (Vaccinia, Adenoviren, BCG, Salmonellen) Entzündung Sicherheit Immunsuppression Reversion Rekombination -> Expression rekombinanter Fremdantigene, Zytokine; Prime/Boost Vakzinierung Nackte DNA Vakzine + Nackte DNA Persistenz, ähnlich der Infektion, billig, haltbar CD4, CD8 T-Zellen, B-Zellen Sicherheit ? Einbau Zytokingene CpGs: hohe konzentrationen nicht-methylierter Motive Aktivierung von TLR-9 -> TH1 -Antwort Adjuvantien + - Adjuvantien Depoteffekt Entzündung alle Prozessierungswege Immunstimulation Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat ISCOMs, Saponin, Mannosepolymere Öl in Wasser, Liposomen Virus-like Particles Lipid A Cholera-Toxoid (B-Untereinheit) Prime-Boost-Vakzinierung McShane et al. Nat. Med. 2004 10:1240 TB reactive T-Zellen Prime-Boost-Vakzinierung Tuberkulose Ist eine Impfung möglich? Tuberkuloseerreger leben in Wirtsmakrophagen Mykobakterien T-Zellen schützen gegen Tuberkulose-Erreger 1927: Der Impfstoff M. bovis Bacille-Calmette-Guerin (BCG) attenuierte M. bovis-Stamm Léon Charles Albert Calmette (1.7.1863 - 29.10.1933) Jean-Marie Camille Guérin (22.12.1872 - 9.6.1961) # wahrscheinlich der am häufigsten verwendete Impfstoff # zunehmender Wirkungsverlust!! Listerien entweichen ins Zytoplasma der Zelle: Listeriolysin Listeria monocytogenes O min 20 min Schutz durch einen gentechnisch veränderten Impfstamm: rBCGureC-Hly Aerosol Infektion mit dem Beijing Stamm in der Maus. ungeimpft BCG BCG ureC Hly Grode et al. JCI 2005 Verschiedene Vakzinierungsstrategien gegen SIV gag in Rhesusaffen CD4 Zellen viral load McElrath et al. Lancet 2008 Die Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung gibt ihnen mehrere Millionen Euro zur Impfstoffentwicklung. Wie gehen sie vor?
