Einsatz des Tandem-Affinity-Purification
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Aus der Abteilung für Molekulare Gastroenterologische Onkologie der Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. S. Hahn Einsatz des Tandem-Affinity-Purification-Verfahrens zum Nachweis von Keratin 23 Interaktionspartnern in Abhängigkeit vom N-terminal bzw C-terminal getaggten Zytokeratin 23 Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Norbert Nosal aus Goldberg 2013 Dekan: Prof. Dr. med. Klaus Überla Referent: Prof. Dr. med. Stephan Hahn Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Joachim Rassow Tag der Mündlichen Prüfung: 13.05.2014 Ich widme diese Arbeit meiner Ehefrau Ingrid, meinen Kindern Julius und Helena sowie meinem Vater Andreas. Mitleid bekommt man geschenkt, Neid muss man sich verdienen. Robert Lembke (17.09.1913 - 15.01.1989) Inhaltsverzeichnis 1 Abkürzungsverzeichnis 3 1 6 Einleitung 1.1 Das kolorektale Karzinom, Prävalenz, Epidemiologie, Ätiologie und Pathologie kolorektaler Karzinome 1.2 6 Molekularbiologische und molekulargenetische Grundlagen kolorektaler Karzinome, vom Gendefekt zum Krebs 1.3 7 Tumorgene des KRK, inaktivierte Tumorsupressorgene und aktivierte Onkogene in der Pathogenese kolorektaler Karzinome 1.3.1 Chromosom 5q: APC- bzw. WNT-Signalweg 8 1.3.2 Chromosom 17q: P53 Signalweg 9 1.3.3 Kandidatengene auf Chromosom 18q 9 1.3.4 K-ras Gene 11 1.3.5 Mismatch-Reparatursysteme 12 1.3.6 Bub-Gene 13 1.3.7 Epigenetische Veränderungen im KRK 13 1.4 Tumorprogressionsmodell kolorektaler Karzinome 14 1.5 Klassische Diagnostik und Therapie kolorektale Karzinome 14 1.6 Die Zytokeratinfamilie 17 1.7 Zytokeratinveränderungen bei Karzinomen und Metastasen 17 1.8 Interaktionen zwischen Keratinen und anderen Proteinen 18 1.9 Aufbau und Funktion von Smad4 19 1.10 Auswirkung des Tumorsuppressors Smad4 nach Rekonstitution in der kolorektalen Karzinomzelllinie SW480 21 1.11 Identifikation von Keratin 23 als Smad4-Kandidatenprotein 22 1.12 TAP 1.12.1 Voraussetzungen der TAP 22 1.12.2 Weiterentwicklung der TAP 23 2 Zielsetzung der Arbeit 25 3 Material und Methoden 26 3.1 Molekularbiologische Methoden 1 3.1.1 Plasmiddesign 31 3.1.2 vent PCR 33 3.1.3 Gelelektrophorese von DNA 35 3.1.4 Elution von DNA aus Agarosegelen 35 3.1.5 Elution von DNA mittels Phenol-Chloroform-Extraktion 36 3.1.6 Restriktion 37 3.1.7 Gelelektrophorese und Photometrie 3.1.7.1 Mengenabschätzung mittels Gelelektrophorese 38 3.1.7.2 Mengenabschätzung mittels Photometrie 39 3.1.8 Ligation 39 3.1.9 Transformation 40 3.1.10 Klonselektion 41 3.1.11 Insert Überprüfung mittels Taq PCR 42 3.1.12 Plasmidpräparation aus E. coli 43 3.1.13 Glycerindauerkulturen 45 3.1.14 Sequenzierung der PCR-Produkte 45 3.2 Retroviraler Gentransfer 3.3 Zellbiologische Arbeiten 47 3.3.1 Zellkultur 51 3.3.2 Zelllyse 52 3.3.3 Proteinmengenbestimmung mittels Coomassie-Brillant-Blau G250 (Bradford-Verfahren) 3.4 4 4.1 53 Proteinchemische Arbeiten 3.4.1 Tandem-Affinitäts-Aufreinigung 54 3.4.2 Polyacrylamidgele für Western-Blot-Analysen 56 3.4.3 Übertragen der Proteinbanden auf PVDF-Membran 57 3.4.4 Immunologische Färbung der PVDF-Membran 58 3.4.5 Silberfärbung nach Blum et al. (1987) 60 Ergebnisse 62 Etablierung des C-terminal getaggten Tandem-Affinitäts-AufreinigungsKonstruktes 62 4.2 GFP-Infektionskontrolle der SW480 Zellen 63 4.3 Tandem-Affinitäts-Aufreinigung mit KRT23 Köderproteinen 65 2 4.4 Nachweis der KRT23 Interaktionspartner und Vergleich der Interaktionspartner in Abhängigkeit von der Tag-Position (N-terminal bzw. C-terminal) 67 5 Diskussion 69 6 Zusammenfassung 74 7 Literatur 75 8 Anhang 88 3 Abkürzungsverzeichnis 5-FU A APC APS ATF6 ATP bp BSA CBP co-Smad DMEM DMSO DNA dNTP’s DPC4 DTT ECL EDTA EpCAM FAP FCS GFP GTP h HBS HEPES hMLH1 HNPCC ID Ig I-Smad kD KRK KRT LC-ESI-MS LOH M MALDI MTHFR MIN Min MS MW n NCBI PAGE PBS PCR PK 5-Fluoruracil Ampere Adenomatöse Poliposis Coli Ammoniumpersulfat Activating transcription factor 6 Adenosin-Triphosphat Basenpaar bovine serum albumin Calmodulin bindendes Peptid common Smad Dulbecco´s modified eagle medium Dimethylsulfoxid deoxyribonucleic acid Desoxyribonukleosidtriphosphate Deleted in pancreatic carcinomas locus 4 Dithiothreitol enhanced chemiluminescence Ethylendiamintetraacetat Epithelial cell adhesion molecule Familiäre adenomatöse polyposis Fötales Kälberserum grün fluoreszierendes Protein Guanosin-Triphosphat Stunde HEPESgepufferte Kochsalzlösung 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure human mutL homolog 1 hereditäres non-polypöses Kolonkarzinom Identität Immunoglobulin inhibitorisches Smad Kilodalton Kolorektales Karzinom Keratin Kopplung von HPLC und ESI-MS Lost of Heterology mol/L matrix-assisted-laserdesorption/-ionisation Methylentetrahydrofolatreduktase Mikrosatelliten Instabilität Minute Massenspektrometrie Molekulargewicht unabhängige Experimentanzahl national center for biotechnology information Polyacrylamidgel Elektrophorese Phosphatgepufferte Kochsalzlösung polymerase chain reaction Proteinkinase 4 Prot A PSCA PTM PVDF RIPA RNA rpm R-Smad RT sek SDS TAE TAP Taq TBST TEMED TEV TGF TNF TNM Tris U UICC UV V v/v w/v WHO Protein A Prostata stem cell antigen posttranslationale Modifikation Polyvinylidenfluorid Radioimmunoprecipitation assay ribonucleic acis rounds per minute rezeptoraktiviertes Smad Raumtemperatur Sekunde Sodiumdodecylsulfate Tris, Essigsäure, EDTA Puffer Tandem-Affinitäts-Puricication Enzym des Bakteriums Thermus aquaticus Trisgepufferte Kochsalzlösung mit Tween N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Tabakmosaikvirus-Protease transforming growth factor tumor necrosis factor Tumor-Nodu(lu)s-Metastase Tris(hydroxymethyl-)aminomethan Unit Union for international cancer control Ultraviolett Volt Volumen pro Volumen Gewicht pro Volumen World health organisation 5 1 Einleitung 1.1 Das kolorektale Karzinom, Prävalenz, Epidemiologie, Ätiologie und Pathologie kolorektaler Karzinome Epidemiologisch ist das kolorektale Karzinom der häufigste bösartige Tumor des Gastrointestinaltrakts und die zweithäufigste zum Tod führende Tumorerkrankung in Deutschland. Jedes Jahr sterben etwa 30.000 Patienten an den Folgen eines kolorektalen Karzinoms (KRK) (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). Jährlich treten in Deutschland etwa doppelt so viele Neuerkrankungen auf. Das Lebenszeitrisiko, an einem KRK zu erkranken, beträgt in Deutschland etwa 6 %, d.h. etwa jeder 17. Bundesbürger erkrankt an einem KRK im Laufe seines Lebens. Vor dem 40. Lebensjahr beträgt das relative Risiko unter 5% um dann in Abhängigkeit vom Alter logarithmisch anzusteigen (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). Tritt jedoch die Erkrankung im jungen Alter und/oder familär gehäuft auf, so besteht der Verdacht auf eine hereditäre Form des KRK. Bis zu 10% der kolorektalen Karzinome sind im engeren Sinn hereditären, autosomal-dominant vererblichen Formen zuzuordnen wie HNPCC, FAP, PeutzJeghers-Syndrom oder die juvenile Polyposis coli. Zu den nicht-hereditären Risikofaktoren zählt vor allem die Colitis ulzerosa, wobei bei M. Crohn kein signifikanter Anstieg zu erkennen ist (Askling et al., 2001). Die Mehrheit der KRK (etwa 85-90%) ist den nicht hereditären, also sporadischen Karzinomen zuzuordnen, für die eine multifaktorielle Genese anzunehmen ist. Aus heutiger Sicht spielen neben genetischen Faktoren v.a. Umwelteinflüsse eine entscheidende Rolle (Lichtenstein et al., 2000). Auch bei sporadischen KRK treten etwa 20-30% familiär gehäuft auf. So haben erstgradig Verwandte (v.a. jüngeres Erkrankungsalter) eines KRK-Erkrankten ein erhöhtes relatives Risiko an einem KRK zu erkranken (Burt 2000; Fuchs et al., 1994). Das relative Risiko steigt mit der Zahl der erstgradig erkrankten Verwandten in der Familie (Winawer et al., 1996). Als Ursache angenommen werden polygenetische Veränderungen, wie z.B. Mutationen in rezessiven Genen und Mutationen in dominanten Genen mit niedriger Penetranz. Bekannt sind z.B. der I1307KPolymorphismus, Mutationen der Methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR), Mutationen der N-Azetyltransferase 1 und 2 (NAT1 und NAT2) und Mutationen des 6 Transforming-growth-Faktor-Rezeptors Typ I (TGF-ß-R-I(6A)). Sie alle sind mit einem erhöhten Risiko für kolorektale Karzinome assoziiert (Potter 1999). Bei letzterem Signalweg spielt auch der Smad4-Signalweg eine Rolle. Aber auch die Lebensumstände (sog. Lifestyle) spielt eine Rolle. So gelten Übergewicht, geringe körperliche Aktivität und „westliche“ Ernährung (kalorienreich, fettreich, fleischreich, ballaststoffarm) als erhöhte Risikofaktoren für die Entwicklung eines KRK. Der Verzehr von rotem Fleisch und scharf angebratenem Fleisch stellen ein erhöhtes Risiko dar, während ein hoher Gemüsekonsum einen protektiven Effekt hat. Auch Alkohol- und Nikotinkonsum sind Risikofaktoren für die Entwicklung eines KRK (Kune et al., 1992). Adenokarzinome stellen die häufigste Tumorart des KRK dar. Diese entwickeln sich nahezu immer aus adenomatösen Polypen, wobei villöse Adenome häufiger entarten als tubuläre Karzinome. Die histologische Klassifikation kolorektaler Karzinome erfolgt nach der WHO-Klassifikation (Jass et al.,1989). Das Tumorstadium besitzt grundlegende Bedeutung für die Einschätzung der Prognose der Erkrankung. Es wird durch die TNM-Klassifikation festgelegt. Das TNM-Stadium wird durch das zytologische Grading ergänzt. Hochdifferenzierte Karzinome (G1) haben eine bessere Prognose als entdifferenzierte Karzinome (G4) . Weitere Risikofaktoren sind die Residualtumorklassifikation (R-Klassifikation), die VKlassifikation (Invasion von Blutgefäßen) sowie die L-Klassifikation (Invasion von Lymphgefäßen) (Newland et al., 1994; Yada et al., 1997). 1.2 Molekularbiologische und molekulargenetische Grundlagen kolorektaler Karzinome, vom Gendefekt zum Krebs Das Verständnis der Onkogenese wird anhand wissenschaftlich anerkannter und nachgewiesener Modelle wie der klonalen Genese, das Modell der Down- und Upregulation von Onkogenen und Tumorsupressorgenen sowie das Modell der genetischen Instabilität erklärt. (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). In kolorektalen Karzinomen entsteht, wie auch bei anderen malignen Erkrankungen, das Karzinom durch erworbene (somatische) Mutationen, die einer Zelle und ihren Tochterzellen einen Überlebens- und Wachstumsvorteil verschaffen (Nowell 1976). Diese Mutationen betreffen meistens Wachstums- und Kontrollgene und erlauben der Zelle sich unabhängig von wachstumslimitierenden Signalen der umgebenden Zellen zu teilen. Klone mit unterschiedlichen Mutationsprofilen existieren nebeneinander 7 und unterliegen einem Selektionsdruck. In einem Tumor liegen daher unterschiedlich große klonale Subpopulationen mit unterschiedlichen Mutationsprofilen vor. Onkogene leiten sich von in der Zelle vorhandenen Protoonkogenen ab, die i. d. R. eine wachstumsfördernde Funktion in der Kontrolle der Zelle haben. So kodieren sie Informationen für Wachstumsfaktoren, deren Rezeptoren für intrazytoplasmatische Teile der Signaltransduktionskette oder für nukleäre Transkriptionsfaktoren (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). Bei KRK spielt eine Punktmutation im Kras-Onkogen eine entscheidende Rolle. Darüber hinaus spielen noch Amplifikationen eine wesentliche Rolle. Die Tumorsupressorgene haben eine hemmende Regulationsfunktion des Zellwachstums und der Zellteilung. Bereits 1976 verfasste Knudson die Hypothese, dass eine Mutation auf einem Allel nicht ausreicht, da die Funktion durch das andere Allel übernommen wird (Knudson et al., 1976). Erst der Verlust des anderen Allels, was als 2. somatisches Ereignis bezeichnet wird, führt zum Funktionsverlust des Gens. Die genetische Instabilität, die in vielen Tumorarten nachgewiesen werden kann, ist eine wichtige, die Tumorgenese beschleunigende, Veränderung. Nach heutigen Vorstellungen reicht die endogene Mutationsfrequenz nicht aus, um die zur Entwicklung eines malignen Tumors notwendige Anzahl von Mutationen innerhalb der Lebensspanne eines Menschen zu erklären. Eine genetische Instabilität lässt sich bereits in frühen Stadien der Kanzerogenese nachweisen (Aaltonen et al., 1994; Bomme et al., 1998). Als Folge der genetischen Instabilität kommt es zur Inaktivierung von Tumorsupressorgenen, Aktivierung von Onkogenen und letztlich zur Progression des Tumors. Die meisten Tumoren weisen eine genetische Instabilität auf chromosomaler (mikroskopischer) Ebene. Sichtbar wird es durch Verluste von Chromosomenarmen und chromosomalen Stückverlusten. Aber auch numerische Chromosomenaberrationen, Translokationen oder Genamplifikationen können die Ursache sein (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). 1.3 Tumorgene des KRK, inaktivierte Tumorsupressorgene und aktivierte Onkogene in der Pathogenese kolorektaler Karzinome Nach Schulmann K. und Schmiegel W. unterscheidet man verschiedene Tumorgene des KRK (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002): 8 1.3.1 Chromosom 5q: APC- bzw. WNT-Signalweg Für das Verständnis der Pathogenese kolorektaler Karzinome ist das APC-Gen von grundlegender Bedeutung, da es in über 90% aller sporadischen KRK inaktiviert ist (Kinzler und Vogelstein, 1996). Da APC auch in der Mehrzahl der frühen Adenome inaktiviert ist, geht man für APC von einer Schlüsselstellung in der Tumorinitiierenden Funktion aus, daher sind APC sogenannte Gatekeeper-Gene (Morin PJ und Weeraratna AT, 2003). Die Bedeutung der fehlenden APC-vermittelten ß-Catenin-Degradierung für die Kanzerogenese wird durch die Häufung von Mutationen des APC-Gens im Bereich der ß-Catenin-Bindungsstellen verdeutlicht. In Tumoren ohne Nachweis einer APCMutation lassen sich in etwa 50% Mutationen des ß-Catenin-Gens nachweisen (Sparks et al., 1998) 1.3.2 Chromosom 17q: P53 Signalweg P53 besitzt eine zentrale Rolle in der Regulation des Zellzyklus, in der Induktion der Apoptose sowie in der Bewahrung der genomischen Stabilität durch die Kontrolle des DNA-Reparatursystems (Vousden KH, 2000). Ein Inaktivierung des p53-Gens wird in >75% der Karzinome sowie hochgradigen Adenome beschieben, während in frühen Adenomen das p53-Gen auf beiden Genloki intakt ist. (Boland et al., 1995). Von einer adjuvanten Chemotherapie mit 5-FU profitieren Patienten im Stadium III bei fehlendem Nachweis einer p53-Expression, während bei Patienten mit Nachweis einer p53-Expression kein Unterschied zwischen Operation und Chemotherapie mit 5-FU besteht. (Ahnen et al., 1998). In einer anderen Studie (Elsaleh et al., 2000) konnte keine prognostische Bedeutung nachgewiesen werden, weder für das Gesamtkollektiv, noch für die Gruppe, die adjuvant 5-FU erhielt. Deshalb ist die Rolle des p53 als Chemosensibilitätsmarker umstritten. Aktuell tendiert man wieder zu p53 als Marker für das krankheitsfreie Überleben (Perraud et al., 2011). 1.3.3 Kandidatengene auf Chromosom 18q Für den häufig nachweisbaren LOH von Chromosom 18q beim KRK sind in mehr als 70% der Fälle das DCC, Smad4- oder Smad2-Gen verantwortlich (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). Das ‚deleted in colon cancer’-Gen (kurz DCC) ist auf dem langen Arm des 9 Chromosoms 18 lokalisiert. DCC scheint die Apoptose zu induzieren und ist möglicherweise ein Substrat für Caspase-3. Ein Großteil aller KRK weist einen Expressionsverlust von DCC auf (Thiagalingam et al., 1996). DCC gehört zur Familie der netrin-1-Rezeptoren. Ein zeitgleicher Verlust von p53 und DCC geht mit einer signifikant erhöhten Rate an Metastasen einher (Krimpenfort et al., 2012). In klinischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass ein DCC-Expressionsverlust ein unabhängiger ungünstiger Prognosefaktor für Patienten mit einem KRK im Stadium II und III ist (Shibata et al., 1996). Smad4 (DCP4) ist ein auf dem langen Arm des Chromosom 18 (18q21) lokalisiertes, evolutionär hoch konserviertes Tumorsupressorgen, das zunächst in Pankreaskarzinomen identifiziert wurde und auch bei kolorektalen Karzinomen von Bedeutung ist (Hahn et al., 1996). Die Tumorsupressorfunktion kann durch den Nachweis von Keimbahnmutationen des Smad4-Gens bei der autosomal-dominant vererbten juvenilen Polyposis belegt werden. Die juvenile Polypose ist mit einem erhöhten allgemeinen Risiko für kolorektale Karzinome und andere intestinale Karzinome assoziiert (Houlston et al., 1998; Howe et al., 1998). Das Smad4-Gen besteht aus 11 Exons und kodiert für ein 552 Aminosäuren großes Protein mit hoher Homologie zu Drosophila-MAD-Proteinen, die im TGF-ß-Signalweg der Zelle eine wichtige Rolle spielen (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). TGF-ß inhibiert physiologischerweise das Wachstum von Zellen. Die TGF-ß-abhängige Wachstumskontrolle ist in vielen Tumoren verloren gegangen. Entsprechend wurde zunächst davon ausgegangen, dass Smad4 eine zentrale Rolle in der TGF-ßvermittelten Wachstumsinhibition Tumorzelllinien belegen diese spielt. Weitere Hypothese (Zhou experimentelle et al., Daten 1998). aus In-vitro- Untersuchungen an Tumorzelllinien konnten eine entsprechende, TGF-ß-induzierte Wachstumshemmung nicht nachweisen, sondern identifizierten vielmehr einen Einfluss von Smad4 auf die Expression von Genen, die z.B. die Zusammensetzung der extrazellulären Matrixkomponenten beeinflussen (Schwarte-Waldhoff et al., 1999). Diese Daten stützen ein Modell, in dem DPC4 durch die Begünstigung der Tumorinvasions- und Metastasierungsprozesse tumorigen wirkt. Zudem gibt es Hinweise, die belegen, dass der Smad4-Funktionsverlust durch eine verstärkte Gefäßneubildung das Tumorwachstum unterstützen kann (Schwarte-Waldhoff et al., 2000). Nach Bindung von TGF-ß an den TGF-ß-R-II wird der TGF-ß-R-I im Bereich der juxtamembranär lokalisierten Domäne durch Phosphorylierung aktiviert. Nach 10 Aktivierung des Typ I Rezeptors werden rezeptorregulierte Smad (R- Smad) an ihrem C-terminalen Ende phosphoryliert, dissoziieren vom Rezeptorkomplex und bilden dann mit Smad4 zytoplasmatische Heterodimere, die in den Zellkern transloziert werden (Schwarte-Waldhoff et al., 2000). Hier wird durch Interaktion des SmadKomplexes mit Transkriptionsfaktoren die Transkription von Zielgenen reguliert. Inhibitorische Smad (I- Smad) wie Smad6 und Smad7 wirken antagonistisch durch Bindung an den Rezeptorkomplex. Smad4-Mutationen lassen sich in 10-16% aller sporadischen KRK nachweisen (Koyama et al., 1999; MacGrogan et al., 1997). Es handelt sich überwiegend um Missense-Mutationen, daneben auch um Deletionen, selten um Nonsense-Mutationen. Eine höhere Mutationsfrequenz von 30-35% lassen sich in metastasierenden Tumoren bzw. in Metastasen nachweisen (Miyaki et al., 1999). Auch immunhistochemisch korreliert der Smad4-Expressionsverlust mit dem Vorhandensein von Metastasen (Maitra et al., 2000). Smad2 ist ein weiteres auf dem Chromosom 18 (18q21) lokalisiertes Gen, das zur Klasse der rezeptorregulierten Smad (R-Smad) gehört. Bei 3-8 % aller KRK lassen sich Mutationen nachweisen (Eppert et al., 1996). Es handelt sich überwiegend um Missense-Mutationen und Deletionen. Neben der Smad4/Smad2-Inaktivierung spielen in KRK alternative Mechanismen der Inaktivierung des TGF-ß-Signalwegs eine Rolle. So konnten in MIN+-kolorektalen Karzinomen in 80% Mutationen des TGF-ß-R-II nachgewiesen werden (Markowitz et al., 1995). In Studien konnte eine prognostische Bedeutung eines LOH des Chromosoms 18q für das KRK im Stadium UICC II nachgewiesen werden (Carethers et al., 1998). Bei Verlust des Chromosoms 18q verlaufen die Tumoren wie klinisch Tumoren im Stadium UICC III, während Tumoren ohne LOH klinisch wie Tumoren im Stadium UICC I verlaufen, also eine deutlich bessere Prognose haben. Hieraus könnte ein LOH des Chromosoms 18q als Indikator für eine adjuvante Chemotherapie dienen (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). 1.3.4 K-ras Gene Transformierende Mutationen führen nach dem RAS-Modell zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zugunsten eines aktivierten Zustands. Normalerweise ist die zelluläre RAS-Aktivität sehr genau kontrolliert, wobei die Mehrheit der RAS-Proteine eine inaktivierte Konformation annimmt. Durch einen Stimulus stromaufwärts in der Signaltransduktionskette kommt es zu einem Austausch von inaktivierendem GDP zu 11 aktivierendem GTP am RAS-Protein und damit zu einer Aktivierung desselben. Die übliche RAS-Inaktivierung durch eine GTPase-Aktivität wird durch eine transformierende Mutation des RAS-Gens verhindert (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). Für das KRK spielt insbesondere das K-ras-Gen-Modell (lokalisiert auf dem kurzen Arm des Chromosoms 12) eine Rolle und hier eine G:T-Mutation im Kodeon 12 des K-ras-Gens. K-ras-Mutationen lassen sich in etwa 50% aller kolorektalen Karzinome nachweisen (Bos 1989). K-ras-Mutationen korrelieren mit der Invasionstiefe, dem Tumorstadium und einer ungünstigen Prognose (Andreyev et al., 1998; Cerottini et al., 1998; Finkelstein et al., 1993; Troungos et al., 1997). Der Unterschied bezüglich der Prognose ist für Patienten im Stadium II am deutlichsten (Ahnen et al., 1998). Auch für Stadium III wurde in einigen Studien eine signifikant schlechtere Prognose gefunden (Pricolo et al., 1996). Die RASCAL-Multicenterstudie an 2721 Patienten weist K-ras-Mutationen als unabhängigen, negativen Prognosefaktor bezüglich des Gesamtüberlebens und des Auftretens eines Rezidivs aus. Des Weiteren war der Nachweis von K-ras-Mutationen in mehreren Studien mit einer erhöhten Chemoresistenz assoziiert. In einer Studie an 66 bzw. 163 Patienten mit Tumoren im Stadium UICC II bzw. UICC III, die randomisiert entweder mit 5-FU-Levamisol adjuvant therapiert wurden oder keine adjuvante Therapie erhielten, konnte kein Überlebensvorteil durch die adjuvante Therapie mit 5-FU-Levamisol für die Patienten mit Wildtyp-ras-Tumoren nachgewiesen werden, während Patienten mit K-rasMutationen nicht von der adjuvanten Therapie profitierten (Ahnen et al., 1998) 1.3.5 Mismatch-Reparatursysteme Ein defektes MMR-Reparatursystem ist charakteristisch für HNPCC-assoziierte Tumoren. Als Folge des defekten MMR-Systems weisen die Tumoren eine Mikrosatelliteninstabilität auf, auch MIN+ bezeichnet (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). MMR-Gene kodieren für Proteine, die für die Erkennung und Reparatur von Basenfehlpaarungen im DNA-Doppelstrang essentiell sind. Die Mutation eines Allels führt zunächst nicht zu einem Wachstumsvorteil der Zelle, da der Funktionsverlust durch das 2. intakte Allel kompensiert werden kann. Erst, wenn im 2. Allel aufgrund einer somatischen Schädigung eine weitere nicht funktionsfähige Kopie entsteht, akkumulieren in dieser Zelle Mutationen, die aufgrund des defekten 12 MMR-Systems nicht repariert werden können. Dies entspricht dem von Knudson für Tumorsupressorgene entwickelten 2-Treffer-Modell (Knudson et al., 1976). Tumore mit einem defekten MMR-System weisen gegenüber MIN- Tumoren eine deutlich beschleunigte Progression auf. 1.3.6 Bub-Gene Eine weitere mögliche Ursache chromosomaler Instabilität ist der Funktionsverlust des mitotischen Checkpunkts und der Kontrolle der Chromosomentrennung in der Mitose (Cahill et al., 1998). So konnten die humanen Homologe mad, bub und MPS1 als Bestandteile des mitotischen Checkpunkts identifiziert werden. Mutationen im hbub1 und hbubr1-Gen, die zur Gruppe der bub-Gene gehören, konnten in Kolonkarzinomzelllinien nachgewiesen werden (Cahill et al., 1998). Beide Gene sind Proteinkinasen mit 2 evolutionär hoch konservierten Domänen, die für die Bindung anderer bub-Proteine und für die Kinetochorlokalisation von Bedeutung sind. Der Nachweis von Mutationen in den bisher bekannten Komponenten des bub und madSystems gelingt in kolorektalen Karzinomen aber nur in maximal 5-10% der Fälle (Imai et al., 1999). Aufgrund dieser Befunde muss das Vorhandensein weiterer Komponenten angenommen werden. So wird ein Zusammenhang mit einer p53vermittelten-Apoptose bei hbub1-Defizienz beschrieben (Gao et al., 2009). 1.3.7 Epigenetische Veränderungen im KRK Eine Methylierung von Cytosinresten findet bevorzugt im Bereich von CpG Inseln statt. Etwa 1-2% des gesamten Genoms bestehen aus nicht-methylierten CpGAbschnitten, die meist zwischen 1 und 2 kb groß sind und in der Regel in der Promoterregion von Genen lokalisiert sind. CpG-Abschnitte sind in fast allen Housekeeping-Genen und in einer Reihe von gewebsspezifisch exprimierten Genen vorhanden (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). Diese Gene können einerseits durch Hypomethylierung aktiviert oder andererseits durch Hypermethylierung inaktiviert werden. Eine Hypomethylierung konnte für Onkogene wie H-ras, K-ras, cmyc und blc2 nachgewiesen werden (Laird and Jaenisch, 1994). Eine verminderte Expression von Tumorsupressorgenen aufgrund einer Hypermethylierung konnte für VHL, BRCA1, RB und p16 nachgewiesen werden. Bei den 15% der MIN+sporadischen Tumoren liegt in 70% eine Hypermethylierung des hMLH1-Promoters 13 zugrunde, die zu einer Hypermethylierung-Inaktivierung des hMLH1-Gens führt (Cunningham et al., 1998; Kane et al., 1997, Thibodeau et al., 1998). Ursächlich ist wahrscheinlich eine grundlegende Störung der epigenetischen Kontrolle der Methylierung. 1.4 Tumorprogressionsmodell kolorektaler Karzinome Das kolorektale Karzinom bietet ein gutes Modell der Tumorprogression vom frühen Adenom, zum späten Adenomen, Carcinoma in situ zum invasiven Karzinom. Durch Untersuchungen konnte man so häufige Onkogen- und oder Tumorsupressorgenveränderungen nachweisen. (Fearon- und Vogelstein, 1990) Am Anfang entstehen durch Mutationen des APC-Gens Mikroadenome. Solche Veränderungen führen zu Wachstumsvorteilen und können über Dekaden bestehen, bevor eine erneute Mutation in einer einzelnen Zelle einen weiteren Überlebensvorteil bringt und zu einer weiteren Welle der klonalen Zellexpansion führt. Solche Mutationen treten häufig im K-ras-Gen auf und sind histologisch mit einer Progression vom frühen in das intermediäre Adenom assoziiert (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). Der Verlust des Chromosomenarms 18q führt wahrscheinlich zur Inaktivierung eines oder mehrerer Tumorsupressorgene wie DCC, DPC4 und Smad2 und ist wiederum histologisch mit dem Auftreten von fortgeschrittenen, hochgradig dysplastischen Adenomen verknüpft. Die biallelische Inaktivierung des Tumorsupressorgens p53 findet schließlich als spätes Ereignis am Übergang hochgradig dysplastischer Adenome in das invasive Karzinome statt. Bei der Entstehung von Metastasen kommt es zu weiteren Genalterationen (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). 1.5 Klassische Diagnostik und Therapie kolorektale Karzinome Da das kolorektale Karzinom häufig lange unentdeckt bleibt durch unspezifische Symptome wie Anämie, Obstipation oder Diarrhöen sowie blutigen Stuhlgang (Alexiusdottir et al., 2012) und sich bei der Erstdiagnose häufig bereits in einem fortgeschrittenen Stadium befindet, ist es wichtig, eine diagnostische Möglichkeit zu finden, bevor die ersten Symptome wie blutiger Stuhlgang, Obstipation oder Ileus eintreten. Eine Möglichkeit bietet der Hämoccult-Test. Durch diesen Test kann die Mortalität kolorektaler Karzinome um 16-23% gesenkt werden (Towler et al., 1998). 14 Eine weitaus höhere Sensitivität und Spezifität bietet die hohe Koloskopie, die inzwischen vom Gesundheitsministerium als Vorsorgeuntersuchung anerkannt wurde. So kann jeder ab 50 Jahren eine Koloskopie durchführen lassen und bei unauffälligem Befund alle 10 Jahre wiederholen lassen. Abweichende Empfehlungen gelten für hereditäre Karzinome. Bei Kontraindikationen für eine Koloskopie bietet sich auch die Möglichkeit eines Kolonkontrasteinlaufs an, der inzwischen auch als 3-D-Koloskopie angeboten wird. Ein Vorteil der Endoskopie ist jedoch, dass eine diagnostische wie auch therapeutische Option besteht, d.h. kleinere Polypen reseziert und histologisch untersucht werden können. So kann nach dem Tumorprogressionsmodell bereits in einem frühen Stadium ein potentielles Karzinom verhindert werden. Beim Nachweis eines Karzinoms muss neben der Angabe der Tiefenausdehnung (pT-Stadium), des histologischen Differenzierungsgrads (Grading), dem Vorhandensein oder Fehlen von Lymphgefäß oder Veneninvasion (L- und V-Status) eine Beurteilung des Resektionsrandes erfolgen (R-Status). Als zusätzliche Option zur Beurteilung des Krankheitsfortschritts dient die Information nach metastatisch befallenen Lymphknoten (pN-Stadium). Letztere ist nicht endoskopisch möglich, sondern nur durch operatives Vorgehen. Nach Vorliegen der vorläufigen Histologie schließt sich die Resektion des befallenen Darmabschnittes an mit Entfernung des regionalen Lymphabflussgebietes sowie möglichen umgebenden befallenen Organen. Dabei kann man von einer Hemikolektomie rechts, über eine erweiterte Hemikolektomie rechts, eine Transversumresektion, oder eine erweiterte Hemikolektomie links bzw. eine Hemikolektomie links durchführen. (Hohenberger et al., 2000). Operativ anders gestaltet sich das Rektumkarzinom, da dort die Kontinenzerhaltung im Vordergrund steht. Dies ist bis etwa 5 cm ab der Anokutanlinie möglich. Es können so inzwischen 85% aller Rektumkarzinome sphinktererhaltend operiert werden. Wenn aufgrund der Tumorgröße keine kurative Option mehr gegeben ist (etwa 10%), kann und soll eine neoadjuvante Therapie erfolgen um die Tumorgröße und Ausdehnung zu reduzieren und eine mögliche operative Option anzuschließen nach erneuter Überprüfung der Ausdehnung (Schulmann K. und Schmiegel W., 2002). Diese neoadjuvante Therapie besteht beim Rektumkarzinom aus einer kombinierten Radiochemotherapie. Im Anschluss folgt die Operation. Nach erfolgter Operation sollte im Anschluss die adjuvante Chemotherapie erfolgen, falls diese nicht bereits neoadjuvant erfolgte. Die Kombination der Chemotherapeutika ist abhängig vom 15 histologischen Status sowie des Stadiums nach UICC’s, vom Allgemeinzustand der/der Patientin/Patienten sowie von Nebendiagnosen, der allgemeinen Lebenserwartung und vom Vorliegen von Fernmetastasen. Im Falle von M1 ändert sich das Therapieziel und die Aggressivität der kombinierten Therapeutika in ein palliatives Konzept. Das UICC beschreibt ähnlich wie der TNM-Status die Ausdehnung der Tumorerkrankung auf die Kolonschleimhaut und -serosa (UICC Ia), den Durchbruch der Muscularis (UICC Ib), der Aussaat von Tumorgewebe im Peritoneum und des infiltrativen Wachstums in umgebende Organe (UICC II), der Lymphknotenmetastasierung (UICC III) sowie das Vorhandensein von Fernmetastasen. Durch eine adjuvante Therapie erhöht sich die 5-Jahres-Überlebensrate zwar um wenige Prozent, aber letztlich ist die Ausdehnung des Tumors wesentlich entscheidender auf die Prognose. So beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate im UICCStadium I 98-100%, im Stadium II beträgt es 75-80%, im Stadium III 59-66% und im Stadium IV etwa 12-20%. Durch eine adjuvante Chemotherapie kann im Stadium UICC III eine Verbesserung der 5-Jahres-Überlebensrate von 5 % erreicht werden (Dube et al., 1997). Derzeit wurde die Standardtherapie mit 5-FU-Folinsäure (Schmiegel et al., 2000) abgelöst durch eine Kombinationschemotherapie aus 5-FU/ Leucovorin und zusätzlich Oxaliplatin, das sogenannte FOLFOX-4 Protokoll (Schmiegel et al., 2008). Neben der unspezifischen Chemotherapie wurde in Studien bereits der Erfolg von aktiver und passiver Immuntherapie erforscht. Bei der aktiven spezifischen Immuntherapie werden autologe Tumorvakzine erprobt, die in Form einer TumorzellBCG-Vakzine verabreicht werden. Nach anfänglich vielversprechenden Daten von Vermorken et al. (Vermorken et al., 1999) konnte kein Vorteil in einer weiteren Studie (Harris et al., 2000) nachgewiesen werden. Bereits 1994 wurde der erste monoklonale Antikörper Edrecolomab (Panorex®), der gegen EpCAM gerichtet ist, beim KRK im Stadium UICC III erprobt und zunächst aufgrund vielversprechender Ergebnisse (Riethmüller et al., 1998) mit einer signifikanten Reduktion der Gesamtmortalität von 32% zugelassen. Nach einer Kontrollstudie konnte der Effekt nicht mehr nachgewiesen werden, so dass der Antikörper nicht mehr eingesetzt wird. 16 1.6 Die Zytokeratinfamilie Die Zytokeratinfamilie besteht aus den sauren Typ I zytoplasmatischen Keratinen 9-23 und den Haarkeratinen Ha 1-8 sowie den basischen Typ II Keratinen 1-8 und den Haarkeratinen Hb 1-6 (Kirfel et al., 2002). Dabei bilden die Haarkeratine vorwiegend extrazelluläre Proteine. Die zytoplasmatischen Keratine bilden den Hauptanteil der strukturbildenden Proteine in epithelialen Zellen. Ein Heterodimer formiert sich aus einem basischen und einem sauren Keratin (Parry et al., 1985). Diese Zusammensetzung bestimmt die Eigenschaften des Dimers und damit auch, ob es sich um einfache Epithelien handelt wie bei Keratin 8 und 18 oder um komplexe Epithelien wie bei Keratin 5 und 14 (Yamada et al., 2002). KRT8 und KRT18 sind die häufigsten Vertreter der Intermediärfilamente einfacher epithelialer Zellen und von Tumoren, die aus solchen Zellen entstehen. Die primäre Funktion der Keratine ist der Schutz der epithelialen Zellen vor mechanischem und nicht-mechanischem Stress, der zum Zelltod führen kann. Keratinfilamente werden komplexen Regulationen unterworfen wie posttranslationaler Modifikation und Interaktionen mit gleichen und unterschiedlichen Keratintypen sowie weiteren Proteinklassen (Coulombe und Omary, 2002). Dabei interagieren Keratine über verschiede Signalwege wie dem TNF-Signalweg. Bei mechanischem oder nicht-mechanischem Stress kommt es zu einem KRT8 oder KRT18-Defekt und einer folgenden Induktion der Apoptose, die über den TNFSignalweg erfolgt. Darüber hinaus binden KRT8 und KRT18 die zytoplasmatische Domäne von TNF-R2 (Caulin et al., 2000). Wird die Apoptose induziert, kommt es zu vielfachen zellulären Umstrukturierungen, an denen ebenfalls Keratine beteiligt sind. Anfangs steht die Phosphorylierung eines Keratin-Serins. Bereits 1994 erforschten Ku und Omary in ser-52 die Hauptphosphorylierungsstelle des Keratin 18 und beschrieben eine Hauptrolle in der filamentären Reorganisation (Ku und Omary, 1994). KRT18 und KRT19 sind die Haupt Typ I Keratine und unterscheiden sich trotz gleicher Phosphorylierung in vielen Regulationswegen (Zhou et al., 1999). 1.7 Zytokeratinveränderungen bei Karzinomen und Metastasen Wie in normalen Zellen so findet auch in der Krebszelle ein Keratinstoffwechsel statt. 17 Bereits 1984 beschrieben Debus et al. eine mögliche Typisierung der menschlichen Zellen außerhalb des Primärorgans durch Zytokeratinnachweis mit monoklonalen Antikörpern (Debus et al., 1984). So kann man zumindest epitheliale Zellen von anderen Zellen unterscheiden. Keratine sind klassischerweise in epithelialen Zellen vorhanden, während Vimentin in mesenchymalen Zellen vorkommt (Chu et al., 1993). So können z.B. Keratin 8 und 18 als Marker für den Nachweis von Mammakarzinomzellen herangezogen werden (Cîmpean et al., 2008). Zusätzlich kann auf den Status der Entartung von Primarius und Metastasen rückgeschlossen werden. Eine Hochregulation des einfachen epilthelialen Keratin 8 und Herunterregulation der anderen Keratine (wie K5, K6, K14 und K17) ist ein spätes Ereignis und ein Marker für die fortgeschrittene Entartung der Zelle (Caulin et al., 1993). Der Grund dafür liegt in der Art und Weise, in der sich Epithelien entwickeln. Zu Beginn bildet sich das Gewebe unter der Expression von den primären Keratinen 8 und 18 aus. Mit fortschreitender Entwicklung erweitert sich der Keratinpool der Zelle über die Expression von sekundären Keratinen. Typische Vertreter von Keratinen, die im Verlauf der Differenzierung gebildet werden, sind Keratin 7, Keratin 19 und Keratin 20 (Owens and Lane, 2003). So kann durch Färbung von Keratin 7 eine Unterscheidung zwischen den Metastasen kolorektalen Ursprungs oder einer Pankreaskarzinomabstammung erfolgen (Quentmeier et al., 2001; Ji et al., 2002). Neben den sekundären Keratinen besitzen auch die primären einen diagnostischen Wert. Grundlage für die Nutzung von Pan-Keratin Antikörpern in der Histologie und Zytologie ist die Änderung der Expressionshöhe von Keratin 8 und Keratin 18 während der Progression zur malignen Zelle (Schaafsma et al., 1990; Trask et al., 1990). Die Expressionskonzentration des Keratin 18 korreliert mit der Fähigkeit zum invasiven Verhalten der malignen Zellen (Chu et al., 1997). Ein ähnliches Phänomen zeigen Zellen von nicht epithelialen Tumoren, die eine spontane Expression der beiden intermediären Filamente aufweisen (Zarbo et al., 1990; Lasota et al., 1996). Dies belegt eine Korrelation zwischen Tumorprogression und Keratinexpression. 1.8 Interaktionen zwischen Keratinen und anderen Proteinen Keratine interagieren am häufigsten mit sich selbst wie bei den sauren und basischen Keratinen beschrieben. Aber sie haben ebenfalls eine Funktion in verschiedenen 18 Signalkaskaden. So bindet das 14-3-3-Protein das Keratin 18 nach Phosphorylierung des Ser33 (Ku 1998). 14-3-3 ist wiederum ein potenter Inhibitor der Protein Kinase C und steuert die Exozytose (Jones 1995). Weiter beeinflusst es weitere Signalkaskaden mit p53 und unterstützt die Inhibitorische Wirkung des p53 auf den G2/M-Status (Benzinger et al., 2005). Keratine interagieren abhängig vom Zellteilungsstatus mit anderen Proteinen. Durch Zellzyklusanalysen wurde nach Überexpression von Keratin 10 ein vermehrter G1Arrest beobachtet und für die Keratin 16-überexprimierenden Zellen eine Verschiebung hin zur S-Phase gezeigt. Der G1-Arrest konnte auf die Inaktivierung der beiden Proteinkinasen PKB und PKCζ zurückgeführt werden (Paramio et al., 2001). Histologisch kann man Keratine in der Mitosephase beobachten als Polkörper mit den Spindelfasern. Keratin 8-Überexpression führt in genetisch veränderten Mäusen ebenfalls zu histologisch erfassbaren Alterationen des exokrinen Pankreas einschließlich Dysplasien und Verlust der Azinarstruktur, einer Rückdifferenzierung von Azinar zu duktalen Zellen, Entzündung, Fibrose und Ersatz des exokrinen Gewebes durch Fettgewebe sowie fehlgesteuerter Zellproliferation und Apoptosen. Ähnliche phänotypische Veränderungen beobachtet man in TGFbetaRII-Mäusen, die wiederum erhöhte K8/K18-Level haben (Casanova et al., 1999). Eine wichtige Funktion von TGF-beta ist die Regulation von anti-mitogenen und pro apoptotischen Prozessen, die letztlich über Smad-Proteine gesteuert werden. Eine Unabhängigkeit von der TGF-beta und Smad-induzierten Wachstumshemmung und Apoptose ist in vielen Tumoren nachzuweisen (Ten Dijke et al., 2002). 1.9 Aufbau und Funktion von Smad4 Smad4 wurde ursprünglich DPC4 genannt. Dieses steht für „deleted in pancreatic carcinomas locus 4“. Dieser Name deutet auf seine intrazelluläre Funktion hin. Es ist in jedem zweiten Pankreasadenokarzinom (Hahn et al., 1996) und in rund einem Drittel aller Kolonkarzinome (Miyaki et al., 1999) ausgeschaltet. Die Gruppe der Smad-Proteine sind Transkriptionskofakoren und intrazelluläre Signaltransmitter der TGF-ß-Zytokin-Superfamilie. Massague et al. beschrieb im über 19 30 verschiedene Mitglieder dieser Familie (Massague et al., 2000). Diese können auf aktivierende oder deaktivierende Art Einfluss auf die S-Proteine nehmen. Alle Rezeptor-Smads interagieren mit Smad4. Verschueren und Huylebroeck beschrieben Smad4 als einen zentralen Protagonisten im komplexen Smad-System nach TGF-ß-Aktivierung, der unterschiedlichste Funktionen erfüllt (Verschueren und Huyleboeck, 1999). Wie in Abb. 1.1. beschrieben, erfolgt die Auslösung der Signale durch Ligandenbindung der TGF-ß-Zytokinen an einen Typ II TGF-ß-Rezeptor (TßRII), der daraufhin mit einem Typ I Rezeptor (TßRI) komplexiert und diesen phosphoryliert. Die Phosphorylierung führt zu einer Signalübertragung der Rezeptoren über die Smadproteine. Man unterscheidet drei Klassen von Smads, die R-Smads (1, 2, 3, 5 und 8, hier handelt es sich um Rezeptor-aktivierte Smads), die Co-Smads (Smad4) sowie die ISmads (Smad6 und 7, hier handelt es sich um Inhibitorische Smads). Die aktivierten R-Smads bilden einen heteromeren Komplex mit Smad4. Daraufhin wandert der Komplex in den Kern und moduliert in Kooperation mit weiteren Transkriptionsfaktoren die Transkriptionsrate von Zielgenen. Die inhibitorischen Smads hemmen die Aktivierung und Komplexbildung von R-Smads (SchwarteWaldhoff, 2003). Abb. 1.1: Linearer Smad4-Signalweg (nach Schwarte-Waldhoff 2003) 20 1.10 Auswirkung des Tumorsuppressors Smad4 Rekonstitution in der kolorektalen Karzinomzelllinie SW480 nach Schwarte-Waldhoff et al. konnte nachweisen, dass die stabile Rekonstruktion von Smad4 in Smad4-defizienten menschlichen Kolonkarzinomzellen zu einer Unterdrückung des Tumorwachstums führt. Reexpressionsstudien nach stabiler Rekonstruktion von Smad4 in SW480 Zellen führten zur Reprogrammierung des Expressionsprofils (Schwarte-Waldhoff, 2003). Abb. 1.2: Reexpressionsmodell von Smad4 mit Einfluss auf die Expression zahlreicher Zielgene (Abb. Schwarte-Waldhoff 2003) Dadurch konnte man Rückschlüsse ziehen auf zahlreiche Zielgene (Abb1.2) und Funktionen. So ist der Verlust von Smad4 ein spätes Ereignis im karzinogenen Prozess. Smad4-Knock-out im Mausmodell bewirkt die Progression vom Adenom zum Karzinom. Smad4-vermittelte Tumorsuppression ist unabhängig von TGF-ßinduzierter Wachstumshemmung. Smad4-vermittelte Tumorsuppression ist assoziiert mit der Suppression der Invasivität. Smad4-vermittelte Tumorsuppression ist assoziiert mit der Supression der Angiogenese (Schwarte-Waldhoff, 2003). 21 1.11 Identifikation von Keratin 23 als Smad4-Kandidatenprotein Liffers et al. führte eine differentielle Analyse des Zellkernproteoms der kolorektalen Tumorzelllinie SW480 durch (Liffers et al., 2011). Ziel der Arbeit war es, potentielle Interaktionspartner des Smad4-Proteins zu identifizieren. In Abhängigkeit des Smad4-Status konnten 17 neue Kandidatenproteine nach 2D-Analyse des Zellkernproteoms der SW-480 Smad4-positiven Zelllinie mittels MALDI-MS 17 nachgewiesen werden, u.a. Keratin 23, dessen Funktion bis dahin unbekannt war. Die Bestätigung der Smad4 abhängigen Expression von Keratin 23 fand über eine Northern-Blot-Analyse statt (Liffers et al., 2011). Da die Funktion und die Interaktionspartner des Keratin 23 weitgehend unbekannt waren, forcierte er seinen Fokus auf dieses Protein. Die Zielsetzung bestand im Erforschen der zellulären Funktion des Keratin 23 in Abhängigkeit vom Smad4Status. Auf indirektem Weg konnte er durch die Identifizierung der Interaktionspartner des Keratin 23 mittels Tandem-Affinity-Purification Hinweise auf dessen Funktion erlangen. 1.12 TAP 1.12.1 Voraussetzungen der TAP Die Interaktionsanalysen sind in vitro schwierig durchzuführen. Schwierigkeiten bereitet die geringe Proteinkonzentration, die Aufreinigung von anderen zellulären Bestandteilen und nicht zuletzt die geringe Interaktionsbindungskraft. Man benötigt also ein schonendes System, das die Interaktionsbindung nicht zerstört sowie die Proteine nicht denaturiert. Darüber hinaus soll das Aufreinigungssystem überflüssige, nicht interagierende Zellbestandteile und v.a. Proteine entfernen und die Konzentration des Zielproteins durch Überexprimierung erhöhen. Es sollte eine in vivo Situation ablaufen. Eine anerkannte Methode ist das ‚Tandem Affinity Purification’-System, kurz TAP. Hier wird das zu untersuchende Protein auf DNA-Ebene an zwei ‚Tags’ (Protein A und flag in zweifacher Anzahl) gebunden, die spezifisch mittels Antikörper aus dem Teich der Proteine nach Zelllyse ‚gefischt’ werden können. Eine Schnittstelle wie die TEV wird verwendet um die nach erfolgter Bindung ‚überflüssigen’ Tag Protein A zu 22 entfernen. Hierfür bedient man sich der bekannten Hilfskonstrukte Flag, TEV und Prot A, die zur spezifischen Aufreinigung mittels Tandem-Affinity-Purification eingesetzt werden (Abb.1.3). Abb. 1.3: Aufbau des C-terminal getaggten KRT23-Konstruktes. Flag, TEV und Prot A dienen als Hilfskonstrukte des Köderproteins Keratin 23 zur spezifischen Aufreinigung mittels Tandem-Affinity-Purification. Mit Hilfe der TAP war es verschiedenen Forschergruppen gelungen, bis dahin unbekannte Proteininteraktionen nachzuweisen. So gelang es Rigaut et al. erstmals die TAP bis zum massenspektrometrischen Nachweis von Proteininteraktionspartnern durchzuführen (Rigaut et al., 1999). Dies erfolgte in einer Hefezelllinie, allerdings war da schon darauf verwiesen worden, dass die Umsetzung auf die eukaryonten Zellen weiterer technischer Veränderungen bedarf. Dieselbe Forschungsgruppe zeigte unter Bouveret et al. Sm-like Proteinkomplexe (Bouveret et al., 2000). 1.12.2 Weiterentwicklung der TAP Die Idee ein Protein zu untersuchen mittels einer Aufreinigung eines angehängten Tags besteht schon lange (Cuatrecasas, Wilchek und Anfinsen, 1968). Den Durchbruch erlangte Rigaut durch Einführung einer doppelten Reinigung, durch die man reproduzierbare, durch weitere Experimente bestätigte Ergebnisse erhielt (Rigaut et al. 1999). Die TAP wurde bereits vielfach verifiziert. Hatte man anfangs Calmodulien (Honey 2001) an das zu untersuchende Protein gehangen und mittels Ca-Ausfällung präzipitiert, so verfeinerte Knuesel et al. 2003 dieses Verfahren mit Protein A, einer TEV-Schnittstelle und Flag-Antigen. Die beiden Proteine wurden mittels AK spezifisch gebunden und gewaschen. Mittlerweile gibt es großangelegte systematisierte TAP-Analyseverfahren. So gelang Gavin et al. 2002 eine funktionelle Ordnung des Hefeproteoms durch eine 23 systematische Analyse der Proteinkomplexe (Gavin et al. 2002). Die Arbeitsgruppe um Krogan und Greenblatt erstellte 2005 eine globale Landkarte der Proteinkomplexe der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Krogan und Greenblatt, 2005). In eukaryonten Zellen hatte Bouwmeester et al. im Jahre 2004 einen durchschlagenden Erfolg, als er mit der TNF-alpha/NF-kappa B Signalkaskade erstmals eine funktionelle Karte erstellte (Bouwmeester et al., 2004). In einer Übersichtsarbeit von Li 2011 wurden TAP-Systeme in Hefezellen, Bakterienzellen und Säugetierzellen dargestellt. Es wurden über 30 verschiedene TAP-Tag-Kombinationenen angewandt, über 10.000 Protein-Interaktionspartner in Hefezellen identifiziert, über 1000 in Bakterienzellen und über 100 Interaktionen in Säugetierzellen (Li, 2011) dargestellt. Hit Hilfe der Interaktionspartneranalyse konnten Interaktionskarten dargestellt werden, die helfen, die intrazellulären Abläufe besser zu verstehen. 24 2 Zielsetzung der Arbeit In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe um Liffers et al. wurden mittels eines sogenannten Tandem-Affinitäts-Aufreinigungsystems neue Interaktionspartner für das in der Kolonkarzinomzelllinie SW 480 hochregulierte Keratin 23 identifiziert (Liffers et al., 2011). Durch die erschlossenen Interaktionspartner des Keratin 23 konnten Rückschlüsse auf die Signalwege geschlossen werden. In der Untersuchung von Liffers et al. wurde die Aufreinigung mittels eines AffinitätsTag am N-terminalen Ende des Keratin 23 Proteins durchgeführt. Da in der Literatur beschrieben wurde, dass die Positionierung des Affinitäts-Tags (N-terminal oder Cterminal) einen deutlichen Einfluss auf die möglichen nachweisbaren Interaktionspartner haben kann, sollte in der vorliegenden Arbeit geklärt werden, ob dies auch für die von Liffers et al. identifizierten Keratin 23 Interaktionspartner zutrifft. Ziel der Arbeit war es daher, eine Keratin 23 Interaktionsanalyse mittels eines Cterminal angehängten Prot A-Flag-Affinitätstags sowohl in Smad4 negativen als auch in Smad4 positiven Kolonkarzinomzellen SW480 zu etablieren. Anschließend sollten nachgewiesene Interaktionspartner identifiziert und Interaktionsanalyse von Liffers et al. verglichen werden. 25 mit den Proteinen der 3 Material und Methoden Feinchemikalien: 1,4-Dithiothreitol (DTT) 1-Butanol 1kb DNA-Leiter 2-Propanol Acetonitril Acrylamid (37,1:1) Agar Agarose- Low melt Ammoniumacetat Ammoniumhydrogencarbonat Ammoniumperoxodisulfat Ammoniumsulfat Anti-Flag-Agarose Aprotinin β-Mercaptoethanol Benzonase Bestatin Bromphenolblau BSA (Fraktion V) Calciumchlorid Carbenicillin Complete™, Protease Inhibitor Cocktail Tabletten Coomassie Brillantblau G 250 di-Kaliumhydrogenphosphat Dimethylsulfoxid (DMSO) dNTPs Dulbecco’s Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) Essigsäure Ethanol absolut Ethanol MEK vergällt Ethidiumbromid (1 % (w/v)) Ethylendiamin Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA) Formamid Ficoll® 400 Fötales Kälberserum (FCS) Formaldehydlösung 37 % säurefrei Geneticin 418 (50 mg/mL) Glutamin (200 mM) Glycerin wasserfrei Glycin Glycogen (20 mg/mL) HEPES IgG Sepharose 6 Fast Flow Isopropanol, 99,5 % 26 BioRad, München, D Merck, Darmstadt, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Roth, Karlsruhe, D Sigma, Taufkirchen, D BioRad, München, D Biomol, Hamburg, D Sigma, Taufkirchen, D J.T. Baker, Deventer, NL Merck, Darmstadt, D Sigma, Taufkirchen, D Sigma, Taufkirchen, D Sigma, Taufkirchen, D Merck, Darmstadt, D Sigma, Taufkirchen, D BioRad, München, D Sigma, Taufkirchen, D Merck, Darmstadt, D Sigma, Taufkirchen, D Roche, Mannheim, D Sigma, Taufkirchen, D Sigma, Taufkirchen, D Fluka, Buchs, CH Promega, Ingelheim, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Fluka, Buchs, CH Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Beckman Coulter, Krefeld, D Sigma, Taufkirchen, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D Merck, Darmstadt, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D Merck, Darmstadt, D Serva, Heidelberg, D Roche, Mannheim, D Biomol, Hamburg, D Amersham, Freiburg, D J.T. Baker, Deventer, NL Kaliumchlorid Kalziumchlorid LB-Broth Leupeptin L-Glutamin Lysin Magnesiumchlorid-Hexahydrat Magnesiumsulfat-Hexahydrat Methanol Mineralöl N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Natriumfluorid Natriumacetat Natriumcarbonat Natriumchlorid Natriumdihydrogenphosphat Monohydrat Natriumdodecylsulfat (SDS) Natriumorthovanadat Natriumfluorid Natriumpyruvat Natriumthiosulfat Pentahydrat Paraformaldehyd Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Penicillin/Streptomycin Stammlösung Pepstatin A Poly-D-Lysin Precision Plus Protein Standards Dual Color Puromycin Pyronin Y Quick Start Mix Saccharose Silbernitrat ThermoPol Puffer 10x Thioharnstoff Trifluoressigsäure (TFA) Tris(hydroxymethyl-)aminomethan (Tris Base) Tris(hydroxymethyl-)aminomethan Hydrochlorid (Tris HCl) Triton X-100 Trypsin/EDTA Tween 20 Xylencyanol Merck, Darmstadt, D Sigma, Taufkirchen, D Sigma, Taufkirchen, D Sigma, Taufkirchen, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D Sigma, Taufkirchen, D Sigma, Taufkirchen, D Sigma, Taufkirchen, D Roth, Karlsruhe, D Sigma, Taufkirchen, D BioRad, München, D Sigma, Taufkirchen, D Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Sigma, Taufkirchen, D Calbiochem, Darmstadt, D Biomol, Hamburg, D Roth, Karlsruhe, D Sigma, Taufkirchen, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D Sigma, Taufkirchen, D Roth, Karlsruhe, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D Sigma, Taufkirchen, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D BioRad, München, D Sigma, Taufkirchen, D Sigma, Taufkirchen, D Beckman Coulter, Krefeld, D Sigma, Taufkirchen, D Merck, Darmstadt, D NEB, Frankfurt am Main, D Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Sigma, Taufkirchen, D Sigma, Taufkirchen, D Sigma, Taufkirchen, D Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, D Sigma, Taufkirchen, D Merck, Darmstadt, D Enzyme: BamHI 20 U/µL MfeI 10 U/µL SalI 20 U/µL T4-DNA-Ligase 1 U/µL NEB, Frankfurt am Main, D NEB, Frankfurt am Main, D NEB, Frankfurt am Main, D Invitrogen, Karlsruhe, D 27 Taq-Polymerase 5 U/µL AcTEV 10 U/µL vent-Polymerase 2 U/µL NEB, Frankfurt am Main, D Invitrogen, Karlsruhe, D NEB, Frankfurt am Main, D Zellen: E. coli TOP10 Invitrogen, Karlsruhe, D HEK293T ATCC, Rockville, MD, USA adenoviral transformierte humane embryonische Nieren-Epithelzelllinie mit integriertem temperatursensitiven SV40 large T-Antigen SW480: ATCC, Rockville, MD, USA kolorektale Karzinomzellline aus humanem epithelialen Adenokarzinom (3-4 Grad), DPC4-negativ, Mischung aus epithelialen (predominiert) und bipolaren Zellen Geräte: Abstandshalter, 0,75 x 10 x 300 mm Abstandshalter, 1,5 x 10 x 300 mm Analysenwaagen BL 1500 S und BP 121 S BioPhotometer Typ 6131 CDC-Kamera Fluorescent Tables Combi Light FSPCM/WL & Darkroom λ = 312 nm Cellophanfolie CEQ 8000 Deckgläschen, optisch plan geschliffen, 20 x 26 mm Dounce Homogenisator Einfriercontainer Cryo 1 C Elektrophorese-Kammern: DNS: Comphor L Midi-System Eppendorf Pipetten Research 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL Filmentwickler (Optimax) Fluoreszenz Tisch Combi Light TFP-M/WLm λ = 321 nm Gelgießstand Gelschienen, 250 mm angefertigt Geltrockner Glasplatten, 250 x 300 mm Heizbad Heizblock Model HB110 HeraCell Inkubator HeraSafe Sterilbank Desaga, Wiesloch, D Desaga, Wiesloch, D Sartorius, Göttingen, D Eppendorf, Hamburg, D LTF-Labortechnik, Wasserburg, D Pütz Folien, Taunusstein, D Beckman Coulter, Krefeld, D Menzel, Braunschweig, D Merk Eurolab, Bochum, D Nalgene, Neerijse, B Bio-Rad, München, D Eppendorf, Hamburg, D Typon Röntgenfilm, Grünstadt, D MWG-Biotech, Ebersberg, D Desaga, Wiesloch, D Plexiglas Lehmann, Dortmund, D BioRad, München, D Desaga, Wiesloch, D GFL, Burgwedel, D Uniequip, München, D Kendro, Langenselbold, D Kendro, Langenselbold, D Mikroskope: Konfokalmikroskop Leica TCS SP2 Mikroskop Leica, Heidelberg, D Olympus Microscopy, Hamburg, D 28 Netzteile: EPS 3501XL Consort E802 Neubauerzählkammer PAGE-Kammer, 1D-PAGE PAGE-Kammer, 2D-PAGE pH-Meter Präzisionsküvette aus SUPRASIL® Quarzglas, Schichtdicke 10 mm Quarzglasröhrchen Amersham, Freiburg, D Consort NV, Turnhout, B Roth, Karlsruhe, D Invitrogen, Karlsruhe, D Desaga, Sarstedt, Nümbrecht, D Mettler-Toledo, Giessen, D HELLMA, Müllheim, D Chromatographie Service, Langerwehe, D Scanner: HP PSC 2175 PowerLook 2100 XL Typhoon 9400 Hewlett-Packard, Dortmund, D Umax Data Systems Inc.,TW Amersham, Freiburg, D Schüttler: Typ 3005 Typ 3016 Schüttelinkubator Kühlthermoschüttler KTM100RP Sterilbank Hera Safe GFL, Burgwedel, D GFL, Burgwedel, D Infors AG, Bottminge, CH HLC, Bovenden, D Heraeus Hanau, D Thermocycler: Mastercycler gradient PTC-200 Thermal Cycler PTC-200 Umwälzkühler TC 300 Wärmeschrank Wasserbad Western Blot Apparatur Fastblot B43 Eppendorf, Hamburg, D MJ Research, Waltham, MA, USA Thermo Haake, Karlsruhe, D Heraeus Hanau, D GFL, Burgwedel, D Biometra, Göttingen, D Zentrifugen: Multifuge 3S-R Tischzentrifuge 5415 D Tischzentrifuge 5415 R ZipTips Elektroporator 2510 Heraeus Hanau, D Eppendorf, Hamburg, D Eppendorf, Hamburg, D Millipore, Eschborn, D Eppendorf, Hamburg, D Verbrauchsmaterial: 10 mL Polyallomer Zentrifugentubes 15 mL Polypropylenröhrchen CellStar®, 50 mL Polypropylenteströhrchen CellStar®, 96-well-THERMOQUICK PCR Platten Typ 2 CellStar®, Cryos CellStar®, Elektroporationsküvetten, 1 mm Spaltbreite Parafilm Greiner Bio-One, Frickhausen, D Greiner Bio-One, Frickhausen, D Bio-Rad, München, D Brand, Wertheim, D Pipettenspitzen: 62 mm lang 0030 001.222 100 mm lang 5242 956.003 Eppendorf, Hamburg, D Eppendorf, Hamburg, D 29 Kendro, Düsseldorf, D Greiner Bio-One, Frickhausen, D Greiner Bio-One, Frickhausen, D TipOne Tips Extended Length, Natural, 0,1-10 µL, 2-20 µL 20-200 µL, 200-1000 µL Roti®-PVDF-Membran Safe-Lock Reaktionsgefäße 0,5 mL, 1,5 mL, 2,0 mL Skalpellklinge Sterilfilter Filtropur, S 0,45 TC-Platte 96-well, U-Form, W.Lid CellStar® Whatman-Gel-blotting-papier, GB002 Zellkulturschalen CellStar® 6-well, 12-well, 10 cm, 14,5 cm Zentrifugenadapter Kits: ECL-Kit: Supersignal® West Pico High Purity Plasmid Midiprep Purification System Starlab, Ahrensburg, D Roth, Karlsruhe, D Eppendorf, Hamburg, D Bayka, Tuttlingen, D Sarstedt, Nürnbrecht, D Greiner Bio-One, Frickhausen, D Schleicher & Schuell, Dassel, D Greiner Bio-One, Frickhausen, D Kendro, Düsseldorf, D Pierce, Perbio Science, Bonn, D Perfectprep Gel Cleanup Marligen, Bioscience, Ijamsville, MD, USA Eppendorf, Hamburg, D Computerprogramme: Leica Confocal Software Version 2.5 Microsoft Office 2003 CEQ Analysis Software V.9.0 Vector NTI Leica, Heidelberg, D Microsoft Corp., München, D Beckman Coulter, Krefeld, D Invitrogen, Karlsruhe, D 30 3.1 Molekularbiologische Methoden 3.1.1 Plasmiddesign Folgende Plasmide wurden im Rahmen der Forschungsarbeit verwendet. pBabe puro, des Weiteren pKRT23, das Konstrukt von Liffers et al.. Im Rahmen der Arbeit wurde darüber hinaus noch pPSCA verwendet. Es ist ein Plasmid zur Expression von PSCA (Prostata stem cell antigen) in Kombination mit Protein A, TEV-Schnittstelle und Flag. Abb. 3.1.: pBabe puro (Quelle: http://www.biovisualtech.com/bvplasmid/pBABE-puro.jpg). Als Schnittstellen dienen u.a. BamHI, MfeI (nicht abgebildet) sowie SalI. In den in Abb. 3.1 dargestellten Vektor wurden im Rahmen der Forschungsarbeit von Liffers et al. die in Abb. 3.2.a dargestellten Sequenzen zwischen den Schnittstellen BamH1(1355) und SalI(1397) einkloniert. 31 a) BamH1 SalI b) BamH1 SalI Abb. 3.2.a+b: a).Konstrukt von Liffers et al. zur TAP und anschließenden Proteinuntersuchung. b) pPSCA Als Kontrollvektor wurde das pPSCA Konstrukt verwendet, welches sich durch Austausch von PSCA statt Keratin 23 unterscheidet. Als Vorlage zur Erstellung des Plasmides dienten die Daten von Knuesel M et al. aus dem Jahr 2003 (siehe Abb. 3.3). Abb. 3.3: Vorlage für das TAP-Konstrukt von Knuesel M et al. (Mol Cell Proteomics 2003;2:1225 1233). Die Aminosäurenabfolge (unterer Teil) der IgG Binding-Domain, Flag-TAG und TEV-Cleavage-Site dienten als Matrize für die Primerkonstruktion. Die in Tab 3.1. dargestellten Primer wurden für das KRT23, Prot A und Flag in Kombination mit der TEV-Cleavage-site verwendet. Erst durch Restriktion und Ligation der Restriktionsstellen BamHI, MfeI und SalI ergibt sich das für die TAP benötigte Protein (Abb. 3.4.). 32 Tab. 3.1: Auflistung der in der vent-PCR verwendeten Oligonukleotide Template Sense Primersequenz Keratin 23 Isoform A Flag + TEV Protein A Abb. 3.4: 5´-CGGGA TCCAC CACCT GAACT CCGGA CACAG CTT-3´ 5´-GCCAA TTGGA CTACA AGGAC GACGA TGACA AGGCG AATTG CCGGC CCGGC AG -3´ 5´-TACGC GTCGA CGAAG CCGTA CACAA CAAAT T -3´ dNTP-Mix: mM mM mM mM dATP dCTP dGTP dTTP LB-Medium: 20 g/L 5´-GCCAA TTGTG CGTGC TTTTG GATTT CA-3´ 5´-TACGC GTCGA CATGC CGGGG CTTGC CGGCA T-3´ 5´-TACTG GTCGA CCTAA TTCGC GTCTA CTTTC GGCG -3´ Aufbau des Konstruktes mit entsprechenden Restriktionsstellen. 3.1.2 vent PCR 10 10 10 10 Antisense Primersequenz LB-Broth ThermoPol. Puffer 10x: 100 mM KCl 200 mM Tris HCl, pH 8,8 bei 25°C 33 100 20 1 mM (NH4)2SO4 mM MgSO4 % (v/v) Trition X-100 Ansatz A: 1,0 8,0 2,5 1,0 1,0 11,5 µL µL µL µL µL µL Template LB Medium MgSO4 Primer; Sense (Tab. 4.1) Primer; Antisense (Tab 4.1) H2O Ansatz B: 5,0 2,5 2,5 0,5 0,5 1,0 13,0 µL µL µL µL µL µL µL ThermoPol Puffer 10x dNTPs DMSO BSA MgSO4 vent-DNA Polymerase H2O Zur Erstellung des Vektors wurde das Vent-Verfahren eingesetzt, bei dem das Polymeraseenzym Vent verwendet wird, das sich durch hohe Prozessivität und Korrekturlesefunktion (proof reading) auszeichnet. Als Template für die PCR wurde das pKRT23 von Liffers et al. eingesetzt, denn es enthielt alle Bausteine für das Ziel des C-terminal getaggten Keratins 23. Zunächst wurde Ansatz A bei 95°C für 5 Minuten denaturiert. Nach Abkühlen des Ansatzes auf Eis wurde der Ansatz B pipettiert. Nach einer Inkubation des Reaktionsansatzes bei 94°C für 1 min folgten 25 Zyklen zur Amplifikation des primerspezifischen PCR-Produktes in folgender Reihenfolge: Schritt 1 entsprach der Denaturierung der DNA bei 94°C für 30 sek. Als zweiter Schritt folgte der Abfall auf die primerspezifische Annealingtemperatur (siehe Tab.: 3.3). Hier banden die Primer während der folgenden 30 sek Sequenz spezifisch an die DNA und es folgte bei 72°C die Primerextension und -elongation. Der Dauer der Primerextension lag ein Zeitintervall von 1 min pro kb zu Grunde. Das entsprach für alle Primerextensionen 40 sek. Nach Beendigung des letzten Zyklus fand eine Verlängerung der Primerextension um 5 min statt mit anschließender Abkühlung auf 35°C. 34 3.1.3 Gelelektrophorese von DNA TAE-Puffer: 40 1 1,92 mM mM M Tris, pH 8,3 EDTA Glycin 1g Agarose in 99ml TAE aufgelöst sowie Hinzugabe von 1 % (v/v) Ethidiumbromid DNA-Probenpuffer 5x: 15 50 0,1 0,004 0,004 in TAE % (w/v) mM % (w/v) % (v/v) % (v/v) Ficoll® 400 (Gelpulver) EDTA SDS Xylencyanol Bromphenolblau Die Gelelektrophorese diente der Auftrennung der DNA nach molekularer Größe und nach Ladung. Hier wanderten kleine, negativ geladene Moleküle schneller zur Anode und trennten sich so von den anderen Molekülen (1% Agarosegel entsprach einer Porengröße von 150 nm). Durch Hinzugabe von 1,5 µL Ethidiumbromid wurde die DNA markiert. Nach dem Vermischen der Proben mit DNA-Probenpuffer wurden pro Tasche je nach DNA-Konzentration bis zu 10 µL, bei Gelen zur weiteren Verarbeitung der DNA bis zu 50 µL, Probe aufgetragen und bei einer Spannung von 130 V (ca. 30 min) nach ihrer Größe getrennt. Nebenbei lief die 1kb DNA Leiter, die gleichzeitig zur Massenabschätzung genutzt wurde (siehe Kapitel 3.1.7). Die Detektion der DNA erfolgte über UV-Licht (Ethidiumbromideffekt) bei 312 nm, und die Aufnahmen wurden mittels einer CDC-Kamera gemacht. 3.1.4 Elution von DNA aus Agarosegelen Eppendorf Bindungspuffer (Zusammensetzung nicht bekannt) Eppendorf Waschpuffer (Zusammensetzung nicht bekannt) Mittels Perfectprep® Gel Cleanup wurde die DNA aus dem Gel extrahiert. Nach Identifizierung der Bande mittels UV-Licht wurde das Gelstück herausgeschnitten. Zuerst wurde das Gelstück im Eppendorf-Reaktionsgefäß 35 gewogen und anschließend mit dem dreifachen Volumen an Bindungspuffer versetzt. Nach 10 Minuten Inkubation bei 50°C hatte sich das Gelstück aufgelöst. Nach Hinzugabe von Isopropanol (Volumen entsprechend des Gelausgangsgewichtes) erfolgte die Überführung in die DNA-Säule in einem neuen Eppendorfgefäß. Nach Zentrifugation (8.000 x g; RT; 1 min) erfolgte ein Waschschritt (750 µL Wasch- puffer; 8.000 x g; RT; 1 min). Nach dem Verwerfen des Eluats schloss sich ein weiterer Zentrifugationsschritt (8.000 x g; RT; 1 min) an. Die Elution der DNA erfolgte mit 30 µL H2O bei 8.000 x g; RT; 1 min. Die DNA wurde zur Weiterverarbeitung bei -20°C gelagert. 3.1.5 Elution von DNA mittels Phenol-Chloroform-Extraktion Die Phenol-Chloroform-Extraktion ist eine Methode zur Beseitigung von Proteinverunreinigungen von Nukleinsäuren (Chomczynski P und Sacchi N., 2006). Nach Zugabe des Phenols und des Chloroforms bildeten sich im Reaktionsgefäß zwei Phasen aus. In der oberen wässrigen Phase befanden sich die Nukleinsären. Die untere, organische Phase, bestand aus Phenol. Zwischen diesen beiden Phasen bildete sich eine Interphase aus den durch das Phenol denaturierten Proteinen aus. Das Chloroform verhinderte, dass Phenol sich ebenfalls in der wässrigen Phase löste und optimierte die Phasentrennung. Die DNA wurde aus der wässrigen Phase mit Ethanol (100 % v/v) in Gegenwart eines hochkonzentrierten monovalenten Kations wie z.B. Natriumacetat gefällt. Na+-Ionen neutralisierten dabei die negative PhosphatGruppen des DNA-Rückgrats und machten das Nukleinsäure-Molekül weniger hydrophil. Ethanol entzog den Nukleinsäuren die Hydrathülle und ermöglichte die Interaktion zwischen Na+-Ionen und den Phosphatgruppen. Glykogen wurde ebenfalls zugesetzt, um die Präzipitation zu verbessern. Die Na+-Ionen wurden aus dem Präzipitat durch mehrere Waschschritte mit Ethanol (70 % v/v) entfernt. Die DNA-Probe wurde auf 200 µL mit ddH2O aufgefüllt und mit dem gleichen Volumen an PC8 versetzt. Nach einer gründlichen Mischung wurde die Phasentrennung über Zentrifugation (5 min, 13200 rpm, RT, Eppendorf-Zentrifuge 5415D) beschleunigt. Die wässrige Phase wurde in ein neues 1,5 mL-EppendorfGefäß überführt und mit 1/10 Volumen einer 3-molaren Natriumacetat-Lösung (pH 5,2) versetzt. Zur DNA-Fällung wurden anschließend 2 µL einer 20 mg/mL Glykogen36 Lösung sowie 2 Volumen Ethanol (100 % v/v) zugegeben. Nach einem gründlichen Mischen wurde erneut zentrifugiert, um die ausgefällte DNA zu pelletieren. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet zweimal mit je 300 µL Ethanol (70 % v/v) gewaschen. Anschließend wurde das Pellet luftgetrocknet und in 10 µL ddH2O aufgelöst. 3.1.6 Restriktion BamHI-Restriktion für a) pBabe puro und b) KRT23: 0,5 µL BamHI (Stock: 20U/µL, laut Tab. 10U/µg DNA.=>0,5µL/µg DNA) 1,0 µg Template 0,5 µL BSA 10 mg/mL 4,0 µL BamHI-Puffer 10x: (100 mM Tris HCl, pH 7,9 bei 25°C 1,5 M NaCl 100 mM MgCl2 10 mM DTT) 34 µL H2O MfeI-Restriktion für a) KRT23 und b) Linker (Flag + TEV) 0,25 µL MfeI (Stock: 10U/µL, laut Tab. 2,5U/µg DNA.=> 0,25µL /µg DNA) 1,0 µg Template 4,0 µL (MfeI-Puffer 10x: 200 mM Tris Acetat, pH 7,9 bei 25°C 100 mM Magensiumacetat 500 mM Kaliumacetat 10 mM DTT) 34,75 µL H2O SalI-Restriktion für a) Linker (Flag + TEV), b) Prot A (2x) und c) pBabepuro 1,0 µL SalI (Stock: 20U/µL, laut Tab. 20U/µg DNA ben.=> 1µL/µg DNA) 1,0 µg Template 0,5 µL BSA 10 mg/mL 4,0 µL (SalI-Puffer 10x: 100 mM Tris HCl, pH 7,9 bei 25°C 1,5 M NaCl 100 mM MgCl2 10 mM DTT) 33,5 µL H2O Damit ein DNA-Insert in einen Vektor kloniert werden kann, mussten seine Enden zu den Enden des offenen Vektors komplementär sein. Dies wurde über eine Restriktion mit Restriktionsendonukleasen erreicht. Diese Enzyme schnitten die doppelsträngige DNA an definierten Stellen, indem sie die Phosphodiesterbindung im Zucker37 Phosphat-Rückgrat der DNA hydrolysierten. Als Restriktionsprodukte wurden DNAFragmente entweder mit glatten oder mit überhängenden Enden produziert. Für eine spätere Ligation musste das Insert mit zwei unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen geschnitten werden, die jeweils eine Schnittstelle innerhalb des Plasmids besaßen. Enzyme und Reaktionspuffer wurden nach Angaben des Herstellers verwendet. Die Erfolgskontrolle einer Restriktion wurde mittels analytischer Agarose- Gelelektrophorese durchgeführt. Nach dem Mischen des Restriktionsansatzes wurde dieser für 2 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend das DNA-Fragment über Gelelektrophorese und Elution aufgereinigt (siehe Kapitel 3.1.3 - 3.1.5). 3.1.7 Gelelektrophorese und Photometrie 3.1.7.1 Mengenabschätzung mittels Gelelektrophorese Für die Ligation musste die DNA-Menge vor der Ligation abgeschätzt werden. Dabei bediente man sich kommerzieller DNA Ladder, die sowohl die kb-Banden anzeigte, als auch unterschiedliche Mengen in Graustufen entsprechend der DNA-Menge in ng. Abb. 3.5.: DNA-Mengenmessung am Beispiel von 2ng pBabepuro (Lane II) und 2ng pKRT23 (Lane III) nach Restriktion mit MfeI. Lane I zeigt die 1kb DNA-Ladder Abb. 3.5. zeigt eine DNA-Mengenabschätzung vor Ligation. Die erste Lane entsprach der 1kb Ladder. Die Menge an pBabepuro konnte mit der ersten Bande von unten 38 der DNA-Ladder verglichen werden (entspricht 25 ng) und die Menge an pKRT23 entsprach etwa der 2. Bande von unten, nämlich der 10 kb Bande (30 ng). Da jeweils 2ng verwendet wurden, betrug in diesem Beispiel die notwendige Menge etwa 60 ng. 3.1.7.2 Mengenabschätzung mittels Photometrie Nach Restriktion wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt um die gespaltenen Nukleotide entsprechend ihrer Größe aufzutrennen und die Menge abzuschätzen. Es wurde, zusätzlich zur Mengenabschätzung mittels Gelelektrophorese, die dsDNAKonzentration photometrisch bestimmt. Die DNA-Konzentration konnte photometrisch mit Hilfe des Lambert-Beer-Gesetzes bestimmt werden (Glasel JA, 1995). Dieses beschreibt die Lichtabsorption einer gelösten Substanz bei Durchqueren einer Küvette. Nukleinsäuren weisen ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 260 nm auf, das Extinktionsergebnis bei der Wellenlänge 260 nm ist proportional zur DNA-Menge. Zusätzlich zum Konzentrationsergebnis und der Extinktion bei der Wellenlänge 260 nm wurden als Anhaltspunkt für die Reinheit der gemessenen Nukleinsäureproben die Extinktionen bei 280 nm angezeigt. Letztere sollte bei reiner Probe nahe Null liegen. Aus den Daten abgeleitet wurde der Quotient OD260 /OD280 angezeigt. Dieser sollte >2,0 betragen (Quelle: Bedienungsanleitung Eppendorf BioPhotometer Typ 6131). 3.1.8 Ligation Ligasepuffer 10x: 660 66 100 660 mM mM mM µM Tris HCL, pH 7,6 MgCl2 DTT ATP Ligationsansatz: 100 x 1 2 ad 20 ng ng µL µL µL Plasmid DNA (~6kb/Plasmid) Insert T4 DNA Ligase Ligasepuffer H2O 39 Inserts: KRT23 (~1,2kb/Insert) Linker (Flag + TEV) (~0,2 kb/Insert) Prot A (~0,4 kb/Insert) Ein DNA-Fragment kann in ein offenes Plasmid über eine Ligation eingeführt werden. (Zitat). Diese Reaktion fand in Anwesenheit von speziellen Enzymen, den Ligasen, statt. Die Ligasen katalysierten die Ausbildung einer Phosphodiesterbindung zwischen den freien 5’-OH und 3‘-PO4 Gruppen der doppelsträngigen DNAMoleküle. Nach einer erfolgreichen Ligation erhielt man einen rekombinanten Vektor, der das eingeführte Insert enthielt. In den Ligationsreaktionen wurden die restringierten Produkte (Kap. 3.1.6) nach der Aufreinigung (Kap. 3.1.4 und Kap. 3.1.5) und Mengenbestimmung (Kap. 3.1.7) in einem Mengenverhältnis von 1:5 (Vektor zu Insert) in den retroviralen Vektor pKRT23 (Kap. 3.1.1) ligiert. Die Reaktionen katalysierte die T4-DNA-Ligase über Nacht (16°C). Zur Kontrolle der Ligation wurde zusätzlich eine Reaktion mit Insert aber ohne Ligase sowie eine Reaktion ohne Insert angesetzt. Analog zu Kap. 3.1.5 erfolgte die Aufreinigung des Ligationsansatzes mittels PC8. Insgesamt wurden die Schritte 3 Mal durchgeführt, da jedes Insert einzeln ligiert und anschließend mittels TAQ-PCR (siehe Kap. 3.1.11) kontrolliert wurde um eine höchst mögliche Erfolgsausbeute zu erlangen. 3.1.9 Transformation LB-Medium: 20 g/L LB-Broth 40 µL elektrokompetente Zellen (E600nm: 0,5 - 0,6) 10 ng Plasmid (3.1.9) (insgesamt 3x) Die Transformation ist eine Methode, die eine direkte Einführung nackter DNA in Bakterienzellen ermöglicht (Satkauskas S, Ruzgys P, Venslauskas MS, 2012). In der Molekularbiologie wird oft das Verfahren dervElektroporation für die Transformation von Bakterien verwendet. Dabei wird durch das Anlegen eines externen elektrischen Feldes die Plasmamembran der Bakterien kurzzeitig permeabilisiert, damit die DNA in die Zelle gelangen kann. 40 Zur Amplifikation des Expressionsvektors diente der E. coli-Stamm Top10 von Invitrogen, der bei -70°C gelagert wurde. Die benötigten kompetenten Bakterien zur Transformation sowie die Gene Pulser Küvetten wurden gekühlt. Bei hoher Plasmidkonzentration wurde 1 µL Ligationsansatz (entsprechend 10ng Plasmid) zu 40 µL elektrokompetenter Zellen zugeführt. Die Elektroporation erfolgte bei einer Spannung von 1800 V für ca. 5-6 msek, wobei die Zellen direkt im Anschluss in 1 mL LB-Medium überführt wurden und zur Ausbildung der Antibiotikaresistenz bei 37°C 1 h auf dem Schüttelinkubator bei 190 rpm inkubiert wurden. Die Bakterien wurden auf je zwei unterschiedliche Agarplatten (50µL und 500µL) mit dem entsprechenden Antibiotikum (Carbenicillin, kurz CB) ausplattiert. Die Carbenicillin-enthaltenden LB-Platten wurden über Nacht bebrütet (37°C), um die Bildung der Kolonien optimal zu unterstützen. Nur die transfizierten Zellen konnten das Carbenicillingen exprimieren und hatten somit einen Selektionsvorteil. 3.1.10 Klonselektion LBCB –Medium: 20 g/L LB-Broth 0,05 mg/mL Carbenicillin Nachdem die Bakterienkulturen über Nacht bei 37°C auf LBCB-Platten inkubiert wurden, erfolgte zunächst die selektive Übertragung von Einzelkolonien auf ein 48er Well unter Verwendung von je 200µL LBCB-Medium. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C erfolgte die Aufsplittung des 200µL Mediums auf 100µL Stock (4°C) und 100µL zur weiteren Plasmidüberprüfung mittels PCR. Hierfür erfolgte die Überführung der 100µL Bakterien in ein neues Well mit anschließender Zentrifugation (EppendorfZentrifuge 5415D) bei 1500 rpm bei RT für 3 min und anschließendem Abkippen des Überstandes. Zum Pellet wurden 100µL H2O zugegeben. Es erfolgte die PCR mit je 1-2 µL pro Klon mit Sense- und Antisense Primern. 3.1.11 Insert Überprüfung mittels Taq-PCR Tris –AS-Puffer (10x): 750 200 mM mM Tris-HCl, pH 8,8 (NH4)2SO4 41 0,1 mg/mL TweenR 20 Ansatz A 20µL: 2,0 1,0 0,5 0,5 0,63 1,0 14,37 µL µL µL µL µL µL µL Tris-AS Puffer 10x MgCl2; 50 mM Primer I; 10 pmol/µL Primer II; 10 pmol/µL dNTP;10mM (3.1.2) Template (aus Zellsuspension) H2O Mineralöl zum Überschichten Ansatz B 5µL: 1,0 µL Tris-AS Puffer 10x 3,5 µL H2O 0,5 µL Taq-Polymerase 603 Die Polymerase-Kettenreaktion oder PCR (engl.: polymerase chain reaction) dient zur spezifischen Amplifikation von DNA-Fragmenten (Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H., 1992). Dabei wurden die neuen Fragmente komplementär zum Matrizenstrang (Template) unter katalytischer Einwirkung einer DNA Polymerase synthetisiert. Außerdem benötigte man zwei kurze Oligonukleotide (Primer), die mit dem Template am 3‘-Ende des jeweiligen Strangs hybridisierten und somit die Grenzen des DNA-Fragments auf der Matrizen-DNA festlegten. Ausgehend vom Primer-Molekül synthetisierte die DNA-Polymerase einen komplementären Gegenstrang der Matrizen-DNA. Ein PCR-Zyklus setzt sich aus drei Teilschritten zusammen: Denaturierung, Hybridisierung (Annealing) und Elongation. Zunächst wurde die doppelsträngige Matrizen-DNA bei 94 °C denaturiert, woraufhin Einzelstränge für das weitere Vorgehen zur Verfügung standen. Um bei so einer hohen Temperatur eine Denaturierung der Polymerase zu verhindern, wurde die thermostabile Taq-Polymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus eingesetzt. Damit anschließend eine Hybridisierung der Primer mit dem Template erfolgen konnte, wurde die Reaktionstemperatur bis auf 4 °C unterhalb der Schmelztemperatur der Primer gesenkt. Während der Elongation erfolgte die Kettenverlängerung bei 72 °C. Diese Temperatur ist für die katalytische Aktivität der Taq-Polymerase optimal. Die PCR bestand aus etwa 30 Zyklen. Die Entstehung von PCR-Produkten lässt sich mit einem exponentiellen Zusammenhang beschreiben. 42 Es erfolgte die Amplifikation des spezifischen Sequenzabschnitts entsprechend der in Tab 3.2 und 3.3. angegebenen Parametern. Tab. 3.2: PCR-Programm X entsprach verwendeten s- und as-Primer. Temperatur 94°C 94°C X °C 72°C 72°C 4°C Tab. 3.3: . Zeit 5 min 30 s 30 s 1,5 min 7 min hold der spezifischen Annealingtemperatur für den Zyklen 30 Die Annealingtemperatur für das PCR-Programm. Alle Zahlen in °C Primer Sense Denaturierungstemp. Sense Annealingtemp. Antisense Antisense Denaturier- Annealingungstemp. temp. Mittelwert Annealingtemp. Keratin 23 Isoform A 74 64 65 55 59 Linker (Flag + TEV inkl.) 79 70 76 66 66 Protein A 68 58 68 58 58 3.1.12 Plasmidpräparation aus E. coli LBCB-Medium: 20 0,05 g/L LB-Broth mg/mL Carbenicillin Äquilibrierungspuffer: 100 mM Natriumacetat, pH 5,0 600 mM NaCl 0,15 % (v/v) Triton X-100 Suspensionspuffer: 50 mM Tris HCl, pH 8,0 10 mM EDTA 0,2 mg/mL RNase A Lysepuffer: 200 mM NaOH 1 % (w/v) SDS Neutralisationspuffer: 43 3,1 M Kaliumacetat, pH 5,5 Waschpuffer: 100 mM Natriumacetat, pH 5,0 800 mM NaCl Elutionspuffer: 100 mM Tris HCl, pH 8,5 1,25 M NaCl, pH 8,0 70 % (v/v) Ethanol Isopropanol Wurde in der selektierten Kolonie (Kap. 3.1.10) das gewünschte Insert mittels PCR bestätigt (Kap. 3.1.11), erfolgte die Aufreinigung der DNA mittels FastPlasmid® Mini Kit (Eppendorf). Hierfür wurden zunächst 5µL Bakteriensuspension in 50ml LB-Medium (mit 50µL CB) angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Inkubation erfolgte am nächsten Tag die Abzentrifugation der Kultur bei 3000 x g für 15 min bei RT mit anschließender Überstandentfernung. Als Erstes wurde die Säule mit 10 mL Äquilibrierungspuffer versetzt. Das gewonnene Zellpellet (50mL) wurde mit 4 mL Supensionspuffer vermischt und mit Lysepuffer (4 mL) versetzt. Anschließend wurde nach 5 min Inkubation bei RT der Neutralisationspuffer zugefügt. Nach Zentrifugation (3000 x g; RT; 10 min) erfolgte zur Aufreinigung von genomischer DNA die Abpipettierung des wässrigen Überstandes (mit Plasmid) und die Überführung in die mit Waschpuffer vorbehandelte Säule. Unter Gravitationskraft durchlief zunächst die Probe den Filter und es folgten die beiden Waschschritte mit je Waschpuffer 10 mL. Zur Trennung der Plasmid-DNA von der Säule wurde daraufhin Elutionspuffer (5 mL) zugefügt. Der Filter wurde verworfen und die Plasmid-DNA befand sich im Eluat. Das Eluat wurde für 30 min mit 3,5 mL Isopropanol präzipitiert. Unter Kühlung auf 4°C wurde die Plasmid-DNA dann bei 15.000 x g für 30 min abzentrifugiert. Der so gewonnene Überstand wurde verworfen und das Pellet zweimal mit 3 mL 70%igem Ethanol gewaschen (15.000 x g; 4°C; 5 min). Das Pellet wurde für 10 min bei RT getrocknet und abschließend in 150 µL H2O aufgenommen. Die Plasmid-DNA wurde bei -20°C gelagert. 44 3.1.13 Glycerindauerkulturen Nach der Transformation eines bestimmten Plasmids in E.coli wurde eine kleine Menge Bakteriensuspension in Form einer Dauerkultur konserviert. Diese Dauerkultur konnte jederzeit zur Gewinnung des Plasmids benutzt werden. Dazu wurden 500 µL Bakteriensuspension in einem Kryogefäß mit 500 µL Glycerin (99 % v/v) gemischt. Die Kulturen wurden bei - 70 °C eingefroren und konnten über längere Zeiträume gelagert werden. 3.1.14 Sequenzierung der PCR-Produkte Beckman-Coulter Quick-Start-Mix (Zusammensetzung nicht bekannt) Sequenzier-Mix: 50-100 fMol 10 pMol 4 µL ad 10 µL DNA Template Primer (Tab. 3.4) Quick-Start-Mix (Beckman Coulter) H2O “Stopplösung”-Mix: 2µL 3M 2µL 100mM 2µL 20mg/mL Natriumacetat EDTA Glykogen 70 Ethanol % (v/v) 30µL Tab. 3.4: Formamid Sequenzierprimer Primer Sequenz Orientierung KRT23 s 5´-TGAAC TCCGG ACACA GCTT -3´ Sense pBabe as 5´-TTCCA CACCC TAACT GAC-3´ Antisense TEV+Flag s 5´-TTGGA CTACA AGGAC GACGA TG -3´ Sense Prot A as 5´-CTAAT TCGCG TCTAC TTTCGG CG-3´ Antisense Nach der Klonierung wurde die komplette DNA-Sequenz des Inserts überprüft um mögliche Mutationen auszuschließen. Dies erfolgte über eine Sequenzierung, ein Verfahren, bei dem die Basensequenz der DNA bestimmt wird. Dazu wurde der gewünschte DNA-Abschnitt in zwei getrennten Ansätzen jeweils in 45 Sense und Antisense Richtung durch einen spezifischen Primer sequenziert. Neben den vier dNTPs wurden dem Reaktionsgemisch Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs) zugesetzt, die keine 3‘-OHGruppe tragen. Die ddNTPs wurden wie die anderen Desoxynukleotide in die DNA-Kette eingebaut, allerdings konnte die Kettenverlängerung aufgrund der fehlenden 3‘-OH-Gruppe nicht erfolgen. Die DNASynthese brach an dieser Stelle ab. Auf diese Weise erhielt man ein Gemisch mit unterschiedlich langen DNA-Fragmenten, die anschließend mittels Kapillarelektrophorese in einem Polyacryamidgel nach ihrer Länge aufgetrennt wurden. Durch eine Fluoreszenzmarkierung der vier ddNTPs mit unterschiedlichen Farbstoffen konnten die aufgetrennten Fragmente mit einem Laser detektiert und die Sequenz ermittelt werden. Der erste Schritt der Sequenzierung war der Denaturierungsschritt der Plasmid-DNA für 1 min bei 96°C und anschließende Abkühlung auf RT. Nach Hinzugabe der anderen Bestandteile des Sequenzier-Mixes und der DNA folgten 40 Wiederholungen mit erneuter Denaturierung bei 96°C für 20 sek, anschließender Abkühlung der Lösung auf 50°C für 20 sek und Amplifizierung für 4 min bei 60°C. Mit Hilfe des Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research) erfolgte die lineare Amplifikation nach dem Prinzip des Kettenabbruchs (Sanger et al. 1977). Nach 40 Wiederholungen erfolgte die Aufreinigung im Eppendorf-Reaktionsgefäß. Zuerst wurde die Sequenzierreaktion mit dem „Stopplösungs-Mix“ versetzt. Durch Glykogenzugabe wurde der Präzipitationseffekt verbessert. Nach Hinzugabe von 60 µL Ethanol (abs.) und Mischen der Lösung folgte die Zentrifugation (3.500 x g) der DNA für 25 min bei 4°C. Es wurde anschließend zweimal mit Ethanol (70 % (v/v)) gewaschen und jeweils 2 min bei RT abzentrifugiert. Nach dem Trocknen des Pallets im Brutschrank bei 37°C wurden die Sequenzierprodukte in 30 µL Formamid aufgenommen. Es folgte die Analyse mit dem CEQ8000 Sequenzierer (Beckman Coulter). Die Daten wurden mit der CEQ Analysis Software V.9.0 ausgewertet. Die Referenzsequenz stammte für das Keratin 23 Isoform A aus der NCBI-Datenbank, für TEV und Flag s sowie ProtA as aus dem pKRT23 von Liffers et al. und für pBabe as aus dem Datenblatt des Vektors pRAVflag (Knuesel et al. 2003). 46 3.2 Retroviraler Gentransfer 62µL 2M CaCl2 DNA: 12 12 6 12 µg µg µg µg pKRT23 pHIT 60 (gag/pol) pHIT G (VSV-G/env) MP71 vector (GFP tragend) green fluorescent protein Trypsin/EDTA, pH 7,4: 0,05 0,53 % (w/v) Trypsin mM EDTA Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4: 0,144 g/L 0,795 g/L 9 g/L KH2PO4 Na2HPO4 x 7H2O NaCl HEPESgepufferte Kochsalzlösung (HBS) 2x: 50 1,5 280 mM mM mM HEPES-NaOH, pH 7,0 Na2PO4 NaCl Kulturmedium für Kryokulturen: 25 % (v/v) 11 % (v/v) in DMEM fetales Kälberserum (FCS) Dimethylsulfoxid (DMSO) Um genetisches Material mit einer guten Effizienz stabil in eukaryontische Zellen einbringen zu können, werden Vektoren retroviralen Ursprungs verwendet (Cockrell AS, Kafri T., 2007). Retroviren besitzen ein einzelsträngiges (+)-RNAGenom, welches nach dem Eintritt in die Wirtszelle in DNA umgeschrieben wird und so als Provirus in das Wirtszellgenom integriert werden kann. Dies wird von einer im Viruspartikel enthaltenen Reversen Transkriptase katalysiert. Die verwendeten viralen Vektoren sind replikationsinkompetent, da ihnen genetische Informationen für Membranproteine oder regulatorische Sequenzen fehlen. Um dennoch infektiöse Partikel produzieren zu können, werden Verpackungszellen mit mehreren Vektoren kotransfiziert, die die für die Synthese notwendigen Gene sowie das Transgen getrennt enthalten. Meist wird ein System verwendet, welches aus zwei Hilfsvektoren 47 und dem Transgen kodierenden viralen Vektor besteht. Die Hilfsvektoren tragen die gag- und pol-Gene bzw. das env-Gen. Erstere kodieren für Proteine, die u. a. die reverse Transkription, die Integration des Provirus und die Partikelbildung vermitteln. Das env-Gen kodiert für ein Hüllprotein, über welches das Wirtsspektrum definiert wird. Ein häufig verwendetes Hüllprotein ist das Glykoprotein G des Vesicular Stomatitis Virus (VSV), da dieses für die Transfektion nahezu aller Zellarten genutzt werden kann. Während die auf den Hilfsvektoren kodierten viralen Proteine anhand der heterologen Promotoren kontrolliert werden, wird das Transgen von modifizierten long terminal repeats (LTRs) flankiert, welche nicht nur die Genexpression steuern, sondern auch für die Integration in das Genom der Wirtszelle von Bedeutung sind. Zellen, die mit allen Vektoren kotransfiziert wurden, produzieren Viruspartikel, in denen das Transgen als genomische RNA vorliegt. Nach der Transduktion von Zielzellen mit diesen Virionen integriert das Transgen in deren Genom. Aufgrund der fehlenden viralen Proteine können jedoch keine weiteren Viruspartikel produziert werden. Als erster Schritt wurden drei Zellkulturschalen mit 10 cm Durchmesser für die 293T Zellen vorbereitet. Ziel war es für den Tag der Transfektion die 293T Zellen mit einer Konfluenz von 50% für eine optimale Transfektionseffizienz zu erhalten. Hierfür wurden zunächst die Zellen via Trypsin/EDTA von der Zellkulturschale abgelöst, anschließend gezählt und gleichmäßig auf drei 10 cm Zellkulturschalen aufgeteilt. Als Vorbereitung zur Transfektion wurden entsprechend des Pipettierschemas (Tab 3.5) die Plasmide in H2O in einem Volumen 500 µL gelöst, 62 µL der CaCl2- Stammlösung hinzugefügt und abschließend zweifacher HBS-Puffer langsam zugefügt. Es folgte eine 10 minütige Inkubation bei RT. Tab. 3.5: Pipetierschema für Calciumtransfektion Plasmid Klon 3 Klon 8 pKRT23 pHit60 pHitG pMP71 X X X X X X GFP X X X Der folgende Schritt der Transfektion (Tag 0) erfolgte durch Zugabe des Gemisches in das Medium der drei 293T-Zellkulturschalen. Die resultierende Provirus-DNA, die das Transgen enthält, wurde in den Zellkern 48 transloziert und dort in das Wirtszellgenom integriert. Nach der Transfektion lagen gentechnisch veränderte Organismen der Sicherheitsstufe 2 vor. Es folgte eine 16stündige Inkubation bei 32°C und 5% CO2. Am Tag 1 erfolgte ein Mediumwechsel der transfizierten 293 T-Zellen. Abb. 3.6: Schema der Ca-Transfektion mittels pHit60 (gag/pol), pHitG (VSV-G, env) und pKRT23 (Gesamtkonstruktplasmid) gag steht für core (Kernprotein), pol steht für Reverse Transkriptase (Lese- und Schreibpolymerase), env steht für envelope (Hüllprotein) VSV-G steht für coat (Hüllprotein) (modifziert nach http://www.stanford.edu/group/nolan/tutorials/ images/proteins.jpg) Am selben Tag wurde ein 6er-Well (3,5cm Durchmesser) vorbereitet, in dem die oberen 3 Wells mit den Zellen der Smad4 negativen Kolonkarzinomzelllinie SW480 und die unteren Wells mit den Smad4 positiven SW480 Zellen vorbereitet wurden. Nach Zellzählung konnte am Folgetag (Tag 2) eine 50%ige Konfluenz der Zielzellen erreicht werden. Am Tag 3 erfolgte zunächst die Abnahme des Virusüberstandes von den 293T Zellen. Anschließend wurden die Zellen wieder mit Medium versetzt (zur erneuten Überstandgewinnung am Tag 4). Es folgte eine Überprüfung des Transfektionserfolges mittels fluoreszenzmikroskopischer Abschätzung der Anzahl an GFP positiven 293T Zellen (Abb.3.7). 49 . Abb. 3.7: Transfektionskontrolle 3 Tage nach Ca-Transfektion mit MP71 vector, der das green fluorescent protein trägt in Smad4-neg. und Smad4 pos. SW480 Zellen. A zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen der Smad4 neg. Zellen. B zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen der Smad4 pos. Zellen. C zeigt fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der der Smad4 neg. Zellen. D zeigt fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Smad4 pos. Zellen. Zur Trennung der eukaryonten Zellen von den Viren erfolgte eine Sterilfiltration. So konnten die kleinen Viruspartikel durch den Filter in Lösung gehen. Da die Viren nur kurz überlebensfähig waren, erfolgte am Tag 3 die Transduktion der Zielzellen SW480 Smad4 pos. und Smad4 neg.. Das HBS-Medium des 6er-Wells wurde abgesaugt, die adhärenten Zellen mit PBS gewaschen und abschließend je 2,5 mL des virushaltigen Überstandes aus den 293T Zellen auf das 6er-Well SW480 überführt und inkubiert (32°C, 5% CO2). Dieser Vorgang wurde am Tag 4 mit dem Überstand der 293T Zellen wiederholt. Anschließend wurden die 293T-Zellen inaktiviert. Abschließend wurden die gewonnenen Klone nach 3 Tagen in neue Kulturschalen (Ø 14,5 cm) umgesetzt, bis zu einer Konfluenz von 80 % angezogen und als Kryokultur, nach Resuspension der Zellen in Einfriermedium, bei -80°C gelagert. Da die transduzierten SW480-Zellen das Antibiotikaresistenzgen enthielten, konnten 50 durch Hinzugabe von Carbenicillin die transgenen Zellen selektioniert werden. Den GFP transduzierten Zellen wurde das Antibiotikum ebenfalls zugesetzt, um die erfolgreiche Selektion zu dokumentieren. 3.3 Zellbiologische Arbeiten 3.3.1 Zellkultur Dulbbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM): 264,00 0,10 400,00 200,00 6400,00 3700,00 125,00 4500,00 15,00 84,00 48,00 580,00 30,00 42,00 105,00 105,00 146,00 30,00 66,00 42,00 95,00 16,00 72,00 94,00 4,00 4,00 4,00 7,20 4,00 4,00 0,40 4,00 mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L CaCl2 x 2H2O Fe(NO3)3 x 9H2O KCl MgSO4 x 7H2O NaCl NaHCO3 NaH2PO4 x 2H2O D-Glukose Phenolrot L-Arginin x HCl L-Cystein L-Glutamin Glycin L-Histidin HCl x H2O L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin x HCl L-Methionin L-Phenylalanin L-Serin L-Threonin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin D-Ca Pantothenat Cholinchlorid Folsäure i-Inositol Nikotinamid Pyridoxal HCl Riboflavin Thiamin HCL 51 Zellkulturmedium: 50 0,3 1 10 0,2 in DMEM U/mL mg/mL mM % (v/v) mg/mL Penicilin/Streptomycin L-Glutamin Natrium-Pyruvat fötales Kälberserum (FCS) Geneticin (G418) Trypsin/EDTA, pH 7,4: 0,05 0,53 % (w/v) Trypsin mM EDTA Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4: 0,144 0,795 9 g/L g/L g/L KH2PO4 Na2HPO4 x 7H2O NaCl Die optimalen Wachstumsbedingungen für die SW480 Kolonkarzinomzelllinien waren bei 10 % CO2 und einer Temperatur von 37°C. Da die Zellen sich rasch vermehrten, war eine Verdünnung auf 1/10 der Ausgangszellen der konfluenten Zellen alle 3 Tage notwendig. Analog zu den 293T-Zellen wurde zunächst das Medium von der Platte abgesaugt, anschließend mit Trypsin/EDTA bei 37°C inkubiert bis sich die Zellen gelöst hatten. Durch einen Waschschritt mit PBS-Puffer wurden Zelltrümmer und Mediumreste entfernt. Durch Hinzugabe von FCS-haltigem Medium wurde nach ca. fünf Minuten bei 37°C Inkubation die enzymatische Reaktion des Trypsins gestoppt und durch eine Zentrifugation (1500 x g; RT; 3 min) der Überstandes vom zellreichen Pellet abgekippt. Die Zellen wurden mit frischem Medium vermischt und anschließend 3 min bei 1500 rpm und RT zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet in neuem Medium gelöst. Die Zellen wurden auf ein neues 14,5 cm Well ausplattiert. 3.3.2 Zelllyse Lysepuffer RIPA: 50 150 1 mM mM mM Tris-Acetat, pH 7,4 NaCl EDTA 52 15 1 1 % (w/v) Glycerin % (v/v) Triton X-100 % (v/v) Na-Deoxycholate 0,1 % (v/v) SDS Proteaseinhibitor: 50 2 5 2 25 5 mM mM µg/mL µM µg/mL µM NaF NaVO4 Aprotinin Bestatin Leupeptin Pepstatin A Zur „Verlangsamung“ der Proteasen wurden die Zellen auf Eis lysiert. Verwendet wurde der o.g. Lysepuffer (1mL) mit 40µL Proteaseinhibitor nach vorherigem Absaugen des Mediums und Waschen der Zellen mit PBS-Puffer. Die Zellen wurden von der Kulturschale gelöst, mit der Pipette aufgenommen und in ein vorgekühltes 1,5 mL Eppendorfreagenzgefäß überführt. Es folgte die 30-minütige Inkubation auf Eis. Anschließend erfolgte bei 13200 rpm unter Kühlung auf 4°C die Zentrifugation für 15 Minuten. Der Überstand wurde weiter verarbeitet, während das Pellet eingefroren wurde. 3.3.3 Proteinmengenbestimmung mittels Coomassie-Brillant-Blau G-250 (Bradford-Verfahren) Bradfordlösung (Zusammensetzung nicht bekannt) Probelösung: 1 1 mL µL Bradfordlösung Zellüberstand nach Lyse Der Triphenylmethanfarbstoff Coomassie-Brillant-Blau G-250 hat ungebunden ein Absorptionsspektrum von 460 nm und bildet einen roten Farbstoff. Durch Bindung mit Proteinen geht der Farbstoff in seine unprotonierte, anionische Sulfonatform über und das Absorptionsmaximum verschiebt sich auf 595 nm. Da der Extinktionskoeffizient des Farbstoff-Protein-Komplexes in seiner gebundenen Form sehr viel höher ist, kann die Zunahme der Absorption bei 595 nm durch die Bildung 53 des Komplexes mit hoher Empfindlichkeit gegen das freie Farbreagens photometrisch gemessen werden und ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung (Bradford, M.M. ,1976). Zur genauen Proteinbestimmung wurde das Eppendorf Bio Photometer verwendet. Es erfolgte die Nulleichung mit Bradfordlösung ohne Protein. Zunächst wurde die Bradfordlösung mit der Proteinprobe vermischt und anschließend in eine UVette überführt. Dann wurde der Extinktionskoeffizient E595 gemessen und die Konzentration entsprechend des Extinktionskoeffizient berechnet. 3.4 Proteinchemische Arbeiten 3.4.1 Tandem-Affinitäts-Aufreinigung Essigsäure: 500 5 mM mM CH3COOH, pH 3,4 NH4Ac; zum pH einstellen Lysepuffer: 50 150 1 2 mM mM mM % (v/v) Tris-Acetat, pH 7,4 NaCl EDTA Triton X-100 Proteaseinhibitoren I: 50 2 1 mM mM Tab Waschpuffer: 50 mM 150 mM 1 mM 1 mM 2 % (v/v) NaF NaVO4 Roche mini complete auf 50 mL Tris-Acetat, pH 7,4 NaCl EDTA DTT Triton X-100 Proteaseinhibitoren II: 50 mM NaF 2 mM NaVO4 5 µg/mL Aprotinin 2 µM Bestatin 25 µg/mL Leupeptin 5 µM Pepstatin A 54 SDS-Elutions-Puffer (2x): 125 4 20 mM Tris, pH 6,8 % (w/v) SDS % (w/v) Glycerin In Analogie zu 3.3.2 wurden die Zellen lysiert (hier Verzicht auf Na-Deoxycholate). Um Zelltrümmer zu beseitigen, erfolgte zunächst ein dreimaliger Waschschritt mit PBS-Puffer. Vorab wurden die Zellen auf 4°C gelagert und das Medium abgesaugt. Es folgte die Zugabe des Lysepuffers und 30 min Inkubation auf Eis. Nach Ablauf der Inkubation wurden die Lysate bei 1000 x g für 10 Min. bei 4°C geklärt. Dieser Waschschritt erfolgte 2 Mal. Zwischenzeitlich wurden die IgG-Beads mit Lysepuffer, einmalig mit 0,5 M Essigsäure sowie anschließend erneut mit Lysepuffer gereinigt. Es folgte der Vereinigungsschritt der geklärten Lysate mit den IgG-Beads bei 4°C im Überkopfschüttler für 1 Stunde. Im nächsten Schritt wurden die mit dem Köderprotein gebundenen IgG-Beads bei 50 xg für 2 min zunächst abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die gebundenen Beads mehrfach mit Waschpuffer gereinigt. Im Anschluss erfolgte die Überführung der gebundenen Beads in Elutionssäulen. Um die schweren IgG-Beads von dem Köderprotein zu lösen, wurde im folgenden Schritt die TEV-Spaltung durchgeführt. Hierfür wurden 100 U in Waschpuffer gelöst und über die Elutionsäulen geführt, für 30 Min bei RT inkubiert. Zur maximalen Ausbeute des an der TEV-Stelle gespaltenen Köderproteins wurde der Durchlauf 3x über die Elutionssäulen geführt. Zwischenzeitlich wurden die Flag-Beads mit Waschpuffer und 0,1 M Glycin (pH 3,5) gewaschen, auf neue Elutionsäulen überführt und für die Vereinigung mit dem TEVEluat vorbereitet. Diese Vereinigung erfolgte für eine Stunde im Überkopfschüttler bei 4°C. Es folgte drei Mal ein erneuter Waschschritt um alle nicht gebundenen Proteine aus der Elutionssäule durch zu entfernen (500 µL, 100 xg, 30 sek, 4°C). Letztlich wurden die Beads aus der Elutionssäule durch Hinzugabe von 2x SDSElutionspuffer gelöst (3 Min, RT). 55 3.4.2 Polyacrylamidgele für Western-Blot-Analysen SDS-Laufpuffer: 25 192 0,1 mM Tris HCl, pH 7,4 mM Glycin % (w/v) SDS Trenngel (10% PAA): 1,9 ml 1,7 ml 1,3 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,002 ml H2O % (w/v) Polyacrylamid (PAA) M Tris HCl, pH 8,8 % (w/v) SDS 10 % (w/v) APS TEMED 30 1,5 10 Sammelgel (5% PAA): 3,4 ml 0,83 ml 0,63 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,005 ml 0,05 ml 30 1,5 % (w/v) M 10 10 H2O Polyacrylamid (PAA) Tris HCl, pH 8,8 % (w/v) SDS % (w/v) APS TEMED Bromphenolblau SDS-Probenpuffer 125 50 4 20 mM mM % (w/v) % (w/v) Tris, pH 6,8 DTT SDS Glycerin Pyronin Y Nachdem die Western-Blot Probe mit SDS-Probenpuffer für 5 Min bei 95 ° C gekocht wurde, konnte sie auf das Western-Blot-Gel aufgetragen werden. Vorab wurden 2 Glasplatten in einem Western-Blot Ständer eingespannt und nach unten sowie zu beiden Seiten abgedichtet. Die Gele wurden in einem Gelgießstand von Biorad hergestellt. Die Poren des Polyacrylamidgels hatten einen definierten Durchmesser, der von der Acrylamidkonzentration abhing. Die diskontinuierliche SDS-Page wurde verwendet um eine höhere Auflösung zu erreichen. Bei dieser wurden zwei Gelbereiche mit unterschiedlichen Porendurchmessern eingesetzt: Im weitporigen Sammelgel war die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine aufgrund des geringen Siebeffekts hoch. An der Grenze zwischen Sammel- und Trenngel wurden die Proteine jedoch 56 abgebremst, sodass sie sich in diesem Bereich konzentrierten und in sehr dünnen Banden in das Trenngel eintraten. Der Effekt konnte durch pH-Wert-Unterschiede in den verwendeten Puffern verstärkt werden. Die Trennung der Proteine erfolgte in einem 12%- oder 10%igen Trenngel, das Sammelgel wies 5 % auf. Nach obigem Schema wurden je 5 ml Trenngel und Sammelgel vorbereitet und über eine Pasteurpipette in den vorgesehenen Spalt eingefüllt. Hier wurde zunächst das Trenngel bis zu einer Markierung gefüllt und mit Isopropanol bis zur Kante aufgefüllt. Isopropanol diente hier als Platzhalter für das dann folgende Sammelgel. War das Trenngel abgekühlt und auspolymerisiert, wurde das Isopropanol aus der Kammer abgegossen und mit zubereitetem Sammelgel gefüllt. Solange das Sammelgel noch nicht auspolymerisiert war, wurde ein Kamm in den Spalt eingefügt um die Probetaschen zu formen. Eine weitere Probetasche wurde mit einem Proteinmarker gefüllt. Die Probetaschen hatten ein Füllungsvolumen von 20 µL. Da die Beweglichkeit der Moleküle im elektrischen Feld proportional zum Verhältnis von Ladung zu Masse war, wurde bei der SDS-Page das anionische Detergenz SDS zugesetzt. Es band alle Proteine im selben Verhältnis, sodass deren Eigenladung durch die negative Ladung des SDS maskiert wurde. Daher wurde die Beweglichkeit der Moleküle bei der Gelelektrophorese nur durch Molekularsiebeffekte, welche aufgrund der Poren der Gelmatrix auftraten, beeinflusst. Die Trennung der Proteine erfolgte demnach nur nach der Größe. 3.4.3 Übertragen der Proteinbanden auf PVDF-Membran Transferpuffer: 25 150 10 mM mM % (v/v) Tris-HCl, pH 8,3 Glycin Methanol Der Western Blot ist eine Methode zum Transfer von Proteinen aus einem Polyacrylamidgel auf eine Trägermembran unter Anlegen eines elektrischen Feldes. Als Trägermaterial kann Nitrocellulose oder Polyvinylidenfluorid (PVDF) verwendet werden. Da die Proteine nach der SDS-Page negativ geladen sind, wandern sie im elektrischen Feld Richtung Anode, sodass eine auf der Anodenseite platzierte Membran eine Immobilisierung der Proteine ermöglicht. Anschließend können die auf die Membran transferierten Proteine durch Kopplung mit spezifischen Antikörpern 57 nachgewiesen werden (Hall RA, 2004). Zunächst wurden 2 zurechtgeschnittene Whatmanplatten in Transferpuffer getaucht. Zur Erhöhung der Hydrophilie wurde anschließend die Membran für 1 min in Methanol getaucht und anschließend in Transferpuffer belassen. Anschließend erfolgte eine 4-lagige Schichtung auf der Anode nach folgender Reihenfolge: Whatmanpapier, Membran (vorher rechts unten mit X markiert), anschließend das SDS-Gel, welches wiederum von einem Blatt Whatmanpapier abgedeckt wurde. Vor der Abdeckung mit dem Whatmanpapier wurden noch die Proteinbandenmarkierungen des Gels auf die Membran übertragen (hier mit Nadelstichmarkierungen). Für 10 min erfolgte der 308 mA/Membran. Abb. 3.8: Schematische Darstellung des Blotsandwich. 3.4.4 Immunologische Färbung der PVDF-Membran Trisgepufferte Kochsalzlösung mit 0,05% Tween (TBST): 50 150 0,05 mM Tris, pH 7,4 mM NaCl % (v/v) Tween 20 Blockpuffer: 5 % (w/v) Milchpulver in TBST ECL-Reagenz 58 Proteintransfer bei Abb. 3.9: Erst- und Zweitantikörperbindung mit Peroxidase-katalysierter Oxidation des Luminol und folgender Lichtemission (Quelle: http://www.gelifesciences.com/Images/ps/figure1t.gif) Die mittels eines Western Blots auf eine Membran transferierten Proteine konnten immunologisch über die Bindung von Antikörpern nachgewiesen werden. Durch die Verwendung eines Antikörpers, der ein Epitop des entsprechenden Proteins erkannte, konnten kleinste Mengen spezifisch nachgewiesen werden. Dieser so genannte Primärantikörper wurde über einen Sekundärantikörper nachgewiesen, der an Immunglobuline der Spezies band, aus der der Primärantikörper gewonnen wurde. Um diesen Proteinkomplex detektieren zu können, wurde der Sekundärantikörper markiert. So konnte er an Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) gekoppelt werden, die unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid Luminol, ein zyklisches Diacylhydrazid, oxidierte. Das entstehende 3-Aminophthalat befand sich in einem angeregten Zustand. Die Abgabe der überschüssigen Energie erfolgte als Chemilumineszenz, welche mit Röntgenfilmen detektiert werden konnte. Durch Verstärkersubstanzen wie Phenole wurde die Dauer der Lichtemission verlängert (enhanced chemiluminescence). Um Hintergrundsignale durch unspezifische AK-Bindungen auf der Roti®-PVDFMembran der Fa. Roth zu minimieren, wurde diese zunächst über Nacht bei 4°C geblockt. Anschließend wurde am Folgetag zunächst die Pufferlösung entfernt. Es folgten Waschschritte mit TBST sowie das Auftragen des ersten monoklonalen Antikörpers anti-Flag M2 (Maus) in einer Verdünnung von 1:1000 der Fa. Sigma (1 h, RT, Schüttler). Es folgten drei Waschschritte um überschüssige Antikörper vor der Zugabe des sekundären Antikörpers von der Membran zu entfernen. Es folgte analog zum ersten AK-Schritt das Auftragen des zweiten Antikörpers (anti-Maus/HRP in einer 59 Verdünnung von 1:2500 der Fa. Santa Cruz) in Waschpuffer gelösten Antikörpers. Nach einer Stunde Einwirkzeit wurden die Waschschritte drei mal wiederholt. Das ECL-Reagenz wurde zugesetzt. Die am zweiten AK gebundene Peroxidase katalysierte die Oxidation des Luminols. Somit kam es an den Stellen an denen der AK gebunden hatte zu einer Lichtemission, die bandenspezifisch war. Die Signalstärke wiederum und damit umgekehrt proportional die Belichtungszeit hing von der Konzentration der Proteinbanden und der Bindung der Antikörper ab. 3.4.5 Silberfärbung nach Blum et al. (1987) Fixierung: 40 10 % (v/v) Ethanol p.a. % (v/v) Essigsäure Inkubation: 0,8 mM Natriumthiosulfat Färbung: 6 mM Silbernitrat Entwickler: 283 0,05 mM Natriumcarbonat % (v/v) Formaldehyd Stop-Lösung: 5 % (v/v) Essigsäure Das Prinzip der Silberfärbung ist die Komplexbildung der Ag+-Ionen mit den Glutamin-, Asparagin- und Cysteinresten der Proteine (Rehm 2002). Die Detektion folgt durch reduzierende Agenzien, welche die Reaktion der Ag+-Ionen zu metallischem Silber bewirken. Analog zu Tab 3.6 wurden die einzelnen Wasch- und Inkubationsschritte durchgeführt. Das Gel wurde nach der SDS-Page 1 h mit der Fixierlösung [40% (v/v) Ethanol, 10% (v/v) Essigsäure, 50 % (v/v) Aqua dest] inkubiert und anschließend 2 x 20 min mit 40%igem Ethanol (v/v) gewaschen. Nach 20 min Waschschritt mit Millipore Wasser 60 erfolgte die 1 min Inkubation mit 0,8 mM Natriumthiosulfat. Nach dreimaligem Waschschritt für je 30 sek erfolgte die Färbung mit 6 mM Silbernitrat für 20 min. Nach erneutem Waschen (3x30 sek) erfolgte das Auftragen der Entwicklerlösung [283 mM Natriumcarbonat, 0,05 % (v/v) Formaldehyd} bis die Proteinbanden gut sichtbar waren. Nach erneutem Waschschritt für 20 sek wurde die Reaktion mittels 5%iger (v/v) Essigsäure gestoppt (5 min). Tab. 3.6: Potokoll einer Proteinsilberfärbung nach Blum et al. (1987). Lösung Inkubationsdauer L/Gel Fixerer Ethanol Millipore Wasser Inkubation Waschen Färbung Waschen Entwickler Waschen Stopplösung 60 min 2 x 20 min 20 min 1 min 3 x 30 sek 20 min 3 x 30 sek bis Proteinmuster gut sichtbar 20 sek ca. 5 min 0,5 0,5 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 61 4. Ergebnisse 4.1. Etablierung des C-terminal Aufreinigungs-Konstruktes getaggten Tandem-Affinitäts- Ausgehend vom KRT23-TAP-Vektor von Liffers et al., bei dem KRT23-Köderprotein N-terminal getaggt vorlag, wurden für den in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Tandem-Affinitäts-Aufreinigungsversuch die Affinitätstags Protein A und Flag C-terminal an KRT23 angehängt (siehe Abb. 3.4). Analog zu Liffers Studie wurde das Protein A als erster Affinitätstag gewählt. Der zweite Affinitätstag war das Flag-Tag. Die beiden Tags waren durch zwei hintereinander liegende spezifische Schnittstellen für das TabakmosaikvirusProtease (TEV) verbunden. Somit konnte durch Einsatz der Protease spezifisch das Protein A abgespalten werden. Im ersten Schritt der Klonierung wurde das KRT23-PCR-Produkt sowie der Vektor pBabepuro mittels Restriktionsendonukleaseverdau für die nachfolgende Ligation der KRT23-Sequenz in den pBabepuro Vektor vorbereitet (nachfolgend pKRT23). Abb. 4.1.A zeigt die DNA-Fragmente der genannten Komponenten, die für die Gelreinigung verwendet wurden. Im zweiten Schritt wurde das mittels PCR gewonnene Flag-TEV-Produkt sowie der Vektor pKRT23 mittels Restriktionsendonukleaseverdau für die nachfolgende Ligation des Flag-TEV-Fragments in den pKRT23 Vektor vorbereitet (nachfolgend pKRT23-FlagTEV). Abb. 4.1.B zeigt die DNA-Fragmente der genannten Komponenten, die für die Gelreinigung verwendet wurden. Im dritten Schritt wurde das Protein-A-Produkt sowie der Vektor pKRT23-FlagTEV mittels Restriktionsendonukleaseverdau für die nachfolgende Ligation der Protein AFragmente in den pKRT23-FlagTEV Vektor vorbereitet (nachfolgend pKRT23FlagTEVProtA). Abb. 4.1.C zeigt die DNA-Fragmente der genannten Komponenten, die für die Gelreinigung verwendet wurden. 62 Abb. 4.1: (A) Erste Restriktion von KRT23 (I) und pBabepuro (II) (B) Zweite Restriktion von pKRT23 (I und II) und Flag+TEV (III und IV), (C) Dritte Restriktion von Prot A (I) mit pKRT23FlagTEV (II) (L=Ladder) Sämtliche Klonierungsschritte wurden per direkter Bakterien-PCR überprüft. In Abb. 4.2 wurde exemplarisch die direkte Bakterien-PCR nach dem dritten Klonierungsschritt dargestellt. Abb. 4.2: Direkte Bakterien-Kolonien-PCR zur Insertüberprüfung. U.a. wurden die Klone 3, 8, 13, 16, 19 und 23 dabei als positiv, d.h. Plasmid-enthaltend, identifiziert. Diese sechs Kolonien wurden für die weiteren Schritte verwendet. Aufgrund fehlender Alternativen musste im dritten Klonierungsschritt eine ungerichtete Klonierung mit SalI erfolgen. Mittels Sequenzierung wurde im Anschluss an die Überprüfung mit der direkten Bakterien-PCR zwischen den beiden Varianten unterschieden, die aufgrund der ungerichteten Klonierungsstrategie entstehen konnten (Prot A Insert in Sense-Leserichtung und Prot A Insert in Antisense- Leserichtung). Nur die erste Variante wurde für die Tandem-Affinitätsaufreinigung verwendet. 4.2. GFP-Infektionskontrolle der SW480 Zellen Nach erfolgter Herstellung retroviraler Virionen zur Übertragung des KRT23-TAP63 Transgens auf die Zielzellen, wurden entsprechend des Protokolls (siehe Kap. 3.2) die SW480 Smad4 neg. und Smad4 pos. Zellen transduziert und mittels Puromycin erfolgreich transduzierte Zellen selektioniert. Als Kontrolle für die Transduktionseffizienz wurde ein GFP-Plasmid ohne Puromycin Genkassette parallel transduziert. Mit dem GFP-Kontrollvirus konnte indirekt anhand der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen auf die erfolgreiche Infektion der Zielzellen geschlossen werden. Da in der Arbeit untersucht werden sollte, ob die KRT23-Interaktionspartner nicht nur von der Position des Tags sondern auch von der Smad4-Expression abhängig sind, wurden sowohl Smad4 pos. als auch Smad4 neg. Zelllinien in der Transduktion eingesetzt. In der Kontrolle wurde statt pKRT23-FlagTEVProtA der GFP-Vektor pMP71 verwendet. Abb. 4.3. zeigt, dass sowohl die Smad4 pos. wie auch Smad4 neg. Zelllinie in über 80 % infiziert wurde. Abb. 4.3: SW480 Zellen nach Infektion. A + C zeigen die Smad4 neg. Zellen, B + D die Smad4 pos. Zellen. A + B zeigen lichtmikroskopische Aufnahmen der Zellen. B + D zeigen fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen. Man erkennt die Verteilung der GFP Expression in den SW480-Zelllinien. 64 Da mittels des Kontrollvektors der Erfolg der pKRT23-TAP Transduktion indirekt nachgewiesen wurde, wurden die SW480-Zellen mit Puromycin behandelt. Nach Abschluss der Selektion lagen konstitutiv TAP-Tag-Keratin 23 exprimierende SW480 Zellen vor. 4.3. Tandem-Affinitäts-Aufreinigung mit KRT23 Köderproteinen Mit Hilfe des Flag-Tags wurde zum einen die erfolgreiche Expression des KRT23Köderproteins überprüft. Zum anderen wurden damit die Schritte der TAPAffinitätsreinigung kontrolliert. Es wurden sowohl SW480 Smad4 negative (Abb. 4.4.A) als auch SW480 Smad4 positive Zellen (Abb. 4.4.B) untersucht. Wie in Abb. 4.4 A+B Lane I zu sehen ist, konnte KRT23-TAP erfolgreich exprimiert werden. Der erste Schritt der Affinitätsaufreinigung, die Bindung von KRT23-TAP an die IgG-Sepharose via Protein A ist in Lane II dargestellt. Lane III zeigt das Eluat der IgG-Sepharose ohne Köderprotein als Negativkontrolle. Nachdem die TEV-Protease die IgG-Beads vom Keratin-Flag-Protein abgespalten hatte, zeigte sich in Lane IV kein Nachweis mehr von Keratin, was einer vollständigen Spaltung der TEV-Protease entspricht (Eluat der Sepharose nach TEV-Spaltung als Negativkontrolle). Im Anschluss erfolgte die Bindung des Keratin-Flag-Proteins an Flag-Beads. Lane V zeigt die Negativkontrolle des verbliebenen TEV-Eluates. Das bedeutet, dass das KRT23-Flag Protein vollständig an der Flag-Agarose gebunden hatte. Lane VI zeigt das Flag-getaggte KRT23 im Eluat nach TEV-Spaltung. Das Tabak-Mosaik-VirusEnzym schneidet spezifisch an der TEV-Schnittstelle. Hierdurch wurde das Protein A mit seinen unspezifischen Bindungen von der KRT23-Flag-Bindungsstelle gespalten. Folglich zeigt sich, dass das Protein das erwartete Molekulargewicht von weniger als 68 kD aufweist. Lane VII zeigt den Versuch, das Köderprotein von der FlagSepharose durch Zugabe von H2O zu lösen. Dies gelang erwartungsgemäß nicht (Negativkontrolle). Erst nach Hinzugabe von 2x SDS-Puffer lösen sich die FlagBeads vollständig vom KRT23-Köderprotein und dieses ist nun im Eluat in Lane VIII nachweisbar (Positivkontrolle). 65 Abb. 4.4: SDS-Page-Analyse zur Überprüfung der TAP-Schritte. Indirekter Nachweis von Keratin 23 mittels anti-Flag-Antikörper. In Abb. 4.4 A wurde das Lysat der SW480 Smad4 negativen Zelllinie aufgetragen, In Abb. 4.4 B wurde das Lysat der SW480 Smad4 positiven Zelllinie. Zuordnung der verschiedenen Spuren I-IX siehe Tab 4.1. Tab. 4.1: TAP-Analyse Proben zu Abb. 4.4 LaneNummer M I II III IV V VI VII VIII Lane Proteinmarker in kD Gesamtzelllysat (Positivkontrolle, TAP-Tag-KRT23 bei ~68 kD) Eluat des an Sepharose gebundenen KRT23-Köderproteins Negativkontrolle (Eluat der Sepharose ohne KRT23-Köderprotein) Negativkontrolle (Eluat der Sepharose nach TEV-Spaltung) Negativkontrolle (TEV-Durchfluss nach Flag-Beads-Bindung) Eluat nach TEV-Spaltung Negativkontrolle (Flag-Eluat in H2O gelöst) Flageluat in SDS gelöst 66 4.4. Nachweis der KRT23-Interaktionspartner und Vergleich der Interaktionspartner in Abhängigkeit von der Tag-Position (Nterminal bzw. C-terminal) Nach erfolgreicher TAP wurde die SDS-Page zum sensitiven Nachweis der potentiellen Interaktionspartner silber gefärbt (siehe Kap. 3.4.5). In Abb. 4.5.A sind die in der durchgeführten TAP Reinigung identifizierten Proteine nach SDS-Page gezeigt. Im Vergleich dazu zeigt Abb. 4.5.B das Ergebnis der TAP Reinigung von Liffers et al. (Liffers et al, 2011), in der das Affinitäts-Tag am N-Terminus lokalisiert war. Wie zu erkennen ist, wurden in beiden Analysen dieselben Interaktionspartner identifiziert. So unterscheidet sich die Smad4-positive Zelllinie (Lane I in Abb. 4.5 A+B) von der Smad4-negativen Zelllinie (Lane II in Abb. 4.5 A+B) durch zwei zusätzliche Banden (Banden 7 und 8) zwischen ~20 kD und ~25 kD. Die beiden zusätzlich nachweisbaren Proteine sind 14-3-3 Isoform γ und 14-3-3 Isoform ε. Das Silberfärbungsergebnis zeigt ferner in beiden Analysen 7 weitere Smad4unabhängige Banden, die durch Liffers et al. mittels nanoLC-ESI-MS/MS identifiziert wurden. Es handelt sich um das Keratin 23 Isoform A, die Keratine 8 and 18, die Hitzeschock Proteine 60 und 70, die leichte Kette des IgG sowie Plectin 1 Isoform 11. Tab. 4.2 gibt die Liste der über Tandem-Affinitätsaufreinigung ko-immunpräzipitierten Proteine und via Massenspektrometrie von Liffers et al. identifizierten Proteine wieder. Aufgrund der hohen Übereinstimmung im Molekulargewicht sowie auch der Ausprägung der Banden ist anzunehmen, dass mit dem C-terminal getaggten sowie N-terminal getaggten KRT23-Köderprotein die gleichen Proteine als Interaktionspartner nachweisbar sind. Dies trifft sowohl für die Interaktionspartner in Smad4 pos. als auch in Smad4 neg. Zelllinien zu. Deshalb erschien eine erneute massenspektrometrische Untersuchung nicht sinnvoll und wurde daher nicht durchgeführt. 67 Abb. 4.5 A +B: A. Silberfärbung der mittels Tandem-Affinitätsaufreinigung gewonnenen C-terminalgetaggten Proteine nach gelelektrophoretischer Aufreinigung. Lane 1 zeigt die SW480 Smad4 pos. Zelllinie. Lane II zeigt die SW480 Smad4 neg. Zelllinie. Lane III zeigt den Proteinmarker (in kD). Die Zahlen auf der linken Seite entsprechen den Banden in Tab. 4.2 mit den identifizierten Proteinen B. Komplexzusammensetzung der Interaktionspartner des N-terminal-getaggten Keratin 23 nach TAP von Liffers et al. 1. SW480 Smad4 positive und 2. Smad4 negative Zelllinien. Die Zahlen auf der rechten Seite entsprechen den Banden in Tab. 4.2 mit den identifizierten Proteinen Die Trennung erfolgte bei beiden Gelen über eine 4-12% SDS-Page. Die Proteine wurden über Silberfärbung visualisiert. Tab. 4.2: Zusammenfassung der nanoLC-ESI-MS/MS-Auswertung von Liffers et al. der über die Tandem-Affinitäts-Aufreinigung ko-immunpräzipitierten Proteine. Bande 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Protein ID Plectin1 Isoform 11 HSP 70 Protein 8 Isoform 1 Chaperonin 60 Keratin 8 Keratin 23 Isoform A Keratin 18 14-3-3 Isoform ε 14-3-3 Isoform γ IgG; leichte Kette 68 5 Diskussion Die Funktion eines Proteins kann indirekt durch den Nachweis seiner Interaktionspartner aufgeschlüsselt werden. Sie hängen u.a. von Tertiärstrukturen der Proteine und der Wechselwirkungen ihrer Domänen ab. Die Proteinforschung ist wesentlich komplexer als die Genforschung. Während es sich bei einer DNA um eine eindimensionale Informationskette handelt, die auch posttranskriptional verändert wird, werden Proteine in die Sekundärstruktur gefaltet oder gehelixt und ordnen sich abhängig von Ladungen, Schwefelbrücken und Ionenmilieu zu der 3-D-Tertiärstruktur mit funktionellen Gruppen. Es ist also nicht ausreichend nur eine Aminosäurekette zu analysieren, sondern das gefaltete, dynamische dreidimensionale Protein. Gelegentlich liegt sogar die quartäre Struktur vor, wenn Proteine, wie bei Antikörpern oder dem Hämoglobin, eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung eingehen, was die Interaktionsanalyse weiter verkomplizieren kann. Die Analyse kann noch komplexer werden, wenn das zu untersuchende Protein zusätzlich zu seiner Proteinfaltung auch posttranlationale Proteinmodifikationen aufweist, die in der DNAMatrize nicht kodiert sind. Um natürliche Interaktionspartner eines Proteins zu identifizieren, ist es somit von eminenter Bedeutung, das Protein möglichst in seiner nativen Tertiärstruktur herzustellen. Eine Möglichkeit Proteine in ihrem reaktiven Faltungs- und untersuchen Modifikationszustand ist die hinsichtlich ihrer Tandem-Affinitäts-Reinigung. Interaktionspartner Erstmalige zu Affinitäts- untersuchungen auf Proteinebene wurden 1968 von Cuatrecasas, Wilchek und Anfinsen beschrieben (Cuatrecasas, Wilchek und Anfinsen, 1968). Dieselben Autoren entwickelten in der Folgezeit die Affinitäts Chromatographie aus der sich die Affinitäts Elektrophorese, die Affinitäts Präzipitation, die Immunaffinitätschromatographie sowie die TAP entwickelte (Cuatrecasas und Wilchek, 2004). In der vorliegenden Arbeit wurde die Tandem-Affinitäts-Aufreinigung zur Untersuchung der Interaktionspartner verwendet. Sie eignet sich zur Reinigung von Proteinkomplexen (Rigaut et al., 1999). Das TAP-System wurde erstmals in Hefezellen angewandt und später auf Pflanzen- und Säugetierzellen angepasst (Gavin et al., 2001, Knuesel et al., 2003). So wurden in großangelegten TAPAnalysen 589 Proteine in Saccharomyces cerevisiae untersucht (Gavin et al., 2001). Hierbei wurden 232 Multiproteinkomplexe nachgewiesen und bei 344 Proteinen 69 konnten neue zelluläre Funktionen entdeckt werden, wobei für 231 Proteine bis dahin keine Funktion beschrieben worden war. Die Tags waren CBP und Protein A und sie wurden an das C-terminale Ende angehangen (Gavin et al., 2001). Für die TAP können variable und beliebig viele Tags an das Köderprotein angehängt werden. In der Regel wird mit zwei Tags gereinigt, z.B. Protein A und Flag. Der Vorläufer der heute bekannten TAP war das Single-Tag-Purification-Konstrukt, welches sich durch eine Affinitätsaufreinigung an einem Tag auszeichnete. Das Hauptproblem war die geringe Sensitivität und Spezifität. So führte ein Single-Tag-Purification System mit Flag in der eukaryonten Zelle zu einer 50%igen Rate an falsch positiven Interaktionspartnern (Edwards et al., 2002). Durch das Hinzuziehen eines zweiten Tags lag die Zahl der falsch positiven Ergebnisse bei etwa 15 %, d.h. nur noch jeder siebte Interaktionspartner wäre durch eine unspezifische Bindung gegen das TAPKonstrukt zu erklären. In der eukaryonten Zelle führte die Aufreinigung mit CBP intrazellulär zu Ca-Präzipitationen und Konformitätsänderung der Proteine (Knuesel et al., 2003). Deshalb wurde in dieser Arbeit, wie bei den meisten Versuchsreihen mit Säugetierzellen, Flag statt CBP als ein Affinitätstag verwendet, während Protein A als weiteres Affinitätstag verwendet wurde. Die Tandem-Affinitäts-Aufreinigung wurde zum Nachweis von Keratin 23 Interaktionspartnern eingesetzt. In der Vorarbeit von Liffers et al. konnten mittels einer N-terminalen Tag-Affinitätsreinigung erste neue Interaktionspartner identifiziert werden (Liffers et al., 2011). Im Lichte der Tatsache, dass die Tag-Richtung Einfluss auf die Interaktionspartner hat (Gavin et al., 2002; Edwards et al., 2002), sollte in der vorliegenden Arbeit überprüft werden, ob sich das Bindungsverhalten des C-terminal getaggten Keratin 23 vom N-terminal getaggten Keratin 23 unterscheidet. Dazu wurden am C-terminalen Ende des Keratin 23 die Affinitätsproteine Protein A und Flag exprimiert. Der Vorteil des Flag-Proteins ist, dass eine hohe Reinheit der Proteinreinigung erzielt werden kann. Auch ist es unwahrscheinlich, dass Flag-Tag aufgrund seines geringen molekularen Gewichts einen nennenswerten Einfluss auf Funktion und Struktur des so getaggten Tags hat (Xu et al., 2010). Das in der molekularen Größe deutlich größere Protein A bietet zwar mehr Fläche für unspezifische Bindungen. Es wird jedoch nach dem Abspalten mit der TEV-Protease im TEV-Eluat an der IgG-Sepharose gebunden und spielt somit für die Interaktionspartneranalyse keine Rolle. Ein Vorteil des Protein A des Bakteriums Staphylococcus aureus ist seine hohe Affinität an IgG-Antikörper (Xu et al., 2010). 70 Beide Proteine wurden spezifisch über Antikörperbindungen aus dem Proteinpool nach Zelllyse gebunden. Die Stärke lag in der Kombination aus beiden TAP-Tags. Während im ersten Reinigungsschritt durch die hohe Affinität des Protein A an die Antikörperreinigungsmatrix das Keratin 23 Protein effektiv aus dem Proteinpool gezogen wurde, wurde im zweiten Reinigungsschritt, nach Abspaltung des Proteins A mittels TEV-Protease, eine hohe Reinheit durch den Einsatz des Flag-Tags, und der damit verbundenen geringeren unspezifischen Bindungseigenschaften des Tags, erzielt. In einer Übersicht von 40 untersuchten möglichen Tags bei TAP-Analysen gehörten die in dieser Arbeit verwendeten Flag und Prot A nach His Tag zu den am häufigsten verwendeten Tags (Li 2010). Weitere mögliche Tags sind das CBP, HA, Myc, V5, Strep II, SBP, S-Peptid, CBD, GST und MBP. Die traditionellen Tags wie CBP und Prot A wurden häufig in den ursprünglich entwickelten TAP-Untersuchungen in der Hefezelle verwendet, während die alternativen Tags in den Säugetierzellen verwendet wurden (Li 2010). Die Wahl der Tags kann einen Einfluss auf die zytoplasmatischen Eigenschaften des Zielproteins nehmen. So wurde z.B. eine Veränderung des Transportes des ATF6 (Activating transcription factor 6) durch die Positionierung des Tags, das die posttranslationale Modifizierung des Proteins veränderte, beschrieben (Sato Y et al., 2011). In diesen Untersuchungen wurde ATF6 zwischen die N-terminale Signal Sequenz und das C-terminal positionierte TAP-Tag integriert. Dies führte dazu, das ATF6 in das Endoplasmatische Retikulum transloziert, dort glykosiert und über Disulfid-Brücken gebunden, anschließend in den Golgi-Apparat transportiert und ins Zytoplasma sekretiert wurde. Dies erfolgte beim nativen ATF6 nicht. Somit konnte eine Änderung des intrazytoplasmatischen Verhaltens durch das Tag nachgewiesen werden (Sato Y et al., 2011). Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit erhobenen Daten wurde in der Literatur beschrieben, dass die Tag-Fusionsrichtung an das Köderprotein einen Einfluss auf die Ergebnisse der Interaktionspartner bei der TAP haben kann. Zu Beginn der Etablierung der TAP-Studien um das Jahr 2001 wurden zunächst keine Unterschiede durch Wahl der C- oder N-terminal angehängten Proteine beschrieben. Da die dreidimensionale Struktur und somit die Affinitätsgruppen der zu untersuchenden Proteine verändert werden konnte, wurde dieser Frage gerade zu Beginn der TAPStudien nachgegangen und die zu untersuchenden Proteine sowohl C-terminal als auch N-terminal getaggt (Puig et al. 2001, Tasto et al., 2001). Große Unterschiede 71 der Interaktionspartner konnten anhand der Tag-Richtung bei den wenigen untersuchten Proteinen zunächst nicht nachgewiesen werden (Puig et al., 2001). Die Interaktionspartner-Analyse waren größtenteils identisch. In der Folge wurden in einer großangelegten Untersuchung von Gavin et al. 589 Proteine untersucht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in 82 % der TAP-Untersuchungen Interaktionspartner des C-terminal fusionierten Köderproteins nachweisbar sind. Sollte es, wie in den restlichen 18 % der Untersuchungen beschrieben, bei den Cterminal getaggten Köderproteinen zu keinem Nachweis von Interaktionspartnern kommen, wurde die Änderung der Tag-Richtung in N-terminal empfohlen (Gavin et al., 2002). Gleiches wurde in einer weiteren Studie beschrieben (Dziembowski und Serraphin, 2003). Die Autoren beschrieben eine mögliche Instabilität des ProteinProtein-Komplexes oder der Struktur, die eintreten kann, wenn man das Tag an das C- oder N-terminale Ende des Zielproteins bindet. Eine weitere Studie zu Interaktionspartnern durch C- und N-terminal getaggte Proteine analysierte 43 Proteine in Arabidopsis (Schottenkresse), die der Tandem Affinitäts Reinigung unterzogen wurden (Rubio et al., 2005). Es konnten in 36 von 43 TAPUntersuchungen erfolgreich Interaktionspartner nachgewiesen werden. In weniger als der Hälfte (21 TAP-Analysen) konnten die selben Interaktionspartner durch die Tag-Anordnung in beide Richtungen (also C- und N-terminal) nachgewiesen werden. In 13 TAP-Untersuchungen wurden z.T. gleiche, aber auch z.T. unterschiedliche Interaktionspartner beim Vergleich zwischen N-terminal und C-terminal dargestellt. Als Ursache für die Wachstumsbedingungen Unterschiede der Zellen wurden und mögliche unterschiedliche unterschiedliche Untersuchungs- bedingungen gesehen. Eine weitere mögliche Ursache in der Abhängigkeit der TagRichtung wurde von den Autoren nicht gesehen. In zwei Fällen konnten die Interaktionspartner eindeutig nur in einer Richtung (also entweder C- oder Nterminal) nachgewiesen werden, während es in der anderen Richtung eindeutig keine Interaktion gab (CSN3 und COP1). Es wurde daraus geschlossen, dass möglicherweise die Tag-Richtung einen Einfluss auf die Interaktion des Proteins hätte, da es die funktionelle Gruppe oder die Tertiärstruktur geändert haben könnte (Rubio et al., 2005). Ein Vergleich der Interaktionspartner in beide Tag-Richtungen ist somit sinnvoll um mögliche Fehlerquellen auszuschließen. Um diese Fehlerquelle auszuschließen wurde in dieser Arbeit ergänzend zum N-terminalen System von Liffers et al. das Keratin 23 C-terminal getaggt. 72 Eine Literatur Recherche der bisher per TAP ermittelten Interaktionspartner ergab, dass nur wenige Untersuchungen sowohl mit C-terminal als auch N-terminal getaggten Proteinen durchgeführt wurden. Dass die Positionierung der AffinitätsTags einen entscheidenden Einfluss auf die erfolgreiche Nachweisbarkeit der Interaktionspartner haben kann, wurde von Markov et al. gezeigt. Nach vielen Versuchen, die Interaktionspartner der mitochondrial RNA-Polymerase (mtRNAP) mittels Tandem-Affinitäts-Aufreinigung nachzuweisen, gelang 2009 durch eine Änderung der Tag-Richtung der Durchbruch. Da das C-terminale Model aufgrund der Nähe des Tags zur active site mit der mtRNAP Funktion inkompatibel war, konnte erst das N-terminale TAP–mtRNAP-Modell erste Ergebnisse zu den Interaktionspartnern zeigen (Markov et al., 2009). Auch wenn die Wahrscheinlichkeit unter 20% liegt, dass man durch unterschiedliche Tag-Richtung unterschiedliche Interaktionspartner findet, wurde genau dieser Frage in der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Entsprechend der Wahrscheinlichkeit unterschiedlicher Interaktionspartner konnte auch in dieser Arbeit kein Unterschied dargestellt werden zwischen N-terminal und C-terminal getaggtem Köderprotein Keratin 23. Auch wurden die von Liffers et al. beschriebenen Interaktionspartner in Abhängigkeit vom Smad4-Status bestätigt. So binden u.a. Keratin 8, Keratin 18, 14-3-3 Isoform ε und 14-3-3 Isoform γ an Keratin 23. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte TAPAnalyse hat auf der einen Seite, wie oben dargestellt, den Vorteil der geringen unspezifischen Bindung, ist jedoch auf der anderen Seite eine Technologie bei der sowohl die Wahl des Tags als auch die Tag-Positionierung (C- oder N-terminal) einen Einfluss auf die nachweisbaren Keratin 23 Interaktionspartner hat. Eine zweifache Auswertung der Interaktionspartner durch C- und N-terminal getaggtes Köderprotein kann die Auswertung der Interaktionspartner des Köderproteins zwar verbessern, kann aber nicht verhindern, dass schwache Interaktionspartner verloren gehen. Eine weitere Optimierungsmöglichkeit der Interaktionsanalyse ist z.B. der Einsatz mehrerer unterschiedlicher Tags (Li 2011). Durch die Keratin 23 Überexpression ist es auch möglich, dass aufgrund der unphysiologisch hohen zellulären Keratin 23 Menge Proteine an Keratin 23 binden, die unter physiologischen Bedingungen nicht binden würden. Eine Möglichkeit der Validierung der im TAP-System nachgewiesenen Interaktionspartner wäre die klassische Immunpräzipitation mittels eines Keratin 23 spezifischen Antikörpers und nachgeschaltetem Nachweis möglicher Interaktionspartner im Western Blot. 73 6 Zusammenfassung Durch die Einführung der Tandem-Affinitäts-Aufreinigung steht heute ein schonendes in-vivo-Verfahren zur Interaktionsanalyse von Proteinkomplexen zur Verfügung. Dieses brachte einen erheblichen Fortschritt in die Protein-Analyse. Mit Hilfe der Interaktionsanalysen können Protein-Komplex-Netzwerke entdeckt und charakterisiert werden, die helfen die Funktion einzelner Proteine innerhalb der Proteinnetzwerke sowie zelluläre Abläufe besser zu verstehen. Nachdem Liffers et al. (2011) die Interaktionspartner des mit N-terminal getaggten Keratin 23 beschrieben hatte, erfolgte in dieser Arbeit eine Analyse mit C-terminal getaggten Keratin 23, da die Position des Tags Einfluss auf die Interaktionspartner nehmen kann. Es kann zu einer Veränderung der Tertiärstruktur oder der active site in Abhängigkeit von der Richtung der Bindung der Tags an das Köderprotein kommen. Folglich können Interaktionspartner nicht binden und per TAP nicht nachgewiesen werden. Um diese Fehlerquelle auszuschließen, wurde das Köderprotein Keratin 23 mittels eines C-terminalen Protein A-Flag-Affinitätstags auf mögliche Interaktionspartner untersucht. Zur effektiven und stabilen Expression des KRT23-TAP Proteins in epithelialen Kolontumorzellen, wurde die lentivirale Transduktion gewählt. Aufgrund der Tatsache, dass die KRT23 Expression in Kolontumoren Smad4 abhängig reguliert wird, wurde die Interaktionsanalyse sowohl in Smad4 pos. als auch Smad4 neg. SW480 Kolonkarzinomzellen durchgeführt. Mit der schonenden Tandem-Affinitätsaufreinigung wurde das Köderprotein spezifisch über zwei Immunaffinitäts-Aufreinigungsschritte aufgereinigt. Die so gewonnenen Interaktionspartner deckten sich mit den Ergebnissen des N-terminal getaggten Keratin 23 von Liffers et al. (Liffers et al., 2011). 7 Proteine waren Smad4 unabhängig. Es waren Plectin1 Isoform 11, HSP 70, Protein 8 Isoform 1, Chaperonin 60, Keratin 8, Keratin 18 sowie die leichte Kette des IgG. Zwei Proteine waren lediglich in der Smad4 pos. Zelllinie nachweisbar: 14-3-3 Isoform ε und 14-3-3 Isoform γ. Zusammenfassend belegen somit die Daten der hier vorgelegten Analyse, dass im Falle des Keratin 23 die Tag-Richtung in der Tandem-Affinitäts-Aufeinigung im Hinblick auf die identifizierbaren Interaktionspartner keine Rolle spielt und bestätigen in einem unabhängigen Versuch die von Liffers et al. nachgewiesenen Keratin 23 Interaktionspartner. 74 7 Literatur Aaltonen, L. 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Ohne ihre Hilfe durch „Rücken-frei-Halten“ meiner Ehefrau Ingrid hätte ich diese Arbeit nicht beendet. 87 LEBENSLAUF Name: Norbert Nosal Geburtsort Goldberg (Polen) Geburtstag: 3.03.1981 Schullaufbahn: 1987-1990 1990-1991 1991-1997 1997-2000 Henry-van-de-Velde Grundschule Hagen Vincke Grundschule Hagen Realschule Hagen-Nord Fichte Gymnasium, Hagen Studium: 10/2000- 06/2007 Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum 16.06.2007 Approbation 07/2007 -09/2012 Assistenzarzt für Gynäkologie und Geburtshilfe in Essen. Seit 19.09.2012 Facharzt für Gynäkologie und Geburtshilfe 2004 - Arbeitsgruppe Prof. Dr. Stephan Hahn, Molekulare gastroenterologische Onkologie, Ruhr-Universität Bochum Arbeitstätigkeit: Promotion: 2013 88
