Differentielle Genexpressionsanalyse von Smad4 defizienten

Differentielle Genexpressionsanalyse von Smad4
defizienten Pankreaskarzinomzelllinien nach
Reexpression von Smad4
DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Chemie an der
Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Dipl.-Biochem. Marc Zapatka
Bochum 2003
DANKSAGUNG
An erster Stelle möchte ich Frau Dr. Irmgard Schwarte-Waldhoff für die hervorragende
Betreuung bei meiner Doktorarbeit, ihr aufrichtiges Interesse, ihre Bereitschaft zu
anregenden Diskussionen und zu konstruktiver Kritik danken. Selbstverständlich bin ich
Ihr auch für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes, der technischen Geräte, meiner
Finanzierung und der Möglichkeit, an Kongressen teilzunehmen überaus dankbar.
Bei Herrn PD Dr. Stephan Hahn möchte ich mich für die Betreuung der Arbeit, die
Übernahme des Gutachtens und die anregenden Diskussionen zur Entwicklung der
Auswertungsmethode herzlich bedanken.
Herrn Professor Dr. Rolf Heumann danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens
und Herrn Professor Dr. Christof Wöll für die Bereitschaft als dritter Prüfer zu
fungieren.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Susanne Klein-Scory, die mit Ihren kritischen
Anmerkungen in Diskussionen geholfen hat, Sachverhalte aus neuen Perspektiven zu
betrachten, was dem Fortschreiten meiner Arbeit gut getan hat.
Natürlich gilt mein Dank auch allen ehemaligen und derzeitigen Mitarbeitern des IMBL
und des Labors für Molekulare Onkologie für das gute Arbeitsklima und die gute
Zusammenarbeit. Besonders sei hier Frau Dr. Nicole Müller gedankt, die meine Arbeit
durch anregende Diskussionen sehr unterstützt hat. Bei Anke Baar, Christina EilertMicus, Anna Schöneck und besonders bei Sabine Hoppe bedanke ich mich für die
zuverlässige technische Assistenz.
Für die umsichtige Pflege der Nacktmäuse und die Unterstützung bei den
Tumorigenitätstests im Tierstall des Essener Klinikums danke ich Claudia Lechleiter
und Thomas Haberland.
Herrn PD Dr. Hendrik Ungefroren gilt besonderer Dank für die Bereitstellung der
Retroviren, die zur Transduktion der Zellen eingesetzt wurden.
Ganz besonders möchte ich Sylvia Schweitzer dafür danken, dass sie mich während der
schwierigen Phase der Verfassung dieser Arbeit immer unterstützt hat.
Letztlich gilt mein Dank natürlich auch meinen Eltern, die mir das Studium der
Biochemie ermöglicht, und so den Grundstein für diese Arbeit gelegt haben.
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS...................................................................................... I
ABKÜRZUNGEN ............................................................................................... IV
1
EINLEITUNG ............................................................................................. 1
1.1
Der Tumorsuppressor Smad4................................................................................................ 1
1.2
Der TGFβ/Smad Signalweg ................................................................................................... 2
1.2.1
Die TGFβ Superfamilie................................................................................................... 3
1.2.2
TGFβ Rezeptoren............................................................................................................ 4
1.2.3
Die Smad Proteine........................................................................................................... 5
1.2.4
Smads als Transkriptionskomodulatoren ........................................................................ 7
1.3
Die Smad Proteine im Signalnetzwerk.................................................................................. 8
1.4
Tumorsuppressorfunktion von Smad4 ................................................................................. 9
1.5
Modellsystem zur Untersuchung der Effekte von Smad4 ................................................... 9
1.6
Zielsetzung der Arbeit .......................................................................................................... 10
2
MATERIAL .............................................................................................. 12
2.1
Puffer und Lösungen ............................................................................................................ 12
2.2
Medien ................................................................................................................................... 14
2.3
Chemikalien .......................................................................................................................... 15
2.4
Zelllinien ................................................................................................................................ 15
2.5
Antikörper............................................................................................................................. 15
2.6
Enzyme .................................................................................................................................. 15
2.7
Kits ......................................................................................................................................... 16
2.8
Verbrauchsmaterialien......................................................................................................... 16
2.9
Geräte .................................................................................................................................... 16
2.10
Primer .................................................................................................................................... 17
3
METHODEN ............................................................................................ 22
3.1
DNA ....................................................................................................................................... 22
3.1.1
cDNA Synthese............................................................................................................. 22
3.1.2
Isolierung von DNA aus Agarosegelen......................................................................... 22
Inhaltsverzeichnis
3.1.3
ii
Herstellung von DNA Sonden für die Northern Blot Hybridisierung ........................... 22
3.2
RNA ....................................................................................................................................... 23
3.2.1
Präparation von RNA .................................................................................................... 23
3.2.2
RNA Gelelektrophorese und Northern Blot .................................................................. 24
3.2.3
Northern Blot Hybridisierung ....................................................................................... 25
3.2.4
Digitalisierung von hybridisierten Membranen............................................................. 26
3.2.5
Clontech cDNA Expressions Array .............................................................................. 26
3.3
Protein.................................................................................................................................... 28
3.3.1
Präparation von Proteinen ............................................................................................. 28
3.3.2
Proteingelelektrophorese mittels SDS-Page.................................................................. 29
3.3.3
Western Blot und Immundetektion von Proteinen ........................................................ 29
3.3.4
Nachweis von Interferon γ............................................................................................. 30
3.4
Zellkultur............................................................................................................................... 30
3.4.1
Hitzeinaktivierung von FKS.......................................................................................... 30
3.4.2
Test auf Mycobakterien Kontamination........................................................................ 31
3.4.3
Passagieren von Zellen.................................................................................................. 31
3.4.4
Einfrieren von Zellen .................................................................................................... 31
3.4.5
Auftauen von Zellen...................................................................................................... 31
3.4.6
Virale Transduktion von Zellen .................................................................................... 32
3.4.7
Herstellung von konditionierten Medien....................................................................... 32
3.5
Tumorigenitätstests an Nacktmäusen ................................................................................. 33
3.5.1
Präparation von RNA aus Tumorgewebe...................................................................... 33
4
ERGEBNISSE ......................................................................................... 34
4.1
Vorüberlegungen zur Auswertung...................................................................................... 35
4.2
Auswertung der Makroarrays ............................................................................................. 35
4.2.1
Beurteilung von Signalen .............................................................................................. 36
4.2.2
Normalisierung.............................................................................................................. 38
4.2.3
Überlegungen zur Anzahl der notwendigen Wiederholungen....................................... 40
4.2.4
Definierung von Kandidatengenen................................................................................ 41
4.3
Smad4 abhängige differentielle Genexpressionsanalyse von Hs766T in vitro................. 43
4.3.1
Normalisierung.............................................................................................................. 43
4.3.2
Validierung der Arrayergebnisse................................................................................... 44
4.3.3
Signifikanzanalyse mit Arrayergebnissen nach Tusher................................................. 55
4.3.4
Funktionelle Einordnung der Differentiell exprimierten Gene ..................................... 57
4.3.5
Untersuchungen zum Interferon Signalweg .................................................................. 60
4.4
Expressionsunterschiede nach subkutaner Injektion in Nacktmäuse.............................. 73
4.4.1
Expressionsunterschiede humaner Gene ....................................................................... 74
4.5
Untersuchung an der Zelllinie CFPAC-1............................................................................ 77
4.5.1
Etablierung der Smad4 Exprimierenden Zellen ............................................................ 77
4.5.2
Überprüfung der Wiederherstellung von TGFβ-Antworten.......................................... 78
4.5.3
Expressionsunterschiede unter Zellkulturbedingungen in CFPAC-1............................ 79
4.5.4
Verhalten von CFPAC-1 Zellen nach subkutaner Injektion in Nacktmäuse ................. 81
4.5.5
Überprüfung von Interferon regulierten Genen............................................................. 81
5
DISKUSSION .......................................................................................... 84
5.1
Entwicklung der Auswertungsmethode .............................................................................. 85
Inhaltsverzeichnis
iii
5.2
Funktionelle Relevanz der Smad4 abhängig regulierten Gene in Hs766T Zellen........... 89
5.3
Effekte von Smad4 auf Interferonsignalwege .................................................................... 91
5.4
Auswirkungen der Smad4 Expression in Nacktmaustumoren ......................................... 95
5.5
Effekte von Smad4 in CFPAC1 Zellen................................................................................ 96
6
ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................... 99
7
LITERATURVERZEICHNIS .................................................................. 101
8
ANHÄNGE ............................................................................................ 107
8.1
Programme.......................................................................................................................... 107
8.1.1
HTML/VBScript Code zur automatisierten Kontrolle der Auswertung...................... 107
8.1.2
VBA-Makro zur Auswertung der Genpix Pro-Ergebnisse.......................................... 112
8.2
Kongressbeiträge ................................................................................................................ 121
8.3
Lebenslauf ........................................................................................................................... 122
ABKÜRZUNGEN
α
anti
A
Adenin
AMH
anti Müllerian hormone
BMP
bone morphogenetic protein
BSA
bovines Serumalbumin
C
Zytosin
cDNA
complementary DNA
Co-Smad
common mediator Smad
DEPC
Diethylpyrocarbonat
DMEM
Dulbecco´s modified eagle medium
DNA
Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)
dNTP
2'-Desoxyribonukleotid-5'-Triphosphat
DTT
Dithiothreitol
DPC4
deleted in pancreatic carcinoma, locus 4
EtBr
Ethidiumbromid
G
Guanin
GDF
growth differentiation factor
GO
GeneOntology
IFN
Interferon
I-Smad
Inhibitory Smad
LAP
latency associated protein
M
Molar
MH
Mad Homologie Region
Min
Minute
OD
optische Dichte
PanIN
pankreatische intraepitheliale Neoplasie
RNA
Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)
R-Smads
Rezeptorassoziierte Smad Proteine
RT
Raumtemperatur
SBE
Smad bindendes Element
T
Thymin
Abkürzungen
v
TGFβ
transforming growth factor β
TIFF
Tagged Image File Format
Tris
Trishydroxymethylaminomethan
U
Enzymeinheit (unit)
U/Min
Umdrehungen pro Minute
1 EINLEITUNG
1.1 DER TUMORSUPPRESSOR SMAD4
In 90% aller Fälle findet sich der Verlust eines Allels des Chromosoms 18q in
Pankreaskarzinomen (Hahn, Seymour u. a. 1995). Dies regte zur weiteren genetischen
Untersuchung der Region an und führte zur Entdeckung des Tumorsuppressorkandidatengens Smad4 (Hahn, Schutte u. a. 1996). Smad4, auch DPC4 (deleted in
pancreatic carcinoma, locus 4) genannt, ist auf Chromosom 18q.21.1 lokalisiert und
30% der pankreatischen Adenokarzinome weisen den Verlust eines Smad4 Allels auf.
In weiteren 20% wurden Punktmutationen von Smad4 nachgewiesen (Hahn, Schutte u.
a. 1996). Auch in Karzinomen des Gallengangs ist Smad4 zu 16% bis 50% mutiert
(Hahn, Bartsch u. a. 1998) und in 15% bis 55% der Tumore des Gallengangs nicht
exprimiert (Argani, Shaukat u. a. 2001). Weiterhin treten Mutationen von Smad4 zu
16% bei Kolonkarzinomen auf (Takagi, Kohmura u. a. 1996; Thiagalingam, Lengauer
u. a. 1996). Bei anderen Tumoren liegt die Häufigkeit der Smad4 Mutation unter 10%
(Riggins, Kinzler u. a. 1997). Smad4 Mutationen in der Keimbahn werden bei Patienten
mit familiärer juveniler Polyposis beschrieben (Howe, Roth u. a. 1998), die ein
vermehrtes
Auftreten
von
Dickdarmpolypen
und
ein
erhöhtes
Risiko
für
gastrointestinale Tumore aufweisen.
Abbildung 1 Progressionsmodell der Pankreaskarzinomvorstufen (Wilentz, IacobuzioDonahue u. a. 2000)
Die Mutationen von Smad4 in Tumoren häufen sich in Pankreas und Kolonkarzinomen
in späteren Tumorstadien. Pankreaskarzinomvorstufen werden nach dem Grad der
1 EINLEITUNG
2
Dysplasie klassifiziert (pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN 1A bis 3) Abbildung
1. Im ersten Grad ist die Expression von Smad4 nicht beeinträchtigt. Mit
fortschreitender Dysplasie (PanIN 2) weisen 13% und bei hoher Dysplasie (PanIN 3)
weisen 41% keine Smad4 Expression mehr auf (Luttges, Galehdari u. a. 2001). Auch in
Kolonkarzinomen zeigt sich eine Abnahme der Smad4 Expression im Verlauf der
Tumorprogression (Maitra, Molberg u. a. 2000; Mikami, Ookawa u. a. 2001). Adenome
weisen noch keine Smad4 Mutation auf. Von den auf die Mukosa begrenzten
Karzinomen haben 10%, von den invasiven Karzinomen bis zu 5% und von den
metastatischen Karzinomen sogar 35% Mutationen im Smad4 Gen (Miyaki, Iijima u. a.
1999).
Smad4 gehört zur Familie der Smad Proteine, die aus hoch konservierten Proteinen
besteht. Die ersten Vertreter dieser Proteinfamilie wurden in Drosophila melanogaster
(Mothers against decapentaplegic, Mad) und Caenorhabditis elegans (small genes
2,3,4, Sma) beschrieben (Sekelsky, Newfeld u. a. 1995; Savage, Das u. a. 1996). Der
Name der Smad Proteine leitet sich wegen ihrer Homologie zu den eben genannten
Proteinen aus „Sma“ und „Mad“ ab, die zu „Smad“ verbunden wurden (Liu, Hata u. a.
1996). Neben dem ersten humanen Vertreter Smad1 (Liu, Hata u. a. 1996) wurden
bisher 7 weitere Mitglieder beschrieben (Smad2 bis Smad8). Smad Proteine sind
intrazelluläre Proteine, die das Signal von Zytokinen der transforming growth factor β
(TGFβ) Superfamilie weiterleiten. Die mittlerweile über 50 bekannten Mitglieder
regulieren eine Vielzahl von zellulären Prozessen wie Proliferation, Differenzierung,
Migration und Apoptose spielen aber auch in der Embryogenese und bei der
Gewebehomeostase eine Rolle (Massague 1998; Krieglstein, Strelau u. a. 2002).
1.2 DER TGFβ/SMAD SIGNALWEG
Der TGFβ/Smad Signalweg (Abbildung 2) führt nach Bindung eines Zytokins der
TGFβ Superfamilie zur Aktivierung der entsprechenden Rezeptoren. Anschließend
werden die rezeptoraktivierten Smad Proteine phosphoryliert. Diese binden dann an
Smad4 und translozieren in den Kern. Nach der Bindung von transkriptionellen
Kofaktoren und Koaktivatoren oder Korepressoren wird die Expression von Genen
positiv oder negativ beeinflusst (Massague 1998; Itoh, Itoh u. a. 2000; Miyazono,
Kusanagi u. a. 2001; ten Dijke, Goumans u. a. 2002).
1 EINLEITUNG
3
Abbildung 2 Schematische Darstellung des TGFβ/Smad Signalweges (Massague und
Chen 2000)
1.2.1 DIE TGFΒ SUPERFAMILIE
Die TGFβ Superfamilie zeichnet sich durch ein gemeinsames Strukturmotiv, den
Zysteinknoten (cystine knot motif) aus, der zur Bildung von drei konservierten Paaren
von intrazellulären Disulfidbrücken führt. Die Superfamilie wird üblicherweise anhand
der Signalweiterleitung durch die rezeptorassoziierten Smads und wegen Sequenzhomologien in zwei Familien unterteilt. Die Mitglieder der Aktivin/TGFβ Familie
binden an Rezeptoren, die zur Phosphorylierung von Smad2 und Smad3 führen. Die
Mitglieder der BMP Familie (bone morphogenetic protein), die GDF Proteine (growth
differentiation factor) und AMH (anti Müllerian hormone) leiten ihre Signale durch
Smad1, 5 und 8 weiter (siehe Abbildung 3).
Die TGFβ Unterfamilie besteht aus drei hoch homologen Isoformen von TGFβ. TGFβ1,
TGFβ2 und TGFβ3 sind auf Chromosom 19q13, 1q41 und 14q24 lokalisiert (Piek und
Roberts 2001). Jede Isoform wird gewebeabhängig und im Verlauf der Entwicklung
unterschiedlich exprimiert (Roberts und Sporn 1992). TGFβ1 wird von dem
komplexesten Promotor der drei Isoformen reguliert. Die Bedeutung des Zytokins zeigt
sich auch darin, dass seine Expression bei verschiedenen Krankheiten verändert ist.
Die TGFβ Zytokine können Zellzyklusarrest in hämatopoetischen Zellen und
Epithelzellen bewirken und können die Proliferation und Differenzierung von
mesenchymalen Zellen kontrollieren. Sie induzieren die Bildung der extrazellulären
Matrix und sind beteiligt an Wundheilung und Immunsuppression (Massague 1998;
Piek und Roberts 2001).
1 EINLEITUNG
4
Abbildung 3 Signaltransduktion der TGFβ Superfamilie (Massague, Blain u. a. 2000)
Die TGFβ Isoformen werden in einer latenten Form von Zellen sekretiert. Die
inaktivierende N-terminale Domäne (latency associated protein, LAP) ist nichtkovalent
an die C-terminale Domäne gebunden (Taipale, Saharinen u. a. 1998). Die intramolekular inaktivierte Form von TGFβ kann nicht an Rezeptoren binden und kann
deshalb keine Signale weiterleiten. Die Aktivierung kann durch Proteolyse des LAP
oder Konformationsänderungen erfolgen (Piek, Heldin u. a. 1999; Piek und Roberts
2001).
1.2.2 TGFβ REZEPTOREN
Die Zytokine der TGFβ Superfamilie binden nach ihrer Aktivierung an spezifische
Rezeptoren (Abbildung 3). Die TGFβ-Rezeptorfamilie, eine Gruppe von Transmembranproteinen mit Serin/Threonin-Kinaseaktivität wird anhand von Struktur und
Funktion der Kinase in Typ I und Typ II Rezeptoren unterteilt (Massague 1998). Die
Typ I Unterfamilie wird durch eine als GS-Domäne benannte Region charakterisiert
(Wrana, Attisano u. a. 1994). Jeder der bisher sieben bekannten Typ I Rezeptoren kann
mit jedem der fünf bekannten Typ II Rezeptoren interagieren, aber die Signalspezifität
wird nur vom Typ I Rezeptor vermittelt (Attisano und Wrana 2002).
1 EINLEITUNG
5
Die Signaltransduktion durch Typ I und Typ II Rezeptoren erfolgt nach der Bindung des
Liganden an den spezifischen Typ II Rezeptor. Anschließend wird normalerweise der
Typ I Rezeptor assoziiert und der heteromere Komplex zusätzlich durch die Affinität
der Rezeptoren stabilisiert. TGFβ2 hingegen hat eine zu geringe Affinität zum Typ II
Rezeptor und kann alleine nicht ausreichend stark an diesen binden. Die transient
gebildeten Komplexe aus Typ I und Typ II Rezeptoren werden aber auch durch TGFβ2
stabilisiert und erlauben so die Bildung des aktiven Rezeptorkomplexes. Der Typ II
Rezeptor aktiviert anschließend den Typ I Rezeptor durch Phosphorylierung von Serinund Threoninresten hauptsächlich in der GS Domäne an einem TTSGSGSG Motiv
(Massague 1998). Diese von Liganden induzierte Phosphorylierung ist notwendig für
die anschließende durch den Typ I Rezeptor erreichte Phosphorylierung der Smad
Proteine, die dann das Signal weiterleiten (Wrana, Attisano u. a. 1994; Wieser, Wrana
u. a. 1995; Souchelnytskyi, ten Dijke u. a. 1996).
Eine weitere Unterfamilie von extrazellulären Rezeptoren (Typ III) besteht aus zwei
verwandten Proteinen, Betaglycan und Endoglin. Diese Rezeptoren haben keine
intrinsische Signalaktivität. Betaglycan verstärkt die Bindung der TGFβ Isoformen an
Typ II Rezeptoren, was besonders für TGFβ2 wichtig ist, da dieses eine geringe
Rezeptoraffinität hat (Lopez-Casillas, Wrana u. a. 1993; Sankar, Mahooti-Brooks u. a.
1995). Endoglin bindet kein TGFβ2 und unterscheidet sich hierdurch von Betaglycan
(Barbara, Wrana u. a. 1999).
1.2.3 DIE SMAD PROTEINE
Nach der Aktivierung der Rezeptoren durch die Ligandenbindung erfolgt die
Signalweiterleitung durch die Smad Proteine. Die Smad Proteine lassen sich in drei
Gruppen einteilen, die rezeptorregulierten Smads (R-Smads), die common-mediator
Smads (Co-Smads) und die inhibitorischen Smads (I-Smads) (Heldin, Miyazono u. a.
1997). Sie enthalten eine konservierte C-terminale Mad Homologie 2 Domäne (MH2).
Die R- und Co-Smad Proteine haben N-terminal zusätzlich eine MH1 Domäne (Shi,
Hata u. a. 1997; Shi, Wang u. a. 1998). Die MH1 Domäne hemmt bei den R-Smad
Proteinen intramolekular die Aktivität der MH2 Domäne (Hata, Lo u. a. 1997). Erst
nach Phosphorylierung am SXS Motiv erfolgt die Bildung von Homooligomeren, die
zusammen mit Smad4 Heterooligomere bilden. Der Transport in den Zellkern, die DNA
Bindung und die Interaktion mit Transkriptionsfaktoren findet vermittelt durch
1 EINLEITUNG
6
Sequenzen in der MH1 Region statt. Die MH2 Region ist für die Erkennung der Typ I
Rezeptoren (nicht bei Smad4), die Oligomerisierung der Smad Proteine (nicht bei
I-Smad Proteinen), die Lokalisation im Zytoplasma und auch für die Interaktion mit
Transkriptionsfaktoren verantwortlich (nicht bei I-Smads) (Moustakas, Souchelnytskyi
u. a. 2001).
Die R-Smads werden anhand ihrer Signalweiterleitung in zwei Gruppen unterteilt.
Smad2 und 3 werden nach Bindung der TGFβ Isoformen, der Aktivine und von Nodal
vom Typ I Rezeptor durch Phosphorylierung aktiviert. Die Smads 1, 5 und 8 werden bei
BMP, GDF und AMH Signalen aktiviert (Abbildung 4).
Abbildung 4 Phylogenetischer Stammbaum und schematischer Aufbau der Smad
Proteine (Itoh, Itoh u. a. 2000)
Von den I-Smads sind in Säugetieren bisher zwei Vertreter, Smad6 und Smad7
beschrieben worden (Imamura, Takase u. a. 1997; Nakao, Afrakhte u. a. 1997). Die
Expressionen dieser Inhibitoren werden durch TGFβ/Aktivin und BMP Liganden
induziert und wirken über einen negativen Rückkopplungsmechanismus auf TGFβ- und
BMP-Signalwege (Christian und Nakayama 1999). I-Smads können mit Typ I
Rezeptoren interagieren und so die Aktivierung der R-Smads unterbinden (Imamura,
Takase u. a. 1997; Nakao, Afrakhte u. a. 1997). Für Smad6 wird weiter vermutet, dass
es an Smad1 bindet und somit die Bildung des Smad1/Smad4 Komplexes verhindern
kann (Hata, Lagna u. a. 1998).
1 EINLEITUNG
7
1.2.4 SMADS ALS TRANSKRIPTIONSKOMODULATOREN
Nach der Aktivierung der R-Smads oligomerisieren diese mit Smad4, translozieren in
den Kern und regulieren die Transkription verschiedener Gene (Heldin, Miyazono u. a.
1997).
Smad3 und Smad4 können über ihre MH1 Domäne direkt mit spezifischen DNA
Sequenzen interagieren (Shi, Wang u. a. 1998; Johnson, Kirkpatrick u. a. 1999; Jones
und Kern 2000). Die Sequenz CAGAC des Smad-bindenden Element (SBE) kommt bei
zufälliger Basenverteilung im Durchschnitt alle 1024 Basenpaare im Genom vor. Die
Bindung ist zudem sehr schwach und allein nicht ausreichend für die vollständige
Aktivierung der Transkription von Zielgenen (Shi, Wang u. a. 1998). Da die Smads 1, 3
und 4 ähnliche Affinitäten für das Smad-bindende Element haben, kann die selektive
Expression von Genen nicht allein über die DNA-Bindung gesteuert sein. Die große
Variabilität der zellulären Wirkungen von TGFβ wird vielmehr durch die Kooperation
mit anderen Transkriptionsfaktoren oder Transkriptionsregulatoren erreicht (Itoh, Itoh
u. a. 2000; Massague und Wotton 2000). Beispielsweise bindet der Koaktivator CBP/
p300 an Smad 1, 2 und 3 und erhöht so die Transkription von Zielgenen. MSG1, ein
starker Transaktivator, ohne eigene DNA bindende Domäne, stabilisiert die Bindung
von Smad4 an CBP/p300 und wirkt so ebenfalls positiv auf die Transkription (Yahata,
de Caestecker u. a. 2000). Durch die Interaktion mit Transkriptionsrepressoren wie
TGIF, Ski, SnoN oder SNIP wird die Transkription gehemmt. Entweder werden
Histondeacetylasen an Transkriptionskomplexe gebunden, oder die Interaktion mit
Transkriptionsaktivatoren wie CBP/p300 unterbunden (Itoh, Itoh u. a. 2000; Miyazono,
Kusanagi u. a. 2001; ten Dijke, Goumans u. a. 2002).
Von den Transkriptionsfaktoren, die mit Smad Proteinen interagieren können, wurde
FAST-1 als erster identifiziert. FAST-1 kann in Xenopus an ein Aktivin responsibles
Element binden, benötigt aber zur effizienten DNA-Bindung und Transkription die
Kooperation von Smad2 und Smad4 (Chen, Rubock u. a. 1996; Chen, Weisberg u. a.
1997). Viele andere Transkriptionsfaktoren mit ebenfalls positivem (zum Beispiel AP-1,
die SP-1- und AML-Familie) oder negativem Einfluss (zum Beispiel Evi1 und E1A) auf
TGFβ Zielgene wurden beschrieben (ausführlichere Auflistungen finden sich in
Attisano und Wrana 2000; Itoh, Itoh u. a. 2000; Miyazono, Kusanagi u. a. 2001; ten
Dijke, Goumans u. a. 2002).
1 EINLEITUNG
8
1.3 DIE SMAD PROTEINE IM SIGNALNETZWERK
Die Smad Proteine scheinen eine wichtige Funktion bei der Integration von
verschiedenen Signalwegen zu haben (Abbildung 5). Einflüsse anderer Signalwege auf
den TGFβ/Smad Signalweg sind bekannt (Piek, Heldin u. a. 1999; Zhang und Derynck
1999; Massague und Chen 2000; Qing und Derynck 2001). Diese können zum einen
wie EGF, Interferon γ oder TNF-α durch die Induktion von Smad7 hemmend wirken
(Derynck, Akhurst u. a. 2001). Sie können aber auch durch die Interaktion mit Smad3
zur
Transkription
von
Zielgenen
führen
(β-Catenin,
LEF/TCF,
c-jun
oder
ATF2)(Derynck, Akhurst u. a. 2001). Auch die Phosphorylierung und Aktivierung von
Smad3 durch die Jun N-terminale Kinase wurde beschrieben (Engel, McDonnell u. a.
1999). Die Wechselwirkung kann auch anhand der Kompetition um die Bindung des
Koaktivators CBP/p300 stattfinden. Die TGFβ induzierte Expression von Kollagen wird
beispielsweise so von IFNγ gehemmt (Ghosh, Yuan u. a. 2001).
Abbildung 5 Wechselwirkungen des TGFβ Signalweges mit anderen Signalwegen
(Derynck, Akhurst u. a. 2001)
Vielfältig sind auch die Einflüsse des TGFβ/Smad Signalweges auf andere Signalwege
(Abbildung 5). TGFβ kann die Erk MAP Kinase (Mulder und Morris 1992), die P38
MAP Kinase und die Jun Kinase aktivieren, obwohl die Aktivierung in verschiedenen
1 EINLEITUNG
9
Zellen variiert. Auch die übergeordnete MAP Kinase Kinase Kinase TAK1 wird schnell
durch TGFβ aktiviert (Yamaguchi, Shirakabe u. a. 1995), aber auch durch andere
Signalwege beeinflusst. TGFβ kann die GTPasen RhoA (Bhowmick, Ghiassi u. a. 2001)
und RhoB (Engel, Datta u. a. 1998) aktivieren oder stabilisieren und führt so
beispielsweise zur Aktivierung der Jun Kinase (Engel, McDonnell u. a. 1999). Die
Assoziation von TGFβ-Rezeptoren mit der Protein Phosphatase 2A und anschließend
mit der S6 Kinase wurde beschrieben und führt zu Zellzyklusarrest (Petritsch, Beug u.
a. 2000). Die Aktivierung von unterschiedlichen Kinasen, die weitere Nachwirkungen
haben, zeigt dass die Effekte des TGFβ/Smad Signalweges vielfältig sind und sich nicht
auf das einfache Schema einer linearen Signaltransduktion reduzieren lassen.
1.4 TUMORSUPPRESSORFUNKTION VON SMAD4
Die häufige Inaktivierung von Smad4 in pankreatischem Krebs und anderen
Krebsformen spricht für eine Funktion als Tumorsuppressor (siehe 1.1). Die wichtigen
Effekte von Smad4 in der Entwicklung zeigten sich bei Untersuchungen von Mäusen
mit homozygoter Deletion von Smad4. Diese Mutation ist letal. Die Deletion eines
Allels verursachte in Mäusen nach einem Jahr die Entwicklung von malignen
intestinalen
Tumoren
(Takaku,
Oshima
u.
a.
1998).
Bisher
wurde
die
tumorsupprimierende Wirkung des TGFβ/Smad Signalweges hauptsächlich der
Repression von c-myc (Pietenpol, Holt u. a. 1990) und der Induktion der Zyklin
abhängigen Kinase Inhibitoren p15INK4b und p21CIP1 zugeschrieben (Feng, Lin u. a.
2000; Pardali, Kurisaki u. a. 2000). Aber die Tumorgenese ist komplexer und von vielen
Faktoren abhängig (Hanahan und Weinberg 2000). Der TGFβ/Smad Signalweg hat
neben der Kontrolle des Zellzyklus auch einen Einfluss auf das den Tumor umgebende
Stroma. Der Einfluss auf die Angiogenese zeigt sich in der Induktion von
Thrombospondin und Represssion von VEGF nach Smad4 Rekonstitution in Hs766T
Tumorzellen (Schwarte-Waldhoff, Volpert u. a. 2000).
1.5 MODELLSYSTEM ZUR UNTERSUCHUNG DER EFFEKTE VON
SMAD4
Zur Untersuchung der Effekte von Smad4 bietet sich die Wiederherstellung der Smad4
Expression in Tumorzelllinien an, die keine Smad4 Expression mehr aufweisen. Durch
1 EINLEITUNG
10
die anschließende, vergleichende Untersuchung der Smad4 exprimierenden Zellen und
der Kontrollzellen lassen sich ansonsten identische Zellen auf die Effekte von Smad4
untersuchen. Die Smad4 Expression geht erst spät im Verlauf der Karzinogenese nach
der Ansammlung anderer Mutationen verloren (siehe 1.1 Abbildung 1). Der hier
verwendete Ansatz bietet die Möglichkeit den Effekt der Smad4 Expression im üblichen
Kontext von anderen für Tumore charakteristischen Mutationen zu untersuchen.
Für die pankreatische Karzinomzelllinie Hs766T, die eine Deletion beider Allele von
Smad4 aufweist, wurde die tumorsupprimierende Funktion der stabilen Smad4
Expression bereits beschrieben (Schwarte-Waldhoff, Volpert u. a. 2000). Die Smad4
exprimierenden Klone zeigen nach subkutaner Injektion in Nacktmäuse im Gegensatz
zu den schnell wachsenden Kontrollklonen eine Begrenzung der Tumorgröße auf 3 bis
5 mm Durchmesser. Im Gegensatz dazu war unter Zellkulturbedingungen kein großer
Unterschied in der Proliferationsrate festzustellen. Die Behandlung von Cornea von
Ratten mit von den Zellen konditioniertem Medien führte nur als Reaktion auf
Überstände der Smad4 negativen Zellen zur Induktion von Blutgefäßen. Eine
Untersuchung von angiogenen Regulatoren führte zur Entdeckung der reziproken
Regulation von VEGF und Thrombospondin. Dies zeigt den Effekt der Smad4
Rekonstitution auf die Angiogenese. Neben diesen Genen, die auf Grund von
Beobachtungen und Hypothesen entdeckt wurden, sind andere vielfältige Auswirkungen
von Smad4 auf das Expressionsprofil der Zellen zu erwarten, da Smad4 ein
transkriptioneller
Komodulator
ist
und
schon
zahlreiche
Interaktionen
mit
Transkriptionsfaktoren beschrieben wurden. Die Verwendung der cDNA Array
Technologie bietet den Vorteil die Expressionslevel vieler Gene gleichzeitig bestimmen
zu können. Aufgrund der bekannten Regulation der Transkription von Genen durch
Smad4 ist die Verwendung einer Methode, die auch moderate Unterschiede zuverlässig
erkennen kann besonders wichtig.
1.6 ZIELSETZUNG DER ARBEIT
Diese Dissertation zielte darauf hin die Effekte der Wiederherstellung der Expression
des Tumorsuppressors Smad4 in pankreatischen Karzinomzelllinien zu untersuchen.
Um
einen
Überblick
über
die
Effekte
von
Smad4
auf
Ebene
der
Transkriptionsregulation zu erhalten, sollten Smad4 abhängig transkriptionell regulierte
1 EINLEITUNG
11
Gene gefunden werden. Diese Kandidatengene können durch die Erstellung und den
Vergleich von Expressionsprofilen mit Makroarrays schnell entdeckt werden. Da sich
aber die Zellen nur in der Expression von Smad4 und in den sich hierdurch ergebenden
Effekten
unterscheiden,
ist
es
besonders
wichtig
auch
relativ
moderate
Expressionsdifferenzen messen zu können. Die stabil Smad4 exprimieren Klone der
Zelllinie Hs766T zeigten in Nacktmausexperimenten eine verringerte Tumorprogression
(Schwarte-Waldhoff, Volpert u. a. 2000) Der Vergleich dieser Klone mit
Kontrollklonen sollte zu Erkenntnissen über die tumorsupprimierende Funktion von
Smad4 führen. Unter Verwendung dieser Zellen sollte eine Auswertungsmethode für
die Makroarrays entwickelt und validiert werden, die auch moderate Unterschiede
anzeigen kann. Die Ergebnisse der Makroarrayhybridisierungen sollten durch NorthernBlot Hybridisierungen validiert werden und so die Auswertungsmethode weiter
optimiert werden. Die so erhaltene valide Auswertungsmethode kann dann auch über
diese Arbeit hinaus für weitere Analysen in anderen Zellsystemen verwendet werden.
Die Ergebnisse der Arrayhybridierungen mit den Hs766T Zellen sollten dann nach
möglichen Smad4 Effekten durchsucht werden und falls sich solche ergeben diese in
weiteren funktionellen Analysen untersucht werden. Um die tumorsupprimierende
Funktion von Smad4 noch genauer zu untersuchen sollten Expressionsprofile von
Nacktmaustumoren derselben Klone aufgenommen werden, um auch in vivo die Effekte
der Expression von Smad4 zu ermitteln. In CFPAC1 einer weiteren Smad4 defizienten
Pankreaskarzinomzelllinie sollte durch retrovirale Transduktion Smad4 stabil
eingebracht werden, um auch in dieser die Effekte der Smad4 Rekonstitution zu
untersuchen.
2 MATERIAL
2.1 PUFFER UND LÖSUNGEN
10fach Laufpuffer für
Proteingele
250 mM Tris, pH 8,3
1,92 M Glycin
1 % SDS
10fach MOPS
0,2 M MOPS
50 mM NaAc
10 mM EDTA
pH 7,0
10fach PBS
1,37 M
27 mM
15 mM
43 mM
20fach SDS
NaCl
KCl
KH2PO4
Na2PO4
20 % (w/v) SDS, zum Lösen auf 65°C erhitzen
20fach SSC
3 M NaCl
0,3 M tri-Natriumcitrat
pH 7,0
50fach Denhardt
10 g/l BSA
10 g/l Ficoll (Typ 400, Sigma)
10 g/l Polyvinylpyrrolidone (PVP 360 K,
Sigma)
50fach TAE-Puffer
2 M Tris
1 M Eisessig
50 mM Na2 EDTA .2 H2O
DNA-Ladepuffer
0,21 % Bromphenolblau
0,21 % Xylencyanid
12,5 % Ficoll (Typ 400, Sigma)
H2ODEPC
Heringssperma DNA
Lösung
High TE-Puffer
0,1 % (v/v) DEPC (Diethylpyrocarbonat)
lösen, über Nacht inkubieren,
autoklavieren
500 ng/ml gescherte Heringssperma DNA
10 mM Tris/HCl, pH 8.0
1 mM EDTA
100 mM Tris/HCl, pH 8.0
25mM EDTA
2 MATERIAL
Hybridisierungslösung
13
5,5 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Formamid
50-fach Denhardt
50 % Dextransulfat
20 % SDS
5 M NaCl
pro Hybridisierungsflasche
Lösung D
4M
25 mM
0,5 %
7,2 µl/ml
Guadiniumthiocyanat
Natriumcitrat
N-Lauroyl-Sarcosine
β-Mercaptoethanol
NP-40 Lysepuffer
0,5 %
100 mM
25 mM
1 mM
1 mM
Nonidet P 40
NaCl
Tris, pH 7,4
EDTA
PMSF
complete Protease-InhibitorCocktail (Roche)
OD-Puffer
10 mM Tris/HCl pH 7,5
Präparationspuffer
20 mM
1%
1 mM
5 mM
10%
2 mM
0,1 M
PräparationspufferSupplement
Protein-Probenpuffer
RNA-Ladepuffer
RNA-Probenpuffer
HEPES
Triton X-100
DTT
Benzamidin
Glyzerin
EDTA
NaCl
10% BSA
1500 U/ml Trasylol
in PBS
100 mM
200 mM
4%
0,2 %
20 %
Tris, pH 6,8
DTT
SDS
Bromphenolblau
Glycerol
50 % Glycerin
1 mM EDTA
0,2 % Bromphenolblau
für eine RNA-Probe wurden 1 µl
Ladepuffer mit 0,7 µl
Ethidiumbromid-Lösung versetzt
5 µl Formamid
2 µl Formaldehyd
1 µl MOPS-Puffer
Angaben für eine Probe
2 MATERIAL
14
Sammelgelpuffer
5 % Acrylamid /Bisacrylamid-Lösung
(Gel 30,Roth)
125 mM Tris, pH 8,8
0,1 % SDS
0,1 % APS
0,1 % TEMED
Semi-dry Transferpuffer
Kathodenpuffer ,pH 9,4
25 mM Tris
40 mM 6-Aminohexansäure
20 % Isopropanol
Anode-I-Puffer, pH 10,4
30 mM Tris
20 % Isopropanol
Anode-II-Puffer, pH 10,4
300 mM Tris
20 % Isopropanol
Trenngelpuffer
Üblicherweise 8 % Acrylamid /Bisacrylamid-Lösung
(Gel 30,Roth)
375 mM Tris, pH 8,8
0,1 % SDS
0,1 % APS
0,1 % TEMED
Alle Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben mit H2Odest angesetzt.
ExpressHybTM Hybridisierungslösung
Clontech
2.2 MEDIEN
Dulbecco´s Modified Eagle Medium
Gibco / Life Technologies
Penicillin / Streptomycin
Gibco / Life Technologies
L-Glutamin
Gibco / Life Technologies
Natrium-Pyruvat
Gibco / Life Technologies
fötales Kälberserum
Gibco / Life Technologies
Geneticin (G418)
Gibco / Life Technologies
Trypsin/EDTA
Gibco / Life Technologies
BM-Cyclin
Roche
2 MATERIAL
15
2.3 CHEMIKALIEN
Gescherte Heringssperma DNA
Sigma
α-32PdATP (10µCi/µl; 3000 Ci/mmol)
Hartmann Analytics
Alle hier nicht gesondert aufgeführten Chemikalien wurden unter anderem von Gibco
BRL, Merck, Roth, Serva oder Sigma bezogen.
2.4 ZELLLINIEN
Die Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville,
MD, USA) bezogen. Die Zelllinie Hs766T wurde von Owens und Mitarbeitern 1973 am
Naval Biosciences Laboratory aus einem pankreatischen Adenokarzinom mit
Lymphknotenmetastase isoliert und weist einen epithelialen Phänotyp auf. Der
Karyotyp ist verändert und die Zellen bilden sowohl in Methocel, als auch auf
kontaktinhibierenden Zelleinzelschichten Kolonien aus. Die Zelllinie CFPAC-1 stammt
aus einem duktalen Adenokarzinom mit einer Lebermetastase und wurde von
Shoumacher isoliert (Schoumacher, Ram u. a. 1990). Beiden ist eine homozygote
Deletion von Smad4 gemein, was sie für die Untersuchung von Effekten nach Smad4
Expression besonders geeignet macht.
2.5 ANTIKÖRPER
Für die Detektion von Smad4 auf Immobilon P Membranen wurde der Antikörper
α-Smad4 Klon B8 von Santa Cruz in einer Verdünnung von 1:500 eingesetzt. Die
Detektion von β-Tubulin wurde mit dem Klon 2.1 von Sigma in einer Verdünnung von
1:2000 durchgeführt. Als sekundärer mit Peroxidase-konjugierter Antikörper diente α
mouse HRP von Santa Cruz in einer Verdünnung von 1:2000.
2.6 ENZYME
DNA Polymerase I Klenow Fragment
Invitrogen
Superscript II RNase H- Reverse Transkriptase
Invitrogen
Taq DNA Polymerase
Gibco Life Technologies
2 MATERIAL
16
2.7 KITS
BD Atlas™ Nylon Arrays
BD Clontech
BD Atlas™ Pure Total RNA Labeling Kit
BD Clontech
Bradford-Reagenz
Bio-Rad
ECL Western Blot Detection Reagenz
Amersham
Interferon γ ELISA Kit
Coulter Immunotech Inc.
Megaprime Labeling Kit (RPN 1605)
Amersham
PCR Mycoplasma Detection Kit
Panvera
QiaEx Gelextraction Kit
Qiagen
QiaQuick Nucleotide Removal Kit
Qiagen
RNeasy Kit
Qiagen
2.8 VERBRAUCHSMATERIALIEN
Chromaspin Säulen
Clontech
Hybond N Nylon Membran
Amersham
Hyperfilm ECL
Amersham
Immobilon-P Membran
Millipore
QIAShredder
Qiagen
Zellkulturmaterial
Greiner bio-one
2.9 GERÄTE
Axiovert S100
Zeiss
Cyclone Storage Phosphorimager
Packard Instruments
2 MATERIAL
17
Hybridisierungsflaschen
Schott
Multi Image Light Cabinet
Alpha Innotech Corporation
Multiscan RC
Labsystems
Rotanta 96R
Hettich
Semi dry Blotter Pegasus
Phase
Triathler Multilabeltester
Hides
Trio Thermoblock
Biometra
US Autoflow CO2 Water Jacketed Inkubator
Nuaire
Zentrifuge 5417R
Eppendorf
2.10 PRIMER
Für Amplifizierung von Fragmenten zur Synthese von DNA-Sonden wurden die
nachfolgenden Primersequenzen verwendet.
β-Aktin
ACCTTCAACACCCCAGCCATGTACG
CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG
CD74
CATGTTGCCATACTTGGTGG
CCCTGTACACAGGCTTTTCC
CDC25B
TTTCCTGTCCCACCATACGAGCACCT
CTGGATCCGCAACAAGACAGCAGCAAGTTCTGAG
CDC37H
ACAGATCAAGCACTTTGGCATGCTTCG
CTGGATCCGGCGATCGGCTGTCTTAATCTTAGTG
CDH11
TGCTGTATCCCACGGAGATCACCGTC
GACTGCAGAATAGGGTAGCCCAGCCATTTACCCG
2 MATERIAL
CDH3
18
CTGGATCCTATGGATGGAGTAAGCAACC
TTCTACAGCATCACGGGGCC
CDH6
GCTTTTTGAATCGAGGTCCC
GCACCCTGAGGAATCCTGAAG
CK19
CAGGTCAGTGTGGAGGTGGATTCC
CTGGATCCAGCTCAATCTCAAGACCCTGAAGGG
ERF1
GCCCATCTTCAGCAGACTTTCCATC
CTGGATCCAATTGACTTGTCCTTATGTTAGGTGGG
ERK5
GACAGTGTACCCAGGTGCCGACC
CTGGATCCGGATGCCCTCACGCCTTGCATGG
FLT3LG
AAAGGGCTGTCACCCGGCTTGGCCC
CTGGATCCGCGACAGTCTTGAGCCGCTCCATCCA
FRA1
CCCTGCCGCCCTGTACCTTGTATC
CTGGATCCAGACATTGGCTAGGGTGGCATCTGCA
GBP2
TTTGGTCCACATCCTTGAAAG
ACAAGTTGCAGAATTTTGTTCC
GNBPG10
TGCAGAGCTTCAACAGTACTGTATGC
CTGGATCCTATCTGTGATTTTGGCTATAGGACCAG
GRP78
GGGTGGCGGAACCTTCGATGTGTC
CTGGATCCATTTGGCCCGAGTCAGGGTCTCAG
GSPT1
TCCATATCTGGATAATTTGCCGAACTTC
CTGGATCCTACGGTATCAGTCTCTACATCATCGG
2 MATERIAL
HD2
19
TATCAACCTAGTGCTGTGGTATTACAG
CTGGATCCACAATCAAGGGCAACTGCAGTCTC
HLA-G
GCAGACCCTGCGCGGCTACTAC
CTGGATCCACTTGCGCTTGGAGATCTGAGCC
IFI17
TCATCCTGTCACTGGTATTCGGCTC
CTGGATCCGTGGGTATAAACTGCTGTATCTAGGG
IFI27
TCCGGAGAGTCCAGTTGCTC
CTCACCTCATCAGCAGTGACC
IFI-6-16
GATACTTGTGGGTGGCGTAC
TCCGTTTTCTTGTGCTACCTG
IFIT1
TGATCATCAGGTCAAGGATAGTCTGG
CTGGATCCTGCCCATGTGGTAATACATCCAGG
Interferon γ
ATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGG
TTTTCGCTTCCCTGTTTTAGCTGCTGGC
IRF1
TGAAAGACCAGAGCAGGAACAAGGGC
CTGGATCCACTGTGTAGCTGCTGTGGTCATCAGG
ITGB4
CTCTCCCTGCAGTTTATTCC
GGACCTGTACATCCTCATGG
JUN
TTAACAGTGGGTGCCAACTCATGCTAACGC
CTGGATCCGAGATCGAATGTTAGGTCCATGCAGTTC
MAPKK1
GCAGCTCCCTTATGATCTGG
CTGCAGTTAACGGGACCAG
2 MATERIAL
Mesothelin
20
CCGTTCATGTTCTGGAAAGCAAGGC
GGGCCAGCTAGACAAAGACACCC
MIC1
ACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTG
CTGGATCCTGGCTAACAAGTCATCATAGGTCTGG
MX1
GGTAGCCACTGGACTGACGACTTG
CTGGATCCGCAAGGTGGAGCGATTCTGAGGG
NEDDH5
GGTGGTCGGTGAATCAGGTCTAGG
CTGGATCCGCCTGTTCAAGCCGCTCTCGTC
Nexin
TATCAAGTGCCAATGCTGGCCCAGC
CTGGATCCGTGAACTTGGGCAGGATCACCTGC
NFKB2
CTGCACCTAGCCATCATCCACGGG
CTGGATCCTGGATACAGTCCCTCAAAGTCAGGC
NFKBIA
GGCTGGTTGGTGATCACAG
GCTGAAGAAGGAGCGGCTAC
NGALP25
CAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGG
CTGGATCCGAGGGTGATCTTGAAGTACTCCCTG
OAS2
TGGTTTTCTGCAACTGGCTC
CCTGCAGCGAAACTTCATTC
P21 rac2
GCAAGACCTGCCTTCTCATCAGC
CTGGATCCTCGATGGTGTCCTTGTCGTCCC
PIG7
TATTACCCCACTCCTCCAGCTCCC
CTGGATCCGGCGTTATAGGACAGCTGACTCACG
2 MATERIAL
PSMB9
21
ACCGGCAGCTGTAATAGTGAC
TATCGAGAGGACTTGTCTGCAC
STAT3
TAGTGAACTGGACGCCGGTC
GGGGCTTTTGTCAGCGATG
TGFBI
TGGTGATGGTGGAGATGACC
CTTCACCATCTTCGCCCCTAG
TIEG
CTTTGGGGACTTGTGTGCC
GTGAGAGAAACACAGTGGCAGATG
3 METHODEN
3.1 DNA
3.1.1
CDNA SYNTHESE
Die cDNA wurde mit SuperScript II RNase H- Reverser Transkriptase (Invitrogen)
hergestellt. In einem 20 µl Ansatz wurden hierzu 5 µg Gesamt-RNA mit 1 µl Oligo-dT
(12-18mer, 500µg/ml) und 1µl dNTP Mix (10 mM je Nukleotid) mit H2O auf 12 µl
eingestellt. Nach fünf Minuten bei 65°C wurde die Lösung auf 4°C abgekühlt.
Anschließend wurden 4 µl 5-fach First-Strand Puffer, 2 µl 0,1 M DTT und 1µl RNasin
(40U/µl) zugegeben. Nach zwei Minuten bei 42°C wurde 1 µl SuperScript II zugegeben
und in 50 Min bei 42°C die DNA-Kopie der RNA hergestellt. Durch 15 Min bei 70 °C
wurde das Enzym inaktiviert. Die cDNA konnte dann zur Sondensynthese verwendet
werden.
3.1.2 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN
Unter langwelligem UV-Licht wurden die gewünschten DNA Fragmente mit einem
Skalpell entsprechend der Bande aus dem Gel ausgeschnitten. Die Extraktion der DNA
erfolgte mit dem Qiaex Gel-Extraktion Kit von Qiagen nach Angaben des Herstellers.
3.1.3 HERSTELLUNG VON DNA SONDEN FÜR DIE NORTHERN BLOT
HYBRIDISIERUNG
Zur schnellen Herstellung von Sonden wurden diese mit genspezifischen Primern aus
oligo dT-geprimter cDNA (Herstellung siehe 3.1.1) mittels PCR amplifiziert. Für die
Synthese der genspezifischen Primer bei der Firma MWG Biotech wurden entweder die
Primersequenzen der Atlasfilter von BD Clontech verwendet, oder eigene mit Hilfe des
Programms
Vector
NTI
bestimmt.
Die
zur
Primerkonstruktion
benötigten
Gensequenzen wurden von der Gendatenbank des National Center for Biotechnology
Information (USA, www.ncbi.nlm.nih.gov) bezogen. Anhand der so erhaltenen Sequenz
des zu amplifizierenden Gens wurde ein Primerpaar ermittelt, welches ein Produkt von
250 bis 350 Basenpaaren amplifiziert. Es wurde auf einen GC-Gehalt um 50%, geringe
Abweichungen in den Schmelzpunkten der Primer und eine Zytosin- oder Guaninbase
am 3’ Ende geachtet. Die Sonden wurden anschließend mit Hilfe von BLAST
3 METHODEN
23
(www.ncbi.nlm.nih.gov) auf mögliche Homologien zu anderen Genen untersucht.
Dieses Programm ermöglicht einen Ähnlichkeitsvergleich der Primersequenzen mit den
verschiedenen in der Gendatenbank enthaltenen Sequenzen. Das Ergebnis der BLASTSuche zeigte dann alle entsprechenden Sequenzen an, die der Primer hybridisieren kann.
Falls sich durch zu starke Homologien des gewählten Bereichs zu anderen Genen
ergaben, wurde ein PCR-Fragment aus einem anderen Bereich des Gens gewählt.
Üblicherweise wurde die Amplifizierung in einem 50 µl Ansatz nach dem Protokoll von
Gibco / Lifetechnologies durchgeführt:
2 µl
5 µl
1,5 µl
1 µl
1 µl
1 µl
0,4 µl
oligo dT initiierte cDNA
10-fach PCR-Puffer
50 mM MgCl2
dNTP-Lösung (jeweils 10 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
5’ genspezifischer Primer
3’ genspezifischer Primer
Taq-DNA Polymerase (Gibco / Life Technologies)
wurden mit H2O bis zum Endvolumen von 50 µl aufgefüllt
Die PCR-Reaktion unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Schritt
1
2
3
4
Phase
Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Synthese
5
Synthese
Bedingungen
2 Min 94°C
30 Sek 94°C
1 Min 5-10°C unter dem Schmelzpunkt der Primer
30 Sek 72°C
35 Wiederholungen von Schritt 2 bis 4
10 Min 72°C
Die PCR Produkte wurden in einem 2%igen Agarose Gel mit Ethidiumbromid in
einfachem TAE-Puffer elektrophoretisch aufgetrennt und die DNA-Fragmente isoliert
(siehe 3.1.2).
3.2 RNA
3.2.1 PRÄPARATION VON RNA
3.2.1.1 PHENOL-CHLOROFORM-ISOAMYLALKOHOL EXTRAKTION
Die Präparation von RNA wurde nach einem Protokoll von Chomczynski und Sacchi
(Chomczynski und Sacchi 1987) durchgeführt. Hierzu wurde Lösung D frisch mit
β-Mercaptoethanol versetzt und die Zellen in 2 ml pro 10 cm Zellkulturschale lysiert.
Das Lysat wurde in ein Polypropylen Röhrchen überführt. Nach der Zugabe von 200 µl
2M NaAc (pH 4,0), 2 ml H2O gesättigtem Phenol und 400 µl Chloroform /
3 METHODEN
24
Isoamylalkohol (Mischungsverhältnis 49:1) wurde gemischt und 15 Min auf Eis
gekühlt. Anschließend wurde 20 Min zentrifugiert (4°C, 3500 U/Min, Heraeus Varifuge
25). Die obere, wässrige und nukleinsäurehaltige Phase wurde in ein neues
Polypropylen Röhrchen überführt. Die proteinhaltige Interphase und die organische
untere Phase wurden entsorgt. Nach der Zugabe von Isopropanol (einfache Menge des
Volumen des Überstandes) wurden die Nukleinsäuren eine Stunde bei -20°C
präzipitiert. Nach dem Abzentrifugieren (20 Min, 4°C, 3500 U/Min) wurde das
Präzipitat in 500 µl Lösung D gelöst und in ein Eppendorf Gefäß (1,5 ml) überführt.
Nach der Zugabe von 500 µl Isopropanol wurden die Nukleinsäuren eine Stunde bei 20°C präzipitiert und 10 Minuten bei 4°C und 13000 U/Min in der Tischzentrifuge
sedimentiert. Die RNA wurde in 400 µl DEPC-Wasser gelöst und nach der Zugabe von
40 µl NaAc (3 M, pH 5,2) und 800 µl Ethanol durch Zentrifugation (10 Min, 4°C,
13000 U/Min) präzipitiert. Die RNA wurde in etwa 50 µl DEPC-Wasser aufgenommen.
Um die Löslichkeit zu erhöhen wurde die RNA fünf Minuten bei 65°C inkubiert. Zur
Konzentrationsbestimmung wurde die optische Dichte bei 260 nm in OD-Puffer
photometrisch bestimmt (1OD entspricht etwa 40 µg/ml an RNA). Als Maß für die
Reinheit wurde der Quotient der OD bei 260 und der OD bei 280 nm berechnet (reine
RNA-Lösung 2,0).
3.2.2 RNA GELELEKTROPHORESE UND NORTHERN BLOT
Die RNA-Gelelektrophorese wurde wie folgt. Üblicherweise wurden 6 µg Gesamt-RNA
pro Spur eingesetzt. Die RNA wurde in RNA-Probenpuffer mit Formamid und
Formaldehyd 10 Minuten bei 65°C denaturiert. Nach der Zugabe von RNA-Ladepuffer
erfolgte die elektrophoretische Auftrennung in einem 1%igen Agarosegel mit 2,5%
Formaldehyd. Das Gel wurde 1,5 Stunden bei 75 V in 1-fach MOPS Puffer. Auf einem
UV-Leuchttisch wurde das Gel anschließend mit einer CCD-Kamera dokumentiert. Vor
dem Kapillarblot der RNA auf eine Nylonmembran (Hybond N, Amersham) wurde das
Formaldehyd durch Waschen mit H2ODEPC aus dem Gel entfernt. Mit 20x SSC als
Transferpuffer wurde dann über Nacht die RNA transferiert. Durch kurze Bestrahlung
mit UV-Licht wurde die RNA an der Nylonmembran fixiert. Die Membranen wurden
danach mit 2x SSC gewaschen und konnten in Kunststofffolie gelagert, oder direkt für
eine Hybridisierung verwendet werden.
3 METHODEN
25
3.2.3 NORTHERN BLOT HYBRIDISIERUNG
Der Nachweis von spezifischen Transkripten aus der auf Nylonmembranen
aufgebrachten RNA erfolgte mit einer radioaktiv markierten cDNA Sonde. Die
Northern Blots wurden hierzu mit der RNA Seite nach innen in Hybridisierungsflaschen
(Schott) gegeben und mit der Vorhybridisierungslösung mindestens eine Stunde bei
42°C im Hybridisierungsofen inkubiert. Die Synthese der radioaktiven Sonde erfolgte
mit zufälligen Hexanukleotiden als Primern mit dem Megaprime Labeling Kit (RPN
1605, Amersham). Als radioaktives Nukleotid wurde α32P-dATP (Hartmann Analytics)
eingesetzt. Zur Markierungsreaktion wurden 25 ng der jeweiligen DNA Sonde
verwendet. Die Sonde wurde mit 2,5 µl High TE-Puffer und 2,5 µl Primer-Mischung 5
Min aufgekocht und bei Raumtemperatur abgekühlt. Hieran anschließend wurden die
unmarkierten Nukleotide (CTP, GTP, TTP, je 2 µl), der Reaktionspuffer (2,5 µl), das
Klenow-Fragment (1 µl) und das radioaktiv markierte Nukleotid (α32P-dATP, 3000
mCi/ mmol) zugegeben. Die Markierungsreaktion erfolgte im Heizblock für 30 Minuten
bei 37°C. Die Reaktion wurde mit 0,2 M EDTA (2,5 µl) gestoppt und die freien
Nukleotide durch Zentrifugation durch Chromaspin-Säulen (Clontech) entfernt. Zur
Messung der Aktivität der Sonde wurde 1 µl mit 200 µl H2O im Szintillationszähler
gemessen. Der Rest der Sonde wurde für 5 Minuten aufgekocht und auf Eis abgekühlt.
Nach kurzer Zentrifugation (30 s, 13500 U/Min) wurde die Sonde dann zum Northern
Blot in die Vorhybridisierungslösung gegeben und über Nacht bei 50°C im
Hybridisierungsofen inkubiert. Falls diese Bedingungen für die Sonde zu stringent
waren, wurde die Hybridisierung bei 42°C durchgeführt. Im Anschluss an die
Hybridisierung wurde der Northern Blot zweimal 5 Min mit 2 x SSC und 0,5% SDS
gewaschen. Danach wurde einmal 15 Minuten mit 2x SSC und 0,5% SDS und zum
Abschluss dreimal 15 Minuten mit 0,5x SSC und 0,5% SDS gewaschen. Die
Membranen wurden anschließend in Folie eingeschweißt und auf Phosporimager
Screens exponiert. Membranen, die anschließend mit einer weiteren Sonde hybridisiert
werden sollten, wurden 10 Minuten mit kochender 0,1% SDS Lösung inkubiert und mit
2x SSC Lösung gespült. Der Filter konnte dann für weitere Hybridisierungen verwendet
werden.
3 METHODEN
26
3.2.4 DIGITALISIERUNG VON HYBRIDISIERTEN MEMBRANEN
Nach 3 bis 14 Tagen wurden die Phosphorimager Screens mit einem Cyclone
Phosphorimager (Packard) unter Steuerung durch die Software Optiquant digitalisiert.
Die densitometrische Auswertung wurde direkt in der Optiquant Software durchgeführt.
Falls die Daten im Programm GenePix ProTM (Axon Instruments, Inc.) zur
Arrayauswertung weiterverwendet werden sollten, wurden die erhaltenen 16 Bit TIFF
Bilddaten in von diesem Programm lesbare 16 Bit GEL Bilder exportiert.
3.2.5 CLONTECH CDNA EXPRESSIONS ARRAY
Die Durchführung der cDNA Array Hybridisierung erfolgte grundsätzlich anhand der
Herstellerangaben im AtlasTM Pure Total RNA Labeling System Nutzerhandbuch und
anhand des BD Atlas™ cDNA Expression Arrays Anwenderhandbuchs. Abweichend
vom Originalprotokoll wurde als reverse Transkriptase die Superscript II RNase HReverse Transkriptase von Invitrogen verwendet, da mit ihr in Vorexperimenten bessere
Ergebnisse erzielt wurden. Außerdem wurde für die Trennung der radioaktiven
Nukleotide von den markierten cDNA-Sonden das QIAquick Nucleotide Removal Kit
von Qiagen verwendet.
3.2.5.1 ANREICHERUNG VON POLYA+-RNA
Die Anreicherung der PolyA+-RNA wurde mit dem Atlas Total pure RNA Labeling Kit
(Clontech,
Inc)
nach
Herstellerangaben durchgeführt. Zur Vorbereitung der
magnetischen, Streptavidin-gekoppelten Beads wurden diese resuspendiert und pro
Hybridisierungsansatz 15 µl mit 400 µl einfachem Binding Buffer versetzt. Nach dem
Mischen wurden die Beads im Magnetseparator gesammelt und der Überstand
abgenommen. Der Waschvorgang wurde dreimal wiederholt. Die Beads wurden
abschließend in 15 µl einfachem Binding Buffer gelöst.
Das Volumen von 20 µg RNA wurde mit H2ODEPC auf 45 µl eingestellt und 1 µl der
biotinylierten Oligo-dT Primer zugegeben. Nach gutem Durchmischen wurde die RNA
mit ihrem Poly-Adenin-Ende durch zweiminütiges Erhitzen auf 70°C und 10 Minuten
bei RT an die Oligo-dT Primer gebunden. Anschließend wurden 45 µl 2fach Binding
Buffer zugegeben und durch Pipettieren gemischt. Die zuvor gewaschenen Beads
wurden resuspendiert und 15 µl in jeden Ansatz gegeben. Die Suspension wurde 25
Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und die magnetischen Beads mit dem
3 METHODEN
27
Magnetseparator gesammelt. Der Überstand wurde entsorgt und zweimal mit je 50 µl
einfachem Wash Buffer gewaschen. Die Beads wurden hierbei zwischen den
Waschschritten durch leichtes Klopfen resuspendiert. Nach der Zugabe von je 50 µl
Reactionbuffer und der Sammlung der Beads mit dem Magnetseparator wurde der
Überstand entsorgt und die Beads in 6 µl je Ansatz aufgenommen.
3.2.5.2 SYNTHESE DER CDNA PROBEN
Für die Synthese der cDNA Sonden wurde zunächst eine Reaktionsmischung
vorbereitet:
Reaktionsmischung (ohne Enzym)
fünffach Reaction Buffer
10fach dNTP Mix
α-32P-dATP (3000 Ci/mmol, 10 µCi/µl)
100 mM DTT
pro Ansatz
4 µl
2 µl
5 µl
0,5 µl
Jeweils 2 µl des jeweiligen CDS Primer Mix wurden zu den resuspendierten Beads
pipettiert und diese im vorgeheizten Thermoblock zwei Minuten bei 65°C inkubiert. In
dieser Zeit wurden pro Ansatz 2 µl Superscript II RNase H- Reverse Transkriptase
(Invitrogen) in die Reaktionsmischung gegeben. Die Beads wurden zwei Minuten bei
50°C inkubiert und in jeden Ansatz 13,5 µl der Reaktionsmischung pipettiert.
Anschließend fand für 25 Minuten bei 50°C die Synthese der cDNA Sonden statt. Die
Reaktion wurde durch Zugabe von 2 µl Terminationsmix beendet und das Enzym durch
fünf Minuten bei 70°C inaktiviert. Nach einer dreiminütigen Inkubation auf Eis wurde
die Lösung durch kurze Zentrifugation gesammelt. Die anschließende Trennung der
cDNA Sonden von den Nukleotiden erfolgte mit dem QIAquick Nucleotide Removal
Kit (Qiagen). Um die überschüssigen radioaktiven Nukleotide nach der Synthese der
DNA-Sonden zu entfernen, wurden in jeden Ansatz 250 µl PN-Buffer gegeben und die
Lösung nach gutem Durchmischen auf die Silica-Membran-Säule gegeben und eine
Minute bei 6000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde zweimal mit 500 µ Buffer
PE gewaschen (Zentrifugation 1 Min, 6000 U/Min). Nach dem Trocknen der Säule
durch einminütige Zentrifugation bei 13000 U/Min wurde die DNA durch Zugabe von
100 bis 200 µl Buffer EB (10 mM Tris/HCl, pH 8,5) und einminütiger Zentrifugation
bei 13000 U/Min in ein neues Eppendorf Gefäß eluiert.
3 METHODEN
28
3.2.5.3 HYBRIDISIERUNG
Die Hybridisierung der Array-Membranen erfolgte in ExpressHyb Hybridization
Solution (Clontech) unter Zugabe von gescherter Heringssperma-DNA. Die
Hybridisierungslösung wurde bis zum vollständigen Lösen bei 68°C inkubiert. In der
Zwischenzeit wurde gescherte Heringssperma-DNA bei 100°C für fünf Minuten
denaturiert und schnell auf Eis abgekühlt. Pro Milliliter wurden 0,1 mg DNA in die
warme ExpressHyb Hybridization Lösung gegeben und bis zur Benutzung auf 68°C
gehalten. Die Hybridisierungsflaschen wurden mit destilliertem Wasser gefüllt und die
Membranen hineingegeben. Nachdem das Wasser ausgegossen war und sich die
Membranen ohne Luftblasen an die Hybridisierungsflasche angelegt hatten, wurden
jeweils 10 ml der vorbereiteten ExpressHyb Hybridization Lösung hinzugegeben. Die
Membranen wurden in dieser Lösung für 30 Min prähybridisiert und die denaturierten
Sonden hinzugegeben. Bei 68°C wurde über Nacht hybridisiert. Zum Waschen der
Membranen wurde eine zweifache SSC-Lösung mit 0,5 % SDS und eine 0,5fache SSCLösung mit 0,5 % SDS vorbereitet und auf 68°C erwärmt. Die Membranen wurden
einmal kurz mit der zweifachen SSC-Lösung und zweimal für 30 Minuten mit
dergleichen Lösung bei 68°C gewaschen. Anschließend wurde noch zweimal mit der
0,5fachen SSC-Lösung gewaschen und die Filter für die Detektion in Folie
eingeschweißt. Die Exposition erfolgte, wie auch nach den Northern Blot
Hybridisierungen, auf Phosphorimager Screens. Vor einer erneuten Hybridisierung
derselben Membran musste die hybridisierte DNA entfernt werden. Hierzu wurde eine
0,5%ige SDS Lösung erwärmt und der Filter fünf bis zehn Minuten in der Lösung
gekocht. Nach dem Abkühlen konnte der Filter für die nächste Hybridisierung
eingesetzt werden.
3.3 PROTEIN
3.3.1 PRÄPARATION VON PROTEINEN
Zur Präparation von Proteinen wurden die Zellen mit eiskaltem PBS gewaschen und mit
500 bis 700 µl NP-40 Lysepuffer auf Eis lysiert. Die Lysate wurden 30 Min lang in
einem Überkopfschüttler bewegt. Unlysierte Zelltrümmer wurden durch Sedimentation
entfernt (10 Minuten, 15000 g, 4°C). Zur Konzentrationsbestimmung der Proteinlösung
wurde ein Bradford Test von Bio-Rad verwendet. Diese Art der Proteinbestimmung
3 METHODEN
29
nutzt die von der Proteinbindung abhängige Verschiebung des Absorptionsmaximums
des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G-250 in saurer Lösung (465 nm zu 595
nm)(Bradford 1976). Die Durchführung erfolgte im 200 µl Maßstab nach
Herstellerangaben. Die verwendete Eichreihe umfasste Konzentrationen von 0,5 bis 5
µg BSA pro µl.
3.3.2 PROTEINGELELEKTROPHORESE MITTELS SDS-PAGE
Üblicherweise wurden 50 µg Protein in Protein-Probenpuffer aufgenommen. Nach
fünfminütigem Erhitzen auf 95°C wurde sie auf Eis abgekühlt. Die Auftrennung der
Proteine
erfolgte
entsprechend
ihrem
Molekulargewicht
in
einem
SDS-
Polyacrylamidgel. Durch Inkubation der Proteine mit SDS und reduzierenden Mitteln,
die Schwefelbrücken unterbinden, werden die Proteine vollständig denaturiert und
dissoziiert. SDS bindet an hydrophobe Regionen der Proteine. Die stark negative
Ladung von SDS nivelliert alle Ladungen der Proteine, so dass in der Regel alle
Proteine eine ähnliche Form und ein identisches Ladungs-Masse Verhältnis aufweisen.
Die Auftrennung der Proteine erfolgt dann im Polyacrylamidgel nur aufgrund von
Siebeffekten. Zur Konzentrierung der Proteine wurde über das Trenngel ein Sammelgel
mit niedrigerem pH-Wert gegossen. Durch den niedrigen pH-Wert wird das im Puffer
enthaltene Glycin protoniert und der Ladungstransport durch die Bewegung der
Proteine erreicht. Die Auftrennung der Proteine erfolgte dann im stärker vernetzten
Trenngel.
3.3.3 WESTERN BLOT UND IMMUNDETEKTION VON PROTEINEN
Der Transfer der Proteine aus dem Gel auf eine Immobilon P Membran (Millipore)
erfolgte im Semi-Dry-Blot Verfahren. Zur Auftrags- und Übertragskontrolle wurde die
Membran mit Ponceau-S Lösung, oder mit Amidoschwarz-Lösung gefärbt. Für den
Western Blot wurde die gefärbte Immobilon P Membran (Millipore) über Nacht in PBS
mit 0,5% Tween und 5% Magermilchpulver zur Blockierung eingelegt. Anschließend
wurde zwei Stunden mit dem Primärantikörper in PBS mit 0,5% Tween und 1%
Magermilchpulver in PBS inkubiert. Es folgten fünf Waschschritte mit 0,5% Tween in
PBS und die 45 Minuten andauernde Inkubation mit dem zweiten Antikörper in PBS
mit 0,5% Tween und 1% Magermilchpulver. Die Detektion der Peroxidaseaktivität
erfolgte mit dem ECL-Reagenz (Amersham) nach Angaben des Herstellers. Zur
3 METHODEN
30
Detektion wurden Röntgenfilme für fünf Sekunden bis zwei Stunden exponiert und
entwickelt.
3.3.4 NACHWEIS VON INTERFERON γ
Zur Detektion von Interferon γ wurde der Interferon γ ELISA von Coulter Immunotech
Inc. nach Herstellerangaben verwendet. Als positive Kontrolle dienten humane
Lymphozyten, die mit Ionomycin und Phorbolester aktiviert wurden (zur Verfügung
gestellt von Dr. Jan Schmielau). Die Interferon Menge wurde zum einen direkt aus
Zellkulturüberständen bestimmt. Für die Messung der intrazellulären Interferone
wurden die Zellen vor der Messung fünfeinhalb Stunden mit dem Inhibitor des GolgiTransportes Monensin (2 µM in DMSO) behandelt. Nach dem Waschen mit PBS
wurden die Zellen in Präparationspuffer aufgenommen und die Proben in einem
Polytron-Homogenisator mit halber Stärke viermal für 5 Sekunden homogenisiert. Die
Proben wurden nach einer Proteinbestimmung nach Bradford auf 1 mg/ml eingestellt
und mit dem vierfachen Volumen an Präparationspuffer-Supplement versetzt.
Für die Detekion wurden jeweils 50 µl der Probe (Zellkulturüberstand oder Lysat mit
Supplement) in die Vertiefung der Elisa-platte gegeben und zwei Stunden bei 350
U/Min geschüttelt. Anschließend wurde zweimal mit der Washsolution aus dem Kit
gewaschen und jeweils 50 µl biotinylierter Antikörper sowie 100 µl Stepravidingekoppelter Peroxidase hinzugegeben. Es wurde 30 Min bei 350 U/Min inkubiert und
wieder zweimal gewaschen. Nach der Zugabe von 100 µl TMB-Substrat pro Vertiefung
wurde 20 min in der Dunkelheit bei 350 U/Min inkubiert und anschließend die Reaktion
durch Zugabe von 50 µl StopSolution beendet. Die Messung erfolgte bei 450 nm im
Photometer.
3.4 ZELLKULTUR
3.4.1 HITZEINAKTIVIERUNG VON FKS
Um das Komplementsystem im verwendeten fötalen Kälberserum (FKS) zu
inaktivieren, wurde das eingefrorene Serum im Kühlschrank aufgetaut. Anschließen
wurde es für eine halbe Stunde auf 56°C erwärmt und konnte nach dem Abkühlen
verwendet werden.
3 METHODEN
31
3.4.2 TEST AUF MYCOBAKTERIEN KONTAMINATION
Um eine Kontamination der Zellkulturen mit Mycoplasmen nachzuweisen, wurde die
DNA der Mycobakterien im Zellkulturüberstand mit einer nested-PCR nachgewiesen.
Die verwendeten Primer waren spezifisch für hoch konservierte Bereiche von Genen
der 16 S und 23 S ribosomalen RNA (PCR Mycoplasma Detection Set, Panvera). Für
die erste Runde der PCR wurden 5 µl Zellkulturüberstand in einem 25 µl Ansatz
eingesetzt (5 µl Überstand, 2,5 µl 10x PCR Puffer (Life Technologies), 0,75 µl 50 mM
MgCl2, 0,5 µl dNTP je 10 mM, je 0,25 µl F1 und R1 Primer, 15,5 µl H2O, 0,25 µl TaqPolymerase (Life Technologies)). Für die zweite PCR wurden 1 µl der ersten PCR und
das innere Primerpaar F1, R2 in einem 15 µl Ansatz verwendet. Jeweils 5 µl des ersten
und zweiten PCR-Ansatzes wurden in DNA-Probenpuffer aufgenommen und in einem
2%igen Agarosegel (1x TAE Puffer mit Ethidiumbromid) durch Gelelektrophorese
aufgetrennt. Falls Mycoplasmen in Kulturen detektiert wurden und diese weiter
verwendet werden sollten, erfolgte eine Behandlung mit dem AntibiotikaKombinationspräparat BM-Cyclin (Boehringer) nach Angaben des Herstellers.
3.4.3 PASSAGIEREN VON ZELLEN
Zum Passagieren von Zellen wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und die Zellen mit
PBS gewaschen. Durch Zugabe von einfachem Trypsin/EDTA (Invitrogen) und
anschließender Inkubation im Brutschrank wurden die Zellen abgelöst. Zur
Zellsuspension wurde Zellkulturmedium mit FKS gegeben und die Zellen
abzentrifugiert (5 Min, 150 g, RT). Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen
üblicherweise zu einer Konfluenz von 10% mit Zellkulturmedium wieder ausplattiert.
3.4.4 EINFRIEREN VON ZELLEN
Zur Lagerung wurden die Zellen wie beim Passagieren abgelöst und nach der Abnahme
des Überstandes in eiskaltem FKS mit 10% DMSO aufgenommen. Nach dem
langsamen Einfrieren der Zellsuspension bei -80°C wurden die Zellen in
Flüssigstickstoff gelagert.
3.4.5 AUFTAUEN VON ZELLEN
In Stickstoff eingefrorene Zellen wurden unter Beobachtung im 37°C Wasserbad
aufgetaut und unter der Sterilbank langsam in 10 ml Zellkulturmedium gegeben. Die
Zellen wurden sedimentiert (5 Min, 150 g, RT). Nach der Aufnahme in
3 METHODEN
32
Zellkulturmedium wurden die Suspension auf eine 10 cm Zellkulturschale gegeben. Bei
Zellen, die bekanntermaßen schlecht wuchsen oder empfindlich auf das Einfrieren
reagierten, wurde eine 6 cm Zellkulturschale verwendet.
3.4.6 VIRALE TRANSDUKTION VON ZELLEN
Die virale Transduktion von Zellen wurde verwendet, um Smad4 in Zellen mit Smad4
Deletion (CFPAC-1) einzubringen. In den TJBA5b-MoLink-neo Vektor (TJ-Mother
Vektor) wurde das Smad4 unter 5’ LTR-Kontrolle in die multiple Klonierungsstelle
eingebracht. Als Negativkontrolle wurde der Vektor ohne das Smad4 Fragment
verwendet. Zur Verpackung des Expressionsvektors in infektiöse aber replikationsdefiziente Retroviruspartikel wurde eine dreifache simultane Transfektion der
Verpackungszelllinie 293T benutzt. Die Zellen wurden mit dem leeren TJ-Mother
Vektor oder dem Smad4 enthaltenden Konstrukt, sowie einem Vektor (pKAT
1.gag/pol.ATG), der die Genprodukte von gag und pol lieferte und zur
Pseudotypisierung mit einem pCMV-VSV-G Plasmid transfiziert (Howard, Boenicke u.
a. 1999; Howard, Boenicke u. a. 2000). 24 Stunden nach der Transfektion wurde ein
Mediumwechsel
durchgeführt
und
nach
weiteren
24
bis
48
Stunden
der
Zellkulturüberstand mit den Retroviren abgenommen und eingefroren. Die Produktion
der Überstände erfolgte durch PD Dr. H. Ungefroren im Labor für molekulare
Onkologie an der Klinik für Generelle und Thorax Chirurgie der Universität zu Kiel.
Zur Transduktion von Zellen wurden 2 x 105 Zellen pro Vertiefung einer 6-well
Zellkulturschale ausgesät. Am folgenden Tag wurden die Virusüberstände durch
Sterilfiltrierung (0,45 µm) von Zellresten befreit. Das Medium wurde von den Zellen
entfernt und 1,5 ml Virusüberstand mit 6 µl Polybren (10 mg/ml) auf die Zellen
gegeben. Bei den für die Selektionskontrolle verwendeten Zellen wurde nur das
Medium gewechselt. Nach weiteren 16 bis 24h wurden die Zellen durch Medium mit
G418 auf Geneticin Resistenz hin selektioniert. Nachdem die Kontrollzellen durch das
Selektionsmedium abgetötet waren, wurden die Zellen auf Smad4 RNA und Smad4
Protein untersucht.
3.4.7 HERSTELLUNG VON KONDITIONIERTEN MEDIEN
Zur Herstellung von konditioniertem Medium wurden die Zellen dreimal mit
serumfreiem Medium gewaschen und 24 Stunden unter serumfreien Bedingungen
3 METHODEN
33
kultiviert. Anschließend wurde ein Mediumwechsel durchgeführt und die Zellen für 48
Stunden in neuem Medium kultiviert. Dieses Medium konnte dann für weitere
Untersuchungen verwendet werden.
3.5 TUMORIGENITÄTSTESTS AN NACKTMÄUSEN
Die Tumorigenität von Zellen wurde in sechs Wochen alten weiblichen Nacktmäusen
(BALB/cOlaHsD-nu/nu, Harlan Winkelmann) untersucht. Den Tieren wurden beidseitig
im Nackenbereich je 100 µl einer Zellsuspension mit 2 x 106 Zellen (bei CFPAC-1 oder
Hs766T) in PBS subkutan injiziert. Das Tumorwachstum wurde äußerlich durch
Messung mit einer Schieblehre kontrolliert. Wenn einer der Tumore eine maximale
Ausdehnung von 10 mm in einer Dimension erreicht hatte, wurde das Tier durch
Begasung mit CO2 getötet. Die Tumore wurden herauspräpariert und für nachfolgende
Genexpressionsanalysen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Falls später eine
histologische Untersuchung der Tumore erfolgen sollte, wurden die Tumore in einer
4%igen phosphatgepufferten Formalinlösung fixiert und anschließend in Parafin
eingebettet.
3.5.1 PRÄPARATION VON RNA AUS TUMORGEWEBE
Das Tumorgewebe wurde mit einem Kryotom bei -25°C in 25 µm dicke Scheiben
geschnitten. 600µl RLT-Puffer mit 10µl β-Mercaptoethanol pro Milliliter Puffer
(Zusammensetzung siehe Herstellerprotokoll) wurden in einem 1,5 ml Eppendorf Gefäß
vorgelegt und etwa 20 Schnitte Tumorgewebe (maximal 30 mg) hinzu gegeben. Das
Gewebe wurde nach dem Lösen im RLT-Puffer auf eine QIAShredder Säule gegeben
und durch zweiminütige Zentrifugation bei 13500 U/min in der Eppendorf-Zentrifuge
homogenisiert. Anschließend erfolgte die Präparation der RNA nach dem RNeasy
Protokoll von Qiagen. Aus 30 mg Tumorgewebe ergaben sich so im Idealfall etwa 25
µg RNA.
4 ERGEBNISSE
Die Expression von Smad4 in Hs766T Zellen mit homozygoter Smad4 Deletion führte
zur Tumorsuppression durch die Suppression der Angiogenese (Schwarte-Waldhoff,
Volpert u. a. 2000). Neben der differentiellen Expression von VEGF1 und
Thrombospondin sollten weitere Smad4 Zielgene gefunden werden. Um die Analyse
auf eine große Anzahl von Genen auszuweiten, sollten Genexpressionsprofile durch
Makroarrayhybridisierungen erhoben werden. Der Vergleich der Profile von Smad4
exprimierenden Zellen und Kontrollzellen sollten nach Möglichkeit Smad4 abhängige
Differenzen im Expressionslevel von Zielgenen aufdecken.
Das käuflich erhältliche cDNA Arraysystem von BD (Becton, Dickinson and Company,
früher Clontech) wurde gewählt, weil es folgende Vorteile aufweist: Erstens sind bei
diesem cDNA Arraysystem die aufgebrachten cDNA-Mengen kontrolliert (10 ng +/- 2
ng pro cDNA) und deshalb die Ergebnisse von verschiedenen Hybridisierungen gut
vergleichbar. Zweitens sind die cDNA Sequenzen auf geringe Kreuzhybridisierungen
hin überprüft. Drittens erfolgt die Sondensynthese mit einer Mischung aus
genspezifischen Primern und erhöht so die Sensitivität. Viertens gibt es von dem
Arraysystem sowohl Arrays mit humanen, Krebs assoziierten Sonden, als auch einen
murinen Array. Die Analysen der Smad4 abhängigen Expressionsdifferenzen sollten
zunächst mit kultivierten Zellen untersucht werden. In diesem System war dann eine
valide Auswertungsmethode zu entwickeln. Zur Überprüfung der Arrayergebnisse
wurden Northern Blot Hybridisierungen durchgeführt, da diese wenig anfällig für
Artefakte sowie leicht zu quantifizieren sind und eine große Genauigkeit aufweisen.
Nach der Entwicklung einer verlässlichen Auswertung sollte die Methode zur Messung
der Smad4 abhängigen Veränderung der Genexpressionslevel in Nacktmaustumoren
und weiteren Zelllinien verwendet werden. Besonders für die Auswertung der
Expressionsprofile der Nacktmaustumore ist eine genaue Auswertungsmethode
notwendig, da bei ihnen die verfügbare RNA-Menge besonders begrenzt ist.
4 ERGEBNISSE
35
4.1 VORÜBERLEGUNGEN ZUR AUSWERTUNG
Zur Etablierung und Validierung der Auswertung der cDNA Makroarrays wurde
Gesamt-RNA von Smad4 exprimierenden und Kontrollklonen der Zelllinie Hs766T
verwendet. Diese Zellline ist eine pankreatische Karzinomzelllinie, die eine
homozygote Deletion von Smad4 aufweist. Die Reexpression von Smad4 wurde durch
Transfektion mit einem pBK-CMV-Smad4 Konstrukt und anschließender Selektion auf
Geneticinresistenz erreicht (Schwarte-Waldhoff, Volpert u. a. 2000). Für die Analyse
wurde
Gesamt-RNA
von
subkonfluenten
Zellen
verwendet,
die
unter
Standardbedingungen kultiviert wurden. Die Durchführung der Aufreinigung der
PolyA+ RNA und der Hybridisierung erfolgte wie in 3.2.5 beschrieben.
4.2 AUSWERTUNG DER MAKROARRAYS
Nach der Exposition der Makroarray-Filter auf Phosphor Storage Membranen wurde
diese mit einem Cyclone-Phosphorimager der Firma Packard-Instruments digitalisiert.
Als erster Schritt der Analyse mussten aus den digitalisierten Hybridisierungsbildern im
TIFF Format die Signalintensitäten an jeder einzelnen Position der aufgebrachten
cDNA’s errechnet werden.
Die Analyse der Bilder erfolgte mit der Software „GenePix Pro“ von Axon
Laboratories. Dieses eigentlich für Mikroarrays entwickelte Programm wurde
verwendet, da zu Beginn der Analysen die Software des Arrayherstellers BD Clontech
nicht die Möglichkeit bot einen signalspezifischen Hintergrund zu berechnen. Diese
Berücksichtigung des Hintergrundes ist für eine genaue Auswertung unbedingt
notwendig,
da
ansonsten
ein
lokal
stärkerer
Hintergrund
ein
intensiveres
Hybridisierungssignal und somit fälschlicherweise eine größere Transkriptmenge
vortäuschen würde.
Das verwendete Programm ermittelt den Hintergrund aus einem Bereich, der das
auszuwertende Signal umgibt und die Fläche zwischen den angrenzenden neun Signalen
umfasst (siehe Abbildung 6).
4 ERGEBNISSE
36
Abbildung 6 Berechnungsmaske von Genepix Pro: Die Signalintensität des
Hybridisierungssignals an einer aufgebrachten cDNA wurde aus der
Summe aller Signalbildpunkte berechnet. Zur Korrektur des lokalen
Hintergrundes jedes Signals wurde der jeweilige Median der Intensität
der Hintergrundbildpunkte von jedem Signalbildpunkt subtrahiert. Der
Bereich der Hintergrundbildpunkte umfasste den kreisrunden Bereich
vom dreifachen Signaldurchmesser um das Signal herum ohne die
„ausgelassenen Bildpunkte“ und ohne die Signalbildpunkte.
4.2.1 BEURTEILUNG VON SIGNALEN
Zur Berechnung der Signalintensitäten mussten die auszuwertenden Bereiche zunächst
manuell festgelegt werden. Position und Größe der einzelnen Auswertungskreise
(Abbildung 6) wurden hierzu in der Auswertungssoftware für jedes Signal angepasst.
Die im Programm verwendeten Kriterien zur Einteilung der Signale in detektiert
„Found“ oder nicht detektiert „Not found“ richten sich nach den Anforderungen für
Mikroarrays, bei denen die Hybridisierungsprobe mit Fluoreszensfarbstoffen markiert
wird. Diese Kriterien konnten nicht angewendet werden, da radioaktive Nukleotide zur
Markierung der hybridisierten cDNA verwendet wurden und deshalb die Signale eine
völlig andere Form aufweisen. Im Unterschied zu den Signalen fluoreszenzmarkierter
cDNA sind die Signale radioaktiv markierter cDNA durch die Streuung der
radioaktiven Strahlung nicht scharf begrenzt. Der Intensitätsverlauf der Signale ist
infolgedessen viel flacher und die Signale sind nicht so leicht vom Hintergrund zu
unterscheiden.
4 ERGEBNISSE
37
In dieser Arbeit wurden alle Gene als verlässliches Signal gewertet deren mittlere
Signalintensität das Anderthalbfache des Medians der Hintergrundintensität überschritt,
(Hintergrundberechnung siehe Abbildung 6). Gene mit einer mittleren Signalintensität
unter dieser Schwelle wurden als nicht auswertbar gekennzeichnet, wenn der
Hintergrund stärker als das Dreifache des geringsten Hintergrundes des gesamten
Arrays war. Die übrigen Signale wurden als nicht detektiert markiert.
Da aufgrund der großen Signalanzahl einzelne Bewertungsfehler in der manuellen
Auswertung nicht auszuschließen waren, wurde in der Programmiersprache Visual
Basic (VBScript) eingebunden in HTML (Hypertext mark-up language) ein Programm
zur Plausibilitätsprüfung entwickelt. Die Kontrolle der beurteilten Signale erfolgte wie
in Abbildung 8 angegeben. Das Programm trifft Entscheidungen über die Einordnung
der Signale nach dem Verhältnis von Signalintensität zum signalspezifischen
Hintergrund, oder zum geringsten Hintergrund auf dem Array. Störungen zum Beispiel
durch Hybridisierungsartefakte werden in der automatisierten Auswertung nicht
erkannt. Deshalb wurden alle vom Programm veränderten Signalbeurteilungen nach der
automatisierten Beurteilung mit dem jeweiligen Bild für die 8 umgebenden Signale
dargestellt. Diese wurden dann manuell begutachtet und falsche Signaleinordnungen
mit Hilfe des Bildes erkannt und korrigiert.
Abbildung 7 Darstellung des digitalisierten Umgebungsbildes eines Hybridisierungsartefaktes. Der Quotient von mittlerer Signalintensität zum Hintergrund
ist größer als1.5. Das Signal ist aber unförmig und beinhaltet eine Stelle
unspezifischer Signalintensität.
Durch die genaue Festlegung der Auswertungskriterien und die weitgehende
Automatisierung wurde zum einen eine einheitliche Beurteilung der Signale
gewährleistet, durch die manuelle Begutachtung der Signale aber auch die Erkennung
von Artefakten erhalten. Sehr schwache Signale wurden ebenso wie Signale mit
starkem Hintergrund besonders berücksichtigt, um keine fehlerhaften Signale in die
nachfolgende Auswertung einfließen zu lassen.
4 ERGEBNISSE
38
Abbildung 8 Auswertungsschema zur Beurteilung eines Hybridisierungssignals
4.2.2 NORMALISIERUNG
Zahlreiche Gründe können zu Intensitätsunterschieden bei der Hybridisierung führen.
Schon bei der Verwendung derselben RNA kann es zum Beispiel Varianzen in der
eingesetzten RNA Menge, in der Effizienz der cDNA Synthese, in der
Hybridisierungseffizienz und in der Effektivität der Waschschritte nach der
Hybridisierung geben (Quackenbush 2002). Um die Expressionsdaten von zwei oder
mehr Hybridisierungen trotzdem vergleichen zu können, ist eine Normalisierung der
Signalintensitäten notwendig.
Für die Durchführung einer Normalisierung ist eine bekannte Beziehung zwischen den
Hybridisierungsergebnissen
notwendig.
Bei
RNA-Proben
mit
ähnlichem
Genexpressionsmuster kann bei zufälliger Auswahl der Sonden auf dem Array im
Mittel von gleicher Expression aller Gene ausgegangen werden (Quackenbush 2002).
Deshalb ist der Bezug auf die Summe der Signalintensitäten aller detektierten Signale
nach Hintergrundkorrektur zur Normalisierung von cDNA-Arrays weit verbreitet. In
dieser Arbeit sollten die Genexpressionsmuster von Zellen in Abhängigkeit von der
4 ERGEBNISSE
39
Expression von Smad4 untersucht werden. Da die Zellen jeweils von derselben Zelllinie
abgeleitet sind und sich nur in der Expression von Smad4 und hierdurch bedingten
Veränderungen unterscheiden, wurde dieser Zusammenhang auch in dieser Arbeit
angenommen.
In der vorliegenden Studie wurde nicht über die Gesamtsumme aller hintergrundkorrigierten Signale normalisiert, sondern es wurden nur solche Gene berücksichtigt,
die in allen zu normalisierenden Makroarrays detektiert wurden. Diese Art der
Normalisierung ist unempfindlicher gegen Unterschiede in der Qualität der Arrays:
Falls eine Arrayhybridisierung weniger sensitiv ist und deshalb im niedrigen
Intensitätsbereich weniger Signale aufweist, würde die Gesamtsumme der Signale
niedriger ausfallen. Auch wenn das Hybridisierungssignal an einigen Stellen durch
Hybridisierungsartefakte nicht auswertbar ist, und diese Signale deshalb in der
Signalsumme aller detektierten Signale eines Array fehlen, ist die Signalsumme zu
niedrig. Die Korrektur durch eine Normalisierung über die Gesamtsumme aller
hintergrundkorrigierten Signale würde dadurch fälschlicherweise zu starke Expressionsunterschiede vortäuschen.
Abbildung 9 zeigt für zwei Arrayhybridisierungen beispielhaft die Auswirkung der
beiden Normalisierungen im Vergleich zu den nicht normalisierten Signalintensitäten.
Im idealen Fall sollten alle Intensitäten auf dieser Winkelhalbierenden liegen, da hier
die Ergebnisse von zwei Hybridisierungen mit identischen Ribonukleinsäuren
verglichen wurden. Der angegebene Median ist ein Maß für die Abweichung der
Signale von der Winkelhalbierenden. Der Abgleich auf die Signalsumme der
gemeinsamen Signale zeigt die geringste Abweichung von der Winkelhalbierenden.
Dieser Abgleich war deshalb am besten für die Normalisierung geeignet und wurde für
alle nachfolgenden Auswertungen verwendet.
Zur Vereinfachung der Normalisierung wurde ein Excel-Makro geschrieben, das diese
Aufgabe übernahm. Von dem Programm wurden zunächst die Ergebnisdateien der
GenePix Pro Auswertung eingelesen. Das Makro ermittelte dann alle Gene, die in allen
abzugleichenden Makroarrays ein auswertbares und über dem Hintergrund liegendes
Signal zeigten. Der Normalisierungsfaktor für jeden Makroarray wurde aus dem
Kehrwert der jeweiligen Summe der hintergrundkorrigierten Signalintensitäten der so
ermittelten Gene berechnet.
4 ERGEBNISSE
40
Abbildung 9 Vergleich der Normalisierungsarten. Dargestellt sind die relativen
Signalintensitäten von zwei Arrayhybridisierungen mit identischer RNA.
Die Intensitäten der hintergrundkorrigierten Rohdaten werden mit zwei
möglichen Normalisierungsmethoden verglichen.
4.2.3 ÜBERLEGUNGEN ZUR ANZAHL DER NOTWENDIGEN
WIEDERHOLUNGEN
Die Ergebnisse einer einzelnen Arrayhybridisierung sind oft unzuverlässig. Die
einzelnen Hybridisierungssignale schwanken selbst bei identischen Ribonukleinsäuren
zu stark, um Expressionsunterschiede in zwei Proben verlässlich anzugeben (siehe
Abbildung 9). Durch Mittelung der Intensitäten aus mehreren Wiederholungen können
bessere Ergebnisse erzielt werden. Eine Mindestanzahl von drei Wiederholungen je
Gruppe wird nach statistischen Berechnungen empfohlen (Lee, Kuo u. a. 2000;
Wolfinger, Gibson u. a. 2001). In dieser Arbeit wurden soweit möglich mindestens vier
Wiederholungen in einer Gruppe durchgeführt.
4 ERGEBNISSE
41
4.2.4 DEFINIERUNG VON KANDIDATENGENEN
Gene, die potentiell differentiell exprimiert sind (Kandidatengene), können auf
verschiedene Weise ausfindig gemacht werden. Die einfachste Möglichkeit ist die
Ermittlung aus einer vergleichenden Darstellung der mittleren Signalintensitäten jeder
Gruppe, wie sie der Scatter-Plot ermöglicht. Eine bessere Übersicht bietet die
Darstellung nach Dudoit (Dudoit, Yang u. a. 2000). Sie stellt die Rotation eines ScatterPlots um 45° im Uhrzeigersinn dar und wird durch die Auftragung des mittleren
Quotienten
QMittel = log 2
I Smad4 rekonstituierte ,
I Smad4 negative
I Mittel = log 2 I Smad4 rekonstituierte × I Smad4 negative
gegen
die
mittlere
Signalintensität
erreicht. An dieser Auftragung lassen sich
besonders Artefakte und intensitätsabhängige Effekte gut erkennen (Abbildung 11). Sie
wurde deshalb bisher hauptsächlich zur Überprüfung und Darstellung von
Normalisierungen verwendet. Wenn man den gleitenden Durchschnitt der Quotienten
der Signalintensitäten als Ausgleichskurve aufträgt, können intensitätsabhängige
Unterschiede nach der Normalisierung auf einen Blick erkannt werden. Falls eine
Verschiebung in der Ausgleichskurve zum Beispiel bei niedrigen Intensitäten
vorhanden ist, zeigt das eine geringere Sensitivität der Arrayhybridisierungen einer
Gruppe an (siehe beispielhaft Abbildung 38 auf Seite 1). Aus dieser Darstellung lassen
sich differentiell exprimierte Gene nur anhand ihrer mittleren Genexpression ergründen.
Sie bietet keine Möglichkeit die Schwankungen in der Signalintensität der einzelnen
Arrays abzubilden. Folglich wird die Konsistenz der Daten vernachlässigt. Die
Berücksichtigung der Streuung der Signalintensitäten ist notwendig, da bei alleiniger
Definition von Kandidatengenen anhand der Quotienten der mittleren Signalintensitäten
Gene zurückgewiesen werden, die einen geringen Unterschied aufweisen, auch wenn
dieser bei wiederholten Messungen statistisch hoch signifikant ist (Tanaka, Jaradat u. a.
2000; Wolfinger, Gibson u. a. 2001).
Um
die
Beurteilung
Wahrscheinlichkeit
von
eines
Intensitätsdifferenzen
zu
objektivieren
und
die
Unterschiedes zwischen den Signalen von Smad4
rekonstituierten Zellen und den Kontrollzellen zu berechnen, bot sich der von Welch
modifizierte zweiseitige t-Test an. Dieser Test ist besonders geeignet, da er im
Gegensatz zum Wilcoxon-Test oder dem Mann-Whitney-U-Test, die beide von
Ordinaldaten ausgehen, für intervallskalierte Daten geeignet ist und somit Intensitäten
4 ERGEBNISSE
42
hinsichtlich ihrer absoluten Stärke berücksichtigt. Dieser modifizierte t-Test setzt
zudem keine identische Streuung der Intensitäten beider Gruppen (Smad4
rekonstituierte
Klone/
Kontrollklone)
voraus
und
ist
außerdem
gegenüber
Abweichungen von der Normalverteilung der Intensitäten sehr unempfindlich
(Bronstein und Semendjajew 1991). Die Signifikanz eines Unterschiedes in der
Genexpression kann also durch den t-Wert beschreiben werden und ein niedriger t-Wert
als Hinweis auf differentielle Expression aufgefasst werden.
Die Verwendung des t-Wertes zur Charakterisierung der Signifikanz des Unterschiedes
der Genexpressionen löst zugleich ein weiteres Problem in der Kandidatengensuche.
Bei der Betrachtung des Verlaufes der Standardabweichungen der Signalintensitäten
wird ein starker Anstieg der Streuung bei niedrigen Intensitäten deutlich. Eine Auswahl
von Kandidatengenen nach dem Quotienten der Genexpression sollte deshalb
normalerweise eine intensitätsabhängige Komponente beinhalten. Da aber die Streuung
der Intensitäten unter den Arrays schon im t-Test einbezogen ist, musste dieser Einfluss
nicht mehr gesondert berücksichtigt werden.
Für die Auswahl von potentiell differentiell exprimierten Genen ist daher die mittlere
Signalintensität wichtig, da sie angibt wie weit sich ein Signal vom Hintergrund abhebt
und somit wie verlässlich es ist. Der Quotient der mittleren Signalintensitäten drückt die
Differenz in der Signalintensität aus und gibt die Größe des Unterschiedes der
Signalintensitäten an. Die Ergebnisse aus dem Welchschen t-Test sind ein Maß für die
Signifikanz des Unterschiedes der Signalintensitäten und berücksichtigen die Streuung
bei niedrigen Intensitäten. Diese drei für die Suche nach potentiellen Kandidatengenen
wichtigen Größen wurden gemeinsam, in einem an die Darstellung nach Dudoit
angelehnten Blasendiagramm abgebildet. Für die Blasengröße wurde der Kehrwert des
Ergebnisses des t-Tests als Variable gewählt, damit größere Blasen die Gene mit einer
höheren Wahrscheinlichkeit der differentiellen Genexpression anzeigen (Abbildung 12).
Anhand dieser Darstellung konnten folglich auf einen Blick für jedes Gen die drei für
die Definition von Kandidatengenen interessanten Größen betrachtet werden. Dies
sollte die Erkennung von Genen mit moderaten aber signifikanten Genexpressionsunterschieden auch bei insgesamt niedriger Signalintensität ermöglichen.
4 ERGEBNISSE
43
Abbildung 10 Zusammenhang zwischen mittlerer Signalintensität und mittlerer
prozentualer Standardabweichung für die Arrayergebnisse von
subkonfluenten Hs766T Zellen.
4.3 SMAD4 ABHÄNGIGE DIFFERENTIELLE GENEXPRESSIONSANALYSE VON HS766T IN VITRO
Für den Vergleich der Genexpression in Smad4 exprimierenden Klonen und
Kontrollklonen wurde Gesamt-RNA von subkonfluenten Hs766T Zellen präpariert. Es
wurden vier cDNA Arrays mit Poly-A+ RNA von Smad4 negativen Zellen und fünf
cDNA Arrays mit Poly-A+ RNA von Smad4 rekonstituierten Zellen hybridisiert.
4.3.1 NORMALISIERUNG
Zur Überprüfung der Normalisierung wurde die von Dudoit empfohlene Darstellung
gewählt (4.2.4 oben). Die Ausgleichskurve wurde durch den gleitenden Durchschnitt
von jeweils 30 Werten berechnet (siehe Abbildung 11). Die Auftragung des
Logarithmus der mittleren Quotienten gegen die mittleren Signalintensitäten zeigte eine
gute Annäherung an den Wert 0. Diese entspricht einem Quotienten der Genexpression
von 1 und somit gleicher Expression eines Gens in Smad4 positiven und Smad4
negativen Zellen. Da die untersuchten Zellen von einer Zelllinie abgeleitete Klone sind,
ist anzunehmen, dass sie sich in ihrem gesamten Expressionsprofil sehr ähnlich sind.
Unterschiede in einzelnen Zielgenen sollten sich durch das mittels Expressionsvektor
4 ERGEBNISSE
44
eingebrachte Smad4 und dessen Einflüsse auf die Genexpression anderer Gene ergeben.
Die Ausgleichskurve zeigte eine gute Normalisierung an. Nur im Bereich niedriger
Intensitäten ergab sich eine leichte Verschiebung zu positiven Quotienten. Im Mittel
sind die nachgewiesenen Gene folglich in den Arrayergebnissen nicht differentiell
exprimiert und die Daten sollten über den gesamten Intensitätsbereich für die Suche
nach Kandidatengenen geeignet sein.
Abbildung 11 Hs766T Quotient der mittleren Signalintensität gegen mittlere
Signalintensität nach Dudoit. Dargestellt sind die Ergebnisse aus vier
Arrayhybridisierungen mit Kontroll-RNA und fünf Hybridisierungen mit
RNA von Smad4 rekonstituierten Zellen. Die Ausgleichskurve aus dem
gleitenden Durchschnitt von dreißig Werten berechnet.
4.3.2 VALIDIERUNG DER ARRAYERGEBNISSE
Anhand der Arrayergebnisse sollten Kandidaten für eine Smad4 abhängige differentielle
Expression ermittelt werden. Zur Validierung der Arrayergebnisse wurden Northern
Blot Hybridisierungen von insgesamt 37 verschiedenen Genen verwendet. Zum einen
wurden die Gene gezielt für die Validierung ausgewählt, um die Expression von Genen
mit differentieller Expression, aber auch von nicht differentiell exprimierten Genen zu
überprüfen. Zum anderen ergaben sie sich aus vorherigen Auswertungsmethoden als
Kandidaten oder wurden aus inhaltlichen Überlegungen ausgewählt. Mit Hilfe der
Expression dieser 37 Gene die dann aus den Northern Blot Hybridisierungen bekannt
4 ERGEBNISSE
45
war, sollten anschließend Kriterien entwickelt werden, nach denen Zielgene nur aus den
Arrayergebnissen zuverlässig ermittelt werden können.
Abbildung 12 Blasendiagramm der Ergebnisse der Genexpressionsanalysen der
subkonfluenten Hs766T Zellen. Die Blasengröße stellt den Kehrwert des
Ergebnisses des t-Tests dar. Die schwarz markierten Gene wurden zur
Überprüfung mittels Northern Blot Hybridisierung ausgewählt.
Die für die Northern Blot Hybridisierung verwendeten DNA-Sonden wurden aus
Gesamt-RNA nach Oligo-dT initiierter cDNA Synthese über PCR mit genspezifischen
Primern generiert. Die Primersequenzen für diese Amplifizierung wurden entweder wie
in 3.1.3 angegeben ermittelt oder entsprachen den Sequenzen, die für die Herstellung
der cDNA Arrays verwendet wurden (Primersequenzen von BD Clontech). So konnte
sichergestellt werden, dass die Sonden dasselbe Gen wie die auf den Array
aufgebrachten cDNA-Fragmente erkennen. Die Herstellung der
32
P-markierten DNA
Sonde für die Hybridisierung wurde mit dem Megaprime Kit von Amersham
durchgeführt. Die Kontrolle der RNA-Mengen auf dem Northern Blot erfolgte durch
anschließende Hybridisierung mit einer Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase
(GAPD) spezifischen Sonde, obwohl GAPD Smad4 abhängig eine höhere Expression
aufwies.
4 ERGEBNISSE
46
Bei den Ergebnissen der Hybridisierungen fiel auf, dass GAPD bei allen
Hybridisierungen in den Smad4 exprimierenden Klonen im Mittel eine höhere
Transkriptmenge
aufwies
als
in
den
Kontrollklonen.
Dies
kann
nicht
an
unterschiedlichen Auftragsmengen liegen, da für die Proben zuvor über die optische
Dichte die Konzentration bestimmt wurde und daraufhin gleiche RNA-Mengen
eingesetzt wurden. Außerdem wiesen die Ethidiumbromid-Färbungen der RNA-Gele
sehr ähnliche Mengen an 28S und 18S ribosomaler RNA auf. Für 26 Northern Blots mit
besonders ähnlichen Auftragungsmengen wurde daraufhin das Verhältnis der GAPD
Transkriptmenge von den Smad4 exprimierenden und den Kontrollklonen bestimmt. Es
ergab sich im Mittel der 26 Northern Blots ein Verhältnis von 1,75 mit einer
Standardabweichung von 0,39. GAPD weist also Smad4 abhängig leicht erhöhte
Transkriptmenge auf. Die Schwankungen in der Expression innerhalb der Smad4
exprimierenden und der Kontrollklone waren aber geringer als die Veränderungen der
β-Aktin Menge (Abbildung 13). Da der Expressionsunterschied in der GAPD Menge
nicht stark von Experiment zu Experiment schwankte, wurde dieses Gen trotzdem
weiterhin zusätzlich zur Kontrolle der RNA-Mengen über die Ethidiumbromid-Färbung
der 28S und 18S ribosomalen RNAs für die Kontrolle des gleichmäßigen Übertragens
auf die Nylonmembran verwendet.
Abbildung 13 Transkriptmenge von β-Aktin und GAPD sowie EtBr-Färbung der RNA
von Hs766T Zellen
Bei der Überprüfung der Genexpression mittels Northern Blot Hybridisierung wurde ein
Transkript als differentiell exprimiert gewertet, wenn es im Mittel mindestens um den
Faktor 1,3 höher oder um den Faktor 0,77 niedriger exprimiert war und es keine
eindeutig klonalen Unterschiede gab. Die nachfolgenden Abbildungen (Abbildung 15
bis Abbildung 16) stellen die Ergebnisse aus den Northern Blot Hybridisierungen im
Vergleich mit den Ergebnissen aus den Arrayhybridisierungen dar. Auf der linken Seite
4 ERGEBNISSE
47
sind jeweils die Daten aus den Northern Blot Hybridisierungen abgebildet. Der
angegebene Faktor wurde densitometrisch nach Hintergrundkorrektur aus dem Quotient
der mittleren Signalintensitäten von Smad4 exprimierenden Klonen bezogen auf die
Kontrollzellen berechnet. Der Faktor und der t-Wert der Arrayhybridisierungen wurde
analog
nach
Hintergrundkorrektur
und
Normalisierung
bestimmt.
Die
Balkendiagramme geben die relative Signalintensität auf den Arrays an. Falls ein Signal
wegen einer Störung nicht ausgewertet wurde, fehlt der Balken. Wie bereits erwähnt,
wurden Signale deren Intensität kleiner als die anderthalbfache Hintergrundintensität
war, gleich Null gesetzt.
Von den überprüften 37 Transkripten wiesen nach dieser Einordnung fünf Gene eine
Smad4 abhängige Erhöhung der Transkriptmenge auf (Abbildung 15).
Abbildung 14 Fünf Gene mit Smad4 abhängiger Erhöhung der Transkriptmenge. Der
Faktor gibt den Quotienten der mittleren Signalintensität nach
Hintergrundkorrektur von Smad4 exprimierenden Klonen zu
Kontrollklonen an.
Bei 17 Genen war eine Smad4 abhängige Verringerung der Transkriptmenge zu
beobachten (Abbildung 14).
4 ERGEBNISSE
48
Abbildung 15 17 Gene mit Smad4 abhängig reduzierten Transkriptmengen. Der Faktor
gibt
den
Quotienten
der
mittleren
Signalintensität
nach
Hintergrundkorrektur von Smad4 exprimierenden Klonen zu
Kontrollklonen an.
4 ERGEBNISSE
49
Abbildung 16 13 Gene mit nicht Smad4 abhängiger Transkriptmenge. Der Faktor gibt
den Quotienten der mittleren Signalintensität nach Hintergrundkorrektur
von Smad4 exprimierenden Klonen zu Kontrollklonen an.
Bei 13 Genen war der Effekt der Smad4 Expression auf die Transkriptmenge nur sehr
gering, sie waren um weniger als den Faktor 1,3 differentiell exprimiert (Abbildung 16)
oder wiesen klonale Unterschiede in der Expression auf (Abbildung 17). Besonders
Cadherin 3 (X63629) und P21-Rac2 (M64595) zeigten starke klonale Unterschiede in
der Genexpression, die nicht mit dem Smad4 Status der Zellen korrelierten. Sie wurden
deshalb nicht für den Vergleich der Kontrollhybridisierungen mit den Ergebnissen aus
den Arrayhybridisierungen verwendet.
4 ERGEBNISSE
50
Abbildung 17 Gene mit klonal unterschiedlicher Transkriptmenge
Abbildung 18 Vergleich der Hs766T Arrayergebnisse von subkonfluenten Hs766T
Zellen mit den Ergebnissen aus den Northern Blot Hybridisierungen. Die
Blasenfläche gibt den Kehrwert des Ergebnisses aus dem t-Test wieder.
Signale, die nicht über dem Hintergrund lagen, wurden zur Berechnung
des Quotienten auf 0,00001 festgelegt.
4 ERGEBNISSE
51
Tabelle 1 Ergebnisse der subkonfluenten Hs766T Zellen. Der Quotient gibt das
Verhältnis der Expression in Smad4 exprimierenden Zellen bezogen auf die
Smad4 negativen Zellen an.
In Abbildung 18 und Tabelle 1 werden die Ergebnisse von den 35 Northern Blot
Hybridisierungen zusammen mit den Ergebnissen aus den Arrayhybridisierungen
dargestellt. Ausgelassen wurden die beiden Gene, die klonale Unterschiede in der
4 ERGEBNISSE
52
Expression aufwiesen (Abbildung 17). Bei der Betrachtung des Blasendiagramms zeigt
sich, dass Gene, deren Transkripte in der Northern Blot Hybridisierung eine Smad4
abhängige Differenz in der Transkriptmenge aufwiesen, auch häufig anhand der Array
Ergebnissen als differentiell beurteilt werden können. Sie sind durch einen stark von der
Nulllinie entfernten Quotienten gekennzeichnet und haben einen niedrigen t-Wert. Es
zeigt sich auch, dass die Auftragung nach Dudoit ohne Berücksichtigung der t-Werte
nicht ausreichend ist, um Kandidatengene zu definieren. Das Gen NGALP25 zum
Beispiel wäre nach Intensität und Quotient ein guter Kandidat, aber die
Berücksichtigung des t-Wertes (t-Wert = 0,302) zeigt, dass der scheinbar große
Unterschied in der Genexpression durch einen Ausreißer in einem Array verursacht
wurde (siehe Abbildung 19).
Abbildung 19 Signalintensitätsverteilung bei NGALP25. K3 und K6 sind
Kontrollklone, D5 und D8 Smad4 exprimierende Klone der Zellline
HS766T.
Unter den 35 durch Northern Blot Hybridisierung überprüften Genen sind fünf
bestätigte differentielle Gene, die nach den Atlasarraydaten nicht als Kandidaten
definiert worden wären (HD2, CDC25B, FLT3LG, Nexin und GNBPG10). Alle 13
Gene, die sich in der Überprüfung als nicht differentiell exprimiert erwiesen haben,
wurden unter Berücksichtigung des t-Wertes auch nach den Arrayergebnissen als nicht
differentiell exprimiert beurteilt. Von den fünf durch Smad4 induzierten Genen
kommen anhand des Blasendiagramms drei Gene eindeutig als Kandidaten in Frage.
Von den 17 Genen, deren Transkriptmenge in der Überprüfung Smad4 abhängig
reprimiert war, wurden nur drei Gene anhand des Blasendiagramms nicht als
Kandidatengene ausgewiesen (HD2, CDC25B, FLT3LG). Alle anderen wiesen einen
niedrigen t-Wert und einen großen Unterschied in der mittleren Transkriptmenge auf
und waren somit als Kandidatengene erkennbar.
4 ERGEBNISSE
Da
die
53
Übereinstimmung
Hybridisierungsergebnissen
gut
zwischen
ist,
ist
die
Array-
und
Darstellung
der
Northern
Ergebnisse
Blot
der
Arrayhybridisierungen im Blasendiagramm geeignet, um Kandidatengene zu definieren.
Bei 30 von 35 Genen, also in 86% der Fälle, wurden die Ergebnisse aus den
Arrayhybridisierungen von den Daten der Northern Blot Hybridisierungen bestätigt.
Von den hier validierten Genen wird nur eins fälschlicherweise als differentiell
exprimiert ausgewiesen, wenn man die Gene als differentiell exprimiert ansieht, bei
denen in den Atlasergebnissen ein mindestens zweifacher Unterschied der
Genexpression vorliegt und zweitens der Wert des Student-t-Tests maximal 0,15
beträgt. Von den 13 nach Northern Blot Hybridisierung nicht differentiell exprimierten
Genen entspricht nur ein Gen, TIEG, den Kriterien. Diese Kriterien sollten also geeignet
sein, in den Arrayergebnissen weitere Kandidatengene zu finden. Bei Anwendung der
Kriterien erhält man insgesamt 29 Gene. Sie sind in Abbildung 20 zusammen mit den
bisher überprüften Genen dargestellt. Von den 29 Genen wurden bisher 15 Gene mittels
Northern Blot Hybridisierung überprüft und 14 von ihnen waren differentiell exprimiert.
Wegen der Bestätigungsquote von 93 % wurde auch für die übrigen 14 Gene die
differentielle Expression angenommen. In der Summe ergeben sich also mit den 22
bestätigten differentiell exprimierten Genen, die in Abbildung 15 und Abbildung 14
dargestellt sind, und den 14 anhand der Kriterien neu definierten Genen (Tabelle 2)
insgesamt 36 Gene, die Smad4 abhängig differentiell exprimiert sind.
Aufgrund der guten Übereinstimmung der überprüften Genexpressionen mit den
Ergebnissen aus den Arrayhybridisierungen ist davon auszugehen, dass die hier
erarbeiteten Auswahlkriterien bei weiteren Anwendungen dieses Arraysystems und
dieser Auswertung anwendbar sind und zuverlässig Smad4 Zielgene anzeigen. Deshalb
wird im weiteren Verlauf dieser Arbeit von der Validität dieser Methode ausgegangen
und die Überprüfung mittels Northern Blot Hybridisierung nur noch im Einzelfall
erfolgen.
4 ERGEBNISSE
54
Tabelle 2 Gene mit differentieller Smad4 abhängiger Expression. Aufgeführt sind die
Gene die anhand der Kriterien für eine differentielle Expression aus den
Arrayergebnissen definiert wurden.
Abbildung 20 Blasendiagramm von subkonfluenten Hs766T Zellen mit Markierung
von Genen die sich als differentiell exprimiert erwiesen haben und Genen
die mindestens einen zweifachen Unterschied in der Genexpression
aufwiesen und bei denen der t-Wert maximal 0.15 betrug.
4 ERGEBNISSE
55
4.3.3 SIGNIFIKANZANALYSE MIT ARRAYERGEBNISSEN NACH TUSHER
Die Signifikanzanalyse von Mikroarray-Daten (SAM-Analyse) nach Tusher (Tusher,
Tibshirani u. a. 2001) wird häufig zur Analyse von Arrayergebnissen verwendet war.
Die SAM-Analyse berechnet über einen für die Arrayauswertung angepassten Test
mittels eines Excel Add-In (Erweiterung für MS Excel) für jedes Gen mehrere Werte
zur Beurteilung der Wahrscheinlichkeit einer differentiellen Expression. Für jedes Gen
wird neben dem Quotienten der Genexpression der zu vergleichenden Experimente ein
prozentualer q-Wert ausgegeben. Dieser gibt die Irrtumswahrscheinlichkeit für die
Signifikanz der differentiellen Transkriptmengen an, wobei der Signifikanzbereich dem
Programm vorgegeben werden kann. Durch die gleichzeitige Ausgabe einer Schätzung
der fälschlicherweise als signifikant detektierten Gene, lässt sich die Güte der
ermittelten Gene beurteilten. Diese Methode soll nun mit der zuvor beschriebenen
Methode verglichen werden. In Tabelle 3 sind die Ergebnisse der SAM-Analyse für
dieselben neun Arrayhybridisierungen wie in Abbildung 12 den Ergebnissen aus den
Northern Blot Hybridisierungen gegenübergestellt.
Abbildung 21 Vergleich des Blasendiagramms mit der SAM-Analyse anhand der
Arrayergebnisse der subkonfluenten Hs766T Zellen.
Abbildung 21 zeigt die Ergebnisse aus den Arrayhybridisierungen und die Ergebnisse
aus der Signifikanzberechnung mittels SAM-Analyse.
4 ERGEBNISSE
Tabelle 3 Ergebnisse der Signifikanzanalyse nach Tusher
Arrayhybridisierungen von subkonfluenten Zellen
56
für
die
Hs766T
Unter den 17 Gene, die die Signifikanzanalyse von Tusher als differentiell exprimiert
ansieht, sollten 10 Gene fälschlicherweise als differentiell ausgewiesen sein. Unter den
14 überprüften Genen findet sich aber nur ein nicht differentiell exprimiertes Gen
(TIEG, S81439) und ein klonal variabel exprimiertes Gen (CDH3, X63629). Die
Fehlerrate wird folglich von der SAM-Analyse zu hoch eingeschätzt. Die Analyse ist
4 ERGEBNISSE
57
also zu stringent. Bei einer Verringerung der Stringenz werden 329 signifikant
differentiell exprimierte Gene mit 313 falsch positiven ausgewiesen. Die Auswahl des
Signifikanzbereich ist also aufgrund zu schlecht variierbar und deshalb für die Analyse
der hier verwendeten Arrays nur bedingt geeignet. Zwar waren 87% der von ihr
definierten und hier überprüften Kandidatengene korrekt definiert, aber es lassen sich
über die Vorgabe des Signifikanzbereiches keine weiteren Kandidatengene für eine
differentielle Expression finden. Die Beurteilung der Gene anhand des „Score(d)“, der
wie der t-Wert eine Beurteilung der Gene anhand der Signifikanz der Differenz der
Genexpressionen erlaubt, zeigt insgesamt nur eine mittlere Korrelation (R2=0.64) mit
dem t-Wert. Der für die vorliegende Untersuchung interessierende Bereich der
niedrigen t-Werte (< 0.2) korrelierte hoch mit dem „Score(d)“ der SAM Analyse
(R2=0.72). Da der t-Test sich also nicht stark von den Ergebnissen der SAM-Analyse
unterschied und leichter zu berechnen war, wurde er in den weiteren Analysen
verwendet.
Abbildung 22 Vergleich der Berechnung der Signifikanz von Expressionsunterschieden
mit der Signifikanzanalyse für Mikroarrays nach Tusher (Tusher,
Tibshirani u. a. 2001) und über den von Welch modifizierten t-Test.
4.3.4 FUNKTIONELLE EINORDNUNG DER DIFFERENTIELL EXPRIMIERTEN
GENE
Um einen besseren Überblick über einen möglichen funktionellen Zusammenhang der
Smad4 abhängig differentiell exprimierten Gene zu bekommen, wurde die Software
MAPPFinder verwendet (Dahlquist, Salomonis u. a. 2002; Doniger, Salomonis u. a.
2003). Dieses Programm sucht anhand der Genbankkennzeichnung die Kategorien eines
4 ERGEBNISSE
58
jeden Gens aus der Gene-Ontology1 heraus. Die Gene werden nach dieser Zuordnung zu
den Funktionen gruppiert. Es können Kriterien für die differentielle Expression von
Genen definiert und die Kategorien gefunden werden, die einen großen Anteil an und
eine große Anzahl von differentiell exprimierten Genen aufweisen. So lassen sich unter
den Genen, die den Kriterien entsprechen, funktionelle Gemeinsamkeiten entdeckten.
Für die Analyse mit dem Programm MAPPFinder wurden 36 Gene als differentiell
angesehen. Zum einen wurden die 22 in Tabelle 1 aufgeführten Gene verwendet, für die
die differentielle Expression im Northern Blot bestätigt wurde. Andererseits wurden
aber auch die in Tabelle 2 angegebenen Gene berücksichtigt, die die Kriterien, t-Wert
kleiner 0.15 und Unterschied in der Genexpression größer als zweifach, erfüllten. Die
Analyse wurde für insgesamt 650 Gene durchgeführt, die bei mindestens einer der
Arrayhybridisierungen eine nachweisbare Expression aufwiesen. Da für ein als
differentiell exprimiert angesehenes Gen keine Kategorie in der Gene-Ontology
hinterlegt war, beschränkte sich die Analyse auf 35 differentiell exprimierte Gene. Bei
Beschränkung auf solche Gene-Ontology-Kategorien unter denen mindestens zwei
differentielle Gene vorkamen, ergaben sich die in Tabelle 4 (Seite 59) genannten
Ergebnisse.
Zur Bewertung des Anteils der differentiellen Gene innerhalb einer Gene-Ontology
Kategorie wird durch MAPPFinder jeweils ein z-Wert berechnet.
Formel 1 Berechnung des z-Wertes durch MAPPFinder (Doniger, Salomonis u. a. 2003)
Der z-Wert liegt bei Null, wenn die Anzahl der differentiellen Gene der erwarteten
Anzahl differentieller Gene entspricht. Die erwartete Anzahl an differentiellen Genen
wird über die Anzahl der in dieser Gene-Ontology Kategorie gemessenen Gene durch
Bezug auf den Anteil der insgesamt differentiell exprimierten Gene berechnet. Dabei
geht man von zufälliger Verteilung der differentiellen Gene aus. Bei einem z-Wert
kleiner Null kommen deshalb weniger differentielle Gene vor als bei einer
Zufallsverteilung zu erwarten gewesen wären. Diese Kategorien sind folglich nicht
1
http://www.geneontology.org Das Ziel der Geneontology ist es ein einheitliches Vokabular zur
Beschreibung der molekularen Funktion, dem biologischen Prozess und der zellulären
Kompartimentierung von Genprodukten zu erstellen.
4 ERGEBNISSE
59
relevant und wurden in der Tabelle nicht berücksichtigt. Die Gene-Ontology Kategorien
mit z-Werten größer Null sind je interessanter desto größer der z-Wert ist. Bei den
HS766T Zellen fielen unter den Kategorien mit einem z-Wert größer zwei besonders
die Kategorien auf, die einen Einfluss der Expression von Smad4 auf die Transkription
nachweisen. Unter den sechs Kategorien mit den stärksten Veränderungen zeigen drei
einen Effekt. Zum einen finden sich zwei differentiell exprimierte Gene, die eine
Histondeacetylase Funktion haben, zum anderen sind zwei Gene mit der negativen
Regulation der Transkription vom Polymerase II assoziiert und acht Gene haben eine
Transkriptionsfaktorfunktion. Dieser Befund deckt sich mit der schon bekannten
Funktion von Smad4 als transkriptioneller Komodulator und verdeutlicht seine
vielfältigen Auswirkungen auf Transkriptionsfaktoren.
Tabelle 4 MAPPFinder Ergebnisse (Doniger, Salomonis u. a. 2003) der
Arrayhybridisierungen von Hs766T RNA von Smad4 exprimierenden und
Kontrollklonen. Dargestellt sind alle Prozesse, Funktionen oder
Kompartimente, denen mindestens 2 differentiell exprimierte Gene
zuzuordnen waren und deren z-Wert positiv war.
Die Immunantwort, der Prozess mit dem zweitbesten z-Wert, umfasst die größte Anzahl
an differentiell exprimierten Genen. Hier sind elf von den 51 nachweisbaren Genen
differentiell exprimiert. Alle elf Gene zeigen durch die Smad4 Expression eine
4 ERGEBNISSE
60
Verringerung der Transkriptmenge, die wie schon beschrieben, mittels Northern Blot
Hybridisierung bereits überprüft worden war (siehe Abbildung 15 und Tabelle 5). Für
diese Gene ist in der Literatur eine Induzierbarkeit durch Interferone beschrieben
(Tabelle 5). Da außerdem alle diese Gene Smad4 abhängig reprimiert sind, scheint
Smad4 die Repression von Interferon induzierten Genen zu bewirken. Dieser Einfluss
kann direkt sein durch Interaktionen von Smad4 mit Proteinen der Interferon
Signalwege, oder indirekt durch Auswirkungen von Smad4 bedingten Veränderungen in
der Zelle. Vorstellbar wären hier zum Beispiel Expressionsunterschiede von
Komponenten der Interferonsignalwege, Absättigung von Bindungspartnern, die für die
transkriptionelle Antwort auf Interferone notwendig sind oder unterschiedliche
Aktivierungslevel von Signalwegen, die mit den Interferon Signalwegen interagieren.
Da also viele Möglichkeiten für eine Einwirkung der Smad4 Expression auf die
Expression der durch Interferone induzierbaren Gene vorstellbar sind, werden im
folgenden einige Untersuchungen zu möglichen Wechselwirkungen vorgenommen
Tabelle 5 Gene mit der funktionellen Klassifizierung "Immunantwort". Die
Quotienten geben das Verhältnis der Transkriptmengen aus den Northern
Blot Hybridisierungen von Smad4 exprimierenden Klonen bezogen auf die
Kontrollklone an. Die Literaturstellen verweisen auf Artikel, in denen die
Induzierbarkeit der Gene durch Interferon beschrieben wird.
4.3.5 UNTERSUCHUNGEN ZUM INTERFERON SIGNALWEG
Bei der funktionellen Analyse der Genexpressionsdaten ergaben sich die größten
Unterschiede bei den Genen, die mit der Immunantwort zusammenhängen. Eine
Literaturrecherche ergab, dass sämtliche elf Gene in dieser Kategorie von Interferonen
induziert werden (Tabelle 5). Die Transkriptmengen aller dieser Gene wurden durch die
Smad4 Expression reduziert. Deshalb wurde die Reaktion der Interferon Signalwege in
4 ERGEBNISSE
61
den Zellen genauer untersucht. Zunächst wurde überprüft, ob die Induktion von
Interferon induzierten Genen in den Smad4 exprimierenden Zellen verändert ist, da in
den Smad4 exprimierenden Zellen eine Hemmung von Interferon Signalwegen die
verringerte Transkriptmenge erklären könnte.
Durch Behandlung mit Interferon alpha, beta und gamma wurde überprüft, ob die
HS766T Zellen noch normale transkriptionelle Reaktionen auf extrazelluläres Interferon
aufweisen. Die Zellen wurden zu diesem Zweck 6 Stunden lang in normalem Medium
den Interferonen ausgesetzt. Die RNA der Zellen wurde anschließend auf die
Expression von bekannten Zielgenen der Interferone untersucht (Der, Zhou u. a. 1998).
Abbildung 23 Interferon Behandlung von Hs766T Zellen. Die Zellen wurden in
normalem Medium kultiviert und die Interferone in Kombination mit
einem Mediumwechsel hinzugegeben. (IFNα: 10000 IE/ml ,IFNβ: 1000
IU/ml, IFNγ: 167ng/ml). Bei OAS2, MX1 und IRF1 sind die Ergebnisse
der nicht mit Interferon behandelten Zellen verstärkt dargestellt, um die
Unterschiede zwischen den Smad4 exprimierenden und den
Kontrollzellen zu verdeutlichen. Die EtBr-Färbung der ribosomalen
RNAs ist repräsentativ für alle Hybridisierungen.
Die Typ I Interferone α und β führten, wie bereits in (Der, Zhou u. a. 1998) beschrieben,
zur Induktion der Transkripte der Interferon induzierbaren Proteine MX1 und der
Oligoadenylat-Synthetase 2. Diese Gene wurden wesentlich schwächer durch das Typ II
Interferon γ induziert. Diese Reaktion lies auf einen intakten Typ I Interferon Signalweg
schließen. Der durch die Smad4 Expression verursachte Unterschied in der
Transkriptmenge der beiden war nach Induktion durch Typ I Interferone nicht mehr
4 ERGEBNISSE
62
signifikant. Nach Behandlung mit Interferon γ erhöhte sich die Transkriptmenge beider
Gene. Der Smad4 bedingte Unterschied blieb hierbei erhalten.
Abbildung 24 Induktionsfaktoren von OAS2, MX1, IRF1 und HLA-G nach
sechsstündiger Behandlung mit Interferonen, bezogen auf die
Kontrollklone K3 und K6 ohne Interferon-Behandlung. Die Klone D4,
D5 und D8 exprimieren Smad4.
IRF1 ist ein Gen, welches hauptsächlich durch Interferon γ induziert wird (Der, Zhou u.
a. 1998). Die Behandlung mit Interferon γ führte bei IRF1 zu einer deutlichen Induktion
des Transkriptes. Die Transkriptmenge wurde aber auch durch die Interferone α und β
erhöht. Dies zeigt, dass die Zellen auch auf Interferon γ mit der eindeutigen Induktion
eines bekannten Zielgens reagierten. Der Smad4 abhängige Unterschied in der
Expression von IRF1 blieb auch nach Interferon γ Behandlung erhalten. Die Induktion
mit Interferon α oder β führte nur zu einer geringfügigen Induktion. Der Smad4
abhängige Unterschied blieb bei der Interferon β Behandlung erhalten.
4 ERGEBNISSE
63
Das Gen HLA-G ist ein Beispiel für Gene, die bekanntermaßen von allen drei
Interferonen, also von Interferonen vom Typ I und von Typ II induziert werden
(Ibrahim, Guerra u. a. 2001). Es weist auch in Abbildung 24 eine leichte Induzierbarkeit
durch alle Interferone auf. Durch Smad4 Expression zeigt sich ein auch unter der
Interferonbehandlung stabiler Transkriptmengenunterschied.
Die unterschiedlichen Interferon Signalwege vom Typ I und Typ II ließen sich nahezu
unabhängig voneinander durch Typ I oder Typ II Interferone aktivieren. Bekannte
Zielgene zeigten nach 6 Stunden eine deutliche Erhöhung der Transkriptmenge. Die
Aktivierung der Zielgene trat in Smad4 exprimierenden und Kontrollzellen auf. Es
konnte deshalb davon ausgegangen werden, dass beide Arten von InterferonSignalwegen in Hs766T Zellen unabhängig von der Smad4 Expression aktivierbar sind.
Die Smad4 abhängigen Unterschiede waren nach Interferon γ und β Behandlung bei
jedem Gen noch vorhanden. Nach der Behandlung mit Interferon α zeigte sich der
Unterschied nur noch beim gering induzierten HLA-G. Die Reduktion der
Transkriptmenge durch Smad4 scheint daher in einer Verringerung der Aktivierbarkeit
der Transkription der beschriebenen Gene durch Interferone begründet zu sein.
4.3.5.1 SERUMEFFEKTE
Das im normalen Kulturmedium enthaltene Serum kann Effekte auf die Transkription
von interferoninduzierten Genen ausüben (Gao, Folghera u. a. 1993). Durch
Serumentzug wurde untersucht, wie sich das Serum auf die Transkriptmengen der
Interferon induzierten Gene auswirkt. Es stellte sich die Frage, ob erstens durch
Serumbehandlung die Gene induziert werden und ob zweitens der Unterschied
unabhängig von der Serummenge im Kulturmedium erhalten bleibt. Die Zellen wurden
hierzu unter serumfreien Bedingungen und unter Zusatz von 10% fötalem Kälberserum
(FKS) kultiviert; nach 24, 48 und 72 Stunden wurden die Transkriptmengen von IRF1
überprüft (Abbildung 25, Abbildung 26).
4 ERGEBNISSE
64
Abbildung 25 Effekte des Serumentzugs auf die IRF1 Expression. Die RNA der Zellen
wurde 24, 48 und 72 Stunden nach dreimaligem Waschen mit
serumfreien Medium präpariert. Die Kontrollzellen wurden analog
behandelt, aber nach dem Waschen serumhaltiges Medium zugegeben.
Abbildung 26 Relative Transkriptmengen von IRF1 nach 24, 48 und 72 Stunden
serumfreier Kultivierung und Behandlung mit 10% FKS. K3 und K6 sind
Kontrollklone; D4, D5 und D8 sind Smad4 exprimierende Zellen.
Die Transkriptmengen von IRF1 wiesen unabhängig von den Kulturbedingungen in den
Smad4 exprimierenden Klonen einen signifikant niedrigeren Level auf (t=1,1*10-6
serumfrei bzw. t=1,7*10-5 10% FKS). Durch die Behandlung mit Serum wurde sowohl
in den Kontrollklonen (t=1,1*10-6), als auch in den Smad4 exprimierenden Zellen
4 ERGEBNISSE
65
(t=1,2*10-3)die IRF1 mRNA-Menge signifikant erhöht. Zwischen den verschiedenen
Inkubationszeiten zeigten im Mittel in Abhängigkeit von der Smad4 Expression keine
signifikanten Unterschiede. Die Induktion durch die im Serum vorhandenen
Komponenten schien also nach 24 Stunden schon abgeschlossen zu sein. Das Serum
enthält folglich Faktoren, die eine Induktion von IRF1 bewirken. Da der Smad4
abhängige Unterschied aber unabhängig von den Kulturbedingungen erhalten blieb,
können Faktoren aus dem Serum nicht die alleinige Ursache für die Unterschiede in der
IRF1 Expression sein.
4.3.5.2 ÜBERSTANDSEXPERIMENT
Die Behandlung mit FKS zeigte, dass es nicht alleine für die höhere Expression der
Interferon induzierten Gene verantwortlich sein kann. Eine mögliche Erklärung für die
Induktion wäre eine größere Produktion von Interferonen in den Kontrollzellen. Eine
infolge dessen höhere extrazelluläre Interferon Konzentration könnte dann über die
intakten Interferon Signalwege den Unterschied in der Expression der Interferon
induzierten Gene bewirken. Smad4 könnte daher für eine geringere Interferon
Produktion verantwortlich sein.
Zur Überprüfung dieser Möglichkeit der autokrinen Stimulierung der Interferon
induzierten Gene wurde untersucht, ob die Zellen unterschiedliche Mengen von
Interferonen produzieren. Die Expression der Interferone β und γ wurde durch Northern
Blot Hybridisierung überprüft. Interferon γ wurde ausgewählt, da die Expression von
IRF1 zur Sekretion von Interferon α, β führt (Kroger, Dallugge u. a. 2003) und somit
auch für die Veränderung anderer Interferon regulierter Gene verantwortlich sein kann.
Interferon β wurde untersucht, da es die Zielgene von Typ I Interferonen induziert.
Beide Interferone ließen sich durch Hybridisierung nicht nachweisen. Mittels der
sensitiveren RT-PCR zeigten sich Unterschiede in der Expression von Interferon γ
(Abbildung 27). Die beiden Kontrollklone zeigten eine schwache Bande auf der
erwarteten Höhe von Interferon γ. Bei den Smad4 exprimierenden Klonen zeigte sich
kein PCR-Produkt. Die Expression von Smad4 scheint also die Transkriptmenge von
Interferon γ unter die Nachweisgrenze zu reduzieren.
4 ERGEBNISSE
66
Abbildung 27 RTPCR für Interferon γ in cDNA aus Hs766T Zellen. Bei A wurde die
größte Menge an cDNA eingesetzt, B bis E enthalten jeweils die Hälfte
der Menge des Vorgängers. Bei M ist der Größenmarker aufgetragen. Für
Interferon γ wurden 35 für β-Aktin 25 Zyklen in der Amplifizierung
verwendet.
Auf Grund des Nachweises der unterschiedlichen in der RTPCR nachgewiesenen
Expression von Interferon γ wurde mit einem Enzym gekoppelten Antikörper Nachweis
(ELISA, enzyme linked immuno assay) versucht, Interferon in den Zellen oder in von
den Zellen konditioniertem Medium nachzuweisen. Für den intrazellulären Nachweis
wurden mit Ionomycin und Phorbolester behandelte Lymphozyten verwendet. Zur
intrazellulären Anreicherung des Interferon γ im endoplasmatischen Retikulum wurden
die Zellen für fünfeinhalb Stunden Monensin einem Inhibitor des Transportes zum
Golgi-Apparat behandelt. Die Lymphozyten lagen weit oberhalb der Eichgeraden (OD
1,51 entspricht deutliche mehr als 30 Einheiten/ ml) und zeigen die Sensitivität des
ELISA’s an. Die Eichgerade verlief linear bis 0.39 Einheiten/ ml; es ließ sich aber in
den Hs766T unabhängig von Monensinbehandlung und Smad4 Expression kein
Interferon γ nachweisen. Die Untersuchung von konditionierten Überständen auf
Interferon γ führte ebenfalls nicht zu einem Nachweis von Interferon γ.
Es ließ sich zwar mRNA von Interferon γ in den Kontrollzellen nachweisen, aber der
Interferon γ ELISA, war entweder nicht sensitiv genug, oder die Zellen produzierten
kein Interferon γ Protein. Um zu überprüfen, ob die Zellüberstände biologisch aktive
Interferone oder andere Substanzen aufweisen, die für die Expression der Interferon
induzierten Gene verantwortlich sein könnten, wurde untersucht, ob die Behandlung mit
4 ERGEBNISSE
67
konditioniertem Medium in Abhängigkeit von der Smad4 Expression andere
Auswirkungen hat. Zur Überprüfung des Effektes des konditionierten Mediums wurde
die Expression des am stärksten durch Interferon γ induzierten Gene, IRF1 mittels
Northern Blot Hybridisierung überprüft (Abbildung 28, Abbildung 30).
Abbildung 28 Effekte von konditionierten Zellkulturüberständen auf die Expression
interferoninduzierter Gene. Die Zellen wurden 24 Stunden serumfrei
kultiviert und anschließend serumfreies Medium für 48 Stunden
konditioniert. Danach wurden 24 Stunden serumfrei gehaltene Zellen 6
Stunden mit dem konditionierten Medium behandelt und die RNA
präpariert.
Abbildung 29 Transkriptmengen von IRF1 nach Behandlung von Hs766T Zellen mit
konditionierten Medien
Auch nach der Behandlung mit konditionierten Überständen blieben die Smad4
abhängigen Unterschiede erhalten. Die Art des konditionierten Überstandes hatte keinen
Einfluss auf die IRF1 Transkriptmenge. Eine autokrine Stimulierung von IRF1 war also
nicht anzunehmen. Zudem lies sich auch über einen Interferon γ spezifischen ELISA
außer in den Positivkontrollen kein Interferon γ nachweisen. Die höhere Expression
Interferon induzierter Gene in den Smad4 negativen Kontrollzellen war also nicht durch
eine Interferon γ Produktion zu erklären.
4 ERGEBNISSE
68
4.3.5.3 DOSIS- UND ZEITABHÄNGIGKEIT DER REAKTION
Die Differenz in der Expression von interferoninduzierten Genen könnte durch
Unterschiede in der Expression von Komponenten der Interferon Signalwege verursacht
sein. Eine veränderte Aktivierbarkeit der Interferon Signalwege kann durch
Untersuchung der Zeit- und Dosisabhängigkeit der Reaktion auf Interferone
nachgewiesen werden.
Abbildung 30 Dosisabhängigkeit der IRF1 und HLA-G Transkriptmengen nach
Interferon γ Behandlung2 Northern Blot Hybridisierungen mit je 6 µg
Gesamt-RNA, Behandlung der Hs766T Klone mit IFNγ für 6 Stunden
mit den angegebenen Mengen nach Kultivierung in serumfreien Medium
für 24 Stunden.
Abbildung 30 zeigt die Dosisabhängigkeit der Induktion von IRF1 durch Interferon γ
unter serumfreien Bedingungen. Bei Behandlung mit 0,1 bis 10 Einheiten IFN γ pro ml
wies der Kontrollklon eine größere IRF1 Menge auf. Bei 100 und 1000 Einheiten IFN γ
waren die Mengen vergleichbar. Der Smad4 abhängige Unterschied blieb also bei
Behandlung mit niedrigen Interferon Mengen erhalten und verschwand erst bei nahezu
maximaler Induktion. Es gab folglich eine Smad4 abhängige Reduktion der
Transkriptmenge im nicht aktivierten Zustand und bei nicht maximaler Induktion von
IRF1.
2
Die Darstellung der Intensitäten ist nichtlinear durch die Graustufen wiedergegeben.
Zur besseren Sichtbarkeit der schwachen Banden wurde den schwächeren Intensitäten
eine größere Anzahl an Graustufen zugewiesen (Optiquant, Option „Scale for large
dynamic Range“,Exponenten 0,3).
4 ERGEBNISSE
69
Abbildung 31 Induktionsfaktoren von IRF1 und HLA-G nach Interferon γ Behandlung
bezogen auf den serumfreien Smad4 exprimierenden Klon.
HLA-G wurde ebenfalls im Smad4 positiven Klon und im Kontrollklon induziert,
behielt aber den anfänglichen Expressionsunterschied auch nach Induktion durch IFN γ
bei. Da die Transkriptmenge bis zur Behandlung mit 1000 Enzymeinheiten pro
Milliliter weiter anstieg, scheint hier die maximale Aktivierung noch nicht erreicht zu
sein. Es findet sich also auch bei HLA-G ein Smad4 abhängiger Unterschied, der auch
nach Induktion mit relativ hohen Dosen von Interferon γ erhalten bleibt.
Für die genauere Untersuchung der Reaktion auf Interferon γ wurde der zeitlichen
Ablauf der Reaktion auf extrazelluläres Interferon untersucht. Hs766T Zellen wurden
hierzu bis zu acht Stunden mit Interferon γ behandelt und die Expression von drei
interferonregulierten Genen überprüft (Abbildung 32). MX1 wird hauptsächlich durch
Interferone von Typ I induziert (Der, Zhou u. a. 1998). IRF1 und CD74 sind vor allem
durch Interferon γ induzierbar (Sartoris, Valle u. a. 1998; Abe, Urano u. a. 1999).
In allen untersuchten Genen ist eine Induzierbarkeit durch Interferon γ zu beobachten.
Die Induktion aller Gene ist im Smad4 exprimierenden Klon D8 schwächer als im
Kontrollklon K3. Der zuvor beobachtete basale Unterschied in den Transkriptmengen
blieb auch in diesem Experiment erhalten. Bei IRF1 ist er aufgrund der starken
interferonabhängigen
Induktion
nicht
in
dieser
Verstärkung
sichtbar.
Die
Induktionsfaktoren sind für IRF unabhängig vom der Smad4 Expression sehr ähnlich,
obwohl sich die Transkriptmengen eindeutig unterscheiden (Abbildung 33). Für CD74
und MX1 konnten die Induktionsfaktoren nicht verlässlich bestimmt werden, da die
Intensitäten im Smad4 exprimierenden Klon zu gering waren. Die zuvor schon
4 ERGEBNISSE
70
beobachteten Smad4 abhängigen Unterschiede in der Transkriptmenge blieben aber
auch nach Behandlung mit Interferon γ, wenn auch auf höherem Niveau, erhalten.
Abbildung 32 Zeitverlauf der Reaktion von Hs766T Zellen auf Interferon γ. Die
Behandlung erfolgte mit 10 IE/ml.
Folglich ist die Induzierbarkeit von Genen durch Interferon γ nicht von Smad4
beeinflusst. Die Smad4 abhängigen Unterschiede in der Transkriptmenge blieben aber
auch nach Induktion durch Interferon γ erhalten.
4 ERGEBNISSE
71
Abbildung 33 Signalintensität und Induktionsfaktoren von IRF1 bezogen auf den
Nullwert nach Behandlung von Hs766T Zellen mit Interferon γ
4.3.5.4 EFFEKT VON TGFΒ AUF DIE INTERFERON ABHÄNGIGE INDUKTION VON
ZIELGENEN
Bei den Hs766T Zellen führt die Expression von Smad4 nicht zu einer
Wiederherstellung der klassischen Reaktionen auf Behandlung mit TGFβ. Es zeigt sich
beispielsweise keine Induktion von p15INK4b und nur eine geringe Induktion von
p21CIP1, aber keine Wachstumsinhibition durch TGFβ (Schwarte-Waldhoff, Volpert u.
a. 2000). Obwohl diese TGFβ-Antworten durch die Smad4 Expression nicht
wiederhergestellt werden, könnte TGFβ einen Einfluss auf die Interferon induzierten
Gene haben. Vorstellbar wäre ein Antagonismus zwischen dem TGFβ Signalweg und
dem Interferon Signalweg, der in den Smad4 exprimierenden Zellen zur Hemmung der
Interferon induzierten Gene führt. Um dies zu überprüfen, wurden Hs766T Zellen mit
Interferon γ und TGFβ behandelt. Falls TGFβ über Smad4 auf die interferonregulierten
Gene einwirkt, sollte die Reaktion auf Interferon γ durch TGFβ Behandlung verändert
werden. Es wurde eine geringe Interferon γ Konzentration gewählt (10 Einheiten/ml),
4 ERGEBNISSE
72
die nur zu einer schwachen Induktion führte, um einen möglichen TGFβEffekt nicht
durch die starke Induktion der Gene zu überdecken.
Abbildung 34 Behandlung von Hs766T Zellen mit Interferon γ (10 U/ml) und TGFβ1
(5 ng/ml) unter serumfreien Bedingungen
Abbildung 35 Relative Transkriptmengen nach Interferon γ und TGFβ1 Behandlung
von serumfrei kultivierten Hs766T Zellen
Abbildung 34 und Abbildung 35 zeigen die Ergebnisse der Behandlung von Hs766T
Zellen mit Interferon γ und TGFβ. Bei IRF1 führte die Behandlung mit Interferon γ zu
einer deutlichen Induktion der Transkriptmenge nach einer und vier Stunden. Smad4
abhängig zeigte sich eine leichte Reduktion der mRNA-Mengen im Smad4
exprimierenden Klon. Die TGFβ Behandlung führte in den Smad4 exprimierenden
Zellen nicht zu einer Beeinflussung der IRF1 Induktion durch Interferon γ. Die im
Kontrollklon zu beobachtende verstärke Induktion nach 4 Stunden kombinierter TGFβund Interferon-Behandlung konnte in nachfolgenden Experimenten nicht bestätigt
werden.
4 ERGEBNISSE
73
HLA-G wies ebenfalls unabhängig von der Behandlung in den Kontrollklonen eine
größere mRNA Menge als in den Smad4 exprimierenden Klonen auf. Die Induktion
durch Interferon γ war nur gering und führte nach vier Stunden Smad4-unabhängig zu
mehr Transkript. Die Behandlung mit TGFβ führte zu keiner signifikanten Reduktion
der HLA-G Transkriptmengen.
Die Behandlung mit TGFβ und Interferon γ zeigte, dass sich die Smad4 abhängigen
Unterschiede in der Expression von IRF1 und HLA-G nicht durch die Behandlung mit
rekombinantem TGFβ verändern ließen. Die Verringerung der Transkriptmenge der
Interferon regulierten Gene scheint daher durch Smad4 verursacht zu sein, nicht aber
ein Effekt von TGFβ zu sein.
4.4 EXPRESSIONSUNTERSCHIEDE NACH SUBKUTANER
INJEKTION IN NACKTMÄUSE
Hs766T Zellen zeigen bei stabiler Expression von Smad4 und subkutaner Injektion in
die Nackenregion von Nacktmäusen (BALB/c01aHsd-nu/nu) ein verringertes
Tumorwachstum mit einem Wachstumsstop der Smad4 exprimierenden Klone zwischen
drei und fünf mm Durchmesser (Schwarte-Waldhoff, Volpert u. a. 2000). Mit Hilfe der
Atlas Makroarray Analyse sollte der Einfluss von Smad4 auf das Expressionsprofil von
Hs766T Zellen nach subkutaner Injektion in Nacktmäuse genauer untersucht werden.
Da die Sonden auf dem humanen Atlas Array auf geringe Kreuzhybridisierungen hin
optimiert sind, sollte es möglich sein, das Expressionsprofil von humanen Hs766T
Zellen in Nacktmäusen zu ermitteln. Die anschließende Analyse der RNA aus den
Tumoren auf einem murinen Atlas Makroarray sollte Hinweise auf die zelluläre
Zusammensetzung der Tumore geben, da diese durch Interaktionen der humanen Zellen
mit murinen Zellen Unterschiede aufweisen könnte.
Für die Bildung der Nacktmaustumore wurden jeweils 2 x 106 Zellen Smad4
exprimierende Zellen und Kontrollzellen in PBS in Nacktmäuse injiziert. Nachdem die
Tumore der Smad4 negativen Hs766T Zellen in einer Richtung eine Ausdehnung von
10 mm erreicht hatten, wurden sie präpariert und in flüssigem Stickstoff konserviert.
Anschließend wurde das Gewebe mit einem Kryotom zerkleinert. Die RNA Präparation
erfolgte wie in Abschnitt 3.5.1 angegeben.
4 ERGEBNISSE
74
4.4.1 EXPRESSIONSUNTERSCHIEDE HUMANER GENE
Zunächst wurde die Tumor RNA auf dem humanen cDNA Array untersucht. In
Abbildung 36 sind die Ergebnisse von je vier Arrays mit RNA von Smad4
rekonstituierten Klonen und aus Kontrollklonen dargestellt. Für die Analysen wurden
vier Smad4 negative Tumore vom K6 Klon, drei Tumore vom Smad4 exprimierenden
D8 Klon und ein Tumor vom D5 Klon verwendet.
Abbildung 36 Arrayergebnisse aus Nacktmaustumoren von Hs766T Klonen
Die im Diagramm ausgefüllten Gene (siehe auch Tabelle 6) weisen einen minimal
zweifachen Unterschied in der Genexpression und einen maximalen t-Wert von 0,15
auf. Sie sollten folglich mit hoher Wahrscheinlichkeit differentiell exprimiert sein. Da
die Menge an Tumor-RNA begrenzt ist, wurde zur Überprüfung der Zuverlässigkeit nur
ein Gen für die Northern Blot Hybridisierung ausgewählt.
Abbildung 37 zeigt die Expressionsmengen von Mesothelin unter Zellkulturbedingungen und in zwei Nacktmaustumoren. Um sicherzustellen, dass die cDNA
Sonde spezifisch für die humane Sequenz ist und somit auch nur das Signal der Hs766T
Zellen detektiert wird, wurde mit der Sondensequenz eine BLAST-Analyse3
durchgeführt. Von der 201 Basenpaare langen Sonde, die zu 100% mit der humanen
3
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool) ist eine Sammlung
von Programmen, um alle verfügbaren Sequenzen organismusübergreifend nach Ähnlichkeiten zu
durchsuchen.
4 ERGEBNISSE
75
Sequenz übereinstimmt, findet sich die größte Homologie zu Maussequenzen in einem
25 Basenpaare langen Bereich, in dem 96% der Basenpaare übereinstimmen. Unter den
verwendeten Hybridisierungsbedingungen sollte also nur die humane mRNA oder
cDNA mit der Sonde hybridisieren, und es kann davon ausgegangen werden, dass das
Signal humanspezifisch ist.
Abbildung 37 Mesothelin Expression in Hs766T Zellen im subkutanen Nackmaustumor
und unter serumhaltigen Zellkulturbedingungen
Die Mesothelinexpression war in den Nacktmaustumoren von Smad4 exprimierenden
Zellen verringert und bestätigte das Ergebnis aus den Arrayhybridisierungen. Im
Gegensatz dazu war in den unter Zellkulturbedingungen kultivierten Zellen ein leichter
Anstieg der Mesothelinexpression in den Smad4 positiven Zellen zu verzeichnen.
In Tabelle 6 sind die Gene angegeben, für die anhand ihres Expressionsprofils ein
Smad4 abhängiger Unterschied vermutet wird. Das Gen mit dem besten t-Wert ist die
von Interferonen induzierbare durch doppelsträngige RNA aktivierbare Proteinkinase.
Eine Überprüfung der Homologie der 226 Basenpaare langen Sonde zu murinen
Sequenzen zeigte nur in einem 28 Basenpaar langen Bereich eine Übereinstimmung von
26 Basenpaaren. Somit ist kein Signal von den im Tumor enthaltenen murinen Zellen zu
erwarten und es kann aufgrund des niedrigen t-Wertes und des Unterschiedes in der
Signalintensität von einer differentiellen Expression ausgegangen werden.
4 ERGEBNISSE
76
Tabelle 6 Differentielle Gene aus den subkutanen Nackmaustumoren. Es sind Gene
dargestellt, deren t-Wert kleiner als 0.15 ist und die mindestens einen
zweifachen Expressionsunterschied aufweisen.
4.5 UNTERSUCHUNG AN DER ZELLLINIE CFPAC-1
Da die Pankreaskarzinomzelllinie CFPAC-1 wie Hs766T auch eine homozygote
Deletion von Smad4 aufweist, wurde sie für die Rekonstitution mit Smad4 ausgewählt.
Die Transduktion der Zellen erfolgte mit VSV-G pseudotypisierten, attenuierten
Retroviren (siehe 3.4.6). Die Zellen wurden anschließend durch Kultivierung mit 800
µg/ml Geneticin auf die Integration des Konstruktes hin selektiert.
4.5.1 ETABLIERUNG DER SMAD4 EXPRIMIERENDEN ZELLEN
Zum Nachweis, dass das retrovirale Konstrukt auch nach Integration in den Zellen noch
zur Transkription des Smad4 führt, wurde RNA von subkonfluenten Zellen mittels
Northern Blot Hybridisierung untersucht (Abbildung 38).
Abbildung 38 Smad4 Transkriptmengen in retroviral transduzierten CFPAC-1 Zellen.
Die Anzahl der Passagierungen ist mit Px angegeben.
Die Transkription der Smad4 mRNA ist auch über eine große Anzahl von Passagen
stabil. Die Expression von Smad4 wurde durch einen Western Blot und anschließende
Immundetektion mit einem Smad4 spezifischen Antikörper nachgewiesen (Abbildung
39). Die Smad4 Proteinmenge blieb bis Passage 20 in etwa vergleichbar und lag über
der Menge, die von der pankreatischen Karzinomzelllinie Paca44 exprimiert wurde. Bei
längerer Passagierung der Zellen bis Passage 57 lies sich nur noch eine geringe Menge
Smad4 nachweisen.
4 ERGEBNISSE
78
Abbildung 39 Smad4 Proteinexpression in retroviral transduzierten CFPAC-1 Zellen im
Vergleich
zur
endogenen
Smad4
Expression
in
der
Pankreaskarzinomzelllinie Paca44. Die Anzahl (x) der Passagierungen
der Zellen ist mit Px angegeben.
Die Transduktion der CFPAC-1 Zellen mit dem retroviralen Vektor führte zu einer
mindestens bis Passage 20 stabilen Expression von Smad4. Die Proteinmengen lagen
etwas über den endogen von der Pankreaskarzinomzelllinie Paca44 exprimierten. Bei
Beachtung der Reduktion der Smad4 Expression bei langer Passagierung der Zellen,
sollten diese für die Analyse der Effekte von Smad4 geeignet sein.
4.5.2 ÜBERPRÜFUNG DER WIEDERHERSTELLUNG VON TGFβANTWORTEN
Nach der Expression von Smad4 interessiert zunächst die Auswirkung auf bekannte von
TGFβ regulierte Gene wie PAI1 und p21CIP1 (Grau, Zhang u. a. 1997), um die mögliche
Wiederherstellung des klassischen TGFβ Signalweges zu überprüfen. CFPAC1 Zellen
wurden für eine bis acht Stunden mit TGFβ behandelt und die Veränderung der
Transkriptmengen von PAI1 und p21CIP1 durch Northern Blot Hybridisierung überprüft
(Abbildung 40).
Zur genauen Analyse der Reaktion auf die TGFβ-Behandlung wurden die mRNA
Mengen densitometrisch quantifiziert, auf die jeweilige Menge an GAPD abgeglichen
und der größte Wert für jedes Gen auf eins standardisiert (Abbildung 41).
Die Smad4 exprimierenden CFPAC1 Zellen zeigten basal eine erhöhte mRNA Menge
von PAI1. Durch die TGFβ-Behandlung lies sich PAI1 nur in den Smad4
exprimierenden Zellen induzieren. Die TGFβ-abhängige Induzierbarkeit von PAI1 ist
folglich durch die Expression von Smad4 wiederhergestellt. Auch bei p21CIP1 zeigte
sich eine geringfügige Erhöhung der basalen mRNA Menge. Die Induzierbarkeit durch
TGFβ ist in den Kontrollzellen nicht wiederhergestellt. Bei den Smad4 exprimierenden
Zellen
war
eine
geringe
Induzierbarkeit
von
p21CIP1
zu
beobachten.
Die
4 ERGEBNISSE
79
Wiederherstellung der Funktion des klassischen TGFβ Signalweges scheint also
bezogen auf die beiden untersuchten Gene vorhanden zu sein.
Abbildung 40 Reaktion von subkonfluenten CFPAC-1 Zellen (Passage 7) auf die
Behandlung mit TGFβ (5 ng/ml).
Abbildung 41 Quantifizierung der Reaktion von CFPAC1 Zellen nach Smad4
Expression auf die Behandlung mit TGFβ (5 ng/ml)
4.5.3 EXPRESSIONSUNTERSCHIEDE UNTER ZELLKULTURBEDINGUNGEN IN
CFPAC-1
Nach Expression von Smad4 in CFPAC1 Zellen wurden auch diese durch cDNAArrayhybridisierungen auf die Effekte der Wiederherstellung der Smad4 Expression
untersucht. Hierzu wurde RNA von subkonfluenten Zellen präpariert und je drei Array
Hybridisierungen
mit
RNA
von
CFPAC-1 Kontrollzellen und den Smad4
exprimierenden Zellen durchgeführt. Abbildung 42 stellt die Ergebnisse aus diesen
Arrayhybridisierungen im Blasendiagramm dar.
Das Blasendiagramm wies im niedrigen Intensitätsbereich eine Verschiebung der
mittleren Genexpression zu den Smad4 exprimierenden Zellen hin auf. Deshalb könnten
hier allenfalls Gene als differentiell exprimiert angesehen werden, die in den
4 ERGEBNISSE
80
Kontrollzellen ein stärkeres Signal zeigten. Im mittleren bis hohen Intensitätsbereich
war die mittlere Genexpression der Zellen vergleichbar. Insgesamt fiel auf, dass sich die
Expressionsprofile der Zellen sehr ähnlich sind. Es gab wenige Gene mit niedrigem tWert, die einen großen Unterschied in der Genexpression aufwiesen.
Für zwei Gene wurde die Genexpression durch Northern Blot Hybridisierung überprüft
(Abbildung 43). Das TGFBI (M77349) Transkript wurde, wie anhand der Ergebnisse
vermutet, Smad4 abhängig induziert. ITGB4 (X53587) zeigte im Mittel ebenfalls eine
größere Transkriptmenge in den Smad4 exprimierenden Zellen.
Abbildung 42 Blasendiagramm der Arrayhybridisierungen von Smad4 exprimierenden
CFPAC-1 Zellen und Kontrollzellen. Dargestellt sind die Ergebnisse von
jeweils 3 Arrayhybridisierungen.
Abbildung 43 Differentiell exprimierte Gene in CFPAC-1. Dargestellt sind die
Hybridisierungsergebnisse von RNA Präparationen unterschiedlicher
Passagen der subkonfluenten CFPAC1 Zellen.
4 ERGEBNISSE
81
4.5.4 VERHALTEN VON CFPAC-1 ZELLEN NACH SUBKUTANER INJEKTION
IN NACKTMÄUSE
Um den Effekt der Smad4 Expression in den CFPAC-1 Zellen auf das Tumorwachstum
zu untersuchen, wurden Smad4 exprimierende Zellen und Kontrollzellen subkutan in
die Nackenregion von Nacktmäusen (BALB/c01aHsd-nu/nu) injiziert. Die Tumorgröße
wurde aus den Ausdehnungen der Tumore in Längs- und Querrichtung berechnet, die
mit
einer
Schieblehre
ermittelt
wurden
(Abbildung
Volumenberechnung verwendete Formel Tumorvolumen =
44).
Die
hier
zur
Π
× (Länge x Breite x Höhe )
6
korreliert nach Tomayko und Reynolds am stärksten mit dem Tumorgewicht (Tomayko
und Reynolds 1989).
300
200
TJM-Smad4 21d
TJM 21d
TJM-Smad4 14d
TJM 14d
0
TJM-Smad4 7d
100
TJM 7d
Volumen in mm
3
400
Abbildung 44 Tumorgrößen nach Injektion von CFPAC-1 Zellen in die Nackenregion
von Nacktmäusen (BALB/c01aHsd-nu/nu)
Die Zellen zeigten durch die Expression von Smad4 keine Veränderung in der
Tumorgröße. Die Smad4 Expression hatte also in diesen Zellen keinen offensichtlichen
Effekt auf das Tumorwachstum nach subkutaner Injektion in Nacktmäuse.
4.5.5 ÜBERPRÜFUNG VON INTERFERON REGULIERTEN GENEN
In Hs766T Zellen wiesen nach Expression von Smad4 viele Interferon regulierte Gene
eine geringere Transkriptmenge auf. In CFPAC1 ergab sich aufgrund der
Atlasarrayergebnisse kein Hinweis auf eine vergleichbare Regulation. Um zu
überprüfen, ob Interferon Induzierte Gene auch in CFPAC1 nach retroviraler
Transduktion von Smad4 differentiell exprimiert sind, wurde die Expression von IRF,
IFI17 und MX1 nach TGFβ-Behandlung untersucht (Abbildung 45, Abbildung 46).
4 ERGEBNISSE
82
Die Transkriptmenge von IRF1, IFI17 und MX1 war beim Vergleich des Nullwertes
ohne TGFβ Behandlung nach Smad4 Expression im Verhältnis zu den Smad4 negativen
Zellen reduziert. Die drei Gene wiesen somit in CFPAC1 eine Smad4 abhängige
Reduktion der Transkriptmenge auf.
Die Behandlung mit TGFβ führte bei IRF in den Smad4 exprimierenden Zellen zu einer
geringen Induktion nach 2, 4 und 8 Stunden, die in den Smad4 negativen Zellen nicht zu
beobachten war. IFI17 wies in den Kontrollzellen zu allen Zeitpunkten eine höhere
Expression auf und wurde durch TGFβ in den Smad4 exprimierenden Zellen induziert.
Die MX1 mRNA-Menge war ebenfalls in den Kontrollzellen höher als in den Smad4
exprimierenden Zellen. Die TGFβ Behandlung bewirkte nur in den Smad4
exprimierenden Zellen eine durchgehende Erhöhung der MX1 mRNA-Menge.
Abbildung 45 Expression von Interferon induzierten Genen in CFPAC1 Zellen nach
Smad4 Expression und TGFβ-Behandlung (5 ng/ml)
Bei allen drei Genen war also die mRNA-Menge durch die Smad4 Expression in den
Zellen reduziert. TGFβ bewirkte in den Smad4 exprimierenden Zellen eine geringe
Induktion der drei untersuchten Gene, die in den Kontrollzellen nicht zu beobachten
war.
4 ERGEBNISSE
83
Abbildung 46 Transkriptmengen von IRF1, IFI17 und MX1 in CFPAC1 Zellen nach
Smad4 Expression und Behandlung mit 5ng/ml TGFβ1 in serumfreiem
Medium für 0 bis 24 Stunden
5 DISKUSSION
Smad4 wurde als Tumorsuppressorkandidatengen auf Chromosom 18q entdeckt (Hahn,
Schutte u. a. 1996), von dem unter anderem bei pankreatischen Adenokarzinomen
häufig ein Allel im Verlauf der Tumorprogression verloren geht. Smad4 ist ein Mitglied
der Smad Proteinfamilie, die Signale der TGFβ-Zytokin-Superfamilie weiterleitet.
Es wurde gezeigt, dass die stabile Expression von Smad4 in der Zelllinie Hs766T, die
eine homozygote Deletion von Smad4 aufweist, zu einem Stopp des Tumorwachstums
nach subkutaner Injektion in Nacktmäuse bei einer Tumorgröße von drei bis fünf
Millimetern Durchmesser führt (Schwarte-Waldhoff, Volpert u. a. 2000). Im Gegensatz
dazu war kein großer Unterschied in der Proliferationsrate unter Zellkulturbedingungen
festzustellen. Die Zellen wiesen keine Wiederherstellung der Induktion der typischen
TGFβ-Zielgene p15INK4b und p21CIP1 auf. Die Basalexpression von VEGF und
Thrombospondin 1 hingegen waren reziprok in Abhängigkeit von der Smad4
Expression reguliert und führten zu einer verringerten Angiogenese in den Tumoren von
Smad4 exprimierenden Zellen.
In dieser Arbeit sollten die Auswirkungen der Reexpression von Smad4 auf das
Expressionsprofil der pankreatischen Adenokarzinomzelllinie Hs766T genauer untersucht werden und weitere Smad4 regulierte Gene entdeckt werden. Ein Schwerpunkt
dieser Arbeit war es, eine Methode anhand des Vergleichs von Smad4 exprimierenden
Klonen und Smad4 negativen Klonen der Zelllinie Hs766T zu etablieren, die in der
Lage ist auch moderate Unterschiede in der Expression sensitiv und zuverlässig zu
detektieren.
Zur
Überprüfung
der
Arrayergebnisse
wurden
Northern
Blot
Hybridisierungen verwendet, da diese wenig anfällig für Artefakte sind, leicht zu
quantifizieren sind und eine große Genauigkeit aufweisen. Anschließend soll diese
Auswertungsmethode sowohl im Rahmen dieser Arbeit als auch darüber hinaus für
andere differentielle Expressionsanalysen verwendet werden. Der Vergleich von
Expressionsprofilen sollte zunächst in Hs766T Zellen, sowohl unter Zellkulturbedingungen, als auch in Nacktmaustumoren, durchgeführt werden. Für die Auswertung
der Expressionsprofile der Nacktmaustumore ist eine valide Auswertungsmethode
notwendig, da bei ihnen die verfügbare RNA-Menge besonders begrenzt ist. In der
5 DISKUSSION
85
Zelllinie CFPAC1, einer weiteren Zelllinie mit homozygoter Smad4 Deletion, sollte
Smad4 reexprimiert werden, um auch in dieser Zelllinie nach Smad4 abhängig
regulierten Genen zu suchen. Der Vergleich der in beiden Zelllinien gefundenen, Smad4
abhängig regulierten Gene sollte zur Einschätzung der Relevanz der entdeckten Gene
dienen. Gene, die in beiden Zelllinien gleichsinnig von Smad4 reguliert sind, also nicht
vom genetischen Hintergrund der Zellen abhängig sind, haben möglicherweise weit
reichende Bedeutung in der Karzinogenese des Pankreas.
5.1 ENTWICKLUNG DER AUSWERTUNGSMETHODE
Für die Analyse der Smad4 abhängigen transkriptionellen Effekte wurde zunächst ein
verlässliches System entwickelt werden, mit dem die Expression von vielen Genen
simultan und mit ausreichender Genauigkeit aufgenommen werden konnten. Das
cDNA-Arraysystem Atlas von BD wurde verwendet, da es folgende Vorteile bot:
Erstens sind bei diesem cDNA Arraysystem die Ergebnisse von verschiedenen Hybridisierungen gut vergleichbar, da die aufgebrachten cDNA-Mengen gut kontrolliert sind
(10 ng +/- 2 ng pro cDNA). Zweitens wurde das Problem von Kreuzhybridisierungen
seitens des Herstellers durch Vermeidung von Sequenzhomologien der cDNA
Sequenzen zu anderen bekannten Sequenzen minimiert. Bei diesem Arraysystem wird
drittens durch die Verwendung einer Mischung aus genspezifischen Primern die
Sensitivität bei der Sondensynthese erhöht. Viertens ermöglicht die Zusammenstellung
der Gene auf dem Array eine Beschränkung der Analyse auf Gene, die bekanntermaßen
mit Krebs assoziiert sind.
Zu Beginn der Auswertung von Arrayexperimenten müssen aus den digitalisierten
Signalen der hybridisierten Membranen die einzelnen Intensitäten der Hybridisierung
für jede aufgebrachte cDNA ermittelt werden. Für diese Berechnung der Signalintensitäten können verschiedene Programme verwendet werden. Hier wurde das
Programm GenePix Pro von Axon Laboratories zur densitometrischen Auswertung
benutzt, da es im Vergleich zu anderen Programmen besonders geeignet ist (Le Meur
2001). Es bietet wie die häufig verwendeten Programme Scanalyse und Imagene eine
verlässliche Quantifizierung. Zusätzlich zu einer benutzerfreundlichen Oberfläche hat
GenePix Pro eine Programmierschnittstelle vorzuweisen, die es ermöglicht die
Auswertung in Teilen zu automatisieren.
5 DISKUSSION
86
Die Berechnung der Intensität eines Hybridisierungssignales wird durch mehrere
Faktoren beeinflusst. Unerlässlich ist die Berücksichtigung der Hintergrundintensität,
die von Signal zu Signal variieren kann. Wichtig ist die Art der Begrenzung von Signal
und Hintergrund sowie die Methode zur Berechnung der hintergrundkorrigierten Signalintensität. In dem verwendeten Programm GenePix Pro erfolgt die Auswertung der
Signale über Auswertungskreise, die in Größe und Lage variabel sind. Es wurde für die
Auswertung von Mikroarrays entwickelt, die mit Fluoreszenz-markierten Sonden
hybridisiert werden. Diese Signale haben eine geringere Streuung, als radioaktiv
markierte Nukleotide, die über die Fläche der aufgebrachten Sonde hinaus streuen. Da
die Größe des Signals von radioaktiven Proben mit ansteigender Signalintensität
zunimmt
und
der
Algorithmus
in
GenePix
Pro
für
Mikroarrays
mit
fluoreszenzmarkierten Proben optimiert ist, musste die Methode entsprechend angepasst
werden. Eine einfache Berechnung der korrigierten Signalintensität aus dem Median der
Hintergrundintensität und dem Mittelwert der Signalintensität führt hier nicht zu
korrekten Ergebnissen, da für schwache Signale das Programm nicht in der Lage ist die
Größe des Auswertungskreises automatisch anzupassen. Für diese Signale wurde die
Größe des Auswertungskreises manuell festgelegt. Durch die manuelle Anpassung
ändert sich für ansonsten gleiche Signale die Größe des ausgewerteten Bereiches. Damit
dies nicht zu einer Verzerrung in der korrigierten Signalintensität führt, wurde für die
Auswertung die Summe der Intensität aller Bildpunkte im Auswertungskreis nach
Abzug des Medians der Hintergrundintensität berechnet. Dieser Algorithmus bietet den
Vorteil, dass bei kleinen Signalen, bei denen der Hintergrund nur geringfügig von der
Streuung des Signals beeinflusst wird, eine Vergrößerung des ausgewerteten Bereiches
durch die Hintergrundkorrektur nur geringe Auswirkungen hat. Die mittlere
Signalintensität hingegen nimmt bei einer Vergrößerung des Auswertungskreises ab, da
eine größere Anzahl von Hintergrundbildpunkten fälschlicherweise dem Signal
zugerechnet wird.
Für den quantitativen Vergleich von zwei Expressionsprofilen wird die Mittelung der
Signalintensitäten über mindestens drei Makroarrayhybridisierungen in jeder Gruppe
empfohlen (Lee, Kuo u. a. 2000; Wolfinger, Gibson u. a. 2001). Wenn die korrigierten
Signalintensitäten von verschiedenen Arrayhybridisierungen verglichen werden sollen,
ist aber eine Normalisierung der Intensitäten erforderlich. Die ist notwendig, da die
5 DISKUSSION
87
Intensitäten von Hybridisierung zu Hybridisierung aus vielfältigen Gründen variieren.
Es kann die RNA Menge variieren, die Effektivität der cDNA-Synthese, der
Hybridisierung oder der Waschvorgänge kann Unterschiede verursachen (Quackenbush
2002). Für die Normalisierung wurde in dieser Arbeit die Summe aller Signale
verwendet, die auf allen zu normalisierenden Makroarrays detektierbar waren. Diese
Methode bot den Vorteil auch unterschiedlich sensitive Makroarrayhybridisierungen
vergleichen zu können, da im Gegensatz zum Abgleich über alle Signalintensitäten nur
die starken, störungsfreien Signale zur Normalisierung verwendet werden.
Nach der Normalisierung wurde für jedes Gen das Verhältnis der mittleren Genexpressionen von Smad4 exprimierenden Zellen zu Kontrollzellen ermittelt. Neben
diesem Faktor ist die Streuung innerhalb der mittleren Genexpressionen zur
Einschätzung der Zuverlässigkeit der Werte wichtig. Deshalb wurde der von Welch
modifizierte zweiseitige t-Test mit unterschiedlichen Varianzen für jedes Gen
durchgeführt, um ein Maß für die Signifikanz des Unterschiedes der Expression
anzugeben. Für die übersichtliche Darstellung der Ergebnisse von Makroarrayhybridisierungen wurde das Diagramm nach Dudoit (Dudoit, Yang u. a. 2000), eine
Variante des Scatter-Plots, modifiziert und der Kehrwert des Ergebnisses des t-Tests als
dritte Variable eingebunden. Das so entstandene Blasendiagramm ermöglicht es,
gleichzeitig alle drei für die Suche nach differentiell exprimierten Genen wichtigen
Parameter darzustellen. Zum einen werden die Signalintensität und das Verhältnis der
Genexpressionen deutlich. Zum andern wird die Signifikanz eines Unterschiedes der
mittleren Genexpressionen über die Blasengröße sofort erkannt.
Für die Validierung der Array-Technologie und der hier entwickelten Auswertungsmethode wurden die Ergebnisse der Arrayhybridisierungen mit zahlreichen Northern
Blot Hybridisierungen als Referenzmessung überprüft. Insgesamt wurden hierzu 37
verschiedene Sonden verwendet und deren Hybridisierungsergebnisse mit denen aus
neun Arrayhybridisierungen von Smad4 exprimierenden und Smad4 negativen Zellen
verglichen. Teilweise waren diese Gensonden im Verlauf der Entwicklung der
Auswertung als Kandidatengene definiert worden, oder sie wurden gezielt ausgewählt,
um eine gleichmäßige Repräsentation von verschiedenen Signalintensitäten, Quotienten
der Genexpressionen und Signifikanzen zu gewährleisten. Mit Hilfe dieser Validierung
sollte zum einen überprüft werden, wie sensitiv und zuverlässig auch moderate
5 DISKUSSION
88
Differenzen in der Genexpression durch die Arrayhybridisierungen nachgewiesen
werden können. Zum andern sollten unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus den
Northern Blot Hybridisierungen aber auch Kriterien entwickelt werden, die eine
verlässliche Auswahl von Smad4 abhängig differentiell exprimierten Genen anhand der
Arrayergebnisse ermöglichen. Die Genexpression der 37 überprüften Gene wies in
Array und Northern Blot Hybridisierung bei Verwendung der hier entwickelten
Auswertung eine gute Übereinstimmung auf. Zwei der 37 überprüften Genexpressionen
wiesen klonale Unterschiede auf und wurden für die Überprüfung nicht weiter
verwendet. Wenn man einen Unterschied in der Genexpression um den Faktor 1.3 in der
Northern Blot Hybridisierung als differentiell exprimiert ansieht, stimmten für 30 der 35
Gene die Ergebnisse der beiden Nachweismethoden überein. Da somit in 86% der
überprüften Fälle die Genexpression durch die Arrayhybridisierung und die Northern
Blot Hybridisierung gleichsinnig gemessen wurde und sich die mit beiden Methoden
bestimmten Faktoren der differentiellen Expression ähnelten, kann die hier entwickelte
Auswertung als sehr zuverlässig angesehen werden. Um auch in weiteren Arrayhybridisierungen Kandidatengene definieren zu können, wurden die Kriterien t-Wert
kleiner 0,15 und mindestens zweifacher Unterschied in der Genexpression ausgewählt.
Die Anwendung dieser Kriterien auf die Gesamtergebnisse der Arrayhybridisierungen
mit den Smad4 exprimierenden Zellen und Smad4 negativen Hs766T Zellen führte zu
einer Auswahl von 29 Genen. Für 15 dieser 29 Kandidatengene wurde zuvor die
Genexpression mittels Northern Blot Hybridisierung überprüft. 14 Genen wiesen eine
differentielle Expression auf und nur ein Gen erwies sich als nicht differentiell
exprimiert. Da sich somit 93% der überprüften Kandidatengene auch in der Northern
Blot Hybridisierung als differentiell exprimiert erwiesen, wurden die Kriterien zur
Auswahl von differentiell exprimierten Genen anhand der Arrayergebnisse als
zuverlässig bewertet. Die entwickelte Auswertung erwies sich also im Rahmen der
Überprüfungen als valide. Mit Anwendung der so entwickelten Kriterien können also
weitere Ergebnisse aus Arrayhybridisierungen ohne jeweils neue, umfassende
Validierung als zuverlässig betrachtet werden. Diese Methodik wurde im Rahmen
dieser
Arbeit
anschließend
sowohl
für
die
Untersuchung
von
RNA
aus
Nacktmaustumoren, als auch für die Untersuchung einer weiteren mit Smad4
transduzierten Zelllinie verwendet.
5 DISKUSSION
89
In der Literatur wird zur Einschätzung der Signifikanz von Unterschieden beim
Vergleich von Arrayhybridisierungen häufig die von Tusher entwickelte Methode
herangezogen (Tusher, Tibshirani u. a. 2001). Diese Methode verwendet einen speziell
für Mikroarrayhybridisierungen angepassten t-Test und gibt zusätzlich Irrtumswahrscheinlichkeiten zur Beurteilung der Güte der vorgeschlagenen Kandidatengene
aus. Der Vergleich dieser Methode mit der Berechnung der Signifikanz über den in
dieser Arbeit verwendeten zweiseitigen von Welch modifizierten t-Test mit unterschiedlichen Varianzen zeigte, dass bei beiden Methoden die als differentiell exprimiert
eingestuften Gene weitgehend übereinstimmen. Von den Genen, die die Methode von
Tusher als Kandidatengene vorschlägt, wurde für 14 Gene die differentielle Expression
durch Northern Blot Hybridisierungen bestätigt. Die Berechnung nach Tusher gibt für
diese 14 Gene eine Irrtumswahrscheinlichkeit von acht an, ist also viel zu restriktiv.
Diese Methode bietet folglich keine Vorteile gegenüber dem t-Test, der in der hier
entwickelten Auswertung zur Signifikanzberechnung verwendet wurde.
5.2 FUNKTIONELLE RELEVANZ DER SMAD4 ABHÄNGIG
REGULIERTEN GENE IN HS766T ZELLEN
Um in dem Muster der differentiell exprimierten Gene Funktionen und Prozesse zu
entdecken, die von Smad4 beeinflusst werden, wurde eine Analyse mit Hilfe der
Zuordnung jedes einzelnen Gens zu den Kategorien der GeneOntology durchgeführt.
Das Programm MAPPFinder wurde zu dieser funktionellen Einordnung verwendet
(Doniger, Salomonis u. a. 2003). Bei der Untersuchung der Zelllinie Hs766T hatten sich
22 Gene in der Northern Blot Hybridisierung als differentiell exprimiert erwiesen. 14
weitere Gene entsprachen den Kriterien für eine zuverlässig differentielle Expression.
Diese insgesamt 36 Gene wurden in die Analyse mit MAPPFinder einbezogen. Da für
ein Gen keine funktionelle Annotation vorhanden war, reduzierte sich die Anzahl der
Gene während der Analyse auf 35. Die funktionelle Analyse der Smad4 abhängig
differentiell exprimierten Gene zeigte auf, das die meisten Gene mit der Immunantwort
zusammenhängen. Sämtliche elf Gene, die in diese Kategorie fielen, sind von
Interferonen reguliert, und ihre Transkriptmenge ist Smad4 abhängig reduziert (Tabelle
5). Im Folgenden sollen für einzelne der differentiell exprimierten Gene weitere
5 DISKUSSION
90
mögliche Zusammenhänge mit der Smad4 vermittelten Tumorsuppression erläutert
werden.
Das Gen mit der stärksten Smad4 abhängigen Verringerung der Expression in der
Northern Blot Hybridisierung war das CD74 Antigen. CD74 verhindert durch die
Bindung an MHC Klasse II Moleküle die Bindung von Antigenen an neu synthetisierte
MHC Klasse II Moleküle im endoplasmatischen Retikulum. Die HLA Moleküle der
Klasse II präsentieren auf der Zelloberfläche von antigenpräsentierenden Zellen
Fragmente von Proteinen, die in intrazellulären Vesikeln vorliegen. Dies führt durch die
Interaktion mit CD4-T Zellen zu einer Reaktion des Immunsystems auf fremdartige
Peptide. In Smad4 negativen Hs766T Zellen wurde eine hohe Expression von CD74
beobachtet. Eine verstärkte CD74 Expression ermöglicht Tumorzellen dem Angriff des
Immunsystems zu entgehen. Durch die verringerte Antigenpräsentation werden
Tumorzellen vom Immunsystem nicht erkannt (Clements, Baskar u. a. 1992). In
Hs766T Zellen ist Smad4 ein negativer Regulator der CD74 Expression. Der Verlust
von Smad4 in der Karzinogenese könnte also mit einem „immune escape“
Mechanismus assoziiert sein. Obwohl ein direkter Zusammenhang von Smad4 Verlust
mit höherer Expression von CD74 noch nicht erwiesen ist, wären verschiedene
publizierte Befunde mit einem solchen Mechanismus im Einklang. Eine erhöhte
Expression von CD74 wurde von Jiang im Verlauf der Progression von Kolonneoplasien gefunden (Jiang, Xu u. a. 1999). Diese Progression ist aber auch mit einer
Abnahme der Smad4 Expression verbunden (Maitra, Molberg u. a. 2000; Mikami,
Ookawa u. a. 2001). Auch für Plattenepithelkarzinome der Speiseröhre wurde sowohl
eine Abnahme der Smad4 Expression, als auch eine Erhöhung der CD74 Expression
getrennt voneinander nachgewiesen (Ishigami, Natsugoe u. a. 2001; Natsugoe,
Xiangming u. a. 2002).
In Abhängigkeit von der Smad4 Expression sind aber auch Gene supprimiert, die die
Präsentation von Antigenen auf der Zelloberfläche vermitteln. Hierzu zählt die
Interferon γ induzierbare Untereinheit LMP2 β 9 (large multifunctional protease 2) des
20S Proteasoms. Auch die Sonde für HLA-G zeigte in den Smad4 negativen Zellen eine
wesentlich höhere Transkriptmenge an. Bedingt durch die hohe Sequenzhomologie von
HLA-A, B, C, E und F mit HLA-G konnte keine eindeutige Festlegung auf eines dieser
Antigene vom Typ I des Haupthistokompatibilitätskomplexes erfolgen. Die Proteine
5 DISKUSSION
91
vom Typ I des Haupthistokompatibilitätskomplexes präsentieren zytotoxischen CD8positiven T-Zellen Peptidfragmente, die das 20S Proteasom durch Zerkleinerung von
intrazellulären Peptiden herstellt. Die höhere Expression dieser beiden Komponenten
führt vermutlich auch zu einer verstärkten Präsentation von Antigenen. Ob eine
verstärkte Antigenpräsentation eine höhere Immunogenität der Tumorzellen nach sich
zieht, ist unklar. Eine sehr starke Präsentation von Antigenen kann, falls zusätzliche
kostimulierende Moleküle fehlen, Tumorzellen auch ermöglichen die Immunantwort zu
unterwandern (Gimmi, Freeman u. a. 1993).
5.3 EFFEKTE VON SMAD4 AUF INTERFERONSIGNALWEGE
Die funktionelle Annotation der Smad4 abhängig differentiell exprimierten Gene in
Hs766T zeigte die größten transkriptionellen Veränderungen bei Genen, die der
Kategorie Immunantwort angehören. Eine Überprüfung der transkriptionellen
Regulation der elf Gene in dieser Kategorie anhand von Literaturdaten führte zu dem
Befund, dass alle diese Gene Interferon induzierbar sind.
Es sind mehrere Mechanismen vorstellbar, wie Smad4 die Expression der Interferon
regulierten Gene reduzieren kann. Zum einen ist eine direkte Wechselwirkung zwischen
Smad4 respektive dem TGFβ-Signalweg und den Interferon Signalwegen oder der
Expression einzelner Zielgene denkbar. Andererseits könnte Smad4 auf die Produktion
von Interferonen wirken und damit indirekt eine auto- bzw. parakrine Induktion der
Interferon regulierten Gene verringern.
Zunächst wurden die Hs766T Zellen mit rekombinanten Interferonen behandelt, um zu
überprüfen, ob die Zellen noch auf exogene Interferone reagieren. Die Interferone α, β
und γ bewirkten Smad4 unabhängig eine Induktion bekannter Zielgene. Die
grundsätzliche Funktion der Interferonsignalwege war folglich durch die Expression
von Smad4 nicht beeinträchtigt. Die Smad4 abhängigen Unterschiede blieben bei HLAG auch nach Interferon Behandlung erhalten. IRF1, OAS2 und MX1 wiesen nach
Behandlung mit Interferon β oder γ ebenfalls noch eine Smad4 abhängige differentielle
Expression auf.
Da die Unterschiede in der Expression von IRF1 nach der Behandlung mit Interferon γ
erhalten blieben und IRF1 zur transkriptionellen Aktivierung der Typ I Interferone α
5 DISKUSSION
92
und β führt (Harada, Willison u. a. 1990), wurde die Reaktion auf Interferon γ
Behandlungen genauer untersucht. Die Dosisabhängigkeit der Reaktion auf die
Behandlung mit Interferon γ zeigte für IRF1 eine vergleichbare maximale Wirkdosis für
Smad4 exprimierende und Kontrollzellen. Die Transkriptmengen hingegen waren in
den Smad4 negativen Zellen bei allen Dosierungen höher als in den Smad4
exprimierenden Zellen. Bei HLA-G, einem Gen, das nur schwach durch Interferon γ
induziert wird, blieb der Smad4 abhängige Unterschied auch nach Induktion mit
Interferon γ erhalten. Die Untersuchung der Zeitabhängigkeit der Reaktion auf
Interferon γ zeigte eine maximale Induktion von IRF1 nach vier Stunden. Die Gene
MX1 und CD74 wiesen die maximale Induktion nach acht Stunden auf. Bei allen drei
Genen zeigte sich Smad4 abhängig eine Reduktion der Transkriptmengen. Der zeitliche
Verlauf und die maximale Induzierbarkeit von IRF1 durch Interferon γ ist Smad4
abhängig nicht verändert. Die Reexpression von Smad4 wirkt sich primär auf den
basalen Expressionslevel von IRF1 aus. Bei CD74 und MX1, Gene, die hauptsächlich
durch Interferone vom Typ I induzierbar sind, ist die Reaktion auf die Interferon γ
Behandlung verzögert. Die Induktion beginnt später als die Induktion von IRF1 und
erreicht ihr Maximum bei acht Stunden. Die Induktion von CD74 und MX1 könnte also
indirekt über Interferon γ induziertes IRF1 und IRF1 induziertes Interferon α oder β
erfolgen (Harada, Willison u. a. 1990).
Die Smad4 abhängig verringerten Transkriptmengen von Interferon regulierten Genen,
zeigten eine Wechselwirkung zwischen dem TGFβ Signalweg und dem Interferon γ
Signalweg auf. In diesem Zusammenhang sind schon einige Ergebnisse beschrieben
worden. Interferon γ bewirkt nach Aktivierung von Jak1 und STAT1 die Expression
von Smad7, welches die Reaktionen auf TGFβ in der Zelle inhibiert (Ulloa, Doody u. a.
1999). Eine weitere Wechselwirkung zwischen dem Interferon γ- und dem TGFβSignalweg wurde für den Kollagen 1A2 Promotor beschrieben. TGFβ führt zur
Induktion von COL1A2. Interferon γ aktiviert STAT1α, das mit dem von TGFβ
aktivierten Smad3 um den Koaktivator p300/CBP konkurriert, der für die Transkription
von Kollagen 1A2 benötigt wird (Ghosh, Yuan u. a. 2001). Bei der Antigenpräsentation
von Makrophagen bewirkt TGFβ über eine Reduktion der Expression von CIITA,
einem Transaktivator für die Haupthistokompatibilitätsgene vom Typ II, die
Verringerung der mRNA Menge von Haupthistokompatibilitätsgenen der Klasse II
5 DISKUSSION
93
(Delvig, Lee u. a. 2002). Hinweise auf den hemmenden Einfluss des TGFβ Signalweges
zeigten sich auch in TGFβ1 defizienten Mäusen, die eine erhöhte Expression von IRF1
und STAT1α aufwiesen (McCartney-Francis und Wahl 2002).
Um zu untersuchen, ob sich extrazelluläres TGFβ auf die Interferon γ Induktion von
Zielgenen auswirkt, wurden Hs766T Zellen 4 Stunden mit beiden Zytokinen behandelt.
Es zeigten sich bei IRF1 und HLA-G wieder die Smad4 abhängig verringerten
Transkriptmengen. Die Behandlung mit TGFβ1 führte aber zu keiner Veränderung der
Expression von IRF1 oder HLA-G. Es gibt folglich keine Hinweise auf einen Effekt
von extrazellulärem TGFβ1 auf die Expression der Interferon regulierten Gene.
Serum enthält bekanntermaßen Faktoren, die die Transkription von Interferon
induzierten Genen bewirken können (Gao, Folghera u. a. 1993). Um den Einfluss des
Serums zu messen, wurden Hs766T Zellen in serumfreiem Medium kultiviert und die
Expression von IRF1 gemessen. Es zeigte sich für IRF1 eine verringerte
Transkriptmenge nach Serumentzug. Das verwendete Serum und andere Serumchargen
erhöhten die Expression der interferoninduzierten Gene (Daten nicht gezeigt). Da der
Smad4 abhängig induzierte Unterschied aber erhalten blieb, konnte das Serum nicht für
die Expressionsunterschiede verantwortlich sein.
Als nächstes wurde die Hypothese untersucht, ob die Smad4 negativen Zellen über eine
autokrine Stimulierung die Induktion von Interferon induzierten Genen bewirken. Da
schon die im Serum enthaltenen Zytokine eine Induktion von IRF1 bewirkte, wurde die
Interferon γ Menge in serumfreiem Medium überprüft. Der hierfür durchgeführte
ELISA konnte weder in Zellkulturüberständen, noch intrazelluläres Interferon γ bei den
Hs766T Zellen nachweisen. Dies verwundert aber nicht, wenn man die untere
Nachweisgrenze des ELISA von etwa 0,3 IE/ml ebenso wie die schon durch 0,1 IE/ml
induzierte IRF1 Menge berücksichtigt. Die Menge von 0,1 IE/ml an Interferon γ im
Zellkulturmedium bewirkte eine stärkere Veränderung der Transkriptmenge von IRF1
als der Smad4 abhängige Unterschied beträgt. Der ELISA war somit nicht hinreichend
sensitiv, um eine Interferon γ Menge nachzuweisen, die eine autokrine Induktion in den
Hs766T Zellen hätte verursachen können. Anschließend wurden serumfrei kultivierte
Zellen mit konditioniertem Medium behandelt. Es wurden jedoch keine Effekte der
konditionierten Medien beobachtet. Falls Interferon γ endogen exprimiert wird, können
5 DISKUSSION
94
die Effekte nicht durch konditionierte Medien übertragen werden. Um zu klären, ob die
Hs766T Zellen Interferon γ in geringen Mengen exprimieren und so die
unterschiedliche Expression von IRF1 erklärt werden kann, wurde eine RT-PCR für
Interferon γ durchgeführt. Die Smad4 exprimierenden Zellen wiesen in der RT-PCR
kein PCR Produkt auf. In den Smad4 negativen Zellen hingegen zeigte sich in mehreren
unabhängigen Experimenten ein Interferon γ Transkript. Smad4 scheint also in Hs766T
Zellen ein negativer Regulator der Interferon γ Expression zu sein. Ein ähnlicher Befund
zeigte sich in natürlichen Killerzellen, die nach TGFβ-Behandlung eine verringerte
Stabilität der Interferon γ RNA aufwiesen (Hayashi, Inoue u. a. 2003).
Die hier dargelegten Befunde lassen eine Smad4 abhängige negative Regulation der
Interferon γ Expression vermuten. Zwar zeigten sich bei der Behandlung von Zellen mit
konditioniertem Medium keine Veränderungen der IRF1 Transkriptmenge, da
Interferon γ aber das instabilste der Interferone ist (Wang und R 1995), war ein Effekt,
der zudem von sehr kleinen Mengen von Interferon γ verursacht sein kann, nicht
unbedingt zu erwarten. IRF1 wird stark von Interferon γ induziert (Abbildung 23) und
ist ein transkriptioneller Aktivator der Interferone α und β .(Harada, Willison u. a.
1990). Da IRF1 folglich auch die Induktion der Gene, die von den Interferonen α und β
induziert werden, verursachen kann, könnten die weiteren differentiell exprimierten
Gene indirekt betroffen sein. Der Effekt von Smad4 auf die Expression der Interferon
regulierten Gene wäre also über den Einfluss auf die Interferon γ Transkription zu
erklären. Die verspätete Induktion von MX1 und HLA-G durch Interferon γ spricht auch
für einen solchen indirekten Effekt von Interferon γ auf diese beiden Gene. Falls
endogenes Interferon γ für die Smad4 abhängigen Unterschiede verantwortlich ist, sollte
dieser Effekt durch funktionsblockierende Interferon γ spezifische Antikörper
unterbunden werden können. Falls Smad4 eine Auswirkung auf die Interferon γ mRNA
hat, könnten Promotoranalysen weitere Erkenntnisse liefern. Ein Einfluss von Smad4
auf die Stabilität der Interferon γ mRNA könnte wie bei Hayashi untersucht werden
(Hayashi, Inoue u. a. 2003).
5 DISKUSSION
95
5.4 AUSWIRKUNGEN DER SMAD4 EXPRESSION IN
NACKTMAUSTUMOREN
Die Untersuchung der Expressionsprofile der RNA aus subkutanen Nacktmaustumoren
führte zu den in Tabelle 6 aufgeführten differentiell exprimierten Genen. Mittels
Northern Blot Hybridisierung wurde das Gen mit dem zweitbesten t-Wert Mesothelin
überprüft und die reduzierte Expression in Tumoren von Smad4 exprimierenden Zellen
bestätigt. Dieses Gen codiert für ein Zelloberflächenglykoprotein, welches bei
Eierstockkrebs, Mesotheliomen und Plattenepithelkarzinomen aber auch in normalen
Mesothelzellen stark exprimiert ist (Chang und Pastan 1996). Es wurde als neuer
Marker zur Erkennung von pankreatischen Adenokarzinomen vorgeschlagen, der in
normalem pankreatischen Gewebe nicht oder nur sehr schwach exprimiert wird und in
52 von 60 Tumoren eine stärkere Expression als im den Tumor umgebenden Gewebe
aufweist (Argani, Iacobuzio-Donahue u. a. 2001). Die Smad4 abhängig reduzierte
Expression von Mesothelin in den tumorsupprimierten Zellen steht somit im Einklang
mit den Befunden aus Tumorgeweben. Die Expression von Mesothelin wird murinen
Brustepithelzellen durch Wnt1 induziert (Prieve und Moon 2003). Zytokine aus der Wnt
Familie werden typischerweise von mesenchymalen Zellen exprimiert. In den
Nacktmaustumoren sind mesenchymale Zellen der Maus rekrutiert, die Wnts
produzieren und die Mesothelin Expression in Hs766T Zellen induzieren könnten.
Diese Wnt abhängige Induktion von Mesothelin könnte durch Smad4 unterdrückt sein.
Interaktionen von Wnt/βCatenin- und TGFβ/Smad-Signalwegen wurden bereits bei
verschiedenen Mechanismen in der Entwicklungsbiologie und Tumorbiologie gefunden.
Eine Möglichkeit diese Hypothese zu überprüfen besteht in der genaueren
Untersuchung des Effektes von murinen Fibroblasten auf Hs766T Zellen.
Das Gen mit der höchsten Wahrscheinlichkeit einer differentiellen Expression war die
PRKR eine Interferon induzierbare von doppelsträngiger RNA abhängige Kinase. Sie
lies nach den Arrayergebnissen mit der RNA aus subkutanen Nacktmaustumoren eine
Smad4 abhängige Reduktion der Transkriptmenge erwarten. Dies deckt sich mit dem
Befund der stärkeren Expression von Interferon regulierten Genen in kultivierten
Smad4 negativen Zellen und lässt einen vergleichbaren Effekt von Smad4 auf
interferonregulierte Gene vermuten. Die unter Zellkulturbedingungen starken
Expressionsdifferenzen bei den Interferon regulierten Genen finden sich in den
5 DISKUSSION
96
Arrayergebnissen der Nacktmaustumore nicht wieder. Dies ist nicht eigenartig, da im
Tumor eine komplexe Interaktion von mäusischen Zellen mit den Tumorzellen
stattfindet. In Schnitten der Tumore waren beispielsweise auch Makrophagen
nachzuweisen, die über die Ausschüttung von Interferonen und anderen Zytokinen eine
vollkommen andere Umgebung als in vitro schaffen.
5.5 EFFEKTE VON SMAD4 IN CFPAC1 ZELLEN
Die Befunde einer auf eine Zelllinie beschränkten Analyse von Smad4 abhängig
differentiell exprimierten Genen lassen sich nur schlecht verallgemeinern. Deshalb
wurde Smad4 in CFPAC1 einer weiteren pankreatischen Karzinomzelllinie mit
homozygotem Smad4 Verlust, wieder exprimiert. Vor dieser Arbeit angestellte
Versuche mittels stabiler Transfektion Smad4 zu reexprimieren waren nicht erfolgreich.
Deshalb wurde eine Transduktion mit VSV-G pseudotypisierten Retroviren
durchgeführt, da diese Retroviren für ihre hohe Transduktionseffizienz bei der Infektion
von pankreatischen Karzinomzelllinien bekannt sind (Howard, Boenicke u. a. 2000).
Die CFPAC1 Zellen wiesen bis zur Passage 20 nach Transduktion sowohl Smad4
mRNA, als auch Protein für Smad4 auf. Die Proteinmenge lag im Vergleich zur
Pankreaskarzinomzelllinie Paca44 auf etwas höherem Niveau, wies aber keine starke
Überexpression auf. In Immunfluoreszenzanalysen von CFPAC1-Zellen zeigte sich eine
relativ gleichmäßige Smad4 Expression in der Zellpopulation (Daten nicht gezeigt).
In CFPAC1 Zellen wurde zunächst überprüft, ob die Reexpression von Smad4 zu einer
Restaurierung von TGFβ Antworten führte. Dazu wurden die Zellen mit
rekombinantem TGFβ behandelt und die Expression „klassischer“ TGFβ Zielgene
analysiert. PAI1, ein Gen welches durch TGFβ1 induziert wird, wies nur nach der
Rekonstitution von Smad4 eine deutliche Induzierbarkeit nach vier bis 8 Stunden auf.
Sogar die basale Transkriptmenge war in Smad4 positiven Zellen erhöht. Diese Smad4
abhängige Induktion von PAI1 wurde schon beschreiben (Stroschein, Wang u. a. 1999).
Sie wird durch kooperative Bindung von Smad3 und Smad4 an den PAI1 Promotor
erzielt. Für p21CIP1 zeigten sich nur geringe Smad4 Effekte. Nach TGFβ1 Behandlung
war zudem in den Smad4 exprimierenden Zellen nur eine geringe Induktion von p21CIP1
zu beobachten. Die Induktion von p21CIP1 durch TGFβ1 erfolgt in HACAT Zellen, die
eine endogene Smad4 Expression aufweisen durch die Interaktion von Smad3 und
5 DISKUSSION
97
Smad4 mit SP1 am p21CIP1-Promotor (Pardali, Kurisaki u. a. 2000). Der nur geringe
Effekt auf die p21CIP1 Transkriptmenge in CFPAC1 Zellen und die fehlende
Wachstumsinhibition
durch
TGFβ
deckt
sich
mit
Befunden
aus
Smad4
Rekonstitutionen in anderen Zelllinien (Daten nicht gezeigt). Die Reexpression von
Smad4 kann also nicht mit der Wiederherstellung der TGFβ induzierten
Wachstumsinhibition über p21CIP1, p15INK4b und c-myc gleichgesetzt werden. Um den
Effekt der Smad4 Rekonstitution auf das Tumorwachstum zu untersuchen, wurden
CFPAC1 Zellen subkutan in Nacktmäuse injiziert. Die Zellen bildeten schnell Tumore
aus und die Expression von Smad4 hatte im Unterschied zum tumorsupprimierenden
Effekt in Hs766T Zellen keinen Einfluss auf die Tumorgröße. Eine Erklärung für diese
Diskrepanz ist nicht trivial, da in den Zellen auch Mutationen und Veränderungen in
anderen Signalwegen vorliegen, die die Karzinogenese stärker beeinflussen können als
die Expression von Smad4.
Für die Suche nach Smad4 abhängig regulierten Genen in den CFPAC1 Zellen, wurden
Atlas cDNA Arrayhybridisierungen durchgeführt. Die von den Arrayergebnissen
ausgewiesenen Expressionsunterschiede waren in CFPAC1 geringer als in den Hs766T
Zellen. Von den hoch exprimierten Smad4 Zielgenen wurden TGFBI und ITGB4 im
Northern Blot überprüft. Beide zeigten in der Northern Blot Hybridisierung dieselbe
Smad4 abhängige Regulation, wie mit den Arrayergebnissen angezeigt. TGFBI ist ein
durch TGFβ induzierbares Adhäsionsmolekül, welches Typ I, II, und IV Kollagene
bindet und vermutlich Zell-Zell Kontakte vermittelt. ITGB4 ist ein Lamininrezeptor und
ist an der Ausbildung von Hemidesmosomen beteiligt. Die differentielle Expression
dieser beiden Gene lässt einen Effekt von Smad4 auf die Zelladhäsion vermuten, wie er
auch schon in Kolonkarzinomzellen nach Expression von Smad4 beschrieben wurde
(Müller, Reinacher-Schick u. a. 2002).
Da die Smad4 Expression in der Zelllinie Hs766T zu einer Reduktion der Expression
von Interferon induzierten Genen führte, wurde für einzelne Gene auch die Expression
in den CFPAC1 Zellen untersucht. Die Northern Blot Hybridisierungen zeigten für die
drei überprüften, Interferon regulierten Gene ebenfalls eine Reduktion der
Transkriptmenge. IRF1 ein Interferon γ Zielgen war ebenso wie die hauptsächlich von
Typ I Interferonen regulierten Gene IFI17 und MX1 in den Smad4 exprimierenden
CFPAC1 Zellen geringer exprimiert. Diese Bestätigung der Smad4 abhängigen
5 DISKUSSION
98
Regulation von Interferon regulierten Genen in einer weiteren Zelllinie spricht für die
Relevanz des Befundes und zeigt einen Einfluss von Smad4 auf die Regulation von
Interferon regulierten Genen auf. Ob dieser Einfluss direkt oder indirekt ist kann erst in
weiteren noch anzustellenden Experimenten herausgefunden werden.
In dieser Arbeit wurde eine valide Methode für die Auswertung von Makroarrays
entwickelt, mit der auch moderate Unterschiede in der Genexpression verlässlich
detektiert werden können. Diese Auswertungsmethode ist zur Untersuchung der Effekte
der Smad4 Expression in Kolonkarzinomzelllinien genutzt worden und soll auch für
weitere Analysen verwendet werden. In den beiden untersuchten pankreatischen
Adenokarzinomzelllinien wurde nach Expression von Smad4 die verringerte Expression
von Interferon induzierten Genen nachgewiesen. Da der Effekt in zwei unabhängigen
Zelllinen auftrat und zur Expression von Smad4 zwei unterschiedliche Systeme
verwendet wurden, sind die hier ermittelten Daten für die Funktion von Smad4 relevant.
Auch hier sind weitere Analysen durch Promotorstudien, oder funktionsinhibierende
Interferon γ spezifische Antikörper möglich, um die Regulation dieser Gene durch
Smad4 genauer zu untersuchen. Bei den Analysen der Nacktmaustumore von Hs766T
Zellen wurde die differentielle Expression des Tumormarkers Mesothelin entdeckt.
Dieser Smad4 abhängige Expressionsunterschied trat nicht in vitro auf. Dies spricht für
eine Smad4 abhängige Regulation der Mesothelin Expression durch die umgebenden
Zellen. Diesem Befund könnte beispielsweise durch die genauere Untersuchung der
Interaktion zwischen murinen Fibroblasten und den Hs766T Zellen weiter
nachgegangen werden.
Sowohl der nachgewiesene Einfluss von Smad4 auf die Transkription Interferon
regulierter Gene, als auch die von der zellulären Umgebung und von Smad4
beeinflusste Transkription von Mesothelin sprechen für eine Smad4 abhängige
Veränderung der Interaktion mit anderen Zellen. Welche Zellen dafür in Frage kommen
wird durch weitere Analysen zu klären sein. Der Einfluß von Smad4 auf die
Angiogenese durch die Reduktion der Gefäßbildung konnte schon vorher gezeigt
werden (Schwarte-Waldhoff, Volpert u. a. 2000). Es liegt daher nahe zu vermuten, dass
die tumorsupprimierende Wirkung wenigstens zum Teil durch die Veränderung der
zellulären Interaktionen beeinflusst ist.
6 ZUSAMMENFASSUNG
Smad4 ist ein Tumorsuppressorgen, das in Tumoren des Gastrointestinaltraktes und
insbesondere in Pankreastumoren häufig funktionell inaktiviert wird. Das Smad4
Protein ist ein zentraler Transmitter von Signalen der TGFβ Zytokin-Superfamilie, es
wird aber auch von anderen Signalwegen angesteuert. Auf biochemischer Ebene ist
Smad4
ein
Transkriptions-Komodulator
mit
äußerst
vielfältigen
Interaktions-
möglichkeiten mit anderen Transkriptionsregulatoren.
Ursprünglich wurde vermutet, dass der Verlust von Smad4 zur Resistenz der
entstehenden
Tumorzellen
gegenüber
wachstumshemmenden,
also
tumor-
supprimierenden Effekten von TGFβ führt. Inzwischen wurden Befunde aus
unterschiedlichen Forschungsrichtungen angesammelt, die den Verlust von Smad4
innerhalb der mehrstufigen Karzinogenese mit dem Übergang von gutartigen Krebsvorstufen zu Invasivität und Metastasierung assoziieren.
In der hier vorgelegten Arbeit wurde ein zellbiologisches Modell benutzt, um die
Funktionen von Smad4 durch „Expression profiling“ weiter zu untersuchen. Smad4 war
in der menschlichen, pankreatischen Adenokarzinomzelllinie Hs766T nach stabiler
Transfektion reexprimiert worden. Es war bekannt, dass diese Reexpression eine
Suppression des Tumorwachstums bewirkte, ohne eine TGF-ß induzierte Wachstumshemmung zu restaurieren. An der Tumorsuppression war eine Hemmung der
angiogenen Eigenschaften von Smad4 defizienten Hs766T Zellen durch eine reziproke
Regulation von Thrombospondin-1 und VEGF auf der Ebene der Transkription
beteiligt. Weitere Auswirkungen der Smad4 Reexpression auf das Expressionsprofil
von Hs766T Zellen in vitro und in vivo wurden in dieser Arbeit ermittelt.
Zur Analyse der Expressionsprofile wurde die Hybridisierung von cDNA Makroarrays
verwendet und eine valide Auswertungsmethode entwickelt, die es ermöglicht, auch
moderate Unterschiede in der Genexpression verlässlich anzuzeigen. Die Ergebnisse der
Arrayhybridisierungen wurden durch Northern Blot Hybridisierungen validiert und die
Auswertung der Makroarrays anhand der Überprüfungen optimiert. Eine funktionelle
Annotation / Zuordnung der ermittelten Smad4 abhängig regulierten Gene ließ
erkennen, dass die stärksten durch Smad4 bewirkten Veränderungen bei Genen aus dem
6 ZUSAMMENFASSUNG
100
funktionellen Zusammenhang „Immunantwort“ zu finden sind. Alle elf Gene mit dieser
funktionellen Einordnung waren in den Smad4 negativen Zellen stärker exprimiert. Da
alle diese Gene durch Interferone induziert werden können, wurden die Interferon
Signalwege in Hs766T Zellen näher untersucht. Die generelle Funktion der Interferon
Signalwege war durch Smad4 Reexpression nicht beeinträchtigt: selbst geringe
Konzentrationen (0,1 U/ml) von Interferonen (α, β oder γ, ) führten zu einer Induktion
der Zielgene in Smad4 defizienten und in Smad4 reexprimierenden Hs766T Zellen,
wobei der Smad4 abhängige Expressionsunterschied (z.T.) auch bei hoher Dosierung
der Interferone erhalten blieb.
Anschließend wurde die endogene Interferon Expression untersucht. Nur mit der
sensitiven RT-PCR Methode konnte eine Transkript von Interferon γ nachgewiesen
werden, und zwar ausschließlich in Smad4 defizienten Hs766T Zellen. Smad4 scheint
also in Hs766T Zellen ein negativer Regulator von Interferon γ zu sein. Diese Funktion
würde ausreichen, die Expressionsunterschiede aller Interferon induzierbaren Gene in
Hs766T Zellen zu erklären, da IFNγ IRF1 induziert, IRF1 wiederum IFNα und β und
darüber indirekt auch IFNα und β induzierbare Gene.
Die Untersuchung der Expressionsprofile von Smad4 exprimierenden Zellen und
Smad4 negativen Zellen in vivo im Nacktmaustumor zeigte vermutlich aufgrund der
völlig unterschiedlichen „Umgebung“ auch andere Effekte: so war die Expression des
Tumormarkers Mesothelin, der bekannterweise von Wnt1 reguliert wird, Smad4
abhängig reduziert.
Die Smad4 abhängig verringerte Expression von Interferon induzierten Genen konnte in
einer weiteren Smad4 defizienten Zelllinie nach stabiler Smad4 Expression
nachgewiesen werden; hiermit ist die Relevanz der hier erarbeiteten Befunde bestätigt.
Ob Interferon γ, Mesothelin und weitere hier identifizierte Smad4 abhängig regulierte
Gene direkte Zielgens von Smad4 sind, welche Mechanismen der Regulation zugrunde
liegen und wie die funktionellen Auswirkungen zu bewerten sind, wird in zukünftigen
Arbeiten zu klären sein. Zusätzlich zum schon nachgewiesenen Einfluss von Smad4 auf
die Angiogenese stützen die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothese, dass die Smad4
abhängige Tumorsuppression durch veränderte zelluläre Interaktionen bewirkt zu sein
scheint.
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complex." Embo J 14(10): 2199-208.
Wilentz, R., C. Iacobuzio-Donahue, u. a. (2000). "Loss of expression of Dpc4 in
pancreatic intraepithelial neoplasia: evidence that DPC4 inactivation occurs late
in neoplastic progression." Cancer Res 60(7): 2002-6.
Wolfinger, R. D., G. Gibson, u. a. (2001). "Assessing gene significance from cDNA
microarray expression data via mixed models." J Comput Biol 8(6): 625-37.
Wrana, J. L., L. Attisano, u. a. (1994). "Mechanism of activation of the TGF-beta
receptor." Nature 370(6488): 341-7.
Yahata, T., M. P. de Caestecker, u. a. (2000). "The MSG1 non-DNA-binding
transactivator binds to the p300/CBP coactivators, enhancing their functional
link to the Smad transcription factors." J Biol Chem 275(12): 8825-34.
Yamaguchi, K., K. Shirakabe, u. a. (1995). "Identification of a member of the
MAPKKK family as a potential mediator of TGF-beta signal transduction."
Science 270(5244): 2008-11.
Zhang, Y. und R. Derynck (1999). "Regulation of Smad signalling by protein
associations and signalling crosstalk." Trends Cell Biol 9: 274-9.
8 ANHÄNGE
8.1 PROGRAMME
Die nachfolgend aufgelisteten Makros wurden in Rahmen dieser Arbeit zur Auswertung
der Atlas cDNA Makroarrays entwickelt. Das HTML/VBScript Programm wird zur
automatisierten Kontrolle (siehe 4.2.1) der Auswertung der Makroarrays in dem
Programm GenePix Pro verwendet. Das VBA Makro übernimmt in Excel sowohl das
Einlesen der Ergebnisdateien aus GenePix Pro, als auch die Normalisierung der
Arraydaten und die zur Erstellung des Blasendiagramms notwendigen Berechnungen
(siehe 4.2.4).
8.1.1 HTML/VBSCRIPT CODE ZUR AUTOMATISIERTEN KONTROLLE DER
AUSWERTUNG
<!-- GenePix Pro: Automatische Korrektur von Signalbeurteilung, Präsentation der
veränderten Signale mit Umgebungsbild -->a
<html>
<head>
<style type="text/css">
@import url(GenePix_Style_Base.css);
</style>
<title>Clontech Atlas </title>
</head>
<body language="vbscript" marginheight="0" marginwidth="0" topmargin="0" leftmargin="0">
<!-- HTML Layout portion -->
<table width=600 border=0 cellspacing=0 cellpadding=5>
<tr class="title">
<td colspan=2>
<p class="heavy">Clontech Atlas: Korrektur der Bewertung der Spots
</td>
</tr>
<tr>
<td colspan=2 class="instructions">
Korrektur der Bewertungen (Flags) für alle Spots:</td></tr>
</table>
<table width=600 border=0 cellspacing=0 cellpadding=5>
<tr class="title">
<tr><td>kein Signal</td><td>aber F1Mean >= 1.5 x B1Median</td><td>-->
Signal</td></tr>
<tr><td>kein Signal</td><td>aber B1Median > 3 x minimaler Hintergrund</td><td>-->
Störung</td></tr>
<tr><td>Signal</td><td>aber F1Mean < 1.5 x B1Median</td><td>--> kein Signal</td></tr>
<tr><td>Störung</td><td>aber B1Median <= 2 x minimaler Hintergrund</td><td>--> kein
Signal</td></tr>
</table>
<table width=600 border=0 cellspacing=0 cellpadding=5>
<tr class="title">
<!-- NoExport -->
<tr>
<td class="instructions">
8 ANHÄNGE
108
Klicke den Start-Knopf um die Korrektur zu starten.
</td>
<td class="instructions" valign="bottom" align="right">
<input type="button" value="Start" onclick="Run()">
</td>
</tr>
<!-- /NoExport -->
<tr>
<td class="overline" id="FlagTable" colspan=2>
 
</td>
</tr>
</table>
<script language="vbscript" src="AxGenePixConstants.vbs">
// link in an external file that contains constant definitions for Results column numbers
</script>
<script language="vbscript">
Option Explicit
// Assign some GenePix Object Model references to variables
Dim GenePix
Set GenePix = window.external
Dim Results
Set Results = GenePix.Results
Dim ArrayStats
Set ArrayStats = CreateObject ("AxonWebUtilities.ArrayStatistics")
Dim Report
Set Report = GenePix.Report
Dim ImageTab
Set ImageTab = GenePix.ImageTab
Dim TableBuilder
Set TableBuilder = CreateObject("AxonWebUtilities.TableBuilder")
Dim sTmp,i,Anzahl
//
//
//
//
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Function: Run
This Function is called on clicking the Start button
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Function Run()
Report.Busy = true
// Exit if there is no data in the Results tab
If Results.Height = 0 then
alert("Open a Results file and then hit Start again.")
Report.Busy = false
Exit Function
End If
call FlagCorrection()
Report.Busy = false
End Function
//
//
//
//
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Function:
This Function is called on clicking the Start button
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Function FlagCorrection()
Dim F1Mean, B1Median, Flag, Hintergrund
Dim FColumnName, BColumnName
8 ANHÄNGE
109
Anzahl =0
//Neue Analyse mit vorhandenem Setting
GenePix.SwitchToTab(0)
ImageTab.ZoomOut
ImageTab.AutoscaleDisplaySettings
GenePix.Analyze
sTMP = "Analyse der Daten abgeschlossen, automatische Korrektur erfolgt."
sTMP = "<table border=0 style='font-size:16pt'>"
//
sTmp = sTmp & "<tr><td>F1 Mean</td>"
//
sTmp = sTmp & "<td>B1Median</td>"
// sTmp = sTmp & "<td>F1Mean<br>------------<br>B1Median</td>"
// sTmp = sTmp & "<td>Flag</td>"
// sTmp = sTmp & "<td>Bild</td></tr>"
// Ermittelung des schwächsten Hintergrundsignals ohne Berücksichtigung der Störungen=>
Störungen müssen mindestens 2x schwächstes Hintergrundsignal haben
Results.HideItems -100, FALSE, TRUE
Results.HideItems -100, TRUE, TRUE
ArrayStats.array = Results.Column(c_B1Median)
Results.HideItems -100, FALSE, FALSE
Results.HideItems -100, TRUE, FALSE
Hintergrund=Round(ArrayStats.Min, 0)
sTmp = sTmp & "<tr>Minimum des Hintergrundes: " & Hintergrund & "</tr>"
For i = 0 to Results.Height - 1
//Vorsicht bei Veränderung des Resultfiles !!! muss hier angepasst werden
FColumnName = "F600 Median"
BColumnName = "B600 Median"
Results.Sort BColumnName, 1
F1Mean = Results.Value(i, FColumnName)
B1Median = Results.Value(i, BColumnName)
Flag = Results.Flag(i)
// Kein Signal, aber mehr als 150% vom Background => wird zu Signal
// Kein Signal, aber mehr Hintergrund als 300% vom schwächsten Hintergrund => wird zu
Störung
If Flag = -50 then
If F1Mean/B1Median >= 1.5 then
If B1Median/3 > Hintergrund then
Results.Flag(i) = -100
Ergebnistabelle F1Mean, B1Median
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight:
bold'>kein Signal<br>|<br>|<br>V<br>Störung</td>"
// Extraction des Bildes
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight: bold'>" &
Results.Value(i, "Name") & "<br><img src=" & Pictureextraction(i) & "></td>"
sTmp = sTmp & "<td><input type='button' value=' Signal
'
onclick='SetFlag("& i & ", 0)'><br><input type='button' value='kein Signal'
onclick='SetFlag("& i & ", -50)'><br><input style='font-weight: bold' type='button'
value=' Störung ' onclick='SetFlag("& i & ", -100)'></td></tr>"
Else
Results.Flag(i) = 0
Ergebnistabelle F1Mean, B1Median
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight: bold'>kein
Signal<br>|<br>|<br>V<br>Signal</td>"
// Extraction des Bildes
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight:
bold'>" & Results.Value(i, "Name") & "<br><img src=" & Pictureextraction(i) & "></td>"
sTmp = sTmp & "<td><input style='font-weight: bold' type='button'
value=' Signal
' onclick='SetFlag("& i & ", 0)'><br><input type='button' value='kein
Signal' onclick='SetFlag("& i & ", -50)'><br><input type='button' value=' Störung '
onclick='SetFlag("& i & ", -100)'></td></tr>"
End If
Else
If B1Median/3 > Hintergrund then
Results.Flag(i) = -100
Ergebnistabelle F1Mean, B1Median
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight: bold'>kein
Signal<br>|<br>|<br>V<br>Störung</td>"
// Extraction des Bildes
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight: bold'>" &
Results.Value(i, "Name") & "<br><img src=" & Pictureextraction(i) & "></td>"
8 ANHÄNGE
110
sTmp = sTmp & "<td><input type='button' value=' Signal
'
onclick='SetFlag("& i & ", 0)'><br><input type='button' value='kein Signal'
onclick='SetFlag("& i & ", -50)'><br><input style='font-weight: bold' type='button'
value=' Störung ' onclick='SetFlag("& i & ", -100)'></td></tr>"
End If
End If
End If
// Signal: zwei Fälle F1 <= 1,5x B1 wird kein Signal, falls zudem noch B1 > 3x
Hintergrund wird Störung
If Flag = 0 then
If F1Mean/B1Median < 1.5 then
If B1Median/3 > Hintergrund then
Results.Flag(i) = -100
Ergebnistabelle F1Mean, B1Median
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight:
bold'>Signal<br>|<br>|<br>V<br>Störung</td>"
// Extraction des Bildes
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight: bold'>" &
Results.Value(i, "Name") & "<br><img src=" & Pictureextraction(i) & "></td>"
sTmp = sTmp & "<td><input type='button' value=' Signal
'
onclick='SetFlag("& i & ", 0)'><br><input type='button' value='kein Signal'
onclick='SetFlag("& i & ", -50)'><br><input style='font-weight: bold' type='button'
value=' Störung ' onclick='SetFlag("& i & ", -100)'></td></tr>"
Else
Results.Flag(i) = -50
// Ausgabe für Veränderung Signal -> kein Signal, da Signal schwächer als 150% vom
Hintergrund entfernt, da nicht fragwürdige automatische Beurteilung
//
Ergebnistabelle F1Mean, B1Median
//
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight:
bold'>Signal<br>|<br>|<br>V<br>Kein Signal</td>"
// Extraction des Bildes
//
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight:
bold'>" & Results.Value(i, "Name") & "<br><img src=" & Pictureextraction(i) & "></td>"
//
sTmp = sTmp & "<td><input type='button' value=' Signal
onclick='SetFlag("& i & ", 0)'><br><input style='font-weight: bold' type='button'
value='kein Signal' onclick='SetFlag("& i & ", -50)'><br><input type='button' value='
Störung ' onclick='SetFlag("& i & ", -100)'></td></tr>"
End If
End If
End If
'
// Störung, aber weniger Hintergrund als 200% vom schwächsten Hintergrund => wird zu kein
Signal
// falls zu kein Signal verändert, aber außerdem noch Signal > 150% vom Hintergrund =>
wird zu Signal
If Flag = -100 then
If B1Median/2 < Hintergrund then
If F1Mean/B1Median >= 1.5 then
Results.Flag(i) = 0
Ergebnistabelle F1Mean, B1Median
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight:
bold'>Störung<br>|<br>|<br>V<br>Signal</td>"
// Extraction des Bildes
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight: bold'>" &
Results.Value(i, "Name") & "<br><img src=" & Pictureextraction(i) & "></td>"
sTmp = sTmp & "<td><input style='font-weight: bold' type='button'
value=' Signal
' onclick='SetFlag("& i & ", 0)'><br><input type='button' value='kein
Signal' onclick='SetFlag("& i & ", -50)'><br><input type='button' value=' Störung '
onclick='SetFlag("& i & ", -100)'></td></tr>"
Else
Results.Flag(i) = -50
Ergebnistabelle F1Mean, B1Median
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight:
bold'>Störung<br>|<br>|<br>V<br>kein Signal</td>"
// Extraction des Bildes
sTmp = sTmp & "<td align='center' style='font-weight: bold'>" &
Results.Value(i, "Name") & "<br><img src=" & Pictureextraction(i) & "></td>"
sTmp = sTmp & "<td><input type='button' value=' Signal
'
onclick='SetFlag("& i & ", 0)'><br><input style='font-weight: bold' type='button'
value='kein Signal' onclick='SetFlag("& i & ", -50)'><br><input type='button' value='
Störung ' onclick='SetFlag("& i & ", -100)'></td></tr>"
End If
End If
End If
8 ANHÄNGE
Next
SetHTML(sTMP)
// Zurück zum Resultat
GenePix.SwitchToTab(5)
End Function
//
//
//
//
++++++++++++++++
Sub: Ergebnistabelle
Oft wiederholte Ausgabe
++++++++++++++++
Sub Ergebnistabelle(F1Mean, B1Median)
Anzahl = Anzahl+1
sTmp = sTmp & "<tr><td style='font-size:20pt'>" & Anzahl &
"</td><td>F1Mean<br>B1Median<br><br>F1Mean<br>-----------<br>B1Median</td>"
sTmp = sTmp & "<td style='font-weight: bold'>" & F1Mean & "<br>" & B1Median &
"<br><br><br>" & Round(F1Mean/B1Median,2) &"<br><br></td>"
End Sub
//
//
//
//
++++++++++++++++
FUNCTION: Pictureextraction
Gets and returns Spot environment
++++++++++++++++
Function Pictureextraction(i)
Dim X,Y
ImageTab.AutoScaleDisplaySettings
X = Results.Value(i, "X")
Y = Results.Value(i, "Y")
Pictureextraction = ImageTab.SubImage(3, X-700, Y-700, 1400, 1400)
End Function
//
//
//
//
++++++++++++++++
Sub: SetFlag
Sets new Flag
++++++++++++++++
Sub SetFlag(i, wert)
Results.Flag(i) = wert
End Sub
//
//
//
//
++++++++++++++++
FUNCTION: GetResultsFileName
Gets and returns the Results file name
++++++++++++++++
Function GetResultsFileName()
Dim sFileName
// get file name
sFileName = Trim(Results.FileName)
// check file name
If sFileName = "" then
sFileName = "(untitled)"
End If
// return file name
GetResultsFileName = sFileName
End Function
//
//
//
//
++++++++++++++++
FUNCTION: SetHTML
Constructs HTML for the table
++++++++++++++++
Function SetHTML(sTMP)
Dim i
sTmp = sTmp & "</table>"
111
8 ANHÄNGE
112
sTMP = sTMP & "<table><tr><td class='instructions'>Korrektur beendet klicke den StartKnopf erneut, um die Korrektur wieder zu starten.</td><td class='instructions'
valign='bottom' align='right'><input type='button' value='Start'
onclick='Run()'></td></tr></table>"
FlagTable.InnerHTML = sTmp
End Function
</script>
</body>
</html>
8.1.2 VBA-MAKRO ZUR AUSWERTUNG DER GENPIX PRO-ERGEBNISSE
VERSION 5.00
Begin {C62A69F0-16DC-11CE-9E98-00AA00574A4F} UserForm1
Caption
=
"GenePix *.gpr Import"
ClientHeight =
1455
ClientLeft
=
45
ClientTop
=
330
ClientWidth =
5190
OleObjectBlob
=
"UserForm1.frx":0000
StartUpPosition =
1 'Fenstermitte
End
Attribute VB_Name = "UserForm1"
Attribute VB_GlobalNameSpace = False
Attribute VB_Creatable = False
Attribute VB_PredeclaredId = True
Attribute VB_Exposed = False
' Alle Variablen müssen deklariert werden
Option Explicit
Private Klon
Private Sub CommandButton1_Click()
Klon = "D"
Call Import
End Sub
Private Sub CommandButton4_Click()
Klon = "K"
Call Import
End Sub
Sub Import()
Dim sFile
Dim tabellenname '
Dim varanswer As Integer
Application.ScreenUpdating = False
Application.DisplayAlerts = False
' Auswahl der Datei
sFile = Application.GetOpenFilename( _
FileFilter:="GenePix Report (*.gpr), *.gpr", FilterIndex:=1, _
Title:="Copy Text File To Worksheet")
If sFile <> False Then
Worksheets.Add
Range("A1").Select
Workbooks.OpenText FileName:=sFile
' Datei in temporäres Arbeitsblatt importieren
ActiveSheet.UsedRange.Select
' Auswahl der Felder im Arbeitsblatt
Selection.Copy
' Kopieren
tabellenname = ActiveSheet.Name
ActiveWorkbook.Close
' Schließen der temporären Excel-Datei
ActiveSheet.Paste
' Kopieren der Daten in Arbeitsblatt
Range("E:E,F:F,G:G,I:I,K:K,M:AP").Select
Selection.Delete Shift:=xlToLeft
' Tabellennamen bereinigen
ActiveSheet.Name = Klon & Mid(Replace(tabellenname, ",", "_"), 12)
8 ANHÄNGE
113
' entfernt Datum vom gpr Filenamen
' Entfernung von - und + Zeichen aus dem Tabellennamen, um spätere Berechnungen
zu ermöglchen
tabellenname = ActiveSheet.Name
ActiveSheet.Name = Replace(tabellenname, "-", "_")
tabellenname = ActiveSheet.Name
ActiveSheet.Name = Replace(tabellenname, "+", "_")
' Korrektur der Tabelle, Entfernung von überzähligen Informtionszeilen, da sonst
die Berechnung fehlschlägt
' Test auf Art/Versionsnummer des Resultfiles, ermöglicht Umgang mit
verschiedenen GenePix Versionen
If ActiveSheet.Cells(2, 1).Value = 27 Then Range("12:19").Delete
If ActiveSheet.Cells(2, 1).Value = 22 Then Range("12:14").Delete
' Berechnung der Signale (mit Backgroundabzug ohne Abgleich)
ActiveSheet.Range("I22").Formula = " Signal nach Backgroundabzug"
ActiveSheet.Range("I23:I1198").Formula = "=PI()*E23^2/4*(F23-G23)"
Range("A1").Select
Application.ScreenUpdating = True
varanswer = MsgBox("Weitere " & Klon & "-Klone importieren", vbYesNo, "Frage")
If varanswer = vbNo Then Exit Sub Else If Klon = "D" Then Call
CommandButton1_Click
If Klon = "K" Then Call CommandButton4_Click
End If
End Sub
Private Sub CommandButton2_Click()
End
End Sub
Private Sub CommandButton3_Click()
Dim Blattname, Formel, Z, X As String
Dim j, i, Blattzahl, Abgleich As Integer
MsgBox ("Bitte warten, die Berechnung nimmt einige Zeit in Anspruch. Berechnung starten?
")
' Aktualisierung aus
Application.ScreenUpdating = False
Worksheets(2).Select
Columns("D:D").Select
Application.CutCopyMode = False
Selection.Copy
Sheets("Daten").Select
Range("A1").Select
ActiveSheet.Paste
For j = 1 To Sheets.Count - 1
Worksheets(j).Select
Columns("H:I").Select
Selection.Copy
Sheets("Daten").Select
Cells(1, 3 * j + 1).Select
Selection.PasteSpecial Paste:=xlValues, Operation:=xlNone, SkipBlanks:= _
False, Transpose:=False
Blattname = Worksheets(j).Name
Sheets("Daten").Cells(22, 3 * j).Formula = Blattname
Sheets("Daten").Cells(21, 3 * j + 1).Formula = Blattname
Sheets("Daten").Cells(21, 3 * j + 2).Formula = Blattname
Next j
'Berechung der Signalanzahl über alle Experimente
ActiveSheet.Range("B22").Formula = "Signalanzahl"
For j = 23 To 1198
Formel = "=sum("
For i = 1 To Sheets.Count - 1
Formel = Formel & "if(R" & j & "C" & 1 + 3 * i & ">=0,1,0)"
If i = Sheets.Count - 1 Then Formel = Formel & ")" Else Formel = Formel &
","
'Formel =
"=sum(if(d23>=0,1,0),if(g23>=0,1,0),if(j23>=0,1,0),if(m23>=0,1,0))"
Next i
ActiveSheet.Cells(j, 2).Formula = Formel
Next j
'Berechnung der Signalsumme, falls Signal in allen vorhanden und Gesamtsignal(für Level)
For j = 1 To Sheets.Count - 1
Abgleich = 0
For i = 23 To 1198
8 ANHÄNGE
114
Formel = "=if(R" & i & "C2=" & Sheets.Count - 1 & ",R" & i & "C" & 3 * j
+ 2 & ",0)"
ActiveSheet.Cells(i, 3 * j).Formula = Formel
Next i
ActiveSheet.Cells(20, 3 * j).Formula = "Summe Signale"
ActiveSheet.Cells(21, 3 * j).Formula = "=sum(R23C" & 3 * j & ":R1198C" & 3 * j &
")"
ActiveSheet.Cells(19, 3 * j + 2).Formula = "Gesamtsumme"
ActiveSheet.Cells(20, 3 * j + 2).Formula = "=sum(R23C" & 3 * j + 2 & ":R1198C" &
3 * j + 2 & ")"
ActiveSheet.Cells(15, 3 * j + 3).Formula = "Anzahl Signale für Abgleich"
For i = 23 To 1198
If ActiveSheet.Cells(i, 3 * j).Value > 0 Then Abgleich = Abgleich + 1
Next i
ActiveSheet.Cells(16, 3 * j + 3).Formula = "=" & Abgleich
Next j
' Copy Paste Wert der Summenberechung
For j = 1 To Sheets.Count - 1
Cells(21, 3 * j).Select
Application.CutCopyMode = False
Selection.Copy
Selection.PasteSpecial Paste:=xlValues, Operation:=xlNone, SkipBlanks:= _
False, Transpose:=False
Next j
' Abgeglichene Signale Berechnen
For j = 1 To Sheets.Count - 1
Cells(17, 3 * j).Formula = "Signale abgeglichen"
For i = 23 To 1198
Formel = "=if(R" & i & "C" & 3 * j + 1 & ">=0,R" & i & "C" & 3 * j + 2 &
"/R21C" & 3 * j & ",if(R" & i & "C" & 3 * j + 1 & "=-50,0,""""))"
ActiveSheet.Cells(i, 3 * j).Formula = Formel
Next i
Next j
' Summe Abgeglichene Signale Berechnen
For j = 1 To Sheets.Count - 1
Cells(18, 3 * j).Formula = "Summe Signale abgeglichen"
Cells(19, 3 * j).Formula = "=sum(R23C" & 3 * j & ":R1198C" & 3 * j & ")"
Next j
'Level Spalten einfügen
For j = 1 To Sheets.Count - 1
Columns(3 * j + j).Select
Selection.Insert Shift:=xlToRight
Cells(22, 4 * j).Formula = "L_" & Cells(22, 4 * j - 1).Value
For i = 23 To 1198
Z = "if(R" & i & "C" & 4 * j - 1
X = Z & "/R19C" & 4 * j - 1 & "*10^8"
Formel = "=" & Z & "=0,0," _
& Z & "="""",-1," _
& X & "<25000,1," _
& X & "<100000,2," _
& X & "<400000,3," _
& X & "<1000000,4," _
& X & "<2000000,5," _
& X & ">2000000,6))))))))"
ActiveSheet.Cells(i, 4 * j).Formula = Formel
Next i
'
=WENN(AA23=0;0;WENN(AA23="";0;WENN(AA23/AA$1199*10^8<25000;1;WENN(AA23/AA$1199*10^8<10000
0;2;WENN(AA23/AA$1199*10^8<400000;3;WENN(AA23/AA$1199*10^8<1000000;4;WENN(AA23/AA$1199*10
^8<2000000;5;WENN(AA23/AA$1199*10^8>2000000;6;))))))))
Next j
Application.ScreenUpdating = False
Call Ttestfaktoren
Call Qualitaetskontrolle
Application.ScreenUpdating = True
Call VorlageSAM
Call MAPlot
MsgBox ("Berechnung beendet. :-)")
End
End Sub
Sub MAPlot()
Dim kklone, dklone, Dmittel, Kmittel, Faktor, Intensitaet, Bereich As String
Dim i As Integer
Dim Formel As String
8 ANHÄNGE
115
Sheets("SAM").Select
Sheets.Add
With ActiveSheet
.Move after:=Worksheets(Worksheets.Count)
.Name = "MA-Plot"
End With
Sheets("twert+Faktoren").Select
Cells.Select
Selection.Copy
Sheets("MA-Plot").Select
Selection.PasteSpecial Paste:=xlPasteValues, Operation:=xlNone, SkipBlanks _
:=False, Transpose:=False
' Entfernen von überflüssigen Spalten
Columns("G:G").Select
Selection.Insert Shift:=xlToRight
Columns("G:G").Select
Selection.Insert Shift:=xlToRight
Cells(1, 7).Formula = "Mittlere Intensität"
Cells(1, 8).Formula = "Mittlere Log Ratio"
' Ermittelung der Bereiche für K / D Experimente
For i = 1 To Sheets.Count - 6
If Left(Cells(1, 7 + 2 * i).Value, 1) = "K" Then _
If kklone <> "" Then kklone = kklone & ","
If Left(Cells(1, 7 + 2 * i).Value, 1) = "K" Then _
kklone = kklone & "R2C" & 7 + 2 * i
If Left(Cells(1, 7 + 2 * i).Value, 1) = "D" Then _
If dklone <> "" Then dklone = dklone & ","
If Left(Cells(1, 7 + 2 * i).Value, 1) = "D" Then _
dklone = dklone & "R2C" & 7 + 2 * i
Next i
Dmittel = "if(Average(" & dklone & ")=0,0.00001,Average(" & dklone & "))"
Kmittel = "if(Average(" & kklone & ")=0,0.00001,Average(" & kklone & "))"
Faktor = "=log(" & Dmittel & "/" & Kmittel & ",2)"
Intensitaet = "=log(sqrt(" & Dmittel & "*" & Kmittel & "),2)"
For i = 2 To 1177
Cells(i, 7) = Replace(Intensitaet, "R2", "R" & i)
Cells(i, 8) = Replace(Faktor, "R2", "R" & i)
Next i
' Einfügen von Diagramm
Columns("G:H").Select
Selection.Copy
Selection.PasteSpecial Paste:=xlPasteValues, Operation:=xlNone, SkipBlanks _
:=False, Transpose:=False
'Löschen der Zellen mit fehlenden Werten
Application.ScreenUpdating = False
For i = 1177 To 2 Step -1
If Not IsNumeric(Cells(i, 7)) Then Rows(i).EntireRow.Delete Shift:=xlUp
Next i
'Ermitteln der übriggeblebenen Zeilen
Bereich = "cells(2,7),cells(" & ActiveSheet.UsedRange.Rows.Count & ",8)"
'Einfügen der xy Graphik
Charts.Add
ActiveChart.ChartType = xlXYScatter
ActiveChart.SeriesCollection(1).Name = "=""MA-Plot"""
ActiveChart.Location Where:=xlLocationAsNewSheet, Name:="MA-Plot Diag."
With ActiveChart
.HasTitle = True
.ChartTitle.Characters.Text = "MA-Plot"
.Axes(xlCategory, xlPrimary).HasTitle = True
.Axes(xlCategory, xlPrimary).AxisTitle.Characters.Text = "Mittlere Intensität"
.Axes(xlValue, xlPrimary).HasTitle = True
.Axes(xlValue, xlPrimary).AxisTitle.Characters.Text = "Mittlerer log-Ratio"
End With
'Hintergrund entfernen und Pixel verkleinern
With Selection.Border
.ColorIndex = 16
.Weight = xlThin
.LineStyle = xlContinuous
End With
Selection.Interior.ColorIndex = xlNone
ActiveChart.SeriesCollection(1).Select
With Selection.Border
.Weight = xlHairline
8 ANHÄNGE
.LineStyle = xlNone
End With
With Selection
.MarkerBackgroundColorIndex = xlAutomatic
.MarkerForegroundColorIndex = xlAutomatic
.MarkerStyle = xlDiamond
.Smooth = False
.MarkerSize = 3
.Shadow = False
End With
Set kklone = Nothing
Set dklone = Nothing
End Sub
Sub VorlageSAM()
Dim i, letztezeile, letztespalte As Integer
Sheets("twert+Faktoren").Select
Application.CutCopyMode = False
Sheets("twert+Faktoren").Copy after:=Sheets(Sheets.Count)
Sheets("twert+Faktoren (2)").Select
Sheets("twert+Faktoren (2)").Name = "SAM"
Cells(1, 1).Formula = "UNIQID"
Cells(1, 2).Formula = "NAME"
' entferne Twert+Faktoren, Level
Columns("C:F").Select
Selection.Delete Shift:=xlToLeft
' Entferne Spalten mit L_ als Name -> Level Spalten entfernt
For i = 1 To Worksheets.Count - 5
Columns(2 + i + 1).Select
Selection.Delete Shift:=xlToLeft
Next i
' Ersetze leere Felder mit NA
letztezeile = ActiveSheet.UsedRange.Rows.Count
letztespalte = ActiveSheet.UsedRange.Columns.Count
Range(Cells(1, 1), Cells(letztezeile, letztespalte)).Select
Selection.Replace What:="", Replacement:="NA", LookAt:=xlPart, _
SearchOrder:=xlByRows, MatchCase:=False, SearchFormat:=False, _
ReplaceFormat:=False
'Einfügen der Vorberechnungen für SAM Analyse, es müssen alle mit nur einem Wert und
alle mit Summe 0 aussortiert werden
Columns("C:C").Select
Selection.Insert Shift:=xlToRight
Selection.Insert Shift:=xlToRight
Cells(1, 3).Formula = "Anzahl"
Cells(1, 4).Formula = "Summe"
Cells(2, 3).Formula = "=COUNT(RC[2]:RC[" & Worksheets.Count - 4 & "])"
Cells(2, 4).Formula = "=SUM(RC[1]:RC[" & Worksheets.Count - 4 & "])"
Range("C2:D2").Select
Selection.AutoFill Destination:=Range("C2:D1177"), Type:=xlFillCopy
'Löschen der Zellen mit 0 Werten
Application.ScreenUpdating = False
For i = 1177 To 2 Step -1
If Cells(i, 3) <= 1 Then Rows(i).EntireRow.Delete Shift:=xlUp
Next i
For i = 1177 To 2 Step -1
If Cells(i, 4) = "0" Then Rows(i).EntireRow.Delete Shift:=xlUp
Next i
' Hilfsspalten löschen
Columns("C:D").Select
Selection.Delete Shift:=xlToLeft
Application.ScreenUpdating = True
End Sub
Private Sub Ttestfaktoren()
Dim kklone, dklone, Formel As String
Dim i, j As Integer
Dim n
' Neue Tabelle twert+Faktoren füllen mit Daten Level und Signal
Sheets("Daten").Select
Columns("A:A").Select
Selection.Copy
Sheets.Add
ActiveSheet.Name = "twert+Faktoren"
116
8 ANHÄNGE
117
ActiveSheet.Paste
For i = 1 To Sheets.Count - 2
' Signale Kopieren
Sheets("Daten").Select
Columns(4 * i - 1).Select
Application.CutCopyMode = False
Selection.Copy
Sheets("twert+Faktoren").Select
Cells(1, 2 * i + 4).Select
Selection.PasteSpecial Paste:=xlValues, Operation:=xlNone, SkipBlanks:= _
False, Transpose:=False
' Level Kopieren
Sheets("Daten").Select
Columns(4 * i).Select
Application.CutCopyMode = False
Selection.Copy
Sheets("twert+Faktoren").Select
Cells(1, 2 * i + 5).Select
Selection.PasteSpecial Paste:=xlValues, Operation:=xlNone, SkipBlanks:= _
False, Transpose:=False
Next i
'Mittlere Level berechnen K
Cells(22, 2).Formula = "K_Level_mittel"
Formel = ""
For j = 23 To 1198
For i = 1 To Sheets.Count - 2
If Left(Cells(22, 4 + 2 * i).Value, 1) = "K" Then _
If Cells(j, 4 + 2 * i + 1).Value >= 0 Then _
If Left(Formel, 10) = "=Average(i" Then _
Formel = Formel & "," Else Formel = "=Average("
If Left(Cells(22, 4 + 2 * i).Value, 1) = "K" Then _
If Cells(j, 4 + 2 * i + 1).Value >= 0 Then _
Formel = Formel & "if(R" & j & "C" & 4 + 2 * i + 1 & ">=0,R" & j &
"C" & 4 + 2 * i + 1 & ",)"
' Wenn schon mindestens ein Wert eingetragen Komma einfügen, zum
Abtrennen des nächsten Wertes
Next i
If Formel <> "" Then Formel = Formel & ")"
Cells(j, 2).Formula = Formel
Formel = ""
Next j
'Mittlere Level berechnen D
Cells(22, 3).Formula = "D_Level_mittel"
' Erstellen der Formel mit beginnendem Buchstaben des Experiment
For j = 23 To 1198
Formel = ""
For i = 1 To Sheets.Count - 2
If Left(Cells(22, 4 + 2 * i).Value, 1) = "D" Then _
If Cells(j, 4 + 2 * i + 1).Value >= 0 Then _
If Left(Formel, 10) = "=Average(i" Then _
Formel = Formel & "," Else Formel = "=Average("
If Left(Cells(22, 4 + 2 * i).Value, 1) = "D" Then _
If Cells(j, 4 + 2 * i + 1).Value >= 0 Then _
Formel = Formel & "if(R" & j & "C" & 4 + 2 * i + 1 & ">=0,R" & j &
"C" & 4 + 2 * i + 1 & ",)"
' Wenn schon mindestens ein Wert eingetragen Komma einfügen, zum
Abtrennen des nächsten Wertes
Next i
If Formel <> "" Then Formel = Formel & ")"
Cells(j, 3).Formula = Formel
Formel = ""
Next j
'Bestimmung des Faktors D/K
Cells(22, 4).Formula = "Faktor_DzuK"
' Bestimmen der D und K Bereiche
kklone = ""
dklone = ""
For i = 1 To Sheets.Count - 2
If Left(Cells(22, 4 + 2 * i).Value, 1) = "K" Then _
If kklone <> "" Then kklone = kklone & ","
If Left(Cells(22, 4 + 2 * i).Value, 1) = "K" Then _
kklone = kklone & "R23C" & 4 + 2 * i
If Left(Cells(22, 4 + 2 * i).Value, 1) = "D" Then _
8 ANHÄNGE
118
If dklone <> "" Then dklone = dklone & ","
If Left(Cells(22, 4 + 2 * i).Value, 1) = "D" Then _
dklone = dklone & "R23C" & 4 + 2 * i
Next i
For i = 23 To 1198
dklone = Replace(dklone, "R" & i - 1, "R" & i)
kklone = Replace(kklone, "R" & i - 1, "R" & i)
Cells(i, 4).Formula = _
"=if(sum(" & dklone & "," & kklone & ")=0,"""",if(sum(" & kklone &
")=0,""D"",if(sum(" & dklone & ")=0,""K"",round(sum(" & dklone & ")/count(" & dklone &
")/sum(" & kklone & ")*count(" & kklone & "),2))))"
Next i
' Berechnen der Twerte, da die Excel Funktion TTEST zusammenhängende Bereiche _
für die zu vergleichenden Werte verlangt, werden die Werte zuerst in eine _
neue Tabelle eingefügt
Sheets("Daten").Select
Columns("A:A").Select
Selection.Copy
Sheets.Add
ActiveSheet.Name = "TTest"
ActiveSheet.Paste
' Signale kopieren zuerst K-Klone, dann D-Klone
' Überprüfung ob K-Klon
n = 2
For i = 1 To Sheets.Count - 2
Sheets("twert+Faktoren").Select
If Left(Cells(22, 4 + 2 * i).Value, 1) = "K" Then _
Columns(4 + 2 * i).Select: _
Application.CutCopyMode = False: _
Selection.Copy: _
Sheets("TTest").Select: _
Cells(1, n).Select: _
n = n + 1: _
Selection.PasteSpecial Paste:=xlValues, Operation:=xlNone, SkipBlanks:= _
False, Transpose:=False
Next i
For i = 1 To Sheets.Count - 2
Sheets("twert+Faktoren").Select
If Left(Cells(22, 4 + 2 * i).Value, 1) = "D" Then _
Columns(4 + 2 * i).Select: _
Application.CutCopyMode = False: _
Selection.Copy: _
Sheets("TTest").Select: _
Cells(1, n).Select: _
n = n + 1: _
Selection.PasteSpecial Paste:=xlValues, Operation:=xlNone, SkipBlanks:= _
False, Transpose:=False
Next i
' Einfügen der Formel für den Twert
Cells(22, 5).Formula = "Twert2seit."
Sheets("TTest").Select
kklone = "TTest!R23C2:R23C"
dklone = ":R23C" & Sheets.Count - 2
For i = 1 To Sheets.Count - 2
If Left(Cells(22, 1 + i).Value, 1) = "D" Then _
kklone = kklone & i - 1 + 1: _
dklone = "TTest!R23C" & i + 1 & dklone: _
Exit For
Next i
Sheets("twert+Faktoren").Select
For i = 23 To 1198
dklone = Replace(dklone, "R" & i - 1, "R" & i)
kklone = Replace(kklone, "R" & i - 1, "R" & i)
Cells(i, 5).Formula = _
"=TTest(" & dklone & "," & kklone & ",2,3)"
' Zweiseitiger (da Nullhypothese D > oder < K somit - oder + zweiseitig) Welch
(keine gleiche Streuung vorausgesetzt) T-Test
Next i
' Ersetzen der DIV/0 Fehlermeldungen durch leeren Text
Sheets("twert+Faktoren").Select
Columns("E:E").Select
Selection.Copy
Selection.PasteSpecial Paste:=xlValues, Operation:=xlNone, SkipBlanks:= _
False, Transpose:=False
8 ANHÄNGE
Application.CutCopyMode = False
Selection.Replace What:="#DIV/0!", Replacement:="", LookAt:=xlPart, _
SearchOrder:=xlByRows, MatchCase:=False
'Löschen der ersten 21 Zeilen, da leer oder nur Kommentar
Rows("1:21").Select
Selection.Delete Shift:=xlUp
Cells(1, 1).Select
'Einfügen der Numerierung
Columns("A:A").Select
Selection.Insert Shift:=xlToRight
For i = 1 To 1177
Cells(i, 1).Formula = "=" & i
Next i
Sheets("twert+Faktoren").Select
Cells(1, 1).Formula = "Nummer"
Cells(1, 2).Formula = "Position"
End Sub
Private Sub UserForm_Click()
End Sub
Public Function Replace(ByVal zu_durchsuchender_Text As String, ByVal Was_ersetzen As
String, ByVal durch_was_ersetzen As String)
'Hilfsfunktion zum Ersetzen von Text
If Was_ersetzen = "" Then Exit Function
If zu_durchsuchender_Text = "" Then Exit Function
Dim i As Integer, L As Integer, t As String, P As Integer
L = Len(Was_ersetzen)
P = InStr(1, zu_durchsuchender_Text, Was_ersetzen, vbTextCompare)
While P > 0
t = t & Left(zu_durchsuchender_Text, P - 1) & durch_was_ersetzen
zu_durchsuchender_Text = Mid(zu_durchsuchender_Text, P + L)
P = InStr(zu_durchsuchender_Text, Was_ersetzen)
Wend
Replace = t & zu_durchsuchender_Text
End Function
Sub Qualitaetskontrolle()
Dim Kopf, Anzahl, i As Integer
Dim Formel As String
Kopf = 5
' Anzahl Kopfzeilen
Worksheets.Add
ActiveSheet.Name = "Report"
Cells(1, 1).Formula = "Zusammenstellung der Arrays"
Cells(2, 1).Formula = "Signale für Abgleich"
Cells(3, 1).Formula = Worksheets("Daten").Range("G16").Value
Cells(Kopf, 1).Formula = "Arrayname"
Cells(Kopf, 2).Formula = "Störung"
Cells(Kopf, 3).Formula = "Kein Signal"
Cells(Kopf, 4).Formula = "Signal"
Cells(4, 5).Formula = "Signal"
Cells(Kopf, 5).Formula = "Median"
Cells(Kopf, 6).Formula = "Min"
Cells(Kopf, 7).Formula = "Max"
Cells(4, 8).Formula = "Background"
Cells(Kopf, 8).Formula = "Median"
Cells(Kopf, 9).Formula = "Min"
Cells(Kopf, 10).Formula = "Max"
' Ermittelung der Anzahl der importieren Arrays
Anzahl = ActiveWorkbook.Worksheets.Count
' Anzahl -4 ist Anzahl der importierten Arrays
For i = 1 To Anzahl - 4
' Name der Tabelle
Cells(i + Kopf, 1) = Worksheets(i).Name
' Wichtig in Formeln (english) Abtrennung mit , nicht mit ; !!!
Formel = "=COUNTIF(" & Cells(i + Kopf, 1).Value & "!H23:H1198,-100)"
Cells(i + Kopf, 2).Formula = Formel
Formel = "=COUNTIF(" & Cells(i + Kopf, 1).Value & "!H23:H1198,-50)"
Cells(i + Kopf, 3).Formula = Formel
Formel = "=COUNTIF(" & Cells(i + Kopf, 1).Value & "!H23:H1198,0)"
Cells(i + Kopf, 4).Formula = Formel
Formel = "=Median(" & Cells(i + Kopf, 1).Value & "!f23:f1198)"
Cells(i + Kopf, 5).Formula = Formel
119
8 ANHÄNGE
Formel = "=Min(" & Cells(i + Kopf, 1).Value & "!f23:f1198)"
Cells(i + Kopf, 6).Formula = Formel
Formel = "=Max(" & Cells(i + Kopf, 1).Value & "!f23:f1198)"
Cells(i + Kopf, 7).Formula = Formel
Formel = "=Median(" & Cells(i + Kopf, 1).Value & "!g23:g1198)"
Cells(i + Kopf, 8).Formula = Formel
Formel = "=Min(" & Cells(i + Kopf, 1).Value & "!g23:g1198)"
Cells(i + Kopf, 9).Formula = Formel
Formel = "=Max(" & Cells(i + Kopf, 1).Value & "!g23:g1198)"
Cells(i + Kopf, 10).Formula = Formel
Next i
Columns("A:J").AutoFit
'Bestimmung von Maximum in einigen Spalten => roter Hintergrund
Columns("B").Select
GoToMax
With ActiveCell.Interior
.Color = RGB(200, 0, 0)
End With
Columns("C").Select
GoToMax
With ActiveCell.Interior
.Color = RGB(200, 0, 0)
End With
End Sub
Sub StarteUserform1()
' AtlasUserform Makro
Dim Warnung As Boolean
' Neue Arbeitsmappe
Workbooks.Add
' Alle Tabellen löschen
Warnung = Application.DisplayAlerts
Application.DisplayAlerts = False
ActiveWorkbook.Worksheets("Tabelle3").Delete
ActiveWorkbook.Worksheets("Tabelle2").Delete
Application.DisplayAlerts = Warnung
Worksheets("Tabelle1").Name = "Daten"
' Userform starten
Load UserForm1
UserForm1.Show
End Sub
Sub GoToMax()
' Hilfsfunktion zur Aktivierung der Zelle mit dem größten Wert
Dim WorkRange As Range
Dim MaxVal As Double
' Exit, falls kein Bereich selektiert ist
If TypeName(Selection) <> "Range" Then Exit Sub
' Wenn nur eine Zelle ausgewählt ist suche im gesamten Arbeitsblatt
' Sonst Suche im ausgewählten Bereich
If Selection.Count = 1 Then
Set WorkRange = Cells
Else
Set WorkRange = Selection
End If
' Bestimmung des maximalen Wertes
MaxVal = Application.Max(WorkRange)
' Suche und selektiere Maximum
On Error Resume Next
WorkRange.Find(What:=MaxVal, _
after:=WorkRange.Range("A1"), _
LookIn:=xlValues, _
LookAt:=xlPart, _
SearchOrder:=xlByRows, _
SearchDirection:=xlNext, MatchCase:=False _
).Select
If Err <> 0 Then MsgBox "Maximum nicht gefunden: " & MaxVal
End Sub
120
8 ANHÄNGE
121
8.2 KONGRESSBEITRÄGE
„Stable Reexpression of the Tumor Suppressor Smad4 in Pancreatic Carcinoma Cells:
Impact on Expression Profiles“
Zapatka M., Baar A., Ungefroren H., Hahn S., Schmiegel W., Schwarte-Waldhoff I.
Digestive Disease Week 2002
19 bis 22 Mai, San Francisco, Vereinigte Staaten von Amerika
„Stable reexpression of the tumor suppressor Smad4 in pancreatic cancer cells: Impact
on expression profiles“
Zapatka M., Baar A., Ungefroren H., Hahn S., Schmiegel W., Schwarte-Waldhoff I.
EMBL/SALK/EMBO Conference on Oncogenes and Growth Control 2002
20 bis 23 April, Heidelberg, Deutschland