Untersuchungen zur Expression von Ki67, Tenascin und Fibronectin

Aus der Klinik und Poliklinik für Urologie
(Direktor Prof. Dr. med. K. – J. Klebingat)
und dem Institut für Anatomie
(Direktor Prof. Dr. med. J. Fanghähnel)
Der Medizinischen Fakultät der Ernst – Moritz – Arndt – Universität Greifswald
Untersuchungen zur Expression von Ki67, Tenascin und Fibronectin im
Peniskarzinom des Menschen und deren Bedeutung für
Metastasierungsverhalten und Prognose des Primärtumors
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der
Medizinischen Fakultät
der
Ernst – Moritz – Arndt – Universität
Greifswald
2005
Vorgelegt von:
Jens Knödel
geboren am 14.08.1969
in Döbeln
Dekan:
Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer
1. Gutachter:
Prof. Dr. med. habil. K.- J. Klebingat
2. Gutachter:
Prof. Dr. med. habil. P. Fornara
3. Gutachter:
Ort, Raum:
Greifswald, Hörsaal Hautklinik
Tag der Disputation: 16.05.2006
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung
2.
Material und Methoden
2.1.
Patienten und Präparate
2.1.1.
Patientenkollektiv
2.1.2.
Therapie
2.1.3.
TNM – Klassifikation
2.1.4.
Histologie und Grading
2.1.5.
Klinisches Follow up
2.1.6.
Primäre Aufarbeitung der Präparate
2.2.
Material
2.2.1.
Chemikalien HE – Färbung
2.2.2.
Fertigreaktionssystem (Kit)
2.2.3.
Antikörper
2.2.4.
Kunststoff – und Glasmaterialien
2.2.5.
Häufig verwendete Lösungen und Chemikalien
2.2.6.
Geräte und Apparaturen
2.2.7.
Verwendete Software
2.3.
Methoden
2.3.1.
Präparation der Paraffinschnitte
2.3.2.
Entparaffinierung
2.3.3.
HE – Färbung
2.3.4.
Antikörperverdünnungen
2.3.5.
Färbung mit Antikörpern monoklonal/polyklonal
2.3.6.
Lichtmikroskopische Untersuchung
3
Inhaltsverzeichnis
2.3.7.
Kontrolle negativer Präparate
2.3.8.
Statistische Auswertung
3.
Ergebnisse
3.1.
Überlebensdaten
3.2.
Expression von Ki67, Tenascin und Fibronectin
3.2.1.
Gesundes Gewebe
3.2.1.1.
Ki67
3.2.1.2.
Tenascin
3.2.1.3.
Fibronectin
3.2.2.
Ki67 – Expression im Tumorgewebe
3.2.2.1.
Carcinoma in situ
3.2.2.2.
T1N0M0 – Karzinome
3.2.2.3.
T2 – 4N0M0 – Karzinome
3.2.2.4.
T1 - 4N+M+ - Karzinome
3.2.2.5.
Ki67 in Lymphknoten – bzw. Organmmetastasen
3.2.2.6.
Ki67 – Expression in Abhängigkeit vom Tumorgrading
3.2.3.
Untersuchung zu Tumorverhalten und Expression von Ki67
3.2.3.1.
Metastasierung
3.2.3.2.
Tumorprogreß
3.2.3.3.
Überlebenszeit
3.2.4.
Expression von Tenascin im Tumorgewebe
3.2.4.1.
Carcinoma in situ
3.2.4.2.
T1N0M0 – Karzinome
3.2.4.3.
T2 – 4N0M0 – Karzinome
3.2.4.4.
T1 - 4N+M+ - Karzinome
4
Inhaltsverzeichnis
3.2.4.5.
Lymphknoten – bzw. Organmetastasen
3.2.4.6.
Tenascin – Expression in Abhängigkeit vom Tumorgrading
3.2.5.
Untersuchung zu Tumorverhalten und der Expression von Tenascin
3.2.5.1.
Metastasierung
3.2.5.2.
Tumorprogreß
3.2.5.3.
Überlebenszeit
3.2.6.
Expression von Fibronectin im Tumorgewebe
3.2.6.1.
Carcinoma in situ
3.2.6.2.
T1N0M0 – Karzinome
3.2.6.3.
T2 – 4N0M0 – Karzinome
3.2.6.4.
T1 – 4N+M+ - Karzinome
3.2.6.5.
Lymphknoten – bzw. Organmetastasen
3.2.6.6.
Fibronectin – Expression in Abhängigkeit vom Tumorgrading
3.2.7.
Untersuchung zu Tumorverhalten und Fibronectin – Expression
3.2.7.1.
Metastasierung
3.2.7.2.
Tumorprogreß
3.2.7.3.
Überlebenszeit
4.
Diskussion
5.
Zusammenfassung
6.
Literaturverzeichnis
5
Einleitung
6
1. Einleitung
Das Peniskarzinom ist eine seit Jahrhunderten bekannte Erkrankung, bereits von Ägyptern,
Hebräern und Persern wurden Peniskarzinome in Wort und Bild dokumentiert. Der erste
Bericht über eine Penisamputation mit nachfolgender Koagulation des Stumpfes stammt von
Celsus aus dem ersten Jahrhundert v. Chr. Des Weiteren berichtet Morgagni im Jahr 1761
über eine von Valsalva durchgeführte partielle Penektomie [1].
Das Peniskarzinom ist in den Industriestaaten eine seltene Tumorentität. Ihr Anteil liegt bei
weniger als 1 % aller Krebserkrankungen [1;2]. In einigen Teilen Asiens und Mittel – sowie
Südamerikas hingegen beträgt die Häufigkeit bis zu 12 % [2]. In der männlichen Bevölkerung
dieser Regionen kann das Peniskarzinom bis 22 % aller Tumorerkrankungen ausmachen [1].
Dies ist auf andere kulturelle und religiöse Anschauungen zurückzuführen, vor allem besteht
eine Korrelation in Bezug auf eine mangelnde Genitalhygiene. Dagegen ist die
Erkrankungshäufigkeit bei der jüdischen Bevölkerung mit neonataler Zirkumzision praktisch
Null [3;4;5], eine später durchgeführte Zirkumzision schützt jedoch nicht vor einem
Peniskarzinom [6].
Die Inzidenz beträgt in den Industriestaaten 1 Tumorerkrankung pro 100000 Männer und
Jahr, in der Altersgruppe über 50 Jahre liegt sie bei 9 / 100000 und Jahr [1;2]. Ein höheres
Erkrankungsrisiko haben Asiaten und Südamerikaner verglichen mit der schwarzen und
weißen Rasse [2].
Bezüglich der Pathogenese des Peniskarzinoms sind verschiedene Faktoren gesichert. Als
prädisponierend gelten Smegmaretention, chronische Balanoposthitiden und chronische
Irritationen. So liegt die Rate der Peniskarzinompatienten mit begleitender Phimose bei 90 %
[2]. Eine entscheidende Rolle spielt eine Infektion mit Humanem Papilloma Virus (HPV).
Hier dominieren die HPV – Subtypen 16, 18, 31 und 33. Es konnte ein Zusammenhang
zwischen HPV – Infektionen und Penis – sowie Zervixkarzinomen nachgewiesen werden,
HPV – DNA konnte hierbei bei 42 % der Peniskarzinome und nahezu 100 % der
Zervixkarzinome evaluiert werden [7;8;9;10;11]. Beim Vulvakarzinom konnte ebenfalls eine
HPV – Infektion in ca. 50 % nachgewiesen werden [7;9;10;12;13]. Durch die HPV Infektion kommt es zu einer Expression der Onkogene E6 und E7. Diese wirken inhibitorisch
auf die Tumorsuppressorgene p53 und Retinoblastomagen [2]. Somit kommt es zu einer
Störung der Zellapoptose und erhöhter Mutationsanfälligkeit mit nachfolgender maligner
Entartung. Cubilla et al. (2000) korrelierten den histologischen Typ des Peniskarzinoms mit
der möglichen Entstehungsursache, sie zeigten eine HPV – Assoziation beim kondylomatösen
Einleitung
7
und beim basaloiden Typ, während die typische squamöse Form des penilen Karzinoms nicht
HPV assoziiert ist [14].
Des Weiteren werden exogene Noxen als mögliche Risikofaktoren diskutiert. So zum Beispiel
Nikotin und für den Beruf des Schornsteinfegers vermutlich Ruß – bzw. Staubexposition.
Raffn und Korsgaard berichteten über eine Häufung von Erkrankungen bei Arbeitern einer
Asbestfabrik in Dänemark [15;16].
Als obligate prämaligne Läsionen des Penis gelten die Leukoplakie, der Morbus Bowen, die
Erythroplasie (Queyrat) sowie das Carcinoma in situ. Im weiteren Sinne zählen
Riesenkondylome (Buschke – Löwenstein, verruköses Karzinom) sowie chronisch
entzündliche Prozesse (z. B. Balanitis sclerotica obliterans) und chronische Irritation (z.B.
Smegmaretention) zu prädisponierenden Faktoren (s. Tab. 1.1)[12;17;18].
Über
95
%
aller
malignen
Penistumoren
sind
epithelialen
Ursprungs
also
Plattenepithelkarzinome mit unterschiedlichen Verhornungsgraden. Hiervon finden sich ca.
50 % der Tumore im Bereich der Glans sowie ca. 20 % im Bereich der Präputialhaut, meist
von einer Phimose maskiert. Cubilla (2001)[19] klassifiziert pathohistologisch den einfachen
squamösen Karzinomtyp, den papillären Typ, beide als häufigste Varianten und weiterhin
einen condylomatösen, einen basaloiden sowie verrucösen Typ. Weitere den Penis
betreffende bösartige Tumoren sind das Basalzellkarzinom, das Melanom, das Sarkom sowie
das maligne Hämangioendotheliom. Hierzu liegen jedoch nur Einzelfallberichte vor. Mit der
Zunahme von HIV – Infektionen häuft sich in den letzten Jahren die Inzidenz von Kaposi –
Sarkomen im Bereich des Penis [1;2;19].
Tabelle 1.1 Präkanzerosen des Peniskarzinoms [1;2;12;17;18]
obligate Präkanzerosen
fakultative Präkanzerosen
Carcinoma in situ
Erythroplasie (Queyrat)
Morbus Bowen
Leukoplakie
Riesenkondylome
(Buschke – Löwenstein, verruköses
Karzinom)
Balanitis sclerotica obliterans
chronische Irritation
Histopathologisch erfolgt die Klassifikation nach den Kriterien der WHO / UICC 2002 nach
den unterschiedlichen Graden der Differenzierung.
GX
G1:
G2:
G3:
Differenzierungsgrad kann nicht bestimmt werden
hohe Differenzierung
mittlere / mäßige Differenzierung
geringe Differenzierung
Einleitung
8
Hinzu kommt beim Peniskarzinom die Angabe des Verhornungsgrades. Die Ausdehnung der
Tumorerkrankung wird ebenfalls nach den Festlegungen der WHO / UICC 2002 im TNM –
System angegeben.
T
Primärtumor
TX
T0
Tis
Ta
T1
T2
T3
T4
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
kein Anhalt für Primärtumor
Carcinoma in situ
nichtinvasives verruköses Karzinom
Tumor infiltriert subepitheliales Bindegewebe
Tumor infiltriert Corpus spongiosum oder cavernosum
Tumor infiltriert Urethra oder Prostata
Tumor infiltriert andere Nachbarstrukturen
N
Regionäre Lymphknoten
NX
N0
N1
N2
N3
regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
keine regionären Lymphknotenmetastasen
Metastasen in solitärem oberflächlichen Leistenlymphknoten
Metastasen in multiplen oder bilateralen Leistenlymphknoten
Metastasen in tiefen Leisten – oder Beckenlymphknoten (uni – oder bilateral)
M
Fernmetastasen
MX
M0
M1
Vorliegen von Metastasen kann nicht beurteilt werden
keine Fernmetastasen
Fernmetastasen
Neben dem TNM – System kann die Stadiengruppierung auch nach der früher sehr
gebräuchlichen Einteilung nach Jackson oder nach den Vorgaben der AJC / UICC von 1997
erfolgen [1].
Stadieneinteilung (AJC / UICC 1997)
Stadium 0
Stadium 1
Stadium 2
Stadium 3
Stadium 4
Tis – a
T1
T1
T2
T1 – 2
T3
T4
T0 – 4
T0 – 4
N0
N0
N1
N0 – 1
N2
N0 – 2
N0 – 3
N3
N0 – 3
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M1
Klinisch verbirgt sich das Peniskarzinom oft hinter einer nicht reponierbaren Vorhaut. Von
einer schmerzlosen kleinen Induration ausgehend kann das Wachstum exophytisch - papillär,
Einleitung
9
zum Teil knotig verrukös oder diffus infiltrierend ulzerös vonstatten gehen. Bei der
Untersuchung tastet man derbe grobbuckelige Knoten, eine oft brettharte Infiltration des
darunter liegenden Gewebes. Weiterhin findet sich eine geringe Vulnerabilität [1;2;20;21].
Zunächst stellen die Buck – Faszie sowie die Tunica albuginea eine anatomische Grenze dar,
nach Infiltration dieser Schichten erfolgt dann eine beschleunigte Dissemination über die
Corpora cavernosa. Somit kann frühzeitig eine lymphogene Metastasierung auftreten. Da die
Lymphdrainage, ein Netzwerk bildend, auch auf die kontralaterale Seite erfolgt, fließt die
Lymphe zunächst in die beidseitigen oberflächlichen inguinalen Lymphknoten [1;22].
Anschließend setzt sich dieser Weg über die tiefen inguinalen und dann iliakalen
Lymphknoten auf beiden Seiten fort. Bei ca. einem Drittel der Patienten finden sich bei
Diagnosestellung
positive
inguinale
metastatische
Lymphknoten
[23;24].
Eine
Fernmetastasierung tritt meist deutlich verzögert und dann häufig pulmonal, ossär oder
intraabdominell auf. Es gibt keine charakteristischen Frühsymptome, so wird die
Diagnosestellung oft verzögert und viele Erkrankte suchen erst den Arzt in fortgeschrittenem
Stadium auf [25].
Die Diagnostik umfaßt zunächst die klinische Untersuchung, wobei meist schon bei der
Palpation
der
Penistumor
gesichert
werden
kann
[21].
Eine
Exploration
der
Leistenlymphknoten ist obligat, 35 % - 60 % der Patienten weisen bereits eine Vergrößerung
der Lymphknoten auf. Hiervon sind jedoch etwa 50 % entzündlich reaktiv vergrößert
[1;23;24]. In rund 20% nicht tastbarer Leistenlymphknoten liegen aber schon okkulte
Metastasen vor. Da ein genaues Staging wichtig für die stadiengerechte Therapieplanung und
Prognose ist, handelt es sich bei der Beurteilung des Lymphknotenstatus um ein besonderes
diagnostisches
Problem,
mit
letztlich
entscheidender Bedeutung für das weitere
therapeutische Procedere.
Vervollständigt wird die Diagnostik durch eine Sonografie des Abdomens sowie auch des
Penis, ggf. kann eine Cavernosografie oder Magnetresonanztomografie Auskunft über die
lokale Tumorausdehnung geben [1;2;21]. Ein Röntgen des Thorax, eine Computertomografie
des Abdomens und fakultativ ein Skelettszintigramm komplettieren das Staging. Spezielle
Laboruntersuchungen neben einem Routinelabor sind nicht erforderlich. Der Befall von
Lymphknoten kann aber auch mit bildgebenden Verfahren nicht mit ausreichender Sicherheit
festgelegt werden. Letztlich bleibt als diagnostische Maßnahme noch die operative
Exploration mit ggf. Schnellschnittuntersuchung zu nennen.
Einleitung
10
Ziel der Therapie ist zunächst die lokale Tumorkontrolle, im Stadium Tis
– a
wird die
pathologische Diagnose mittels tiefer PE gestellt. Dann erfolgt entweder eine lokale
chirurgische Exzision des Befundes [1;2;26;27;28] oder alternativ eine Behandlung mittels
Lasertherapie (z. B. Nd – YAG oder CO2 – Laser) [29;30;31]. Eine weitere Alternative stellt
eine topische Applikation des Chemotherapeutikums 5 – FU dar. Unter Berücksichtigung der
oben beschriebenen viralen Genese findet heute zunehmend eine primäre Therapie bzw.
anschließende
Rezidivprophylaxe
mit
Imiquimod
Anwendung
[32;33;34].
Eine
organerhaltende Therapie kann ebenfalls bei kleinen T1 – Tumoren mittels lokaler Exzision,
Laserbehandlung oder Radiatio versucht werden [27;28]. Bei großen T1 – Karzinomen und
höheren Tumorstadien wird die partielle Penektomie bzw. eine totale Penisamputation mit
Anlage
eines
Neomeatus
perineal
erforderlich
(Boutonniere)[28;35:36].
Ein
Sicherheitsabstand von etwa 2 cm ggf. mit intraoperativer Schnellschnittuntersuchung ist
hierbei erforderlich [27;28]. Agrawal et al. (2000)[37] haben, den Absetzungsrand betreffend,
das Tumorgrading untersucht und halten bei G1 - und G2 – Tumoren einen Abstand von 1 cm
und für G3 – Tumoren einen Abstand von 1,5 cm für ausreichend. Alternativ kann prinzipiell
als 2. Wahl eine Bestrahlungstherapie indiziert sein. Diese sollte Patienten, welche einer
operativen Therapie nicht zustimmen und sehr ausgedehnten primär inoperablen Befunden
vorbehalten bleiben [27;28]. Da das Plattenepithelkarzinom nur sehr schlecht auf eine
Bestrahlung anspricht, sind hierbei Strahlendosen von mindestens 60 Gy erforderlich [38;39],
was zu einer hohen Nebenwirkungsrate führt. Als rein palliative Maßnahme muß die
Strahlentherapie bei einem Tumordurchmesser von > 3 cm und bei Invasion von tieferen
Penisstrukturen angesehen werden [40]. Weitere Ansätze wie z. B. eine Kontaktbestrahlung,
die interstitielle Strahlentherapie und eine kombinierte Radiochemotherapie sind denkbar,
weitere Daten liegen hierzu aber in der Literatur nicht vor.
Ein zentrales Problem der weiteren Therapie ist die Frage, ob und in welchem Umfang eine
operative Entfernung von Lymphknoten zu erfolgen hat. Wie oben bereits angeführt, liegen in
ca. 35 – 60 % bei Diagnosestellung palpable inguinale Lymphknoten vor, aber in ca. 50 %
sind diese reaktiv entzündlich verändert. Demgegenüber zeigen etwa 20 % der klinisch
unauffälligen Lymphknoten okkulte Metastasen. Durch bildgebende Verfahren ist zum
gegenwärtigen Zeitpunkt nicht mit ausreichender Sensitivität und Spezifität eine eindeutige
Zuordnung möglich [12;23;24;41;42]. Die von Dassler 1948 erstmals beschriebene klassische
inguinale Lymphknotendissektion ist mit einer hohen postoperativen Morbidität mit
Komplikationsraten von 80% - 90% behaftet [1;28;42;43]. Hierbei besonders zu erwähnen
Einleitung
11
sind Hautlappennekrose, chronisches Lymphödem, Serom, Wundinfektion, Phlebothrombose
und embolisches Geschehen. Aus diesem Grund wurde versucht, die Dissektion von
Lymphknoten einzuschränken, ohne eine Veränderung des Progressionsrisikos für den
Patienten einzugehen [41;44;45;46;47].
Da bei den Frühstadien Tis, Ta und T1 mit einer Wahrscheinlichkeit von 5 -12 % inguinale
Metastasen auftreten, ist in diesen Fällen bei klinisch unauffälligen Lymphknoten ein
abwartendes Vorgehen mit kurzfristigen Kontrollen gerechtfertigt [1;28;41]. Bei allen anderen
T – Stadien und negativen Lymphknoten sollte zumindest eine beidseitige Sentinel –
Lymphknotenbiopsie erfolgen. Diese Vorgehensweise wurde erstmals von Cabanas 1977
beschrieben (s. Abb.1.1)[44]. Sie wird aber kontrovers diskutiert, weil es bei diesem
Herangehen in einigen Fällen zu einer Tumorprogression kam [48]. Eine weitere heute meist
akzeptierte Möglichkeit bietet die modifizierte Lymphadenektomie, welche von Catalona
erstmals durchgeführt wurde [45]. Hierbei wird das inguinale Dissektionsgebiet auf die
medialen tiefen und oberflächlichen inguinalen Lymphknoten beschränkt und damit bei hoher
diagnostischer Sicherheit die postoperative Morbidität gesenkt (s. Abb.1.2)[49;50;51].
Aufbauend auf dieser Operationstechnik wurden weitere Modifikationen, z.B. von Jacobellis
2003, zur Senkung der Komplikationsraten bei gleich bleibender diagnostischer Sicherheit
beschrieben [47]. Nur bei Nachweis von positiven Lymphknoten sollte dann eine Erweiterung
zur radikalen Lymphadenektomie inguinal und pelvin beidseits vorgenommen werden
[1;28;52]. Eine neue Möglichkeit der Lymphknotendetektion wurde von Horenblas (2000)
vorgeschlagen. Hierbei werden die Sentinellymphknoten szintigrafisch mittels Gammakamera
erfasst. Längerfristige Ergebnisse wurden hierzu aber noch nicht berichtet [53;54;55]. Zum
derzeit empfohlenen Vorgehen siehe Tabelle 1.2.
Tabelle 1.2 Therapeutisches Vorgehen beim Peniskarzinom (modifiziert n. Rübben)[1]
keine diagnostische Lymphadenektomie,
Stadium Tis, a, 1, klinisch N0
engmaschige Kontrolle
Stadium T2 – 3, klinisch N0
diagnostische Lymphadenektomie
Stadium Tis, a, T1 – 3, klinisch N+
sekundäres Auftreten von einseitigen
Lymphknotenmetastasen
inguinale Lymphknotenmetastasen bei
jungem Patienten
therapeutische Lymphadenektomie
nach antibiotischer Therapie
einseitige Lymphadenektomie
therapeutische Lymphadenektomie mit
pelviner Lymphknotenentfernung
Bei primär klinisch nachweisbaren Lymphknotenvergrößerungen in allen T - Stadien sollte
zunächst eine antibiotische Therapie für 4 – 6 Wochen eingeleitet werden und dann immer
eine beidseitige inguinale Lymphknotenexstirpation angeschlossen werden [28].
Einleitung
12
Weiterhin ist zu beachten, dass eine verzögerte Operation der Lymphknoten, also erst bei
klinisch manifesten Filiae zu einer signifikant schlechteren Prognose führt [23;56;57].
Demgegenüber genügt aber bei sekundär auftretenden Metastasen im lokoregionären
Lymphgebiet die Entfernung des Befundes, ein erneutes beidseitiges Vorgehen ist hier nicht
erforderlich [1;28].
Eine primäre Strahlentherapie bei nachweisbaren inguinalen Lymphknotenveränderungen
führt bei Vorliegen von Metastasen nur zu einem Down – Sizing und nicht zu einer Heilung.
Auch bei primär klinisch negativen Lymphknoten stellt die Radiatio keine Alternative dar, es
wurde bei 22 % der Patienten eine Tumorprogression beschrieben [58].
Abb.1.1
Cabanasbiopsie
(nach Altwein und Jacobi 1982)
aus Jocham und Miller
„Praxis der Urologie“ (2003)[26]
Abb.1.2
modifizierte inguinale LA
nach Catalona:
inguinaler Venenstern und dessen
5 Lymphknotengruppen; in Zone
II, III und V befindet sich das
Lymphknotenresektionsgebiet
(nach Crawford 1984);
aus Jocham und Miller
„Praxis der Urologie“ (2003)[26]
Einleitung
13
Nach abgeschlossener Primärtherapie stellt sich die Frage nach dem weiteren therapeutischen
Vorgehen. Hier kommt unter Berücksichtigung aller individuellen Faktoren des Patienten eine
systemische Chemotherapie zur Anwendung. Hierzu wurden verschiedene Substanzen
untersucht. Wirksamkeit zeigten Bleomycin, Cisplatin und Methotrexat. Dabei ist einer
Kombinationstherapie gegenüber Monotherapie der Vorzug zu geben. Hierzu werden die o. g.
Substanzen untereinander oder mit anderen Präparaten kombiniert. Der Therapieansatz kann
adjuvant oder palliativ (bei fortgeschrittener organmetastasierter Erkrankung) sein. Als
adjuvante
Therapieschemata
Lymphknotenmetastasen
eine
werden
VBM
–
bei
ausgedehntem
Polychemotherapie
Primärtumor
(Vincristin,
ohne
Bleomycin,
Methotrexat) über 12 Wochen und bei Lymphknotenmetastasennachweis 6 Zyklen
Chemotherapie mit Cisplatin / 5 – FU empfohlen. Unter palliativer Zielsetzung kann bei
jüngeren Patienten ebenfalls eine Therapie mit Cisplatin / 5 – FU versucht werden. Bei älteren
Kranken kann wegen des geringeren Nebenwirkungsprofils eine Monotherapie mit Bleomycin
oder Methotrexat erwogen werden. Bei der Monotherapie kann dann die Therapie bis zur
Tumorprogression weitergeführt werden [1;2;26;59;60].
Ob und wie lange eine adjuvante Polychemotherapie einen Benefit für die Patienten bedeutet,
ist nach der derzeitigen Datenlage nicht ersichtlich. Bei metastasierter Erkrankung ist eine
komplette Remission sehr selten und das Ansprechen dauert in der Regel nicht länger als 6
Monate [1;2].
Die Prognose der Tumorerkrankung ist abhängig von der Primärtumorgröße und der
Infiltrationstiefe (siehe Tabelle 1.3)[22;28;61;62;63]. Der entscheidende Parameter ist aber
der Befall der regionalen Lymphknoten. Auch die Anzahl der beteiligten Lymphknoten sowie
der bilaterale Befall spielen eine Rolle. Dabei sinkt bei mehr als 2 befallenen Lymphknoten
die Fünfjahresüberlebensrate von etwa 80 % auf unter 20 % [23;25;64]. Das
histopathologische Grading hat insofern prognostische Relevanz, als dass mit zunehmender
Entdifferenzierung die Wahrscheinlichkeit von Lymphknotenmetastasen zunimmt (siehe
Tabelle 1.4)[28;63;65]. Der Verhornungsgrad hat dagegen keinen Einfluss auf die Prognose.
Empirisch scheint die Erkrankung bei jüngeren Patienten aggressiver abzulaufen als bei
älteren Erkrankten. Eine Karzinomkontrolle kann deshalb nur über die genaue Kenntnis des
Lymphknotenstatus führen. Wie oben angeführt, gestaltet sich aber gerade die Beurteilung der
regionalen
Lymphknotenstationen
als
sehr
schwierig.
Weiterhin
kann
die
erste
Lymphknotenstation auch übersprungen werden [1]. Bisher wird deshalb ein operatives
Einleitung
14
Vorgehen bevorzugt, was jedoch auch bei oben angeführten Veränderungen des operativen
Managements mit einer relativ hohen Morbidität einhergeht. Der Kliniker steht hier vor einer
schwierigen Entscheidung, entweder Tumorkontrolle mit unter Umständen deutlicher
Einschränkung der Lebensqualität oder abwartendes Vorgehen (gerade bei älteren Patienten)
mit besserer Lebensqualität aber deutlich schlechterer Prognose bei metachron auftretendem
Lymphknotenbefall [56;57]. Hier wäre ein Zugewinn an Prognosefaktoren für die
Beurteilung des Lymphknotenstatus wünschenswert, um ein risikoadaptiertes Vorgehen
zu ermöglichen. Dafür ist allerdings eine weitere Klärung der Tumorbiologie notwendig.
Leider sind wegen der geringen Inzidenz dieser Tumorerkrankung in den Industriestaaten die
Möglichkeiten in Bezug auf große Studien und im Hinblick auf die molekularbiologische
Diagnostik begrenzt.
Tabelle 1.3: Tumorstadium und Wahrscheinlichkeit von Lymph –
knotenmetastasen und 5 – Jahres – Überlebensrate (n. Doehn) [28]
Tumorstadium
N positiv ( % )
5 –Jahres - Überlebensrate ( % )
T1N0M0
0 – 30
70 – 100
T2 – 3N0M0
25 – 50
66 – 88
T1 – 3N1 – 3M0
100
8 – 40,3
T1 – 4N0 – 3M1
<5
Tabelle 1.4: Tumorgrading und Wahrscheinlichkeit von Lymphknotenmetastasen (n. Doehn)
[28]
Tumorgrading
N positiv ( % )
G1
0 – 47,5
G2
38,5 – 79,0
G3
66,7 - 100
Untersuchungen mit größeren Erkrankungszahlen sind hier vor allem aus Südamerika und
Asien zu erwarten. Erste Ergebnisse, welche ein besseres Verständnis der Pathomechanismen
des Peniskarzinoms und einen Hinzugewinn an Prognosefaktoren ermöglichen sollen, liegen
bereits vor. Insbesondere wird hierbei das Augenmerk auf die Erkennung von Tumormarkern
gelegt. Nach Magdelenat (1992) existieren bei diesen Markern allgemein gesehen 3 Gruppen;
1. onkofetale Antigene, welche normal nur während der Fetalzeit exprimiert werden; 2.
kohlehydrathaltige Antigene als Baustein von Glykolipiden und Glykoproteinen und
3.verschiedenartige Eiweiße, wie z. B. gewebespezifische Enzyme und Proteine des
Zytoskeletts [66].
Das Peniskarzinom betreffend wurden das p53 sowie das PCNA (proliferating cell nuclear
antigen) auf ihren prognostischen Vorhersagewert von Martins et al. (2002) untersucht [67].
Es
zeigte
sich
beim
PCNA
nur
eine
Korrelation
der
Expression
mit
der
Einleitung
15
Lymphknotenmetastasierung, während eine p53 – Überexpression mit dem T – Stadium, dem
Tumorgrad, mit dem Lymphknotenstatus sowie mit dem tumorspezifischen Überleben
korrelierte. Die Autoren schlussfolgerten hieraus, dass p53 beim Tumorstaging und bei der
Therapieplanung mit herangezogen werden sollte. Im Gegensatz dazu fanden Walts et al.
(1993) bei ihrer Untersuchung von benignen, dysplastischen und malignen anogenitalen
Epithelveränderungen nicht notwendigerweise eine p53 – Überexpression als Zeichen für
Bösartigkeit [68;69]. Leis et al. (1998) fanden keine p53 – Genmutation in einem primären
HPV 18 – assoziierten Peniskarzinom, aber eine Mutation des c – rasHa – Onkogens in einer
nach 7 Jahren aufgetretenen Spätmetastase. Die Bedeutung dieser Erkenntnis konnte jedoch
nicht eingeschätzt werden [8;70]. Eine weitere Arbeit zur p53 – Expression und Prognose
beim Peniskarzinom von Lopes et al. (2002) konnte eine p53 – Überexpression als
unabhängigen Faktor für eine Lymphknotenmetastasierung einhergehend mit schlechter
Prognose der Tumorerkrankung ermitteln [71].
Auf der Suche nach weiteren prognostischen Markern untersuchten Bezerra et al. (2001) den
Einfluß der HPV – Infektion auf die Tumorprognose und kamen zu dem Ergebnis, dass der
HPV – Status den Verlauf der invasiven Tumorerkrankung nicht beeinflusst [72]. Es wurde
ebenfalls versucht, aus den histologischen Subtypen beim Peniskarzinom einen Rückschluß
auf
die Wahrscheinlichkeit von Lymphknotenmetastasen zu ziehen. Eine hohe Zahl
lymphogener Filiae fand sich beim basaloiden und sarkomatoiden Subtyp. Eine mittlere
Wahrscheinlichkeit zeigte sich bei den typischen Plattenepithelkarzinomen, welche aber die
größte Gruppe darstellten. Es konnte letztlich keine sichere Vorhersage des Lympknotenstatus
erfolgen [19].
Fazit: Bisher konnte für das Peniskarzinom kein sicherer Parameter zur Vorhersage
einer
lymphogenen
Metastasierung
als
entscheidendem
Kriterium
für
das
Langzeitüberleben gefunden werden, p53 erscheint vielversprechend zu sein, aber
weitere Untersuchungen müssen die oben angeführten Studien weiter untermauern.
Ein weiterer bei verschiedenen Karzinomen untersuchter Parameter ist das Ki67, ein dimeres
nukleäres Antigen in proliferierenden Zellen, bestehend aus einem 345 KD und einem 395
KD Monomer. Die Expression des Antigens beginnt in der mittleren G1 – Phase des
Zellzyklus und hält durch die S – Phase sowie G2 – Phase an und erreicht ihren Höhepunkt in
der M – Phase. Anschließend erfolgt ein steiler Abfall der Expression am Ende der M – Phase
[73;74]. Es handelt sich somit um einen Proliferationsmarker, wobei die genaue Funktion des
Ki67 jedoch noch unklar ist.
Einleitung
16
Hieraus kann man schlussfolgern, dass eine Expression von Ki67 auch in normalen
Gewebestrukturen stattfindet, beispielhaft hierfür zeigt sich eine Ki67 – Expression in den
basalen Keratinozyten der normalen Haut [75]. Dies konnten Scurry et al. 1998 bestätigen
[76]. Sie fanden ebenfalls eine erhöhte Antigenkonzentration in den basalen Zellen der Vulva.
Als weiteres Beispiel sei die Ki67 – Expression als Zeichen der hohen proliferativen Aktivität
bei unreifen Lymphozyten genannt [77]. Es zeigt sich also, dass dieser Marker nicht
tumorspezifisch sondern ein allgemeines Kriterium sich teilender Zellen ist. Trotzdem lässt
die oben angeführte Überlegung den Schluss zu, dass gerade in malignen Geweben aufgrund
der hohen proliferativen Aktivität auch eine hohe Expression von Ki67 erfolgt. Weitergeführt
stellt sich dann die Frage, ob sich daraus prognostische Aussagen für den Verlauf einer
Tumorerkrankung ableiten lassen. Diesen Fragen wurde in vielen Publikationen
nachgegangen, so konnten z. B. Mate et al. (1996) für das nicht – kleinzellige
Bronchialkarzinom einen signifikanten Zusammenhang zwischen einem hohen Ki67 – Index
und einem schlechten Tumorgrading zeigen [78]. Ähnliches konnten Nguyen et al. (2000)
ebenfalls für das nicht – kleinzellige Bronchialkarzinom finden, hierbei evaluierten die
Autoren gleichzeitig eine höhere Ki67 – Expression in Plattenepithelkarzinomen gegenüber
Adenokarzinomen. Abschließend werteten die Autoren ihre Ergebnisse dahingehend, dass
Ki67 insgesamt aber kein unabhängiger prognostischer Parameter ist [73].
Als weiteres Beispiel kann das Zervixkarzinom genannt werden, Brown et al. (1988) fanden
hier keinen augenscheinlichen Zusammenhang zwischen der Ki67 – Produktion und
konventionellen
histologischen
Kriterien
sowie
der
Tumordifferenzierung
[79].
Demgegenüber zeigte Padovan et al. (2000) einen negativen Ki67 – Level bei
Zervixkarzinomen im klinischen Stadium 1B (32 von 39 Patientinnen), während alle
Patientinnen im klinischen Stadium 4 eine Ki67 – Expression aufwiesen [80].
Da es sich beim Peniskarzinom überwiegend um Plattenepithelkarzinome handelt, erscheint
es sinnvoll, einen Vergleich mit Plattenepithelmalignomen anderer Körperregionen zu suchen.
Nach Kenntnis des Autors liegen spezielle Untersuchungen zur Ki67 – Produktion beim
Peniskarzinom nicht vor. Lediglich 1 verruköses Karzinom des Penis wurde von Medina
Perez et al. (1999) evaluiert, es zeigte sich immunhistochemisch im Tumor eine erhöhte
Ki67 – Expression und diese besonders in den basalen mikroinvasiven Zellnestern [81]. Für
Plattenepithelmalignome des Kopf – und Halsbereiches wird die Bedeutung des
Proliferationsmarkers noch kontrovers diskutiert, besonders hinsichtlich der prognostischen
Aussagen besteht Uneinigkeit. Zidar et al. (1996) konnten einen signifikanten Anstieg der
Expression von Ki67 mit zunehmender Entdifferenzierung beim Larynxkarzinom zeigen. Die
Einleitung
17
Autoren schlossen daraus, dass Ki67 hilfreich zur besseren Festlegung des Tumorgradings ist
[82]. Bereits 1994 hatten Roland et al. den Proliferationsmarker Ki67 bei 79 Patienten mit
einem Plattenepithelkarzinom im Kopf – und Halsbereich untersucht. Sie fanden heraus, dass
die Ki67 – Expression nicht geeignet war, später entstehende Lymphknotenmetastasen
vorherzusagen [83]. Eine Korrelation zur Überlebenszeit wurde ebenfalls nicht gefunden.
Ähnliche Ergebnisse beschrieben Bayazit et al. (2002), sie konnten keinen Zusammenhang
zwischen der Ki67 – Produktion und dem N – bzw. T – Stadium beim Larynxkarzinom mit
Invasion feststellen. Es zeigte sich lediglich eine Korrelation zwischen der Ki67 – Expression
und dem Tumorgrading [84].
Demgegenüber stehen Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen, welche dem Ki67 eine
prognostische Relevanz gerade beim Plattenepithelmalignom zusprechen. Xie et al. (1999)
untersuchten hierzu 85 squamöse Karzinome der Zunge der Stadien T1 – T4 und konnten für
Apoptosemarker und auch für Ki67 eine Korrelation zwischen hoher Expression und
schlechter Prognose nachweisen [85]. Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen Valente et al.
(1999) bei ihrer Untersuchung von 102 Larynxkarzinomen, 84,6 % der Patienten mit hoher
Proliferation erlitten innerhalb von zwei Jahren ein Rezidiv oder verstarben an ihrem Tumor.
Sie sind der Meinung, dass die Ki67 – Expression ein unabhängiger prognostischer Parameter
für das Überleben ist [86]. Interessanterweise bestand im Rahmen dieser Untersuchung kein
Zusammenhang zwischen Proliferation (Ki67) und Grading, pathologischem Stadium und
Tumorsubtyp. Adnane at al. (2002) fanden eine zunehmende Erhöhung der Ki67 – Level bei
fortschreitenden invasiven Plattenepitheltumoren, eine Aussage zu einer prognostischen
Relevanz dieser Erkenntnis wurde nicht gegeben [87]. Als letztes Beispiel sind die
Untersuchungen von Lazaris et al. (2002) zu nennen, diese Arbeitsgruppe evaluierte ebenfalls
Larynxkarzinome und fand eine Korrelation zwischen hoher Ki67 Produktion und
fortgeschrittenen Tumoren, Lymphknotenbefall sowie frühem Rezidiv. In der statistischen
Analyse zeigten sich dann der Lymphknotenbefall und der Ki67 – Level als signifikante
Parameter zur Vorhersage eines Rezidivs [88].
Fazit:
Da
es
sich
beim
Peniskarzinom
histologisch
ebenfalls
um
ein
Plattenepithelkarzinom handelt, erscheinen auch hier Untersuchungen zur Ki67
Expression weitere Aussagen zum Metastasierungsverhalten und Prognose zu
versprechen.
Einleitung
18
Das Tenascin stellt einen weiteren interessanten Parameter zur Invasivität und damit zum
Metastastasierungverhalten von Karzinomen dar. Tenascin ist ein Glycoprotein, welches
strukturelle Ähnlichkeiten zum Fibronectin und zum EGF (Epidermical Growth Factor)
aufweist [89;90]. Die Erstbeschreibung fand zu Beginn der 80-er Jahre parallel in mehreren
Arbeitsgruppen statt [89;90;91]. Seine Benennung erfolgte daher unter verschiedenen
Bezeichnungen: Glial Mesenchymal Extracellular Matrix Protein (GMEM) (Bourdon
1983)[92], Myotendinous Antigen (Chiquet 1984)[93], Restrictin, Zytotactin (Grumet
1985)[94] und Janusin, J1 (Kruse 1985)[95], Neuronectin (Rettig 1989)[96]. Das
neuentdeckte Protein erweckte Interesse aufgrund seines Vorkommens im embryonalen und
pathologisch veränderten Gewebe. Die jetzige Bezeichnung Tenascin setzt sich aus dem
lateinischen tenere (halten) und nascens (entstehen, sich entwickeln) zusammen [89].
Das Tenascin ist ein Hexamer aus 190- 300 KD großen Untereinheiten, welche durch
Disulfidbrücken untereinander verbunden sind. Diese Untereinheiten besitzen cystinreiche
terminale Domänen, welche für die Oligomerisation von Bedeutung sind. Weitere
Bestandteile sind epidermal growth factor – ähnliche Aminosäuresequenzen, gefolgt von
Fibronectin Typ3 – repeats und eine fibrinogenähnliche globuläre Domäne [89;90;91].
Inzwischen wurden verschiedene Subtypen des Tenascin beschrieben. Das Tenascin C
existiert in zwei Varianten als TnCL (large) und TnCS (small), welche durch alternatives
Splicing entstehen [97]. Es spielt eine morphoregulatorische Rolle während der embryonalen
Entwicklung, beim Gewebeumbau und bei Erkrankungen mittels Regulation der Zelladhäsion
und des Signaltransfers in Nerven und anderen Zellen. Weitere Subtypen stellen das Tenascin
R, Tenascin W und Tenascin X und Tenascin Y dar. Das Tenascin R wird von
Oligodendrozyten während der Myelinisierung in der späten Schwangerschaft und in der
frühen postnatalen Phase exprimiert. Das Tenascin X wurde als Flexilin als Bestandteil von
bovinem Bindegewebe isoliert. Es spielt eine essentielle Rolle in der embryonalen
Entwicklung, da eine Mutation in diesem Protein beim Ehlers Danlos Syndrom, einer
hereditären Bindegewebserkrankung mit Spinnengliedrigkeit, vaskulären Wandstörungen und
Wundheilungsstörungen nachgewiesen wurde. Tenascin Y ist ein Protein, welches das
Muskelzellwachstum stimuliert [89;90;91].
Zusammenfassend lassen sich dem Tenascin die in Tabelle 1.5 dargestellten Funktionen
zuordnen [93;98;99;100].
Einleitung
19
Tabelle 1.5
Funktionen des Tenascin im gesunden Gewebe
- Zelladhäsion
- Zellmotilitätsregulation
- Leitstruktur der Zellmigration
- Promotion des Zellwachstums
- Begrenzung verschiedener Gewebe
- Regulation der Gewebedifferenzierung
In Tumoren hingegen konnten weitere Funktionen nachgewiesen werden. Hier erscheint das
Tenascin als Promotor der Invasion und Metastasierung auf der Grundlage einer Reduktion
der Tumorzelladhäsion. Desweiteren spielt es eine Rolle als Stimulator bei der Sekretion von
Metallo - Matrix – Proteasen mit nachfolgender Matrixdegeneration als Voraussetzung für die
Tumorzellinvasion [89;101].
Diverse Arbeitsgruppen konnten eine Tenascin Expression in den Basalzellschichten maligner
Tumoren nachweisen, so zum Beispiel Hindermann et al. (1999) beim oralen
Plattenepithelkarzinom. Bei gut differenzierten Karzinomen wurde hierbei Tenascin von einer
zum Stroma hin liegenden Schicht Tumorzellen gebildet. Bei gering differenzierten Tumoren
hingegen zeigte sich eine höhere Zahl Tenascin bildender Tumorzellen in den invasiven
Karzinomnestern. Zusätzlich zeigte sich Tenascin vermehrt an der Invasionsfront. Der Autor
schloss hieraus auf einen instabilen Umbau der extrazellulären Matrix mit Reduktion der
Adhäsion und dadurch Begünstigung der Invasion [97]. Analog dazu konnten Pilch et al.
(1999) ebenfalls eine starke Erhöhung der Expression von Tenascin in invasiven
Zervixkarzinomen feststellen. Interessanterweise fand sich bei dieser Untersuchung im
gesunden Gewebe nur eine Tenascinfärbung im Bereich von Gefäßen aber nicht im Bereich
der epithelialen Basalmembran. Bei dieser Arbeit wurde eine Subgruppe von Patienten mit
invasiven Karzinomen gefunden, bei denen eine fehlende Tenascin – Expression als Zeichen
einer gestörten stromalen Abwehr einhergehend mit einer schlechten Prognose diskutiert
wurde [102].
Die Arbeitsgruppe Dandachi et al. (2001) konnte für das Mammakarzinom eine verstärkte
Expression des Tenascin in Tumorzellen und stromalen Zellen nachweisen, es zeigte sich eine
Korrelation zwischen Tenascin und dem Tumorgrad sowie dem Alter der Patienten. Es konnte
eine Gruppe von jungen Patientinnen mit hoher Tenascinexpression und schlechter Prognose
aufgezeigt werden [103].
Auch Yoshida et al. (1999) zeigten eine vermehrte Tenascinproduktion im Stroma von
invasiven Larynxkarzinomen, es fand sich wiederum eine Darstellung intrazytoplasmatisch in
den invasiven Tumorzellnestern. Sie interpretierten diese Ergebnisse ebenfalls dahingehend,
Einleitung
20
dass die Tenascinexpression der Tumore für ihre Proliferation und Migration und damit
Invasion verantwortlich ist [104].
Zidar et al. (2001) wiesen auch eine verstärkte Expression des Tenascin im
Plattenepithelkarzinom des Larynx insbesondere im Tumorstroma und an der Invasionsfront
nach. Allerdings wurde eine umgekehrte Relation zum Tumorgrad gefunden. Ein signifikanter
Zusammenhang zwischen Tenascinproduktion und dem Tumorstadium konnte nicht
nachgewiesen werden [105].
Fazit: Wie sich die extrazelluläre Matrix im Peniskarzinom als Plattenepithelkarzinom
bezüglich des Tenascin verhält und ob sich daraus evtl. prognostische Aussagen
gewinnen lassen, ist bisher nicht bekannt.
Auch das Fibronectin als ein zum Tenascin korrespondierendes Protein erscheint ein
interessanter Faktor der extrazellulären Matrix mit möglichem Einfluß auf die Tumorbiologie
zu sein.
Die Struktur des Fibronectin ist gut erforscht, es handelt sich um ein großes dimeres
Glycoprotein, bestehend aus ca. 230 – 250 kDa großen Monomeren, welche durch ein Paar
Disulfidbrücken in der Nähe des Carboxyl – Endes miteinander verbunden sind. Die
Polymerisation
erfolgt
ebenfalls
mittels
Disulfidbrücken
zwischen
den
einzelnen
Proteinketten. Jede Untereinheit ist durch eine Reihe von sich wiederholenden Domänen
(Repeats) zusammengesetzt, welche durch flexible Polypeptidketten verbunden werden. Der
Haupttyp dieser Domänen ist der Fibronectin – Typ III – Repeat, ca. 90 Aminosäuren lang
und wiederholt sich 15mal in jeder Untereinheit. Eine besondere Aminosäuresequenz, die
sogenannte RDG – Sequenz (Arg – Gly – Asp) des Typ III – Repeat ist für die Bindung an
Zelloberflächen verantwortlich (Integrinbindung). Weitere Domänen besitzen Affinität z. B.
zu Heparin und Collagen [106;107].
Molekulare Varianten des Fibronectin entstehen durch alternatives Splicing der pre – mRNA
und posttranslational durch Modifikation des Proteins durch de novo Glykosilierung.
Bekannte Varianten, welche durch Elimination bzw. Hinzufügen von RNA – Sequenzen
entstehen, sind ED – A Fibronectin, ED – B Fibronectin und IIICS Fibronectin (Kosmehl
1996) [107]. Im Körper kommt Fibronectin in zwei Formen vor, gelöst, als Plasmafibronectin,
dieses wird vorwiegend von der Leber produziert, und ungelöst als Protein der extrazellulären
Matrix [106].
Folgende Funktionen werden hierbei für das Fibronectin angenommen:
Einleitung
21
Tabelle 1.6 [107;108;109]
Funktionen des Fibronectin im gesunden
Gewebe
- Zelladhäsion
- Steuerung der Zellmigration
- Modulation der Zellproliferation
- Modulation der Zelldifferenzierung
- Wahrung der Zellform
- Begrenzung unterschiedlicher Gewebe
Weiterhin ist bekannt, dass ED – A Fibronectin normal beim Erwachsenen vorkommt,
während ED – B Fibronectin und de novo glykosiliertes Fibronectin in embryonalem und
Tumorgewebe sowie bei Gewebereparationsprozessen gebildet wird. Aus diesem Grund
werden die beiden letzteren auch zusammenfassend als onkofetales Fibronectin bezeichnet
[110;111].
Unter Berücksichtigung der oben angeführten Daten wurde von verschiedenen Autoren die
Rolle des Fibronectin bei Wachstum und Metastasierung von Malignomen auch im Hinblick
auf eine prognostische Aussage untersucht. Görögh et al. (2001) hält einen Abfall der
Fibronectinexpression für eine grundlegende Eigenschaft von Zellen, welche durch virale
Onkogene bzw. durch Karzinogene verändert wurden. Dies wird vom Autor als ein möglicher
Schlüsselmechanismus für die Karzinogenese und für eine Metastasierung gesehen. Er führt
diesen Expressionsabfall bei den von ihm untersuchten Larynxkarzinomen auf eine
verminderte Transkription zurück [109].
Im Gegensatz hierzu fanden Zidar et al. (2001) in den meisten Plattenepithelkarzinomen des
Larynx eine erhöhte Fibronectinproduktion, welche aber mit höherer Entdifferenzierung
abnahm.
In
Gebieten
Lymphozytendichte,
mit
lymphozytären
Fibronectin
weniger
Infiltraten
nachweisbar,
war,
hier
abhängig
zeigten
die
von
der
geringer
differenzierten Karzinome eine ausgeprägtere lymphozytäre Infiltration und damit geringere
Fibronectinexpression.
Weiterhin
war
im
Bereich
der
Invasionsfront
die
Fibronectinkonzentration erhöht. Eine Korrelation zum Staging bzw. zu einer Metastasierung
zeigte sich nicht, die Autoren werteten aber eine schwache Färbung von Fibronectin als
schlechtes prognostisches Zeichen [105].
Bereits 1995 hatten Hauptmann et al. kolorektale Karzinome hinsichtlich Fibronectin
untersucht und hierbei eine deutliche Expression vor allem von Isoformen des Fibronectin
nachgewiesen, sie vermuteten hierbei eine Begünstigung der Invasion durch die so veränderte
extrazelluläre Matrix [112]. Ebenfalls für kolorektale Karzinome konnten Inufusa et al. (1995)
eine erhöhte Fibronectinproduktion entsprechend einem höheren Tumorstadium finden,
Einleitung
22
hierbei zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen Lebermetastasierung und damit
schlechter Prognose der Erkrankung und dem Level der Fibronectinexpression [113].
Eine weitere Untersuchung bezüglich des Fibronectin von Pujuguet et al. (1996) zeigte
ebenfalls eine Überproduktion von Fibronectin bei Kolorektalkarzinomen, es konnte hierbei
gezeigt werden, dass die Tumorzellen selbst das Fibronectin exprimieren und zusätzlich
tumorassoziierte Myofibroblasten zur Bildung von Fibronectin stimulieren [114].
Dies deckt sich mit Erkenntnissen der Arbeitsgruppe um Mandel et al. (1994), welche orale
Karzinome hinsichtlich der Isoformen des Fibronectin untersuchte und eine Überexpression
bei invasiven Karzinomen fand. Hingegen war keine Veränderung im Bereich von
prämalignen Läsionen nachweisbar. Eine Aussage zur prognostischen Relevanz wurde von
den Autoren nicht gemacht [115].
Eine deutliche Fibronectinüberexpression im Tumorstroma konnte auch Kaczmarek et al.
(1994) für die invasiven ductalen Karzinome der Brust nachweisen. Es zeigte sich weiterhin
ein solcher Befund in den observierten Tumorgefäßen. Dagegen trat bei den invasiven
lobulären Mammakarzinomen eine geringere Fibronectindarstellung auf [116].
Für orale Plattenepithelkarzinome konnte Kosmehl et al. (1999) eine verstärkte Produktion
besonders des oncofetalen Fibronectins aufzeigen, er fand im Stromabereich der gut
differenzierten Karzinome eine eher fokale Fibronectindarstellung sowie eine Konzentration
an der Invasionsfront. Die schlecht differenzierten Tumore zeigten die Invasionsfront
betreffend ein ähnliches Bild aber sonst eine eher diffuse Fibronectinverteilung im Stroma.
Eine Korrelation zwischen Stärke der Expression und dem Tumorgrad konnte jedoch nicht
ermittelt werden [117]. In einer weiteren Arbeit dieses Autors (1996) wird ein
unterschiedliches Verhalten von Karzinomen beschrieben und zwar dahingehend, dass
epitheliale Karzinome eine eher starke Fibronectinexpression zeigen und im Gegensatz hierzu
Adenokarzinome (z.B. Renalzellkarzinome) nur eine feine von ihm als „Spots“ bezeichnete
Darstellung zulassen [107;118].
Castellani et al. (1994) untersuchte das Verhalten des oncofetalen Fibronectins im Rahmen
der Angiogenese und konnte eine erhöhte Expression in Gefäßen in Tumoren aber auch im
normalen Gewebe nachweisen. Reife Gefäße zeigten keine Darstellung. Der Autor
bezeichnete die immunhistochemische Darstellung des oncofetalen Fibronectins als hilfreich
zur Abschätzung der Angioneogenese in Tumorprozessen [119].
Eine primäre Reduktion der Fibronectinmatrix, mit dadurch erst möglicher Invasion, wird von
Ruoslahti (1999) postuliert, anschließend kommt es zu einer Änderung der extrazellulären
Matrix im Sinne eines Wundmilieus mit Bildung von Fibronectin, welches dann als Mediator
Einleitung
23
für eine weitere Migration und damit Invasion dient [120]. In der gleichen Arbeit beschreibt
der Autor die antiadhäsive Wirkung von Superfibronectin, einer polymeren Form des
Fibronectins. Mit Hilfe dieser Substanz konnten tierexperimentell Metastasen von
verschiedenen Tumorarten verhindert werden, ohne dass der Primärtumor selbst beeinflusst
wurde.
Hierzu
passend
findet
Tuszynski
et
al.
(1997)
eine
Inhibition
von
Tumorzellmetastasen durch die Gabe von Peptiden, welche die RGD - Sequenz des
Fibronectin enthalten [121].
Fazit:
Das
Verhalten
des
Fibronectin
auf
die
Tumorbiologie
und
das
Metastasierungsverhalten des Peniskarzinoms ist bisher nicht bekannt.
Die Tumorbiologie wird von Proteinen der extrazellulären Matrix entscheidend beeinflusst,
hierbei scheinen die Proteine Tenascin und Fibronectin gerade für Plattenepithelkarzinome
besonders erfolgversprechend zu sein. Weiterhin kann durch Untersuchung von
intrazellulären Antigenen auf das Tumorverhalten geschlossen werden. Hierbei erscheint der
Proliferationsmarker Ki67 für Plattenepithelkarzinome besonders erfolgversprechend. Aus
diesem Grund sollen Ki67, Tenascin und Fibronectin in dieser Arbeit für das Peniskarzinom
genauer untersucht werden.
Für die vorliegende Arbeit ergaben sich daher folgende Aufgaben:
1.
Untersuchungen zur Expression von Ki67 in Peniskarzinomen unterschiedlicher
Stadien
2.
Untersuchungen
zur
Expression
von
Tenascin
in
Peniskarzinomen
mit
unterschiedlichen Stadien
3.
Untersuchung der Expression von Fibronectin in Peniskarzinomen unterschiedlicher
Tumorstadien
4.
Evaluation des Einflusses der untersuchten Faktoren auf Metastasierungsverhalten
und Prognose
Aufgrund der geringen Inzidenz des Peniskarzinoms macht sich eine Aufarbeitung der
Präparate
mehrer
pathologischer
Institute
über
mehrere
Jahre
erforderlich.
Als
Untersuchungsmethode zur Expression von Proteinen wurde daher für die vorliegende Arbeit
die an eingelagerten Paraffinpräparaten durchführbare Methodik der Immunhistochemie
gewählt.
Material und Methoden
24
2. Material und Methoden
2.1. Patienten und Präparate
2.1.1. Patientenkollektiv
Für die vorliegende Arbeit wurden die pathologischen Präparate von Patienten der Klinik und
Poliklinik für Urologie der Ernst Moritz Arndt Universität Greifswald sowie der Klinik für
Urologie des Medizinischen Zentrums der Landeshauptstadt Schwerin untersucht. Insgesamt
konnten die Präparate von 35 Patienten ausgewertet werden, 13 Patienten im Zeitraum von
1991 – 2002 aus der Urologischen Klinik der Universität Greifswald und 22 Patienten im
Zeitraum von 1995 – 2002 aus der Urologischen Klinik Schwerin. Das Alter der Erkrankten
lag bei Diagnosestellung zwischen 35 und 89 Jahren im mittel bei 65,1 Jahren. Das
prätherapeutische Staging und die Primärtherapie wurden von den oben genannten Kliniken
durchgeführt, ebenso weitere sekundäre therapeutische Maßnahmen mit Ausnahme einer
Radiatio.
2.1.2. Therapie
Die Diagnose konnte bei 6 Patienten mittels Probeexcision und bei 10 Patienten durch
Circumcision
gestellt werden.
In 19 Fällen wurde die Indikation zu einer operativen
Therapie aufgrund des makroskopischen Befundes gesehen. Das operativ therapeutische
Vorgehen umfaßte die lokale Laserapplikation bei 6 Patienten, wobei bei einigen Erkrankten
bis zu 5 Sitzungen im Verlauf bis zur Heilung bzw. bis zum Progreß erfolgten. Insgesamt 5
Patienten wurden lokal durch eine Zirkumzision ausreichend behandelt. Weitaus am
häufigsten
erfolgte
eine
operative
Sanierung
des
Lokalbefundes
durch
eine
Penisteilamputation (16mal). Die klassische Penisamputation mit Anlage einer Boutonniere
mußte in 6 Fällen erfolgen.
Im weiteren Verlauf wurden bei insgesamt 15 Patienten inguinale Lymphknoten exstirpiert,
dies geschah in allen Fällen metachron, bei 9 Erkrankten fand die Lymphadenektomie
explorativ statt, die anderen 6 Lymphadenektomien wurden aufgrund palpatorisch
vergrößerter Lymphknoten durchgeführt. Wegen eines progredienten Tumorleidens wurden
bei 2 Patienten Metastasen im Bereich der Haut lokal exzidiert.
Material und Methoden
25
Als adjuvante Therapieverfahren kamen bei metastasiertem Tumor die Strahlentherapie sowie
eine Polychemotherapie zur Anwendung. Im Rahmen einer Radiatio wurden 6 Patienten
palliativ
beidseits
inguinal
und
iliacal
behandelt,
5
Karzinompatienten
wurden
chemotherapiert. Hierbei kamen unterschiedliche Therapieschemata zum Tragen. Zweimal
wurde das BMP – Schema (Bleomycin, Methotrexat, Cisplatin) appliziert, 1 Patient wurde
mit Paclitaxel und Carboplatin therapiert. Bei weiteren 2 Behandlungen kam eine Bleomycin
– Monotherapie zur Anwendung.
2.1.3. TNM – Klassifikation
Alle Peniskarzinome wurden nach den Vorgaben der WHO im TNM – Schema von 2002
klassifiziert, wobei das T – Stadium in allen Fällen pathologisch festgelegt werden konnte,
während das N – bzw. M – Stadium pathologisch oder klinisch durch Palpation,
konventionelle Röntgenuntersuchung, Sonografie sowie Computertomografie bestimmt
wurde.
Histopathologisch ließen sich 4 Patienten mit einem Carcinoma in situ verifizieren, weiterhin
zeigten 4 Kranke ein begleitendes Carcinoma in situ. Als ein Stadium T1 wurden 12 Tumore
verifiziert. Eine tiefe Invasion ließ sich bei 8 Karzinomen im Stadium T2, bei 8 T3 – Tumoren
sowie in einem T4 – Peniskarzinom sichern. In einem Fall wurde ein verruköses Karzinom
diagnostiziert. In einem Fall eines Carcinoma in situ zeigte sich im auswertbaren Präparat
lediglich eine Dysplasie.
Von den 15 Lymphadenektomiepatienten zeigten 6 Präparate keine Metastasen, 4
Karzinomkranke hatten eine Metastase in einem inguinalen Lymphknoten, 2 Patienten zeigten
Filiae in mehreren oberflächlichen Leistenlymphknoten und bei 3 Erkrankten wurde
pathologisch eine N3 – Metastasierung diagnostiziert.
Auf eine Ausbreitungsdiagnostik wurde bei 11 Patienten verzichtet und diese somit als Mx
klassifiziert. Bei 18 Karzinompatienten zeigte sich klinisch keine fassbare Metastasierung. Im
Rahmen des Stagings konnte bei 6 Fällen röntgenologisch bzw. computertomografisch eine
ossäre bzw. pulmonale Filialisierung nachgewiesen werden. Nach Excision von
Hautmetastasen konnten 2 Tumorkranke pathologisch als M1 eruiert werden.
Material und Methoden
26
2.1.5. Histologie und Grading
Alle untersuchten histologischen Schnittpräparate wurden nach speziellen Kriterien
ausgesucht, so dass eine Beurteilung des Tumors selbst, der Karzinomgrenzen sowie des
umliegenden normalen Gewebes möglich war. Alle so ausgewählten Schnitte untersuchte ein
Pathologe nochmals mikroskopisch, um die o.g. qualitativen Merkmale sicherzustellen.
Insgesamt gelangten 4 Carcinomata in situ zur Untersuchung, wobei ein Befund als basaloid
imponierte, bei 4 weiteren Schnitten zeigte sich ein begleitendes Carcinoma in situ. Ein
Penistumor stellte sich als verruköses oberflächliches Karzinom heraus. Bei den 29 invasiven
Tumoren handelte es sich ausnahmslos um Plattenepithelkarzinome, wovon 24 eine
Verhornung aufwiesen. Mit insgesamt 22 G2 – Tumoren stellten die mäßig differenzierten
Karzinome die größte Gruppe dar, gefolgt von 4 hoch differenzierten und 3 schlecht
differenzierten Peniskarzinomen.
2.1.5. Klinisches Follow up
Das klinische Follow up liegt zwischen 24 Monaten und 12 Jahren, im mittel bei 65,5
Monaten, die Nachbeobachtung erfolgte durch die Kliniken selbst bzw. zum einen Teil durch
eine urologisch onkologische Spezialambulanz, zum anderen durch ambulant tätige Urologen.
Für die vorliegende Arbeit wurde zum einen Einsicht in die Krankenakten der jeweiligen
Patienten in den urologischen Kliniken genommen, zum anderen wurden die nachsorgenden
ambulant tätigen Urologen sowie Hausärzte telefonisch interviewt. Weiterhin wurden die
Ambulanzunterlagen dieser Ärzte zur persönlichen Einsicht zur Verfügung gestellt.
2.1.6. Primäre Aufarbeitung der Präparate
Die primäre Aufarbeitung der Präparate begann noch im OP, wo nach Entnahme des
jeweiligen Gewebes eine Fixierung in Formaldehyd erfolgte. Nach Transport in das jeweilige
pathologische Institut wurden dort die Gewebeproben entsprechend den Empfehlungen für die
Aufarbeitung von Tumorpräparaten geschnitten und in Paraffin eingebettet. Nach Aufbringen
der Paraffinschnitte auf Objektträger mit anschließender HE – bzw. Spezialfärbung erfolgte
die mikroskopische histopathologische Begutachtung. Anschließend wurde das Material in
Form der HE – Schnittpräparate sowie Paraffinblöcke in den Archiven der einzelnen Institute
gelagert.
Material und Methoden
Tabelle 2 Patientendaten mit Tumorstadium und Therapie
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Patient Alter OP-Jahr
TNM
Grading Therapie
Cis
ZR
51
1998 pTcis
0
CC, Laser
BW
56
1995 pTcis
0
4xLaser+PE
KE
55
1995 Dysplasie/Cis
0
Exzision
TF
61
2000 pTcis
0
Exzision
WB
35
2000 pTcispN0
0
5xLaser, Teilamp., LA
MH
59
1998 pTapN0 M0
1
CC, LA
N0M0
SE
67
1997 pT1 N0 M0
2
CC, Laser
WO
44
2001 pT1 N0 Mx
2
Exzision, CC
RG
59
1993 pT1 N0 Mx
3
Exzision, CC
SJ
59
1999 pT1 N0 M0
2
Exzision, LA
LG
69
1998 pT1pN0 M0
2
Teilamp., LA
DR
68
1995 pT2 N0 M0
2
Teilamp.
KD
55
2001 pT2 N0 M0
2
Exzision
BG
61
2001 pT1 N0 M0
1
CC
DH
68
1998 pT3pN0 M0
1
Penisamp., LA
KK
76
2001 pT3pN0 M0
2
Penisamp., Sentinel-LA
BH
66
1991 pT1pN0 Mx
1
Teilamp., Penisamp. (Rezidiv)
WE
87
1996 pT3 N0 Mx
3
Teilamp.
SE
78
1996 pT2 N0 M0
2
CC, Laser
AK
87
1998 pT3 N0 Mx
2
Penisteilamputation
N+M0
HG
69
2001 pT1pN3 Mx
2
CC, Teilamp., LA
RH
62
1999 pT1pN2 M0
2
CC, Teilamp., LA
SW
76
1997 pT1 N1 M0
2
PE+Laser, Radiatio
SE
56
1993 pT1pN1 Mx
2
Teilamp., LA, CTX
BK
77
1996 pT2pN1 M0
2
Teilamp., LA, Radiatio
BH
58
1993 pT2pN3 Mx
2
Teilamp., LA, CTX
BE
66
1997 pT3pN2 M0
2
Penisamp., LA
UW
89
1997 pT3 N2 Mx
2
Penisamp., Radiatio
KK
88
1998 pT3 N2 Mx
1
Teilamp., Radiatio
JE
78
2001 pT4 N2 Mx
2
Penisamp., Radiatio
N+M+
KE
40
1997 pT1pN3 M1
3
CC+TM-Exzision, LA, CTX
SG
58
1998 pT1pN1 M1
2
Teilamp., LA, CTX
MU
63
1996 pT2pN1 M1
2
Teilamp., LA, CTX
FK
78
1999 pT2 N2 M1
2
Teilamp., Radiatio
OE
60
1995 pT3 N3 M1
2
Teilamp., Radiatio
CC=Zirkumzision, PE=Probeexzision, LA=Lymphadenektomie,
Teilamp.=Penisteilamputation, Penisamp.=Penisamputation, CTX=Chemotherapie
27
Material und Methoden
28
2.2. Material
2.2.1. Chemiekalien HE – Färbung
Eosin
Ethanol
Hämalaun (n. Meyer)
Baker
Roth
Baker
2.2.2. Fertigreaktionssystem (Kit)
Biocare 4 plusTM Universal Immunoperoxidase Detection System
Biocarta
2.2.3. Antikörper
Ki 67
Tenascin
Fibronectin
monoclonal rabbit anti human antigen
monoclonal human clone BC 24
polyclonal anti human rabbit antigen
Dako
Sigma
Sigma
2.2.4. Kunststoff – und Glasmaterialien
Objektträger, Deckgläser,
Objektträgerständer,
Reaktionsgefäße (1,5 ml; 2,0 ml)
Reaktionsgefäße (10 ml; 20 ml)
Pipettenspitzen
Greiner
Falcon
Falcon
Falcon
Falcon
2.2.5. Häufig verwendete Lösungen und Chemikalien
Aqua dest.
Neoclear
Neomount
Xylene
Merck
Merck
Baker
PBS – Puffer (1000 ml Aqua dest.; 8,0g NaCl
0,2g KH2 PO4; 2,9g Na2HPO4 x12 H2O; 0,2g KCl)
Roth
Merck,
Sigma
Citrat – Puffer (225 ml Aqua dest.; 4,5 ml 0,1 M Zitronensäure;
20,5 ml 0,1 M Natriumcitrat)
Merck
Roth
2.2.6 Geräte und Apparaturen
Leica / Jung Histoslide 2000
Mikroskop Jenamed 2
Digitales Fotoverarbeitungssystem Olympus
Mikrowellenkochgerät
Pipetten (1 µl bis 2ml)
feuchte Platte
PAP Pen
Material und Methoden
29
2.2.7. Verwendete Software
Bei der Erstellung dieser Arbeit kamen folgende Programme zur Anwendung: „Word für
Windows“ (Microsoft), „Excel für Windows“ (Microsoft), „Power Point für Windows“
(Microsoft) und im Rahmen der digitalen Bilddokumentation das Programm „Analysis“
(Olympus). Weiterhin wurden für die Erstellung und Bearbeitung von Bildern die Programme
„HP Precisionscan Pro3.1“ und „HP Fotodruck“ (Hewlett Packard) verwendet. Die
statistischen Analysen erfolgten mit dem Programm „ SPSS 12.0 für Windows“ (SPSS Inc.).
2.3. Methoden
2.3.1. Präparation der Paraffinschnitte
Die in den einzelnen pathologischen Instituten nach o.g. Kriterien ausgewählten
Paraffinblöcke wurden mit einem Histotom bei Raumtemperatur geschnitten und auf
Objektträger der
Firma Greiner aufgebracht. Anschließend erfolgte eine Trocknung der
Präparate ebenfalls bei Raumtemperatur für 24 Stunden, um eine optimale Fixierung der
Schnitte auf dem Objektträger zu gewährleisten.
2.3.2. Entparaffinierung
Bei der Entparaffinierung der histologischen Präparate wurde nach allgemein gültigem
Standard verfahren. Zunächst wurden hierzu die Objektträger für jeweils 10 min. in 2 Xylene
– Bäder ( Baker ) eingebracht, dann erfolgte ein Umschichten der Objekte für 2 mal 5 min. in
100 % Ethanol. Im weiteren Verlauf konnten die Präparate dann für ebenfalls je 5 min. in
Ethanollösung mit absteigender Konzentration ( 90 %; 80 %; 70 %; 50 % ) eingebracht
werden. Abschließend erfolgte eine zweimalige Spülung mit Aqua dest..
2.3.3. HE – Färbung
Nach abgeschlossener Entparaffinierung der Schnitte konnte die Färbung, zunächst für 5 min.
in Hämalaun (n. Meyer) beginnen. Anschließend ausgiebige Spülung der Objektträger mit
Aqua dest. und dann Inkubation von Eosin (Baker) wiederum für 5 min.. Nach zweimaligem
Einbringen in 96 % Ethanol sowie einmal in 100 % Ethanol konnten die Proben mit zweimal
Material und Methoden
30
Neoclear (Merck) für je 10 min. fixiert werden. Abschließend wurden die Präparate mit
Neomount (Merck) eingedeckelt.
2.3.4. Antikörperverdünnungen
Um eine möglichst optimale Färbung und damit Auswertbarkeit der immunhistochemischen
Schnitte zu erzielen, stand am Beginn der Arbeit das Anfertigen von verschiedenen
Präparationen mit unterschiedlich verdünnten Antikörperkonzentrationen. Bei diesen wurde
vom Procedere identisch wie unten beschrieben verfahren. Für die Antikörper Tenascin und
Fibronectin wurden Verdünnungen zwischen 1:400 und 1:8000 gewählt, als optimal hat sich
eine Verdünnung der Antikörper von 1:4000 gezeigt. Für Ki67 wurde dies ebenfalls mit
Verdünnungen für den Antikörper zwischen 1:400 und 1:4000 durchgeführt, hier hat sich die
Antikörperverdünnung von 1:1600 als geeignet herausgestellt.
2.3.5. Färbung mit Antikörpern monoklonal / polyklonal
Bei dem verwendeten Kit (Biocarta) handelt es sich um ein für monoklonale wie für
polyklonale Antikörper universell einsetzbares Reaktionssystem, deshalb konnten alle
verwendeten Antikörper mit demselben
Kit immunhistochemisch untersucht werden.
Während des Verfahrens gingen wir nach den Empfehlungen der Herstellerfirma vor, es
wurden vorwiegend die Fertigreagenzien des Kits verwendet. Vor Beginn der eigentlichen
immunhistochemischen Färbung wurden die Objekte, wie bereits oben beschrieben,
entparaffiniert. Das weitere Procedere fand dann auf einer feuchten Platte statt, um ein
Austrocknen der Schnitte strikt zu vermeiden. Nach der Entparaffinierung Spülung des
Untersuchungsmaterials 2 mal für je 5 min. in Aqua dest., dann Auflegen der Objektträger auf
die feuchte Platte und Markierung der Schnitte mit einem PAP Pen. Als erster Schritt wurden
nun pro Objekt je 4 Tropfen PEROXIDAZED I für 5 min. inkubiert, um die endogene
Peroxidaseaktivität zu neutralisieren. Anschließend Waschen der Schnitte je 5 min. in
Leitungswasser und Aqua dest., dann konnten die Präparate in einen zum Kochen geeigneten
Objektträger verbracht werden. Nach Auffüllen des Objektträgers mit BORGDECLOAKER
erfolgte nun das Kochen der Präparate für 20 min. (wobei darauf geachtet wurde, ein
Austrocknen durch Nachgeben von BORGDECLOAKER zu vermeiden). Alternativ zum
DECLOAKER fand eine Citrat – Pufferlösung Anwendung. Nach dem Kochprozeß wurde ein
vollständiges Abkühlen des Materials abgewartet, dann zunächst Waschen der Objekte 2mal
Material und Methoden
31
je 5 min. mit Leitungswasser und Aqua dest. sowie nachfolgend Stabilisierung des
Reaktionsmillieus durch PBS – Puffer für wiederum 5 min.. Zur Verringerung von störenden
Hintergrundverunreinigungen wurden nun für 5 min. Einwirkzeit BackgroundSNIPER bzw.
BackgroundERASER
auf
die
Präparate
aufgebracht.
Nach
Herstellen
der
Antikörperverdünnungen (Ki 67 1:1600; Tenascin und Fibronectin 1:4000) und Pipettieren
auf die Objektträger konnten diese im Kühlschrank bei 4° C für 24 Stunden inkubiert werden.
Am nächsten Tag konnte dann nach Entfernen der Antikörperverdünnungen durch
zweimalige Spülung mit PBS – Puffer für je 10 min. ein sekundärer Antikörper als
UNIVERSAL LINK für ebenfalls 10 min. aufgebracht werden. Nach erneuter zweimaliger
Spülung mit PBS – Puffer wurde nun die Reaktionsperoxidase STREPTAVIDIN – HRP in
Form von ca. je 4 Tropfen auf die Objektträger appliziert und anschließend wurden 10 min.
Einwirkzeit abgewartet. Im weiteren Verlauf erfolgte die nochmalige Waschung in PBS –
Puffer zweimal für je 10 min., während dieser Zeit konnte die Farbstoffverdünnung nach der
Vorschrift des Herstellers angefertigt werden. Hierzu wurde je 1 Tropfen DAB – Chromogen
Substrat pro ml Substratpuffer verwendet, anschließend wurde die Lösung auf die Präparate
pipettiert und 5 min. abgewartet, hierdurch wurde bei Vorhandensein der zu untersuchenden
Antigene eine Braunfärbung erzielt. Nach anschließender 10 minütiger Spülung mit
destilliertem Wasser Vervollständigung des Färbeprozesses, indem die Histologien für 1
Minute in Hämalaun (n. Meyer) eingebracht wurden. Abschließend ausgiebige Spülung mit
Leitungswasser und einmalig mit Aqua dest. für 10 Minuten.
Als letzte Schritte der immunhistochemischen Untersuchung erfolgte nun die Dehydratation
der Schnitte mittels 100 % Ethanol zweimal für jeweils 10 min., anschließend wiederum
zweimaliges Einbringen in Neoclear (Merck) je 5 Minuten und letztlich Eindeckeln der
histologischen Schnitte mit Neomount (Merck), wie bereits für die HE- Färbung beschrieben.
Bei allen Färbevorgängen wurde simultan immer eine Negativkontrolle angefertigt, welche
mit demselben o.g. Procedere aber ohne Aufbringen eines Antikörpers gefärbt wurde. So
gelang es, falsch positive Präparationen zu vermeiden.
2.3.6. Lichtmikroskopische Untersuchung
Die lichtmikroskopische Auswertung führten wir ohne vorherige Kenntnis der TNM –
Klassifikation durch. Alle Präparate wurden zusätzlich von zwei entsprechend erfahrenen
unabhängigen Untersuchern nachbegutachtet. Besondere Beachtung wurde auf verschiedene
Bereiche in den jeweiligen Schnitten gelegt, Färbung im Tumor selbst, Darstellung des dem
Material und Methoden
32
Tumor angrenzenden Bereichs sowie Färbung im Gesunden. Präparate ohne aussagekräftiges
normales Gewebeareal wurden auch hier noch von der Arbeit ausgenommen. Als besonders
repräsentativ erscheinende immunhistologische Färbungen wurden fotografisch dokumentiert.
Für die histologische Färbung von Ki67 zählten wir zwei verschiedene Tumorareale zu je 100
Zellen aus, bildeten den Mittelwert und geben diesen als Prozent Ki67 – positver Zellen im
Tumor an. Dieses Procedere wurde auch im gesunden Abschnitt angewandt. Als Ki67 –
negativ werden Bereiche ohne Nachweis Ki67 – positiver Zellen bezeichnet, als schwach
positiv Areale mit einer Zellzahl zwischen 1 % und 15 %(Labeling – Index, Label,
Expression), als positiv eine Zahl Ki67 – positiver Zellen zwischen 16 % und 60 % und als
stark positive Bezirke werden Abschnitte mit einer Zahl Ki67 exprimierender Zellen über 60
% klassifiziert.
Da es sich bei den immunhistochemischen Untersuchungen von Tenascin und Fibronectin um
fibrilläre Strukturen handelt, wurde für diese eine semiquantitative Beurteilung bevorzugt.
Hierbei wurden ebenfalls die Begriffe negativ für eine fehlende Darstellung, schwach positiv
für eine rudimentäre Anfärbung, positiv bei guter Farbintensität sowie stark positiv bei
ausgeprägter Intensität verwendet. Auch hier wurden die oben genannten Schnittbereiche
immer einzeln beurteilt.
2.3.7. Kontrolle negativer Präparate
Um falsch negative Schnittpräparate zu vermeiden, wurden nach der lichtmikroskopischen
Auswertung
negative
Antikörperkonzentration
immunhistologische
untersucht.
Färbungen
Hierbei
fanden
erneut
dann
mit
einer
höheren
Präparationen
mit
Antikörperverdünnungen für Tenascin von 1:2000, für Fibronectin von ebenfalls 1:2000 und
für Ki 67 von 1:800 nach unter 2.3.5. beschriebenem Vorgehen statt. Erst wenn auch diese
Schnitte keine Einfärbung für die entsprechenden Antikörper aufwiesen, wurden sie als
negativ ausgewertet.
Material und Methoden
33
2.3.8. Statistische Auswertung
Die Ergebnisse werden in den Darstellungen des Abschnittes 3 grafisch veranschaulicht. Als
beeinflussende Faktoren wurden das Tumorstadium und damit die Infiltrationstiefe, das
Tumorgrading, die histologische Subklassifizierung sowie das Vorhandensein von
pathologisch erfassten Metastasen untersucht. Die statistischen Angaben sind deskriptiv, da es
sich um ein relativ kleines Patientenkollektiv handelt.
Zur Auswertung der Messungen erfolgte die Bestimmung des arithmetischen Mittels sowie
der Standardabweichung. Die univariate Analyse der immunhistochemischen Labeling –
Indices für die einzelnen Antikörper erfolgte für nichtmetastasierte vs. metastasierte Tumoren
mit dem 2 – tail unpaired t Test mit Welch correction. Die Evaluation der Korrelation
zwischen den immunhistochemischen Daten und der Lymphknotenmetastasierung wurde
mittels Chi – Quadrat Test durchgeführt. Die Überlebensdaten wurden mittels Kaplan – Meier
Methode und log rank Test analysiert. Ein p – Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant
gewertet.
Ergebnisse
34
3. Ergebnisse
3.1. Überlebensdaten
Insgesamt wurden für diese Arbeit 35 Patienten aus 2 urologischen Kliniken evaluiert,
hiervon 13 Patienten im Zeitraum 1991 – 2002 aus der Urologischen Klinik der Universität
Greifswald und 22 Patienten im Zeitraum 1995 – 2002 aus der Urologischen Klinik des
Medizinischen Zentrums der Landeshauptstadt Schwerin. Bei Diagnosestellung lag das
durchschnittliche Alter der Erkrankten bei 65,1 Jahren (35 – 89 Jahre), das klinische Follow
up erfolgte zwischen 24 Monaten und 12 Jahren, im Durchschnitt 65,5 Monate.
Die Diagnose des Primärtumors wurde bei 6 Tumorerkrankungen mittels Probeexzision
gesichert, bei weiteren 10 Patienten wurde die Diagnose durch eine Zirkumzision festgelegt
und bei 19 Patienten wurde die Indikation zum operativen Vorgehen aufgrund des
makroskopischen Befundes gestellt. In allen Fällen wurde der Primärtumor operativ saniert,
hierbei wurde bei 6 Patienten eine lokale Laserapplikation gewählt, wobei teilweise bis zu 5
Behandlungen bis zu einer Heilung bzw. bis zum Progress des Tumors durchgeführt wurden.
Insgesamt 3 Patienten wurden mittels lokaler Tumorexzision therapiert. Weitere 5 Patienten
konnten durch eine Zirkumzision ausreichend behandelt werden. Weitaus am häufigsten
wurde jedoch eine Penisteilamputation (bei 16 Kranken) zur Therapie des Lokalbefundes
durchgeführt. Wegen der ausgedehnten Tumorbefunde war in 6 Fällen die klassische
Penisamputation mit Anlage einer Boutonniere notwendig.
Histopathologisch fanden sich eigenständig 4 Carcinomata in situ, 1 Präparat wurde in der
nachträglichen Begutachtung als Dysplasie verifiziert, 1 Befund imponierte als basaloider
Tumor. Weiterhin konnten 4 begleitende in situ Karzinome und 1 verruköses Karzinom
untersucht werden. Von den 29 invasiven Karzinomen konnten 12 als T1 – Tumore
klassifiziert werden, bei den tiefer invasiven Karzinomen zeigten sich jeweils 8 T2 – bzw. T3 –
Befunde. Bei einem Tumor handelte es sich um ein ausgedehntes T4 – Karzinom. Das
Grading betreffend wurden 4 hoch differenzierte Karzinome gefolgt von 22 G2 – Tumoren
und 3 schlecht differenzierten Karzinomen gefunden.
Bei insgesamt 15 Patienten wurde im Verlauf der Behandlung eine Lymphadenektomie
durchgeführt, dabei wurden 9 Kranke ca. 6 Wochen nach Primärtumor - OP
lymphadenektomiert. Bei 6 Patienten schloss sich die Lymphadenektomie erst verzögert nach
Auftreten einer Lymphknotenschwellung an. Von den operierten Patienten zeigten 6
Operationspräparate keine Metastasen, 4mal wurde eine Metastase in einem oberflächlichen
Ergebnisse
35
inguinalen Lymphknoten evaluiert, bei 2 Karzinompatienten waren mehrere inguinale
Lymphknoten tumorinfiltriert und bei 3 Patienten wurde pathologisch eine pelvine
lymphogene Filialisierung diagnostiziert. Demgegenüber wurde bei 14 Patienten mit einem
invasiven Tumor auf eine Entfernung von Lymphknoten ganz verzichtet, hiervon wurden aber
nur 8 Kranke als negativ eruiert. Bei einem Patienten wurde klinisch das Stadium als N1
festgelegt, weitere 4 Tumorpatienten zeigten ein klinisches Stadium N2 und bei einem
Erkrankten wurde ein klinisches Lymphknotenstadium N3 gefunden.
Zum Diagnosezeitpunkt wurde bei 11 Patienten auf eine weiterführende Diagnostik zur
Metastasensuche verzichtet und diese als Mx klassifiziert. Bei 18 Erkrankungen wurde
klinisch keine fassbare Fernmetastasierung gefunden. Weitere 5 Tumorpatienten zeigten
vorwiegend pulmonal und ossär eine Metastasierung. Bei zwei dieser Patienten konnte dann
eine Filialisierung auch pathologisch durch die Exzision von Hautmetastasen bestätigt
werden. Zusammenfassend siehe hierzu auch Tabelle 3.1.1.
Als adjuvante Therapieverfahren kamen eine Strahlentherapie sowie eine Chemotherapie zur
Anwendung, bei 6 Patienten erfolgte eine Radiatio von inguinalen sowie pelvinen
Lymphknoten, insgesamt 5 Tumorpatienten wurden mit einer Chemotherapie behandelt.
Hierbei wurde in 2 Fällen nach dem BMP – Schema (Bleomycin, Methotrexat, Cisplatin)
therapiert, wobei einmal 6 Serien und einmal 8 Serien verabreicht wurden. Weitere 2
Tumorkranke erhielten eine Monochemotherapie mit 6 bzw. 3 Kursen Bleomycin und ein
Patient erhielt 4 Serien einer Taxol/Carboplatin – Polychemotherapie.
Tabelle 3.1.1. Tumorstadium/Tumorgrading
T-Stadium
G1
G2
G3
T1 – Tumore
T2 – Tumore
T3/4 -Tumore
1
1
2
9
7
6
2
0
1
N0
N+
Mx/0
M+
6
4
4
6
4
5
11
5
8
2
2
1
Die Analyse der Überlebensdaten erfolgte retrospektiv anhand des eigenen Datenmaterials
sowie durch Telefoninterview bzw. Einsicht in Krankenakten der nachsorgenden Urologen
bzw. Hausärzte. Von den 35 Patienten wurden insgesamt 33 ausgewertet, es zeigte sich für
alle Erkrankungen ein medianes Überleben von 50,4 Monaten. Die Überlebensdaten für jeden
einzelnen Patienten sind in Tabelle 3.1.2. angeführt. Zur genaueren Analyse des Überlebens
wurden die Patienten in Subgruppen unterteilt, hierbei zeigte sich für die Gruppe der
Carcinomata in situ und T1N0M0 – Karzinome ein medianes Überleben von 52,5 Monaten.
Für die Gruppe der T2N0M0 – Tumorpatienten konnte das Überleben mit einem mittleren
Ergebnisse
36
Wert von 70,9 Monaten bestimmt werden. Weiterhin fand sich ein medianes Überleben von
30,7 Monaten für die Gruppe der T3/4N0M0 – Tumore.
Es zeigten sich kein signifikanter Zusammenhang zwischen T – Stadium und
Lymphknotenmetastasierung, T – Stadium und krankheitsspezifischem Überleben sowie
ebenfalls
kein
signifikanter
Zusammenhang
zwischen
Tumorgrading
und
Lymphknotenmetastasierung sowie tumorspezifischem Überleben. Unabhängig vom T –
Stadium konnte für nicht lymphknotenmetastasierte Patienten ein mittleres Überleben von
55,4 Monaten und für Kranke mit Lymphknotenmetastasen unabhängig vom T – Stadium ein
Überleben median von 44,5 Monaten evaluiert werden. Hier zeigt sich ein signifikanter
Unterschied der Überlebensraten mit deutlichem Vorteil für Karzinompatienten ohne
Lymphknotenmetastasen (p=0,010). Alle angeführten Daten wurden in der Tabelle 3.1.3.
noch einmal zusammengefasst.
Tabelle 3.1.2 Überlebensdaten der einzelnen Patienten in Monaten
Nr. Name Überleben ohne TM Überleben mit TM Tod tumorbedingt Tod andere Ursache
1 DH
60
2 UW
2
3 SE
33
4 BE
78
5 SE
76
6 ZR
73
7 RH
47
8 WO
36
9 HG
36
10 FK
10
11 WB
47
12 BH
105
13 OE
6
14 BKH
96
15 WE
43
16 DR
105
17 KK
31
18 MH
73
19 KE
8
20 SW
83
21 SG
23
22 JE
12
23 MU
101
24 SJ
63
25 LG
17
26 BH
122
27 KE
123
28 KD
29
29 TF
40
30 SE
13
31 RG
30
32 AK
16
33 KK
28
Ergebnisse
37
Tabelle 3.1.3 durchschnittliche Überlebenszeiten der einzelnen Subgruppen in Monaten
alle
Cis + T1
T2
T3/4
N0
N+
M0
M+
50,4
52,5
70,9
30,7
55,4
44,5
54,2
29,6
3.2. Expression von Ki67, Tenascin und Fibronectin
3.2.1. Gesundes Gewebe
3.2.1.1. Ki67
Da es sich beim Ki67 um einen Proliferationsmarker handelt, kam es im gesunden
Plattenepithel zu einer Expression allerdings in geringem Maße in der basalen Epithelschicht.
Dieses Verhalten wurde auch als Kontrolle für die Qualität der immmunhistochmischen
Färbung mit herangezogen. Weiterhin zeigte sich innerhalb lymphozytärer Infiltrate eine
Expression von Ki67. Mit Auftreten von dysplastischen Epithelarealen war häufig auch eine
Zunahme der Ki67 – Expression zu verzeichnen, hierbei wurde aber eine Darstellung von
10% an der Gesamtpopulation nicht überschritten. Zwei typische Befunde hierzu sind in den
Abbildungen 3.2.1.1. und 3.2.1.2. dargestellt.
3.2.1.2. Tenascin
Tenascin spielt während der embryonalen Entwicklung als Promotor der Zellmigration sowie
Gewebedifferenzierung eine entscheidende Rolle und kommt beim adulten Gewebe nur
rudimentär vor, im gesunden Epithel des Penis konnte Tenascin als schmale subepitheliale
scharf begrenzte Membran mit intensiver Färbung nachgewiesen werden. Weiterhin war
teilweise eine granuläre Färbung für Tenascin in der basalen Zellschicht des Epithels
feststellbar. Bei dysplastisch bzw. entzündlich veränderten Epithelbereichen zeigte sich eine
Verbreiterung der ansonsten schmalen Tenascinmembran. Innerhalb lymphozytärer Infiltrate
bei entzündlichen Veränderungen war eine verminderte Expression von Tenascin
nachweisbar. Außer als schmale Membran subepithelial fand sich Tenascin auch noch im
Bereich von Gefäßwänden, ebenfalls als sehr schmale intensiv gefärbte Membran. Hierfür
wurden zwei Beispiele in den Abbildungen 3.2.1.3. und 3.2.1.4. dargestellt.
Ergebnisse
38
3.2.1.3. Fibronectin
Im normalen Penisgewebe zeigte sich ein ubiquitäres Vorkommen von Fibronectin
im
subepithelialen Bindegewebe mit diffuser Verteilung der Filamente. Auffällig zeigte sich auch
hier eine verminderte Darstellung des Fibronectin im Bereich lymphozytärer Infiltrationen bei
entzündlich veränderten Epithelarealen. In der Abbildung 3.2.1.5. ist ein Beispiel dargestellt.
3.2.2. Ki67 – Expression im Tumorgewebe
3.2.2.1. Carcinoma in situ
Insgesamt wurden 8 Carcinomata in situ untersucht, 4 der Karzinome waren hierbei mit
invasiven Penistumoren assoziiert. Weiterhin wurden ein verruköses Karzinom sowie die
bereits oben beschriebene Dysplasie mit untersucht. Zur Expression der einzelnen Karzinome
siehe Tabelle 3.2.2.1.
Tabelle 3.2.2.1. Ki67 – Expression in Carcinomata in situ
Patient
Alter
OP - Jahr
TNM
Grading
Ki67 in %
ZR
WB
BW
TF
RH
SE
SE
FK
MH
KE
51
35
56
61
62
67
78
78
59
55
1998
2000
1995
2000
1999
1997
1997
1999
1998
1995
Cis
Cis
Cis
Cis basaloid
Cis+pT1 pN2 cM0
Cis+pT1 cN0 cM0
Cis+pT2 cN0 cM0
Cis+pT2 cN2 cM1
pTa pN0cM0
Dysplasie
0
0
0
0
2
2
2
2
1
0
25
50
41
70
74
70
20
26
10
8
Alle in situ Karzinome zeigten eine vermehrte Expression von Ki67, 5 Karzinome zeigten
einen intermediären Ki67 – Labeling – Index. 3 Carcinomata in situ fielen durch eine starke
Erhöhung des Ki67 – Label auf, siehe hierzu auch die Abbildung 3.2.2.1. Im verrukösen
Karzinom und Präparat der Dysplasie konnte eine schwache Ki67 – Expression nachgewiesen
werden. Für die gesamte Gruppe wurde ein mittlerer Ki67 – Label von 42,9% errechnet.
Ergebnisse
39
3.2.2.2. T1N0M0 - Karzinome
Zur immunhistochemischen Färbung für Ki67 in nicht metastasierten T1 – Karzinomen siehe
auch Tabelle 3.2.2.2. Es konnten hierzu 6 Patienten ausgewertet werden, wobei 5 Kranke
Ki67 intermediär exprimierten und ein Patient einen schwachen Ki67 – Labeling - Index auch
in den Kontrollfärbungen aufwies. Das Präparat dieses Patienten stammt aus dem Jahr 1993.
Zu den Färbungen dieser Patientengruppe siehe Abbildung 3.2.2.2. Es wurde ein mittlerer
Ki67 – Label von 38,8% für diese Gruppe berechnet.
Tabelle 3.2.2.2. Ki67 – Expression in nicht metastasierten T1 - Tumoren
Patient
Alter
OP - Jahr
TNM
Grading
Ki67 in %
SE
WO
SJ
LG
RG
BG
67
44
59
69
59
61
1997
2001
1999
1998
1993
2001
pT1 cN0 cMx
pT1 cN0 cMx
pT1 cN0 cM0
pT1 pN0 cM0
pT1 cN0 cMx
pT1 cN0 cMx
2
2
2
2
3
1
50
52
30
52
5
44
3.2.2.3. T2 – 4N0M0 - Karzinome
In dieser Gruppe fanden sich insgesamt 8 Patienten, es zeigte sich eine Gleichverteilung
zwischen T2 – und T3 – Erkrankungen. Das Präparat von 1991 sowie ein Patient von 1998
zeigten auch nach Kontrollfärbung einen schwachen Ki67 – Labeling - Index. Es fand sich in
6 Fällen ein mittlerer Ki67 - Label und bei keinem Patienten zeigte sich eine starke Ki67 –
Expression. Zu dieser Patientengruppe siehe auch die exemplarische Abbildung 3.2.2.3.
Tabelle 3.2.2.3. Ki67 – Expression in nicht metastasierten T2 – 4 – Tumoren
Patient
Alter
OP - Datum
TNM
Grading
Ki67 in %
DH
SE
WE
DR
KD
BH
AK
KK
68
78
87
68
55
66
87
76
1998
1996
1996
1995
2001
1991
1998
2001
pT3 pN0 cM0
pT2 cN0 cM0
pT3 cN0 cMx
pT2 cN0 cM0
pT2 cN0 cM0
pT2 pN0 cMx
pT3 cN0 cMx
pT3 pN0 cM0
1
2
3
2
2
1
2
2
11
45
50
30
54
5
47
32
In dieser Gruppe konnte ein mittlerer Ki67 – Wert von 34,2% berechnet werden.
Ergebnisse
40
3.2.2.4. T1 - 4N+M+ - Karzinome
Wie aus Tabelle 3.2.2.4. ersichtlich, konnten insgesamt 15 Patienten mit metastasiertem
Tumor ausgewertet werden, hiervon zeigten alle Präparate eine vermehrte Ki67 – Expression,
8 immunhistochemische Untersuchungen ließen einen intermediären Ki67 – Labeling – Index
erkennen, wobei die 2 Präparate von 1993 vermutlich aufgrund des Alters stark alteriert
waren. Insgesamt 7 gefärbte Präparate konnten als stark positiv für die Ki67 – Expression
gewertet werden. Beispielhaft für diese Patientengruppe sind die Abbildungen 3.2.2.4. und
3.2.2.5., der mittlere Ki67 – Level lag in dieser Gruppe bei 50,3%. Bei Vernachlässigung der
2 wahrscheinlich überalterten Präparate von 1993 erreichte der durchschnittliche Ki67 – Label
in dieser Gruppe 54,2%.
Tabelle 3.2.2.4. Ki67 – Expression in metastasierten Karzinomen
Patient
Alter
OP - Datum
TNM
Grading
Ki67 in %
UW
BE
RH
HG
FK
OE
BK
KK
KE
SW
SG
JE
MU
BH
SE
89
66
62
69
78
60
77
88
40
76
58
78
63
58
56
1997
1997
1999
2001
1999
1995
1996
1998
1997
1997
1998
2001
1996
1993
1993
pT3 cN2 cMx
pT3 pN2 pM1
pT1 pN2 cM0
pT1 pN3 cMx
pT2 cN2 cM1
pT3 cN3 cM1
pT2 pN1 cM0
pT3 cN2 cMx
pT1 pN3 cM1
pT1 cN1 cM0
pT1 pN1 cM1
pT4 cN2 cMx
pT2 pN1 pM1
pT2 pN3 cMx
pT1 pN1 cMx
2
2
2
2
2
2
2
1
3
2
2
2
2
2
2
63
45
75
67
64
74
74
49
72
46
20
34
22
25
25
3.2.2.5. Ki67 in Lymphknoten – bzw. Organmetastasen
Es konnten von insgesamt 9 Tumorpatienten Lymphknoten – bzw. Organmetastasen
untersucht werden, eine Metastase zeigte einen schwache Ki67 – Label und bei 6
immunhistochemischen Untersuchungen konnte ein intermediärer Ki67 – Labeling – Index
evaluiert werden. 2 Metastasenkranke exprimierten Ki67 stark (siehe Tabelle 3.2.2.5.). Der
mittlere Wert für Ki67 liegt bei 44,8%. Zur Veranschaulichung siehe hierzu auch die
Abbildungen 3.2.2.6. und 3.2.2.7.
Ergebnisse
41
Tabelle 3.2.2.5. Ki67 – Expression in Metastasen
Patient
Alter
OP - Datum
BE
RH
HG
BK
KE
SG
MU
BH
SE
66
62
69
77
40
58
63
58
56
1997
1999
2001
1996
1997
1998
1996
1993
1993
TNM
Metastase
Ki67 in %
pT3 pN2 pM1 LK +Haut
pT1 pN2 cM0 LK re. + li.
pT1 pN3 cMx
LK
pT2 pN1 cM0
LK
pT1 pN3 cM1
LK
pT1 pN1 cM1
LK
pT2 pN1 pM1 LK + Haut
pT2 pN3 cMx
LK
pT1 pN1 cMx
LK
47
46
75
66
58
31
18
52
10
LK=Lymphknoten
3.2.2.6. Ki67 – Expression in Abhängigkeit vomTumorgrading
Abhängig vom Tumorgrading ergab sich für die G1 – Karzinome ein mittlerer Wert für den
Ki67 – Level von 27,2%, für die mäßig differenzierten Tumore ein Wert 46,6% und für die
schlecht differenzierten Befunde eine mittlere Ki67 – Expression von 42,3%. Da die G2 –
Karzinome aber mit Abstand die größte Gruppe darstellen, kann hieraus nur ein Trend
hinsichtlich einer stärkeren Expression des Ki67 bei zunehmender Tumorentdifferenzierung
abgeleitet werden.
3.2.3. Untersuchung zu Tumorverhalten und Expression von Ki67
3.2.3.1. Metastasierung
Es zeigte sich in dieser Arbeit ein signifikanter Unterschied in der Ki67 – Expression
zwischen nicht lymphknotenmetastasierten und lymphknotenmetastasierten Peniskarzinomen,
wobei die metastasierten Tumore hier einen deutlich höheren Label erkennen ließen. Der 2 –
tail – t – Test zeigte einen signifikanten Unterschied mit p = 0,04. Im Gegensatz hierzu fand
sich bezüglich der Ki67 – Expression kein Unterschied zwischen fernmetastasierten
Karzinomen und nicht fernmetastasierten Tumoren (s. Tabelle 3.2.3.1.1).
Ergebnisse
42
Tabelle 3.2.3.1.1 Ki67 – Expression metastasierte vs. nicht metastasierte Tumore
Nr.Pat.
N0
N+
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------pT1
12
38.8%
53.2%
pT2- 4 17
34.2%
49.0%
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------29
36.2%
50.4%
(p=0.04)
Nr.Pat.
M0
M+
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------pT1
12
44.6%
46.0%
pT2- 4 17
39,9%
51.2%
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------29
42.2%
48.6%
(p=0.52)
Der Index für die Bewertung der Ki67 Expression wurde wie folgt definiert: Unter 15 % schwach
positive Expression, 16-60 % mittelgradig positive Expression, über 60 % stark positive Expression.
Bei 3 von 29 Patienten fand sich eine schwach positive Ki67 – Expression. Keiner dieser Patienten
zeigte Lymphknotenmetastasen. Es zeigte sich bei 19 Patienten eine mittelgradig positive Expression
von
Ki67.
Alle
7
Patienten
mit
stark
positivem Ki67
–
Labeling
-
Index
wiesen
Lymphknotenmetastasen auf (s. Tabelle 3.2.3.1.2). Für diese 3 definierten Gruppen zeigte sich ein
signifikanter Zusammenhang zwischen Ki67 – Labeling – Index und Lymphknotenmetastasierung
(p=0,004) sowie zwischen Ki67 – Labeling – Index und Fernmetastasierung (p=0,026).
Tabelle 3.2.3.1.2 Ki67 – Expression der invasiven Peniskarzinome
Schwache Ki67-Expression
Intermediäre Ki67-Expression
Starke Ki67-Expression
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------11 Patienten pT1-3 N0 M0
0 Patienten
M0 N0
3 Patienten pT1-3 N0 M0
0 Patienten
N+ M0
5 Patienten pT1-4 N+ M0
4 Patienten pT1-4 N+ M0
3 Patienten pT1-2 N+ M+
3 Patienten pT1-2 N+ M+
3.2.3.2. Tumorprogreß
Insgesamt 3 Patienten zeigten einen Progreß ihrer Erkrankung, hierbei handelte es sich bei 2
Tumorpatienten um lymphogen metastasierte Stadien, bei dem dritten Patienten wurde ein
invasives Karzinom nur lokal exzidiert, auf eine Lymphadenektomie wurde verzichtet. Bei
Ergebnisse
43
diesem Patienten erfolgte dann eine lokale Strahlentherapie bei klinisch unauffälligem
Lymphknotenstatus.
Betrachtet man für diese 3 Kranken die Ki67 – Expression, so zeigt sich eine hohe Expression
im Mittel von 65% Ki67 positiver Zellen im Tumor.
3.2.3.3. Überlebenszeit
Bei einem Cut off für die Ki67 – Expression von 50% zeigt sich im logrank – Test ein
signifikanter Überlebensvorteil für die Gruppe mit niedrigerer Ki67 – Darstellung (p=0,0158).
Siehe hierzu die Abb. 3.2.3.3.
Abb. 3.2.3.3 Überlebenszeitkurven nach Kaplan – Meyer für Ki67 – Labeling - Index
Ki67 –Labeling-Index
1,0
Ki67 <50%
Ki67 >50%
zensiert
zensiert
Überleben
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,00
25,00
50,00
75,00
Monate nach Diagnose
100,00
125,00
Ergebnisse
44
3.2.4. Expression von Tenascin im Tumorgewebe
3.2.4.1. Carcinoma in situ
Tabelle 3.2.4.1. Expression von Tenascin im Carcinoma in situ
Patient Alter OP - Jahr
ZR
WB
BW
TF
RH
SE
SE
FK
MH
KE
51
35
56
61
62
67
78
78
59
55
1998
2000
1995
2000
1999
1997
1997
1999
1998
1995
TNM
Grading
Tenascin
Cis
Cis
Cis
Cis basaloid
Cis+pT1 pN2 cM0
Cis+pT1 cN0 cM0
Cis+pT2 cN0 cM0
Cis+pT2 cN2 cM1
pTa pN0cM0
Dysplasie
0
0
0
0
2
2
2
2
1
0
unter Cis verbreitert mäßig, Zellen frei
unter Cis verbreitert stark, Zellen basal beladen
unter Cis verbreitert mäßig, Zellen basal beladen
unter Cis verbreitert mäßig, Zellen frei
unter Cis verbreitert mäßig, Zellen frei
unter Cis verbreitert stark, Zellen basal beladen
unter Cis verbreitert stark, Zellen basal beladen
unter Cis verbreitert stark, Zellen basal beladen
basal verbreitert stark, in TM - Septen stark
basal etwas verbreitert stark, Zellen frei
Beim Carcinoma in situ ließ sich bei allen Patienten eine mäßig bis starke Färbung für
Tenascin im Bereich der Basalmembran nachweisen, weiterhin war diese in allen Fällen
verbreitert, ein Unterschied zwischen tumorassoziierten Carcinomata in situ und Patienten mit
einem alleinigen Carcinoma in situ fand sich nicht. Auffällig war, dass bei 5 Fällen die
basalen Zellen ebenfalls eine granuläre Färbung aufwiesen, was für eine Produktion des
Proteins in diesen Zellen spricht. Als Beispiele für diese Subgruppe sind die Abbildungen
3.2.4.1. und 3.2.4.2. angeführt.
3.2.4.2. T1N0M0 – Karzinome
Tabelle 3.2.4.2. Tenascin – Expression in T1N0M0 - Tumoren
Patient Alter OP - Jahr
SE
WO
SJ
LG
RG
BG
67
44
59
69
59
61
1997
2001
1999
1998
1993
2001
TNM
Grading
Tenascin
pT1 cN0 cMx
pT1 cN0 cMx
pT1 cN0 cM0
pT1 pN0 cM0
pT1 cN0 cMx
pT1 cN0 cMx
2
2
2
2
3
1
um Invasion stark, im TM-Stroma mäßig
um Invasion stark, im TM-Stroma stark, Zellen+
um Invasion mäßig, im TM-Stroma schwach
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
negativ
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
Bei 5 Patienten dieser Gruppe zeigte sich im Bereich der Invasionsfront eine starke Färbung
für Tenascin, im Tumorstroma fand eine unterschiedliche Expression von Tenascin statt, sie
reichte von schwach positiv bis stark positiv. In Bereichen von lymphozytären Infiltraten war
eine Abnahme der Tenascindarstellung zu verzeichnen. Ein Präparat ließ auch in der
Kontrollfärbung kein Tenascin erkennen. Zu diesen Färbungen siehe auch die Abbildungen
3.2.4.3.und 3.2.4.4. In einem Fall war auch eine granuläre Färbung der randständigen
Ergebnisse
45
Tumorzellen im invasiven Bereich erkennbar, was ebenfalls für eine Bildung des Proteins
durch den Tumor spricht.
3.2.4.3. T2 – 4N0M0 – Karzinome
Auch hier zeigte sich in nahezu allen Präparationen eine mäßig bis starke Tenascinexpression
im Bereich der Invasionsfront sowie im Tumorstroma, eine Verminderung trat hier ebenfalls
in lymphozytären Infiltraten auf. Das wahrscheinlich überalterte Präparat aus dem Jahr 1991
war auch in den Kontrollen nicht auswertbar. Wie in den Abbildungen 3.2.4.5. und 3.2.4.6.
ersichtlich, zeigte sich kein wesentlicher Unterschied zu den T1 – Tumoren.
Tabelle 3.2.4.3. Tenascin in nichtmetastasierten invasiven Tumoren
Patient Alter OP - Datum
DH
SE
WE
DR
KD
BH
AK
KK
68
78
87
68
55
66
87
76
1998
1996
1996
1995
2001
1991
1998
2001
TNM
Grading
pT3 pN0 cM0
pT2 cN0 cM0
pT3 cN0 cMx
pT2 cN0 cM0
pT2 cN0 cM0
pT2 pN0 cMx
pT3 cN0 cMx
pT3 pN0 cM0
1
2
3
2
2
1
2
2
Tenascin
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
um Invasion mäßig, im TM-Stroma mäßig
um Invasion mäßig, im TM-Stroma mäßig
um Invasion mäßig, im TM-Stroma stark
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
negativ
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
3.2.4.4. T 1 - 4 N+M+ - Karzinome
In den Fällen der metastasierten Karzinome zeigt sich ein ähnliches Bild wie bereits zuvor
beschrieben, meist kommt es um die Invasionsfront zu starken Produktion und damit Umbau
der extrazellulären Matrix. Nur 1 Patient fiel hier durch eine schwache Darstellung auf. Das
Tumorstroma reagierte in den meisten untersuchten Präparaten ebenfalls mit einer starken
Tenascin – Färbung, in 6 Fällen war wieder eine granuläre Anfärbung der Tumorzellen im
Invasionsbereich nachweisbar. Zu dieser Gruppe von Patienten sei auf die Abbildungen
3.2.4.7. und 3.2.4.8. verwiesen.
Ergebnisse
46
Tabelle 3.2.4.4. metastasierte Peniskarzinome und Tenascin - Expression
Patient Alter OP-Datum
UW
BE
RH
HG
FK
OE
BK
KK
KE
SW
SG
JE
MU
BH
SE
89
66
62
69
78
60
77
88
40
76
58
78
63
58
56
1997
1997
1999
2001
1999
1995
1996
1998
1997
1997
1998
2001
1996
1993
1993
TNM
Grading
pT3 cN2 cMx
pT3 pN2 pM1
pT1 pN2 cM0
pT1 pN3 cMx
pT2 cN2 cM1
pT3 cN3 cM1
pT2 pN1 cM0
pT3 cN2 cMx
pT1 pN3 cM1
pT1 cN1 cM0
pT1 pN1 cM1
pT4 cN2 cMx
pT2 pN1 pM1
pT2 pN3 cMx
pT1 pN1 cMx
2
2
2
2
2
2
2
1
3
2
2
2
2
2
2
Tenascin
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
um Invasion stark, im TM-Stroma stark, Zellen+
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
um Invasion stark, im TM-Stroma schwach, Zellen+
um Invasion mäßig, im TM-Stroma mäßig
um Invasion schwach, im TM-Stroma schwach
um Invasion stark, im TM-Stroma mäßig
um Invasion stark, im TM-Stroma stark, Zellen+
um Invasion stark, im TM-Stroma stark, Zellen+
um Invasion stark, im TM-Stroma stark, Zellen+
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
um Invasion mäßig, im TM-Stroma mäßig
um Invasion stark, im TM-Stroma stark
um Invasion stark, im TM-Stroma stark, Zellen+
3.2.4.5. Lymphknoten – bzw. Organmetastasen
Bei nahezu allen untersuchten Filiae der Peniskarzinome kam es zu einer starken Expression
von Tenascin um die invasiven
Tumorausläufer, ausgenommen hiervon blieben wieder
Areale mit lymphozytärer Reaktion. Das Stroma der Metastasen konnte meist als mäßig bzw.
stark in seiner Darstellung eingestuft werden. Siehe hierzu auch die Abbildungen 3.2.4.9. und
3.2.4.10. Insgesamt präsentierte sich also ein ähnliches Bild wie in den Primärtumoren selbst.
Tabelle 3.2.4.5. Tenascin – Expression in Metastasen der Peniskarzinome
Patient Alter OP - Datum
BE
RH
HG
BK
KE
SG
MU
BH
SE
66
62
69
77
40
58
63
58
56
1997
1999
2001
1996
1997
1998
1996
1993
1993
TNM
Metastase
pT3 pN2 pM1 LK +Haut
pT1 pN2 cM0 LK re. + li.
pT1 pN3 cMx
LK
pT2 pN1 cM0
Lk
pT1 pN3 cM1
LK
pT1 pN1 cM1
LK
pT2 pN1 pM1 LK + Haut
pT2 pN3 cMx
LK
pT1 pN1 cMx
LK
Tenascin
um
um
um
um
um
um
um
um
um
Metastase stark, im Stroma schwach
Metastase stark, im Stroma schwach
Metastase stark, im Stroma stark
Metastase stark, im Stroma stark
Metastase stark, im Stroma stark
Metastase stark, im Stroma stark, Zellen+
Metastase stark, im Stroma mäßig
Metastase mäßig, im Stroma mäßig
Metastase stark, im Stroma stark
3.2.4.6. Tenascin – Expression in Abhängigkeit vom Tumorgrading
Eine Abhängigkeit zwischen Tumorgrading und der Expression von Tenascin konnte nicht
nachvollzogen werden, da es unabhängig vom Grading in den meisten Fällen zu einem mäßig
Ergebnisse
47
bis starken Nachweis von Tenascin kam. Jeweils ein G1 – und ein G3 – Karzinom zeigten
eine schwache Darstellung für Tenascin.
3.2.5 Untersuchung zu Tumorverhalten und Expression von Tenascin
3.2.5.1. Metastasierung
Ein Einfluss des Proteins Tenascin als Bestandteil der extrazellulären Matrix in malignen
Tumoren auf die Wahrscheinlichkeit einer Metastasenbildung konnte in dieser Untersuchung
nicht nachgewiesen werden. Nichtmetastasierte und bereits metastasierte Tumoren zeigten ein
ähnliches stromales Verhalten hinsichtlich der Tenascin – Färbung, so dass keine Vorhersage
einer eventuellen Metastasierung möglich war. Ebenso war keine Vorhersage einer zu
erwartenden Invasion bei oberflächlichem Karzinom möglich. Auffällig war jedoch in der
statistischen Analyse mittels χ2 – Test der intrazytoplasmatischen Tenascindarstellung im
Bereich der invasiven Tumoranteile (s. Tabelle 3.2.5.1).
Tabelle 3.2.5.1 Expression von Tenascin
Zahl
Zahl Patienten
Patienten mit Metastasen
(%)
TN-C Stroma Expression
schwach
9
5 (55,6 %)
stark
20
10 (50,0 %)
TN-C Expression in
Tumorzellen
nein
22
9 (40,9 %)
ja
7
6 (85,7 %)
TN-C Invasionsfront
schwach
7
3 (42,8 %)
stark
22
12 (54,5 %)
Univariate
Analyse
χ2 = 0,21
p = 0,88
χ2 = 3,88
p = 0,048
χ2 = 0,43
p = 0,51
3.2.5.2. Tumorprogreß
Bei den 3 zurzeit im Tumorprogreß befindlichen Patienten zeigten 2 jeweils eine starke
Expression von Tenascin an der Invasionsfront sowie im Tumorstroma, der andere hingegen
zeigte eine schwache Darstellung von Tenascin in diesen Bereichen. Bei keinem der Patienten
fand sich eine Tenscindarstellung in den Tumorzellen.
Ergebnisse
48
3.2.5.3. Überlebenszeit
Entsprechend des bereits oben angeführten fand sich kein signifikanter Vorteil bezüglich des
mittleren Überlebens für die Gruppe nichtfilialisierter bzw. metastasierter Peniskarzinome
bezüglich der Tenascinexpression.
Wenn man die Überlebensdaten der 3 zurzeit progredienten Tumorpatienten betrachtet (s.
Tabelle 3.1.2), findet sich für den Karzinompatienten mit der schwachen Tenascinexpression
ein deutlich längeres Überleben.
Ergebnisse
49
3.2.6. Expression von Fibronectin im Tumorgewebe
3.2.6.1. Carcinoma in situ
Im subepithelialen Bindegewebe aller Präparate kam es zu einer schwach positiven
Darstellung von Fibronectin, hier waren keine Unterschiede zwischen tumorassoziierten
Carcinomata in situ und alleinigen in situ Karzinomen sichtbar. Wesentliche Unterschiede
zwischen den Karzinomen und dysplastischen Befunden zeigten sich ebenfalls nicht. Es fand
sich lediglich eine Verminderung der Darstellung innerhalb lymphozytärer Infiltrationen. Eine
Zusammenfassung aller Patienten ist in Tabelle 3.2.6.1. sowie in den Abbildungen 3.2.6.1.und
3.2.6.2. dargestellt.
Tabelle 3.2.6.1. Fibronectin und in situ Karzinome
Patient Alter OP - Jahr
ZR
WB
BW
TF
RH
SE
SE
FK
MH
KE
51
35
56
61
62
67
78
78
59
55
1998
2000
1995
2000
1999
1997
1996
1999
1998
1995
TNM
Grading
Cis
Cis
Cis
Cis basaloid
Cis+pT1 pN2 cM0
Cis+pT1 cN0 cM0
Cis+pT2 cN0 cM0
Cis+pT2 cN2 cM1
pTa pN0cM0
Dysplasie
0
0
0
0
2
2
2
2
1
0
Fibronectin
subepitheliales Stroma schwach positiv
subepitheliales Stroma schwach positiv
subepitheliales Stroma schwach positiv
subepitheliales Stroma schwach positiv
Stroma unter Cis negativ, Lymphozyten
subepitheliales Stroma schwach positiv
subepitheliales Stroma schwach positiv
subepitheliales Stroma schwach positiv
subepitheliales Stroma schwach positiv
Stroma schwach positiv auch in Septen
3.2.6.2 T1N0M0 – Karzinome
An der Invasionsfront dieser Karzinomgruppe kam es bei allen Patienten zu einer vermehrten
Fibronectin – Expression, welche aber nicht einheitlich ausgeprägt war. Im Tumorstroma fand
sich ebenfalls Fibronectin aber in geringerem Ausmaß als um die Tumore herum. Auch im
Tumorstroma erschien zwischen den einzelnen Patienten eine uneinheitliche Darstellung. In
Gebieten mit lymphoplasmazellulärer Infiltration ging auch das Fibronectin zurück. Alle
Patienten sind in Tabelle 3.2.6.2. aufgeführt, entsprechende Darstellungen zeigen die
Abbildungen 3.2.6.3. und 3.2.6.4.
Ergebnisse
50
Tabelle 3.2.6.2. Fibronectin bei T1 - Peniskarzinomen
Patient Alter OP - Jahr
SE
WO
SJ
LG
RG
BG
67
44
59
69
59
61
1997
2001
1999
1998
1993
2001
TNM
Grading
pT1 cN0 cMx
pT1 cN0 cMx
pT1 cN0 cM0
pT1 pN0 cM0
pT1 cN0 cMx
pT1 cN0 cMx
2
2
2
2
3
1
Fibronectin
um
um
um
um
um
um
TM mäßig, im TM-Stroma schwach
TM mäßig, im TM-Stroma schwach
TM mäßig, im TM-Stroma schwach
TM stark, im TM-Stroma mäßig
TM stark, im TM-Stroma mäßig
TM mäßig, im TM-Stroma schwach
3.2.6.3. T2 – 4N0M0 – Karzinome
In dieser Gruppe zeigte sich 1 Präparat ohne Fibronectindarstellung auch in den Kontrollen,
dies wird in diesem Fall aber auf das Alter sowie die Paraffineinbettung (Schnitt von 1991)
zurückgeführt. Ansonsten kam es bei allen anderen Patienten im Bereich der Invasionsfront
wieder zu einer deutlichen Fibronectin – Expression in unterschiedlichem Ausmaß. In
Bereichen mit lymphozytärer Infiltration war wiederum eine geringere Fibronectinproduktion
nachweisbar. Wie bei der vorhergehenden Gruppe bereits beschrieben, fand sich auch hier im
Tumorstroma oft eine geringere Fibronectinfärbung. Als Beispiele für diese Patientengruppe
sind die Abbildungen 3.2.6.5. und 3.2.6.6. angeführt, alle Patienten sind in Tabelle 3.2.6.3.
aufgelistet.
Tabelle 3.2.6.3. Fibronectin bei nichtmetastasierten invasiven Karzinomen
Patient Alter OP - Datum
DH
SE
WE
DR
KD
BH
AK
KK
68
78
87
68
55
66
87
76
1998
1996
1996
1995
2001
1991
1998
2001
TNM
Grading
pT3 pN0 cM0
pT2 cN0 cM0
pT3 cN0 cMx
pT2 cN0 cM0
pT2 cN0 cM0
pT2 pN0 cMx
pT3 cN0 cMx
pT3 pN0 cM0
1
2
3
2
2
1
2
2
Fibronectin
Invasionsfront
Invasionsfront
Invasionsfront
Invasionsfront
Invasionsfront
negativ
Invasionsfront
Invasionsfront
stark, TM-Stroma mäßig
mäßig, TM-Stroma schwach
mäßig, TM-Stroma schwach
stark, TM-Stroma mäßig
mäßig, TM-Stroma mäßig
stark, TM-Stroma mäßig
mäßig, TM-Stroma schwach
3.2.6.4. T1 – 4N+M+ - Karzinome
In allen metastasierten Peniskarzinomen war eine Fibronectin – Expression nachweisbar,
wobei in einem Fall diese nur schwach positiv ausfiel. Die anderen Patienten zeigten
wiederum eine mäßig bis stark positive immunhistochemische Färbung, wobei im Bereich der
Invasionsfront auch hier wieder eine stärkere Darstellung als im Tumorstroma selbst gelang.
In Bereichen mit entzündlicher Reaktion war, wie bereits festgestellt, keine Fibronectin –
Ergebnisse
51
Färbung nachweisbar. Zu den Patienten mit metastasiertem Peniskarzinom siehe Tabelle
3.2.6.4. und die Abbildungen 3.2.6.7. und 3.2.6.8.
Tabelle 3.2.6.4. metastasierte Peniskarzinome und Fibronectin
Patient Alter OP - Datum
UW
BE
RH
HG
FK
OE
BK
KK
KE
SW
SG
JE
MU
BH
SE
89
66
62
69
78
60
77
88
40
76
58
78
63
58
56
1997
1997
1999
2001
1999
1995
1996
1998
1997
1997
1998
2001
1996
1993
1993
TNM
Grading
Fibronectin
pT3 cN2 cMx
pT3 pN2 pM1
pT1 pN2 cM0
pT1 pN3 cMx
pT2 cN2 cM1
pT3 cN3 cM1
pT2 pN1 cM0
pT3 cN2 cMx
pT1 pN3 cM1
pT1 cN1 cM0
pT1 pN1 cM1
pT4 cN2 cMx
pT2 pN1 pM1
pT2 pN3 cMx
pT1 pN1 cMx
2
2
2
2
2
2
2
1
3
2
2
2
2
2
2
Invasionsfront stark, TM-Stroma stark
Invasionsfront mäßig, TM-Stroma mäßig
Invasionsfront mäßig, TM-Stroma schwach
Invasionsfront stark, TM-Stroma mäßig
Invasionsfront stark, TM-Stroma stark
Invasionsfront mäßig, TM-Stroma mäßig
Invasionsfront stark, TM-Stroma schwach
Invasionsfront schwach, TM-Stroma schwach
Invasionsfront stark, TM-Stroma mäßig
Invasionsfront stark, TM-Stroma schwach
Invasionsfront stark, TM-Stroma stark
Invasionsfront stark, TM-Stroma stark
Invasionsfront stark, TM-Stroma mäßig
Invasionsfront mäßig, TM-Stroma mäßig
Invasionsfront stark, TM-Stroma schwach
3.2.6.5. Lymphknoten – bzw. Organmetastasen
In allen untersuchten Metastasen lässt sich ein ähnliches Bild wie in den Primärtumoren
nachweisen, alle Filiae exprimierten Fibronectin in unterschiedlicher Stärke, 2 Fälle zeigten
eine schwach positive Darstellung im Bereich der Invasion, der Rest war durch eine mäßige
bis starke Färbung in diesem Bereich gekennzeichnet. Im Gegensatz zu den Primärtumoren
fand sich im Metastasenstroma eine nahezu identische Stärke der Fibronectindarstellung. Alle
Patienten mit ihren Filiae sind in Tabelle 3.2.6.5.dargestellt und entsprechender Bilder in den
Abbildungen 3.2.6.9. sowie 3.2.6.10.
Tabelle 3.2.6.5 Metastasen und Fibronectin - Expression
Patient Alter OP-Datum
BE
RH
HG
BK
KE
SG
MU
BH
SE
66
62
69
77
40
58
63
58
56
1997
1999
2001
1996
1997
1998
1996
1993
1993
TNM
Metastase
pT3 pN2 pM1 LK +Haut
pT1 pN2 cM0 LK re. + li.
pT1 pN3 cMx
LK
pT2 pN1 cM0
Lk
pT1 pN3 cM1
LK
pT1 pN1 cM1
LK
pT2 pN1 pM1 LK + Haut
pT2 pN3 cMx
LK
pT1 pN1 cMx
LK
Fibronectin
um Metastase stark, TM-Stroma mäßig
um Metastase mäßig, TM-Stroma stark
um Metastase schwach, TM-Stroma schwach
um Metastase schwach, TM-Stroma mäßig
um Metastase mäßig, TM-Stroma stark
um Metastase stark, TM-Stroma stark
um Metastase stark, TM-Stroma mäßig
um Metastase mäßig, TM-Stroma mäßig
um Metastase stark, TM-Stroma mäßig
Ergebnisse
52
3.2.6.6. Fibronectin – Expression in Abhängigkeit vom Tumorgrading
Ein Zusammenhang zwischen dem Grading der einzelnen Karzinome und der Stärke der
Fibronectinfärbungen fand sich nicht, da die meisten Tumore eine mäßige bis starke
Expression präsentierten. Weiterhin stellen die G2 – Tumore die mit Abstand größte Gruppe
dar, so dass die wenigen hier untersuchten G1 – bzw. G3 – Karzinome keine verlässliche
Aussage zulassen.
3.2.7. Untersuchung zu Tumorverhalten und Fibronectin – Expression
3.2.7.1. Metastasierung
Ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Fibronectin – Expression und einer
Metastasierung konnte nicht nachgewiesen werden, da nahezu alle untersuchten
Peniskarzinome ein ähnliches Expressionsmuster zeigten. Einzig signifikanter Unterschied
war ein vermehrtes Auftreten von Lymphknotenmetastasen bei Karzinomen mit starker
stromaler Reaktion auf Fibronectin (p=0,044). Ebenso ist keine Vorhersage einer
Tumorprogression von einem nicht invasiven Tumor in ein infiltrierendes Karzinom möglich.
Eine Übersicht hierzu ist in Tabelle 3.2.7.1 angegeben.
Tabelle 3.2.7.1 Fibronectin in Abhängigkeit vom Lymphknotenstatus
univariate
NN+
Analyse
Invasionsfront schwach
mäßig
stark
1
8
5
1
4
10
χ2=2,23
P=0,136
Stroma
8
6
0
5
6
4
χ2=4,04
P=0,044
schwach
mäßig
stark
3.2.7.2. Tumorprogreß
Für die 3 im Progreß befindlichen Patienten stellt sich die Fibronectinexpression
unterschiedlich dar, so dass wegen der kleinen Patientenzahl keine Aussage getroffen werden
kann.
Ergebnisse
53
3.2.7.3. Überlebenszeit
Auch für Fibronectin konnte in dieser Untersuchung kein signifikanter Zusammenhang
zwischen Stärke seiner Expression und dem mittleren Überleben gefunden werden. Dies
betrifft Patienten mit invasivem Tumor ebenso wie Erkrankte mit einem nicht filialisierten
Malignom.
Ergebnisse
Abb.3.2.1.1 Ki67 in normaler Basalschicht links im Bild (Vergr. 40x)
( rechts invasives Karzinom)
Abb.3.2.1.2 Ki67 in Dysplasie (Vergr.100x)
54
Ergebnisse
Abbildung 3.2.1.3 Tenascin in Gefäßen und Basalmembran
(Vergr. 40x)
Abb. 3.2.1.4. Tenascin in Basalmembran (Vergr. 100 x)
55
Ergebnisse
Abb. 3.2.1.5. Fibronectin in normalem Stroma (Vergr. 100x)
56
Ergebnisse
Abb. 3.2.2.1 Carcinoma in situ mit starker Ki67 – Expression
(Vergr. 40x)
Abb. 3.2.2.2. T1- Tumor mit intermediärer Ki67 – Färbung
(Vergr. 40x)
57
Ergebnisse
Abb. 3.2.2.3. invasiver Tumor mit intermediärer Ki67 – Darstellung
(Vergr. 200x)
Abb.3.2.2.4. Ki67 im metastasierten Tumor (Vergr.100x)
58
Ergebnisse
Abb. 3.2.2.5. Ki67 im metastasierten Tumor (Vergr.400x)
Abb. 3.2.2.6. Metastase mit Ki67 (Vergr. 100x)
59
Ergebnisse
Abb. 3.2.2.7. Ki67 in Metastase (Vergr. 400x)
60
Ergebnisse
Abb. 3.2.4.1. Tenascin – Verbreiterung basal mit lymphozytärem
Infiltrat (Vergr. 40x)
Abb. 3.2.4.2. Tenascin in Basalzellen (Vergr. 200x)
61
Ergebnisse
Abb. 3.2.4.3. T1 – Tumor mit starker stromaler Tenascinfärbung
(Vergr. 100x)
Abb. 3.2.4.4. T1 – Tumor mit mäßiger Tenascindarstellung
(Vergr. 100x)
62
Ergebnisse
Abb.3.2.4.5. T2 – Tumor mit deutlicher Tenascinexpression im Stroma
(Vergr.40x)
Abb.3.2.4.6. Tumor mit starker Tenascin – Expression an
Invasionsfront (Vergr. 100x)
63
Ergebnisse
Abb.3.2.4.7. metastasierter Tumor mit deutlicher Tenascinfärbung
(Vergr. 400x)
Abb.3.2.4.8. Tenascinexpression in metastasiertem Tumor
( Vergr. 100x)
64
Ergebnisse
Abb. 3.2.4.9. Lymphknotenmetastase Tenascin (Vergr. 100x)
Abb.3.2.4.10. Lymphknotenmetastase (Vergr. 400x)
65
Ergebnisse
Abb.3.2.6.1. Fibronectin und Carcinoma in situ (Vergr. 100x)
Abb. 3.2.6.2. in situ Karzinom und Fibronectin im Stroma
(Vergr. 400x)
66
Ergebnisse
Abb. 3.2.6.3. T1 – Tumor mit starker Fibronectinfärbung
(Vergr. 100x)
Abb. 3.2.6.4. T1 – Tumor mit mäßiger Fibronectinexpression
(Vergr.400x)
67
Ergebnisse
Abb. 3.2.6.5. invasiver nichtmetastasierter Tumor mit Fibronectin
(Vergr. 100x)
Abb. 3.2.6.6. nichtmetastasierter Tumor mit Fibronectinfärbung
(Vergr.400x)
68
Ergebnisse
Abb.3.2.6.7. metastasierter Tumor mit Fibronectin (Vergr. 100x)
Abb. 3.2.6.8. metastasierter Tumor mit hoher Fibronectindichte
(Vergr. 400x)
69
Ergebnisse
Abb. 3.2.6.9. Fibronectin in Metastase (Vergr. 100x)
Abb. 3.2.6.10. Fibronectin in Metastase (Vergr.400x)
70
Diskussion
71
4. Diskussion
Da die Inzidenz des Peniskarzinoms in den westlichen Industriestaaten sehr gering ist, liegen
bisher nur relativ wenige Informationen über mögliche Proliferations - bzw. Tumormarker
vor, die Einfluss auf das therapeutische Vorgehen nehmen könnten. Dies ist um so
bedauerlicher, da nach Entfernung des Primärtumors häufig das therapeutische Dilemma in
der
weiteren
Behandlung
in
der
Entscheidung
für
oder
gegen
eine
inguinale
Lymphadenektomie besteht. Da eine Lympknotenmetastasierung den entscheidenden Faktor
für die Prognose der Erkrankung darstellt [122;123], sollte ab einem Tumorstadium 2 bei
klinisch negativen Lymphknoten zumindest eine diagnostische Lymphadenektomie erfolgen,
denn die Wahrscheinlichkeit positiver Lymphknoten liegt hier bei 25 – 50% [1;28].
Demgegenüber stehen die nicht unerhebliche operative Morbidität der Lymphadenektomie
von bis zu 80% und die Tatsache, dass selbst bei palpablen inguinalen Lymphknoten der
Eingriff für 50% der Patienten eine Übertherapie bedeutet [42;43]. Im Falle nicht tastbarer
Lymphknoten bedeutet die Operation sogar für etwa 80% der Kranken eine Übertherapie,
obwohl auch bei dieser klinischen Situation in etwa 20% bereits okkulte lymphogene Filiae
vorliegen [23;24]. Diverse Arbeitsgruppen versuchten eine Lösung dieses Problems durch
verschiedene Modifikationen der operativen Strategie herbeizuführen und somit die
Morbidität der Operation zu reduzieren [46;47]. Hierbei wurden durchaus erste Erfolge
erzielt, zuletzt durch das von Horenblas et al. (2000) praktizierte Sentinel – Lymph – Node
Konzept mit szintigrafischer Detektion von inguinalen Lymphknoten [53;54].
In dieser Arbeit zeigt sich nach Analyse der klinischen Daten ebenfalls ein signifikanter
Überlebensvorteil für Patienten ohne Lymphknotenmetastasen (p=0,010). Es fällt aber auf,
dass entgegen den in der Einleitung und oben angeführten Empfehlungen von 16
Tumorkranken mit einem Primärtumor T2
und höher nur 6 einer Lymphadenektomie
unterzogen wurden. Dies demonstriert ein doch häufiges Abweichen vom empfohlenen
Vorgehen im klinischen Alltag. Als Ursachen hierfür können sicherlich das oft hohe
Lebensalter bei Diagnosestellung und daraus resultierend eine Multimorbidität genannt
werden. Unter Berücksichtigung des eben angeführten wäre es für den Therapeuten
wünschenswert, Entscheidungshilfen für oder wider eine Lymphadenektomie zur Verfügung
zu haben.
Die differenzierte Aufarbeitung von histologischen Präparaten führte hier zu ersten
Ergebnissen, so konnten als unabhängige Prognosefaktoren für das Vorliegen von
Lymphknotenfiliae das Tumorstadium [23;124] und das Tumorgrading identifiziert werden
Diskussion
72
[63;125]. Im Gegensatz zu diesen Untersuchungen fanden sich aber in dieser Arbeit keine
signifikanten
Zusammenhänge
zwischen
T
–
Stadium
bzw.
Grading
und
Lymphknotenmetastasierung. Neben diesen Parametern konnten weitere pathologische
Faktoren wie die Tumorinvasionstiefe und die Infiltration von Blut – und Lymphgefäßen als
relevant zur Vorhersage von Lymphknotenmetastasen beurteilt werden [35;126].
Betrachtet man nun für die Patienten dieser Arbeit die zwei unabhängigen Prognosefaktoren
Tumorstadium und Tumorgrading, so finden sich 13 Patienten mit einem T1 – Karzinom und
16 Kranke mit einem T2 – Tumor oder schlechter. Die Entscheidung für oder wider eine
Lymphadenektomie ist somit anhand des T – Stadiums für dieses Patientenkollektiv nicht
möglich. Beim Grading fanden sich lediglich 3 G1 – bzw. G3 – Befunde, der weitaus größte
Anteil wurde von mäßig differenzierten Karzinomen gebildet. Dies deckt sich auch mit der
Literatur, hier werden etwa 90% der Peniskarzinome als gut bis mäßig differenziert
beschrieben. Die zwei unabhängigen Prognosefaktoren sind also unzureichende klinische
Prädiktoren für die Entscheidung zur Lymphknotendissektion [28].
Aus diesem Grund ist die Suche nach verlässlichen prognostischen Faktoren notwendig, hier
bieten sich immunhistochemisch zu evaluierende molekularbiologische Marker an. Die
Datenlage hierzu ist aber das Peniskarzinom betreffend noch wenig aufschlußreich. Da ein
Zusammenhang zwischen Tumorgenese und einer HPV – Infektion gesichert ist, wurde der
Einfluss der HPV – Infektion auf die Prognose von einigen Arbeitsgruppen untersucht.
Hierbei fanden Bezerra et al. (2001) kein Zusammenhang zwischen HPV – Status und
Prognose des Peniskarzinoms [72]. Weiterhin konnte herausgefunden werden, dass die
histologisch größte Gruppe der Plattenepithelkarzinome nur in 35% HPV assoziiert war [7].
Die Arbeitsgruppe um Slaton at al. (s.u.) untersuchte den prognostischen Wert der MMP9 und
des VEGF für die Prognose des Peniskarzinom [127].
In jüngster Zeit fanden Untersuchungen zur prognostischen Wertigkeit des p53 beim
Peniskarzinom statt, hierbei konnten Lopes et al. (2002) eine p53 positive Immunhistochemie
als unabhängigen prognostischen Parameter für eine Lymphknotenmetastasierung aufzeigen
[71]. Zu demselben Ergebnis kamen Martins et al. (2002), sie untersuchten zusätzlich das
PCNA in seiner prognostischen Relevanz, konnten aber für dieses Antigen keine Bedeutung
für die Prognose peniler Karzinome erkennen [67].
Nach Kenntnis dieser Arbeiten liegt die Untersuchung weiterer Proliferations – bzw.
molekularbiologischer Marker nahe.
Einen bisher sehr breit untersuchten Proliferationsmarker stellt das Ki67 dar, dessen Funktion
jedoch weitgehend unklar ist. Die Bedeutung des Ki67 als prognostischer Marker wird
Diskussion
73
kontrovers gesehen. Hierzu sind Arbeiten zu anderen Plattenepithelkarzinomen, insbesondere
des Oropharynx, interessant im Hinblick auf das Peniskarzinom.
-
Zidar et al. (1996) konnten einen signifikanten Zusammenhang zwischen
Tumorgrading und Ki67 – Expression aufzeigen, es wurde mit zunehmender
Entdifferenzierung eine Zunahme des Ki67 – Labeling beobachtet. Hieraus
schlußfolgerten die Autoren, dass Ki67 hilfreich für eine objektivere Festlegung
des Tumorgradings sei [82].
-
Xie et al. konnten 1999 für orale Plattenepithelkarzinome zeigen, dass eine hohe
Ki67 – Expression mit einer schlechten Prognose korrelierte, besonders wenn
weitere Proliferations – und Apoptosemarker kombiniert werden [85].
-
Ebenfalls 1999 fanden Valente et al. für Larynxkarzinome einen engen
Zusammenhang zwischen Proliferation gekennzeichnet durch hohe Ki67 – Label
und frühem Rezidiv bzw. Tod durch die Tumorerkrankung. Eine Korrelation
zwischen Proliferationsrate, Tumorgrading und Tumorstadium konnte nicht
gefunden werden [86].
-
Matsumoto et al. (1999) untersuchten ebenfalls Plattenepithelkarzinome des
Mundbereiches und fanden bei metastasierten Tumoren eine höhere Expression
von Ki67. Er schloß hieraus, dass Ki67 hilfreich zur Vorhersage von
Lymphknotenmetastasen ist [128].
-
Lazaris et al. (2002) konnten bei Larynxkarzinomen eine Korrelation zwischen
starker Ki67 – Expression und fortgeschrittener Tumorerkrankung, lymphogener
Metastasierung und frühem Rezidiv nachweisen [88].
-
Im Jahr 2000 hat Padovan et al. Zervixkarzinome hinsichtlich verschiedener
Proliferationsmarker und Prognose der Tumorerkrankung untersucht und gezeigt,
dass die Ki67 – Expression mit fortgeschrittener Erkrankung und schlechter
Prognose korrelierte [80].
Diskussion
-
74
Adnane et al. (2002) und Thomson et al. (2002) fanden ebenfalls einen
Zusammenhang zwischen hohem Ki67 – Label und Tumorprogression sowie
schlechter Prognose [87].
Demgegenüber stehen Arbeiten negativer Aussage das Ki67 bei Plattenepithelkarzinomen
betreffend.
-
1994 hatten Roland et al. 79 Plattenepithelkarziome des Kopf – und Halsbereiches
hinsichtlich der Ki67 – Expression und Vorhersage von Lymphknotenmetastasen
sowie Prognose der Tumorerkrankung untersucht und hierbei für beide
Fragestellungen keinen Zusammenhang gefunden [83].
-
Bayazit et al. (2002) konnten ebenfalls keinen Zusammenhang zwischen
Tumorstadium und Lymphknotenstatus und Höhe des Ki67 – Labels bei
Larynxkarzinomen finden. Es zeigte sich lediglich eine Abhängigkeit vom
Tumorgrading [84].
In der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig Peniskarzinome immunhistochemisch
hinsichtlich der Stärke der Ki67 – Expression untersucht.
Von den 8 Carcinomata in situ waren 4 mit invasiven Tumoren assoziiert, es zeigte sich ein
unterschiedliches Verhalten die Ki67 – Expression betreffend. Insgesamt 3 dieser Karzinome
zeigten eine starke Ki67 – Expression (s.Tabelle 3.2.2.1).
Unter Berücksichtigung des histopathologischen Gradings konnte für G1 – Karzinome ein
mittlerer Ki67 – Labeling – Index von 27,2%, für G2 – Tumore ein Index von 46,6% und für
G3 – Peniskarzinome eine durchschnittliche Expression von 42,3% bestimmt werden
(s.3.2.2.6.). Da die mäßig differenzierten Tumore die größte Gruppe darstellen, konnte keine
auffällige Verbindung zwischen Grading und Ki67 – Expression gefunden werden. Das
Ergebnis stimmt mit den Arbeiten von Xie et al. und Valente et al. überein [85;86].
Wenn man alle 29 invasiven Karzinome betrachtet, zeigte sich für 3 Tumore eine schwache
Ki67 – Expression, bei 19 Patienten konnte eine mittlere Ki67 – Darstellung gefunden werden
und bei 7 invasiven Karzinomen zeigte sich eine starke Ki67 – Expression (s. Tabelle
3.2.3.1.2). Alle 3 schwach Ki67 exprimierenden Tumore waren nicht metastasiert, während
alle 7 Karzinome mit hohem Ki67 – Label Metastasen zeigten (p=0,004). Bei Untersuchung
der mittleren Ki67 – Expression von lymphogen metastasierten (Ki67 50,4%) und nicht
lymphogen metastasierten Karzinomen (Ki67 36,2%) findet sich im 2tail t – Test ein
Diskussion
75
signifkanter Unterschied (p=0,04). Dieses Ergebnis stimmt mit den oben angeführten
Untersuchungen von Matsumoto et al., Lazaris et al. sowie Adnane et al. überein, welche
einen hohen Ki67 – Level mit einer fortgeschrittenen Erkrankung korrelieren konnten
[87;88;128]. Im Gegensatz hierzu konnte aber bei nicht fernmetastasierten und
fernmetastasierten Tumoren kein signifikanter Unterschied im mittleren Ki67 – Labeling
gefunden werden (48,6% vs. 42,2%, p=0,52).
Bei weiterer Betrachtung der invasiven Peniskarzinome unter Berücksichtigung der Ki67 –
Expression sowie der Überlebensdaten der einzelnen Patienten konnte bei einem Cut off für
den Ki67 – Label von 50% im Log rank – Test ein signifikanter Überlebensvorteil (p=0,0158)
für die Gruppe der Patienten mit niedrigerer Ki67 – Expression festgestellt werden
(s.Abb.3.2.3.3).
Auch
dieses
Ergebnis
stimmt
mit
den
Untersuchungen
anderer
Arbeitsgruppen, wie z. B. Xie et al. und Padovan et al., überein [80;85]. Dies steht allerdings
im Gegensatz zu den Ergebnissen von Roland et al. und Bayazit et al. [83;84]. Die Analyse
der Überlebensdaten für die invasiven Peniskarzinome unserer Untersuchungsgruppe zeigte
desweiteren einen deutlichen Zusammenhang zwischen Tumorprogression und hoher Ki67 –
Expression (s. 3.2.3.2.). Alle 3 tumorprogredienten Patienten dieser Untersuchung zeigen
einen Ki67 – Label über 50%.
Aus den oben genannten Ergebnissen dieser Arbeit zum Verhalten der Ki67 – Expression bei
Peniskarzinomen lassen sich folgende Schlußfolgerungen ableiten:
1.
Bei den 3 in situ Karzinomen mit starkem Ki67 – Labeling könnten unmittelbar
präinvasive Stadien vorliegen. Bisher finden sich in der Literatur keine Angaben
über Kriterien, wann präkanzeröse Veränderungen in invasive Tumorstadien
übergehen. Auch für Plattenepithelkarzinome anderer Lokalisationen gibt es hierzu
keine Hinweise. In dieser Arbeit fand sich ein niedriger Ki67 – Index von 10% für
das verruköse Karzinom. Da verruköse Peniskarzinome bekanntlich sehr lange
oberflächlich wachsen und erst sehr spät ein mikroinvasives Wachstum zeigen,
könnte dies als Hinweis dafür dienen, daß bei Zunahme der Ki67 – Expression in
Carcinomata in situ ein invasives Wachstum bevorsteht. Hierzu liegt die
Untersuchung eines verrukösen Peniskarzinoms von Medina Perez et al. (1999)
vor, er konnte besonders eine Ki67 – Darstellung in den mikroinvasiven Nestern
seines Tumors nachweisen [81]. Einen weiteren Hinweis kann eine Arbeit Cubilla
et al. (2001) geben, er untersuchte die histologischen Subtypen des Peniskarzinoms
auf die Wahrscheinlichkeit des Vorliegens von Lymphknotenmetastasen. Hierbei
Diskussion
76
zeigte u. a. der basaloide Subtyp ein aggressives Verhalten [19]. In dem hier
untersuchten Carcinoma in situ vom basaloiden Typ zeigte sich eine starke Ki67 –
Expression, was auch für eine Tendenz zur Invasion sprechen könnte.
2.
Eine Abhängigkeit zwischen Grading und Höhe des Ki67 – Labeling besteht nicht.
Hier stimmen die Ergebnisse der Arbeit mit den Aussagen anderer Arbeitsgruppen
wie z. B. Valente et al. und Matsumoto et al. überein [86;128]. Warum im
Gegensatz hierzu in anderen Untersuchungen z. B. von Zidar et al. und Roland et
al. eine Korrelation zwischen Tumorgrading und Ki67 – Expression aufgezeigt
werden konnte mag an einer bis heute noch uneinheitlichen Beurteilung für das
Ki67 – Labeling liegen [82;83]. So arbeiten einige Autoren mit vorher festgelegten
Grenzwertbereichen unterschiedlicher Art (z. B. Nguyen et al., Padovan et al.),
andere Autoren verwenden hingegen die absoluten Ki67 – Label für ihre
Auswertung
[73;80].
Weiterhin
werden
in
manchen
Untersuchungen
unterschiedliche Tumorgruppen einer Region ausgewertet, was ebenfalls zu
anderen Ergebnissen führen kann (z.B. Valente 1999)[86].
3.
Ein hoher Ki67 – Index spricht für das Vorliegen einer lymphogenen
Metastasierung. Ab einem Label von 60% traten bei allen Patienten
Lymphknotenmetastasen auf. In diesen Fällen sollte also eine Lymphadenektomie
unbedingt angestrebt werden. Bei der Gruppe der mittleren Ki67 – Expression
traten in etwa 50% der Patienten ebenfalls Lymphknotenfiliae auf, so dass auch
hier
bei
hoch
intermediärem
Ki67
–
Label
eine
Lymphadenektomie
empfehlenswert ist. Hingegen kann bei Vorliegen einer schwachen Ki67 –
Darstellung und Fehlen weiterer Risikofaktoren auf eine Entfernung von
Lymphknoten verzichtet werden, da in keinem dieser Fälle eine Metastasierung
aufgetreten war. Diese Beobachtungen stimmen mit den Ergebnissen anderer
Arbeiten überein, z. B. konnten Matsumoto et al. und Lazaris et al. ebenfalls einen
Zusammenhang zwischen starker Expression von Ki67 und dem Vorliegen
lymphogener Filiae aufzeigen [88;128].
4.
Ab einem Cut off von 50% für den Ki67 – Index zeigt sich eine signifikante
Verschlechterung
des
Überlebens,
auch
dies
konnte
bereits
für
Plattenepithelkarzinome anderer Lokalisationen von anderen Autoren in ihren
Arbeiten bestätigt werden (Xie et al., Valente et al., Padovan et al., Adnane et
Diskussion
77
al.)[80;85;86;87]. Aus diesem Grund erscheint Ki67 geeignet, zur Vorhersage der
Prognose der Peniskarzinomerkrankung einen Beitrag zu leisten. So könnte man
Peniskarzinompatienten mit einem Ki67 – Index über 50% frühzeitig einer
adjuvanten Therapie zuführen. Werden die 3 Patienten mit progredienter bzw.
rezidivierender Tumorerkrankung und hoher Ki67 – Expression betrachtet, kann
auch für die Tumornachsorge geschlossen werden, dass Patienten mit Ki67 – Label
über 50% einer engeren Nachsorge bedürfen, um ein Tumorrezidiv frühzeitig zu
erkennen.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dem Ki 67 als Proliferationsmarker
eine Rolle bei der Vorhersage einer Lymphknotenmetastasierung sowie für die Abschätzung
der Prognose der Peniskarzinomerkrankung zukommt. Auf bisher evaluierte Risikofaktoren
für eine Metastasierung sowie prognostische Parameter kann jedoch nicht verzichtet werden.
Vielmehr soll die zusätzliche Nutzung von Ki67 eine bessere Entscheidungshilfe für das
therapeutische Vorgehen bieten. Einschränkend muss gesagt werden, dass jedoch die kleine
Fallzahl weitere Untersuchungen mit mehr Patienten notwendig macht. Es wäre
wünschenswert, dann für diese Untersuchungen ein noch exakteres Tumorstaging zu erhalten.
Weiterhin kann der Einfluss des Alters der einzelnen Präparate auf das Ergebnis dieser
Untersuchung nicht abgeschätzt werden. Die Verwendung von Präparaten jüngeren Datums
könnte diese Beeinflussung vernachlässigbar machen. Des weiteren stellt bei der Bestimmung
der Ki67 – Expression der Untersucher selbst eine Fehlerquelle dar, in dieser Arbeit wurde die
Auswertung von 2 Gutachtern unabhängig voneinander durchgeführt, um diesen Einfluss so
klein wie möglich zu halten. In Arbeiten anderer Autoren wie z.B. Valente et al. lag die
Varianz aber zwischen den Untersuchern und bei jedem einzelnen Gutachter niedriger als
10% [86].
Im Folgenden sollen nun, mit dem Tenascin beginnend, die Ergebnisse der untersuchten
stromalen Marker diskutiert werden. Auch hierzu ist ein Blick auf die Arbeiten anderer
Autoren
zu
Plattenepithelkarzinomen
anderer
Lokalisation
bzw.
anderen
Karzinomerkrankungen interessant.
-
1995 untersuchten Ishihara et al. Tenascin im Mammakarzinom hinsichtlich seiner
prognostischen Relevanz, es fand sich hierbei eine Subgruppe von Patientinnen mit
Diskussion
78
deutlicher stromaler und intrazytoplasmatischer Tenascinexpression und schlechter
Prognose [129;130].
-
Jahkola et al. untersuchten im Jahr 1998 intraduktale Mammakarzinome
hinsichtlich ihrer Tenascinproduktion und schlossen aus ihren Ergebnissen, dass
eine stromale und mäßige bis starke periduktale Tenascinexpression ein Zeichen
für eine frühe Invasion darstellen [131].
-
Ebenfalls für das Mammakarzinom konnten Dandachi et al. (2001) eine vermehrte
Darstellung von Tenascin in Tumorzellen und im Tumorstroma nachweisen. Es
zeigte sich ein möglicher Zusammenhang zwischen Tenascinexpression,
Tumorgrading und Alter der Patientinnen. Eine Gruppe junger Patientinnen mit
hoher Tenascinexpression im Tumor hatte einen ungünstigen Erkrankungsverlauf
[103].
-
Yoshida et al. zeigten 1999 auch für Larynxkarzinome eine vermehrte stromale
sowie intrazytoplasmatische Tenascinexpression
und zwar besonders in den
peripheren Zellen der invasiven Tumoranteile [104].
-
Ebenfalls 1999 konnten Hindermann et al. für orale Plattenepithelkarzinome eine
vermehrte Expression von Tenascin im Stroma sowie an der Invasionsfront der
invasiven Karzinome nachweisen. Weiterhin fand sich gleichfalls eine
intrazytoplasmatische Tenascingranulation, diese zeigte eine Abhängigkeit vom
Grading. Bei den gut differenzierten Karzinomen lagen die Zellen als einfache
Lage peripher in den invasiven Nestern. Mit weiterer Entdifferenzierung war eine
Zunahme der tenascingranulierten Zellen und diffuse Verteilung auch innerhalb
der Invasionsnester zu beobachten [97].
-
Pilch et al. beobachteten 1999 für Zervixkarzinome ein etwas anderes Verhalten.
Subepithelial fanden sie kein Tenascin, die meisten invasiven Karzinome zeigten
eine starke Tenascinexpression im bzw. um den Tumor. Einige der invasiven
Karzinome
zeigten
keine
Tenascinimmunoreaktivität.
Hier
bestand
eine
Korrelation zum Auftreten von Lymphknotenmetastasen, so dass daraus auf eine
Diskussion
79
Alteration der stromalen Abwehr einhergehend mit schlechter Prognose
geschlossen wurde [102].
-
Kalembeyi
et
al.
(2003)
untersuchten
den
Zusammenhang
zwischen
Tenascinproduktion in Mammakarzinomen und Produktion von Metallo – Matrix –
Proteasen (MMP). Sie stellten fest, daß Tenascin direkt die Expression von MMP
9 induziert und somit zum Remodelling der extrazellulären Matrix bei invasiven
Karzinomen beiträgt [132].
Für Peniskarzinome wurde die Tenascinexpression in dieser Arbeit erstmalig untersucht. Bei
den 8 untersuchten in situ Karzinomen fand sich in allen Fällen eine subepitheliale
Verbreiterung der sonst schmalen basalen Tenascindarstellung. Diese erschien mäßig bis stark
ausgeprägt. Weiterhin fiel bei 5 der Carcinomata in situ in der Basalzellschicht eine
Tenascinexpression auf (s. 3.2.4.1.).
Eine Abhängigkeit zwischen dem Tumorgrading und der Expression konnte nicht verifiziert
werden. Je ein Patient mit einem G1 – bzw. G3 Peniskarzinom zeigte eine negative Reaktion
auf Tenascin, alle anderen Tumore exprimierten Tenascin mäßig bis stark. Dies widerspricht
den Ergebnissen von Dandachi et al. und Zidar et al., wobei die beiden Arbeitsgruppen genau
umgekehrte Korrelationen fanden [103;105]. Dagegen stimmt das Ergebnis mit anderen
Arbeiten, wie z. B. Hindermann et al. oder Yoshida et al. überein [97;104].
Betrachtet man gesondert die 29 invasiven Peniskarzinome, so zeigt sich übereinstimmend
mit den Ergebnissen von anderen Autoren, wie z. B. Dandachi et al., Hindermann et al. und
Yoshida et al. bei nahezu allen Tumoren eine mäßig bis starke Erhöhung der
Tenascinexpression im Bereich der Tumorinvasionsfront sowie im Tumorstroma zwischen
den Invasionsnestern [97;103;104]. Weiterhin ergab sich in Kongruenz mit den oben
angeführten Autoren in dieser Arbeit bei insgesamt 7 Patienten eine Tenascinexpression in
den peripheren Zelllagen der invasiven Karzinomnester. Die stromale Reaktion auf Tenascin,
die Tumorinvasionsfront bzw. das Tumorstroma betreffend, zeigt sich kein signifikanter
Zusammenhang zwischen nicht metastasierten und bereits filialisierten Tumoren. Anders
stellt sich dies für die intrazelluläre Tenascinexpression dar. Hier wurde ein signifikanter
Zusammenhang zwischen Metastasierung und Tenascindarstellung gefunden (χ2 =0,048; s.
Tabelle 3.2.5.1). Etwa 85% der Tumore mit Tenascinexpression in den Tumorzellen hatten
metastasiert. Dies steht in Einklang mit den Ergebnissen von Ishihara et al. sowie Dandachi et
Diskussion
80
al., widerspricht aber der Auffassung von Pilch et al., der wie oben beschrieben eine fehlende
Tenascinexpression für ein schlechtes prognostisches Zeichen hält [102;103;129].
Von den 3 tumorprogredienten Patienten zeigten 2 eine starke stromale Tenascinfärbung, bei
dem Patienten mit der längsten Überlebenszeit fand sich eine schwache stromale Darstellung.
Keiner bot eine zelluläre Tenascinexpression. Eine Schlußfolgerung aus diesen Informationen
möchte der Autor nicht ziehen, da bei 3 Patienten mit unterschiedlichem Verhalten keine
Aussage möglich ist.
Nach Zusammenschau der Überlebensdaten von metastasierten und nicht filialisierten
Peniskarzinomen sowie deren Expression von Tenascin ließ sich kein Zusammenhang
nachweisen.
Unter Berücksichtigung der oben angeführten Ergebnisse zur Expression von Tenascin beim
Peniskarzinom kann man folgende Schlüsse ziehen:
-
Beim Carcinoma in situ findet sich regelhaft eine im Gegensatz zum normalen
Epithel verbreiterte Reaktionszone auf Tenascin. Inwieweit dies eine Invasion
ankündigt, kann nicht angegeben werden. Verwiesen sei an dieser Stelle nochmals
auf Jahkola et al. (1998), der bei seinen intraduktalen Mammakarzinomen eine
starke Tenascinexpression für ein Zeichen einer frühen Invasion hält [131].
Weitere Untersuchungen bestätigen ebenfalls eine vermehrte Tenascinexpression
subepithelial
bei
in
situ
Karzinomen
(Pöllänen
et
al.1996,
Tiitta
et
al.1994)[133;134]. Die Autoren hielten dies für Zeichen von proliferativer
Aktivität. Auffällig bei Carcinomata in situ des Penis war bei 5 Tumoren eine
Tenascinexpression in den basalen Zellen, was ein Hinweis dafür ist, dass
zumindest ein Teil der Tenascinproduktion hier stattfindet. Weiterführende
Informationen aus der Literatur ließen sich hierzu nicht finden.
-
Wie bereits von Mackie (1997) und Tremble (1994) beschrieben, spielt Tenascin
im malignen Tumorgewebe eine andere Rolle als während der embryonalen
Entwicklung oder bei der Wundheilung [89;101]. Sie waren der Meinung, daß
Tenascin als Promotor der Invasion und damit Metastasierung auf der Grundlage
einer Reduktion der Tumorzelladhäsion wirkt. Diese Meinung kann durch die
Ergebnisse dieser Arbeit bestätigt werden. In nahezu allen Peniskarzinomen zeigte
sich eine Tenascindarstellung im Bereich der Invasionsfront sowie im
Diskussion
81
Tumorstroma. Hier besteht ebenfalls Analogie zu anderen Autoren wie z. B.
Hindermann et al., Yoshida et al. sowie Ishihara et al. [97;104;129]. Die Wirkung
des Tenascins bei Invasion und Metastasierung scheint in einer Stimulation der
Sekretion
von
Matrix
–
Metallo
–
Proteasen
(MMP)
und
dadurch
Matrixdegeneration zu liegen. Kalambeyi et al. (2003) wiesen nach, daß Tenascin
direkt und im Zusammenwirken mit TGF – β (transforming growth factor) die
Sekretion von MMP und ganz besonders von MMP 9 stimuliert [132]. Hierzu
passend findet sich eine Arbeit von Slaton et al. (2000), welcher für invasive
Peniskarzinome im Bereich der invasiven Tumoranteile eine erhöhte MMP 9 –
Expression
feststellte.
Interessanterweise
lymphknotenmetastasierten
Penistumoren
wies
derselbe
signifikant
Autor
höhere
bei
mittlere
Expressionslevel für MMP 9 und VEGF (vascular epidermal growth factor) nach
[127]. Aus diesem Grund erscheinen die von uns aufgezeigten Unterschiede in der
zytoplasmatischen Anreicherung von Tenascin in einem Teil der metastasierten
Peniskarzinome interessant.
-
Die vorliegende Arbeit bestätigt die Auffassung von Ishihira et al., der für
Mammakarzinome
einen
Zusammenhang
zwischen
intrazellulärer
Tenascinexpression sowie starker stromaler Tenascindarstellung und schlechter
Prognose
fand.
85%
der
Peniskarzinome
mit
intrazytoplasmatischer
Tenascinexpression waren metastasiert. Ursache hierfür könnte der von Kalembeyi
et al. beschriebene Escape-Mechanismus des Tenascin im Sinne einer Umgehung
der TGF-β induzierten Zellwachstumshemmung sein. Die klinische Bedeutung
liegt in einer zusätzlichen Information für Patienten mit intrazytoplasmatischer
Tenascinexpression. Hier sollte eine inguinale Lymphadenektomie angestrebt
werden [129;132].
-
Problematisch erscheint jedoch der generelle Einsatz als Metastasierungsmarker,
da die Mehrzahl der Patienten diese spezielle Tenascinexpression nicht aufwies.
Eine Vorhersage lymphogener Metastasen war nicht möglich, dies entspricht
ebenfalls dem Ergebnis anderer Autoren [105;129].
-
Eine prognostische Aussage für den Verlauf der Tumorerkrankung unter
Berücksichtigung der Tenascinexpression war nicht möglich (s. auch Tabelle
Diskussion
82
3.2.5.1), da eine sichere Vorhersage einer Lymphknotenmetastasierung als
entscheidendem prognostischen Kriterium nicht möglich war.
Auch für die Untersuchungen zur Tenascinexpression gilt, daß bei der kleinen hier
untersuchten Patientengruppe eine definitive Aussage nicht möglich ist und ggf. zur
weiteren Evaluierung die Untersuchung einer größeren Anzahl Karzinome erforderlich
wäre. Da sich aber die Ergebnisse dieser Untersuchung mit den gemachten Erfahrungen
von anderen Autoren weitgehend decken, wird man auch bei weiterführender
Untersuchung der Tenascinproduktion beim Peniskarzinom keinen Hinzugewinn an
prognostischer Information erwarten können.
Als letzten untersuchten Marker der extrazellulären Matrix sollen nun noch die Ergebnisse
zur Expression von Fibronectin bei Peniskarzinomen diskutiert werden. Auch dieser
Marker wurde in der vorliegenden Arbeit erstmalig für Peniskarzinome evaluiert. Hierfür
ist wiederum ein Blick auf die Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen zu
Plattenepithelkarzinomen bzw. Tumoren anderer Lokalisationen interessant.
-
Inufusa et al. (1995) fanden eine deutlich erhöhte Fibronectinexpression, allerdings
das onkofetale Fibronectin betreffend, für kolorektale Karzinome abhängig vom
Tumorstadium. Sie konnten zeigen, daß die Fibronectinintensität mit dem
Vorhandensein von Lebermetastasen korrelierte und leiteten hieraus eine
prognostische Relevanz ab. Demgegenüber bestand kein Zusammenhang zwischen
normalem Fibronectin und klinischen Parametern [113].
-
1996 stellten Pujuguet et al. ebenfalls für kolorektale Karzinome eine erhöhte
Fibronectin – Expression im Tumorstroma fest. Dies bezog sich auf das onkofetale
sowie auf das normale Fibronectin. Sie fanden weiterhin heraus, dass die
Tumorzellen selbst zur Produktion des Fibronectin fähig sind. Weiterhin konnte in
dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit den Tumoren assoziierte Myofibroblasten
Fibronectin produzieren [114].
-
Bereits 1994 hatten Kaczmarek et al. für invasive duktale Mammakarzinome eine
erhöhte Fibronectinproduktion nachgewiesen. Hierbei zeigte sich eine besondere
Diskussion
83
Reaktivität für das onkofetale Fibronectin. Eine Wertung der Ergebnisse wurde
nicht gegeben [116].
-
Orale Plattenepithelkarzinome betreffend konnten Mandel et al. bereits 1994 einen
engen Zusammenhang zwischen invasiven Karzinomen und höherer Fibronectin –
Expression nachweisen. Dies betraf aber vor allem das onkofetale Fibronectin. Sie
schlussfolgerten hieraus, dass mit der Untersuchung des Fibronectin eine Aussage
über eine höhere Aggressivität der Tumore möglich ist [115].
-
Eine weitere Arbeit von Kosmehl et al. aus dem Jahr 1999 untersuchte ebenfalls
orale Plattenepithelkarzinome hinsichtlich ihrer Fibronectinexpression. Hierbei
fand die Arbeitsgruppe ebenfalls eine erhöhte Fibronectindarstellung vor allem an
der
Invasionsfront
der
invasiven
Karzinome.
Eine
eher
fokale
Fibronectindarstellung im Tumorstroma dominierte bei den gut differenzierten
Tumoren. Bei den schlechter differenzierten Karzinomen war die Darstellung im
Tumorstroma eher diffus. Eine Korrelation zwischen Tumorgrading und
Fibronectin – Expression wurde aber nicht gefunden [117].
Bei den von uns untersuchten in situ Karzinomen des Penis fand sich im subepithelialen
Bindegewebe eine schwache Fibronectindarstellung, ein ähnlicher Befund zeigte sich aber
auch bei normalem sowie dysplastisch verändertem Epithel. Hierbei dürfte es sich um ein
normales Vorkommen von Fibronectin handeln. Einzig auffälliger Befund war eine
fehlende Fibronectinexpression im Bereich von lymphozytären Infiltraten (s.3.2.6.1). Dies
entspricht den Ergebnissen anderer Autoren wie z. B. Zidar et al. (2001)[105].
Wenn man das Tumorgrading und die Fibronectinexpression betrachtet, so kann für die
hier untersuchten Karzinome kein Zusammenhang zwischen Differenzierung und Stärke
der Fibronectinproduktion gefunden werden. Die meisten Karzinome wiesen eine mäßige
bis starke Fibronectinfärbung an der Invasionsfront bzw. im Tumorstroma auf. Außerdem
stellten die mäßig differenzierten Tumore wie bereits oben angeführt die bei weitem
größte Gruppe dar. Das Ergebnis deckt sich mit den Aussagen anderer Autoren wie z. B.
Kosmehl et al. oder Mandel et al. [115;117].
Bei den 29 invasiven Peniskarzinomen zeigte sich für die Expression von Fibronectin kein
signifikanter Zusammenhang zwischen der Stärke seiner Produktion und dem
Metastasierungsverhalten. Dies entspricht den Ergebnissen anderer Autoren wie z. B.
Diskussion
84
Zidar et al. sowie Kosmehl et al. aber widerspricht der Feststellung von Inufusa et al.
[105;113;117] Lediglich bei starker Expression von Fibronectin intrastromal zeigten sich
signifikant mehr Lymphknotenmetastasen (p=0,044, s.3.2.7.1.). Alle 4 hierunter
zusammengefaßten Patienten wiesen Lymphknotenfiliae auf. Dieses würde der
Untersuchung
von
Inufusa
entsprechen,
der
eine
Korrelation
zwischen
Fibronectinexpression und Vorhandenein von Lebermetastasen und damit schlechter
Prognose bei kolorektalen Karzinomen fand [113]. Für Patienten mit Fernmetastasen
konnte kein Unterschied hinsichtlich der Fibronectinproduktion gefunden werden (s.
Tabelle 3.2.6.4.).
Für die 3 im Progreß befindlichen Patienten fand sich kein Zusammenhang hinsichtlich
ihrer Fibronectinexpression gegenüber Patienten ohne Progression. Abschließend kann
noch festgestellt werden, das auch beim Vergleich der Überlebensdaten aufgrund der
meist mäßigen bis starken Fibronectinreaktion keine prognostische Aussage zum
Überleben möglich war.
Aus den oben angeführten Aussagen hinsichtlich der Fibronectinreaktion ergeben sich
folgende Überlegungen:
-
Bei den untersuchten in situ Karzinomen des Penis zeigte sich im wesentlichen
eine normale Konstellation (das extrazelluläre Fibronectin betreffend). Lediglich
wegen häufig aufzufindender subepithelialer lymphozytärer Infiltrate als Zeichen
einer Abwehr kann das Fibronectin subepithelial vermindert auftreten. Hieraus
folgt, dass bei oberflächlichen Tumoren eine Degeneration der extrazellulären
Matrix, zumindest das Fibronectin betreffend, noch nicht stattfindet. Dies
entspricht auch der Auffassung von anderen Autoren wie z.B. Zidar et al. (2001)
und Kosmehl (1996) [105;107].
-
Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen die Auffassungen von Kosmehl et al.
(1999) und Armstrong et al. (2000) dahingehend, dass Fibronectin ein Promotor
der Invasion ist [106;117]. Weiterhin kann in Kongruenz zu diesen Autoren ein
Umbau der extrazellulären Matrix, gerade das Fibronectin betreffend, bestätigt
werden. Die Untersuchung der Fibronectinexpression in dieser Arbeit erfolgte mit
einem polyklonalen Antikörper für das gesamte Fibronectin. Daher war keine
Differenzierung zwischen normalem Fibronectin und onkofetalem Fibronectin
Diskussion
85
möglich. Sehr wahrscheinlich ist aber, dass es sich bei der vermehrten Expression
von Fibronectin in den invasiven Peniskarzinomen um onkofetales Fibronectin
handelt. Dies kann gefolgert werden, da hierzu eigentlich Konsens in der Literatur
besteht (Kosmehl et al. 1996, 1999, Kaczmarek et al. 1994, Inufusa et al.
1995)[107;113;116;117;118]. In dieses Bild fügt sich eine Arbeit von Görögh et al.
(2001) ein, welcher eine reduzierte Expression von normaler Fibronectin – mRNA
in Larynxkarzinomen nachwies [109]. Es kommt also während der Transkription
zu einer verminderten Expression von normalem Fibronectin.
-
Der Umbau der extrazellulären Matrix beeinflußt entscheidend die Fähigkeit
maligner Zellen zur Invasion und ist somit wichtig für das Verständnis der
Tumorbiologie. Bei der Untersuchung der invasiven Peniskarzinome war aber
keine Vorhersage einer möglichen Filialisierung möglich. Dies widerspricht zwar
der Arbeit von Inufusa et al. (1995), bestätigt aber die Beobachtungen von anderen
Arbeitsgruppen wie z.B. von Pujuguet et al. (1994), Mandel et al. (1994), Kosmehl
et al. (1999) und Zidar et al. (2001)[105;113;114;115;117]. Für die oben
beschriebenen 4 Patienten mit hoher intrastromaler Fibronectinexpression und
Lymphknotenmetastasen zeigte sich zwar in dieser Arbeit ein signifikanter
Unterschied gegenüber den anderen Penistumoren, aber wegen der sehr geringen
Patientenzahl kann hier eine Vorhersagemöglichkeit nicht postuliert werden.
-
Da keine Vorhersage des Lymphknotenstatus möglich war, ist auch keine
prognostische Aussage zum Verlauf der Tumorerkrankung möglich. Ebenso war
keine Angabe über eine zu erwartende Tumorprogression möglich. Auch dies
deckt sich wiederum mit den Ergebnissen von anderen Autoren (z.B. Pujuguet et
al. 1996, Zidar et al. 2001)[105;114].
Auch für die Untersuchungen zum Fibronectin muss man abschließend sagen, dass aufgrund
der geringen untersuchten Patientenzahl sichere Aussagen erst nach Bewertung eines
größeren Patientenkollektivs möglich sind. Aber wie bereits oben ausgeführt, beeinflusst das
Fibronectin zwar die Tumorbiologie aber eine prognostische Relevanz wird auch bei
weiterführender Evaluierung für das Peniskarzinom nicht zu erwarten sein.
Zusammenfassung
86
5. Zusammenfassung
Im Nachfolgenden sollen noch einmal die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit unter
Berücksichtigung der in der Einleitung gemachten Zielstellungen Erwähnung finden.
1.
Eine Abhängigkeit zwischen Grading und Höhe des Ki67 – Labeling besteht bei
Peniskarzinomen nicht. Hier stimmen die Ergebnisse der Arbeit mit den Aussagen
anderer Arbeitsgruppen wie z. B. Valente et al. und Matsumoto et al. überein
[86;128].
2.
Ein hoher Ki67 – Index spricht für das Vorliegen einer lymphogenen
Metastasierung, ab einem Label von 60% traten bei allen Patienten
Lymphknotenmetastasen auf, in diesen Fällen sollte also eine Lymphadenektomie
unbedingt angestrebt werden. Bei einer mittleren Ki67 – Expression sollte
ebenfalls eine Lymphadenektomie durchgeführt werden, da auch in dieser Gruppe
bei etwa 50 % der Patienten Lymphknotenfiliae auftraten. Auf eine Entfernung
von Lymphknoten kann man hingegen bei Patienten ohne Risikofaktoren mit
einem schwachen Ki67 – Label verzichten, da bei diesen Tumoren keine
Lymphknotenmetastasen nachweisbar waren. Diese Beobachtungen stimmen mit
den Ergebnissen anderer Arbeiten überein, z. B. konnten Matsumoto et al. und
Lazaris et al. für Plattenepithelkarzinome ebenfalls einen Zusammenhang
zwischen starker Expression von Ki67 und dem Vorliegen lymphogener Filiae
aufzeigen [88;128].
3.
Ab einem Cut off von 50% für den Ki67 – Index zeigt sich im logrank - Test eine
signifikante Verschlechterung des Überlebens, auch dies konnte bereits für
Plattenepithelkarzinome anderer Lokalisationen von anderen Autoren in ihren
Arbeiten bestätigt werden (Xie et al., Valente et al., Padovan et al., Adnane et al.).
Ki67 scheint aus diesem Grund geeignet, als zusätzlicher prognostischer Parameter
für das Peniskarzinom zu fungieren [80;85;86;87].
4.
Die vorliegende Arbeit bestätigt die Auffassung von Ishihira et al., der für
Mammakarzinome
einen
Zusammenhang
zwischen
intrazellulärer
Tenascinexpression sowie starker stromaler Tenascindarstellung und schlechter
Zusammenfassung
Prognose
fand.
85%
der
Peniskarzinome
87
mit
intrazytoplasmatischer
Tenascinexpression waren metastasiert. Die klinische Bedeutung liegt in einer
zusätzlichen
Information
für
Patienten
mit
intrazytoplasmatischer
Tenascinexpression. Hier sollte eine inguinale Lymphadenektomie angestrebt
werden [129;130].
5.
Ein
Einsatz
des
Tenascin
zur
Vorhersage
einer
Metastasierung
beim
Peniskarzinom erscheint problematisch, da die Mehrzahl der Patienten keine
signifikant spezifische Tenascinexpression aufwies. Eine Vorhersage lymphogener
Metastasen war nicht möglich, dies entspricht ebenfalls dem Ergebnis anderer
Autoren [105;129].
6.
Eine prognostische Aussage für den Verlauf der Tumorerkrankung unter
Berücksichtigung der Tenascinexpression war nicht möglich.
7.
Bei
der
Untersuchung
der
invasiven Peniskarzinome
hinsichtlich
ihrer
Fibronectinexpression war keine Vorhersage einer möglichen Filialisierung
möglich. Dies widerspricht zwar der Arbeit von Inufusa et al. (1995), bestätigt aber
die Beobachtungen von anderen Arbeitsgruppen wie z.B. von Pujuguet et al.
(1994), Mandel et al. (1994), Kosmehl et al. (1999) und Zidar et al.
(2001)[105;113;114;115;117].
8.
Da für Fibronectin keine Vorhersage des Lymphknotenstatus möglich war, ist auch
keine prognostische Aussage zum Verlauf der Tumorerkrankung möglich. Auch
dies deckt sich mit den Ergebnissen von anderen Autoren (z.B. Pujuguet et al.
1996, Zidar et al. 2001)[105;114].
Wegen der insgesamt doch kleinen Patientenzahl sind die Ergebnisse dieser Arbeit natürlich
anfechtbar. Deshalb ist die Fortführung der Untersuchungen insbesondere zum Ki67 mit einer
größeren Patientenzahl erforderlich. Hierzu können dann weitere molekularbiologische
Marker, wie z.B. das p53 mit in die Betrachtungen einbezogen werden.
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Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine
Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Schwerin, 05.10.2005
Jens Knödel
Lebenslauf
Name:
Jens Eghard Knödel
geboren:
14.08.1969
Geburtsort:
Döbeln
Wohnhaft:
Bergstraße 25
19055 Schwerin
Familienstand:
verheiratet
Kinder:
1
Nationalität:
deutsch
Schulbildung:
1976 – 1986 Allgemeinbildende Schule Döbeln ( Realschulabschluß )
1986 – 1988 Gymnasium Döbeln ( Abitur )
Wehrdienst:
1988 – 1989
Studium:
1989 – 1995 Studium der Humanmedizin Ernst Moritz Arndt
Universität Greifswald
1995 Staatsexamen
Berufstätigkeit:
Oktober 1995 – März 1997 AiP Urologische Klinik des Medizinischen
Zentrums der Landeshauptstadt Schwerin
April 1997 – März 1998 AiW Klinik für Chirurgie Abteilung
Visceralchirurgie des Medizinischen Zentrums der Landeshauptstadt
Schwerin
April 1998 – März 2003 AiW Urologische Klinik des Medizinischen
Zentrums der Landeshauptstadt Schwerin
April 2003 Prüfung zum Facharzt für Urologie
Seit April 2003 Facharzt für Urologie Urologische Klinik Helios
Kliniken Schwerin
Schwerin, 05.10.2005
Jens Knödel
Danksagung
Diese Dissertation wurde im Zeitraum Dezember 2001 bis Oktober 2005 an der Klinik und
Poliklinik für Urologie sowie am Institut für Anatomie der Medizinischen Fakultät der Ernst
Moritz Arndt Universität Greifswald erstellt.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. med. C. Protzel für die ausgezeichnete
wissenschaftliche Betreuung sowie für den menschlichen Beistand.
Herrn Dr. med. habil. J. Giebel danke ich für die Überlassung der Reagenzien sowie für die
Beratung bezüglich der durchzuführenden immunhistochemschen Arbeitstechniken.
Weiterhin möchte ich Herrn Dr. med. C. Woenckhaus für die Unterstützung bei den
mikroskopischen Auswertungen danken.
Mein Dank gilt des weiteren Herrn Prof. Dr. K. J. Klebingat für die wertvollen fachlichen
Hinweise sowie allen Mitarbeitern des Institutes für Anatomie insbesondere Frau Bansemir
für ihren fachlichen und menschlichen Beistand.
Abschließend möchte ich Herrn Dr. med. R. Hinze für die Bereitstellung der relevanten
histologischen Präparationen aus Schwerin danken.