Über die Koordinierung von Protein-, Polysaccharid

HOPPE-SEYLER'S Z. PHYSIOL. CHEM.
Bd. 349, S. 1037-1048, August 1968
Untersuchungen zur Biosynthese der Chondroitinsulfat-Proteine, II
Über die Koordinierung von Protein-, Polysaccharid- und SulfatesterSynthese im Rippenknorpel von Kälbern
Von TILMANN O. KLEINE, H ANS-JOACHIM KIRSIG und HELMUTH HILZ
Aus dem Physiologisch-Chemischen Institut der Universität Hamburg*
(Der Schriftleitung zugegangen am 4. April 1968)
Zusammenfassung: Der In-vitro-Einbau von 35SOf ,
[14C]Glucosamin und [14C]Serin in gereinigte Chondroitin-4-sulfat-Peptide von Kälberrippenknorpel
wird durch Sulfatanaloga inhibiert.
Diejenigen SWe^-Konzentrationen, welche eine
SOproz. Einbauhemmung in Chondroitinsulfatpeptide bewirken, liegen für Sulfat bei 4 · 10~6M,
fürGlucosaminbeiS · 10~6M, für Serin bei 3 · 1Q-6M.
Die Serin-Inkorporation in das gesamte Knorpelprotein wird jedoch erst durch 2 · 10~5M Selenat,
die anaerobe Glykcüyse durch J · W~\\( Sehnst zcr
50% inhibiert. 4 · 10~6M Selenat führt zu einem Anstau von UDP-7V-Acetyl-hexosaminen.
Molybdat in Konzentrationen von mehr als
5 · 10~4M entkoppelt in steigendem Maße die glykolytische Energieproduktion mit einer entsprechenden Zunahme des ADP/ATP-Quotienten, der Glykolysestimulierung (bis zu 240% der Norm) und
der Hemmung der Makromolekül-Synthese.
Inhibierung der Protein-Synthese durch Puromycin
vermindert nicht nur den Glucosamin- und Sulfat-
einbau in das Chondroitinsulfatpeptid, sondern
führt auch zu einer Anhäufung von UDP-JV-Acetylhexosaminen und aktivem Sulfat in den Knorpelzellen.
Die Auftrennung von Chondroitin-4-sulfat auf
Ecteola-Cellulose-Säulen zeigt eine weitgehend
gleichartige Hemmung des Sulfat-Einbaus in alle
Fraktionen durch Puromycin mit Ausnahme der
höchstsulfatierten Fraktion. Die 35SO|G-lnkorporation in diese Fraktion (3—4% der gesamten
ü'ronsäurej ist nach Vorbehandlung mit Puromycin
viel weniger gehemmt als diejenige in den anderen
Fraktionen.
Diese Befunde stehen in Übereinstimmung mit
einem Synthese-Mechanismus, bei dem die Kettenverlängerung der Polysaccharidkomponente mit
ihrer Sulfatierung gekoppelt ist. Außerdem besteht eine Rückkopplung zwischen Sulfopolysaccharidsynthese und Erstellung der Protein-Polysaccharid-Bindungsregion (Serineinbau).
Summary: Studies on the biosynthesis of chondroitinsulphate proteins, II: Coordination of the synthesis of
protein, polysaccharide and sulphate esters in the rib
cartilage of calves. The incorporation of 35SO|0,
[14C]glucosamine and [14C]serine into purified
chondroitin 4-sulfate peptides in slices of calf cartilage is suppressed by sulphate analogues.
Selenate concentrations that produce a 50% inhibition of incorporation into chondroitin sulphate
are: 4 · 10~6M for sulphate, 5 · 10~6M for glucos-
amine, and 3 · 10~6M for serine, whereas the value
for serine incorporation into total protein is nearly
2 · 10~5M, and for anaerobic glycolysis 1 · 10~4M.
Selenate (4 · 10~6M) also leads to an accumulation
of UDP-7V-acetylhexosamines.
At concentrations above 5 · 10~4M, molybdatecauses an "uncoupling" of glycotytic energy production with a concomitant increase in the ADP/ATP
ratio, stimulation of glycolysis up to 240 %, and an
increased breakdown of macromolecular synthesis.
Abkürzung: S'-Phospho-adenosin-S'-sulfophosphat =
aktives Sulfat.
* Postanschrift: Prof. Dr. H. HILZ, D-2 Hamburg 20,
Martinistraße 52.
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1038
T. O. KLEINE, H.-J. KIRSIG und H. HILZ
Bd. 349 (1968)
The inhibition of protein synthesis by puromycin
not only suppresses glucosamine and sulphate incorporation, but also leads to an accumulation of
active sulphate and UDP-7V-acetylhexosamines.
Chromatography of the chondroitin 4-sulphate on
ecteola cellulose reveals a similar inhibition of sulphate incorporation into all fractions by puromycin, except for the fraction with the highest degree
of sulphation. Sulphate incorporation into this
fraction (3—4% of the total uronic acid), is much
less affected by preincubation with puromycin than
is the incorporation into the other fractions.
These observations are consistent with a mechanism of chondroitin sulphate synthesis, where elongation of the polysaccharide chain is coupled to its
sulphation. In addition, there obviously exists a
control system relating sulphopolysaccharide synthesis to the formation of the protein-polysaccharide linkage region (serine incorporation).
Obgleich in den Chondroitinsulfatproteinen die
Proteinkomponente meist nur 6—20% des Gesamtmoleküls ausmacht, lassen sich diese Verbindungen auch als Proteide mit einer Kohlenhydratkomponente als prosthetischer Gruppe auffassen.
Da die Synthese eines Apoenzyms über die Konzentration der prosthetischen Gruppe gesteuert
wird (vgl.1-3), wäre auch bei der Bildung der Chondroitinsulfatproteine eine ähnliche Regulationsweise denkbar. CAM PO und DziEwiATKOWSKi4 sowie GROSS et al.5 konnten die simultane Synthese
der Hauptkomponenten des Chondroitinsulfatproteins (Polysaccharidketten, Sulfatester, Akzeptorprotein) wahrscheinlich machen. Im Gegensatz
hierzu weisen die Befunde von TELSER et al.6'7 am
isolierten, zellfreien System aus Hühnerembryoknorpel auf eine Dissoziation zwischen Polysaccharidbildung, Sulfatierung und Akzeptorproteinsynthese hin. In dieser Arbeit wird über Versuche berichtet, die Biosynthese der Chondroitinsulfatproteine und ihre Regulation durch Einsatz
spezifischer Inhibitoren der Sulfopolysaccharidbildung bzw. der Proteinsynthese zu analysieren. Die
Untersuchungen wurden mit Knorpelschnitten von
Kälberrippenknorpel durchgeführt, die in vitro fast
ausschließlich Chondroitin-4-sulfat-Protein syn-
thetisieren8. Teile dieser Arbeit wurden 1965 auf der
Tagung der Gesellschaft für Physiologische Chemie in Köln9 und auf der IV. FEBS-Tagung in Oslo
196710 vorgetragen.
Methodik
Knorpelschnitte
Rippenknorpel von Kälbern (3—4 Monate alt) wurde
auf dem Schlachthof unmittelbar nach dem Töten entnommen und auf Eis gelegt. Nach Abtrennen von anhaftendem Gewebe wurde der Knorpel mit einem
Mikrotom in Scheiben von ca. 100 Dicke geschnitten.
Dabei blieb das Perichondn'um zur liefe. Die Knorpelschnitte wurden bis zur Inkubation in einer feuchten
Kammer eisgekühlt aufbewahrt. Ungeschnittener, in
Eis aufbewahrter Knorpel behielt mindestens 3—4 Tage
seine volle enzymatische Aktivität. Einfrieren auf — 20 °C
führte jedoch zur vollständigen Inaktivierung.
Standard-Inkubationsansatz
In viereckigen WARBURG-Gefäßen (Volumen ca. 15 "m/)
mit Seitenbirne wurden Knorpelschnitte (200 bzw.
300 mg Feuchtgewicht) in 2,80 bzw. 4,00 m/ KREBSRiNGER-Lösung (sulfat-arm)* mit Glucose (l l,6mM) bei
37 °C unter Schütteln und mit N2/CO2 (95:5 v/v) als
Gasphase 120 Min. inkubiert und der Gasaustausch gemessen. Zusätze wie Puromycin oder Sulfatanaloga
1
C. L. HAMMEL u. S. P. BESSMAN, Science 154, 1080 wurden der KREBS-RiNGER-Lösung zu Beginn der In[1966].
kubation zugesetzt. Nach 20 Min. Vor-Inkubation wur2
H. S. M ARVER, D. P. TSCHUDY, M. G. PERLROTH u. den aus dem Seitenarm 0,20 m/ KREBS-RING ER-Lösung
A. COLLINS, Science 154, 501 [1966].
mit einer der folgenden radioaktiven Verbindungen zu3
J. WITT u. L. HEILMEYER, Biochem. biophysic. Res. gesetzt:
Commun. 25, 340 [1966].
4
R. D. CAMPO u. D. D. DZIEWIATKOWSKI, J. biol. Che- * End-Konzentration der Lösung mit H2SO4 auf 0,5mM
SO42e eingestellt.
mistry 237, 2729 [1962].
5
8
J. J. GROSS, M. B. MATHEWS u. A. DORFMAN, J. biol.
I. Mitteil. T. O. KLEINE u. H. HILZ, diese Z. 349,
Chemistry 235, 2889 [I960].
1027 [1968], vorstehend.
6
A. TELSER, H. C. ROBINSON u. A. DORFMAN, Proc. nat. 9 H.-J. KIRSIG u. H. HILZ, Abstr. Tag. d. Ges. Physiol.
Chem., Köln 1965.
Acad. Sei. USA 54, 912 [1965].
7
A. TELSER, H. C. ROBINSON u. A. DORFMAN, Arch. 10 T. O. KLEINE, H.-J. KIRSIG u. H. HILZ, Abstr. p. 71,
IV. FEBS meeting Oslo 1967.
Biochem. Biophysics 116, 458 [1966].
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Zur Biosynthese der Chondroitinsulfatproteine, II
Bd. 349(1968)
2,5 C Na235SO4 (trägerfrei, Fa. Buchler & Co.,
Braunschweig)
bzw. 0,5 C [l-14C]Glucosamin (spezif. Aktiv.
oder 5
[6-3H]Glucosamin (spezif. Aktiv. 238 mC/
mMol, New England Nuclear Corp., Dreieichenhain,
Frankfurt)
bzw. 2,5 C [u-14C]L-Serin (spezif. Aktiv. 120 C/ Mol)
oder l C [14C]L-Leucin (spezif. Aktiv. 35,5 <3/
1,
Radiochem. Center Amersham, England).
Bei Versuchen mit [3H]Glucosamin wurde die Glucosekonzentration auf 0,58mM erniedrigt. Auf diese Weise
wurde die Konkurrenz um die Hexokinase zugunsten
des Glucosamins verschoben und die Einbauraten stiegen an. Unter diesen Bedingungen mußte jedoch die
Inkubationszeit auf 90 Min. beschränkt werden, da es
sonst zur Glucose-Verarmung kam. Nach der Inkubation wurden die Gefäße abgekühlt, die Inkubationsflüssigkeit abgegossen und die Schnitte dreimal mit
0,25M Saccharose-Lösung gewaschen. Bei Versuchen mit
35
SC>420 wurde außer Saccharose noch Ammoniumsulfat
(0,5M) zugesetzt. Die Knorpelschnitte wurden dann mit
Papain abgebaut und dialysiert wie beschrieben8.
1039
versuchen 0,07mM SO42e bei Zugabe von 10 C35SO420.
Nach Inkubation wurden die Knorpelschnitte (200 mg)
sofort zwischen Filtrierpapier abgetupft und in 4 ml
,
Phosphatpuffer, pH 7,4, für 2 Min. auf 100°C
erhitzt. Nach raschem Abkühlen und Abzentrifugieren
der Schnitte wurden zu 2 ml Überstand 50 mg Aktivkohle (Merck A.G., Darmstadt) zugesetzt und nach Abzentrifugieren der Überstand verworfen. Darauf wurde
der Kohleniederschlag 5mal mit je 7 ml 0,01 M K2SÜ4
in 0,01 M Na2P2O?, pH 8,0 gewaschen und schließlich
aus dem adsorbierten aktiven [35S]Sulfat mit 3 ml
0,lN HC1 (30 Min. bei 37°C) 35SO420 abhydrolysiert
(vgl.11). Vorversuche ergaben, daß unter diesen Bedingungen weder freies 35SO426> noch Chondroitinsulfat
an die Kohle adsorbiert bzw. hydrolysiert werden. Nach
Abkühlen und Zentrifugieren des Ansatzes wurde vom
Überstand ein Aliquot auf Eisenplättchen im Methandurchflußzähler gezählt. Ähnliche Ergebnisse wurden
erzielt durch elektrophoretische Trennung des HitzeExtraktes sowie nach Extraktion der Knorpelschnitte
mit Trichloressigsäure. Nicht inkubierte Kontrollen
wiesen einen zu vernachlässigenden Radiosulfat-Einbau
in die Fraktion des aktiven Sulfats auf.
Bestimmung des Glucosamineinbaus in die VDP-NBestimmung des SO 4 - Einbaus in Chondroiiin-4-sulfat- Acetyl-hexosaminfraktion
Nach Inkubation unter Standardbedingungen, jedoch
Peptide
3
Die Chondroitinsulfatpeptide wurden mit Cetylpyridi- mit 0,58mM Glucose und 5 C [6- H]Glucosamin
niumcbloFid (3 mg auf l mg Chondroitiasulfat, 30 Min. (spezif. Aktiv. 238 mCi'mbfoi) wurden cfre Schnitte zweibei 37°C) ausgefällt. Der 17000x#-Niederschlag wurde mal mit kalter isotoner Saccharose gewaschen, auf Filter! Glucoszweimal mit 0,lproz. Cetylpyridiniumchlorid in 0,03M papier abgetupft und zusammen mit 40
! UDP-N-Acetyl-glucosamin (Fa.
NaCl gewaschen und mit Äthanol gefällt5. Der in l ml amin und l
Wasser gelöste Niederschlag wurde wie beschrieben Boehringer & Soehne, Mannheim) in 4 ml 0,01 M Phosanalysiert8. In einigen Fällen wurde der Einbau von phatpuffer, pH 7,4, für 2 Min. auf 100°C erhitzt, abRadiosulfat in das Chondroitinsulfat dadurch ermittelt, gekühlt, 3 ml des Überstandes mit 100 mg Aktivkohle
daß die inkubierten und gewaschenen Schnitte unter (Merck) gemischt und nach 60 Min. zentrifugiert. Das
internem Mischen 24 Std. gegen fließendes Leitungs- Kohlesediment wurde 5mal mit 5 ml Phosphatpuffer
wasser dialysiert und der gesamte Inhalt des Dialysier- gewaschen und die Nucleotide zweimal mit 3 ml 50proz.
schlauches dann unter Zusatz von 50
! Na2SO4, wäßriger Pyridinlösung eluiert. Die erhaltenen Über0,3 ml TOproz. HC1O4 und 0,3 ml konz. HNO3 verascht stände wurden mit Chloroform extrahiert, gefrierge!
wurde. Aus dem in 5 ml Wasser aufgenommenen Rück- trocknet und der Rückstand unter Zusatz von 2
stand wurde mit l ml IM Bariumacetat-Lösung das Sul- UDP-W-Acetyl-glucosamin in 60 / Wasser aufgenomfat als BaSO4 ausgefällt. Der abzentrifugierte Nieder- men. Die Nucleotidfraktion wurde sowohl durch Elektroschlag wurde 2mal mit 3 ml Wasser, l mal mit 3 ml phorese (10 V/cm, 8 Std. 4°C, 0,025M Citratpuffer,
Methanol gewaschen, im Vak. über CaCl2 getrocknet pH 5,70) wie durch Papierchromatographie (aufsteigend,
und in l ml Wasser fein suspendiert. Davon wurden 96proz. Äthanol/1 M Ammoniumacetat 7:3 (V/V);
0,4 ml auf Aluminiumplättchen im Methandurchfluß- Schleicher-&-Schüll-Papier 2043 b) getrennt, die UDP7V-Acetyl-hexosamin-Fraktion ausgeschnitten und mit
zähler (Friesecke & Höpfner, Erlangen) gezählt.
Dioxanszintillator auf Radioaktivität analysiert. Beide
Trennmethoden ergaben vergleichbare Werte.
Bestimmung des ^ SO/?Q -Einbaus in aktives Sulfat
erDie Standard-Inkubationsbedingungen wurden wie folgt Die Hitzeextraktion der UDP-TV-Acetyl-hexosamine
3
geändert: Bei den Versuchen mit Selenat und Molybdat gab 90 % Ausbeute, wenn den Schnitten H-markiertes
betrug die SO420-Konzentration im Medium 0,25mM bei UDP-W-Acetyl-glucosamm zugesetzt wurde. Andere
Extraktionsverfahren wie Zerkleinerung der in flüssiger
einem Angebot von 20 C 35SO420, bei den PuromycinLuft eingefrorenen Schnitte und anschließende längere
11
P. W. ROBBINS u. F. LIPMANN, J. biol. Chemistry 229, Einwirkung von kalter 4proz. Perchlorsäure ergaben
857 [1957].
niedrigere Werte.
35
2
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1040
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In den abzentrifugierten Knorpelschnitten wurde der
Einbau des radioaktiven Glucosamins in das Chondroitinsulfat nach Papainverdauung und Cetylpyridiniumchlorid-Fällung bestimmt.
Markierung und Bestimmung des Gesamtproteins in
Knorpelschnitten
Nach Inkubation unter Standardbedingungen wurden
die auf Filterpapier getrockneten Knorpelschnitte gewogen. Ein Drittel des Gesamtgewichtes diente der
Protein-Analyse, aus den restlichen 2/a wurde nach
Papainverdauung die Chondroitinsulfat-Fraktion isoliert. Zur Analyse der Proteine wurden die Schnitte
2 Std. mit 5proz. Trichloressigsäure (0°C) und anschließend 20 Std. mit kaltem Aceton extrahiert. Dann
wurde in 2 m/ Sproz. Trichloressigsäure 20 Min. bei
90°C erhitzt, der Niederschlag bei 6000 U./Min. abzentrifugiert, gewaschen und in 2 m/ 0,5N KOH gelöst.
Nach Abzentrifugieren des unlöslichen protein-freien
Anteils wurde das Protein im Überstand nach der Biuretmethode und die Radioaktivität wie beschrieben8 ermittelt.
Bd. 349(1968)
Tab. 1. Wirkung verschiedener Sulfatanaloga auf den
35
SO420-Einbau in die Sulfopolysaccharidfraktion und
auf die anaerobe Glykolyse. Die Absolutwerte der Kontrolle für 100 mg Knorpelschnitte aus 4—6 Bestimmungen betragen bei 35SO42ö-Einbau: 12089 ± 2380 Ipm,
bei der CO2-Produktion: 0,72 ± 0,05
CO2
(Standard ab weichung).
Standardbedingungen
mit
150 Min. Inkubation bei gleichzeitiger Zugabe von
35
4
SO420 und Analogen. Der Sulfateinbau in das
Chondroitinsulfat wurde durch erschöpfende Dialyse
und Veraschung der polymeren Fraktion ermittelt
(s. Methodik).
Anion
(l · 10-4M)
35
SO420-Einbau
(Kontrolle = 100)
SO32e
Se0420
CrO420
2
4
20
WO4
71
5,5
10,3
79
81
CO2-Produktion
(Kontrolle = 100)
105
65
37
119
97
Ergebnisse
/. Versuche zur spezifischen Hemmung der Chondroitinsulfatsynthese
Die Prüfung verschiedener SuJ/aiaualo^a (9·12·13)
an Kälberrippenknorpelschnitten ergab bei einer
Konzentration von l · 10~4M in allen Fällen eine
Hemmung des Sulfateinbaus in die Sulfopolysaccharidfraktion (Tab. 1). Die gleichzeitige Messung der (anaeroben) Glykolyserate deutete aber
darauf hin, daß vor allem im Falle des Chromats
eine Inhibierung der Chondroitinsulfatsynthese
nicht allein über eine Hemmung der Synthese des
aktivierten Sulfats zustande kommt, sondern in beträchtlichem Maße auch über eine Störung der
Energieproduktion. Wir wählten deshalb für die
vorgesehenen Versuche zunächst Molybdat, das bei
der Konzentration l · 10~4M zwar eine nur mäßige
Hemmung der Chondroitinsulfatbildung, aber auch
keine Glykolysehemmung bedingt.
a) Die Wirkung von Molybdat auf die Chondroitinsulfatsynthese
Wie Abb. l vermittelt, zeigt die Hemmung der
Chondroitinsulfatsynthese durch steigende Mengen
Molybdat eine zweiphasige Abhängigkeit. Der rela12
H. HILZ u. F. LIPMANN, Proc. Nat. Acad. Sei. USA
41, 880 [1955].
13
L. G. WILSON u. R. S. BANDURSKI, J. biol. Chemistry
233, 975 [1958].
200
150
* 100
Prot
MoO**lMol/l]——
Abb. 1. Der Einfluß von Molybdat auf anaerobe Glykolyse, Chondroitinsulfat- und Proteinsynthese in Knorpelschnitten. Die Synthese von Chondroitinsulfat wurde
mittels 35SO42ö-Einbau (gemäß den Angaben der Legende von Tab. 1), diejenige von Protein mittels [14C]Leucin-Einbau (s. Legende zu Tab. 2) bestimmt.
150 Min. Inkubation unter Standardbedingungen
(20 Min. Vorinkubation mit Molybdat).
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Zur Biosynthese der Chondroitinsulfatproteine, II
1041
Tab. 2. Entkoppelnde Wirkung von Molybdat auf die anaerobe Glykolyse in Knorpelschnitten. Alle Werte beziehen
sich auf 100mg Knorpel-Feuchtgewicht. 400mg Knorpelschnitte wurden unter Standardbedingungen (20 Min.
Vorinkubation mit Molybdat) mit l € [14C]L-Leucin in 5 m/ Medium für 150 Min. inkubiert, in flüssiger Luft eingefroren, zerkleinert und mit 7 m/ 3proz. HC1O4 30 Min. extrahiert und abzentrifugiert. Nach Neutralisation mit
KHCO3 wurde im klaren Überstand ATP mit Hexokinase und ADP mit Pyruvatkinase bestimmt14. Der extrahierte
Rückstand wurde nach erschöpfender Dialyse gegen Leitungswasser mit Papain verdaut 8 und ein Aliquot im
Methan-Durchflußzähler gezählt (Leucin-Einbau). Für den 35SO420-Einbau gelten die in Tab. l beschriebenen
Bedingungen.
Molybdat
[Mol//]
—
3·
1·
3·
"4
-3
-3
ATP/ADP
[
1,86
1,41
1,15
0,28
Glykolyse
! CO2] [%]
0,66
1,14
1,62
1,32
tiv flache Kurvenverlauf im Bereich zwischen
l · 10~5M und 3 · 10~4M Molybdat wird bei höheren
Konzentrationen abgelöst von einer Kurve, die sich
rasch der vollständigen Inhibierung nähert. Offensichtlich wird hier der erste Hemmungstyp überlagert von einer vermutlich unspezifischen Schädigung. Das ergibt sich auch aus dem Verlauf des
Aminosäuren-Einbaus: Im Konzentrationsbereich
zwischen 5 · 10~5 und 3 · 10~4M erfolgt nur eine gering Be&jiflussung. Molyboatkonzentrationen von
10~3M und darüber bewirken jedoch eine starke
Inhibierung. Der Bereich der unspezifischen Schädigung von Sulfat- und Aminosäuren-Einbau entspricht gleichzeitig einer maximalen Stimulierung
der Glykolyse. Alle drei Phänomene lassen sich
durch eine „entkoppelnde" Wirkung des Molybdats auf die -glykolytische Energieerzeugung erklären: Wie Tab. 2 demonstriert, kommt es mit
steigender Molybdatkonzentration zu einer immer
stärkeren ATP-Verarmung, in deren Gefolge die
Glykolyse stimuliert, die Synthese von Makromolekülen aber reduziert wird.
Trotzdem zeigen die Versuche, daß in einem niedrigen Konzentrationsbereich Molybdat eine vermutlich spezifische Hemmung der Chondroitinsulfatsynthese bewirkt. Diese spezifische Hemmung
kommt über eine Beeinträchtigung der Synthese des
aktiven Sulfats zustande (Abb. 2 oben). Die
„Durchmarkierung" des aktiven Sulfats, bei der
ein Gleichgewicht zwischen spezifischer Aktivität
des freien Sulfats und des aktiven [35S]Sulfats
in den Knorpelschnitten erreicht wird, ist nach
14
H. A. ADAMS in Method, d. enzymat. Analyse, S. 539
u. 573 (H. U. BERGMEYER, Ed.), Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1962.
100
173
245
200
[14C]Leucin-Einbau
[Ipm]
[%]
6275
5507
4037
870
35
SO420-Einbau
[Ipm]
[%]
100
88
64
14
8531
5768
955
-
100
68
11
—
5—10 Min. zu beobachten. Unter diesen Bedingungen stellt die Hohe der Markierung von aktivem Sulfat ein Maß für seine Konzentration
dar. 2 · 10~4M Molybdat bedingt demnach ein Absinken der normalen Menge an aktivem Sulfat
auf ca. 57%. Aber auch die Sulfopolysaccharidsynthese ist unter diesen Bedingungen etwa auf die
Hälfte vermindert. Im Bereich der spezifischen
Hemmung der Chondroitinsulfatbildung durch
Molybdat ist aucn der Leucin-Einöau m cfie Knorpelproteine in geringem, doch deutlichen Ausmaß
(Abb. 1) betroffen. Dies deutet daraufhin, daß eine
enge Beziehung zwischen einem Teil der Proteinsynthese und der Chondroitinsulfatbildung existieren muß. Die spezifische Wirkung des Molybdats
erstreckt sich aber nur auf einen relativ kleinen,
noch wenig wirksamen Konzentrationsbereich. Die
weiteren Untersuchungen wurden deshalb mit
Selenat vorgenommen.
b) Inhibierung der Chondroitinsulfatsynthese durch
Selenat
Selenat in einer Konzentration von 8 · 10~5M hemmt
den Einbau von 35SOfe, [14C]Glucosamin und
[14C]Serin in gereinigtes Chondroitinsulfat fast
vollständig (Tab. 3). Diese Hemmung kommt jedoch nicht über eine Blockierung der Bildung von
aktivem Sulfat zustande. Wie die untere Hälfte
der Abb. 2 zeigt, erreicht die Synthese von aktivem
Sulfat in Gegenwart von Selenat (2 · 10~4M)
zwar nur 81% der Kontrollansätze und indiziert
damit eine partielle Hemmung der Sulfat-Aktivierung. Die Sulfatierung von Chondroitinsulfat ist
jedoch weit stärker inhibiert. Dies scheint zunächst
auf eine unspezifische Wirkung des Selenats hin-
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1500
Abb. 2. Hemmung des 35SO42e-Einbaus in aktives Sulfat (PAPS) und in Chondroitinsulfc (ChS) durch
2 · 10~4M Molybdat (oben) und 2 · 10~4M Selenat (unten). Inkubation unter Standardbedingunge (20 Min. Vorinkubation mit Molybdat bzw. Selenat). Analytik gemäß den Bedingungen der Legende von To. 1.
zuweisen. Durch folgende Beobachtungen wird jedoch eine primäre und spezifische Hemmung der
Sulfatierungsreaktion durch niedrige Selenatkonzentrationen wahrscheinlich gemacht:
Die Energieproduktion (gemessen an der Glykolyse,
die unter den anaeroben Verhältnissen als einzige
Reaktionsfolge ATP erzeugen kann) wird zwar bei
hohen Selenatkonzentrationen partiell gehemmt.
Dies erklärt aber weder die Hemmung des Sulfat-
einbaus noch die der Glucosamin-und Senn-Inkorporation in Chondroitinsulfatpotide (Abb. 3).
Auch der Anstau der energiereihen UDP-7VAcetyl-hexosamine, der bei Inhibieang der Chondroitinsulfatsynthese durch niedrie (4 · 10~6M)Selenat-Konzentrationen (Abb. 4) bobachtet wird,
setzt eine intakte Energieproduktin voraus. Ein
Anstau der UDP-Derivate ist selfct bei höheren
Selenatkonzentrationen (8 · 10~5M) och zu sehen.
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Tab. 3. Spezifische Aktivit t verschiedener Reinigungsstufen des Chondroitinsulfatpeptids. Mittelwerte aus 2—4 Versuchen mit mittlerer Abweichung. Die Werte wurden in Ipm/μΜοΙ Glucurons ure angegeben. Ermittlung der Radioaktivit t erfolgte auf Alu-Pl ttchen im Methan-Durchflu z hler. Inkubation unter Standardbedingungen (200 mg
Knorpelschnitte). 20 Min. Vorinkubation mit Selenat (8 · 10~5M) bzw. Puromycin (5 · 10~5M). Reinigung des markierten Chondroitinsulfatpeptids nach Papainverdauung und wiederholter Umf llung mit Cetylpyiidiniumchlorid
(CPC). Weitere Details sind im experimentellen Teil beschrieben.
Radioaktive
Vorstufe
Zus tze
—
Selenat
Puromycin
14
C-Glucosamin —
Selenat
Puromycin
14
—
C-Serin
Selenat
Puromycin
35
SO42e
Dialysat nach
Papainverdauung
[Ipm]
[%]
2490 ± 293 100
400 dz 42 16
448 ± 11 18
136 ± 16 100
36 ± 1 26
78 dz 27 57
338 ± 69 100
41 dz 9 12
5
17 dz 4
l.CPC-F llung
[Ipm]
[%]
2708 .dz 406 100
331 d: 23 12
381
14
127 ± 12 100
32 dz 3 25
34 dz 1 28
282 dz 20 100
2
5zt 1
3
9dz 1
2. CPC-F llung
[Ipm]
[%]
3384 dz 233 100
394 dz 46 12
15
507 .
171 ± 38 100
38 dz 3 22
41 ± 4 24
—
—
3. CPC-F llung
[Ipm]
[%]
3098 ± 12 100
333 dz 49 11
20
606
180 ±31 100
43 dz 1 24
47 dz 3 26
—
—
ΊΜοΙ/lJ
Abb. 3. Der Einflu der Selenatkonzentration auf die Inkorporation verschiedener Vorstufen in Chondroitinsulfatpeptide. 300 mg Knorpelschnitte wurden 90 Min. mit 2,5 μC [14C]L-Serin bzw. mit 5 μC [3H]Glucosamin und
0,5 μC 35SO420 (Doppelmarkierung) unter Standardbedingungen inkubiert. Die Isolierung des Chondroitinsulfatpeptides erfolgte durch Cetylpyridiniumchlorid-F llung, die gesamten Knorpelproteine wurden als Biuretprotein
bestimmt. Die absoluten Kontrollwerte betrugen: 22822 Ipm/mg Protein f r die Summe [34C]Serin-markierter Knorpelproteine; 378 Ipm/μΜοΙ Glucurons ure f r [14C]Serin-markierte, 4429 Ipm/μΜοΙ Glucurons ure
f r 35SO420-markierte und 7951 Ipm/μΜοΙ Glucurons ure f r [3H]Glucosamin markierte Chondroitinsulfatpept:de. Die Kontrollwerte f r die CC>2-Produktion sind aus Tab. l ersichtlich, a) · 0: Anaerobe Glykolyse;
c
o: Serineinbau in das Gesamtprotein; 3
3: Serineinbau in Chondroitinsulfatpeptide. b) · ·:
Glucosamineinbau in Chondroitinsulfat; o
o: Sulfat-Einbau in Chondroitinsulfat.
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3000-
Se
UDP-HexNAc
ChS
10002000
Kontr.
Kontr.
500-
mo·
30
60
90
t [Min.]
3
Abb. 4. UDP-7V-Acetyl-[ H]hexosamin-Anstau (a) und Hemmung des [3H]Glucosamineinbaus in Chondroitinsulfat (b) durch 4 · 10~6M Selenat. 300 mg Knorpelschnitte wurden unter Standardbedingungen inkubiert und die
UDP-A^-Acetyl-[3H]hexosamin-Fraktion wie in der Methodik beschrieben gemessen. Die Radioaktivität der Chondroitinsulfatpeptide wurde nach Papainverdauung und Cetylpyridiniumchlorid-Fällung bestimmt (s. Methodik).
Empfindlicher als die Energieproduktion reagiert
die generelle Proteinsynthese auf Selenat (Abb. 3).
Bei 2 · 10~5M ist der Serin-Einbau bereits zu 50%
gehemmt. Ähnlich verhält sich auch der Einbau
anderer markierter Aminosäuren. Trotzdem erklärt
auch diese vielleicht unspezifische* Wirkung nicht
die bedeutend empfindlichere Reaktion derjenigen
Parameter, welche die De-novo-Synthese von Chondroitinsulfatprotein indizieren (Abb. 3): Die 50%Hemmung für den Serineinbau in das Gesamtprotein liegt bei 2 · 10~5M Selenat, während der
Glucosamineinbau schon bei ca. 5 · 10~6M, der
Sulfateinbau bei 4 · 10~6M Selenat zur Hälfte inhibiert sind.
//. Hemmung der Chondroitinsulfatproteinsynthese
durch Puromycin
Vorinkubation von Knorpelschnitten mit 5 · 10^"5M
Puromycin für 20 Min. unterbindet fast vollständig
* Nach SCHUBERT machen die Protein-Polysaccharide
ca. 50% der Trockenmasse des Knorpelgewebes aus15.
Eine spezifische Hemmung dieser Komponente sollte
sich dann auf jeden Fall in der Markierung des Gesamtproteins bemerkbar machen.
15
J. MALAWISTA u. M. SCHUBERT, J. biol. Chemistry
230, 535 [1958].
die Inkorporation von [I4C]Serin in das Chondroitinsulfatpeptid (Tab. 3). Gleichzeitig erfahren
aber auch Sulfat- und Glucosamineinbau eine drastische Reduktion. Die so indizierte Inhibierung
von Polysaccharid- und Sulfopolysaccharidsynthese äußert sich auch in einem Ansiau der aktivierten Vorstufen UDP-N-Acetyl-hexosamin (Tab. 4)
und aktives Sulfat (Abb. 5). Zwar besteht ein
definitiver Einfluß von Puromycin auf die Glykolyse (Tab. 4); doch lassen sich damit die beobachteten Phänomene nicht erklären.
Die Inhibierung der Sulfopolysaccharidbildung
durch Puromycin tritt nicht sofort in voller Stärke
auf, sondern entwickelt sich im Verlauf der Inkubation (Abb. 5). So ist die Hemmung zum Zeitpunkt 90 Min. (+20 Min. Vorinkubation) fast
vollständig, während in den ersten 30 Min. weniger
als 50% Inhibierung zu beobachten ist.
Eine Auftrennung der Chondroitinsulfatketten an
Ecteola-Cellulose zeigt, daß alle Ketten (bezüglich
Heterogenität vgl. vorhergehende Arbeit8) eine
ähnliche Inhibierung des Sulfateinbaus durch
Puromycin erfahren (Tab. 5). Die einzige Ausnahme bildet die (letzte) Fraktion VII (Sulfatierungsgrad > 1), deren Sulfateinbau durch Puromycin weit weniger gehemmt wird. Diese Fraktion
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1045
Zur Biosynthese der Chondroitinsulfatproteine, II
Tab. 4. UDP-7V-Acetyl-hexosamin-Anstau und Hemmung der anaeroben Glykolyse durch 5 · 10~5M Puromycin in
Knorpelschnitten. 300 mg Knorpelschnitte wurden mit l μΟ [14C]Glucosamin 30 Min. unter Standardbedingungen
(20 Min. Vorinkubation ± Puromycin) inkubiert und die 14C-Markierung der UDP-W-Acetyl-hexosaminfraktion
sowie die anaerobe Glykolyse (120 Min. Inkubation) gemessen, wie im methodischen Teil beschrieben.
Kontrolle
Puromycin
In Vielfachen
der Kontrolle
(= 1,00)
162 ± 10
2,46 i 0,33
209 ± 26
1,58± 0,23
1,29
0,64
Parameter
UDP-W-Acetyl-hexosamin-Markierung [Σ Ipm]
Anaerobe Glykolyse [μΜο! CO2/120 Min.]
b)
' Kontr.
ί
".20-
+Pur.
t fMin.J -
30
60
Abb. 5. Anstau von aktivem Sulfat (a) und Hemmung der Chondroitinsulfatsynthese (b) in Knorpelschnitten
durch 2 · 10~4M Puromycin (Pur.). 200 mg Knorpelschnitte wurden mit 10 μΟ 35SO426> unter Standardbedingungen (20 Min. Vorinkubation) inkubiert und der Radiosulfat-Einbau in die aktives Sulfat enthaltende Fraktion,
wie in der Methodik angegeben, gemessen. Die Chondroitinsulfatsynthese wurde nach ersch pfender Dialyse
der Knorpelschnitte gegen Tr gersulfat durch Isolierung des markierten Sulfates nach Veraschung bestimmt
(s. Methodik).
Die gegen ber Tab. 3 und 5 etwas geringere Hemmung der Sulfat-Inkorporation durch Puromycin ist vermutlich
durch die unterschiedliche Aufarbeitung bedingt.
enth lt 4% der gesamten Urons ure und 7% des
Estersulfates. Eine gewisse Beimengung dieser
Fraktion scheint noch in der vorhergehenden Fraktion VI enthalten zu sein. Die gleichen Ergebnisse
werden auch erzielt, wenn man die Polysaccharid-
fraktion nach Papainverdauung mit Cetylpyridiniumchlorid umf llt. Trotzdem deutet das Hexosamin/Urons ure-Verh ltnis von ca. 1,1 auf eine geringe Verunreinigung dieser beiden Fraktionen mit
Keratansulfat hin.
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T. O. KLEINE, H.-J. KIRSIG und H. HILZ
Bd. 349 (1968)
Tab. 5. Der Einfluß von Puromycin auf die spezifische Markierung der Sulfatester von Chondroitinsulfatpeptiden
nach Ecteola-Chromatographie. Alle Werte beziehen sich auf 1300mg Knorpelschnitte. Nach In-vitroMarkierung der Schnitte mit 35SO42e (10 €/300 mg Feuchtgewicht ± 5 · 10~5M Puromycin, 20 Min. Vorinkubation), Papainverdauung und Dialyse erfolgte die Fraktionierung auf einer Ecteola-Cellulosesäule (vgl. 8 und
Methodik). Bezifferung vgl. Legende zu Tab. 9 der vorangehenden Arbeit8.
Fraktion
NaCl-Konzentration
im Eluat
[Mol//]
Nr.
I + 11
III
IV
v
VI
VII
0,10
0,25
0,50
0,75
1,00
2,00
Uronsäure [
Kontrolle
Puromycin
6,7
33,4
43,5
21,5
16,0
4,6
3,4
22,0
54,8
22,9
18,0
4,3
Diskussion
In dieser Arbeit wurde versucht, auf zwei Fragen
eine Antwort zu finden:
1. Gibt es eine Kopplung zwischen Sulfatierung,
Polysaccharidsynthese und Verknüpfung der Chondroitinsulfatkette mit dem Akzeptorprotein?
2. Liegt der geschwindigkeitsbestimmende Schritt
der Chondroitinsulfatprotein-Synthese bei der Bildung des Sulfopolysaccharids oder bei der Erstellung der Proteinkomponente — analog der Coenzym-Induktion ?
Spezifische Hemmung der Chondroitin-4-sulfat-Proteinsynthese durch Sulfatanaloga
Die Synthese des Chondroitinsulfats im Chondroitinsulfatprotein erfordert als essentiellen Schritt
die Übertragung der Sulfatgruppe vom aktiven Sulfat auf eine präformierte Oligo- oder Polysaccharidkette6'7' 9.16-18. Eine spezifische Unterbindung der
Synthese des aktiven Sulfats muß daher zu einem
Ausfall der Sulfatierungsreaktion führen. Untersuchungen von HILZ und LiPMANN12 hatten gezeigt,
daß Selenat die In-vitro-Synthese von /?-Nitrophenylsulfat aus anorganischem Sulfat und /?-Nitrophenol in Säugetierleber durch Hemmung der
Bildung des aktivierten Sulfats inhibiert. WILSON
16
]
E. MEEZAN u. E. A. DAVIDSON, J. biol. Chemistry 242,
4956 [1967].
17
S. SUZUKI u. J. L. STROMINGER, J. biol. Chemistry
235, 257, 267, 274 [I960].
18
F. D'ABRAMO u. F. LIPMANN, Biochim. biophysica
Acta [Amsterdam] 25, 211 [1957].
Spezif. Aktivität der Sulfatgruppen
[Ipm/
SO420]
Kontrolle Puromycin In % der
Kontrolle
2680
2740
3500
—
8320
17700
274
307
420
675
1580
8020
10
11
12
—
19
45
und BANDURSKi13 erweiterten diesen Befund und
fanden, daß die ATP-Sulfurylase aus Hefe mit
verschiedenen sulfatanalogen Verbindungen (SO|G,
SeO2©, CrOf©, MoOf 0 und WO|Ö) reagiert.
Erwartungsgemäß hemmen alle diese Sulfatanaloga
den Einbau von Radiosulfat in die Chondroitinsulfat-Fraktion des Kälberrippen-Knorpels, jedoch nicht allein durch die Drosselung der
Synthese von aktivem Strffef, SftrideYfi z. T.
auch durch die Beeinflussung der Energieproduktion. Im Hühnerembryoknorpel hatten BOYD und
NEUMANN19 schon früher eine Inhibierung der
35
SOfe-ChondroitinsulfatmarkierungdurchMolybdat und Selenat beobachtet und sie auf eine Atmungshemmung zurückgeführt. Diese Deutung ist
für unsere Versuche irrelevant, da hier die Knorpelschnitte unter anaeroben Bedingungen inkubiert
wurden.
Wirkungen des Molybdais
Molybdat zeigt unter diesen Bedingungen eine entkoppelnde Wirkung auf die Glykolyse. Eine Ähnlichkeit mit der Arsenatwirkung auf die Glykolyse20"22 ist auffallend: In beiden Fällen scheint es
letztlich zu einer ATPase-Wirkung auf Grund spon19
E. BOYD u. W. F. NEUMAN, Arch. Biochem. Biophysics 51, 475 [1954].
20
O. WARBURG, Wasserstoffübertragende Fermente,
S. 46, Ed. Contor Freiburg i. Br. 1949.
21
O. MEYERHOF, P. OHLMEYER u. W. MÖHLE, Biochem.
Z. 297, 90 [1938].
22
D. M. NEEDHAM u. P. K. PILLAI, Biochem. J. 31,1837
[1937].
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Bd. 349 (1968)
Zur Biosynthese der Chondroitinsulfatproteine, II
taner Hydrolyse energiereicher Verbindungen (1Arsenoglycerat-3-phosphat bzw. Adenylmolybdat)
zu kommen. Die Verschiebung im AdeninnucleotidSystem zugunsten von AMP-ADP erzwingt über
wohl allosterische Beeinflussung der glykolytischen
Schlüsselenzyme die beschleunigte Bildung von
Lactat. Damit ist freilich auch die Signifikanz der
Molybdatwirkung für die Frage der Koordination
der Chondroitinsulfatprotein-Synthese weitgehend
eingeschränkt. Für eine spezifische Hemmung der
Synthese des aktiven Sulfats dürfte nur derjenige Konzentrationsbereich von sulfatanalogen
Verbindungen infrage kommen, in dem weder die
Energieproduktion noch die generelle Synthese von
Makromolekülen in den Knorpelzellen beeinträchtigt wird. Dieser Bereich ist für Molybdat sehr
klein, für Selenat liegt er jedoch günstiger.
Wirkungen des Selenats
Selenat bewirkt neben einer partiellen Hemmung
der Sulfataktivierung eine starke Inhibierung der
Sulfatierung des Chondroitinsulfates. Möglicherweise kann dies durch eine Hemmung der Sulfokinase-Aktivität durch Analoga des aktiven
Sulfats wie Adenosin-5'-selenophosphat oder 3'Phospho-adenosin-5'-setenophosphat erklärt werden, die in wäßriger Lösung eine gewisse Beständigkeit aufweisen13.
Spezifität der Unterbindung der Sulfatierung durch
niedrige Selenatkonzentrationen (<10~5M)
Weder die Energieversorgung, noch der Einbau von
Serin in das gesamte Knorpelprotein sind unter diesen Bedingungen signifikant betroffen. Trotzdem
kommt es nicht nur zu einer Inhibierung des Sulfateinbaues in das Chondroitinsulfatpeptid, sondern
auch simultan zu einer fast gleichstarken Hemmung
der Glucosamin- und der Serin-Inkorporation. Zu
diesen Zeichen der gehemmten Polysaccharidbildung ist auch der Anstau von UDP-7V-Acetylhexosaminen in der Knorpelzelle zu zählen. Die
Befunde demonstrieren eine enge Kopplung zwischen dem Aufbau der Polysaccharidketten und
deren Sulfatierung.
Im Zusammenhang mit diesen Beobachtungen stehen auch Untersuchungen des Arbeitskreises um
DoRFMAN6, welche die Hemmungen der Polysaccharidkettenbildung durch 5-Oxo-6-diazo-norleucin zeigen. Dabei erfolgte gleichzeitig eine
erniedrigte Inkorporation von 35SO|e (und [14C]Serin) in das Chondroitinsulfatpeptid, sofern das
1047
System aus „minced cartilage" (wahrscheinlich
ganzen Knorpelzellen) bestand. Auch diese Befunde demonstrieren, daß in der intakten Knorpelzelle eine strenge Kopplung zwischen Polysaccharidsynthese und Sulfatierung besteht. Ein ähnliches
Postulat wurde kürzlich von DAVIDSON und Mitarbeitern erhoben16. Da sowohl nach Inhibierung
der Sulfatierung durch Selenat als auch nach Hemmung der Polysaccharidkettensynthese durch
5-Oxo-6-diazo-norleucin der Einbau von Serin in
das Chondroitinsulfatpeptid* ebenfalls sehr stark
retardiert ist, muß die Erstellung der „Bindungsregion" Ser-Xyl-Gal-Gal in die Rückkopplungshemmung mit einbezogen sein.
Hemmung der Chondroitin-4-sulfat-Proteinsynthese
durch Puromycin
Wird die Synthese der Proteinkomponente durch
Puromycin gehemmt, so resultiert eine drastische
Verminderung des Sulfat- und Glucosamin-Einbaus in das Chondroitinsulfat. Die Synthesehemmung durch Puromycin im Knorpel kann durch
Auswaschen reversibel gestaltet werden24. Obwohl
Puromycin eine deutliche Wirkung auf die Glykolyse entfaltet, dürfte die Hemmung der Sulfopolysaccharidbildung über die Blockierung der (Akzeptor-)Proteinsynthese zustande kommen. Diese
Interpretation erfährt eine wesentliche Stütze durch
den Befund, daß Vorstufen der Sulfopolysaccharidketten wie UDP-7V-Acetyl-hexosamin und aktives
Sulfat unter diesen Bedingungen akkumuliert werden. Eine Anhäufung von UDP-Hexosaminen bei
der Hemmung der Glykoproteinsynthese25"29 und
der Chondroitinsulfatbildung6 wurde schon mehrfach beobachtet.
* Bei der Abspaltung der Proteinkomponente durch
Papain verbleiben die Serinreste der Bindungsregion an
der Polysaccharidkette (vgl. 23).
23
H. Mum, Biochem. J. 69, 195 [1958].
24
G. DE LA HABA u. H. HOLTZER, Science 149, 1263
[1965].
25
S. KORNFELD, R. KORNFELD, E. F. NEUFELD u. P. J.
O'BRIEN, Proc. nat. Acad. Sei. USA 52, 311 [1964].
26
C. J. BATES, W. R. ADAMS u. R. E. HANDSCHUHMACHER, J. biol. Chemistry 241, 1705 [1966].
27
G. W. M. COOK, M. T. LAICO u. E. H. EYLAR, Proc.
nat. Acad. Sei. USA 54, 247 [1965].
28
J. MOLNAR, R. A. LUTES u. R. J. WINZLER, Cancer
Res. 25, 1438 [1965].
29
J. MOLNAR u. D. SY, Biochemistry [Washington] 6,
1941 [1967].
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1048
Zur Biosynthese der Chondroitinsulfatproteine, II
Bd. 349(1968)
Die Kinetik der Puromycinhemmung indiziert, daß
in den Knorpelzellen ein gewisser Vorrat an Akzeptorprotein vorhanden ist, der noch für einige Zeit
die Bildung des Chondroitinsulfatproteins erlaubt.
Der allmählich einsetzende Mangel an Akzeptorprotein führt jedoch zu einer Hemmung der Polysaccharidbildung wie auch der Sulfatierung. Da die
prozentuale Inhibierung der Sulfatinkorporation
eher größer ist als die des Glucosamineinbaus, müssen Kettenverlängerung und Sulfatierung simultan
erfolgen. Doppelmarkierungsversuche mit 35SO|e
und [3H]Glucosamin zeigen ein gleichartiges Einbauverhältnis dieser beiden Vorstufen in verschieden langen Chondroitinsulfatketten, ein weiteres
Argument für simultane Polysaccharidkettenverlängerung und Sulfatierung31. Die einzige Ausnahme stellt ein sehr kleiner Teil der Sulfopolysaccharide (4%, Sulfatierungsgrad > 1) dar, der in
Anwesenheit von Puromycin eine weit geringere
Hemmung der Sulfatinkorporation aufweist. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei nicht um eine unspezifische Persulfatierungsreaktion von Chondroitinsulfat (vgl. 1. c.16»30), sondern um den er-
höhten „turnover" eines Sulfopolysaccharides, da
die spezifische Aktivität der Sulfatgruppe und der
Hexosaminkomponente gegenüber denjenigen der
anderen Fraktionen deutlich erhöht ist31. Aus diesen Versuchen mit Puromycin ist jedenfalls zu folgern, daß der limitierende Prozeß für die Chondroitinsulfatproteinsynthese in der Bildung der
Chondroitinsulfatkomponente zu suchen ist. Die
Erstellung dieses Chondroitin-4-sulfat-Proteins
wird somit nach anderen Grundsätzen reguliert
als die coenzymgesteuerte Synthese bestimmter
Enzyme.
Nicht vereinbar sind unsere Beobachtungen mit der
an zellfreien Systemen entwickelten Vorstellung,
daß Sulfatierung, Polysaccharidbildung und Akzeptorprotein-Synthese unabhängig voneinander verlaufen6» 7.
30
31
E. MEEZAN u. E. A. DAVIDSON, J. biol. Chemistry 242,
1685 [1967].
Diese Arbeit wurde durch Beihilfen der DEUTSCHEN
FORSCHUNGSGEMEINSCHAFT unterstützt.
Fräulein K. KLAPPROTH danken wir für wertvolle technische Mitarbeit.
H.-J. BUBENZER, T. O. KLEINE u. H. HILZ, Abstr. p.
124, V. FEBS-meeting Prag 1968.
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