Vergleichende molekulargenetische Untersuchungen - E-LIB

Zentrum für Humangenetik
VERGLEICHENDE MOLEKULARGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN
BENIGNER MESENCHYMALER UND MALIGNER EPITHELIALER TUMOREN
UNTER BESONDERER BERÜCKSICHTIGUNG DES SCHILDDRÜSENKARZINOMS
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Doctor rerum naturalium)
Vorgelegt dem Promotionsausschuß des Fachbereichs 2,
Biologie / Chemie, der Universität Bremen
von Markus Klemke
Bremen, im November 2013
Referent:
Prof. Dr. Jörn Bullerdiek, Universität Bremen
Korreferent:
Prof. Dr. Andreas Dotzauer, Universität Bremen
Datum der Disputation:
28. Januar 2014
“I do not know what I may appear to the world, but to myself I seem to
have been only like a boy playing on the seashore, and diverting myself in
now and then finding a smoother pebble or a prettier shell than ordinary,
whilst the great ocean of truth lay all undiscovered before me.”
Sir Isaac Newton
Zitiert nach: Memoirs of the life, writings, and discoveries of Sir Isaac Newton, Vol. II, Ch. 27.
Sir David Brewster, Edmonston and Douglas, Edinburgh 1860.
INHALT
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1 Die Familie der High Mobility Group Proteine
1
1.2 Leiomyome des Uterus
7
1.3 Tumoren der Schilddrüse
9
1.4 Zielsetzungen
13
2
15
MATERIAL UND METHODEN
2.1 Gewebeproben humaner Tumoren
15
2.2 RNA-Isolierungen
15
2.3 cDNA-Synthesen
15
2.4 Quantitative Real-Time RT-PCRs
16
2.5 RT-PCR
16
2.6 Gelelektrophoretische Auftrennung
17
2.7 Stimulation der HMGA2-Expression in adipösen mesenchymalen Stammzellen
17
2.8 Plasmidisolierung aus transformierten E. coli-Zellen
18
2.9 Transfektion eukaryotischer Zellen
18
3
19
ERGEBNISSE
3.1 Chromosomale Aberrationen und deren Auswirkungen auf die HMGA-Gene in
Leiomyomen des Uterus
19
3.1.1 Overexpression of HMGA2 in uterine leiomyomas points to its general
role for the pathogenesis of the disease (Klemke et al., 2009)
20
3.1.2 6p21 rearrangements in uterine leiomyomas targeting HMGA1
(Hashemi Nezhad et al., 2010)
31
3.1.3 Loss of let-7 binding sites resulting from truncations of the 3' untranslated
region of HMGA2 mRNA in uterine leiomyomas (Klemke et al., 2010)
3.2 Identifizierung einer intronischen miRNA durch Sequenzvergleiche
39
47
3.2.1 A microRNA encoded in a highly conserved part of the
mammalian HMGA2gene (von Ahsen et al., 2008)
48
3.3 Molekulargenetische Marker zur Abgrenzung von Schilddrüsenkarzinomen follikulären Ursprungs
52
3.3.1 Upregulation of HMGA2 in thyroid carcinomas: a novel molecular
marker to distinguish between benign and malignant follicular neoplasias
(Belge et al., 2008)
54
INHALT
3.3.2 On the prevalence of the PAX8-PPARG fusion resulting from the
chromosomal translocation t(2;3)(q13;p25) in adenomas of the thyroid
(Klemke et al., 2011)
64
3.3.3 Detection of PAX8-PPARG fusion transcripts in archival thyroid
carcinoma samples by conventional RT-PCR (Klemke et al., 2012)
72
3.4 Vergleichende molekulargenetische Untersuchungen benigner mesenchymaler
und maligner epithelialer Tumoren
81
3.4.1 Correlated expression of HMGA2 and PLAG1 in thyroid tumors, uterine
leiomyomas and experimental models (Klemke et al., 2014)
82
4 DISKUSSION
94
4.1 HMGA2 als Marker für Malignome der Schilddrüse
94
4.2 Die Rolle der HMGA-Gene in Uterus-Leiomyomen
98
4.3 Die PAX8/PPARG-Genfusion in Schilddrüsentumoren
100
4.4 Identifizierung eines in HMGA2 lokalisierten, intronischen miRNA-Gens
durch Sequenzvergleiche
104
4.5 Wechselwirkungen zwischen HMGA2 und PLAG1
105
4.6 Resümee
108
5
ZUSAMMENFASSUNG
110
6
SUMMARY
112
7
PUBLIKATIONSÜBERSICHT
114
7.1 Begutachtete Artikel
114
7.2 Posterpräsentationen
115
8
LITERATURVERZEICHNIS
116
9
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
136
10 ERKLÄRUNG
139
11 DANKSAGUNG
140
1 EINLEITUNG
1 EINLEITUNG
1.1 Die Familie der High Mobility Group-Proteine
Die High Mobility Group-Proteine wurden 1973 im Chromatin aus Kalbsthymus entdeckt und
nach ihrer hohen elektrophoretischen Mobilität in Polyacrylamid-Gelen benannt (Goodwin et
al., 1973). Es handelt sich um chromatin-assoziierte Nicht-Histon-Proteine geringer Masse
mit einem Molekulargewicht von weniger als 30 kDa, die einen hohen Anteil sowohl
basischer als auch saurer Aminosäuren enthalten (Goodwin et al., 1973). Zur Gruppe der
HMG-Proteine gehören die Familien der HMGA-, HMGB- und HMGN-Proteine, deren
strukturelle Gemeinsamkeit ein saurer Karboxyterminus ist (Noro et al., 2003). Die Familie
der HMGN-Proteine ist nach ihrer Nukleosomen-Bindedomäne benannt (Crippa et al., 1992),
die eine Bindung an Nukleosomenkerne ermöglicht. Die HMGB-Proteine, die die zweite
HMG-Familie bilden, zeichnen sich durch zwei basische HMG-Box-Domänen aus, die aus
jeweils drei Alpha-Helices bestehen, welche zu einer L-förmigen Struktur gefaltet sind (Weir
et al., 1993; Read et al., 1993).
Zur dritten HMG-Familie gehören die HMGA-Proteine, die Gegenstand der vorliegenden
Arbeit sind. Sie wurden 1983 in der Zervixkarzinom-Zellinie HeLa entdeckt (Lund et al.,
1983). Namensgebende Eigenschaft dieser Familie ist das Vorhandensein von drei ATHooks, mit denen die Proteine in der kleinen Furche an AT-reiche DNA-Abschnitte binden
(Solomon et al., 1986; Elton et al., 1987; Reeves et al., 1987; Reeves und Nissen, 1990) und
dadurch zu einer Krümmung der DNA führen können (Lehn et al., 1988). Sie werden daher
auch als architektonische Transkriptionsfaktoren bezeichnet, die eine wichtige Funktion in
der Regulation zahlreicher Gene ausüben (Bustin und Reeves, 1996; Bustin, 1999), obwohl
sie keine intrinsische Kapazität zur Transkriptionsaktivierung haben (Wolffe, 1994). Allen
HMGA-Proteinen ist außerdem eine Proteinbindedomäne gemeinsam, mit deren Hilfe sie
Wechselwirkungen mit anderen Proteinen eingehen können (Chau et al., 1995;
Schoenmakers et al., 1995; Reeves und Beckerbauer, 2005; Fusco und Fedele, 2007). Zwei
Gene, HMGA1 und HMGA2, kodieren für die Proteine der HMGA-Familie.
Das HMGA1-Gen ist in der chromosomalen Bande 6p21 lokalisiert (Friedmann et al., 1993).
Durch alternatives Spleißen seiner mRNA können drei unterschiedliche Proteine gebildet
werden, die man als HMGA1a, HMGA1b und HMGA1c bezeichnet (Johnson et al., 1989;
Nagpal et al., 1999). Zwar können sie an die kleine Furche der DNA binden und sie krümmen, sind allein aber nicht in der Lage, die Transkription zu aktivieren (Thanos und Maniatis,
1992; Geierstanger et al., 1994). Durch posttranslationelle Modifikationen wie Phosphorylierungen (Elton und Reeves, 1986; Nissen et al., 1991) und Acetylierungen (Munshi et al.,
1998) können die HMGA1-Proteine reguliert werden. Ein zellzyklusabhängiger Phosphorylierungsstatus von HMGA1a steuert beispielsweise die Apoptoseinduktion in leukämischen
1
1 EINLEITUNG
Zellen (Diana et al., 2001). Auch Methylierungen des HMGA1a-Proteins wurden in diesem
Zusammenhang festgestellt (Sgarra et al., 2003a, Sgarra et al., 2003b). Als weitere
posttranslationelle Modifikationen wurden Sumoylierungen, d. h. Markierungen durch das
SUMO-Protein, von HMGA1 und Ribosylierungen sowohl von HMGA1 als auch von HMGA2
beschrieben (Li et al., 2007a; Giancotti et al., 1996).
In manchen benignen Tumoren mesenchymalen Ursprungs ist HMGA1 von chromosomalen
Aberrationen betroffen. Rearrangierungen der chromosomalen Bande 6p21 in chondroiden
Lungenhamartomen (Johansson et al., 1993) führen zu einer Reaktivierung von HMGA1
(Kazmierczak et al., 1996a; Xiao et al., 1997; Kazmierczak et al., 1999). Gleiches gilt auch
für Lipome und Uterus-Leiomyome (Kazmierczak et al., 1998; Tallini et al., 2000; Bartuma et
al., 2007). Die chromosomalen Bruchpunkte sind in den meisten Tumoren downstream von
HMGA1 lokalisiert (Kazmierczak et al., 1998), können aber auch upstream oder intragenisch
auftreten (Kazmierczak et al., 1996a; Xiao et al., 1997).
Eine Überexpression von HMGA1 wurde in verschiedenen Malignomen festgestellt, darunter
kolorektale Karzinome (Fedele et al., 1996; Abe et al., 1999; Kim et al., 1999; Chiappetta et
al., 2001; Balcerczak et al., 2003), Karzinome des Uterus (Bandiera et al., 1998), der
Prostata (Tamimi et al., 1993; Tamimi et al., 1996), des Ovars (Masciullo et al., 2003), der
Mamma (Flohr et al., 2003; Chiappetta et al., 2004; Peluso und Chiappetta, 2010), des
Pankreas (Abe et al., 2000; Abe et al., 2002), der Schilddrüse (Chiappetta et al., 1995;
Chiappetta et al., 1998; Kim et al., 2000) sowie Plattenepithelkarzinome des Kopf-HalsBereichs (Rho et al., 2007).
Die von HMGA1 ausgeübten Funktionen sind vielfältig. Ein gut untersuchtes Beispiel der
Wirkung von HMGA1 ist die Expression des Interferon β-Gens (IFN-β) (Yie et al., 1999).
Obwohl HMGA1 selbst nicht als Aktivator fungiert, ist es essentiell für die virusinduzierte
Bildung des IFN-β-Enhancers. Die Bindung des HMGA1-Proteins an regulatorische Elemente im Bereich des IFN-β-Promotors bewirkt eine Konformationsänderung der DNA und
führt zur Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren, darunter NF-κB und ATF-2, sowie zur
Bildung eines stabilen Nukleoproteinkomplexes, der als Enhanceosom bezeichnet wird
(Thanos und Maniatis, 1992; Thanos und Maniatis, 1995). Für die Bindung des NF-κBProteins an die DNA ist nicht nur deren durch HMGA1 verursachte Krümmung sondern auch
eine direkte Interaktion zwischen HMGA1 und NF-κB erforderlich (Du et al., 1993). Eine
spezifische Acetylierung von HMGA1 durch das CREB-Bindeprotein (CBP) führt zum Zerfall
des Enhanceosoms und zur Abschaltung der IFN-β-Expression (Munshi et al., 1998).
HMGA1 interagiert darüber hinaus auch mit dem Tumorsuppressor p53 und inhibiert über
verschiedene Mechanismen die p53-abhängige Apoptose. Zum einen ist HMGA1 in der
Lage, p53 zu binden und damit einerseits die Transkription von p53-Zielgenen zu beeinflussen, andererseits löst es die Aktivierung des p53-Inhibitors MDM2 aus (Pierantoni et al.,
2
1 EINLEITUNG
2006; Frasca et al., 2006). Des weiteren übt HMGA1 eine Funktion im Glukosestoffwechsel
aus und wird auch mit Typ-2-Diabetes assoziiert (Brunetti et al., 2001; Foti et al., 2003; Foti
et al., 2005; Iritano et al., 2012; Chiefari et al., 2012). Während HMGN-Proteine DNA-Reparaturmechanismen unterstützen, hemmt HMGA1 außerdem die Nukleotidexzisionsreparatur
UV-induzierter DNA-Schäden (Adair et al., 2005; Adair et al., 2007; Maloney et al., 2007).
Das vierte Protein der HMGA-Familie wird von einem eigenen Gen kodiert, das in der chromosomalen Region 12q14~15 lokalisiert ist und die Bezeichnung HMGA2 trägt. Die ersten
drei Exons kodieren für je eine AT-Hook-Domäne. Auf das dritte Exon folgt das mit mehr als
100 kb sehr große Intron 3. Das vierte Exon kodiert für eine Spacer-Domäne, die HMGA2
von den HMGA1-Proteinen unterscheidet (Chau et al. 1995). Die saure, karboxyterminale
Proteinbindedomäne wird vom fünften Exon kodiert (Chau et al., 1995; Ashar et al., 1996).
Ebenso wie HMGA1 (Chiappetta et al., 1996) wird auch HMGA2 in embryonalen Geweben
exprimiert, wohingegen in adulten Geweben keine oder nur eine sehr geringe Expression
erfolgt (Zhou et al., 1995; Rogalla et al., 1996; Hirning-Folz et al., 1998; Gattas et al., 1999).
Besonders stark wird HMGA2 in embryonalen Stammzellen exprimiert (Li et al., 2006), und
mittlerweile ist bekannt, daß das Protein wichtige Funktionen in Stammzellen ausübt. Beispielsweise nimmt man an, daß HMGA2 in die Differenzierung embryonaler Stammzellen zu
Skelettmuskelzellen involviert ist (Caron et al., 2005). Eine Schlüsselrolle bei der Regulierung entwicklungsrelevanter Gene wird HMGA2 zugeschrieben, da ein siRNA-vermittelter
Knockdown die Expression des Pluripotenz-Markers UTF1 signifikant vermindert (Li et al.,
2007b). Kontrovers diskutiert wird derzeit die Interaktion zwischen HMGA2 und den mit zellulärer Seneszenz assoziierten Proteinen p14Arf und p16Ink4a, die durch CDKN2A kodiert werden. Versuche an murinen neuralen Stammzellen ergaben, daß HMGA2 die Expression der
Proteine p16Ink4a und p19Arf (homolog zum humanen p14Arf) vermindert, wobei diese Wirkung
mutmaßlich über eine Hemmung des Ink4a/Arf-Aktivators Jun-B erfolgt. Aufgrund dieser
Erkenntnisse wurde angenommen, daß HMGA2 zur Aufrechterhaltung des Selbsterneuerungspotentials beiträgt (Nishino et al., 2008). Ähnliche Hinweise lieferten Experimente mit
mesenchymalen Stammzellen, in denen gezeigt wurde, daß ein siRNA-vermittelter Knockdown von HMGA2 zu einer Verminderung des Selbsterneuerungspotentials führt (Kubo et
al., 2009). Untersuchungen an humanen Uterus-Leiomyomen zeigten andererseits aber, daß
eine verstärkte HMGA2-Expression mit einer hohen p14Arf-Expression korreliert (Markowski
et al., 2010a). Des weiteren löste die Stimulation von adipösen mesenchymalen Stammzellen (ADSCs) mit FGF1 eine simultane Steigerung der Expression von HMGA2 und p14Arf aus
(Markowski et al., 2011). Eine Kooperation war zuvor auch für HMGA2 und p16Ink4a
beschrieben worden (Narita et al., 2006). Daraus wurde geschlossen, daß die HMGAProteine durch die Hemmung proliferationsassoziierter Gene zur zellulären Seneszenz und
damit zu einer Blockade der malignen Transformation beitragen. Den scheinbaren Wider-
3
1 EINLEITUNG
spruch zwischen onkogenem Potential einerseits und der Repression proliferationsassoziierter Gene andererseits versuchte man durch eine Abhängigkeit der HMGA-Wirkungen vom
zellulären Kontext zu erklären (Narita et al., 2006).
Aufgrund der Möglichkeit, die durch Retroviren verursachte neoplastische Transformation
von Schilddrüsenzellen der Ratte durch die Expression einer gegen HMGA2 gerichteten
Antisense-RNA zu inhibieren (Berlingieri et al., 1995), ging man von einer Schlüsselrolle von
HMGA2 bei der malignen Transformation von Thyreozyten aus. Zur gleichen Zeit erkannte
man, daß Deletionen innerhalb von HMGA2, die in einem inaktiven Protein resultieren, zu
einem verminderten Wachstum von Mäusen und zu stark reduziertem Fettgewebsanteil
führen (Ashar et al., 1995; Zhou et al., 1995). Aus zahlreichen Untersuchungen ist bekannt,
daß in verschiedenen benignen, soliden Tumoren die Region 12q14~15 (Schoenmakers et
al., 1994; Schoenberg Fejzo et al., 1995; Kazmierczak et al., 1995a) bzw. das darin lokalisierte HMGA2 von chromosomalen Aberrationen betroffen ist. Dazu gehören Lipome,
Uterus-Leiomyome, chondroide Lungenhamartome, pleomorphe Speicheldrüsenadenome
(Ashar et al., 1995, Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et al., 1996b), Angiomyxome
(Kazmierczak et al., 1995b; Nucci et al., 2001; Rabban et al., 2006) sowie Endometriumpolypen (Bol et al., 1996; Hennig et al., 1996a; Dal Cin et al., 1998). In Lipomen und
chondroiden Lungenhamartomen wurde eine Fusion mit LPP beschrieben (Petit et al., 1996;
Rogalla et al., 1998a), in Leiomyomen des Uterus sind beispielsweise RAD51B (Schoenmakers et al., 1999) oder ALDH2 (Kazmierczak et al., 1995c) präferierte Translokationspartner von HMGA2, und in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen wurden Fusionen mit
FHIT (Geurts et al., 1997a) und NFIB (Geurts et al., 1998) beschrieben.
Eine starke Re-Expression von HMGA2 kennzeichnet aber auch zahlreiche Malignome
epithelialen Ursprungs wie Mammakarzinome (Rogalla et al., 1997), Bronchialkarzinome
(Rogalla et al., 1998b; Sarhadi et al., 2006; Meyer et al., 2007), Pankreaskarzinome (Abe et
al., 2003), Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle (Miyazawa et al., 2004) und Sarkome
(Berner et al., 1997).
Von den vielfältigen, von HMGA2 ausgeübten Funktionen werdem im folgenden ausgewählte, besonders relevante Aspekte dargestellt.
HMGA2 bindet mit derselben Affinität wie HMGA1 an das PRDII-Element des IFN-βPromotors und begünstigt ebenfalls die Bindung von NF-κB, wodurch eine transkriptionelle
Aktivierung eintritt (Mantovani et al., 1998; Noro et al., 2003). Am Beispiel des IFN-βPromotors wurde auch gezeigt, daß durch Phosphorylierungen die DNA-Bindungsaffinität
des HMGA2-Proteins beeinflußt werden kann (Schwanbeck et al., 2000). Während in diesem
Fall die AT-Hooks von Phorsphorylierungen betroffen sind, können auch Phosphorylierungen
der sauren, karboxyterminalen Domäne die DNA-Bindungsaffinität vermindern (Sgarra et al.,
4
1 EINLEITUNG
2009). Ebenfalls im Zusammenspiel mit NF-κB reguliert HMGA2 die Transkription von IMP2
(Cleynen et al., 2007).
Eine Überexpression von HMGA2 in Adenomen der Hypophyse geht auf eine Amplifikation
zurück (Finelli et al., 2002) und bewirkt eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors E2F1
(Fedele et al., 2006a; Fedele et al., 2006b), der unter der Kontrolle des Zellzyklusregulators
pRB steht. Der Eintritt in die S-Phase wird verhindert, wenn E2F1 von pRB in einem
Komplex mit der Histondeacetylase HDAC1 gebunden und damit inaktiviert wird (Seville et
al., 2005). Die Interaktion zwischen HMGA2 und pRB bewirkt eine E2F1-Aktivierung, indem
HDAC1 aus dem Komplex gelöst wird, was zur Acetylierung von E2F1 durch Histonacetylasen und damit zur Stabilisierung seiner freien und aktiven Form führt, woraufhin HMGA2 und
pRB sich von E2F1 ablösen (Fedele et al., 2006c).
Des weiteren interagiert HMGA2 mit dem Repressorprotein p120E4F und bedingt eine
Dissoziation desselben vom cAMP-responsiven Element (CRE) des CCNA2-Promotors,
wodurch die Transkription des Zellzyklusregulators Cyclin A aktiviert wird (Tessari et al.,
2003). Auch indirekt wirkt HMGA2 auf die Cyclin A-Expression, weil E2F1 an dessen Regulation beteiligt ist. Außerdem können HMGA-Proteine die Cyclin A-Expression auch durch die
Aktivierung des AP1-Komplexes induzieren.
Der AP1-Komplex, zu dem u. a. drei Jun- und vier Fos-Proteine gehören, kann zahlreiche
Gene aktivieren, die Funktionen in der Zellproliferation, Tumorigenese und Metastasierung
erfüllen (Angel und Karin, 1991; Karin et al., 1997). Zwei seiner Proteine, Jun-B und FRA1,
sind essentiell für die neoplastische Transformation von Schilddrüsenzellen der Ratte. Die
Transkription beider Gene wird von HMGA2 aktiviert, so daß sich bei hoher HMGA2Konzentration die Zusammensetzung des AP1-Komplexes verändert und seine transkriptionelle Aktivität gesteigert wird. Somit besteht über die Proteine des AP1-Komplexes eine
Verknüpfung zwischen HMGA2 und der neoplastischen Transformation (Vallone et al.,
1997).
Die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) kann den Zellen epithelialer Tumoren die
Fähigkeit zur Migration und unkontrollierter Proliferation verleihen (Huber et al., 2005). Eine
Untersuchung des Transkriptionsprofils der Mammakarzinom-Zellinie MCF-7 ergab, daß vor
allem HMGA1b die Expression einiger EMT-Markergene verändert (Reeves et al., 2001).
Mittlerweile ist bekannt, daß auch HMGA2 in die epithelial-mesenchymale Transition involviert ist (Miyazawa et al., 2004). Zunächst wurde eine Aktivierung über den TGF-β/SmadSignalweg festgestellt (Thuault et al., 2006). Später fand man zudem heraus, daß HMGA2
den Transkriptionsfaktor Snail reguliert (Thuault et al., 2008), welcher ein E-CadherinRepressor und damit an der EMT beteiligt ist (Peinado et al., 2004). Daneben aktiviert
HMGA2 auch den Transkriptionsfaktor Twist (Tan et al., 2012). Eine starke HMGA2Expression wurde insbesondere in der invasiven Front muriner und humaner Tumoren
5
1 EINLEITUNG
festgestellt. Dabei aktiviert HMGA2 die Expression des TGF-β Typ 2 Rezeptors (TGFβRII)
und somit den TGF-β-Signalweg. Dies spricht nicht nur für eine entscheidende Funktion von
HMGA2 in der epithelial-mesenchymalen Transition, sondern man nimmt außerdem an, daß
es insbesondere die Infiltration und Metastasierung epithelialer Tumoren begünstigt
(Morishita et al., 2013). Übereinstimmende Daten stammen aus Untersuchungen an aus
hepatozellulären Karzinomen hervorgegangenen Zellinien. Es wurde nicht nur von einem
Zusammenhang zwischen der Stärke der HMGA2-Expression und der Invasivität berichtet,
sondern es zeigte sich auch eine Korrelation mit der Expression mehrerer EMT-Marker (Luo
et al., 2013). Des weiteren wird HMGA2 für eine Deregulation von EMT-Genen in Ovarialkarzinomen verantwortlich gemacht (Wu et al., 2011). In Prostatakarzinomen bewirkte eine
posttranskriptionelle Hemmung der HMGA2-Expression durch miR-154 eine eingeschränkte
Migrationsfähigkeit und verminderte Invasivität in vitro. Außerdem stieg die Konzentration
des epithelialen Markers E-Cadherin an, wohingegen die des mesenchymalen Markers Vimentin abnahm. Dies wurde als Anzeichen für die Fähigkeit der miR-154 angesehen, über
eine regulatorische Wirkung auf HMGA2 der EMT entgegenwirken zu können (Zhu et al.,
2013).
Der Promotor des DNA-Reparaturgens ERCC1 wird sowohl von HMGA1 als auch von
HMGA2 negativ reguliert, wobei die Bindung von HMGA2 mit höherer Affinität erfolgt
(Borrmann et al., 2003). Somit ist auch HMGA2 an der Regulation von DNA-Reparaturmechanismen beteiligt. Im Gegensatz dazu wird das mit Brustkrebs in Verbindung stehende
Tumorsuppressorgen BRCA1 zwar von HMGA1 negativ reguliert, nicht jedoch von HMGA2
(Baldassarre et al., 2003).
Um den Mechanismus der HMGA2-Regulation aufzuklären, versuchte man zunächst, den
Promotor als positiv regulatorisches Element zu charakterisieren (Rustighi et al., 1999;
Rustighi et al., 2002). Nach Experimenten mit ähnlicher Zielsetzung gelangten belgische
Wissenschaftler zu der Annahme, daß HMGA2 von weiteren, noch unbekannten Elementen
negativ reguliert werden muß (Ayoubi et al., 1999). Es bestand die Vermutung, daß die 3’UTR regulatorische Elemente enthält, womit auch eine pathologische Relevanz von Transkripten mit Verlusten in der 3’-UTR, wie sie in einem pleomorphen Speicheldrüsenadenom
entdeckt worden waren (Geurts et al., 1997b), erklärbar wäre. Außerdem führt im Gegensatz
zum Wildtyp-HMGA2 sowohl ein HMGA2-LPP-Fusionsprotein als auch ein trunkiertes
Protein zur malignen Transformation von NIH3T3-Zellen (Fedele et al., 1998). Der experimentelle Nachweis für eine regulatorische Funktion der 3’-UTRs beider HMGA-Gene erfolgte
wenige Jahre später (Borrmann et al., 2001), wobei der exakte Regulationsmechanismus
noch nicht aufgeklärt werden konnte. Dies gelang sechs Jahre später zwei unabhängigen
Gruppen, die zeigen konnten, daß MicroRNAs der let-7-Familie in der Lage sind, HMGA2
posttranskriptionell zu hemmen (Mayr et al., 2007; Lee und Dutta, 2007). Es folgten Berichte
6
1 EINLEITUNG
über die supprimierende Wirkung der let-7-Familie auf die HMGA2-Expression in Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (Hebert et al., 2007) und in Uterus-Leiomyomen
(Wang et al., 2007). Let-7 wird seinerseits durch Lin-28 reguliert, das die Prozessierung der
primären let-7-Transkripte posttranskriptionell inhibiert (Viswanathan et al., 2008; Newman et
al., 2008; Heo et al., 2008). Interessanterweise gilt Lin-28 als ein Faktor, mit dessen Hilfe
somatische Zellen zu pluripotenten Stammzellen reprogrammiert werden können (Yu et al.,
2007; Büssing et al., 2008). Vorstellbar ist somit, daß die hohe HMGA2-Expression in
embryonalen Stammzellen auf eine wegen hoher Lin-28-Expression verminderte Inhibierung
durch let-7 zurückzuführen sein kann.
1.2 Leiomyome des Uterus
Eine der in der vorliegenden Arbeit als Modell für die Wirkung der HMGA-Gene genutzten
Tumorentitäten sind humane Uterus-Leiomyome. Sie sind die am häufigsten auftretenden
gynäkologischen Tumoren. Der Verlauf kann symptomlos erfolgen, zu den von ihnen ausgehenden Symptomen können aber unter anderem Abdominalschmerzen, Menorrhagien
oder selten sogar Sterilität zählen (Stewart et al., 2001). Es handelt sich um benigne Tumoren mesenchymalen Ursprungs, zu deren Prävalenz unterschiedliche Angaben zu finden
sind. Es ist mindestens ein Drittel aller Frauen im Alter von 30 Jahren oder älter betroffen, es
wird aber vermutet, daß die Prävalenz sogar 77 % erreichen könnte (Zaloudek und Norris,
1987; Cramer und Patel, 1990; Baird et al., 2003; Heinemann et al., 2003). In bis zu 50 %
der Tumoren können klonale chromosomale Veränderungen festgestellt werden (Nilbert und
Heim, 1990; Rein et al., 1991). Untersuchungen zur Klonalität ergaben, daß Uterus-Leiomyome monoklonal sind (Wong et al., 1992; Mashal et al., 1994; Hashimoto et al., 1995;
Canevari et al., 2005; Zhang et al., 2006). Multiple Myome entwickeln sich jedoch unabhängig voneinander (Linder und Gartler, 1965; Townsend et al., 1970). Anhand rekurrenter
Aberrationen lassen sich mehrere zytogenetische Gruppen unterscheiden. Am häufigsten
treten
Translokationen
unter
Beteiligung
der
Region
12q14~15
auf,
häufig
als
t(12;14)(q14~15;q23~24), und auch interstitielle Deletionen des Chromosoms 7 als
del(7)(q22q32) sind nicht selten. In einer weiteren Gruppe ist die chromosomale Bande 6p21
von Aberrationen betroffen. Eine Untersuchung von 115 Leiomyomen ergab, daß Tumoren
mit einer 12q14~15-Veränderung überdurchschnittlich groß sind, wohingegen die Größe von
Myomen mit einer del(7) unterhalb des Durchschnitts liegt (Rein et al., 1998; Hennig et al.,
1999). Außerdem gibt es Hinweise darauf, daß intramural oder subserös lokaliserte Myome
häufiger zytogenetische Aberrationen aufweisen als submuköse (Brosens et al., 1998).
Die Translokation t(12;14)(q14~q15;q23~q24) betrifft etwa 20 % aller Myome mit aberrantem
Karyotyp (Meloni et al., 1992), aber auch variante Translokationen und andere Aberrationen
7
1 EINLEITUNG
wie parazentrische Inversionen können die Region 12q14~15 betreffen (Wanschura et al.,
1997).
Aberrationen der Region 12q14~15 (Schoenberg Fejzo et al., 1995) wirken sich auf das in
diesem Bereich lokalisierte HMGA2 aus (Schoenmakers et al., 1995; Hennig et al., 1996a;
Schoenberg Fejzo et al., 1996). Mittels Northern Blot und RT-PCR wurde festgestellt, daß
Uterus-Leiomyome mit dieser chromosomalen Veränderung verstärkt HMGA2 exprimieren,
während im Myometrium derselben Patientinnen keine HMGA2-Expression nachgewiesen
werden konnte (Gattas et al., 1999). Auch immunhistochemische Untersuchungen stellten
eine erhöhte HMGA2-Expression in Uterus-Leiomyomen fest (Klotzbücher et al., 1999).
Diese Beobachtungen wurden auch in einer ersten Untersuchung unter Verwendung einer
quantitativen Real-Time RT-PCR bestätigt (Gross et al., 2003). Die chromosomalen Bruchpunkte sind häufig upstream von HMGA2 in Entfernungen von 10 bis 100 kb, seltener auch
downstream lokalisiert (Schoenberg Fejzo et al., 1996; Quade et al., 2003). Als Fusionspartner wurden verschiedene Gene identifiziert wie beispielsweise RAD51B (Schoenmakers
et al., 1999) oder HEI10 (Mine et al., 2001a). Ebenso wurden aber auch aberrante Spleißvarianten (Kurose et al., 2001) oder trunkierte Proteine nachgewiesen, die zwar alle drei ATHooks besaßen, denen jedoch die karboxyterminale Domäne fehlte (Klotzbücher et al.,
1999; Mine et al., 2001b; Quade et al., 2003).
Am zweithäufigsten tritt eine interstitielle Deletion del(7)(q22-q32) auf (Sargent et al., 1994;
Ishwad et al., 1995), in einigen Untersuchungen war dies auch die häufigste Aberration
(Nilbert und Heim, 1990; Ozisik et al., 1993). Sie kann sowohl als einzige chromosomale
Aberration als auch in Kombination mit 12q14~q15-Rearrangierungen auftreten (Sait et al.,
1989). Wenn die del(7) als solitäre zytogenetische Aberration auftritt, ist einer RT-PCRbasierten Untersuchung zufolge keine erhöhte HMGA2-Expression feststellbar. Wird die
del(7) jedoch von einer t(12;14) begleitet, dann können HMGA2-Transkripte auch mittels RTPCR nachgewiesen werden (Hennig et al., 1997).
In etwa 5 % der Uterus-Leiomyome mit aberrantem Karyotyp ist die chromosomale Bande
6p21 betroffen. Diese Veränderungen treten zum Beispiel als reziproke Translokation mit
den Chromosomen 1, 10 oder 14 als Translokationspartner auf, aber auch Translokationen
mit anderen Chromosomen wurden ebenso festgestellt wie Inversionen (Nilbert et al., 1989;
Kiechle-Schwarz et al., 1991; Ozisik et al., 1995; Hennig et al., 1996b; Sornberger et al.,
1999). Betroffen von Aberrationen der Bande 6p21 ist das darin lokalisierte Gen HMGA1
(Kazmierczak et al., 1996c; Williams et al., 1997), allerdings wurden in Leiomyomen des Uterus bislang keine intragenischen Rearrangierungen von HMGA1 nachgewiesen (Kazmierczak et al., 1998). Inzwischen wurde bekannt, daß in einem großen Anteil der Uterus-Leiomyome Mutationen im Gen MED12 vorhanden sind, das für eine Untereinheit des MediatorKomplexes kodiert (Mäkinen et al., 2011a; Mäkinen et al., 2011b). Der Mediator-Komplex ist
8
1 EINLEITUNG
ein aus insgesamt 26 Untereinheiten bestehender und mit der RNA-Polymerase II interagierender Regulator der Transkription zahlreicher Gene (Taatjes, 2010). Aufgrund der beobachteten Häufigkeit von MED12-Mutationen nimmt man an, daß diese Mutationen ursächlich für
die Genese von Uterus-Leiomyomen sind, wobei eine Aktivierung des Wnt/-Catenin-Signalweges vermutet wird (Markowski et al., 2012). Mittlerweile wurden mutierte MED12-Allele
auch in malignen Tumoren des Uterus sowie in extrauterinen Leiomyomen nachgewiesen
(Pérot et al., 2012; Ravegnini et al., 2013; Markowski et al., 2013). Interessanterweise
wurden MED12-Mutationen in Myomen mit normalem Karyotyp als auch in den
zytogenetischen Gruppen mit del(7) und 6p21-Aberration gefunden, es ist jedoch kein Fall
bekannt, in dem eine MED12-Mutation gleichzeitig mit einer 12q14~15-Veränderung auftritt.
Daraus leitete sich die Vermutung ab, daß Veränderungen von MED12 und HMGA2
alternative Auslöser für die Entstehung von Uterus-Leiomyomen sein könnten (Markowski et
al., 2012).
1.3 Tumoren der Schilddrüse
Einen frühen Hinweis auf das onkogene Potential von HMGA2 in der Schilddrüse lieferten
Experimente, die mit Thyreozyten der Ratte durchgeführt worden waren. Eine durch Retroviren ausgelöste neoplastische Transformation ließ sich verhindern, wenn die HMGA2-Expression durch eine Antisense-RNA blockiert wurde (Berlingieri et al., 1995). Weitere Untersuchungen zur Rolle der HMGA-Proteine bei der Entstehung von Schilddrüsentumoren konzentrierten sich jedoch vornehmlich auf das verwandte HMGA1 (Chiappetta et al., 1995;
Chiappetta et al., 1998; Kim et al., 2000). Da über den Zusammenhang zwischen der Tumorigenese in der Schilddrüse und HMGA2 wenig bekannt war, bildet die Untersuchung der
HMGA2-Expression in Schilddrüsentumoren einen weiteren Schwerpunkt der vorliegenden
Arbeit.
Der häufigste Tumor der Schilddrüse ist das Adenom, bei dem es sich um eine klonale
Läsion handelt (Thomas et al., 1989). Im Rahmen von Sektionsstudien wurde dieser benigne
Tumor in 1 - 20 % aller untersuchten Schilddrüsen gefunden (Doniach, 1978; Rosai et al.,
1992). Dagegen sind Karzinome der Schilddrüse vergleichsweise selten. Bei Frauen macht
Schilddrüsenkrebs etwa 1,9 %, bei Männern etwa 0,7 % aller Krebserkrankungen aus. In
Deutschland erkrankten im Jahr 2006 1620 Männer und 3660 Frauen daran (Broschüre
„Krebs in Deutschland 2005/2006“, RKI, 2010). Weltweit lag die Inzidenz 2002 bei über
140.000 Fällen (37.424 Männer, 103.589 Frauen) (Parkin et al., 2005). Nur etwa 1 - 12 % der
Schilddrüsenkarzinome entstehen aus den kalzitoninproduzierenden C-Zellen, mit 88 - 99 %
entstehen sie mehrheitlich aus den epithelialen Follikelzellen (Schmid et al., 2003; Schmid et
al., 2005). Nach der aktuellen Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation werden Schilddrüsenkarzinome in fünf Entitäten unterteilt: papilläre (PTC) und follikuläre Karzinome (FTC),
9
1 EINLEITUNG
die auch als gut differenzierte Karzinome zusammengefasst werden, medulläre (MTC),
anaplastische (ATC) und seit 2004 auch gering differenzierte Karzinome (PDTC; DeLellis et
al., 2004). In Gebieten mit ausreichender Jodversorgung ist das papilläre Karzinom der
häufigste maligne Schilddrüsentumor, in Strumaendemiegebieten mit Jodmangel tritt es in
etwa ebenso häufig auf wie das follikuläre Karzinom (Schmid et al., 2003).
Als Mikrokarzinome werden papilläre Karzinome bezeichnet, deren Durchmesser einen
Zentimeter nicht überschreitet. Ihre klinische Relevanz wird jedoch kontrovers diskutiert
(Rosai et al., 2003; Dietlein et al., 2004). Aufgrund der hohen Überlebensrate von mehr als
90 % ist die Prognose des papillären Karzinoms sehr gut (Schmid et al., 2005). Sie hängt
offenbar aber auch vom Vorhandensein von Gefäßeinbrüchen ab (Gardner et al., 2000). Das
PTC kann bereits frühzeitig metastasieren, wobei diese Metastasierung vorwiegend
lymphogen erfolgt (Machens et al., 2005). In etwa der Hälfte der papillären Karzinome kann
eine Punktmutation des Gens BRAF festgestellt werden, die meisten in Form der Hot-SpotMutation V600E (Cohen et al., 2003; Xu et al., 2003). Weitere 10 - 20 % der PTCs weisen
RET/PTC-Rearrangierungen auf, und in etwa 10 % ist NTRK1 von Rearrangierungen
betroffen (Nikiforova und Nikiforov, 2008; Vriens et al., 2009). BRAF-Mutationen und
RET/PTC-Rearrangierungen treten nicht gemeinsam in PTCs auf sondern schließen sich
gegenseitig aus (Soares et al., 2003). Während in klassischen PTCs vor allem RET/PTC1
vorkommt, weist die follikuläre Variante (FVPTC) häufiger RET/PTC3 auf (Nikiforov, 2002).
FVPTCs weisen zudem häufiger als klassische PTCs RAS-Mutationen auf (Zhu et al., 2003).
RET/PTC-Rearrangierungen treten besonders oft in Karzinomen auf, die durch eine erhöhte
Strahlungsexposition induziert wurden. Die Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im April
1986 setzte große Mengen des radioaktiven Isotops
vorkommende, stabile Jodisotop
131
I frei, das wie das natürlich
127
I in der Schilddrüse metabolisiert wird, so daß dieses
Organ besonders hohen Strahlungsdosen ausgesetzt wird. Infolge der Tschernobyl-Katastrophe stieg insbesondere bei Kindern die Schilddrüsenkrebsrate an, wobei RET/PTC-Rearrangierungen gehäuft nachweisbar sind (Nikiforov, 2006; Williams, 2008). Mutationen des
BRAF-Gens scheinen dagegen nicht gehäuft nach Strahlungsexposition aufzutreten (Lima et
al., 2004).
Die Häufigkeit von BRAF-Mutationen, die gelegentlich auftretenden RAS-Mutationen sowie
die RET/PTC-Rearrangierungen deuten gemeinsam auf einen maßgeblichen Anteil des
RET/RAS/BRAF/MAPK-Signalweges bei der Entstehung papillärer Schilddrüsenkarzinome
hin (Kimura et al., 2003; Soares et al., 2003; Xing et al., 2007).
Das follikuläre Schilddrüsenkarzinom ist ein maligner Tumor mit Follikelzelldifferenzierung,
dessen Kernmorphologie nicht die für PTCs charakteristischen Veränderungen aufweist
(DeLellis et al., 2004). Es macht 10 - 30 % aller Schilddrüsenkarzinome aus und ist damit
deutlich seltener als das PTC, in Jodmangelgebieten liegt die Inzidenzrate jedoch höher
10
1 EINLEITUNG
(Schmid et al., 2010a). Im Gegensatz zur überwiegend lymphogenen Metastasierung der
papillären Karzinome zeichnen sich follikuläre Karzinome durch eine vorwiegend hämatogene Metastasierung aus. Fernmetastasen treten im Skelett, in den Lungen oder im Gehirn
auf. Neben der TNM-Kategorie hat die Unterscheidung zwischen minimal- und grobinvasiven FTCs große Bedeutung für die Prognose (Schmid et al., 2005). Bei etwa 37 – 50 %
aller FTC handelt es sich um minimal-invasive Karzinome, bei denen einzelne Kapseldurchbrüche oder Gefäßeinbrüche nachweisbar sind. Fernmetastasen gehen von etwa 10 % der
minimal-invasiven FTCs aus, wohingegen grob-invasive FTCs in etwa 50 % der Fälle
Fernmetastasen absiedeln (Schmid et al., 2005). Entsprechend unterscheiden sich auch die
Zehnjahresüberlebensraten erheblich. Während sie bei minimal-invasiven FTCs bei 80 90 % liegt, erreicht sie bei grob-invasiven FTCs nur etwa 50 % (Schmid et al., 2005). Es wird
außerdem vermutet, daß im Falle eines minimal-invasiven FTCs die Unterscheidung
zwischen Kapseldurchbruch und Gefäßeinbruch die Prognose entscheidend beeinflußt
(Baloch und LiVolsi, 2001). Des weiteren ist die onkozytäre Variante eines FTCs mit einer
schlechteren Prognose verbunden als die nicht-onkozytäre Variante, wofür zumindest anteilig die geringere Fähigkeit, radioaktive Jodisotope zu speichern, und das dadurch verminderte Ansprechen auf eine Radiojod-Therapie verantwortlich sein könnte (Schröder, 1988).
Lymphknotenmetastasen treten bei follikulären seltener und weniger frühzeitig als bei papillären Karzinomen auf. In der Regel finden sie sich erst bei FTCs, die eine Größe von 2 cm
erreichen (Machens et al., 2005). Insbesondere minimal-invasive FTCs stellen eine diagnostische Herausforderung dar, da sie nur durch den Nachweis von Gefäßeinbrüchen oder
Kapseldurchbrüchen von Adenomen abgegrenzt werden können (DeLellis et al., 2004).
Dafür ist oftmals die Untersuchung zahlreicher Gewebeblöcke erforderlich (Schmid et al.,
2003; Schmid und Farid, 2006).
RAS-Mutationen finden sich häufig in follikulären Karzinomen, allerdings treten sie auch in
Adenomen auf und sind damit nicht karzinomspezifisch (Namba et al., 1990). Häufig ist
NRAS und seltener HRAS von solchen Mutationen betroffen (Hara et al., 1994; Oyama et al.,
1995; Nikiforova et al., 2003b). Von pathogenetischer Relevanz dürfte außerdem der
Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) / AKT-Kinase-Signalweg sein, da eine Aktivierung der
PI3K/AKT-Kaskade beschrieben wurde, die unter anderem durch Mutationen in den Genen
PI3KCA und PTEN ausgelöst wird (Xing, 2008; Vriens et al., 2009). Des weiteren wurde eine
Fusion der Gene PAX8 und PPARG in follikulären Karzinomen entdeckt, die auf eine
chromosomale Translokation t(2;3)(q13;p25) zurückgeht (Kroll et al., 2000). Später stellte
sich allerdings heraus, daß auch diese Aberration ebenfalls in Adenomen nachgewiesen
werden kann (Cheung et al., 2003), und gelegentlich findet sie sich auch in FVPTCs (Castro
et al., 2005; Castro et al., 2006). Eine PAX8-PPARG-Fusion tritt in der Regel nicht kombiniert
mit RAS-Mutationen auf (Nikiforova et al., 2003b).
11
1 EINLEITUNG
Zum Teil kontrovers diskutiert wird die Frage, ob Adenome durch sekundäre genetische
Veränderungen die Fähigkeit zur Metastasierung erlangen und damit zu einem FTC werden,
oder ob ein Tumor a priori und damit auch ohne nachweisbare Kriterien des follikulären
Karzinoms als maligner Tumor festgelegt ist. Kapseldurchbrüche oder Gefäßeinbrüche treten
allerdings erst ab einer Tumorgröße von 1 - 2 cm auf (Machens et al., 2005). Da sie die
morphologische Voraussetzung für die Fähigkeit zur Metastasierung darstellen, wird die
sogenannte Adenom-Karzinom-Sequenz als wahrscheinlicher angesehen (Schmid et al.,
2010a; Schmid et al., 2010b). Dementsprechend wird auch angenommen, daß manche nach
histologischen Kriterien als benigne einzustufende Tumoren bereits ein prämalignes Potential besitzen (Arora et al., 2008). Für eine Adenom-Karzinom-Sequenz spricht auch, daß
genetische Veränderungen wie RAS-Mutationen (Nikiforova et al., 2003a), PAX8-PPARGFusionen (Cheung et al., 2003) sowie eine Deregulation des Transkriptionsfaktors FOXO3a
(Karger et al., 2009) sowohl in Adenomen als auch in follikulären Karzinomen nachgewiesen
wurden.
Die schlechteste Prognose ist mit dem anaplastischen Karzinom (ATC) verknüpft. Man
nimmt an, daß ATCs sowohl aus differenzierten Karzinomen als auch de novo entstehen
können. Die meisten Patienten versterben bereits innerhalb eines halben Jahres nach der
Diagnosestellung (Schmid et al., 2005).
Medulläre Karzinome (MTC) haben ihren Ursprung in den parafollikulären C-Zellen (DeLellis
et al., 2004). Neben den sporadischen MTC sind bis zu 50 % der MTC genetisch
determiniert und treten als familiäres MTC oder im Rahmen eines MEN2A- oder MEN2BSyndroms (Multiple endokrine Neoplasie) auf (Schmid et al., 2005). Von Mutationen in
hereditären MTCs ist fast immer das RET-Protoonkogen betroffen (van Heyningen, 1994).
Ein wichtiges Werkzeug in der Diagnostik von Schilddrüsentumoren ist die FeinnadelAspirationsbiopsie (FNAB). Im Rahmen einer Punktion werden Zellen aus dem Tumor zur
zytologischen Begutachtung gewonnen. So lassen sich z. B. papilläre Karzinome anhand
ihrer typischen Kernmorphologie bereits präoperativ erkennen. Wegen einer nahezu identischen Zellmorphologie ist dagegen die Abgrenzung follikulärer Karzinome von Adenomen
anhand zytologischer Präparate kaum möglich (Greaves et al., 2000; Baloch et al., 2002;
Smith et al., 2005; Takano 2011). Zur Abklärung malignitätsverdächtiger Tumoren erfolgt
eine Resektion, da zur Beurteilung der Dignität eine histopathologische Begutachtung erforderlich ist, in deren Rahmen die Kapsel genauestens untersucht werden muß. Nur in einem
kleinen Teil der aufgrund zytologischer Untersuchungen als malignitätsverdächtig eingestuften Schilddrüsentumoren wird postoperativ allerdings ein follikuläres Karzinom diagnostiziert
(Goellner et al., 1987; Chiappetta et al., 1998; Greaves et al., 2000; Baloch et al., 2002).
Auch bei der follikulären Variante des papillären Karzinoms kann eine Differentialdiagnose
problematisch sein (Lloyd et al., 2004). In seltenen Fällen kann selbst nach sorgfältiger
12
1 EINLEITUNG
histologischer Untersuchung die Dignität eines Schilddrüsentumors nicht eindeutig beurteilt
werden (Schmid, 2010b), und es existiert eine Reihe von Sonderfällen, die leicht fehlinterpretiert werden und zu einer falschen Diagnose führen können (Rosai et al, 2006). Es
besteht daher weiterhin ein Bedarf an neuen Markern, die insbesondere die Diagnostik der
Tumoren zu unterstützen vermögen, deren Klassifizierung mit Hilfe der Zytologie nahezu
unmöglich ist oder selbst nach histologischer Aufarbeitung eine Herausforderung darstellt.
1.4 Zielsetzungen
Bisherige Erkenntnisse zur HMGA2-Expression in Uterus-Leiomyomen mit chromosomalen
Aberrationen der Region 12q14~15 sollten durch die Untersuchung eines umfangreichen
Kollektivs verifiziert werden, wobei ergänzend zu vorherigen Ansätzen eine Quantifizierung
der Genexpression unter Verwendung der äußerst sensitiven Real-Time RT-PCR erfolgen
sollte. Vergleichbare Untersuchungen beschränkten sich bislang auf relativ geringe
Probenumfänge. Des weiteren sollte auch der Expressionsstatus von HMGA2 in UterusLeiomyomen ermittelt werden, die keine zytogenetisch erkennbare Veränderung im Bereich
des HMGA2-Locus aufweisen. Dieser Ansatz dient der Klärung der Frage, ob das Gen auch
in Tumoren mit zytogenetisch normalem Karyotyp eine pathogenetische Rolle spielen kann
und somit nicht nur in der 12q14~15-Gruppe ein entscheidender Faktor in der Tumorigenese
der Uterus-Leiomyome ist. Außerdem wurde untersucht, wie häufig trunkierte HMGA2Transkripte in Uterus-Leiomyomen mit chromosomalen Bruchpunkten in der Region
12q14~15 vorkommen, da ein Verlust von miRNA-Bindestellen die in dieser zytogenetischen
Gruppe besonders stark erhöhte Expression des Gens erklären könnte. Vergleichend wurde
ebenfalls mittels Real-Time RT-PCR die
HMGA1-Expression in Leiomyomen mit
Aberrationen der Bande 6p21 quantifiziert, da weitaus weniger Daten zum Zusammenhang
zwischen dieser chromosomalen Veränderung und der Auswirkung auf HMGA1 vorlagen.
Ein weiterer Hauptaspekt der vorliegenden Arbeit sind genetische Eigenschaften der
Schilddrüsenkarzinome mit follikulärem Ursprung. Trotz intensiver Bemühungen konnte
bisher kein molekulargenetischer Marker identifiziert werden, der insbesondere die Diagnostik follikulär strukturierter Tumoren mit ausreichend großer Sicherheit unterstützt und für die
Beurteilung der Dignität auch grenzwertiger Fälle hinreichend sensitiv und spezifisch ist. Da
eine Reaktivierung von HMGA2 in diversen Malignomen einerseits und eine verstärkte
Expression des nahe verwandten HMGA1 in Schilddrüsenkarzinomen andererseits beschrieben worden war, dennoch aber nur wenige Untersuchungen zur Rolle von HMGA2 in der
Tumorigenese der Schilddrüse erfolgt sind, wurde die Expression sowohl in benignen als
auch in malignen Schilddrüsentumoren mittels Real-Time RT-PCR quantifiziert. Ziel dieser
Untersuchung war es, Aussagen über die potentielle Eignung von HMGA2 als Marker für
Malignome dieses Organs treffen zu können. Aufgrund der von pleomorphen Adenomen
13
1 EINLEITUNG
bekannten Überexpression von PLAG1, die einerseits bei chromosomalen Aberrationen der
Bande 8q12 auftritt, in der PLAG1 lokalisiert ist, die andererseits auch ohne diese
Veränderung aber bei gleichzeitiger HMGA2-Überexpression beobachtet werden kann,
wurde außerdem die PLAG1-Expression in malignen und benignen Schilddrüsentumoren
untersucht. Zur Untersuchung eines möglichen Zusammenhangs zwischen der Expression
beider Gene wurden zusätzlich Uterus-Leiomyome mit Aberrationen der chromosomalen
Banden 12q14~15 herangezogen, da in dieser zytogenetischen Gruppe HMGA2 bekanntermaßen stark aktiviert ist. Ergänzend wurden Zellkulturversuche durchgeführt, um die
aufgrund der Ergebnisse der Tumoruntersuchungen aufgestellte Hypothese eines regulatorischen Zusammenhangs zwischen HMGA2 und PLAG1 zu verifizieren. Als weitere genetische Eigenschaft und zeitweilig als Malignitätsmarker angesehene Besonderheit wurde die
in follikulären Neoplasien der Schilddrüse vorkommende Fusion der Gene PAX8 und
PPARG untersucht. Da bisherige Angaben zu ihrer Prävalenz in Adenomen sowie in follikulären Karzinomen zum Teil relativ stark divergieren, wurde zunächst untersucht, wie häufig
die der Fusion zugrundeliegende Translokation t(2;3)(q13;p25) in einer umfangreichen Serie
von Adenomen auftritt. Obwohl unstrittig sein dürfte, daß die Prävalenz der PAX8-PPARGFusion in follikulären Karzinomen höher als in Adenomen ist, wurden auch diesbezüglich
stark schwankende Angaben veröffentlicht. Als methodisches Problem bestand hierbei der
Umstand, daß nahezu sämtliche Arbeiten an frischen oder kryokonservierten Gewebeproben
durchgeführt wurden. Das Ziel eines weiteren Ansatzes war es daher, die ungleich leichter
verfügbaren, formalinfixierten Gewebe aus pathologischen Archiven für zukünftige Untersuchungen zur Prävalenz der Fusion in FTCs zugänglich zu machen.
14
2 MATERIAL UND METHODEN
2 MATERIAL UND METHODEN
Im folgenden Abschnitt wird eine Übersicht über die Herkunft verwendeter Gewebeproben
sowie über die angewandten Methoden gegeben. An dieser Stelle nicht aufgeführt werden
die FISH, immunhistochemische Färbungen sowie zytogenetische Methoden. Ausführlichere
Schilderungen zur Methodik finden sich in den jeweiligen Publikationen.
2.1 Gewebeproben humaner Tumoren
Bei molekulargenetischen Untersuchungen von Tumoren der Schilddrüse wurden in der
Regel formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeproben verwendet. Diese stammten
aus pathologischen Instituten, überwiegend aus dem Zentrum für Pathologie am Klinikum
Bremen-Mitte, und waren histologisch begutachtet worden. In Einzelfällen standen auch
Zellinien bzw. Primärkulturen oder schockgefrorene Gewebeproben zur Verfügung.
Die Probenentnahmen aus Uterus-Leiomyomen nach Myomenukleationen oder Hysterektomien fanden direkt im Operationssaal statt. Dabei wurde jeweils ein Teil der Probe in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und ein weiterer Teil in Hanks Salzlösung (HBSS,
Hanks’ balanced salt solution) mit Penicillin (200 IE/ml) und Streptomycin (200 µg/ml) zur
Anlage von Primärkulturen und späteren Karyotypisierung transportiert. Im Falle von Hysterektomien konnte häufig auch eine Probe des tumorfreien Myometriums asserviert werden.
Die Probenentnahmen fanden im Krankenhaus St. Joseph-Stift, Bremen, sowie im DIAKO,
Evangelisches Diakonie-Krankenhaus, Bremen, statt.
2.2 RNA-Isolierungen
Zur RNA-Isolierung aus FFPE-Geweben wurden zunächst 5 µm dünne Schnitte angefertigt
und mit Xylol entparaffiniert. Die RNA-Isolierung erfolgte anschließend mit dem „High Pure
RNA Paraffin Kit“ (Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim) gemäß der Anweisungen des Herstellers. In späteren Arbeiten wurde stattdessen das „RNeasy FFPE Kit“ (Qiagen
GmbH, Hilden) eingesetzt. Bei RNA-Isolierungen aus kryokonservierten Geweben wurde das
„RNeasy Mini Kit“ (Qiagen) gemäß Herstellerangaben eingesetzt. Die RNA-Konzentration
wurde im Anschluß an die Isolierung spektrophotometrisch bestimmt. Dazu wurde das
„BioPhotometer“ (Eppendorf AG, Hamburg) verwendet.
2.3 cDNA-Synthesen
Für Real-Time RT-PCRs wurden in der Regel 250 ng Gesamt-RNA in Reaktionsansätzen zu
20 µl nach der von Gerard et al. (1997) beschriebenen Methode revers transkribiert. Als
Primer wurden Hexanukleotide (Invitrogen GmbH bzw. Life Technologies GmbH, Darmstadt)
verwendet, als Enzym wurde zumeist die Reverse Transkriptase des Moloney-Mäuse15
2 MATERIAL UND METHODEN
Leukämievirus (M-MLV RT, Invitrogen bzw. Life Technologies) nach den Vorgaben des
Herstellers eingesetzt. Außerdem diente „RNase OUT“ (Invitrogen bzw. Life Technologies)
als RNase-Inhibitor. Bei Verwendung von Hexanukleotiden wurden die Reaktionsansätze für
10 min bei 25 °C inkubiert, bevor die Reaktion bei 37 °C für 50 min stattfand und anschließend das Enzym durch Erhitzen auf 70 °C für 15 min inaktiviert wurde.
2.4 Quantitative Real-Time RT-PCRs
Zur genspezifischen Expressionsanalyse kamen entweder kommerzielle TaqMan-Assays
(Applied Biosystems Deutschland GmbH bzw. Life Technologies GmbH, Darmstadt) oder
separat synthetisierte Primer und TaqMan-Sonden (Heid et al., 1996) zum Einsatz, die in der
Regel FAM als 5’-Fluorophore enthielten. Als 3’-Quencher dienten neben TAMRA auch
nicht-fluoreszierende Fluorophore, zum Teil auch in Verbindung mit sogenannten „minor
groove binders“ (MGB). Des weiteren wurde der „TaqMan Universal PCR Master Mix“
(Applied Biosystems bzw. Life Technologies) verwendet. Die Reaktionen liefen auf dem
„7300 Real-Time PCR System“ (Applied Biosystems) unter folgendem Temperaturprofil ab:
50 °C für 2 min, 95 °C für 10 min und bis zu 50 PCR-Zyklen mit 15 sec bei 95 °C und 1 min
bei 60 °C. Die Auswertung der Experimente erfolgte unter Verwendung der „7300 System
Sequence Detection Software“ (Applied Biosystems). Als endogene Kontrolle in relativen
Quantifizierungen diente entweder 18S rRNA oder HPRT1.
Die relativen Genexpressionen wurden mit Hilfe der komparativen ∆CT-Methode berechnet
(Livak und Schmittgen, 2001; Schmittgen und Livak, 2008). Dabei wird zunächst für jede
Probe die Differenz aus den mittleren CT-Werten des Zielgens und der endogenen Kontrolle
(∆CT) ermittelt. Eine Probe wird als sogenannter Kalibrator festgelegt, zu dessen Genexpression die Messungen aller anderen Proben in Relation gesetzt werden, in dem die Differenz
aus ∆CT-Wert jeder Einzelprobe und ∆CT-Wert des Kalibrator berechnet wird (∆∆CT). Daraus
lassen sich mit der Formel 2-∆∆Ct relative Werte ableiten, wobei der Kalibrator definitionsgemäß den Wert 1 erhält.
2.5 RT-PCR
Für herkömmliche RT-PCRs wurden cDNA-Synthesen wie oben beschrieben durchgeführt,
allerdings wurde bis zu 1 µg Gesamt-RNA eingesetzt. Zur Amplifizierung wurden verschiedene Taq-Polymerasen eingesetzt, darunter beispielsweise die „Dream Taq DNA Polymerase“ (Fermentas GmbH, St. Leon Rot) mit einem mitgelieferten Reaktionspuffer. Zum
Nachweis der PAX8-PPARG-Fusionstranskripte wurden die genspezifischen Primer in einer
Konzentration von 0,1 µM verwendet. Die hauptsächlich verwendeten Thermocycler waren
der „mastercycler gradient“ (Eppendorf) und der „TGradient“ (Biometra GmbH, Göttingen).
Die initiale Denaturierung bei 95 °C wurde üblicherweise für 5 - 10 min durchgeführt. Dann
16
2 MATERIAL UND METHODEN
folgten 40 - 45 PCR-Zyklen, in denen die Denaturierungstemperatur bei 95 °C lag, gefolgt
von einer Annealing-Phase bei einer den jeweils verwendeten Primern angepaßten Temperatur (etwa 60 bis 65 °C) sowie einer Elongationsphase bei 72 °C. Die Dauer der einzelnen
Phasen variierte, lag in der Regel aber zwischen 30 - 60 sec. Die finale Elongation erfolgte
für 5 - 7 min bei 72 °C.
2.6 Gelelektrophoretische Auftrennung
Zur Separation von PCR-Produkten wurden Agarose-Gele unterschiedlicher Konzentrationen
hergestellt. Für längere Fragmente wurde „LE Agarose“ (Biozym Scientific GmbH, Hessisch
Oldendorf) in Verbindung mit TAE-Puffer, für sehr kurze PCR-Produkte stattdessen „Sieve
3:1 Agarose“ (Biozym) mit TBE-Puffer verwendet. In Anhängigkeit von der Anwendung
wurde auf verschiedene Fragmentlängenmarker zurückgegriffen, am häufigsten kamen
jedoch „GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder“ und „Ultra Low Range DNA Ladder“ (Fermentas)
zum Einsatz. Die Agarosegele wurden gefärbt mit 10 mg/ml Ethidiumbromid (Invitrogen). Die
angelegte Spannung lag bei Gelen mittlerer Größe und Verwendung der LE Agarose meist
um 100 V, bei kleinen Gelen und Sieve 3:1 Agarose dagegen stets bei 80 V. Im Anschluß an
die Gelelektrophorese wurden die Gele auf einem UV-Transilluminator UST-30M-8E (Biostep
GmbH, Jahnsdorf) unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von 312 nm betrachtet und ggf. zur
Dokumentation fotografiert.
Für Sequenzierungen der PCR-Produkte wurden die entsprechenden Banden unter UV-Licht
aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Die DNA wurde anschließend unter Verwendung des
„QIAquick Gel Extraction Kits“ (Qiagen) aufgereinigt und zum Sequenzieren an einen
externen Dienstleister gesendet (Eurofins MWG GmbH, Ebersberg).
2.7 Stimulation der HMGA2-Expression in adipösen mesenchymalen Stammzellen
Die Gewinnung adipöser mesenchymaler Stammzellen aus adultem Fettgewebe erfolgte wie
an anderer Stelle beschrieben (Markowski et al., 2011). In sterilen Petrischalen mit einem
Durchmesser von 9,6 cm wurden 300.000 Zellen in Medium TC199 (200 IE/ml Penicillin,
200 µg/ml Streptomycin) mit 20 % FCS ausgesät. Die Serumkonzentration wurde nach 24 h
auf 1 % gesenkt. Nach weiteren 24 h wurde das Medium verworfen und ersetzt durch
Medium TC199, das FGF1 (Jena Bioscience, Jena) in einer Konzentration von 25 ng/ml
enthielt. Parallel wurden Zellen in Medium TC199 mit 1 % FCS ohne FGF1 als Kontrolle
kultiviert. Nach Inkubationszeiten von 12, 24 und 72 h wurden die Zellen in Puffer RLT mit βMercaptoethanol lysiert. Die RNA-Isolierung erfolgte mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) nach
den Anweisungen des Herstellers.
17
2 MATERIAL UND METHODEN
2.8 Plasmidisolierung aus transformierten E. coli-Zellen
Es lagen kryokonservierte Escherichia coli-Zellen vor, die mit den gewünschten Plasmiden
transformiert worden waren. Dabei handelte es sich um den eukaryotischen Expressionsvektor pCR3.1 (Invitrogen), der einen CMV-Promotor enthält, ohne Insert einerseits und um
denselben Vektor, in den die HMGA2-kodierende Sequenz kloniert worden war. Die transformierten Zellen wurden aufgetaut und zum Animpfen von Vorkulturen verwendet. Dazu wurden 6 ml LB-Medium (1 % NaCl, 1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Hefeektrakt, 100 µg/ml Ampicillin,
pH 7,0) angeimpft und bei 37 °C ca. 7 h inkubiert. Als Hauptkultur wurden 300 µl der
Vorkulturen in 300 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin gegeben und ebenfalls bei 37 °C
über Nacht inkubiert. Die Isolierung der Plasmide erfolgte unter Verwendung des Nucleo
Bond Xtra Maxi Plus EF Kits (Macherey-Nagel GmbH, Düren) gemäß Herstellerangaben. Die
Konzentrationen der Plasmide wurden spektrophotometrisch bestimmt. Zur Kontrolle wurde
ein Verdau von je 2 µg Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym EcoRI („Fast Digest“,
Fermentas) gemäß Herstellerangaben bei 37 °C für 30 min durchgeführt und anschließend in
einem 1,5-prozentigen Agarose-Gel aufgetrennt. Der Vektor besitzt zwei Schnittstellen für
dieses Enzym, die das einklonierte Insert flankieren, so daß nach dem Verdau und gelelektrophoretischer Auftrennung die Präsenz eines Inserts festgestellt und dessen Länge
abgeschätzt werden kann.
2.9 Transfektion eukaryotischer Zellen
In 2 ml Medium mit 10 % DMSO kryokonservierte Zellen der MCF7-Zellinie wurden bei 37 °C
im Wasserbad aufgetaut, in 8 ml Medium TC199 mit 20 % FCS überführt und bei 120 x g für
10 min sedimentiert. Die Zellpellets wurden in Medium resuspendiert, in Zellkulturflaschen
mit 5 ml Medium überführt und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Am nächsten Tag wurde
das Medium ausgetauscht. Bei konfluentem Wachstum wurden die Zellen trypsiniert (TrypLE
Express, Life Technologies) und passagiert. Zur Transfektion wurden pro Well einer 6-WellZellkulturplatte (Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden) 150.000 Zellen in 2 ml Medium TC199
ausgesät und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Am nächsten Tag wurden sie mit
Hilfe der Transfektionsreagenz Lipofectamine LTX (Life Technologies) transfiziert. Zur Bildung der Transfektionskomplexe wurde antibiotika- und serumfreies Medium verwendet.
Neben dem Leervektor ohne Insert und dem HMGA2-Expressionsvektor wurde je ein Ansatz
unbehandelt belassen sowie mit Transfektionsreagenz ohne Plasmid-DNA behandelt. In
einem Gesamtvolumen von 500 µl wurden 7 µl Transfektionsreagenz und 2,5 µg PlasmidDNA für 25 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf die Zellen in 2 ml Medium getropft. Die transfizierten Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Isolierung
der mRNA erfolgte 24 h bzw. 48 h nach der Transfektion unter Verwendung des RNeasy
Mini Kits (Qiagen).
18
3 ERGEBNISSE
3 ERGEBNISSE
3.1 Chromosomale Aberrationen und deren Auswirkungen auf die HMGA-Gene in
Leiomyomen des Uterus
Benigne Tumoren mesenchymalen Ursprungs weisen häufig klonale chromosomale Aberrationen auf, anhand derer sie zytogenetischen Gruppen zugeordnet werden können. Dies trifft
auf etwa ein Fünftel bis die Hälfte aller Leiomyome des Uterus zu (Nilbert und Heim, 1990;
Kiechle-Schwarz et al., 1991; Pandis et al., 1991; Rein et al., 1991; Meloni et al., 1992).
Myome mit Veränderungen der Region 12q14~15 bilden eine der beiden größten zytogenetischen Gruppen (Heim et al., 1988; Schoenmakers et al., 1995; Wanschura et al., 1997).
Nahezu ebenso häufig ist die chromomale Bande 7q22 entweder von einer interstitiellen
Deletion del(7)(q22q32) oder anderen Rearrangierungen betroffen (Rein et al., 1991; Ozisik
et al., 1993; Sargent et al., 1994). Deutlich seltener treten Myome mit Aberrationen der chromosomalen Bande 6p21 auf (Nilbert und Heim, 1990; Kiechle-Schwarz et al., 1991; Ozisik et
al., 1995). Wie auch aus Untersuchungen anderer benigner mesenchymaler Tumoren bekannt ist, sind die HMGA-Gene häufig von chromosomalen Veränderungen betroffen. Rearrangierungen der Region 12q14~15, in der HMGA2 lokalisiert ist, treten unter anderem in
Lipomen (Ashar et al., 1995; Schoenmakers et al., 1995; Sreekantaiah et al., 1991; Nielsen
und Mandahl, 2002; Mandahl und Mertens, 2010), in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen (Sandros et al., 1990; Bullerdiek et al., 1993; Schoenmakers et al., 1995), in chondroiden Lungenhamartomen (Dal Cin et al., 1993; Fletcher et al., 1995; Schoenmakers et al.,
1995; Rogalla et al., 2000) sowie in Endometriumpolypen (Walter et al., 1989; Vanni et al.,
1993) auf. Ebenso ist auch die Bande 6p21, in der das verwandte HMGA1-lokalisiert ist,
häufig in Lipomen, chondroiden Lungenhamartomen und Endometriumpolypen von chromosomalen Rearrangierungen betroffen (Johansson et al., 1993; Xiao et al., 1997; Kazmierczak
et al., 1998; Kazmierczak et al., 1999; Tallini et al., 2000; Bartuma et al., 2007; Medeiros et
al., 2012), nicht jedoch in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen (Rohen et al., 1999).
Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zum Zusammenhang
zwischen chromosomaler Aberration und Auswirkung auf die HMGA-Gene in Uterus-Leiomyomen unternommen. In den nachfolgend vorgestellten Publikationen wurde untersucht,
wie sich Aberrationen der Banden 12q14~15 und 6p21 auf die Expression der HMGA-Gene
auswirken. Im Fokus einer weiteren Arbeit stand der zugrundeliegende Mechanismus, der
bei 12q14~15-Veränderungen die HMGA2-Expression beeinflussen kann.
19
3 ERGEBNISSE
3.1.1 Overexpression of HMGA2 in uterine leiomyomas points to its general role for
the pathogenesis of the disease (Klemke et al., 2009)
Unter den Uterus-Leiomyomen mit klonalen chromosomalen Aberrationen liegen am
häufigsten solche Veränderungen vor, die die chromosomale Region 12q14~15 betreffen
(Heim et al., 1988). Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, daß in Tumoren dieser zytogenetischen Gruppe HMGA2 von den chromosomalen Veränderungen betroffen ist (Ashar et
al., 1995; Schoenmakers et al., 1995; Schoenberg Fejzo et al., 1995; Hennig et al., 1996a;
Wanschura et al., 1997). Im Gegensatz zu Lipomen müssen die Bruchpunkte in Myomen
nicht zwangsläufig intragenisch lokalisiert sein, sondern können sowohl upstream als auch
downstream von HMGA2 auftreten. Eine Veränderung der Transkripte bleibt dann zwar aus,
es wird aber eine verstärkte Genexpression ausgelöst (Schoenberg Fejzo et al., 1996;
Hennig et al., 1999; Tallini et al., 2000; Gross et al., 2003; Quade et al., 2003). Bislang nicht
hinreichend untersucht war das Expressionslevel in Myomen, die keine den HMGA2-Locus
betreffenden chromosomalen Veränderungen aufweisen. Daher wurden insgesamt 180
Uterus-Leiomyome von 100 Patientinnen zunächst karyotypisiert. Zytogenetisch wurde eine
Aberration im Bereich 12q14~15 in elf Tumoren nachgewiesen. Zumeist handelte es sich
dabei um eine Translokation t(12;14)(q15;q24). In einem weiteren Leiomyom schlug die
Karyotypisierung fehl, eine HMGA2 betreffende Rearrangierung konnte aber mittels FISH
nachgewiesen werden. Die übrigen Leiomyome wiesen einen normalen Karyotyp oder andere klonale Aberrationen auf. Darüber hinaus lagen Gewebeproben von 57 Myometrien vor,
die ebenfalls zur Quantifizierung der HMGA2-Expression mittels qRT-PCR herangezogen
wurden. Von 51 Patientinnen standen zusammengehörige Gewebeproben des Myometriums
und mindestens eines Leiomyoms zur Verfügung. Die Quantifizierung ergab, daß die Myome
mit 12q14~15-Veränderungen HMGA2 erwartungsgemäß am stärksten exprimieren. Als
unerwartet niedrig stellte sich das Expressionslevel allerdings in einem Myom mit zytogenetisch nachgewiesener t(12;14)(q15;q24) heraus. In diesem Fall wurde eine Interphase-FISH
an formalinfixiertem Gewebe des Tumors mit einer den HMGA2-Locus überspannenden
Sonde durchgeführt. In 98 % der ausgewerteten Zellkerne wurden dabei kolokalisierte Signale der Bruchpunktsonde beobachtet, was auf einen intakten HMGA2-Locus hindeutet. Auffällig hoch war dagegen das Expressionslevel in einem Myom mit nach zytogenetischer Untersuchung normalem 46,XX-Karyotyp. Auch dieser Tumor wurde einer FISH unterzogen,
wobei eine Rearrangierung in 23 % der Zellen festgestellt wurde, die zytogenetisch nicht in
Erscheinung getreten war und die die hohe HMGA2-Expression erklären kann. Aufgrund der
Ergebnisse der FISH mußte dieses Myom folglich der Gruppe mit 12q14~15-Aberration zugeordnet werden. Nach den kombinierten Ergebnissen der zytogenetischen und molekularzytogenetischen Untersuchungen wiesen zwölf der 180 untersuchten Leiomyome den
20
3 ERGEBNISSE
HMGA2-Locus betreffende Aberrationen auf. In all diesen Fällen wurde eine sehr starke
Expression des Gens festgestellt.
Im Gegensatz zu der gut untersuchten Situation in Myomen mit chromosomaler Veränderung
der Region 12q14~15 war nicht bekannt, ob auch Myome mit normalem Karyotyp bzw. mit
andersartigen Aberrationen eine veränderte HMGA2-Expression aufweisen. Von 51 Hysterektomie-Patientinnen lagen auch Gewebeproben von tumorfreiem Myometrium vor, so daß
ein Vergleich der HMGA2-Expression von insgesamt 107 Leiomyomen, davon fünf mit aberranter Region 12q14~15, mit dem dazugehörigen Myometrium möglich war. Es wurde festgestellt, daß nicht nur die Gruppe der Myome mit 12q14~15-Veränderungen verstärkt
HMGA2 exprimiert, sondern daß auch Myome ohne diese chromosomale Aberration das
Gen mehrheitlich wesentlich stärker exprimieren als die glatte Muskulatur des jeweiligen
Uterus. Von 101 Myomen ohne 12q14~15-Veränderung lag das Expressionslevel in nur elf
Tumoren unterhalb des im Myometrium der jeweils selben Patientin ermittelten Wertes. Auch
zwischen der mittleren relativen HMGA2-Expression in tumorfreien Myometrien (1,8) und
Myomen ohne 12q14~15-Veränderung (11,4) bestand ein statistisch signifikanter Unterschied (p < 0,05).
21
3 ERGEBNISSE
I.
Overexpression of HMGA2 in uterine leiomyomas
points to its general role for the pathogenesis of the disease.
Klemke M, Meyer A, Hashemi Nezhad M, Bartnitzke S, Drieschner N, Frantzen C, Schmidt
EH, Belge G, Bullerdiek J. 2009. Genes, Chromosomes and Cancer 48: 171-178.
Eigenanteil:
 Probenentnahme
aus
Uterus-Leiomyomen
und
dazugehörigen
Myometrien
zur
Kryokonservierung sowie Karyotypisierung
 Durchführung der RNA-Isolierung sowie der relativen Quantifizierung der HMGA2Expression und deren Auswertung in Zusammenarbeit mit A. Meyer
 Verfassen des Manuskripts in Zusammenarbeit mit N. Drieschner und J. Bullerdiek
22
3 ERGEBNISSE
GENES, CHROMOSOMES & CANCER 48:171–178 (2009)
Overexpression of HMGA2 in Uterine Leiomyomas
Points to its General Role for the Pathogenesis
of the Disease
Markus Klemke,1† Anke Meyer,1† Maliheh Hashemi Nezhad,1 Sabine Bartnitzke,1 Norbert Drieschner,1
Christiane Frantzen,2 Ernst Heinrich Schmidt,3 Gazanfer Belge,1 and Jörn Bullerdiek1,4*
1
Center for Human Genetics,University of Bremen, 28359 Bremen,Germany
Women’s Clinic, St.Joseph-Stift Hospital, 28209 Bremen,Germany
3
Department of Obstetrics and Gynecology,DIAKO Evang.Diakonie Hospital, 28239 Bremen,Germany
4
Clinic for Small Animals and Research Cluster REBIRTH,University of Veterinary Medicine, 30137 Hanover,Germany
2
An overexpression of HMGA2 is supposed to be a key event in the genesis of leiomyoma with chromosomal rearrangements affecting the region 12q14-15 targeting the HMGA2 gene, but gene expression data regarding differences between
uterine leiomyomas with and those without 12q14-15 aberrations are insufficient. To address the question whether
HMGA2 is only upregulated in the 12q14-15 subgroup, the expression of HMGA2 was analyzed in a comprehensive set of
leiomyomas (n ¼ 180) including tumors with 12q14-15 chromosomal aberrations (n ¼ 13) and matching myometrial tissues (n ¼ 51) by quantitative RT-PCR. The highest expression levels for HMGA2 were observed in tumors with rearrangements affecting the region 12q14-15, but although HMGA2 is expressed at lower levels in leiomyomas without such
aberrations, the comparison between the expression in myomas and matching myometrial tissues indicates a general upregulation of HMGA2 regardless of the presence or absence of such chromosomal abnormalities. The significant (P < 0.05)
overexpression of HMGA2 also in the group of fibroids without chromosomal aberrations of the 12q14-15 region suggests
C 2008 Wiley-Liss, Inc.
V
a general role of HMGA2 in the development of the disease.
INTRODUCTION
Uterine leiomyomas (UL, fibroids) are the
most frequent gynecological tumors and, despite
being benign, constitute an enormous public
health burden. Among the symptoms caused by
uterine leiomyomas are menorrhagia, abdominal
pain, and infertility (Stewart, 2001). Their actual
prevalence is still a matter of debate and seems
to vary among populations, but at least one third
of women aged 30 years or older have one or
more UL (Cramer and Patel, 1990; Baird et al.,
2003; Heinemann et al., 2003). Their incidence
seems to be higher in African American than in
European American or European women (Marshall et al., 1998).
Currently, mutations of the two human genes
encoding high mobility group proteins of the
HMGA type, i.e., HMGA1 and HMGA2 have
been assumed to be causally linked with the development of subsets of uterine leiomyomas.
Both genes encode members of the so-called
high mobility group proteins. HMGA proteins are
capable of binding to the minor groove of ATrich DNA with three DNA-binding domains (socalled AT-hooks), thus inducing conformational
changes in chromatin structure and enabling the
regulation of the expression of various target
genes. In addition, they can interact with other
proteins by means of their acidic domain (Fusco
and Fedele, 2007). HMGA1 and HMGA2 map to
chromosomal bands that are targeted by nonrandom structural chromosomal abnormalities found
in uterine leiomyomas, i.e., 6p21 for HMGA1
(Kazmierczak et al., 1996) and 12q14-15 for
HMGA2 (Ashar et al., 1995; Schoenmakers et al.,
1995). Usually, these regions are affected by chromosomal translocations but inversions can occur
as well with structural chromosomal aberrations
affecting 12q14-15 being much more frequent
than those affecting 6p21 (Nilbert and Heim,
1990). The molecular alterations resulting from
the cytogenetic deviations generally seem to
Supported by: Tönjes-Vagt-Stiftung, Bremen.
y
Markus Klemke and Anke Meyer contributed equally to this
work.
*Correspondence to: Jörn Bullerdiek, Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Str. ZHG, 28359 Bremen,
Germany. E-mail: [email protected]
Received 9 May 2008; Accepted 18 September 2008
DOI 10.1002/gcc.20627
Published online 3 November 2008 in
Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com).
C 2008 Wiley-Liss, Inc.
V
23
3 ERGEBNISSE
172
KLEMKE ET AL.
include an upregulation of the genes (Tallini
et al., 2000; Gross et al., 2003). With regard to
HMGA2, a considerable fraction of the chromosomal breakpoints has been assigned to regions
outside the open reading frame of the gene, thus
primarily affecting its expression rather than its
protein sequence (Quade et al., 2003). Thus,
overexpression of HMGA2 seems to be sufficient
to trigger tumorigenesis. It is obvious that an
enhanced level of HMGA2 is pathogenetically relevant in a subset of some 10–20% of uterine leiomyomas (Hennig et al., 1999), but it remains an
open question whether or not an increased level
of HMGA2, compared to normal myometrium,
may characterize also leiomyomas that do not
have HMGA2 rearrangements. A recent study by
Peng et al., (2008) suggests that upregulation of
HMGA2 may be a more general phenomenon in
UL but the analyzed tumors were not genetically
classified and no matched samples were analyzed
individually by quantitative RT-PCR. Herein, we
have quantitated the level of HMGA2 mRNA in a
large series of uterine leiomyomas.
MATERIALS AND METHODS
Tissue Samples
Samples of uterine leiomyomas and myometrium were snap frozen in liquid nitrogen immediately after surgery and stored at 80 C. In case
of UL another part of the tumor was used for cell
culturing and karyotyping. Informed consent was
obtained from all patients.
For fluorescence in situ hybridization (FISH)
analyses HOPE (HEPES-glutamic acid buffer
mediated organic solvent protection effect)-fixed,
paraffin-embedded tissue sections were used.
The tissues were cut into 5 lm sections which
were subsequently used for FISH analyses.
RNA Isolation, Reverse Transcription, and
Quantitative RT-PCR
RNA was isolated from fresh-frozen tissue samples with the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Germany) including DNase treatment according
to the manufacturer’s instructions and quantitated
by spectrophotometry. After reverse transcription
of 250 ng of total RNA using M-MLV RT (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) and random hexamers, the HMGA2 mRNA levels were determined
by relative quantification referring to the expression of 18S rRNA. Real-time PCR was performed
on a 7300 Real-Time PCR System with Assay
No. Hs00171569_m1 (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany) for the detection of HMGA2 and
primers and probe for 18S rRNA as described
previously (Belge et al., 2008).
Analysis of Gene Expression
The relative expression was calculated by the
DCt method, using 18S rRNA as endogenous control and by choosing the HMGA2 expression of a
myometrial sample as calibrator. The significance
of differential HMGA2 expression between the
different groups (myometrium, myoma with and
without 12q14-15 aberrations) was determined by
Student’s t-test.
Cell Culture
After surgery, samples of primary tumors were
stored in Hank’s solution with antibiotics (200
IU/ml penicillin, 200 lg/ml streptomycin). For
cell culture the tumor samples were minced and
treated with 0.26% (200U/ml) collagenase (Serva,
Heidelberg, Germany) for 5–8 hr. After centrifugation, the pellet was resuspended in culture medium (TC 199 with Earle’s salts supplemented
with 20% fetal bovine serum, 200 IU/ml penicillin, 200 lg/ml streptomycin) and incubated at
37 C and 5% CO2.
Chromosome Analyses
For chromosome analyses exponentially growing cultures of leiomyoma cells were used. Metaphase chromosome spreads were prepared by
using colcemid (0.06 lg/ml for 1 hr) to arrest cultured cells during mitosis. A hypotonic solution
(culture medium and aqua bidest in a 1:6 ratio)
and the fixative (methanol and acetic acid in a
3:1 ratio) were then applied sequentially. Finally,
the chromosome suspension was dropped onto
glass slides. The chromosomes were GTGbanded according to routine techniques. Karyotype description followed ISCN (2005).
HMGA2-Specific Break-Apart Probes and FISH
For FISH three BAC clones were used as
break-apart probes. RP11-745O10 (AC078927)
and RP11-293H23 (AC012264) are located distal
(30 ) to HMGA2. RP11-269K4 (AQ478964 and
AZ516203) is located proximal (50 ) to HMGA2.
Labeling was performed by nick translation
(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) either
with digoxigenin (RP-269K4) or biotin (RP11-
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
24
3 ERGEBNISSE
OVEREXPRESSION OF HMGA2 IN UTERINE LEIOMYOMAS
745O10 and RP11-293H23). For each FISH
experiment 2 ng/ll of the distally located probes
(RP11-745O10 and RP11-293H23) and 3 ng/ll of
RP11-296K4 were used in 15 ll hybridization
solution containing 50% formamide, 2SSC, 10%
dextrane sulfate and 105 ng/ll COT human
DNA.
FISH analysis on metaphase preparations was
performed after GTG banding of the metaphase
spreads. Treatment of metaphases and subsequent FISH experiments were performed as
described previously (Kievits et al., 1990) with a
few modifications. For one slide 25 ll of hybridization mixture were used. Codenaturation was
performed on a Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany) for 3 min at 80 C followed by O/N hybridization in a humidified
chamber at 37 C. Posthybridization was performed at 61 C for 5 min in 0.1SSC. Subsequent treatment of slides was performed as
described previously (Kievits et al., 1990). For
detection of the hybridized probes antidigoxigenin fluorescein fab fragments (Roche Diagnostics)
and Cy3-conjugated streptavidin (Dianova,
Hamburg, Germany) were used. Slides were
counterstained with DAPI (0.75 lg/ml) (Vector
Laboratories, Burlingame, CA).
For FISH, formalin-fixed, paraffin-embedded
(FFPE) tissue sections were deparaffinized with
diethylether. Protease digestion was done with a
pepsin ready-to-use solution (DCS, Hamburg,
Germany) for 12–17 min. After dehydration in a
70%, 80%, and 95% ethanol series the sections
were postfixed with 1% formaldehyde in 1PBS
for 15 min. Prior to codenaturation the sections
were dehydrated again. Codenaturation was performed on a Mastercycler gradient (Eppendorf)
for 5 min at 85 C followed by O/N hybridization
in a humidified chamber at 37 C. Posthybridization was performed at 42 C or 61 C for 2 min in
0.4SSC/0.3%NP-40. Subsequent treatment of
slides and detection of hybridized probes were
performed as described for FISH on metaphase
preparations.
Slides were examined in an Axioskop 2 plus
fluorescence microscope (Zeiss, Göttingen, Germany). Images were captured with an AxioCam
MRm digital camera and were edited with AxioVision (Zeiss). For metaphase preparations, 10
metaphases were examined. For analysis of
FFPE tissue sections at least 100 nonoverlapping
nuclei from different (at least three) areas of the
tumors were scored. Nuclei with two colocalized
red/green signals (RG) were scored as normal.
173
Nuclei with one colocalized red/green signal, one
single red, and one single green signal
(1RG1R1G) were scored as positive for HMGA2
rearrangement.
RESULTS
For this study 180 uterine leiomyomas from
100 patients have been investigated by qRTPCR for the expression level of HMGA2. A total
of 57 myometrium samples from uteri removed
because of the occurrence of UL were investigated as well. For 51 of these samples, matching
tissue from one or more leiomyomas was available. All UL have been karyotyped successfully
based on at least 10 G-banded metaphases showing a resolution of 400 bands per haploid set or
higher.
Based on cytogenetics the group of UL was
further subdivided into those showing aberrations
of chromosomal region 12q14-15 (n ¼ 13; Table 1)
and those with an apparently normal karyotype or
other clonal aberrations (n ¼ 167), respectively.
As to these three groups, i.e., myometrium, UL
with 12q14-15 changes, and other UL HMGA2
expression was determined by qRT-PCR using
fresh-frozen samples. The average relative
HMGA2 mRNA expression was 1.99 for the myometria and 261.41 for all UL. When distinguishing between both subgroups of UL outlined
above average expression levels were 3213.78 for
UL with aberrations in the chromosomal region
12q14-15 and 31.59 for those without changes in
this region, respectively.
Thus, even within the group of UL without
cytogenetically detectable rearrangements of the
HMGA2 locus at 12q14-15 HMGA2 mRNA was
expressed at a higher level than in myometrium
(Fig. 1). Differences between all leiomyomas and
myometrium as well as between leiomyomas
without 12q14-15 aberrations and myometrium
were statistically significant (P < 0.005 and P <
0.05, respectively). Furthermore, an individual
analysis of the matched samples (51 myometrial
tissues and 107 corresponding UL) was performed. The mean HMGA2 expression was 11.37
in karyotypically normal UL (n ¼ 101) and 1.77
in the corresponding myometrial tissues (n ¼ 51).
The results clearly show that in nearly all cases
within each of the paired samples the leiomyomas showed higher HMGA2 expression than the
corresponding myometrium (Fig. 2).
One case with a normal karyotype and an
unexpectedly high HMGA2 expression as well as
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
25
3 ERGEBNISSE
174
KLEMKE ET AL.
TABLE 1. Karyotypes of the 13 Leiomyomas with Chromosome 12 Aberrations and Results of Interphase FISH with HMGA2
Specific Break-Apart Probes
Karyotype
46,XX,inv(5)(q15q31 33),t(12;14)(q15;q24)[13]
46,XX,t(12;15;14)(q15;q26;q24)[20]/46,XX[1]
46,XX[36]
–
46,XX,der(1)r(1;2),t(12;14)(q15;q24)[4]/46,XX,t(12;14)(q15;q24)[13]
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[9]/46,XX[3]
46,XX,r(1),t(1;12;14)(p36.3;q14;q24)[19]
46,XX,t(2;12)(q33;q13)[17]
46,XX,der(12),der(14)?ins(14;12)[8]/46,idem,r(1)[4]
46,XX,t(3;5;12)(q23 25;p13 15;q13 15)[11]/45,XX,idem,-22 [10]
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[5]/46,XX[9]
45,XX,t(12;14)(q15;q24),der(14)t(12;14)(q15;q24),-22[15]
45,XX,t(12;14)(q15;q24),der(14)t(12;14)(q15;q24),-22[15]
Relative HMGA2
expression
FISH results
(2RG/1RG1R1G)a
8.6
302.3
894.5
993.3
1047.8
1327.3
1722.5
2381.6
3444.3
4450.7
5906.1
7760.3
11539.7
98/1
–
72/23
41/51
m
–
–
–
–
–
–
–
–
a
Percentage of nuclei either with two colocalized signals (2RG) or with one colocalized, one single red and one single green signal (1RG1R1G) indicating a HMGA2 rearrangement.
m, FISH was performed on metaphase preparations (Fig. 4). All 10 metaphases showed a breakpoint upstream of HMGA2.
a second myoma with a cytogenetically visible
t(12;14) and a rather low HMGA2 expression were
checked by interphase FISH. In the cytogenetically normal myoma, FISH showed HMGA2 disruption in 23% of the cells (Fig. 3, Table 1). The
tumor with visible t(12;14) but low expression of
HMGA2 showed two colocalized signals in 98% of
the nuclei, indicating an intact HMGA2 locus.
Metaphase FISH was also done on one case
with a t(12;14)(q15;q24) (Fig. 4). Interestingly,
the probe located proximal to HMGA2 (RP11269K4) showed three signals: on the normal chromosome 12, the derivative chromosome 12, and
the derivative chromosome 14 (Fig. 4C), indicat-
ing a breakpoint located 50 of HMGA2. The
approximately 16kb distance between the probe
RP11-269K4 and the 50 end of HMGA2 suggests
that the breakpoint was located approximately
20kb upstream of HMGA2.
DISCUSSION
Despite their high prevalence the etiology and
pathogenesis of UL remain poorly understood.
Mutations of the gene encoding the high mobility
group protein HMGA2 have been suggested to
cause a subset of uterine leiomyomas (Schoenmakers et al., 1995; Hennig et al., 1999). As a
Figure 1. Relative quantification of the HMGA2 expression in uterine leiomyomas and myometrial
tissues. Green bars: Myometrium; yellow bars: UL without cytogenetically detectable aberrations of
chromosomal region 12q14-15; red bars: UL with 12q14-15 aberrations.
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
26
3 ERGEBNISSE
OVEREXPRESSION OF HMGA2 IN UTERINE LEIOMYOMAS
175
Figure 2. HMGA2 expression in UL (crosses) and matching myometrial tissues (open circles) in
increasing order of expression in myometrial tissues. Triangles indicate UL with 12q14-15 aberrations.
rule, this subset is characterized by cytogenetically visible structural chromosome alterations
affecting chromosomal region 12q14-15. HMGA2
has been identified as the target of these alterations (Schoenmakers et al., 1995) and despite a
wide distribution of breakpoints, intragenic as
well as extragenic (Kazmierczak et al., 1995;
Hennig et al., 1996; Schoenmakers et al., 1999;
Kurose et al., 2000; Mine et al., 2001; Takahashi
et al., 2001; Quade et al., 2003), the key mechanism by which the chromosomal alterations
contribute to tumorigenesis seems to be an upregulation of the HMGA2 gene leading to overexpression of the full-length transcript or a
truncated or chimeric protein. Nevertheless, the
majority of UL lack cytogenetically visible
chromosome alterations and also by molecularcytogenetic methods there is no evidence that
submicroscopic alterations of the HMGA2 locus
occur in a considerable number of these cases
(Weremowicz and Morton, 1999). On the other
hand, HMGA2 overexpression could play a more
general role in the development of UL, and not
only in the subgroup characterized by 12q14-15
alterations. Roughly 10 years ago the hypothesis
was advanced that HMGA2 overexpression induces
an embryonic chromatin configuration in cells, thus
re-endowing them with a stem-cell like behavior
(Bullerdiek, 1997). This assumption was further
supported by recent studies on the HMGA2 expression in embryonic stem cells (Li et al., 2006, 2007).
Here, we have shown that also UL without
cytogenetically detectable 12q14-15 rearrange-
ments overexpress HMGA2. This supports the
assumption that an elevated level of a stem-cell
chromatin associated protein is one of the key
events in the genesis of UL. Of particular note,
the expression of HMGA2 in myomas almost
always exceeded that of the corresponding myometrium (Fig. 2). Apparently, the basic level of
HMGA2 varies among the samples. Possibly, this
could reflect changes throughout the menstrual
Figure 3. Dual-color FISH performed on interphase nuclei of a
leiomyoma with cytogenetically normal karyotype. One nucleus showing two colocalized red/green signals (2RG, left) and a second nucleus
with one colocalized red/green and one single red and green signal
(1RG1R1G, right), respectively, indicating a rearrangement of
HMGA2.
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
27
3 ERGEBNISSE
176
KLEMKE ET AL.
Figure 4. FISH with HMGA2 break-apart probes in a UL with
t(12;14)(q15;q24). A: G-banded metaphase prior to FISH. B: The
same metaphase after dual-color FISH indicating a rearrangement of
the HMGA2 locus. C: Corresponding figure only showing the green
fluorescent probe (RP11-269K4) located proximal (50 ) to HMGA2. D:
Corresponding figure only showing the red fluorescent probes
(RP11-745O10 and RP11-293H23) located distal (30 ) to HMGA2.
cycle. Such alterations in gene expression patterns have been described, e.g., by Kayisli et al.
(2007). Herein, the term overexpression refers to
an expression exceeding that of the matching
myometrium. Despite the monoclonal origin of
UL (Townsend et al., 1970; Mashal et al., 1994;
Hashimoto et al., 1995; Zhang et al., 2006) overexpression of HMGA2 must not necessarily be
due to mutations affecting the gene itself. It has
recently been described that HMGA2 is regulated
by microRNAs of the let-7 family (Lee and
Dutta, 2007; Mayr et al., 2007; Park et al., 2007;
Shell et al., 2007; Kumar et al., 2008; Motoyama
et al., 2008; Peng et al., 2008). Thus, having now
identified the overexpression of HMGA2 also in
UL without 12q14-15 alterations being visible at
the microscopic level, future studies should also
address mutations of let-7 genes and their binding sites within the 30 UTR of HMGA2.
To further validate the cytogenetic results in
cases with high HMGA2 expression and no visible
translocation or vice versa, FISH was performed
with HMGA2 break-apart probes. In the first case,
separate signals from BAC clones located 50 and
30 of HMGA2 occurred in 23% of the cells, indicating a translocation with a breakpoint within or
in close proximity of HMGA2. Besides a cryptic
HMGA2 rearrangement undetectable by classical
cytogenetics, a selection of cells without translocation during cell culture may explain the observation that the karyotype was apparently normal.
However, the fact that chromosome 12 was found
to be aberrant in almost one fourth of the cells
by FISH is concordant with the high HMGA2
expression despite an apparently normal
karyotype.
In the second case showing a low HMGA2
expression despite a visible t(12;14) the signals
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
28
3 ERGEBNISSE
OVEREXPRESSION OF HMGA2 IN UTERINE LEIOMYOMAS
were colocalized in 98% of the cells suggesting
that the breakpoint was localized outside the region
covered by the FISH probes. This unusually large
distance between the breakpoint and HMGA2 may
explain why the observed HMGA2 expression was
unexpectedly low in one UL with a t(12;14). On the
other hand, as indicated by FISH on metaphases of
one UL with t(12;14)(q15;q24), an extragenic
breakpoint upstream but in closer proximity of
HMGA2 can be sufficient to trigger the observed
overexpression. Breakpoints located 50 of HMGA2
in UL with t(12;14) have also been reported by
Quade et al. (2003).
The HMGA2 expression in uterine leiomyomas
has also been quantified in a study by Gross et al.
(2003). Eleven karyotypically normal UL plus
four matching myometrial samples as well as 10
UL with 12q14-15 rearrangements plus three
myometrial tissues were analyzed by qRT-PCR,
and a significantly higher HMGA2 expression in
UL with 12q14-15 rearrangements was noted.
However, in contrast to the present study, no significant differences between the expression levels
in karyotypically normal UL and matching myometrial samples were observed.
In summary, our results confirm the strongly
increased HMGA2 expression in UL with 12q1415 rearrangements. Moreover, the expression levels detected in 101 UL from 51 patients and 51
matching myometrial samples indicate a general
increase of HMGA2 mRNA also in karyotypically
normal tumors.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Karmela Sobczyk and Manuela
Grund for their valuable technical support.
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30
3 ERGEBNISSE
3.1.2 6p21 rearrangements in uterine leiomyomas targeting HMGA1 (Hashemi Nezhad
et al., 2010)
Neben der Gruppe der Uterus-Leiomyome mit Aberrationen der chromosomalen Region
12q14~15 ist in einer kleineren zytogenetischen Gruppe die Bande 6p21 von rekurrenten
Chromosomenveränderungen betroffen (Nilbert und Heim, 1990; Kiechle-Schwarz et al.,
1991; Ozisik et al., 1995; Hennig et al., 1996b; Sandberg, 2005). Molekulares Target der
chromosomalen Bruchpunkte in diesem Bereich ist das in der Bande 6p21 lokalisierte Gen
HMGA1 (Kazmierczak et al., 1996c; Kazmierczak et al., 1998), das für zwei weitere HighMobility-Group-Proteine kodiert. Ein Zusammenhang zwischen 6p21-Aberrationen und der
Expression des HMGA1-Gens war in Analogie zur HMGA2-Aktivierung bei Veränderungen
der chromosomalen Region 12q14~15 anzunehmen, allerdings existierten nur wenige diesbezügliche Untersuchungen mit geringen Fallzahlen. Es gab beispielsweise Studien, in
denen eine gesteigerte HMGA1-Expression über einen Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) (Williams et al., 1997) oder über einen immunhistochemischen Proteinnachweis in
vier Leiomyomen aus der 6p21-Gruppe nachgewiesen worden war (Tallini et al., 2000).
Untersuchungen auf mRNA-Ebene waren dagegen kaum vorhanden. Der Zusammenhang
zwischen 6p21-Veränderung und HMGA1-Expression wurde mittels herkömmlicher RT-PCR
an lediglich drei Leiomyomen untersucht (Sornberger et al., 1999).
Mittlerweile stehen weitaus sensitivere Methoden zur Quantifizierung der Genexpression zur
Verfügung, von denen in der nachfolgenden Publikation die quantitative Real-Time RT-PCR
herangezogen wurde, um die HMGA1-Expression in sieben Leiomyomen mit 6p21-Aberration sowie in acht Tumoren ohne zytogenetisch erkennbare chromosomale Veränderung zu
messen und zu vergleichen. Dabei stellte sich heraus, daß im Vergleich zu karyotypisch
normalen Myomen sechs der sieben Tumoren, welche eine 6p21 betreffende Translokation
bzw. in einem Fall eine Monosomie 6 aufwiesen, deutlich stärker HMGA1 exprimieren. Somit
konnte bestätigt werden, daß chromosomale Aberrationen, die die Bande 6p21 betreffen, mit
einer verstärkten HMGA1-Expression assoziiert sind, ebenso wie Veränderungen von
12q14~15 zu einer Aktivierung von HMGA2 führen. Außerdem wurde in allen hier eingeschlossenen Myomen die HMGA2-Expression untersucht. Hierbei zeigte sich, daß die Stärke
der Expression von HMGA1 und HMGA2 nicht miteinander korreliert, obwohl in zwei
Myomen mit hoher HMGA1-Expression auch HMGA2 überexprimiert wurde.
31
3 ERGEBNISSE
II.
6p21 rearrangements in uterine leiomyomas targeting HMGA1.
Hashemi Nezhad M, Drieschner N, Helms S, Meyer A, Tadayyon M, Klemke M, Belge G,
Bartnitzke S, Burchardt K, Frantzen C, Schmidt EH, Bullerdiek J. 2010. Cancer Genetics and
Cytogenetics 203: 247-252.
Eigenanteil:
 Probenentnahme
aus
Uterus-Leiomyomen
und
dazugehörigen
Myometrien
zur
Kryokonservierung sowie Karyotypisierung
 Mitwirkung an der relativen Quantifizierung der HMGA2-Expression
32
3 ERGEBNISSE
Cancer Genetics and Cytogenetics 203 (2010) 247e252
6p21 rearrangements in uterine leiomyomas targeting HMGA1
Maliheh Hashemi Nezhada, Norbert Drieschnera, Sabrina Helmsa, Anke Meyera,
Mahboobeh Tadayyona, Markus Klemkea, Gazanfer Belgea, Sabine Bartnitzkea,
Käte Burchardtb, Christiane Frantzenc, Ernst Heinrich Schmidtd, Jörn Bullerdieka,e,*
a
Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Str. ZHG, D-28359 Bremen, Germany
Department of Pathology, General Hospital Bremen-Mitte, St.-Jürgen-Str. 1, D-28177 Bremen, Germany
c
Women’s Clinic, St. Joseph-Stift Hospital, Schwachhauser Heerstrasse 54, D-28209 Bremen, Germany
d
Department of Obstetrics and Gynecology, Evang. Diakonie Hospital, Gröpelinger Heerstrasse 406-408, D-28239 Bremen, Germany
e
Clinic for Small Animals, University of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, D-30137 Hanover, Germany
b
Received 7 January 2010; received in revised form 2 August 2010; accepted 5 August 2010
Abstract
To quantify the expression of HMGA1 mRNA in uterine leiomyomas, the expression of HMGA1 was
analyzed in a series including tumors with aberrations of chromosome 6 (n 5 7) and cytogenetically
normal tumors (n 5 8) as a control group by quantitative reverse transcriptaseepolymerase chain reaction. The average expression level in the 6p21 group was found to be 5.6 times higher than that in the
control group, and with one exception, all cases with 6p21 alteration revealed a high expression of
HMGA1 mRNA than cytogenetically normal tumors. Nevertheless, compared to fibroids with a normal
karyotype, the upregulation of the HMGA1 mRNA in these cases was much less strong than that of
HMGA2 mRNA in case of 12q14~15 aberrations identified in previous studies. Ó 2010 Elsevier
Inc. All rights reserved.
1. Introduction
Uterine leiomyomas (ULs) belong to the cytogenetically
best investigated human tumors. The cytogenetic analyses
have revealed several subtypes, with a frequent group
showing rearrangements of chromosomal region 12q14~15,
which apparently targets the gene encoding the highmobility group AT-hook 2 (HMGA2) [1,2]. Accordingly,
tumors of this type show significantly higher expression of
HMGA2 than fibroids with an apparently normal karyotype
[3]. HMGA2 is a protein abundantly expressed in stem cells
and casually linked to their self-renewal ability. A decrease of
HMGA2 has recently seen linked to the group of hematopoietic as well as neural stem cells [4]. Accordingly, it is
tempting to speculate that in terms of pathogenesis, smooth
muscle cells continuously expressing HMGA2 are maintaining a self-renewing program that occasionally also display
multilineage potential as witnessed by variants as, for
example, lipoleiomyomas or leiomyomas with cartilaginous
differentiation [5,6].
Of note, a smaller subgroup of ULs shows rearrangements of 6p21 (i.e., the locus where HMGA1, the other
gene encoding proteins of the HMGA type, has been
* Corresponding author. Tel.: þ49-421-2184239; fax: þ49-4212184239.
E-mail address: [email protected] (J. Bullerdiek).
mapped), suggesting that HMGA1 is the relevant target
gene in that subgroup of ULs [7]. In small series of ULs,
it was shown that this rearrangement leads to an overexpression of HMGA1 [8,9]. However, to our knowledge, no
study quantifying the expression of HMGA1 mRNA in
ULs of this subtype has been performed. Thus, we analyzed
the HMGA1 expression in seven ULs with aberrations of
chromosome 6 in comparison to myomas with normal
karyotype and to the matching myometrial tissues.
2. Materials and methods
2.1. Tissue samples and chromosome analysis
For RNA isolation, samples of ULs and myometrium
were snap frozen in liquid nitrogen immediately after
surgery and stored at 80 C. For cell culture, samples of
primary tumors were transferred to Hank’s solution with
antibiotics (200 IU/mL penicillin, 200 mg/mL streptomycin) after surgery. Cell culture and chromosome analyses were performed as described previously [3].
2.2. RNA isolation, reverse transcription, and quantitative
reverse transcriptaseepolymerase chain reaction
Total RNA was isolated from tissue samples with the
RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) including
0165-4608/$ - see front matter Ó 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cancergencyto.2010.08.005
33
3 ERGEBNISSE
248
M. Hashemi Nezhad et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 203 (2010) 247e252
DNase 1 treatment according to the manufacturer’s instructions, and quantitated by spectrophotometry. Reverse
transcription of 250 ng RNA was carried out with
M-MLV reverse transcriptase, RNaseOUT, and random
hexamers (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) according to
the manufacturer’s recommendations. Controls without
reverse transcriptase were included for each sample to
ensure the absence of DNA contaminations, which, as
a result of the high number of HMGA1-related retropseudogenes, could lead to false-positive results.
Quantitative real-time reverse transcriptaseepolymerase
chain reaction (RT-PCR) was performed on a real-time
Fig. 1. Karyotypes of two ULs with 6p21 rearrangements with different levels of HMGA1 expression and the histologic appearance of these ULs. (A) Representative G-banded karyotype of myoma 87: 46,XX,t(6;14)(p23;q24), tas(14;21)(pter;qter). (B) Representative G-banded karyotype of myoma 125A: 46,XX,
t(6;11)(p21;p15), chromosomes participating in the 6p21 rearrangements are indicated by arrows. Histologic appearance of myoma 87 (C) and myoma
125A (D).
34
3 ERGEBNISSE
M. Hashemi Nezhad et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 203 (2010) 247e252
PCR cycler (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)
with TaqMan Universal Mastermix. Of each cDNA, 2 mL
served as template in a final reaction volume of 20 mL.
Reaction condition were as follows: 2 minutes at 50 C,
10 minutes at 95 C, 50 cycles of 15 seconds at 95 C, and
1 minute at 60 C. For transcripts of HMGA1, a set of
primers and probe was designed (forward primer: 50 -GGA
CCA AAG GGA AGC AAA AA-30 , reverse primer: 50 TTC CTG GAG TTG TGG TGG TTT-30 , probe: 6-FAMAAG GGT GCT GCC AAG ACC CGG-MGB). 18S rRNA
was chosen as endogenous control and detected with the
following primer/probe set: forward primer: 50 -GGA TCC
ATT GGA GGG CAA AGT-30 , reverse primer: 50 -AAT
ATA CGC TAT TGG AGC TGG AAT TAC-30 , probe:
TGC CAG CAG CCG C [10]. All reactions were run in
triplicate.
2.3. Analysis of gene expression
The relative expression was calculated by the DCt
method, using 18S rRNA as endogenous control and
choosing the HMGA1 expression of a myometrial sample
(of normal group) as calibrator. For statistical analyses,
Student’s t-test was used. P-values of #0.05 were considered to be significant.
249
2.4. Fluorescence in situ hybridization
For determination of rearrangements involving 6p21 and
HMGA1, respectively, fluorescence in situ hybridization
(FISH) was performed on metaphase preparations of the
cases myoma 36, myoma 110, myoma 121B, myoma
125A, and myoma 166A. For FISH, two overlapping clones
CTD-2522J1 (GenBank accession number AQ280064 and
AQ280066) and CTD-2510D13 (GenBank accession
number AQ264849 and AQ264850), both located distal to
HMGA1 in 6p21, and two overlapping clones CTD-2524P4
(GenBank accession number AQ310763 and AQ277896)
and RP11-140K17 (GenBank accession number AQ385566
and AQ385568), both located proximal to HMGA1, in 6p21
were used. CTD clones were obtained from Invitrogen
(Darmstadt, Germany); RP11-140K17 was obtained from
imaGenes (Berlin, Germany). DNA was isolated with the
Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen, Hilden, Germany).
One microgram of isolated plasmid DNA was labeled by
nick translation (Abbott Molecular, Wiesbaden, Germany)
either with SpectrumOrange-dUTP (CTD-2522J1 and
CTD-2510D13) or SpectrumGreen-dUTP (CTD-2524P4
and RP11-140K17) (Abbott Molecular). Treatment of
metaphases and subsequent FISH experiments were carried
out as described previously [11]. Twenty microliters of the
Fig. 2. FISH analysis with HMGA1 break-apart probes in four UL with 6p21 rearrangement. (A) Myoma 125A, (B) myoma 166A, (C) myoma 121B,
(D) myoma 110 (for karyotypes see Table 1). The green fluorescent probes (CTD-2524P4 and RP11-140K17) located proximal to HMGA1, the red fluorescent probes (CTD-2522J1 and CTD-2510D13) located distal to HMGA1. Arrows point to normal chromosomes 6 and the rearranged chromosomes.
35
Abbreviations: e, unknown; ND, not done; NA, not available.
166A
14B
12B
24
27A
20
37D
29
36
113C
117D
121B
125A
110
Karyotype
46,XX,t(6;14)(p23;q24)[6]/46,XX,t(6;14)(p23;q24),tas(14;21)(p13;q22)[11]/
46,XX[2]/47,XX,þ12[1]
46,XX,t(6;11)(p21;p15)[7]/46,XX[14]
44,XX,der(1)t(1;?),der(3),der(5)t(5;?),6,der(11)?t(11;15)(q25;q22),del(15)
(q22),der(15)t(15;?),19[25]
46,XX,t(6;10)(p23;q23)[5]/46,XX[7]
46,XX,t(6;11)(p23;q21)[4]/46,XX[12]
42~46,X,X[6],1[19],t(1;8)(p22;q24)[11],der(1)[6],del(3)[3],add(6)[19],8
[6],der(8)[4],10[6],11[6],13[6],14[19],22[15],þmar1[18],þmar2
[18],þmar3[6],þmar[6][cp19]/46,XX[1]
46,XX,t(6;10)(p21;q22)[13]/46,XX[8]
46,XX[10]
46,XX[10]
46,XX[20]
46,XX[10]
46,XX[10]
46,XX[15]
46,XX[21]
46,XX[14]
Case no.
87
110.4
2.8
3.1
3.9
4.8
5.1
10.0
12.6
23.2
34.0
41.2
63.3
32.0
33.2
0.5
Relative
HMGA1
expression
1.29
3.8
2.4
0.5
2.8
0.6
12.9
1.1
10.7
11.4
26.0
0.8
2.7
1.6
0.6
Relative
HMGA2
expression
d
46
41
44
40
36
43
48
39
53
39
38
42
44
63
Patient
age (y)
3
d
d
1
5
d
2
3.5
6
3.5
4.5
3
2.5
4
d
Tumor
size (cm)
NA
8.5
1.0
7.6
NA
1.2
15.4
8.5
6.9
NA
NA
NA
2.3
NA
1.7
HMGA1
expression
matching
myometrium
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Single
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Single
Multiple
Single or
multiple
Split signals
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
No split signals
ND
ND
Split signals
Split signals
Split signals
ND
FISH analysis
for HMGA1
rearrangements
250
Table 1
Cytogenetic and molecular-cytogenetic data, results of relative HMGA1 and HMGA2 expression, and clinical data of all ULs. All tumors investigated were histologically typical leiomyomas.
3 ERGEBNISSE
M. Hashemi Nezhad et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 203 (2010) 247e252
36
3 ERGEBNISSE
M. Hashemi Nezhad et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 203 (2010) 247e252
break-apart probe was used per slide. Co-denaturation was
performed on a ThermoBrite (Abbott Molecular) for 7
minutes at 77 C, followed by overnight hybridization in
a humidified chamber at 37 C. Posthybridization was performed at 70 C for 2 minutes in 0.4 standard saline
citrate/0.3% NP-40. Metaphases were counterstained with
DAPI (40 ,6-diamidino-2-phenylindole; 0.75 mg/mL). Slides
were examined with an Axioskop 2 Plus fluorescence
microscope (Carl Zeiss, Göttingen, Germany). Images were
captured with a high-performance CCD camera (Visitron
Systems, Puchheim, Germany) and were edited with FISH
View (Applied Spectral Imaging, Migdal Ha’Emek, Israel).
Chromosomes were identified by inverted DAPI staining.
For each case, if possible, at least 10 metaphases were
analyzed, and 100 interphase nuclei were scored. Colocalized signals (green/red) indicate a nonrearranged
breakpoint region, whereas separated green and orange
signals indicate a rearrangement of the chromosomal region
6p21 and HMGA1, respectively.
3. Results
In this study, seven ULs with chromosomal rearrangements of 6p21 and eight karyotypically normal ULs as detected by chromosome analysis of GTG-banded metaphases
and FISH analysis were subjected to real-time RT-PCR
analysis. According to the histological examination, no sign
of leiomyosarcoma or atypical leiomyoma was detected in
any of the cases (Fig. 1).
For identification of 6p21 rearrangements involving
HMGA1 FISH on metaphase preparations and interphase
nuclei of five myomas (four cases with 6p rearrangement
or loss of one normal chromosome 6, respectively, and
one with apparently normal karyotype) was performed
with a HMGA1-specific break-apart probe. The results
revealed a signal pattern corresponding to a 6p21
251
rearrangement involving HMGA1 in all cases except for
that with a normal karyotype (numbers 110, 121B, 125A,
and 166A; Fig. 2AeD).
The expression of HMGA1 mRNA in seven ULs with
6p21 rearrangement was compared to that in eight samples
of UL with an apparently normal karyotype, which served
as controls (Table 1). For nine of these samples, matching
myometrium was available. Two myometrial samples belonged to fibroids of the 6p group, and the remaining
tissues belonged to fibroids of the normal group. The
average relative expression level in the 6p group was 45fold compared to its expression in a myometrium sample
of normal group as calibrator and differed significantly
from that in the control group (8.2-fold increase). As to
the expression in the individual tumors, HMGA1 expression, with one exception, clearly distinguishes between
both karyotypic groups (Fig. 3). In the exception, case
87, no unusually high percentage of metaphases with
normal karyotype could be detected, which may explain
the low expression of HMGA1 observed. Regarding
the expression of HMGA1 in UL and matching myometrium, there were no significant differences in the normal
group.
Next, we analyzed whether the expression of HMGA1
correlates with the expression of HMGA2. No evidence
for such a correlation was obtained (Fig. 3).
4. Discussion
ULs are by far the most common gynecological tumors,
occurring in at least 70e80% of all women in their reproductive years [12e14]. Cytogenetic subtypes have been
identified that may correlate with a different molecular
pathogenesis of the disease. So far, the best-investigated
group is characterized by 12q14~15 changes associated
with a strong overexpression of HMGA2 [3,15]. The
Fig. 3. Relative quantification of the HMGA1 and HMGA2 expression in normal and aberrant uterine leiomyomas (ULs).
37
3 ERGEBNISSE
252
M. Hashemi Nezhad et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 203 (2010) 247e252
overexpression of the stem-cell chromatin-associated
protein HMGA2 fits well with important characteristics of
UL growth. A much smaller subset of UL is characterized
by 6p21 rearrangements leading to the upregulation of
a closely related protein of the HMGA family (i.e.,
HMGA1). Likely activation of either of both genes and
the abundance of their proteins, respectively, leads to an
almost identical histopathologic phenotype of the tumors
commonly referred as leiomyomas.
However, what distinguishes tumors of both types is the
level of overexpression of HMGA genes compared to myometrium. Whereas the average upregulation of HMGA2 in
case of 12q14~15 aberrations is in range of 3,000-fold [3],
even when omitting the outlier represented by case 87, upregulation of HMGA1 due to 6p21 rearrangements is on
average 45-fold and raise up to a maximum of only 52.4-fold.
We had recently been able to show that most cytogenetically normal leiomyomas show subtle changes of the
HMGA2 level compared to the matching myometrium as
well [3]. Some recent studies have correlated HMGA2 with
stemness of mesenchymal cells and stem cell self-renewal
[4,16]. Although similar studies are lacking for HMGA1,
it is tempting to assume that the translocation products of
both genes can shift mesenchymal stem cells or progenitors
of smooth muscle cells and other mesenchyme-derived
cells back to a higher self-renewing potential. Nevertheless,
we were recently able to show that there is no correlation
between the expression of Ki-67 and HMGA2 [17]. Thus,
the exact mechanism by which increased levels of HMGA
proteins contribute to benign tumorigenesis still remains to
be elucidated. However, HMGA1 can be assumed to have
the ability to replace, at least in part, the function of
HMGA2 and vice versa. The proteins of both genes are
highly charged DNA-binding proteins that show abundant
expression in embryonic cells but greatly decreased expression in most adult cells. They share a high homology in
their DNA-interacting domains; despite their apparent
differences in interaction partners [18], this may explain
why knockout for neither gene alone is lethal.
Acknowledgments
This study was supported by grant from the Tönjes-VagtFoundation, Bremen. We acknowledge the valuable
technical support of Tanja Schwarz and Lisa Imbiel.
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38
3 ERGEBNISSE
3.1.3 Loss of let-7 binding sites resulting from truncations of the 3' untranslated
region of HMGA2 mRNA in uterine leiomyomas (Klemke et al., 2010)
In Uterus-Leiomyomen tritt beim Vorliegen einer chromosomalen Aberration der Region
12q14~15 auch dann eine erhöhte HMGA2-Expression auf, wenn der Bruchpunkt außerhalb
des Gens liegt (Tallini et al., 2000; Gross et al., 2003; Quade et al., 2003). Durch welche
Faktoren diese Überexpression ausgelöst wird, ist nicht im Detail bekannt. Ein gut untersuchter Mechanismus der HMGA2-Regulation ist aber die posttranskriptionelle Hemmung durch
miRNAs aus der let-7-Familie (Mayr et al., 2007; Lee und Dutta, 2007, Park et al., 2007;
Shell et al., 2007). Die 3’-UTR der HMGA2-mRNA weist acht let-7-Bindestellen auf (Lee und
Dutta, 2007), durch die die Translation bei Bindung eines mit spezifischen miRNAs beladenen RISC (RNA-induced silencing complex) inhibiert oder eine Degradation der mRNA
herbeigeführt werden kann (Rana, 2007; Bushati und Cohen, 2007). Bei Transkripten mit
trunkierter 3’-UTR können diese let-7-Bindestellen fehlen, womit ein Verlust dieses
Regulationsmechanismus einhergeht. Eine Funktion bei der Hemmung der HMGA2Expression wurde den miRNAs der let-7-Familie auch in Uterus-Leiomyomen zugeschrieben
(Peng et al., 2008).
Es war nicht bekannt, ob die HMGA2-Überexpression in Uterus-Leiomyomen mit Aberrationen der chromosomalen Region 12q14~15 in erster Linie durch eine transkriptionelle Aktivierung oder auch durch einen Ausfall posttranskriptioneller Regulationsmechanismen
ausgelöst werden kann. Käme es durch eine Trunkierung der Transkripte zum Verlust von
Teilen oder der gesamten 3’-UTR, würden die Transkripte damit auch ihre let-7-Bindestellen
verlieren. Somit würde die posttranskriptionelle Regulation durch die miRNAs der let-7Familie aufgrund nicht vorhandener Targetsequenzen fehlschlagen und zu einer Überexpression führen. Um diese Frage zu beantworten, wurde eine quantitative Real-Time RTPCR entwickelt, mit deren Hilfe trunkierte und vollständige HMGA2-Transkripte diskriminiert
werden können. Da intragenische Bruchpunkte häufig im dritten Intron lokalisiert sind
(Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et al., 1995c; Petit et al., 1996; Lemke et al.,
2001), wurde zur Detektion aller Transkriptvarianten ein kommerzieller TaqMan-Assay
verwendet, dessen Primer komplementär zum Übergang der Exons 1 und 2 sind. Auf diese
Weise können sowohl vollständige als auch trunkierte mRNAs detektiert werden. Zusätzlich
wurde eine Kombination aus Primern und einer TaqMan-Sonde verwendet, die einen
Abschnitt am distalen Ende der 3’-UTR detektiert, der nur bei vollständigen Transkripten mit
allen acht let-7-Bindestellen vorhanden ist. Getestet wurde dieses Verfahren zunächst an
einer auf ein Lipom zurückgehenden Zellinie, die bekanntermaßen eine Translokation
t(3;12)(q27~28;q14~15) aufweist und in der Fusionstranskripte bestehend aus den Exons 1
bis 3 von HMGA2 und den Exons 9 bis 11 von LPP, nicht jedoch die vollständige HMGA2-
39
3 ERGEBNISSE
mRNA nachgewiesen wurde (Lemke et al., 2001). Der in den Exons 1 und 2 lokalisierte
Assay ergab einen ∆CT-Wert von -0,581, wohingegen er unter Verwendung des am distalen
Ende der 3’-UTR gelegenen Assays bei +11,552 lag. Dieser gravierende Unterschied ist ein
deutliches Anzeichen für die differentielle Expression vollständiger und trunkierter Transkripte und zugleich der erfolgreiche Nachweis für die Eignung der gewählten Assays zur
Detektion der unterschiedlichen mRNAs.
Daher wurde dieser Ansatz sowohl an zwei Zellinien angewendet, die aus Uterus-Leiomyomen mit bekannten Translokationen unter Beteiligung der Region 12q14~15 hervorgegangen sind, als auch an 13 schockgefrorenen Gewebeproben von Leiomyomen, die
ebenfalls bekannte Aberrationen des HMGA2-Locus aufwiesen (Klemke et al., 2009).
Als Schwellwert für eine differentielle Expression wurde in Anlehnung an Bartuma et al.
(2009) ein zehnfacher Unterschied in der relativen Expression zwischen beiden Assays
gewählt. Bei der relativen Quantifizierung der Expression in beiden Myom-Zellinien mit
12q14~15-Veränderung wurde dieser Wert deutlich überschritten, was als weiterer Beleg für
die Anwendbarkeit des Tests anzusehen ist. Unter Verwendung der 13 Gewebeproben der
Tumoren wurde wie bereits zuvor beschrieben (Klemke et al., 2009) mit dem in den Exons 1
und 2 lokalisierten Assay eine starke HMGA2-Expression ermittelt. Ein ähnliches Ergebnis
wurde in acht Myomen unter Verwendung des am distalen Ende der 3’-UTR lokalisierten
Assays erzielt, woraus geschlossen werden kann, daß keine Trunkierung der HMGA2-mRNA
vorliegt. In fünf der untersuchten Myome wurde der festgelegte Grenzwert eines zehnfachen
Expressionsunterschiedes überschritten. Da in drei dieser fünf Myome mit differentieller
Expression zwar ein großer Anteil der Transkripte trunkiert zu sein scheint, aber auch
vollständige Transkripte in nicht unerheblichem Maße vorhanden sein müssen, liegt der
chromosomale Bruchpunkt vermutlich außerhalb von HMGA2. In den anderen beiden
Myomen wurden deutlichere Unterschiede festgestellt. Trotz einer hohen Konzentration der
mRNA, die die ersten HMGA2-Exons enthält, wurden mit dem 3’-UTR-Assay Werte ermittelt,
die mit dem Resultat der Lipom-Zellinie vergleichbar sind. Diese Beobachtung legt nahe, daß
in diesen beiden Myomen vornehmlich trunkierte Transkripte vorliegen, die nicht die vollständige 3’-UTR enthalten. Somit ist die Wahrscheinlichkeit hoch, daß die Bruchpunkte der
Translokationen in diesen Tumoren innerhalb von HMGA2 liegen und so eine Trunkierung
der mRNA verursachen, die deshalb nicht mehr der posttranskriptionellen Regulation durch
miRNAs der let-7-Familie unterliegt. Da von einem Verlust der Regulation durch let-7
aufgrund trunkierter HMGA2-Transkripte nur ein kleiner Anteil der Myome mit Aberrationen
der Region 12q14~15 betroffen ist, muß im Regelfall ein anderer Mechanismus der
Dysregulation vorliegen, der die starke HMGA2-Expression in der gesamten 12q14~15Gruppe verursacht.
40
3 ERGEBNISSE
III.
Loss of let-7 binding sites resulting from truncations of the
3' untranslated region of HMGA2 mRNA in uterine leiomyomas.
Klemke M, Meyer A, Hashemi Nezhad M, Belge G, Bartnitzke S, Bullerdiek J. 2010. Cancer
Genetics and Cytogenetics 196: 119-123.
Eigenanteil:
 Probenentnahme aus Uterus-Leiomyomen zur Kryokonservierung sowie Karyotypisierung
 Planung der qRT-PCR zur Erfassung differentieller Expression
 Durchführung der RNA-Isolierung sowie der relativen Quantifizierung vollständiger und
trunkierter HMGA2-Transkripte und deren Auswertung
 Verfassen des Manuskripts in Zusammenarbeit mit J. Bullerdiek
41
3 ERGEBNISSE
Cancer Genetics and Cytogenetics 196 (2010) 119e123
Loss of let-7 binding sites resulting from truncations of the
3’ untranslated region of HMGA2 mRNA in uterine leiomyomas
Markus Klemkea, Anke Meyera, Maliheh Hashemi Nezhada, Gazanfer Belgea,
Sabine Bartnitzkea, Jörn Bullerdieka,b,*
b
a
Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG, 28359 Bremen, Germany
Clinic for Small Animals and Research Cluster REBIRTH, University of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, 30137 Hannover, Germany
Received 28 May 2009; received in revised form 11 September 2009; accepted 27 September 2009
Abstract
A subset of uterine leiomyomas (UL) shows chromosomal rearrangements of the region
12q14~q15, leading to an overexpression of the high-mobility group protein A2 gene (HMGA2).
Recent studies identified microRNAs of the let-7 family as post-transcriptional regulators of
HMGA2. Intragenic chromosomal breakpoints might cause truncated HMGA2 transcripts lacking
part of the 3’ UTR. The corresponding loss of let-7 complementary sites (LCS) located in the 3’
UTR would therefore stabilize HMGA2 mRNA. The aim of this study was to check UL with rearrangements of the chromosomal region 12q14~15 for truncated HMGA2 transcripts by real-time
reverse-transcription polymerase chain reaction. In 8/13 leiomyomas with aberrations of chromosomal region 12q15, the results showed the presence of the complete 3’ UTR with all LCS. A differential expression with highly reduced 3’ untranslated region levels was found in 5/13 myomas. In
two of these, full-length transcripts were almost undetectable. Truncated transcripts were apparently
predominant in roughly one-third of UL with chromosomal rearrangements affecting the HMGA2
locus, where they lead to a higher stability of its transcripts and subsequently contribute to the overexpression of the protein. The assay used is also generally suited to detect submicroscopic alterations leading to truncated transcripts of HMGA2. Ó 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.
1. Introduction
A subgroup of uterine leiomyomas (UL) is characterized
by rearrangements of chromosomal segment 12q14~q15.
Roughly 15 years ago, a causal link among these aberrations, the deregulation of the gene encoding the highmobility group AT-hook 2 (HMGA2), and the pathogenesis
of UL has been shown [1e3]. HMGA2 was found to be targeted by breakpoints that are located either intragenically
or extragenically 3’ or 5’ of the gene. This type of abnormality is shared by a variety of other mainly benign tumors
of mesenchymal origin (e.g., lipomas or pulmonary chondroid hamartomas) [1,2,4,5]. Initially, the transcriptional
deregulation of HMGA2 by the rearrangements of controlling elements and/or fusion genes was thought to be the
relevant molecular alteration resulting from the chromosomal rearrangements. Because HMGA2 is abundantly
* Corresponding author. Tel.: þ49-421-2184239; fax: þ49-4212184239.
E-mail address: [email protected] (J. Bullerdiek).
expressed during prenatal development and because its
rearrangements often leave the open reading frame (ORF)
intact, it is tempting to assume that the increased protein
level alone is sufficient to cause or contribute to UL development [6]. Accordingly, the 12q14~q15 rearrangements
are always associated with a drastically increased level of
HMGA2 mRNA [7e9]. However, there have been recent
descriptions of another mechanism by which the chromosomal deviations can lead to a higher stability of the
HMGA2 transcript and, subsequently, a higher protein level
as well. The 3’ untranslated region (UTR) of HMGA2 was
shown to harbor multiple binding sites for microRNAs of
the let-7 family [10e14]. Truncations of the HMGA2 transcript resulting from intragenic breakpoints can thus reduce
the sensitivity of the transcript against microRNAs of the
let-7 family, finally leading to a higher protein level in
the corresponding cells. This also explains an earlier observation that constructs containing a truncated HMGA2 3’
UTR are more stable than those with a wild-type UTR
[15]. While this mechanism is experimentally well documented, it is unclear to which extent truncation of HMGA2
0165-4608/10/$ e see front matter Ó 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cancergencyto.2009.09.021
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3 ERGEBNISSE
120
M. Klemke et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 196 (2010) 119e123
mRNA coincides with the chromosomal rearrangements of
the gene locus and could amplify the effect of simple transcriptional up-regulation. To address this question, we have
quantified and compared the level of wild-type and
truncated HMGA2 mRNA from 13 primary UL and 2 cell
lines derived from UL with 12q14~q15 rearrangements
by real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
2. Materials and methods
2.1. Tumor samples and cell culture
Tissue samples of uterine leiomyomas were collected
immediately after surgery, snap-frozen in liquid nitrogen,
and stored at e80 C for RNA isolation. Samples used
for cell culturing were treated as described previously [9].
Immortalized cells from a lipoma with a t(3;12)
(q27~q28;q14~q15) accompanied by a partial genomic
deletion of the HMGA2 locus were used as a control
because the presence of fusion transcripts consisting of
exons 1e3 of HMGA2 and exons 9e11 of LPP was shown
for this case [16]. Cells were cultured in medium 199 with
Earle’s salts containing 1% fetal calf serum (FCS) for
24 hours and in FCS-free medium for an additional
24 hours to avoid the stimulating effects of FCS on the
expression of HMGA2 from the nonrearranged allele.
Before the isolation of total RNA, cells were lysed directly
in the cell culture flask.
2.2. Methods
Total RNA was isolated from tissue samples and cell
cultures using the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Germany). In addition to the on-column DNase I digestion,
a second digestion was performed in solution before reverse
transcription, since the PCR reaction with the primer set
binding in the 3’ UTR of HMGA2 is highly sensitive to
contaminations with genomic DNA.
Reverse transcription of 250 ng RNA was carried out
with Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) reverse
transcriptase and random hexamers (Invitrogen, Karlsruhe,
Germany) according to the manufacturer’s recommendations. Controls without enzyme (NoRT) were included for
each sample to ensure the absence of DNA contaminations,
which would introduce a bias to the results of the 3’
UTRespecific primer set.
Quantitative real-time RT-PCR was performed on a 7300
Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Darmstadt,
Germany) with TaqMan Universal PCR Mastermix. Of each
cDNA, 2 mL served as template in a final reaction volume of
20 mL. Reaction conditions were as follows: 2 minutes at
50 C, 10 minutes at 95 C, and 50 cycles of 15 seconds at
95 C and 1 minute at 60 C. A commercial HMGA2-specific
assay (assay ID Hs00171569_m1; Applied Biosystems) with
primers binding in exons 1 and 2 was used to detect transcripts irrespectively of a possible downstream truncation.
In addition, for full-length transcripts with an intact 3’
UTR, a set of primers and probe complementary to the distal
3’ end of the mRNA downstream of all let-7 complementary
sites (Fig. 1) was designed (forward primer: 5’-TGTATTAT
CACTGTCTGTTCTGCACAA-3’, reverse primer: 5’-TGG
AACTGTAACAAAGAGCAGGAA-3’, probe: 6FAM-CAG
CCTCTGTGATCCCCATGTGTTTTG-TAMRA). A differential expression of full-length and truncated HMGA2 transcripts has been reported recently for lipomas with t(3;12)
[17]. Herein, for evaluating the 3’ UTRespecific primer/
probe set and graphic display of the results, the same method
with slight modifications has been used. To evaluate the
primer and probe set designed for the distal 3’ UTR of
HMGA2, a cell line of a lipoma with t(3;12) was tested for
differential expression. In a previous study [16], we had
reported the presence of HMGA2-LPP fusion transcripts
consisting of exons 1e3 of HMGA2 and exons 9e11 of
LPP in this cell line.
HPRT1 was chosen as an endogenous control and was detected with the following primer/probe set: forward primer:
5’-GGCAGTATAATCCAAAGATGGTCAA-3’, reverse primer: 5’-GTCTGGCTTATATCCAACACTTCGT-3’, probe:
6FAM-CAAGCTTGCTGGTGAAAAGGACCCC-TAMRA.
All reactions were run in triplicate. Due to the low HMGA2
expression in normal tissues, the Ct values of the 3’ UTRe
specific PCR were much higher in myometrial tissues than
in myomas with aberrations affecting the chromosomal
region 12q15, making the use of normal tissue as a calibrator
unsuitable. Therefore, the myoma with the smallest difference in dCt values between both PCRs (case 4) was chosen
as a calibrator. Although the chromosomal region 12q13~q15
is rearranged in this case, the closely related dCt values
indicate the predominance of full-length transcripts. Thus,
an overestimation of the relative 3’ UTR expression resulting
from the alternative use of myometrial tissues was avoided.
The log10 of the relative expression was used for graphic
display (Fig. 2).
3. Results
In a total of 234 uterine leiomyomas from 124 patients,
chromosome analysis of GTG-banded metaphases revealed
rearrangements of the chromosomal region 12q14~15 in 12
cases (Table 1), which were subjected to real-time RT-PCR
analysis. One additional myoma (case 13) had an apparently normal karyotype, but fluorescence in situ
Fig. 1. Schematic representation of the full-length HMGA2 transcript with
the ORF consisting of five exons (gray boxes) and let-7 complementary
sites (LCS) in the 3’ UTR (black lines) according to TargetScan [20], PicTar
[21], and miRanda [22,23]. For a detailed list of the LCS, see ref. 11, Table
S2. The black bars below the transcript indicate the positions of the regions
amplified with two different primer sets.
43
3 ERGEBNISSE
M. Klemke et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 196 (2010) 119e123
121
Fig. 2. Relative expression of HMGA2 in uterine leiomyomas with chromosomal aberrations affecting region 12q14~15 and a lipoma cell line with known
absence of full-length transcripts as a control. The log10 of the relative expression levels is shown (RQ: relative quantification). qRT-PCR was performed with
primers located in exons 1 and 2 of HMGA2 (light gray bars) and an additional set of primers located in the distal 3’ UTR of the gene (dark gray bars). Case 4
was used as calibrator. Asterisks indicate cell lines of myomas with t(12;14).
hybridization (FISH) revealed split signals for HMGA2,
indicating a hidden rearrangement of the gene locus.
With the criteria defined by Bartuma et al. [17] (i.e., an
expression level that is 10 times higher for exons 1 and 2
than for the distal 3’ UTR), a differential expression was
observed in two myoma cell lines (cases 1 and 2), as well
as in 5/13 myomas (cases 8, 10, 13, 14, and 15; Fig. 2).
In contrast, no differential expression was detected in the
remaining eight myomas.
In the lipoma cell line, which was used as control, the relative expression of HMGA2 exons 1e2 was only slightly
lower than in the myoma used as the calibrator, but the
expression of the distal 3’ UTR is clearly reduced
(log10 5 3,36), thus indicating the usefulness of the test
procedure used.
4. Discussion
We recently reported an overexpression of HMGA2 in
uterine leiomyomas with a normal 46,XX karyotype in
comparison to matching myometrial tissues [9]. Moreover,
our results confirmed the previous finding, that HMGA2 is
strongly overexpressed in leiomyomas with chromosomal
aberrations, affecting the locus of the gene [7e9]. However,
the molecular mechanisms causing an overexpression,
especially in those cases with cytogenetically detectable
translocations with breakpoints in or close to chromosomal
region 12q14~15, remain to be identified. Several studies
[10e13] have reported the post-transcriptional regulation
of HMGA2 expression by miRNAs of the let-7 family.
Reduced expression of let-7 family members in uterine
Table 1
Karyotypes of 13 leiomyomas and two cell lines (nos. 1 and 2) originating from myomas with chromosomal translocations affecting region 12q13~q15
Case no.
Karyotype
Age (yr)
Tumor diameter (cm)
1
2
3
4
5
6
7
8
9a
10
46,XX,del(7)(q22q32),t(12;14)(q15;q24)[29]
46,X,t(X;12)(q22;q15)[8]
46,XX,t(12;15;14)(q15;q26;q24)[20]/46,XX[1]
46,XX,t(3;5;12)(q23~25;p13~15;q13~15)[11]/45,XX,idem,e22[10]
46,XX,der(7)del(7)(p)del(7)(q),add(8)(q2?),add(10)(q2?),t(12;14)(q15;q24)[15]
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[9]/46,XX[3]
46,XX,r(1),t(1;12;14)(p36.3;q14;q24)[7]
46,XX,t(2;12)(q33;q13)[17]
n. a.
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[12]/
45,XX,der(1),?t(1;2),e2,add(7)(?q36),t(12;14)(q15;q24)[2]/
46,XX,del(4)(q31~q32),der(10),?t(10,14)(q24;q32),t(12;14)(q15;q24)[9]
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[5]/46,XX[9]
45,XX,t(12;14)(q15;q24),der(14)t(12;14)(q15;q24),e22[8]
46,XX
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[13]/46,XX,der(1)r(1;2),t(12;14)(q15;q24)[4]
46,XX,ins(14;12)[8]/46,idem,r(1)[4]
e
e
49
42
40
47
40
49
46
47
e
e
1.5
5.0
8.0
5.0
6.0
10.0
3.0
4.0
37
32
48
44
73
7.0
10.0
1.5
6.0
2.5
11
12
13a
14
15
Abbreviation: n.a., not available
a
Case in which FISH revealed split signals for the HMGA2 locus, indicating a rearrangement of the gene.
44
3 ERGEBNISSE
122
M. Klemke et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 196 (2010) 119e123
leiomyomas has been reported as well [14]. In addition to
a downregulation of miRNAs responsible for the repression
of HMGA2 expression, losses of the let-7 complementary
sites (LCS) within the 3’ UTR of HMGA2 may also lead
to a deficiency in let-7emediated regulation [10]. Herein,
we have investigated 13 leiomyomas as well as two cell
lines of myomas with chromosomal aberrations affecting
the HMGA2 locus using a real-time RT-PCR approach to
detect the truncation of HMGA2 transcripts.
In 8/13 myomas, no differential expression between
HMGA2 exons 1 and 2 and the 3’ UTR was observed (Fig. 2).
This is in good agreement with previous studies reporting
breakpoints upstream of the HMGA2 gene in leiomyomas
with rearrangements of chromosomal region 12q14~15 [18].
A lipoma with a t(3;12)(q27~q28;q14~q15) and a known
disruption of the HMGA2 gene was used as a control. The
observed expression of the 3’ UTR is extremely low in this
sample, indicating the near absence of full-length transcripts. A complete absence should lead to negative PCR
results, however, the negligible expression level is likely
to be caused by a minor transcription of the unaltered allele.
Both cell lines as well as 5/13 myomas revealed a differential expression of exons 1e2 and the 3’ UTR. In three of
these tumors (cases 10, 14, and 15), however, a noteworthy
amount of transcripts is truncated, but since full-length
transcripts do not seem to be absent, the chromosomal
breakpoint is unlikely to be located within the gene.
Two myomas (nos. 8 and 13) revealed expression levels
of the 3’ UTR, which are comparably low as the 3’ UTR
expression in the control, indicating the almost complete
absence of full-length transcripts. Of note, the karyotype
of one of these cases (no. 13) is apparently normal, but
FISH performed on interphase nuclei indicated a rearrangement of HMGA2 [9].
Overall, the test seems to be well suited to detect truncated HMGA2 transcripts caused by cytogenetically visible
genomic rearrangements as well as by those undetectable
by conventional cytogenetics.
In conclusion, we were able to identify five leiomyomas
with a strongly reduced expression of the full-length
mRNA, which is the prevailing transcript in the remaining
eight leiomyomas, also showing chromosomal rearrangements affecting 12q14~q15. Thus, a loss of let-7 complementary sites does not account for the overexpression of
HMGA2 in the majority of UL, but seems to amplify the
effects of a transcriptional de-regulation of HMGA2 in
a rather small subset of these tumors. Of note, phenotypic
effects of a truncation of the HMGA2 3’ UTR have also
been described in a boy with a pericentric inversion of
chromosome 12 that truncated HMGA2 [19].
Acknowledgments
This study was supported by a grant from the TönjesVagt-Foundation.
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46
3 ERGEBNISSE
3.2 Identifizierung einer intronischen miRNA durch Sequenzvergleiche
MicroRNAs (abgekürzt: miRNA oder miR) sind einzelsträngige Ribonukleinsäuren mit einer
Länge von 20 - 22 Nukleotiden. Zuerst entdeckt wurde die zu lin-14 komplementäre miRNA
lin-4 im Nematoden Caenorhabditis elegans (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993). Die
miR-kodierenden Gene können sowohl in intergenischen Bereichen als auch intragenisch
lokalisiert sein (Lin et al., 2006), in der Klasse der Mammalia werden die meisten miRNAs
jedoch intronisch kodiert (Kim und Kim, 2007). Sie werden mit Ausnahme von in repetitiven
Elementen wie Alu-Repeats lokalisierten miRNA-Genen (Borchert et al., 2006) von der RNAPolymerase II transkribiert (Bracht et al., 2004; Cai et al., 2004; Lee et al., 2004). Die
primären Transkripte, die als Pri-miRNA bezeichnet werden, besitzen daher eine 5’-Cap und
sind polyadenyliert (Cai et al., 2004). Sie bilden eine charakteristische Struktur in Form einer
einzelsträngigen Schleife („loop“) und eines doppelsträngigen Bereichs („stem“) aus. Im
Zellkern schneidet ein Enzymkomplex, zu dem die Typ III-RNase Drosha sowie das
doppelsträngige RNA bindende Enzym DGCR8/Pasha gehören, die Pri-miRNA an zwei
Stellen, so daß eine Haarnadelstruktur, die sogenannte Prä- oder Präkursor-miRNA, entsteht. Sie ist etwa 70 Nukleotide lang und wird mit Hilfe von Exportin-5 aus dem Nukleus in
das Zytoplasma transportiert. Dort wird die Prä-miRNA von Dicer, einer weiteren RNase III,
unter Beteiligung des RNA-Bindeproteins TRBP/Loquacious erneut gespalten, so daß ein
zunächst noch doppelsträngiges RNA-Molekül mit einer Länge von 20 bis 22 Basenpaaren
(miRNA:miRNA*-Duplex) entsteht. Nach Rekrutierung des Argonaut-2 Proteins (Ago2) bildet
sich ein als RISC (RNA-induced silencing complex) bezeichneter Ribonukleoproteinkomplex
aus. Aus dem miRNA:miRNA*-Duplex bildet vornehmlich das Molekül mit der weniger stabilen Basenpaarung an seinem 5’-Ende die reife miRNA. Der als miRNA* bezeichnete Gegenstrang wird in der Regel degradiert (Schwarz et al., 2003; Du und Zamore, 2005). Mit Hilfe
der im RISC gebundenen miRNA kann eine spezifische Bindung an die Ziel-mRNA erfolgen,
woraufhin diese entweder degradiert oder ihre Translation inhibiert wird (Rana, 2007; Bushati
und Cohen, 2007).
47
3 ERGEBNISSE
3.2.1 A microRNA encoded in a highly conserved part of the mammalian HMGA2 gene
(von Ahsen et al., 2008)
Die typische Sekundärstruktur der primären miRNA-Transkripte erlaubt die Vorhersage
potentieller miRNA-Gene auf der Grundlage von Sequenzinformationen. Experimente mit
murinen miRNAs wiesen eine als mmu-miR-763 bezeichnete MicroRNA nach, die durch ein
Gen im dritten Intron des murinen Hmga2 kodiert wird (Berezikov et al., 2006). In der
folgenden Veröffentlichung (von Ahsen et al., 2008) wurde ein 1,2 kb langer Abschnitt aus
dem dritten humanen HMGA2-Intron mit der entsprechenden Sequenz acht anderer
Mammalia verglichen. Dieser Sequenzvergleich ergab, daß der darin enthaltene, die murine
miR-763 kodierende Abschnitt in den herangezogenen Sequenzen hochkonserviert ist,
wohingegen andere intronische Bereiche variabel sind. In den dem murinen Gen homologen
Sequenzen wurden Sequenzidentitäten zwischen 92 und 100 % festgestellt. Aufgrund der
geringen Sequenzunterschiede in diesem 120 bp langen Bereich könnten seine Transkripte
in allen untersuchten Spezies die für primäre miRNAs typische Stem-Loop-Struktur
ausbilden. Zwischen der humanen und der murinen Sequenz liegt die Homologie bei 95 %,
und die Sequenz der reifen, murinen miR unterscheidet sich in nur einer von 22 Positionen
von der humanen Sequenz.
Da die murine miR-763 experimentell nachgewiesen wurde und die Sequenz des murinen
miRNA-Gens zu 95 % (114 von 120 Basenpaaren) mit der humanen Sequenz übereinstimmt, wäre eine Prozessierung des entsprechenden Bereichs des dritten HMGA2-Introns
zu einer reifen miRNA auch beim Menschen denkbar. Die humane miR-763 könnte vor allem
in solchen Geweben entstehen, die eine starke Expression des HMGA2-Gens aufweisen, da
Vorläuferstrukturen in Form von Präkursor-mRNAs (Prä-mRNA) vorhanden sind, die wie
intergenische miRNAs von der RNA-Polymerase II transkribiert wurden. Aus ihnen werden
die Introns und damit auch der die Stem-Loop-Sequenz enthaltende Abschnitt herausgespleißt. Bislang existieren jedoch keine über die Sequenzhomologie hinausgehenden Hinweise auf eine humane miR-763, da im Gegensatz zur murinen miR-763 kein experimenteller Nachweis vorliegt. Daher muß die humane miR-763 derzeit noch als hypothetisch
angesehen werden.
48
3 ERGEBNISSE
IV.
A microRNA encoded in a highly conserved part
of the mammalian HMGA2 gene.
Von Ahsen I, Nimzyk R, Klemke M, Bullerdiek J. 2008. Cancer Genetics and Cytogenetics
187: 43-44.
Eigenanteil:
 Diskussion des Manuskripts mit I. von Ahsen und R. Nimzyk
 Versuche zum experimentellen Nachweis der miRNA mittels RT-PCR
49
3 ERGEBNISSE
Cancer Genetics and Cytogenetics 187 (2008) 43e44
Short communication
A microRNA encoded in a highly conserved part
of the mammalian HMGA2 gene
Inga von Ahsena,b, Rolf Nimzykb, Markus Klemkeb, Jörn Bullerdieka,b,*
a
Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine and Research Cluster of Excellence ‘‘REBIRTH,’’
Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hannover, Germany
b
Center of Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG, D-28359 Bremen, Germany
Received 14 July 2008; accepted 16 July 2008
Abstract
The high mobility group protein HMGA2 plays an important role as a chromatin component of
stem cells and as a protein causally related to the development of a variety of benign tumors
(e.g., uterine leiomyomas, lipomas, and pleomorphic adenomas of the salivary glands). Herein,
the existence of a highly conserved region within intron 3 of HMGA2 encoding a microRNA is
described. The co-expression with HMGA2 suggests that as an intronic microRNA, this microRNA
may cooperate with HMGA2 in its physiological and/or aberrant functions. Ó 2008 Elsevier Inc.
All rights reserved.
The high mobility group A2 (HMGA2) protein is an
architectural transcription factor that can bind to DNA by
any of the three separate DNA-binding domains called AT
hooks, thus regulating a huge number of target genes [1].
HMGA2 is abundantly expressed during embryonic
development and in embryonic stem cells [2e5]. Also, its
aberrant expression has been linked causally to the growth
and development of a variety of benign tumors (e.g., lipomas, leiomyomas, pleomorphic adenomas of the salivary
glands, and pulmonary chondroid hamartomas [6e8],
whereas its overexpression in malignant tumors has been
correlated with a worse prognosis and may be associated
with cancer cells showing a stem cellelike behavior [9].
From the growth patterns of some of the entities of benign
tumors displaying a marked intratumoral histologic
heterogeneity (e.g., cartilage, smooth muscle, and adipose
tissue), despite their monoclonal origin, we have concluded
that this protein allows the cells to regain stem cell properties [10], thus mediating their ability to follow various
routes of mesenchymal differentiation and even stimulate
the outgrowth of epithelial components not derived from
the tumor cell population itself [11,12]. Comparative
genome analysis by sequence alignment shows that the
HMGA2 open reading frame is highly conserved among
* Corresponding author. Tel.: þ49-421-218-4239; fax: þ49-421-2184239.
E-mail address: [email protected] (J. Bullerdiek).
mammals, and even a comparison to other vertebrates
(e.g., chicken) reveals a high degree of homology [13].
With regard to its noncoding regions (i.e., untranslated regions and intronic sequences), the homology is much lower.
Despite this generally lower homology, intron 3 of HMGA2
harbors a short sequence that turns out to be considerably
conserved. Intron 3 of HMGA2 has a size of roughly 112
kilobases [14] and represents one of the most frequent targets of structural chromosomal abnormalities in human
tumors [7]. A short sequence within that intron shows a high
homology to an intronic sequence of the murine HMGA2
(i.e., a locus encoding microRNA mmu-miR-763 (http://
www.microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/mirna_entry.
pl?acc5MI0004516). Moreover, clearly related conserved
sequences can be found as HMGA2 intronic microRNA in
the genome of other mammalian species [e.g., cow, dog,
rabbit, elephant, and rhesus macaque (Fig. 1)]. As a rule,
intronic microRNA are transcribed by polymerase II being
part of a transcription unit with their host genes [15]. Accordingly, the primary transcript of HMGA2 not only gives
rise to an mRNA encoding a protein highly relevant in embryonic and tumor development, but in addition, a microRNA seems to be processed from it. However, the high
evolutionary conservation of a small part of intron 3 of
HMGA2 for a long period of at least 85e100 million years
of mammalian development supports an important role for
this microRNA and the significance of its coregulation with
HMGA2 itself.
0165-4608/08/$ e see front matter Ó 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cancergencyto.2008.07.009
50
3 ERGEBNISSE
44
I. von Ahsen et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 187 (2008) 43e44
Figure 1. Comparative genome analysis of 1200 base pairs (bp) of intron3 of HMGA2 by sequence alignment (matches in green, mismatches in red) between
human (Homo sapiens; 100%) used as template, chimpanzee (Pan troglodytes; 99%), rhesus macaque (Macaca mulatta; 100%), elephant (Elephas maximus;
92%), rabbit (Oryctolagus cuniculus; 96%), mouse (Mus musculus; 95%), rat (Rattus norvegicus; 96%), dog (Canis familiaris; 97%), and cow (Bos Taurus;
98%). This part of the intron encodes microRNA mmu-miR-763 (gray- and violet-colored); the homology of sequences (120 bp) is indicated in parentheses.
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the majority of pulmonary chondroid hamartomas: a survey of 30
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Expression of the HMGA2-LPP fusion transcript in only one of 61 karyotypically normal pulmonary chondroid hamartomas suggests the primary
nature of chromosomal aberrations in those tumors with chromosomal
rearrangements. Cancer Genet Cytogenet 2002;138:160e4.
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51
3 ERGEBNISSE
3.3 Molekulargenetische Marker zur Abgrenzung von Schilddrüsenkarzinomen
follikulären Ursprungs
Tumoren der Schilddrüse können insbesondere dann eine diagnostische Herausforderung
darstellen, wenn es sich um follikuläre Neoplasien handelt, da hier histologisch als einzige
Unterscheidungskriterien zwischen Adenomen und follikulären Karzinomen Kapseldurchbrüche oder Gefäßeinbrüche herangezogen werden können (Schmid et al, 2003; Sheu et al.,
2003; DeLellis et al., 2004). Zytologische Präparate aus präoperativen Feinnadelpunktionen
ermöglichen diese Abgrenzung nicht, da die Zellmorphologie follikulärer Adenome und
Karzinome in der Regel identisch ist (Greaves et al., 2000; Baloch et al., 2002; Smith et al.,
2005; Takano, 2011). Somit kann eine gesicherte Diagnosestellung in der Regel erst
postoperativ nach histologischer Aufarbeitung des Tumors erfolgen. Nur in einem geringen
Prozentsatz der präoperativ als malignitätsverdächtig eingestuften Tumoren bestätigt sich
dabei allerdings der Verdacht auf ein Karzinom (Goellner et al., 1987; Chiappetta et al.,
1998; Greaves et al., 2000; Baloch et al., 2002). Aus diesen Gründen besteht ein hoher
Bedarf an einem molekularen Marker, der die Beurteilung der Dignität unterstützen kann
(Schmid und Farid, 2006).
Zwar existierten bereits Studien zur Expression der HMG-Gene in Schilddrüsentumoren,
diese konzentrierten sich jedoch auf HMGA1 (Chiappetta et al., 1995; Chiappetta et al.,
1998), dessen Expression als Voraussetzung für die maligne Transformation von Thyreozyten angesehen wurde (Berlingieri et al., 1995). Später wurde HMGA1 sogar als spezifischer Marker für follikuläre Karzinome vorgeschlagen (Czyz et al., 2004). Obwohl es
andererseits Hinweise auf eine wichtige Funktion von HMGA2 bei der malignen Transformation von Thyreozyten gab (Berlingieri et al., 1995; Vallone et al., 1995), wurde es im Zusammenhang mit Karzinomen der Schilddrüse vernachlässigt. Ein Grund dafür kann darin
gesehen werden, daß man aufgrund der an Zellinien gemachten Beobachtungen bereits früh
zu dem Schluß gekommen war, HMGA2 werde nicht ausnahmslos in Schilddrüsenkarzinomen exprimiert (Chiappetta et al., 1995). Sieben Schilddrüsenkarzinom-Zellinien waren
mittels Northern und Western Blot untersucht worden. Während in allen Zellinien eine
Expression von HMGA1 festgestellt wurde, waren zwei Zellinien negativ im Hinblick auf die
HMGA2-Expression, darunter auch die einzige aus einem follikulären Karzinom hervorgegangene Zellinie WRO (Chiappetta et al., 1995). Insbesondere die Feststellung, daß diese
Zellinie HMGA2 nicht exprimiert, erscheint zweifelhaft und kann dem Umstand geschuldet
sein, daß die Sensitivität der zum Nachweis der Expression durchgeführten Northern und
Western Blots verhältnismäßig gering war.
Im nachfolgend beschriebenen Abschnitt wurde deshalb die HMGA2-Expression in einer
umfangreichen Serie von Gewebeproben aus benignen und malignen Schilddrüsentumoren
52
3 ERGEBNISSE
mit Hilfe einer Real-Time RT-PCR untersucht, die sich durch eine hohe Sensitivität auszeichnet. Darüber hinaus wurden ausgewählte Fälle auch immunhistochemisch mit einem gegen
das HMGA2-Protein gerichteten Antikörper gefärbt. In zwei weiteren Veröffentlichungen
werden Ergebnisse aus Untersuchungen zur Fusion der Gene PAX8 und PPARG dargestellt,
die ebenfalls als ein für follikuläre Karzinome spezifischer Marker vorgeschlagen wurde,
dessen Sensitivität inzwischen aber ebenso fraglich ist wie seine Spezifität.
53
3 ERGEBNISSE
3.3.1 Upregulation of HMGA2 in thyroid carcinomas: a novel molecular marker to
distinguish between benign and malignant follicular neoplasias (Belge et al., 2008)
Die HMGA2-Expression von insgesamt 61 formalinfixierten Gewebeproben aus Schilddrüsentumoren wurde mit einer qRT-PCR quantifiziert und mit der in Normalgeweben festgestellten Expression verglichen. In 19 Fällen handelte es sich um Tumoren, die histologisch
als Adenom klassifiziert worden waren. Als weitere nicht-maligne Läsion wurden zwei Fälle
von Thyroiditis untersucht. Aus der Gruppe der malignen Tumoren wurden Gewebeproben
aus 28 papillären, neun follikulären und drei anaplastischen Karzinomen in die Untersuchung
einbezogen. Ausgewählte Fälle wurden zusätzlich immunhistochemisch mit einem gegen
das HMGA2-Protein gerichteten Antikörper gefärbt.
Wie die Quantifizierung der HMGA2-Expression ergab, war in benignen Läsionen, d. h. in
Adenomen und beiden Fällen von Thyroiditis, keine oder eine im Vergleich zu tumorfreiem
Schilddrüsengewebe nur moderat erhöhte Expression feststellbar. Nur fünf der 21 benignen
Läsionen wiesen leicht erhöhte Werte auf, die nur von einigen wenigen Karzinomen
unterschritten wurden.
In der Mehrheit der Karzinome wurden Werte gemessen, die die Expression der nichtmalignen Läsionen überstieg. Keine gesteigerte HMGA2-Expression wurde in nur je einem
papillären und follikulären Karzinom festgestellt. Abgesehen von diesen Ausnahmen wurde
in den untersuchten Karzinomen mehrheitlich eine verglichen mit tumorfreiem Schilddrüsengewebe mindestens zehnfach, zum Teil auch mehr als einhundertfach höhere Expression
ermittelt. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, daß HMGA2 einen wichtigen Hinweis auf die
Dignität von Schilddrüsentumoren geben kann. Die Ergebnisse der immunhistochemischen
Färbung bestätigten die mittels quantitativer Real-Time RT-PCR gewonnenen Erkenntnisse.
Sowohl in tumorfreiem Schilddrüsengewebe als auch in einem follikulären Adenom wurde
keine positive Reaktion mit dem HMGA2-spezifischen Antikörper beobachtet. Im Gegensatz
dazu zeigte sich in den untersuchten Karzinomen eine starke nukleäre Anfärbung. Besonders eindrucksvoll gelang dies in einem insulär differenzierten Bereich eines follikulären
Karzinoms. Während die Zellkerne von transformierten Thyreozyten sehr stark angefärbt
wurden, zeigten die Kerne in dazwischengelagertem Bindegewebe eine negative Färbereaktion. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, daß Karzinome im Gegensatz zu Adenomen verstärkt HMGA2 exprimieren und daß die Quantifizierung der HMGA2-Expression
somit ein hilfreiches Werkzeug für die Dignitätsbewertung insbesondere follikulärer Neoplasien der Schilddrüse darstellen könnte.
54
3 ERGEBNISSE
V.
Upregulation of HMGA2 in thyroid carcinomas:
a novel molecular marker to distinguish between
benign and malignant follicular neoplasias.
Belge G, Meyer A, Klemke M, Burchardt K, Stern C, Wosniok W, Loeschke S, Bullerdiek J.
2008. Genes, Chromosomes and Cancer 47: 56-63.
Eigenanteil:
 Durchführung der RNA-Isolierungen aus FFPE-Gewebeproben
 Durchführung und Auswertung der quantitativen Real-Time RT-PCR gemeinsam mit
A. Meyer
 Verfassen des Manuskripts in Zusammenarbeit mit A. Meyer und J. Bullerdiek
Anmerkung: In diese Publikation flossen zum Teil Ergebnisse ein, die bereits im Rahmen
meiner Diplomarbeit erlangt wurden („Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens in
malignen Tumoren mittels Real-Time PCR“, Universität Bremen, 2006).
55
3 ERGEBNISSE
GENES, CHROMOSOMES & CANCER 47:56–63 (2008)
Upregulation of HMGA2 in Thyroid Carcinomas:
A Novel Molecular Marker to Distinguish Between
Benign and Malignant Follicular Neoplasias
Gazanfer Belge,1* Anke Meyer,1* Markus Klemke,1* Käte Burchardt,2 Corinna Stern,3 Werner Wosniok,4
Siegfried Loeschke,1 and Jörn Bullerdiek1†
1
Center for Human Genetics,University of Bremen,Bremen,Germany
Department of Pathology,General Hospital Bremen-Mitte,Bremen,Germany
3
Department of Pathology,General Hospital Altona,Hamburg,Germany
4
Institute of Statistics,University of Bremen,Bremen,Germany
2
The identification of molecular markers allowing to differentiate between benign and malignant thyroid tumors remains a diagnostic challenge. Herein, we have used the expression of the high mobility group protein gene HMGA2 and its protein, respectively, as a possible marker detecting malignant growth of thyroid tumors. HMGA2 belongs to the high mobility group proteins,
i.e. small, highly charged DNA-binding proteins. While HMGA2 is highly expressed in most embryonic tissues, its expression in
adult tissues is very low. However, a reactivation of HMGA2 expression has been described for various malignant tumors and
often correlates with the aggressiveness of the tumors. The aim of this study was to investigate whether the HMGA2 expression can be used to detect malignant thyroid tumors. RNA from 64 formalin-fixed paraffin-embedded thyroid tissues including
normal tissue (n 5 3), thyroiditis (n 5 2), and follicular adenomas (n 5 19) as well as follicular (n 5 9), papillary (n 5 28), and
anaplastic (n 5 3) carcinomas was reverse transcribed. Finally, real-time quantitative RT-PCR was performed. Expression differences of up to 400-fold were detected between benign and malignant thyroid tumors. Based on HMGA2 expression alone, it
was possible to distinguish between benign and malignant thyroid tissues with a sensitivity of 95.9% and a specificity of 93.9%.
There was a highly significant (P < 0.001) difference with histology of the tumors being the gold standard between the benign
lesions and malignant tumors. Our results show that even as a stand-alone marker HMGA2 expression has a high potential to
C 2007 Wiley-Liss, Inc.
improve diagnoses of follicular neoplasms of the thyroid. V
INTRODUCTION
Thyroid nodules are frequently found in both
sexes. While by palpation it is detected in 4–8% of
adults, ultrasound examination reveals a much
higher frequency of about 40% corresponding to
roughly 50% of thyroid nodules found at autopsy.
As to those nodules selected for fine needle aspiration (FNA), the average cancer rate is 10–13%
and does not increase with the number of nodules
per patient (Frates et al., 2005). In patients with
multiple nodules the cancer is located in the dominant or larger nodule in only two thirds of the cases
(Frates et al., 2005). FNA is now the widely
accepted method for screening of suspect lesions
for cancer. However, the histological diagnosis of
follicular-patterned thyroid lesions is often difficult
and cytological samples obtained by FNA are even
more difficult to diagnose (Greaves et al., 2000;
Baloch et al., 2002; Smith et al., 2005). These difficulties are reflected by papers entitled ‘‘The demise of follicular carcinoma of the thyroid (LiVolsi
and Asa, 1994)’’, ‘‘Can we agree to disagree’’
C
V
(LiVolsi, 2003), or ‘‘Follicular-patterned lesions of
the thyroid: the bane of the pathologist’’ (Baloch
and LiVolsi, 2002). A particular problem in clinical
practice is the cytological differentiation between
follicular thyroid carcinoma (FTC) and benign follicular thyroid adenoma (FTA), since the cell morphology is often nearly identical. Thus, FNA followed by cytological examination often will not
lead to a precise diagnosis of these lesions. To find
diagnostic markers that would enable a better classification of thyroid tumors, we quantified HMGA2
gene expression in benign as well as malignant thyroid lesions and normal thyroid tissue samples by
quantitative real-time reverse-transcription-PCR
(qRT-PCR). The high mobility group A (HMGA)
*These authors contributed equally to this paper.
†
Correspondence to: J. Bullerdiek, Center for Human Genetics,
University of Bremen, Leobener Str. ZHG, D-28359 Bremen,
Germany. E-mail: [email protected]
Received 3 May 2007; Accepted 19 September 2007
DOI 10.1002/gcc.20505
Published online 17 October 2007 in
Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com).
2007 Wiley-Liss, Inc.
56
3 ERGEBNISSE
UPREGULATION OF HMGA2 IN THYROID CARCINOMAS
proteins are small chromatin associated nonhistone
proteins that act as architectural transcription
factors (Wolffe, 1994; Bustin and Reeves, 1996).
HMGA proteins have three DNA-binding domains
designated as AT-hooks, enabling their binding
to the minor groove of AT-rich DNA, and an acidic
C-tail responsible for protein–protein interactions
(Reeves and Nissen, 1990; Chau et al., 1995; Harrer et al., 2004; Reeves and Beckerbauer, 2005).
The interaction of HMGA with DNA leads to
changes in chromatin structure involving HMGA
proteins in the regulation of the expression of a
high number of target genes. The oncogenic
potential of HMGA2 was first described by Ashar
et al. (1995) and Schoenmakers et al. (1995). The
HMGA2 expression level is very high during embryonic development whereas it is almost undetectable in differentiated cells and tissues (Chiappetta et al., 1996; Rogalla et al., 1996; Hirning-Folz
et al., 1998). A strong association between the overexpression of HMGA2 and an adverse prognosis has
been demonstrated for carcinomas of the breast
(Rogalla et al., 1997), lung (Sarhadi et al., 2006),
and squamous cell carcinoma of the oral cavity
(Miyazawa et al., 2004).
Nevertheless, so far only few of these studies
have used qRT-PCR to quantify HMGA2 expression in human neoplasias. In the present study, we
analyzed the expression level of HMGA2 in paraffin-embedded thyroid tissues, using real-time
quantitative RT-PCR. The HMGA2 gene expression of 9 FTCs, 28 PTCs, 3 ATCs, 19 adenomas,
and 3 normal thyroid tissue samples was tested by
quantitative real-time RT-PCR. To confirm the
qRT-PCR results on the protein level, immunohistochemistry was performed on two samples from
apparently normal thyroid tissue, five adenomas,
seven FTCs, and five PTCs with an antibody
raised against HMGA2.
MATERIALS AND METHODS
Patients
All patients underwent surgery between 1995
and 2005 in the general hospitals Bremen-Mitte or
Hamburg Altona. In this study 64 thyroid samples
from 44 female and 17 male patients were analyzed: 19 were adenomas, 28 papillary thyroid carcinomas (PTC), 9 follicular carcinomas (FTC), and
3 anaplastic carcinomas (ATC) (Table 1). In addition, two samples from patients with lymphofollicular thyroiditis were included. The control group
consisted of three nonmalignant surrounding tissues. The age of patients ranged from 21 to 85
57
years. The average thyroid nodule size was 3.1 cm
(range 0.3–14.0 cm).
Sample Preparation
Six 5-lm sections of each FFPE tissue were
deparaffinized in xylene prior to RNA isolation.
Haematoxylin–eosin stains were prepared from
consecutive sections following those used for RNA
isolation. To validate the constant expression level
of the endogenous control, RNA was isolated from
a primary cell culture derived from apparently normal thyroid tissue, cell cultures of six adenomas
(S325, S40.2, S211, S121, S731, and S734.1), and
two carcinomas (ARO and WRO) with the RNeasy
Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)
according to the manufacturer’s instructions.
RNA-Isolation
Total RNA was extracted using the high pure
RNA paraffin kit for isolation of total RNA from
FFPE tissues (Roche, Penzberg, Germany) including a Proteinase K and DNase I digestion according to the manufacturer’s instructions. The RNA
concentration and the ratio of absorbance at 260–
280 nm was quantitated by spectrophotometry.
Reverse Transcription
About 250 ng of total RNA was reverse transcribed with 200 U of M-MLV reverse transcriptase
(Invitrogen, Karlsruhe, Germany) and 150 ng
random hexamers according to the manufacturer’s
instructions. RNA was denatured before transcription at 658C for 10 min and subsequent cooling on
ice for 1 min. After adding the enzyme to the RNA
primer mixes, samples were incubated for 10 min
at 258C to allow annealing of the random hexamers. Reverse transription was performed at 378C
for 50 min followed by inactivation of the reverse
transcriptase at 708C for 10 min.
Real-Time Quantitative RT-PCR
RT-PCR amplification was performed using the
ABI Prism 7300 sequence detection system
(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany).
Because of different degradation of RNA isolated
from formalin-fixed samples, a relative quantification method with 18S rRNA as endogenous control
was used.
HMGA2 and 18S rRNA expression analyses were
performed in triplicate in a total volume of 20 ll using
2 ll of each cDNA corresponding to 25 ng of total
RNA. TaqMan primers and probe for HMGA2 were
ordered as assay on demand (No. Hs00171569_m1;
Applied Biosystems, Darmstadt, Germany). The
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
57
3 ERGEBNISSE
58
BELGE ET AL.
TABLE 1. Histology of Thyroid Lesions Used for HMGA2
Expression Analyses
Case
no.
Age
(years)
Sex
Histology
1
2
3
4
5
6
7
8
ST
58
40
47
25
85
53
44
48
f
m
m
f
m
f
m
f
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
63
29
54
71
35
51
42
42
34
61
44
39
30
40
42
35
61
72
84
38
50
21
31
46
65
54
85
85
42
66
72
38
76
33
69
42
30
49
25
48
76
67
59
34
57
31
27
f
f
f
f
m
f
m
f
f
f
m
f
f
f
f
f
m
f
f
f
f
f
m
f
f
f
f
f
m
f
f
m
f
f
m
f
f
f
f
f
f
m
f
f
f
m
m
Thyroiditis
Adenoma
Adenoma
Adenoma
PTC
Adenoma
Adenoma
Adenoma
Normal
thyroid
tissue
Thyroiditis
Adenoma
Adenoma
Adenoma
Adenoma
Adenoma
Adenoma
Adenoma
FTC
Adenoma
Adenoma
Adenoma
Adenoma
Adenoma
Adenoma
MI-FTC (t)
FTC (o)
FV-PTC
FV-PTC
PTC
PTC
FV-PTC
PTC
PTC
ATC
PTC
PTC
PTC
FV-PTC
MI-FTC
FV-PTC
PTC
ATC
PTC
FV-PTC
FV-PTC
PTC
PTC
FV-PTC
PTC
ATC
FTC (t)
FTC
PTC
PTC
PTC
FV-PTC
Tumor
diameter
(cm)
TNM
classification
and/or grading
–
7.5
6.8
2.5
4.0
6.5
4.0
5.0
–
–
–
–
–
7.0
1.0
1.7
6.5
6.0
3.5
1.0
2.2
4.0
1.0
1.5
0.3
3.8
4.0
2.1
8.0
1.0
6.0
0.6
2.2
1.0
2.5
1.5
2.0
0.6
1.5
14.0
0.7
2.0
1.0
0.8
3.8
2.5
0.5
1.4
2.5
1.2
2.3
0.8
1.7
5.5
1.2
2.3
0.9
2.0
2.5
pT3a
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
G1
–
–
–
–
–
–
pT2 N0 MX
pT4
pT1
pT3 pNX
pT1
pT2
pT1 pNX pMX
pT2 pN0
pT1; G2
pT4 N0; GIV
pT1 pNX pMX
G2
pT3; G3
pT1 N0 MX
pT1
pT3
pT1; G1
pT4b
pT2; G2
pT1 NX MX
pT2a; G2
pT2 NX
pT2
pT2 pN0
pT1; G1-2
pT4b
pT3 pNX pM1
pT1; G2
pT2 pN1 pMX
pT1
pT3 pN1
pT2
TABLE 1. Histology of Thyroid Lesions Used for HMGA2
Expression Analyses (Continued)
Case Age
no.
(years) Sex
56
57
58
59
60
61
66
41
37
69
79
71
f
m
f
m
f
f
Histology
PTC
PTC
FTC
FTC
PTC
FTC (o), with
partially
insular
pattern
Tumor
TNM
diameter classification
(cm)
and/or grading
2.0
2.0
2.8
3.0
2.0
9.0
pT3; G2
pT1; G2
pT2 N0
pT4
pT3 pNX; G1
pT4 NX MX
ST, surrounding tissues; PTC, papillary thyroid carcinoma; FTC, follicular thyroid carcinoma; MI-FTC, minimally invasive FTC; ATC, anaplastic
thyroid carcinoma; FV-PTC, follicular variant PTC; (o), oncocytic; (t),
trabecular.
HMGA2-specific primers in this assay are spanning
the boundary between Exons 1 and 2. Primers and
probe for 18S rRNA were 50 -GGATCCATTGGA
GGGCAAGT-30 (forward), 50 -AATATACGCTATTG
GAGCTGGAATTAC-30 (reverse), and FAM-TGC
CAGCAGCCGC-MGB TAMRA (probe) (Antonov
et al., 2005). For each run nontemplate controls
(NTC) and reactions without reverse transcriptase
(-RT) were included. PCR conditions were as follows: 2 min at 508C and 10 min at 958C, followed by
50 cycles with 15 sec at 958C and 1 min at 608C.
Analysis of Gene Expression
The relative expression was calculated by the
DCt method. The results were compared with
those obtained by conventional histology, which is
the current ‘‘gold standard’’ in diagnosis of thyroid
lesions. In addition, correlation analyses as well as
normal distribution parameter estimations were
performed to determine the optimal decision limit
to distinguish benign from malignant tumors. Sensitivity and specificity calculations were done on
logarithms of expression to obtain normally distributed values. Moreover, Student’s t test was performed to determine the significance of observed
differences in HMGA2 expression in benign and
malignant tissues.
Immunohistochemical Analysis of
HMGA2 Expression
For the immunohistochemical analysis of
HMGA2 expression, formalin-fixed and paraffinembedded tissue sections (6 lm) were deparaffinized, rehydrated, and washed with PBS before
immunoperoxidase staining. Slides were incubated
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
58
3 ERGEBNISSE
UPREGULATION OF HMGA2 IN THYROID CARCINOMAS
overnight at 48C in a humidified chamber with
goat anti-HMGA2 (Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, California, USA). Biotinylated antigoat link was used as secondary antibody (30 min).
Slides were then incubated with avidin biotin
enzyme label (Vector Laboratories, California,
USA) for 30 min and developed with AEC peroxidase substrate (Camon Laborservice GmbH, Wiesbaden, Germany) for 10 min. Finally, slides were
counter-stained with haematoxylin.
Figure 1. Ct values of 18S rRNA in different types of thyroid cells.
Adenoma-derived cell lines: S325/TSV40, S40.2/TSV40, S211/TSV40,
S121/TSV40, S731, S734.1; ARO: cell line of an anaplastic carcinoma;
WRO: cell line of a follicular carcinoma. Dark gray bar: mean value.
59
RESULTS
The expression of 18S rRNA in thyroid cell cultures (one normal thyroid, six adenomas and two
carcinomas) showed only a low variation, the mean
Ct value was 8.56 6 0.21 (Fig. 1). Therefore, 18S
rRNA was chosen as endogenous control for relative quantification.
In all samples an expression of HMGA2 was
detected (Fig. 2). The highest expression was
found in a FTC with partially insular pattern with
a 432-fold HMGA2 expression in relation to normal
tissue. In contrast, inflammatory diseases or adenomas showed a significantly lower level of HMGA2
expression. One FTC was gross dissected to quantify the HMGA2 expression in the tumor and the
surrounding tissue separately. The HMGA2 expression in the surrounding tissue was not higher than
in normal thyroid tissues, whereas HMGA2 was
overexpressed 47.2-fold in the tumor.
The possible correlation between the expression
of HMGA2 mRNA and the malignant transformation of the follicular epithelium is illustrated in
Figure 2 showing all cases analyzed in increasing
order of HMGA2 expression.
A normal distribution was fitted to the expression data to estimate the decision limit, sensitivity,
and specificity. The decision limit for the discrimination of benign and malignant tissues is 3.99 with
a sensitivity of 95.9% and a specificity of 93.9%.
Figure 2. HMGA2 expression in thyroid lesions. Results of the relative HMGA2 quantification. The mean
value of three surrounding thyroid tissues (ST, green bar) serves as calibrator. Different thyroid lesions are represented by bar colors: blue: FTC, dark gray: PTC, light gray: ATC, white: follicular adenoma or thyroiditis.
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
59
3 ERGEBNISSE
60
BELGE ET AL.
Figure 3. Immunostaining of thyroid tissues with an antibody raised
against the HMGA2 protein. (A) Normal thyroid tissue, 3100; (B) Follicular adenoma (Case no. 2), 3100; (C) and (D) Papillary thyroid carcinoma (Case no. 54), 3100 and 3400, respectively; (E) and (F) Follicular
thyroid carcinoma (Case no. 38), 3100 and 3400, respectively; (G) and
(H) Follicular thyroid carcinoma with partially insular pattern (Case no.
61), 3100 and 3400, respectively. Bars indicate 100 lm. Brown staining
of nuclei was noted in cases revealing high HMGA2 expression by realtime PCR.
As to the adenomas, the HMGA2 expression level
of benign tumors was not significantly elevated as
ascertained by Student’s t test (P 5 0.42). A maximum value of 11-fold overexpression was found in
an atypical adenoma. The majority of the malignant
samples had expression levels of more than the 20fold of normal tissue values. Values up to a 400-fold
overexpression were detected. Finally, mean values
in the groups (normal, benign, and malignant tissues) were compared by t tests. There was no significant difference between the normal and benign tissue groups (P 5 0.42), while the differences
between the normal and malignant tissue group as
well as between the benign and malignant tissue
group were highly significant (P < 0.001).
In the next step, the group of follicular carcinomas
and follicular variants of papillary carcinomas was
compared with follicular adenomas. The decision
limit to separate these two groups is 6.3 with a sensitivity of 81.2% and a specificity of 88.3%. A significant, but weak correlation between patients’ age and
relative HMGA2 expression (Pearson correlation coefficient 5 0.25340, P 5 0.048) was observed, whereas
no significant correlations were found between the
tumor size or patients’ age and the expression level.
It should be noted that the qRT-PCR results are
based on whole sections. Thus, the area covered by
the tumor itself is different among the cases. To check
if the results even can be expected to improve when
detecting HMGA2 expression only in the tumor cells,
IHC has been performed in a number of cases.
A strong nuclear positivity was observed in all
carcinomas, whereas no immunoreactivity was
observed in normal thyrocytes, tumor cells of
adenomas, cells of the stromal component of carcinomas, and lymphocytes, respectively (Fig. 3).
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
60
3 ERGEBNISSE
UPREGULATION OF HMGA2 IN THYROID CARCINOMAS
DISCUSSION
Currently, FNA biopsy with subsequent cytologic diagnosis is the most important procedure
in preoperative thyroid tumor diagnosis besides
scintigraphy. However, it is virtually impossible to
differentiate between follicular carcinomas and
adenomas based on samples obtained by FNA
alone. Only in 20–30% of the cases of surgically
removed thyroid glands due to suspicious cytological results is a follicular malignancy diagnosed at
postoperative histology (Goellner et al., 1987;
Chiappetta et al., 1998; Greaves et al., 2000; Baloch
et al., 2002). With regard to the limitations of FNA
cytology, reliable markers that allow to differentiate between different thyroid nodules are still an
unmet challenge especially for follicular thyroid
neoplasias. Also, there is a high demand to stratify
the group of papillary cancers with an adverse
prognosis. Herein, we have described our results
obtained with the expression of HMGA2 as a standalone molecular marker.
The aim of this study was to evaluate the potential of HMGA2 expression for the diagnosis of thyroid tumors. As a rule, the expression level of benign tumors was comparable with those of normal
tissues. In contrast, we were able to demonstrate
that HMGA2 is significantly overexpressed in most
thyroid carcinomas as compared with benign
tumors. Values up to 400-fold overexpression were
detected.
Even with archival material it was possible to
identify malignancies with a sensitivity of 95.9%
based on HMGA2 expression alone taking histology
as the gold standard. Furthermore, it should be
noted that the quantitative real-time PCR results
are based on whole sections. Thus, as shown by
the IHC data, if only the area covered by the tumor
is studied, even greater differences between benign and malignant samples should be seen.
Generally, HMGA2 expression either as a standalone parameter or combined with others is a
promising marker with the potential to improve
preoperative diagnoses and treatment of thyroid
nodules. Besides its utility for clinical diagnostics
of follicular thyroid tumors, the increased expression of HMGA2 may also improve the understanding of the molecular mechanisms involved in the
genesis of thyroid malignancies.
As an alternative to quantitative real-time PCR,
immunohistochemistry is a suitable method to
detect the HMGA2 protein in nuclei of malignant
thyroid tumors. As shown by immunostaining with
an HMGA2-specific antibody (Fig. 3), malignant
epithelial tumor cells exhibit a strong nuclear reac-
61
tion, whereas normal thyrocytes and adenomas as
well as stromal components of carcinomas do not
show immunoreactivity, thus confirming the results
obtained by quantitative real-time PCR. Therefore, HMGA2-specific immunohistochemistry can
improve the diagnosis of thyroid tumors.
Furthermore, in papillary thyroid carcinomas
(PTCs), the HMGA2 overexpression varied over a
broad range. Although PTCs have a favorable prognosis in general, there are subgroups in which the
prognosis is worse. Current methods fail to identify
these subgroups prior to surgical removal. Because
HMGA2 expression seems to be a more general
marker of increased malignancy in a variety of malignant neoplasms (e.g. lung cancer (Sarhadi et al.,
2006) and squamous cell carcinomas of the oral
cavity (Miyazawa et al., 2004)), it is tempting to
speculate that the range of HMGA2 overexpression
in PTCs reliably identifies the subgroup of PTCs
with a poor prognosis. Interestingly, in a recent
study by Rodrigues et al. (2007) HMGA2 was found
to be one of the most overexpressed genes in a
group of aneuploid papillary thyroid cancers.
Previous studies have identified a variety of
genes as potential markers of malignant thyroid
neoplasms and in the most recent studies often a
combination of several genes is recommended.
Kebebew et al. (2006) investigated 19 cases each of
hyperplastic nodules, follicular adenomas, follicular
thyroid cancers, follicular variants of papillary cancers, and papillary thyroid cancers. Their study is
based on the expression of three cell-cycle regulatory genes, MCM5, MCM7, and RAD9, as molecular
markers of malignancy. While the combined use of
these genes provided a sensitivity of 98.2%, the
specificity did not exceed 65.7%. As to single
genes, overlaps in expression levels in benign and
malignant tumors ranged between 27.3 and 38.9%
(Kebebew et al., 2006).
Another multi-gene assay focussing on follicular
neoplasias has been suggested by Weber et al.
(2005). In this study, both immunostaining and
quantitative RT-PCR for three genes were performed. However, minimally invasive FTCs representing the most important diagnostic challenge
were excluded from this study. In contrast, this
subtype as well as atypical adenomas were included in a study by Fryknäs et al. (2006). Several
genes were identified, which are differentially
expressed in adenomas and FTCs. Interestingly,
HMGA2 was included in the cDNA microarray, but
not included in the panel of finally selected genes.
The FHL1 expression, which is described more in
detail, was significantly lower in (minimally invaGenes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
61
3 ERGEBNISSE
62
BELGE ET AL.
sive) FTCs than in (atypical) adenomas. However,
FHL1 expression levels of benign and malignant
follicular neoplasias overlap to a great extent, so
that the FHL1 expression alone does not seem to
allow a sufficient differentiation between these
groups (Fryknäs et al., 2006).
Moreover, several proteins have been suggested
as targets for immunostaining, e.g. galectin-3
(GAL3) and human bone marrow endothelial cell
(HBME)-1. Although immunohistochemistry can
be an adjunct in the diagnostic process, the staining pattern can vary in subvariants of differentiated
thyroid carcinomas representing a particular problem in borderline tumors where a reliable marker
is highly needed (Castro and Gharib, 2005; Sheils,
2005). It has been reported, that under certain circumstances, e.g. Hashimoto thyroiditis with coexistent solitary or multiple nodules, the usefulness
of GAL3 expression analysis is limited (Niedziela
et al., 2002). While the GAL3 mRNA and protein
level is increased in the majority of PTCs, follicular thyroid tumors were negative with regard to
GAL3 mRNA. This observation raises doubts on
the usefulness of this marker, since it seems to be
impossible to distinguish adenomas from follicular
cancers (Feilchenfeldt et al., 2003).
Other studies suggested the expression of
HMGA1 as a suitable genetic marker to distinguish
benign from malignant thyroid tumors (Chiappetta
et al., 1995, 1998; Berlingieri et al., 2002; Czyz
et al., 2004). As for the RT-PCR analyses, one main
disadvantage of HMGA1 is the existence of several
retropseudogenes, which can lead to false-positive
results in quantification experiments when RNA
extractions are contaminated with genomic DNA.
In contrast to HMGA1, no retropseudogenes of
HMGA2 are known (Blank et al., 2000; Rogalla
et al., 2001; Strichman-Almashanu et al., 2003).
Thus, to the best of our knowledge, HMGA2
expression is currently the best known single molecular marker to distinguish between benign and
malignant thyroid neoplasms.
An additional point of interest are papillary thyroid microcarcinomas (PTMC), defined as being
less than or equal to 1.0 cm in diameter. However,
the clinical relevance of these tumors still remains
a matter of debate and markers to judge the aggressiveness are missing (Frates et al., 2005; Burman,
2006; Roti et al., 2006). Herein, we quantified the
expression of HMGA2 in 10 cases of papillary thyroid microcarcinoma (Case nos. 26, 28, 30, 34, 37,
39, 40, 43, 48, and 53), and found an overexpression in comparison with normal thyroid tissue.
Nevertheless, the expression levels found in the
individual PTMCs varied over a broad range.
Thus, we assume that HMGA2 expression might
be a potent genetic marker to discriminate PTMCs
displaying aggressive behavior from those with an
indolent clinical course, but clinical trials are necessary to verify the utility of HMGA2 expression
analysis in the diagnosis of PTMC. Further analyses on fresh frozen tissues or FNA biopsies are necessary to elucidate if the accuracy of this new
marker is sufficient even to identify the challenging minimally invasive subtype of FTCs.
In summary, HMGA2 expression is a molecular
marker that does not only distinguish between benign and malignant growth but also reflects the
continuous process underlying the malignant transformation of thyroid nodules. Besides real-time
quantitative PCR, immunohistochemistry is an
adequate method to investigate the HMGA2 status
of thyroid tissue samples.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Annette Rudolph, Prof. Dr. Ulrich
Bonk, and Prof. Dr. Jörg Caselitz, who generously
agreed to provide us with biological specimens,
and Cornelia Ebisch for excellent technical assistance. We thank Prof. Dr. Thomas Löning and his
staff for the immunostainings.
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63
3 ERGEBNISSE
3.3.2 On the prevalence of the PAX8-PPARG fusion resulting from the chromosomal
translocation t(2;3)(q13;p25) in adenomas of the thyroid (Klemke et al., 2011)
Die Suche nach molekularen Markern zur Unterstützung der Dignitätsbewertung follikulärer
Neoplasien führte im Jahr 2000 zur Entdeckung von Fusionstranskripten der Gene PAX8
und PPARG (Kroll et al., 2000). Bei PAX8 handelt es sich um einen schilddrüsenspezifischen
und für die Entwicklung der Follikelzellen essentiellen Transkriptionsfaktor (Mansouri et al.,
1998; Antonica et al., 2012), wohingegen PPARG für einen ubiquitär exprimierten nukleären
Rezeptor kodiert (Fajas et al., 1997). Auf chromosomaler Ebene liegt dieser Genfusion eine
Translokation t(2;3)(q13;p25) zugrunde, die zuvor bereits bei follikulären Adenomen beschrieben worden war (Teyssier et al., 1990; Sozzi et al., 1992; Roque et al., 1993). In der
Erstbeschreibung der Folgen dieser Translokation auf molekularer Ebene konnten PAX8PPARG-Fusionstranskripte und auch die daraus resultierenden Fusionsproteine häufig in
follikulären Karzinomen, nicht jedoch in follikulären Adenomen nachgewiesen werden (Kroll
et al., 2000). Mit der Annahme, daß die entdeckten Fusionsproteine bzw. -transkripte einen
entscheidenden Beitrag zur Entstehung follikulärer Karzinome leisten könnten, verband sich
auch die Hoffnung, die beobachtete Genfusion könne sich als Marker für follikuläre Karzinome eignen und die Abgrenzung derselben von Adenomen unterstützen. Nachfolgende
Untersuchungen zahlreicher Arbeitsgruppen zur Prävalenz der PAX8-PPARG-Fusion ergaben jedoch, daß die Fusion erstens nicht so häufig wie ursprünglich vermutet in follikulären
Karzinomen auftritt (Martelli et al., 2002; Aldred et al., 2003; Dwight et al., 2003), was eine
geringere Sensitivität bedeutet, und daß sie zweitens auch in Adenomen nachgewiesen
werden kann, wodurch zusätzlich die Spezifität vermindert ist (Marques et al., 2002; Banito
et al., 2007; vgl. Tabelle 1 aus Klemke et al., 2011).
Trotz zahlreicher Untersuchungen blieb die Frequenz der PAX8-PPARG-Fusion in beiden
Tumorentitäten unklar, da die von unterschiedlichen Gruppen erzielten Ergebnisse zum Teil
stark divergierten. Um die Frage zu klären, wie häufig sie tatsächlich in Adenomen auftritt
und wie stark die Spezifität dadurch vermindert ist, wurden 192 follikuläre Adenome zytogenetisch untersucht, wobei die t(2;3)(q13;p25) in nur zwei Fällen nachgewiesen werden
konnte. Eine erneute histologische Begutachtung beider Tumoren ergab keine Hinweise auf
Malignität, so daß Zweifel an ihrer Dignität ausgeschlossen werden konnten. Die PPARGRearrangierung wurde in einem Tumor auch durch eine FISH bestätigt. Des weiteren wurden
in beiden Adenomen Fusionstranskripte der Gene PAX8 und PPARG durch RT-PCRs mit
anschließender Sequenzierung der PCR-Produkte nachgewiesen. Die in dieser Serie aus
192 Adenomen festgestellte Frequenz der Genfusion liegt damit bei etwa einem Prozent und
damit deutlich unter den in einigen anderen Studien ermittelten Häufigkeiten (Cheung et al.,
2003; Nakabashi et al., 2004; vgl. Tabelle 1 aus Klemke et al., 2011).
64
3 ERGEBNISSE
VI.
On the prevalence of the PAX8-PPARG fusion resulting
from the chromosomal translocation t(2;3)(q13;p25)
in adenomas of the thyroid.
Klemke M, Drieschner N, Laabs A, Rippe V, Belge G, Bullerdiek J, Sendt W. 2011. Cancer
Genetics 204: 334-339.
Eigenanteil:
 Durchführung der RT-PCRs und der gelelektrophoretischen Auftrennungen
 Aufreinigung der PCR-Produkte zur Vorbereitung der Sequenzierung
 Auswertung der Sequenzierungsergebnisse
 Verfassen des Manuskripts in Zusammenarbeit mit N. Drieschner und J. Bullerdiek
65
3 ERGEBNISSE
Cancer Genetics 204 (2011) 334e339
BRIEF COMMUNICATION
On the prevalence of the PAX8-PPARG fusion
resulting from the chromosomal translocation
t(2;3)(q13;p25) in adenomas of the thyroid
Markus Klemke a, Norbert Drieschner a, Anne Laabs a, Volkhard Rippe a,
€rn Bullerdiek a,b,*, Wolfgang Sendt c
Gazanfer Belge a, Jo
a
Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG, Bremen, Germany; b Clinic for Small Animals and
Research Cluster REBIRTH, University of Veterinary Medicine, Hannover, Germany; c Department of General and Visceral
Surgery, St. Joseph-Stift Hospital Bremen, Bremen, Germany
The chromosomal translocation t(2;3)(q13;p25) characterizes a subgroup of tumors originating
from the thyroid follicular epithelium and was initially discovered in a few cases of adenomas.
Later, a fusion of the genes PAX8 and PPARG resulting from this translocation was frequently
observed in follicular carcinomas and considered as a marker of follicular thyroid cancer. According to subsequent studies, however, this rearrangement is not confined to carcinomas but also
occurs in adenomas, with considerably varying frequencies. Only five cases of thyroid adenomas
with this translocation detected by conventional cytogenetics have been documented. In contrast,
studies using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) detected fusion transcripts resulting from that translocation in an average of 8.2% of adenomas. The aim of this study
was to determine the frequency of the PAX8-PPARG fusion in follicular adenomas and to use the
HMGA2 mRNA level of such tumors as an indicator of malignancy. In cytogenetic studies of 192
follicular adenomas, the t(2;3)(q13;p25) has been identified in only two cases described herein.
Histopathology revealed no evidence of malignancy in either case, and, concordantly, HMGA2
mRNA levels were not elevated. In summary, the fusion is a rare event in follicular adenomas
and its prevalence may be overestimated in many RT-PCR–based studies.
Keywords Follicular thyroid neoplasia, t(2;3)(q13;p25), PAX8-PPARG fusion, HMGA2
ª 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.
Distinguishing follicular thyroid carcinomas (FTC) from
adenomas cytologically represents a major diagnostic challenge because of their similar appearance, so there is a need
for specific markers (1). The chromosomal t(2;3)(q13;p25) is
a recurrent cytogenetic aberration in follicular neoplasias of
the thyroid leading to a fusion of the genes encoding the
thyroid-specific transcription factor PAX8 and the peroxisome
proliferatoreactivated receptor gamma (PPARg). Although
the translocation had been reported before in adenomas as
well (2e4), the PAX8-PPARG rearrangement was considered
a marker of FTC in a study by Kroll et al., who detected PAX8PPARG fusion transcripts in 5/8 FTCs but in none of 20
follicular adenomas (FA), 10 papillary carcinomas, and 10
multinodular hyperplasias (5). Accordingly, it was proposed
Received October 18, 2010; received in revised form April 28,
2011; accepted May 3, 2011.
* Corresponding author.
E-mail address: [email protected]
that the PAX8-PPARG fusion may aid the differential diagnosis of follicular neoplasias. The presence of the fusion gene
in follicular thyroid carcinomas has been confirmed by several
studies, even though its prevalence seems to be lower than
initially reported (Table 1A). It occurs in FA, however, with
a prevalence reported to range between 0.0 and 54.5%
(for references, see Table 1A). Herein, we present two
novel cases of thyroid adenomas that harbor the
t(2;3)(q13;p25) and express low levels of HMGA2, a molecular marker to distinguish between benign and malignant
thyroid tumors (6e9).
Materials and methods
Tissue samples
Tumor samples were snap-frozen in liquid nitrogen immediately after surgery and stored at e80 C for RNA isolation.
2210-7762/$ - see front matter ª 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cancergen.2011.05.001
66
3 ERGEBNISSE
PAX8-PPARG fusion in thyroid adenomas
Table 1
335
Prevalence of PAX8-PPARG rearrangements in follicular neoplasias of the thyroid
A. Prevalence of PAX8-PPARG fusion transcripts according to RT-PCRebased studies
Reference
FA with
fusion of
PAX8ePPARG
Total
number
of FA
Frequency
(%)
FTC with
fusion of
PAX8ePPARG
Total
number
of FTC
Frequency
(%)
Kroll et al. (5)
Marques et al. (22)a
Nikiforova et al. (21)
Martelli et al. (23)
Cheung et al. (19)
Aldred et al. (24)
Nikiforova et al. (25)
Dwight et al. (26)
Hibi et al. (27)
Lacroix et al. (28)
Nakabashi et al. (29)
Sahin et al. (30)a
Giordano et al. (31)
Di Cristofaro et al. (32)
Banito et al. (33)d
Algeciras-Schimnich et al. (20)
Overall prevalence
0
2
2
e
6
e
1
1
0
1
3
e
0
0
5
2
23
20
16
25
e
11
e
23
40
12
26
10
e
10
9
40
39
281
0.0
12.5
8.0
e
54.5
e
4.3
2.5
0.0
3.8
30.0
e
e
0.0
12.5
5.1
8.2
5
5
8
0
6
2
5
4c
0
4
4
8
8
9
7
13
88
8
9
15
5
17
19
17
34
6
21
12
10
13
21
17
21
245
62.5
55.6
53.3
0.0
35.3
10.5
29.4
11.8
0.0
19.0
33.3
57.4
61.5
42.9
41.2
61.9
35.9
FISH performed
in addition
to PCR
Yes
No
No
No
No
No
Nob
Yes
Yes
No
No
No
No
No
Yes
Yes
B. Prevalence of the chromosomal t(2;3)(q13;p25) according to cytogenetic studies
Reference
FA with t(2;3)
Total number of FA
Frequency of
translocation (%)
Teyssier et al. (2)
Antonini et al. (13)
Sozzi et al. (3)
Roque et al. (4)
Belge et al. (14)
Roque et al. (15)
Overall prevalence
1
0
2
1
0
1
5
42
6
5
18
69
6
146
2.4
0.0
40.0
5.6
0.0
16.7
3.4
Translocation
Case no.
t(2;3)(q12;p24)
e
t(2;3)(q12-13;p24-25)
t(2;3)(q13;p25)
e
t(2;3)(q13;p25)
43
e
1 and 2
6
e
10
C. Prevalence of the PAX8ePPARG rearrangement according to FISH-based studies
Reference
FA with PAX8ePPARG
rearrangement
Total number of FA
Frequency of
rearrangement (%)
French et al. (16)
Castro et al. (17)
Chia et al. (18)
Overall prevalence
0
3
0
3
40
9
24
73
0.0
33.3
0.0
4.1
(A) Summary of 16 RT-PCRebased studies on follicular adenomas as well as carcinomas. Some studies additionally performed FISH
experiments, as indicated in the last column. aImmunohistochemical results excluded. bFISH was performed on 16 additional carcinomas, but
not on the 40 cases listed here. cSix FTCs were positive for rearrangement in FISH analysis. dAuthors do not state the results of FISH and
RT-PCR separately. (B) Cytogenetic studies on the chromosomal t(2;3)(q13;p25) in follicular thyroid adenomas. (C) Summary of studies in
which the PAX8-PPARG rearrangement was detected by FISH.
For cell cultures, tissues were kept in Hank’s solution with
200 IU/mL penicillin and 200 mg/mL streptomycin.
Cell culture and chromosome analyses
Tissue samples of surgically removed thyroid tumors were
minced and treated with 0.26% (200 U/mL) collagenase
(Serva, Heidelberg, Germany) for 3e5 hours. After centrifugation, the pellet was re-suspended in culture medium
(TC 199 with Earle’s salts supplemented with 20% fetal
bovine serum, 200 IU/mL penicillin, 200 mg/ml streptomycin)
and incubated at 37 C and 5% CO2. Exponentially growing
cultures of thyroid cells were used for GTG banding and
chromosome analyses according to routine methods.
Karyotype description followed ISCN 2009 (10). A total of
192 tumor samples were karyotyped successfully.
Fluorescence in situ hybridization (FISH)
For the detection of rearrangements of the PPARG gene,
interphase FISH (I-FISH) with a PPARG break-apart probe
(PanPath, Budel, The Netherlands) was performed on touch
preparations. For one slide, 10 mL of the PPARG break-apart
probe was used. Co-denaturation was performed on
67
3 ERGEBNISSE
336
a Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany) for
3 minutes at 80 C followed by overnight hybridization in
a humidified chamber at 37 C. Post-hybridization was performed at 61 C for 5 minutes in 0.1 standard saline citrate
(SSC). Interphase nuclei were finally counterstained with
DAPI (0.75 mg/mL; Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Slides were examined with an Axioskop 2 plus fluorescence
€ttingen, Germany). Images were
microscope (Zeiss, Go
captured with an AxioCam MRm digital camera and edited
€ttingen, Germany). At least 200
with AxioVision (Zeiss, Go
non-overlapping nuclei were scored. For determination of
cut-off values, signal patterns of 200 non-overlapping nuclei
of control specimens (i.e., touch preparations of four previously frozen normal thyroid tissue samples) were determined. Cut-off values were defined as the mean plus three
standard deviations (M þ 3SD) of the number of nuclei with
abnormal signal patterns in control specimens (11). Nuclei
with two co-localized red/green signals (RG) were scored as
normal. Nuclei with one co-localized red/green signal, one
single red, and one single green signal (1RG1R1G) were
scored as positive for a PPARG rearrangement.
RNA isolation and reverse-transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR)
RNA was isolated from frozen tissue samples with the
RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Reverse transcription was performed using M-MLV RT (Invitrogen,
Darmstadt, Germany) according to the manufacturer’s
instructions. For the detection of fusion transcripts, three
different primers specific for PAX8 (50 -GCC ACC AAG TCC
CTG AGT CC-30 , exon 5; 50 -GCA TTG ACT CAC AGA GCA
GCA-30 , exon 7; 50 -GCT CAA CAG CAC CCT GGA-30 , exon
8) were used in combination with a PPARG-specific reverse
primer (50 -CAT TAC GGA GAG ATC CAC GG-30 ). PCR was
performed with DreamTaq DNA polymerase (Fermentas, St.
Leon-Rot, Germany). Reaction conditions were as follows: 5
minutes at 95 C followed by 41 cycles of 30 seconds at
95 C, 30 seconds at 60 C, and 1 minute at 72 C, and a final
elongation at 72 C for 5 minutes. PCR products were
separated by agarose gel electrophoresis, distinct bands
were excised from the gel, and the DNA was extracted with
the Gel Extraction Kit (Qiagen). The purified PCR products
were sequenced directly (Eurofins MWG Operon, Ebersberg,
Germany). Two tumors with a known chromosomal
t(2;3)(q13;p25) and 19 karyotypically normal tumors were
used for RT-PCR.
Quantitative real-time PCR
The relative quantification of HMGA2 expression was
performed with the HMGA2-specific TaqMan assay
Hs00171569_m1 (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany),
as described elsewhere (6), on a 7300 Real-Time PCR System
(Applied Biosystems). For the detection of the endogenous
control HPRT1, primers 5’-GGC AGT ATA ATC CAA AGA
TGG TCA A-30 and 50 -GTC TGG CTT ATA TCC AAC ACT
TCG T-30 were used in combination with the HPRT1-specific
hydrolysis probe 6FAM-CAA GCT TGC TGG TGA AAA GGA
CCC C-TAMRA.
M. Klemke et al.
Results
Cytogenetic analyses identified a chromosomal t(2;3)
(q13;p25) as the sole clonal aberration in two thyroid tumors
classified as follicular adenomas by routine histological
examinations (Figure 1A): The first tumor (case 1) was 2.5
cm in diameter and was removed from the right thyroid lobe
of a 25-year-old female patient. The second tumor harboring
the translocation (case 2) measured 3.7 cm in diameter and
was found during pathologic examination of a nodular goiter
of a 36-year-old female patient. In addition to hematoxylin
and eosin staining, sections were also Elastica van Gieson
(EvG)-stained. A microfollicular growth pattern but no
invasive growth of the tumor was noted, which was
accordingly classified as microfollicular adenoma. The t(2;3)
(q13;p25) was also confirmed by FISH on interphase nuclei
(Figure 1B).
RT-PCR was performed on both tumors with the chromosomal translocation, as well as on 19 adenomas with an
apparently normal karyotype, to detect PAX8-PPARG fusion
transcripts. It was positive in both cases with the translocation, but in none of the cases with an apparently normal
karyotype. The PCR products of the two positive cases were
sequenced directly to confirm their identity. In case 1, two
different fusion transcripts consisting of exons 1e7 and
1e10, respectively, of PAX8 fused to PPARG were found.
Three different fusion transcripts consisting of PAX8 exons
1e7, 1e8, and 1e9, respectively, fused to PPARG were
identified in case 2 (Figure 1C).
Finally, we have quantified the HMGA2 mRNA level,
which was not elevated in the two adenomas with the PAX8PPARG fusion, compared to histologically normal thyroid
tissue (data not shown).
Discussion
When PAX8-PPARG fusion transcripts were discovered in
follicular thyroid carcinomas with a t(2;3), it was suggested
that this gene fusion was a useful marker for the diagnosis of
follicular neoplasias of the thyroid (5). Subsequent studies,
however, reported lower occurrence rates of the fusion
transcripts in follicular carcinomas than initially reported.
While this gene fusion seems to characterize a distinct
subgroup of follicular thyroid tumors, it is not specific for
malignant tumors, because it has also been detected in
follicular adenomas (Table 1A).
In our series of 192 follicular adenomas, the t(2;3)(q13;p25)
was detected in only two tumors by conventional cytogenetics.
Histologic examination revealed no evidence for malignancy in
either case. In addition, HMGA2 mRNA levels (6e9) were not
elevated in the two tumors with the translocation, compared
to histologically normal thyroid tissue. By RT-PCR and
sequencing of PCR products, fusion transcripts of PAX8 and
PPARG were detected in both cases. Hence, it was shown that
the chromosomal translocation led to the same gene fusion
that was initially described for FTC.
Based on cytogenetic analyses, the translocation leading
to the PAX8-PPARG fusion is a rare finding in thyroid
adenomas. The Mitelman Database (12) was searched for
cases of FA harboring a t(2;3)(q12e13;p24e25) chromosomal
translocation (last checked on February 25, 2011). Previous
68
3 ERGEBNISSE
PAX8-PPARG fusion in thyroid adenomas
337
Figure 1 (A) Partial G-banded karyotype of case 1 with a t(2;3)(q13;q15) as the sole chromosomal aberration. (B) Interphase-FISH
with a PPARG break-apart probe (PanPath, Budel, Netherlands) on a touch preparation of case 2 showing a rearrangement of PPARG
as indicated by a split of the PPARG surrounding probes (signals marked by green and red arrow). The non-rearranged region appears
as a red/green fusion signal (yellow arrow). (C) Sequences of four different PAX8-PPARG fusion transcripts. The fusion sites are
indicated by arrows. From top to bottom: exons 1e7, 1e8, 1e9a, and 1e10 of PAX8 are fused to PPARG. The first three fusion
transcripts are from case 2, the fusion of PAX8 exon 10 (in addition to exon 7) to PPARG was found in case 1. PAX8 exon numbering
is based on GenBank accession number NM_003466.
studies based on cytogenetic analysis (2e4,13e15) reported
the t(2;3)(q13;p25) leading to a fusion of PAX8 and PPARG
in only 5/146 cases (Table 1B), corresponding to a prevalence of 3.4%. In three more recent studies, FISH was used
to detect the rearrangement in 73 follicular adenomas
(16e18; Table 1C), but only three cases were positive
(4.1%). These data indicate that the prevalence of the
chromosomal aberration in adenomas is low and does not
coincide with the more frequently reported occurrence of
PAX8-PPARG fusion transcripts. In contrast to the relatively
low prevalence observed in the present series, several other
studies, though usually based on smaller series, have
identified this aberration by RT-PCR at a much higher
frequency (Table 1A). The highest frequency of this gene
fusion reported in follicular adenomas was 54.5% (19).
Summing up the results of several studies, PAX8-PPARG
fusion transcripts were detected by RT-PCR in 23/281
adenomas (8.2%; for references, see Table 1A). As
a possible explanation for the clear discrepancy in the
prevalence of the gene fusion in adenomas, we considered
the use of different methods for its detection. Mosaicism of
aberrant and cytogenetically normal cells in thyroid
adenomas might cause discrepant results between cytogenetic analyses and RT-PCRebased studies. Interphase
69
3 ERGEBNISSE
338
FISH analyses of tumors harboring the rearrangement
revealed that the proportion of fusion-positive tumor cells
varied between 16 and 93% (20). If only a small fraction of
cells in a tumor is aberrant, they might escape detection by
chromosome analysis. The fusion transcripts, however,
would still be detectable by RT-PCR on native tissue
samples. As another explanation, the rearrangement may
not always be detectable at the cytogenetic level, as reported
for many other chromosomal translocations in tumors. In the
present study, however, PAX8-PPARG fusion transcripts
were not detected in any of the 19 adenomas with an
apparently normal karyotype that were subjected to RT-PCR.
Another conceivable reason for the relatively high prevalence of the gene fusion in adenomas in some studies may
be the possible mis-identification of follicular thyroid carcinomas, in which the rearrangement is known to be more
common than in follicular adenomas. As discussed by
Nikiforova et al. (21), tumors classified as adenomas and
harboring the PAX8-PPARG fusion may in fact be follicular
carcinomas that were removed at a preinvasive stage.
Nevertheless, in follicular carcinomas as well, the
frequency of the fusion gene varies over a broad range
among different studies. In a recent study based on FISH
(18), the authors discuss the role of the patients’ ethnic
background and geographic location as possible explanations for the relatively low frequency they observed in follicular thyroid carcinomas. Future studies should address the
question of whether these factors also may cause diverging
frequencies of the gene fusion in adenomas.
In summary, our results indicate that the chromosomal
t(2;3)(q13;p25) and the resulting fusion of PAX8 and PPARG
is rare in follicular adenomas. The diverging rates of occurrence in adenomas between different studies could be
explained by a high rate of hidden translocations, a minority
of positive cells in the samples, or by the use of different
methodologies. In addition, the influence by other factors
such as ethnic background or geographic location still
remains to be elucidated.
Acknowledgments
We thank Dr. Birgit Rommel for critically reading the
manuscript.
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3 ERGEBNISSE
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339
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71
3 ERGEBNISSE
3.3.3 Detection of PAX8-PPARG fusion transcripts in archival thyroid carcinoma
samples by conventional RT-PCR (Klemke et al., 2012)
Der Nachweis von PAX8-PPARG-Fusionstranskripten durch RT-PCRs erfolgte in allen bisherigen Publikationen ausschließlich an frischen oder kryokonservierten Geweben. Bei Verwendung von Primern, die mehrere hundert Basenpaare lange PCR-Produkte generieren, ist
diese Methode nicht auf formalinfixierte Gewebe übertragbar. Die RNA solcher Gewebe ist
fixierungsbedingt degradiert, so daß nur kurze Abschnitte amplifiziert werden können. Erstmalig beschrieben wurde der RT-PCR-basierte Nachweis der Fusionstranskripte in formalinfixierten Geweben in einer Arbeit von Algeciras-Schimnich et al. (2010). Es wurden vier
unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Primer sowie eine hochauflösende Kapillarelektrophorese der Produkte mit gleichzeitiger Messung der Fluoreszenz verwendet. Da dieses
Verfahren relativ aufwendig ist, wurde ein Nachweis der Fusionstranskripte im Rahmen einer
herkömmlichen RT-PCR in Kombination mit einer gelelektrophoretischen Auftrennung angestrebt. Zunächst wurde die RT-PCR an zwei Adenomen mit bekannter t(2;3)(q13;p25) und
bereits erfolgtem Nachweis von PAX8-PPARG-Fusionstranskripten getestet. Im Unterschied
zu der in einer vorherigen Studie durchgeführten PCR an frischen bzw. kryokonservierten
Geweben (Klemke et al., 2011) wurde die RT-PCR nun jedoch an aus FFPE-Geweben
isolierter RNA durchgeführt. Alle bekannten Fusionstranskripte konnten auch unter Verwendung von degradierter RNA amplifiziert und im Agarose-Gel visualisiert werden. Daraufhin
wurden FFPE-Gewebe von insgesamt 21 follikulären Karzinomen und sieben follikulären
Varianten von papillären Karzinomen, die nicht karyotypisiert oder mit Hilfe der FISH auf eine
Translokation untersucht worden waren, dieser RT-PCR unterzogen. In keinem der sieben
FVPTCs wurde ein positives Ergebnis erzielt. Zwei der follikulären Karzinome wurden jedoch
positiv auf PAX8-PPARG-Fusionstranskripte getestet. Da eine übereinstimmende Länge der
mittels Gelelektrophorese erzeugten Banden nicht ausreicht, um die entsprechenden PCRProdukte zu identifizieren, wurden diese zusätzlich sequenziert. Ein follikuläres Karzinom
exprimierte insgesamt fünf verschiedene Transkripte, in denen jeweils die Exons 7, 8, 9 oder
10 von PAX8 mit PPARG fusioniert waren. Zusätzlich trat die Fusion von Exon 10 sowohl mit
einer kompletten Deletion des Exons 9 als auch ohne diese auf. In Übereinstimmung mit
dem Resultat der RT-PCR zeigte die anschließend durchgeführte FISH in diesem Tumor
einen mit 79 % hohen Anteil der Nuklei mit einer Rearrangierung der Bande 3p25 an. In dem
zweiten FTC konnte nur ein Transkript mit einer Fusion des Exons 10 (ohne Deletion von
Exon 9) mit PPARG gefunden werden. Zwar wurden auch in diesem Fall Nuklei mit
rearrangierter Bande 3p25 mittels FISH nachgewiesen, ihr Anteil lag mit nur einem Prozent
jedoch unterhalb der Detektionsgrenze. Zusätzlich wurde ein PAX8-PPARG-Fusionstranskript in einer Knochenmarksmetastase eines follikulären Karzinoms gefunden.
72
3 ERGEBNISSE
VII.
Detection of PAX8-PPARG fusion transcripts in archival thyroid
carcinoma samples by conventional RT-PCR.
Klemke M, Drieschner N, Belge G, Burchardt K, Junker K, Bullerdiek J. 2012. Genes,
Chromosomes and Cancer 51: 402-408.
Eigenanteil:
 Konzeption des Vorhabens und Planung der RT-PCRs
 Durchführung der RT-PCRs und der gelelektrophoretischen Auftrennungen
 Aufreinigung der PCR-Produkte zur Vorbereitung der Sequenzierung
 Auswertung der Sequenzierungsergebnisse
 Verfassen des Manuskripts in Zusammenarbeit mit N. Drieschner und J. Bullerdiek
73
3 ERGEBNISSE
GENES, CHROMOSOMES & CANCER 51:402–408 (2012)
Detection of PAX8–PPARG Fusion Transcripts in
Archival Thyroid Carcinoma Samples by
Conventional RT-PCR
Markus Klemke,1 Norbert Drieschner,1 Gazanfer Belge,1 Käte Burchardt,2 Klaus Junker,2 and Jörn Bullerdiek1*
1
Center for Human Genetics,University of Bremen,Bremen,Germany
Institute of Pathology,Clinical Center Bremen-Mitte,Bremen,Germany
2
The t(2;3)(q13;p25) occurs in a subgroup of follicular-patterned thyroid tumors and leads to a fusion of the genes encoding
for the thyroid-specific transcription factor paired box 8 (PAX8) and the peroxisome proliferator-activated receptor
gamma (PPARc). Although initially discovered in follicular carcinomas (FTC), the fusion transcripts were also detected in a
small fraction of follicular adenomas and rarely in follicular variants of papillary carcinomas (FV-PTC). In most RT-PCR
based studies, fresh or snap-frozen tissue samples were used. The aim of the present study was to develop a method for
the detection of chimeric PAX8–PPARG transcripts in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) thyroid tumor samples by
conventional RT-PCR. For this purpose, RNA from FFPE samples of 21 FTC, seven FV-PTC, and one bone metastasis
derived from an FTC was subjected to RT-PCR with subsequent gel electrophoretic separation of the products. Fusion
transcripts were detected in 2/21 primary FTC (9.5%) and in the bone metastasis, but they were undetectable in all seven
FV-PTC under investigation. The RT-PCR approach described herein allows to detect all known variants of PAX8–PPARG
fusion transcripts and is applicable to FFPE tissues. Thus, it can be used to screen archival thyroid tumor samples for the
C 2011 Wiley Periodicals, Inc.
V
gene fusion.
INTRODUCTION
Eleven years ago, a fusion of the genes PAX8
and PPARG resulting from the t(2;3)(q13;p25) was
described in follicular thyroid carcinomas (FTC)
(Kroll et al., 2000), and it was assumed that it might
be specific for FTC. However, in later studies, the
presence of PAX8–PPARG fusion transcripts was
reported in follicular adenomas (FA) as well.
Besides conventional cytogenetic analysis and fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the
translocation, RT-PCR is a commonly used
method for the detection of the fusion transcripts.
However, for most RT-PCR approaches published
so far intact RNA from fresh or snap-frozen tissues
is required and they cannot be performed on
degraded RNA isolated from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. In a recently
published approach, fluorescently labeled primers
were used in combination with high-resolution
fragment analysis (Algeciras-Schimnich et al.,
2010). Herein, we describe a method to detect chimeric PAX8–PPARG transcripts in RNA from
FFPE samples using a conventional RT-PCR with
gel electrophoretic separation of PCR products. Of
note, an additional sense primer for the detection
of a fusion transcript, which is not included in the
recently published RT-PCR based analysis of
PAX8–PPARG fusions in FFPE samples (Algeciras-
Schimnich et al., 2010) was used. Since there have
been reports on tumors harboring the PAX8–
PPARG rearrangement, which express this additional variant as the sole fusion transcript (Cheung
et al., 2003), it is important to include specific primers for this variant. Otherwise such tumors would
escape the RT-PCR based detection of the fusion.
The RT-PCR described in the present study offers
a reliable tool to screen archives of FFPE thyroid
tumors for the presence of PAX8–PPARG fusion
transcripts.
MATERIALS AND METHODS
Tissue Samples
FFPE tissue samples of two FA of the thyroid
that were recently described in detail (Klemke
et al., 2011) were used to ascertain the feasibility
of the RT-PCR approach for the detection of
PAX8–PPARG fusion transcripts. One tumor (Case
1) is known to express three different chimeric
*Correspondence to: Jörn Bullerdiek, Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG, 28359 Bremen,
Germany. E-mail: [email protected]
Received 21 April 2011; Accepted 20 November 2011
DOI 10.1002/gcc.21925
Published online 16 December 2011 in
Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com).
C 2011 Wiley Periodicals, Inc.
V
74
FTC
FTC (m. i.)
FTC (w. i.)
FTC (w. i.)
FTC (m. i.)
FTC (w. i.)
FTC (w. i.)
FTC (w.i.)
FTC (m.i.)
FTC (w.i.)
FTC (w. i.)
FTC
FTC (m.i.)
FTC (m.i.)
FTC (m.i.)
FTC (m.i.)
FTC (m.i.)
FTC (m.i.)
FTC (m.i.)
FTC (m.i.)
FV-PTC
FV-PTC
FV-PTC
FV-PTC
FV-PTC
FV-PTC
FV-PTC
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1.6
3.5
1.5
4.5
3.6
1.3
6.0
1.0
3.6
2.2
3.3
1.2
0.7
1.5
1.8
2.5
1.5
1.8
8.0
1.2
6.0
1.0
3.3
extensive
growth
2.8
2.0
5.5
3.7
2.5
3.0
Tumor size (cm)
66
23
48
63
46
65
72
58
41
35
74
47
38
50
33
24
39
41
61
53
53
68
62
81
37
66
67
36
25
69
Patient’s age
M
F
F
M
M
F
F
M
M
F
F
M
F
M
F
F
M
F
M
F
M
M
F
F
F
F
M
F
F
M
Sex
(0/12)
(0/2)
(0/15)
(0/14)
(0/50)
(0/24)
(0/13)
(0/14)
L0 V0 R0
R0
pMX R0
R0
pMX R0
pMX R0
R0
pN1a (1/20) R0
pN0 (0/30) R0
pN1a (3/26) pMX R0
pN0
pN0
pN0
pN0
pN0
pN0
pN0
pN0
(M)
N0 (0/44) pN0 pMX V1 RX
pN0 (0/3) pMX R0
pN0 (0/8) R0
pT1 pN1 (4/11) R0
pT3 pN1 (3/25) L1 V1 pMX R0
pT1
pT3
pT2
pT1
pT3
pT1
pT2
pT2
pT3
pT1
pT1
pT1
pT1
pT2
pT1
pT1
pT4
pT1
pT3 pNX pMX V1 R0
pT3 pN0 (0/17) pMX R1
pT2 pN0 (0/31) R0
pT4a pN1a (1/2) (pN1b) M1 (PUL) R1
pT2 pN0
pT1
pT3 pN1 (1/8) pM1
pT4
pTNM classification
Negative
Negative
7, 8, 9, 9 þ
10, 8 þ 10
Negative
Negative
Negative
Negative
8 (Detected in a bone
metastasis but not
in the primary tumor)
10
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
7, 8, 9
7, 10
Negative
PAX8 exons juxtaposed to PPARG
Regional lymph node
micrometastases
Regional lymph node metastases
Regional lymph node metastases,
vascular invasion
Regional lymph node metastasis
Bone metastasis at the time of
surgery, additional bone metastases after 2.0 and 2.4 years
Vascular invasion
Multiple lung metastases and
mediastinal lymphomas (at the
time of surgery)
Vascular invasion
Regional lymph node metastasis,
bone metastasis at the time of
surgery
Liver metastasis (1.5 years)
Bone metastases (3.7 and 5.6
years)
Remarks/clinical outcome
CHIMERIC PAX8-PPARG TRANSCRIPTS IN FFPE TISSUES
FA, follicular adenoma; FTC, follicular thyroid carcinoma; m.i., minimally invasive; w.i., widely invasive; FV-PTC, follicular variant of a papillary thyroid carcinoma.
FA
FA
FTC
Type of tumor
1
2
3
Case No.
TABLE 1. Clinicopathological Parameters of all Thyroid Tumors Included in the Present Study
3 ERGEBNISSE
403
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
75
3 ERGEBNISSE
404
KLEMKE ET AL.
TABLE 2. Sequences and Locations of the Primers Used for the Detection of the Positive Control (PAX8 exons 5 and 6) and the
PAX8–PPARG Fusion Transcripts
Primer
Sequence (50 –30 )
Location
Product length (bp)
E5
E6-as
E7
E8
E9
E10
PPARG-as
TCA ACC TCC CTA TGG ACA GC
GGA GTA GGT GGA GCC CAG G
CCG CTC GAG TGC CCA TTT GA
CCT CTC GAC TCA CCA GAC CT
GCC CTT CAA TGC CTT TCC CCA TG
AGC GGA CAG GGC AGC TAT GC
CCA AAG TTG GTG GGC CAG AAT
PAX8, exon 5
PAX8, exon 6
PAX8, exon 7
PAX8, exon 8
PAX8, exon 9
PAX8, exon 10
PPARG, exon 5
125
124
84
117
98
For the primers E7–E9 in combination with the PPARG specific antisense primer, the length of the shortest amplicon is indicated. All primer
sequences except primer E7 located in exon 7 of PAX8 were reported previously (Algeciras-Schimnich et al., 2010). as: antisense.
PAX8–PPARG transcripts consisting of exons 1–7,
1–8, and 1–9 of PAX8 juxtaposed to exon 5 (the
first coding exon) of PPARG. In the second tumor
(Case 2) two fusion transcripts consisting of exons
1–7 and 1–10 fused to PPARG were detected earlier. After the RT-PCR was established using the
FA samples, it was performed on 21 FTC as well
as on seven FV-PTC, which have not been karyotyped or analyzed by FISH previously. All carcinomas were diagnosed by routine histological
classification of hematoxylin and eosin stained tissue sections. In addition, a bone metastasis that
had developed in one FTC patient (Case 15) was
also included in the study. Clinicopathological parameters of the tumors included in the study are
given in Table 1.
RT-PCR
Six 5 lm sections of each tumor were deparaffinized with xylene and rehydrated with ethanol.
RNA was isolated with the RNeasy FFPE kit
(Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer’s instructions. In a total reaction volume
of 20 ll, 1 lg RNA was reverse transcribed with
M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen,
Darmstadt, Germany). The final concentrations
of the reaction components were as follows: 1
first strand buffer (50 mM Tris–HCl, 75 mM KCl,
3 mM MgCl2), 0.5 mM dNTPs (each) 2 U/ll
RNaseOUT recombinant ribonuclease inhibitor,
10 U/ll M-MLV reverse transcriptase, 10 mM dithiothreitol, and 7.5 ng/ll random hexamers. The
reaction tubes were incubated at 25 C for 10
min, at 37 C for 50 min, and finally at 70 C for
15 min.
In each PCR reaction, 4 ll of cDNA was used
as template. PCR was performed with 2.5 U
DreamTaq DNA polymerase (Fermentas, St.
Leon-Rot, Germany) per reaction in a total reaction volume of 25 ll with the following final con-
centrations: 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs
(each), and 0.1 lM sense as well as antisense
primer. The initial denaturation was performed at
95 C for 10 min followed by 41–43 cycles of
95 C for 30 sec, 65 C for 30 sec, and 72 C for 30
sec. The final extension was performed at 72 C
for 7 min.
The sequences of the primers used for the
detection of the positive control (exons 5–6 of
PAX8) and the different PAX8–PPARG transcripts
are given in Table 2. All primer sequences
except the sense primer in exon 7 of PAX8 were
published recently (Algeciras-Schimnich et al.,
2010). In contrast to the method described by
Algeciras-Schimnich et al. (2010), unmodified oligonucleotides were used in the present study.
PCR products were separated on 4% agarose gels
with 0.5 TBE buffer and stained with ethidium
bromide.
FISH
For the detection of rearrangements of the
PPARG gene, interphase-FISH (I-FISH) with a
PPARG break-apart probe (PanPath, Budel, Netherlands) was performed on FFPE tissue sections.
Pretreatment of 4 lm tissue sections was performed as described previously for FFPE tissue
sections (Hopman and Ramaekers, 2001) with a
few modifications. Digestion with a pepsin readyto-use solution (DCS, Hamburg, Germany) was
performed at 37 C for 2 30 min. Fifteen microliters of the PPARG break-apart probe was used
per slide. Co-denaturation was performed on a
ThermoBrite (Abbott Molecular, Wiesbaden,
Germany) for 5 min at 85 C followed by overnight hybridization in a humidified chamber at
37 C. Posthybridization was performed at 42 C
for 2 min in 0.4 SSC/0.3% NP-40. Interphase
nuclei were counterstained with DAPI (0.75 lg/
ml) and slides were examined with an Axioskop 2
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
76
3 ERGEBNISSE
CHIMERIC PAX8-PPARG TRANSCRIPTS IN FFPE TISSUES
405
plus fluorescence microscope (Carl Zeiss, Göttingen, Germany). Images were captured with a
high performance CCD-camera (Visitron Systems,
Puchheim, Germany) and were edited with FISH
View (Applied Spectral Imaging, Migdal HaEmek, Israel). 100 nonoverlapping nuclei from different (at least four) areas of the tumor were
scored.
RESULTS
Samples of two well characterized FA with
t(2;3)(q13;p25) were used to check the performance of the RT-PCR. PAX8–PPARG fusion transcripts were detected in both cases as reported
previously (Klemke et al., 2011). The gel electrophoretic separation of the PCR products (Fig. 1,
left) resulted in distinct bands for the positive
control as well as for fusions of exons 7, 8, 9, and
10 of PAX8 to PPARG. The identity of the PCR
products was confirmed by direct sequencing. In
the PCR with the forward primer located in
PAX8 exon 7 an additional longer band was visible. By sequencing of this PCR product, its origin
from the fusion of PAX8 exon 8 to PPARG was
shown.
The positive controls with primers located in
PAX8 exons 5 and 6 resulted in distinct bands
with an expected length of 125 bp in all 21 FTC
and 7 FV-PTC under investigation.
Of the 21 primary FTC screened for fusion
transcripts, two cases were positive (9.5%). The
first of them (No. 16) expressed only one type of
chimeric transcript in which exon 10 of PAX8 was
fused to PPARG. Several PCR products were visible in the second case (No. 10, Fig. 1, right).
Strong bands resulted from the PCRs with forward primers located in PAX8 exon 7 and 10,
respectively. Interestingly, the PCRs with forward
primers located in exons 8 and 9 resulted in weak
bands with the expected length of 84 and 117 bp,
but strong bands of a higher molecular weight
appeared in both cases. These PCR products
were sequenced directly, and the product generated with the forward primer in exon 9 also contained exon 10 of PPARG, the same variant that
was also detected with the forward primer in
exon 10. The longer product of the PCR with
the forward primer located in exon 8, however,
indicated the presence of an additional transcript
variant. Sequencing revealed a fusion of exon 10
to PPARG as well, while exon 9 was completely
deleted in this case.
Figure 1. Gel electrophoretic separation of RT-PCR products
using RNA templates extracted from FFPE samples of two adenomas
(left, E7–E9 from Case 1, E10 from Case 2) and one follicular carcinoma (right, Case 10). M: Fragment length marker (GeneRuler Low
Range DNA Ladder, Fermentas, St. Leon-Rot, Germany), N: no template control, P: positive control (PAX8 exons 5 and 6). Lanes E7–
E10: PCR with primers specific for PAX8–PPARG fusion transcripts.
The names of the forward primers used in combination with the
reverse primer (PPARG-as) are indicated above the lanes (see also Table 2). Asterisk: the fusion transcript in which PAX8 exon 8 is juxtaposed to PPARG is also detected with a primer located in exon 7
(product length: 245 bp). Triangles: weak bands in the RT-PCR with
RNA from a follicular carcinoma corresponding to PAX8 exon 8 and
9 joined to PPARG. The longer PCR products in this case correspond
to PAX8 exons 8 þ 10 (E8, 186 bp) and 9 þ 10 (E9, 219 bp) juxtaposed to PPARG.
A bone metastasis derived from a follicular carcinoma (Case 15) was also analyzed, and a chimeric transcript consisting of PAX8 exon 8
juxtaposed to PPARG was detected. Two samples
of the primary tumor, which was multifocal, were
available for RT-PCR, but chimeric transcripts
were detected in neither of them. Therefore, this
case was regarded as negative when calculating
the frequency of the rearrangement.
To verify the results obtained by RT-PCR, IFISH with a PPARG break-apart probe was performed on FFPE sections. In Case no. 10, 79/100
nuclei showed one co-localized signal corresponding to the unaffected chromosome 3 and split red
and green signals, indicating a translocation targeting PPARG (Fig. 2) in accordance with the
positive PCR result. In a second follicular carcinoma with positive PCR result (No. 16), FISH
revealed a break affecting the PPARG locus in
only 1/100 nuclei. In case of the bone marrow
metastasis (Case No. 15), FISH did not result in
appropriate signals.
DISCUSSION
In all 28 FFPE samples under investigation,
the positive control was successfully amplified
indicating a sufficient quality of all RNA samples
for RT-PCR analysis. Using FFPE tissue samples
of two FA for which the presence of PAX8–
PPARG fusion transcripts was shown previously,
it was possible to detect the transcripts by
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
77
3 ERGEBNISSE
406
KLEMKE ET AL.
Figure 2. I-FISH with a PPARG break-apart probe on an FFPE section of Case 10. A rearrangement of PPARG is indicated by a split of
the PPARG break-apart probes. The nonrearranged region appears as
a red/green fusion signal. Two nuclei with aberrations affecting PPARG
are visible (upper left and lower right corner).
RT-PCR. Thus, it was demonstrated that conventional RT-PCR is suitable for the detection of
chimeric PAX8–PPARG transcripts in FFPE tissue samples.
Of the 21 FFPE tissue samples from FTC,
fusion transcripts were found in two cases. One
of them (Case 16) expressed only one transcript
variant, but in the second case (No. 10) five different variants were detected. Exons 7, 8, 9, and
10 of PAX8 were juxtaposed to PPARG in this
case, and the fusion of exon 10 occurred with as
well as without a complete deletion of exon 9.
Partial deletions of exon 9 that have been
reported in previous studies (Marques et al.,
2002) were not found. Of note, this second case
of FTC was a rather large tumor with a diameter
of 6.0 cm and did not only show capsular invasion
but was angioinvasive as well. It is tempting to
speculate that the transcript with exon 10 of
PAX8 juxtaposed to PPARG accompanied by a
deletion of exon 9, which was not observed in
any other of the cases, contributes to aggressiveness of thyroid tumors. While exons 10 and 11 of
PAX8 encode an activating domain of the protein,
an inhibitory domain is encoded by exon 9, which
is rich in proline, serine, and threonine residues
(PST domain). It has been demonstrated that removal of this domain results in a strong increase
in the transactivating potential of the corresponding protein (Poleev et al., 1995, 1997). Likewise,
a PAX8–PPARc fusion protein lacking the region
encoded by PAX8 exon 9 but containing the
transactivating domain encoded by exon 10 may
as well exhibit a strong transactivating potential
due to the lost repression of function of the activating domain. Further studies are required to
elucidate whether tumors expressing fusion transcripts with partial or complete deletions of exon
9 exhibit a more aggressive behavior in general.
Regardless of whether fusion proteins lacking the
domain encoded by exon 9 of PAX8 display a significant but as yet unknown effect, this second
case is an unusual tumor, because the presence
of five different fusion transcripts in a single carcinoma is a rare finding and may account for the
aggressiveness of the tumor.
The incidence of the rearrangement observed
in our series of FTC (9.5%) is relatively low
when compared with the average rates observed
by other investigators. However, similarly low
rates were also reported in some studies. In a
study by Aldred et al. (2003), the fusion transcripts were detected by RT-PCR in 2/19 cases
of FTC (10.5%). The authors discussed the possibility of a geographical variation in the incidence
of the translocation among FTC but could not
confirm this hypothesis. Instead, they speculated
that the frequency of the translocation may be
generally lower than reported in earlier studies.
As in the present study, their FTC samples were
collected in a German Hospital. Considered together, these results indicate that at least in Germany, the gene fusion is less common in FTC.
Interestingly, a chimeric PAX8–PPARG transcript was detected in a bone metastasis originating from an FTC (Case 15) located in the lower
jaw of the patient. In this case, PAX8 exon 8 is
juxtaposed to PPARG. Samples of the primary tumor located in the thyroid were also analyzed by
RT-PCR, but no chimeric transcript was found.
The tumor was multifocal, and unfortunately the
available FFPE samples did not cover all foci.
Thus, the bone metastasis is likely to originate
from one of the nodules unavailable for RT-PCR
analysis.
All seven FFPE tissue samples from FV-PTC
under investigation were negative with respect to
chimeric PAX8–PPARG transcripts. This observation is in good agreement with previous work
because fusion transcripts have been detected by
RT-PCR in only two FV-PTC cases so far (Castro et al., 2006).
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
78
3 ERGEBNISSE
CHIMERIC PAX8-PPARG TRANSCRIPTS IN FFPE TISSUES
407
Figure 3. Four variants of PAX8–PPARG fusion transcripts. Exons 8
(B), 9 (C), and 10 (D) are fused in-frame to PPARG (Kroll et al.,
2000). A fourth transcript variant with exon 7 juxtaposed to PPARG
described later (Marques et al., 2002; Cheung et al., 2003) is not
translated into a fusion protein (A). Due to a premature stop codon,
it is translated into a truncated PAX8 protein. The start codon of
PPARG is underlined and the fusion junctions are indicated by vertical
lines.
The rearrangement affecting chromosome band
3p25 was also detected by I-FISH in the tumor
in which multiple fusion transcripts were
detected (No. 10). In this case, the rate of translocation-positive nuclei was high (79%). In a tumor expressing a single fusion transcript variant
(No. 16), the chromosomal translocation was
detected in only 1/100 nuclei by FISH. By FISH
alone this case would be scored as negative for a
PPARG rearrangement because the fraction of
positive nuclei is below the detection limit. However, a small fraction of cells harboring the translocation and expressing PAX8–PPARG fusion
transcripts seems to be sufficient to induce positive RT-PCR signals and could thus lead to discrepant results between both methods. Moreover,
the paucity of positive cells may indicate that in
this case the rearrangement had occurred as a
secondary event.
Recently, the detection of PAX8–PPARG transcripts by a four-color RT-PCR assay and automated high-resolution fragment analysis was
reported (Algeciras-Schimnich et al., 2010). We
were able to demonstrate that fusion transcripts
in RNA from FFPE samples can also be successfully amplified by conventional RT-PCR and
visualized by standard gel electrophoresis with
ethidium bromide staining without the use of fluorescently labeled primers and capillary electrophoresis. We identified one FTC expressing five
variants, but often only a single transcript variant
can be detected. In the study by AlgecirasSchimnich et al. (2010), no primer located in
exon 7 of PAX8 was used, although fusion transcripts consisting of exons 1–7 joined to PPARG
were described earlier (Marques et al., 2002;
Cheung et al., 2003). Thus, translocation-positive
tumors would escape detection by the RT-PCR
assay if they would express a transcript consisting
of PAX8 exons 1–7 fused to PPARG exclusively.
Therefore, we have designed an additional
primer with a binding site in exon 7 and were
able to detect the transcript with exon 7 of PAX8
as the fusion partner in adenomas as well as in
one follicular carcinoma. The use of primers specific for all known chimeric PAX8–PPARG transcripts is recommended, because a given tumor
may express any one of them as the sole fusion
transcript. Unlike the three transcripts described
by Kroll et al. (2000), no fusion protein is
encoded by the transcript in which exon 7 is
joined to PPARG. While exons 8, 9, and 10 are
fused in-frame to their partner, the fusion of
exon 7 induces an early stop codon directly after
the junction and results in a truncated PAX8 protein (Fig. 3).
In summary, it was demonstrated that conventional RT-PCR is feasible and well-suited for the
detection of chimeric PAX8–PPARG transcripts in
FFPE samples as well. The RT-PCR was performed on FFPE samples of 28 follicular-patterned thyroid tumors. Whereas no fusion was
detectable in seven cases of FV-PTC, fusion
transcripts were detected in 9.5% of FTC. To
detect all known variants of fusion transcripts,
the RT-PCR described in the present study uses
an additional forward primer located in exon 7 of
PAX8. Since it is applicable to partially degraded
RNA from FFPE tissues, our approach enables
the RT-PCR based detection of PAX8-PPARG
fusion transcripts in archival thyroid tumor samples, which are more easily available than fresh or
cryopreserved tissues.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank Caroline Zeiser for excellent technical assistance.
Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
79
3 ERGEBNISSE
408
KLEMKE ET AL.
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Genes, Chromosomes & Cancer DOI 10.1002/gcc
80
3 ERGEBNISSE
3.4 Vergleichende molekulargenetische Untersuchungen benigner mesenchymaler
und maligner epithelialer Tumoren
Eine auf Microarrays basierende Untersuchung von Schilddrüsentumoren bestätigte, daß
HMGA2 zwischen Adenomen und Karzinomen differentiell exprimiert wird (Prasad et al.,
2008). Von allen darin erfaßten Genen wird HMGA2 am stärksten in malignen Schilddrüsentumoren überexprimiert. An fünfter Position in der Liste der überexprimierten Gene folgt das
„pleomorphic adenoma gene 1“ (PLAG1), das für einen sieben Zink-Finger-Domänen beinhaltenden Transkriptionsfaktor mit karboxyterminaler Transaktivierungsdomäne kodiert. Es
wird vornehmlich in fötalen Geweben exprimiert (Kas et al., 1997; Kas et al., 1998) und ist in
die Entwicklung von pleomorphen Speicheldrüsenadenomen (Kas et al., 1997), Lipoblastomen (Hibbard et al., 2000), Hepatoblastomen (Zatkova et al., 2004), pädiatrischen, gastrointestinalen Stromatumoren (GIST, Agaram et al., 2000) und seltenen Fällen von chronischer
lymphatischer Leukämie involviert (CLL, Pallasch et al., 2009). Pleomorphe Speicheldrüsenadenome lassen sich zytogenetischen Gruppen zuordnen, wobei am häufigsten chromosomale Aberrationen der Bande 8q12 und der Region 12q14~15 vorkommen (Sandros et al.,
1990; Bullerdiek et al., 1987; Bullerdiek et al., 1988; Bullerdiek et al., 1989). PLAG1 ist in der
chromosomalen Bande 8q12 lokalisiert (Kas et al., 1997; Kas et al., 1998), die in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen von rekurrenten Rearrangierungen betroffen ist (Stenman et al., 1984; Sandros et al., 1990; Bullerdiek et al., 1993). In der Regel tritt in pleomorphen Adenomen der Speicheldrüse mit dieser chromosomalen Aberration eine PLAG1-Aktivierung auf, zu der es allerdings auch ohne 8q12-Veränderung kommen kann (Åström et al.,
1999). Obwohl 8q12- und 12q14~15-Veränderungen nicht gemeinsam in Speicheldrüsenadenomen auftreten (Sandros et al., 1990; Bullerdiek et al., 1987; Bullerdiek et al., 1988;
Bullerdiek et al., 1989), kann in ca. 40 % (2/5) der Tumoren eine simultane Aktivierung von
PLAG1 und HMGA2 festgestellt werden (Åström et al., 1999). Die Erkenntnisse aus Untersuchungen von pleomorphen Speicheldrüsenadenomen in Verbindung mit der von Prasad et
al. (2008) berichteten Überexpression beider Gene in Schilddrüsenkarzinomen warfen die
Frage auf, ob beide Gene Teil eines gemeinsamen Signaltransduktionsweges sein könnten.
Daher wurde zunächst die Expression beider Gene in Schilddrüsentumoren eingehender untersucht. Da es außerdem Hinweise auf eine verstärkte PLAG1-Expression in Uterus-Leiomyomen gab (Åström et al., 1999), wurde eine Quantifizierung der Expression beider Gene
auch in Myomgeweben durchgeführt, wobei sowohl Myome mit normalem Karyotyp als auch
Tumoren mit chromosomalen Veränderungen der Region 12q14~15 eingeschlossen wurden.
Letztere zeichnen sich durch eine starke HMGA2-Aktivierung aus, so daß auch eine erhöhte
PLAG1-Expression zu erwarten wäre, wenn PLAG1 in einer Signalkaskade HMGA2 nachgeschaltet und somit ein (direktes oder indirektes) Zielgen von HMGA2 ist.
81
3 ERGEBNISSE
3.4.1 Correlated expression of HMGA2 and PLAG1 in thyroid tumors, uterine
leiomyomas and experimental models (Klemke et al., 2014)
Die Expression der Gene HMGA2 und PLAG1 wurde in 37 Schilddrüsentumoren quantifiziert, wobei es sich in 14 Fällen um Adenome und in den übrigen 23 Fällen um Karzinome
handelte. Wie bereits zuvor gezeigt, konnte in der Regel eine starke HMGA2-Expression in
Karzinomen festgestellt werden, wohingegen das Expressionslevel in Adenomen geringer
war. In allen sieben untersuchten klassischen papillären Karzinomen wurde eine im Vergleich zu den Adenomen deutlich erhöhte HMGA2-Expression festgestellt. Allerdings wurde
HMGA2 nur in sieben von 13 untersuchten follikulären Karzinomen überexprimiert.
Die erhöhte HMGA2-Expression in den klassischen papillären Karzinomen wurde in allen
sieben Fällen von einer hohen PLAG1-Expression begleitet. In der Gruppe der follikulären
Karzinome korrelierten die HMGA2- und PLAG1-Expressionen ebenfalls stark. Nur in einem
der fünf FTCs ohne HMGA2-Aktivierung war eine leicht verstärkte PLAG1-Expression erkennbar, und in sechs von sieben follikulären Karzinomen mit hoher HMGA2-Expression
wurde auch PLAG1 stark exprimiert. Die Ergebnisse der relativen Quantifizierung aller 37
untersuchten Schilddrüsentumoren wurden herangezogen, um Spearmans Rangkorrelationskoeffizienten als Maß der Korrelation zwischen der HMGA2- und PLAG1-Expression zu
ermitteln. Da dieser Wert mit ρ = 0,82 (p < 0,0001) sehr hoch war, deuten die Ergebnisse auf
eine starke Abhängigkeit beider Meßgrößen voneinander hin.
Um den möglichen Zusammenhang zwischen beiden Genen weiter zu untersuchen, wurde
ihre Expression anschließend in 32 Uterus-Leiomyomen quantifiziert. Zytogenetischen Untersuchungen zufolge trugen 16 dieser Tumoren eine Rearrangierung des HMGA2-Locus
12q14~15. Fünfzehn dieser Fälle wiesen dementsprechend auch eine erhöhte HMGA2Expression auf. Ein Myom, auf das diese Beobachtung nicht zutraf, obwohl zytogenetisch
eine t(12;14)(q15;q24) erkennbar war, wurde einer FISH unterzogen, derzufolge der chromosomale Bruchpunkt nicht durch die Sonden flankiert wurde (Klemke et al., 2009). Von den 16
Uterus-Leiomyomen mit zytogenetisch normalem Karyotyp wiesen zwei Tumoren eine
HMGA2-Überexpression auf. Auch sie wurden deshalb mittels FISH untersucht, die in einem
Myom eine zytogenetisch nicht sichtbare Rearrangierung des HMGA2-Locus nachweisen
konnte (Markowski et al., 2010b). Durch die Kombination aus konventioneller Zytogenetik
und FISH mußte die Einordnung jeweils eines Tumors korrigiert werden. In allen 16 Leiomyomen mit einer Rearrangierung unter Beteiligung der Region 12q14~15 wurde eine stark
erhöhte HMGA2-Expression ermittelt, wohingegen in nur einem von 16 Myomen mit intaktem
HMGA2-Locus eine solche Überexpression festgestellt wurde, deren Ursache bislang nicht
aufgeklärt werden konnte.
82
3 ERGEBNISSE
Bei der Messung der PLAG1-Expression fiel auf, daß eine erhöhte HMGA2-Expression, die
in 17 Leiomyomen – eines davon ohne nachweisbare chromosomale Aberration der Region
12q14~15 – festgestellt worden war, stets auch mit einer erhöhten PLAG1-Expression einhergeht. Demgegenüber war in nur zwei von 15 Fällen ohne HMGA2-Rearrangierung und
-Überexpression eine Erhöhung der PLAG1-Aktivität festzustellen. In diesen beiden Fällen
wurden submikroskopische Rearrangierungen des PLAG1-Locus vermutet. Eines dieser
Myome wurde daher zusätzlich mit einer FISH unter Verwendung einer den PLAG1-Locus
überspannenden Bruchpunktsonde untersucht, jedoch lieferte auch die FISH keinen Hinweis
auf eine Rearrangierung im Bereich 8q12. Statistische Berechnungen bestätigten, daß die
Expressionslevel beider Gene auch in Uterus-Leiomyomen stark miteinander korrelieren.
Zur weiteren Aufklärung des Zusammenhangs von HMGA2- und PLAG1-Expression wurden
darüber hinaus zwei experimentelle Ansätze verfolgt. Adipöse mesenchymale Stammzellen
(ADSCs) wurden verwendet, um die HMGA2-Expression mit Hilfe des Proteins FGF1 zu stimulieren (Ayoubi et al., 1999). Zur Kontrolle wurde die HMGA2-Expression quantifiziert, und
erwartungsgemäß wurden nach 24, 48 und 72 Stunden im Vergleich zu unbehandelten
Zellen erhöhte Werte festgestellt. Auch die PLAG1-Expression war in mit FGF1 stimulierten
Zellen gegenüber nicht stimulierten ADSCs um das Zwei- bis Dreifache erhöht.
Im zweiten Experiment wurde die Mammakarzinom-Zellinie MCF7, die auch in anderen
Untersuchungen als Modell für Wirkungen von HMG-Proteinen diente (Baldassarre et al.,
2003; Mussnich et al., 2013), transient transfiziert. Dazu wurde ein eukaryotischer Expressionsvektor verwendet, in den die für HMGA2 kodierende Sequenz kloniert worden war. Die
Regulation durch einen Promotor des Zyotomegalie-Virus (CMV) gewährleistet eine starke
konstitutive HMGA2-Expression. Um den Erfolg der Transfektion zu überprüfen, wurde die
IGF2BP2-Expression quantifiziert, da IGF2BP2 (synonym: IMP2) bekanntermaßen von
HMGA2 reguliert wird (Brants et al., 2004; Cleynen et al., 2007). Die 24 bzw. 48 Stunden
nach der Transfektion ermittelte IMP2-Expression war sowohl gegenüber unbehandelten
Zellen als auch im Vergleich zu mit einem leeren Vektor ohne HMGA2-Insert transfizierten
Zellen deutlich erhöht. Ebenso konnte zu beiden Meßzeitpunkten ein Anstieg der PLAG1Expression konstatiert werden.
Schließlich wurde aus einer SELEX-Studie (Cui und Leng, 2007) die Nukleotidfolge 5’ AWAWTSSSSNWWWWT - 3’ als Konsensussequenz potentieller HMGA2-Bindestellen abgeleitet. Damit wurde im fünften Exon des PLAG1-Gens die Sequenz 5’ - ATATTGGCCT
ATAAT - 3’ (Accession No. NG_023310.1, Nukleotide 53615 - 53629) identifiziert, an die
eine Bindung von HMGA2 vorstellbar ist.
83
3 ERGEBNISSE
VIII.
Correlated expression of HMGA2 and PLAG1 in thyroid tumors,
uterine leiomyomas and experimental models.
Klemke M, Müller MH, Wosniok W, Markowski DN, Nimzyk R, Helmke BM, Bullerdiek J.
2014. PLoS ONE 9: e88126.
Eigenanteil:
 Durchführung der RNA-Isolierung sowie der relativen Quantifizierung der HMGA2- und
PLAG1-Expression und deren Auswertung
 Stimulation von ADSCs mit FGF1 mit D. Markowski, anschließend Quantifizierung der
HMGA2- und PLAG1-Expression
 Plasmidisolierung aus transformierten E. coli-Zellen mit M. Müller
 Transfektion der MCF7-Zellinie mit einem HMGA2-Expressionsvektor mit anschließender
Quantifizierung der IMP2- und PLAG1-Expression gemeinsam mit M. Müller
 Verfassen des Manuskripts in Zusammenarbeit mit J. Bullerdiek
84
3 ERGEBNISSE
Correlated Expression of HMGA2 and PLAG1 in Thyroid
Tumors, Uterine Leiomyomas and Experimental Models
Markus Klemke1, Marietta Henrike Müller1, Werner Wosniok2, Dominique Nadine Markowski1,
Rolf Nimzyk1, Burkhard Maria Helmke3¤, Jörn Bullerdiek1,4*
1 Center for Human Genetics, University of Bremen, Bremen, Germany, 2 Institute of Statistics, University of Bremen, Bremen, Germany, 3 Institute of Pathology, University
of Heidelberg, Heidelberg, Germany, 4 Institute for Medical Genetics, University of Rostock, University Medicine, Rostock, Germany
Abstract
In pleomorphic adenomas of the salivary glands (PASG) recurrent chromosomal rearrangements affecting either 8q12 or
12q14,15 lead to an overexpression of the genes of the genuine transcription factor PLAG1 or the architectural
transcription factor HMGA2, respectively. Both genes are also affected by recurrent chromosomal rearrangements in benign
adipocytic tumors as e. g. lipomas and lipoblastomas. Herein, we observed a strong correlation between the expression of
HMGA2 and PLAG1 in 14 benign and 23 malignant thyroid tumors. To address the question if PLAG1 can be activated by
HMGA2, the expression of both genes was quantified in 32 uterine leiomyomas 17 of which exhibited an overexpression of
HMGA2. All leiomyomas with HMGA2 overexpression also revealed an activation of PLAG1 in the absence of detectable
chromosome 8 abnormalities affecting the PLAG1 locus. To further investigate if the overexpression of PLAG1 is inducible by
HMGA2 alone, HMGA2 was transiently overexpressed in MCF-7 cells. An increased PLAG1 expression was observed 24 and
48 h after transfection. Likewise, stimulation of HMGA2 by FGF1 in adipose tissue-derived stem cells led to a simultaneous
increase of PLAG1 mRNA. Altogether, these data suggest that HMGA2 is an upstream activator of PLAG1. Accordingly, this
may explain the formation of tumors as similar as lipomas and lipoblastomas resulting from an activation of either of both
genes by chromosomal rearrangements.
Citation: Klemke M, Müller MH, Wosniok W, Markowski DN, Nimzyk R, et al. (2014) Correlated Expression of HMGA2 and PLAG1 in Thyroid Tumors, Uterine
Leiomyomas and Experimental Models. PLoS ONE 9(2): e88126. doi:10.1371/journal.pone.0088126
Editor: Jacques Emile Dumont, Universite Libre de Bruxelles (ULB), Belgium
Received August 23, 2013; Accepted January 6, 2014; Published February 7, 2014
Copyright: ß 2014 Klemke et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits
unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work was supported in part by a grant from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). No additional external funding was received for this
study. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
¤ Current address: Institute of Pathology, Elbe Klinikum Stade, Stade, Germany
certain fetal tissues [17,18]. Oncogenic activation of PLAG1 plays a
key role in the development of lipoblastomas [19], hepatoblastomas [20], chronic lymphocytic leukemia [21] as well as in pediatric
gastro-intestinal stromal tumors [22]. PLAG1 has been found to
bind the insulin-like growth factor gene (IGF-II) promoter and to
stimulate its activity [23–25].
Similar but not identical to what is seen in pleomorphic
adenomas both genes participate in the genesis of benign adipose
tissue tumors. Chromosomal translocations affecting 12q14,15
and targeting HMGA2 are a common finding in lipomas often as a
t(3;12)(q27;q14,15) [26,27]. In contrast, translocations of 8q12
are a recurrent cytogenetic deviation in lipoblastomas, i. e. rare
benign adipose tissue tumors of early childhood [19,28–30].
Interestingly, pleomorphic adenomas and lipoblastomas share the
most frequent type of this rearrangement, i.e. a simple reciprocal
translocation t(3;8)(p21;q12). Recently, an infantile lipoblastoma
with rearrangements of the HMGA2 locus has been described as
well [31]. These findings raise the question why transcriptional
activation of either of these two genes leads to the formation of
tumors as similar as lipomas and lipoblastomas. One likely
explanation is that they both act as part of a common pathway.
Besides pleomorphic adenomas and adipose tissue tumors, another
link between these two genes has recently emerged: in thyroid
tumors, the expression level of HMGA2 has been found to allow a
Introduction
The DNA-binding protein high mobility group AT-hook 2
(HMGA2) and the zinc finger protein PLAG1 share a common
role in the molecular pathogenesis of certain benign tumors, e. g.
of the salivary glands and of adipose tissue. Pleomorphic
adenomas are benign tumors of myoepithelial origin most often
located in the parotid glands. Based on the existence of clonal
chromosomal aberrations cytogenetic subtypes of pleomorphic
adenomas can be distinguished [1–3]. Of these, structural
rearrangements involving chromosomal regions 8q12 and
12q14,15 are most frequently observed. Both types of aberrations
seem to occur mutually exclusive [2,4–6] and appear to be causally
linked to the development of the disease. Though independently
related to the same histologic tumor entity, the target genes
rearranged by these aberrations encode proteins with different
functions. HMGA2 is located within the region 12q14,15 which is
frequently affected by chromosomal alterations [7–9] and encodes
a DNA-binding non-histone protein mainly expressed during
embryogenesis and in embryonic as well as in adult stem cells [10–
16]. PLAG1 (Pleomorphic adenoma gene 1) mapping to 8q12
encodes a genuine transcription factor encompassing seven zinc
finger domains and a carboxyterminal transactivation domain.
PLAG1 is developmentally regulated and highly expressed in
PLOS ONE | www.plosone.org
1
February 2014 | Volume 9 | Issue 2 | e88126
85
3 ERGEBNISSE
Transcriptional Activation of PLAG1
good discrimination between benign and malignant thyroid lesions
[32–35]. Likewise, Prasad et al. have recently studied the genomewide mRNA expression patterns of benign and malignant thyroid
tumors in a systematic approach aimed at the identification of
those genes best suited to distinguish between both types of thyroid
lesions. The expression of HMGA2 ranked at the first position
followed by Kallikrein 7 (KLK7), Mannose receptor, C type 2 (MRC2),
Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), and PLAG1 [36].
Because of the apparent relationship of HMGA2 and PLAG1 in
the molecular pathogenesis of salivary gland adenomas and
adipose tissue tumors, we also quantified and compared the
expression of HMGA2 and PLAG1 mRNA in thyroid adenomas as
well as in papillary and follicular thyroid carcinomas. To further
analyze the relationship between these two genes, we also
quantified the PLAG1 expression in 32 uterine leiomyomas (UL)
with as well as without 12q14 rearrangements. In addition, the
PLAG1 expression was quantified in adipose tissue-derived stem
cells (ADSCs) upon a stimulation of HMGA2 by FGF1. Furthermore, the MCF-7 breast cancer cell line, which has previously
been used as a model in transfection experiments aiming at the
functions of HMG proteins [37,38], was transiently transfected
with a eukaryotic expression vector encoding for wild-type
HMGA2 to evaluate whether PLAG1 can be transcriptionally
activated by HMGA2.
as follows: 2 min at 50uC and 10 min at 95uC followed by 50
cycles of 15 sec at 95uC and 1 min at 60uC.
Stimulation of HMGA2 Expression
Human adipose tissue-derived stem cells were obtained and
treated as described previously [16]. For stimulation with
fibroblast growth factor 1 (FGF1), cells were plated at a density
of 36105 cells/9.6-cm dish. After 24 hours the serum concentration was reduced to 1%. Another 24 hours later the medium was
replaced by serum-free medium supplemented with 25 ng/ml of
human recombinant FGF1 (Jena Bioscience, Jena, Germany).
Twelve, 24, and 72 hours after growth factor addition, cells were
harvested and total RNA was extracted. As controls cells were
cultured in medium 199 supplemented with 1% fetal bovine serum
(FBS) without FGF1.
Plasmid DNA Purification
Plasmid pCR3.1 containing the sequence coding for human
wild type HMGA2 as well as the empty vector serving as a control
(for generation of the vectors see [43]) were purified using the
NucleoBond Maxi Plus EF Kit (Macherey-Nagel, Düren,
Germany) according to the manufacturer’s instructions.
Cell Culture and Transfection of MCF-7 Cells
The cell line MCF-7 (breast cancer) was maintained in medium
199 (Life Technologies) supplemented with 20% FBS in an
incubator at 37uC and 5% CO2. When grown till confluence, cells
were passaged using TrypLE Express (Life Technologies). The day
before transfection, 150,000 cells were seeded in 6-well plates
(Nunc, Wiesbaden, Germany) in 2 ml medium 199 supplemented
with 20% FBS and allowed to attach for 24 h. Transfection
complexes were prepared in a total volume of 500 ml in serum free
medium 199 without antibiotics, 2.5 mg of the respective plasmid
DNA and 7 ml Lipofectamine LTX transfection reagent (Life
Technologies). A mock control treated with transfection reagent
only as well as a non-treated control were included for each
incubation period. During the formation of transfection complexes
(25 min at room temperature), old growth medium was replaced
by 2 ml fresh medium. Transfection complexes were then pipetted
drop-wise to the cells. After incubation for 24 h or 48 h, cells were
harvested in 350 ml RLT buffer (Qiagen) containing b-mercaptoethanol for RNA isolation using the RNeasy Mini Kit and
Qiacube (Qiagen). As a positive control, the expression of
IGF2BP2 (synonym: IMP2), which is known to be regulated by
HMGA2 [44,45], was quantified by qRT-PCR as described above
using the TaqMan Assay Hs00538956_m1 (Applied Biosystems).
Methods
Tissue Samples
Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples of 37 thyroid
tumors were classified histologically. Fourteen cases were classified
as follicular adenomas (FA), eleven tumors were diagnosed as
papillary carcinomas (PTC), and four of them were follicular
variants (FV PTC). The remaining twelve tumors were follicular
thyroid carcinomas (FTC). Cryopreserved tissue samples of 32
uterine leiomyomas that have been analyzed cytogenetically
[16,39–41], were also used for quantification of gene expression.
The karyotypes of the leiomyomas are given in supplementary
Table S1. Karyotype description followed ISCN 2009 [42].
RNA Isolation and Reverse Transcription
In case of thyroid tumors, RNA was isolated from six 5 mm
sections of FFPE tissues with the RNeasy FFPE kit (Qiagen,
Hilden, Germany). RNA from cryopreserved leiomyoma tissues as
well as from cultivated cells (ADSCs and MCF-7 cell line) was
isolated with the RNeasy Mini kit (Qiagen). Of each sample,
250 ng RNA was used for reverse transcription with M-MLV
reverse transcriptase and random hexamers (Invitrogen, Darmstadt, Germany) according to the manufacturer’s instructions.
Statistical Analysis
As a measure of association between the relative HMGA2 and
PLAG1 expression levels, Spearman’s rank correlation coefficient
was calculated using the data of all 37 thyroid tumor samples
analyzed. In addition, Pearson’s correlation coefficient was
calculated using the relative expression values as well as the
DCT values. In case of uterine leiomyomas, the expression levels of
both HMGA2 and PLAG1 were classified as high or low based on
the DCT values (HMGA2: ,0/$0, PLAG1: ,3/$3). The
agreement between the HMGA2 and the PLAG1 classes was then
quantified and tested by the kappa coefficient of agreement.
Quantitative Real-time RT-PCR (qRT-PCR)
Quantitative real-time RT-PCR was performed with the
TaqMan Universal PCR Master Mix on a 7300 Real-Time
PCR System (Applied Biosystems) as described elsewhere [32].
The relative quantification of the HMGA2 expression was
performed with the HMGA2-specific TaqMan assay
Hs00171569_m1 (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany).
For the detection of the endogenous control HPRT1, primers 59GGC AGT ATA ATC CAA AGA TGG TCA A-39 and 59-GTC
TGG CTT ATA TCC AAC ACT TCG T-39 were used in
combination with the HPRT1-specific hydrolysis probe 6FAMCAA GCT TGC TGG TGA AAA GGA CCC C-TAMRA. The
PLAG1 expression was quantified with the TaqMan assay
Hs00231236_m1 (Applied Biosystems). Reaction conditions were
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Ethics Statement
This study was conducted in accordance with the Declaration of
Helsinki [46] and the guidelines of the German National Ethics
Council [47]. In case of uterine leiomyomas, the use of tissue
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February 2014 | Volume 9 | Issue 2 | e88126
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3 ERGEBNISSE
Transcriptional Activation of PLAG1
samples taken from surgically removed tumors was approved by
the Ethics Committee of the Ärztekammer Bremen. Written
informed consent was obtained from all patients. For the
investigations on thyroid tumors, archival samples originally taken
for diagnostic purposes were used. All thyroid tumor samples were
used in previous studies [32,48].
Results
Expression of HMGA2 and PLAG1 in Adenomas and
Carcinomas of the Thyroid
The expression of HMGA2 and PLAG1 was quantified in 37
thyroid tumors. An adenoma with low expression of both genes
was chosen as calibrator for the relative quantification. The
highest relative HMGA2 expression observed in 14 follicular
adenomas was 17.4, whereas the expression levels in four FV PTC
ranged between 23.9 and 156.9. Even higher expression levels
ranging between 128.2 and 1207.5 were observed in seven PTC
(Fig. 1).
Based on their HMGA2 expression, two groups of follicular
thyroid carcinomas can be distinguished. Seven cases clearly
overexpressed HMGA2 with expression levels ranging between
33.3 and 478.3, whereas in five FTCs the HMGA2 expression was
within the range of adenomas (0.4 up to 5.73, Fig. 2).
The relative expression of PLAG1 ranged between 0.2 and 19.8
in follicular adenomas and was below ten in twelve of 14 cases
(Figs. 1 and 2). In the follicular variants of papillary carcinomas, it
ranged between 10.9 and 27.2, and in the classic variants of
papillary carcinomas, the PLAG1 expression ranged between 21.3
and 72.2. Akin to HMGA2, PLAG1 is also expressed at higher levels
in papillary carcinomas. In the subgroup of follicular carcinomas
without or with only slight HMGA2 overexpression, the PLAG1
Figure 2. HMGA2 expression in thyroid tumors. Box-whisker-plot
indicating the relative expression of HMGA2 (light gray) and PLAG1 (dark
gray) in five groups of thyroid tumors. Group 1: follicular adenomas
(n = 14), group 2: follicular variants of papillary carcinomas (n = 4), group
3: papillary carcinomas (n = 7), group 4: follicular thyroid carcinomas
without HMGA2 over-expression (n = 5), group 5: follicular thyroid
carcinomas with HMGA2 overexpression (n = 7). The asterisk marks an
outlier.
doi:10.1371/journal.pone.0088126.g002
expression levels ranged between 0.3 and 0.6 in four cases while
one case showed a slight overexpression (7.4). In contrast, PLAG1
was expressed at levels between 13.9 and 55.9 in six follicular
carcinomas overexpressing HMGA2. No overexpression of PLAG1
(0.9) was detected in only one FTC with high HMGA2 expression.
Figure 1. Relative expression of PLAG1 versus HMGA2 in 37 thyroid tumors. The calibrator sample for the quantification of both genes’
expression is a follicular adenoma. Open circle: follicular adenoma; full circle: follicular carcinoma; square: papillary carcinoma; triangle: follicular
variant of papillary carcinoma.
doi:10.1371/journal.pone.0088126.g001
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3 ERGEBNISSE
Transcriptional Activation of PLAG1
transfected either with the empty vector or with the vector
containing an insert encoding for wild-type HMGA2. qRT-PCR
revealed a strongly increased HMGA2 expression in the latter
(Fig. 5) indicating successful transfection. In addition, the
expression of IMP2 encoding for the insulin-like growth factor 2
mRNA binding protein 2 was quantified, because it is a known
target of HMGA2 [44,45]. Whereas no effect was apparent upon
transfection with the empty vector, IMP2 was clearly upregulated
upon transfection with the vector encoding for HMGA2.
Quantifications at both 24 and 48 h after transfection resulted in
a similar value of at least 4-fold IMP2 overexpression (Fig. 6).
Similar results were obtained for PLAG1, the expression of which
remained unaltered by the addition of transfection reagent alone
(‘‘mock’’) as well as after transfection with the empty vector. Cells
transfected with the vector containing the HMGA2 insert,
however, showed an approximately 2.8-fold increase in PLAG1
expression as compared to mock transfected cells 24 h as well as
48 h after transfection (Fig. 6).
Thus, as to the expression level of both genes a strong variation
was noted even within the group of malignant tumors. If an
alternative overexpression of either gene represents different
pathways of tumorigenesis one would expect no or even an
inverse correlation. On the other hand a correlation would
indicate their involvement in just one pathway. Spearman’s
correlation coefficient thus was calculated as a measure of
association between the HMGA2 and PLAG1 expression for all
37 tumor samples and resulted in a high value (r = 0.82, p,
0.0001) indicating that the expression of both genes is strongly
correlated in thyroid tumors. For reasons of comparison, Pearson’s
correlation coefficient was calculated and also indicates a strong
correlation when using the DCT values (r = 0.77, p,0.0001). Due
to the exponential transformation, the linear relationship is less
pronounced on the basis of relative gene expression values
(r = 0.44, p,0.001).
Expression of HMGA2 and PLAG1 in Uterine Leiomyomas
Recurrent rearrangements affecting the chromosomal band
12q14 are known to cause an overexpression of HMGA2 in uterine
leiomyomas. Therefore, UL (n = 32) were chosen to study a
presumable effect of HMGA2 on the PLAG1 expression. One
myoma with a normal 46,XX karyotype was chosen as calibrator
for the qRT-PCR data obtained for both genes.
Of 17 UL with known 12q14 rearrangement including case 646
without cytogenetically visible breakpoint but rearranged HMGA2
locus according to FISH [40], an overexpression of HMGA2 was
detected in 16 cases. In the remaining case without elevated
HMGA2 expression despite a cytogenetically
visible
t(12;14)(q15;q24) (no. 503) FISH revealed no rearrangement of
the HMGA2 locus [39].
Only 1/15 UL without cytogenetically detectable 12q14
aberration also showed an elevated HMGA2 expression. A hidden
rearrangement of HMGA2 was suspected but no evidence for such
a rearrangement was obtained by FISH (case 520).
The expression of PLAG1 was clearly elevated in all 17 UL
which overexpress HMGA2. In 15 UL with low HMGA2
expression, elevated levels of PLAG1 were detected in only two
cases (509 and 617, Fig. 3). Spearman’s rank correlation coefficient
was calculated for the expression of both genes and resulted in a
high value (r = 0.75, p,0.0001). Pearson’s correlation coefficient
also indicated a significant correlation when it was calculated
based on the DCT values (r = 0.85, p,0.0001). Similarly a high
and significant degree of agreement was found between the low/
high expression classification of samples obtained by both
parameters (kappa = 0.8735, 95% CI = (0.752, 1.000), see also
Table 1).
Discussion
Previous studies on pleomorphic adenomas of the salivary
glands have shown that PLAG1 is frequently overexpressed in
PASG with normal karyotype as well as with 12q14,15
abnormalities [50,51].
Akin to what has been described for PASG, the results of the
present study indicate that both genes are co-expressed in thyroid
tumors as well as in leiomyomas. In papillary carcinomas
(including follicular variants), both genes are expressed at higher
levels than in follicular adenomas. Follicular carcinomas with high
HMGA2 expression levels also express PLAG1 at elevated levels.
A correlation between chromosomal rearrangements affecting
the HMGA2 locus and the HMGA2 protein expression has been
shown in uterine leiomyomas [52]. Moreover, it has been shown
that in thyroid carcinomas the increased expression of HMGA2
and PLAG1 is detectable on the mRNA as well as on the protein
level [53]. Therefore, the correlation of HMGA2 and PLAG1
mRNA expression described herein is expected to reflect a
correlation at the protein level as well.
Besides the typical rearrangements involving chromosomal
band 8q12 including the most frequent t(3;8)(p21;q12), an
activation of PLAG1 in pleomorphic adenomas of the salivary
glands occurs also in tumors with 12q14,15 abnormalities lacking
8q12 aberrations [50]. Besides 13/17 tumors with an apparently
normal karyotype, 5/10 pleomorphic adenomas with 12q13,15
abnormalities were found to overexpress PLAG1. In the same
study, the PLAG1 expression was investigated in three UL, and two
cases were also found to overexpress PLAG1, but no cytogenetic
data were available for these three tumors.
These findings suggest alternative mechanisms of PLAG1
activation in tumorigenesis other than gene rearrangements. The
results presented herein point to HMGA2 as an upstream
regulator of PLAG1 and are additionally confirmed by the
correlation between the expressions of both genes in uterine
leiomyomas. An activation of HMGA2 in UL by 12q14 aberrations
is well known [7,39,54–56]. Therefore, we chose 15 UL with an
apparently normal karyotype or with chromosomal aberrations
affecting regions other than 12q14 and 17 cases with 12q14
aberrations to quantify the expression of PLAG1 and HMGA2
simultaneously. Of the 15 UL showing low HMGA2 levels, 13 also
showed low levels of PLAG1. The two remaining cases showed an
elevated PLAG1 expression despite a low HMGA2 mRNA
expression, thus pointing to mechanisms other than HMGA2
upregulation being responsible for PLAG1 activation. In pleomor-
Stimulation of HMGA2 Expression in ADSCs
To stimulate the expression of HMGA2 in ADSCs, FGF1 was
chosen because it is a known inducer of HMGA2 [49]. The relative
quantification revealed a 3.9-fold increase of the HMGA2 mRNA
level 24 h after the addition of FGF1. Simultaneously, the PLAG1
expression increased by 2-fold (Fig. 4). After 48 h, the HMGA2
level decreased only slightly, but a clear peak could not be
identified, because the highest level was observed after 72 h with a
4.2-fold increase. The expression of PLAG1 increased continuously
to a 2.9-fold expression 72 h after the addition of FGF1.
Transient Transfection of the MCF-7 Breast Cancer Cell
Line
The expression of HMGA2 in MCF-7 cells was quantified 24
and 48 h after transfection in mock transfected cells and in cells
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3 ERGEBNISSE
Transcriptional Activation of PLAG1
Figure 3. Relative expression of HMGA2 and PLAG1 in uterine leiomyomas. Open circle: HMGA2, full circle: PLAG1, cross: calibrator sample.
Green: the HMGA2 locus is not affected by rearrangement (n = 16), red: the HMGA2 locus is affected by rearrangement (n = 16). In two cases marked
with an asterisk, cytogenetic and FISH results differ. A t(12;14)(q15;q24) was visible in case 503, but FISH excluded a rearrangement of HMGA2. In case
646 FISH revealed a hidden rearrangement of HMGA2 [40].
doi:10.1371/journal.pone.0088126.g003
phic adenomas of the salivary gland cryptic, intrachromosomal 8q
rearrangements have been observed leading to a fusion of PLAG1
with CHCHD7 or TCEA1 [57]. Because the breakpoints are
located in the 59-noncoding regions of both fusion partners, these
fusions lead to an activation of PLAG1 by promoter swapping.
Similar events that escape detection by conventional cytogenetics
may have caused the upregulation of PLAG1 observed in two UL
without visible rearrangements affecting 8q12. In all 17 UL with
elevated HMGA2 levels a concomitant overexpression of PLAG1
was noted. The fact that increased HMGA2 levels were always
linked to elevated PLAG1 levels suggests HMGA2 as an activator
of PLAG1. Because no chromosomal rearrangements affecting
8q12 were present in these 17 UL, we assumed that elevated
HMGA2 levels caused by 12q14 abnormalities trigger the
activation of PLAG1. In turn, HMGA2 may exert its stimulating
effect on the growth of UL with 12q14 aberrations [54] at least in
part by activating PLAG1, which was shown to possess transactivating capacity [18] and is able to activate downstream target
genes like IGF-II.
The observation that FGF1-stimulated expression of HMGA2 is
accompanied by increased PLAG1 expression levels (Fig. 4), further
supports the hypothesis that HMGA2 exerts a PLAG1-activating
function. Likewise, transient overexpression of HMGA2 using an
appropriate vector is sufficient to trigger an upregulation of
PLAG1. Although factors beside HMGA2 may be involved in the
upregulation of PLAG1, comparable to the cooperation between
HMGA2 and NF-kB in the transcriptional activation of the IFN-b
gene IFNB1 [58,59] or IMP2 [44,45], the HMGA2 expression
vector alone was sufficient to exert an activating effect not only on
the known HMGA2 target IMP2 but also on PLAG1.
In conclusion, it has been shown that PLAG1 overexpression in
thyroid carcinomas as well as in uterine leiomyomas with
aberrations affecting the chromosomal region 12q14,15 strongly
correlates with the overexpression of HMGA2. The increased
expression levels of both genes upon stimulation of ADSCs with
FGF1 and particularly the upregulation of PLAG1 upon introduction of an HMGA2 expression vector into the MCF-7 cell line
strongly suggest that PLAG1 is regulated by HMGA2 and that
histologic similarities observed between benign tumors with either
Table 1. Case numbers of uterine leiomyomas assigned to
high vs. low gene expression classes according to DCT values.
HMGA2 expression
PLAG1 expression
Low (DCT $3)
High (DCT ,3)
Low (DCT $0)
n = 13
n=2
High (DCT ,0)
n=0
n = 17
Figure 4. Relative expression of HMGA2 and PLAG1 in ADSCs
after stimulation with FGF1. Light gray: HMGA2, dark grey: PLAG1.
Expression levels were measured before and 24, 48 and 72 h after
stimulation with the FGF1 protein.
doi:10.1371/journal.pone.0088126.g004
doi:10.1371/journal.pone.0088126.t001
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3 ERGEBNISSE
Transcriptional Activation of PLAG1
Figure 6. Relative expression of IMP2 and PLAG1 in MCF-7 cells
transfected with an HMGA2 expression vector. Light gray: IMP2,
dark grey: PLAG1. The gene expression was measured 24 h (1) and 48 h
(2) after transfection. The expression level of mock-transfected cells
24 h after transfection was used as calibrator. U: untreated cells, M:
mock-transfected cells (transfection reagent only), E: cells transfected
with the empty expression vector, I: cells transfected with the
expression vector containing the insert encoding for HMGA2.
doi:10.1371/journal.pone.0088126.g006
Figure 5. Relative expression of HMGA2 in transiently transfected MCF-7 cells. The gene expression was measured 24 h (1) and
48 h (2) after transfection. U: untreated cells, M: mock-transfected cells
(transfection reagent only), E: cells transfected with the empty
expression vector, I: cells transfected with the HMGA2 expression vector.
doi:10.1371/journal.pone.0088126.g005
rearrangements of the HMGA2 or the PLAG1 locus result from
activation within the same pathway.
Author Contributions
Supporting Information
Conceived and designed the experiments: MK JB. Performed the
experiments: MK MHM DNM. Analyzed the data: MK WW RN
BMH. Contributed reagents/materials/analysis tools: BMH. Wrote the
paper: MK JB.
Table S1 Karyotypes of all 32 uterine leiomyomas.
(DOC)
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7
February 2014 | Volume 9 | Issue 2 | e88126
91
3 ERGEBNISSE
Supplementary Table S1: Karyotypes of all 32 uterine leiomyomas.
unaffected by the rearrangement according to FISH
[39]
.
2)
1)
HMGA2 is
FISH revealed a hidden
rearrangement of HMGA2 [40].
Case
Karyotype
503.1 1)
46,XX,inv(5)(q15q31~33),t(12;14)(q15;q24)[13]
509.1
46,XX[14]
514.1
46,XX[17]
520.1
46,XX[7]
523.1
45,XX,t(12;14)(q15;q24),der(14)t(12;14)(q15;q24),-22[8]
527.1
46,XX[10]
529.2
46,XX[14]
533.1
46,XX,r(1),t(1;12;14)(p36.3;q14;q24)[19]
535.1
47,XX,+10[2]/46,XX[10]
536.4
46,XX[11]
539.3
46,XX[9]
541.1
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[5]/46,XX[9]
545.1
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[9]/46,XX[3]
552.2
46,XX,t(2;12)(q33;q13)[17]
556.1
46,XX,t(3;5;12)(q23~25;p13~15;q13~15)[11]/45,XX,idem,-22[10]
558.1
46,XX[13]
579.1
46,XX,t(12;15;14)(q15;q26;q24)[20]
92
3 ERGEBNISSE
Supplementary Table S1 (continued).
Case
Karyotype
580.1
46,XX,der(7)del(7)(p)del(7)(q),add(8)(q),add(10)(q),t(12;14)(q15;q24)[19]
612.1
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[13]/46,XX,der(1)r(1;2),t(12;14)(q15;q24)[4]
613.1
46,XX[15]
613.2
46,XX[15]
613.3
46,XX[16]
46,XX,der(1)del(1)(p22),der(3)?t(1;3)(p22;q?),der(5)del(5),der(12)t(12;?)
617.1
(q24.3;?),-14,-20,+mar1,+mar2[6]
628.2
46,XX,?ins(12;14)(q15;q31q24)[5]/46,XX[14]
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[12]/46,XX,del(4)(q31~q32),der(10),?t(10,14)
632.1
(q24;q32),t(12;14)(q15;q24)[9]
635.1
46,XX,der(10),del(12)(q13~q14)[18]
643.2
46,XX,t(12;14)(q15;q24)[14]
45,XX,r(1),der(13;14)(q10;q10)t(12;14)(q15;q24)[20]/44,XX,-1,der(13;14)
645.1
(q10;q10)t(12;14)(q15;q24)[6]
646.1 2)
46,XX,t(2;12)(p21;p13)[11]
653.1
46,XX[14]
654.1
46,XX[8]
46,XX,add(1)(p13),r(1)(?p36.3q25),add(7)(q22),der(10)t(1;10)(q25;q22),
677.3
der(12)add(12)(p11.2)add(q12),add(13)(q12)[20]/46,XX[3]
93
4 DISKUSSION
4 DISKUSSION
Eine Reaktivierung des HMGA2-Gens, die in vielen malignen Tumoren auftritt, trägt entscheidend zur Zelltransformation bei. Einige Mechanismen, über die HMGA2 sein onkogenes Potential entfalten kann, wurden mittlerweile aufgeklärt. Es steigert die Aktivität von E2F1
und AP-1 und induziert die Cyclin-A-Expression (Fedele et al., 2006b; Fedele et al., 2006c;
Vallone et al., 1997; Tessari et al., 2003). Des weiteren reguliert HMGA2 außerdem Gene,
die an der epithelial-mesenchymalen Transition mitwirken (Tan et al., 2012; Wu et al., 2011).
Bisherige Untersuchungen zur HMGA2-Reaktivierung in malignen epithelialen Tumoren
hatten Tumorentitäten wie beispielsweise Mammakarzinome (Rogalla et al., 1997) oder
Bronchialkarzinome (Rogalla et al., 1998b; Sarhadi et al., 2006; Meyer et al., 2007) zum
Gegenstand. Eines der Ziele der vorliegenden Arbeit war es daher, die Rolle von HMGA2 in
epithelialen Tumoren der Schilddrüse zu beleuchten (Belge et al., 2008). Daneben wurde
auch die Fusion der Gene PAX8 und PPARG, die als Marker für follikuläre Karzinome
diskutiert wurde, behandelt (Klemke et al., 2011; Klemke et al., 2012). HMGA2 ist aber nicht
nur in epithelialen Malignomen von Interesse, denn auch in benignen Tumoren mesenchymalen Ursprungs kann vor allem durch chromosomale Aberrationen eine Reaktivierung
auftreten, was in der vorliegenden Arbeit am Beispiel von Uterus-Leiomyomen berücksichtigt
wurde (Klemke et al., 2009; Klemke et al., 2010; Hashemi Nezhad et al., 2010). Schließlich
führte die Kombination aus Untersuchungen an Schilddrüsentumoren und Leiomyomen des
Uterus dazu, daß PLAG1 als ein potentielles, weiteres Zielgen von HMGA2 identifiziert
werden konnte (Klemke et al., 2014).
4.1 HMGA2 als Marker für Malignome der Schilddrüse
Es besteht ein großer Bedarf an molekularen Markern, die die Diagnostik von Neoplasien der
Schilddrüse bereits präoperativ unterstützen können. Zwar existieren molekulargenetische
oder immunhistochemische Marker für Tumorentitäten wie beispielsweise papilläre Karzinome, zur sicheren Identifizierung follikulärer Karzinome steht gegenwärtig jedoch kein Marker
zur Verfügung. Obwohl entsprechend zahlreiche Forschungsarbeiten durchgeführt wurden,
die die Identifizierung solcher Marker zum Ziel hatten, konnte bislang keiner der darin
vorgeschlagenen Kandidaten in der klinischen Praxis etabliert werden.
Eine verstärkte Expression des ansonsten überwiegend in der Embryonalentwicklung aktiven
Gens HMGA2 war bereits an verschiedenen malignen Tumoren epithelialen Ursprungs
beschrieben worden. Hierzu zählen unter anderem Sarkome (Berner et al., 1997), Mammakarzinome (Rogalla et al., 1997), Bronchialkarzinome (Rogalla et al., 1998b; Sarhadi et al.,
2006; Meyer et al., 2007), Pankreaskarzinome (Abe et al., 2003) sowie Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle (Miyazawa et al., 2004). Hinweise auf eine Rolle von HMGA2 auch bei
94
4 DISKUSSION
der Pathogenese von Karzinomen der Schilddrüse ergaben sich aus der Beobachtung, daß
die Inhibition der HMGA2-Expression die retroviral vermittelte, neoplastische Transformation
von Schilddrüsenzellen der Ratte supprimiert (Berlingieri et al., 1995). Allerdings inhibierte
die gegen HMGA2 gerichtete Antisense-cDNA auch die HMGA1-Expression, so daß nicht
ausgeschlossen werden konnte, daß die beobachtete Suppression der neoplastischen
Transformation auf das verwandte HMGA1 zurückging. Später zeigte sich, daß eine
HMGA2-abhängige transkriptionelle Aktivierung der Gene JUNB und FOSL1, deren Produkte
jun-B und FRA1 Bestandteil des AP1-Komplexes sind, Voraussetzung für die neoplastische
Transformation von Thyreozyten ist (Vallone et al., 1997; Battista et al., 1998). Nachdem
festgestellt worden war, daß HMGA2 für die Transformation in vivo nicht erforderlich ist
(Scala et al., 2001), dürfte das Interesse an HMGA2 im Zusammenhang mit Malignomen der
Schilddrüse jedoch gesunken sein. Stattdessen konzentrierte man sich auf HMGA1, dem
zuvor ebenfalls eine Rolle in der Tumorigenese der Schilddrüse zugeschrieben worden war
(Chiappetta et al., 1995; Chiappetta et al., 1998). In einer späteren Publikation wurde die Bedeutung von HMGA1 auch im Zusammenhang mit der AP1-Aktivierung betont (Berlingieri et
al., 2002). Schließlich postulierte man HMGA1 sogar als einen für follikuläre Karzinome
spezifischen Marker (Czyz et al., 2004). In nicht unerheblichem Maße dürfte eine an sieben
aus Schilddrüsenkarzinomen hervorgegangenen Zellinien durchgeführte Studie (Chiappetta
et al., 1995) dazu beigetragen haben, daß die HMGA2-Expression in Tumoren der Schilddrüse nicht vertieft untersucht wurde. In nur fünf dieser sieben Zellinien konnte eine HMGA2Expression mittels Northern und Western Blot nachgewiesen werden, weshalb man von
einer zu geringen Sensitivität von HMGA2 als Marker ausging. Es wäre jedoch vorstellbar,
daß eine HMGA2-Expression aufgrund einer zu geringen Sensitivität der durchgeführten
Blots in zwei Zellinien nicht detektiert werden konnte. Die weitaus sensitivere, quantitative
Real-Time RT-PCR war 1995 noch nicht verbreitet, und umfangreiche HMGA2-Expressionsanalysen mittels qRT-PCR an Schilddrüsentumoren waren noch nicht durchgeführt worden.
Laut Chiappetta et al. (1995) konnte in der Zellinie WRO das HMGA2-Protein nicht nachgewiesen werden, und im Northern Blot waren HMGA2-Transkripte „nahezu nicht detektierbar“.
Spätere Quantifizierungen mittels Real-Time RT-PCR ergaben dagegen, daß die WRO-Zelllinie eine relativ starke HMGA2-Expression aufweist (unveröffentlichte Ergebnisse). Zu
berücksichtigen ist außerdem eine potentielle Fehlidentifizierung von Zellinien. In der Zellinie
NPA, die aus einem papillären Schilddrüsenkarzinom hervorgegangen sein soll, konnte
weder mittels Northern noch mittels Western Blot eine HMGA2-Expression festgestellt
werden. In der Zellinie ARO, deren Ursprung in einem anaplastischen Schilddrüsenkarzinom
angenommen wurde, konnte zwar die mRNA nachgewiesen werden, dem Western Blot
zufolge ist allerdings nur eine sehr geringe Menge des HMGA2-Proteins vorhanden
(Chiappetta et al., 1995). Inzwischen ist bekannt geworden, daß diese Zellinien nicht wie
95
4 DISKUSSION
zuvor angenommen Schilddrüsengewebe entstammen. ARO ist demnach identisch mit der
Zellinie HT-29, bei der es sich um Zellen eines Kolonkarzinoms handelt. Ein ähnliches
Problem besteht mit der Zellinie NPA, in der keine HMGA2-Expression nachweisbar war. Sie
soll identisch sein mit einer Zellinie, die als MDA-MB-435S/M14 bezeichnet wird (Schweppe
et al., 2009). Auch diese Zellinie geht nicht auf ein Karzinom der Schilddrüse sondern auf ein
Melanom zurück, was das negative Resultat von Chiappetta et al. (1995) erklären kann.
Außerdem muß hinterfragt werden, inwieweit die aus Untersuchungen an Zellkulturen
stammenden Ergebnisse auf Tumoren in vivo übertragbar sind. Mehrere Untersuchungen an
Uterus-Leiomyomen haben gezeigt, daß Rearrangierungen der chromosomalen Region
12q14~15 mit einer Überexpression von HMGA2 korrelieren. Daher überraschten Genexpressionsanalysen, die nach Kultivierung der aus solchen Myomen stammenden Zellen
durchgeführt worden waren. Es war ein zum Teil drastischer Rückgang der HMGA2Expression in vitro zu verzeichnen, so daß sich die Expressionslevel von Zellen mit
rearrangiertem und unverändertem HMGA2-Locus einander annäherten (Markowski et al.,
2010b). Daher stellt sich auch für die Tumoren der Schilddrüse die Frage, ob die in einem in
vitro-System erhaltenen Ergebnisse auch für Tumoren in vivo repräsentativ sein können. Die
deutliche Abnahme der HMGA2-Expression bei Kultivierung von Myomen mit Aberration der
chromosomalen Region 12q14~15 spricht eher für eine begrenzte Aussagekraft der an
Zellkulturen durchgeführten Messungen, zumal auch bei Kultivierung von Thyreozyten mit
Veränderungen zu rechnen ist. Manche Schilddrüsen-Zellinien scheinen unabhängig von
ihrem Ursprung den undifferenzierten Tumoren genetisch ähnlicher zu sein. Zudem haben
viele Zellinien die Fähigkeit zur Expression schilddrüsenspezifischer Gene verloren (Pilli et
al., 2009). Was immunhistochemische Untersuchungen betrifft, so ist aus der Familie der
HMGA-Proteine vornehmlich HMGA1 untersucht worden. In älteren Veröffentlichungen spielt
dabei sicherlich auch eine Rolle, daß gegen HMGA1 gerichtete Antikörper früher verfügbar
waren als HMGA2-spezifische (Fusco und Fedele, 2007).
Aus mehreren Gründen erschien folglich eine umfangreichere Quantifizierung der HMGA2Expression in humanen Schilddrüsentumoren als sinnvoll. Hierzu wurden formalinfixierte
Gewebeproben von nicht-malignen Läsionen der Schilddrüse ebenso verwendet wie von 40
Karzinomen, darunter neun follikuläre Karzinome. Während in benignen Läsionen in der Regel keine oder allenfalls eine leichte Erhöhung der HMGA2-Expression zu beobachten war,
exprimierten nahezu alle Karzinome HMGA2 stark (Belge et al., 2008). Lediglich für je ein
follikuläres und ein papilläres Karzinom galt dies nicht, so daß eine Sensitivität von über
96 % erreicht wurde. Zu bedenken ist außerdem, daß die zur Quantifizierung herangezogene
RNA aus kompletten Gewebeschnitten erfolgte, die neben Karzinomanteilen auch Schilddrüsenparenchym enthielten, so daß die Eindeutigkeit der Resultate nach Durchführung einer
Mikrodissektion gesteigert werden könnte. Darauf wurde zugunsten eines immunhistochemi-
96
4 DISKUSSION
schen Nachweises des HMGA2-Proteins in ausgewählten Fällen verzichtet. Die Überexpression in den Karzinomen konnte auch auf Proteinebene bestätigt werden (Belge et al., 2008).
Nach Veröffentlichung dieser Ergebnisse wurden weitere Studien zur HMGA2-Expression in
Tumoren der Schilddrüse publiziert. Der Vergleich zwischen quantitativer Real-Time RT-PCR
und immunhistochemischem HMGA2-Nachweis bestätigte zwar die Beobachtung, daß Karzinome generell eine erhöhte HMGA2-Expression aufweisen, führte aber auch zu dem Schluß,
daß die qRT-PCR zur Abgrenzung maligner und benigner Tumoren besser geeignet ist als
die immunhistochemische Färbung (Chiappetta et al., 2008). In einer weiteren Veröffentlichung wurde die bereits beschriebene Überexpression neben qRT-PCR und Immunhistochemie auch mittels Western Blot bestätigt (Prasad et al., 2008). In zwei weiteren Arbeiten, in
denen nicht nur formalinfixierte Gewebe, sondern auch zytologische Präparate verwendet
wurden, konnte gezeigt werden, daß diese Erkenntnisse auch auf Präparate übertragbar
sind, die durch Feinnadelpunktionen von Schilddrüsentumoren gewonnen wurden (Lappinga
et al., 2010; Jin et al., 2011).
Intensive Bemühungen anderer Arbeitsgruppen führten dazu, daß zahlreiche potentielle
Marker vorgeschlagen wurden. Ein Beispiel hierfür ist FHL1, das in follikulären Karzinomen
weniger stark als in Adenomen exprimiert wird, wobei dieser Unterschied statistisch signifikant ist (Fryknäs et al., 2006). Dennoch ist der Umstand problematisch, daß in den Expressionsstärken zwischen beiden Tumorentitäten ein großer Überlappungsbereich existiert, so
daß eine Dignitätsbewertung einzelner Tumoren trotz statistisch signifikanter Unterschiede
ausschließlich mit Hilfe der FHL1-Expression in den meisten Fällen nicht möglich sein dürfte.
Im Unterschied dazu wird HMGA2 in Adenomen und follikulären Karzinomen nicht nur signifikant unterschiedlich exprimiert, sondern es kommt in diesen Tumoren auch kaum zu Überschneidungen der Expressionsstärke. Daher läßt sich nach Untersuchung einer ausreichend
großen Fallzahl höchstwahrscheinlich ein Schwellwert festlegen, der die Zuordnung zu einer
der beiden Gruppen mit großer Sicherheit erlaubt. Besonderes Augenmerk muß dabei auf
follikuläre Karzinome gerichtet werden, die keine erhöhte HMGA2-Expression aufweisen.
Diese Fälle dürften zwar eine Minderheit darstellen, ihre Existenz ist aber weitgehend gesichert. Da in der klinischen Praxis falsch-negative Bewertungen follikulärer Neoplasien weitestgehend minimiert werden müssen, kann eine Ergänzung in Form eines oder mehrerer
zusätzlicher Marker erforderlich werden. Von diesen wenigen Ausnahmefällen abgesehen
bietet HMGA2 gegenüber FHL1 aber den Vorteil, daß auch eine Einzelmessung zur Dignitätsbewertung herangezogen kann, da dieses Gen auch als alleiniger Marker für eine
Diskriminierung der diagnostisch problematischen follikulären Neoplasien vielversprechend
erscheint. Im Zusammenhang mit Ovarialkarzinomen wurde HMGA2 auch als therapeutischer Ansatzpunkt diskutiert (Malek et al., 2008). Ob HMGA2 auch in Schilddrüsenkarzinomen nicht nur für diagnostische sondern auch für therapeutische Zwecke in Betracht
97
4 DISKUSSION
gezogen werden kann, ist fraglich, da bei Schilddrüsenkrebs eine Thyreoidektomie indiziert
ist und außerdem eine Radiojodtherapie durchgeführt werden kann. Zur Vermeidung von
Rezidiven könnte HMGA2 dennoch ein interessanter Ansatzpunkt werden, was nach dem
derzeitigen Kenntnisstand aber spekulativ ist.
4.2 Die Rolle der HMGA-Gene in Uterus-Leiomyomen
Die am häufigsten in Uterus-Leiomyomen vorkommende rekurrente chromosomale Aberration betrifft die Region 12q14~15, meist als t(12;14)(q14~q15;q23~q24) (Meloni et al., 1992),
aber auch in Form anderer Aberrationen (Wanschura et al., 1997). Betroffen von Veränderungen dieser Region ist HMGA2 (Schoenmakers et al., 1995; Hennig et al., 1996a; Schoenberg Fejzo et al., 1996), das infolge der strukturellen Veränderung verstärkt exprimiert wird
(Gattas et al., 1999; Hennig et al., 1999; Tallini et al., 2000; Gross et al., 2003, Quade et al.,
2003). Diese früheren Erkenntnisse konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit bestätigt
werden, da in insgesamt zwölf Leiomyomen mit Aberrationen der Region 12q14~15 eine
stark erhöhte HMGA2-Expression festgestellt wurde (Klemke et al., 2009). Die Untersuchung
der HMGA2-Expression in Myomen ohne chromosomale Aberration der Region 12q14~15
wurde in bisherigen Studien dagegen vernachlässigt. Die Quantifizierung in einer vergleichsweise großen Anzahl von Myomen ohne zytogenetisch erkennbare chromosomale Veränderungen sowie den dazugehörigen Myometrien ergab, daß HMGA2 in etwa 90 % der Myome
ohne zytogenetisch erkennbare Anomalie stärker als im Myometrium exprimiert wird (Klemke
et al., 2009). Obwohl Myome mit normalem Karyotyp HMGA2 nicht so stark exprimierten wie
Myome der 12q14~15-Gruppe, ist dieser Befund dennoch bemerkenswert, da er impliziert,
daß HMGA2 auch ohne eine den Genlocus betreffende, chromosomale Veränderung zur
Tumorentstehung beitragen könnte. Da die Mehrheit der Uterus-Leiomyome keine chromosomalen Aberrationen aufweist, bedeutet dieses Resultat, daß HMGA2 möglicherweise nicht
nur in einer zytogenetischen Gruppe besonders relevant ist, sondern daß seine Dysregulation in einem sehr viel größeren Anteil eine entscheidende Funktion erfüllen könnte. Die
Mechanismen, die zu einer Steigerung der HMGA2-Expression in karyotypisch normalen
Myomen führen, sind nicht bekannt. Vorstellbar wäre beispielsweise ein Ausfall der posttranskriptionellen Regulation durch miRNAs der let-7-Familie (Mayr et al., 2007; Lee und Dutta,
2007; Shell et al., 2007; Park et al., 2007).
Neben Uterus-Leiomyomen mit Aberrationen der Region 12q14~15 existiert eine kleinere
zytogenetische Gruppe, in der Rearrangierungen der chromosomale Bande 6p21 vorliegen
(Nilbert und Heim, 1990; Kiechle-Schwarz et al., 1991; Ozisik et al., 1995; Hennig et al.,
1996b). Betroffen ist in diesen Fällen das eng mit HMGA2 verwandte Gen HMGA1 (Kazmierczak et al., 1996c; Kazmierczak et al., 1998). Zwar gab es Hinweise auf eine HMGA1-Überexpression infolge der Aberration der Bande 6p21 (Sornberger et al., 1999; Tallini et al.,
98
4 DISKUSSION
2000), diese Untersuchungen beschränkten sich allerdings auf die Proteinebene bzw. auf
einen qualitativen mRNA-Nachweis mit einer herkömmlichen RT-PCR. Da auf quantitativen
Methoden beruhende Studien zur HMGA1-Expression in Uterus-Leiomyomen fehlten, wurde
sie im Rahmen einer qRT-PCR in Myomen mit veränderter Bande 6p21 quantifiziert und mit
Myomen ohne zytogenetisch sichtbare Chromosomenanomalien verglichen. Dabei stellte
sich heraus, daß HMGA1 in Myomen mit Rearrangierungen unter Beteiligung der Bande
6p21 in der Regel deutlich stärker exprimiert wird als in karyotypisch normalen Myomen
(Hashemi Nezhad et al., 2010). In Analogie zur HMGA2-Expression bei Aberrationen der
Region 12q14~15 kann als Ursache dieser erhöhten Expression ein Ausfall negativer
Regulationsmechanismen ebenso in Betracht gezogen werden wie der Austausch von
Promotoren, so daß HMGA1 unter die Kontrolle eines Promotors gelangen könnte, der für
eine konstitutive Genexpression verantwortlich ist. Noch ist unbekannt, welche Rolle HMGA1
bei der Entstehung von Uterus-Leiomyomen spielt. Das sehr ähnliche HMGA2 wurde mit
dem Stammzellcharakter und dem Selbsterneuerungspotential mesenchymaler Zellen in
Verbindung gebracht (Li et al., 2007b; Nishino et al., 2008). Aufgrund der strukturellen
Gemeinsamkeiten von HMGA1 und HMGA2 sind vergleichbare Funktionen von HMGA1
denkbar, die Folgen einer verstärkten HMGA1-Expression auf molekularer Ebene und die
Bedeutung für die Tumorigenese von Uterus-Leiomyomen sind jedoch unbekannt. Ähnlichkeiten wie die hohe Homologie der DNA-Bindedomänen lassen vermuten, daß die starke
HMGA1-Expression in Leiomyomen mit 6p21-Veränderung einen sehr ähnlichen Effekt wie
die HMGA2-Expression bei 12q14~15-Veränderung haben könnte. Gestützt wird diese Annahme durch erst kürzlich veröffentlichte Forschungsergebnisse, denen zufolge HMGA1 in
der Lage ist, somatische Zellen zu pluripotenten Stammzellen zu reprogrammieren (Shah et
al., 2012). Unter anderem wurde nachgewiesen, daß HMGA1 die Pluripotenz-Gene SOX2,
LIN28 und cMYC stimuliert, und auch seine Bindung an die Promotoren dieser Gene konnte
festgestellt werden (Shah et al., 2012). Im Hinblick auf eine mögliche Rolle bei der Pathogenese von Myomen wäre vorstellbar, daß HMGA1 in ähnlicher Weise auf mesenchymale
Stammzellen wirkt und einen proliferationssteigernden Effekt ausübt.
Obwohl bekannt war, daß Uterus-Leiomyome mit chromosomaler Aberration der Region
12q14~15 eine besonders starke HMGA2-Expression aufweisen (Gattas et al., 1999; Hennig
et al., 1999; Tallini et al., 2000; Gross et al., 2003, Quade et al., 2003, Klemke et al., 2009),
herrschte Unklarheit über die zugrundeliegenden Mechanismen. Neben einem Promotortausch konnte auch der Verlust regulatorischer Elemente in Erwägung gezogen werden
(Quade et al., 2003). Nachdem bekannt geworden war, daß in der 3’-UTR Bindestellen für
miRNAs der let-7-Familie vorhanden sind, die eine posttranskriptionelle Regulation ermöglichen (Mayr et al., 2007; Lee und Dutta, 2007; Shell et al., 2007; Park et al., 2007), stellte
sich die Frage, ob der Verlust der let-7-Bindestellen auch in Uterus-Leiomyomen für eine
99
4 DISKUSSION
erhöhte HMGA2-Expression verantwortlich sein könnte. Daher wurde eine qRT-PCR so angelegt, daß mit zwei unterschiedlichen Primerkombinationen alle HMGA2-Transkripte einerseits und nur vollständige Transkripte andererseits erfaßt werden (Klemke et al., 2010). Ergeben sich deutliche Diskrepanzen zwischen beiden PCRs, kann davon ausgegangen
werden, daß zumindest anteilig trunkierte HMGA2-Transkripte vorhanden sind, die aufgrund
fehlender Bindestellen nicht unter der Kontrolle der let-7-miRNAs stehen. Auf diese Weise
wurden dreizehn Uterus-Leiomyome mit einem von Aberrationen betroffenen HMGA2-Locus
untersucht. Sehr deutliche Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen beider PCRs ergaben
sich allerdings in nur zwei Fällen. Daraus ist zu schließen, daß chromosomale Bruchpunkte
zwar intragenisch auftreten und zu trunkierten HMGA2-Transkripten führen können, die
keine let-7-Bindestellen aufweisen und sich daher einer posttranskriptionellen Kontrolle entziehen, allerdings scheint dies nur auf eine Minderheit der Tumoren zuzutreffen. In den
meisten Fällen wurden auch vollständige Transkripte detektiert, so daß ein intragenischer
Bruchpunkt als Ursache für die Steigerung der HMGA2-Expression ausgeschlossen werden
kann. Dieses Resultat stimmt mit anderen Untersuchungen überein, denen zufolge die chromosomalen Bruchpunkte häufig außerhalb des Gens lokalisiert sind (Quade et al., 2003). Als
grundlegender, zur Überexpression führender Mechanismus kommt die Trunkierung der
Transkripte daher nicht in Frage. Der Verlust posttranskriptioneller Regulationsmechanismen
ist dadurch zwar nicht auszuschließen, denn neben einer Trunkierung der mRNA könnten
Punktmutationen der let-7-Bindestellen ebenso dazu führen, daß die miRNAs nicht an die
mRNA binden können. Außerdem könnte auch eine verminderte Expression der miRNAs
selbst zu einem ähnlichen Effekt führen. Hinweise auf eine verminderte let-7-Expression in
Uterus-Leiomyomen existieren bereits (Peng et al., 2008). Neben einer posttranskriptionellen
Regulation kann aber auch eine transkriptionelle Aktivierung, deren Ursachen noch aufzuklären sind, hauptsächlich für die starke HMGA2-Expression verantwortlich sein.
4.3 Die PAX8/PPARG-Genfusion in Schilddrüsentumoren
Zum Zeitpunkt ihrer Erstbeschreibung wurde die Fusion der Gene PAX8 und PPARG in
Schilddrüsenkarzinomen für einen vielversprechenden, karzinomspezifischen Marker gehalten (Kroll et al., 2000). Folglich stellten zahlreiche Arbeitsgruppen eigene Untersuchungen
zum Auftreten dieser Genfusion in Karzinomen der Schilddrüse an, deren Ergebnisse die
Eignung der PAX8-PPARG-Fusion als Marker für follikuläre Karzinome jedoch in Frage
stellten. Einerseits zeichnete sich eine zu geringe Sensitivität ab, weil der Anteil der fusionspositiven FTCs geringer als ursprünglich angenommen war, andererseits schien auch die
Spezifität vermindert zu sein, da zum Teil auch Adenome die Genfusion aufwiesen. Auffällig
ist zudem, daß die in unterschiedlichen Studien angegebenen Häufigkeiten des Auftretens
der Fusion sowohl in follikulären Karzinomen als auch in Adenomen stark divergieren. In der
100
4 DISKUSSION
ersten der beiden diesbezüglichen Publikationen der vorliegenden Arbeit wurde die Häufigkeit der der Genfusion zugrundeliegenden chromosomalen Translokation in einem umfangreichen Kollektiv aus 192 Adenomen untersucht (Klemke et al., 2011). Es zeigte sich, daß
die t(2;3)(q13;p25) in nur zwei Fällen zytogenetisch detektiert werden konnte, was einem
prozentualen Anteil von einem Prozent entspricht. Diese Beobachtung ist im Einklang mit
anderen zytogenetischen Untersuchungen, in denen fünf von 146 Adenomen diese
Translokation aufwiesen (Tabelle 1 aus Klemke et al., 2011). Im Gegensatz dazu ist der
prozentuale Anteil der PAX8-PPARG-Fusion in einigen molekulargenetischen Studien, die
auf einem Nachweis der Transkripte durch eine RT-PCR basieren, deutlich höher und
erreicht im Mittel 8,2 % (23 von 281 Adenomen). Für diese Diskrepanz kommen mehrere
Erklärungen in Frage. Erstens kann die Anwendung unterschiedlicher Nachweismethoden zu
diskrepanten Ergebnissen führen. Aus FISH-Untersuchungen an follikulären Karzinomen
weiß man, daß der Anteil fusionspositiver Zellen stark schwanken kann (Algeciras-Schimnich
et al., 2010). In einer nicht-quantitativen RT-PCR wäre unabhängig vom Anteil positiver Zellen ein positives Resultat zu erwarten. Bei einer der Karyotypisierung vorausgehenden Kultivierung könnten Zellen, die die Translokation tragen, von Zellen ohne die t(2;3)(q13;p25)
verdrängt werden und verlorengehen, so daß sie zytogenetisch nicht in Erscheinung treten.
Alternativ könnten auch submikroskopische Rearrangierungen vorliegen, die nur molekulargenetisch erfaßt werden können. Für diese Möglichkeit konnten bisher allerdings keine
Hinweise gefunden werden, da in insgesamt 19 zytogenetisch unauffälligen Adenomen auch
mittels RT-PCR keine PAX8-PPARG-Fusionstranskripte nachgewiesen werden konnten
(Klemke et al., 2011). Es kann auch nicht ausgeschlossen werden, daß die Genfusion mit
unterschiedlicher Häufigkeit in verschiedenen Ethnien oder geographischen Regionen auftritt. Diese Möglichkeit wurde von einer Arbeitsgruppe diskutiert, die Schilddrüsentumoren
mittels FISH auf die Rearrangierung untersucht hat (Chia et al., 2010). Die derzeitige Datenlage läßt es jedoch nicht zu, diese Hypothese zu verifizieren. Ein interessanter Aspekt ist
außerdem die korrekte Klassifizierung follikulärer Neoplasien. Wie beschrieben kann die Abgrenzung follikulärer Karzinome und Adenome problematisch sein, da gemäß Definition der
WHO als histologische Unterscheidungskriterien nur Kapseldurchbrüche und Gefäßeinbrüche gelten. Geht man von einer Adenom-Karzinom-Sequenz aus – für die mehrere Anhaltspunkte sprechen – dann müßten Tumoren existieren, in denen das die maligne Transformation auslösende Ereignis bereits eingetreten ist, die aber noch nicht die histologischen
Kriterien eines Karzinoms erfüllen, weil weder Kapseldurchbruch noch Gefäßeinbruch erfolgt
sind. Somit könnte die PAX8-PPARG-Fusion in einem Tumor auftreten, der zwar histologisch
als Adenom klassifiziert werden muß, der sich auf molekularer Ebene aber bereits zu einem
Karzinom entwickelt hat („präkanzeröse“ oder „prämaligne“ Läsion). Unabhängig von den Ursachen, die zu divergierenden Häufigkeiten der Fusion in Adenomen führen, bleibt festzuhal-
101
4 DISKUSSION
ten, daß die an einer vergleichsweise großen Serie durchgeführten Untersuchungen darauf
hindeuten, daß die PAX8-PPARG-Fusion nur sehr selten in Adenomen der Schilddrüse
anzutreffen ist.
Ziel der nächsten Publikation zum Thema PAX8-PPARG-Fusion war die Ermittlung der Häufigkeit in Schilddrüsenkarzinomen. In nahezu allen zuvor veröffentlichten, RT-PCR-basierten
Studien wurden frische oder kryokonservierte Gewebeproben von Tumoren verwendet, was
wegen der Seltenheit insbesondere follikulärer Karzinome hier nicht in Frage kam. Das
Bremer Krebsregister (abrufbar unter www.krebsregister.bremen.de) gibt für die Jahre 2000
bis 2009 insgesamt 51.130 bösartige Neuerkrankungen im Land Bremen an, davon handelt
es sich aber in nur 302 Fällen um Karzinome der Schilddrüse, was einem prozentualen
Anteil von 0,6 % entspricht. Berücksichtigt man außerdem, daß es sich in den meisten Fällen
um papilläre Karzinome handelt und zudem die Diagnose eines follikulären Karzinoms in der
Regel erst postoperativ als gesichert gelten kann, dann wird deutlich, daß aussagekräftige
Fallzahlen kaum erreicht werden können, wenn man sich darauf beschränkt, frische oder
kryokonservierte Gewebeproben zu verwenden. Im Jahr 2010 wurde eine RT-PCR
vorgestellt, die auch an formalinfixierten Geweben durchgeführt werden kann. Die Primer
waren so gewählt worden, daß sie Amplikons geringer Länge erzeugen, so daß auch die
degradierte RNA formalinfixierter Gewebe verwendet werden kann. Allerdings wurden fluoreszenzmarkierte Primer verwendet, die in der sich an die PCR anschließenden Kapillarelektrophorese detektiert wurden (Algeciras-Schimnich et al., 2010). Es stellte sich daraufhin
die Frage, ob vergleichbare Ergebnisse auch ohne diese Technik erzielt werden können. Daher wurden die Sequenzen der Primer übernommen, auf eine Fluoreszenzmarkierung wurde
aber verzichtet, da die PCR-Produkte in einem herkömmlichen Agarosegel aufgetrennt und
anschließend sequenziert werden sollten. Außerdem wurde ein Primer ergänzt, da mit den
beschriebenen Primern nicht alle bekannten Fusionstranskripte detektiert werden können.
Das zusätzliche Transkript beinhaltet allerdings ein vorzeitiges Stopkodon, so daß statt eines
Fusionsproteins ein trunkiertes PAX8-Protein daraus resultiert. Die prinzipielle Eignung der
herkömmlichen RT-PCR zum Nachweis der Fusionstranskripte wurde durch die Verwendung
von RNA aus zwei Adenomen mit bereits in der vorherigen Arbeit nachgewiesenen Genfusion (Klemke et al., 2011) bestätigt. Im Anschluß wurde die RT-PCR an formalinfixierten
Gewebeproben von 21 follikulären Karzinomen und sieben follikulären Varianten papillärer
Karzinome durchgeführt. In letzteren konnten keine Fusionstranskripte nachgewiesen werden, was gut mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt, da nur äußerst
selten von der PAX8-PPARG-Fusion in FVPTCs berichtet wurde. In zwei der 21 FTCs lieferte die PCR ein positives Resultat, was einem prozentualen Anteil von 9,5 % entspricht
(Klemke et al., 2012), der damit deutlich von dem mit 62,5 % relativ hohen Anteil der Erstbeschreibung abweicht. Als Marker für follikuläre Karzinome scheint diese Genfusion daher
102
4 DISKUSSION
kaum geeignet zu sein, denn obwohl die Spezifität wie in der Untersuchung der 192 Adenome gezeigt wurde relativ hoch sein dürfte, ist die Sensitivität mit nur knapp 10 % zu gering,
als daß von einem hilfreichen Marker die Rede sein könnte. Die nach Entdeckung der
Fusionstranskripte gehegte Hoffnung auf einen molekularen Marker, der die Diagnose
insbesondere follikulärer Neoplasien unterstützen kann, erfüllt die Genfusion somit nicht.
Eine andere Bewertung könnte sich allenfalls ergeben, wenn sich zeigen ließe, daß die
PAX8-PPARG-Fusion in einer Untergruppe follikulärer Karzinome das die maligne
Transformation auslösende Ereignis oder zumindest eine charakteristische Eigenschaft ist.
Eine Kombination mit Markern, die spezifisch die Gruppe der FTCs ohne diese Genfusion
kennzeichnen, könnte dann das diagnostische Interesse an der PAX8-PPARG-Fusion
gegebenenfalls wieder steigern. In der Untersuchung der 21 FTCs fiel außerdem auf, daß
ein der RT-PCR zufolge fusionspositiver Tumor nach dem Ergebnis der FISH als negativ
klassifiziert worden wäre, da der Anteil der Nuklei mit PPARG-Rearrangierung mit nur einem
Prozent unterhalb der Detektionsgrenze lag. Diese Feststellung stützt die bereits nach der
Untersuchung der Adenome aufgestellte Hypothese, daß unterschiedliche Untersuchungsmethoden diskrepante Ergebnisse generieren. Insgesamt fällt jedoch auf, daß die Häufigkeit
der Genfusion auch in den follikulären Karzinomen mit 9,5 % im Vergleich zu den in anderen
Publikationen dargestellten Ergebnissen verhältnismäßig gering ist. Faßt man 16 Veröffentlichungen zusammen, in denen die Fusionstranskripte mittels RT-PCR nachgewiesen wurden, liegt die Häufigkeit positiver FTCs bei rund 36 % (88 von 245 FTCs; Tabelle 1 aus
Klemke et al., 2011). Die Gründe für den niedrigen Anteil fusionspositiver Karzinome in der
eigenen Untersuchung bleiben unklar. In Anbetracht des mit 21 Fällen relativ geringen Probenumfangs können statistische Ursachen nicht ausgeschlossen werden. Möglicherweise
existieren aber auch Unterschiede in der geographischen Verteilung, wie bereits von Chia et
al. (2010) diskutiert. In einer Arbeit, in der die mittels RT-PCR ermittelte Häufigkeit der Fusion in follikulären Karzinomen bei nur 10,5 % (2/19 FTCs) lag (Aldred et al., 2003), wurden
ausschließlich aus einem deutschen Krankenhaus stammende Gewebeproben verwendet.
Zusammen mit der vorliegenden Untersuchung, in der ebenfalls alle verwendeten Tumoren
von Patienten aus Deutschland stammten, könnte dies darauf hindeuten, daß die Genfusion
zumindest in Deutschland seltener in follikulären Karzinomen auftritt als in anderen Regionen. Zur Verifizierung dieser Vermutung wären allerdings umfangreichere Untersuchungen
erforderlich. Auch im Rahmen einer FISH-basierten Arbeit wurde die Rearrangierung ebenfalls in einer vergleichsweise geringen Häufigkeit von 12 % in FTCs nachgewiesen (Boos et
al., 2013). Leider wird darin aber nicht angegeben, aus welcher Region die verwendeten
Proben stammen. Die Zugehörigkeit der Autoren kann lediglich nahelegen, daß es sich um
Gewebeproben aus der Schweiz handelt, womit ein weiterer Hinweis auf eine in dieser
Region generell geringere Häufigkeit der Genfusion in FTCs gegeben wäre. Obwohl die
103
4 DISKUSSION
Ursachen für stark unterschiedliche Häufigkeiten der PAX8-PPARG-Fusion nicht abschließend aufgeklärt werden konnten, vereinfacht die hier etablierte RT-PCR zukünftige diesbezügliche Untersuchungen, da durch sie auch fixierte und archivierte Gewebeproben follikulärer Karzinome als mögliches Untersuchungsobjekt erschlossen wurden, was wegen der im
Vergleich zu Frischgewebe deutlich besseren Verfügbarkeit selbst seltener Tumorentitäten
besonders attraktiv ist.
4.4 Identifizierung eines in HMGA2 lokalisierten, intronischen miRNA-Gens durch
Sequenzvergleiche
Die ursprüngliche Annahme, miRNA-kodierende Gene seien überwiegend in nicht-kodierenden Transkriptionseinheiten lokalisiert, mußte revidiert werden, nachdem immer mehr
miRNA-Gene in den Introns proteinkodierender Gene lokalisiert wurden (Kim und Kim,
2007). Ein solches intronisches miRNA-Gen wurde auch im dritten Intron des murinen
Hmga2-Gens identifiziert und die daraus hervorgehende reife miRNA konnte experimentell
nachgewiesen werden (Berezikov et al., 2006). Vergleicht man die Sequenzen dieses
HMGA2-Introns verschiedener Mammalia miteinander, fällt auf, daß der dem murinen miR763-Gen homologe Bereich vieler Säuger hochkonserviert ist, wohingegen die Sequenz
nicht-kodierender Abschnitte des Introns erwartungsgemäß variabel ist. Die humane Sequenz könnte ebenso wie bei der Maus die für primäre miRNA-Transkripte typische Haarnadelstruktur ausbilden. Diese Ähnlichkeiten legten die Vermutung nahe, daß im humanen
HMGA2 ein intronisches Gen lokalisiert sein könnte, das für eine homologe miRNA kodiert
(von Ahsen et al., 2008). Eine andere Arbeitsgruppe identifizierte ebenfalls die potentielle
miRNA im humanen HMGA2 aufgrund ihrer in silico-Analysen, und fand darüber hinaus eine
potentielle Bindestelle in der HMGA2 3’-UTR. Daraufhin wurde spekuliert, daß zwischen der
miRNA und ihrem Wirtsgen HMGA2 eine negative Rückkoppelung bestehen könnte (Artzi et
al., 2008). Aufgrund dieser Vermutungen wurden im Rahmen dieser Arbeit Versuche unternommen, die reife, humane miRNA mittels einer RT-PCR nachzuweisen. Dazu wurden vor
allem Gewebeproben verwendet, die bekanntermaßen eine starke HMGA2-Expression aufweisen, da angenommen wurde, daß sowohl die HMGA2-kodierende mRNA als auch die
Vorläufer-miRNA aus einem gemeinsamen Transkript entstehen könnten. Die Regulation der
potentiellen Zielgene der miRNA könnte somit mit einer starken HMGA2-Expression korrelieren, obwohl HMGA2 nicht direkt involviert ist. Ein experimenteller Nachweis der Existenz
einer homologen humanen miR-763 gelang trotz dieser Bemühungen bislang jedoch nicht,
wofür verschiedene Ursachen in Frage kommen. Zum einen ist vorstellbar, daß die miRNA
unabhängig von ihrem Wirtsgen exprimiert wird und sie deshalb in Zellen zu finden wäre, die
HMGA2 nicht oder kaum exprimieren. Zum anderen liegen keine Hinweise auf bestimmte
Gewebe- oder Zelltypen vor, in denen die Existenz der reifen miRNA besonders wahrschein-
104
4 DISKUSSION
lich ist. Deshalb wäre es möglich, daß die humane miR-763 nur in speziellen, bisher nicht
untersuchten Zelltypen vorkommt und zudem auf bestimmte Entwicklungsstadien beschränkt
ist. Daneben spielen aber auch methodische Aspekte eine Rolle. Für die miRNA-spezifische
cDNA-Synthese wurde ein Stem-Loop-Primer verwendet, dessen 3’-Überhang ausgehend
von der reifen, murinen miRNA erstellt wurde. Eine erfolgreiche cDNA-Synthese erfordert,
daß das 3’-Ende der reifen miRNA lückenlos an diesen Überhang binden kann. Voraussetzung dafür ist aber, daß sich die 3’-Enden der murinen und humanen miRNA nicht unterscheiden. Unklar ist jedoch, ob die Schnittstellen in den miRNA-Vorläufern exakt übereinstimmen. Schon eine Verschiebung um ein Nukleotid kann dazu führen, daß die reife miRNA
mit dem gewählten Primer nicht mehr revers transkribiert werden kann. Es bleibt festzuhalten, daß die Existenz eines miRNA-kodierenden Gens im dritten Intron des HMGA2-Gens
aufgrund der Ähnlichkeit zwischen muriner und humaner Sequenz zwar angenommen
werden kann, aufgrund eines bislang fehlenden experimentellen Nachweises aber nicht
gesichert und daher weiterhin als hypothetisch anzusehen ist.
4.5 Wechselwirkungen zwischen HMGA2 und PLAG1
Nach Erscheinen der Publikation zur Überexpression von HMGA2 in Malignomen der Schilddrüse (Belge et al., 2008) nahmen sich einige andere Arbeitsgruppen dieser Thematik an.
Kurze Zeit später wurde eine Untersuchung unter Anwendung von Microarrays veröffentlicht,
nach deren Ergebnissen HMGA2 das in malignen Schilddrüsentumoren am stärksten überexprimierte Gen war (Prasad et al., 2008). Zu weiteren stark überexprimierten Genen gehörte PLAG1, das für einen Transkriptionsfaktor kodiert, dessen Locus in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen häufig von chromosomalen Rearrangierungen betroffen ist (Sandros et
al., 1990; Bullerdiek et al., 1989; Bullerdiek et al., 1993). Eine chromosomale Translokation
t(3;8)(p21;q12) führt zu einem Austausch der Promotoren zwischen PLAG1 und CTNNB1,
was in einer konstitutiven PLAG1-Expression resultiert (Kas et al., 1997). Auch intrachromosomale Rearrangierungen können zu einem Promotoraustausch führen (Asp et al., 2006),
und selbst ohne eine Veränderung der Bande 8q12 kann PLAG1 in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen verstärkt exprimiert werden, wenn stattdessen ein rearrangierter HMGA2Locus vorliegt (Åström et al., 1999). Dementsprechend wurde auch eine simultane Expression beider Gene festgestellt (Enlund et al., 2002). Eine Gruppe myoepithelialer Tumoren,
die pleomorphen Adenomen sehr ähnlich sind, wurde kürzlich daraufhin untersucht, ob in
ihnen ebenfalls die HMGA2- und PLAG1-Loci von rekurrenten chromosomalen Aberrationen
betroffen sind. Die Untersuchung ergab, daß eine genetische Verbindung zu pleomorphen
Adenomen zwar in Form PLAG1 betreffender Rearrangierungen vorhanden ist, Veränderungen des HMGA2-Locus wurden dagegen nicht identifiziert (Antonescu et al., 2013). Interessanterweise sind beide Gene aber in die Genese von lipomatösen Tumoren involviert. Trans-
105
4 DISKUSSION
lokationen unter Beteiligung der chromosomalen Bande 8q12 treten als rekurrente Aberration in Lipoblastomen auf, an deren Entstehung eine PLAG1-Aktivierung maßgeblich beteiligt
ist (Hibbard et al., 2000; Gisselsson et al., 2001; Röpke et al., 2007; Bartuma et al., 2008).
Dagegen ist HMGA2 häufig von chromosomalen Aberrationen in Lipomen betroffen (Nielsen
und Mandahl, 2002; Mandahl und Mertens, 2010). Es stellte sich daher die Frage, ob Störungen in Form transkriptioneller Aktivierung eines der beiden Gene zu ähnlichen Tumoren
führen und HMGA2 und PLAG1 als alternative Auslöser der Tumorentstehung angesehen
werden können. Dies könnte vor allem dann zutreffen, falls beide Gene Teil einer gemeinsamen Signalkaskade wären. Die starke Überexpression von HMGA2 und PLAG1 in Karzinomen der Schilddrüse (Prasad et al., 2008), für die weder 8q12 noch 12q14~15 betreffende
Aberrationen beschrieben sind, lieferte einen zusätzlichen Hinweis auf ein mögliches Zusammenwirken. Zur Klärung der Frage, ob ein der Situation in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen und in Lipomen bzw. Lipoblastomen vergleichbarer Zusammenhang auch in der
Schilddrüse besteht, wurden die HMGA2- und PLAG1-Expressionen in Schilddrüsentumoren
gleichzeitig quantifiziert. Aus diesen Messungen ergab sich eine deutliche Korrelation, da
eine verstärkte HMGA2-Expression in Karzinomen der Schilddrüse mit einer PLAG1-Aktivierung einherging. Dagegen wurde bei niedriger HMGA2-Expression in keinem Fall eine
verstärkte PLAG1-Expression festgestellt (Klemke et al., 2014). Somit ergab sich ein weiterer
Anhaltspunkt für einen regulatorischen Zusammenhang zwischen HMGA2 und PLAG1. Gestützt wurde diese Annahme des weiteren durch die Feststellung, daß auch Uterus-Leiomyome mit starker HMGA2-Expression, bedingt durch chromosomale Aberrationen der Region 12q14~15, eine sehr starke PLAG1-Expression aufweisen. Zwar trat eine erhöhte
PLAG1-Expression in seltenen Fällen auch bei geringer HMGA2-Expression auf, was auf
HMGA2-unabhängige Mechanismen der PLAG1-Aktivierung wie beispielsweise intrachromosomale Rearrangierungen hindeutet. Der umgekehrte Fall wurde jedoch nicht beobachtet:
alle Myome mit hoher HMGA2-Expression wiesen auch eine PLAG1-Überexpression auf, so
daß diese Resultate mit einer HMGA2 nachgeschalteten Position von PLAG1 im selben
Signaltransduktionsweg vereinbar sind (Klemke et al., 2014). Daraufhin wurde die HMGA2Expression in adipösen mesenchymalen Stammzellen durch Zugabe des Proteins FGF1
stimuliert, woraufhin eine simultane Steigerung der PLAG1-Expression beobachtet werden
konnte. Auch dieses Ergebnis stützt die Vermutung einer PLAG1-aktivierenden Wirkung von
HMGA2. Um einen HMGA2-unabhängigen Effekt des FGF1-Proteins auszuschließen, wurden zusätzlich Zellen der Mammakarzinom-Zellinie MCF7 transient mit einem HMGA2kodierenden Vektor transfiziert. Die relative Quantifizierung ergab, daß die auf diese Weise
herbeigeführte HMGA2-Expression ausreicht, um auch die PLAG1-Expression zu verstärken. Ebenso wie das bekanntermaßen von HMGA2 regulierte, als Positivkontrolle dienende
IGF2BP2, exprimierten die mit dem HMGA2-kodierenden Vektor transfizierten Zellen auch
106
4 DISKUSSION
vermehrt PLAG1 (Klemke et al., 2014). Ob die PLAG1-aktivierende Wirkung von HMGA2 auf
einer direkten Interaktion beruht, ist derzeit nicht zweifelsfrei geklärt. Sequenzanalysen
ergaben, daß PLAG1 nach den Kriterien von Cui und Leng (2007) eine potentielle Bindestelle für HMGA2 beinhaltet, ein experimenteller Nachweis für diese Bindung existiert jedoch
noch nicht. Mit Hilfe der Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) könnte aufgeklärt werden, ob
HMGA2 in diesem Bereich oder in der Promotorregion von PLAG1 bindet. Derzeit ist auch
vorstellbar, daß die PLAG1-Aktivierung nicht direkt sondern über Zwischenstufen erfolgt.
Ungeachtet dessen ist aufgrund der vorliegenden Ergebnisse anzunehmen, daß HMGA2
und PLAG1 mit hoher Wahrscheinlichkeit Teile einer gemeinsamen Signalkaskade sind, in
der sich PLAG1 an einer HMGA2 nachgeschalteten Position befindet. Hierfür sprechen nicht
nur die Beobachtungen, daß in Schilddrüsenkarzinomen einerseits und in Uterus-Leiomyomen andererseits eine HMGA2-Überexpression in aller Regel von einer starken PLAG1Aktivität begleitet wird, sondern auch die gesteigerte PLAG1-Expression in adipösen mesenchymalen Stammzellen nach Stimulation von HMGA2 durch FGF1. Insbesondere die
Erkenntnis, daß allein die ektopische Expression von HMGA2 ausreicht, um PLAG1 zu
stimulieren, bekräftigt diese Hypothese. HMGA2 entfaltet seine genregulatorische Wirkung
oft im Zusammenspiel mit anderen Proteinen. So kooperiert es beispielsweise bei der transkriptionellen Aktivierung von IFNB1 (Mantovani et al., 1998; Noro et al., 2003) und IGF2BP2
mit NF-κB (Brants et al., 2004; Cleynen et al., 2007). Daher wäre es denkbar, daß eine
Verstärkung der PLAG1-aktivierenden Wirkung erzielt werden könnte, wenn gleichzeitig
Kofaktoren stimuliert werden. Dies wäre aber keine essentielle sondern eine optionale Vorgehensweise, da am Beispiel der Positivkontrolle IGF2BP2 gezeigt werden konnte, daß eine
simultane Einflußnahme auf den Kofaktor NF-κB keine Voraussetzung für die Wirksamkeit
von HMGA2 ist. Insgesamt deuten die Ergebnisse aller Untersuchungen sehr deutlich darauf
hin, daß PLAG1 von HMGA2 reguliert wird. Die Aktivierung desselben Signaltransduktionsweges könnte erklären, warum chromosomale Rearrangierungen einer der beiden Loci zu
morphologisch so ähnlichen Tumoren wie Lipoblastomen und Lipomen führen können.
107
4 DISKUSSION
4.6 Resümee
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit führten zu neuen Erkenntnissen über den Zusammenhang zwischen HMGA-Genen und Uterus-Leiomyomen. Zum einen konnte gezeigt werden, daß chromosomale Aberrationen der Bande 6p21 einen Einfluß auf die Expression von
HMGA1 ausüben. Zum anderen wurde festgestellt, daß HMGA2 nicht nur in Leiomyomen mit
Rearrangierungen der chromosomalen Region 12q14~15 überexprimiert wird. Da es auch in
Tumoren mit zytogenetisch normalem Karyotyp stärker als in tumorfreiem Myometrium exprimiert wird, besteht die Möglichkeit, daß HMGA2 nicht nur in einer zytogenetischen Gruppe
sondern in der Mehrheit aller Uterus-Leiomyome einen Faktor darstellt, der maßgeblich an
ihrer Entstehung beteiligt ist. In zukünftigen Untersuchungen wäre gegebenenfalls auch zu
überprüfen, ob HMGA2 sogar für therapeutische Zwecke nutzbar sein könnte. Von besonderem Interesse ist die Frage, ob das Wachstum oder sogar die Bildung von Uterus-Leiomyomen durch expressionsinhibierende Maßnahmen wie beispielsweise siRNAs oder unter
Anwendung von gegen HMGA2 gerichteten Antikörpern unterbunden werden kann. Zur weiteren Aufklärung der genetischen Ursachen dieser benignen mesenchymalen Tumoren und
der Rolle der HMGA-Gene sollten zukünftige Untersuchungen sich nicht nur auf Tumoren
beschränken, in denen die Loci von HMGA1 oder HMGA2 von strukturellen Veränderungen
betroffen sind.
Im Hinblick auf Tumoren der Schilddrüse stehen weniger therapeutische, sondern vielmehr
diagnostische und prognostische Aspekte im Vordergrund. Die hier vorgestellten Ergebnisse
machen HMGA2 auch in Verbindung mit nachfolgenden Veröffentlichungen anderer Arbeitsgruppen zu einem vielversprechenden, potentiellen Marker für Schilddrüsenkarzinome. Insbesondere follikuläre Schilddrüsenkarzinome müssen vertieft untersucht werden. Dabei sind
zytologische Präparate aus Feinnadelbiopsien vorzuziehen, da sich eine Quantifizierung der
Genexpression an diesen Präparaten leichter in klinische Abläufe integrieren ließe.
Der diagnostische Nutzen der PAX8-PPARG-Genfusion dürfte dagegen vergleichsweise gering sein, da sie in einem Großteil der follikulären Karzinome nicht nachweisbar ist. Dessen
ungeachtet bietet die in der vorliegenden Arbeit vorgestellte RT-PCR die Möglichkeit, auch
archivierte Gewebeproben in retrospektiven Studien diesbezüglich zu screenen. Damit kann
die Anzahl untersuchter Gewebeproben aller relevanten Tumoren gesteigert werden, womit
aufgeklärt werden könnte, warum bislang zum Teil stark divergierende Frequenzen der Genfusion ermittelt wurden. Dies gilt nicht nur für follikuläre Karzinome, sondern insbesondere
auch für Adenome der Schilddrüse. Daraus könnte sich schließlich die Möglichkeit eröffnen,
die für unterschiedliche Häufigkeiten verantwortlichen Faktoren wie beispielsweise geographische Gegebenheiten oder die ethnische Herkunft aufzuklären und somit das Verständnis
der Zusammenhänge zwischen der PAX8-PPARG-Fusion und Tumoren der Schilddrüse zu
erweitern.
108
4 DISKUSSION
Die hier präsentierten Analysen hinsichtlich der Expression von HMGA2 und PLAG1 sowohl
in Schilddrüsentumoren als auch in Uterus-Leiomyomen zeigen eine deutliche Korrelation
an. Gestützt durch die an Zellkulturen durchgeführten Experimente deuten diese Resultate
darauf hin, daß auch PLAG1 zu den Zielgenen von HMGA2 gerechnet werden muß. Es
bleibt abzuklären, über welchen Mechanismus HMGA2 einen Einfluß auf PLAG1 ausübt und
ob eine Bindung des HMGA2-Proteins an regulatorische Elemente des PLAG1-Gens stattfindet. Im Rahmen von in silico-Analysen konnte eine potentielle HMGA2-Bindestelle in einem
PLAG1-Exon identifiziert werden. Da ein Nachweis für eine direkte Wechselwirkung bislang
nicht erbracht wurde, ist auch eine indirekte Einflußnahme unter Beteiligung weiterer Faktoren vorstellbar. Die Kenntnis der molekularen Interaktion zwischen HMGA2 und PLAG1 kann
von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Tumorentstehung sein, die sich nicht
nur auf die in dieser Arbeit untersuchten Tumorentitäten beschränken muß. Möglicherweise
wäre sie auf ein breites Spektrum verschiedener Arten von Tumoren übertragbar.
109
5 ZUSAMMENFASSUNG
5 ZUSAMMENFASSUNG
Obwohl Leiomyome des Uterus die häufigsten gynäkologischen Tumoren darstellen, sind die
für ihre Entstehung verantwortlichen Auslöser weitgehend unbekannt. Die chromosomale
Region 12q14~15 ist in Myomen am häufigsten von rekurrenten Aberrationen betroffen. In
der vorliegenden Arbeit wurde bestätigt, daß diese zytogenetische Gruppe eine besonders
starke Expression des HMGA2-Gens aufweist. Mit einer qRT-PCR, die zwischen trunkierten
und vollständigen Transkripten diskriminieren kann, konnte gezeigt werden, daß in der Mehrheit der untersuchten Myome trotz einer 12q14~15-Rearrangierung vollständige Transkripte
detektierbar sind. Folglich kann ein Verlust von Bindestellen für miRNAs der let-7-Familie in
der 3’-UTR als generelle Ursache der HMGA2-Reaktivierung in dieser zytogentischen Gruppe ausgeschlossen werden. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß Leiomyome ohne zytogenetisch erkennbare Aberration im Bereich 12q14~15 eine höhere HMGA2-Expression
aufweisen als Myometrium derselben Patientinnen, so daß eine pathogenetische Relevanz
von HMGA2 auch in Myomen mit unverändertem Karyotyp denkbar geworden ist. Weitaus
seltener ist die chromosomale Bande 6p21 von chromosomalen Rearrangierungen betroffen.
Zu Auswirkungen auf das in dieser Bande lokalisierte, eng mit HMGA2 verwandte HMGA1
lagen kaum Daten vor. Daher wurde seine Expression unter Verwendung einer qRT-PCR
quantifiziert und festgestellt, daß Myome mit Aberrationen der Bande 6p21 verstärkt HMGA1
exprimieren. In Anbetracht der Ähnlichkeit der HMGA-Proteine ist es vorstellbar, daß
chromosomale Aberrationen ihrer Loci alternative Auslöser der Myombildung darstellen.
In vielen malignen Tumoren epithelialen Ursprungs findet ebenfalls eine Reaktivierung des
HMGA2-Gens statt. Ein zweiter Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit liegt deshalb auf Tumoren der Schilddrüse, bei denen ein großer Bedarf an molekularen Markern zur Unterstützung der bisher verfügbaren diagnostischen Verfahren besteht. Während viele Tumorentitäten bereits präoperativ nach Feinnadelpunktionen mit großer Sicherheit erkannt werden
können, stellen insbesondere follikuläre Neoplasien eine diagnostische Herausforderung dar,
da follikuläre Karzinome aufgrund identischer Zellmorphologie anhand zytologischer Präparate nicht von Adenomen abgegrenzt werden können. Bereits die im Rahmen einer Diplomarbeit erlangten Ergebnisse deuteten darauf hin, daß sich auch Karzinome der Schilddrüse
durch eine sehr starke HMGA2-Expression auszeichnen. In Fortführung dieser ersten Untersuchung wurde das HMGA2-Protein immunhistochemisch in Schilddrüsenkarzinomen nachgewiesen. Außerdem wurden weitere follikuläre Karzinome untersucht. Dabei zeigte sich,
daß diese diagnostisch besonders problematische Tumorentität zwar häufig aber nicht ausnahmslos eine erhöhte HMGA2-Expression aufweist. Somit wäre die Erfassung ergänzender
Charakteristika hilfreich, um follikuläre Neoplasien sicher zu klassifizieren und follikuläre
Karzinome mit höherer Sensitivität zu detektieren.
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5 ZUSAMMENFASSUNG
Obwohl die Translokation t(2;3)(q13;p25) zuerst in Adenomen der Schilddrüse beschrieben
wurde, entdeckte man die resultierende Fusion der Gene PAX8 und PPARG in follikulären
Karzinomen. Zunächst wurde sie als potentieller Marker für follikuläre Karzinome diskutiert.
Nachfolgende Untersuchungen ergaben jedoch, daß diese Genfusion auch in Adenomen
auftritt, allerdings divergieren die angegebenen Häufigkeiten stark. Die Untersuchung einer
umfangreichen Serie von Adenomen mittels konventioneller Zytogenetik sowie einer RTPCR ergab, daß die Translokation bzw. Genfusion zwar nur selten in Adenomen auftritt,
bestätigte aber gleichzeitig, daß es sich nicht um karzinomspezifische Ereignisse handelt.
Untersuchungen zur Häufigkeit der Genfusion in follikulären Karzinomen werden durch die
geringe Inzidenz dieser Tumorentität erschwert. Daher wurde eine RT-PCR etabliert, die alle
bekannten PAX8-PPARG-Fusionstranskripte erfaßt und die außerdem auf archivierte,
formalinfixierte Gewebeproben anwendbar ist. Somit werden umfangreiche Untersuchungen
auch seltener Tumorentitäten ermöglicht. Mit dieser PCR konnte die Genfusion in 9,5 % aller
untersuchten follikulären Karzinome nachgewiesen werden. Dieser Anteil ist verglichen mit
vielen zuvor publizierten Daten deutlich geringer.
Ein neben HMGA2 in Schilddrüsenkarzinomen stark exprimiertes Gen ist einer Microarraybasierten Studie zufolge PLAG1. Dieses Gen wird in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen
mit chromosomalen Aberrationen, die entweder seinen eigenen Locus 8q12 oder den
HMGA2-Locus betreffen, überexprimiert. In Verbindung mit Microarray-Daten von Schilddrüsentumoren ergab sich die Frage, ob ein tumorunabhängiger Zusammenhang zwischen
beiden Genen besteht. Eine parallele, relative Quantifizierung der HMGA2- und PLAG1Expression ergab, daß die Expression beider Gene in Schilddrüsenkarzinomen eng miteinander korreliert. Auch in Uterus-Leiomyomen, die in Abhängigkeit von der Präsenz einer
12q14~15-Aberration große Unterschiede in der Stärke der HMGA2-Expression aufweisen,
ging eine Reaktivierung von HMGA2 stets mit einer erhöhten PLAG1-Expression einher. In
Zellkulturversuchen konnte zudem gezeigt werden, daß eine Steigerung der HMGA2-Expression sowohl durch Stimulation mit einem Wachstumsfaktor als auch durch transiente Transfektion mit einem HMGA2-Expressionsvektor zu einer Erhöhung der PLAG1-Expression
führt, was als Indiz dafür gedeutet wird, daß PLAG1 sich in einer gemeinsamen Signalkaskade mit HMGA2 befindet und daß zudem HMGA2 einen positiv regulatorischen Effekt
auf PLAG1 ausübt.
Insgesamt konnte aufgezeigt werden, daß das HMGA2-Gen nicht nur in einer zytogenetischen Gruppe der Uterus-Leiomyome von pathogenetischer Relevanz ist, sondern generell
an der Entstehung dieser benignen, mesenchymalen Tumoren beteiligt sein kann. Darüber
hinaus müssen nun auch Karzinome der Schilddrüse zu denjenigen malignen, epithelialen
Tumoren gezählt werden, in denen häufig eine Reaktivierung von HMGA2 stattfindet, woraus
sich eine mögliche Nutzung seiner Expression für diagnostische Zwecke ableitet.
111
6 SUMMARY
6 SUMMARY
Leiomyomas of the uterus are the most frequent gynecological tumours. Nevertheless, their
pathogenesis remains largely unknown. Chromosomal rearrangements affecting the region
12q14~15 belong to the most frequent recurrent chromosomal aberrations. A strong overexpression of HMGA2 in this group was confirmed in the present thesis. To evaluate whether or
not the loss of miRNA binding sites in the mRNA accounts for this observation, a qRT-PCR
was established, which discriminates between truncated and full-length transcripts. Despite a
rearranged HMGA2 locus, full-length mRNAs were detectable in most leiomyomas. Thus,
truncated transcripts due to intragenic breakpoints cannot account for the reactivation of
HMGA2 in leiomyomas of the 12q14~15 group in general. Moreover, fibroids without cytogenetically detectable 12q14~15 aberration were found to express HMGA2 at higher rates than
the corresponding myometrium. Therefore, HMGA2 may also be of pathogenetic relevance
in fibroids without chromosomal abnormalities affecting 12q14~15 and could possibly play a
crucial role in a much larger fraction of uterine leiomyomas than previously assumed. A
smaller cytogenetic subgroup harbours aberrations of the chromosomal band 6p21, in which
HMGA1 is located. Despite the similarity between HMGA2 and HMGA1 the effect of 6p21
aberrations upon the expression of HMGA1 in leiomyomas has not been investigated previously. In a series of leiomyomas harbouring chromosome 6 abnormalities, qRT-PCR revealed a significantly increased HMGA1 expression. Because the proteins encoded by both
HMGA genes are very similar, overexpression of either HMGA1 or HMGA2 may have similar
effects. Chromosomal translocations affecting the loci of either gene may thus be alternative
events in the tumourigenesis of leiomyomas that lead to an identical outcome.
Besides benign mesenchymal tumours, several malignant tumours of epithelial origin also
exhibit a reactivation of HMGA2. Herein, a second main focus was laid on tumours of the
thyroid gland, since they have not been investigated extensively with respect to HMGA2.
Although many of them can accurately be classified presurgically by fine-needle aspiration
biopsies, some entities represent a diagnostic challenge. Because the cell morphology of
adenomas and follicular carcinomas is identical, it is virtually impossible to discriminate follicular neoplasias by cytology alone. Based on preliminary results presented in a diploma
thesis, the HMGA2 expression of thyroid tumours was further investigated. It was shown that
HMGA2 is strongly expressed in thyroid carcinomas of follicular origin by qRT-PCR as well
as by immunohistochemistry. The analysis of additional cases revealed that although a reactivation of the gene occurs frequently, a fraction of FTCs cannot be detected by means of
HMGA2 expression. Nevertheless, the current results suggest that HMGA2 has the potential
to serve as a marker in the diagnosis of thyroid tumours. To increase the sensitivity of a test
for malignancy, the incorporation of additional tumour characteristics will be beneficial.
112
6 SUMMARY
The chromosomal translocation t(2;3)(q13;p25) was initially discovered in thyroid adenomas.
When the resulting fusion of the genes PAX8 and PPARG fusion was discovered in follicular
thyroid carcinomas, it was regarded as an event that is specific for this entity. However, it has
been detected in adenomas as well. Due to diverging frequencies in different reports, a comprehensive cohort of adenomas was analysed by conventional cytogenetics. The presence of
PAX8-PPARG fusion transcripts was confirmed in translocation-positive cases using an RTPCR. Although the occurrence of the gene fusion in adenomas was confirmed, it seems to
be a rare event. Because the incidence of follicular carcinomas is low, a conventional RTPCR capable of detecting all known variants of fusion transcripts also in formalin-fixed tissues was established. It revealed that only 9.5 % of all tested FTCs harbour the PAX8PPARG fusion. A major advantage of this approach is that archived tumour material can be
screened. Thus, even rare tumour entities such as follicular thyroid carcinomas can be
analysed in larger quantities as an important prerequisite for a more precise determination of
the frequency of the gene fusion.
According to a microarray-based approach, PLAG1 is among the most upregulated genes in
thyroid carcinomas besides HMGA2. This gene is activated in pleomorphic adenomas of the
salivary glands harbouring rearrangements of the chromosomal band 8q12. Moreover, rearrangements affecting the HMGA2 locus can also lead to an upregulation of PLAG1 even in
the absence of a rearranged PLAG1 locus. Thus, the question arose if a general connection
exists between both genes that is independent of the type of tumour. Therefore, the expression of both HMGA2 and PLAG1 was quantified in a series of thyroid tumours and found to
be closely correlated. Subsequently, the investigation was extended to uterine leiomyomas
revealing that a high HMGA2 expression due to 12q14~15 rearrangements coincides with a
strongly increased expression of PLAG1. An increased overexpression of PLAG1 in leiomyomas was previously unknown. In cell culture experiments, the stimulation of HMGA2 with a
growth factor as well as the transient transfection with an HMGA2 expression vector resulted
in an increased PLAG1 expression. Although the mechanism of interaction remains to be resolved, these findings strongly indicate that HMGA2 and PLAG1 act in the same signal transduction pathway and that HMGA2 exerts an activating effect upon PLAG1.
In conclusion, it has been revealed that HMGA2 is not only of pathogenetic relevance in
uterine leiomyomas with chromosomal rearrangements affecting the region 12q14~15, but
that it rather may play a crucial role in the tumourigenesis of these benign tumours in
general. Furthermore, a reactivation of HMGA2 has been confirmed in thyroid carcinomas of
the follicular epithelium, which implies that the gene represents a promising molecular
marker for diagnostic purposes in thyroid tumours.
113
7 PUBLIKATIONSÜBERSICHT
7 PUBLIKATIONSÜBERSICHT
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7 PUBLIKATIONSÜBERSICHT
7.2 Posterpräsentationen
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HMGA2 as single marker for thyroid carcinomas (P3-9). DSPAC 's annual meeting 2008:
Targeted cancer therapy - new possibilities and demands on pathology. Jahrestreffen der
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Vejle,
DK.
Abstract:
APMIS
(Acta
Pathologica,
Microbiologica
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Immunologica
Scandinavica) 116: 245. (Präsentierender Autor: Dr. S. Loeschke.)
Klemke M, Belge G, Meyer A, Burchardt K, Stern C, Wosniok W, Loeschke S, Bullerdiek J.
Overexpression of HMGA2 in thyroid carcinomas as a novel molecular marker for
preoperative discrimination of follicular neoplasias. 19. Jahrestagung der Deutschen
Gesellschaft für Humangenetik, 8. - 10. April 2008, Hannover Congress Centrum. Abstract:
Medizinische Genetik 1/2008, P130.
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HMGA2 as single marker for thyroid carcinomas (P-64). Looking Towards the Future : 3rd
Intercontinental Congress of Pathology, 18. - 22. Mai 2008, Barcelona, E. Abstract: Virchows
Arch 452 (Suppl. 1): S73-S74. (Präsentierender Autor: Dr. S. Loeschke.)
Klemke M, Drieschner N, Laabs A, Sendt W, Rippe V, Bullerdiek J, Belge G. Chromosomale
Translokationen t(2;3)(q13;p25) in follikulären Schilddrüsentumoren - eine Seltenheit in
Adenomen? 11. Bremer Krebskongreß (Bremer Krebsgesellschaft e. V.), 18. - 19. November
2009, Congress Centrum Bremen.
Klemke M, Drieschner N, Laabs A, Rippe V, Belge G, Sendt W, Bullerdiek J. The detection of
PAX8/PPARγ fusion transcripts in follicular-patterned thyroid tumours. 22. Jahrestagung der
Deutschen Gesellschaft für Humangenetik, 16. - 18. März 2011, Universität Regensburg.
Abstract: Medizinische Genetik 1/2011, P-CytoG-184.
Klemke M, Belge G, Sendt W, Bullerdiek J. The detection of PAX8/PPARγ fusion transcripts
in archival thyroid tumour samples by conventional RT-PCR. 54. Symposion der Deutschen
Gesellschaft für Endokrinologie, 30. März - 2. April 2011, Congress Center Hamburg,
Abstract PS1-08-6.
Klemke M, Drieschner N, Belge G, Burchardt K, Junker K, Bullerdiek J. Nachweis von PAX8PPARG-Fusionstranskripten in FFPE-Gewebeproben von Schilddrüsentumoren. 12. Bremer
Krebskongreß (Bremer Krebsgesellschaft e. V.), 8. - 9. November 2011, Swissôtel Bremen.
115
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135
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ADSC
Adipöse, mesenchymale Stammzellen
AKT
Proteinkinase B
ALDH2
Aldehyd-Dehydrogenase 2
AP1
Aktivatorprotein 1 (Transkriptionsfaktor)
ATC
Anaplastisches Schilddrüsenkarzinom
ATF-2
Aktivierender Transkriptionsfaktor 2
Bcl-2
Mitochondriales Membranprotein B-cell CLL/lymphoma 2
BRAF
v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1, Serin-Threonin-spezifische
Proteinkinase
BRCA1
Breast cancer 1, early onset
cAMP
zyklisches Adenosin-Monophosphat
CBP
CREB-Bindeprotein (CREBBP)
CCNA2
Cyclin A2
CDKN2A
Cyclin-abhängiger Kinaseinhibitor 2A
cDNA
copy DNA
ChIP
Chromatin-Immunopräzipitation
CLL
Chronische lymphatische Leukämie
cMYC
v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian), nukleäres
Phosphoprotein
CRE
cAMP-responsives Element
CREB
cAMP-responsives Element Bindeprotein
CTNNB1
Catenin (Cadherin-assoziiertes Protein), beta 1
DNA
Desoxyribonukleinsäure
E2F1
E2F Transkriptionsfaktor 1
EMSA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
EMT
Epithelial-mesenchymale Transition
ERCC1
Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency,
complementation group 1
FAM
6-Carboxyfluorescein
FGF1
Fibroblast growth factor 1
FHIT
Fragile Histidine Triad
FHL1
Four and a half LIM domains 1
FISH
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
FNAB
Feinnadel-Aspirationsbiopsie
FOSL1
FOS-like antigen 1 (FRA1)
136
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
FOXO3a
Forkhead box O3a
FTC
Follikuläres Schilddrüsenkarzinom
FVPTC
Follikuläre Variante eines papillären Schilddrüsenkarzinoms
GIST
Gastrointestinaler Stromatumor
HBSS
Hanks’ balanced salt solution
HDAC1
Histon-Deacetylase 1
HEI10
CCNB1IP1, Cyclin B1 interacting protein 1, E3 ubiquitin protein ligase
HMG
High mobility group
HMGA1
High mobility group protein AT-Hook 1
HMGA2
High mobility group protein AT-Hook 1
HMGB1/2
High mobility group protein box 1/2
HMGN
High mobility group nucleosomal binding domain
HPRT1
Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase 1
HRAS
Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog
IE
Internationale Einheit
I-FISH
Interphase-FISH
IFNB1
Interferon, beta 1, fibroblast
IFN-β
Interferon-β
IGF2BP2
Insulin-like growth factor II mRNA binding protein 2 (IMP2)
IHC
Immunhistochemie
let-7
MicroRNA let-7 (lethal-7)
Lin-28
lin-28 homolog A (C. elegans) (LIN28)
LPP
LIM domain containing preferred translocation partner in lipoma
MAPK
Mitogen-aktivierte Proteinkinase
MDM2
MDM2 oncogene, E3 ubiquitin protein ligase
MED12
Mediator complex subunit 12
MEN
Multiple endokrine Neoplasie
MGB
minor groove binder
miRNA, miR MicroRNA
M-MLV
Moloney Murines Leukämievirus
mRNA
messenger-RNA
MTC
Medulläres Schilddrüsenkarzinom
NFIB
Nukleärer Faktor I/B
NF-κB
Nukleärer Faktor Kappa B
NRAS
neuroblastoma RAS viral oncogene homolog
NTRK1
Neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 1
p53
Tumorprotein p53 (TP53)
137
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
PASG
Pleomorphes Speicheldrüsenadenom
PAX8
Paired box 8
PI3K
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase
PI3KCA
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit alpha
PLAG1
Pleiomorphic adenoma gene 1
PPARG
Peroxisome proliferator-activated receptor gamma
pRB
Retinoblastoma 1 (RB1)
PRDII
Positive regulatory domain II (IFN-β-Promotor)
PTC
Papilläres Schilddrüsenkarzinom
PTEN
Phosphatase and tensin homolog
qRT-PCR
Quantitative Real-Time RT-PCR
RAD51B
RAD51 homolog B (S. cerevisiae)
RET/PTC
ret proto-oncogene („rearranged during transfection“), Rezeptor-Tyrosinkinase
RISC
RNA-induced silencing complex
RKI
Robert-Koch-Institut
RNA
Ribonukleinsäure
rRNA
ribosomale RNA
RT-PCR
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
SELE
Selectin E
siRNA
small interfering RNA
SOX2
SRY (sex determining region Y)-box 2 (Transkriptionsfaktor)
SUMO
Small Ubiquitin-related Modifier
TAE
Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TAMRA
Tetramethylrhodamin
TBE
Tris-Borat-EDTA-Puffer
TGF- β
Transforming growth factor beta
TNM
Klassifikation zur Stadieneinteilung maligner Tumoren (Tumor, Lymphknoten,
Metastasen)
UTF1
Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1
UTR
Nichttranslatierte Region
WHO
Weltgesundheitsorganisation
FFPE
formalin fixed, paraffin embedded
CT
Cycle threshold
FCS
fetal calf serum, fötales Kälberserum
LB
Lysogeny Broth Nährmedium
DMSO
Dimethylsulfoxid
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10 ERKLÄRUNG
10 ERKLÄRUNG
Erklärung gemäß §6 (5) der Promotionsordnung der Universität Bremen für die mathematischen, natur- und ingenieurwissenschaftlichen Fachbereiche vom 14. März 2007
Hiermit erkläre ich, Markus Klemke, geboren am 11. Juni 1979 in Bremen, daß ich die vorliegende Dissertationsschrift mit dem Titel „Vergleichende molekulargenetische Untersuchungen benigner mesenchymaler und maligner epithelialer Tumoren unter besonderer
Berücksichtigung des Schilddrüsenkarzinoms“ selbständig verfaßt und keine anderen als die
angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Bremen, den 25. November 2013
Markus Klemke
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11 DANKSAGUNG
11 DANKSAGUNG
Besonders danken möchte ich Herrn Prof. Dr. Jörn Bullerdiek dafür, daß er mir die
Umsetzung meines Promotionsvorhabens im Zentrum für Humangenetik ermöglicht und
dasselbe betreut hat, für zahlreiche Anregungen und Diskussionen sowie für die Übernahme
des Referats.
Herrn Prof. Dr. Andreas Dotzauer danke ich für die Übernahme des Korreferats. Außerdem
danke ich Frau Prof. Dr. Ursula Dicke, Herrn PD Dr. Gazanfer Belge, Frau Marietta Müller
und Frau Claudia Krupinski für ihre Teilnahme am Prüfungsausschuß.
Des weiteren danke ich PD Dr. Burkhard M. Helmke, Käte Burchardt, Prof. Dr. Klaus Junker,
PD Dr. Wolfgang Sendt, Dr. Heiko Dirks, Prof. Dr. Ernst Heinrich Schmidt, Prof. Dr.
Christiane Frantzen und Dr. Gudrun Michael, ohne deren Kooperationsbereitschaft diese
Arbeit nicht durchführbar gewesen wäre.
Überaus dankbar bin ich außerdem Dr. Nina Winter und Dr. Norbert Drieschner, die wertvolle
Anmerkungen und Hinweise zu dieser Arbeit geliefert haben.
Vielen aktuellen und ehemaligen Kolleginnen und Kollegen möchte ich einerseits für
fachliche Diskussionen, Hilfestellungen und Ratschläge, andererseits aber auch für fachfremde Unterhaltungen, für das gesellige Konsumieren zweier Alkaloide, sowie für all die
heiteren Momente im ZHG danken, für die sie gesorgt haben: Dr. Nina Winter (wir sehen uns
hoffentlich nicht erst in Freißenbüttel \m/), Marietta Müller (bis zum Juni muß der Käfer fertig
sein!), Dr. Andreas Richter, Lars Kloth, Dr. Norbert Drieschner, PD Dr. Gazanfer Belge, Arlo
Radtke, Dr. Yvonne Kiefer, Martina Lübbing, Henrieke Förster, Meike Spiekermann, Bianca
Burchardt, Svenja Kerschling, Rebecca Schröder, Laura Rogge, Dr. Nicola Reimann-Berg,
Dr. Inga von Ahsen, Dr. Dominique Markowski (wenn’s mal wieder „Ernst“ wurde), Helge
Thies, Inga Flor, Dr. Rolf Nimzyk, Dr. André Fehr, Dr. Anke Meyer, Dr. Birgit Rommel, Dr.
Sabine Bartnitzke, Dr. Siegfried Loeschke, Daniela Begandt, Anne Laabs und Angelika
Schneider-Uhlhorn.
Won’t forget these days!
Ebenso möchte ich folgenden Personen für langjährige Freundschaften danken, deren
Bedeutung auch ohne weitere Ausführungen hoffentlich allen bewußt ist: Nadine Rogge,
Michael Jöckel, Dörte Kaufhold, Henning Söder, Meike und Marco Ehrich, Katrin Wendhut,
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11 DANKSAGUNG
Verena Hell, Susanne Mahnkopf, Corinna Colell und Ingo Oehlkers, Sarah und Jan
Hochlenert, Fabian Arndt und Michael Bohlmann.
Noch nicht ganz so langjährig aber deswegen nicht minder geschätzt ist die Freundschaft mit
Nadine Müller, der ich für interessante Gespräche ebenso wie für die Begleitung zu In
Extremo-Konzerten mit einem Zitat danken möchte, das zwar nicht von InEx, aber aus
Omnia Sol Temperat stammt: Sum presentialiter absens in remota.
Meinen Eltern Gisela und Günter Klemke bin ich für ihre ausdauernde Unterstützung zu
besonderem Dank verpflichtet. Meiner Schwester Christina Klemke danke ich darüber hinaus
für ihre Hilfe bei syntaktischen Problemen, die während des Verfassens dieser Dissertation
auftraten. Großer Dank gebührt auch meinen Großeltern Marianne und Karl Wenzel, auf
deren Unterstützung ich ebenfalls immer zählen konnte.
Ganz besonders danke ich Nicole Kroog für die aufgebrachte Geduld, ihr Verständnis und
vor allem für die Kraft, die sie mir in den vergangenen Jahren gegeben hat.
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