Untersuchungen zur Eignung von Raupen des Goldafters Euproctis

Institut für Forstentomologie, Forstpathologie und Forstschutz
Department für Wald- und Bodenwissenschaften
Universität für Bodenkultur, Wien
Untersuchungen zur Eignung von Raupen des Goldafters
Euproctis chrysorrhoea (Lepidoptera: Erebidae)
als Überwinterungswirt für die Brackwespe Glyptapanteles liparidis
(Hymenoptera: Braconidae)
Masterarbeit von
Fromm Franziska, B.Sc.
Betreuer:
Priv. Doz. Dr. Christa Schafellner
Prof. Dr. Axel Schopf
Wien, 2014
Danksagung
Mit diesem Schreiben möchte ich bei allen Menschen bedanken, welche mich
während der Untersuchungen und des Schreibprozesses meiner Masterarbeit
fachlich und technisch beraten haben. Allen voran ist hier meine Betreuerin Dr.
Christa Schafellner zu nennen, welcher ich für die exzellente Betreuung und
Hilfestellung danken möchte. Andrea Stradner, Dr. Dörte Görtz und Josef
Pennersdorfer möchte ich dafür danken, dass sie mir bei der Durchführung meiner
Versuche im Labor geholfen haben. Ein großer Dank gilt auch DI Peter Kritsch und
DI Martina Marschnig für ihre Hilfestellung bei den Auswertungen und sonstigen
technischen Problemen. Dem gesamten Team des Institutes für Forstschutz,
Forstpathologie und Forstschutz möchte ich dafür danken, dass sie mich so
freundlich in ihr Team aufgenommen und damit eine wunderbare Arbeitsatmosphäre
für mich geschaffen wurde.
Vielen Dank auch an meine Korrekturleser DI Silvio Riener und DI Harald Tisch. Ich
möchte mich auch bei meinen Eltern für die laufende finanzielle und moralische
Unterstützung herzlichst bedanken.
Inhaltsverzeichnis
Abstract
1.
Einleitung ...........................................................................................................1
2.
Material und Methoden ....................................................................................7
2.1 Versuchstiere… ..............................................................................................7
2.2 Überwinterung unter kontrollierten Bedingungen .......................................... 10
2.3 Überwinterung im Freiland ............................................................................ 10
2.4 Physiologische Messungen während der Überwinterung ............................. 13
2.4.1
Respiration ........................................................................................... 14
2.4.2
Frostresistenz ....................................................................................... 18
2.5 Überwinterung von parasitierten Raupen...................................................... 20
2.6 Mikrosporidieninfektion ................................................................................. 22
2.7 Statistische Analysen .................................................................................... 26
3.
Ergebnisse ...................................................................................................... 27
3.1 Überwinterung von unparasitierten Euproctis chrysorrhoea Raupen ............ 27
3.1.2
Überwinterung unparasitierter Raupen unter kontrollierten
Bedingungen ........................................................................................ 27
3.1.2
Überwinterung unparasitierter Raupen im Freiland .............................. 27
3.1.3
Atmungsaktivität während der Überwinterung ...................................... 28
3.1.4
Frostresistenz während der Überwinterung .......................................... 35
3.2 Überwinterung von parasitierten Euproctis chrysorrhoea Raupen ................ 38
3.2.1
Überwinterung der Parasitoiden unter kontrollierten Bedingungen ...... 42
3.2.2
Überwinterung der Parasitoiden im Freiland ........................................ 45
3.3 Mikrosporidieninfektion ................................................................................. 46
4.
Diskussion ....................................................................................................... 47
4.1 Überwinterungsstrategien von Euproctis chrysorrhoea Raupen ................... 47
4.2 Eignung von Euproctis chrysorrhoea Raupen als Überwinterungswirt für
Glyptapanteles liparidis ................................................................................. 49
4.3 Einfluss einer Mikrosporidienentwicklung auf die Wirts-/
Parasitoidentwicklung ................................................................................... 51
5.
Schlussfolgerungen und Ausblick ............................................................... 54
6.
Literaturverzeichnis ........................................................................................ 55
7.
Abbildungsverzeichnis ................................................................................... 64
8.
Tabellenverzeichnis ........................................................................................ 67
Abstract:
The gregarious, multivoltine braconid wasp Glyptapanteles liparidis (Hymenoptera:
Braconidae) is an important natural enemy of larvae of the gypsy moth, Lymantria
dispar (Lepidoptera: Erebidae), a serious forest pest insect. The gypsy moth has only
one generation per year and the overwintering stadium is the egg. Thus, to maintain
the population, the wasps depend on hosts that overwinter in the larval stage.
The aim of the thesis was to investigate whether larvae of the browntail moth,
Euproctis chrysorrhoea (Lepidoptera: Erebidae), that hibernate in nests on their food
plants, are suitable overwintering hosts of G. liparidis parasitoids. Additionally, the
overwintering behaviour of the browntail moth larvae were documented and
physiological parameters (oxygen consumption, supercooling point) were recorded
during the winter months.
Larvae of browntail moth were collected from of a colony on Sorbus aria trees and
kept under long day and short day photoperiods at 20°C in climate chambers and
under outdoor conditions, respectively, for overwintering.
Irrespective of temperature and photoperiod, the larvae stopped feeding in autumn
and entered a state of rest, remaining in the second larval instar. Frost resistance
increased continuously from October to February and decreased in spring. A
concomitant decrease in respiration rates was not observed. This suggests an
obligatory diapause in the overwintering browntail moth larvae.
Browntail moth larvae that were parasitized by G. liparidis wasps in autumn (October,
November) showed similar behaviour as unparasitized larvae. For overwintering, the
parasitoids remained as eggs or first instars inside their host. Parasitoid emergence
from the host could only be observed in a small number of outdoor larvae. When
larvae were parasitized in spring after diapause was broken, the parasitoids
developed continuously within their hosts. All host larvae that were kept under
laboratory conditions died until January; no parasitoids emerged from these larvae. It
is reasonable to assume that browntail moth larvae are not only alternate hosts to
gypsy moth larvae but also suitable overwintering hosts for G. liparids wasps.
1.
Einleitung
Die gregäre endoparasitische Brackwespe Glyptapanteles liparidis (Bouchè)
(Hymenoptera: Braconidae) ist ein wichtiger natürlicher Gegenspieler von Raupen
des Schwammspinners, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae) (Burgess &
Crossman, 1929); in Europa ist sie eine der am häufigsten vorkommenden
Brackwespenarten (Schopf & Steinberger, 1996). Der Schwammspinner ist eine
polyphage Schmetterlingsart, welche über Nordafrika (Mittelmeerküstenländer) über
West-, Süd- und Mitteleuropa sowie in Russland und Japan verbreitet ist.
Massenvermehrungen des Schwammspinners treten vor allem in Eichenwäldern in
trockenen und warmen Jahren auf (Wellenstein & Schwenke, 1978), seit Mitte der
80er Jahre vermehrt in Mittel- und Osteuropa (Schopf & Hoch, 1997). In Österreich
findet man den Schwammspinner vor allem in Eichenwäldern im östlichen
Niederösterreich, im Burgenland und in der Steiermark (Jahn & Sienreich, 1957;
Fuester et al., 1981; Hoch & Schopf, 1995).
Durch ihr hohes Vermehrungspotential und ihr exzellentes Suchvermögen spielt G.
liparidis eine wichtige Rolle in der Regulierung von Schwammspinnerpopulationen,
vor allem in der Latenzphase (Coulson, 1981; Schaefer, 1981; Coulson et al., 1986;
Schopf & Hoch, 1997; Hoch et al., 2001). Selbst bei geringer Populationsdichte
ermöglicht das hochsensible Such- und Wirtsauffindungsvermögen der Wespe ein
schnelles Reagieren auf ein punktuelles Vorkommen von Wirtsraupen (Schopf &
Hoch, 1997; Hoch et al., 2001). Die Wespe weist eine polyvoltine Entwicklung auf,
wobei sich ein bis zwei Generationen im Jahr in den Raupen des Schwammspinners
entwickeln können (Schopf & Hoch, 1997; Hoch et al., 2001). Die Wespen
bevorzugen frühe Stadien (erstes bis drittes Larvenstadium, L1-L3) zur Eiablage. Je
nach Größe der Wirtsraupe und dem Parasitierungszeitpunkt werden 30 Eier und
mehr in die Leibeshöhle injiziert. Nach ca. fünf Tagen schlüpfen die Larven des
ersten Larvenstadiums (L1). Bei 20°C entwickeln sich die Larven nach etwa 10 bis
12 Tagen ins zweite Larvenstadium (L2) weiter. Knapp drei Wochen nach der
Parasitierung bohren sich die Larven aus den Wirtsraupen aus. Während des
Ausbohrens häuten sie sich in das dritte Larvenstadium (L3), dabei werden die
Ausbohröffnungen in der Cuticula der Wirtsraupe mit den abgestreiften alten
Larvenhäuten der Parasitoiden verschlossen und verhindern ein Ausbluten.
1
Die Verpuppung erfolgt nach dem Ausbohren in der Nähe der Wirtsraupen in von
den Parasitoidenlarven gesponnenen weißen Kokons. Die Wirtraupe selbst bleibt
noch einige Tage am Leben, es ist ihr jedoch nicht mehr möglich zu fressen und sich
koordiniert zu bewegen (Schopf, 1991; Schopf & Steinberger, 1996; Schopf & Hoch,
1997; Schopf, 2007). Der Schlupf der adulten Wespen aus den Kokons erfolgt nach
etwa einer Woche. Weibliche Wespen schlüpfen ein bis zwei Tage nach den
Männchen und werden sofort von ihnen begattet. Danach machen sich die Weibchen
auf die Suche nach potentiellen Wirtsraupen (Schopf, 1991; Schopf & Steinberger,
1996; Schopf & Hoch, 1997; Schopf, 2007).
Während der endoparasitischen Entwicklung in den Wirtsraupen ernähren sich die
Parasitoiden von der Hämolymphe der Wirtstiere. Die Dauer der Entwicklung ist
dabei von den Ernährungs- und Entwicklungsbedingungen der Wirtsraupen abhängig
(Schopf, 1991; Schopf & Steinberger 1996).
Für eine erfolgreiche endoparasitische Entwicklung muss der Parasit die gegen ihn
gerichtete Immunabwehr des Wirtes außer Kraft setzten. Dazu werden bei der
Eiablage von den Wespen Viruspartikel eines symbiontischen Virus (Polydnavirus
PDV) und Giftdrüsensekrete (Venomsekrete) in die Leibeshöhle der Wirtsraupen
abgegeben (Krell, 1991). Die Replikation der Viren erfolgt in den sogenannten
Calyxzellen des Ovars der Wespenweibchen. Die Zellwand einer virogenen
Calyxdrüsenzelle wird aufgelöst und die Viruspartikel (Virionen) in das Ovidukt
entlassen. In der Wirtsraupe dringen die Virionen in die Blutzellen (Hämozyten) ein,
docken an die Zellkerne an und schleusen die Viren-DNA in den Kern der Wirtszelle.
Viruspartikel und Venomsekrete verhindern die Einkapselung der injizierten Eier
durch die Hämozyten der Wirtsraupen. Die Parasitoidenlarven werden nach dem
Schlupf aus dem Ei von bestimmten Zellen (Teratocyten) unterstützt, welche aus der
äußeren Hülle (Serosa) der Eier stammen. Auch diese wirken hemmend auf die
Immunabwehr der Wirtsraupe (Schopf, 2007).
Die Larven selbst manipulieren und beuten ihren Wirt aus. Sie entziehen der
Wirtraupe Nährstoffe aus der Hämolymphe und beeinflussen deren Hormonhaushalt
(Schopf & Steinberger, 1996). Die Parasitoidenlarven verhalten sich dabei dennoch
sehr wirtschonend, weil sie einerseits vom Wirt als Nährstofflieferant abhängig und
andererseits geschwächte Wirte anfällig für Krankheitserreger sind (Schopf, 2007).
Gegen Ende der endoparasitischen Phase der Entwicklung kommt es zu einem
drastischen Anstieg des Juvenilhormontiters in den parasitierten Wirtsraupen.
2
(Schopf & Rembold, 1993; Schafellner et al., 2004, 2007), was sowohl die
Metamorphose als auch jegliche Häutung des Wirtstieres in ein weiteres
Larvenstadium verhindert. Auch eine vorzeitige Verpuppung des Wirtstieres wird
unterbunden, offenbar weil die Parasitoiden nicht imstande wären, sich aus der
dicken Puppencuticula auszubohren (Krell, 1991; Schafellner et al., 2004, 2007;
Schopf, 2007).
Um die Population das ganze Jahr über aufrechterhalten zu können, benötigt die
Wespe Wirte, welche im Larvenstadium überwintern. Der Schwammspinner bildet
eine Generation pro Jahr (univoltin), überwintert im Eistadium und ist daher als
Überwinterungswirt nicht geeignet (Burgess & Crossmann, 1929; Wellenstein &
Schwenke, 1978). In der Literatur werden einige Alternativ- und Überwinterungswirte
für G. liparidis angegeben (Burgess & Crossmann, 1929; Capek, 1988; Schopf,
2007). Als solche gelten nah verwandte Erebidenarten, wie der Goldafter, Euproctis
chrysorrhoea, oder der Schwan, Euproctis similis. Des Weiteren werden auch Arten
aus der Familie Lasciocampidae, speziell die Kiefernspinnerarten Dendrolimus pini in
Europa sowie Dendrolimus spectabilis in Asien genannt (Burgess & Crossmann,
1929; Capek, 1988; Schopf, 2007). Prinzipiell wären auch der Brombeerspinner,
Macrothylacia
rubi,
und
der
Buchen-Streckfuß,
Calliteara
pudibunda,
als
Überwinterungswirte geeignet, da sie im Larvenstadium überwintern. Ob eine Art als
Alternativ- oder Überwinterungswirt in bestimmten Gebieten vorhanden ist, hängt
stark vom Bestandesaufbau und der vorhandenen Vegetation ab (Schopf, 2007).
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Raupen des Goldafters Euproctis
chrysorrhoea
(Lepidoptera:
Erebidae).
Der
Goldafter
wurde
wie
der
Schwammspinner in den letzten Jahren in die Familie der Erebidae, Unterfamilie
Lymantriinae verschoben und ist somit ein naher Verwandter des Schwammspinners
(Lafontaine & Fibiger, 2006). Diese neue Klassifizierung ist in der europäischen
Wissenschaftsgemeinde nicht unumstritten; viele Autoren geben für beide Arten nach
wie vor die Zugehörigkeit zur Familie der Lymantriidae an. Obwohl der Goldafter, wie
auch der Schwammspinner, eine univoltine Lebensweise aufweist, könnten seine
Raupen aufgrund ihrer Biologie, des annähernd gleichen Lebensraumes und
Wirtspflanzensprektrums als Alternativwirte der Brackwespe dienen (Fernald &
Kirkland, 1903; Burgess, 1923; Skatulla & Schwenke, 1978).
3
Die natürliche Verbreitung des Goldafters in Europa erstreckt sich nördlich bis SüdSchweden und Livland, südlich und südöstlich bis zum Mittelmeer und dem
Schwarzen Meer (Skatulla & Schwenke, 1978). Massenvermehrungen treten
periodisch in Zentral- und Osteuropa auf (Pilarska et al., 2001). In Österreich kommt
der Schmetterling auf Alleebäumen, in Parkanlagen und Laubmischwäldern vor.
In den USA wurde der Goldafter erstmals 1897 in der Nähe von Boston,
Massachusetts, beobachtet (Fernald & Kirkland, 1903). Die Art breitete sich in den
folgenden 20 Jahren über den Osten der USA bis nach Südkanada aus (Burgess,
1923). Aufgrund seines invasiven Charakters galt dieser Schmetterling Anfang des
20. Jahrhunderts als der schädlichste in Nordamerika (Fernald & Kirkland, 1903).
Durch mechanisches Entfernen von Überwinterungsnestern und dem Einfluss
natürlicher Feinde des Goldafters kam es 1914 zu einem Rückgang der
Populationsdichte (Burgess, 1923; Schaefer, 1974). Heute gibt es nur mehr wenige
Vorkommen, welche sich auf die Ostküste der USA beschränken (Schaefer, 1974).
Der Goldafter ist ein polyphager Blattfresser, welcher ein weites Spektrum an
Wirtsbaumsarten aufweist (Burgess & Crossman, 1929). Dazu zählen Arten aus den
Gattungen Quercus, Prunus, Sorbus, Betula, Populus und Rosa. Blätter von Rubus
sp. und Corylus sp. werden zwar gefressen, jedoch wird an diesen kein Winternest
gebaut. Laut Skatulla & Schwenke (1978) ist der Goldafter in erster Linie ein an
Weißdorn (Crategus sp.) fressender Heckenbewohner. Erst bei Nahrungsmangel
werden Obst- und Waldbäume befallen (Skatulla & Schwenke, 1978).
Massenvermehrungen des Goldafters führen bei den befallenen Wirtsbäumen zu
Kahlfraß und Zuwachsverlusten, im Extremfall zum Absterben. Daher wird der
Goldafter als forstlicher Schädling eingestuft (Fernald & Kirkland, 1903; Burgess,
1923; Zeitgamel, 1974; Schaefer, 1974; Frago et al., 2009). Daneben stellen die
Haare der Raupen auch ein Risiko für den Mensch dar. Die Raupen besitzen
spezielle Haare (Setae), welche Toxine enthalten, die beim Menschen Allergien und
Schleimhautreizungen, im Extremfall Erblindung, verursachen können (Schaefer,
1974). Laut Schaefer (1974) führten diese Haare in der Vergangenheit sogar zum
Tod von Wissenschaftlern. Die Setae bilden sich erst im dritten und vierten
Larvenstadium und sind auf das erste und zweite Abdominalsegment beschränkt. Die
Haare können sehr leicht abbrechen und mit dem Wind verbreitet werden (Kephart,
1914; Schaefer, 1974; Blair, 1979; Hossler, 2010).
4
Im Gegensatz zum Schwammspinner, welcher als Raupe nur von April bis Juni zu
finden ist, verbringt der Goldafter fast zehn Monate im Larvenstadium (von
September bis Juni) (Fernald & Kirkland, 1903; Saccuman, 1963). Die nachtaktiven,
weiblichen Falter legen im Juli zwischen 100-500 Eier an der Unterseite von Blättern
ab und bedecken diese mit goldbrauner Afterwolle (Haare vom Abdomen der Falter).
Unter natürlichen Bedingungen (Freiland) schlüpfen die Raupen von Mitte Juni bis
Anfang August. Die jungen Raupen leben einige Wochen gesellig und fressen
schabend an der Blattoberfläche, wobei das Adersystem des Blattes dabei
verschmäht wird (Fernald & Kirkland, 1903; Burgess, 1923; Skatulla & Schwenke,
1978). Bei abnehmenden Temperaturen und Tageslichtverhältnissen bereiten sich
die Raupen ab Mitte September auf die Überwinterung vor (Fernald & Kirkland, 1903;
Danilevsky et al., 1970; Kelly et al., 1989). Die überwinternden Raupen spinnen sich
in aus Blättern zusammengezogene Überwinterungsnester ein, in welchen sie in
Kolonien zu 25-400 Individuen überwintern. Die Überwinterung erfolgt im zweiten
oder dritten Larvenstadium. Ob es sich bei der Überwinterung der Raupen um ein
echtes Diapauseverhalten handelt, ist kaum erforscht (Danks, 1987; Frago et al.,
2010).
Im April kriechen die Raupen bei zunehmenden Tagestemperaturen aus ihren
Nestern und beginnen mit dem geselligen Raupenfraß an den Blättern ihrer
Wirtspflanzen (Fernald & Kirkland, 1903; Burgess, 1923; Frago et al., 2010). Die
Überwinterungsnester dienen dabei als Nachtlager. In späteren Stadien verlassen
die Raupen die Kolonien und fressen einzeln (Frago et al., 2009). Die Verpuppung
erfolgt im Juni nach dem fünften oder sechsten Larvenstadium. Die Mitte Juni
schlüpfenden Falter nehmen keine Nahrung mehr zu sich und weisen eine kurze
Lebensspanne auf (Fernald & Kirkland, 1903; Burgess, 1923; Frago et al., 2010).
Die exakte Anzahl der Larvenstadien vor der Verpuppung ist nicht bekannt.
Allgemein wird angenommen, dass fünf bis acht Stadien vor der Verpuppung
durchlaufen werden (Burgess, 1923; Auersch, 1955; Skatulla & Schwenke, 1978;
Frago et al., 2009). Die Unsicherheit bezüglich der Anzahl der Larvenstadien lässt
sich aus dem auftretenden Entwicklungspolymorphismus (unterschiedlich rasche
Entwicklung der Individuen) erklären.
Zur natürlichen Regulation von Goldafterpopulationen tragen mehrere parasitische
Insekten bei (Mamedov, 1988). Zu diesen zählen Vertreter der Braconiden wie
Meteorus versicolor, Apanteles lateicolor, die Ichneumonide Scambus brevicornis
5
und die Tachinenart Tachina praeceps. Meteorus versicolor wird dabei als effektivste
Art angeführt, Goldafterraupenpopulationen zu regulieren (Mamedov, 1988). Des
Weiteren wirken Kernpolyederviren und einige pathogene Pilze, darunter vor allem
Mikrosporidien, stark populationsmindernd (Sterling & Speight, 1989). Das
Bakteriumpräparat
Bacillus
thuringiensis,
welches
am
Markt
unter
dem
Produktnamen Dipel erhältlich ist, wird bei der biologischen Kontrolle gegen den
Goldafter eingesetzt (Percival, s.a.).
Eine zentrale Fragestellung dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob sich die
Goldafterraupe als Überwinterungswirt für die Brackwespe G. liparidis eignet und
damit den Fortbestand der Wespenpopulation ermöglicht. In einer vorhergehenden
Arbeit konnte festgestellt werden, dass Goldafterraupen erfolgreich von der Wespe
parasitiert werden und im Frühjahr als Wirte für die Entwicklung der Parasitenlarven
geeignet sind (Marschnig, 2013).
Mit der zentralen Fragestellung verknüpft ist das bis heute kaum erforschte
Überwinterungsverhalten der Goldafterraupen. Konkret sollte untersucht werden, ob
es sich bei der Winterruhe um eine echte Diapause handelt und welche Rolle dabei
Temperatur und Photoperiode spielen. Um diese Fragen zu beantworten, wurden
Raupen sowohl im Freiland als auch unter kontrollierten Bedingungen über mehrere
Monate (Oktober bis Juni) gehalten. Zusätzlich wurden während des natürlichen
Überwinterungszeitraums Respirations- und Frostresistenzmessungen durchgeführt.
6
2.
2.1
Material und Methoden
Versuchstiere
Die verwendeten Goldafterraupen stammen aus zwei Populationen. Die erste ist eine
Folgegeneration der Raupen, welche für die Diplomarbeit von Marschnig (2013) im
Labor gezüchtet wurden. Die ursprünglichen Überwinterungsnester mit den Raupen
stammen von Mehlbeerbäumen (Sorbus aria) nahe Traismauer, Niederösterreich
(15°46´00.28``Ost, 48°20´52.34``Nord), die im Februar 2012 abgesammelt und für
den Aufbau einer Zucht unter natürlichen Bedingungen verwendet wurden. Dazu
wurden Überwinterungsnester (ca. 12 Stück) in einem Käfig im Garten des Institutes
für Forstentomologie, Forstpathologie und Forstschutz (IFFF) platziert. Zur
Verpuppung wurden die Raupen in einem Klimaschrank (Sanyo Incubator, Modell:
MIR-533) unter Langtagbedingungen (LT 16h Licht und 8h Dunkelheit, 16L:8D) und
konstanter Temperatur (20°C) gehalten. Die Raupen wurden bis zur Verpuppung mit
Weißdornblättern (Crategus sp.) auf Zweigen gefüttert. Zum Schlüpfen der Falter
wurden die Puppen in Plastikboxen mit Gazedeckel (25 x 25 x 25 cm) gesetzt, in
welchen die Falter Ende Juli längliche, mit Afterwolle bedeckte Eigelege ablegten.
Anfang August wurden die Eigelege abgesammelt und die daraus schlüpfenden
Raupen in der vorliegenden Arbeit für die Versuche verwendet. Ab dem Schlüpfen
Mitte August wurden die Tiere mit Weizenkeimdiät (Tab. 1) (Bell et al., 1981)
gefüttert, die von den Raupen sehr gut angenommen wurde. Im Gegensatz dazu
verweigerten Raupen aus den Überwinterungsnestern der Laborzucht, die ab dem
Schlüpfen bis zur Überwinterung mit Blattmaterial gefüttert worden waren, die Diät
und verhungerten (Marschnig, 2013).
Die zweite Population stammte direkt aus Überwinterungsnestern, welche Anfang
November 2012 von denselben Mehlbeerbäumen wie oben nahe Traismauer
aufgesammelt wurden (Abb. 1). Die besiedelten Überwinterungsnester wurden in
zwei Plastikboxen mit Gazedeckel (25 x 25 x 25 cm) verfrachtet und im
Institutsgarten unter Freilandbedingungen gehalten. Die Tiere wurden mit Blättern
der Mehlbeere gefüttert (Abb. 2).
7
Abb. 1: Überwinterungsnest an Mehlbeere.
Abb. 2: Mehlbeerblätter als Futter für die
Goldafterraupen im Überwinterungsnest.
Die für die Versuche verwendeten G. liparidis Wespen stammen aus einer
Dauerzucht des IFFF. Diese Zucht wurde vor mehr als 20 Jahren mit einer sich in
Schwammspinnerraupen
entwickelnden
(Burgenland)
Durch
angelegt.
Wespenkolonie
laufende
Parasitierung
aus
von
Klingenbach,
Raupen
des
Schwammspinners wird die Erhaltung der Wespenpopulation sichergestellt.
Die adulten Wespen werden in einem Klimaschrank (Liebherr profiline) unter
Langtagbedingungen (16L:8D) bei 15°C (Tag) bzw. 10°C (Nacht) gehalten. Sie
werden mit Wasser und Honig gefüttert.
Zur
Untersuchung
Mikrosporidieninfektion
der
von
während
des
Goldafterraupen
Versuchszeitraumes
aus
dem
Freiland
vorgefunden
wurde
ein
Infektionsversuch mit Schwammspinnerraupen angelegt, um die Mikrosporidien
näher zu charakterisieren. Dafür wurden Raupen aus der Dauerzucht (New Jersey
Standard Strain) der USDA- APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service,
OTIS Methods Development Center, MA 02542) verwendet. Die Raupen (Abb. 3 und
4) wurden in einem Klimaschrank (Kirsch) unter einer Photoperiode von 16L:8D bei
20°C (Tag) und 15°C (Nacht) gehalten. Die Raupen für den Infektionsversuch
wurden mit derselben Weizenkeimdiät (Abb. 3) ad libitum gefüttert wie die Raupen
des Goldafters.
8
Abb. 3: Schwammspinnerraupen (L2) auf
Weizenkeimdiät.
Abb. 4: Schwammspinnerraupe (L5) in
Petrischale mit Weizenkeimdiät.
Tab. 1: Zusammensetzung von 1,0 kg Weizenkeimdiät (Bell et al.,1981).
Inhaltsstoffe
Menge
Trinkwasser
815 ml
Agar, fein gemahlen (Sigma-Aldrich)
Weizenkeime (Dr. Grandel GmbH)
15 g
120 g
Casein (Sigma)
25 g
Vitamin Mix (Bio-Serv)
10 g
Ascorbinsäure (Vit. C) (Sigma)
5g
Wesson Salz ohne Eisen (Bio-Serv)
8g
Eisencitrat (Sigma)
0,1 g
Sorbinsäure (Sigma) *
2g
Methyl Paraben (Sigma-Aldrich) *
1g
Chlortetracyclin, HCl (Appli Chem) *
0,1 g
(*) zur Konservierung
9
2.2
Überwinterung unter kontrollierten Bedingungen
Für den Überwinterungsversuch unter kontrollierten Bedingungen wurden jene
Raupen herangezogen, welche aus den Eigelegen der Dauerzucht schlüpften. Dazu
wurden alle wie in Kapitel 2.1 beschriebenen Eigelege Anfang August abgesammelt
und in zwei Gruppen aufgeteilt. Ein Teil der Eigelege wurde in Kunststoffbecher
(10x7 cm) (Abb. 5) gesetzt und für den Überwinterungsversuch im Labor im
Klimaschrank (Sanyo Incubator, Modell: MIR-533) mit einer Photoperiode von 16h
Licht und 8h Dunkelheit, (Langtag LT, 16L:8D) bei einer Temperatur von 20°C
gehalten (LT 20°C) wie zuvor schon die Goldafterpuppen der Laborzucht. Der
Raupenschlupf
erfolgte
nach
ca.
acht
Tagen
(erstes
Larvenstadium
L1).
Anschließend wurden je 100 Raupen auf 20 Kunststoffbecher aufgeteilt. 18 Becher
(Abb. 6) wurden bis zum Versuchsbeginn unter den oben genannten Bedingungen
gehalten, die restlichen beiden wurden im Klimaschrank (Memmert, Model: ICP 500)
unter Kurztagbedingungen (KT 8h Licht und 16h Dunkelheit, 8L:16D) bei 20°C
aufbewahrt (KT 20°C). Die Raupen verblieben vom Mitte August bis Mitte September
im ersten Larvenstadium.
Abb. 5: Kunststoffbecher (10x7 cm) mit
Gazedeckel zur Haltung von L1 Raupen.
2.3
Abb. 6: Haltung der Raupen in
Kunststoffbechern und Plastikboxen im
Klimaschrank.
Überwinterung im Freiland
Für den Überwinterungsversuch im Freiland wurde ein Teil der Eigelege (Abb. 7) auf
Plastikboxen aufgeteilt (Abb. 8) und im Institutsgarten aufgestellt.
10
Der Schlupf der Raupen in den Boxen erfolgte zeitgleich mit dem der Tiere in den
Kunststoffbechern in den Klimaschränken (vergleiche 2.2). Auch diese Raupen
verblieben von Mitte August bis Mitte September im ersten Larvenstadium. Bis
Oktober wurden die Raupen in den Boxen belassen und regelmäßig mit
Rosenblättern (Rosa sp.) gefüttert. Dazu wurden Zweige von Rosensträuchern
geschnitten und in Zentrifugenröhrchen (50 ml) gesteckt, die mit einer Mischung aus
Wasser und Pflanzennährlösung gefüllt waren, um die Zweige frisch zu halten. Nach
einem oberflächlichen Fensterfraß sponnen sich die Raupen in Gespinste zwischen
den Blättern ein (Abb. 9), von denen aus sie einen Skelettierfraß vollzogen (Abb. 10).
Abb. 7: Eigelege bedeckt mit Afterwolle.
Abb. 8: Plastikboxen mit Eigelegen.
Abb. 9: Rosenzweige in Zentrifugalröhrchen mit Nährlösung; Raupengespinste.
Abb. 10: Junge Goldafterraupen
Gespinst und Fensterfraß am Blatt.
(L1),
11
Nachdem sich die Raupen in den im Institutsgarten gelagerten Boxen ins zweite
Larvenstadium (L2) gehäutet hatten, wurden Anfang Oktober einzelne Gespinste zu
je ca. 100 Raupen abgesammelt und auf vier Netze aufgeteilt (Abb. 11).
Die Gespinstnetze wurden anschließend mit einem Faden an Zweige eines
Weißdornstrauches
(Crategus
sp.)
im
Institutsgarten
gebunden
und
mit
Kunststoffnetzen (Material: Propyltex 05-280/41) (Abb. 12) überstülpt, die mit
Kabelbindern verschlossen wurden. Im Zeitraum von November bis Februar wurden
von jedem Sack zehn Raupen für die physiologischen Untersuchungen (Respiration,
Frosthärte) entnommen. Die Raupen, die im März und April getestet wurden,
stammten aus verschiedenen Säcken. Die restlichen Tiere verblieben während des
Winters in den Freilandsäcken im Institutsgarten.
Um das Überwinterungsverhalten von parasitierten Goldafterraupen im Freiland
untersuchen zu können, wurden aus den Boxen im Klimaschrank LT 20°C nach der
Häutung der Raupen ins L2 40 Raupen entnommen und G. liparidis Weibchen zur
Eiablage angeboten. Nach erfolgter Parasitierung wurden die Tiere in „künstlichen
Gespinsten“ zu je 20 Stück (aufgeteilt auf zwei Kunststoffnetzsäcke) an einem
Weißdornzweig zur Überwinterung ausgebracht.
Abb. 11: Netz mit Goldaftergespinsten.
Abb. 12: Kunststoffnetzsack mit Raupen
auf Weißdorn.
12
Zusätzlich wurde ein Gazenetz mit einem Datenlogger (Tinytag Plus, Gemini Data
Logger) an einen Zweig gebunden, um die Lufttemperatur während des
Versuchszeitraumes aufzuzeichnen.
Die Überwinterungsnester, welche Anfang November von Mehlbeerbäumen
abgesammelt wurden, verblieben während des Winters in den zwei Plastikboxen.
Von November bis April wurden pro Monat zehn Raupen aus den Boxen entnommen
und für physiologische Untersuchungen verwendet. Der Rest überwinterte im
Institutsgarten.
Insgesamt
wurden
vier
Versuchsgruppen
gebildet,
die
sich
durch
die
Haltungsbedingungen in den Klimaschränken bzw. im Freiland an verschiedenen
Futterpflanzen ergaben (Tab. 2).
Tab. 2: Versuchsgruppen.
Versuchsgruppen
Abkürzung
Klimaschrank Langtag
LT 20°C
Klimaschrank Kurztag
KT 20°C
Freiland auf Weißdorn
FL 1
Raupen in Gruppen in Kunststoffnetzen auf
Weißdorn im Institutsgarten, Weißdornblätter
FL 2
Raupen von Mehlbeerbäumen, im Nov. gesammelt,
Haltung in Plastikboxen, Mehlbeerblätter
(Crataegus sp.)
Freiland auf Mehlbeere
(Sorbus aria)
2.4
Beschreibung
Raupen im Klimaschrank unter
Langtagbedingungen (16L:8D) bei 20°C, in
Kunststoffbechern á 100 Stück, Weizenkeimdiät
Raupen im Klimaschrank unter Kurztagbedingungen
(8L:16D) bei 20°C, in Kunststoffbechern á 100
Stück, Weizenkeimdiät
Physiologische Messungen während der Überwinterung
Um die physiologischen Veränderungen während der Überwinterungsphase zu
untersuchen, wurden im Zeitraum Oktober bis April einmal pro Monat bei zehn
Raupen aus jeder Versuchsgruppe die Atmungsaktivität und Frostresistenz bestimmt.
Aufgrund der ab November in den Klimaschränken auftretenden erhöhten Mortalität
der Versuchsraupen, welche sich bis Jänner fortsetzte, konnten die Messungen mit
den Tieren aus LT 20°C nur im Zeitraum Oktober bis Jänner, mit Tieren aus KT 20°C
im Zeitraum November bis Dezember durchgeführt werden. Die Raupen aus den
Versuchsgruppen FL 1 und FL 2 wurden im Zeitraum November bis April untersucht.
13
2.4.1
Respiration
Zur Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs der Goldafterraupen während des
Überwinterungszeitraumes wurde ein am Institut vorhandenes Mikrorespirometer
(Eigenbau) (Abb. 13) verwendet. Das Grundprinzip dabei ist die Bestimmung des
Sauerstoffverbrauches durch ein volumetrisches Respirometer mit kontantem Druck
nach Scholander et al. (1952). Das Prinzip basiert auf einem Druckausgleichsystem.
Gemessen
wird
der
Druckausgleich
zwischen
der
Respirations-
und
der
Kompensationskammer.
Abb. 13: Mikrorespirometer für zehn Parallelmessungen.
Die Anlage besteht im Wesentlichen aus vier Bauelementen (Manometerblock (A),
Mikroliterspritze (B), Mikrometerschraube (C) und Schiebemotor (D)), die auf einer
Grundplatte aus 15 mm starkem Plexiglas montiert sind. Die einzelnen Elemente sind
in Abb. 14 dargestellt.
Der Manometerblock (A) besteht aus einem Manometer (1) in der Form von
gegabelten Säulen gefüllt mit Öl, einem Manometerverschluss (4) und je zwei Stößel
(Manometerverschlussbügel) zur Ölstandregulierung. Von diesen aus führen zwei
Längsbohrungen zu dem Respirations- und Kompensationsgefäß (2 und 3), welche
mit Dichtungsringen versehen sind. Im Respirationsgefäß (Objektkammerbehälter)
befindet sich am Boden ein mit 20% Kalilauge getränktes Wattestück. Über das
Wattestück wird ein Netz gelegt, damit die Tiere nicht mit der Kalilauge in Berührung
kommen. Der Ausgleich des im Respirationsgefäß verbrauchten Sauerstoffes wird
durch Nachschieben von Luft aus einer gasdichten Mikroliterspritze erreicht (B). Die
14
Spritzen können je nach Sauerstoffverbrauch an das Messobjekt angepasst werden.
Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurden 100 µl Spritzen (Hamilton)
verwendet. Von der Spritze aus führt eine abgedichtete Teflonkanüle zum
Respirationsgefäß.
Die
senkrecht
über
der
Spritze
angebrachte
Einbaumikrometerschraube (C) bewirkt den Vorschub des Spritzenstempels. Der
Antrieb des Vorschubes erfolgt mit einem eingebauten Schiebemotor (D). Der
Schiebemotor ist mit einer Infrarot-Lichtschranke, bestehend aus einer Lichtquelle
und einem Phototransistor, verbunden, welche Niveauänderungen des Ölpegels
registriert. An den Lichtschranken sind zwei Feinjustierschrauben angebracht, mit
welchen der Ölstand in den Säulen justiert werden kann.
Abb. 14: Schematische Darstellung eines Mikrorespirometers (Pruscha et al., 1983).
15
Die Mikrorespirationsanlage befindet sich während des Messvorgangs in einem
Wasserbad mit konstanter Temperatur, welches vor der Messung auf die
gewünschte
Temperatur
akklimatisiert
werden
muss.
Änderungen
der
Wassertemperatur während des Messvorganges rufen Volumsänderungen hervor,
die zu Messfehlern führen.
Im ersten Schritt wurden die Respirationsgefäße mit den Goldafterraupen bestückt
und auf die Anlage geschraubt. Nach dem Einstellen des Steuerelementes, dem
manuellen Öldruckausgleich mit den Stößeln am Manometer und der Nachjustierung
mit den Feinjustierschrauben an der Lichtschranke, wurde der Messvorgang
gestartet. Während des Messvorgangs verbrauchten die Tiere im Respirationsgefäß
Sauerstoff (O2) und produzierten Kohlendioxid (CO2), das von der Kalilauge
gebunden wurde; es entstand ein Unterdruck durch den der Ölpegel in den Säulen
stieg. Dieser Anstieg wurde von einer Lichtschranke überwacht. Von der
Lichtschranke aus wurde über ein Relais der Antriebsmotor in Gang gesetzt und so
von der Mikrometerschraube Luft aus der Spritze zum Druckausgleich in die
Respirationskammer gedrückt. Gleichzeitig tastete die Lichtschranke die Schlitze der
auf dem Ritzel am Motor aufgepressten kupferkaschierten Scheibe ab. Sobald sich
die Scheibe drehte, wurde jedes Freigeben des Lichtstrahls als Impuls gewertet
(Scholander et al., 1952; Pruscha et al., 1983). Die Impulse (counts) (Abb. 15)
wurden von einem Computer aufgezeichnet. Sie ermöglichten die Berechnung, wie
viel µl Luftsauerstoff in die Anlage gedrückt wurden. In der vorliegenden Arbeit
wurden jeweils zehn Parallelmessungen pro Versuchsgruppe durchgeführt. Die
Wasserbadtemperatur betrug bei allen Messvorgängen konstante 20°C. Ein
Messvorgang dauerte ca. 12 Stunden. Die Raupen wurden im Vorfeld der
Respirationsmessung mit einer Mikrowaage (Mettler Toledo, Model: MT 5) (Abb. 16)
gewogen.
16
Abb. 15: Kontinuierlicher O2-Verbrauch (counts) von fünf E. chrysorrhoea Raupen (R1-R5) in
der Respirationskammer (Mikrorespirometer) innerhalb von 12 Stunden.
Abb. 16: Mikrowaage (METTLER TOLEDO, Model: MT 5) zur Bestimmung des
Raupengewichtes.
17
Nach der Messung wurden die Daten in ein Excel File transformiert und ausgewertet.
Dabei wurden die counts pro Minute und mit einem Volumsfaktor für die
Hamiltonspritze multipliziert und dann auf den Stundenverbrauch umgerechnet.
Dieser Wert wurde dann durch das Raupengewicht dividiert, um den O2-Verbrauch
pro Gewichtseinheit zu bestimmen. Aus der Bezugsgröße µl*h-1*mg-1 lassen sich
unterschiedlich schwere Raupen miteinander vergleichen.
Des Weiteren wurden die Monatsmaxima, -minima und -mittelwerte der Temperatur
im Freiland den Messergebnissen der Versuchsgruppen FL 1 und FL 2
gegenübergestellt. Um den Einfluss der Temperatur auf den O2-Verbrauch der Tiere
beurteilen zu können, wurden im ersten Schritt die Temperaturmaxima, -minima und
-mittelwerte jeweils am Messtag und in der Messwoche aus den stündlichen
Aufzeichnungen
des
Datenloggers
errechnet.
In
der
Folge
wurden
die
Sonnenstunden am Messtag (Tageslichtdauer) und der Messbereich der jeweiligen
Woche aus den Aufzeichnungen der Zentralanstalt für Meteorologie ZAMG
(www.zamg.at) ausgelesen. Die Sonnenstunden geben Auskunft über die jeweilige
Photoperiode, denen die Tiere im Freiland ausgesetzt waren. Anschließend wurden
die Daten beider Gruppen miteinander verglichen.
2.4.2
Frostresistenz
Um Aussagen über die Frostresistenz der überwinternden Raupen machen zu
können, wurde der Unterkühlungspunkt (Super Cooling Point SCP) bestimmt. Als
SCP
bezeichnet
man
jene
Temperatur,
bei der
sich
Eiskristalle
in
der
Körperflüssigkeit der Tiere bilden. Da bei dieser Reaktion Wärme freigesetzt wird
(exotherm), kann diese als kurzfristige Erhöhung der Körpertemperatur gemessen
werden. Der Punkt, bei dem es während der Abkühlphase zu einem plötzlichen
Temperaturanstieg kommt, wird als SCP bezeichnet (Abb. 17).
Zur Bestimmung des SCP wurden die Raupen aus dem Respirationsversuch
verwendet. Dabei wurden die Raupen einzeln in 2 ml Zentrifugenröhrchen (SIGMAALDRICH) eingeklemmt. Der Deckel des Röhrchens wurde im Vorfeld angebohrt,
sodass man die Messelektrode an die Raupe anlegen konnte. Darüber wurde ein
weiteres Zentrifugenröhrchen (25 ml) mit angebohrtem Deckel als Isoliermantel
angesetzt. Anschließend wurden die Messelektroden mit den Tieren in einer
Tiefkühltruhe (Liebherr COMPUTER CONTROL) bis auf ca. -35 °C abgekühlt. Bei
18
den
Messelektroden
handelte
es
sich
um
Thermoelemente
aus
zwei
Metalllegierungen. Bei Temperaturänderungen registrieren sie eine Spannung, die
an das Aufzeichnungsprogramm weiterleitet wird. Aufgezeichnet wird zunächst der
stetige Abfall der Temperatur. Beim Erreichen des SCP wird durch die
Kristallisationsbildung
ein
Temperaturanstieg
registriert
(Abb.
17).
Ist
das
Körperwasser des Tieres vollständig gefroren, fällt die Temperatur wieder ab. Die
Aufzeichnungen der Temperaturkurven wurden nach der Messung in ein Excel File
transformiert
und
die
Temperaturen
des
SCP
aus
den
Aufzeichnungen
herausgefiltert.
Auch
bei
den
Auswertungen
der
Frostresistenzmessungen
wurden
die
Monatsmaxima, -minima und -mittelwerte der Temperatur aus den Aufzeichnungen
des Datenloggers berechnet und den Messergebnissen der Versuchsgruppen FL 1
und FL 2 gegenübergestellt.
°C 0
-5
-10
-15
-20
SCP
-25
Abb. 17: Typischer Messverlauf zur Bestimmung des SCP (°C) einer E. chrysorrhoea
Raupe. Bei der Bildung von Eiskristallen im Körper der Raupe (SCP) kommt es zu einem
Temperaturanstieg von ca. 5°C (exotherme Reaktion).
19
Abb. 18: Messstation mit Messelektroden, Tiefkühlelement und Computer.
2.5
Überwinterung von parasitierten Raupen
Zur Untersuchung des Überwinterungsverhaltens von parasitierten Raupen des
Goldafters wurden Tiere verwendet, die ab September im Klimaschrank bei LT 20°C
auf Weizenkeimdiät gehalten wurden. Nach der Häutung der Goldafterraupen ins
zweite Larvenstadium wurden ab Mitte September laufend Raupen den Wespen zur
Eiablage angeboten (Abb. 19). Die Wespen nahmen die Wirtsraupen an und legten
mehrere Eier in die Leibeshöhle ab. Bei der Eiablage nahmen die Weibchen eine
charakteristische Stellung ein, bei der sie das letzte Beinpaar nach dorso-caudal
streckten. Jede Goldafterraupe wurde von nur einem Wespenweibchen parasitiert.
Danach wurden die Tiere in kleinen Gruppen in Kunststoffbecher mit Weizenkeimdiät
gesetzt. Einige Becher wurden bis zum Zeitpunkt der Sektion in den Klimaschrank
bei KT 20°C gestellt. Die übrigen wurden im Klimaschrank unter LT 20°C gehalten.
Mit
der
Photoperiode
8L:16D
(KT)
sollten
Tageslichtverhältnisse
in
den
Wintermonaten simuliert werden. Tiere mit der Photoperiode 16L:8D (LT) dienten als
Kontrollgruppe. Beide Gruppen wurden bei konstanten 20°C gehalten, um den
Einfluss der Temperatur auf die Entwicklung der Parasitoiden und der Wirtsraupen
während der Überwinterung ausschließen zu können.
Mitte November wurden weitere Tiere im zweiten Larvenstadium aus der
Versuchsgruppe LT 20°C parasitiert und in einen Klimaschrank (Liebherr profi line,
Modell: LC 5000) bei 4°C unter Dauerdunkel gehalten. Damit sollte die langfristige
Überlebensmöglichkeit
der
Parasitoiden
in
einem
Überwinterungswirt
unter
simulierten Winterbedingungen getestet werden.
20
Abb. 19: Parasitierungsdose mit Raupen des Goldafters und G. liparidis Wespen. Die
Raupen wurden mit der Federpinzette fixiert und den Wespen zum Anstich angeboten.
Um den Entwicklungsfortschritt der Parasitoiden in den Raupen festzustellen, wurden
die Wirtsraupen von Oktober bis November regelmäßig seziert und das
Entwicklungsstadium der Parasitoiden dokumentiert. Die Raupen wurden im Vorfeld
der Sektion mit einer Mikrowaage (METTLER TOLEDO, Model: MT 5) gewogen
(Abb. 16) und ihre Kopfkapselbreite bestimmt. Die Sektion erfolgte unter einem
Auflichtmikroskop (Wild Herresburg, Model: Wild M8). Der Körperinhalt der Raupe
wurde mit etwa 1 ml Wasser gespült, mit einer Pipette aufgesaugt und auf einen
Objektträger aufgebracht. Im Durchlichtmikroskop (Reichard Polyvar) wurde
anschließend die Anzahl der Parasitoideneier bzw. -larven bestimmt. Die
Parasitoidenstadien wurden mit einer Digitalkamera (Auflichtmikroskop Model: Nixon
COOLPIX
P6000;
Durchlichtmikroskop
Nikon
DIGITAL
SIGHT
DS-
Fi1)
dokumentiert. Der Entwicklungsstand der Parasitoiden in den Wirtsraupen bei 4°C
Dauerdunkel wurde in monatlichen Abständen von Mitte Dezember bis Mitte Februar
untersucht.
21
Abb. 20: Glyptapanteles liparidis (a) Parasitoidenei (Durchlicht), (b) Parasitoidenlarve (L1)
mit sklerotisierten Mundwerkzeugen (MWZ) und Eihautresten (Durchlicht), (c)
Parasitoidenlarve (L1) ausgespült aus einer E. chrysorrhoea Raupe (Auflicht).
2.6
Mikrosporidieninfektion
Ab Mitte November kam es bei den unparasitierten Tieren in den Klimaschränken LT
20°C und KT 20°C zu einer erhöhten Mortalität. Da die Tiere in den Wochen zuvor
kaum mehr Nahrung zu sich genommen hatten, wurde angenommen, dass sie
aufgrund von Unterernährung und dem daraus resultierenden Energieverlust
verstarben.
22
Um mögliche Mortalitätsgründe festzustellen wurden Quetschpräparate der toten
Raupen im Phasenkontrast mit einem Durchlichtmikroskop (Nikon ECLIPSE E800,
Leica STEREOVAR) untersucht. Dabei wurde eine Infektion mit Mikrosporidien
festgestellt (Abb. 21).
In den Folgemonaten wurden die für physiologische Messungen herangezogenen
Raupen auf Befall kontrolliert (Versuchsgruppen LT 20°C, FL 1 und FL 2 im Zeitraum
Jänner 2013 bis April 2013). Raupen der Gruppe KT 20°C waren alle Ende
Dezember verstorben, daher liegen für diese Versuchsgruppe keine Daten zur
Atmungsaktivität und Frostresistenz vor.
Abb. 21: Sporen
(Quetschpräparat).
von
Mikrosporidien
im
Körper
von
E.
chrysorrhoea
Raupen
Zur Bestimmung der Mikrosporidienart wurden Mitte Februar aus dem Pool der
gesammelten toten Raupen der Vormonate jeweils 30 Tiere mit positivem
Mikrosporidienbefall für Quetschpräparate entnommen und zusätzlich auf Infektionen
durch Pilze, Bakterien und Viren getestet. Zur Gewinnung von Sporen wurde die
gesamte Flüssigkeit der Präparate in einem Zentrifugenröhrchen (50 ml) gesammelt
und bei 3500 U/min 15 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Am Grund des
Zentrifugenröhrchens bildete sich ein Pellet, das Sporen enthielt. Der Überstand
wurde abpipettiert und verworfen. Das Pellet wurde mit einigen Tropfen Wasser
suspendiert und geschüttelt. Danach wurden etwa 0,5 ml der Sporenlösung in
Gefrier-Vials gefüllt und mit 0,5 ml Glycerol als Gefrierschutz überschichtet. Die Vials
wurden verschlossen und in Flüssigstickstoff (Dewar) gelagert.
23
Die restliche Suspension wurde für einen Infektionsversuch mit Raupen des
Schwammspinners verwendet. Mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer (Abb. 22)
wurde im Phasenkontrast mit einem Durchlichtmikroskop die Sporenkonzentration in
der Suspension bestimmt. Die Zählkammer besteht aus einer oberen und unteren
Kammer, welche etwa 10 µl Sporensuspension aufnehmen. In beiden Kammern
wurde jeweils das mittlere Quadrat mit 25 Kästchen ausgezählt (Abb. 23) und auf die
Gesamtmenge an Sporen hochgerechnet. Für den Folgeinfektionsversuch wurde die
Konzentration der isolierten Sporen mit Wasser auf 1000 Sporen/µl eingestellt.
Abb. 22: Neubauer-Zählkammer.
Abb. 23: Zähl-Kästchen von NeubauerZählkammer. Der mittlere Kreis wurde
ausgezählt,
(http://www.zaehlkammer.de/deutsch/neu
bauer.improved.html).
Zur Infektion wurden 48 Raupen des Schwammspinners am ersten Tag des dritten
Larvenstadiums verwendet, die vor der Infektion keine Nahrung aufgenommen
hatten. Im ersten Schritt wurden mit einem Skalpell 1-2 mm³ große Weizenkeimdiät
Futterstückchen abgeschnitten und mit einer Pinzette auf zwei Zellkulturplatten
(Corning, 24 well plates) verteilt. Danach wurde auf die Futterstücke 1 µl
Sporenlösung aufgetragen und die Raupen dazugesetzt. Nur jene Raupen, die das
Weizenkeimdiätstück innerhalb von 24 Stunden vollständig aufgefressen hatten,
24
wurden weiter verwendet. Am darauffolgenden Tag wurden die Raupen in
Kunststoffbecher mit Weizenkeimdiät umgesetzt und in einem Klimaschrank
(Liebherr, Model: UKS 2600 Index 20A/001) unter Langtag (16L:8D) bei 24°C (Tag)
und 18°C (Nacht) gehalten. Innerhalb von 24 Tagen wurden im Abstand von drei bis
vier Tagen jeweils drei Raupen seziert (Abb. 26). Dabei wurden von jeder Raupe
Mitteldarm, Fettkörper, Spinndrüsen, Gonaden und Malpighische Gefäße auf das
Vorhandensein von Sporen untersucht.
Abb. 24: Schwammspinnerraupe ventral geöffnet.
Obwohl die Raupen aus dem Freiland nach jeder Messung des SCP auf
Mikrosporidienbefall untersucht wurden, sollte überprüft werden, dass sich die
Sporen nicht erst nach der Überwinterungsphase bei höheren Temperaturen
entwickelten. Daher wurden im April und Mai je 30 Goldafterraupen aus den
Versuchsgruppen FL 1 und FL 2 abgesammelt. Im April wurden die Tiere in
Kunststoffbechern mit Weißdornblättern in den Klimaschrank LT 20°C gestellt und
laufend mit frischem Futter gefüttert. Im Mai verblieben die Raupen bis zum
Sektionszeitpunkt im Garten. Nach ca. 30 Tagen wurden alle Raupen seziert und auf
Mikrosporidienbefall untersucht.
25
2.7
Statistische Analysen
Die Statistische Auswertung erfolgte mit SPSS 21.0 für Windows und Excel 2010. Es
wurden die Mittelwerte und Standardfehler der einzelnen Versuchsgruppen
berechnet. Die Werte wurden im Vorfeld auf Abhängigkeiten geprüft. Signifikante
Unterschiede zweier Gruppen wurden mit stichprobenunabhängigem t-Test ermittelt.
Mittelwerte von mehr als zwei Gruppen wurden mit einer einfaktoriellen
Varianzanalyse
und
einem
Post-hoc-Test
(Scheffé)
getestet.
Die
Irrtumswahrscheinlichkeit (Signifikanzniveau) wurde auf P<0,05 gesetzt. Um lineare
Zusammenhänge
zwischen
einzelnen
Variablen
festzustellen,
wurde
für
normalverteilte Daten der Korrelationskoeffizient nach Pearson berechnet (Borz,
1999).
26
3.
Ergebnisse
3.1
Überwinterung von unparasitierten Euproctis chrysorrhoea Raupen
Die Ergebnisse zum Überwinterungsverhalten der Goldafterraupen beziehen sich auf
Beobachtungen unparasitierter Raupen aus allen Versuchsgruppen hinsichtlich
Entwicklung (Stadien), Fraßaktivität, Mobilität und Mortalität sowie Messungen des
Sauerstoffverbrauchs und der Frosthärte während der Überwinterung.
3.1.1
Überwinterung
unparasitierter
Raupen
unter
kontrollierten
Bedingungen
Mitte September häuteten sich die Raupen aller Versuchsgruppen (LT 20°, KT 20°C)
in
das
zweite
Larvenstadium
und
blieben
bis
Jänner
in
diesem.
Der
Häutungszeitpunkt der Tiere unter KT 20°C unterschied sich nicht von dem der LT
20°C Tiere. Nach der Häutung begannen die Raupen Gespinste zu weben, in welche
sie sich gesellig zurückzogen und die sie nur zur Nahrungsaufnahme verließen.
Anfang Oktober konnte ein Rückgang der Fraßaktivität in beiden Versuchsgruppen
beobachtet werden, der sich progressiv fortsetzte und auch durch laufenden
Futterwechsel nicht änderte. Anfang November kam es zum völligen Fraßstopp. Die
Raupen beider Gruppen (LT 20°C, KT 20°C) verhielten sich wieder gleich. Raupen,
welche durch Hygienemaßnahmen aus ihren Gespinsten gelöst und in einen
anderen Becher versetzt wurden, bildeten anfangs erneut Gespinste. Mitte
November wurden keine Gespinstnester mehr angelegt, es kam allerdings zu einer
erhöhten Mortalität in beiden Versuchsgruppen, welche sich bis Jänner fortsetzte und
damit endete, dass alle Individuen verstarben. Die toten Tiere wurden abgesammelt
und tiefgefroren (-20°C). Die Todesursache in der Versuchsgruppe LT 20°C war eine
Mikrosporidieninfektion (Kapitel 2.7, 3.3); in der Gruppe KT 20°C konnte keine
schlüssige Erklärung für das Sterben der Tiere gefunden werden.
3.1.2
Überwinterung unparasitierter Raupen im Freiland
Die unparasitierten Goldafterraupen aus der Versuchsgruppe FL 1, welche nicht für
physiologische Messungen im Zeitraum November bis April herangezogen wurden,
27
häuteten sich in etwa zeitgleich mit den Raupen in den Klimaschränken ins zweite
Larvenstadium und verblieben während des gesamten Überwinterungszeitraums im
Freiland in diesem Stadium. Anfänglich fraßen die Tiere noch an Blättern des
Weißdornstrauches. Mit dem Blattfall stellten sie jedoch die Fraßaktivität ein. Die
Überwinterung erfolgte gesellig in Überwinterungsnestern, welche schon vor dem
Aussetzen in die Freilandsäcke angelegt und danach nicht mehr geöffnet wurden.
Ende September wurden noch weitere Blätter des Weißdornstrauches in die bereits
bestehenden Überwinterungsnester miteingesponnen. Nach dem Blattfall wurden die
Nester nicht mehr verlassen. Anfang April häuteten sich die Raupen in das dritte
Larvenstadium. Mit dem Blattaustrieb am Weißdornstrauch Mitte April verließen sie
ihre Überwinterungsnester und vollzogen einen Skelettierfraß an den frisch
ausgetriebenen Blättern. Die Raupen nahmen in dieser Zeit sehr viel Nahrung zu
sich, sodass laufend neue Zweige in die Säcke eingepackt werden mussten.
Raupen, die sich ins vierte Larvenstadium gehäutet hatten, wurden abgesammelt
und in Plastikboxen mit eingefrischten Weißdornzweigen im Institutsgarten gehalten.
Die Verpuppung der Tiere erfolgte Ende Mai, Anfang Juli schlüpften die Falter.
Die Raupen der Gruppe FL 2 befanden sich bereits zum Sammlungszeitpunkt
(Oktober) im zweiten Larvenstadium. Die Überwinterung erfolgte in den an
Mehlbeerbäumen angelegten Überwinterungsnestern, die bis April nicht mehr
verlassen wurden. Die Entwicklung im Frühjahr verlief ähnlich wie die der
Versuchsgruppe FL 1. Um ihre Ernährung sicherzustellen wurden ihnen ab April bis
zur Verpuppung laufend eingefrischte Rosenzweige als Futter zur Verfügung gestellt.
Die Rosenblätter wurden von den Raupen, die ursprünglich von der Mehlbeere
stammten, sehr gut angenommen.
Zu einer nennenswerten Mortalitätsrate während der Überwinterung kam es in keiner
der beiden Freilandgruppen.
3.1.3
Atmungsaktivität während der Überwinterung
Weder bei den Tieren im Freiland noch bei den Tieren im Klimaschrank bei
konstanten 20°C und Langtag- bzw. Kurztagbedingungen konnte von Oktober/
November bis März eine Abnahme des Sauerstoffverbrauches festgestellt werden
(Tab. 3). Lediglich im April nahm die Atmungsaktivität der Raupen aus der
Versuchsgruppe FL 2 signifikant zu (Abb. 26).
28
Tab. 3 : Mittlerer O2-Verbrauch (MW±SE, µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea Raupen während
der Überwinterungsphase von Oktober 2012 bis April 2013.
Gruppe/
Monat
Okt
LT/20°C
KT/20°C
FL 1
FL 2
0,46±0,07 (7)
Nov
1,26±0,18 (10) b, A
0,46±0,04 (10) a, B
0,69±0,12 (9) a, A
0,67±0,06 (10) a, A
Dez
0,49±0,10 (10) a, A
0,53±0,06 (9) a, A
1,31±0,15 (7) a, B
0,40±0,04 (9) a, A
Jän
0,91±0,10 (10) ab, A
0,94±0,23 (10) a, A
0,96±0,11 (10) a, A
Feb
0,62±0,16 (6) a, A
1,08±0,16 (7) a, A
Mär
0,91±0,04 (10) a, A
0,71±0,13 (9) a, A
Apr
0,94±0,10 (9) a, A
2,01±0,26 (9) b, B
Werte in der Klammer geben die Anzahl der untersuchten Raupen an. Abkürzungen siehe
Tab. 2. Die Messergebnisse wurden innerhalb der Versuchsgruppen über alle Monate (a, b)
und zwischen den Versuchsgruppen in den einzelnen Monaten (A, B) auf signifikante
Unterschiede verglichen(P<0,05; ANOVA; Post-Hoc Scheffé bzw. Student´s t-Test).
Innerhalb der Versuchsgruppe LT 20°C gab es in den Monaten November und
Jänner eine signifikant höhere Atmungsaktivität als in den übrigen Monaten. Die
Messergebnisse waren in den Monaten Oktober (0,46±0,07 µl*h-1*mg-1) und
Dezember (0,49±0,10 µl*h-1*mg-1) annähernd gleich niedrig. Die Messergebnisse der
Tiere aus KT 20°C beziehen sich auf die Monate November (0,53±0,06 µl*h-1*mg-1)
und Dezember (0,46± 0,04 µl*h-1*mg-1) und unterscheiden sich nicht signifikant
voneinander (Tab. 3) (tFG17= 0,82; P=0,418 2-seitig). Zwischen den Gruppen LT 20°C
und KT 20°C bestand ein hoch signifikanter Unterschied im Monat November (Abb.
25). Die Tiere auf KT 20°C verbrauchten dabei signifikant weniger Sauerstoff als die
Tiere unter LT 20°C.
29
µl*h -1*mg-1
2,5
2,0
b
1,5
LT 20°C
ab
1,0
KT 20°C
a
a
0,5
B
A
A
A
0,0
Okt
Nov
Dez
Jän
Abb. 25: Mittlerer O2-Verbrauch (µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea Raupen (n=7-10) unter LT
20°C und KT 20°C während der Überwinterungsphase (Okt.-Jän.) im Klimaschrank. Die
Buchstaben über den Säulen geben signifikante Unterschiede innerhalb der Versuchsgruppe
LT 20°C im Verlauf der Untersuchung an (P<0,05; ANOVA; Post-Hoc Scheffé), die
Buchstaben in den Säulen geben signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen
LT 20°C und KT 20°C an (P<0,05; Student´s t-Test).
Die
mittleren
Respirationsraten
der
Raupen
aus
FL
1
schwankten
im
Untersuchungszeitraum zwischen 0,69±0,12 µl*h-1*mg-1 (November) bis 0,94±0,10
µl*h-1*mg-1 (April). Der höchste Wert konnte im Dezember mit 1,31±0,15 µl*h-1*mg-1
gemessen werden, danach erfolgte eine Abnahme der Atmungsaktivität, welche im
Mittel um die 0,35±0,16 µl*h-1*mg-1 pro Monat betrug. Ab März kam es dann wieder
zum einem Anstieg auf 0,91±0,04 µl*h-1*mg-1 (Tab. 3). Dennoch konnte kein
signifikanter Unterschied zwischen den Monaten festgestellt werden (Abb. 26).
Die Raupen der Gruppe FL 2 hatten im November einen mittleren O2-Verbrauch von
0,67±0,06 µl*h-1*mg-1; im Dezember fiel der Wert auf 0,40±0,04 µl*h-1*mg-1. Im
Jänner und Februar stieg die Atmungsaktivität wieder an (0,96±0,11 µl*h-1*mg-1 bzw.
1,08±0,16 µl*h-1*mg-1). Trotz steigender Außentemperaturen war der O2-Verbrauch
im März wieder niedriger; erst im April kam es zu einer Verdoppelung der
Atmungsaktivität. Die Raupen wiesen einen O2-Verbrauch von 2,01±0,26 µl*h-1*mg-1
auf (Tab. 3).
30
Abb. 26: Mittlerer O2-Verbrauch (µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea Raupen (n=6-10) der
Versuchsgruppen FL 1 und FL 2 während der Überwinterungsphase (Nov.-Apr.) im Freiland.
Die Buchstaben über den Säulen geben signifikante Unterschiede innerhalb der
Versuchsgruppe FL 2 an (P<0,05; ANOVA; Post-Hoc Scheffé). Die Werte innerhalb der
Versuchsgruppe FL 1 unterscheiden sich nicht signifikant. Die Buchstaben in den Säulen
geben signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen FL 1 und FL 2 an (P<0,05;
Student´s t-Test). Zusätzlich angegeben sind die Monatsmaxima (MAX), -minima (MIN) und
-mittelwerte (MW) der Temperatur.
Zwischen den beiden Freilandgruppen (FL 2, FL 1) lassen sich signifikante
Unterschiede im O2-Verbrauch in den Monaten Dezember und April erkennen.
Während die FL 1 Tiere im Dezember den höchsten Wert aufwiesen, verbrauchten
die FL 2 Tiere sehr wenig O2, im April war es umgekehrt (Abb. 26).
Eine Betrachtung der Tagesmittelwerte der Temperatur und Sonnenstunden am
jeweiligen Messtag bzw. der Messwoche zeigte folgende Ergebnisse. Die
Tagesmittelwerte der Temperatur schwankten bei den FL 1 Tieren zwischen den
einzelnen Messtagen von November bis Februar lediglich um 1-3°C; von Februar bis
April stieg die Temperatur von Monat zu Monat um 5-7°C an. An den Messtagen der
FL 2 Tiere schwankten die Temperaturen in den ersten fünf Monaten um 3-7°C; im
März war die Tagestemperatur um 8,6°C niedriger als am Messtag im Februar und
im April war die Temperatur am Messtag um 15°C höher als im März (Tab. 4).
Die Sonnenstunden schwankten zwischen den einzelnen Messtagen bei beiden
Versuchsgruppen nur um einige Minuten. In den Messwochen ergaben sich
31
hinsichtlich
des
Temperaturverlauf
und
der
Lichtphasen
ähnliche
Schwankungsbereiche. Auffallend war jedoch die Variabilität der Monats-, Tagesund Wochenmittelwerte der Temperatur in manchen Monaten. So schwankten die
Temperaturmittelwerte im März in der Gruppe FL 1 um 4-6°C und in der Gruppe FL 2
im Februar um die 3-7°C (Tab. 4, rote Umrandungen). Betrachtet man die Monate
Dezember und Jänner, in welchen sowohl bei den Tieren aus FL 1 (Abnahme) und
FL 2 (Zunahme) erhebliche Unterschiede im O2-Verbrauch festgestellt wurden, so
war im Dezember der Tagesmittelwert der Temperatur um etwa 1,0°C niedriger als
im Jänner; bei den FL 2 Tieren unterscheiden sich die Tagesmittelwerte um mehr als
2,5°C. Die Lichtphase unterschied sich nur um fünf Minuten. An den Messtagen für
beide
Freilandgruppen
im
April
herrschten
annähernd
gleiche
Temperaturbedingungen (Schwankung 0,1°C), trotzdem war der O2-Verbrauch der
FL 2 Tiere mehr als doppelt so hoch als der Verbrauch bei den FL 1 Tieren. (Tab. 4).
Tab. 4: Temperaturmittelwerte für Monat MMw, Tag TMw und Woche WMw und
Sonnenstunden (Lichtphasen) am Messtag und in der Kalenderwoche (KW), sowie der
mittlere O2-Verbrauch (MW± SE, µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea Raupen aus den Gruppen
FL 1 und FL 2.
Gruppe
FL 1
FL 2
Messtag
KW
MMw
TMw
WMw
Lichtphase
Lichtphase
°C
°C
°C
Messtag(h)
KW(h)
O2-
Anz.
Verbrauch
Tiere
µl/mg/h
(n)
31.10.
44
6,7
3,8
4,2
9,58
9,46-10,04
0,69±0,12
9
10.12.
50
0,5
1,8
-1,0
8,26
8,21-8,26
1,30±0,15
7
3.1.
1
0,2
2,8
3,4
8,28
8,25-8,31
0,94±0,23
10
3.2.
5
0,9
2,1
4,3
9,37
9,20-9,37
0,61±0,16
6
11.3.
11
3,1
7,2
1,7
11,38
11,38-11,59
0,91±0,04
10
19.4.
16
11,9
13,9
14,8
13,54
13,40-14,00
0,94±0,10
9
6.11.
45
6,7
6,7
7,6
9,40
9,25-9,42
0,67±0,06
10
6.12.
49
0,5
0,2
-0,4
8,31
8,27-8,35
0,40±0,04
9
3.1.
1
0,2
2,8
3,4
8,28
8,25-8,31
0,96±0,11
10
1.2.
5
0,9
7,4
4,3
9,31
9,20-9,37
1,08±0,16
7
15.3.
11
3,1
-1,2
1,7
11,52
11,38-11,59
0,71±0,13
9
14.4.
15
11,9
13,8
10,6
13,37
13,17-13,37
2,01±0,26
9
Abkürzungen siehe Tab. 2. Signifikante Unterschiede siehe Tab. 3. Für die
Wochenmittelwerte wurden die Mittelwerte für Temperatur und Lichtphasen aus den
Tageswerten errechnet. Die Temperaturdaten wurden von einem Datenlogger im
Institutsgarten abgelesen, die Werte für die Lichtphasen stammen von der Homepage der
ZAMG (www.zamg.at).
32
In den Abb. 27 und 28 ist ersichtlich, dass weder die Temperaturmaxima bzw.
-minima am Messtag (Ausnahme März) (Abb. 27), noch die in der jeweiligen
Messwoche (Abb. 28) große Schwankungen aufwiesen.
(a)
µl*h -1*mg-1 4,0
25
9,58h
8,26h
8,28h
9,37h
11,38h
13,45h
3,5
°C
20
15
3,0
MAX
10
2,5
MW
5
2,0
MIN
0
FL 1
-5
1,5
-10
1,0
-15
0,5
-20
0,0
-25
31.10.
10.12.
3.1.
3.2.
11.3.
19.4.
Abb. 27: Mittlerer O2-Verbrauch (MW±SE, µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea Raupen aus der
Gruppe FL 1 (a) und der Gruppe FL 2 (b), sowie die Temperatur (°C) (Max, Min, MW) und
die Tageslichtdauer (h) am Messtag. Die Buchstaben (a, b) über den Säulen geben
signifikante Unterschiede innerhalb der Versuchsgruppe FL 2 an. Die Werte innerhalb der
Versuchsgruppe FL 1 unterscheiden sich nicht signifikant (P<0,05; ANOVA; Post-Hoc
Scheffé). Das Datum auf der x- Achse gibt den Tag der Messung an.
33
(a)
µl*h -1*mg-1
4,0
25
9,46-
3,5
10,04 h
8,21-
8,26h
8,25-
8,31h
9,20-
9,37h
11,38-
11,59h
13,40-
14,00h
°C
20
15
3,0
2,5
2,0
10
MAX
5
MW
MIN
0
FL 1
-5
1,5
-10
1,0
-15
0,5
-20
0,0
-25
31.10.
10.12.
3.1.
3.2.
11.3.
19.4.
Abb. 28: Mittlerer O2-Verbrauch (MW±SE, µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea Raupen aus der
Gruppe FL 1 (a) und der Gruppe FL 2 (b) am Messtag, sowie die Temperatur (°C) (Max,
Min, MW) und der Schwankungsbereich der Tageslichtdauer (h) in der jeweiligen
Messwoche. Die Buchstaben über den Säulen geben signifikante Unterschiede innerhalb
der Versuchsgruppe FL 2 an. Die Werte innerhalb der Versuchsgruppe FL 1 unterscheiden
sich nicht signifikant (P<0,05; ANOVA; Post-Hoc Scheffé).
34
3.1.4 Frostresistenz während der Überwinterung
Die Messung der Frostresistenz erfolgte mit jenen Tieren, an denen zuvor
Respirationsmessungen durchgeführt worden waren. Während des gesamten
Überwinterungszeitraumes konnte bei den Tieren aus allen Gruppen eine
kontinuierliche Abnahme des SCP festgestellt werden (Tab. 5).
Tab. 5: Supercooling Point (SCP) (MW±SE,°C) von E. chrysorrhoea Raupen während der
Überwinterungsphase von Oktober 2012 bis April 2013.
Monat/
Gruppe
LT/20°C
KT/20°C
FL 1
FL 2
Okt
-18,0±2,16 (8)
a
Nov
-21,0±2,05 (9)
a
-24,8±0,75 (9)
a
-23,3±2,42 (10)
a
-22,6±1,81 (10)
a
Dez
-23,0±1,61 (10)
a
-25,7±1,50 (10)
a
-26,9±1,90 (10)
a
-27,0±1,55 (10)
a
Jän
-24,0±1,64 (5)
a
-25,4±1,67 (9)
a
-24,5±2,40 (9)
a
Feb
-25,1±3,23 (6)
a
-24,5±1,90 (10)
a
Mär
-21,0±2,51 (7)
ab
-25,0±1,63 (9)
a
Apr
-10,7±0,82 (8)
b
-11,4±0,92 (9)
b
Werte in der Klammer geben die Anzahl der untersuchten Raupen an. Abkürzungen siehe
Tab. 2. Die Messergebnisse wurden innerhalb der Versuchsgruppen über alle Monate auf
signifikante Unterschiede geprüft. Zwischen den Versuchsgruppen gab es in den einzelnen
Monaten keine signifikanten Unterschiede (P<0,05; ANOVA; Post-Hoc Scheffé bzw.
Student´s t-Test).
Raupen der Gruppe LT 20°C wiesen SCP Werte von -18,0°C im Oktober und
-24,0°C im Jänner auf. Jeden Monat fielen die Werte um etwa 3°C. Raupen der
Gruppe KT 20°C wiesen im Vergleich zu LT 20°C im November zwar tiefere SCP
Werte (-24,8°C) auf, die Werte nahmen danach aber nur um etwa 1°C ab (-25,7°C)
(Tab. 5) (Abb. 29). Es konnte kein signifikanter Unterschied innerhalb der Gruppen
und zwischen den Gruppen festgestellt werden.
35
Okt
Nov
Dez
Jän
°C 0
-5
-10
-15
LT/20°C
-20
KT/20°C
-25
-30
-35
Abb. 29: Supercooling Point (SCP) (MW±SE, °C) von E. chrysorrhoea Raupen (n=5-10)
unter LT 20°C bzw. KT 20°C während der Überwinterungsphase (Okt.-Jän.). Die Werte
innerhalb und zwischen den Versuchsgruppen unterscheiden sich nicht signifikant (P<0,05;
ANOVA; Post-Hoc Scheffé bzw. Student´s t-Test).
Die Werte der SCP Messungen der Tiere aus FL 1 und FL 2 lagen nahe an jenen der
Versuchsgruppen LT 20°C und KT 20°C. Im November hatten die FL 1 Raupen
Werte von -23,3°C, die aus FL 2 -22,6°C. Die niedrigsten Temperaturen für
Einzeltiere waren -26,9°C bei FL 1 und -27,0°C für FL 2 im Dezember. Im Jänner und
Februar waren die SCP Temperaturen beider Gruppen etwa gleich (-25°C). Mit
steigender Temperatur nahmen die SCP Werte wieder ab und erreichten Mitte April
nur mehr -11,4°C. Die Werte lagen damit statistisch signifikant über den Werten der
Vormonate (P<0,05) (Tab. 5) (Abb. 30).
36
Abb. 30: Supercooling Point (SCP) (MW±SE, °C) von E. chrysorrhoea Raupen (n= 6-10)
unter FL 1 bzw. FL 2 während der Überwinterungsphase (Nov.-Apr.). Die Buchstaben unter
den Säulen geben signifikante Unterschiede innerhalb der Versuchsgruppe FL 1 bzw. FL 2
an (P<0,05; ANOVA, Post-Hoc Scheffé). Zusätzlich angegeben sind die Monatsmaxima
(MAX), -minima (MIN) und -mittelwerte (MW) der Temperatur (°C).
Um festzustellen, ob zwischen dem O2-Verbrauch und dem SCP der Raupen ein
linearer Zusammenhang besteht, wurde ein Pearson-Korrelationskoeffizient (r)
berechnet. Für die Versuchsgruppe LT 20°C ergab der Korrelationskoeffizient -0,06
(P=0,814), für KT 20°C wurde ein Korrelationswert von -0,21 (P=0,391) ermittelt, d.h.
in beiden Gruppen konnte kein linearer Zusammenhang festgestellt werden. Auch in
der Versuchsgruppe FL 1 gab es keinen linearen Zusammenhang (r=0,05; P=0,766).
Im Gegensatz dazu weisen die Werte der Gruppe FL 2 einen deutlicheren positiven
Zusammenhang (r=0,54; P=0,000) auf (Abb. 31). Je tiefer der Wert für den SCP lag,
desto niedriger war der O2-Verbrauch der Tiere.
37
(a)
(b)
0,0
1,0
2,0
3,0
°C 0
0,0
4,0
µl*mg-1*h -1
1,0
2,0
3,0
°C 0
4,0
µl*mg-1*h -1
LT 20°C
-5
r = 0,54
-5
-10
FL 1
-15
FL 2
KT 20°C
-10
-15
-20
r = 0,05
-25
-20
r = -0,06
-25
-30
r =-0,21
-30
-35
Abb. 31: Zusammenhang von O2-Verbrauch (µl*h-1*mg-1) und SCP (°C) in der
Überwinterungsphase von Oktober 2012 bis April 2013 in allen Versuchsgruppen (a) LT
20°C und KT 20°C, (b) FL 1 und FL 2; r Pearson-Korrelationskoeffizient.
3.2
Überwinterung von parasitierten Euproctis chrysorrhoea Raupen
Um das Larvenstadium der parasitierten Raupen zu ermitteln, wurden die
Kopfkapselbreiten aller Tiere aus den Versuchsgruppen LT 20°C und KT 20°C vor
der Sektion gemessen. Die Raupen der Versuchsgruppe LT 20°C wiesen eine
minimale Kopfkapselbreite von 0,74 mm und eine maximale Kopfkapselbreite von
1,02 mm auf (MW±SE; 0,89±0,13 mm). Die Kopfkapselbreiten der Raupen aus der
Versuchsgruppe KT 20°C lagen zwischen 0,80 mm und 1,10 mm (MW±SE;
0,91±0,17 mm) (Abb. 32). Die Raupen befanden sich zum Zeitpunkt der Sektion
damit alle im L2, unabhängig vom Zeitpunkt der Untersuchungen. Es bestand kein
signifikanter Unterschied zwischen den Werten der Versuchsgruppe KT 20°C und LT
20°C (tFG45,5=0,831, P=0,410 2-seitig).
38
Abb. 32: Kopfkapselbreiten (MW±SE; mm) von parasitierten E. chrysorrhoea Raupen der
Versuchsgruppen LT 20°C (n= 25) und KT 20°C (n=25) zum Zeitpunkt der Sektion (a) alle LT
20°C und KT 20°C Raupen, (b) getrennt nach Tagen nach der Parasitierung (days post
parasitism, dpp). Die horizontale Linie in den Boxplots zeigt den Median, die Länge der
Boxen repräsentieren die 25. und 75. Perzentilen. Die Fehlerbalken zeigen Minimal- und
Maximalwerte.
39
Die Parasitierung von Goldafterraupen durch G. liparidis Wespen gestaltete sich
schwierig. Wespen, die zuvor Raupen des Schwammspinners parasitiert hatten,
nahmen Raupen des Goldafters nicht als Wirte zur Eiablage an. Daher wurden nur
solche Wespen zur Parasitierung herangezogen, welche zwar begattet waren, aber
noch keine Eier abgelegt hatten. Je nach Größe und Behaarung der Goldafterraupen
dauerte die Eiablage einige Sekunden bis mehrere Minuten. Jedoch konnte die
Parasitierung mehrerer Raupen auch einige Stunden dauern. Kleine L2 Raupen und
stark behaarte Raupen wurden von den Wespen ungern oder gar nicht
angenommen.
Die
Wespen
injizierten
bei
der
Parasitierung
der
Goldafterraupen
der
Versuchsgruppen LT 20°C und KT 20°C im Durchschnitt 5 Eier pro Raupe. Die
Anzahl der in die Raupen abgelegten Parasitoide unterschied sich nicht signifikant
zwischen den Gruppen (tFG41=-1,243, P=0,221 2-seitig). Da sich das Raupengewicht
zwischen Parasitierungs- und Sektionszeitpunkt nicht änderte, wurde das Gewicht
der Tiere am Tag der Sektion dazu verwendet um festzustellen, ob zwischen
Körpergröße der Raupen und der Anzahl der sich in den Wirtsraupen entwickelnden
Parasitoide ein linearer Zusammenhang besteht (Korrelation nach Pearson). Das
Gewicht der parasitierten Raupen beider Versuchsgruppen war annähernd gleich (LT
20°C 3,56±0,95 mg; KT 20°C 3,59±1,53 mg) (Tab. 6). Es konnte kein linearer
Zusammenhang
zwischen
dem
Körpergewicht
der
Wirtsraupen
und
der
Parasitoidenanzahl in den Raupen (LT 20°C: r=0,13, P=0,573; KT 20°C: r=-0,38,
P=0,038) nachgewiesen werden (Abb. 33).
40
Tab. 6: Gewicht (MW±SE, mg) von E. chrysorrhoea Raupen und Anzahl der Parasitoide
(Median) pro Wirtraupe in den Versuchsgruppe LT 20°C und KT 20°C zum Zeitpunkt der
Sektion.
Tage
LT 20°C
KT 20° C
nach der
Körpergewicht
Parasitoide/Wirt
Körpergewicht
Parasitoide/Wirt
Parasitierung
(MW±SE, mg)
(Median)
(MW±SE, mg)
(Median)
5
4,11±0,86
4
4,65±2,16
2
6
4,61±1,82
11
2,31±1,52
7
7
3,46±1,47
5
4,89±2,21
8
8
3,10±0,83
7
2,93±1,71
5
9
2,91±0,71
3
3,13±1,77
3
10
4,44±1,11
8
4,86±2,20
6
11
2,40±0,46
5
3,80±1,95
4
17
3,49±0,34
4
2,03±1,43
7
Durchschnitt
3,56±0,95
5
3,59±1,53
5
Pro Sektionstag und Versuchsgruppe wurden jeweils 3 Raupen seziert, mit Ausnahme des
17. Tages, an dem in der Versuchsgruppe LT 20°C und KT 20°C nur 2 Raupen seziert
wurden.
Parasitoide/Raupe
20
15
LT 20°C
10
r = 0,13
KT 20°C
5
r = -0,38
0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Raupengewicht (mg)
Abb. 33: Zusammenhang Körpergewicht (mg) von E. chrysorrhoea Raupen (am
Sektionstag) und Anzahl der Parasitoide pro Wirtsraupe der Versuchsgruppen LT 20°C und
KT 20°C; r Pearson-Korrelationskoeffizient.
41
3.2.1
Überwinterung der Parasitoiden unter kontrollierten Bedingungen
Der Entwicklungsfortschritt der Parasitoiden in der Wirtraupe während der
Wintermonate unter Kurz- bzw. Langtagbedingungen und konstanten 20°C wurde
anhand von Raupen dokumentiert, die im Zeitraum Anfang bis Ende Oktober und
Anfang bis Mitte November von Brackwespenweibchen parasitiert worden waren.
In den Raupen der Gruppe KT 20°C, welche im Oktober parasitiert wurden, fanden
sich bis zum 5. Tag nach der Parasitierung nur Eier. Frühestens ab dem 7. Tag nach
der Parasitierung waren L1 Larven vorhanden, wobei bis zum 11. Tag auch
Parasitoideneier in den Raupen gefunden wurden; ab dem 17. Tag waren alle
Parasitoidenlarven geschlüpft (Abb. 34a).
Die Entwicklung der Parasitoiden der Gruppe LT 20°C verlief ähnlich wie in der
Gruppe KT 20°C. Bis zum Tag 5 nach Anstich wurden nur Eier in den Raupen
gefunden, ab dem 7. bis zum 17. Tag waren in den Wirtraupen sowohl Eier als auch
L1 Larven vorhanden. Erst ab dem 24. Tag fanden sich bei allen untersuchten
Raupen ausschließlich L1 Larven (Abb. 34b). In beiden Gruppen wurde am 9. Tag
ein Übergangsstadium zum Parasitoidenschlupf festgestellt, bei dem sich fertig
entwickelte L1 Larven noch in der Eihülle befanden (Abb. 34). Am 10. Tag schlüpften
die Parasitoidenlarven aus den Eiern.
KT 20°C/
Okt
(a)
L1
ÜG
Ei
5
7
8
9
10
11
Tage nach Parasitierung
17
24
42
LT 20°C/
Okt
(b)
L1
ÜG
Ei
5
7
8
9
10
11
Tage nach Parasitierung
17
24
Abb. 34.: Entwicklung von G. liparidis Parasitoiden in E. chrysorrhoea Wirtsraupen unter
konstanten Versuchsbedingungen. (a) LT 20°C und (b) KT 20°C. Die Parasitierung der
Raupen erfolgte im Oktober. ÜG = Übergangstadium (L1 Parasitenlarven befinden sich in
der Eihülle).
Die Entwicklung der Parasitoiden in im November parasitierten Wirtsraupen erfolgte
etwas langsamer. Bei den Raupen aus der Gruppe KT 20°C fanden sich bis zum 5.
Tag nach der Parasitierung ebenfalls nur Eier, ab dem 6. Tag waren L1 Larven
deutlich in der Eihülle sichtbar, ab dem 8. Tag fanden sich geschlüpfte L1
Parasitoidenlarven im Hämocoel der Wirtraupen. An allen Untersuchungstagen
wurden Eier gefunden, welche sich aber offenbar nicht mehr weiter entwickelten
(Abb. 35a).
In der Gruppe LT 20°C wurden erst ab dem 17. Tag nach der Parasitierung L1
Larven gefunden. Ein Übergangsstadium (Larven deutlich sichtbar in der Eihülle)
konnte wie bei KT 20°C ab dem 6. Tag festgestellt werden. Auch in dieser Gruppe
waren an allen Kontrollterminen (5-17 Tage nach der Parasitierung) Parasitoideneier
in den Wirtsraupen vorhanden (Abb. 35b).
43
KT 20°C/
Nov
(a)
L1
ÜG
Ei
5
6
7
8
Tage nach Parasitierung
11
17
LT 20°C/
Nov
(b)
L1
ÜG
Ei
5
6
7
8
9
Tage nach Parasitierung
11
17
Abb. 35: Entwicklung von G. liparidis Parasitoiden in E. chrysorrhoea Wirtsraupen unter
konstanten Versuchsbedingungen (a) LT 20°C und (b) KT 20°C. Die Parasitierung der
Raupen erfolgte im November. ÜG = Übergangstadium (L1 Parasitenlarven befinden sich in
der Eihülle).
44
Für die Untersuchung der langfristigen Entwicklung der Parasitoiden in den
Wirtsraupen über die Wintermonate wurden Tiere herangezogen, die im November
parasitiert und anschließend bei 4°C Dauerdunkel gehalten wurden. Bei den
Sektionen von je drei Raupen im Dezember, Jänner und Februar wurden lediglich
Eier, nie jedoch geschlüpfte Larven gefunden. Auch ein Übergangsstadium wurde
nicht beobachtet.
3.2.2 Überwinterung der Parasitoiden im Freiland
Säcke mit parasitierten Raupen in künstlich geformten Nestern aus Papiertüchern
wurden von Oktober bis Mitte April im Freiland belassen und danach aufgelöst. In
diesen Säcken fanden sich nur mehr tote Raupen. Da die Raupen zum Teil stark
vertrocknet waren, konnten sie nicht mehr seziert werden. Bei einer Raupe befand
sich ein bereits geöffneter Kokon der Brackwespe (Abb. 36). Die Wespe hatte sich
offenbar schon Anfang April aus der Goldafterraupe ausgebohrt und verpuppt.
Abb. 36: Kokon von G. liparidis mit geöffnetem Deckel neben einer E. chrysorrhoea Raupe
nach der Überwinterung im Freiland Mitte April.
Mitte Mai wurden 15 Goldafterraupen (L4) aus dem Überwinterungsversuch (FL 1
Gruppe) von G. liparidis Weibchen parasitiert und im Freiland gehalten. Bei drei
Raupen bohrten sich Anfang Juli ± 10 Brackwespenlarven pro Wirtsraupe aus,
welche sich neben den Raupen verpuppten (Abb. 37a). Nach ca. 5-8 Tagen
schlüpften aus diesen Kokons die adulten Wespen (Abb. 37b).
45
Abb. 37: (a) Kokons von G. liparidis neben der Wirtsraupe E. chrysorrhoea, (b) E.
chrysorrhoea Raupe mit Kokon und adulter G. liparidis Wespe.
3.3
Mikrosporidieninfektion
Raupen, die für die Überwinterungsversuche unter konstanten Bedingungen
gehalten wurden, waren zum Teil mit Mikrosporidien infiziert. Von den Raupen der
Gruppe LT 20°C, welche für die physiologischen Untersuchungen verwendet wurden,
waren im Jänner etwa 30% der Tiere mit Mikrosporidien befallen. In der Gruppe KT
20° C wurde dagegen keine Infektion festgestellt. Die Tiere dürften aufgrund anderer
Ursachen verstorben sein. Bei den Freilandtieren FL 1 und FL 2 wurde zu keinem
Zeitpunkt (Jänner, Februar, März, April) eine Infektion mit Mikrosporidien
nachgewiesen.
Der Versuch Raupen des Schwammspinners zu verwenden, um die aus den
Goldafterraupen stammenden Mikrosporidien zu identifizieren, missglückte. Die
Schwammspinnerraupen entwickelten sich nach der Inokulation mit einer 1000
Sporen Dosis pro Tier weiter und verpuppten sich schließlich ohne nennenswerte
Beeinträchtigung. Die Sektion der Raupen alle 3-4 Tage nach Inokulation ergab in
keinem der untersuchten Organe (Mitteldarm, Spinndrüsen Fettkörper, Malpighische
Gefäße, Gonaden) eine Entwicklung oder Vermehrung der Sporen.
46
4.
Diskussion
4.1
Überwinterungsstrategien Euproctis chrysorrhoea Raupen
Raupen des Goldafters unterbrechen für die Überwinterung ihre Entwicklung, in
Mitteleuropa ist dies das zweite (Skatulla & Schwenke, 1978) und in der Türkei das
vierte und fünfte Larvenstadium (Gürses, 1975; Eroğlu, 1992). In der vorliegenden
Arbeit war es ausschließlich das zweite Larvenstadium, in welchem die Tiere
überwinterten (Marschnig, 2013; eigene Ergebnisse). Ab Mitte September wurde eine
abnehmende Fraßaktivität der Raupen bei allen Versuchsgruppen beobachtet. Die
Raupen
im
Freiland
stellten
das
Fressen
ein,
sobald
der
Blattfall
der
Überwinterungssträucher (Crategus sp.) einsetzte. Ein Fraßstopp wurde auch bei
den Tieren im Klimaschrank beobachtet, die keinen Futtermangel (Weizenkeimdiät)
erlitten. Die Überwinterung fand in den im Herbst gesponnen Überwinterungsnestern
statt.
Raupen des Goldafters zählen zu den frostempfindlichen Arten, die vor dem Winter
gefrierhemmende Stoffe wie Glycerin, Zuckeralkohole, Proteine und/ oder Zucker im
Körper
einlagern.
Diese
Stoffe
setzen
den
Gefrierpunkt
des
Wassers
(Eiskristallbildung) in den Körperzellen und der Hämolymphe herab und verhindern
dadurch eine Zerstörung der Zellen und Gewebe durch die Ausdehnung des
Wassers beim Frieren (Lee, 1989; Duman et al., 1991; Moore & Lee, 1991; Storey &
Storey, 1991). Durch die hohe Konzentration an gefrierhemmenden Substanzen wird
das Frieren der Zellen bis zu Temperaturen, die in der Regel im Lebensraum nur
selten unterschritten werden, verhindert. Fällt die Temperatur unter einen kritischen
Wert (Super Cooling Point, SCP), sterben sie (Moore & Lee, 1991; Somme, 1999;
Danks, 2000; Sinclair et al., 2003). Generell nimmt die sogenannte Frosthärte bei
überwinternden Insekten während der Wintermonate zu und im Frühjahr wieder ab.
Die Raupen in der vorliegenden Arbeit verhielten sich ebenso: die SCP Werte
nahmen von Oktober bis Februar kontinuierlich ab und im Frühjahr wieder zu. Im
Dezember und Jänner überlebten einzelne Raupen Temperaturen von -35°C, im
April lag die durchschnittliche Frosthärte bei -11°C. In der Literatur werden für
Goldafterraupen an der Nordamerikanischen Ostküste letale Temperaturen von
-25°C angegeben (Gilliatt, 1921; Pantyukhov, 1964), Tiere aus kälteren Regionen in
Russland überlebten aber auch -32°C (Sacharov, 1930).
47
Zusätzlich zum Anstieg der Frosthärte kommt es während der Wintermonate zu einer
Reduktion des Stoffwechsels, was sich unter anderem in einer verringerten
Atmungsaktivität der überwinterten Insekten zeigt (Danks, 1987). Allerdings konnte
bei den Goldafterraupen keine kontinuierliche Abnahme der Respirationsrate
während der Überwinterung beobachtet werden. In der Gruppe LT 20°C waren in
den Monaten Oktober und Dezember die Respirationsraten sogar höher als in den
übrigen Monaten. Erhebliche Unterschiede ließen sich bei den im Freiland
gehaltenen Gruppen im Dezember und April feststellen. Die Annahme, dass die
Unterschiede der Messergebnisse bei den FL Versuchsgruppen durch verschiedene
Temperaturen an den Messtagen resultierten, konnte nur in wenigen Fällen bestätigt
werden. Während die Respirationsraten der Gruppe FL 1 im Dezember und April
nicht mit den Außentemperaturen korrelierten, zeigten die Respirationsraten der FL 2
Tiere, dass ein Rückgang der Temperatur, wie es im Dezember und März der Fall
war, zu einem niedrigen O2-Verbrauch führte; ein Anstieg der Temperatur im April
erhöhte den O2-Verbrauch. In beiden Fällen konnte gezeigt werden, dass die
Respirationsraten unabhängig von der jeweiligen Tageslänge (Photoperiode) waren.
Entwicklungsstopp,
Immobilität
und
eingestellte
Fraßaktivität
in
allen
Versuchsgruppen deuten darauf hin, dass Goldafterraupen im Herbst in eine echte
Diapause gehen, die sobald sie einmal induziert ist, unabhängig von äußeren
Faktoren (Temperatur und Photoperiode) abläuft. Die Zunahme der Frosthärte trat in
allen Gruppen auf, auch in jenen, welche bei 20°C gehalten wurden. Danks (1987)
und Frago et al. (2009) konnten zeigen, dass sich Raupen des Goldafters, die von
Beginn an unter Langtagbedingungen gehalten wurden, ohne Unterbrechung der
Raupenentwicklung zum Falter entwickeln können. Damit wäre davon auszugehen,
dass es sich bei der Raupendiapause um eine fakultative Diapause handelt, die
durch abnehmende Tageslängen induziert wird. Die Raupen in der vorliegenden
Arbeit
zeigten
jedoch
selbst
unter
Langtagbedingungen
die
typischen
Diapausemerkmale - es muss sich hier also um eine (genetisch bedingte) obligate
Diapause handeln. Im Freiland sind die Raupen im August und September täglich
kürzer werdenden Tageslängen ausgesetzt, die von den Tieren als Signal zur
Diapauseinduktion genutzt werden können.
48
Selbst das Vorhandensein von Nahrung während des Winters kann die Diapause der
Goldafterraupen nicht völlig verhindern. Raupen, die auf dem immergrünen
Erdbeerstrauch Arbutus unedo gehalten
wurden, gingen trotz vorhandenen Futters von Mitte September bis Mitte November
in eine Ruhephase, in der sie nicht fraßen und sich nicht häuteten (Frago et al.,
2010)
4.2 Eignung von Euproctis chrysorrhoea Raupen als Überwinterungswirt für
Glyptapanteles liparidis
Die Untersuchungen von Marschnig (2013) zeigten, dass Raupen des Goldafters im
Frühjahr geeignete Alternativwirte für G. liparidis Wespen sind. Jedoch wurde auch
festgestellt, dass im Falle einer Wahlmöglichkeit zwischen Schwammspinner- und
Goldafterraupen die Wespen zur Parasitierung den Schwammspinner deutlich
bevorzugten. Der Versuch, Raupen des Goldafters im Herbst mit G. liparidis zu
parasitieren,
war
nur
dann
erfolgreich,
wenn
die
Wespen
vorher
keine
Schwammspinnerraupen angestochen hatten. Die Wirtsakzeptanz im Freiland dürfte
deutlich besser sein, wenn ausschließlich Raupen des Goldafters vorhanden sind.
Die Anzahl der in einen Wirt abgelegten Eier hängt bei gregären Parasitoiden oft von
der Wirtsgröße ab (Häckermann et al., 2007). Größere Raupen weisen ein höheres
Ressourcenpotential auf als kleinere, was sich auf die Parasitenentwicklung
auswirken kann (Harvey et al., 2004). In den Untersuchungen von Marschnig (2013)
wurden verschieden große Raupen des Schwammspinners und des Goldafters von
G. liparidis Wespen parasitiert; die Anzahl der abgelegten Eier pro Raupe war jedoch
bei beiden Arten annähernd gleich. Dorn et al. (2007) beobachteten ähnliches bei
zwei verwandten Schmetterlingsarten (Cydia molesta und C. pomponella) mit
unterschiedlicher Größe, deren Raupen von Hyssopus pallidus (Hymenoptera:
Eulophidae) parasitiert werden. Die Anzahl der in die Wirtraupe abgelegten Eier
hängt nicht nur von der Wirtsgröße, sondern auch von der Nährstoffverfügbarkeit in
den
Wirtsraupen
Nährstoffverfügbarkeit
ab
(Sequeira
oder
der
&
Mackauer,
veränderte
1992).
physiologische
Die
schlechte
Zustand
der
diapausierenden Goldafterraupen könnten Gründe dafür sein, dass im Herbst
durchschnittlich weniger Eier in die Wirtsraupen abgelegt wurden als im Frühjahr,
wenn die Raupen nach dem Ende der Diapause wieder Nahrung zu sich nehmen.
49
Ein
signifikanter
Zusammenhang
zwischen
Körpergewicht
und
Anzahl
der
abgelegten Eier konnte nicht festgestellt werden. Das Ergebnis deckt sich mit den
Resultaten von Marschnig (2013).
Während sich die Parasitoiden in den im Frühjahr nach Beendigung der Diapause
parasitierten Raupen des Goldafters innerhalb von 29 bis 30 Tagen ausbohrten
(Marschnig,
2013),
verblieben
die
Parasitoiden
in
überwinternden
Raupen
unabhängig von Photoperiode und Temperatur im Ei- oder im ersten Larvenstadium.
Der Zeitpunkt der Parasitierung war maßgeblich dafür verantwortlich, wie lange das
Eistadium dauerte. In später parasitierten Raupen dauerte es bis zu drei Wochen bis
die Larven aus den Eiern schlüpften. In diesen Raupen wurden neben L1 Larven
auch Eier gefunden wurden, die sich nicht mehr weiterentwickelten. Diese
Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass sowohl das L1 Stadium als auch das
Eistadium das Überwinterungsstadium der Parasitoiden im Wirt sein kann.
Wirtsraupen, die im Frühjahr nach der Überwinterung parasitiert wurden,
entwickelten sich vom zweiten bis ins vierte Larvenstadium bevor die Parasitoiden
schlüpften (Marschnig, 2013). Wirtraupen in Vorbereitung auf die Überwinterung
unterbrachen dagegen im September ihre Entwicklung und häuteten sich nicht mehr.
Die parasitische Wespe G. liparidis passt mit der Unterbrechung ihrer Entwicklung im
Ei- oder L1 Stadium ihren Lebenszyklus an den der Wirtraupe an. Es ist somit
anzunehmen, dass die Parasitoiden ebenso eine Diapause durchlaufen wie ihre
Wirte und von diesen hormonell mitgesteuert werden. Eroğlu (2003) beobachtete
ähnliches in diapausierenden Raupen des Goldafters, die von der Schlupfwespe
Meteorus versicolor (Hymenoptera: Braconidae) parasitiert waren. Der Parasitoid
überwinterte im Ei- oder im ersten Larvenstadium im Wirt und setzte seine
Entwicklung im Frühjahr fort. Die Brackwespe Apanteles euonymellae, ein solitärer
Endoparasitoid, entwickelt sich dagegen vom ersten bis zum vierten Larvenstadium
in Raupen des kleinen Pappelglasflüglers, Paranthrene tabaniformis, und überwintert
als erwachsene Larve in den Wirtsraupen. Im Frühjahr endet die Diapause und der
Parasitoid vervollständigt seine Entwicklung (Georgiev, 2001).
Die Nährstoffverfügbarkeit in diapausierenden Wirtraupen beeinflusst nicht nur die
Anzahl der in die Raupen abgelegten Eier (Sequeira & Mackauer, 1992), sondern
könnte
auch
Auswirkungen
auf
die
Wirtsentwicklung
selbst
haben.
Die
Parasitoidenentwicklung kann unabhängig von abiotischen Faktoren gestoppt
werden, wenn die Wirte schlecht genährt sind (Schafellner & Schopf, 2003).
50
Demnach könnte der Entwicklungsstopp der Parasitoiden in den Goldafterraupen
auch durch einen Nährstoffmangel bedingt sein. Da die Raupen während des
Winters ihre Fraßaktivität einstellen, muss auf die vorhandenen Reserven
zurückgegriffen werden; daraus entsteht eine Konkurrenzsituation zwischen Wirt und
Parasitoiden.
Auch Temperatur und Photoperiode können die Entwicklungszeit der Parasitoiden in
ihren Wirtsraupen beeinflussen. So verzögert sich die Entwicklung im Allgemeinen
mit sinkenden Temperaturen (Nealis & Fraser, 1988; Gould & Eklinkton, 1990; Allen
& Keller, 1991; Tillman & Powell, 1991; Oliveira et al., 1998). Der Entwicklungsstopp
der Parasitoiden in den Goldafterraupen war jedoch weder von der Temperatur noch
von der herrschenden Photoperiode abhängig. Die Auswirkung abnehmender
Temperatur- und Tageslichtverhältnisse auf die Diapauseinduktion von Micropolis
mediator, eine solitäre, multivoltine Brackwespe, die Raupen der BaumwollKapseleule, Helicoverpa armigera, parasitiert, ergab eine kritische Temperatur von
17,9°C und eine Tageslänge von 11,75 Stunden. Bei Durchschnittstemperaturen von
16-20°C und Tageslichtlängen von 4 bis 10 Stunden gehen die Tiere in Diapause
(Hun et al., 2005; Li et al., 2008).
Die Diapause der Parasitoiden wird nach der Überwinterung von steigenden
Temperaturen und Tageslichtlängen beendet und die Entwicklung im Wirt fortgesetzt
(Eroğlu, 2003; Georgiev, 2001). Dies scheint auch bei der Überwinterung von G.
liparidis in Raupen des Goldafters der Fall zu sein.
4.3
Einfluss
einer
Mikrosporidieninfektion
auf
die
Wirts-/
Parasitoidenentwicklung
Die während des Versuchszeitraumes auftretende Infektion mit Mikrosporidien
verursachte eine erhöhte Mortalität in der Versuchsgruppe LT 20°C, was einerseits
physiologische Messungen ab Jänner unmöglich machte und andererseits dazu
führte, dass keine Aussagen darüber getroffen werden können, ob sich die
Parasitoiden der Wirtsraupen nach Beendigung der Diapause weiterentwickelt
hätten. Da die Entwicklung der Parasitoiden im Oktober und November untersucht
wurde, kann angenommen werden, dass die untersuchten parasitierten Raupen noch
nicht mit Mikrosporidien infiziert waren. Dasselbe gilt für die Versuchsgruppe KT
20°C, in der keine Infektion mit Mikrosporidien auftrat, die Tiere aber dennoch aus
51
unbekannter Ursache im Jänner starben. Die Messergebnisse für die Monate davor
zeigen eine konstante Zunahme der Frostresistenz, sodass die Tiere bis dahin wohl
relativ unbeeinträchtigt waren.
Hoch & Schopf (2000) beschreiben die Interaktion der Mikrosporidienart Vairimorpha
sp. mit G. liparidis in Raupen des Schwammspinners. Die Kombination von Pathogen
und Parasitoid führte im Wirtstier zu einer stärkeren Hemmung von Wachstum und
Entwicklung als bei einer Infektion allein. Infizierte Raupen, die anschließend
parasitiert wurden, verstarben schneller als Raupen, die nur infiziert waren. Wenn der
Wirt dagegen zuerst parasitiert war, entstanden für Vairimorpha sp. gewisse Vorteile,
da sie sich durch die Schwächung des Wirtorganismus leichter etablieren konnte. Die
Infektion mit Vairimorpha sp. hatte aber auch einen negativen Einfluss auf die
Entwicklung des Parasitoiden. Es bohrten sich weniger Parasitoiden aus als aus
nicht infizierten, parasitierten Wirten.
Die in der Versuchsgruppe LT 20°C vorgefundenen Mikrosporidien könnten von
infizierten Faltern stammen, welche die Sporen bei der Eiablage auf die nächste
Generation übertragen haben. Mit dem Umsetzen der Tiere und dem laufenden
Futterwechsel ging die Infektion offenbar auf die restliche Versuchspopulation über,
da Mikrosporidien auch horizontal durch perorale Aufnahme von infizierten
Kotkrümmeln auf Artgenossen übertragen werden. Dank der Verbreitung durch
umweltresistente Sporen und vertikale Übertragung können Mikrosporidiensporen die
Diapause in ihren Wirten überdauern (Linde, 1993; Goertz & Hoch, 2008). Eine
Infektion der Raupen im Freiland konnte jedoch definitiv ausgeschlossen werden.
Die Sporenentwicklung in den infizierten diapausierenden Raupen (LT 20°C) verlief
sehr langsam. Bis zum Tod der gesamten Population vergingen etwa zwei Monate.
In nicht diapausierenden Raupen verursachen Mikrosporidien bereits nach ca. zwei
Wochen den Tod des Wirtstieres (Goertz, persönliche Kommunikation).
Mikrosporidien verhalten sich meist wirtspezifisch (Linde, 1993; Goertz & Hoch,
2008). Die vorgefundenen Mikrosporidien ließen sich nicht auf Raupen des
Schwammspinners
übertragen,
weshalb
auch
in
diesem
Fall
von
einer
wirtsspezifischen Art ausgegangen werden muss. Dagegen konnten Solter & Maddox
(1998) zeigen, dass sich von 20 in verschiedenen Lepidopteren gesammelten
Mikrosporidienarten
18
erfolgreich
in
nordamerikanischen
Raupen
des
Schwammspinners entwickelten.
52
In der Literatur finden sich einige in Raupen des Goldafters vorkommende
Mikrosporidiengattungen: Endoreticulatus sp. und Nosema sp. in Nordamerika und
Europa (Zwölfer, 1927; Lipa, 1964; Sidor, 1975; Pilarska et al., 2001).
Endoreticulatus sp.-Sporen vermehren sich in den Zellen des Mitteldarms, Nosema
sp. dagegen nur in den Spinndrüsen. Die Übertragung der ersteren Art erfolgt in
Nestern durch Kotkrümmelfraß, bei der zweiteren Art beim Spinnen der Gespinste
(Jeffords et al., 1987; Pilarska et al., 2001). Hylin et al. (2006) beschrieben die Art
Nosema chrysorrhoea, die auf Raupen des Goldafters spezialisiert sein dürfte;
Infektionsversuche von L. dispar, Mamestra brassicae und Spodoptera littoralis mit
isolierten Sporen verliefen negativ.
In der vorliegenden Untersuchung konnte weder die Gattung, noch die Art der
vorgefundenen Mikrosporidien bestimmt werden. Jedoch wurde ein Teil der
Sporensuspension isoliert und in flüssigem Stickstoff für weitere Versuche am IFFF
aufbewahrt.
53
5.
Schlussfolgerungen und Ausblick
Raupen des Goldafters weisen während des Winters eine obligate Diapause auf.
Diese wird im Herbst von sinkenden Temperatur- oder Tageslichtverhältnissen
induziert und kann in der Folge weder durch höhere Temperaturen noch durch
Langtagverhältnisse gebrochen werden. Die Raupen unterbrechen ihre Entwicklung
und Fraßaktivität, parallel dazu erhöht sich ihre Frostresistenz. Die Überwinterung
findet im zweiten Larvenstadium in Überwinterungsnestern auf den Futterpflanzen
statt.
Die parasitische Wespe G. liparidis überwintert im Ei- oder L1 Larvenstadium in den
Goldafterraupen. Die Parasitoiden vollziehen zeitgleich mit der Wirtsraupe einen
Entwicklungsstopp. Im Frühjahr vollenden die Parasitoiden ihre Entwicklung und
bohren sich aus dem Wirt aus.
In weiterführenden Untersuchungen könnte überprüft werden, ob es sich bei der
Überwinterung der Raupen, welche unter Langtagbedingungen (16L: 8D) bei 20°C
gehalten wurden, um eine echte Diapause oder nur eine kurze Ruhephase
(Quieszenz) handelt, die durch entsprechende Bedingungen übersprungen werden
könnte. Physiologische Messungen an den Raupen sollten die Überwinterungsphase
ergänzen. Wäre man in der Lage während der Überwinterung den Raupen
Blattmaterial als Futter anbieten zu können, ließen sich fundierte Aussagen über ihre
Entwicklung machen. Hierfür könnten z.B. Rosenstöcke mit Blättern den Raupen als
Nahrung dienen. Die Ernährung der Raupen mit Blattmaterial könnte auch
Auswirkungen auf die Parasitoidenentwicklung haben und eventuell die Verfügbarkeit
von
Nährstoffen
für
die
Parasitoiden
verbessern.
Zusätzlich
sollte
die
Parasitoidenentwicklung bei unterschiedlichen Temperatur- und Tageslichtlängen
beobachtet
und
die
erfolgreiche
Überwinterung
der
Parasitoiden
in
den
Goldafterraupen sowohl im Freiland als auch im Labor überprüft werden.
Um Infektionen der Versuchspopulationen mit Pathogenen zu vermeiden, sind
diverse Hygienemaßnahmen von außerordentlicher Bedeutung. Daher sollten
Eigelege aus dem Freiland zuerst desinfiziert und schon im Vorfeld auf mögliche
Infektionen überprüft werden, um die Ergebnisse der Versuche nicht durch kranke
Tiere zu verfälschen bzw. die Aussagen zu beeinträchtigen.
54
6.
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63
7.
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.:
Überwinterungsnest an Mehlbeere. ...........................................................8
Abb. 2.:
Mehlbeerblätter als Futter für die Goldafterraupen im
Überwinterungsnest. ..................................................................................8
Abb. 3.:
Schwammspinnerraupen (L2) auf Weizenkeimdiät. ...................................9
Abb. 4.:
Schwammspinnerraupe (L5) in Petrischale mit Weizenkeimdiät. ..............9
Abb. 5.:
Kunststoffbecher (10x7 cm) mit Gazedeckel zur Haltung von L1
Raupen. ................................................................................................... 10
Abb. 6.:
Haltung der Raupen in Kunststoffbechern und Plastikboxen im
Klimaschrank. .......................................................................................... 10
Abb. 7.:
Eigelege bedeckt mit Afterwolle. .............................................................. 11
Abb. 8.:
Plastikboxen mit Eigelegen. ..................................................................... 11
Abb. 9.:
Rosenzweige in Zentrifugalröhrchen mit Nährlösung;
Raupengespinste. .................................................................................... 11
Abb. 10.: Junge Goldafterraupen (L1), Gespinst und Fensterfraß am Blatt. ........... 11
Abb. 11.: Netz mit Goldaftergespinsten. .................................................................. 12
Abb. 12.: Kunststoffnetzsack mit Raupen auf Weißdorn. ........................................ 12
Abb. 13.: Mikrorespirometer für zehn Parallelmessungen. ...................................... 14
Abb. 14.: Schematische Darstellung eines Mikrorespirometers
(Pruscha et al., 1983). ............................................................................. 15
Abb. 15.: Kontinuierlicher O2-Verbrauch (counts) von fünf E. chrysorrhoea
Raupen (R1-R5) in der Respirationskammer (Mikrorespirometer)
innerhalb von 12 Stunden. ....................................................................... 17
Abb. 16.: Mikrowaage (METTLER TOLEDO, Model: MT 5) zur Bestimmung des
Raupengewichtes. ................................................................................... 17
Abb. 17.: Typischer Messverlauf zur Bestimmung des SCP (°C) einer E.
chrysorrhoea Raupe. Bei der Bildung von Eiskristallen im Körper der
Raupe (SCP) kommt es zu einem Temperaturanstieg von ca. 5°C
(exotherme Reaktion). ............................................................................. 19
Abb. 18.: Messstation mit Messelektroden, Tiefkühlelement und Computer. .......... 20
Abb. 19.: Parasitierungsdose mit Raupen des Goldafters und G. liparidis
Wespen. ................................................................................................... 21
64
Abb. 20.: Glyptapanteles liparidis (a) Parasitoidenei (Durchlicht), (b)
Parasitoidenlarve (L1) mit sklerotisierten Mundwerkzeugen (MWZ)
und Eihautresten (Durchlicht), (c) Parasitoidenlarve (L1) ausgespült
aus einer E. chrysorrhoea Raupe (Auflicht). ............................................ 22
Abb. 21.: Sporen von Mikrosporidien im Körper von E. chrysorrhoea Raupen
(Quetschpräparat). ................................................................................... 23
Abb. 22.: Neubauer-Zählkammer. ........................................................................... 24
Abb. 23.: Zähl-Kästchen von Neubauer-Zählkammer. Der mittlere Kreis wurde
ausgezählt,
(http://www.zaehlkammer.de/deutsch/neubauer.improved.html). ............ 24
Abb. 24.: Schwammspinnerraupe ventral geöffnet. ................................................ 25
Abb. 25.: Mittlerer monatlicher O2-Verbrauch (µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea
Raupen (n=7-10) unter LT 20°C und KT 20°C während der
Überwinterungsphase (Okt.-Jän.) im Klimaschrank. ................................ 30
Abb. 26.: Mittlerer O2-Verbrauch (µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea Raupen
(n=6-10) der Versuchsgruppen FL 1 und FL 2 während der
Überwinterungsphase (Nov.-Apr.) im Freiland. ........................................ 31
Abb. 27.: Mittlerer O2-Verbrauch (MW±SE ,µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea
Raupen aus der Gruppe FL 1 (a) und der Gruppe FL 2 (b), sowie die
Temperatur (°C) (Max, Min, MW) und die Tageslichtdauer (h)
am Messtag. ........................................................................................... 33
Abb. 28.: Mittlerer O2-Verbrauch (MW±SE ,µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea
Raupen aus der Gruppe FL 1 (a) und der Gruppe FL 2 (b) am
Messtag, sowie die Temperatur (°C) (Max, Min, MW) und der
Schwankungsbereich der Tageslichtdauer (h) in der jeweiligen
Messwoche. ............................................................................................ 34
Abb. 29.: Supercooling Point (SCP) (MW±SE, °C) von E. chrysorrhoea
Raupen (n=5-10) unter LT 20°C bzw. KT 20°C während der
Überwinterungsphase (Okt.-Jän.). ........................................................... 36
Abb. 30.: Supercooling Point (SCP) (MW±SE, °C) von E. chrysorrhoea Raupen
(n=6-10) unter FL 1 bzw. FL 2 während der Überwinterungsphase
(Nov.-Apr.). .............................................................................................. 37
Abb. 31.: Zusammenhang von O2-Verbrauch (µl*h-1*mg-1) und SCP (°C) in der
Überwinterungsphase von Oktober 2012 bis April 2013 in allen
Versuchsgruppen (a) LT 20°C und KT 20°C, (b) FL 1 und FL 2. ............. 38
65
Abb. 32.: Kopfkapselbreiten (MW±SE; mm) von parasitierten E. chrysorrhoea
Raupen der Versuchsgruppen LT 20°C (n= 25) und KT 20°C (n=25)
zum Zeitpunkt der Sektion (a) alle LT 20°C und KT 20°C Raupen,
(b) getrennt nach Tagen nach der Parasitierung (days post parasitism,
dpp). . ....................................................................................................... 39
Abb. 33.: Zusammenhang Körpergewicht (mg) von E. chrysorrhoea Raupen
(am Sektionstag) und Anzahl der Parasitoide pro Wirtsraupe der
Versuchsgruppen LT 20°C und KT 20°C. ................................................ 41
Abb. 34.: Entwicklung von G. liparidis Parasitoiden in E. chrysorrhoea
Wirtsraupen unter konstanten Versuchsbedingungen. (a) LT 20°C
und (b) KT 20°C. Die Parasitierung der Raupen erfolgte im Oktober. . .... 42
Abb. 35.: Entwicklung von G. liparidis Parasitoiden in E. chrysorrhoea
Wirtsraupen unter konstanten Versuchsbedingungen (a) LT 20°C und
(b) KT 20°C. Die Parasitierung der Raupen erfolgte im November. ........ 44
Abb. 36.: Kokon von G. liparidis mit geöffnetem Deckel neben einer
E. chrysorrhoea Raupe nach der Überwinterung im Freiland
Mitte April. ................................................................................................ 45
Abb. 37.: (a) Kokons von G. liparidis neben der Wirtsraupe E. chrysorrhoea,
(b) E. chrysorrhoea Raupe mit Kokon und adulter
G. liparidis Wespe. ................................................................................... 46
66
8.
Tabellenverzeichnis
Tab. 1:
Zusammensetzung von 1,0 kg Weizenkeimdiät (Bell et al., 1981). ............9
Tab. 2:
Versuchsgruppen. .................................................................................... 13
Tab. 3:
Mittlerer O2-Verbrauch(MW±SE, µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea
Raupen während der Überwinterungsphase von Oktober 2012
bis April 2013. . ......................................................................................... 29
Tab. 4:
Temperaturmittelwerte für Monat MMw, Tag TMw und Woche WMw
und Sonnenstunden (Lichtphasen) am Messtag und in der
Kalenderwoche (KW), sowie der mittlere O2-Verbrauch (MW± SE,
µl*h-1*mg-1) von E. chrysorrhoea Raupen aus den Gruppen FL 1
und FL 2. .................................................................................................. 32
Tab. 5:
Supercooling Point (SCP) (MW±SE,°C) von E. chrysorrhoea Raupen
während der Überwinterungsphase von Oktober 2012 bis April 2013. . ... 35
Tab. 6:
Gewicht (MW±SE, mg) von E. chrysorrhoea Raupen und Anzahl der
Parasitoide (Median) pro Wirtraupe in den Versuchsgruppe LT 20°C
und KT 20°C zum Zeitpunkt der Sektion. ................................................. 41
67