Institut für Zellbiologie im Zentrum Anatomie - MH

ANATOMIE
Institut für Zellbiologie im Zentrum Anatomie

Direktor: Prof. Dr. Ernst Ungewickell
Tel.: 0511 / 532-6744 • E-Mail: [email protected] • www99.mh-hannover.de/institute/zellbiologie/
Forschungsprofil
Gerichtete Transportvorgänge zwischen intrazellulären Kompartimenten in eukaryotischen Zellen sind notwendig
für den Erhalt dieser Kompartimente sowie für die Sekretion von verschiedenen Signalstoffen und von Komponenten
der extrazellulären Matrix. Auch bei der zellulären Aufnahme sowohl von gelösten Molekülen als auch von größeren
Partikeln und deren Prozessierung im Rahmen der Immunabwehr sind intrazelluläre Transportprozesse essentiell.
Im Mittelpunkt des Forschungsinteresses der Abteilung stehen
1) die Aufklärung der molekularen Mechanismen bei Clathrin-abhängigen Transportprozessen;
2) Untersuchungen von Transportvorgänge bei der Antigenprozessierung;
3) Aufklärung der Funktion von Clathrin und Adaptoren bei der Phagozytose;
4) zellbiologische Charakterisierung von Umbauprozessen nach Implantation von unterschiedlichen Biomaterialien;
5) Untersuchungen zur Funktion von Amphiphysinen in den Epithelzellen des proximalen Tubulus der Niere.
Zur Bearbeitung unserer Fragestellungen werden biochemische, molekularbiologische sowie moderne fluoreszenzmikroskopische und elektronenmikroskopische Methoden eingesetzt.
Forschungsprojekte
Molekularer Mechanismus der Fc-Rezeptor vermittelten Phagozytose in Makrophagen
Makrophagen sind Zellen des Immunsystems, die eine zentrale Rolle sowohl in der angeborenen wie der adptiven
Immunantwort gegen Infektionen spielen. Sie können z. B. Bakterien oder Teile virusinfizierter Zellen aufnehmen und
verdauen. Auf diese Weise beseitigen sie nicht nur die Krankheitserreger, sondern präsentieren auch Antigene auf
ihrer Oberfläche und lösen dadurch eine adaptive Immunantwort aus.
Damit gehören die Makrophagen zu den sogenannten professionellen Phagozyten, wie auch neutrophile Granulozyten und dendritische Zellen. Phagozytose ist eine spezielle Form der Endozytose, bei der Partikel in die Zelle
aufgenommen werden, die größer als 0,2 μm sind und im Lichtmikroskop sichtbar sind.
Makrophagen können Partikel erkennen, die durch an die Oberfläche gebundene Antikörper als fremd oder
infiziert gekennzeichnet sind. Sie nutzen dazu den Fc-Rezeptor auf ihrer Oberfläche, der die konstante Domäne von
Antikörpern (Fc-Domäne) erkennt. Wie bei einem Reissverschluss verzahnen sich Fc-Rezeptor und Antiköper, so dass die
Plasmamembran des Makrophagen das phagozytierte Partikel umhüllt. Das bezeichnet man als Fc-Rezeptor vermittelte
Phagozytose. Nach Fusion der Plasmamembran wird das membranumhüllte Partikel ins Zytoplasma aufgenommen. Ein
Phagosom ist entstanden. Das Phagosom reift durch Im- und Export von Membrankomponenten schließlich zu einem
Phagolysosom, dessen Inhalt durch lysosomale Enzyme abgebaut wird.
Der molekulare Mechanismus zur Bildung eines Phagosoms unterscheidet sich grundsätzlich von anderen Endozytoseformen und benötigt als wesentliche Komponente das Zytoskelettprotein Aktin. Die am besten untersuchte
Form der Endozytose wird charakterisiert durch das Protein Clathrin, das wie ein Gerüst von der zytosolischen Seite
die Membran eines sich bildenden Endozytosevesikel umhüllt. Diesen Mechanismus benutzen Zellen für notwendige
Funktionen des Zellstoffwechsels wie z. B. die Aufnahme von Eisen oder Cholesterin. Die dabei entstehenden Vesikel
Forschungsbericht 2010
15
ANATOMIE
sind wesentlich kleiner als Phagosomen.
Clathrin selbst kann aber nicht an Membranen binden. Dazu benötigt es Adaptorproteine, die einerseits an Membranen anderseits Clathrin binden können, und so die Interaktion des Clathrin mit der Membran vermitteln. Diese
Adaptoren sind Proteinkomplexe mit einem kompakten Rumpf, der Membranproteine und -lipide bindet, und zwei
Anhängen, die Clathrin binden. Es gibt verschiedene Adaptoren (AP-1 und AP-2). AP-2 z. B. fungiert bei der Clathrin
vermittelten Endozytose an der Plasmamembran, während AP-1 eine Rolle spielt bei der Clathrin vermittelten Bildung
von Transportvesikel am Trans-Golgi-Netzwerk.
Bislang war man der Meinung, dass Clathrin und seine Bindungspartner keine Funktion bei der Fc-Rezeptor vermittelten Phagozytose haben. Dieses Modell wurde durch neuere Experimente der Arbeitsgruppe um Florence Niedergang
in Frage gestellt. Bei der Phagozytose in professionellen Phagozyten wird AP-1, aber kein Clathrin, benötigt. Während
sich das Phagosom bildet, wird in diesen Zellen AP-1 ohne Clathrin zu den Phagosomen rekrutiert. Im Gegensatz dazu
wurde AP-2, der Adaptor an der Plasmamembran, nicht rekrutiert.
Diese Arbeit bildete den Ausgangspunkt für unsere eigenen Untersuchungen, die die Strucmed-Studenten Matthias Fett und Tobias Geßler durchgeführt haben. Zur Untersuchung der Fc-Rezeptor vermittelten Phagozytose in
Makrophagen haben wir ein experimentelles Testsystem mit der Monozytenzelllinie THP1 etabliert. Durch Inkubation
mit Phorbolester differenzieren sich diese Zellen zu Makrophagen. Den Zellen werden magnetische bzw. fluoreszierende Partikel mit 2 μm Durchmesser angeboten, die mit Antikörpern beschichtet wurden. Der Fc-Rezeptor erkennt
diese Antikörper, die Partikel werden von den Makrophagen phagozytiert und anschließend können biochemische
oder licht- bzw. elektronenmikroskopische Experimente durchgeführt werden. Mit Hilfe dieses Systems haben wir das
Phagosomen-assoziierte AP-1 biochemisch isoliert und konnten zeigen, dass die fehlende Clathrin-Interaktion nicht auf
eine proteolytische Spaltung des Porteinkomplexes zurückgeht. Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigte, dass AP-1,
nicht jedoch AP-2 oder Clathrin, an Phagosomen rekrutiert wird. Bei der Untersuchung weiterer mit Clathrin assoziierter
Proteine konnten wir nachweisen, dass das Clathrin-Ortholog (CHC22) in Makrophagen exprimiert wird und an Phagosomen lokalisiert ist. Bislang glaubte man, dass CHC22 nur in Muskelzellen vorkommt. Seine Funktion ist unbekannt.
Ersetzt also CHC22 Clathrin am Phagosomen-assoziierten AP-1? Das scheint nicht der Fall zu sein, da CHC22 und
AP-1 positive Strukturen nicht überlappen (Abbildung 1A). Um die zeitliche Abfolge der Rekrutierung der beiden Proteine
genauer zu untersuchen, haben wir unseren Phagozytosetest verfeinert und können nun vier Stadien unterscheiden:
1. Bindung des Partikels an die Plasmamembran; 2. Rekrutierung von Aktin und Bildung des Phagozytosebechers; 3.
Schließen des Phagozytosebechers; 4. Entfernen des Aktinsaums und Internalisierung des Phagosoms. Durch Fluoreszenzmikroskopie konnten wir zeigen, dass AP-1 und CHC22 während der ersten drei Stadien an zwei verschiedenen
Membrankompartimenten zur Membran des Pagozytosebechers rekrutiert werden. Stadium 4 war nicht markiert. Daraus
schließen wir das die AP-1 und CHC22-positiven Strukturen an der Bildung des Phagozytosebechers und nicht an der
Reifung des Phagosoms beteiligt sind. Durch Immunelektronenmikroskopie (Abbildung 1B) konnten wir zeigen, dass
AP-1 und CHC22 nicht an die begrenzende Membran des Phagosoms binden, sondern sich an Membranen befinden,
die bis etwa 250 nm an die Phagosomenmembran heranreichen.
Welche Funktion haben diese Membranen? Wir vermuten, dass die AP-1 und CHC22 positiven Kompartimente Membranbestandteile für den wachsenden Phagozytosebecher liefern. Theoretisch benötigt ein Phagosom mit einem Durchmesser von
2 μm die Membranoberfläche von mehr als 400 kugelförmigen Vesikeln mit einem Durchmesser von 100 nm, was dem durchschnittlichen Durchmesser Clathrin-behüllter Vesikel entspricht. AP-1 bzw. CHC22 positive Vesikel müssten mit der Membran
des Phagozytosebechers verschmelzen. Dazu ist es notwendig, dass die Hüllen aus AP-1 bzw. CHC22 von der Vesikelmembran
abfallen. Da würde erklären, warum wir im direkten Umkreis des Phagosoms kein AP-1 oder CHC22 nachweisen können. Da
diese Vesikel unterschiedliche Hüllproteine tragen, liegt die Vermutung nahe, dass sie unterschiedlichen Ursprungs sind und
unterschiedliche Membranzusammensetzung und Funktionen haben. Das wollen wir in zukünftigen Experimenten aufklären.
16
Forschungsbericht 2010
ANATOMIE
Abb. 1: Mikroskopische Untersuchungen an Makrophagen nach Fc-Rezeptor vermittelter Phagozytose von 2 μm großen Partikeln.
(A) Fluoreszenzmikroskopie: Gefärbt wurden die Proteine AP-1 (rot) und CHC22 (grün). Die Färbungen überlappen nicht, was darauf
hinweist, dass die beiden Proteine sich auf unterschiedlichen Membranen befinden. Phagozytierte Partikel: Dunkelrot, mit Stern
markiert. (B) Immunelektronenmikroskopie mit Antikörpern gegen CHC22 und 10nm-Gold: Goldkolloide zeigen die Lokalisation von
CHC22 an (rot markiert). CHC22 findet sich nicht an der begrenzenden Membran des Phagosoms (links, dunkle Struktur), sondern
an Membranen, die bis etwa 250 nm an die Phagosomenmembran heranreichen.

Projektleitung: Bauerfeind, Rudolf (Dr. rer.nat.); Kooperationspartner: Brodsky, Frances (Prof. DPhil), UCSF, USA;
Förderung: Strucmed MHH
Weitere Forschungsprojekte
Die Funktion der Mikrotubuli für die sekundäre Membranumhüllung von Herpes-Simplex-Virus

Projektleitung: Bauerfeind, Rudolf (Dr. rer.nat.); Kooperationspartner: Sodeik, Beate (Prof. Dr.rer.nat.), Institut für
Virologie, MHH; Förderung: DFG (SPP1175 - Dynamics of Cellular Membranes and their exploitation by viruses)
Lebendzellmikroskopie des Zelleintritts und der Morphogenese des Cytomegalie-Virus (CMV)

Projektleitung: Bauerfeind, Rudolf (Dr. rer.nat.); Kooperationspartner: Koszinowski, Ulrich (Prof. Dr. Dr.h.c.), Max von
Pettenkofer-Institut, Ludwig-Maximilians-Universität München; Förderung: Beim Kooperationspartner
Quantifizierung der Nanopartikelverteilung in Polyurethankunststoffen zur Ermittlung geeigneter
Medizinprodukte

Projektleitung: Brandes, Gudrun (Dr.med.); Kooperationspartner: Wagener, Philipp (Dr.-Ing.), Barcikowski, Stephan
(Dr.-Ing.), Laser Zentrum Hannover; Förderung: DFG (SPP1327) und REBIRTH
Ultrastrukturelle Analyse der Freisetzung von Silber- und Kupfernanopartikeln aus Silikonen zur
Entwicklung biokompatibler Implantate

Projektleitung: Brandes, Gudrun (Dr.med.); Kooperationspartner: Hahn, Anne (Dipl.-Ing.), Barcikowski, Stephan
(Dr.-Ing.), Laser Zentrum Hannover; Förderung: TransRegio37 und REBIRTH
Forschungsbericht 2010
17
ANATOMIE
Elektronenmikroskopische Untersuchungen zur Biokompatibilität von Spinnenseide bei verschiedenen
Wundheilungsmodellen

Projektleitung: Brandes, Gudrun (Dr.med.); Kooperationspartner: Allmeling, Christina, Vogt, Peter M. (Prof. Dr.med.);
Förderung: Braukmann-Wittenberg Stiftung
Charakterisierung des Entwicklungspotentials von olfaktorischen neugeborenen Hüllzellen der Ratte
in vitro und in situ

Projektleitung: Brandes, Gudrun (Dr.med.); Kooperationspartner: Wewetzer, Konstantin (Prof. Dr.hum.-biol),
Baumgärtner, Wolfgang (Prof. Dr.vet.med.), Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover; Förderung: DFG
Das BAR-Domäne Protein Amphiphysin 2 (Bin 1) in der Niere

Projektleitung: Groos, Stephanie (Dr.med.); Kooperationspartner: Dannhauser, Philip (Dr.rer.nat.), Bargsten, Anna,
Wittrock, Inga Mayte
Rekrutierung von B-Zell-Rezeptor und invariante Kette in eine gemeinsame Membrandomäne

Projektleitung: Lindner, Robert (Dr.rer.nat.); Förderung: Strucmed MHH
Oligomerisierungsabhängige Endozytosewege von MHC I-Molekülen in Fibroblasten

Projektleitung: Lindner, Robert (Dr.rer.nat.); Förderung: Strucmed MHH
Membrandomänen-abhängige Endozytose von MHC Molekülen in B-Lymphozyten

Projektleitung: Lindner, Robert (Dr.rer.nat.); Förderung: LOM
Detergenzresistente Membranen als Modelle für „lipid rafts“

Projektleitung: Lindner, Robert (Dr.rer.nat.)
Rekonstitution des Abschnürungsprozesses Clathrin-umhüllter Vesikel von künstlichen Liposomen

Projektleitung: Ungewickell, Ernst (Prof. Dr.rer.nat.); Kooperationspartner: Dannhauser, Philip (Dr.rer.nat.)
Elektronenmikoskopische Untersuchungen von 2-dimensionalen Clathrinnetzwerken auf planaren
synthetischen Phospholipiddoppelschichten

Projektleitung: Ungewickell, Ernst (Prof. Dr.rer.nat.); Kooperationspartner: Dannhauser, Philip (Dr.rer.nat.)
Elektronenmikroskopische Untersuchungen zur Struktur der AAA-ATPase p618 des crenarcheal
Acidianus Two-tailed Virus (ATV)

Projektleitung: Ungewickell, Ernst (Prof. Dr.rer.nat.)
Originalpublikationen
Happel CM, Klose C, Witton G, Angrisani GL, Wienecke S, Groos
S, Bach FW, Bormann D, Männer J, Yelbuz TM. Non-destructive,
high-resolution 3-dimensional visualization of a cardiac defect in
the chick embryo resembling complex heart defect in humans using
micro-computed tomography: double outlet right ventricle with left
juxtaposition of atrial appendages. Circulation 2010;122(22):e561-4
Hoffmann A, Dannhauser PN, Groos S, Hinrichsen L, Curth U,
Ungewickell EJ. A Comparison of GFP-Tagged Clathrin Light Chains
with Fluorochromated Light Chains In Vivo and In Vitro. Traffic
2010;11(9):1129-1140
silk and cells-NIH/3T3 fibroblasts seeded on miniature weaving
frames. PLoS One 2010;5(8):e12032
van Barneveld A, Stanke F, Tamm S, Siebert B, Brandes G, Derichs N, Ballmann M, Junge S, Tümmler B. Functional analysis
of F508del CFTR in native human colon. Biochim Biophys Acta
2010;1802(11):1062-1069
Abstracts
2010 wurden 7 Abstracts publiziert.
Kuhbier JW, Allmeling C, Reimers K, Hillmer A, Kasper C, Menger B,
Brandes G, Guggenheim M, Vogt PM. Interactions between spider
18
Forschungsbericht 2010