Inaugural-Dissertation
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Aus der Universitäts-Frauenklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. Optimierung ovarieller Transplantation mittels Apoptose-Inhibition -Tierexperimentelle Studien am Schaf- Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. vorgelegt 2008 von Elisabeth Walker, geb. Laub geboren in München 1 Dekan : Prof. Dr. Christoph Peters Erstgutachter : Prof. Dr. Gerald Gitsch Zweitgutachter : Prof. Dr. Axel zur Hausen Jahr der Promotion : 2008 3 Für Pauline Louisa 3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis .................................................................................................... 1 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... 3 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis .................................................................... 4 1 Einleitung .............................................................................................................. 5 1.1 Die ovarielle Funktion ....................................................................................... 5 1.2 Indikationen zum Fertilitätserhalt...................................................................... 5 1.3 Ausmaß des ovariellen Funktionsverlustes durch Chemo- und/oder Strahlentherapie ...................................................................................................... 6 1.4 Strategien zum Erhalt der Fertilität ................................................................... 7 1.4.1 Kryokonservierung unbefruchteter/befruchteter Eizellen....................................... 7 1.4.2 Kryokonservierung und Retransplantation von ovariellem Gewebe ...................... 8 1.4.3 Transposition der Ovarien .................................................................................. 12 1.4.4 Medikamentöser Schutz ..................................................................................... 12 1.5 Zelltod: Apoptose vs. Nekrose........................................................................ 13 1.6 Die Bedeutung der Apoptose ......................................................................... 14 1.7 Sphingosin-1-Phosphat .................................................................................. 16 1.8 Studienlage zu S1P........................................................................................ 16 1.9 Ziel der Arbeit ................................................................................................. 17 2 Material und Methoden....................................................................................... 19 2.1 Versuchstiere ................................................................................................. 19 2.2 Zeitlicher Ablauf.............................................................................................. 19 2.3 Blutabnahmen und Hormonanalysen ............................................................. 20 2.4 Beschreibung der Operationen....................................................................... 21 2.5 Histologie........................................................................................................ 24 1 2.5.1 Bestimmung der Follikeldichte ............................................................................ 25 2.5.2 Apoptose-Nachweis mittels TUNEL-Assay ......................................................... 25 2.6 Statistik........................................................................................................... 26 3 Ergebnisse .......................................................................................................... 27 3.1 Histologie........................................................................................................ 27 3.1.1 Follikeldichte....................................................................................................... 29 3.1.2 Zellulärer Apoptosenachweis mittels TUNEL-Assay ........................................... 31 4 Diskussion .......................................................................................................... 33 4.1 Histologie........................................................................................................ 33 4.2 Apoptose ........................................................................................................ 34 4.3 Optimierung.................................................................................................... 36 4.4 Klinische Anwendung ..................................................................................... 37 5 Zusammenfassung ............................................................................................. 38 6 Literaturverzeichnis............................................................................................. 39 7 Anhang ................................................................................................................. 49 7.1 Narkoseprotokoll ............................................................................................ 49 7.2 Protokoll der Hämatoxylin/Eosin- Färbung ..................................................... 51 7.3 Protokoll der TUNEL – Enzymhistochemie..................................................... 51 7.4 Verbrauchsmaterial und Biochemika.............................................................. 53 7.5 Pufferlösungen ............................................................................................... 55 7.6 Geräte ............................................................................................................. 55 Danksagung ............................................................ Fehler! Textmarke nicht definiert. Lebenslauf............................................................... Fehler! Textmarke nicht definiert. 2 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis a.d. Aqua destillata AF Atemfrequenz AZV Atemzugvolumen BSA Bovines Serumalbumin DMF Dimethylformamid EKG Elektrokardiogramm FSH Follikelstimulierendes Hormon HE-Färbung Hämatoxylin/Eosin-Färbung hMG humanes menopausales Gonadotropin i.m. intramuskulär IPPV Intermittierende positive Druckbeatmung i.v. intravenös IVF In-vitro-Fertilisation KGW Körpergewicht LH Luteinisierendes Hormon PBS Phosphate Buffered Saline S1P Sphingosin-1-Phosphat TBS Tris Buffered Saline TdT Terminale deoxynukleotidyl Transferase TUNEL Transferase vermitteltes dUTP-biotin Nick End Labeling ZVK Zentralvenöser Zugang 3 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abbildung 1: Apoptose-Kaskade, modifiziert nach Hancke et al. 16 Abbildung 2: Sphingosin-1-Phosphat 17 Tabelle 1: Übersicht des zeitlichen Ablaufes der Studie 21 Abbildung 3: Vorbereitung und Lagerung eines Schafes für die Operation 22 Abbildung 4: Operationssitus während der Entnahme eines Ovars 23 Abbildung 5: Subfasciale Re-Transplantation des ovariellen Gewebes im Bereich des Musculus rectus abdominis Abbildung 6: Transplantiertes ovarielles Gewebe mit Teil des Rektusmuskels bei der Entnahme Abbildung 7: 31 Durchschnittliche Follikeldichte pro Gesichtsfeld vor bzw. nach Transplantation pro Behandlungsgruppe Abbildung 12: 31 Durchschnittliche Follikelanzahl pro Gesichtsfeld der Studiengruppe am Tag 0 und am Tag 14 Tabelle 3: 30 Durchschnittliche Follikelanzahl pro Gesichtsfeld der Kontrollgruppe am Tag 0 und am Tag 14 Abbildung 11: 29 Durchschnittliche Follikelanzahl pro Gesichtsfeld für jedes Schaf vor bzw. nach Transplantation Abbildung 10: 29 Ovarielle Rinde 14 Tage nach Transplantation bei 20-facher Vergrößerung (HE-Färbung) Tabelle 2: 28 Ovarielle Rinde 14 Tage nach Transplantation bei 2,5-facher Vergrößerung (HE-Färbung) Abbildung 9: 25 Ovarielle Rinde vor Transplantation bei 20-facher Vergrößerung; (HE-Färbung) Abbildung 8: 24 32 Ovarielles Rindengewebe 14 Tage nach Transplantation bei 20-facher Vergrößerung (TUNEL-Färbung) 37 Abbildung 3 und 4 freundlicherweise überlassen von A. Bäßler, 2005 4 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Die ovarielle Funktion Im Ovar befinden sich bereits von Geburt an eine begrenzte individuell unterschiedliche Anzahl von Eizellen (Oozyten), welche sich nicht wie andere Zellen durch Teilung vermehren können. Diese liegen in Form von sogenannten Primordialfollikeln vor und reifen ab der Pubertät zyklisch nach und nach über Primär-, Sekundär- zu sprungreifen Tertiärfollikeln heran [Perez et al, 1999]. Diese sich zyklisch wiederholenden Reifungsprozesse führen zu einer kontinuierlichen Abnahme der Primordialfollikeln in den Ovarien. Somit beträgt die Zahl der Follikel zum Zeitpunkt der Geburt bei einer Frau ca. 1,2 Millionen, bei Eintritt der Pubertät sind noch ca. 400 000 Follikel in den Ovarien vorhanden, aus denen sich die ca. 400 Follikel rekrutieren, welche dann während der reproduktiven Phase einer Frau zur Ovulation gelangen [BLOCK, 1952]. Die Menopause schließlich markiert den vollständigen oder weitgehend vollständigen Verlust sämtlicher ovarieller Follikel und damit den Verlust der ovariellen Funktion [Hammond, 1996]. 1.2 Indikationen zum Fertilitätserhalt Maligne Erkrankungen stellen die 2.-häufigste Todesursache bei Kindern unter 15 Jahren dar. Meist sind es Leukämien, Hodgkin bzw. Non-Hodgkin-Lymphome, solide Hirn- oder Nerventumore oder Wilms-Tumoren. Dennoch können Frauen im präpubertären oder reproduktiven Alter, die an einer onkologischen Erkrankung leiden, mittlerweile durch eine verbesserte bzw. effektivere Diagnostik und Therapie in der Mehrzahl der Fälle geheilt werden [Boring et al, 1994]. So stieg z.B. bei Kindern mit akuter lymphatischer Leukämie die 5Jahres-Überlebensrate von 53% in den Jahren von 1974 bis 1976 auf 85% in den Jahren von 1995 bis 2000 [Jemal et al, 2005]. Ebenso ist das Langzeit-Überleben bei Hodgkin-Patienten auf mehr als 80 % gestiegen [Hobbie et al, 2005]. Schätzungen zufolge wird im Jahr 2010 einer von 715 Erwachsenen anamnestisch eine maligne Erkrankung aufweisen [Brougham et al, 2005]. 5 1 Einleitung Diese enormen Erfolge sind vor allem auf eine verbesserte Chemo- bzw. Strahlentherapie zurückzuführen, welche allerdings einige Nebenwirkungen mit sich bringt [Horwitz et al, 2000]. So führt z.B. bei einem nicht unerheblichen Anteil der Patienten/-innen, abhängig vom Alter und der jeweiligen Therapieform, die antineoplastischen Behandlung durch ihre Gonaden-toxische Wirkung zu einem teils temporären, teils persistierenden Fertilitätsverlust [Chapman, 1982] [Rivkees et al, 1988]. In diesem Zusammenhang ist besonders die Hoch-Dosis Chemotherapie vor Knochenmarkstransplantation zu erwähnen, bei der es in über 80% der Fälle zu einem ovariellen Funktionsverlust (POF, Premature Ovarian Failure) kommt [Wallace et al, 2005a]. 1.3 Ausmaß des ovariellen Funktionsverlustes durch Chemo- und/oder Strahlentherapie Neben den weit verbreiteten onkologischen Indikationen, werden diverse Chemotherapeutika auch bei anderen Krankheitsbildern (z.B. Lupus erythematodes) mit Erfolg eingesetzt. Auch in diesen Fällen kann es, trotz der oftmals geringen Dosis, durch die teilweise notwendige Langzeitbehandlung zu einem ovariellen Funktionsverlust kommen. So erlitten in einer Untersuchung von Blumenfeld et al. 5 von 9 Patientinnen, die aufgrund einer Lupus-Nephritis mit einer LangzeitzytostatikaTherapie (Cyclophosphamid) behandelt worden waren, ein POF [Blumenfeld et al, 2000]. Hierbei zeigte sich eine direkte Abhängigkeit des Eintritts eines POF vom Alter der Patientin (100% der über 30.-jährigen, 50% der 20-30.-jährigen und 13% der unter 20.-jährigen), welche auf den insgesamt größeren ovariellen Follikelpool von jüngeren Patientinnen zurückzuführen ist. Hierzu passt zusätzlich die Beobachtung, dass es bei jüngeren Patientinnen, welche direkt nach Chemotherapie einen regulären Menstruationszyklus hatten, in den darauf folgenden Jahren in der Mehrzahl der Fälle zu einem verfrühten ovariellen Funktionsverlust kam [Byrne et al, 1987], [Wallace et al, 1989]. Weiterhin berichten Larsen et al bzgl. der Korrelation mit dem Alter der Patientin, von einem vierfach erhöhten Risiko für Jugendliche nach einer onkologischen Behandlung ein POF zu erleiden, im Gegensatz zu jungen Frauen zwischen 21 und 25 Jahren, welche eine Risiko-Erhöhung um das 27-fache gegenüber der normalen Population aufweisen [Larsen et al, 2003]. 6 1 Einleitung Auch eine lokale Strahlenbehandlung speziell im Bereich des Beckens beeinträchtigt die ovarielle Funktion und kann zum POF führen. Laut Wallace et al. reicht eine Dosis von < 2 Gy aus, um die Hälfte aller Oozyten zu zerstören [Wallace et al, 2003]. Die gleiche Arbeitsgruppe konnte 2005 schließlich nachweisen, dass eine Dosis von 5-20 Gy zu einem kompletten gonadalen Funktionsverlust, unabhängig vom Alter der Patientin, führt [Wallace et al, 2005b]. Wenn zusätzlich noch eine Chemotherapie verabreicht wird, erhöht sich das Risiko auch bei niedrigeren Dosen drastisch [Williams et al, 1999a]. 1.4 Strategien zum Erhalt der Fertilität Zur Erhaltung der ovariellen Funktion gibt es heutzutage verschiedene Konzepte, die allerdings im Vergleich zu den Möglichkeiten des Fertilitätserhaltes beim Mann noch am Anfang ihrer Entwicklung stehen. 1.4.1 Kryokonservierung unbefruchteter/befruchteter Eizellen Vergleichbar zur Kryokonservierung von Spermien vor Therapiebeginn beim Mann, welches ein etabliertes Verfahren darstellt [Edge et al, 2006], besteht bei der Frau die Option unbefruchtete reife Eizellen einzufrieren. Diese werden nach hormoneller Stimulation in kryokonserviert. vivo zur Anfangs Reife wurden gebracht, allerdings anschließend hierbei entnommen aufgrund der und hohen Empfindlichkeit der Eizellen gegenüber dem Einfriervorgang keine guten Ergebnisse erzielt [Oktay et al, 2001a]. Die Kryokonservierung von unreifen und damit robusteren Eizellen (aufgrund der geringeren Differenzierung) ist zwar möglich, die dann jedoch anschließend notwendige In-Vitro-Maturation (Reifung) der Zellen ist ebenfalls nur selten erfolgreich [Wu et al, 2001]. Neueren Daten zufolge liegen hierbei die Erfolgschancen für eine Schwangerschaft mittlerweile, dank verbesserter Kryomedien bzw. –techniken, bei ca. 17% [Borini et al, 2007]. 7 1 Einleitung Im Gegensatz hierzu ist die Kryokonservierung von befruchteten Eizellen (nach Invitro-Fertilisation) ein seit vielen Jahren weltweit etabliertes Verfahren [Oktay et al, 2004a] [Meniru et al, 1997]. Allerdings ist diese Technik Frauen vorbehalten, die in einer festen Partnerschaft leben. Weiterhin besteht hierbei das Problem, dass zur Gewinnung von befruchtungsfähigen Eizellen diese erst mittels Hormontherapie, über einen gewissen Zeitraum (ca. 2 Wochen), zur Reifung stimuliert werden müssen, was für Frauen, bei denen der sofortige Therapiebeginn im Vordergrund steht, nicht in Frage kommt. 1.4.2 Kryokonservierung und Retransplantation von ovariellem Gewebe Für die Nutzung von kryokonservierten ovariellen Gewebes gibt es zwei Möglichkeiten: die Autotransplantation und die Xenotransplantation. Bei der Xenotransplantation wird ovarielles Gewebe auf immundefiziente Versuchstiere transplantiert. Dort kann bei Bedarf eine Eizellreifung durch hormonelle Stimulation induziert werden, um anschließend mittels In-VitroFertilisation entsprechende Embryonen zu generieren. Durch diese Methode lässt sich das potentielle Risiko, Tumorzellen im Rahmen der Re-Transplantation auf den Rezipienten zurück zu übertragen nahezu ausschließen, welches vor allem bei hämatogenen und systemischen Neoplasien vermutet wird [Kim et al, 2001]. Bei der Autotransplantation muss unterschieden werden zwischen einer orthotopen Transplantation, bei der das aufgetaute Gewebe wieder in seine ursprüngliche OvarLoge zurück transplantiert wird, mit der prinzipiellen Möglichkeit einer Spontankonzeption, und der heterotopen Transplantation, bei der das Gewebe subkutan oder subfaszial z.B. im Bereich des Abdomens zurück transplantiert wird. Die heterotope Transplantation hat den Vorteil, dass der operative Aufwand der ReTransplantation geringer und der anschließende Zugang zu den Follikeln, mit der dann notwendigen In-vitro-Fertilisation, einfacher erscheint. 8 1 Einleitung Tierexperimentelle Studien Die Kryokonservierung und Retransplantation von ovariellem Gewebe wurde in tierexperimentellen Untersuchungen zumeist an Schafen beschrieben, da diese sich durch ihren mono-ovulatorischen Zyklus und der histo-morphologischen Ähnlichkeit mit dem ovariellen Gewebe der Frau, als Tiermodel ausgezeichnet eignen [Baird et al, 1999], [Aubard et al, 1999], [Bedaiwy et al, 2003]. Erste Untersuchungen wurden jedoch an Ratten und Mäusen durchgeführt. So wurde 1957 erstmals von Parrott et al. über erfolgreiche Schwangerschaften nach orthotoper Transplantation von kryokonserviertem ovariellem Gewebe bei Mäusen berichtet [PARROTT, 1957]. Diese Technik der Fertilitätserhaltung bzw. der Fertilitätswiederherstellung ruhte allerdings fast 30 Jahre, bis durch die Verbesserung der zytostatischen und radiotherapeutischen Therapiemöglichkeiten für junge onkologische Patientinnen die Fertilitätserhaltung wieder in den Blickpunkt des Interesses rückte. Als einer der ersten nahmen Harp et al. 1994 diesbezüglich weitere Untersuchungen an Mäusen wieder auf. Hierbei konnte gezeigt werden, dass 75% der Mäuse nach autologer Retransplantation von kryokonserviertem ovariellen Gewebe wieder einen regelrechten Zyklus aufwiesen [Harp et al, 1994]. Callejo et al. untersuchten 1999 an Ratten, inwiefern die Lage des transplantierten Gewebes für die Funktionalität des Gewebes eine Rolle spielt [Callejo et al, 1999]. Hierbei konnte gezeigt werden, dass bereits 3-4 Monaten nach Re-Transplantation, bei 2/3 aller Tiere ein ovulatorischer Zyklus nachweisbar war, unabhängig davon, ob das Gewebe intraperitoneal oder subkutan re-transplantiert wurde. Die Arbeitsgruppe um Gosden et al. verwendete 1994 erstmalig in diesem Zusammenhang das Schaf als Tiermodell [Gosden et al, 1994]. Sie transplantierten das kryokonservierte ovarielle Gewebe orthotop, also in seinen ursprünglichen Situs zurück. Hier konnten die Autoren ebenso 3-4 Monate nach Re-transplantation eine Wiederaufnahme der ovariellen Hormonproduktion nachweisen. Zusätzlich konnte bei 5 von 6 Schafen histologisch ein Follikelwachstum unterschiedlicher Stadien festgestellt werden. 9 1 Einleitung Im Gegensatz zur Kryo-Konservierung, welche lediglich eine geringe Beeinträchtigung der Struktur bzw. der Funktionalität des ovariellen Gewebes beinhaltet [Radford et al, 2001], besteht das größte Problem der Prozedur in einem immensen Follikel-Verlust im Rahmen der Re-Transplantation[Oktay et al, 2004b]. Mit hoher Wahrscheinlichkeit ist hierfür die zeitweilig bestehende Ischämie des Gewebes nach Transplantation aufgrund einer gewissen Latenz bis zur erneuten Gefäßeinsprossung als Ursache anzusehen, woraus eine zelluläre Apoptose resultiert [Oktay et al, 2004b], [Radford et al, 2001], [Oktay et al, 2001b]. Erfahrungen beim Menschen Nur wenige Einzelfallbeschreibungen befassen sich mit der autologen heterotopen Transplantation ovariellen Gewebes beim Menschen [Callejo et al, 2001], [Oktay et al, 2004b], [Oktay et al, 2001b], [Wolner-Hanssen et al, 2005], [Oktay, 2006]. Im Jahr 2001 berichteten Oktay et al. erstmalig über ihre Erfahrungen mit der heterotopen Transplantation beim Menschen, wobei sie das ovarielle Gewebe autolog in den Unterarm bei zwei Patientinnen transplantierten [Oktay et al, 2001b]. Hierbei konnte sowohl endokrinologisch eine zyklische ovarielle Funktion, als auch sono-morphologisch Follikelwachstum nachgewiesen werden. Jedoch scheint dieser Platz aufgrund des geringen Schutzes vor Temperaturunterschieden und der Gefahr mechanischer Verletzungen nicht so gut geeignet zu sein [Oktay et al, 2001b], [Wolner-Hanssen et al, 2005]. Im Jahr 2004 gelang es der Arbeitsgruppe um Oktay et al. eine aus kryokonserviertem und anschließend heterotop transplantiertem ovariellem Gewebe entnommene Eizelle mittels intra-zytoplasmatischer Spermien Injektion (ICSI) zu fertilisieren und bis zum Vier-Zell-Stadium weiter zu kultivieren [Oktay et al, 2004b]. Das ovarielle Gewebe wurde hierbei nach 6-jähriger Kryokonservierung der Patientin subkutan im Bereich des unteren Abdomens replantiert. Anschließend erfolgte eine hormonelle Stimulation mit Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) bzw. humanem Menopausalem Gonadotropin (hMG). Ca. 36 Stunden vor der Entnahme wurde schließlich die finale Eizellreifung durch Gabe von humanem Chorion-Gonadotropin (hCG) induziert um anschließend die entnommene Eizelle mittels ICSI zu fertilisieren. 10 1 Einleitung Der Re-Transfer des Embryos nach Erreichen des Vier-Zell-Stadiums in den Uterus der Patientin blieb jedoch ohne Implantation. Neben der heterotopen Re-Transplantation ist auch die orthotope Transplantation des ovariellen Gewebes beim Menschen in einzelnen Kasuistiken beschrieben worden [Donnez et al, 2004] [Meirow et al, 2005] [Demeestere et al, 2007]. Von der ersten Lebendgeburt eines Kindes berichteten Donnez et al. im Jahre 2004 [Donnez et al, 2004]. Einer 25-jährigen Patientin mit Hodgkin-Lymphom Stadium IV waren 1997, vor dem Beginn einer Chemo- und Radiotherapie, laparoskopisch 5 Biopsien von der ovariellen Rinde entnommen und kryokonserviert worden. Nachdem die Patientin über 5 Jahre in Vollremission, durch die onkologische Behandlung allerdings ein POF eingetreten war, wurde im Jahr 2003 das kryokonservierte ovarielle Gewebe orthotop im Bereich der Ovarloge re- transplantiert. Bereits 5 Monate später konnte, durch Hormonanalysen gesichert, ein normal-ovulatorischer Zyklus und mittels Laparoskopie ein sprungreifer Follikel nachgewiesen werden. Dieser war außerhalb des 1997 in situ belassenen und nun komplett atroph erscheinenden Restovars, gefunden worden. Eine zusätzlich durchgeführte Probenentnahme bestätigte histo-morphologisch vitales ovarielles Gewebe mit entsprechenden Follikeln. Im darauf folgenden Jahr wurde die Patientin spontan schwanger und gebar ein gesundes Kind. Ein Jahr später veröffentlichten Meirow et al. den Bericht über die Geburt eines Kindes einer ehemals onkologischen Patientin, die nach Kryokonservierung und orthotoper Re-Transplantation ovariellen Gewebes schwanger wurde. Hier erfolgte die Eizellentnahme im Spontanzyklus mit anschließender In-vitro-Fertilisation [Meirow et al, 2005]. Erst kürzlich berichteten Demeestere et al. von einer weiteren erfolgreichen SpontanSchwangerschaft bzw. Geburt eines gesunden Kindes nach Kryokonservierung und Retransplantation von ovariellem Gewebe [Demeestere et al, 2007]. Nachdem ein initialer Versuch einer ortho- bzw. heterotopen Transplantation zwar zunächst zu einer spontanen Schwangerschaft geführt hatte, diese jedoch bedauerlicherweise in einem Abort endete, mit anschließendem erneuten Funktionsverlust des transplantierten ovariellen Gewebes [Demeestere et al, 2006], führte schlussendlich ein wiederholtes Auftauen mit nachfolgender erneuter Re-Transplantation von ovariellem Gewebe zur gewünschten Schwangerschaft. 11 1 Einleitung Diese wenigen, aber doch sehr erfolgversprechenden Fallberichte, spiegeln die Dringlichkeit wieder, die in der weiteren Erforschung zur Erhaltung der weiblichen Fertilität liegt. Denn gerade junge Krebs-Patientinnen haben durch verbesserte Therapiemöglichkeiten eine fast normale Lebenserwartung [Horwitz et al, 2000] [Brougham et al, 2005] und daraus resultierend ein Recht auf fertilitätserhaltende Maßnahmen. 1.4.3 Transposition der Ovarien Eine weitere Möglichkeit des gonadalen Schutzes besteht in einer operativen Verlagerung der Ovarien aus dem Zentrum des Bestrahlungfeldes, bei einer lokal im Bereich des Beckens applizierten Radiotherapie. Dadurch wird eine geringere Strahlenbelastung des ovariellen Gewebes durch eine größere Distanz erreicht [Morice et al, 2000]. Dieses Verfahren erscheint jedoch nur dann indiziert, wenn zusätzlich keine systemische Chemotherapie appliziert wird [Williams et al, 1999b]. 1.4.4 Medikamentöser Schutz Eine Möglichkeit die Toxizität von anti-neoplastischen Agenzien, die insbesondere auf sich schnell teilende Zellen, bzw. proliferierende Gewebe toxisch wirken, zu reduzieren, basiert auf der Hypothese, eine externe (medikamentöse) Funktionsruhe des Ovars zu induzieren. Zu dieser Hypothese passend ist die Beobachtung, dass die Gonaden prä-pubertärer Mädchen deutlich weniger anfällig gegenüber dem toxischen Effekt der verwendeten Substanz sind, als die Ovarien adulter Frauen [Meirow et al, 2001], [Chiarelli et al, 1999], [Ataya et al, 1993]. Zur Suppression der ovariellen Funktion werden hauptsächlich GonadotropinReleasing-Hormon-Agonisten (GnRH-Analoga) eingesetzt, welche initial zu einer Steigerung der FSH- bzw. LH-Ausschüttung führen, dann aber, in der Folge durch konstante Stimulation, eine Downregulation der GnRH-Rezeptoren mit konsekutivem Sistieren der ovariellen Funktion bewirken [Ataya et al, 1993], [Ataya et al, 1995], [Blumenfeld et al, 2000], [Blumenfeld, 2007]. 12 1 Einleitung Eine weitere Option das ovarielle Gewebe vor der toxischen Wirkung einer Chemobzw. Radiotherapie zu schützen, besteht in einer lokalen Behandlung mit Sphingosin-1-Phosphat (S1P). S1P, ein Metabolit des Membranlipid-Bausteins Ceramid, verhindert auf zellulärer Ebene den Vorgang der Apoptose (programmierter Zelltod), welche hauptursächlich für die destruierende Wirkung der anti-neoplastischen Behandlung verantwortlich erscheint. Diese Hypothese konnte bereits 2000 von Morita et al., als auch 2007 von Hancke et al. in ersten Untersuchungen am Tiermodell bestätigt werden [Hancke et al, 2007], [Morita et al, 2000]. 1.5 Zelltod: Apoptose vs. Nekrose Ganz allgemein werden zwei Formen des Zelltodes unterschieden: Apoptose und Nekrose. Der Vorgang der Apoptose, als kontrollierter physiologischer Zelltod, geht mit einer Schrumpfung der Zelle, einer Kondensierung des Zellkerns und einer Abschnürung der Zellmembran einher, bevor sich die Zelle komplett in apoptotische Fragmente umwandelt und von benachbarten Zellen phagozytiert wird. Beim Zelluntergang durch Nekrose kommt es dagegen primär zur Schwellung der Zelle, die Plasmamembran reißt auf und das Zytoplasma wird freigesetzt. Als Folge kommt es zu einer lokalen Entzündungsreaktion [Martelli et al, 2001]. Während dem Vorgang der Nekrose ein unkontrollierter Zelluntergang zugrunde liegt, wird die Apoptose durch ein intra- oder extrazelluläres Signal ausgelöst, das über die Aktivierung verschiedener Enzyme (sogenannter Caspasen) gesteuert wird. Unter anderem führt die aktivierte Caspase 3 zur Inaktivierung eines DNAseInhibitors (ICAD-inhibitor of caspase-activated DNAse), wodurch die Abspaltung der zellulären DNA, durch eine entsprechende DNAse (CAD-caspase-activated DNAse), eingeleitet wird [Enari et al, 1998]. Hierbei entstehen DNA-Doppelstrangbrüche, welche mittels TUNEL Assay („Transferase vermitteltes dUTP Nick end labeling“) sichtbar gemacht werden können und somit eine Differenzierung gegenüber der Nekrose ermöglichen [Stadelmann et al, 2000], [Gavrieli et al, 1992]. 13 1 Einleitung 1.6 Die Bedeutung der Apoptose Dieser „programmierte“ Zelltod wird bei Bedarf, im Sinne einer Protektion, ausgelöst. Zellen, welche beschädigt bzw. nicht mehr funktionsfähig sind und somit nicht mehr benötigt werden, werden auf diese Art vor allem in Geweben mit einem hohen Zellumsatz eliminiert. Eine besondere Bedeutung nimmt die Apoptose im Rahmen der Selektion von Keimzellen ein [Perez et al, 1999], [Lawen, 2003]. Ca. 95% aller Keimzellen werden vor dem Erreichen ihres finalen Reifegrades apoptotisch. Dies stellt einen gewissen Schutz dar, da hierdurch unter anderem genetisch veränderte Keimzellen entfernt werden, bevor eine solche genetische Veränderung auf Nachkommen übertragen werden könnte. Der Vorgang des programmierten Zelltods kann sowohl intern (z.B. durch genetische Abberationen), als auch extern induziert werden. Zu den externen Auslösern zählen z.B diverse Medikamente, allen voran zytotoxische Chemotherapeutika [Perez et al, 1999], [Kockx et al, 1998], [Livera et al, 2008]. Weiterhin kann auch durch Stickstoffmonoxid oder aber durch Hypoxie Apoptose induziert werden [Sarih et al, 1993]. Die biochemische Kaskade, die zur zellulären Apoptose führt, ist ein komplexes System, welches stark vereinfacht in Abbildung 1 dargestellt ist. Hieraus lässt sich ableiten, dass Ceramid und S1P gewissermaßen als „ausgleichende Gegenspieler“ bezüglich eines Chemotherapie-induzierten programmierten Zelltods (Apoptose) fungieren [Cuvillier et al, 1996]. 14 1 Einleitung Sphingomyelin Sphingomyelinsynthase Sphingomyelinase (SMase) Ceramid Apoptose Ceramidsynthase Ceramidase Sphingosin S1P-Phosphatase Sphingosinkinase Sphingosin-1-Phosphat (S1P) Schutz vor Apoptose Abbildung 1: Apoptose-Kaskade, modifiziert nach Hancke et al. 15 1 Einleitung 1.7 Sphingosin-1-Phosphat Sphingosin-1-Phosphat (S1P) kommt im menschlichen Organismus ubiquitär vor und gehört zu den wasserlöslichen Lysophospholipiden. Abbildung 2: Sphingosin-1-Phosphat Es wird aus Sphingomyelin, einem Bestandteil der Plasmamembran synthetisiert und fungiert als Ligand einer G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie, deren fünf Mitglieder je nach Gewebe unterschiedlich exprimiert werden [Payne et al, 2002]. S1P wirkt als extrazellulärer Mediator auf vielfältige Zellprozesse ein. So reguliert es unter anderem das Zellwachstum, bzw. Differenzierung, aber auch Apoptose. Zu den Vorstufen von S1P gehört Ceramid, welches als second messenger intrazellulär für die eigentliche Initiierung des programmierten Zelltod verantwortlich ist [Cuvillier et al, 1996], [Spiegel et al, 1998], [Olivera et al, 1999]. 1.8 Studienlage zu S1P Einen ersten Hinweis auf die in Abbildung 1 skizzierten Zusammenhänge bezüglich Apoptose im Ovar ergab sich aus der Arbeit von Horinouchi et al. [Horinouchi et al, 1995]. In dieser Arbeit stellten die Autoren fest, dass bei Sphingomyelinase- (SMase) defizienten Mäusen, die zur Forschung der Niemann-Pick-Krankheit untersucht wurden und einen erniedrigten Ceramidspiegel aufwiesen, die Anzahl ovarieller Follikel postpartal signifikant höher war, als im Vergleich zu wild-typ Mäusen. Diese Beobachtung wurde von der Arbeitsgruppe um Tilly im Rahmen von in vitro Versuchen bestätigt [Morita et al, 2000]. Nach 72 Stunden in Kultur waren signifikant weniger gonadale Zellen von SMase-defizienten Mäuseembryonen apoptotisch (P<0.05), als bei gonadalem Gewebe von wild-typ Mäusen. 16 1 Einleitung Zusätzlich konnten die Autoren nachweisen, dass durch eine Behandlung des gonadalen Gewebes mit S1P in vitro die zelluläre Apoptose signifikant (P<0.001) reduziert werden kann. Im Rahmen einer weiteren Untersuchung analysierte die gleiche Arbeitsgruppe nun in vivo die protektive Wirkung von S1P auf ovarielle Follikel, welche einer zytotoxischen Bestrahlung mit 1 Gy ausgesetzt wurden. Zwei Stunden vor Bestrahlung wurde zwei Gruppen von jungen adulten Mäusen S1P in unterschiedlichen Konzentrationen (1. Gruppe: 50 µM S1P; 2. Gruppe: 200 µM S1P) in die Bursa der Ovarien im Rahmen eines operativen Eingriffs appliziert. Eine 3. Gruppe erhielt kein S1P und diente als Kontrolle. 2 Wochen nach Bestrahlung konnten die Autoren mittels histologischer Untersuchungen eine signifikant (P<0.05) höhere Anzahl an Follikel bei den mit S1P behandelten Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe nachweisen. In einem ähnlichen Versuchsansatz konnten Hancke et al nachweisen, dass der protektive Effekt von S1P auf ovarielle Follikel auch im Rahmen einer Chemotherapie besteht [Hancke et al, 2007]. Anstatt Radiatio erhielten die Mäuse intravenös einen Bolus mit 100 µg Dacarbazine. 2 Wochen später zeigte sich eine signifikant höhere Follikelanzahl bei der mit S1P behandelten Gruppe im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe, zusätzlich war der Prozentsatz an gesunden Nachkommen bei der mit S1P behandelten Gruppe höher. 1.9 Ziel der Arbeit Wie bereits erwähnt, besteht das größte Problem bei der Transplantation von ovariellem Gewebe in einem immensen Follikel-Verlust, welcher vermutlich durch die zeitweilig bestehende Ischämie des Gewebes verursacht wird, die in einer zellulären Apoptose resultiert. S1P greift auf vielfältigen Wegen in physio- und pathophysiologische Prozesse auf zellulärer Ebene ein, wie z.B. der Zellproliferation und –ausdifferenzierung, aber auch der Apoptose [Moolenaar, 2000], [Goetzl et al, 2004]. 17 1 Einleitung Okazaki et al. konnten im Tiermodell nachweisen, dass durch die Applikation von S1P im Rahmen einer Lungen-Transplantation die Funktionalität des Transplantats durch Unterdrückung von Apoptose bzw. inflammatorischer Prozesse deutlich gesteigert werden kann [Okazaki et al, 2007]. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die protektive Wirkung von S1P im Rahmen der ovariellen Transplantation zu untersuchen. Hierbei soll im Detail analysiert werden, ob durch Gabe von S1P, die durch Ischämie ausgelöste Apoptose der ovariellen Follikel nach Transplantation reduziert werden kann. Anhand der Histologie soll die Morphologie des transplantierten Gewebes evaluiert werden. Besonderes Interesse gilt hierbei der Follikeldichte in dem mit S1Pbehandeltem Gewebe im Gegensatz zum unbehandelten Gewebe. Weiterhin soll durch die Anwendung eines TUNEL-Assays (Transferase vermitteltes dUTP Nick end labeling), wodurch apoptotische Zellen im Gewebe markiert werden, überprüft werden, ob durch die Applikation von S1P, die zelluläre Apoptose signifikant reduziert werden kann. 18 2 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Versuchstiere Im Rahmen dieser Studie wurden insgesamt vier weibliche Schafe der Rasse Suffolk behandelt, welche über den gesamten Zeitraum des Projektes im Tierhygienischen Institut in Landwasser/Freiburg im Breisgau artgerecht gehalten und von qualifizierten Tierärzten bzw. Pflegern adäquat betreut wurden. Die Schafe erhielten direkt nach Eintreffen im Institutsstall zur Identifizierung die Buchstaben A-D randomisiert mit wasserfester Farbe auf den Rücken gesprüht. Die Voraussetzungen für die Aufnahme in das Projekt waren eine vorausgegangene Schwangerschaft zum Nachweis der Fertilität, das Alter der Tiere (unter 18 Monate) und der Ausschluss einer bestehenden Schwangerschaft. Sämtliche dieser Kriterien wurden vom Züchter eindeutig für jedes Tier nachgewiesen. Eine schriftliche Genehmigung der Bezirksregierung Freiburg lag bei Versuchsbeginn vor. 2.2 Zeitlicher Ablauf Der Versuch war auf ca. 8 Monate angelegt. Zunächst erfolgte eine 4-monatige Vorbereitungsphase (Oktober 2004 – Januar 2005), in der der hormonelle Zyklus der Schafe mittels regelmäßiger Blutanalysen dokumentiert wurde. Daraufhin erfolgte die Primär-Operation mit Entnahme und Behandlung der Ovarien und anschließender direkter heterotoper Re-Transplantation (Februar 2005 – März 2005). Gemäß Protokoll wurde als individuelle Behandlung jeweils 1 Ovar zweier Tiere mit S1P behandelt, die kontralateralen Ovarien dienten als intra-individuelle Kontrolle, 2 weitere Tiere als inter-individuelle Kontrolle ohne spezifische Behandlung. Ca. 2 Wochen später erfolgte dann die Final-Operation, bei der das ovarielle Gewebe zur abschließenden Analyse entnommen und die Tiere euthanasiert wurden (März 2005 – April 2005) (siehe Tabelle 1). 19 2 Material und Methoden Blutentnahmen Oktober November Dezember Januar Februar März April 3 x wöchentlich 1 x monatlich - - Exstirpation der Ovarien mit (22/23.3.05) direkter heterotoper Retransplantation (30.3.05) Final Operation mit Entnahme (5.4.05) des ovariellen Gewebes (12.4.05) Tabelle 1: Übersicht des zeitlichen Ablaufes der Studie 2.3 Blutabnahmen und Hormonanalysen Von Oktober 2004 bis Dezember 2004 wurde 3 x wöchentlich Blut abgenommen, um einen regulär ovulatorischen Menstrual-Zyklus nachzuweisen (siehe Tabelle 1). Dieser wird, in Analogie zum Menschen, durch einen Anstieg der ProgesteronSerumkonzentration in der 2. Zyklushälfte nachgewiesen. Dazu wurden ca. 10ml Blut aus der Vena jugularis entnommen und in der Frauenklinik Freiburg direkt nach Entnahme zentrifugiert. Das Serum wurde anschließend bis zur eigentlichen Hormonanalyse bei -18 Grad tiefgefroren. Die endgültige Bestimmung der Konzentrationen von Östradiol und Progesteron im Serum erfolgte dann im Anschluss an die Vorbereitungsphase mittels einem handelsüblichen ELISA (DRG International, USA) nach den Vorgaben des Herstellers. 20 2 Material und Methoden 2.4 Beschreibung der Operationen Zum Zwecke des operativen Eingriffs wurden alle Schafe jeweils einen Tag vorher in den Tier-Laborstall der Uniklinik Freiburg gebracht und dort über 24 Stunden präoperativ nüchtern gehalten. Vor Einleitung der Narkose erhielten die Tiere primär zur Sedation eine intramuskuläre Injektion (Atropin 0,05 mg/kg KGW, Xylazin 0,1 mg/kg KGW, Ketamin 10 mg/kg KGW). Nach Anlage eines venösen Zugangs erfolgte dann die eigentliche Einleitung der Narkose mittels Propofol und anschließender Intubation (Narkoseprotokoll siehe Anhang). Die Tiere wurden in Rückenlage auf einem OP-Tisch fixiert und zur Überwachung an ein Beatmungs- sowie ein EKG-Gerät angeschlossen (siehe Abbildung 3). Der OPBereich kranial der Mamillen wurde rasiert und desinfiziert, die Umgebung mit sterilen Tüchern abgedeckt. Mit einem ca. 10cm langen medianen Unterbauch-Längsschnitt wurde der Bauchraum eröffnet und nach sorgfältiger Präparation und Identifikation beide Ovarien abgesetzt (siehe Abbildung 4). Abbildung 3: Vorbereitung und Lagerung eines Schafes für die Operation 21 2 Material und Methoden Abbildung 4: Operationssitus während der Entnahme eines Ovars (bicorner Uterus und Ovar) Kontrollgruppe (Schaf A und Schaf B): Unter sterilen Bedingungen wurde das ovarielle Rindengewebe, welches die Follikel enthält, vorsichtig vom Stroma abpräpariert und in ca. 3-5 mm große Partikel geschnitten. Von jedem Ovar wurden 3 dieser Stücke als Ausgangspräparat zum späteren Vergleich mit dem Gewebe nach Transplantation in Formaldehyd (4%) fixiert. Die restlichen Stücke des ovariellen Gewebes wurden auf einen nicht resorbierbaren Faden aufgezogen und anschließend direkt heterotop in eine entsprechend präparierte subfasciale Tasche des Musculus rectus abdominis re-transplantiert und mit 2 Stichen am Muskel fixiert (siehe Abbildung 5). Behandlungsgruppe (Schaf C und D): Bei Schaf C und D wurden ebenso beide Ovarien exstipiert, anschließend jedoch nur ein Ovar mit Sphingosin-1-Phosphat (400µM in PET-Puffer) behandelt, um das jeweilige kontralaterale Ovar als unbehandelte intra-individuelle Kontrolle verwenden zu können. Zuerst wurde nach Absetzen des Ovars S1P in die ovarielle Rinde injiziert. Nach einer Einwirkzeit von 3 Minuten wurde die ovarielle Rinde wie bei der Kontrollgruppe präpariert und nochmals für 5 Minuten in eine S1P-Lösung, zum Zwecke der Diffusion, eingebracht. Abschließend erfolgte die subfasciale ReTransplantation, wobei das mit S1P behandelte Gewebe im Bereich des rechten 22 2 Material und Methoden Musculus rectus abdominis und das unbehandelte Gewebe im Bereich des linken Musculus rectus abdominis re-transplantiert wurde (siehe Abbildung 5). Abbildung 5: Subfasciale Re-Transplantation des ovariellen Gewebes im Bereich des Musculus rectus abdominis mittels Fixation durch Naht Nach Ausleiten der Narkose wurde das jeweilige Schaf wieder in den Tier-Laborstall zurück gebracht, wo es für die nächsten 5 Tage observiert wurde. Hierbei wurde regelmäßig der Allgemeinzustand, die Wundheilung und die Wasser- und Nahrungsaufnahme von Tierpflegern und Tierarzt überprüft. Alle Tiere tolerierten den operativen Eingriff ohne Komplikationen, so dass sämtliche Tiere nach jeweils fünf-tägiger Beobachtung zurück ins tierhygienische Institut Landwasser transportiert werden konnten. Ca. 2 Wochen später wurde dann jeweils die Final-Operation zur Entnahme des ovariellen Gewebes durchgeführt (siehe Tabelle 1). Mittels einer Überdosis Thiopental wurden die Tiere euthanasiert und das transplantierte Gewebe, welches sich anhand des blau gefärbten Fadens leicht identifizieren ließ, zusammen mit der jeweiligen Rektus-Muskulatur in toto entnommen (siehe Abbildung 6). Das entnommene Gewebe wurde anschließend direkt in 4% Formaldehyd-Lösung konserviert. 23 2 Material und Methoden Abbildung 6: Transplantiertes ovarielles Gewebe mit Teil des Rektusmuskels bei der Entnahme 2.5 Histologie Zur mikroskopischen Beurteilung des ovariellen Gewebes wurden die Proben wie folgt behandelt: Das frische Gewebe wurde in 4 % Formaldehyd-Lösung fixiert und ins Institut für Pathologie transportiert. Nach Einbettung in Paraffin, wurden von der Hälfte des jeweiligen Präparates starke Schnitte angefertigt und diese auf Glasobjektträger aufgebracht. Diese Präparate wurden im nächsten Schritt mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt (Protokoll siehe Anhang). Von dem verbliebenen Restgewebe des jeweiligen Präparates wurden 5µm-Serienschnitte zum Zweck des Apoptose-Nachweises mittels TUNEL-Assays angefertigt und ebenso auf Objektträger aufgebracht. Nun wurde mikroskopisch sowohl die Follikeldichte in der HE-Färbung bestimmt, als auch das Ausmaß der Apoptose nach Anfärbung mittels TUNEL- Assay untersucht. Die Bestimmung der Follikeldichte dient der Quantifizierung der Vitalität bzw. der Funktionalität des transplantierten ovariellen Gewebes. Die jeweiligen Ergebnisse werden zwischen den unterschiedlichen Gruppen (ohne S1P vs. mit S1P) jeweils vor und nach der Transplantation verglichen. Um eine valide und reliable Auswertung zu gewährleisten, wurden die Auszählungen von zwei Personen (Pathologin Dr. Heike Goebel und cand. med. Elisabeth Laub) 24 2 Material und Methoden jeweils zweimal vorgenommen, wobei sich keine signifikanten Unterschiede der Ergebnisse ergaben. 2.5.1 Bestimmung der Follikeldichte Nach einem orientierenden Überblick über das Gewebe in 2,5-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop, wurden bei den eindeutig identifizierbaren ovariellen Anschnitten alle einstellbaren Gesichtsfelder in einer 25-fachen Vergrößerung systematisch nach Follikeln durchsucht. Alle Strukturen die klar als Follikel zu erkennen waren, wurden gezählt. Für die weitere Auswertung erfolgte die gruppenspezifische Zusammenfassung der Werte, wobei die jeweilige Follikeldichte, aus der Gesamtsumme der Follikel, pro ausgezählte Gesichtsfelder, bestimmt wurde. 2.5.2 Apoptose-Nachweis mittels TUNEL-Assay TUNEL - Enzymhistochemie Mit Hilfe des Enzyms Terminale deoxynukleotidyl Transferase (TdT) werden internukleosomale DNA-Strangbrüche markiert (TUNEL = Terminale deoxynukleotidyl Transferase vermitteltes nick-end-labeling). Durch Anlagerung von biotinylierten d-UTP (2'-Deoxyuridine 5'-Triphosphate) werden schließlich apoptotische Zellen dargestellt. Im Originalprotokoll des TUNEL-Assays publiziert von Gavrieli und Sherman 1992 [Gavrieli et al, 1992], färben sich auch Calciumhaltige Partikel in den Präparaten an, so dass in dieser Studie mit dem von Kockx modifizierten Protokoll gearbeitet wurde, dass durch Inkubation mit Zitronensäure Fehlanfärbungen verhindern soll [Kockx et al, 1998] (siehe Protokoll im Anhang). Kontrollen Beim TUNEL-Assay dient humanes Tonsillen-Gewebe als Positiv-Kontrolle. Hierbei färben sich die sogenannten tingiblen Körperchen (apoptotische Lymphozyten) im Zytoplasma der Kernzentrumsmakrophagen positiv an. Eine weitere Positiv-Kontrolle wird durch die Andauung des zu untersuchenden ovariellen Gewebes durch DNAse I erreicht. DNAse I induziert DNA-Strangbrüche und führt somit zu einer Anfärbung 25 2 Material und Methoden sämtlicher Zellkerne. Entsprechende Negativkontrollen werden durch Ersetzen des TdT und des b-dUTP durch einfachen Puffer erreicht. In Analogie zur bereits beschriebenen Auszählung der Follikeldichte, erfolgte nach Anfärbung von apoptotischen Zellen mittels TUNEL-Assay die Auswertung der einzelnen Gruppen. 2.6 Statistik In den deskriptiven Nachkommastellen Tabellen sind die Ergebnisse dargestellt. Die Ergebnisse mit sind einer mit bzw. zwei Mittelwert und Standardabweichung (SD) angegeben. Die statistische Analyse der Daten wurde mit Sigma-Stat® (Version 3.1, Systat Software, Inc., Point Richmond, California, USA) durchgeführt. Daten, die innerhalb einer Gruppe zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfasst worden waren, wurden mit einem Rangreihenvergleich nach Wilcoxon verglichen [Wilcoxon, 1945]. Daten unterschiedlicher Gruppen wurden mit nichtparametrischen zweiseitigen Varianzanalysen verglichen (Mann-Whitney U Test) [Mann et al, 1947]. Ein p-Wert von unter 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. 26 3 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Histologie Das bei der Final OP entnommene ovarielle Gewebe liefert anhand der Follikeldichte und des Ausmaßes der Apoptose eine quantitative Aussage über die Vitalität bzw. Funktionalität des Gewebes. Hierbei lässt sich durch einen Vergleich zwischen der Behandlungs- und der Kontrollgruppe eine Aussage darüber treffen, ob S1P einen protektiven Effekt im Rahmen der Transplantation ausübt. Sowohl bei der mit Sphingosin-1-Phosphat behandelten Gruppe, als auch bei der Kontrollgruppe zeigen sich im Rahmen der mikroskopische Beurteilung an HEgefärbten Schnitten, Follikel unterschiedlicher Größe bzw. Reifestadium, wobei jedoch deutliche morphologische Veränderungen im Vergleich zum ursprünglichen Gewebe, vor der Transplantation, zu sehen sind (siehe Abbildung 7, 8 und 9). Abbildung 7: Ovarielle Rinde vor Transplantation mit Follikeln unterschiedlicher Größe bzw. Stadium bei 20-facher Vergrößerung (HE-Färbung) 27 3 Ergebnisse Abbildung 8: Ovarielle Rinde mit Muskelanschnitt 14 Tage nach Transplantation bei 2,5-facher Vergrößerung (HE-Färbung) Abbildung 9: Ovarielle Rinde 14 Tage nach Transplantation bei 20-facher Vergrößerung (HE-Färbung) 28 3 Ergebnisse Das ovarielle Rindengewebe ist 2 Wochen nach Transplantation zum Großteil durch Granulationsgewebe ersetzt, wodurch im Vergleich zum Ausgangspräparat die Follikeldichte deutlich reduziert erscheint. Die noch vorhandenen Follikel sind oft schon morphologisch verändert. Immer wieder finden sich infarktartig untergegangene Areale mit unterschiedlich alten Nekrosen, umgeben von einer resorptiv-entzündlichen Reaktion. Es zeigen sich Fibrinexsudationen als Zeichen der frischen Schädigung, Erythrozytenextravasate und Siderophagen als Zeichen der Einblutung, neutrophile Granulozyten, Makrophagen und mehrkernige Riesenzellen als Zeichen der Resorption und Granulationsgewebe und Fibrose als Zeichen der Reparation. 3.1.1 Follikeldichte Die durchschnittliche Follikeldichte ist mit der Standardabweichung für jedes Tier und für jede Behandlungsart sowohl vor (also im ursprünglichen Gewebe) als auch nach Transplantation separat in Tabelle 2 dargestellt. Schaf A Schaf B Schaf C Schaf D vor Transplantation 3,35 ± 5,26 1,27 ± 2,84 1,71 ± 2,31 3,76 ± 4,73 0,57 ± 1,23 0,11 ± 0,32 0,06 ± 0,31 0,18 ± 0,46 0,1 ± 0,35 0,33 ± 0,84 nach Transplantation (Ohne S1P) nach Transplantation (Mit S1P) Tabelle 2: Durchschnittliche Follikelanzahl pro Gesichtsfeld für jedes Schaf vor bzw. nach Transplantation mit jeweiliger Standardabweichung (±) 29 3 Ergebnisse Um den Verlust an Follikeln nach 14-tägiger Transplantation im Gewebe zu verdeutlichen, ist die Follikeldichte nocheinmal in graphischer Form für die Kontrollgruppe (Schaf A und B) und für die mit S1P behandelte Gruppe (Schaf C und D) in Abbildung 10 und 11 dargestellt. Abbildung 10: Durchschnittliche Follikelanzahl pro Gesichtsfeld der Kontrollgruppe (Schaf A (dunkelblau) und B (hellblau)) am Tag 0 bzw. am Tag 14 nach Transplantation Abbildung 11: Durchschnittliche Follikelanzahl pro Gesichtsfeld bei Schaf C (dunkelrot) und D (hellrot) am Tag 0 bzw. Tag 14 nach Transplantation mit S1P Behandlung (gestrichelte Linie) bzw. ohne S1P Behandlung (durchgezogene Linie) 30 3 Ergebnisse Follikeldichte pro Behandlungsgruppe Einen Vergleich der durchschnittlichen Follikeldichte pro Behandlungsgruppe ist mit der jeweiligen Standardabweichung vor bzw. nach Transplantation und dem jeweiligen Follikelüberleben in Tabelle 3 dargestellt. Vor Transplantation Nach Transplantation Schaf Schaf A+B Schaf C+D (ohne S1P) (ohne S1P) 2,27 ± 4,3 2,74 ± 3,85 2,51 ± 4,08 2,74 ± 3,85 0,33 ± 0,9 0,12 ± 0,39 0,23 ± 0,7 0,21 ± 0,65 14,5% 4,3% 9,1% 7,6% Follikelüberleben A+B+C+D (ohne S1P) Schaf C+D (mit S1P) Tabelle 3: Durchschnittliche Follikeldichte pro Gesichtsfeld vor bzw. nach Transplantation pro Behandlungsgruppe Anhand der in Tabelle 3 dargestellten Daten ergibt sich beim Vergleich des nichtbehandelten ovariellen Gewebes (Schaf A+B+C+D ohne S1P) zum mit S1Pbehandelten ovariellen Gewebe (Schaf C und D) kein signifikanter Unterschied (Mann-Whitney-Test: P=0,909). Alle Explantate weisen signifikant weniger Follikel auf, als vor Transplantation (Wilcoxon-Test: P=<0,001). 3.1.2 Zellulärer Apoptosenachweis mittels TUNEL-Assay In dem bereits deutlich fibrotisch umgebauten Gewebe, fanden sich in sämtlichen untersuchten Schnitten nur vereinzelt braun-rot angefärbte Zellen, die aufgrund ihres geringen Vorkommens nicht quantitativ auswertbar waren. Zudem konnte nicht 31 3 Ergebnisse geklärt werden, ob es sich hierbei tatsächlich um TUNEL-positive Zellen handelt, da diese zur eindeutigen Identifizierbarkeit entsprechende Kernatypien aufweisen sollten, was jedoch aufgrund der deutlich veränderten zellulären Struktur nur unzureichend möglich war. Weiterhin ließen sich die wenigen angefärbten Zellen, aufgrund der bereits nach 2 Wochen aufgetretenen ausgeprägten morphologischen Veränderungen des Gewebes, nicht eindeutig einem Zelltyp (z.B. Oocyte vs. Stromazelle) zuordnen (siehe Abbildung 12). Dieses Ergebnis bestätigte sich in einem daraufhin erneut durchgeführten Assay, so dass auf eine weitere quantitative Analyse verzichtet wurde. Abbildung 12: Ovarielles Rindengewebe 14 Tage nach Transplantation bei 20-facher Vergrößerung (Anfärbung mittels TUNEL Assay) 32 4 Diskussion 4 Diskussion Die Möglichkeiten zum Fertilitätserhalt bei Frauen, die Chemo- und/oder Strahlentherapie ausgesetzt sind, sind vielfältig. Die Kryokonservierung von befruchteten Eizellen ist ein in der Klinik schon etabliertes Verfahren, wohingegen sich die Kryokonservierung von ovariellem Gewebe noch in der experimentellen Phase befindet [Oktay et al, 2004a]. Eines der Hauptprobleme bei der Transplantation von kryokonserviertem ovariellem Gewebe ist nach wie vor der hohe Follikelverlust ihm Rahmen der ReTransplantation, der vermutlich durch die zeitweilig bestehende Ischämie des Gewebes verursacht wird, mit daraus resultierender Apoptose. Die Prozedur der Kryokonservierung an sich scheint als limitierender Faktor für die Vitalität des Transplantates bzw. der Primordialfollikel eine eher untergeordnete Rolle zu spielen. In der vorliegenden Studie sollte nun geklärt werden, ob der hohe Follikelverlust im Rahmen der Transplantation durch Apoptose bedingt ist, und ob dieser Verlust durch die Behandlung mit dem Apoptose-Inhibitor S1P vermindert werden kann. 4.1 Histologie Aus den Ergebnissen der vorliegenden Studie geht hervor, dass die überwiegende Mehrzahl der Follikel bereits innerhalb der ersten zwei Wochen nach Transplantation zu Grunde geht, und zwar unabhängig davon, ob das Gewebe mit S1P behandelt wurde oder nicht. Der Verlust an Primordial- bzw. Primärfollikeln betrug 2 Wochen nach Transplantation bei der unbehandelten Gruppe (Schaf A+B+C+D) 90,9 % und bei der mit S1P behandelten Gruppe 92,4 %, welches im direkten Vergleich keinen signifikanten Unterschied ergibt. Dieses Ergebnis deckt sich mit den Erkenntnissen anderer Autoren, die ebenso einen immensen Follikelverlust nach Transplantation beschreiben [Aubard et al, 1999], [Baird et al, 1999], [Oktay et al, 2001a], [Callejo et al, 2001]. So beschreiben Baird et al. eine Follikelreduktion um ca. 72% 22 Monate nach Transplantation, bzw. Aubard et al. sogar eine Reduktion der Follikel von 95% bereits 2-3 Monate nach Transplantation. 33 4 Diskussion Die plausibelste Ursache für diesen immensen Follikelverlust im Rahmen der Transplantation ovariellen Gewebes scheint die vorübergehende Ischämie des Gewebes bzw. die Latenz bis zur Neovaskularisation zu sein [Oktay et al, 2001a], [Callejo et al, 2001], [Donnez et al, 2006], [Aubard et al, 1999], [Baird et al, 1999]. In der Literatur werden verschiedene Methoden diskutiert, die zu einer Reduktion der Ischämie nach Transplantation beitragen könnten. So propagieren einige Autoren eine Entnahme des gesamten Ovars inklusive der versorgenden Gefäße, welches dann in toto mit entsprechender Gefäßanastomosierung wieder replantiert werden kann [Jeremias et al, 2002], [Bedaiwy et al, 2003]. Allerdings besteht das Hauptproblem dieser Strategie in der Kryokonservierung eines Ovars in toto, da hierbei dem gesamten Gewebe mittels Perfusion einer kryo-protektiven Lösung das Wasser entzogen werden muss, um eine Zerstörung der Zellen durch intrazelluläre Kristallisation des Wassers während des Gefrier-Prozesses zu verhindern. Weiterhin ist die operative vaskuläre Anastomosierung aufwendig und beinhaltet das Risiko eines thrombotischen Verschluss des Gefäßes mit konsekutivem Organversagen [Bedaiwy et al, 2003]. Eine andere Strategie stellt die Gabe von angiogenese-induzierenden Substanzen zur schnelleren Neovaskularisation des transplantierten Gewebes dar [Krautter C., 2006]. In dieser Arbeit wurde ein verbessertes Follikelüberleben durch die exogene Gabe von angiogenese-induzierendem humanem Menopausen-Gonadotropin (hMG) nach autologer heterotoper Transplantation ovariellen Gewebes beschrieben. Die Autoren konnten nachweisen, dass durch hMG eine gesteigerte Mikrogefäßdichte im Sinne einer verbesserten Neovaskularisation induziert wird, welches schließlich durch eine verbesserte vaskuläre Versorgung des Transplantats zu einem verbesserten Follikelüberleben führt. 4.2 Apoptose In einer Tier-experimentellen in-vivo Studie von Okazaki et al berichten die Autoren, dass durch die Applikation von S1P im Rahmen einer Lungen-Transplantation, mittels Unterdrückung von Apoptose bzw. inflammatorischer Prozesse, die Funktionalität des Transplantats signifikant gesteigert werden kann [Okazaki et al, 2007]. 34 4 Diskussion Im Gegensatz hierzu, konnte in der vorliegenden Arbeit kein signifikanter Unterschied bezüglich des Follikelüberlebens und der Anzahl apoptotischer Zellen zwischen dem mit S1P behandelten Gewebe und den Kontrollen festgestellt werden. Jedoch wurde in der zitierten Arbeit von Okazaki et al. S1P systemisch intravenös verabreicht, im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit, bei der die Applikation lokal mittels Injektion und Diffusionsbad erfolgte. In einer weiteren Studie zur ovariellen Protektion durch S1P von Onions et al. untersuchten die Autoren, ob durch die Zugabe von S1P zum kryo-protektiven Medium, die teilweise auftretende Follikel-Apoptose, bedingt durch den Vorgang der Kryokonservierung, reduziert werden kann [Onions et al, 2008]. Hierbei zeigte sich, in Analogie zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, dass der Vorgang der zellulären Apoptose im Ovar durch die zusätzliche Gabe von S1P nicht reduziert wird. Ein Grund dafür könnte darin bestehen, dass S1P seine anti-apoptotische Wirkung über einen alternativen Signalweg entfaltet [Onions et al, 2008]. Die publizierten Studien, in denen durch S1P erfolgreich die follikuläre Apoptose reduziert werden konnte, bezogen sich entweder auf Chemo- oder auf Radiotherapie induzierte Apoptose im ovariellen Gewebe [Morita et al, 2000], [Hancke et al, 2007]. Hierbei ist bekannt, dass Chemo - bzw. Radiotherapie über einen Anstieg von intrazellulärem Ceramid den programmierten Zelltod einleiten [Perez et al, 1997], [Morita et al, 2000]. Im Falle der durch Kryokonservierung bzw. Transplantation bedingten Apoptose könnte ein alternativer Signalweg zum Zelluntergang führen. Bei der Kryokonservierung von Spermien wird eine Aktivierung des Enzyms Caspase-3 als eigentlicher Auslöser der Apoptose vermutet [Martin et al, 2004], [Stroh et al, 2002]. Weiterhin scheint dieser Signalweg sowohl im Rahmen der Apoptose von murinen Oozyten [Perez et al, 1999], als auch im Rahmen der bovinen Follikelatresie eine wichtige Rolle zu spielen [Nicholas et al, 2005]. Ein weiterer Grund für die lediglich vereinzelt nachweisbare Apoptose in den Präparaten mittels TUNEL-Assay besteht vermutlich darin, dass der überwiegende Anteil der zellulären Apoptose zwei Wochen nach Transplantation bereits abgeschlossen ist. 35 4 Diskussion Apoptotische Zellen Entzündungsreaktion werden phagozytiert laut und Definition ohne Fibroblasten füllen eine den begleitende Raum mit extrazellulärer Matrix aus. Die ausgeprägte Fibrose in den Gewebeschnitten könnte darauf hindeuten, dass apoptotische Follikel bereits abgebaut wurden und die fibrotischen Umbauprozesse 2 Wochen nach Transplantation weitgehend abgeschlossen sind. Da mittels TUNEL-Assay lediglich Zellen in der sogenannten Exekutionsphase der Apoptose markiert werden, erscheint es plausibel, dass eine entsprechende Markierung zwei Wochen nach Transplantation nicht mehr möglich ist. Zu dieser Hypothese passend, sind die Beobachtungen von Kim et al., welche im Rahmen einer in-vitro Kultur von bovinem ovariellem Gewebe feststellten, dass bereits nach 48 Stunden Hypoxie, 50% der Follikel Zeichen der Apoptose aufwiesen [Kim et al, 2004]. Eine alternative Erklärung für die geringe Detektion mittels TUNEL-Assay besteht darin, dass für den ischämisch bedingten Follikelverlust der Vorgang der Nekrose hauptverantwortlich für die Follikelreduktion ist und die zelluläre Apoptose lediglich eine untergeordnete Rolle spielt. 4.3 Optimierung Die vorliegende Studie zeigt, dass die subfasziale Transplantation ovariellen Gewebes prinzipiell möglich ist, der immense Follikelverlust sich jedoch durch die Applikation des Apoptose-Inhibitors S1P nicht reduzieren ließ. Auch ein Unterschied der Apoptose-Rate im S1P-behandelten zum unbehandelten Gewebe ließ sich zwei Wochen nach Transplantation mittels TUNEL-Assay nicht mehr nachweisen. Um zu klären, in welchem Ausmaß und in welchem Zeitraum Apoptose in transplantiertem Gewebe abläuft, erscheint es sinnvoll eine kürzere Zeitspanne zu wählen, nach der das Gewebe analysiert werden sollte. Weiterhin gilt es zu untersuchen, ob durch eine Unterdrückung der Caspasegetriggerten Apoptose, das Follikelüberleben nach ovarieller Transplantation verbessert werden kann. 36 4 Diskussion 4.4 Klinische Anwendung Auch wenn im Ansatz einige erfolgsversprechende Optionen zum Fertilitätserhalt bei onkologischen Patientinnen existieren, sind diese Möglichkeiten aufgrund der fehlenden Erfahrung noch weit davon entfernt im klinischen Alltag eingesetzt zu werden. Durch eine kontinuierliche Weiterentwicklung und Optimierung könnte es jedoch in nicht allzu ferner Zukunft möglich sein, unter Berücksichtigung der Vorstellungen und Bedürfnisse der Patientinnen, ein individuell passendes Behandlungskonzept zur Erhaltung der Fertilität anzubieten, sei es durch Kryokonservierung von befruchteten und/oder unbefruchteten Eizellen, oder aber durch die Kryokonservierung von ovariellem Gewebe. Nicht nur die meist onkologische Grunderkrankung und die dadurch indizierte Therapie, sondern auch das Alter der Patientin, sollte in die Überlegung, welche Option zum Fertilitätserhalt sich am besten für die Patientin eignet, mit einbezogen werden. So kommen für junge, präpubertäre Patientinnen lediglich solche Verfahren in Betracht, die keine ovarielle Stimulation benötigen, wie z.B. die Kryokonservierung von ovariellem Gewebe. Bei älteren Patientinnen, die in einer festen Partnerschaft leben, bietet sich hingegen die Möglichkeit einer ovariellen Stimulation an, kombiniert mit einer In-vitro-Fertilisation und anschließender Kryokonservierung von befruchteten Eizellen. Allerdings nur unter der Voraussetzung, dass ausreichend Zeit für eine ovarielle Stimulation bis zur Einleitung der anti-neoplastischen Behandlung vorhanden ist. Die erste erfolgreiche Re-Transplantation von Ovarialgewebe zur Erfüllung des Kinderwunsches in Deutschland [Dittrich et al, 2008], ebenso wie die Fallberichte über Schwangerschaften und vereinzelten Geburten nach Kryokonservierung und Retransplantation von ovariellem Gewebe darf Malignompatientinnen Hoffnung geben, nach behandlungsbedingter Infertilität den Wunsch auf Familie noch erfüllen zu können. 37 5 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Moderne Behandlungen von onkologischen Erkrankungen haben die Überlebensrate von Malignompatienten deutlich erhöht, führen jedoch häufig zur Infertilität. Eine sehr vielversprechende Methode zum Fertilitätserhalt bei betroffenen Frauen besteht in der Kryokonservierung ovariellen Gewebes vor Therapiebeginn. Die bisherigen Studien zur Re-Transplantation des Gewebes nach überstandener rezidiv freier Krebserkrankung, sind zwar erfolgsversprechend, jedoch noch nicht routinemäßig anwendbar. Eines der Hauptprobleme im Rahmen einer solchen Transplantation, ist der hohe Follikelverlust im ovariellen Gewebe. In der vorliegenden Studie sollte anhand von Schafen als Tiermodell geklärt werden, inwieweit der Follikelverlust im Rahmen der Transplantation des ovariellen Gewebes durch ischämische Apoptose bedingt ist und ob dieser durch die Behandlung des Gewebes mit dem Apoptose-Inhibitor S1P vermindert werden kann. Hierzu wurden bei vier Schafen beide Ovarien entnommen, die ovarielle Rinde präpariert und in kleinen Einheiten direkt subfaszial auf den M. rectus abdominis replantiert. Bei zwei Schafen wurde in jeweils ein Ovar nach Exstirpation S1P injiziert und die ovariellen Rindenpartikel für weitere 5 Minuten in einem S1P-Diffusionsbad belassen. Das übrige ovarielle Gewebe blieb unbehandelt und diente als Kontrolle. Nach jeweils 14 Tagen erfolgte die Entnahme des ovariellen Gewebes zur Auswertung. Bei der histologischen Analyse zeigte sich bei den HE-gefärbten Präparaten kein Unterschied in der Follikeldichte nach Transplantation des S1P behandelten ovariellen Gewebe im Vergleich zur Kontrollgruppe. 14 Tage nach Re- Transplantation fand sich in beiden Gruppen eine ausgeprägte Reduktion der Follikeldichte im Vergleich zum ursprünglichen ovariellen Gewebe (Kontrollen: 90,1%; S1P: 92,4%). Eine quantitative Auswertung der zellulären Apoptose mittels TUNEL-Assay zwischen S1P behandeltem Gewebe und Kontrollen war, vermutlich aufgrund der 2 Wochen nach Transplantation bereits weitgehend abgeschlossenen follikulären Apoptose durch fibrotische Umbauprozesse, nicht durchführbar. Diese Studie belegt, dass eine Transplantation von ovariellem Gewebe prinzipiell möglich ist, jedoch bereits 2 Wochen nach Transplantation die Follikeldichte, vermutlich durch temporäre Ischämie, signifikant reduziert ist. Sollte diese Reduktion auf einer ischämisch-bedingten zellulären Apoptose beruhen, so lässt sich dieser Vorgang durch eine lokale Applikation des Apoptose-Inhibitors S1P nicht verhindern. 38 6 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis Ataya, K. und Ramahi-Ataya, A. (1993). Reproductive performance of female rats treated with cyclophosphamide and/or LHRH agonist, Reprod Toxicol 7(3): S. 229-35 Ataya, K., Rao, L. V., Lawrence, E. und Kimmel, R. (1995). Luteinizing hormonereleasing hormone agonist inhibits cyclophosphamide-induced ovarian follicular depletion in rhesus monkeys, Biol Reprod 52(2): S. 365-72 Aubard, Y., Piver, P., Cogni, Y., Fermeaux, V., Poulin, N. und Driancourt, M. A. (1999). Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep, Hum Reprod 14(8): S. 2149-54 Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M. und Gosden, R. G. (1999). 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Vorbereitung: - Futterentzug: 48h präoperativ - Wasserentzug: 8h präoperativ 2. Anticholinerge und sedative Prämedikation: - Atropin 0,05mg/kg KGW i.m. - Xylazin 0,1mg/kg KGW i.m. - Ketamin 10mg/kg KGW i.m. - Legen eines zentralvenösen Zuganges (ZVK) in die Vena jugularis externa - Präoxygenierung über 3 Minuten (7l/min Sauerstoff pernasal) 3. Einleitung: - Propofol 6mg/kg KGW i.v. - orotracheale Intubation unter laryngoskopischer Kontrolle 4. Aufrechterhaltung der Narkose: - 1,6-2 Vol.% Isofluran in O2 / N2O; FiO2 0,3 - Vecuronium 0,05-0,1mg/kg KGW i.v. (bedarfsgesteuert) - Ketamin 3-5mg/kg KGW i.v. (bedarfsgesteuert) 5. Beatmung: - Intermittierende positive Druckbeatmung (IPPV) - Plateaudruck: 10-15cm H2O - AZV: 10-12ml/kg KGW - AF: 10-12/min - Die Beatmungsparameter werden an der Aufrechterhaltung physiologischer Blutgaswerte ausgerichtet: paO2 92-100mmHg paCO2 32-36mmHg 49 7 Anhang SaO2 96-99% - perioperative Flüssigkeitssubstitution: Vollelektrolytlösung 10ml/kg/h i.v. 6. Monitoring: - EKG - Pulsoxymetrie - Kapnographie 7. Weitere Maßnahmen: - perorales Einführen einer Pansensonde (Magensonde) 8. Narkoseausleitung: Abstellen der Anästhetikazufuhr und 5 Minuten Sauerstoffbeatmung zur Verhinderung einer Lachgasdiffusionshypoxie. Danach langsame Entwöhnung von der Beatmung durch Reduzierung des Atemminutenvolumens unter SIMV (synchronisierte intermittierende Beatmung). Extubation erfolgt mit Erreichen einer suffizienten Spontanatmung und wiedererlangten Schutzreflexen. 9. Postoperative Analgesie: - Metamizol 50mg/kg KGW i.v. alle 6 Stunden für 48h postoperativ 50 7 Anhang 7.2 Protokoll der Hämatoxylin/Eosin- Färbung 1. Deparaffinieren in Xylol 2. Rehydrieren in absteigender Alkoholreihe (100%, 95%, 70%) 3. Spülen unter fließendem Wasser (5min) 4. Überschichten mit Hämatoxylin (5min) 5. 2x kurz eintauchen in 4% HCl 6. Überschichten mit wäßrigem Eosin (4min) 7. Kurz in Wasser eintauchen 8. Kurz in aufsteigender Alkoholreihe 70%, 96% 100% eintauchen 9. 2x eintauchen in Xylol 10.Eindeckeln mit Xylolhaltigem Einbettmedium (z.B. Eukitt) 7.3 Protokoll der TUNEL – Enzymhistochemie 1. Trocknen der Schnitte bei 60 °C über Nacht 2. Entparaffinieren in Xylol und Alkohol (100%, 96%, 85%) 3. Inkubation mit Zitronensäure 3% für 60 min 4. Andauen mit 20 µg/ml Proteinase K für 15 min in feuchter Kammer bei RT 5. Waschen in Aqua bidest, 4 x 2 min 6. Blockierung der endogenen Peroxidase mit 2% H2O2 in Aqua dest. für 5 min 7. Waschen in Aqua bidest 8. Überführung in TDT-Puffer bei RT 9. Inkubation mit TdT (0,3 e.u./µl, Verdünnung 1:100) und biotinyliertem dUTP (Verdünnung 1:200) in TDT-Puffer für 1 h bei 37 °C in feuchter Kammer 10. Waschen in TB-Puffer für 15 min zur Stoppung der Enzymreaktion 11. Waschen in Aqua bidest 12. Überführen in PBS-Puffer (50ml Stammlösung + 950 ml Aqua dest) 13. Überschichtung mit 0,1 % BSA für 10 min in feuchter Kammer (Herabsetzen der unspezifischen Hintergrundsfärbung) 14. Waschen in PBS 5 min 15. Inkubation mit Sheep-Anti-Dig/HRP für 60 min in PBS (1:400) 16. Waschen in PBS 3 x 5 min 51 7 Anhang 17. Farbentwicklung mit AEC (30min) bzw. DAB (1-2 h) bei 37 °C 18. Waschen in Aqua bidest 5 min 19. bei Einzelfärbung: Gegenfärbung mit Mayer`s Hämalaun 20 sec 20. Bläuen: fließendes Wasser 10 min 21. Eindecken mit Glyceringelatine Als Spezifitäts- und Positivkontrolle wurde exemplarisch ein Zwischenschritt bei Punkt 5 eingeführt: 1. Überführung in DN-Puffer 2. Inkubation mit 1µg/ml DNAse I in DN-Puffer für 20 min in feuchter Kammer 3. Waschen in Aqua bidest Anschließend weiter mit Punkt 6. 52 7 Anhang 7.4 Verbrauchsmaterial und Biochemika VerbrauchsMaterial Objektträger Zusatzbezeichnung normal Deckgläser Glyceringelatine Hersteller Code- Nr. Langenbrinck, Emmendingen, D Menzel, D Kayser’s Glyceringelatine Pipettenspitzen Standartips 1000µl Pipettenspitzen Standartips 100µl Merck, Darmstadt,D 9242 Eppendorf-Netheler-Hinz- 0030.015. GmbH, Hamburg, D 002 Eppendorf-Netheler-Hinz- 0030.003. GmbH, Hamburg, D 004 Reagenz Zentrallager/Reagenzienz Aqua dest entrale Zentrallager/Reagenzienz Aqua bidest entrale Sigma Chemical co., Proteinase K Steinheim, D Terminale TdT deoxynucleotidyl Transferase B-dUTP Biotin-16-dUTP Sigma Chemical co., Steinheim, D P6556 T4427 Böhringer, Mannheim, D 1093070 Merck, Darmstadt, D K28624480 DiNa2HPO4 Natriumhydrogenpho sphat-Dihydrat HCL Salzsäure (2N) Merck, Darmstadt, D 109063 NaCL Natriumchlorid Merck, Darmstadt, D K31900304 H2O2 Hydrogenperoxid Merck, Darmstadt, D K20705510 53 7 Anhang KH2PO4 Phosphate Xylol Hämatoxylin Steinheim, D 101K0025 Roth, Karlsruhe, D Mayer’s Hämalaun Merck, Darmstadt, D 109249 Reagenzienzentrale Ethanol 100% Formalin 4% Sigma Chemical co., (Recycling) Roti-Histofix 4% Roth, Karlsruhe, D P087.1 Avanti Polar Lipids, inc. 103154 Serva, Heidelberg, D 11930 D-erythroSPH1PO4 Sphingosin-1Phosphat BSA Bovines SerumAlbumin Antikörper Sheep-Anti- POD – Dig/HRP Antidigoxigenin-FAB Böhringer, Mannheim, D 1207733 ELISA Estradiol-ELISA Estradiol: EIA-2693 Progesteron- Progesteron: ELISA EIA-1561 DRG International, USA DRG International, USA 54 7.5 Pufferlösungen TBS a) 0,5M. pH7,6: 6,05 g Tris (MW 121,14), pH 7,6 + aqua dest ad 100ml, dann + 900ml NaCL auf 1000 ml auffüllen b) 0,1 M. pH 8,2: 1,21 g Tris in aqua dest, pH 8,2, dann mit aqua dest auf 100ml auffüllen PBS- Stammlösung 29,25 g Na2HPO4 * H2O + 4,90 g KH2HPO4 p.a. + 160,00 g NaCL reinst + aqua dest ad 1000 ml PBS 50 ml Stammlösung, 946 ml aqua dest, 4 ml DMSO-Triton 9:1 TDT-Puffer 30mM Tris + 140mM Na-Cacodylat + 1 mM Cobaltchlorid, pH 7,2 TB-Puffer 300 mM NaCl + 30 mM NaCitrat DN-Puffer 30 mM Tris + 140 mM Na-Cacodylat + mM MgCl2 + 0,1 mM Dithiotreitol PET-Puffer 1l ph 7.4 PBS: 8 g NaCl; 0.2 g KCl; 1.44 g Na2HPO4; 0.24 g KH2PO4, 0.05%, Tween-20 und 1.5 mM EDTA 7.6 Geräte Mikroskop: Orthoplan, Leitz, Wetzlar, D mit 2,5-, 10-, 25-, 40-, und 100ger Objektiven, GW 10xM Oberflächenheizplatte, IKA-Werke GmbH & CO.KG, Staufen, D Transferpipetten, Brand GmbH & CO.KG, Wertheim, D Wasserbad, J. Költermann KG, Hänigsen, D 55
