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Aus der Medizinischen Universitätsklinik
Abteilung Innere Medizin I
(Schwerpunkt: Hämatologie und Onkologie)
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Die DNA-demethylierende Substanz 5-Aza-2‘-Deoxycytidin führt
in vitro und in vivo zur Induktion von cancer/tetis (CTA) und
Leukämie assoziierten Antigenen in myeloischen Leukämiezellen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt
2008
von
Maika Almstedt
geboren in
Gießen
Dekan
Prof. Dr. Dr. hc. mult. Hubert Erich Blum
1. Gutachter
Prof. Dr. M. Lübbert
2. Gutachter
Prof. Dr. P. Fisch
Jahr der Promotion
2011
3
Inhalt
Zusammenfassung ...................................................................................................................... 6
1
Einleitung ........................................................................................................................... 7
1.1
Akute myeloische Leukämien .................................................................................... 7
1.2
Epigenetische Ereignisse in der Genregulation .......................................................... 8
1.2.1
DNA Methylierung ........................................................................................... 8
1.2.1.1
Methylierung von CpG Inseln ........................................................................ 8
1.2.1.2
Regulation der Genexpression durch DNA-Methylierung........................... 10
1.2.1.3
DNA Methylierung in Tumorzellen ............................................................. 11
1.2.2
1.3
Veränderungen der Chromatinstruktur............................................................. 14
Epigenetische Therapie ............................................................................................ 15
1.3.1
DNA-Methyltransferase Inhibitoren ................................................................ 15
1.3.1.1
1.3.2
1.4
Histondeacetylase Inhibitoren – Synergismus mit 5-aza-2’-deoxycytidin ...... 17
Molekulare Zielstrukturen für Tumor spezifische Immuntherapie .......................... 18
1.4.1
Cancer Testis Antigene .................................................................................... 18
1.4.1.1
Hintergrund und Nomenklatur der Cancer Testis Antigene......................... 19
1.4.1.2
CTA Expression in normalen und malignen Geweben ................................ 22
1.4.1.3
Regulation der CTA Expression .................................................................. 23
1.4.1.4
Potentielle Funktion von Cancer Testis Antigenen ...................................... 24
1.4.1.5
Immunogenität ............................................................................................. 25
1.4.1.6
Expression von CTAs in hämatologischen Neoplasien ............................... 25
1.4.2
1.5
2
5-aza-2’-deoxycytidin – zelluläre Effekte und klinische Anwendung ......... 16
Leukämie assoziierte Antigene ........................................................................ 26
Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ........................................................................ 28
Material und Methoden .................................................................................................... 29
2.1
Material .................................................................................................................... 29
2.1.1
Zellen ................................................................................................................ 29
2.1.1.1
Humane Zelllinien ........................................................................................ 29
2.1.1.2
Primäre humane Zellen ................................................................................ 30
2.1.2
Materialien für die Zellkultur ........................................................................... 31
2.1.2.1
Zellkulturmedien, Zusätze und Reagenzien ................................................. 31
2.1.2.2
Sonstige Materialien, Plastikwaren .............................................................. 32
2.1.3
Materialien für molekularbiologische Arbeiten ............................................... 32
2.1.3.1
Chemikalien und Reagenzien ....................................................................... 32
2.1.3.2
Standardlösungen und Puffer ....................................................................... 33
2.1.3.3
Enzyme ......................................................................................................... 35
2.1.3.4
Nukleinsäuren............................................................................................... 35
2.1.3.5
Antikörper .................................................................................................... 36
2.1.3.6
Kits ............................................................................................................... 36
2.1.3.7
Sonstige Materialien ..................................................................................... 37
2.1.4
2.2
Geräte ............................................................................................................... 37
Methoden .................................................................................................................. 38
2.2.1
Zellkultur .......................................................................................................... 38
2.2.1.1
Kulturbedingungen ....................................................................................... 39
2.2.1.2
Zellzahl- und Viabilitätsbestimmung ........................................................... 40
2.2.1.3
Abtrennung von toten Zellen und Debris mittels Ficoll ............................... 40
2.2.1.4
DAC und AraC Behandlung der Zellen ....................................................... 40
2.2.1.5
Aufarbeitung von Patientenproben - Isolation von PBMCs......................... 41
2.2.2
Allgemeine molekularbiologische Methoden .................................................. 42
2.2.2.1
RNA Isolation .............................................................................................. 42
2.2.2.2
DNase Verdau .............................................................................................. 42
2.2.2.3
Photometrische Bestimmung der RNA Konzentration ................................ 43
2.2.2.4
Bioanalyzer................................................................................................... 43
2.2.2.5
cDNA Synthese ............................................................................................ 44
2.2.2.6
Proteinisolation............................................................................................. 44
2.2.2.7
Proteinquantifizierung mittels Bradford Assay ............................................ 45
2.2.3
Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) ............................................ 45
2.2.3.1
Molekularer Mechanismus ........................................................................... 45
2.2.3.2
Durchführung ............................................................................................... 47
2.2.3.3
Relative Quantifizierung .............................................................................. 48
2.2.4
Western Blot ..................................................................................................... 52
2.2.4.1
Vorbereitung der Proben .............................................................................. 53
2.2.4.2
Elektrophoretische Auftrennung im Gel ...................................................... 53
2.2.4.3
Transfer von Proteinen auf Filtermembranen ( „blotting“ ) ......................... 54
2.2.4.4
NY-ESO-1 Protein Detektion....................................................................... 54
2.2.5
Expressionsanalyse mittels DNA-Microarray .................................................. 56
3
2.2.5.1
Vorbereitung der Proben .............................................................................. 56
2.2.5.2
Hybridisierung der Proben ........................................................................... 59
2.2.5.3
Waschen und Färben der Microarrays ......................................................... 60
2.2.5.4
Scannen der Arrays und Auswertung der Messdaten................................... 61
Ergebnisse ........................................................................................................................ 63
3.1
Behandlung myeloischer Zelllinien mit 5-Aza-2’-deoxycytidin - Kurzzeitkultur ... 63
3.1.1
Einfluss auf Zellproliferation und Viabilität .................................................... 63
3.1.2
NY-ESO-1 Protein Expression in myeloischen Leukämiezelllinien ............... 65
3.2
Effekte von DAC versus Cytarabin: Geninduktion durch Dnmt-Inhibition ............ 66
3.3
Effekte der DAC Behandlung auf die CTA Expression in Kasumi-1...................... 67
3.3.1
Transkriptionelle Expression von Cancer Testis Antigenen ............................ 67
3.3.2
NY-ESO-1 Protein-Expression ........................................................................ 71
3.4
Kasumi-1 Behandlung mit 5-Aza-2’-deoxycytidin - Langzeitkultur ....................... 72
3.4.1
Einfluss auf Zellproliferation und Viabilität .................................................... 72
3.4.2
Expression von Cancer Testis Antigenen......................................................... 74
3.5
Globale Expressionsanalysen mittels Microarray-Technologie ............................... 77
3.6
CTA und LAA Expression in primären myeloischen Blasten von AML Patienten 78
3.6.1
Transkriptionelle CTA Expression................................................................... 79
3.6.2
MBN Expression in primären myeloischen Blasten ........................................ 82
3.6.3
Globale Analyse der CTA und LAA Expression in vivo mittels Microarray .. 83
4
Diskussion ........................................................................................................................ 85
5
Literatur ............................................................................................................................ 93
Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................... 107
Danksagung .............................................................................. Error! Bookmark not defined.
Lebenslauf ................................................................................ Error! Bookmark not defined.
6
Zusammenfassung
Als Cancer Testis Antigene (CTA) wird eine Gruppe von Genen bezeichnet, die auf Grund
des tumor-spezifischen Expressionsprofils sowie ihres immunogenen Potentials als
interessante Zielstrukturen für krebsspezifische Immuntherapie gelten. Im Unterschied zu
soliden Tumoren zeigen hämatologische Neoplasien keine spontan Expression „klassischer“
Vertreter der CTA Familie wie z.B. NY-ESO-1 oder MAGEA1. DNA Methylierung im
Bereich der Promotorregion der Gene wird als wichtiger Regulationsmechanismen der CTA
Expression diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt der DNA
demethylierenden Substanz 5-aza-2’-deoxycytidin (DAC) auf die Expression von CTAs und
Leukämie-assoziierten Antigenen (LAAs) in myeloischen Leukämienzellen in vitro und in
vivo untersucht.
Zunächst wurde die NY-ESO-1 Expression in 5 myeloischen Leukämiezelllinien (Kasumi-1,
HL60, U937, K562 und NB4) mittels Western Blot analysiert. DAC Exposition führte zu
einer NY-ESO-1 Induktion in 4 der 5 untersuchten Zelllinien.
Weiterführende Untersuchungen der NY-ESO-1, MAGEA1 und MAGEA3 Expression in
Kasumi-1 mittels quantitativer RT-PCR zeigten eine deutliche konzentrations- und
zeitabhängige Induktion der Expression aller drei untersuchten CTAs, die für NY-ESO-1 auch
auf Proteinebene bestätigt werden konnte. Langzeitkultivierung der Kasumi-1 Zellen über 21
Tage ohne weitere DAC Exposition zeigte eine progressive Abnahme der CTA Expression.
Die Transkription des bereits vor Behandlung exprimierten LAA Myeloblastin (MBN) konnte
durch DAC Exposition weiter gesteigert werden. DNA-Microarray Untersuchungen zeigten
eine Induktion von 10 der 67 auf dem Array repräsentierten CTAs in Kasumi-1. Alle 10
induzierten Gene zeigten eine X-chromosomale Lokalisation. Die Mehrzahl der bereits in den
Kontrollzellen exprimierten LAAs zeigte keine weitere Steigerung der Transkription.
Microarry Untersuchungen primärer leukämische Blasten von 6 AML Patienten zeigten eine
Induktion von 2 CTAs und 3 LAAs nach DAC Behandlung. In RT-qPCR Untersuchungen
konnte eine NY-ESO-1 Induktion in 2 von 7 Patienten nachgewiesen werden.
Die in der vorliegenden Arbeit demonstrierte Derepression von CTAs in vitro und in vivo
weist auf einen immunologischen Wirkmechanismus des anti-leukämischen Potentials von
DAC hin. Ein therapeutischer Effekt auf leukämische Blasten könnte somit in der
Hochregulation von Antigenen und daraus resultierend in einer erhöhten Immunogenität der
malignen Zellen bestehen. Dies bietet interessante neue therapeutische Optionen hinsichtlich
einer Kombination DNA-demethylierender Therapie mit Vakzinierungsstrategien.
Einleitung
1
1.1
7
Einleitung
Akute myeloische Leukämien
Akute myeloische Leukämien (AML) gehören zu den häufigsten hämatologischen
Neoplasien. Pathogenetisch liegt der AML die maligne Transformation einer frühen
hämatopoetischen Vorläuferzelle zugrunde, die mit einer Fehlregulation von Differenzierung
und Proliferation verbunden ist und zur Expansion des leukämischen Zellklons mit
Verdrängung der normalen Hämatopoese führt. Es handelt sich um eine heterogene Gruppe
von Erkrankungen, die sich im Wesentlichen durch den Reifungsgrad der betroffenen
Stammzelle unterscheiden. Abhängig davon, ob die genetische Mutation in pluripotenten
Stamm- oder für Differenzierungslinien spezifischen Progenitorzellen stattfindet, kommt es
zur Expansion von Blasten, Promyelozyten, monozytären oder megakaryozytären Vorläufern
mit gestörter Differenzierung (Russell, 1997). Von einigen wenigen familiären AML Fällen
abgesehen (Dowton et al., 1985), handelt es sich in der überwiegenden Anzahl um erworbene
Mutationen.
Zytogenetisch kann man vier große Gruppen von AML unterscheiden: AML mit balancierten
Chromosomenanomalien, AML mit unbalancierten Chromosomenanomalien, AML ohne
Nachweis von Karyotypanomalien und AML mit komplexem Karyotyp ( ≥ 3 Anomalien). Die
häufigsten zytogenetischen Veränderungen stellen die balancierten chromosomalen
Translokationen
dar,
die
bei
20-30%
der
AML
nachweisbar
sind.
Von
den
Chromosomentranslokationen sind in der Regel Regionen betroffen, die für „Master-Gene“
der frühen hämatopoetischen Regulation kodieren wie Transkriptionsfaktoren. Die häufigsten
in akuten myeloischen Leukämien auftretenden balancierten Chromosomenanomalien sind
die t(8;21), t(15;17) und inv(16) (Kern et al., 2004).
Die Charakterisierung solcher Gene, die in Translokationen involviert sind, hat gezeigt, dass
häufig Gene, deren Produkt eine wichtige Rolle in der Hämatopoese spielen, betroffen sind.
In den meisten Fällen ist neben der chromosomalen Translokation jedoch mindestens eine
weitere genetische Veränderung für das Entstehen einer AML notwendig (Jurlander et al.,
1996). Die unterschiedlichen zytogenetischen Veränderungen, die im Rahmen einer AML
auftreten, zeigen eine enge Korrelation zu phänotypischen Merkmalen wie Morphologie,
Oberflächen-Antigen-Profil und Reifungsgrad (Sawyers, 1997). Aber auch klinische
Merkmale wie Therapieansprechen, Krankheitsverlauf und Prognose sind mit den
verschiedenen molekularen Aberrationen assoziiert (Grimwade et al., 1998).
Einleitung
8
Zurzeit existieren verschiedene Klassifikationen der AML. Die bisher gängigste Einteilung
erfolgt nach der FAB-Klassifikation (French-American-British). Grundlage stellt die
zytomorphologische Beurteilung von Blut- und Knochenmarksausstrichen in Kombination
mit zytochemischen Analysen und Reifungsstadien dar. Auf dem Boden dieser
Untersuchungen teilt die FAB-Klassifikation die AML in 8 morphologisch unterscheidbare
Gruppen ein (M0 bis M7) (Bennett et al., 1976; Bennett et al., 1985). Zum Teil entsprechen
diese Gruppen genetisch definierbaren Formen der AML, für die meisten Fälle trifft dies
allerdings nicht zu. Die zunehmenden Einblicke in die Biologie der AML und die
Identifikation spezifischer Chromosomenaberrationen hat die WHO veranlasst eine neue, an
der Biologie und Zytogenetik orientierte Klassifikation vorzuschlagen (Harris et al., 1999).
1.2
Epigenetische Ereignisse in der Genregulation
Während sich die Genetik mit der Sequenz der DNA, ihrer Organisation in Genen und ihrer
Veränderung durch Mutationen beschäftigt, versteht man unter Epigenetik Mechanismen, die
zu vererbbaren Veränderungen des Expressionspotentials von Genen führen, welche im
DNA-Code fixiert und nicht durch Änderung der primären DNA Sequenz verursacht werden.
Epigenetik bezeichnet also Vorgänge, die sich „epi“, das heißt, neben oder über der DNA
abspielen.
Drei Mechanismen spielen eine wichtige Rolle bei der Repression von Genen: DNA
Methylierung, Modifizierung von Histonen sowie RNA-assoziierte Repression der
Genexpression. Durch Störungen in diesem System kann es zu einer inadäquaten Expression
von Genen kommen, welche wiederum zu malignen Erkrankungen führen kann. Im
Unterschied zu Mutationen der DNA-Sequenz stellen epigenetische Veränderungen des
Expressionsprofils potentiell reversible Ereignisse dar und bieten somit interessante
Angriffspunkte für therapeutische Interventionen.
1.2.1 DNA Methylierung
1.2.1.1 Methylierung von CpG Inseln
Den vorherrschenden Akzeptor für Methylgruppen innerhalb der DNA stellen Cytosine im
Kontext von CpG Dinukleotiden dar, in denen die Base Cytosin (C) kovalent über eine
Phosphodiesterbrücke an Guanin (G) gebunden vorliegt (Jones, 2003). 70-80% der in der
DNA vorkommenden CpG Dinukleotide liegen im methylierten Zustand vor, unmethylierte
CpGs findet man insbesondere im Bereich von CpG Inseln (s.u.) (Ehrlich et al., 1982).
Einleitung
9
CpG Dinukleotide zeigen sich in großen Teilen des menschlichen Genoms unterrepräsentiert.
Innerhalb des Genoms gibt es jedoch kleine Regionen, die einen hohen Gehalt an CpGs
aufweisen. Diese Bereiche werden CpG Inseln genannt. Die meisten dieser CpG Inseln
befinden sich in regulatorischen Elementen von Genen und liegen typischerweise im Bereich
der 5’ Region und des ersten Exons (Bird, 1986). Ungefähr die Hälfte aller humanen
Genpromotoren weisen solche CpG Inseln auf, wobei die Mehrheit mit stabil und ubiquitär
exprimierten Genen („housekeeping Genen“) assoziiert ist (Antequera and Bird, 1993).
Typische CpG Inseln liegen zu jedem Entwicklungszeitpunkt unmethyliert vor, die
Expression
des
entsprechenden
Gens
kann
stattfinden,
wenn
die
benötigten
Transkriptionsfaktoren vorhanden sind. Die Kontrolle der Genexpression wird in diesem Fall
nicht durch DNA Methylierung reguliert (Bird, 1986). Kommt es zur de novo Methylierung
in diesen Bereichen, resultiert eine Repression der Transkription. Eine solche aberrante
Methylierung ist ein häufig beobachtbarer Prozess in Tumorzellen und scheint einen frühen
Schritt der Karzinogenese darzustellen (Jones and Baylin, 2002). Die Mechanismen, die zur
Protektion der CpG Inseln in gesunden Zellen vor de novo DNA Methylierung führen, sind
bis jetzt unbekannt. Es wird vermutet, dass die aktive Transkription von Genen einer CpG
Methylierung entgegenwirkt (Clark and Melki, 2002).
Der Transfer der Methylgruppe auf Cytosinreste im Kontext eines CpG Dinukleotids wird
durch DNA Methyltransferasen katalysiert. Dabei spielen mindestens drei DNA
Methyltransferasen eine wichtige Rolle: DNMT1, DNMT3A und DNMT3B. DNMT1 stellt
die in somatischen Zellen am häufigsten vorkommende Form dar und scheint vorwiegend für
die Aufrechterhaltung des Methylierungszustands während der Zellreplikation und damit für
die Weitergabe des Methylierungsprofils an die Tochterzelle verantwortlich zu sein.
(Robertson, 2001; Rountree et al., 2001). DNMT3A und -3B spielen eine wichtige Rolle bei
der de novo Methylierung während der embryonalen Entwicklung (Okano et al., 1999).
Physiologischer Weise spielt die DNA Methylierung von CpG Inseln eine entscheidende
Rolle während der embryonalen Entwicklung, bei der Inaktivierung des X-Chromosoms in
weiblichen Organismen sowie der genetischen Prägung (Li et al., 1993; Li et al., 1992;
Panning and Jaenisch, 1998). Eine weitere wichtige Funktion stellt die Inhibition repititiver
Elemente von ins Genom integrierter viraler Sequenzen, parasitärer Elemente und
Transposons dar (Blum and Marcucci, 2005; Yoder et al., 1997).
Einleitung
10
1.2.1.2 Regulation der Genexpression durch DNA-Methylierung
Wie bereits beschrieben, stellt die DNA Methylierung einen potenten Mechanismus zur
transkriptionellen Repression von Genen dar. Es gibt mehrere Möglichkeiten, wie die
Hypermethylierung von CpG Dinukleotiden die Repression der Transkription beeinflussen
kann. DNA Methylierung kann zum einen die Bindung von Transkriptionsfaktoren, die CpG
Dinukleotide in ihrer Bindungssequenz enthalten, verhindern oder erschweren (Bird, 2002).
Der wichtigere Anteil bezüglich der Transkriptionsinaktivierung scheint jedoch auf
komplexen, indirekten Mechanismen, die Veränderungen der Chromatinstruktur bewirken, zu
beruhen. So konnte nachgewiesen werden, dass in vitro methylierte Gene nach Transfizierung
in Zelllinien zunächst noch transkriptionell aktiv waren. Nach einigen Stunden konnte eine
Veränderung der Chromatinstruktur mit dicht gepackten, transkriptionell inaktiven
Nukleosomen nachgewiesen werden (Kass et al., 1997). Diese Ergebnisse deuten darauf hin,
dass die DNA Methylierung selbst die Transkription nicht beeinflusst, sondern vielmehr die
DNA markiert, so dass es zu einer transkriptionell inaktiven Erscheinungsform kommt
(Rountree et al., 2001).
Transkriptions- Aktivator
Komplex
HAT
TF
CA
TF
X
Sin3
MBD
HDAC
MeCP2
X
Ac Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Deacetylierung
Ac
Ac
Abbildung 1.1 Mechanismus der transkriptionellen Repression durch CpG Methylierung
Schematische Darstellung der Promotor Region eines durch CpG Methylierung reprimierten Gens. Der
horizontale Strich symbolisiert den Sequenzbereich der DNA, schwarze Punkte methylierte CpGs, weiße
unmethylierte CpGs. Die grauen Ovale stellen Histone dar, die entweder im acetylierten oder deacetylierten
Zustand vorliegen. Erläuterungen siehe Text. TF, Transkriptionsfaktor; MBD Methyl-bindendes Protein;
HDAC Histondeacetylase; HAT, Histonacetyltransferase; CA, Co-Aktivator. (Modifiziert nach Claus und
Lübbert, 2003)
Einleitung
11
Die Verknüpfung zwischen Methylierung und Veränderung der Chromatinstruktur wird durch
Proteine, die selektiv an methylierte DNA binden und Co- Repressor-Komplexe rekrutieren,
realisiert. Für das erste bekannte DNA-methyl-bindende-Protein (MBD) MeCP2, konnte über
die Interaktion mit Sin3A eine Rekrutierung der Histondeacetylase (HDAC) 1 und 2
nachgewiesen werden, mit folgender Deacetylierung von Histonen, Verdichtung der
Chromatinstruktur und Repression der Genexpression (vgl. Abbildung 1.1) (Jones et al.,
1998; Nan et al., 1998). Darüber hinaus konnte eine direkte Interaktion der DNA
Methyltransferasen mit HDACs gezeigt werden (Fuks et al., 2000).
1.2.1.3 DNA Methylierung in Tumorzellen
Eine wichtige Eigenschaft von Tumorzellen ist eine veränderte Genfunktion, die zur
Entwicklung eines malignen Phänotyps führt. Diese aberrante Genfunktion ist zum großen
Teil Folge von Mutationen, die zu einer Zerstörung der kodierenden Genregion führen
(Knudson, 1997). Neben den genetischen Veränderungen spielen aber auch epigenetische
Prozesse, die sich auf das Genexpressionsprofil auswirken, eine wichtige Rolle. Dabei kommt
vor allem der aberranten DNA Methylierung eine entscheidende Bedeutung zu.
Abweichungen des Methylierungsmusters der CpG Inseln gehören zu frühen und häufigen
Merkmalen der Tumorgenese (Robertson, 2005). Die Veränderung des Methylierungsprofils
in maligne transformierten Zellen umfasst dabei sowohl eine globale Reduktion des Gehalts
an methylierten Cytosinen (Hypomethylierung) als auch eine Hypermethylierung bestimmter
spezifischer DNA Bereiche (Jones and Laird, 1999). Sowohl der Hypo- als auch der
Hypermethylierung wird eine Bedeutung im Rahmen der Tumorgenese zugeschrieben.
Normale Zelle
Tumorzelle
Hypermethylierung
Hypomethylierung
•Mutationsrate
•Genomische Instabilität
•Tumorsuppressorgene
•Genaktivierung
Abbildung 1.2 Änderungen des DNA Methylierungsmusters in Tumorzellen
Dargestellt sind eine normale Zelle und eine Tumorzelle. Die DNA Sequenz ist als Oval dargestellt, weiße
Kreise symbolisieren unmethylierte, schwarze Kreis methylierte CpGs. Während der Tumorgenese kommt
es zu Veränderungen des Methylierungsprofils mit globaler Hypomethylierung sowie Hypermethylierung
spezifischer DNA Bereiche. Erläuterungen siehe Text, modifiziert nach (Clark und Melki, 2002).
Einleitung
12
Hypomethylierung
Die globale Reduktion des Gehalts an Methylcytosinen stellt ein typisches Kennzeichen von
malignen Zellen dar (Feinberg and Vogelstein, 1983). Die verantwortlichen Mechanismen
sind bisher nicht bekannt. Ebenfalls ist die Frage, in welcher Weise die DNA
Hypomethylierung die Tumorentstehung begünstig, noch nicht abschließend geklärt. Mehrere
Mechanismen scheinen eine Rolle zu spielen. Dabei kann es zum einen zu einer direkten
Aktivierung von Onkogenen kommen. Zum anderen wird die Aktivierung latenter
Retrotransposons sowie eine aus dem Verlust der Methylierung repetitiver Regionen der
DNA resultierende genomische Instabilität diskutiert (Clark and Melki, 2002; Robertson,
2005). Für eine direkte Aktivierung von Onkogenen durch Hypomethylierung liegen wenige
Anhaltspunkte vor, jedoch scheint diese einen entscheidenden Mechanismus bei der
Aktivierung einer Gruppe von Genen mit keimzellspezifischer Expression und aberranter
Induktion in Tumoren (Cancer Testis Antigene) darzustellen (s.u.) (De Smet et al., 1999).
Hypermethylierung
Eine de novo Methylierung von CpGs spezifischer DNA Bereiche, findet man vorwiegend in
der Promoterregion von Genen, die bei der Regulation des Zellwachstums und der
Differenzierung sowie der DNA Reparatur oder der Apoptoseinduktion eine Rolle spielen
(Costello and Plass, 2001). Als Folge der Methylierung kommt es zu einer transkriptionellen
Inaktivierung dieser Gene mit resultierendem Wachstumsvorteil der Tumorzellen (Robertson,
2005). Darüber hinaus kann eine Hypermethylierung in der kodierenden Region von Genen
durch
die
bereits
beschriebene
gesteigerte
Mutagenität
von
5-Methylcytosin
zu
Veränderungen der DNA Sequenz und einem Verlust der Genfunktion führen (Clark and
Melki, 2002).
Eine Hypermethylierung der CpG Inseln von Tumorsuppressorgenen in malignen Zellen
wurde 1989 erstmals für das Retinoblastom Gen (Rb) beschrieben (Greger et al., 1989).
Inzwischen
konnte
für
viele
weitere
Tumorsuppressorgene
eine
transkriptionelle
Inaktivierung durch Hypermethylierung gezeigt werden. Dabei wurden unter anderem Gene
identifiziert, die bei Keimbahnmutationen zu familiären Krebserkrankungen führen (Baylin
and Herman, 2000). Ein Beispiel stellt das mit familiären Nierenzellkarzinomen assoziierte
Von Hippel-Lindau Gen (VHL) dar (Herman et al., 1994).
Nach Knudson’s „two-hit“ Modell führt der Funktionsverlust eines Tumorsuppressorgens
phänotypisch erst zu einer Konsequenz, wenn beide Allele betroffen sind. Für eine
funktionelle Inaktivierung des Gens muss bei der Mutation eines Allels ein weiteres, das
Einleitung
13
zweite Allel betreffende Ereignis hinzukommen. Aberrante DNA Methylierung stellt eine
solche Veränderung dar, welche zur Inaktivierung des zweiten Allels führen kann und somit
eine funktionelle Inaktivierung des Gens bewirkt (Jones and Baylin, 2002). Die Tabelle 1.1
zeigt eine Auswahl häufiger in unterschiedlichen Tumoren durch DNA Methylierung
inaktivierter Gene.
Gen
Tumore
APC (Adenomatöse
Kolorektales Ca
DAC
+
Polyposis Coli)
BRCA1
Literatur
(Deng et al., 2004; Hiltunen et al.,
1997)
Mamma-, Ovarial Ca
+
(Dobrovic and Simpfendorfer, 1997;
Esteller et al., 2000)
E-Cadherin
Mamma-, Prostata Ca, Leukämien
+
(Farinha et al., 2004; Graff et al., 1995;
Melki et al., 2000)
ER (Östrogen
Mamma Ca, Leukämien
+
Rezeptor)
hMLH1
(Ferguson et al., 1995; Issa et al., 1996;
Ottaviano et al., 1994)
Endometrium-, Kolorektales Ca
+
(Esteller et al., 1998; Herman et al.,
1998)
p15
INK4b
p16
INK4a
Myeloische, lymphatische
+
Leukämien
Solide Tumore, hämatologische
1996)
+
Neoplasien
p73
Lymphome
(Farinha et al., 2004; Herman et al.,
(Herman et al., 1995; Merlo et al.,
1995)
+
(Farinha et al., 2004; Kawano et al.,
1999)
RARβ2 (Retinolsäure
Kolon Ca, AML
+
Rezeptor β)
(Cote and Momparler, 1997; Ekmekci
et al., 2004)
Rb (Retinoblastom)
Retinoblastom
(Greger et al., 1989; Sakai et al., 1991)
VHL (von Hippel
Nierenzellkarzinom
+
(Herman et al., 1994)
Mamma Ca
+
(Laux et al., 1999)
Lindau)
WT-1 (Wilms Tumor)
Tabelle 1.1 Tumorsuppressorgene, welche eine Repression durch Hypermethylierung zeigen.
Darstellung einer Auswahl von Tumorsuppressorgenen für die eine Repression durch Hypermethylierung in
unterschiedlichen Tumoridentitäten beschrieben ist. Eine Reaktivierung durch Behandlung mit DAC konnte
für fast alle Gene gezeigt werden.
Die zugrunde liegenden Mechanismen, die zur CpG Hypermethylierung in malignen Zellen
führen, sind noch nicht verstanden. Ein Hinweis stellen die in vielen Tumorzellen erhöhten
Einleitung
14
Level an DNA Methyltransferasen dar (Robertson et al., 1999). Paradoxerweise kommt es
jedoch, wie bereits beschrieben, trotz der erhöhten DNMT Expression zu einer globalen
Hypomethylierung. Ebenfalls kontrovers diskutiert wird die Frage, ob die CpG Methylierung
den erste Schritt der Geninaktivierung darstellt, oder ob diese ein sekundärer Effekt nach
vorausgegangener Inaktivierung durch andere Prozesse ist (Clark and Melki, 2002; Rountree
et al., 2001).
1.2.2 Veränderungen der Chromatinstruktur
Die genomische chromosomale DNA des Menschen liegt im Zellkern durch Proteine
organisiert als Chromatin vor. Die geordnete Verpackung der DNA wird durch Histone
gewährleistet. Dabei ist die DNA in sich regelmäßig wiederholenden Untereinheiten, den
Nukleosomen organisiert. Ein Nukleosom besteht aus DNA, die um einen aus
Histonmolekülen bestehenden Kern
gewickelt ist. Die Nukleosomen sind durch
„unorganisierte“ DNA Abschnitte voneinander getrennt. Der N-Terminale Bereich der
Histone erstreckt sich über die DNA-Helix hinaus in die Umgebungen. Kovalente
Modifikationen in diesem Bereich haben Auswirkungen auf Struktur und Funktion des
Chromatins. Das Chromatin liegt im Zellkern prinzipiell in zwei unterschiedlichen Formen
vor, dem dicht gepackten inaktiven Heterochromatin und dem eher lockeren, transkriptionell
aktiven Euchromatin.
HAT
TF
RNA
Polymerase
Euchromatin
Heterochromatin
Abbildung 1.3 Schematische Darstellung der Chromatinstruktur
Dargestellt sind unterschiedliche Erscheinungsformen der Chromatinstruktur. Im aufgelockerten
Euchromatin liegen die Histone acetyliert vor, Transkriptionsfaktoren (TF) und RNA Polymerasen haben
Zugang zur DNA, die Transkription findet statt. Die untere Abbildung zeigt das dicht gepackte
Heterochromatin mit deacetylierten Histonen und transkriptioneller Repression. Ac, Acetylgruppe; HAT,
Histonacetyltransferase; MBD, Methyl bindendes Protein; HD, Histondeacetylase. ( Übernommen und
modifiziert nach Rountree et al., 2001)
Einleitung
Eine
15
Änderung
der
Chromatinstruktur
findet
vor
allem
im
Rahmen
der
Transkriptionsregulation von Genen statt (Pogo et al., 1966). Dabei spielt die Acetylierung im
Bereich der N-Terminalen Enden der Histone eine wichtige Rolle (Egger et al., 2004). Eine
Anheftung von Acetylgruppen an Lysinreste der Kernhistone findet man in transkriptionell
aktiven Regionen. Die Acetylierung verhindert, dass sich die Chromatinfasern zu kompakten
Strukturen zusammenfalten, so dass der aktive Zustand des Euchromatins erhalten bleibt. Die
Transkription der in dem aufgelockerten Bereich liegenden Gene kann stattfinden (Struhl,
1998). Die Anheftung der Acetylgruppen wird durch Histondeacetylasen (HATs) katalysiert.
HATs agieren als transkriptionelle Co-Aktivatoren und werden durch Interaktion mit
sequenzspezifischen DNA-Bindeproteinen an das Chromatin rekrutiert. (Marmorstein and
Roth, 2001). Die Entfernung von Acetylresten im N-Terminalen Bereich durch
Histondeacetylasen (HDAC) führt entsprechend zu einer Verdichtung der Chromatinstruktur
und zu transkriptioneller Inaktivierung (vgl. Abbildung 1.3).
1.3
Epigenetische Therapie
Im Gegensatz zu genetischen Mutationen, die zu einem irreversiblen Verlust der Genfunktion
führen, stellt die durch DNA Methylierung und Histon Deacetylierung induzierte
epigenetische Repression der Transkription einen potentiell reversiblen Prozess dar. So kann
durch
die
pharmakologische
Hemmung
von
DNA
Methyltransferasen
oder
Histondeacetylasen die Repression einiger Gene wieder aufgehoben werden.
1.3.1 DNA-Methyltransferase Inhibitoren
Die Prototypen demethylierender Agenzien stellen Azacitidine (5-azacitidin) und Decitabine
(5-aza-2’-deoxycytidin; DAC) dar. Beide Substanzen leiten sich von der Base Cytosin ab und
wurden 1964 ursprünglich als Nukleosid Antimetabolite entwickelt (Sorm et al., 1964). In
weiterführenden Untersuchungen konnte eine starke Inhibition der DNA Methylierung
gezeigt werden mit folgender Differenzierung von kultivierten Zellen.
Cytosin
5-azacytidin
5-aza-2‘-deoxycytidin
Abbildung 1.4 Chemische Struktur von Cytosin, 5-azacitidin und 5-aza-2’-deoxycytidin
Chemische Struktur von Cytosin und zwei 5-Aza Analoga mit DNMT Bindungskapazität. Der
demethylierende Effekt wird durch Austausch des Kohlenstoffs an Position 5 mit Stickstoff erreicht.
Einleitung
16
Azacitidine und Decitabine werden an Stelle von Cytosin während der S-Phase in die
replizierende DNA inkorporiert und bilden mit DNA Methyltransferasen einen kovalenten
Komplex, wodurch es zur Inaktivierung der Enzyme kommt (Jones and Taylor, 1980). Dabei
wird vor allem die für den Erhalt des Methylierungsmusters zuständige DNMT1 gebunden.
Durch die Inaktivierung wird die Methylierung von Cytosin Resten im Rahmen der
Replikation gehemmt, es kommt zu hemimethylierter DNA und im weiteren Verlauf zu einem
progressiven Verlust der Methylierung mit jeder Runde eines neuen Zellzyklus bis hin zu
vollständig demethylierter DNA (Taylor and Jones, 1982). Während Azacitidine sowohl in
die DNA als auch in die RNA inkorporiert wird, zeigt Decitabine einen spezifischen Einbau
in die DNA und als Folge dessen ein stärkeres demethylierendes Potential (Issa and
Kantarjian, 2005).
Abbildung 1.5 Decitabine induzierte Inhibition der
Cytosin Methylierung
Progressiver Verlust der DNA Methylierung mit
steigender Zellzykluszahl bis hin zu vollständig
demethylierter DNA. Schwarze Punkte symbolisieren
Decitabine
methylierte,
weiße
Punkte
unmethylierte
CpG
Dinukleotide. (Übernommen und modifiziert aus
Claus and Lubbert, 2003)
1.3.1.1 5-aza-2’-deoxycytidin – zelluläre Effekte und klinische Anwendung
Unterschiedliche zelluläre Effekte von 5-aza-2’-deoxycytidin sind beschrieben worden.
Decitabine zeigt toxische Wirkung auf proliferierende Zellen, wobei insbesondere die
Expositionsdauer eine entscheidende Rolle spielt. Niedrige Dosen zeigen bei längerer
Exposition im Vergleich zu kürzerer Einwirkzeit deutlich stärkere zytotoxische Effekte in
leukämischen Zellen (Momparler and Goodman, 1977). In Blasten von AML Patienten
konnte eine 90% Reduktion des Zellüberlebens bei der Behandlung mit 0,5mM DAC
beobachtet werden (Motoji et al., 1985). Zellzyklusanalysen konnten eine S-Phasen
spezifische Toxizität von DAC zeigen (Momparler et al., 1984). Darüber hinaus konnten von
vielen Autoren differenzierungs-induzierende Effekte der Substanz beschrieben werden
Einleitung
17
(Constantinides et al., 1978; Creusot et al., 1982; Jones and Taylor, 1980). Dabei wurde eine
Differenzierungsinduktion unter anderem bei der in-vitro Exposition von primären
leukämischen Zellen von AML Patienten mit DAC beobachtet (Pinto et al., 1984). Ebenfalls
konnte die (Re-)Aktivierung von durch DNA Methylierung inaktivierter Gene gezeigt
werden. Vor allem die im Rahmen der Tumorgenese inaktivierten Tumorsuppressorgene wie
zum Beispiel p15/INK4b oder E-cadherin, aber auch Gene des inaktivierten X-Chromosoms
zeigten eine Induktion der Expression nach DAC Behandlung (Farinha et al., 2004; Jones et
al., 1982).
Die Einführung von Decitabine und anderen Methyltransferaseinhibitoren in die Klinik, die
Indikationen und die konkreten Funktionsweisen der Substanzen sind zur Zeit Gegenstand
vieler Studien und Untersuchungen (Lübbert, 2000). Während in den primären Studien zur
Behandlung von AML hohe Decitabine Konzentrationen eingesetzt wurden (500-3000 mg/m2
pro Zyklus), werden in den aktuellen klinischen Studien deutlich geringere Konzentrationen
eingesetzt (120-225mg/m2 pro Zyklus). Anstatt sich die zytotoxischen Effekte hoher
Decitabine Konzentrationen zu nutze zu machen, wird versucht das Tumorwachstum über die
Modulierung der DNA-Methylierung, der Reaktivierung von Tumorsuppressorgenen und
einer Differenzierungsinduktion zu kontrollieren.
Erfolge konnten bereits bei der Behandlung fortgeschrittener Myelodysplastischer Syndrome
mit hohem Risiko („high risk“ MDS) (Lübbert et al., 2001; Wijermans et al., 2000), in
chronischen myeloischen Leukämien (CML) und AML erzielt werden (Lübbert and Minden,
2005; Santini et al., 2001).
1.3.2 Histondeacetylase Inhibitoren – Synergismus mit 5-aza-2’-deoxycytidin
Wie bereits beschrieben, stellt die Deacetylierung von Histonen einen entscheidenden
Mechanismus bei der transkriptionellen Repression von Genen dar. Als Histondeacetylase
Inhibitoren wird eine heterogene Substanzgruppe zusammengefasst, welche die Fähigkeit
aufweist Histondeacetylasen (HDAC) zu binden und deren Aktivität zu hemmen. Über diesen
Mechanismus können HDAC-Inhibitoren in kultivierten Tumorzellen zur Aktivierung von
Differenzierungsmechanismen, einer Wachstumsinhibition oder einer Induktion der Apoptose
führen (Egger et al., 2004).
Das
Verständnis
über
das
Zusammenspiel
von
DNA
Methylierung
und
Histonmodifizierungen bei der Regulation der Genexpression hat zu Versuchen geführt
demethylierende Agenzien mit HDAC Inhibitoren zu kombinieren. Während epigenetisch
inaktivierte Gene wie zum Beispiel CDKN2b (p15) oder CDKN1A (p21) durch Behandlung
mit dem HDAC- Inhibitor Trichostatin A (TSA) alleine nicht reaktiviert werden konnten,
Einleitung
18
zeigte sich bei der Kombinationsbehandlung von DAC und TSA eine starke
Transkriptionsaktivierung, welche die durch alleinige DAC Gabe beobachtetete Induktion
deutlich überstieg. Diese Beobachtungen lassen auf eine synergistische Wirkung der beiden
Substanzklassen schließen (Cameron et al., 1999). Die Effekte der Kombinationsbehandlung
von Decitabine und HDAC-Inhibitoren auf hämatologische Neoplasien werden derzeit in
klinische Studien untersucht (Garcia-Manero et al., 2006).
1.4
Molekulare Zielstrukturen für Tumor spezifische Immuntherapie
Die Suche nach humanen Antigenen als Zielstrukturen für Krebs spezifische Immuntherapie,
führte zu
der
Beschreibung unterschiedlicher Gruppen
von
Genen.
Es
werden
Differenzierungsantigene, Cancer Testis Antigene (CTAs), Tumor assoziierte Antigene
(TAAs) sowie Tumor spezifische Antigene unterschieden. Während Differenzierungsantigene
gewebespezifisch exprimiert werden und somit sowohl in gesunden als auch in maligne
entarteten Zellen eines Gewebetyps vorhanden sind, findet man die Expression von Tumor
spezifischen Antigene auf Grund genetischer Veränderungen nur in einem bestimmten
Tumortyp. CTAs und TAAs werden durch ihr spezifisches Expressionsprofil charakterisiert.
Während man CTAs nur in Tumoren und Keimzellen jedoch nicht in normalen Zellen
exprimiert findet, zeigen TAAs eine Überexpression in malignen Zellen (Zendman et al.,
2003a).
1.4.1 Cancer Testis Antigene
Als Cancer Testis Antigene (CTA) wird eine ständig wachsende, heterogene Gruppe von
Genen bezeichnet, deren Hauptcharakteristikum das tumorspezifische Expressionsprofil
darstellt. Wie der Name bereits andeutet, findet man eine Expression dieser Gene in
verschiedenen soliden Tumoren und Leukämien nicht aber in normalen Geweben, mit
Ausnahme des Hodens und der Plazenta (De Plaen et al., 1994). Die potentielle
Immunogenität stellt eine weitere wichtige Eigenschaft dieser Gruppe von Genen dar. So
können viele Mitglieder der Genfamilie sowohl eine humorale als auch eine zelluläre
Immunantwort induzieren (Scanlan et al., 2004). Die tumorspezifische Expression und das
immunogene Potential machen CTAs zu attraktiven Zielen einer spezifischen, gegen maligne
Zellen gerichteten Immuntherapie.
Einleitung
19
1.4.1.1 Hintergrund und Nomenklatur der Cancer Testis Antigene
Die Suche nach tumorspezifischen Antigenen als molekulare Zielstrukturen für Tumor
Immuntherapie führte zur Identifizierung der Cancer Testis Antigene. Dabei ermöglichten
zwei unterschiedliche Verfahren die Entdeckung vieler heute bekannter CTAs. Während die
Gruppe um Thierry Boon eine Methode zur Identifizierung von T-Zell Antigenen entwickelte,
bei der mittels DNA Klonierung T-Zell Epitope detektiert werden (Van den Eynde et al.,
1991), beruht das von Pfreundschuh und Kollegen etablierte Verfahren auf der Identifizierung
humoraler Antigene mittels SEREX Technologie (serological analysis of recombinant cDNA
expression libraries). Die Detektion der Antigene beruht dabei auf dem „Screening“ der aus
Tumor mRNA hergestellten Expressions Libraries mit Patienten Seren (Chen et al., 1997).
Neben den beiden genannten immunologischen Verfahren zur Identifizierung von CTAs,
beruht die Identifizierung weiterer Kandidaten inzwischen meist auf vergleichenden
Expressionsanalysen von mRNA Pools aus Tumor- und normalen Geweben bzw. der Analyse
von Expressions-Datenbanken. Nach dieser Methode identifizierte Gene zeigen das für CTAs
typische Expressionsprofil, ein immunogenes Potential ist für viele jedoch noch nicht
nachgewiesen, so dass sie von einigen Autoren als Cancer Testis assoziierte Gene bezeichnet
werden (Zendman et al., 2003a).
MAGEA1,
das
erste
bekannte
CTA,
wurde
1991
mittels
der
T-Zell
Epitop
Klonierungstechnik identifiziert (van der Bruggen et al., 1991). Weitere nach diesem
Verfahren gefundene CTAs sind BAGE (Boel et al., 1995) und GAGE (Van den Eynde et al.,
1995). SSX2 (Gure et al., 1997), NY-ESO-1 (Chen et al., 1997) und SCP-1 (Tureci et al.,
1998) stellen Beispiele für mittels SEREX Verfahren identifizierte CTAs dar.
Inzwischen sind 44 Cancer Testis Genfamilien bekannt, die zum Teil aus mehreren
Mitgliedern oder Splice Varianten bestehen, so dass insgesamt 89 Gentranskripte resultieren.
Bis auf das tumor-spezifische Expressionsprofil weisen die Gene keine gemeinsamen
Charakteristika auf. So wurde eine Nomenklatur, die auf der chronologischen Entdeckung der
CTAs beruht eingeführt, in welcher die CT Gene durchnummeriert (MAGEA = CT1; BAGE
= CT2) werden (Scanlan et al., 2004). Darüber hinaus lassen sich die CT Gene anhand der
chromosomalen Lokalisation in zwei Gruppen unterteilen. Ungefähr die Hälfte der bekannten
CTAs liegen auf dem X Chromosom (siehe Abbildung 1.6) und machen 10% der auf diesem
Chromosom gelegenen Gene aus (Ross et al., 2005), die andere Hälfte verteilt sich auf die
Autosomen. X-chromosomal gelegenen CTAs bilden häufig große Genfamilien (Simpson et
al., 2005).
Einleitung
20
Abbildung 1.6 X-Chromosomale Lokalisation der
Cancer Testis Antigene
Die Abbildung stellt schematisch das X-Chromosom
einschließlich Lokalisation der CTAs dar. CTAs
finden sich vorwiegend als Cluster in zwei Regionen.
Die Xp11 Region enthält alle Mitglieder der GAGE/
PAGE/ XAGE und SSX Familie sowie Untergruppen
der MAGE Familie. In den Xq26-28 Regionen sind
unter anderem die SPANX, MAGEA, MAGEC und
NY-ESO-1 Familie lokalisiert. (Übernommen aus
Zendman et al., 2003a).
Eine zelluläre oder humorale Immunantwort konnte bereits für 21 der 44 Genfamilien gezeigt
werden, die im Falle von MAGEA-1, SSX und NY-ESO-1 auf beiden Ebenen nachgewiesen
werden konnte (Scanlan et al., 2004). Die Tabelle 1.2 zeigt eine Auflistung der bekannten
CTA Familien einschließlich Nomenklatur, chromosomaler Lokalisation und Typ der
beobachteten Immunantwort.
CTA Familie
Nomen-
Familien-
klatur
mitglieder
Immunantwort
Literatur
Zellulär und humoral
(De Plaen et al., 1994; Stockert et al., 1998;
X- Chromosomal lokalisierte CTAs
MAGEA
CT1
12
van der Bruggen et al., 1991)
MAGEB
CT3
4
Zellulär und humoral
(Lucas et al., 2000; Muscatelli et al., 1995)
GAGE
CT4
8
Zellulär
(De Backer et al., 1999; Van den Eynde et
al., 1995)
SSX
CT5
5
Zellulär und humoral
(Gure et al., 1997; Tureci et al., 1996)
NY-ESO-1
CT6
3
Zellulär und humoral
(Chen et al., 1997; Slager et al., 2003)
MAGEC
CT7
2
Humoral
(Lucas et al., 2000; Lucas et al., 1998)
MAGEE
CT10
1
Humoral
(Gure et al., 2000)
SPANX
CT11
4
Humoral
(Wang et al., 2003; Westbrook et al., 2000;
Zendman et al., 2003b)
XAGE
CT12
8
Humoral
(Liu et al., 2000; Nakagawa et al., 2005;
Zendman et al., 2002)
SAGE
CT14
1
-
(Martelange et al., 2000)
PAGE-5
CT16
2
-
(Scanlan et al., 2002)
NA88A
CT18
1
Zellulär
(Moreau-Aubry et al., 2000)
IL13RA1*
CT19
1
-
(Debinski and Gibo, 2000)
Einleitung
21
CSAGE
CT24
2
-
(Lin et al., 2002)
CAGE
CT26
1
Humoral
(Cho et al., 2002)
HOM-TES-85
CT28
1
Humoral
(Tureci et al., 2002)
HCA661
CT30
1
Humoral
(Wang et al., 2002)
NY-SAR-35
CT37
1
Humoral
(Lee et al., 2003)
FTHL17
CT38
1
-
(Loriot et al., 2003)
NXF2
CT39
1
-
(Loriot et al., 2003)
TAF7L
CT40
1
-
(Wang et al., 2001)
FATE
CT43
1
Humoral
(Dong et al., 2003)
Autosomal lokalisierte CTAs
BAGE
CT2
5
Zellulär
(Boel et al., 1995; Ruault et al., 2002)
SYCP1
CT8
1
Humoral
(Tureci et al., 1998)
BRDT
CT9
1
-
(Scanlan et al., 2000)
HAGE
CT13
1
-
(Martelange et al., 2000)
ADAM2
CT15
1
-
(Scanlan et al., 2002)
LIP1
CT17
1
-
(Scanlan et al., 2002)
TSP50*
CT20
1
-
(Yuan et al., 1999)
CTAGE-1
CT21
2
Humoral
(Eichmuller et al., 2001)
SPA17*
CT22
1
Humoral
(De Jong et al., 2002)
OY-TES-1*
CT23
1
Humoral
(Ono et al., 2001)
MMA1
CT25
2
-
(de Wit et al., 2002)
BORIS
CT27
1
-
(Loukinov et al., 2002)
D40 / AF15q14
CT29
1
-
(Takimoto et al., 2002)
PLU-1*
CT31
1
-
(Lu et al., 1999)
LDHC
CT32
1
-
(Koslowski et al., 2002)
MORC
CT33
1
-
(Koslowski et al., 2002)
SGY-1
CT34
1
-
(Koslowski et al., 2002)
SPO11
CT35
1
-
(Koslowski et al., 2002)
TPX1
CT36
1
-
(Koslowski et al., 2002)
TDRD1
CT41
2
-
(Loriot et al., 2003)
TEX15
CT42
1
-
(Loriot et al., 2003)
TPTE
CT44
1
Humoral
(Dong et al., 2003)
Tabelle 1.2 Auflistung der 44 bekannten CTA Familien
Die Tabelle zeigt die 44 CTA Familien unterteilt nach chromosomler Lokalisation einschließlich der von
Scanlan et al. vorgeschlagenen Nomenklatur (Scanlan et al., 2004) sowie der beobachteten Immunantwort.
Für viele CTAs wurde das immunologische Potential bisher noch nicht untersucht (-). (Modifiziert nach
Simpson et al., 2005 und Kalejs and Erenpreisa, 2005), weitere Quellen (Scanlan et al., 2004) und CT
Datenbank http://www.cancerimmunity.org/ctdatabase.* ubiquitär exprimierte CT Gene
Einleitung
22
1.4.1.2 CTA Expression in normalen und malignen Geweben
Die Untersuchungen der CTA Expression in normalen und malignen Geweben beruhen zum
größten Teil auf RT-PCR Analysen. Bei dem Vergleich der Expression von Cancer Testis
Antigenen in verschiedenen Tumoridentitäten findet man eine deutliche Variationsbreite. So
kann man solche Tumoren unterscheiden, die eine starke und häufige Expression vieler CTAs
zeigen, von denen, die selten eine CTA Expression aufweisen. Aber auch innerhalb von
Tumoren desselben Ursprungsgewebes findet man deutliche Variationen. Dabei spielt vor
allem
das
Stadium
der
Erkrankung
eine
wichtige
Rolle
mit
ansteigender
Expressionshäufigkeit der MAGE Antigene in fortgeschrittenen und metastasierten Tumoren
(Barrow et al., 2006; Dhodapkar et al., 2003).
Melanome, in denen die ersten CTAs identifiziert wurden, gehören zu den am stärksten CTAs
exprimierenden Tumoren. Alle klassischen CTAs werden in Melanomen regelmäßig
exprimiert, am häufigsten findet man Mitglieder der MAGEA Familie. MAGEA3 stellt mit
einer Expressionsrate von bis zu 80% in metastasierten Melanomen das am häufigsten
detektierte CTA dar. Die Expressionslevel von SSX-2, NY-ESO-1, GAGE und BAGE liegen
zwischen 20 und 50%. Insgesamt zeigen sich mehr als 95% der metastasierten Melanome in
RT-PCR Untersuchungen positiv für mindestens ein CTA (Zendman et al., 2001).
Eine häufige Expression von CTAs findet man weiterhin in Tumoren der Blase, der Lunge,
des Ovars und der Leber. Im Gegensatz dazu zeigen Nierenzellkarzinome, kolorektale
Karzinome sowie Magenkarzinome und hämatologische Neoplasien nur selten eine
Expression von CTAs (Simpson et al., 2005).
Die Expression der Antigene in normalen Geweben beschränkt sich im wesentlich auf den
Hoden. Dabei findet man eine CTA Expression in unterschiedlichen Stadien der
Spermatogenese jedoch nicht in andern Zellen des Hodens wie Sertoli- oder Lydig Zellen
(Kalejs and Erenpreisa, 2005). Aufgrund der Blut-Hoden Schranke (Bart et al., 2002) sowie
dem Fehlen der Expression von HLA Klasse I Molekülen in den Keimzellen (Fiszer and
Kurpisz, 1998) werden die CTAs in diesen Zellen unter immunpriviligierten Bedingungen
exprimiert. Ebenfalls findet man eine CTA Expression in Gewebe des Trophoblasten und in
unreifen Keimzellen des fetalen Ovars (Simpson et al., 2005). Aufgrund der
keimzellspezifischen Expression werden die CTAs von einigen Autoren auch als Cancer
Germline Gene bezeichnet. Die zum Teil auch in anderen Geweben wie zum Beispiel dem
Pankreas detektierte CTA Expression weist deutlich niedrigere RNA Level auf, die zu keiner
detektierbaren Protein Expression mittels Immunhistochemie führen, so dass unklar ist, ob
diese eine physiologische Rolle spielt (Scanlan et al., 2004). Auf Grund der
Einleitung
23
immungeschützten Expression in Keimzellen und der um ein Vielfaches geringeren
Expression in gesunden Geweben kann die CTA Expression als Tumor spezifisch bezeichnet
werden.
Immunhistochemische Analysen der CTA Proteinexpression in verschiedenen Tumoren sind
wesentlich seltener publiziert. Antikörper sind nur für MAGEA, NY-ESO-1, MAGEC1 und
SSX erhältlich. Die durchgeführten immunhistochemischen Analysen zeigen ein sehr
heterogenes Expressionsprofil der CTAs. Häufig findet man die Expression nur in einem
relativ geringem Anteil der Zellen (Jungbluth et al., 2000). Vergleicht man die Häufigkeit der
CTA Expression auf mRNA Ebene mit der auf Proteinebene, findet man zum Teil deutliche
Differenzen.
1.4.1.3 Regulation der CTA Expression
Das bei den CTAs vergleichbare Expressionsprofil legt einen übergeordneten, gemeinsamen
Regulationsmechanismus nahe. 1996 konnte De Smet et al. einen Zusammenhang zwischen
der MAGEA-1 Expression und dem Methylierungsstatus von CpG Inseln in der
Promoterregion zeigen. MAGEA1 wurde nur in solchen Tumorzelllinien exprimiert, in denen
die CpG Inseln nicht methyliert vorlagen (De Smet et al., 1996). Weitere Unterstützung für
die Annahme der durch Methylierung regulierten Expression von CTAs brachte die
Beobachtung, dass die Behandlung mit der demethylierenden Substanz DAC eine Expression
von MAGEA1 in zuvor nicht exprimierenden Tumorzellen induzieren konnte (De Smet et al.,
1996; Serrano et al., 1996; Weber et al., 1994). Analysen des Methylierungsstatus der
MAGEA1 Promoterregion vor und nach DAC Behandlung bestätigten die Demethylierung in
diesem Bereich als entscheidenden Mechanismus der MAGEA1 Induktion (De Smet et al.,
1999).
Dieser Zusammenhang konnte darüber hinaus mittels Promoter-Reporteruntersuchungen
bestätigt werden. Dabei wurde das Luciferase Gen unter die Kontrolle des MAGEA1
Promoters gestellt. Eine Luciferase Expression konnte nur in solchen Zellen detektiert
werden, die mit dem, den unmethylierten Promoter tragenden Konstrukt transfiziert wurden
(De Smet et al., 1999). Untersuchungen des MAGEA1 Methylierungsstatus in gesunden
Geweben, in denen keine Expression der MAGE Gene vorliegt, zeigten eine ausgeprägte
Methylierung der Promoterregion (De Smet et al., 1999).
Analysen der CTA Expression in Zelllinien verschiedener solider Tumoren nach DAC
Behandlung zeigten eine Induktion oder verstärkte Expression vieler CTAs, darunter weitere
Mitglieder der MAGEA Familie (Coral et al., 2002; Sigalotti et al., 2002b), LAGE1 (Lethe et
al., 1998), NY-ESO-1 (Coral et al., 2002; Sigalotti et al., 2002a; Weiser et al., 2001a) GAGE,
Einleitung
24
PAGE, XAGE (Karpf et al., 2004) sowie Mitglieder der SSX Familie (dos Santos et al., 2000;
Sigalotti et al., 2002a).
In weiteren Studien wurde die Frage adressiert, ob Histondeacetylase-Inhibitoren (HDACI)
die
DAC-induzierte
Expression
von
CT
Genen
in
Tumorzelllinien,
wie
für
Tumorsuppressorgene beobachtet, weiter verstärken kann. Weiser et al. konnte bei
kombinierter Behandlung von pulmonalen und ösophagealen Tumorzelllinien mit dem
HDACI FR901228 und DAC eine höhere Expression von MAGEA3 und NY-ESO-1
beobachten als in den nur mit DAC behandelten Zellen. FR901288 allein zeigte kaum Effekt
auf die CTA Expression, so dass von einem synergistischen Effekt der Substanzen
ausgegangen werden kann (Weiser et al., 2001a).
Eine mögliche Ursache für die häufige Expression der CT Gene in unterschiedlichen
Tumoridentitäten stellt die in vielen Tumorerkrankungen beobachtete genomweite DNA
Demethylierung dar. Dem entgegen steht jedoch die Beobachtung, dass kolorektale
Karzinome häufig eine globale Hypomethylierung aufweisen, jedoch selten eine Expression
von CTAs (Zendman et al., 2003a). Schlussfolgernd kann man vermuten, dass die
Methylierung zwar eine Schlüsselrolle bezüglich der Expression vieler CTAs spielt, jedoch
nicht der einzige Mechanismus der CTA Regulation während der Keimzellentwicklung und
Tumorgenese zu sein scheint.
1.4.1.4 Potentielle Funktion von Cancer Testis Antigenen
Über die physiologische Rolle der Cancer Testis Antigene in Keimzellen und deren
Bedeutung im Rahmen der Tumorgenese ist bis heute nur wenig bekannt.
Für SCP-1 und BORIS konnte eine Funktion während der Spermatogenese gezeigt werden.
SCP-1 wird in Spermatozyten exprimiert und ist an der korrekten Anlagerung homologer
Chromosomen während der Prophase der Meiose beteiligt (Tureci et al., 1998). BORIS spielt
eine wichtige Rolle bei der Änderung des genetischen Imprinting (Loukinov et al., 2002).
Für MAGEA1 konnte eine Interaktion mit dem transkriptionellen Regulator Protein SKI und
der Histon Deacetylase 1 gezeigt werden. Das SKI Protein vermittelt Interaktionen zwischen
DNA bindenden Proteinen und Proteinen, die die Transkription aktivieren oder reprimieren.
MAGEA1 kann über die Bindung und Inaktivierung von SKIP sowie der Rekrutierung von
HDAC-1 als transkriptioneller Repressor agieren (Laduron et al., 2004).
Die Expression von CTAs in frühen Stadien der Spermatogenese mit einem Abfall während
der Differenzierung deutet auf eine mögliche Rolle der Antigene im Rahmen der
Selbsterneuerung von Keimzellen oder Differenzierung hin. Die Expression dieser Gene in
Tumoren könnte dabei die Rekapitulation bestimmter Eigenschaften der Keimzellen, wie
Einleitung
25
Immortalität, Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Migration und Einwanderung in Gewebe
bedeuten (Nicholaou et al., 2006).
1.4.1.5 Immunogenität
Das Tumor spezifische Expressionsprofil der CTAs sowie das immunogene Potential machen
diese Gene zu interessanten Zielstrukturen für Tumor spezifische Immuntherapie. 21 der 44
CT Genfamilien kodieren für Proteinen, die eine spontane Immunantwort hervorrufen
können. Eine Immunreaktion findet man in Patienten mit malignen Neoplasien, jedoch nicht
in gesunden Probanden (Scanlan et al., 2004). NY-ESO-1 zeigt von den bisher bekannten
CTAs das stärkste immunogene Potential mit sowohl zellulär als auch humoral detektierbarer
Immunantwort (Jager et al., 2000b). Simultane T-Zell und Antikörper Antworten konnten
darüber hinaus für die MAGE und SSX Familie gezeigt werden (Scanlan et al., 2004).
1.4.1.6 Expression von CTAs in hämatologischen Neoplasien
Während eine CTA Expression inzwischen in vielen soliden Tumoren detektiert werden
konnte, findet man diese in hämatologischen Neoplasien nur in Ausnahmefällen exprimiert
(vgl. Tabelle 1.3). Klassische Vertreter der CTA Familie wie NY-ESO-1, MAGEA1 oder
GAGE zeigen keine Expression in Leukämien (Chambost et al., 2001; Lim et al., 1999;
Niemeyer et al., 2003), mit Ausnahme der T-ALL (Schichijo et al., 1996; Shichijo et al.,
1996) und dem multiplen Myelom (van Baren et al., 1999; van Rhee et al., 2005). Für
MAGEA3 konnte eine Expression in AML und ALL gezeigt werden (Martinez et al., 2007).
MAGEA4 Transkription konnte in den Reed-Sternberg Zellen von Hodgkin Lymphomen
detektiert werden (Chambost et al., 2000). Untersuchungen von Non Hodgkin Lymphomen
zeigten eine unter den Subtypen variierende Expression von CT Genen mit der häufigsten
Expression von SCP-1 (HOM-TES-14) in diffus großzelligen B-Zell und T-Zell Lymphomen
(Xie et al., 2003).
Multiple Myelome stellen die hämatologische Neoplasie mit der häufigsten Expression von
CTAs dar. So konnte eine Expression von MAGEA, BAGE, GAGE, LAGE1 und NY-ESO-1
in Knochenmarksbiopsien von Patienten mit multiplem Myelom detektiert werden. Wie
bereits für viele solide Tumore gezeigt, erwies sich die Expression abhängig vom
Krankheitsstadium mit der stärksten Expression in Patienten mit fortgeschrittenen Grad III
Myelomen (van Baren et al., 1999). Im peripheren Blut dieser Patienten konnten gegen NYESO-1 gerichtete Antikörper sowie NY-ESO-1 spezifische T –Zellen nachgewiesen werden
(van Rhee et al., 2005).
Einleitung
26
Myeloische Leukämien zeigen in der Regel keine Transkription klassischer CTAs, eine
Expression von HAGE/DDX43 konnte jedoch in 57% der untersuchten CML und 23% der
AML Proben gezeigt werden (Adams et al., 2002). Darüber hinaus konnte die Expression von
BAGE in 8/30 (27%) der untersuchten AML Patienten detektiert werden (Greiner and
Schmitt, 2007).
CTA Expression in Leukämien [ % ]
AML
CML
CLL
ALL
MAGEA1
0 - 3%
0%
0%
4%
MAGEA3
0 - 31%
0 - 13%
0%
0%
MAGEA6
4%
17%
-
-
NY-ESO-1
0%
0%
0%
0%
SCP-1
0%
-
14%
12%
SSX2
0%
0%
0%
29%
HAGE
23%
57%
-
-
BAGE
27%
0%
0%
-
Literatur
(Adams et al., 2002; Chambost
et al., 2001; Giannopoulos et al.,
2006; Greiner et al., 2004;
Greiner
and
Schmitt,
2007;
Martinez et al., 2007; Niemeyer
et al., 2003; Xie et al., 2003)
Tabelle 1.3 mRNA Expression von CTAs in AML, CML, CLL und ALL
Die Tabelle zeigt die Expressionshäufigkeit von Cancer Testis Antigenen in verschiedenen hämatologischen
Neoplasien. AML, CML, akute und chronische myeloische Leukämie; CLL und ALL, akute und chronische
lymphatische Leukämie (Modifiziert nach Greiner and Schmitt, 2007).
1.4.2 Leukämie assoziierte Antigene
Leukämie assoziierte Antigene (LAAs) bezeichnen eine Untergruppe der Tumor assoziierten
Antigene (TAAs), die eine Überexpression in leukämischen Zellen zeigen. Im Unterschied zu
der Gruppe der CTAs findet man bei TAAs/LAAs eine leichte Expression auch in normalen
Geweben bzw. hämatologischen Vorläuferzellen. Da diese physiologischen Expressionslevel
jedoch wesentlich geringer ausfallen, stellen LAAs eine interessante Alternative zu den in
Leukämien selten exprimierten CTAs als molekulare Zielstruktur für Leukämie spezifische
Immuntherapie dar. Eine Liste der in akuten myeloischen Leukämien häufig überexprimierten
LAAs einschließlich Expression in normalen Geweben sowie Typ der ausgelösten
Immunantwort zeigt die Tabelle 1.4.
Einleitung
27
Expression von LAAs in AML und normalen Geweben, Typ der beobachteten Immunantwort
Expression
Immunantwort in AML Patienten
LAA
AML
normale
Gewebe
CD34+ SZ
Humoral
Zellulär
BCL-2
84%
+
+
N/U
+
G250/CA9
51%
-
-
N/U
+
hTERT
28%
-
+/-
N/U
N/U
MPP11
86%
Hoden, Nieren,
Lunge
+
37%*
N/U
OFA-iLRP
100%
-
-
N/U
+
PRAME
64%
Hoden, Plazenta,
Ovar, Pankreas
-
N/U
+
MBN
67%
myeloische
Zellen, normale
Gewebe
+
N/U
+
RHAMM
70%
Hoden, Thymus,
Plazenta
-
42%*
+
Survivin
100%
Vorläuferzellen
+
N/U
+
67-89%
Plazenta
+
17%*
+
WT-1
Tabelle 1.4 LAA Expression und Immunogenität in AML
Die Tabelle gibt einen Überblick über die Expressionshäufigkeit von LAAs in akuten myeloischen
Leukämien und normalen Geweben sowie die beobachtete Immunantwort in AML Patienten. SZ,
Stammzellen; N/U, nicht untersucht, * Anteil der untersuchten Patienten mit spezifischen Antikörpern.
(Übernommen und modifiziert aus Greiner et al., 2006)
Myeloblastin / Proteinase 3 (MBN) kodiert für eine Serine - Protease, die in den azurophilen
Granula der neutrophilen Granulozyten und Monozyten lokalisiert ist (Rao et al., 1991).
Physiologischerweise findet man die MBN Expression während den frühen Phasen der
myeloischen Differenzierung mit der stärksten Expression auf Reifungsebene der
Promyelozyten. Die G-CSF abhängige Aktivierung der MBN Expression führt zum
Wachstum der Vorläuferzellen (van der Geld et al., 2001). Ein Mechanismus der
Transkriptionsregulation von MBN stellt dabei die DNA Methylierung dar (Lübbert et al.,
1999). Eine MBN Überexpression konnte sowohl in akuten als auch chronischen myeloischen
Leukämien detektiert werden (Dengler et al., 1995). In AML Patienten konnten MBN
spezifische CD8 T-Zellen detektiert werden und klinische Phase I/II Vakzinierungsstudien
Einleitung
28
zeigten sowohl immunologisches also auch klinisches Ansprechen der untersuchten Patienten
(Heslop et al., 2003).
WT1 (Wilms Tumor 1) spielt eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung sowie
bei der Regulation von Wachstum und Differenzierung verschiedener Gewebe. Eine
Überexpression konnte in vielen Leukämien unabhängig vom Subtyp detektiert werden und
scheint durch die Induktion einer unkontrollierten Proliferation an der Leukämieentstehung
beteiligt zu sein (Van Driessche et al., 2005). Die Beobachtung von spezifischen WT1Antikörpern in Patienten mit Leukämien erbrachte den ersten Hinweis hinsichtlich eines
immunogenen Potentials von WT1 in vivo (Elisseeva et al., 2002; Gaiger et al., 2001).
Darüber hinaus konnten spezifische CD8 T-Zellen in WT1 positiven AML Patienten
nachgewiesen werden (Oka et al., 2004).
PRAME (preferentially expressed antigen of melanoma) wurde ursprünglich als Melanomassoziiertes-Antigen identifiziert (Ikeda et al., 1997). Weitere Untersuchungen zeigten eine
häufige Expression in vielen soliden Tumoren und hämatologischen Neoplasien. Darüber
hinaus findet man eine Expression in normalen Geweben wie dem Gehirn und der
Nebenniere. Aufgrund der in diesen Geweben deutlich geringeren Expression verglichen mit
malignen Geweben gilt PRAME ebenfalls als geeignete Zielstruktur für Tumor spezifische
Immuntherapie. 35-47% der untersuchten AML Patienten zeigten eine PRAME Expression.
Dabei konnte eine besonders häufige PRAME Expression in AML M3 mit der Translokation
(8;21) detektiert werden (Greiner et al., 2000; Matsushita et al., 2003).
1.5
Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Effekte des DNA Methyltransferase-Inhibitors 5-aza2’-deoxycytidin (DAC) auf die Expression von Cancer Testis und Leukämie-assozierten
Antigenen in myeloischen Leukämiezelllinien in-vitro sowie in primären myeloischen Blasten
von AML Patienten in vivo zu untersuchen. Drei Prototypen der CTA Familie NY-ESO-1,
MAGEA1 und MAGA3 sowie das Leukämie assoziierte Antigen MBN wurde zu
verschiedenen Zeitpunkten der DAC Exposition hinsichtlich ihrer Expression mittels Western
Blot und quantitativer RT-PCR untersucht. Um das Spektrum der untersuchten CTAs und auf
alle 44 bekannten Genfamilien erweitern zu können, wurden darüber hinaus DNA-Microarray
Analysen durchgeführt.
Material und Methoden
2
29
Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1 Zellen
2.1.1.1 Humane Zelllinien
Alle Zelllinien stammen aus der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Braunschweig.
Kasumi-1
Die Kasumi-1 Zelllinie wurde 1989 aus dem peripheren Blut eines siebenjährigen japanischen
Jungen
mit
akuter
myeloischer
Leukämie
im
zweiten
Relaps
nach
Knochenmarkstransplantation etabliert (Asou et al., 1991). Die Zellen werden einer akuten
myeloblastischen Leukämie mit Ausreifung und der FAB-Klassifikation AML-M2
zugeordnet. Es handelt sich um Myeloperoxidase positive, myeloische Leukämiezellen, die
morphologische Zeichen der partiellen myeloischen Differenzierung zeigen. Die Zellen tragen
die Translokation (8;21), bei der es zu einem Rearrangement zwischen dem AML1-Gen auf
Chromosom 21q22 und dem ETO-Gen auf Chromosom 8q22 kommt, welche zum AML1ETO Fusionsgen führt.
HL60
Die Zelllinie HL60 wurde aus dem peripheren Blut einer 35 Jahre alten Frau mit akuter
myeloische Leukämie 1976 etabliert (Collins et al., 1977). Die Zellen werden ebenfalls der
akuten myeloblastischen Leukämie mit partieller Reifung (FAB-M2) zugeordnet (Dalton et
al., 1988).
U937
Die Zelllinie U937 wurde 1974 aus dem Pleuraerguss eines 37 jährigen Patienten mit
generalisiertem diffusem histiozytärem Lymphom gewonnen. Die Zellen exprimieren
monozytäre Marker und zeigen die für diesen Zelltyp charakteristischen Eigenschaften
(Sundstrom and Nilsson, 1976). Die Zelllinie trägt die Translokation (10;11) mit Beteiligung
der Bande 11q23.
Material und Methoden
30
NB4
Die Zelllinie NB4 wurde 1989 aus dem Knochenmark einer 23 jährigen Frau im zweiten
Rezidiv einer akuter Promyelozytenleukämie (APL = AML FAB M3) etabliert. Die Zellen
tragen die Translokation (15;17), die im PML-RARA Fusionsgen resultiert (Lanotte et al.,
1991).
K562
Die Leukämiezelllinie K562 wurde 1970 aus dem Pleuraerguss einer 53jährigen Patientin mit
chronischer myeloischer Leukämie in der Blastenkrise etabliert. Die Zellen tragen die für die
chronisch myeloische Leukämie typische Translokation (9;22), die im BCR-ABL Fusionsgen
resultiert.
U266
U266 ist eine Myelomzelllinie, die aus dem peripheren Blut eines 53 jährigen Patienten mit
einem IgE produzierenden therapierefraktären, multiplen Myelom gewonnen wurde. Die
Zellen produzieren IgE lambda, darüber hinaus wird das BCL2 Gen exprimiert. U266 Zellen
zeigen eine gehäufte Expression von cancer testis Antigenen (CTAs) (Nilsson et al., 1970).
Die Tabelle 2.1 zeigt die wichtigen zytogenetischen Aberrationen mit den resultierenden
molekulargenetischen Veränderungen der verwendeten Zelllinien sowie die exprimierten
Oberflächenmarker.
2.1.1.2 Primäre humane Zellen
Periphere Blut Lymphozyten
Lymphozyten aus peripherem Blut wurden aus eigenem venösen, EDTA-antikoaguliertem
Blut mittels Ficoll Dichtezentrifugation (s.u.) gewonnen.
Patientenproben
Blutproben von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie wurden vor, während und nach
der Behandlung mit Decitabine gewonnen. Alle Patienten erklärten sich schriftlich damit
einverstanden, dass ihr Probenmaterial für Forschungszwecke genutzt wird. Ebenfalls liegt
eine Zustimmung zu den durchgeführten Untersuchungen von Seiten der Ethikkommision der
Universität Freiburg vor. Die Blasten wurden mittels Ficoll Dichtezentrifugation isoliert. Um
die Verunreinigung durch Lymphozyten und Monozyten möglichst gering zu halten, wurden
Material und Methoden
31
nur Patienten mit einem prätherapeutischen Blastengehalt von >50% im peripheren Blut in die
Untersuchungen eingeschlossen.
Oberflächenmarker und Zytogenetik der Zelllinien
U937
HL60
NB4
K562
U266
balancierte
Translokation
t(8;21)
(q22;q22)
t(10;11)
(p14;q23)
diverse
t(15;17)
(q22;q11-12.1)
t(9;22)
t(1;11)
(p33;q13)
Fusionsprotein
AML1-ETO
AF10 / MLL
PML-RARA
BCR-ABL
CD3
-
-
-
-
-
-
CD4
+
+
+
+
n.a
-
CD13
+
+
+
+
+
-
CD14
-
-
-
-
n.a
-
CD15
+
+
+
+
n.a
-
CD19
-
-
-
-
-
-
CD33
+
+
+
+
n.a
+
CD34
+
-
-
-
-
-
CD38
+
n.a
n.a
+
n.a
+
CD42
n.a
n.a
n.a
n.a
+
n.a
CD54
n.a
+
n.a
n.a
n.a
n.a
CD68
-
+
n.a
-
n.a
n.a
CD71
+
n.a
n.a
n.a
+
n.a
HLA-DR
+
-
n.a
-
n.a
+
Oberflächenmarker
Kasumi 1
Tabelle 2.1 Zytogenetische und molekulargenetische Befunde sowie Oberflächenmarker der
untersuchten Zelllinien. + exprimiert, - nicht exprimiert, n.a nicht angegeben
2.1.2 Materialien für die Zellkultur
2.1.2.1 Zellkulturmedien, Zusätze und Reagenzien
5-Aza-2'-deoxycytidin (DAC, Decitabine)
Sigma Aldrich
Cytarabin (AraC)
Kliniksapotheke / Uniklinikum Freiburg
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Sigma Aldrich
LSM 1077 Lymphocyte Separation Medium
PAA Laboratories Gmbh
Fötales Kälberserum (FCS)
Gibco BRL / Invitrogen, Biochrom AG
Natriumpyruvat (100 mM)
Gibco BRL / Invitrogen
D-PBS
Gibco BRL / Invitrogen
Penicillin-Streptomycin
Gibco BRL / Invitrogen
RPMI 1640 mit L-Glutamin
Gibco BRL / Invitrogen
Material und Methoden
32
Trypanblau 0.4%
Gibco BRL / Invitrogen
TÜRKS Lösung
Merck
2.1.2.2 Sonstige Materialien, Plastikwaren
Glaspipetten (2,5,10,25 ml)
Corning
Kryoröhrchen (1,8ml)
Corning
Mikro-Schraubröhrchen
Sarstedt
Neubauer Zählkammer
Marienfeld
Reaktionsgefäße ( 1,5 , 2 ml )
Eppendorf, Greiner
Sterile Schraubdeckelröhrchen (15, 50 ml)
Greiner
Sterile Spitzen
Molecular Bio Products , Corning
Zellkulturflaschen
Nunc
Pipetboy
Integra Biosciences
2.1.3 Materialien für molekularbiologische Arbeiten
2.1.3.1 Chemikalien und Reagenzien
ABSOLUTETM QPCR Low ROX Mix
Abgene
Agarose
Serva, Sigma-Aldrich
Aqua ad iniectabilia
Braun
Bovines Serumalbumin (BSA)
Sigma-Aldrich, Invitrogen
Borsäure
Merck
Bromphenolblau
Merck
DEPC Wasser
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Sigma Aldrich
DTT (0,1M)
Invitrogen
ECL Plus Western Blot Detektionsreagenzien
Amersham
EDTA
Sigma Aldrich
Ethanol
Merck, BDH Prolabo
Ethidiumbromid
Qbiogen
Glykogen
Ambion
H2O
Gibco BRL / Invitrogen
Isopropanol
Roth
Material und Methoden
33
Magermilchpulver
AppliChem
MES hydrate SigmaUltra
Sigma Aldrich
MES Sodium Salt
Sigma Aldrich
Methanol
Merck
Natriumacetate (NaOAc), 3M
Sigma-Aldrich
Natriumchlorid (5M)
Ambion
Natronlauge NaOH (1mol/l)
Merck
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)
Invitrogen
NuPAGE Antioxidant
Invitrogen
NuPAGE Sample Loading Puffer (4x)
Invitrogen
NuPAGE MES SDS Running Puffer (20x)
Invitrogen
NuPAGE Transfer Puffer (20x)
Invitrogen
PBS
Invitrogen
QPCR ROX Mix
Abgene
R-Phycoerythrin Streptavidin
Molekular Probes
RNAsin Plus RNAse Inhibitor
Promega
Sucrose
Sigma-Aldrich
Salzsäure 5mol/l
Merck
Salzsäure, 1mol/l
Merck
SeeBluePlus2 Gel Marker
Invitrogen
Tris Base
Sigma Aldrich
Tween 20
Sigma-Aldrich, Pierce Chemical
Xylencyanol
Sigma-Aldrich
β-Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich
2.1.3.2 Standardlösungen und Puffer
DNA-Ladepuffer
0,15% Bromphenolblau
0,15% Xylencyanol
42% Sucrose
in 1xTBE
Erststrangpuffer (5x) für cDNA Synthese
Invitrogen
Goat IgG Stock-Lösung (10mg/ml)
50 mg Goat IgG
Material und Methoden
34
150mM NaCl
MES Puffer (12x)
Für 1000 ml
(1,22M MES und 0,89M [Na+])
64,61 g MES Hydrate
193,3 g MES Sodium Salt
800 ml H2O
pH 6,5 – 6,7
Hybridization Puffer (2x)
Für 50 ml
(1x) 100mM MES, 1M Na+ , 20mM EDTA, 0,01% 8,3 ml 12x MES Stock Puffer
Tween20
17,7 ml 5M NaCl
4,0 ml 0,5M EDTA
0,1 ml 10% Tween20
19,9 ml H2O
SSPE (20x)
BioWhittaker Molekular Applications
3M NaCl, 0,2M NaH2PO4, 0,02M EDTA
Stain Puffer (2x)
Für 250 ml
41,7 ml 12x MES Puffer
92,5 ml 5M NaCl
2,5 ml 10% Tween20
113,3ml H2O
TBE (10x)
Für 1000 ml
890 mM Tris-Borat (108 g Tris-Base +
55 g Borsäure pro Liter)
25 mM EDTA
pH 8.0
TBS (10x)
78,4 g Tris Base
160 g NaCl
H2O auf 2000ml
ph 7,6
TBST (1x)
50 ml TBS (10x)
1 ml Tween20
3,5 ml HCl
950 ml H2O
Wasch-Puffer A
Für 1000 ml
(6x SSPE, 0,01% Tween20)
300 ml 20x SSPE
Material und Methoden
35
1,0 ml 10% Tween20
699 ml H2O
Wasch-Puffer B
Für 1000 ml
(100mM MES, 0,1M Na+, 0,01% Tween20)
83,3 ml 12x MES Puffer
5,2 ml 5M NaCl
1,0 ml 10% Tween20
910,5 ml H2O
2.1.3.3 Enzyme
Superscript II Reverse Transcriptase
Invitrogen
2.1.3.4 Nukleinsäuren
Heringssperma DNA
Promega Corporation
Oligo(dT) Primer
Invitrogen
dNTPs
Fermentas
RNA 6000 ladder
Ambion
1 kb Molekulargewichtsmarker
Invitrogen
100 bp Molekulargewichtsmarker
Invitrogen
Oligonukleotide für forward und reverse Primer wurden von Herrn Dr. Igloi (Institut für
Biologie 3, Universität Freiburg) bezogen, die FAM und TAMRA gelabelten Sonden von
Operon / Qiagen. Die Primer- und Sondensequenzen für NY-ESO-1, MAGEA1 und
MAGEA3 wurden aus der Arbeit von Riker et al. übernommen (Riker et al., 2000). Primer
und gelabelte Sonden für MBN wurden mit der Primer Express Software 1.5 (Applied
Biosystems) entworfen. Die für GAPDH verwendeten Primer und Probe Sequenzen wurden
von Applied Biosystems bezogen.
NY-ESO-1 forw
5’ TGC AGA CCA CCG CCA ACT 3’
NY-ESO-1 rev
5’ TCC ACA TCA ACA GGG AAA GCT 3’
NY-ESO-1 probe
MAGEA1 forw
5’ [6~FAM] CAG CTC TCC ATC AGC TCC TGT CTC CAG
[TAMRA] 3’
5’ TAC CTG GAG TAC CGG CAG GT 3’
Material und Methoden
36
MAGEA1 rev
5’ TTG GAC CCC ACA GGA ACT CA 3’
MAGEA1 probe
5’ [6~FAM] CGG ACA GTG ATC CCG CAC GCT [TAMRA] 3’
MAGEA3 forw
5’ TCC TGT GAT CTT CAG CAA AGC TT 3’
MAGEA3 rev
5’ GGG TCC ACT TCC ATC AGC TC 3’
MAGEA3 probe
5’ [6~FAM] CAG TTC CTT GCA GCT GGT CTT TGG CAT
[TAMRA] 3’
MBN forw
5’ CGG CCA CAT AAC ATT TGC AC 3’
MBN rev
5’ GAG TCT CCG AAG CAG ATG CC 3’
MBN probe
5’ [6~FAM] TCG TCC CTC GCC GCA AGG C [TAMRA] 3’
GAPDH forw
5’ GAA GGT GAA GGT CGG AG TC 3’
GAPDH rev
5’ GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC 3’
GAPDH probe
5’ [6~FAM] GGC TGA GAA CGG GAA GCT G [TAMRA] 3’
2.1.3.5 Antikörper
Anti-Streptavidin Antikörper (Ziege), biotinyliert
Vector Laboratories
Goat IgG
Sigma Aldrich
Mouse anti-NY-ESO-1 (U937)
Zymed
Monoklonaler Anti-β-Aktin Antikörper (Maus)
Sigma Aldrich
Anti Mouse IgG – Peroxidase Antikörper (Ziege)
Sigma Aldrich
2.1.3.6 Kits
Bio-Rad Protein Assay
Bio Rad
DNAfree
Ambion
GeneChip Eukaryotic Hybridization Control Kit
Affymetrix
Hybridisation Control Kit
Affymetrix
IVT Labeling Kit
Affymetrix
Nuclear Extract Kit
Active Motif
One-Cycle cDNA Synthesis Kit
Affymetrix
Poly-A RNA Control Kit
Affymetrix
RNAse free DNAse Set
Quiagen
Material und Methoden
37
RNeasy Mini Kit
Quiagen
RNA 6000 Nano LabChip® Kit
Agilent Technologies
Sample Cleanup Module
Affymetrix
2.1.3.7 Sonstige Materialien
96-Loch-Microtiterplatten
®
Greiner
Affymetrix Microarry Suite
Affymetrix
Affymetrix® GeneChip® Scanner
Affymetrix
Blotting Pads
NuPAGE / Invitrogen
Cryoboxen mit Deckel, Rastereinsatz 10x10
RZ
Erlenmeyerkolben (100, 250 ml)
Schott
Filterpapiere
Whatmann
Haushaltsfolie, Saran
Roth
HG-U133A
Affymetrix
HG-U133plus
Affymetrix
Hyperfilm
Amersham
Hypobond-P+ Membranen
Amersham
Messbecher
Kartell
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel
Invitrogen
Kanüle 21 G (0,8 x 40 mm)
B. Braun
PCR-Reaktionsgefäße
Abgene
QPCR Seal
Abgene
RNA 6000 Nano Chip
Agilent Technologies
Reaktionsgefäß (0.5, 1.5, 2.0 ml)
Eppendorf, Greiner
Röhrchen (15, 50 ml)
Greiner
Thermo-Fast 96 Detektionsplatte
Abgene
Wägeschalen (40/40/10, 80/80/20, 140/140/20)
Bender& Hobein
2.1.4 Geräte
ABI Prism 7700
Applied Biosystems
Auflicht Mikroskop Leica DMIL
Leica
Bioanalyzer
Agilent
Entwickler X-Omat M35
Kodak
Material und Methoden
38
Gelkammern
BioRad
Hybridisation Oven 640
Affymetrix
Heizblock TCR100
Roth
Heizblock DB-2D
Techne
Inkubator
Heraeus
Thermomixer Comfort 1,5ml
Eppendorf
Kühlschrank 4°C
Liebherr
Kühlschrank -20°C
Liebherr
Kühlschrank -80°C
Heraeus
Kühlzentrifuge 5417R
Eppendorf
Mikrowelle
AEG
Spektrometer, GeneQuant Pro
Amersham Bioscience
Sterile Werkbank CaminAir HB2448
Heraeus
T3 Thermocycler
Biometra
Thermocycler PTC200
MJ Research, Biozym Diagnostik
Tischzentrifuge 5417C
Eppendorf
Vortexer
Heidolph
Waage Sartorius basic BA1103
Sartorius
Wasserbad Haake W26/PC3,
Haake
XCell SureLock Mini-Cell
NuPage / Invitrogen
Zentrifuge Varifuge 3.0R
Heraeus
2.2
Methoden
2.2.1 Zellkultur
Alle Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 im Inkubator kultiviert. Sämtliche
Zentrifugationsschritte von weiter kultivierten Zellen wurden für 5 min bei 1200 rpm in einer
Heraeuszentrifuge (Varifuge 3.0 R) durchgeführt. Zellkulturarbeiten wurden ausschließlich an
einer sterilen Werkbank durchgeführt. FCS zur Herstellung von Kulturmedien wurde bereits
in Hitze-inaktivierter Form bezogen. Die fertig angesetzten Kulturmedien wurden bei 4°C
aufbewahrt und vor der Benutzung im 37°C Wasserbad vorgewärmt.
Material und Methoden
39
2.2.1.1 Kulturbedingungen
Kultivierung
Alle Medienansätze mit RPMI-1640 wurden mit 5 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung auf
500 ml versetzt. Die Zelllinie Kasumi-1 erhielt das Medium RPMI-1640 mit 20% FCS.
Zusätzlich wurde noch 5 ml Natriumpyruvat-Lösung zum Medium hinzugefügt. Die Kultur
wurde mit einer Zellkonzentration von ca. 106 Zellen/ml gestartet. Mediumwechsel und
Aufteilung der Zellen erfolgten alle zwei bis drei Tage. Die Zellkonzentration wurde im
weitern Kulturverlauf zwischen 0.25 und 1*106 Zellen/ml gehalten. Eine deutliche Menge an
Zelldebris war stets während der Kultur zu beobachten.
Die Zelllinien HL60 und U937 wurden in RPM1-1640 mit 10% FCS kultiviert. Die Zellen
wurden alle zwei Tage aufgeteilt und mit frischem Medium versetzt, so dass
Zellkonzentrationen zwischen 0.5 und 2*106 Zellen/ml erreicht wurden. Die Zelllinie NB4
wurde in RPMI-1640 mit 15% FCS unter den gleichen Bedingungen wie HL60 und U937
kultiviert.
Zum Mediumwechsel wurden die Zellen für 5 min bei 1200rpm in Falcon-Röhrchen
zentrifugiert. Der Überstand mit dem alten Medium wurde verworfen und das Zellpellet in
frischem Medium resuspendiert und auf die Zellkulturflaschen verteilt.
Einfrieren und Auftauen
Sowohl das Einfrieren als auch das Auftauen von Zellen erfolgte sehr zügig, um die toxische
Wirkung des DMSO auf die Zellen möglichst gering zu halten.
Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen mit den Zellen kurz im 37°C Wasserbad
geschwenkt. Bei Flüssigwerden der Zellsuspension wurde diese direkt in 20 ml 37°C warmem
Medium aufgenommen und für 5 min bei 1200rpm zentrifugiert, um das DMSO
auszuwaschen. Das Zellpellet wurde dann in frisches Kulturmedium aufgenommen und in der
gewünschten Dichte auf Kulturflaschen verteilt.
Zum Einfrieren wurden die Zellen 5 min bei 1200 pelletiert und anschließend in einer
Zelldichte zwischen 0.5 und 1*107 in Einfriermedium (50% FCS, 10% DMSO und 40%
RPMI-1640) aufgenommen. Je 1,5 ml der Zellsuspenison wurde in Kryoröhrchen aliquotiert.
Das langsame Einfrieren der Zellen wurde durch die Lagerung der Röhrchen in einem
isolierenden Isopropanol enthaltenden Gefäß gewährleistet. Nach 2-3 Wochen wurden die
Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert.
Material und Methoden
40
2.2.1.2 Zellzahl- und Viabilitätsbestimmung
Zellzahl und Viabilität wurden mittels Trypanblau Färbung bestimmt. Dieser Methode liegt
das Prinzip zu Grunde, dass lebende Zellen den Farbstoff Trypanblau nicht aufnehmen,
während tote Zellen angefärbt werden.
Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 50 µl Zellsuspension mit dem gleichen Volumen
0,8%iger Trypanblaulösung vermischt. Die Mischung aus Farbstoff und Zellen wurde dann
auf eine Neubauer-Zählkammer gegeben und jeweils die vier großen Quadranten wurden
unter dem Durchlichtmikroskop ausgezählt. Blau gefärbte Zellen wurden als tot gewertet,
ungefärbte, helle Zellen als lebend. Da jeder Quadrant einem Volumen on 0.1 mm3 (10-4ml)
entspricht, wurden die Zellzahl und Viabilität in 1ml mit folgenden Formeln berechnet.
Zellzahl/ml = gezählte Zellen /Anzahl ausgezählter Quadranten * 2 (Verdünnungsfaktor) *104
Viabilität = Anzahl lebender Zellen / Summe aller Zellen (lebende + tote) *100%
2.2.1.3 Abtrennung von toten Zellen und Debris mittels Ficoll
Zur Abtrennung von toten Zellen und Debris wurde die Ficoll Gradienten Zentrifugation
durchgeführt. Dazu wurde zunächst in 50 ml Falconröhrchen 1 Volumen Ficoll-Lösung
gegeben und diese mit dem entsprechenden Volumen Zellsuspension vorsichtig überschichtet.
Anschließend wurde für 30 min bei 2100 rpm ohne Bremse zentrifugiert. Während sich die
toten Zellen und der Debris im Pellet sammeln, reichern sich die lebenden Zellen in einer
weiß-gelben Schicht an der Phasengrenze an. Diese Zellen wurden vorsichtig mit der Pipette
entnommen, zweimal mit PBS gewaschen und dann wieder in Kultur genommen.
2.2.1.4 DAC und AraC Behandlung der Zellen
Die Substanz DAC wurde von Sigma Aldrich bezogen. Die zunächst pulverförmige Substanz
wurde in PBS gelöst, alliquotiert und als 100 µM Stock-Lösung bis zur weiteren Verwendung
bei -80°C verwart. Für jeden Puls DAC wurde ein neues Alliquot verwendet. Einmal
aufgetautes DAC wurde nicht wieder verwendet. AraC wurde von der Kliniksapotheke des
Universitätsklinikums Freiburg bereitgestellt. Die Substanz wurde bis zum Gebrauch bei
+4°C gelagert, wobei diese innerhalb von 10 Tagen verwendet wurde. Die Verdünnung auf
die zugefügte Konzentration erfolgte mit PBS.
Die DAC Behandlung der leukämischern Zelllinien erfolgte mit Konzentrationen zwischen 50
und 200 nM. Zu Beginn der Behandlung wurden die Zellen auf eine Konzentration von
2,5*105 Zellen/ml gebracht. DAC wurde in einer Konzentration von 100 µM in sterilem PBS
gelöst. Die Reagenzien wurden unter sterilen Bedingungen in die Kulturflaschen eingebracht.
Material und Methoden
41
Aufgrund der Instabilität von DAC musste die Substanz alle 24 h neu dazugegeben werden.
Die Behandlung erfolgte daher in 3 Pulsen jede 24 h. Die Zellen wurden innerhalb dieser Zeit
täglich zentrifugiert, mit frischem Medium versorgt und gezählt. Anschließend wurden die
Zellen für weitere 72 h Stunden mit Mediumwechsel in Kultur gehalten. Die Zellen wurden in
vielen Experimenten sowohl am sechsten Tag, als auch zu unterschiedlichen Zeitpunkten
während der Behandlung geerntet. In einigen Versuchen wurden Teile der Zellen bis zu 21
Tage nach Beginn der Behandlung in Kultur gehalten.
Die Ara-C Exposition erfolgte für 72 h. Die Zellen wurden auf eine Konzentration von
7.5*105/ml gebracht und einmalig mit Ara-C behandelt. 72h später wurden die Zellen gezählt
und geerntet.
Nach Bestimmung der Zellzahl und Viabilität wurden Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten
während oder nach der DAC bzw. Ara-C Behandlung geerntet. Dazu wurden 5 bis 10*106
Zellen in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und bei 4°C für 10 min bei 4500 rpm
zentrifugiert. Nach Absaugen des Mediums im Überstand wurden die Zellpellets je nach
Weiterverwendung in RLT Lyse-Puffer (Qiagen) oder als Pellet im -80°C Gefrierschrank
gelagert.
2.2.1.5 Aufarbeitung von Patientenproben - Isolation von PBMCs
Blut von AML Patienten, die mit im Rahmen der multizentrischen Phase II AML - Studie
00331 mit niedrig-dosiertem Decitabine behandelt wurden, wurde von der Uniklinik Freiburg,
Abteilung Medizin 1 bezogen. Da die Blasten abgesehen von der Abtrennung von
Granulozyten und Erythrozyten nicht weiter purifiziert wurden, wurden nur Patienten mit
einem Gehalt an Blasten im peripheren Blut von über 50%
in die Untersuchungen
eingeschlossen. Diese Patienten mit hohen Blastenanteilen im peripheren Blut wurden
gewählt, um die Verunreinigung der Blasten durch Monozyten und Lymphozyten möglichst
gering zu halten. Eine weitere Selektion der Blasten wurde auf Grund der geringen
Materialmenge nicht durchgeführt. Es wurden je zwei 10ml EDTA Röhrchen Blut vor,
während und nach der dreitägigen Behandlung abgenommen. Die peripheren mononukleären
Zellen, darunter Blasten, Monozyten und Lymphozyten, wurden, um RNA Degradation zu
vermeiden, so rasch wie möglich mittels Ficoll Dichtegradienten Zentrifugation isoliert.
Dazu wurde zunächst 20 ml Ficoll Lösung in ein steriles Schraubdeckelröhrchen gegeben.
Die 10ml EDTA Blut wurden mit 10 ml PBS Puffer verdünnt und vorsichtig auf die
Ficolllösung geschichtet. Nach Zentrifugation für 30 min bei 2100 rpm ohne Bremse
reicherten sich die mononukleären Zellen an der Phasengrenze als feine gelbliche Bande an.
Im Zellpellet befanden sich die Erythrozyten und Granulozyten. Nach Abnahme der Blasten
Material und Methoden
42
enthaltenden Interphase wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend gezählt. Je
nach Zellzahl wurden 5*106 bis 1*107 Zellen geerntet und als Zellpellet oder in RLTLysepuffer bei -80°C gelagert.
2.2.2 Allgemeine molekularbiologische Methoden
2.2.2.1 RNA Isolation
Die RNA Isolation wurde mit dem RNeasy Kit von Qiagen durchgeführt. Diese Methode
nutzt die selektiven RNA Bindungseigenschaften der Silicagel-Membran. Alle Schritte
wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Zellen wurden dabei zunächst mit dem stark
denaturierenden, Guanidin Isothiocyanat enthaltenden RLT Puffer lysiert. Durch diese
Behandlung wurden RNasen sofort effizient inaktiviert, so dass die Isolierung einer intakten
RNA gewährleistet wurde. Anschließend wurde das Zelllysat durch mehrmaliges Passieren
einer 20-Gauge Kanüle (0,9 mm Durchmesser) homogenisiert. Um die optimale
Bindungskapazität der RNA an die Säulen zu erreichen, wurde 1 Volumen 70%iges Ethanol
dazugegeben und die Zelllysate wurden auf die RNeasy Säulen geladen. Nach kurzer
Zentrifugation bei 10000 rpm lag die Gesamt-RNA an die Membran gebunden vor. Durch
weitere Waschschritte mit 700 µl Puffer RW1 sowie mit 500µl des ethanolhaltigen Puffers
RPE wurden alle anderen Bestandteile entfernt. Im letzen Schritt wurde reine RNA in 40 µl
RNAse freiem Wasser eluiert (siehe auch RNeasy Mini Protokoll für die Isolierung von
Gesamt RNA aus tierischen Zellen). Die RNA wurde anschließend bei -80°C gelagert.
2.2.2.2 DNase Verdau
Bei Verwendung der RNA für quantitative RT PCR wurde die RNA zusätzlich einer DNAse
Behandlung zugeführt, um die Kontamination mit genomischer DNA zu minimieren. Der
DNAse Verdau erfolgte dabei entweder direkt auf der RNeasy Säule mit Hilfe des RNAseFree DNase Sets von Qiagen oder nach der Eluation mit dem DNA-free Set von Ambion.
Bei der DNase Behandlung auf der Säule wurden zunächst Zelllyse, Homogenisation und
Binden der RNA and die Silicagelmembran wie oben beschrieben durchgeführt. Nach einem
Waschschritt mit 350 µl Puffer RW1, wurde die RNA für 15min bei Raumtemperatur mit
DNAseI in RDD Puffer inkubiert. Anschließend wurde mit weitern 350µl Puffer RW1
gewaschen und der Durchfluss verworfen. Für die folgenden Wachschritte und die Eluation
wurde nach dem RNeasy Standardprotokoll (siehe oben) verfahren.
Material und Methoden
43
Die DNAse Behandlung mit dem DNA-free Set von Ambion wurde in 50 µl Reaktionen
durchgeführt. Dabei wurden 0.1 Volumen 10x DNase I Puffer und 1 µl rDNase I (2U/µl) zu
der gewünschten RNA Menge dazugegeben und mit RNase freiem Wasser auf 50 µl
Reaktionsvolumen aufgefüllt. Nach einem Inkubationsschritt für 20-30 min bei 37°C wurde
0.1 Volumen DNAse Inactivation Reagens dazugegeben und für weitere 2 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Zeit wurde der Ansatz 2-3 x durch Pipettieren
gemischt. Es folgte die Zentrifugation bei 10000g für 1.5 min. Der RNA enthaltende
Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und bei -80°C gelagert. Das DNase
und DNase Inactivation Reagens enthaltende Pellet wurde verworfen.
2.2.2.3 Photometrische Bestimmung der RNA Konzentration
Die RNA Konzentration wurde mittels photometrischer Bestimmung der Absorption bei 260
nm und 280 nm ermittelt. Dieser Berechung liegt die Konvention zu Grunde, dass eine OD
bei 260 nM 40µg/ml RNA entspricht. Ein Maß für die Reinheit der Nukleinsäuren stellt der
Quotient der bei 260 nm und 280 nm gemessenen Absorption (A260 nm / A280 nm) dar. Bei reiner
RNA werden Werte zwischen 1,9 und 2.1 erreicht.
2.2.2.4 Bioanalyzer
Die Qualität und Quantität der isolierten und DNase behandelten RNA wurde mit Hilfe des
Agilent 2100 Bioanalyzers bestimmt. Die auf der Elektrophorese basierende LabChipTM
Technologie ermöglicht eine parallele Bestimmung von zwölf RNA Proben hinsichtlich ihrer
Integrität und Konzentration.. Dabei wurde der RNA 6000 Nano Chip und das RNA 6000
Nano LabChip® Kit (Agilent Technologies) verwendet. Dieses Verfahren erlaubt die
Detektion von 5-500 ng/µl RNA.
Im ersten Schritt wurde das Gel für den Chip vorbereitet. Dabei wurden 65 µl Gel Mix mit 1
µl Fluoreszenzfarbstoff durch vortexen gemischt und für 10 min bei 14000 rpm zentrifugiert.
Anschließend wurden 9 µl des Gel-Farbstoff Mix’ auf dem Chip gegeben und über Druck in
den Kapillaren verteilt. Weitere 18 µl des Gel-Farbstoff Mix wurden auf den Chip gegeben
gegeben. In die für RNA Proben und den Marker vorgesehenen Löcher wurde anschließend 5
µl Ladepuffer gegeben. Die RNA Proben und der RNA 6000 ladder (Ambion) wurden bei
70°C denaturiert und je 1 µl in die bereits mit Ladepuffer gefüllten Löcher gegeben. Der Chip
wurde dann für 1 min gevortext und anschließend im Agilent 2100 Bioanalyzer analysiert.
Dabei wird die RNA in den kleinen mit dem Gel-Farbstoff Mix beladenen Kapillaren nach
ihrer Größe aufgetrennt. Über einen Fluoreszenzdetektor werden die RNA Fragmente und
deren Laufzeiten detektiert und in Beziehung zu einer Standardprobe mit bekanntem RNA
Material und Methoden
44
Gehalt gesetzt. Der Bioanalyzer generiert aus den Daten ein Elektropherogramm sowie
gelähnliche Bilder.
Abbildung 2.1 RNA Messung im Bioanalyzer
Dargestellt ist das bei der RNA Messung im
Bioanaylzer hergestellte Elektropherogramm .
Aufgetragen ist die Fluoreszenzintensiät gegenüber
der Zeit. Die beiden Peaks repräsentieren die 28s
und 18s RNA. Das optimale Verhältnis von
28s/18s liegt bei 2. Bei Werten um 2 liegt keine
Degradation der RNA vor.
2.2.2.5 cDNA Synthese
Die cDNA Synthese erfolgte mit RNA-Startkonzentrationen zwischen 250 ng und 1µg. Dabei
wurde zunächst die RNA mit 250 ng Oligo(dT)12-18 Primern (Invitrogen) gemischt und
Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 µl hinzugefügt. Zur Hybridisierung der Primer an den
poly(A) Schwanz der mRNA wurde der Ansatz für 5 min bei 65°C inkubiert, anschließend
auf Eis platziert und kurz zentrifugiert. Im nächsten Schritt wurden 2 µl 10 mM dNTP Mix
(Fermentas), 4µl 5x First Strand Puffer und 2 µl 0.1 M DTT (beide Invitrogen) hinzugefügt.
Optional wurde noch 1 µl RNAsin (Promega) zu dem Ansatz dazugegeben. Nach Inkubation
für 2 min bei 25°C wurde 1 µl Superscript II hinzugefügt. Nach weiteren Inkubationsschritten
für 10 min bei 25°C, 50 min bei 42°C und 15 min bei 70°C wurde die gewonnene cDNA bei 20°C gelagert. Als Negativkontrolle zum Ausschluss einer Kontamination mit genomischer
DNA wurde für jeden Ansatz eine negative RT-Reaktion durchgeführt. Dabei wurden alle
Schritte wie oben beschrieben durchgeführt, anstatt des Enzyms Superscript II wurde 1 µl H20
dem Reaktionsansatz zugefügt.
2.2.2.6 Proteinisolation
Die Isolation von kompletten Zelllysaten erfolgte mit dem Nuclear Extract Kit (Active
Motif). Dabei wurden zwischen 3x106 – 1x107 Zellen in der entsprechenden Menge des
vollständigen
Lyse-Puffers
(bestehend
aus
Lyse-Puffer
AM1,
10mM
DDT
und
Proteaseinhibitorcocktail) resuspendiert (s. Tabelle) und für 10 s gevortext. Nach einer 10
minütigen Inkubationsphase auf Eis wurden die Lysate für weitere 30 s gevortext und
anschließend für 20 min bei 13 000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand mit dem
Material und Methoden
45
Zelllextrakt und den darin enthaltenen Proteinen wurde abgenommen und das Pellet
verworfen. Die Proteinlysate wurden alliquotiert und bei -80°C gelagert.
3,2 x 106 Zellen
5 x 106 Zellen
1 x 107 Zellen
Lysis Puffer AM1
89 µl
133, 5 µl
267 µl
10mM DTT
10 µl
15 µl
30 µl
Protease Inh. Cocktail
1 µl
1,5 µl
3 µl
Gesamtmenge
100 µl
150 µl
300 µl
Komponenten und Präperation des vollständigen Lyse-Puffers
2.2.2.7 Proteinquantifizierung mittels Bradford Assay
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration in den verschiedenen Zelllysaten wurde der
Bradford Assay verwendet. Der Test beruht auf der Bindung des Farbstoffes Coomassie
Brilliant Blue G-250 an Proteine. Durch die Bindung wird das Absorptionsmaximum des
Farbstoffes von 465 auf 595 nm verschoben. Durch die Messung der Absorption bei 595 nm
im Spektrometer und dem Vergleich mit einer Eichkurve kann die Proteinkonzentration der
Lösung
bestimmt werden. Zur Generierung einer Standardkurve mit bekannten
Proteinmengen wurde eine 100 mM Stocklösung von BSA (Bovines Serum Albumin)
verwendet.
Die Konzentrationsbestimmung erfolgte in 96-Loch Mikrotiterplatten. Dabei wurden zunächst
je 200 µl PBS (1x) in die Löcher vorgelegt und 1 µl Proteinlysat hinzu gegeben. Alle
Proteinlysate wurden als Triplikate gemessen.
2.2.3 Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR)
2.2.3.1 Molekularer Mechanismus
Das Prinzip der quantitativen PCR beruht auf der herkömmlichen Polymerasekettenreaktion
und bietet zusätzlich die Möglichkeit der Quantifizierung durch Fluoreszenzmessungen
während der PCR Zyklen. Da die Fluoreszenzintensität proportional zur DNA Menge ansteigt
ist eine Quantifizierung möglich. Eine elektrophoretische Auftrennung der Fragmente ist
nicht notwendig.
Material und Methoden
46
Abbildung 2.1: Funktionsprinzip der quantitativen PCR. Erläuterungen siehe Text. Aus Applied
Biosystems „Essentials of Real Time PCR“
Eine weit verbreitete Möglichkeit zur Quantifizierung stellt der Mechanismus des
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) dar. Ein durch eine Lichtquelle angeregtes
Donor-Fluorochrom (Reporter) gibt einen Teil seiner Energie an ein in der Nähe befindliches
Akzeptor-Fluorochrom (Quencher) ab. Nimmt der Abstand der Fluorochrome zu, so nimmt
das Fluoreszenzsignal des Akzeptors ab, während das des Donors zunimmt. Eine häufige
Anwendung dieses Mechanismus stellen TaqMan® - Sonden dar. Diese bestehen aus
ungefähr zwanzig Basen, die komplementär zu einer zwischen den beiden PCR Primern
gelegenen Nukleotidsequenz des zu untersuchenden Gens sind. Diese genspezifische Sonde
wird an einem Ende mit dem Quencher- und am anderen Ende mit einem Reporter–
Fluoreszenzfarbstoff (z.B. FAM und TAMRA) markiert. Die Fluoreszenz des Reporter
Fluorophor wird bei solchen intakten Sonden durch den Quencher unterdrückt. Während der
Annealing-Phase binden sowohl die Primer als auch die Sonde an den komplementären DNA
Strang. Die Taq-Polymerase, die neben der Fähigkeit zur Neusynthese des Tochterstranges
zusätzlich eine Exonuklease-Aktivität besitzt, baut die Sonde während der Synthese des
Gegenstranges ab. Durch diese Spaltung der Sonde entfernen sich Quencher und Reporter
voneinander, die steigende Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes wird gemessen.
Material und Methoden
47
2.2.3.2 Durchführung
Die quantitative Polymerasekettenreaktion aus cDNA Templates wurde im ABI-Prism-7700Cycler (Applied Biosystems) durchgeführt. Der ABI-Prism-7700-Cycler arbeitet mit 96Loch-PCR-Mikrotiterplatten. Ein optischer Heizdeckel gewährleistet die Temperierung der
Proben. Die Fluoreszenzanregung erfolgt mittels eines Argon-Lasers. Über jedem
Reaktionsgefäß befinden sich Lichtleiter, die die Energie des Lasers in die Wells lenkt sowie
die Fluoreszenz aufnimmt. Das emittierte Licht wird über durch eine CCD Kamera (charged
coupled device) aufgezeichnet und kann somit quantifiziert werden.
Zur relativen Quantifizierung wurden TaqMan® Sonden (Operon/Quiagen) verwendet, die
am 5’-Ende mit dem Reporter-Farbstoff FAM und im Bereich des 3’-Endes mit dem
Quencher Farbstoff TAMRA markiert wurden. Die Primer- und Probesequenzen wurden aus
folgenden Publikationen übernommen: NY-ESO-1, MAGEA1,MAGEA3 (Riker et al., 2000).
Primer und TaqMan Probes für das Myeloblastin Gen wurden mit Hilfe der Primer Express
Software 1.5 (Applied Biosystems) entworfen, die für GAPDH entsprechen den von Applied
Biosystems entworfenen Sequenzen.
Die Reaktionen wurden in 25 µl Ansätzen in 96-Loch-Mikrotiterplatten (Abgene)
durchgeführt. Die gewonnene cDNA wurde in einer Endkonzentration von 100-500ng
verwendet.
PCR-Reaktionskomponenten
Endkonzentration
H2O
Auf 25 µl
ABSOLUTE QPCR ROX Mix
1x
Primer 1 (5-15 pmol/µl)
0,4 µM
Primer 2 (5-15 pmol/µl)
0,4 µM
TaqMan® Probe
0,15 µM
Template: cDNA
10-50 ng
Für die relative Quantifizierung wurden Verdünnungsreihen von cDNA der U266 Zelllinie
(1:1, 1:10, 1:100, 1:1000) hergestellt. Alle Proben und Standards wurden als Duplikate
gemessen. Als Negativkontrollen wurden sowohl Ansätze ohne Template zum Ausschluss
eine Kontamination des Reaktionsansatzes, als auch minus RT-Reaktionen (ohne Reverse
Transkriptase) zum Ausschluss einer Amplifikation von genomischer DNA verwendet. Nach
Material und Methoden
48
Zugabe aller Reaktionskomponenten wurden die Platten mit selbstklebenden optischen Folien
(Abgene) verschlossen.
Die Reaktionen wurden im ABI-Prism-7700-Cycler von Applied Biosystems mit 40-45
Zyklen unter den in der Tabelle aufgeführten Bedingungen durchgeführt.
Schritt
Temperatur °C
Zeit
Zyklen
1. Enzymaktivierung
95°C
15 min
1
2. Denaturierung
95°C
15 sec
3. Annealing/Extension
60°C
1 min
40 - 45
2.2.3.3 Relative Quantifizierung
Die während der PCR aufgezeichnete Fluoreszenzmenge wird im so genannten Amplification
Plot über die Zykluszahl aufgetragen. Diese Darstellung dient als Grundlage für die
quantitative Messung von Nukleinsäuren. Da es in den ersten Zyklen der PCR nur zu einem
geringen
Anstieg
des
Fluoreszenzsignals
kommt
und
dieses
im
Bereich
der
Hintergrundfluoreszenz liegt, wird eine „baseline“ festgelegt. Ein Anstieg der Fluoreszenz
über die baseline zeigt die Detektion des sich anreichernden Produktes an. Wichtig für die
weitere Auswertung ist die Festlegung eines Schwellenwertes (threshold). Dieser
Schwellenwert
ist
eine
definierte
Fluoreszenzintensität,
die
deutlich
über
der
Hintergrundfluoreszenz des ungebundenen Farbstoffes liegt. Die threshold Linie wird
innerhalb der exponentiellen Amplifikationsphase gelegt. Bei einer 100%igen PCR Effizienz
erfolgt in dieser exponentiellen Phase die exakte Verdopplung des Produktes mit jedem
einzelnen PCR Zyklus. Im Gegensatz zur später eintretenden Plateauphase können in diesem
Bereich Unterschiede in der RNA Ausgangsmenge des Zielgens in den verschiedenen PCR
Reaktionen festgestellt werden. Die Zyklusnummer, bei der dieser Schwellenwert in den
Reaktionsansätzen erreicht wird, wird als threshold cycle (CT) bezeichnet. Dieser CT Wert ist
für jede einzelne Probe charakteristisch und dient als Grundlage für die weitere
Quantifizierung.
Material und Methoden
49
Plateauphase
CT-Wert 1:100
1:10
Threshold
1:100
1:1000
Exponentielle
Amplifikationsphase
Hintergrundfluoreszenz
Abbildung
2.2:
Amplification
Plot
einer
cDNA
Verdünnungsreihe.
Aufgetragen
ist
die
Fluoreszenzintensität gegen die Zykluszahl. Erläuterungen siehe Text.
Zur Quantifizierung der unterschiedlichen Expressionslevel wurde die Menge des
untersuchten Gens nach Behandlung der Zellen mit der Menge des Zielgens in der
unbehandelten Kontrolle verglichen. Als interne Kontrolle wurde die Menge von einem
„housekeeping“ Gen (GAPDH) in beiden Proben mitbestimmt, um sicher zu gehen, dass die
gleiche Menge an cDNA analysiert wurde. Die Bedingungen, die an solche housekeeping
Gene gestellt werden, sind die konstante Expression in den Zellen, die in ihrer Stärke nicht
durch die Behandlung der Zellen beeinträchtigt wird.
Relative Quantifizierung mittels Standardkurvenmethode
Zur relativen Quantifizierung wurde die Standardkurvenmethode gewählt. Zur Generierung
der Standardkurve wurde eine Verdünnungsreihe (1:1, 1:10, 1:100, 1:1000) aus cDNA der
Zelllinie U266 gewählt. Den einzelnen Verdünngussstufen wurden entsprechende relative
RNA Mengen in der Ausgangsmenge zugeschrieben. Da eine lineare, umgekehrt
proportionale Beziehung zwischen dem Logarithmus der eingesetzten Menge und dem CTWert besteht, kann aus den festgelegten Ausgangsmengen der Standardproben eine
Standardkurve generiert werden. Der Logarithmus der Ausgangsmenge wird gegen den CT
aufgetragen. Nach Umformung der Gradengleichung y = mx + b kann für jede unbekannte
Probe der Logarithmus der Kopienzahl bestimmt werden.
Material und Methoden
50
x = Logarithmus der Kopienzahl
CT − b
x=
m
CT = Threshold Cycle (y)
b =Y-Achsenabschnitt
m = Steigung
CT
Standardkurve
y = -3,11x + 29,57
35
30
25
20
15
10
5
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
log ng
Abbildung 2.3 Standardkurve aus einer cDNA Verdünnungreihe (1:1, 1:10, 1:100) mit den relativen RNA
Mengen 100, 10 und 1ng. Aufgetragen ist der CT-Wert gegen den Logarithmus der Ausgangsmenge. Aus
dem für eine unbekannte Probe gemessenem CT-Wert kann anhand der Gradengleichung der Logarithmus
der Ausgangsmenge bestimmt werden. Mit Hilfe der Exponentialfunktion 10xkann die Ausgangsmenge der
Probe berechnet werden. Liegt der CT beispielsweise bei 26, errechnet sich für den Logarithmus der
Kopienzahl ein Wert von 1,15. Die relative Ausgangsmenge der RNA liegt bei 14ng.
Mit Hilfe der Exponentialfunktion 10 x kann die Ausgangsmenge der Probe berechnet
werden. Eine solche Standardkurve und die daraus errechneten Ausgangsmengen der
unbekannten Proben wurde sowohl für das Zielgen, als auch für das housekeeping Gen
generiert. Da jeder PCR Ansatz als Duplikat durchgeführt wurde, erfolgte anschließend die
Bestimmung des Mittelwertes der Kopienanzahl jeder Probe.
∑ Duplikate
2
Im nächsten Schritt, der Normalisierung, wurde die errechneten Kopienzahlen des Targetgens
durch die Kopienzahl der internen Referenz geteilt.
Zie lg ennorm =
Kopienzahl Zie lg en
Kopienzahl Re ferenzgen
Material und Methoden
51
Dieser Wert beschreibt die relative RNA-Menge des untersuchten Gens im Vergleich zum
housekeeping Gen. Eine relative RNA Menge von 0,5 bedeutet beispielsweise, dass die
Expression des untersuchten Gens bei 50% der Expressionsstärke des housekeeping Gens
liegt.
Um die Änderung der Expression in Zahlenwerte fassen zu können, wurde die Expression des
normalisierten Zielgens in einem weiteren Rechenschritt zu einem Referenzwert in Bezug
gesetzt. Als Referenzwert diente die Expression in unbehandelten Kontrollzellen bzw.
Patientenmaterial vor Behandlung mit Decitabine.
Expressionänderung =
Zie lg ennorm
Re ferenzwert norm
Relative Quantifizierung mittels vergleichender CT Methode
Alternativ
zur
Standardkurvenmethode
wurde
die
∆∆CT
Methode
zur
relativen
Quantifizierung verwendet. Wichtig dabei ist die Berechnung der Effizienz der PCR
Reaktionen für das Ziel- und das housekeeping Gen. Die Effizienz lässt sich ebenfalls aus der
Steigung m der Standardkurve berechnen.
E = 10 −1 / m − 1
Die beispielhaft gezeigte Standardkurve (s. Abblidung 2.3) zeigt eine Steigung von -3,11. Für
die Effizienz der zugehörigen PCR Reaktion errechnet sich somit ein Wert von 1,09, also von
ungefähr 100%. Nur bei gleicher Effizienz von Zielgen und housekeeping Gen kann die
relative Quantifizierung mittels vergleichender CT Methode durchgeführt werden. Dabei wird
die Expression als n-fache Expression im Vergleich zu den Kontrollzellen angegeben. Im
ersten Schritt wird für jedes Duplikat des PCR-Ansatzes der CT-Mittelwert bestimmt.
CT 1+CT 2
2
Im Weiteren wird der gemittelte CT-Wert des housekeeping Gens von dem des Zielgens
subtrahiert. Es resultiert der ∆CT Wert.
∆CT = CT Zie lg en−CT Re ferenzgen
Material und Methoden
52
Im nächsten Schritt wird zur Berechnung des ∆∆CT- Wertes der ∆CT der Kontrollzellen von
dem der behandelten Proben abgezogen.
∆∆CT = ∆CTbehandelt − ∆CT Kontrollzellen
Um die relative Expressionsänderung im Vergleich zu den Kontrollzellen als n-fache
Expression darzustellen, folgt ein weiterer Rechenschritt.
Expressionsänderung = 2 − ∆∆CT
Berechnung der Standardabweichung
Jede PCR wurde mindestens dreimal wiederholt und die Ergebnisse zur Darstellung gemittelt.
Die Standardabweichung für jeden Datenpunkt wurde mit Hilfe der Microsoft Excel Funktion
„STABW“ generiert. Dabei wird die Standardabweichung ausgehend von einer Stichprobe
geschätzt Die Standardabweichung ist ein Maß dafür, wie weit die jeweiligen Werte um den
Mittelwert streuen. STABW verwendet die folgende Formel:
n ∑ x 2 − (∑ x) 2
n(n − 1)
2.2.4 Western Blot
Zur Detektion der NY-ESO-1 Protein Expression wurde der Western Blot gewählt. Dabei
werden die Proteine zunächst elektrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt und auf eine
Nitrozellulosemembran transferiert. Anschließend erfolgt die
Inkubation mit dem
antigenspezifischen Primärantikörper, der an ein bestimmtes Epitop des gesuchten Proteins
bindet. Durch die Zugabe des Konjugat gekoppelten sekundären Antikörpers, der den an Fc
Teil des spezifischen Antikörpers bindet, erfolgt die Detektion.
Die Versuchsdurchführung erfolgte mit dem NuPAGE® Elektrophoresis System (Invitrogen)
und der XCell SureLockTM Mini-Cell entsprechend des Standardprotokolls.
Material und Methoden
53
2.2.4.1 Vorbereitung der Proben
Für die NY-ESO-1 Protein Detektion mittels Western Blot wurde zwischen 20 und 50 µg
Gesamtprotein verwendet. Nach Zugabe von NuPAGE® LDS Sample Puffer (4x) und
NuPAGE® Reducing Agent (10x) wurden die Proben nach 10 minütiger Inkubation bei 70°C
und anschließender Zentrifugation bei 13.000rpm und 4°C für 5 min in reduzierter Form
elektrophoretisch aufgetrennt.
Reagenz
Menge
Gesamtprotein ( 20-50 µg)
x
NuPAGE® LDS Sample Puffer (4x)
6,25 µl
®
NuPAGE Reducing Agent (10x)
1,25 µl
H2O auf 25µl
x
Gesamtvolumen
25 µl
2.2.4.2 Elektrophoretische Auftrennung im Gel
Zur elektrophoretischen Auftrennung der Proteine nach ihrer Größe wurden die NuPAGE® 412% Bis-Tris Gele in Kombination mit dem NuPAGE® MES SDS Running Puffer verwendet.
Dazu wurden zunächst 1000 ml (1x) NuPAGE® MES SDS Running Puffer vorbereitet.
NuPAGE® MES SDS Running Puffer (20x)
50 ml
Destilliertes Wasser
950 ml
Gesamtvolumen
1000 ml
Anschließend wurden die Gele aus der Plastikeinschweißung entfernt und mit destilliertem
Wasser gewaschen. Nach vorsichtiger Herausnahme des Taschenkamms wurden die Taschen
mit Running Puffer gespült und die Gele in die XCell SureLockTM Mini-Cell Kammer
eingesetzt. 200 ml NuPAGE® MES SDS Running Puffer (1x) wurden mit 50 µl Antioxidant
(Invitrogen) versetzt und in die mittlere, zwischen den beiden Gelen gelegene Kammer
gefüllt, so dass die Geltaschen vollständig bedeckt waren. Durch die Zugabe des Antioxidants
wurden die Proben im reduzierten Zustand und gehalten und die Reoxidation der Proben
während der Elektrophorese verhindert. Je nach verwendetem Gel wurden 20 bis 25 µl der
vorbereiteten Proben aufgetragen. 5 µl des SeeBluePlus2 Gel Markers (Invitrogen) dienten als
Molekulargewichtsmarker. Nach Füllen der äußeren Kammer mit 600 ml Running Puffer
Material und Methoden
54
wurden die Gele für 1 – 2 Stunden bei 150 V laufen gelassen. Nach vollständiger
Elektrophorese wurden die Gele aus der Plastikhülle herausgelöst und dem Blotten zugeführt.
2.2.4.3 Transfer von Proteinen auf Filtermembranen ( „blotting“ )
Für das „Blotten“ wurde zunächst der (1x) NuPAGE® Transfer Puffer vorbereitet. Bei dem
gleichzeitigen blotting von 2 Gelen wurden 200 ml Methanol hinzugefügt um den effizienten
Transfer beider Gele zu gewährleisten.
NuPAGE® Transfer Puffer (20x)
50 ml
NuPAGE® Antioxidant
1 ml
Methanol
100- 200 ml
Destilliertes Wasser
750- 850 ml
Gesamtvolumen
1000 ml
Die zugehörigen blotting Pads wurden solange in Transfer Puffer gelegt, bis sie vollständig
mit Puffer gefüllt und keine Luftblasen mehr vorhanden waren. Das auf Gelgröße
geschnittene Filterpapier wurde ebenfalls in Transfer Puffer eingeweicht.
Die
Nitrozellulosemembranen (Hypobond-P+, Amersham) wurden für 30 Sekunden in Methanol
aktiviert, anschließend wurden die blotting Pads, Filterpapiere, Gel(e) und Membranen(en)
nach der im Protokoll beschriebenen Standardanordnung in die blotting - Kassette
geschichtet.
Als wichtig für die Gewährleistung des vollständigen Transfers zeigte sich vor allem die
Vermeidung von Luftblasen in der Anordnung. Nach Befestigung der blotting – Kassette in
der NuPAGE® Kammer wurde sowohl die Kassette, als auch die äußere Kammer mit Transfer
Puffer aufgefüllt und die ganze Kammer in eine Wanne mit Eis gestellt, um übermäßige
Hitzeentwicklung zu unterbinden und eine sauberen Transfer zu gewährleisten. Der Transfer
erfolgte bei 30 V für 1 ½ Stunden.
2.2.4.4 NY-ESO-1 Protein Detektion
Im Anschluss an den Transfer wurde die Membran für 1 Stunde in Blocking Lösung (5%
Magermilchpulver in TBST) bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Das
Magermilchpulver lagert sich an die Membran an, blockiert die freien Bindungsstellen und
verhindert so ein unspezifisches Binden des zur Detektion verwendeten Antikörpers.
Anschließend wurde die Membran anhand der Orientierung durch den SeeBluePlus2 Gel
Material und Methoden
55
Marker geschnitten, um sowohl das bei 22 kDa liegende NY-ESO-1 Protein, als auch das 44
kDa große β-Actin, das als Ladekontrolle diente, detektieren zu können.
Der die Proteine mit niedrigem Molekulargewicht enthaltende untere Teil der Membran
wurde in einem Ansatz aus 5 ml Blocking Lösung und dem gegen NY-ESO-1 gerichteten
monoklonalen Maus IgG Antikörper E976 (Zymed) in einer Verdünnung von 1:500
(entspricht 10 µl auf 5 ml) über Nacht bei 4°C auf dem Schüttler inkubiert. Der β-Actin
enthaltende obere Abschnitt der Membran wurde in einem Ansatz aus 10 ml Blocking Lösung
mit dem monoklonalen Maus Anti-β-Actin Antikörper (Sigma) in einer Verdünnung von 1 :
40.000 unter den gleichen Bedingungen inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die Antikörper - Blocking - Lösung zur Wiederverwendung
asserviert und die Membranen wurden in einem 30 minütigem Waschritt (1x für 15min und
3x für 5min) mit TBST gewaschen, um schwächer haftende, unspezifisch gebundene
Antikörper von der Membran zu entfernen. Anschließend wurden die Membranen mit dem
gegen den Fc-Teil des Maus Antikörper gerichteten, Meerrettichperoxidase (HRP
horseradish) gekoppelten, sekundären Antikörper (Sigma) in einer Konzentration von 1:20.000
in Blocking Lösung für 1 h bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Nach weiteren
Waschschritten mit TBST (1x für 15 min, 3x für je 5 min), in denen der überschüssige nicht
gebundene Antikörper entfernt wurde, konnte der an den Fc Teil des NY-ESO-1 spezifischen
Antikörper gebundene Zweitantikörper mit den ECL Plus Reagenzien (Amersham) detektiert
werden. Die Detektion beruht auf der bei der Reaktion von Lumigen PS-3 mit
Meerrettichperoxidase entstehenden Chemilumineszenz. Die Lösungen A und B des ECL Kit
wurden im Verhältnis 40:1 gemischt, auf die Membran gegeben, so dass diese vollständig mit
Detektionslösung bedeckt wurde. Nach einer Inkubationszeit von 5min wurde die Membran
in Haushaltsfolie unter Vermeidung von Luftblasen und Falten eingeschlagen, in eine
Filmkassette gelegt, mit einem Hyperfilm (Amersham) bedeckt und der Film nach
unterschiedlichen Belichtungszeiten entwickelt (Entwickler X-Omat M35).
HRP
2. Antikörper
+
Luminol ECL
Abbildung 2.4. Funktionsprinzip
der
Licht
Proteindetektion
Western Blot.
Erläuterungen siehe Text
1. Antikörper
Detektion auf Film
Antigen
Membran
mittels
Material und Methoden
56
2.2.5 Expressionsanalyse mittels DNA-Microarray
Für eine genomweite Genexpressionsanalyse im Zuge der DAC Behandlung von in vitro
behandelten Zellen und primären myeloischen Blasten nach DAC Exposition wurden RNA
Microarryanalysen entsprechend der Affymetrix Technologie mit dem HG-U133plus
GeneChips durchgeführt. Das HG-U133plus Set umfasst rund 54.000 Probe Sets mit denen
47.400 Gentranskripte detektiert werden können.
Die RNA-Hybridisierungsarrays bieten so die Möglichkeit mehrere tausend Gene parallel zu
untersuchen. Auf den Arrays befinden sich an definierten Positionen genspezifische
Oligonukleotide. Diese dienen als Sonden und hybridisieren an komplementären RNA
Fragmenten. Die zu untersuchende RNA wird dabei in mehreren Reaktionsschritten in cRNA
umgeschrieben, mit Biotin markiert und auf die Microarrays hybridisiert. Hierbei binden die
markierten cRNA Fragmente an ihren komplementären Gegenpart auf dem Array. Die nicht
gebundenen Fragmente werden durch Waschen entfernt. Anschließend werden die Arrays mit
Streptavidin-Phycoerythrin gefärbt und das Fluoreszenzsignal jeder Position des Arrays
mittels eines Scanners ausgelesen. Hintergrund für den Vergleich der Genexpression stellt
die Annahme dar, dass die Menge markierter cRNA und das dadurch detektierte Signal
proportional zur Expressionsstärke des Gens ist. Hierbei können jedoch nur relative
Transkriptionsniveaus und keine absoluten Mengen miteinander verglichen werden.
Die experimentelle Durchführung der Microarrays sowie die Auswertung der Messdaten
wurde im Rahmen einer Kooperation im Labor von Herrn Dr. Dietmar Pfeifer (Medizin I,
Uniklinik Freiburg) durchgeführt.
2.2.5.1 Vorbereitung der Proben
Ethanol-Präzipitation der RNA
Nach Isolation der Gesamt RNA aus Zelllinien und primären myeloischen Blasten von AML
Patienten vor und nach DAC Behandlung mit dem RNeasy Mini Kit (Quiagen) und
anschließender Qualitätskontrolle im Bioanalyzer (siehe Punkt 2.2.2.1 und 2.2.2.4) wurde
ausgehend von 1-5 µg RNA die cDNA Synthese durchgeführt. Da die RNA Menge in einem
Volumen von maximal 10 µl vorliegen musste und die RNA Konzentration im Anschluss and
die Isolation meist zu gering war, wurde zunächst eine Ethanol-Präzipitation durchgeführt,
um die gewünschte RNA Konzentration zu erreichen. Zu der in DEPC-Wasser gelösten RNA
wurde 1/10 Volumen 3M NaOAc (pH 5,2), 2,5 Volumenteile Ethanol und 0,5 µl Glycogen
hinzugegeben und gemischt. Nach einer Inkubation für 1h bei -20°C wurde die Probe für 20
min bei 4°C und 12000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend zweimal mit 500 µl
Material und Methoden
57
kaltem 80% Ethanol gewaschen und bei 12000 x g und 4°C für weitere 5min zentrifugiert.
Nach Lufttrocknen des Pellets wurde die RNA in 10 µl DEPC-Wasser resuspendiert und die
Konzentration photometrisch bestimmt (s. 2.2.2.3).
Erst-Strang cDNA Synthese
Nach der Einstellung der RNA Konzentration, wurden 2 µl T7-Oligo(dT) Primer (50 µM)
hinzugegeben. Um ein Endvolumen von 12 µl zu erreichen wurde gegebenenfalls RNAse
freies Wasser hinzugefügt. Der Ansatz wurde für 10min bei 70°C inkubiert, für 2 min auf Eis
gestellt und anschließend 5 s zentrifugiert. Für die Erststrangsynthese, in der an die
vorhandene RNA ein komplementärer DNA Strang synthetisiert wird, wurde zu der mit dem
Primer hybridisierten RNA 4 µl 1stStrand Puffer (5x), 2 µl 0,1 M DTT (Endkonzentration
0,01 M) und 1 µl 10 mM dNTP (Endkonzentration 0,5 mM) gegeben. Es folgten die
Inkubation des Ansatzes für 2 min bei 42°C, Zugabe von 1µl der Reversen Transkriptase
SuperScript II und Inkubation bei 42°C für 60 min. Als Konsequenz der Hybridisierung mit
dem T7-Oligo(dT) Primern trugen alle gebildeten cDNA Proben den Bakteriophagen-T7RNA-Promotor.
Zweit-Strang cDNA Synthese
In der Zweit-Strang Synthese wird aus der cDNA ein DNA-Doppelstrang gebildet, wobei der
ursprüngliche RNA Strang abgebaut wird. Zunächst wurde der Zweit-Strang Master Mix aus
folgenden Komponenten hergestellt.
Reaktionskomponenten
Volumen
RNase freies Wasser
91 µl
2nd Strand Reaction Mix (5x)
30 µl
dNTP, 10mM
3 µl
E.coli DNA Ligase
1 µl
E.coli DNA Polymerase I
4 µl
RNase H
1 µl
Endvolumen
130 µl
Material und Methoden
58
Der vollständige Mix wurden zu dem Reaktionsansatz der Erst-Strang Synthese gegeben und
für 2 Stunden bei 16°C inkubiert. Anschließend wurden 2 µl T4 DNA Polymerase zu jedem
Ansatz gegeben, für weitere 5 Minuten bei 16°C inkubiert und die Reaktion durch Zugabe
von 10 µl 0,5M EDTA gestoppt.
Aufreinigung der doppelsträngigen DNA
Die aus der Zweit-Strang Synthese gewonnene doppelsträngige cDNA wurde mit Hilfe des
Cleanup Module (Affymetrix) aufgereinigt. Dabei wurden 600 µl cDNA Binding Puffer zu
dem Ansatz hinzu gegeben. Es folgte die Zentrifugation für 1min bei 10.000rpm in speziellen
Aufreinigungssäulen (cDNA Cleanup Spin Columns), wobei die DNA an die Säulen
gebunden wurde. Nach einigen Waschschritten wurde die gereinigte DNA mit 14 µl cDNA
Elution Puffer von der Säule eluiert.
In vitro Transkription
Bei der nun folgenden in-vitro Transkription (IVT) wurde die doppelsträngige DNA durch die
T7-RNA-Polymerase wieder in RNA umgeschrieben. Dabei wurden neben unmarkierten auch
mit Biotin gekoppelte Nukleotide verwendet, die später zur Visualisierung der an die Sonden
gebundenen cRNA-Moleküle dienen. Im Gegensatz zur cDNA Synthese kommt es hierbei zu
einer 100 bis 200fachen Amplifikation, da ein cDNA-Strang mehrere Male als Matrize dienen
kann.
Die IVT Reaktion wurde mit dem GeneChip IVT Labeling Kit durchgeführt. Der zur
Transkription erforderliche Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:
Reaktionskomponenten
Volumen
Template cDNA
12 µl
RNase freies Wasser
8 µl
IVT Labeling Puffer (10x)
4 µl
IVT Labeling NTP Mix
12 µl
IVT Labeling Enzym Mix
4 µl
Endvolumen
40 µl
Nach Inkubation für 16 Stunden bei 37°C wurden die Proben entweder gleich weiter
verarbeitet oder bei -70°C gelagert.
Material und Methoden
59
Aufreinigung der IVT Proben
Zur Aufreinigung der Biotin-markierten cRNA wurde das entsprechende Kit von Affymetrix
verwendet. 60 µl RNase freies Wasser, 350 µl IVT cRNA Binding Puffer und 250 µl Ethanol
wurden zu der cRNA gegeben und der Ansatz Aufreinigungssäulen zugeführt. Nach
Waschschritten erfolgte die Eluation in zwei Schritten mit insgesamt 21µl RNase freiem
Wasser.
Quantifizierung und Qualitätskontrolle der cRNA
Die Quantifizierung der cRNA erfolgte mittels photometrischer Messung (s. 2.2.2.3). Zur
Qualitätskontrolle der cRNA wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt.
Fragmentierung der cRNA
Um eine bessere Hybridisierung auf dem Chip zu erreichen, muss die markierte RNA
zunächst fragmentiert werden. Dabei entstehen RNA Stücke in einer Größe zwischen 35 und
200 Basenpaaren. Für die Fragmentierung wurden 20 µg cRNA in 6 µl 5fach
Fragmentierungs- Puffer aufgenommen, RNase freies Wasser bis auf ein Endvolumen von 30
µl hinzu gegeben und der Ansatz für 35 min bei 94°C inkubiert. Anschließend wurde die
Probe für 10 s zentrifugiert und auf Eis aufbewahrt. Der Erfolg der Fragmentierung wurde
durch eine Gelelektrophorese (Bioanalyzer) überprüft.
2.2.5.2 Hybridisierung der Proben
Für die Analyse der Genexpression wurde der HG-U133plus Gen Chip verwendet. Die auf
den Chips immobilisierten Oligonukleotide weisen eine Länge von 25 Basen auf. Da diese
Sondenlänge nicht in jedem Fall eine hochspezifische Hybridisierung der Ziel-RNA zulässt,
werden für jedes zu detektierende Gen 22 verschiedene Sonden, in ihrer Gesamtheit als
Sondensatz bezeichnet, verwendet. Die Sonden sind so ausgewählt, dass sie sich möglichst
nicht überlappen und in unterschiedlichen Bereichen der mRNA Sequenz zu liegen kommen.
Die Hälfte dieser Sonden stellen die genspezifischen Sonden (perfect match probe, PM) dar.
Zu jeder dieser Sonden gibt es genau eine Sonde, bei der an einer Position eine Base
ausgetauscht wurde (mismatch probe, MM). Hintergrundsignale und unspezifische Bindungen
können so erkannt und in die Berechnung mit einbezogen werden.
Hybridisierung
Zunächst wurden der (12x) MES Puffer und (2x) Hybridisierungspuffer hergestellt (siehe
2.1.3.2 Standardlösungen und Puffer) und bei 4°C gelagert.
Material und Methoden
60
Nach Herstellung der Hybridisierungslösung (s. Tabelle) wurde der Ansatz für 5min bei 99°C
und 45°C für 10 min erhitzt. Vor der Inkubation auf den Arrays wurde die
Hybridisierungslösung für 5 min bei maximaler Drehzahl zentrifugiert, um unlösliche Partikel
zu sedimentieren.
Reaktionskomponenten
Volumen
Endkonzentration
Fragmentierte cRNA
30 µl
0,05 µg/µl
Control Oligonukleotide B2 (3nM)
5 µl
50 pM
20x
Eukaryotic
Hybridization 15 µl
1.5 , 5, 25 und 100 pM
Controls (bioB, bioC, bioD, cre)
2x Hybridisierungspuffer
150 µl
1x
DMSO
30 µl
10%
H2O
70 µl
Endvolumen
300 µl
Die Arrays wurden auf Raumtemperatur erwärmt, mit 200 µl (1x) Hybridisierungspuffer
gefüllt und für 10 min bei 45°C unter Rotation präinkubiert. Nach Entnahme des Puffers
wurden die Arrays mit 200µl Hybridisierungslösung befüllt und für 16 h bei 45°C im
Hybridisierungsofen inkubiert.
2.2.5.3 Waschen und Färben der Microarrays
Nach der Inkubation wurde die Hybridisierungslösung entnommen, die Arrays mit 200µl des
Non-Stringent-Wash Puffer A befüllt und bis zur weiteren Verarbeitung im Dunklen
aufbewahrt. Des Weiteren wurde der Stringent Wash Puffer B und der (2x) Stain Puffer
vorbereitet (s. 2.1.3.2 Standardlösungen und Puffer).
Für die Herstellung des SAPE-Lösung (Streptavidin Phycoerythrin) zum Färben der Arrays
wurden zu 600 µl des Stain Puffer (2x), 48 µl BSA (50mg/ml), 12 µl Streptavidin
Phyocerythrin (1mg/ml) und 540 µl H2O gegeben. Weiterhin wurde die Antikörperlösung aus
folgenden Komponenten vorbereitet: 300 µl Stain Puffer (2x), 24 µl BSA (50 mg/ml), 6 µl
Goat IgG Stock (10 mg/ml), 3,6 µl biotinylierter Antikörper (0,5 mg/ml) und 266,4 µl H20.
In der Fluidics Station 450 der Affymetrix Microarray Suite wurden die Arrays automatisch
mit den Lösungen Non-Stringent-Wash A und Stringent-Wash B gewaschen und mit der
SAPE- und Antikörperlösung gefärbt (Programm EukGE-WS2v4). Durch die zweite Färbung
mit biotinyliertem Anti-Streptavidin-Antikörper und erneuter Färbung mit SAPE-Lösung wird
eine Verstärkung des Fluoreszenzsignals erreicht.
Material und Methoden
61
EukGE-WS2v4
1st Post Hyb Wash
10 Zyklen (2x mischen / Zyklus) mit Wash Puffer A bei 25°C
2nd Post Hyb Wash
4 Zyklen (15x mischen/ Zyklus) mit Wash Puffer B bei 50°C
1st Stain
10 min Färbung mit SAPE-Lösung bei 25°C
1st Post Stain Wash
10 Zyklen (4x mischen/ Zyklus) mit Wash Puffer A
2nd Stain
10 min Färbung mit Antikörperlösung bei 25°C
3rd Stain
10 min Färbung mit SAPE Lösung bei 25°C
Final Wash
15 Zyklen (4x mischen/ Zyklus) mit Wash Puffer A bei 30°C.
2.2.5.4 Scannen der Arrays und Auswertung der Messdaten
Die fertigen Arrays wurden direkt im Anschluss mit dem Affymetrix® GeneChip® Scanner
3000 bei einer Wellenlänge von 570 nm gescannt und die Bilddateien gespeichert (DAT
files). Diese stellen die Rohdaten des Experimentes dar. Aus den Bilddaten wurde
anschließend ein CEL file (cell intensity) generiert und die Daten mit dem MAS5 (Microarray
Suite 5) Algorithmus kondensiert. In diesem Kondensierungsschritt werden auf der Grundlage
komplexer Algorithmen aus den Fluoreszenzsignalen der 11 perfect match und 11 mismatch
Sonden (MAS5) ein Signal für jedes Probe-Set generiert. Dies stellt unter anderem die
Grundlage für die Berechnung des Absolut Call dar, der angibt, ob ein bestimmtes Transkript
auf dem Chip zuverlässig detektiert wurde (present call ) oder nicht (absent call). Um
unterschiedliche
Arrays
miteinander
vergleichen
zu
können,
müssen
die
Fluoreszenzintensitäten normalisiert werden. Dieser Normalisierung liegt die Annahme
zugrunde, dass die gesamte Signalstärke eines Arrays immer ungefähr gleich ist (die
Verteilung der Fluoreszenzintensität kann natürlich variieren). Jedem Array wird durch die
Skalierung ein Mittelwert für die Summe aller gemessenen Fluoreszenzintensitäten
zugeschrieben. Für unsere Experimente wurde für alle Arrays ein Intensitätsmittelwert von
150
festgelegt.
Anhand
dieses
festgelegten
Werts
werden
alle
gemessenen
Fluoreszenzintensitäten korrigiert. Die Expression von Genen unterschiedlicher Arrays kann
so verglichen werden und eine Aussage darüber gemacht werden, auf welchem Array die
Expression am stärksten ist.
Zum Vergleich der Genexpression in Kasumi-1 Zellen bzw. primären myeloischen Blasten
vor und nach DAC Exposition wurden die Messdaten der Arrays der unbehandelten Zellen als
Material und Methoden
62
Basislinie definiert und die Affymetrix Software ermittelt dabei einen Chance Call. Die
Expression eines Gens kann im Vergleich zur Basislinie einen Increase (I) (=Zunahme),
Decrease (D) (=Abnahme) oder no change (NC) (=keine Änderung) aufweisen. Der Fold
Change (= x-fache Änderung) gibt die Änderung der Genexpression quantitativ an. Die
Auswertung der Arrays erfolgte mit Hilfe der Expressionist Pro Software der Fa. Genedata
(Basel).
Ergebnisse
3
3.1
63
Ergebnisse
Behandlung myeloischer Zelllinien mit 5-Aza-2’-deoxycytidin - Kurzzeitkultur
Die in vielen soliden Tumoren nachgewiesene Expression von Cancer Testis Antigenen ist in
hämatopoetischen Erkrankungen deutlich seltener zu beobachten. „Klassische“ Vertreter
dieser Genfamilie wie NY-ESO-1 oder MAGEA1 werden in akuten myeloischen Leukämien
nicht exprimiert (Chambost et al., 2001; Lim et al.,, 1999; Niemeyer et al., 2003). DNA
Methylierung konnte als ein entscheidender Mechanismus bei der Regulation der
Genexpression vieler Cancer Testis Antigene identifiziert werden (De Smet et al., 1996).
Um die Hypothese zu prüfen, ob die demethylierende Substanz 5-Aza-2’-deoxycytidin (DAC)
die Expression von Cancer Testis Antigenen (CTAs) induzieren kann, wurden myeloische
Leukämiezelllinien unterschiedlicher Reifungsstadien (HL60, Kasumi-1, U937, NB4, K562)
mit DAC Konzentrationen zwischen 0 und 200 nM behandelt und die Effekte auf
Zellproliferation, Viabilität und CTA Expression untersucht.
3.1.1 Einfluss auf Zellproliferation und Viabilität
Um die Auswirkungen der DAC Behandlung auf Zellproliferation und Zelltod untersuchen zu
können, wurden für HL60, Kasumi-1 und U937 über den Zeitraum der Kultivierung
Zellwachstums- und Viabilitätskurven erstellt (vgl. Abbildung 3.1).
Die Exposition myeloischer Zelllinien mit DAC führt konzentrationsabhängig zu einer
Hemmung der Zellproliferation und der Viabilität. Alle drei untersuchten Zelllinien zeigten
nach der Behandlung mit drei Pulsen DAC eine im Vergleich zu den Kontrollzellen deutlich
reduzierte Proliferationsrate. Dieser Effekt fiel am deutlichsten bei den mit 200 nM DAC
behandelten Zellen aus. Während die Wachstumsrate bei Kasumi-1 und HL60 nach einem
Beobachtungszeitraum von 144 h bereits bei Behandlung mit 50 nM DAC bei 30 bzw. 60%
im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen lag, zeigte U937 bei dieser Konzentration
nur einen geringen Abfall des Zellwachstums. Die Proliferationsrate der mit 200 nM DAC
exponierten Zellen war zum 144 h Zeitpunkt mit Werten zwischen 10 und 25% deutlich
reduziert, Kasumi-1 zeigte die deutlichste Wachstumsinhibition von 30 (50 nM DAC) und
10% (200 nM DAC) zum 144 h Zeitpunkt.
Ergebnisse
64
Abbildung 3.1 Proliferationshemmung und Viabilität von Kasumi-1, HL60 und U937 bei Behandlung
mit 5-Aza-2’-deoxycytidin
Kasumi-1, HL60 und U937 wurden in Startansätzen von 2,5x105 Zellen/ml mit DAC Konzentrationen
zwischen 0 und 200 nM behandelt. Die Behandlung wurde für 3 x 24h durchgeführt (Pfeile entsprechen
DAC Gabe), anschließend wurden die Zellen mit Mediumwechsel für weitere 72h in Kultur gehalten. Die
Kontrollzellen wurden unter den entsprechenden Bedingungen ohne DAC kultiviert. Die Abbildung zeigt
die gemittelten Werte aus mindestens zwei unabhängigen Versuchen. Die Grafiken a, c und e zeigen die
Proliferationsrate der Zellen. Die Abszisse beschreibt das Verhältnis des prozentualen Wachstums der
einzelnen Ansätze zu dem prozentualen Wachstum der unbehandelten Kontrollzellen. Die Viabilität der
Zellen in Grafiken b, d und f wurde mittels Trypanblaufärbung aus dem Verhältnis der lebenden Zellen zur
Gesamtzahl der Zellen ermittelt.
Ergebnisse
65
Kasumi-1 wies im Vergleich zu U937 und HL60 bereits vor Behandlung eine leicht
verminderte Viabilität (zwischen 90 und 95%) auf. Während niedrigere DAC Dosen die
Viabilität aller drei Zelllinien in relativ geringem Ausmaß senkten, konnte bei Exposition mit
200 nM DAC nach 144 h ein deutlicher Abfall der Viabilität auf Werte von 58% (HL60),
64% (Kasumi-1) und 77% (U937) beobachtet werden. Bei Kasumi-1 fiel sowohl in der
Zellwachstums- als auch in der Viabilitätskurve ein deutlicher Knick am Ende des dritten 24 h
Pulses (72 h Zeitpunkt) auf. Dieser Abfall zeigte sich bei U937 und HL60 Zellen bereits zu
früheren Zeitpunkten (48 h). Die Ursache für diese Beobachtung könnte in der höheren
Verdopplungsrate der beiden letztgenannten Zelllinien liegen, die eine rasche Inkorporation
der Substanz in die DNA begünstigt.
3.1.2 NY-ESO-1 Protein Expression in myeloischen Leukämiezelllinien
Um den Einfluss von DAC auf die Expression von CTAs zu untersuchten, wählten wir
zunächst NY-ESO-1 als den neben MAGEA-1 bekanntesten Prototypen dieser Genfamilie.
Zur Analyse der NY-ESO-1 Protein Expression in unterschiedlichen myeloischen
Leukämiezelllinien (Kasumi-1, HL60, U937, NB4 und K562) nach Exposition mit 200 nM
DAC wurden die behandelten Zellen sowie die Kontrollzellen an Tag 6 (144 h) geerntet und
dem Western Blot zugeführt.
NB4
0
NY-ESO-1
β-Actin
200
Kas1
0
200
K562
0
200
U937
0
200
HL60
0
200
U266
nM DAC
22kD
42kD
Abbildung 3.2 NY-ESO-1 Expression in myeloischen Leukämiezelllinien nach DAC Exposition
Die NY-ESO-1 Protein-Expression in myeloischen Leukämiezelllinien nach DAC Behandlung wurde
mittels Western Blot analysiert. Dabei wurden U937, HL60, NB4, K562 und Kasumi-1wie beschrieben mit
200 nM DAC behandelt. Zelllysate von den Kontrollzellen sowie den behandelten Zellen wurden an Tag 6
generiert, die Proteine elektrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran
transferiert. Der Nachweis des 22 kD NY-ESO-1 Proteins erfolgte mit dem monoklonalen Maus Anti-NYESO-1 Antikörper E976 (Zymed). Als Zweitantikörper diente der Meerretichperoxidase gekoppelte AntiMaus Antikörper (Sigma). Die Detektion erfolgte mit den ECLplus Reagenzien (Amersham Biosience). Die
Zelllinie U266 mit bekannter NY-ESO-1 Expression diente als Positivkontrolle, β-Actin als Ladekontrolle.
Ergebnisse
66
Die DAC Exposition myeloischer Leukämiezelllinien unterschiedlicher Reifungsstadien
führte zu einer deutlichen Induktion der NY-ESO-1 Expression. Während die Kontrollzellen
keine NY-ESO-1 Protein-Expression zeigten, kam es in vier der fünf untersuchten Zelllinien
zu einer detektierbaren NY-ESO-1 Expression nach Behandlung mit DAC. Hinsichtlich der
Induktionsstärke konnten Unterschiede zwischen den Zelllinien festgestellt werden.
Die
stärkste Expression konnte in U937 und Kasumi-1 beobachtet werden, gefolgt von HL60.
K562 Zellen zeigten eine leichte NY-ESO-1 Induktion, die in NB4 nicht detektierbar war.
3.2
Effekte von DAC versus Cytarabin: Geninduktion durch Dnmt-Inhibition
Um die Frage zu adressieren, ob die Induktion der NY-ESO-1 Expression ein spezifischer
Effekt der demethylierenden Substanz DAC ist oder ein unspezifischer, beispielsweise durch
Apoptose auslösbarer Effekt, wurden die myeloischen Zelllinien HL60 und U937 in einem
alternativen Versuchsansatz mit dem Zytostatikum Cytarabin (AraC) behandelt. Die Zellen
wurden dabei mit 20 oder 100 nM AraC exponiert und für 72 h in Kultur gehalten. Aufgrund
des stark zelltoxischen Effektes der Substanz konnten die Zellen nicht zu späteren
Zeitpunkten geerntet werden. HL60 zeigte nach AraC Exposition eine Abnahme der Viabilität
auf Werte zwischen 57% (100 nM AraC) und 63% (20 nM AraC). Bei U937 war dieser
Abfall stärker ausgeprägt. Während vor Behandlung Viabilitätswerte von 100% gemessen
wurden, lagen diese nach Behandlung bei 30 bzw. 35% (100 bzw. 20 nM AraC).
Anschließend untersuchten wir vergleichend die NY-ESO-1 Protein Expression in mit DAC
exponierten sowie mit AraC behandelte U937 und HL60 Zellen. Die Zellen wurden dabei mit
50 oder 200 nM DAC exponiert und an Tag 3 oder 6 geerntet. Alternativ erfolgte die
Behandlung mit 20 oder 100 nM AraC für drei Tage. Die Untersuchung der NY-ESO-1
Expression wurde mittels Western Blot durchgeführt (Abbildung 3.3).
Wie bereits beschrieben (vgl. Abbildung 3.2) kam es in U937 und HL60 an Tag 6 der
Behandlung mit 200 nM DAC zu einer deutlichen Induktion der NY-ESO-1 Protein
Expression. NY-ESO-1 Protein konnten in HL60 Zellen bei Behandlung mit 200 nM DAC
bereits an Tag 3 detektiert werden. In den mit 50 nM DAC behandelten U937 bzw. HL60
Zellen war zu keinem untersuchten Zeitpunkt NY-ESO-1 Protein detektierbar. Die mit 20
oder 100 nM AraC behandelten HL60 Zellen und U937 Zellen (Daten nicht abgebildet)
zeigten keine NY-ESO-1 Expression.
Ergebnisse
67
U937
HL60
DAC
DAC
d3
50
d6
200
50
200
d3
0
50
U266
AraC
d6
200
50 200
d3
20
100
nM DAC/AraC
NY-ESO-1
22kD
β-Actin
42kD
Abbildung 3.3 NY-ESO-1 Expression in U937 und HL60 nach DAC Exposition
U937 und HL60 wurden mit 50 oder 200 nM DAC behandelt. Zelllysate von den behandelten Zellen
wurden an Tag 3 und 6 generiert, die der Kontrollzellen an Tag 6. HL60 wurde alternativ mit einer Dosis 20
bzw. 100 nM AraC behandelt und die Zellen ohne Mediumwechsel für weitere 3 Tage in Kultur gehalten.
Die NY-ESO-1 Protein Expression wurde wie beschrieben mittels Western Blot detektiert. Die Zelllinie
U266 mit bekannter NY-ESO-1 Expression diente als Positivkontrolle, β-Actin als Ladekontrolle.
3.3
Effekte der DAC Behandlung auf die CTA Expression in Kasumi-1
Zur weiteren Charakterisierung der NY-ESO-1 Expression sowie der Expression weiterer
Mitglieder der CTA Familie wählten wir die Kasumi-1 Zelllinie, da diese im Western Blot
eine starke Induktion der NY-ESO-1 Expression zeigte. Darüber hinaus zeigten sich die
Zellen im Vergleich zu U937 sensitiv gegenüber der Behandlung mit niedrigen DAC
Konzentrationen (50 nM), die zu einer deutlichen Proliferationshemmung bei relativ hoher
Viabilität (Abbildung 3.1 a, c) führten.
3.3.1 Transkriptionelle Expression von Cancer Testis Antigenen
Zur Untersuchung der Transkription von Cancer Testis Antigenen in Kasumi-1 vor und nach
DAC Behandlung wurde die Expression von drei typischen Vertretern dieser Gruppe, NYESO-1, MAGEA1 und MAGEA3, mittels quantitativer RT-PCR ermittelt. Darüber hinaus
untersuchten wir die DAC Effekte auf die Expression von Myeloblastin/Proteinase 3 (MBN).
Das Leukämie assoziierte Antigen (LAA) Myeloblastin gehört aufgrund der physiologischen
Expression in Promyelozyten nicht zu der Familie der klassischen CTAs.
Kasumi-1 Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten (48, 72 und 144 h) während oder
nach der DAC Exposition geerntet und die RNA extrahiert. Die quantitative Analyse der NYESO-1, MAGEA1, MAGEA3 und MBN Expression erfolgte mittels Real-time PCR unter
Nutzung der Applied Biosystems Technologie. Die Änderung der Genexpression im
Vergleich zu den Kontrollzellen ist in Abbildung 3.4 graphisch dargestellt.
Ergebnisse
68
MAGEA3 Expression
8000
Expression relativ zu
KZ
Expression relativ zu
KZ
NY-ESO-1 Expression
6000
4000
2000
0
KZ 48 72 144 48
400
300
200
100
0
KZ
72 144 48 72 144
48 72 144 48 72 144 48 72 144
Zeit [h]
Zeit [h]
MBN Expression
200
150
100
50
0
KZ
48
72 144 48
72 144 48
72 144
Expression relativ zu
KZ
Expression relativ zu
KZ
MAGEA1 Expression
15
10
5
0
KZ
Zeit [h]
0 nM
50 nM
100 nM
48
72 144 48 72 144 48 72 144
Zeit [h]
200 nM
3.4 Expression von NY-ESO-1, MAGEA1, MAGEA3 und MBN in Kasumi-1 bei Behandlung mit 5Aza-2’-deoxycytidin
Nach Exposition der Kasumi-1 Zellen mit 0-200 nM DAC wurden die Zellen zu unterschiedlichen
Zeitpunkten (48, 72 und 144 h) der Behandlung geerntet, die RNA isoliert, DNAse verdaut und in cDNA
umgeschrieben. Die Transkription von den Cancer Testis Antigenen NY-ESO-1 (a), MAGEA1 (b) und
MAGEA3 (c) sowie dem LAA MBN (d) wurde mittels RT-qPCR untersucht. Als Kontrollzellen (KZ)
dienten unbehandelte, zum 144 h Zeitpunkt geerntet Zellen. Die relative Quantifizierung erfolgte mittels der
Standardkurvenmethode, bei gleicher Effizienz ggf. mit der ∆∆CT-Methode. Die Abbildung zeigt die
Änderung der Genexpression im Vergleich zu den Kontrollzellen. Nach Normalisierung mit dem
Referenzgen GAPDH wurde die CTA und LAA Expression in unbehandelten Zellen gleich 1 gesetzt und
die Werte der behandelten Proben zu diesem in Bezug gesetzt. Die Expression der behandelten Proben wird
als n-fache Expression der Kontrollzellen angegeben. Negative RT Reaktionen dienten dem Ausschluss der
Kontamination durch genomische DNA. Dargestellt sind die Mittelwerte mindestens 3 unabhängiger PCRAnsätze.
Die quantitative Analyse der CTA Transkription zeigte eine konzentrations- und
zeitabhängige Induktion der NY-ESO-1, MAGEA1 und MAGEA3 Expression im Rahmen
der DAC Behandlung (Abbildung 3.4 a-c). Während die zu den gleichen Bedingungen in
Kultur gehaltenen Kontrollzellen keines der drei untersuchten Gene exprimierten, kam es
bereits nach 48 h zu einer leichten und nach 72 h zu einer deutlich detektierbaren Induktion
der Genexpression mit einem Maximum an Tag 6 (144 h). Eine weitere wichtige Rolle
Ergebnisse
69
hinsichtlich der Transkriptionsstärke spielte die verwendetet DAC Konzentration. Die
höchsten Expressionslevel wurden in den mit 200 nM behandelten Zellen gemessen. Das
Maximum der Genexpression wurde in allen drei untersuchten CTAs zum 144h Zeitpunkt und
Exposition mit 200 nM DAC erreicht (vgl. Tabelle 3.1).Die stärkste Induktion der RNA
Expression konnte für NY-ESO-1 beobachtet werden, mit einer über 4000fach erhöhten
Expression an Tag 6 und 200 nM DAC. Die MAGEA3 Expression war unter diesen
Bedingungen ungefähr 200fach, die MAGEA1 Expression ca. 100fach erhöht.
MBN zeigte sich wie erwartet bereits vor DAC Behandlung in Kasumi-1 Zellen exprimiert
(vgl. Tabelle 3.1). Im Zuge der DAC Behandlung kam es zu einer weiteren Steigerung der
Genexpression, die sich wie für die CTA Expression beobachtet als zeitabhängig erwies mit
Maximalwerten an Tag 6. Zu diesem Zeitpunkt war die MBN Expression im Vergleich zu den
Kontrollzellen 9fach erhöht (vgl. Abbildung 3.4d). Die Auswirkungen der DAC
Konzentration auf die MBN Expression zeigten sich im Vergleich zur CTA Induktion
wesentlich geringer mit einer etwa vergleichbaren Transkription bei Behandlung mit 50, 100
oder 200 nM DAC.
CTA Expression in Kasumi-1 + 200nM DAC
Relative RNA Menge
100
10
1
0,1
0,01
0,001
0,0001
0
24
48
72
96
120
144
Zeit [h]
NY-ESO-1
MAGEA1
MAGEA3
MBN
Abbildung 3.5 Relative RNA Mengen von NY-ESO-1, MAGEA1, MAGEA3 und MBN in Kasumi-1
behandelt mit 200 nM DAC.
Die Abbildung zeigt die NY-ESO-1, MAGEA1, MAGEA3 und MBN Expression in Kasumi-1 zu
unterschiedlichen Zeitpunkten (48, 72, 144 h) der mit 200 nM DAC behandelten Zellen. Die relativen RNA
Mengen ergeben sich aus der Normalisierung mit GAPDH. Dargestellt sind die Mittelwerte aus drei
unabhängigen PCR-Ansätzen. Zu beachten ist die logarithmische Skalierung der Y-Achse.
Anhand der Betrachtung der relativen RNA Mengen konnten die Unterschiede in der
Induktionsstärke der vier untersuchten Gene präziser herausgearbeitet werden. Die relative
RNA Menge beschreibt die Expression des untersuchten Gens im Vergleich zum Referenzgen
(GAPDH). Eine relative RNA Menge von 1 bedeutet demnach einen vergleichbare
Ergebnisse
70
Expressionsstärke von untersuchtem Gen und Referenzgen. Die relativen RNA Mengen von
NY-ESO-1, MAGEA1 MAGEA3 und MBN zu unterschiedlichen Zeitpunkten der
Behandlung mit 200 nM DAC zeigt die Abbildung 3.5.
Während die NY-ESO-1 Expression an Tag 6 und 200 nM DAC bei ca. 0,5 lag, fielen die
relativen RNA Mengen von MAGEA1 mit 0,04 und MAGEA3 mit 0,05 um eine
Dezimalstelle
geringer
aus.
Die
NY-ESO-1
Expression
betrug
zu
diesem
Untersuchungszeitpunkt also ca. 50% der GAPDH Expression. Die MAGEA1 und MAGEA3
Expression lag bei 4% bzw. 5%. Die MBN Expressionslevel lagen bereits in den
Kontrollzellen über der GAPDH Expression.
Diese Zahlen machen deutlich, dass es im Zuge der DAC Behandlung zu einer deutlichen
Induktion der Genexpression im Vergleich zu den Kontrollzellen kommt, die transkribierte
RNA Menge verglichen mit einem Housekeeping Gen wie GAPDH allerdings gering bleibt.
Bei bereits hohen Expressionswerten von MBN vor Behandlung fiel die Änderung der
Expressionsstärke im Vergleich zu den CTAs weniger deutlich aus. Dennoch darf nicht
übersehen werden, dass die MBN Transkription insgesamt deutlich über der DAC induzierten
CTA Expression liegt.
Expressionslevel von NY - ESO-1, MAGEA1, MAGEA3 und MBN in Kasumi - 1 nach DAC Behandlung
NY-ESO-1
MAGEA1
MAGEA3
MBN
Zeit [h]
DAC
Konzentration
[nM]
Relative
RNA
Menge
NY-ESO-1/
GDH
Expression
relativ zu
KZ
Relative
RNA
Menge
MAGEA1/
GDH
Expression
relativ zu
KZ
Relative
RNA
Menge
MAGEA3/
GDH
Expression
relativ zu
KZ
Relative
RNA
Menge
MBN /
GDH
Expression
relativ zu
KZ
144
0
0,0001
1
0,0003
1
0,0001
1
3,63
1
48
50
0,016
175
0,0006
2
0,003
11
5,99
2
72
50
0,097
738
0,001
3
0,007
27
16,22
5
144
50
0,122
1049
0,005
15
0,010
40
32,30
9
48
100
0,046
485
0,002
8
0,007
28
5,47
2
72
100
0,131
1145
0,006
18
0,016
65
15,22
4
144
100
0,258
2967
0,014
45
0,025
103
31,34
9
48
200
0,052
541
0,002
6
0,010
40
4,08
1
72
200
0,250
2047
0,014
45
0,028
115
11,69
3
144
200
0,472
4275
0,037
116
0,056
233
25,98
7
Tabelle 3.1 CTA Expressionslevel (RNA) in Kasumi-1 nach DAC Behandlung
Die Tabelle 3.1 zeigt zusammenfassend die Zahlenwerte der relativen RNA Mengen von NY-ESO-1,
MAGEA1, MAGEA3 und MBN nach DAC Behandlung sowie die n-fache Expressionsänderung im
Vergleich zu Kontrollzellen. Wie bereits oben beschrieben, ergeben sich die relativen RNA Mengen aus der
Ergebnisse
71
Normalisierung mit dem Referenzgen GAPDH. Zur Berechnung der Änderung der Genexpression im
Vergleich zu den Kontrollzellen wurde die CTA Expression in unbehandelten Zellen gleich 1 gesetzt und
die Werte der behandelten Proben zu diesem in Bezug gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte mindestens 3
unabhängiger PCR-Ansätze.
Einen Überblick über die n-fache Expressionsänderung sowie die relativen RNA Mengen
aller vier untersuchten Gene im Rahmen der DAC Behandlung gibt die Tabelle 3.1.
3.3.2 NY-ESO-1 Protein-Expression
Um zu untersuchen, ob sich die in der RT-qPCR beobachtete Induktionskinetik der RNA
Expression auch auf Proteinebene widerspiegelt, wurde ein Western Blot durchgeführt. Dabei
wurde aufgrund der besonders starken Transkriptionsinduktion die NY-ESO-1 Protein
Expression untersucht.
72h
144h
U266
0
50
100
200
50
100
200
nM DAC
NY-ESO-1
22kDa
β-Actin
42 kDa
Abbildung 3.6 NY-ESO-1 Protein Expression in Kasumi-1 nach DAC Behandlung
Die NY-ESO-1 Protein-Expression in Kasumi-1 nach DAC Behandlung wurde mittels Western Blot
analysiert. Zelllysate von unbehandelten Kontrollzellen und von Zellen, die mit 50-200 nM DAC behandelt
wurden, wurden nach 72h bzw. 144h generiert. Die Zelllinie U266 mit bekannter NY-ESO-1 Expression
diente als Positivkontrolle, β-Actin als Ladekontrolle.
Die Behandlung von Kasumi-1 Zellen mit 0-200 nM DAC führte korrelierend mit den Daten
der RT-qPCR zu einer deutlichen Induktion der NY-ESO-1 Protein Expression bereits nach
72h bei den mit 100 und 200 nM DAC behandelten Zellen. Nach 144h konnte eine weitere
Steigerung der Proteinexpression beobachtet werden (vgl. Abbildung 3.6). Auch in den mit
50 nM DAC behandelten Zellen konnte zu diesem späteren Zeitpunkt NY-ESO-1 Protein
detektiert werden.
Die Daten weisen darauf hin, dass die demethylierende Substanz DAC die NY-ESO-1
Expression in Kasumi-1 Zellen in konzentrations- und zeitabhängigem Ausmaß sowohl auf
transkriptioneller, als auch auf Proteinebene induziert. Ebenfalls wird deutlich, dass ein
Ergebnisse
72
gewisses Ausmaß an RNA Transkription vorhanden sein muss, um NY-ESO-1 auch auf
Proteinebene detektieren zu können. Vergleicht man die Daten der quantitativen PCR mit der
NY-ESO-1 Proteinexpression im Western Blot genauer, kann man postulieren, dass die NYESO-1 RNA Expression möglicherweise bei mindestens 10% der GAPDH Expression liegen
muss, um eine Expression auf Proteinebene detektieren zu können. Nach 72 Stunden
geerntete Zellen zeigten bei der Behandlung mit 50 nM DAC eine relative RNA Menge von
0,097 (vgl. Tabelle 3.1), NY-ESO-1 war auf Proteinebene noch nicht detektierbar. Betrachtet
man die NY-ESO-1 Expression der Zellen nach 144 h lag die relative RNA Menge bei 0,122,
im Western Blot konnte NY-ESO-1 Proteinexpression detektiert werden.
3.4
Kasumi-1 Behandlung mit 5-Aza-2’-deoxycytidin - Langzeitkultur
In einem erweiterten Versuchsansatz wurden Kasumi-1 Zellen ebenfalls für drei 24h Pulse
mit 0, 50 oder 100 nM DAC behandelt. Ein Teil der Zellen wurde wie bereites oben
beschrieben nach 72 (d3) bzw. 144 h (d6) geerntet. Der andere Teil der Zellen wurde mit
regelmäßigem Mediumwechsel bis Tag 14 oder 21 in Kultur gehalten, um zu beobachten, ob
die nach 6 Tagen gesehene maximale Induktion der Expression der CTAs ohne weitere DAC
Behandlung weiter steigt, auf einem Level konstant bleibt, oder wieder absinkt.
3.4.1 Einfluss auf Zellproliferation und Viabilität
Um die Zellviabilität möglichst hoch zu halten, wurden die Zellen mit niedrigen DAC Dosen
(50 und 100 nM) behandelt. Zur Beurteilung von Zellproliferation und Zelltod wurden
Zellwachstums- und Viabilitätskurven angefertigt (vgl. Abbildung 3.7).
Wie bereits beobachtet zeigte Kasumi-1 auch bei niedrigen DAC Konzentrationen eine
Hemmung der Zellproliferation mit einem deutlichen Abfall der Kurve zum 72 h bzw. Tag 3
Zeitpunkt. Die Proliferationsrate sank auf 30% (50 nM DAC) bis 20% (100 nM DAC) der
Kontrollzellen ab. Diese deutliche Hemmung des Zellwachstums blieb auch bei der weiteren
Kultivierung über 21 Tage ohne DAC Exposition bestehen. Während die mit 50 nM DAC
behandelten Zellen eine leichte Tendenz zur Erholung zeigten, mit Proliferationsraten um
über 40% an Tag 11, blieb das Wachstum der mit 100 nM behandelten Zellen durchgehend
auf deutlich erniedrigtem Niveau. Durch die niedrigen DAC Konzentrationen konnte die
Viabilität auch in den behandelten Zellen über 21 Tage bei relativ hohen Werten um 80%
gehalten werden. Mit zeitlichem Abstand zur letzten DAC Gabe zeigte sich auch hier eine
leichte Tendenz zur Erholung der Zellen.
Ergebnisse
73
Abbildung 3.7 Zellwachstum und Viabilität in Kasumi-1 bei Behandlung mit 5-Aza-2’-deoxycytidin
und Kultivierung über 21 Tage
Kasumi-1 wie beschrieben mit DAC Konzentrationen zwischen 0 und 100 nM behandelt (Pfeile entsprechen
DAC Gabe). Anschließend wurden die Zellen mit Mediumwechsel bis Tag 14 bzw. 21 in Kultur gehalten.
Die Kontrollzellen wurden unter den entsprechenden Bedingungen ohne DAC Gabe kultiviert. Die Grafik a
zeigt die Proliferationshemmung der Zellen. Die Abszisse beschreibt das Verhältnis des prozentualen
Wachstums der einzelnen Ansätze zu dem prozentualen Wachstum der unbehandelten Kontrollzellen. Die
Viabilität der Zellen in Grafik b wurde mittels Trypanblaufärbung aus dem Verhältnis der lebenden Zellen
zur Gesamtzahl der Zellen ermittelt.
Im Weiteren versuchten wir eine Doppelbehandlung der Kasumi-1 Zellen mit Kultivierung
über 21 Tage durchzuführen. In diesem Ansatz wurden die Zellen zunächst für drei 24 h Pulse
mit 50 oder 100 nM DAC behandelt und bis Tag 7 in Kultur gehalten um dann eine erneute
Exposition der Zellen mit drei 24h Pulsen DAC durchzuführen. Dieser Ansatz schien
besonders interessant, da eine solche Doppelinduktion bei Patienten mit Zellzahlen über
40.000/µl in die Phase II AML-Studie 00331 mit Decitabine integriert wurde. Diese Form der
Behandlung wurde von den DAC gegenüber sensitiven Kasumi-1 Zellen nur sehr schlecht
toleriert. Aufgrund von Viabilitätswerten von 22 bzw. 10% (50 bzw. 100 nM DAC) 120 h
Ergebnisse
74
nach Ende der zweiten Exposition (Tag 14) wurde der Versuch nicht fortgeführt; auf Grund
von zu wenig Material war er bezüglich der CTA Expression nicht auswertbar.
3.4.2 Expression von Cancer Testis Antigenen
Um den zeitlichen Verlauf der Expression von CTAs im Rahmen der DAC Behandlung zu
verstehen, wurde die Transkription von NY-ESO-1, MAGEA1, MAGEA3 und MBN neben
den bereits untersuchten frühen Zeitpunkten auch an Tag 14 bzw. 21 untersucht. Die
Expression auf RNA Ebene wurde wie bereits beschrieben mittels RT-qPCR untersucht, die
Bestimmung der NY-ESO-1 Proteinexpression wurde mittels Western Blot durchgeführt.
Abbildung 3.8 Expression von NY-ESO-1, MAGEA1, MAGEA3 und MBN in Kasumi-1 nach DAC
Behandlung und Kultivierung bis Tag 14/21
Nach Exposition der Kasumi-1 Zellen mit 0 bis 100 DAC wurden die Zellen zu unterschiedlichen
Zeitpunkten (d3, d6, d14, d21) geerntet, die RNA isoliert, DNAse verdaut und in cDNA umgeschrieben. Die
Transkription von NY-ESO-1 (a), MAGEA1 (b), MAGEA3 (c) und MBN wurde mittels RT-qPCR
untersucht. Als Kontrollzellen (KZ) dienten unbehandelte, an Tag 21 geerntet Zellen. Die relative
Quantifizierung erfolgte mittels der Standardkurvenmethode, bei gleicher Effizienz ggf. mit der ∆∆CT
Methode. Die Abbildung zeigt die Änderung der Genexpression im Vergleich zu den Kontrollzellen. Nach
Normalisierung mit dem Referenzgen GAPDH wurde die CTA Expression in unbehandelten Zellen gleich 1
gesetzt und die Werte der behandelten Proben zu diesem in Bezug gesetzt. Negative RT Reaktionen dienten
dem Ausschluss der Kontamination durch genomische DANN. Dargestellt sind die Mittelwerte mindestens
3 unabhängiger PCR-Ansätze.
Ergebnisse
75
Die Abbildung 3.8 zeigt die n-fache Änderung der Genexpression von NY-ESO-1 (a),
MAGEA1 (b), MAGEA3 (c) und MBN (d) im Vergleich zu Kontrollzellen. Wie bereits
beschrieben, kam es an Tag 3 (72 h) zu einer Induktion der Expression aller vier untersuchten
Gene mit einem weiteren Anstieg an Tag 6.
Bei anhaltender Kultivierung der Kasumi-1 Zellen ohne DAC Exposition kam es bereits an
Tag 14 zu einer Abnahme der Expression von NY-ESO-1, MAGEA1 und MAGEA3, mit
einem weiteren Abfall an Tag 21. Die Expression lag jedoch auch zu den späten Zeitpunkten
über derjenigen in den unbehandelten Zellen.
Bei der Betrachtung der MBN Expression zeigten sich an Tag 14 bei den mit 50 nM DAC
behandelten Zellen weiter steigende Expressionswerte, die jedoch ebenfalls zum Tag 21
Zeitpunkt deutlich abfielen. Die Tabelle 3.2 zeigt zusammenfassend die die Zahlenwerte der
relativen RNA Menge sowie der Expression im Vergleich zu unbehandelten Zellen.
Expressionslevel von NY– ESO - 1, MAGEA1, MAGEA3 und MBN in Kasumi- 1 nach DAC Behandlung
NY-ESO-1
MAGEA1
MAGEA3
MBN
Zeit [d]
DAC
Konzentration
[nM]
Relative
RNA
Menge
NY-ESO-1/
GDH
Expression
relativ zu
KZ
Relative
RNA
Menge
MAGEA1/
GDH
Expression
relativ zu
KZ
Relative
RNA
Menge
MAGEA3/
GDH
Expression
relativ zu
KZ
Relative
RNA
Menge
MBN /
GDH
Expression
relativ zu
KZ
21
0
0,00003
1
0,000
1
0,000
1,0
0,794
1
3
50
0,016
250
0,003
33
0,002
72,5
3,015
6
6
50
0,019
301
0,003
38
0,001
52,6
7,189
12
14
50
0,010
162
0,002
25
0,001
11,9
9,200
17
21
50
0,006
103
0,001
9
-
-
5,887
8
3
100
0,051
810
0,011
131
0,006
237,9
4,128
5
6
100
0,077
1228
0,019
226
0,013
462,1
24,040
29
21
100
0,008
121
0,002
29
0,001
28,3
9,127
15
Tabelle 3.2 CTA Expressionslevel in Kasumi-1 nach DAC Behandlung und Kultivierung über 21
Tage
Die Tabelle 3.2 zeigt zusammenfassend die Zahlenwerte der relativen RNA Mengen von NY-ESO-1,
MAGEA1, MAGEA3 und MBN nach DAC Behandlung sowie die Expressionsänderung im Vergleich zu
Kontrollzellen. Die relativen RNA Mengen berechnen sich aus der Normalisierung mit dem Referenzgen
GAPDH. Die Änderung der Genexpression ergibt sich aus dem Vergleich der CTA Expression mit den
Kontrollzellen. Dazu wird die CTA Expression in den unbehandelten Zellen gleich 1 gesetzt und die Werte
der behandelten Proben zu diesem in Bezug gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte mindestens 3
unabhängiger PCR-Ansätze.
Ergebnisse
76
Bei der Betrachtung der relativen RNA Mengen aller vier Gene fiel eine im Vergleich zu den
über 6 Tage durchgeführten Versuchen niedrigere Expression relativ zu GAPDH auf.
Während die relative RNA Menge von NY-ESO-1 zum 144 h Zeitpunkt und 100 nM DAC in
der Kultivierung über 6 Tage bei 26% lag, betrug bei der entsprechenden Probe des
Versuches über 21 Tage die Expression 8% der GAPDH Transkription. Diese
unterschiedlichen Expressionslevel resultieren aus der relativen Quantifizierung, die keine
Absolutwerte angibt, sondern immer auf den Vergleich mit der GAPDH Expression
angewiesen ist. Die für die Langzeitkultur verwendeten Kasumi-1 Zellen wurden neu von der
DSMZ bestellt und weisen möglicherweise ein höhere GAPDH Expression auf. Alternativ
könnte das Ansprechen gegenüber DAC verringert sein, dagegen spricht allerdings die
vergleichbare NY-ESO-1 Induktion im Western Blot.
50nM
d0
d3
d6
100nM
d21
NY-ESO-1
β-Actin
d3
d6
d21
U266
22kDa
42 kDa
Abbildung 3.9 NY-ESO-1 Protein Expression in Kasumi-1 nach DAC Behandlung und Kultivierung
über 21 Tage
Die NY-ESO-1 Protein-Expression in Kasumi-1 nach DAC Behandlung wurde mittels Western Blot
analysiert. Zelllysate von Kontrollzellen und von Zellen, die mit 50 oder 100 nM DAC behandelt wurden,
wurde nach 3, 6, 14 oder 21 Tagen generiert. Die Zelllinie U266 mit bekannter NY-ESO-1 Expression
diente als Positivkontrolle, β-Actin als Ladekontrolle.
Die NY-ESO-1 Protein Expression in der Langzeitkultivierung zeigt ein ähnliches Bild wie
bereits beschrieben. Bei den mit 50 nM DAC behandelten Zellen kam es erstmals an Tag 6 zu
einer im Western Blot sichtbaren Proteindetektion. In Lysaten der mit 100 nM DAC
behandelten Zellen konnte die NY-ESO-1 Proteinexpression bereits an Tag 3 detektiert
werden. Zu späteren Zeitpunkten nach Behandlung war die Proteinexpression korrelierend zu
dem in der RT-qPCR beobachteten Abfall der Transkription nicht mehr detektierbar. Die
relative RNA Menge schien in diesem Versuchsansatz bei mindestens 2% der GAPDH
Expression liegen zu müssen, um eine Detektion auf Proteinebene zu erreichen (vgl. Tabelle
3.2).
Ergebnisse
3.5
77
Globale Expressionsanalysen mittels Microarray-Technologie
Um die Untersuchung der Genexpressionsänderung nach DAC Exposition auf alle bisher
bekannten 44 Cancer Testis Antigen Familien auszuweiten zu können, führten wir in
Kooperation mit Herrn Dr. Dietmar Pfeifer (Leiter Core Facility II, Medizin 1, Uniklinik
Freiburg) DNA Microarrayanalysen durch. Zur Genexpressionsanalyse der mit DAC
behandelten Kasumi-1 Zellen verwendeten wir den HG-U133plus 2.0 Chip (Affymetrix), der
rund 47.000 Transkripte humaner Gene umfasst. 67 verschieden Cancer Testis Antigene sind
auf dem Array vertreten, darunter viele Mitglieder der MAGE, SSX oder BAGE Familie.
Anhand der Microarray-Analyse konnten wir zum einen den Absolute Call einzelner CTAs
bestimmen, also eine Aussage darüber machen, ob bestimmte CTAs bereits vor DAC
Behandlung in Kasumi-1 exprimiert werden. Zum anderen konnte die Änderung der
Genexpression nach Behandlung im Vergleich zu den Kontrollzellen quantitativ durch den
Fold Change bestimmt werden (siehe Material und Methoden). Neben den typischen CTAs
erweiterten wir das Spektrum der untersuchten Gene auch auf die in Leukämien eine wichtige
Rolle spielenden Leukämie assoziierten Antigene (LAAs)
CTA und LAA Expression in Kasumi-1 nach DAC Behandlung
CTAs
Expression in unbehandelten Zellen (%)
Hochregulierte
Gene (%)
Reprimierte
Gene (%)
LAAs
X-chromosomal
Autosomal
1/45 (2)
1/22 (5)
7/9 (78)
10/45 (22)
0/22 (0)
2/9 (22)
0/1 (0)
0/1(0)
0/7(0)
Tabelle 3.3 Expression von Cancer Testis Antigenen in Kasumi-1 nach DAC Exposition
Kasumi-1 wurde mit 100 nM DAC behandelt, die Zellen an Tag 3, 6 und 21 geerntet und die RNA
extrahiert. Nach der Synthese doppelsträngiger cDNA folgte die in vitro Transkription der cDNA in RNA,
wobei Biotin gekoppelte Nukleotide eingefügt wurden. Die fragmentierte cRNA wurde auf den HGU133plus 2.0 Gen Chip hybridisiert, gefärbt und anschließend mit dem Affymerix GeneChip Scanner 300
bei einer Wellenlänge von 570 nM gescannt. Die Kondensierung erfolgte nach dem MAS5 Algorithmus.
Die Arrays wurden auf einen Intensitätsmittelwert von 200 skaliert. Der Grenzwert für die Detektion lag bei
Werten über 40 (Absolute Call), ein Fold Change ≥ 2 oder ≤ 0.5 wurde als Änderung der Expression
gewertet.
Ergebnisse
78
Die Tabelle 3.3 zeigt die Expression der 45 X-chromosomal und 22 autosomal lokalisierten
CTAs sowie 9 Leukämie assoziierter Antigene in unbehandelten Kasumi-1 Zellen sowie die
Zahl der regulierten Gene nach DAC Behandlung.
10 der 67 (15%) auf dem HG-U133plus 2.0 Chip vertretenen CTAs zeigten eine
Hochregulation der Genexpression in Kasumi-1 nach DAC Behandlung zu mindestens zwei
der drei untersuchten Zeitpunkte. Bei den übrigen kam zu keiner Änderung der
Genexpression. Vor Behandlung mit der demethylierenden Substanz 5-Aza-2’-deoxycytidin
zeigten lediglich die ubiquitär exprimierten CTAs IL13RA1 und SPA17 eine leichtes Signal.
9 der 10 induzierten Gene zeigten keine Expression vor Behandlung.
Bei der Betrachtung der CTA Regulation bezüglich der chromsomalen Lokalisation der
induzierten Gene ergab sich ein interessantes Bild. 22% der X-chromosomal versus 0% der
autosomal lokalisierten CTAs zeigten eine Hochregulation nach DAC Behandlung. Bei 7 der
10 induzierten CTAs konnte eine Regulation zu allen drei untersuchten Zeitpunkten (Tag 3, 6,
21) nachgewiesen werden. Die drei anderen CTAs zeigten eine Regulation zu den frühen
Zeitpunkten, die an Tag 21 der Kultivierung nicht mehr detektierbar war. Analog zu den
Ergebnissen der quantitativen RT-PCR zeigte die Mehrheit der untersuchten Gene die
höchsten Expressionswerte and Tag 6. Unter den induzierten Genen waren NY-ESO-1 sowie
Mitglieder der MAGE, GAGE und SSX Familie. Am deutlichsten fiel die Induktion der NYESO-1 Expression aus. MAGEA1 zeigte in den Microarrayuntersuchungen im Gegensatz zur
RT-qPCR keine Änderung der Transkription. Begründung dafür könnte zum einen die höhere
Sensitivität der PCR sein. Die Induktion der MAGEA1 Expression wäre in dem Fall zu
schwach, um mittels Microarray detektiert werden zu können. Zum anderen besteht eine sehr
starke Homologie zwischen Vertretern der MAGE Familie. Möglicherweise kommt es durch
Kreuzhybridisierungen der Familienmitglieder zu unspezifischen Bindungen, so dass von der
Software keine Änderung der Expression erkannt wird.
Im Gegensatz zu den CTAs zeigten 7 der 9 LAAs bereits in den unbehandelten Kontrollzellen
eine deutliche Expression. Eine DAC induzierte Steigerung der Expression konnte für 2 Gene
(MBN und PRAME) beobachtet werden.
3.6
CTA und LAA Expression in primären myeloischen Blasten von AML Patienten
Zur Analyse der DAC Effekte in vivo untersuchten wir primäre myeloische Blasten von 7
AML Patienten, die im Rahmen der multizentrischen Phase II AML Studie 00331 für 72
Stunden mit insgesamt 9 Infusionen Decitabine (je 15mg / m2 Körperoberfläche) behandelt
wurden. Patienten, die vor Beginn der Behandlung sehr hohe Blastenzahlen im peripheren
Ergebnisse
79
Blut aufwiesen, wurden zunächst mit Hydroxyharnstoff vortherapiert, um die Blastenzahl zu
reduzieren. Blutproben wurden vor, während und nach der Behandlung mit Decitabine
gewonnen und die Blasten mittels Ficoll-Dichtezentrifugation isoliert. Da keine weitere
Aufreinigung der Blasten erfolgte, wurden nur Patienten mit einem Blastengehalt von >50%
im peripheren Blut eingeschlossen, um die Verunreinigung durch Lymphozyten möglichst
gering zu halten. Die Expression von Cancer Testis Antigenen wurde mittels quantitativer
PCR, DNA Microarray und Western Blot untersucht.
Die Tabelle 3.4 gibt einen Überblick über die wichtigsten Daten der untersuchten Patienten.
Patient
Geschlecht /
Alter
WBC/ % Blasten
Proben
Tag 0
Tag 5-7
Tage
Karyotyp
#1
m/81
15200 / 77
1500 / 28
0, 2, 5
NN
#2
w/80
18600 / 95
19499 / 92
0, 2, 3, 6, 12
Komplex
#3
m/67
4600 / 63
5400 / 46
0, 2, 3, 6
NN
#4
m/76
18400 /70
21200 / 77
0, 3, 7, 10
t(3;4), -7, 12p-
#5
m/82
5200 / 90
8600 / 84
0, 2, 6, 16
47, XY, +5
#6
m/77
3500 / 69
2300 / 42
0, 3, 7
45, XY, 5q-, 7-
#7
m/81
6100 / 64
3300 / 66
0, 3, 7
46, XY
Tabelle 3.4 Patientendaten
Die Tabelle zeigt die wichtigsten Daten der hinsichtlich der CTA Expression untersuchten AML Patienten.
Aufgeführt sind Alter, Geschlecht, Zellzahl und Blastenanteil im peripheren Blut vor Beginn und im Verlauf
der Decitabine Behandlung sowie die Zeitpunkte der entnommenen Proben und der Karyotyp. Die Patienten
wurden alle 8 Stunden über eine Gesamtdauer von 72 Stunden mit je 15mg/m² Decitabine behandelt
(Gesamtdosis über 72 Stunden 135mg/m²) und Blutproben zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Es
wurden nur Patienten mit einem Blastenanteil >50% in die Untersuchungen eingeschlossen.
3.6.1 Transkriptionelle CTA Expression
Die Genexpression von NY-ESO-1, MAGEA1 und MAGEA3 in primären myeloischen
Blasten von AML-Patienten vor und zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Decitabine
Behandlung wurde mittels quantitativer RT-PCR analysiert. Die relative Quantifizierung
erfolgte mit Hilfe der Standardkurvenmethode. Ein häufiges Problem stellte die relativ
schlechte Qualität der nach Isolation von PBMCs extrahierten RNA dar. Diese konnte jedoch
durch sofortige Aufarbeitung der Proben nach Entnahme und direkte Aufnahme der Zellen in
RLT-Lyse Puffer verbessert werden. Es wurde nur solche RNA für die cDNA Synthese und
Ergebnisse
80
anschließende RT-qPCR eingesetzt, die im Bioanalyzer keine Anzeichen für Degradation und
einen Quotienten [28s/18s] von ≥ 1,5 aufwiesen. Das bei der aus Zelllinien extrahierten RNA
erreichte Idealverhältnis von 2 wurde bei der aus den Patientenproben isolierten RNA nur in
seltenen Fällen erreicht. Die Tabelle 3.5 gibt einen Überblick über die NY-ESO-1, MAGEA1
und MAGEA3 Induktion in den untersuchten Patienten.
Patient
NY-ESO-1
MAGEA1
MAGEA3
#1
+
-
-
#2
-
-
-
#3
+
-
-
#4
-
-
-
#5
-
-
-
#6
-
-
-
#7
-
-
-
Tabelle 3.5 NY-ESO-1, MAGEA1 und MAGEA3 Induktion in myeloischen Blasten von AML
Patienten nach Behandlung mit Decitabine
Blut von AML-Patienten mit >50% Blasten im peripheren Blut wurde vor und zu verschiedenen
Zeitpunkten
während
und
nach
Decitabine
Behandlung
entnommen,
PBMCs
mittels
Ficoll-
Dichtezentrifugation separiert und die RNA isoliert. Nach Qualitätskontrolle im Bioanalyzer erfolgte die
Reverse Transkription in cDNA und die quantitative PCR für NY-ESO-1, MAGEA1 und MAGEA3.
GAPDH diente als housekeeping Gen zur Normalisierung der Proben. Negative RT Reaktionen dienten dem
Ausschluss der Kontamination durch genomische DNA. + Geninduktion durch Decitabine, - keine
Induktion oder Expression.
Sieben mit Decitabine behandelte AML Patienten wurden hinsichtlich der Expression von
Cancer Testis Antigenen analysiert. Keiner der untersuchten Patienten zeigte eine Expression
von NY-ESO-1, MAGEA1 oder MAGEA3 vor Behandlung mit Decitabine. Während für
MAGEA1 und MAGEA3 auch nach der Behandlung in keinem der Patienten eine Expression
detektiert werden konnte, kam es in zwei Patienten zu einer Induktion der NY-ESO-1
Expression, die sich vergleichbar mit den in-vitro generierten Zellliniendaten im zeitlichen
Verlauf der Behandlung steigerte (siehe Abbildung 3.10). Die höchsten Expressionswerte
wurden an Tag 5 bzw. 6 erreicht. Die Transkription lag zu diesem Zeitpunkt 6 bzw. 37fach
über der vor Behandlung (Tag 0) gemessenen Expression.
Ergebnisse
81
Expression relativ zu d0
NY-ESO-1 Expression Patient #1
10
8
6
4
2
0
0
2
5
Zeit [d]
Expression relativ zu Tag 0
NY-ESO-1 Expression Patient #3
50
40
30
20
10
0
0
2
3
6
Zeit [d]
Abbildung 3.10 NY-ESO-1 Expression in Patient #1 und #3 im Verlauf der Decitabine Behandlung
Patient #1 und #3 wurden wie beschrieben über 72 Stunden mit einer Gesamtdosis von 135mg/m²
Decitabine behandelt. Der Blastenanteil im peripheren Blut lag bei 77 bzw. 63%. Blut wurde zu den
angezeigten Zeitpunkten entnommen, PBMCs mittels Ficoll-Dichtezentrifugation separiert, RNA isoliert
und cDNA synthetisiert. Anschließend erfolgte die quantitative PCR für NY-ESO-1. Die relative
Quantifizierung erfolgte mittels der Standardkurvenmethode. Tag 0 repräsentiert die vor Behandlung
gewonnenen Blutproben. Die Abbildung zeigt die Änderung der Genexpression im Vergleich zu den vor
Behandlung entnommenen Zellen. Nach Normalisierung mit dem Referenzgen GAPDH wurde die CTA
Expression in unbehandelten Zellen gleich 1 gesetzt und die Werte der behandelten Proben zu diesem in
Bezug gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte mindestens 3 unabhängiger PCR-Ansätze. Negative RT
Reaktionen dienten dem Ausschluss der Kontamination durch genomische DNA
Bei näherer Betrachtung der relativen RNA Mengen (vgl. Tabelle 6) fiel auf, dass die NYESO-1 Expression durch die Behandlung mit Decitabine zwar induziert wurde, die
Transkription im Vergleich zu GAPDH aber dennoch sehr schwach war. Zu keinem der
untersuchten Zeitpunkte lag die NY-ESO-1 Expression bei 1% der GAPDH Expression. Die
Untersuchung der NY-ESO-1 Expression auf Proteinebene fiel für alle sieben Patienten
negativ aus. NY-ESO-1 Protein konnte in keinem der Patienten zu keinem untersuchten
Zeitpunkt detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Die Induktion der NY-ESO-1
Transkription in den Patienten #1 und #3 scheint nicht ausreichend zu sein, um auch auf
Proteinebene mittels Western Blot einen Effekt nachweisen zu können.
Ergebnisse
82
NY-ESO-1 Expressionslevel
Patienten
Zeit [d]
Tabelle 3.6 NY-ESO-1 Expressionslevel in
Relative
RNA Menge
NY-ESO-1 /
GDH
Expression
relativ zu
Tag 0
primären
0
0,0016
1,0
#1
2
0,0011
0,9
#1
5
0,0046
5,6
#3
0
0,0001
1,0
#3
2
0,0006
14,0
#3
3
0,0006
10,4
Blasten
nach
Decitabine Behandlung.
Dargestellt
#1
myeloischen
sind
zusammenfassend
die
Zahlenwerte der relativen RNA Menge sowie
die n-fache Expressionsänderung im Vergleich
zu den Zellen vor Behandlung Die relative
RNA
Menge
berechnet
sich
aus
der
Normalisierung mit dem Referenzgen GAPDH.
Die Änderung der Genexpression ergibt sich
aus dem Vergleich der NY-ESO-1 Expression
mit den Zellen an Tag 0. Dargestellt sind die
Mittelwerte mindestens 3 unabhängiger PCR#3
6
0,0017
33,7
Ansätze.
3.6.2 MBN Expression in primären myeloischen Blasten
Weiterhin untersuchten wir die Myeloblastin Expression mittels quantitativer RT-PCR in
primären Blasten von fünf der sieben AML Patienten, die bereits hinsichtlich der CTA
Expression analysiert wurden. Bei allen fünf untersuchten Patienten konnte bereits vor
Behandlung MBN Transkription in den primären Blasten detektiert werden, eine Steigerung
der Transkription im Zuge der Decitabine Behandlung wurde nicht beobachtet, die Werte
blieben zu allen untersuchten Zeitpunkte auf dem selben Niveau. Abbildung 3.11a zeigt
repräsentativ für alle untersuchten Patienten den zeitlichen Verlauf der MBN Expression in
Patient #3 während Decitabine Behandlung. Hinsichtlich der MBN Expressionsstärke
zwischen den einzelnen untersuchten Patienten ließen sich jedoch individuelle Unterschiede
finden, die in Abbildung 3.11b gezeigt sind. Dargestellt ist die über die unterschiedlichen
Untersuchungszeitpunkte gemittelte MBN Expression in den fünf untersuchten Patienten.
Ergebnisse
83
MBN Expression Patient #3
Expression relativ zu
d0
a
5
4
3
2
1
0
0
2
3
6
Zeit [d]
MBN Expression
Relative RNA Menge
b
10
1
0,1
0,01
#1
#2
#3
#4
#5
Patienten
Abbildung 3.11 MBN Expression in primären myeloischen Blasten
Die Abbildung zeigt die MBN Expression in primären myeloischen Blasten von mit Decitabine behandelten
AML Patienten. Die Expression wurde mittels quantitativer RT-PCR bestimmt. Die relative Quantifizierung
wurde mit Hilfe der Standardkurvenmethode durchgeführt In Grafik a ist die Änderung der MBN
Expression im zeitlichen Verlauf in Patient #3 dargestellt. Die Daten sind repräsentativ für alle untersuchten
Patienten. Grafik b zeigt die gemittelte MBN Expression in allen fünf untersuchten Patienten. Dabei wurde
für jeden Patienten der Mittelwert der MBN Expression aller untersuchten Zeitpunkte gebildet. Die
Darstellung soll die interindividuellen Unterschiede der MBN Expression in den Patienten deutlich machen.
Zu beachten ist die logarithmische Skalierung der Y-Achse.
3.6.3 Globale Analyse der CTA und LAA Expression in vivo mittels Microarray
Im nächsten Schritt wurden Microarrayanalysen mit RNA aus primären myeloischen Blasten
an Tag 0 vor Decitabine Behandlung und an Tag 6 bzw. 7 von sechs der mit RT-qPCR
untersuchten Patienten durchgeführt. Die Arrays, die mit der RNA aus den vor Behandlung
gewonnenen Blasten hybridisiert wurden, dienten als „baseline“. Die Werte der Arrays an Tag
6/7 nach Behandlung wurden als Differenz zur baseline berechnet.
Die Tabelle 3.7 zeigt zusammenfassend die Cancer Testis Antigen Expression in den sechs
untersuchten Patienten. Dargestellt sind CTAs und LAAs, die zumindest in einem der
untersuchten Patienten eine Baseline Expression oder eine Regulation im Rahmen der DAC
Behandlung zeigen.
Ergebnisse
84
Expression von CTAs und LAAs in primären Blasten von AML Patienten
(Fold change an Tag 5/6 nach DAC Behandlung)
#2
MAGEB2
XAGE-1
IL13RA1
BAGE
OY-TES-1
PLU-1
TDRD1
BCL2
MPP11
PRAME
MBN
RHAMM
Survivin
WT-1
#3
#4
#5
#6
*(102)
#7
++
++
+
++
+
++
++
++
++
+
+++
++
++
+++
++
++
+
(2.1)
++
+++
++
++
++
+++
++
++
+
++
*(7)
++
+
+
(3)
(2)
++
+
+
++
++
++ (2.6)
+++
++
++
++
+
++
Tabelle 3.7 CTA und LAA Expression in primären Blasten von AML Patienten
Blut von 6 AML Patienten mit >50% Blasten im peripheren Blut wurde vor und an Tag 5/6 nach Decitabine
Behandlung entnommen, PBMCs mittels Ficoll-Dichtezentrifugation separiert und die RNA isoliert. Nach
der Synthese doppelsträngiger cDNA folgte die in-vitro Transkription der cDNA in RNA, wobei Biotin
gekoppelte Nukleotide eingefügt wurden. Die fragmentierte cRNA wurde auf den HG-U133plus 2.0 Gen
Chip hybridisiert, gefärbt und anschließend mit dem Affymerix GeneChip Scanner 300 bei einer
Wellenlänge von 570 nM gescannt. Die Kondensierung erfolgte nach dem MAS5 Algorithmus. Die Arrays
wurden auf einen Intensitätsmittelwert von 200 skaliert. Der Grenzwert für die Detektion lag bei Werten
über 40 (Absolute Call), ein Fold Change ≥ 2 oder ≤ 0.5 wurde als Änderung der Expression gewertet.
Detektions-Signal: + 50-99, ++ 100-999, +++ ≥ 1000.
Wie erwartet, konnte in keinem der Patienten eine Expression „klassischer“ CTA Familien
vor DAC Behandlung nachgewiesen werden. Unter den Genen, die bereits in unbehandelten
leukämischen Blasten eine Expression zeigten, waren ubiquitär exprimierte CTAs wie
IL13RA1, OY-TES-1 oder PLU-1 sowie die Leukämie assoziierten Antigene. Während die in
Kasumi-1 gezeigte de novo Transkription von CTAs nach DAC Behandlung in Patienten
nicht konsistent nachgewiesen werden konnte, zeigten zwei Patienten ein erhöhte Expression
von mindestens einem der untersuchten Gene. Ein gemeinsames Muster regulierter Gene
konnte jedoch nicht festgestellt werden. Die bereits vor Behandlung beobachtete LAA
Expression zeigte sich im Rahmen der Behandlung nicht verändert.
Diskussion
4
85
Diskussion
Epigenetische Veränderungen wie DNA Methylierung und Histon Modifizierungen sind
bedeutende Mechanismen der transkriptionellen Regulation und spielen sowohl während der
normalen Hämatopoese als auch bei der Entwicklung von hämatologischen Neoplasien eine
entscheidende Rolle. Im Unterschied zu den während der Leukämieentstehung beobachteten
genetischen Veränderungen, wie Punktmutationen oder Deletionen von Genen, stellen
epigenetische Prozesse, die zu einem Funktionsverlust von Genen führen, potentiell reversible
Modifikationen dar und ermöglichen so die Gelegenheit für therapeutische Interventionen.
Das Verständnis darüber, dass die Hypermethylierung von Tumorsuppressorgenen wie zum
Beispiel p15 mit resultierender transkriptioneller Inaktivierung zum leukämischen Phänotyp
beiträgt, hat zum Einzug epigenetisch wirksamer Substanzen wie DNA Methyltransferaseund Histondeacetylase-Inhibitoren in die experimentelle und klinische Forschung geführt. Im
Vordergrund der epigenetischen Behandlung steht im Gegensatz zur konventionellen
Chemotherapie weniger der zytotoxische Effekt auf Tumorzellen, als vielmehr die
Modulierung des Tumorwachstums durch die Reaktivierung von Genen mit folgendem
Wachstumsarrest oder Differenzierungsinduktion.
Trotz der vielfältigen Anwendung von DNA demethylierenden Agenzien wie Decitabine in
der experimentellen Forschung und klinischen Studien sind die Wirkmechanismen der
epigenetischen Therapie komplex und noch wenig verstanden. Als mögliche Angriffspunkte
gelten wie bereits erwähnt die Aktivierung von hypermethylierten Tumorsuppressorgenen
sowie immunologische Aspekte mit einer Sensitivierung der Tumorzellen gegenüber dem
Immunsystem. Eine in vivo Reaktivierung des Tumorsuppressorgens p15 in Folge
demethylierender Therapie konnte in MDS Patienten gezeigt werden (Daskalakis et al., 2002).
Bezüglich des immunologischen Effekts der epigenetischen Therapie in Leukämien wird die
Induktion von Genen, die für immunogenen Proteine wie CTAs oder LAAs kodieren,
diskutiert. Auf Grund der tumorspezifischen Expression und der potentiellen Immunogenität
stellen CTAs geeignete Zielstrukturen für Tumor spezifische Immuntherapie dar.
Hämatologische Neoplasien zeigen jedoch in der Regel keine CTA Expression. Das
Verständnis darüber, dass DNA Methylierung einen entscheidenden Mechanismus bei der
Regulation vieler CTAs spielt (De Smet et al., 1999; Sigalotti et al., 2002b), hat zu der
Fragestellung geführt, ob die Expression durch die Behandlung mit DNA-demethylierenden
Agenzien moduliert werden kann. Bei der Untersuchung der globalen Genexpression von
Diskussion
soliden
Tumorenzellen
86
und
normalen
Fibroblasten
nach
Behandlung
mit
der
demethylierenden Substanz Zebularine stellten sich 67% der tumor-spezifisch induzierten
Gene als Mitglieder der CTA Familie heraus (Cheng et al., 2004). Eine in-vivo Induktion der
NY-ESO-1 Expression mit Nachweis NY-ESO-1 spezifischer Antikörper konnte in Patienten
mit thorakalen Neoplasien unter DAC Behandlung gezeigt werden (Schrump et al., 2006).
Im Gegensatz zu soliden Tumoren, liegen für hämatologische Erkrankungen bisher wenige
Daten über eine mögliche CTA Induktion durch DNA-demethylierende Substanzen vor. Erste
Hinweise für eine in-vivo Induktion in AML und MDS konnten 2003 von Sigalotti et al.
gezeigt werden. Dabei konnte in 10 von 11 untersuchten Patienten eine Expression von NYESO-1, MAGEA1 und SSX mit RT-PCR nach Behandlung mit Decitabine detektiert werden
(Sigalotti et al., 2003).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Auswirkungen der DAC Behandlung auf die
Expression von CTAs und LAAs in myeloischen Zelllinien in-vitro und primäre myeloische
Blasten von AML Patienten in-vivo zu untersuchen. Dabei wurden drei klassische Vertreter
der CTA Familie NY-ESO-1, MAGEA-1 und MAGEA-3 sowie das Leukämie assoziierte
Antigen MBN analysiert. Die Gene wurden nach unterschiedlichen Kriterien gewählt. NYESO-1 gilt unter den bisher bekannten CTAs als das Antigen mit dem stärksten immunogenen
Potential. Patienten mit NY-ESO-1 exprimierenden Tumoren zeigen zu einem hohen
Prozentsatz sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Immunantwort (Jäger et al., 2000b).
MAGEA1 stellt als erstes identifiziertes CTA den Prototypen dieser Genfamilie dar (van der
Bruggen et al., 1991). Darüber hinaus konnte die DNA Methylierung als entscheidenden
Mechanismus der MAGEA1 Expressionsregulation identifiziert werden (De Smet et al.,
1999). Eine MAGEA1 spezifische Immunantwort konnte sowohl auf zellulärer als auch auf
humoraler Ebene detektiert werden (Stockert et al., 1998; van der Bruggen et al., 1991).
MAGEA3 stellt das in vielen soliden Tumoren am häufigsten exprimierte CTA dar. Für alle
drei Gene konnte bereits eine DAC induzierte Expression in Zelllinien von soliden Tumoren
gezeigt werden mit funktioneller Aktivität als Zielstruktur für spezifische T-Zellen (Coral et
al., 2002; Karpf et al., 2004; Sigalotti et al., 2002b; Weber et al., 1994; Weiser et al., 2001a).
MBN zeigt in 67% der akuten myeloischen Leukämien eine Überexpression (Greiner et al.,
2006). Bei der Regulation der Expression scheint ebenfalls DNA Methylierung eine
entscheidende Rolle zu spielen (Lubbert et al., 1999).
Zunächst wurde der Einfluss der DAC Behandlung auf die Zellproliferation und Viabilität der
myeloischen Leukämiezelllinien Kasumi-1, HL60 und U937 untersucht. Dabei führte die
Behandlung mit niedrigen DAC Konzentrationen primär zu einer Inhibition der
Diskussion
87
Zellproliferation bei nur geringem Abfall der Viabilität. Anschließende Untersuchungen der
NY-ESO-1 Protein Expression konnten die NY-ESO-1 Induktion im Rahmen der DAC
Behandlung in 4/5 untersuchten myeloischen Leukämiezelllinien herausstellen, wobei jedoch
Unterschiede hinsichtlich der Expressionsstärke in verschiedenen Zelllinien auffielen. In
Kasumi-1 Zellen konnte eine besonders hohe Sensitivität auch gegenüber niedrigen DAC
Konzentrationen festgestellt werden. Die Behandlung mit dem Zytostatikum Cytarabin zeigte
keine Induktion der NY-ESO-1 Expression. Die starke NY-ESO-1 Induktion in U937
zusammen mit der Beobachtung, dass U937 im Vergleich zu den anderen Zelllinien den
geringsten Abfall der Viabilität an Tag 6 und 200 nM DAC zeigte, deuten auf einen primär
nicht zytotoxischen Wirkungsmechanismus der Substanz hin.
Durch die im Weiteren durchgeführte Untersuchung der NY-ESO-1, MAGEA1, MAGEA3
und MBN mRNA Transkription in Kasumi-1 mittels quantitative RT-PCR konnten wichtige
Erkenntnisse sowohl über die zeitliche Kinetik der DAC Wirkungsweise, als auch über den
Einfluss der eingesetzten Konzentration gewonnen werden. Alle drei untersuchten CTAs
zeigten eine deutliche zeit- und konzentrationsabhängige Induktion der Transkription mit
einem Maximum nach 144 Stunden und Exposition mit 200 nM DAC, die für NY-ESO-1
auch auf Proteinebene nachgewiesen werden konnte. Bei fortgesetzter Kultivierung der
Kasumi-1 Zellen ohne weitere DAC Exposition zeigte sich die CTA Expression zu den
späteren Zeitpunkten verglichen mit der Transkription an Tag 6 zwar deutlich reduziert,
jedoch immer noch über den Ausgangswerten in den unbehandelten Kontrollzellen. Die
Myeloblastin Transkription war bereits vor Behandlung in Kasumi-1 detektierbar. Im Zuge
der DAC Behandlung konnte eine weitere zeitabhängige Steigerung der Expression
nachgewiesen werden, diese zeigte jedoch keinen Unterschied bezüglich der eingesetzten
DAC Konzentration.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Aktivierung von CTAs im Rahmen der DAC
Behandlung einen passageren Effekt darstellt, welcher mit zeitlichem Abstand zur Exposition
wieder rückläufig ist. Dabei stellt sich die Frage, ob eine erneute Exposition der Zellen mit
DAC zu einer stabileren Induktion der Expression führen könnte. Um diese Frage zu
adressieren, wurden in einem weiteren Ansatz Kasumi-1 Zellen zwischen Tag 7 und 10 einer
zweiten DAC Exposition zugeführt. Die Doppelbehandlung wurde von den Kasumi-1 Zellen
jedoch sehr schlecht toleriert und der Versuch konnte aufgrund von sehr geringen
Viabilitätswerten nicht weitergeführt werden.
Globale Genexpressionsanalysen der Kasumi-1 Zellen vor und nach DAC Behandlung mittels
Microarray Technologie zeigten eine Hochregulation von 10 der 67 auf dem U133plus Chip
Diskussion
88
vertretenen CTAs. Dabei wurden vorwiegend Genfamilien bildende, X-chromosomal
lokalisierte Mitglieder der CTA Familie induziert. Die primäre Induktion der Expression Xchromosomal gelegener CTAs legt einen gemeinsamen Regulationsmechanismus nahe.
Während für die Mitglieder der MAGE Familie vor allem die Demethylierung von CpG
Inseln in der Promotorregion in Frage kommt, weisen andere CTAs keine klassischen CpG
Inseln in der Promotorregion auf. Dabei wird vor allem der Mechanismus der NY-ESO-1
Regulation kontrovers diskutiert. NY-ESO-1 zeigt CpG reiche Regionen im Bereich des
Promotors und des ersten Exons, die jedoch nicht den von Takai und Jones vorgeschlagenen
Kriterien für CpG Inseln (Größe zwischen 0.5bp und 5kb, GC Anteil > 55% , Verhältnis von
tatsächlich vorliegenden GpCs zur Menge der erwateten CpGs >0.65) entsprechen (Takai and
Jones, 2002). Während die Gruppe um Schrump keine Korrelation zwischen DNA
Methylierung im Bereich des NY-ESO-1 Promotors und der Transkription zeigen konnte,
beobachteten
James
et
al.
einen
Zusammenhang
zwischen
Demethylierung
und
transkriptioneller Aktivierung. Beide Gruppen nutzten Bisulfit Sequenzierung für ihre
Untersuchungen (Hong et al., 2005; James et al., 2006).
Als weiteren Regulator der MAGEA1 und NY-ESO-1 Expression wird BORIS diskutiert.
BORIS stellt ein paraloges Gen zu dem ubiquitär vorkommenden CTCF dar, welches unter
anderem eine wichtige Rolle bei der Organisation der Chromatinstruktur spielt, und wird auf
Grund seiner tumorspezifischen Expression ebenfalls zu der Gruppe der CTAs gerechnet
(Vatolin et al., 2005). Untersuchungen in Bronchialkarzinom Zelllinien konnten eine DAC
induzierte Aktivierung der BORIS Expression mit folgender direkter Interaktion zwischen
BORIS und dem MAGEA1 bzw. NY-ESO-1 Promotor, die zu einer Aktivierung der
Transkription beider Gene führte, zeigen (Hong et al., 2005; Vatolin et al., 2005). Die
Aktivierung von MAGEA1 und NY-ESO-1 im Zuge der DAC Behandlung scheint in
Bronchialkarzinomen somit neben demethylierenden Effekten auf CpG Inseln innerhalb der
Promoterregion der Gene auch auf einer direkten Interaktion mit BORIS zu beruhen.
In den, in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Microarray Daten, konnte jedoch keine
Induktion der BORIS Expression bei Behandlung von Kasumi-1 mit DAC beobachtet werden,
so dass dieser Regulationsmechanismus in myeloischen Zellen möglicherweise keine so
entscheidende Rolle spielt. Die Beobachtung, dass der knockout von DNMT1 und DNMT3b
in Zelllinien kolorektaler Karzinome zu einer starken Induktion von MAGEA1, XAGE1 und
NY-ESO-1 führt, ist ein weiterer Hinweis auf eine primäre Regulation der CTA Expression
durch DNA Methylierung (James et al., 2006). Dennoch konnte für einige Gene eine
Diskussion
89
methylierungs-unabhängige Induktion durch DAC gezeigt werden, so dass andere bisher nicht
bekannte Regulationsmechanismen möglicherweise eine Rolle spielen (Schmelz et al., 2005).
Um die Effekte demethylierender Therapie in-vivo besser zu verstehen, analysierten wir
primäre Blasten von AML Patienten vor und nach Decitabine Behandlung hinsichtlich der
Expression von NY-ESO-1, MAGEA1, MAGEA3 und MBN. Ein solcher Ansatz war von
daher möglich, da im Rahmen der multizentrischen Phase II AML Studie 00331, AML
Patienten in der Medizin I des Universitätsklinikums Freiburg mit Decitabine behandelt
werden. Da wir die Blasten nach der Ficoll Dichtezentrifugation nicht weiter aufreinigten,
wurden nur Patienten mit einem Blastengehalt im peripheren Blut von über 50% in die
Untersuchungen eingeschlossen.
7 Patienten wurden hinsichtlich der CTA Expression im Rahmen der DAC Behandlung mit
RT-qPCR analysiert. Während vor Behandlung in keinem der Patienten eine Expression von
NY-ESO-1, MAGEA1 oder MAGEA3 detektiert werden konnte, kam es in 2 der 7
untersuchten Patienten zu einer Induktion der NY-ESO-1 Expression, die sich im zeitlichen
Verlauf steigerte. Eine Änderung der MAGEA1 oder MAGEA3 Transkription konnte nicht
beobachtet werden. MBN Expression konnte in allen untersuchten Patienten bereits vor
Behandlung detektiert werden, wobei die Stärke der Expression individuelle Abweichungen
zeigte. Eine Steigerung der Transkription konnte nicht beobachtet werden.
Microarray
Untersuchungen primärer Blasten von 6 AML Patienten zeigten eine Induktion von
mindestens einem der untersuchten Gene in 2 Patienten, eine gemeinsames Muster regulierter
Gene konnte nicht festgestellt werden.
Die in primären Blasten nur in einigen Fällen beobachtete CTA Induktion steht im Kontrast
zu den in-vitro generierten Daten, die einen deutlichen Effekt der DAC Behandlung
hinsichtlich der CTA Expression zeigen konnten. Einige Erklärungsmöglichkeiten kommen in
Frage. AML Patienten werden im Rahmen der AML Studie 00331 72h mit insgesamt
135mg/m² Decitabine behandelt. Diese Dosierung ist möglicherweise zu gering, um die unter
Kulturbedingungen vorliegenden Wirkspiegel zu erreichen. Darüber hinaus kann der
demethylierende Effekt von DAC nur bei ausreichender Zellreplikation zum Tragen kommen.
Bei einer Verdopplungszeit der kultivierten Zelllinien zwischen 24 und 48 Stunden, sind zum
Tag 6 Zeitpunkt also bereits mindestens drei Zellteilungsschritte erfolgt. Die Wachstumsrate
der primären Blasten in-vivo ist im Vergleich zu den Zelllinien deutlich geringer, so dass die
maximalen DAC Effekte möglicherweise erst zu späteren Zeitpunkten zum Tragen kommen
und die gewählten Zeitpunkte zu früh sind, um eine CTA Expression nachweisen zu können.
Für diese Hypothese sprechen die von Sigalotti et al. publizierten in-vivo Daten, die eine CTA
Diskussion
90
Induktion in AML und MDS an Tag 15 und 30 nach Decitabine Behandlung zeigen (Sigalotti
et al., 2003). Darüber hinaus wurden in der vorliegenden Arbeit nur Patienten mit einem
Blastengehalt von über 50% analysiert. Hintergrund für das von uns angewendete Vorgehen
war der Gedanke, ohne weitere Selektion der malignen Zellen eine möglichst reine
Blastenpopulation zu untersuchen. Durch die Auswahl der Patienten nach dem Blastengehalt
im peripheren Blut wurde jedoch auf der anderen Seite nur ein selektioniertes Patientengut
mit fortgeschrittener Erkrankung und schlechter Prognose untersucht.
Die Frage, ob die DAC induzierte CTA Expression einen spezifischen in Tumorzellen
vorkommenden Effekt darstellt oder auch in normalen Geweben unter DAC Exposition zu
beobachten ist, war bereits Bestandteil verschiedener in-vitro Untersuchungen. Dabei konnte
von verschiedenen Gruppen gezeigt werden, dass die DAC Exposition von kultivierten
Epithelien des Bronchialsystems oder des Mammagewebes, von Melanozyten (Weiser et al.,
2001a) (Karpf et al., 2004) sowie von normalen Fibroblasten (Cheng et al., 2004) und
peripherer mononukleärer Zellen (Schmelz et al., 2005) die Zellproliferation im Vergleich zu
Tumorzellen nur wenig beeinträchtigte und keine Induktion der CTA Expression bewirkte.
Bemerkenswerterweise konnte gezeigt werden, dass die DAC Exposition in normalen
Epithelien zwar zu einer Demethylierung der MAGEA1 Promotorregion führte, diese aber
nicht in einer transkriptionellen Aktivierung resultierte. Bei der Transfektion der Zellen mit
einem MAGEA1 Promotor Konstrukt zeigte dieses in den Epithelzellen eine deutlich
geringere Aktivität verglichen mit den transfizierten Tumorzellen (Karpf et al., 2004).
Darüber hinaus wurde die MAGEA1 Promotormethylierng in peripheren mononukleären
Zellen im Rahmen einer klinischen Studie mit kontinuierlicher DAC Infusion über 7 Tage in
zehn Patienten mit soliden Tumoren untersucht. Eine Woche nach der Beendigung der
Infusion (d14) konnte in allen Patienten eine deutliche Reduktion der Methylierung
beobachtet werden. Ob die Änderung des Methylierungsprofils in den PBMCs auch in einer
MAGEA1 Expression resultierte, wurde jedoch nicht untersucht, so dass der DAC Effekt auf
normale Zellen in vivo nicht ausreichend geklärt ist (Samlowski et al., 2005).
Die relativ geringen
Auswirkungen auf die CTA Induktion in AML Patienten durch
Decitabine Behandlung eröffnet die Frage auf mögliche Therapiestrategien, um diesen Effekt
weiter zu verstärken. Auf der Grundlage unserer eigenen Experimente sowie publizierten
klinischen Daten ergeben sich einige weitere Möglichkeiten:
Auf Grund der Beobachtung, dass der DAC induzierte Effekt auf die Genexpression nach
einer gewissen Zeitspanne wieder rückläufig ist, wurde eine Doppelinduktion bei Patienten
mit Zellzahlen über 40.000/µl in die AML-Studie 00331 integriert. Dabei erfolgt an Tag 7-9
Diskussion
eine
wiederholte
91
Behandlung
über
3
Tage.
Untersuchungen
der
globalen
Genexpressionsänderung zu verschiedenen Zeitpunkten während der ersten und zweiten
Induktion sind geplant. Darüber hinaus konnten Untersuchungen in BronchialkarzinomZelllinien einen synergistischen Effekt zwischen DAC und dem HDAC Inhibitor
Depsipeptide (DP) hinsichtlich der NY-ESO-1 und MAGEA3 Induktion nachweisen (Weiser
et al., 2001a; Weiser et al., 2001b). Eine weitere Möglichkeit die CTA Expression in AML
weiter zu forcieren,
könnte somit durch den kombinierten Einsatz von DNA
Methyltransferase-Inhibitoren und Histondeacetylase Inhibitoren erreicht werden.
In einer kürzlich erschienenen Untersuchung von Patienten mit multiplem Myelom auf
Antikörper gegen NY-ESO-1, MAGEA3 und SSX2 konnten diese nur in Patienten mit
vorausgegangener allogener Stammzelltransplantation (SCT) detektierte werden. Da sowohl
vor der SCT als auch im Serum der gesunden Spender keine Antikörper nachgewiesen
werden konnten, gehen die Autoren von einem spezifischen durch die Transplantation
ausgelösten Effekt aus (Atanackovic et al., 2007). Kombinationsbehandlungen von AML
Patienten mit demethylierenden Agenzien und anschließender Stammzelltransplantation
werden in der medizinischen Klinik der Universität Freiburg bereits im Rahmen von
klinischen Studien durchgeführt. Eine Analyse des Serums von Patienten mit DAC + SCT
sowie von Patienten mit reiner DAC Exposition hinsichtlich gegen CTAs und LAAs
gerichteter Antikörper wäre ein interessanter weiterer Ansatz. Bereits durchgeführte
stichprobenartige Serum Untersuchungen von DAC behandelten Patienten ohne SCT auf NYESO-1 Antikörper fielen negativ aus.
Während CTAs in vielen soliden Tumoren exprimiert werden und spontane Immunantworten
detektiert werden können, zeigen Leukämien keine Expression der typischen CTAs.
Leukämische Zellen zeigen sich im Verglich zu soliden Tumoren eventuell gegenüber einer
Expression dieser Gene in-vivo auch unter DAC Exposition weniger sensitiv. Möglicherweise
kommen den in vielen Leukämien stark exprimierten LAAs ein wichtigere Rolle bezüglich
einer gegen maligne Zellen gerichteten Immuntherapie zu. Klinische Studien mit gegen
verschiedene LAAs gerichteten Vakzinen werden bereits durchgeführt (Greiner et al., 2006).
Eine potentielle Einschränkung der CTAs als Zielgene für Tumor spezifische Immunisierung
in soliden Tumoren stellt sowohl die heterogene Expression der CTAs, als auch die zum Teil
sehr niedrigen Expressionslevel mit der Folge einer Selektion der CTA negativen Tumorklone
(Sigalotti et al., 2004) dar. Eine mögliche Strategie zur Überwindung dieser Einschränkungen
besteht in der kombinierten Behandlung aus epigenetischer und immunologischer Therapie.
Erste in-vivo Hinweise für den Erfolg einer solchen Strategie konnten in Mausmodellen
Diskussion
92
gezeigt werden. Bei der Behandlung muriner Xenografts unterschiedlicher Tumoridentitäten
mit DAC konnte eine in-vivo Induktion des murinen CTA P1A gezeigt werden. Eine P1A
Expression konnte dabei in Tumorzellen jedoch nicht in normalen Geweben der Maus
nachgewiesen werden. Der anschließende Transfer von P1A spezifischen T-Zellen in die
behandelten Mäuse führte zu einer signifikanten Reduktion der Metastasenanzahl im
Vergleich zu den Kontrolltieren (Guo et al., 2006).
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit eine Aktivierung von Cancer Testis und
Leukämie assoziierten Antigenen in-vitro und in-vivo durch die DNA-demethylierende
Substanz 5-aza-2’-deoxycytidine gezeigt werden. Die beobachtete CTA Aktivierung deutet
auf eine immunologische Komponente des anti-leukämischen Potentials von DAC hin. Dabei
stellt insbesondere die CTA Induktion in-vivo eine wichtige Erkenntnis für eine mögliche
Kombination epigenetischer und immunologischer Behandlungsansätze dar. Um die
Mechanismen und die Bedeutung der in-vivo Regulation von CTAs in myeloischen Zellen
besser zu verstehen, sind jedoch weitergehende Untersuchungen der CTA Expression in
primären Blasten einer größeren Patientenzahl sowie in aufgereinigten CD34 positiven
Blastenpopulationen nach DAC Behandlung sinnvoll. Weitere wichtige Erkenntnisse können
durch funktionelle Untersuchungen der aktivierten CTAs hinsichtlich ihres Potentials
spezifische Antikörper oder T-Zellen Antworten zu induzieren, gewonnen werden.
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107
Abkürzungsverzeichnis
AML
Akute myeloische Leukämie
AraC
Cytarabin
°C
Grad Celsius
bp
Basenpaare
ca.
cicra
cDNA
komplemantäre DNA
CpG
CpG-Dinukleotid
CTA
Cancer Testis Antigen
d
Tag
Da
Dalton
DAC
5-aza-2’-deoxycytidine
DMSO
Dimethylsufoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNMT
DNA Methyltransferase
dNTP
Desoxyribonukleotidtriphosphat
DTT
Dithiothreitol
et al.
Et alii (und andere)
etc.
et cetera
FCS
Fötales Kälberserum
g
Gramm
ggf.
gegebenenfalls
h
Stunde
HAT
Histonacetylase
HDAC
Histondeacetylase
HDACI
Histondeacetylase Inhibitor
kb
Kilobasenpaare
kDa
Kilodalton
l
Liter
LAA
Leukämie assoziiertes Antigen
m
milli
M
Molar
min
Minute
mRNA
Messenger-RNA
n
nano
N
normal
OD
Optische Dichte
p
pico
PCR
Polymerase- Kettenreaktion
108
qPCR
Quantitative Polymerase-Kettenreaktion
RNA
Ribonukleinsäure
RT
Reverse Transkription
rpm
Umdrehungen pro Minute
s
Sekunde
TAA
Tumor assoziiertes Antigen
U
Units (Enzymeinheit)
u.a.
unter anderem
v.a.
vor allem
Vol
Volumen
z.B.
zum Beispiel
µ
mikro
109
Die Seiten 109- 111 (Danksagung) enthalten persönliche Daten. Sie sind deshalb nicht
Bestandteil der Online-Veröffentlichung."
110
111
Die Seiten 111- 112 (Lebenslauf) enthalten persönliche Daten. Sie sind deshalb nicht
Bestandteil der Online-Veröffentlichung."
112