versuc~1

Versuch 9
„Immunfluoreszenzfärbung“
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Wird benotet?:
Max Mustermann
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JP Dr. Gehrig & S. Lemcke
Einleitung
Ziel des Versuches ist die Fluoreszenzfärbung von Mikrotubuli und DNA in glatten
Gefäßmuskelzellen. Die Färbung der Mikrotubuli erfolgt durch
Immunfluoreszenzfärbung, die DNA wird mit dem interkalierenden
Fluoreszenzfarbstoff DAPI gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden vorher entweder mit
Nocodazol, mit Taxol oder gar nicht behandelt (Kontrolle).
Fluoreszenzmikroskopie
Bei der Fluoreszenzmikroskopie werden Zellbestandteile mit fluoreszierenden
Farbstoffen markiert und so sichtbar gemacht. Die Färbung geschieht meist mittels
direkter oder indirekter Immunfluoreszenzfärbung. Bei der direkten
Immunfluoreszenzfärbung bindet ein, für den zu färbenden Zellbestandteil (Antigen)
spezifischer, fluoreszenzmarkierter Antikörper (ein mit einem Fluorophor verknüpftes
Immunglobulin) direkt an das Antigen der Zelle.
Bei der meist verwendeten indirekten Immunfluoreszenzfärbung bindet der
fluoreszenzmarkierte Antikörper (Sekundärantikörper) nicht direkt an das Antigen,
sondern an einen unmarkierten Primärantikörper, welcher für das Antigen spezifisch
ist. Die Methode der indirekten Färbung erlaubt mehr Flexibilität, da eine Vielzahl von
Primärantikörpern mit den gleichen markierten Sekundärantikörpern kombiniert
werden können, was eine Kostenersparnis mit sich bringt. Ausserdem ist diese
Methode um ein Vielfaches empfindlicher, da mehrere Sekundärantikörper mit den
verschiedenen Epitopen des Primärantikörpers reagieren können.
Ist die Behandlung mit den Fluorenszenzfarbstoffen erfolgt wird die Zelle mit Licht
bestrahlt, welches die Fluorophore absorbieren und kurz darauf (im
Femtosekundenbereich) in einer für sie spezifischen Wellenlänge (die länger ist die
des absorbierten Lichts) wieder emittieren. Mit Fluoreszenzmikroskopen kann die
behandelte Probe mit Licht der benötigten Wellenlänge bestrahlt werden und das
emittierte Licht gleichzeitig beobachtet werden.
Material und Methoden
Der Versuch wurde nach Versuchsanleitung durchgeführt. Diese und die
verwendeten Reagenzien sind auf den Seiten 42 – 44 im Skript zu finden.
Ergebnisse
Vascular-smooth-muscle-cell (VSMC) aus der Kontrollgruppe
Vergr. 100x; Balken = 10 µm
− α-Tubulin gefärbt mit Cy3 in rot
− Nucleus gefärbt mit DAPI in blau
Bild 1
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VSMC behandelt mit Nocodazol
Bild 2
− α-Tubulin gefärbt mit Cy3 in rot
− Nucleus gefärbt mit DAPI in blau
Bild 3
VSMC behandelt mit Taxol
Bild 4
Bild 5
− α-Tubulin gefärbt mit Cy3 in rot
− Nucleus gefärbt mit DAPI in blau
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Vergleicht man die Kontrollzellen mit denen, die mit Nocodazol oder Taxol behandelt
wurden, kann man sehen, dass
-
die mit Taxol behandelten Zellen eine sehr längliche, schmale Form haben.
-
bei den mit Taxol behandelten Zellen der Zellkern dadurch teilweise sehr
eingeengt ist.
-
die unbehandelten Kontrollzellen und die mit Nocodazol behandelten Zellen
breiter sind als die mit Taxol behandelten.
-
bei den mit Taxol behandelten Zellen insgesamt, jedoch speziell in der
Peripherie des Zellkerns, im Vergleich zu Kontroll- und Nocodazolgruppe eine
höhere Dichte von α-Tubulin zu erkennen ist.
-
bei den mit Nocodazol behandelten Zellen auch im Vergleich zu den
Kontrollzellen eine geringere Dichte an α-Tubulin (nur vereinzelte Stränge) zu
erkennen ist.
Diskussion der Ergebnisse
Das Zytoskellet ist für Tierzellen, die keine Zellwände besitzen, besonders wichtig.
Das Gerüst, welches sich aus drei Proteinfilamenttypen zusammensetzt,
repräsentiert nicht nur die „Knochen“ sondern auch die „Muskeln“ der Zelle. Die drei
Filamenttypen sind die Intermediärfilamente (oft aus Vimentin), Mikrofilamente (aus
Actin) und die Mikrotubuli (aus Tubulin).
Mikrotubuli haben in Zellen mehrere Aufgaben. Sie bilden innerhalb der Zelle ein
Schienensystem für Vesikel, Organellen und andere Zellkomponenten. Somit legen
sie weitgehend die Lage der membranumhüllten Organellen in der Zelle fest und
lenken den intrazellulären Transport. In der M-Phase der Mitose bilden Mikrotubuli
die Mitosespindel aus und sind so essentiell für die Zellteilung. Mikrotubuli als
Axonem angeordnet können auch zur Fortbewegung ganzer Zellen oder zur
Bewegung von Flüssigkeiten über Zelloberflächen dienen. Mikrotubuli sind auch zu
einem Großteil an der Gestalt und Stabilität (Druckresistenz) von Zellen beteiligt.
Die Mikrotubuli des Zytoskeletts sind keine statischen Strukturen, sondern werden
laufend auf- und abgebaut und neu umorganisiert. Dieses Charakteristikum der
Mikrotubuli nennt man dynamische Instabilität. Wenn die Untereinheiten, Dimere
bestehend aus den globulären Proteinen α- und β-Tubulin, sich an wachsende
Mikrotubuli addieren, haben sie GTP gebunden. Gebundenes GTP verleiht den
Dimeren eine hohe Affinität zu anderen Tubulin Dimeren. Wird das GTP allerdings zu
GDP hydrolysiert verringert sich die Affinität der Untereinheiten zueinander stark.
Findet die Hydrolyse von GTP am Plus-Ende des Mikrotubulus statt, kann dies den
Zerfall dessen in seine Untereinheiten bewirken. Um sich erneut an einen
wachsenden Mikrotubulus oder das Centrosom zu lagern, müssen die Dimere die
frei im Cytosol vorliegen, ihr GDP gegen GTP austauschen um wieder
polymerisationsfähig zu werden. Nocodazol verhindert das.
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Nocodazol ist das künstliche Äquivalent zum Colchizin, dem Gift der Herbstzeitlose.
Es lagert sich an die „exchange site“ des Tubulin Dimers und verhindert so den
Austausch von GDP gegen GTP.
Am Bild 2 sieht man, dass in der Tat die mit Nocodazol behandelte Zelle eine im
Vergleich zur Kontrollgruppe niedrigere Dichte an Mikrotubuli aufweist. Nur einzelne
Stränge, die wahrscheinlich durch Proteine stabilisiert sind, befinden sich im
polymerisierten Zustand (Ausschnitt Bild 3).
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Taxol ist das Gift der pazifischen Eibe. Es wirkt im Gegensatz zu Nocodazol oder
Colchizin bei Bindung an Mikrotubuli stabilisierend auf diese. Die Mikrotubuli können
dann nicht mehr depolymerisieren, sondern sich nur noch verlängern.
Dies sieht man gut an Bild 4 und 5. Die Zellen sind
hier unnatürlich langgestreckt (Kontrollzellen sind
breiter), sodass sogar einmal der Zellkern
eingequetscht wird (Bild 4). Der Grund für die
Streckung der Zellen ist, wie oben genannt, dass die
Mikrotubuli bei Behandlung mit Taxol nur noch
wachsen können. Dies haben die Mikrotubuli auch
Taxol
getan und haben sich solange verlängert bis die
Zelle sich nicht mehr mit verlängern konnte. Der daraus resultierende Endzustand ist
auf Bild 4 und 5 zu sehen.
Mitosestadien
Nocodazol und Taxol sind beide Spindelgifte. Beide sind für Zellen tödlich und
verhindern die Zellteilung. Somit stammen Bilder zu den Mitosestadien von der
Kontrollgruppe.
Die Bilder zeigen in schwarz-weiß nur die DNA, die mit DAPI angefärbt worden ist.
Minus Cy3
Bild 6
Bild 7
Zeitliche Abfolge der Bilder
Bild 8
Bild 11
Bild 9
Bild 10
1. In Bild 8 sieht man den Zellkern während der Prophase. In der Prophase
kondensieren die replizierten Chromosomen, die auf dem Bild als ineinander
verworrene dicke Linien zu erkennen sind
2. In Bild 9 beginnen sich die nun fertig kondensierten Chromosomen in der
Äquatorialebene der Zelle anzuordnen. Zuvor ist der Zellkern in Bruchstücke
zerfallen und hat die DNA ins Zytosol freigegeben. Die Zelle befand sich
wahrscheinlich in der Metaphase.
3. In Bild 10 sind die Chromosomen schon weiter von der Äquatorialebene
entfernt als ein Bild zuvor. Der Spindelapparat zieht nun die
Tochterchromosomen zu den Zellpolen. Beginnende Anaphase.
4. Auf Bild 11 sind die Chromosomen schon in der Nähe der Zellpole. Telophase
und Cytokinese.
5. Bild 7 könnte den Zustand darstellen der auf Bild 11 folgen würde. Die
Cytokinese, der letzte Teil der M-Phase, ist vorüber und die DNA liegt
unkondensiert in den Zellkernen der jetzt eigenständigen Zellen vor, wo sie
erneut repliziert wird. In diesem Zustand, der Interphase genannt wird,
verbringt die Zelle über 90% der Zeit.
Quellen
-Skript zum Biochemischen Grundpraktikum, Institut für Biochemie, J.-G.-Universität-Mainz
-Biochemie, Stryer, Spektrum 1994 (2. durchgesehene Auflage)
-Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Alberts, Wiley-VCH, 2001 (2. korrigierte Auflage)
http://www.med-rz.uni-sb.de/med_fak/humangenetik/skripte/skriptgrundpraktikumbioinformatik.pdf
http://pharm1.pharmazie.uni-greifswald.de/systematik/6_droge/taxol.htm