for the degree of presented by Science - ETH E

Diss.
ETH
No.
10127
THE USE OF THE RAT WHOLE EMBRYO CULTURE FOR MECHANISTIC
INVESTIGATIONS INTO CONCEPTAL METABOLISM
A dissertation
submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY
ZURICH
for the degree of
Sciences
Doctor of Natural
presented by
GERRARD DIRK CORNELIS TERLOUW
Master of
Science,
University of Leiden
born lAth of March 1964
Middelharnis,
accepted
Prof.
Dr.
Dr.
R.
on
the
Ch.
The Netherlands
recommendation of
Schlatter, examiner
Bechter, co-examiner
Zurich 1993
7
SUMMARY
thesis
This
describes
metabolic
capacity
especially
into
model
the
compound
during
vitro
of
ability
208-199
QA
into
investigations
the
in
the
early
organogenesis
the conceptus
the
using
conceptal
rat
metabolize
to
whole embryo
rat
and
the
culture
system.
1
Chapter
gives
and
toxicology,
compounds
are
P450 monooxygenase
the
QA 208-199
In
Chapters
observed
is added
after addition
to
visceral
vitro,
given
compound,
Vhen
an
(QAA),
not
the culture medium.
QAA and
to
yolk
sac
a
tissue
peak activity
as
the
is
cytochrome
cause
In
and
the metabolites
also described.
the addition of
QAB is
metabolizing system
induced with
less
severe
Aroclor
dysmorphogenic
uM). The main
in vivo
embryotoxicity
in vitro
vitro, QAB is metabolized
series of at
concerns
the
potential of
external
(NOAEL 11.6
does
is
as
possible model
of
that after
teratogenic
a
observed.
are
the conceptus
and
model
reproductive
analytical determination
the culture medium,
to
209-668
metabolite,
Various
is
homogenate S9-fraction,
liver
of QAB
The
of
identification of
the
used
uM).
3.9
(NOAEL
1254s)
The
system.
is demonstrated
it
field
whole embryo culture
system.
synopsis
culture medium,
(adult
by
the
and 3
2
rat
effects
enzyme
(QAB),
the
to
test
a
concerning
difficulties
of
QAB
particular
discussed and
the
the rodent
teratogenicity
in vitro
an
of
overview
an
in
least
major site
six metabolites.
of metabolism in
metabolism in vitro
is
during
prenatal days 10-12.
produces marginal effects
QAB
microinjection of
after
is shown
in
Chapter
4.
onic
in
differentiation at
all
compound into
the amniotic
the
compound. QAA
only the highest
also
occur
groups,
although
or
as
in
a
intra-
impairs embry¬
concentration and after
injections only. Dysmorphogenic effects
experimental
only
cavity
fashion after either exocoelomic
microinjections of
intraamniotic
embryonic differentiation
Dysmorphogenic effects, however,
concentration-dependent
amniotic
the
on
are
the differences
observed
are
not
8
statistically
when
significant
These data
controls.
concomitant
probably
QAA most
responsible for the
QAB-metabolite
the
with
compared
that
indicate
is
not
embryotoxic action of
the
QAB in
vitro.
Chapter 5 it is
In
or
cytochrome
metabolism
P450 inhibitor,
results
of QAB in vitro.
vitro
is
PB,
to
response
uM),
itself
9.5
when added
for
impairment
causing anomalies,
In
fold
(NOAEL
In
3.6
uM).
At
an
causes
no
increase in
the
embryos
the
in
lead
equimolar
These
N-demethyl-QAB,
could be
the
embryotoxicity
It
can
The visceral
metabolism
is
results
of QAB
concluded
to
a
than QAB
12 uM).
in
yolk
cytochrome
The
of
11
vitro
and
uM
an
(NOAEL
for
of
0.7
mM,
differentiation and
and
that
N-desoxy-QAB
is shown,
of
whereas QAB
dysmorphogenic
affecting growth
and
N-desoxy-QAB, but
not
proximate dysmorphogen responsible for
vitro.
in
that
dependent.
concentration
without
indicate
the
less active
increase
an
addition,
N-demethyl-QAB (41 uM)
of anomalies
concentrations
conceptal
growth retardation
growth
on
involve¬
vitro metabolite
concentration
a
a
for differentiation
is
the NOAEL of
effects
incidence
differentiation.
be
severe
intraamniotic
both
N-desoxy-QAB
at
causes
the
as
embryotoxicity
be age
to
higher than for QAB (NOAEL 3.9 uM) and
N-demethyl-QAB
vitro.
QAB
(NOAEL for growth and differentiation
3.6 uM).
and
to
appears
that
(CO)
the
in
ones.
culture medium,
of differentiation at
no
old
122 uM and
growth
the
to
dams with
conceptuses after preex¬
old
day
N-desoxy-QAB
10
suggest
susceptible
metabolite
is
day
6
Chapter
N-demethyl-QAB (NOAEL
41
less
to
the
1254R, 3-methylcholan-
strongly
preinduction
to
in
described
10.5
of
carbon monoxide
using
are
compared
as
embryonic
It
and
in utero
posure
in
phenobarbital)
cytochrome P450-dependent monooxygenases
of
ment
by preinduction
cytochrome P450 inducers (Aroclor
various
threne
that
stated
the rat
sac
is
the
conceptus metabolizes QAB
major site of metabolism. The
P450-dependent
activity during prenatal days
10-12.
in
Various
and
has
its
maximum
(specific?) conceptal
9
cytochrome P450 isoforms
N-desoxy-QAB,
a
may
but not QAA
or
be
involved in the metabolism of QAB.
N-demethyl-QAB,
possible proximate dysmorphogen.
has been shown
to
be
11
ZUSAMMENFASSUNG
Die
vorliegende
metabolische
Kapazitat
wahrend
frtthen
der
Fahigkeit
Kapitel
vitro
Rattenembryos in
die
in der
und
Teratogenese.
werden diskutiert
die
Kapiteln
3.9
2
uM).
208-199
QA
zu
vird
kurz
zusammengefasst.
Schwierigkeiten
3 vird
und
Die
1254R)
(NOAEL
11.6 uM).
ein
eines
reduziert
Kulturmedium,
Der
wichtigste
zeigt keine Embryotoxizitat
QAA und mindestens
Der
Metabolismus
und
maximale Aktivitat
(QAB) werden besprochen.
dass
nachdem
QAB,
die
ins
metabolisierenden
induziert
mit Aroclor
Embryotoxizitat
in vivo Metabolit
QAB wird
allem im
vom
QAB
von
209-668
(QAA)
Embryo in vitro
metabolisiert.
visceralen Dottersack statt
wahrend der prenatalen
wurde
es
teratogenes Potential hat
externen
in vitro.
vor
analytische
Die
sechs weiteren Metaboliten
findet
mogliche
betreffs der Identifikation der
gezeigt,
Zugabe
Kultur als ein
Verschiedene
(Rattenleberhomogenat S9-Fraktion,
ins
zu
vivo
und das Cytochrom P450-Monooxy-
Kulturmedium hinzugefiigt vorden ist,
Systems
ex
Uber die
Speziellen
Nagetierembryo
Metaboliten der Modelsubstanz QA 208-199
(NOAEL
die
vitro und
Modelsubstanz
und besonders uber die
Enzymsystem
den
Uber
Vervendung der Ganzembcyonen Kultur.
Testsystem
Bestimmung
In
im
und
Organogenese,
unter
Modelsubstanzen
genase
Untersuchungen
gibt einen Uberblick uber das Gebiet der Reproduktions-
1
toxikologie,
in
des
Embryos
des
metabolisieren
beschreibt
Arbeit
Tage 10-12
gemessen.
Im
Kapitel
embryonale
Amnionsack
sind
gezeigt,
dass
QAB
geringfiigige
Differenzierung hat,
nur
nachdem die Substanz
(mikro)injiziert
embryonale
alien
treten
sind
Gruppen
nach
nur
aber
.
in den
in
der
signifikant
im
aber die
Vergleich
zu
der
schadigt
hochsten
intraamniotischer Mikroinjektion.
Abnormalitaten auf,
nicht statistisch
nur
QAA
die
Effekte
Mikroinjektion
in den Amnionsack.
Differenzierung,
und
Effekte auf
dysmorphogenen
nach
sovohl
ins Exocoelum als auch
Konzentration
Die
worden ist.
konzentrationsabhangig
Substanz
die
4 wird
In
Unterschiede
der Kontroll-
12
Dies lasst darauf
gruppe.
lich
schliessen,
dass QAA hochstvahrschein-
nicht der fur die embryotoxische Wirkung
liche Metabolit
ist.
Kapitel
wird
Im
5
trachtigen
beschrieben,
mit
Ratten
(Aroclor
1254*
barbital
(PB))
Cytochrom
(AC),
im Alter
Embryonen
Embryonen
auf
die Reaktion
sich
nach
Alter
Prainduktion in
9.5 Tage.
von
embryonalen
Im weiteren
filr durch QAB verursachte
im
P450-Hemmer,
am
sind.
Prainduktion als
Pheno-
oder
als Cytochrom
beteiligt
der
P450-Induktoren
(3-MC)
Monooxygenasen
vitro
verantvort-
Prainduktion
Cytochrom
CO
von
10.5 Tage,
von
veniger empfindlich
vitro als
in
Hilfe
in
QAB
von
durch
3-Methylcholanthrene
P450-abhangige
Metabolismus
PB,
verschiedene
mit
und
dass
QAB
von
sind
utero
mit
Embryotoxizitat
Ausserdem erveist
Alter der Embryonen
vom
abhangig.
Vie
beschrieben im Kapitel
methyl-QAB (NOAEL
41
6,
ist der
uM) nach Zugabe ins Kulturmedium,
(NOAEL
Wachstum
fur
und
uM
eine
(NOAEL 3.6 uM)
der
Schadigung
von
Abnormalityten
als
von
Bei
einer
QAB
eine
Differenzierung
von
aktiv als QAB selbst
12
Der
N-demethyl-QAB
uM) und
von
(41 uM) ist
der
Embryos
Wachstum
deuten
als
Abnormal!taten,
bei einer
und die
"proximate
wobei
equimolaren Konzentration
Differenzierung
zu
beeinfliissen.
N-desoxy-QAB, aber nicht
dysmorphogen"
fiir
die
und
verursacht
Differenzierung und
sovohl
morphologischen Abnormal!taten
darauf hin dass
von
(NOAEL 3.6 uM).
0.7 mM,
von
keine
mit
vitro
10-fach hoher
N-desoxy-QAB
N-demethyl-QAB
von
in
Der
fur das Entstehen
NOAEL
keine Effekte auf Wachstum und
N-desoxy-QAB
pM).
signifikante Wachstumsretardierung
intraamniotischen Konzentration
Zunahme
N-de¬
Differenzierung
einer Konzentration
Differenzierung.
(NOAEL 3.9
filr
weniger
Metabolit N-desoxy-QAB verursacht bei
11
in vitro Metabolit
fOr Wachstum 122 uM und
QAB
zu
als auch
einer Zunahme
fuhren ohne
das
Diese Resultate
N-demethyl-QAB,
EmbryotoxizitSt
von
QAB
verantwortlich sein kBnnte.
Zusammenfassend
vitro
kann gesagt verden,
metabolisiert.
Der
dass der
Metabolismus
Rattenembryo QAB in
findet
vor
allem
im
13
visceralen
der
Dottersack statt,
prenatalen
Verschiedene
sind
Tage
und
10-12,
am
aber nicht
maximale Aktivitat wahrend
ist
embryonale
(spezifische?)
mSglicherweise
N-desoxy-QAB,
hat eine
Metabolismus
QAA
oder
"proximate dysmorphogen" gezeigt.
Cytochrom
P450-abhSngig.
Cytochrom PA50-Isoformen
von
QAB
N-demethyl-QAB, hat
beteiligt.
sich als