Charakterisierung der Interaktion des KIBRA Proteins mit der Protein
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Aus dem Universitätsklinikum Münster Medizinische Klinik D Abteilung für molekulare Nephrologie - Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. H.-J. Pavenstädt - Charakterisierung der Interaktion des KIBRA Proteins mit der Protein Kinase M ζ (PKMζ) INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des doctor medicinae der Medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster vorgelegt von Thomas, Christian Alexander aus Herborn 2014 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Westfälischen WilhelmsUniversität Münster. Dekan: Univ.-Prof. Dr. med. Dr. h.c. Wilhelm Schmitz 1. Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. med. Hermann-Joseph Pavenstädt 2. Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Volker Gerke Tag der mündlichen Prüfung: 10.12.2014 Aus dem Universitätsklinikum Münster Medizinische Klinik D Abteilung für molekulare Nephrologie - Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. H.-J. Pavenstädt Referent: Univ.-Prof. Dr. med. H.-J. Pavenstädt Korreferent: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Volker Gerke Zusammenfassung: Charakterisierung der Interaktion des KIBRA Proteins mit Protein Kinase M ζ (PKMζ) Thomas, Christian Alexander Das intrazelluläre Protein KIBRA (KIdney and BRAin) besitzt zwei interne WW-Domänen, eine C2Domäne, ein PDZ-Bindungsmotif sowie eine Bindungssequenz für die Gruppe der atypischen Protein Kinasen C (aPKC). Über die aPKC-Bindungssequenz interagiert KIBRA mit der neuronenspezifischen, konstitutiv aktiven Protein Kinase M ζ (PKMζ). Weder das genaue Bindungsmotif, noch die physiologische Funktion der Interaktion von KIBRA mit PKMζ sind bisher bekannt und sollten in dieser Arbeit genauer charakterisiert werden. Zur Bestimmung der aPKCBindungssequenz wurden verschiedene KIBRA-Deletionsmutanten mit PKMζ ko-präzipitiert. Zur Charakterisierung der Funktion der KIBRA-PKMζ-Interaktion wurden Zellkulturexperimente mit Untersuchungen der Proteinstabilität durchgeführt. In fluoreszenzmikroskopischen Live Cell Analysen wurde die intrazelluläre Lokalisation und Dynamik von KIBRA sowie der Ko-Transport von KIBRA und PKMζ in kultivierten Primärneuronen analysiert. Die aPKC-Bindungssequenz in humanem KIBRA konnte auf einen Bereich von 22 Aminosäuren (Aminosäuren 953 - 974) eingegrenzt werden. Sequenzanalysen ergaben, dass dieser Abschnitt in den Homologen von KIBRA hoch konserviert ist. Die Überexpression von KIBRA verzögerte den proteasomalen Proteinabbau von PKMζ. Fluoreszenzmikroskopische Analysen ergaben, dass KIBRA in den Dendriten von kultivierten Primärneuronen der Maus transportiert wird und dass dort ein Ko-Transport von KIBRA und PKMζ stattfindet. Tag der mündlichen Prüfung: 10.12.2014 Erklärung: Ich gebe hiermit die Erklärung ab, dass ich die Dissertation mit dem Titel: Charakterisierung der Interaktion des KIBRA Proteins mit der Protein Kinase M ζ (PKMζ) in der molekularen Nephrologie der Medizinischen Klinik D des Universitätsklinikums Münster unter der Anleitung von Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Hermann-Joseph Pavenstädt 1. selbständig angefertigt, 2. nur unter Benutzung der im Literaturverzeichnis angegebenen Arbeiten angefertigt und sonst kein anderes gedrucktes oder ungedrucktes Material verwendet, 3. keine unerlaubte fremde Hilfe in Anspruch genommen, 4. sie weder in der gegenwärtigen noch in einer anderen Fassung einer in- oder ausländischen Fakultät als Dissertation, Semesterarbeit, Prüfungsarbeit, oder zur Erlangung eines akademischen Grades, vorgelegt habe. Münster, den 12.01.2015 Christian Alexander Thomas Inhalt 1. Einleitung ....................................................................................................... 1 1.1 Eigenschaften des KIBRA Proteins.......................................................................... 1 1.2 Bindungspartner und Funktion des KIBRA Proteins ............................................... 2 1.3 Grundlagen zu PKCζ und PKMζ .............................................................................. 6 1.4 Interaktion von KIBRA mit PKCζ / PKMζ .............................................................. 9 1.5 Zielsetzung dieser Arbeit ........................................................................................ 10 2. Materialien ................................................................................................... 11 2.1 Geräte ..................................................................................................................... 11 2.2 Chemikalien, Lösungen und Puffer ........................................................................ 12 2.2.1 Chemikalien ............................................................................................. 12 2.2.2 Antibiotika ............................................................................................... 13 2.2.3 Lösungen und Puffer................................................................................ 13 2.3 Medien .................................................................................................................... 14 2.3.1 Medien zur Kultivierung von Bakterien (E.coli) ..................................... 14 2.3.2 Medien für eukaryotische Zelllinen ......................................................... 14 2.4 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien ................................................................. 15 2.5 Biologische Materialen .......................................................................................... 16 2.5.1 Antikörper ................................................................................................ 16 2.5.1.1 Primäre Antikörper ............................................................................... 16 2.5.1.2 Sekundäre Antikörper ........................................................................... 16 2.5.2 Enzyme und Marker ................................................................................ 16 2.5.3 Primer ...................................................................................................... 17 2.5.4 Klonierungskonstrukte ............................................................................. 18 2.5.5 Verwendete Organismen ......................................................................... 19 2.6 Sonstige Materialien ............................................................................................... 19 2.7 Software und Internetprogramme ........................................................................... 20 3. Methoden ..................................................................................................... 21 3.1 Anzucht, Kultivierung und Lagerung von Bakterien und eukaryotischen Zellen .. 21 3.1.1 Umgang mit Bakterien (E.coli DH10B) .................................................. 21 3.1.2 Umgang mit eukaryotischen Zelllinen..................................................... 21 3.2 Arbeiten mit DNA .................................................................................................. 22 3.2.1 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien ..................................... 22 3.2.2 Inokulation von Bakterienkulturen .......................................................... 23 3.2.3 Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien ...................................... 23 3.2.4 Restriktionsverdau von DNA .................................................................. 24 3.2.5 Agarose-Gelelektrophorese ..................................................................... 24 3.2.6 Sequenzierung von DNA ......................................................................... 25 3.2.7 Transfektion von DNA in eukaryotische Zellen ...................................... 26 3.3 Proteinbiochemische Methoden ............................................................................. 27 3.3.1 SDS-Gelelektrophorese ........................................................................... 27 3.3.2 Western Blot Verfahren ........................................................................... 28 3.3.3 Ko-Immunpräzipitation ........................................................................... 29 3.3.4 Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation ........................................... 30 3.3.5 Live Cell Untersuchungen........................................................................ 32 4. Ergebnisse .................................................................................................... 33 4.1 Bestimmung der aPKC-Bindungssequenz ............................................................. 33 4.1.1 Datenbankanalysen der aPKC-Bindungssequenz .................................... 33 4.1.2 Bindungsfähigkeit von KIBRA-Deletionsmutanten an PKMζ ................ 34 4.1.3 Bindungsfähigkeit der Mutante KIBRA R969W an PKMζ .................... 42 4.2 Bindungsfähigkeit von KIBRA an die Kinase-defiziente Mutante PKMζ K98W . 45 4.3 Stabilisierende Wirkung von KIBRA auf PKMζ ................................................... 47 4.3.1 Auswirkungen der Überexpression von KIBRA auf PKMζ .................... 47 4.3.2 Einfluss von KIBRA auf die Halbwertszeit von PKMζ .......................... 49 4.3.3 Proteasomaler Abbau von PKMζ ............................................................ 51 4.4 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ........................................................ 53 4.4.1 Nachweis der direkten Interaktion von KIBRA mit PKMζ in vivo ......... 53 4.4.2 Transporteigenschaften von KIBRA in Neuronen .................................. 55 4.4.3 Ko-Transport von KIBRA und PKMζ ..................................................... 60 5. Diskussion .................................................................................................... 62 5.1 Charakterisierung der aPKC-Bindungssequenz ..................................................... 62 5.2 Auswirkungen von KIBRA auf die Stabilität von PKMζ ...................................... 66 5.3 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ........................................................ 69 6. Zusammenfassung ....................................................................................... 74 7. Ausblick........................................................................................................ 75 8. Literaturverzeichnis.................................................................................... 76 9. Abbildungsverzeichnis ................................................................................ 84 10. Lebenslauf .................................................................................................... 86 11. Danksagung ................................................................................................. 87 Abkürzungsverzeichnis A d’NTPs Desoxynukleotidtriphosphat Δ Delta A. Aqua A Ampère Abb. Abbildung E add. Auffüllen auf E. coli Escherichia coli AG Arbeitsgruppe EDTA Ethylendiamintetraacetat AMPA 2-amino-3-(3-hydroxy-5-methyl- EGFP enhanced green fluorescent protein isoxazol-4-yl)propanoic acid et al. et alteri aPKC atypische Proteinkinase C etc. et cetera APS Ammoniumpersulfat F AS Aminosäure / Amminosäuren Fl B Full length G Bidest Zweifach g Gramm BiFC bimolecular fluorescence GFP green fluorescent protein complementation GVO Gentechnisch veränderter Organismus bp Basenpaar bzw. Beziehungsweise H β Beta h hour HCl Salzsäure HEK human ebrionic kidney C °C Grad Celsius HeLa Henrietta Lacks C- Carboxy- HRP horseradish peroxidase ca. circa CaCl2 Calciumchlorid I cAMP Cylcisches Adenosinmonophosphat in vitro im Reagenzglas cGMP Cylcisches Guaninmonophosphat in vivo im lebenden System CHX Cycloheximid cm Zentimeter CO2 Kohlendioxid CV Cercopithecus aethiops D d Tag Da Dalton DAG Diacylglycerol DDR1 discoidin domain receptor 1 dest. destilliert DLC1 dynein light chain I DMEM Dulbeccos Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonuckleinsäure K KIBRA Kidney Brain Protein KCl Kaliumchlorid L L Liter LATS large tumor suppressor LB Luria-Bertani-Broth LTP long term potentiation M µ Mikro m Milli M mol pro Liter R MAPK mitogen activated protein kinase RNA Ribonukleinsäure MDCK Madin Darby canine kidney rpm rounds per minute min Minuten RT Raumtemperatur mRNA messenger RNA myr myristoyilated N S s Sekunden S1 nach Gentechnikgesetz N- Amino- NaCl Natriumchlorid SDS Sodiumdodecylsulfat NaF Natriumfluorid SNP single nucleotide polymorphism Na4P2O7 Tetranatriumdiphosphat SNX sorting nexin NFκB nuclear factor ‘kappa-light-chainenhancer‘of activated B-cells NMDA N-methy-D-aspartic acid O OPCA Sicherheitsstufe 1 T Taq Thermus aquaticus TAZ transcriptional coactivator with PDZbinding motif OPR/PC/AID TE Tris-EDTA TEMED Tetramethylethylendiamin P PAGE Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese U PATJ Pals1-associated tight junction protein u. A. unter Anderem PB1 Phox and Bem1p UV Ultraviolett PBS phosphate buffered saline & und PCR Polymerasekettenreaktion PDK1 3-Phosphoinositide dependent protein kinase-1 PDZ Psd95/Discs large/ZO-1 PFA Paraformaldehyd pH PH-Wert PHD Pleckstrin homology domain PICK1 Protein interacting with C V V Volt W WWC WW and C2 domain containing wt Wildtyp kinase 1 PI Phosphatidylinositol Y PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase YAP PIN1 protein interacting with NIM1 PIP Phosphatidylinositolphosphat Z PKC Proteinkinase C ZIP zeta inhibitory peptide PKM Proteinkinase “memory” ξ zeta PP1 Proteinphosphatase 1 PS Pseudosubstrat PVDF Polyvinylidendifluorid % Prozent Yes-associated protein Einleitung | 1 1. Einleitung Die Barriere zwischen Blut und Primärharn wird von fenestriertem Endothel, einer Basalmembran und den Podozyten gebildet. Podozyten sind hoch spezialisierte Zellen mit vielen verzweigten Fußfortsätzen, die eine extrazelluläre Schlitzmembran aufspannen und für die Filterfunktion der Niere von essentieller Bedeutung sind. Störungen dieser feinen Schlitzmembran führen zu glomerulären Erkrankungen, die meist mit einer Proteinurie einhergehen (Pavenstädt et al., 2003). Aus diesem Grund sind Podozyten und speziell die Schlitzmembran Gegenstand der aktuellen Forschung. Die Podozyten in der Niere sind genau wie Neurone im Gehirn hoch polarisierte und postmitotische Zellen, die sich in ihrer Morphologie mit langen, feinen und verzweigten Fortsätzen teilweise ähneln. Für die Aufrechterhaltung ihrer hoch spezialisierten Form und Funktion wird in beiden Zelltypen die Expression einer Gruppe gleicher Schlüsselproteine beobachtet (Kobayashi et al., 2004; Duning et al., 2008). Eines dieser gemeinsamen Schlüsselproteine ist das KIBRA (=Kidney Brain) Protein, dessen Namensgebung aufgrund der hohen Expressionsrate in Niere und Gehirn erfolgte (Kremerskothen et al., 2003). Ein Projekt in der Arbeitsgruppe Molekulare Nephrologie befasst sich mit der weiteren Charakterisierung des KIBRA Proteins und dessen zellulärer Funktion. 1.1 Eigenschaften des KIBRA Proteins Das ca. 125 kDa große, intrazellulär lokalisierte Gerüstprotein KIBRA wurde ursprünglich als Bindungspartner des postsynaptischen Proteins Dendrin entdeckt (Kremerskothen et al., 2003). Humanes KIBRA wird vom WWC1-Gen auf dem Genlocus 5q35.1 kodiert und weist besonders hohe Expressionsraten in der Niere und im Gehirn auf (Kremerskothen et al., 2003; Schneider et al., 2010). Vor kurzer Zeit wurden zwei Paraloge von KIBRA, WWC2 und WWC3, mit 49% bzw. 39% Sequenzhomologie beschrieben, deren Funktion allerdings noch ungeklärt ist (Yoshihama et al., 2012). Die Expression von KIBRA ist im Hippocampus, Hypothalamus und im Cerebellum besonders hoch, in der Niere findet man hohe Expressionsraten in Podozyten, im Tubulusepithel und im Epithel der Sammelrohre (Duning et al., 2008; Johannsen et al., 2008). Innerhalb des KIBRA Proteins wurden zahlreiche Proteindomänen charakterisiert (Abb. 1.1). Einleitung | 2 Abbildung 1.1: Darstellung der Domänen des KIBRA Proteins. Am Aminoterminus befinden sich zwei WW-Domänen (AS 9-85), gefolgt von einer putativen Kernlokalisierungssequenz (AS 361-376). Carboxyterminal befindet sich eine C2 Domäne (AS 660-783), eine Glutaminsäure-reiche Sequenz (AS 845873), eine aPKC-Bindungssequenz (AS 953-996) und ein putatives PDZ Klasse III Bindungsmotif (AS 11101113). Am Aminoterminus finden sich im Bereich der Aminosäuren 9-85 zwei WW-Domänen, deren Name sich aus jeweils zwei konservierten Tryptophanresten ableitet. Diese Domänen haben jeweils eine Länge von 35-40 Aminosäuren und können prolinreiche Sequenzen mit einem PPxY-Motif binden (Kremerskothen et al., 2003). In der Region der Aminosäuren 361376 wird eine mögliche Kernlokalisierungssequenz beschrieben (Rayala et al., 2006). Die C2Domäne, die die Aminosäuren 660-783 umfasst, besteht aus zwei viersträngigen βFaltblättern und ermöglicht eine kalziumabhängige Bindung an Phospholipidstrukturen (Schneider et al., 2010). Weiterhin ist in KIBRA eine glutaminsäurereiche Region bekannt, die in den Aminosäuren 845-873 lokalisiert ist (Kremerskothen et al., 2003), sowie ein putative Klasse III PDZ-Bindungsmotif in den letzten vier Aminosäuren 1110-1113 (Duning et al., 2008). Eine aPKC-Bindungssequenz wird im Bereich der Aminosäuren 953-996 lokalisiert (Büther et al., 2004). 1.2 Bindungspartner und Funktion des KIBRA Proteins Seit der Entdeckung des KIBRA Proteins in einem Screen für Bindungspartner von Dendrin konnten viele weitere Protein-Protein Interaktionen von KIBRA ermittelt werden. Diese sind schematisch in Abb. 1.2 gezeigt. Einleitung | 3 Abbildung 1.2: Darstellung der Bindungspartner des KIBRA Proteins. Das KIBRA Protein besitzt eine Reihe von Interaktionspartnern, die hier schematisch dargestellt sind. Bei bekannter Bindungsregion des Interaktionspartners ist diese durch eine gepunktete Linie angedeutet. Über die aminoterminalen WW-Domänen bindet KIBRA an Merlin/NF-2 und Expanded und ist somit ein Bestandteil des kürzlich entdeckten Hippo-Signalwegs, der die Größe von Organen reguliert, das Verhältnis von Proliferation und Apoptose beeinflusst und an der Erneuerung von Stammzellen beteiligt ist (Zhao et al., 2011). Durch Aktivierung des Signalwegs werden die beiden Ko-Transkriptionsfaktoren YAP (Yes associated protein) und dessen Paralog TAZ (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) von der Proteinkinase Lats1/2 (Large tumor suppressor kinase 1/2) phosphoryliert und daraufhin im Zytoplasma sequestriert und inaktiviert (Zhao et al., 2011). Dadurch wird die Expression einer Vielzahl von proliferativ wirkenden Genen verhindert (Zhao et al., 2011). Neben der Interaktion mit Merlin und Expanded übernimmt KIBRA im Hippo-Signalweg die Stabilisierung von Lats1 durch die Hemmung dessen proteasomalen Abbaus (Xiao et al., 2011). Über die WW-Domänen bindet KIBRA außerdem an die Proteine Dendrin und Synaptopodin, die beide an synaptischer Plastizität beteiligt sind (Kremerskothen et al., 2003; Einleitung | 4 Duning et al., 2008). Untersuchungen mit Synaptopodin-defizienten Mäusen haben gezeigt, dass Synaptopodin an der Ausbildung des Spine apparatus, LTP (long term potentiation) und synaptischer Plastizität beteiligt ist (Deller et al., 2003). Ein weiterer Interaktionspartner von KIBRA ist der Tyrosinkinaserezeptor DDR1 (Discoidin Domain Rezeptor 1), der zusammen mit KIBRA und PKCζ (protein kinase C) einen Komplex formiert und auch an die WWDomänen von KIBRA bindet (Hilton et al., 2008). Außerdem konnte von Hilton und Kollegen eine Beteiligung von KIBRA an der kollagenabhängigen Stimulation des MAPK(mitogen activated protein kinase)-Signalwegs gezeigt werden. Über die C2-Domäne kann eine kalziumabhängige Bindung an Phospholipide und eine antiparallele Homodimerisierung mit anderen KIBRA Molekülen erfolgen (Johansen et al., 2008; Schneider et al., 2010; Duning et al., 2013). Durch Interaktion mit sec3 über die Aminosäuren 129-526 ist KIBRA an der Steuerung der Exozytose beteiligt (Rosse et al., 2009). Die Interaktion mit DLC1 (Dynein Light Chain 1) und SNX4 (Sorting nexin 4) deutet auf eine Beteiligung von KIBRA an vesikulären Transportprozessen hin. SNX4 bildet einen Komplex mit KIBRA und dem Mikrotubuli Motorprotein Dynein und reguliert das Recycling des Transferrinrezepotrs (Traer et al., 2006). Rayala und Kollegen beschrieben die direkte Bindung von KIBRA an DLC1 (Rayala et al., 2006). Weiterhin ist eine Interaktion mit dem Histon H3 über die glutaminsäurereiche Region von KIBRA gezeigt worden, die an der Aktivierung von Östrogenrezeptoren beteiligt ist (Rayala et al., 2006). Die Aurora Kinasen A und B binden an KIBRA und phosphorylieren zellzyklusabhängig die Aminosäure S539 (Xiao et al., 2011). Die Phosphorylierung von KIBRA an S539 spielt eine wichtige Rolle für den geregelten Ablauf der Mitose und kann durch PP1 (Protein Phosphatase 1) wieder rückgängig gemacht werden (Xiao et al., 2011). Das Protein PATJ (Pals1-associated tight junction protein), das über das PDZ-Bindungsmotif an KIBRA bindet, ist als Teil eines Multiproteinkomplexes bekannt, der in Podozyten sowie Neuronen Zellpolarität reguliert (Duning et al., 2008). Weiterhin ist bekannt, dass KIBRA über den aPKC-Par3-Par6 Komplex die Polarität von MDCK (Madin Darby canine kidney)-Zellen moduliert (Yoshihama et al., 2011). Als weiterer Bindungspartner von KIBRA konnte das Protein FEZ1 (fasciculation and elongation protein ζ 1), das an axonalen Wachstumsprozessen beteiligt ist, identifiziert werden (Assmann et al., 2006). KIAA0513, das nach Daten aus einer Mikroarrayuntersuchung vermehrt in Schizophreniepatienten exprimiert wird, interagiert ebenfalls mit KIBRA (Lauriat et al., 2006). Die atypische Proteinkinase PKCζ (aPKCζ) bindet und phosphoryliert KIBRA an den Serinresten S975 und S978 und führt somit möglicherweise zu einer Funktionsänderung des KIBRA Proteins Einleitung | 5 (Büther et al., 2004; Yoshihama et al., 2011). Außerdem ist bekannt, dass die neuronenspezifische und konstitutiv aktive Isoform PKMζ in Mausneuronen mit KIBRA in der CA1- und in CA3- Regionen im Hippocampus und dem Gyrus dentatus ko-lokalisiert (Yoshihama et al., 2009). In einer weiteren Studie konnte die Bindung von KIBRA an PICK1 (Protein interacting with C kinase 1) und eine Modulation des Recycling von Untereinheiten des AMPA-Rezeptors durch KIBRA nachgewiesen werden (Makuch et al., 2011). Außerdem wurden in der Arbeit von Makuch und Kollegen Untersuchungen an KIBRA-defizienten Mäusen durchgeführt, die im Vergleich zu Kontrolltieren ein schlechteres Abschneiden in Gedächtnistests zeigten (Makuch et al., 2011). Neben den strukturellen und molekularen Untersuchungen auf Proteinebene konnte bei Menschen eine Assoziation des KIBRA/WWC1-Gens mit episodischer Gedächtnisleistung hergestellt werden (Papassotiropoulos et al., 2006). Von über 500.000 untersuchten SNPs (Single nucleotid polymorphisms) konnte die stärkste Korrelation bei einem Basenaustausch (C/T) im 9. Intron des WWC1-Gens festgestellt werden (Referenznummer rs17070145). Träger des T-Allels (homozygot oder heterozygot) zeigten signifikant bessere Ergebnisse als homozygote Träger des C-Allels. Dieser Sachverhalt wurde durch weitere genetische Studien bestätigt (Almeida et al., 2008; Schaper et al., 2008; Preuschhof et al., 2008; Bates et al., 2009; Kauppi et al., 2011). Dagegen fanden einige Studien keine direkte Assoziation (Need et al., 2009; Jakobson et al., 2009; Wersching et al., 2011) oder sogar eine umgekehrte Assoziation des T-Allels mit der Gedächtnisleistung (Zhang et al., 2009; Nacamias et al., 2008). Eine Metaanalyse aller bisherigen Studien zeigte jedoch eine signifikante Korrelation des Polymorphismus mit episodischer Gedächtnisleistung und dem Arbeitsgedächtnis (Milnik et al., 2012). Da neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer mit einer Fehlfunktion des Gedächtnisses einhergehen, wurde dieser SNP auch im Zusammenhang mit verschiedenen Alzheimerformen untersucht. Es konnte eine Assoziation von Nicht-T-Allel Trägern und lateonset Alzheimer gefunden werden (Corneveaux et al., 2008), allerdings trat die very-lateonset Form häufiger bei T-Allel Trägern auf (Rodriguez-Rodriguez et al., 2009). Außerdem zeigte sich eine Überexpression von KIBRA und eine Unterexpression der Bindungspartner PKCζ, DLC1, KIAA0513 und dem Östrogenrezeptor im Hippocampus und Temporallappen von an Alzheimer erkrankten Probanden im Vergleich zu gesunden Probanden (Corneveaux et al., 2008; Burgess et al., 2011). In einer anderen Studie konnte die Assoziation eines anderen SNP innerhalb des WWC1-Gens (Referenznummer rs12514426) mit dem Auftreten von Alzheimer hergestellt werden (Beecham et al., 2009). Einleitung | 6 1.3 Grundlagen zu PKCζ und PKMζ Die Isoformen der PKC (Proteinkinase C) gehören zur erweiterten Gruppe der Serin / Threonin Kinasen, die man auch als AGC-Gruppe (cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA), cGMP-abhängige Proteinkinase (PKG) und PKC) bezeichnet (Hirai und Chida, 2003). PKC wurde erstmals bei Untersuchungen im Gehirn von Ratten als sehr aktive und von cyclischen Nukleotiden unabhängige Form entdeckt (Inoue et al., 1977). Die Isoformen werden nach ihrem Aktivierungsweg in klassische (cPKC), neuartige (nPKC) und atypische (aPKC) PKCs eingeteilt, wobei die klassischen durch DAG (Diazylglyzerol) und Ca2+ -abhängig aktiviert werden, die neuartigen lediglich durch DAG und die atypischen weder Ca2+ -abhängig, noch durch DAG (Mellor und Parker, 1998). Die Proteinkinase PKCζ, die zu den atypischen PKCs gezählt wird, wurde erstmals 1989 von Ono und Kollegen beschrieben (Ono et al., 1989). Funktionell ist das Enzym am MAPK Signalweg und dem ribosomalen S6-Proteinkinase-Signalweg, an der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB, an der Zellpolarität und an neuronaler Plastizität beteiligt (Hirai und Chida, 2003). PKCζ ist aus einer Regulations- und einer Kinasedomäne aufgebaut (Abb. 1.3). Abbildung 1.3: Struktur und Domänen der Proteinkinase C ζ. Die carboxyterminale Regulationsdomäne besteht aus einer PB1(Phox and Bem1p)- und einer C1-Domäne sowie einer PS(Pseudosubstrat)-Region. Innerhalb der aminoterminalen Kinasedomäne befindet sich die ATP-Bindungsstelle sowie ein activation loop, ein turn motif und ein hydrophobe motif. Die jeweiligen Aminosäuren, die die Domänen umschreiben, sind in der Grafik angegeben. Die carboxyterminale Regulationsdomäne besteht aus einer PB1(Phox and Bem1p)-Domäne, einer PS(Pseudosubstrat)-Sequenz und einer C1-Domäne. Die PB1 Domäne bindet an sog. OPCA(OPR/PC/AID)-Motife, deren Deletion an den Proteinen p62, MEK5 und PAR-6 dazu führt, dass sie nicht mehr an PKCζ binden können (Diaz-Meco et al., 2001). Die PS-Sequenz stellt eine Abfolge von Aminosäuren dar, die im inaktiven Zustand der Kinase das aktive Einleitung | 7 Zentrum als „pseudohaftes Substrat“ besetzen, mit dem Unterschied, dass an der Serin / Threonin Position ein Alanin zu finden ist, das nicht phosphoryliert wird (Hirai und Chida, 2003). Die C1-Domäne besitzt ein Zinkfinger-Motif und weist große Ähnlichkeit zur C1ADomäne anderer PKC Isoformen auf, wo sie zusammen mit der C1B-Domäne die Grundlage für die Bindung an DAG und Phorboldiester darstellt. Trotz der Ähnlichkeit bindet die C1Domäne von PKCζ weder an DAG, noch kann sie durch Phorboldiester aktiviert werden (Ways et al., 1992). In der aminoterminalen Kinasedomäne wird neben dem aktiven Zentrum an der Aminosäure 281 zwischen einem activation loop, einem turn motif und einem hydrophobe motif (AS 575-580) unterschieden (Hirai und Chida, 2003). Die drei letztgenannten Regionen werden im Rahmen der Aktivierung phosphoryliert. Die Aktivierung der PKCζ erfolgt durch Herauslösen der Pseudosubstratsequenz aus dem aktiven Zentrum und Phosphorylierungen in der Kinasedomäne. Dies erfolgt durch Bindung an Lipidstrukturen, wie Phosphatidylinositole (PIs), Phosphatidsäuren, Arachidonsäuren und Ceramide, wobei Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PIP3) besonders starke Aktivierungseigenschaften aufweist (Nakanishi et al., 1993; Limatola et al., 1994; Müller et al., 1995). PIP3 entsteht durch enzymatische Umwandlung von PI-2,5-bisphosphat durch die PI3K (PI-3-Kinase) und kann neben dem Aufheben der Autoinhibition von PKCζ das Enzym PDK1 (3-PI-dependent protein kinase 1) über dessen PH(pleckstrin homology)-Domäne (PHD) aktivieren (Nakanishi et al., 1993). Dadurch phosphoryliert PDK1 wiederum PKCζ an T410 in der activation loop -Region, was einen notwendigen und unerlässlichen Schritt im Rahmen der Aktivierung von PKCζ darstellt (Chou et al., 1998). Weiterhin erfolgt eine Phosphorylierung an der Aminosäure T560 im turn motif, die vermutlich durch eine Autophosphorylierung bedingt ist (Standaert et al., 2001). Das Enzym PKMζ ist eine konstitutiv-aktive Isoform von PKCζ, die durch Ablesen eines internen Promotors im Gen für PKCζ entsteht und ausschließlich aus der Kinasedomäne von PKCζ aufgebaut ist (Sacktor, 2011). PKMζ wird ausschließlich in neuronalem Gewebe exprimiert und führt zu erhöhten postsynaptischen AMPA-Rezeptor Signalantworten (Hernandez et al., 2003; Sacktor, 2011). Die mRNA von PKMζ wird zu den Dendriten transportiert und dort zunächst translational von PIN1 (Protein interacting with NIM1) gehemmt (Muslimov et al., 2004; Westmark et al., 2010). Bei der Induktion von Langzeitpotentierung wird PIN1 durch Bindung von Glutamat an postsynaptische NMDA(Nmethyl-D-aspartic acid)-Rezeptoren gehemmt, sodass die Translation von PKMζ erfolgen Einleitung | 8 kann (Westmark et al., 2010). Nach der Translation erfolgt eine Bindung an PDK1, die PKMζ an der zu PKCζ analogen activation loop -Region phosphoryliert und aktiviert (Kelly et al., 2007). Durch Aktivierung phosphoryliert PKMζ das Protein PIN1, sodass die eigene Translation in einer Rückkopplungsschleife aufrechterhalten wird (Sacktor, 2010). Abbildung 1.4: Vereinfachte Darstellung der Aktivierung von PKMζ. Die PKMζ mRNA wird zu den Dendriten transportiert und zunächst von PIN1 translational inaktiviert. Durch die Induktion von LTP wird PIN1 gehemmt und PKMζ translatiert. PDK1 aktiviert die Kinaseaktivität von PKMζ in einem weiteren Schritt durch Phosphorylierung am activation loop. Aktive PKMζ-Moleküle wiederum inhibieren PIN1, sodass die lokale Translation in den Dendriten ständig aufrechterhalten wird. Die Vermutung, dass PKMζ bei Gedächtnisprozessen in vivo eine Rolle spielt, konnte mit einer Reihe von Experimenten untermauert werden, bei denen ein Peptid eingesetzt wurde, dessen Aminosäureabfolge die PS-Sequenz von PKCζ darstellt und somit auch die PKMζ im aktiven Zentrum hemmt (Ling et al., 2002; Serrano et al., 2005; Pastalkova et al., 2006; Shema et al., 2009). Um membrangängig zu sein, wurde diese Peptidsequenz in den Versuchen mit einem Myristinsäurerest (myr) versehen und häufig als ZIP-Peptid (zeta inhibitory peptide) bezeichnet (Abb. 1.5). Abbildung 1.5: Schematischer Aufbau von PKCζ und PKMζ. PKCζ besteht aus einer Regulations- und einer Kinasedomäne. Die konstitutiv aktive Isoform PKMζ ist lediglich aus der Kinasedomäne aufgebaut. Bei einer Vielzahl von Versuchen wurde PKMζ mithilfe eines sog. ZIP (Zeta inhibitory peptide) Peptids gehemmt, das die PS-Sequenz aus PKCζ darstellt und durch Anhängen eines Myristinsäurerests (myr) membrangängig ist (nach Pastalkova et al., 2006). Bei elektrophysiologischen Messungen an Hippocampus-Schnitten konnte selbst Stunden nach initialer LTP-Induktion die synaptische Potentierung mittels Applikation von ZIP Einleitung | 9 rückgängig gemacht werden (Ling et al., 2002; Serrano et al., 2005). Durch externe Injektion von ZIP im Vergleich mit der Injektion eines myristoylierten Kontrollpeptids in das Gehirn von Ratten wurden durch Konditionierung erlernte räumliche Gedächtnisinhalte (spatial memory), die bis zu drei Monate zurücklagen, wieder gelöscht, ohne dass das Erlernen neuer Information gestört war (Pastalkova et al., 2006; Shema et al., 2009). Lentivirale Überexpression von PKMζ im Inselkortex von Ratten führte nach Lernprozessen zu signifikant besserem Abrufen der erlernten Gedächtnisinhalte (Shema et al., 2011). Diese Experimente haben zu der Schlussfolgerung geführt, dass PKMζ eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung von Gedächtnisinhalten einnimmt. 1.4 Interaktion von KIBRA mit PKCζ / PKMζ Über die Interaktion von KIBRA mit PKCζ / PKMζ ist bislang wenig bekannt. Sowohl die exakte Bindungsstelle, als auch funktionelle Aspekte der Interaktion sind noch nicht näher beschrieben worden. Büther und Kollegen konnten erstmals eine Bindung von KIBRA an PKCζ nachweisen und das aPKC-Bindungsmotif in humanem KIBRA auf die Aminosäuren 953-997 eingrenzen (Büther et al., 2004). In der gleichen Arbeit wurde die Phosphorylierung von KIBRA an den Stellen S975 und S978 durch PKCζ beschrieben. Yoshihama und Kollegen konnten die Suppression apikaler Exozytose durch die inhibierende Wirkung von KIBRA auf die in vitro gemessene Kinaseaktivität von PKCζ zeigen (Yoshihama et al., 2011). In dieser Arbeit wird das aPKC-Bindungsmotif im Bereich der Aminosäuren 919-978 angegeben, da ein Peptidfragment mit dieser Aminosäuresequenz dazu fähig ist, PKCζ zu hemmen. Die Autoren fanden bei Sequenzanalysen einen Bereich mit hoher Homologie zu der Pseudosubstratsequenz von PKCζ (Yoshihama et al., 2011). Weiterhin konnte eine KoLokalisation von KIBRA und PKMζ in Mausneuronen festgestellt werden (Yoshihama et al., 2009). Aus Untersuchungen der Arbeitsgruppe Molekulare Nephrologie war bekannt, dass im Gehirnlysat von KIBRA-defizienten Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren weniger PKMζ nachweisbar ist (K. Duning, persönliche Mitteilung). Eine genaue Eingrenzung des aPKCBindungsmotifs in KIBRA und Untersuchungen der Funktion der KIBRA-PKMζ Interaktion ist bislang nicht erfolgt. Einleitung | 10 1.5 Zielsetzung dieser Arbeit Da die beiden Proteine KIBRA und PKMζ an molekularen Gedächtnisprozessen beteiligt sind, ist deren Interaktion von besonderem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit soll daher zunächst die Sequenz der aPKC-Bindungsregion in KIBRA genauer untersucht werden. Dafür soll die Bindungsfähigkeit verschiedener KIBRA-Deletionsmutanten an PKMζ in Immunpräzipitationen überprüft werden. Dadurch können die bisher in der Literatur angegebenen Sequenzen mit einer anderen Methode überprüft und noch genauer spezifiziert werden. Da in KIBRA-defizienten Mäusen niedrigere Mengen von PKMζ nachweisbar sind, soll mithilfe von Zellkulturexperimenten analysiert werden, ob KIBRA auf Proteinebene stabilisierend auf PKMζ wirkt. In fluoreszenzmikroskopischen Analysen soll im Rahmen dieser Arbeit mittels bimolekularer Fluoreszenzkomplementation die direkte Interaktion von KIBRA mit PKMζ in lebenden Zellen nachgewiesen werden. Da KIBRA auch an intrazellulären Transportprozessen beteiligt ist, soll die Dynamik von fluoreszierenden KIBRA Fusionsproteinen in kultivierten Primärneuronen untersucht und außerdem auch geprüft werden, ob ein Ko-Transport von KIBRA und PKMζ in Neuronen nachgewiesen werden kann. Materialien | 11 2. Materialien 2.1 Geräte In dieser Arbeit wurden folgende Geräte verwendet: Bezeichnung Typbezeichnung Hersteller Autoklav Varioklav® H+P Labortechnik, Oberschleissheim Blottingkammern (Western-Blot) Mini Trans-Blot ® Cell BioRad, München Brutschränke Bakterien B5050 Heraeus, München Brutschränke Zellkultur Elektrophoresekammer (AgaroseGele) Elektrophoresekammern (PAA-Gele) Heracell 240 Heraeus, München Model B1 Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Novex Mini-Cell Invitrogen, Karlsruhe Entwickler Optimax X-Ray Film Processor PROTEC Medizintechnik, Oberstenfeld Fluoreszenzkamera HXP 120 Zeiss, Hamburg Fluoreszenzmikroskop Axio Observer Zeiss, Hamburg Lumi-Imager F1 Roche, Grenzach-Wyhlen FluorChem FC2 R&D Systems GmbH, Wiesbaden GeneAmp® PCR-System 2700 I. Applied Biosystems, Darmstadt Mastercycler Gradient Eppendorf GmbH, Hamburg pH-Meter RS-232-C Schott, Mainz Reinstwasseranlage Ultra Clear Schüttelinkubator Bakterien Certomat® IS Spannungsquellen Power Pac HCTM SG Wasseraufbereitung und Regenerierstation GmbH, Barsbüttel B. Braun Biotech International, Melsungen BioRad, München Spektrophotometer Picodrop™ Pico 100 Picodrop Ltd., UK Sterilwerkbank HERAsafe Thermostate Thermomixer comfort UV-Tisch (Transilluminator) IL-200-M Heraeus, München Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg H. Saur Laborbedarf, Reutlingen VortexGenie2 Scientific Industries Inc., USA Reax1R Heidolph, Schwabach Geldokumentationssystem PCR-Geräte Vortexer Waagen Zentrifugen ScoutTM Pro Explorer® Pro Ohaus, Giessen MiniStar Mikrozentrifuge VWR, Darmstadt Mikro 200 R Hettich, Tuttlingen Mikro 22 R Hettich, Tuttlingen AllegraTM X-22R Beckmann Coulter, Krefeld Multifuge 3S-R Heraeus, München Ultrazentrifuge: Beckman TL-100 Beckmann Coulter, Krefeld Materialien | 12 2.2 Chemikalien, Lösungen und Puffer 2.2.1 Chemikalien In dieser Arbeit wurden folgende Chemikalien verwendet: Chemikalien Hersteller 2-Propanol Roth, Karlsruhe 6 x Loading Dye Solution Promega, Mannheim Aceton AppliChem, Darmstadt Acrylamid (30 %) + Bisacrylamid (0,8 %) (Rotiphorese Gel 30) Roth, Karlsruhe Agarose Roth, Karlsruhe Ammoniumper(oxodi)sulfat (APS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Ampicillin AppliChem, Darmstadt Bacto-Agar AppliChem, Darmstadt ß-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen Calciumchlorid (CaCl2) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Complete-Tabletten, EDTA-frei Roche Diagnostics, Mannheim Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Röntgenentwicklerlösung Maco, Stapelfeld Fixierlösung Maco, Stapelfeld Ethanol Roth, Karlsruhe Ethidiumbromid AppliChem, Darmstadt Glukose AppliChem, Darmstadt Glycerin Roth, Karlsruhe Glycin AppliChem, Darmstadt HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1 -Piperazinyl) -Ethansulfonsäure (C8H18N2O4S)) Fluka BioChemika, Neu-Ulm LB-Broth Powder (Lennox) Roth, Karlsruhe Lumi-Light Roche Molecular Biochemicals, Kulmbach Lumi-Light Plus Roche Molecular Biochemicals, Kulmbach Magermilchpulver (MMP) Devauge Gesundkostwerk, Lüneburg Methanol AppliChem, Darmstadt Moviol Sigma-Aldrich, Taufkirchen Natriumdodecylsulfat (SDS) AppliChem, Darmstadt Paraformaldehyd (PFA) Fluka BioChemika, Neu-Ulm Penicillin/Streptomycin MP Biomedicals, Illkirch (Frankreich) Ponceau S Sigma-Aldrich, Taufkirchen Saccharose Roth, Karlsruhe Tetramethylethylendiamin (TEMED) AppliChem, Darmstadt Tris(hydroxymethyl)-Aminomethan Sigma-Aldrich, Taufkirchen Triton® X-100 AppliChem, Darmstadt Tween-20 AppliChem, Darmstadt Materialien | 13 2.2.2 Antibiotika Die in dieser Arbeit eingesetzten DNA-Konstrukte zur Transformation in Bakterien besitzen jeweils eine Genkassette für eine bestimmte Antibiotikaresistenz. Zur Selektion von Bakterien, die das Konstrukt und das Resistenzgen exprimieren, wurde dem entsprechenden LB-Kulturmedium bzw. der entsprechenden Agarplatte (siehe Kapitel 2.3.1) ein Antibiotikum zugesetzt. In dieser Arbeit wurden folgende Antibiotika-Endkonzentrationen für bakterielle Kulturen eingesetzt: ● 100 µg/mL Ampicillin (Roth, Karlsruhe) ● 35 µg/mL Kanamycin (Sigma-Aldrich Chemicals, Taufkirchen) 2.2.3 Lösungen und Puffer Die in dieser Arbeit verwendeten Lösungen und Puffer wurden mit A. bidest angesetzt und für empfindliche molekularbiologische Untersuchungen ggf. autoklaviert. Falls der Hersteller keine eindeutigen Angaben zur Lagerung gemacht hat, wurden die Lösungen bei Raumtemperatur gelagert. Auf die jeweils benötigten Lösungen und Puffer wird an entsprechender Stelle in Kapitel 3 hingewiesen. Folgende Lösungen und Puffer wurden in dieser Arbeit verwendet: Bezeichnung Zusammensetzung, Lagerung, Hersteller Acrylamid–Stammlösung 30 % Acrylamid/Bis-Acrylamid Solution, Lagerung bei 4°C, Roth, Karlsruhe Calciumchloridlösung 1mM bis 1M CaCl2, Lagerung bei RT Hepes 1 M 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure, Lagerung kurzfristig bei 4°C und längerfristig bei -20°C, PAA, UK HEBS Lösung (2x) HEPES acid 10 g; NaCl 16 g; KCl 0,74 g; Na2HPO4 x H2O 0,25 g; Glucose 2 g; 10 ml 10 x PBS; Mit H2O auf 11 ml auffüllen; pH von 7,05 einstellen. Lagerung kurzfristig bei 4°C und längerfristig bei -20°C. IP-Puffer 1% Triton-X-100, 20mM Tris-HCl pH 7,4, 25mM NaCl-Lösung, 50mM NaF, 15mM Na4P2O7, 1mM EDTA, Einstellen auf pH= 8,0, Lagerung bei 4°C PBS (Phosphate-Buffered Saline) PBS Dulbecco m/o Ca2+, Lagerung bei RT und falls geöffnet bei 4°C, Biochrom AG, Berlin Protein–Laufpuffer 10x (10x Running buffer) 2 M Glycin; 0,5 % SDS, 250 mM Trizma® Base, Lagerung bei RT Stripping Puffer 15 g Glycin, 1 g SDS, 10 ml Tween 20, auf 1 L mit A. bidest auffüllen und pH 2,2 einstellen, Lagerung bei RT Materialien | 14 TAE Puffer 40 mM Tris; 1 mM EDTA-Na-Salz; 40 mM Essigsäure, Lagerung bei RT Tankblot-Puffer 25mM Tris, 192mM Glycin, in dH20 gelöst, Einstellen auf pH= 8,3, Lagerung bei 4°C Tris Buffered Saline plus Tween-20 (TBS-T) 10 mM Tris pH 7,4; 0,05 % Tween-20; 150 mM NaCl, Lagerung bei RT Transfer–Puffer 10x 144 g Glycin; 30 g Trizma® Base; mit H2O auf 1 Liter auffüllen, Lagerung bei 4°C Trypsin-EDTA Lagerung der Gebrauchslösung bei 4°C, längerfristige Lagerung bei -20°C, PAA, UK 2.3 Medien Die Kulturmedien für Bakterien und eukaryotische Zellen, sowie Agarplatten für Bakterien wurden autoklaviert und, falls nicht anders angegeben, bei 4°C gelagert. 2.3.1 Medien zur Kultivierung von Bakterien (E.coli) Zur Kultivierung von E.coli Bakterien wurden in dieser Arbeit LB(Luria-Bertani-Broth)Flüssigmedium und LB-Agarplatten verwendet: ● Flüssigkultur: 20 g LB-Broth Powder (Roth, Karlsruhe) add. 1L dH2O ● LB-Agarplatten: 20 g LB-Broth Powder (Roth, Karlsruhe) + 20 g/l Bacto-Agar (20 % w/w; AppliChem) add. 1L dH2O Nach Ansetzen der oben genannten Lösungen wurden diese 30 Minuten bei 121°C autoklaviert. Bei Verwendung von Selektionsantibiotika (siehe Kapitel 2.2.2) für die Agarplatten wurden diese erst hinzugegeben, wenn der Autoklav eine Temperatur von ca. 55°C erreicht hat. Den Flüssigkulturmedien wurde bei Bedarf direkt vor Gebrauch ein Antibiotikum hinzugegeben. 2.3.2 Medien für eukaryotische Zelllinen In dieser Arbeit wurden verschiedene eukaryotische Zelllinien verwendet. Für HeLa- und CV1- Zellen sowie für Primärneurone (siehe Kapitel 2.5.5.2) wurde DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Dieses standardisierte Medium enthält Nährstoffe, Aminosäuren, Vitamine und Elektrolyte in physiologischen Konzentrationen. Dem Medium wurde noch 10% fetales Kälberserum (Pan System GmbH, Nürnberg) zugesetzt, das zusätzlich Proteine und Wachstumsfaktoren enthält. Um bakteriellen Kontaminationen vorzubeugen, wurde außerdem noch 1% P/S (Penicillin / Materialien | 15 Streptomycin; MP Biomedicals, Illkirch, Frankreich) zugegeben. Zur Kultivierung von HEK293T- Zellen wurde anstelle des fetalen Kälberserums 10% Kälberserum mit Eisenzusatz verwendet (Cell Concepts, Umkirch), das für das Wachstum der Zellen notwendig ist. 2.4 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien Die Reagenziensysteme (“kits”) und Verbrauchsmaterialien wurden wie vom Hersteller angegeben gelagert und nach Herstellerprotokoll verwendet. Bezeichnung Hersteller Bakterien Kulturröhrchen Sarstedt, Nümbrecht Blottingpapier („Whatman“) Schleicher und Schüll, Berlin Deckgläser VWR, Darmstadt ECL-Filme FUJI Film Super RX, Düsseldorf Filterpapiere Ø 125 mm/ 70 mm Roth, Karlsruhe Fuji Medical X-Ray Films Fuji Foto Film GmbH, Düsseldorf Laborröhrchen 12,0/ 75 mm Greiner Labortechnik, Frickenhausen Live Cell Schalen (µ-Dish 35 mm, steril, hoch) Ibidi, München Lipofectamin 2000 Invitrogen, Karlsruhe Multidishes (6well- und 24well-Platten) Nunc, Langenselbold Objektträger VWR, Darmstadt Petrischalen Greiner Labortechnik, Frickenhausen Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht Zyppy(TM) Plasmid Miniprep Kit Zymo Research, USA Plastikwaren für die Zellkultur BD Falcon, Belgium PureLinkHiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit Invitrogen, Karlsruhe PVDF-Immobilon Membran (0,45 µm) Millipore, Schwalbach am Taunus Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg Sterilfilter Millipore, Schwalbach am Taunus Flexi-Strip Schaber Biwex, Niederlande Zentrifugenfiltersäulen: Amicon Ultra-4 10K, Centrifugal Filter Devices Millipore, USA Materialien | 16 2.5 Biologische Materialen 2.5.1 Antikörper 2.5.1.1 Primäre Antikörper In dieser Arbeit wurden folgende primäre Antikörper verwendet: Spezifität Spezies Verdünnungsfaktor Hersteller Anti-Flag (M2) Maus 1:1000 Sigma-Aldrich, Taufkirchen Anti-GFP (JL8) Maus 1:1000 Sigma-Aldrich, Taufkirchen Anti-KIBRA Maus 1:500 eigene Herstellung Anti-V5 Ratte 1:1000 Sigma-Aldrich, Taufkirchen Anti-Beta-Tubulin Maus 1:1000 Sigma-Aldrich, Taufkirchen 2.5.1.2 Sekundäre Antikörper Für die durchgeführten Western Blot Analysen (siehe Kapitel 3.3.2) wurden folgende HRP(horse radish peroxidase)-gekoppelten Sekundärantikörper verwendet: ● Ziege-Anti-Maus-Antikörper, 1:2000 verdünnt (Jackson Immunoresearch, UK) ● Ziege-Anti-Ratte-Antikörper, 1:2000 verdünnt (Jackson Immunoresearch, UK) 2.5.2 Enzyme und Marker 2.5.2.1 Restriktionsenzyme Zum Schneiden von DNA-Molekülen an definierten Sequenzen wurden folgende Restriktionsendonukleasen des Herstellers NEB (New England Biolabs, Frankfurt a.M.) verwendet: EcoRI (Erkennungssequenz: 5‘-GAATTC-3‘) HindIII (Erkennungssequenz: 5‘-AAGCTT-3‘) SacI (Erkennungssequenz: 5‘-GAGCTC-3‘) Materialien | 17 2.5.2.2 Größenstandards Die in dieser Arbeit verwendeten Größenstandards für DNA- und Proteinanalysen sind in Abb. 2.1 dargestellt: Abbildung 2.1: Verwendete Größenstandards A, Benchtop 100 bp DNA Ladder von Promega, Mannheim, Benchtop 1 kb DNA Ladder von Promega, Mannheim. B, PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder von Fermentas, St. Leon-Rot. 2.5.3 Primer Primer sind synthetisch hergestellte, kurze Oligonukleotide, die spezifisch an bestimmte Stellen der DNA binden können, die zu ihrer eigenen Sequenz komplementär sind. In dieser Arbeit wurden Primer bei der Durchführung einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) im Rahmen der Sequenzierung nach Sanger (siehe Kapitel 3.2.6) in einer Konzentration von 10 pmol/µl eingesetzt. Folgende Primer wurden verwendet: ● EGFP for.: 5‘-CGA GAA GCG CGA TCA CAT GG-3‘ ● KIBRA S1: 5’-CCG CTA CCG AAA CAG TAC CTG GAT-3’ ● KIBRA S2: 5’-CGG CTG GAA AAG GAC CTG CAG GCA G-3’ ● KIBRA S3: 5’-CTG GAC TCC TCC ACT TCA GCC-3 ● KIBRA S4: 5’-CCA CGT TCC TCT CTC TCC TCC-3’ ● KIBRA S5: 5’-GAG GCT TCC GTG CAG AGA CTG-3’ ● KIBRA S6: 5’-CGG CCT CTG GAC GCC TCA GAC-3’ ● KIBRA S7: 5’-AGG GAG CTC AAG CCA GTG GGA-3’ ● KIBRA S8: 5’-TCA CCT GAT ATG GAT GGG TAC-3’ ● KIBRA S9: 5’-CGA AAC TCC CTG GAG CGA-3’ Materialien | 18 2.5.4 Klonierungskonstrukte In dieser Arbeit wurden eukaryotische Vektoren zur Expression rekombinanter Proteine in eukaryotischen Zell-Linien verwendet (siehe Kapitel 3.2.7). Neu erstellte Konstrukte wurden zunächst in Bakterien transformiert (siehe Kapitel 3.2.1) und nach Animpfen von Minikulturen bestimmter Klone mittels Restriktionsverdau und anschließender Sequenzierung überprüft. Folgende Klonierungskonstrukte wurden verwendet: ● pEGFP-IJ-KIBRA Fl (bereitgestellt durch J. Kremerskothen, Molekulare Nephrologie) ● pExP-Flag-PKMζ (bereitgestellt durch A. Schneider, SYGNIS Pharma AG, Heidelberg) ● pExP-Flag-PKMζ K98W (bereitgestellt durch A. Schneider, SYGNIS Pharma AG, Heidelberg) ● pEGFP-IJ-KIBRA Δ(AS 953-997) (bereitgestellt durch J. K., Molekulare Nephrologie) ● pEGFP-IJ-KIBRA Δ(AS 953-974) (bereitgestellt durch J. K., Molekulare Nephrologie) ● pEGFP-IJ-KIBRA Δ(AS 986-997) (bereitgestellt durch J. K., Molekulare Nephrologie) ● pEGFP-IJ-KIBRA R969W (bereitgestellt durch J. K., Molekulare Nephrologie) ● pEGFP-IJ-KIBRA 962-974 (bereitgestellt durch J. K., Molekulare Nephrologie) ● pVen1-Flag-KIBRA 105-1113 (bereitgestellt durch J. K., Molekulare Nephrologie) ● pVen2-HA-PKMζ (bereitgestellt durch J. K., Molekulare Nephrologie) Alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten gentechnisch veränderten Organismen (GVO´s) sind nach Gentechnikgesetz der Risikogruppe R1 zuzuordnen. Materialien | 19 2.5.5 Verwendete Organismen 2.5.5.1 Bakterien (E.coli) Stamm Genotyp Referenz DH10B F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Ф80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 endA1 araD139 ∆(ara, leu) 7697 galU galK ג- rpsL nupG tonA Invitrogen, Karlsruhe 2.5.5.2 Eukaryotische Zellen Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Zelllinien verwendet: Stamm Beschreibung Referenz CV1 Nierenzellen einer afrikanischen grünen Meerkatze. ATCC-Nr. CRL- 1650 HEK293T Humane embryonale Nierenzellen, die durch Transformation mit einem Adenovirus immortalisiert wurden. ATCC-Nr. CRL- 157 HeLa Humane Epithelzellen, die aus einem Zervixkarzinom isoliert wurden. ATTC-Nr. CCL-2 Außerdem wurden in dieser Arbeit primäre, hippocampale Mausneurone für Transfektionen und Live-Cell Untersuchungen verwendet. Die Zellen wurden von Frank Erdmann aus dem Institut für Physiologie I, Münster (Direktor: Prof. Dr. Hans-Christian Pape) isoliert und für Transfektionen bereitgehalten (siehe Kapitel 3.2.7). 2.6 Sonstige Materialien ● Alexa Fluor® 594 Phalloidin, Invitrogen, Karlsruhe Anfärben von F-Aktin in fixierten Zellen (Kapitel 3.3.4) ● ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel, Sigma Aldrich, Taufkirchen Verwendung für KoImmunpräzipitation (Kapitel 3.3.3) ● GFP-Trap® ChromoTech, Martinsried Verwendung für Ko-Immunpräzipitation (Kapitel 3.3.3) Materialien | 20 2.7 Software und Internetprogramme Software/ Programm Anbieter/ Hersteller Adobe Photoshop CS4 Extended 11.0 Adobe Systems © 1990-2008 AxioVision Rel. 4.8.0.0 Carl Zeiss Imaging Solutions GmbH © 2006-2009 CHROMAS Lite Version 2.01 Conor McCarthy © 1998-2005 CorelDRAW X4 Corel Corporation © 2010 ImageJ 1.43m Wayne Rasband, National Institute of Health (USA) Microsoft Office 2007 Microsoft Cooperation © 2007 WS_FTP LE Ipswitch, Inc.; by J. A. Junod © 1992-2000 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ NCBI: PubMed. U.S. National Library of Medicine & National Institutes of Health http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Basic Local Alignment Search Tool by NCBI (National Center for Biotechnology Information) http://www.expasy.ch/ The ExPASy (Expert Protein Analysis System) proteomics server of the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) Methoden | 21 3. Methoden 3.1 Anzucht, Kultivierung und Lagerung von Bakterien und eukaryotischen Zellen 3.1.1 Umgang mit Bakterien (E.coli DH10B) In dieser Arbeit wurden kompetente DH10B E.coli Bakterien verwendet. Diese werden als 150µl Aliqots bei -80°C gelagert. Zum Anzüchten können LB-Agarplatten oder eine LBFlüssigkultur verwendet werden (siehe Kapitel 2.3.1). Das Animpfen der Agarplatten erfolgt durch großflächiges Ausstreichen einer Bakteriensuspension mithilfe einer Impföse und anschließender Inkubation bei 37°C über Nacht im Brutschrank. LB-Flüssigkulturen werden durch Zugabe einer Bakteriensuspension angeimpft und bei 37°C im Schüttelinkubator über Nacht inkubiert. Zur Selektion wird bei Kultivierung von Bakterien ein Antibiotikum zugegeben (siehe Kapitel 2.2.2). Die Flüssigkulturen und Agarplatten können bis zu sechs Wochen bei 4°C gelagert werden. 3.1.2 Umgang mit eukaryotischen Zelllinen Eukaryotische Zellen können als Zellsuspension in Kryoröhrchen (Nunc, Langenselbold) bei -196°C in flüssigem Stickstoff dauerhaft gelagert werden. Um diese Zellen wieder aufzutauen, muss die Zellsuspension in den Kryoröhrchen zügig bei 37°C erwärmt und dann in 5 ml DMEM-Komplettmedium (siehe Kapitel 2.3.2) aufgenommen werden. Diese Lösung wird 5 Minuten bei 600 rpm und 20°C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, das Zellpellet wird erneut in 5 mL DMEM-Medium aufgenommen und dann in einer Kulturschale verteilt. Diese Kulturschale kann anschließend beschriftet und im Brutschrank inkubiert werden. Die Kultivierung der Zellen erfolgt in Brutschränken (siehe Kapitel 2.1) mit einer Temperatur von 37°C und 5 Vol% CO2-Begasung. Eine Kontrolle der Konfluenz der Zellen erfolgt mehrmals pro Woche am Mikroskop in der Zellkultur mit Übersichtsvergrößerung. Bei Ausbildung eines konfluenten Zellrasens ("monolayer") oder bei gelblicher Verfärbung des Indikatorfarbstoffes im Medium (saurer pH-Wert) müssen die Zellen in frischem Medium aufgenommen werden und in eine neue Kulturschale überführt werden ("passagieren"). Methoden | 22 Für Hela Zellen ist eine Behandlung mit 10x Trypsin-EDTA notwendig, das als proteolytisches Enzym die aus Aktin bestehenden Adhäsionsplaques der Zellen auflöst und somit zum Ablösen der Zellen vom Boden der Schale führt (Hynes et al., 1982). Dafür wird zunächst das Medium der Zellen abgesaugt und mit 1 mL Trypsin für ca. 2-3 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die Zellen werden anschließend ggf. durch leichtes Anklopfen der Kulturschale vom Boden abgelöst. Dann werden die Zellen in frischem Kulturmedium aufgenommen und in eine neue Kulturschale passagiert. Da HEK293T-Zellen eine schwache Bodenhaftung aufweisen, können sie direkt nach Absaugen des Mediums durch Abspülen von der Platte in frischem Medium aufgenommen und passagiert werden. Die verwendeten Kulturmedien werden vor Gebrauch auf 37°C und die Trypsinlösung auf Raumtemperatur erwärmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Western Blot-Analysen und Immunpräzipitationen durchgeführt (siehe Kapitel 3.3.2 und 3.3.3). Für diese Techniken müssen Lysate der eukaryotischen Zellen hergestellt werden. Dafür wird die Kulturschale mit den Zellen zunächst auf Eis gestellt und dort nach Absaugen des Mediums einmal mit gekühltem PBS gewaschen. Nach Absaugen der PBS-Lösung werden auf die 6cm-Schalen 250 µl, auf die 10cm-Schalen 500µl IP-Puffer (siehe Kapitel 2.2.3) + complete (Roche Diagnostics, Mannheim) gegeben, um die Membranen der Zellen zu zerstören und intrazelluläre Proteine freizusetzen. Der complete-Inhibitor schützt Proteine vor dem Abbau von Proteasen. Nach kurzer Inkubation werden die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden der Schale abgelöst und das Zelllysat schließlich mit einer Pipette aufgenommen und in ein Reaktionsgefäß gegeben. Dort wird das Lysat zum Homogenisieren ca. siebenmal mit einer 1 ml Spritze und einer 26 Gauge Kanüle aufgezogen. Anschließend werden die Proben 30 Minuten mit 14.000 rpm bei 4°C zentrifugiert, um die unlöslichen Bestandteile und die Zellkerne zu pelletieren. Der Überstand enthält die intrazellulären Proteine und wird in ein neues Gefäß gegeben und bei -80°C gelagert. 3.2 Arbeiten mit DNA 3.2.1 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien Im Rahmen dieser Arbeit wurden neu-erstellte DNA-Konstrukte verwendet (siehe Kapitel 2.5.4). Die Plasmid-DNA wurde mit der etablierten Ca2+-abhängigen DNA-Aufnahme (Dagert und Ehrlich, 1979) in kompetente DH10B E. coli Stämme (siehe Kapitel 2.5.5.1) transformiert. Dieser Stamm wird bei -80°C in Aliquots bereitgestellt. Für eine Methoden | 23 Transformation werden die Bakterien zunächst auf Eis überführt und anschließend in einen einminütigen Hitzeschock von 42°C versetzt. Dabei wird die Membran der Bakterien permeabel und ermöglicht die Aufnahme der hinzugegebenen Plasmide. Außerdem führt die Anwesenheit von Ca2+ zu weniger Abstoßungen zwischen der negativ-geladenen DNA und den ebenfalls negativ-geladenen Zellmembranen. Nach 5-minütiger Inkubation auf Eis folgen eine Zugabe von LB-Medium mit 2% Glucose und eine Inkubation im Schüttelinkubator bei 37°C für 60 Minuten. Da nicht alle Bakterien das zugegebene Plasmid aufnehmen, werden Plasmidvektoren mit einer bestimmten Antibiotikaresistenz eingesetzt. Zur Selektion werden die Bakterien auf einer LB-Agarplatte mit entsprechendem Antibiotikum (siehe Kapitel 2.3.1) ausgestrichen. 3.2.2 Inokulation von Bakterienkulturen Um Bakterien effizient zu vermehren, werden diese in LB-Flüssigmedium im Schüttelinkubator bei 37°C und 170 rpm inkubiert. Je nach benötigter Menge können Mini- (5 mL Medium) oder Maxikulturen (500 mL Medium) angeimpft werden, die mit entsprechender Menge eines Antibiotikums versetzt wurden (siehe Kapitel 2.2.2). Zum Animpfen einer Minikultur wird mit einer 10 µl Pipettenspitze ein einzelner Klon einer Bakterienplatte aufgenommen, der dann in einem 10 mL Bakterienröhrchen mit LBFlüssigmedium inkubiert wird. Für eine Maxikultur wird zunächst ein 2 L Erlenmeyerkolben mit 500 mL Medium bereitgestellt, der mit 500 µl Bakteriensuspension aus einer Minikultur angeimpft wird. 3.2.3 Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien Die Isolation von Plasmid-DNA wurde nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (Birnboim und Doly, 1979) durchgeführt. Diese Methode beruht darauf, dass Plasmid DNA in überspiralisierter Form (sog. „super coil“-Konformation) vorliegt und im Gegensatz zur linearen Zell-DNA unter alkalischen Bedingungen nicht denaturiert wird. Für die Isolierung von Plasmiden aus Bakterien wurden in dieser Arbeit sog. „kits“ verwendet, die alle benötigten Puffer und Reagenzien, sowie eine Anionen-Austauschersäule enthalten. Für vorher angelegte Mini- bzw. Maxikulturen wurden entsprechend Mini- oder Maxi-Präparationskits verwendet (siehe Kapitel 2.4). Nach der Fertigstellung der präparierten Methoden | 24 Plasmid-DNA wurde die DNA-Konzentration mithilfe eines Photometers bestimmt (siehe Kapitel 2.1). Als Referenzwert wurde zunächst das Absorptionsspektrum des Puffers (TE Puffer, Bestandteil des verwendeten “kits”) bestimmt, in dem die DNA aufgenommen wurde. Das Absorptionsmaximum von DNA beträgt 260 nm, das von Proteinen 280 nm. Daraus kann die Konzentration der DNA und ein Quotient für die Verunreinigung mit Proteinen (Absorption 260 nm / 280 nm) bestimmt werden. Dieser liegt idealerweise über 1,7. 3.2.4 Restriktionsverdau von DNA Restriktionsenzyme schneiden DNA an definierten, pallindromischen Stellen und erzeugen unterschiedlich lange DNA-Fragmente. Die Länge der Fragmente kann bei bekannter DNASequenz bestimmt werden. Somit kann bei einem neu erstellten Konstrukt überprüft werden, ob sich das richtige Insert im Plasmid-Vektor befindet. Die eingesetzten Restriktionsenzyme wurden mit dem vom Hersteller empfohlenen und mitgelieferten Puffer ca. 1-2 Stunden bei 37°C inkubiert. In Tab. 3.1 sind die üblich eingesetzten Mengen als Pipettierschema angegeben. 1-5 µg Plasmid-DNA 2 µl 10x Enzympuffer 0,5 - 1 µl Restriktionsenzym 1 0,5 - 1 µl Restriktionsenzym 2 add. 20 µl A. bidest Tabelle 3.1: Pipettierschema eines Restriktionsverdaus. Anschließend wurden die Proben auf ein Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt (siehe Kapitel 3.2.5). 3.2.5 Agarose-Gelelektrophorese Um DNA Fragmente ihrer Größe entsprechend aufzutrennen, werden Agarosegele (1-2 % Agarose in 1x TAE Puffer) verwendet. Je nach gewünschter Trennschärfe können Gele mit 1% oder 2% Agarose eingesetzt werden. Die Gele werden in flüssigem Zustand bei 65°C vorgehalten und zur Anwendung bei Raumtemperatur in Gelkammern gegossen. Danach wird 1% Ethidiumbromid (10 µg/µl) hinzugegeben und es werden entsprechend große Kämme für die spätere Zugabe der Proben in die Kammern eingesetzt. Nach dem Aushärten der Gele Methoden | 25 wird zum Trennen der aufgetragenen Proben ein elektrisches Feld (100-130 V) angelegt. Das eingesetzte Ethidiumbromid weist durch Interkalation mit der DNA ein erhöhtes Fluoreszenzspektrum nach Anregung mit ultraviolettem Licht auf. Bei Verwendung eines Markers mit definierten DNA-Fragmenten (siehe Kapitel 2.5.2.2) kann die Größe der eingesetzten Proben abgelesen werden. 3.2.6 Sequenzierung von DNA Um angefertigte Mini- oder Maxipräparationen auf genaue Basensequenz zu überprüfen, wurde die Sequenzierungsmethode nach Sanger angewandt (Sanger und Coulson, 1975). Dabei wird zunächst eine modifizierte PCR (polymerase chain reaction) mit normalen Desoxynukleotiden (dNTPs) und fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden (ddNTPs), die wegen des fehlenden 3‘ OH-Endes zum Kettenabbruch führen, durchgeführt. Somit entstehen unterschiedlich lange Fragmente, deren letzte Base durch Fluoreszenzanalyse ausgewertet werden kann. Zur Sequenzierung bestimmter Regionen werden in der PCR Primer verwendet, die an spezifische, komplementäre DNA-Regionen binden (siehe Kapitel 2.5.3). Ein Ansatz für eine Sequenzierungs-PCR wird beispielhaft in Tab 3.2 aufgeführt. 1 µg Plasmid-DNA 0,5 µl Primer forward od. reverse 1 µl Big Dye 3.1 2 µl Big Dye Puffer add. 10µl A. bidest Tabelle 3.2: Schematischer Ansatz einer Sequenzierungs-PCR. Die PCR wird mit folgenden Parametern durchgeführt: 95°C für 1 Minute o 95°C für 30 Sekunden o 50°C für 20 Sekunden 25 Zyklen o 60°C für 4 Minuten 4°C bis zur Entnahme der PCR Nach Durchführung der PCR wird den Proben jeweils 10 µl A. bidest zugefügt, sodass ein Gesamtvolumen von 20 µl entsteht. Die DNA in den Proben wird vom Zentrallabor für Methoden | 26 molekulare Diagnostik am Universitätsklinikum Münster mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt und per Fluoreszenzanalyse ausgewertet. Die Auswertung wird über einen FTPServer bezogen und mithilfe des Programms Chromas (siehe Kapitel 2.7) analysiert. Die ermittelte Basensequenz kann daraufhin mit der Internetplattform ExPASy (siehe Kapitel 2.7) in eine Aminosäuresequenz translatiert werden, um mögliche missense Mutationen zu erkennen. 3.2.7 Transfektion von DNA in eukaryotische Zellen Im Rahmen dieser Arbeit wurden Klonierungskonstrukte (siehe Kapitel 2.5.4), die als Plasmid-DNA vorlagen, in eukaryotische Zellen transfiziert, um deren Transkription und Translation zu erzielen. Dabei wurden eukaryotische Zellen entweder mit der CalciumPhosphat-Methode oder mittels Lipofektion transfiziert. Für eine optimale Transfektion sollten die kultivierten Zellen einen Tag vor Transfektion auf 6cm- oder 10cm-Kulturschalen passagiert werden und am Tag der Transfektion eine Konfluenz von 60-80% aufweisen. Dies wurde jeweils mit dem Mikroskop in der Zellkultur in der Übersichtsvergrößerung überprüft. Für Immunfluoreszenz- oder Live Cell Imaging-Analysen wurden die Zellen auf Deckgläschen in 6-well Platten oder in Ibidi-Schalen passagiert. Bei der Calcium-Phosphat-Methode bindet DNA zunächst an ausgefallenes CalciumPhosphat, das dann als Kristall dem Zellkulturmedium hinzugegeben und durch Endozytose in die Zellen aufgenommen wird (Kingston et al., 2001). Für die Calcium-Phosphat Methode wird zunächst 500 µl 0,25 M CaCl2 in ein Reaktionsgefäß vorgelegt und 5-10 µg DNA hinzugegeben. Diesem Ansatz wird unter Verwendung des Vortexers tropfenweise 2x HEPES für eine optimale Bildung der Präzipitate hinzupipettiert. Der Ansatz wird 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann unter Schwenken der Kulturschale tropfenweise in das Kulturmedium der Zellen gegeben. Nach ca. 8 Stunden wird das Medium gewechselt. Die Transfektion mittels Lipofektion wurde im Rahmen dieser Arbeit für Primärneurone, die vom Institut für Physiologie I (Direktor: Prof. Dr. Hans-Christian Pape) zur Verfügung gestellt wurden, und für HeLa-Zellen bei Experimenten mit der sog. Bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (Kapitel 3.3.5) verwendet und nach Protokoll des Herstellers durchgeführt. Bei Anwendung wird zunächst serumfreies Medium in zwei Gefäße vorgelegt. In eines der Gefäße wird die Plasmid-DNA, in das andere Gefäß die Lipofektamin 2000® Reagenz zugegeben. Nach fünfminütiger Inkubation werden beide Lösungen Methoden | 27 zusammengeführt und nochmals 30 Minuten inkubiert. Dann wird der jeweilige Ansatz dem Zellkulturmedium hinzugefügt. Die Liposomen, die das DNA-Konstrukt enthalten, verschmelzen dabei mit der Zellmembran der eukaryotischen Zellen und geben die DNA in das Zytoplasma ab. Nach ca. 5 Stunden wird das Medium der Zellen wieder erneuert. Für optimale Ergebnisse bei anschließenden Untersuchungen hat sich im Rahmen dieser Arbeit eine Inkubationszeit von 24 h nach Transfektion als optimal erwiesen. 3.3 Proteinbiochemische Methoden 3.3.1 SDS-Gelelektrophorese Die Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht wurde mittels SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfate-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese) durchgeführt. Bei dieser Technik wird ein diskontinuierliches Acrylamid-Gel als Trennmedium verwendet, dem zusätzlich das anionische Tensid SDS zur gleichmäßigen negativen Ladung der Proteine hinzugegeben wird. Die Trenngele können je nach Bedarf in unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt werden. Das Acrylamid-Gel besteht aus einem Sammel- und Trenngel, das wahlweise in eine Gelkammer mit einer Stärke von 1,0 mm bzw. 1,5 mm gegossen werden kann. In Tab. 3.3 sind die Konzentrationen beispielhaft für ein 8%iges Gel mit einer Stärke von 1,5 mm dargestellt. Sammelgel (5%) Trenngel (8%) dH20 2,1 ml 4,6 ml 30% Acrylamidmatrix 0,5 ml 2,7 ml Tris 0,38 ml 1 M, pH 6,8 2,5 ml 1,5 M, ph 8,8 10 % SDS 30 µl 10 µl 10% APS 30 µl 100 µl TEMED 3 µl 6 µl Tabelle 3.3 Beispielhafte Zusammensetzung eines 8% SDS-Gels mit 1,5 mm Stärke. Die Herstellung erfolgt in einer Plastik-Gelkammer, in der zunächst die flüssige Lösung des Trenngels gegossen und dann mit Isopropanol beschichtet wird. Sobald das Gel polymerisiert ist, kann das Isopropanol abgegossen und das Sammelgel hineingegossen werden. Für den späteren Auftrag der Proteinlösungen wird nach dem Eingießen des Sammelgels ein Methoden | 28 Plastikkamm eingesetzt. Die fertigen Gele können in feuchtem Papier und Plastikfolie eingepackt max. 1 Woche bei 4°C gelagert werden. Die eingesetzten Proben werden mit 1x oder 2x Lämmli-Puffer versetzt und vor dem Auftragen durch fünfminütige Inkubation bei 95°C denaturiert (Laemmli, 1970). Danach können die Proben zusammen mit einem Marker in die Geltaschen pipettiert werden. Als Größenstandard wurde ein kommerzieller Proteinmix mit definierten Molekulargewichten eingesetzt (Page RulerTM Plus Prestained Protein Ladder, Fermentas; siehe Kapitel 2.5.2.2). Die Gelkammer wird in einer speziellen Vorrichtung mit Elektroden positioniert, die während der Elektrophorese mit frischem 1x Laufpuffer (Running buffer; siehe Kapitel 2.2.3) gefüllt werden. Während sich die Proben im Sammelgel befinden, wird eine elektrische Spannung von 150 V, im Trenngel von 200 V, angelegt. Nach erfolgter Auftrennung der Proteine kann ein Western Blot durchgeführt werden. 3.3.2 Western Blot Verfahren Ein Western Blot ermöglicht den Transfer von Proteinen eines Gels auf eine Membran, die für den spezifischen Nachweis von Proteinen mithilfe von Antikörpern zugänglich ist (Towbin et al., 1979). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Proteine mithilfe des „tank blot“-Verfahrens auf eine PVDF(Polyvinyliden-Fluorid)-Membran mit einer Porengröße von 0,45 µm übertragen. Die verwendeten Lösungen sind im Kapitel 2.2 aufgeführt. Für die Durchführung wird zunächst eine verschließbare Kassette in eine mit Transferpuffer gefüllte Wanne gelegt. In die offene Kassette wird ein Filterpapier platziert, auf das dann das SDS-Gel und die mit Methanol aktivierte PVDF-Membran gelegt werden. Nach dem Platzieren eines weiteren Filterpapiers wird die Kassette nun vorsichtig verschlossen. Der Transfer erfolgt mit Anlegen eines elektrischen Feldes mit einer Stärke von 500 mA für 1,5 bis 2 Stunden. Anschließend werden die übertragenen Proteine auf der Membran mit Ponceau S-Lösung angefärbt und für die Inkubation mit unterschiedlichen Antikörpern wahlweise geschnitten und in gesonderten Gefäßen gelagert. Um unspezifische Bindungen des ersten Antikörpers zu vermeiden, wird die Membran zunächst 30 Minuten mit 5% Milchpulver in TBST bei 37°C oder eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Danach wird der in 5% Milchpulver verdünnte Primärantikörper in entsprechend notwendiger Konzentration hinzugegeben (siehe Kapitel 2.5.1.1). Antikörper, die gegen ein artifizielles Protein-tag zum Nachweis von Fusionsproteinen gerichtet sind, wurden für 1 Stunde bei Methoden | 29 Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Antikörper gegen endogene Proteine wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach wird die Membran 5 x 5 Minuten mit einer TBST-Lösung auf dem Schüttelinkubator gewaschen. Je nach Spezies des ersten Antikörpers erfolgt nun eine Inkubation mit einem zweiten Antikörper, der gegen das Fc-Fragment des ersten Antikörpers gerichtet ist. Der zweite Antikörper wird in einer Konzentration von 1:2000 in 5%iger Magermilchpulver-TBST-Lösung hinzugegeben. Da dieser Antikörper außerdem mit dem Enzym HRP (horse radish peroxidase) gekoppelt ist, kann durch Umsetzen von Luminol in seine oxidierte Form ein Chemilumineszenz-Signal an den Stellen detektiert werden, wo erster und zweiter Antikörper gebunden haben. Nach einem erneuten Wasch-Schritt mit 5 x 5 Minuten TBST-Inkubation erfolgt die Zugabe der Entwicklerlösung Lumi Light oder, bei schwachen Signalen, Lumi Light plus auf die Membran. Die Chemilumineszenz-Signale wurden mit dem Röntgenfilmgerät oder dem Geldokumentationssystem (siehe Kapitel 2.1) detektiert. Die Banden des Größenstandards wurden auf den entwickelten Filmen mithilfe eines Filzstiftes vermerkt, bei dem Geldokumentationssystem wurde zusätzlich ein Foto im sichtbaren Lichtspektrum angefertigt. Falls ein anderes Protein mit ähnlichem Molekulargewicht nachträglich nachgewiesen werden soll, kann die Membran mit einem sog. Stripping buffer (siehe Kapitel 2.2.3) behandelt werden, der die gebundenen Antikörper wieder löst. Dazu wird die in TBST eingelegte Membran mit ~ 5-10 mL Stripping buffer für 30 Minuten bei 50°C inkubiert. Anschließend wird die Membran erneut mit Magermilchpulver geblockt, woran sich wie oben beschrieben eine Inkubation mit 1. und 2. Antikörper anschließt, sodass am Ende die Signale des neu verwendeten Antikörpers nachgewiesen werden können. 3.3.3 Ko-Immunpräzipitation Im Rahmen dieser Arbeit wurden Ko-Immunpräzipitationen zum Nachweis von ProteinProtein Interaktionen eingesetzt. Bei diesem Verfahren werden Agarose beads verwendet, die mit Antikörpern gekoppelt sind. Die Antikörper sind gegen ein Epitop des zu untersuchenden Proteins gerichtet. Durch Inkubation der beads mit den Proteinen eines Zell-Lysats wird das vom Antikörper gebundene Protein mitsamt seiner Interaktionspartner ebenfalls gefällt (kopräzipitiert) (Masters, 2004). Der Nachweis der Proteine erfolgt im Western Blot (siehe Kapitel 3.3.2). Zur Durchführung werden in der Zellkultur zunächst die DNA Konstrukte für die zu untersuchenden Proteine in eukaryotischen Zellen transfiziert (siehe Kapitel 3.2.7). In dieser Methoden | 30 Arbeit wurden beads mit Antikörpern gegen ein M2-Flag- bzw. GFP Epitop verwendet (siehe Kapitel 2.6), daher muss eines der Proteine entsprechend mit einem M2-Flag- bzw. GFP Epitop verbunden sein. Für die Immunpräzipitation wird einer Stammlösung mit beads ein Aliquot entnommen (40 µl pro Ansatz), das nach Zugabe von 700-1000 µl IP-Puffer mit der Tischzentrifuge (6000 rpm) zentrifugiert wird. Danach wird der Überstand weitestgehend abgenommen und mit 700-1000 µl IP-Puffer erneut homogenisiert. Dieser Schritt wird 3x wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation wird der Überstand wieder abgenommen und mit IP-Puffer soweit aufgefüllt, dass eine 50%ige Suspension (slurry) entsteht. Die in der Zellkultur transfizierten Zellen werden lysiert und in IP-Puffer + complete aufgenommen (siehe Kapitel 3.1.2). Danach wird in einem Western Blot kontrolliert, ob die Proteine tatsächlich exprimiert werden. Anschließend wird ein jeweiliger Ansatz für die Immunpräzipitation nach folgendem Schema erstellt: ● 50-100 µl Lysat ● 40 µl vorbereitete Flag-beads ● add. 500 µl IP-Puffer + complete Die Ansätze werden über Nacht in einem Überkopfschüttler bei 4°C inkubiert, damit die Antikörper der beads an die entsprechenden Proteine binden können. Am nächsten Tag werden die Proben wie oben beschrieben 3x gewaschen, um die Spezifität der Kopräzipitate zu erhöhen. Anschließend werden die Proben 1:1 mit 2x Lämmli-Puffer versetzt und 5 Minuten bei 95°C erhitzt, um alle vorhandenen Proteine zu denaturieren. Dann erfolgen eine erneute Zentrifugation in der Minizentrifuge und schließlich der Auftrag des Überstands auf das SDS-Gel für den anschließenden Western Blot zum spezifischen Nachweis der Proteine. 3.3.4 Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation Im Rahmen dieser Arbeit wurde die direkte Interaktion zweier Proteine mit der sog. BiFCTechnik (Bimolekular Fluoresce Complementation) untersucht (Kerpolla, 2008). Dabei werden Fusionsproteine eingesetzt, die die beiden Proteine enthalten, deren potentielle Interaktion man nachweisen möchte. Diese sind mit jeweils einem Fragment eines fluoreszierenden Venus-tag gekoppelt. Das Konstrukt des Vektors pVen1 enthält die Aminosäuren 1-154, der Vektor pVen2 die Aminosäuren 155- 238 des Venus-Proteins. Die beiden Fragmente haben für sich alleine keine Fluoreszenzeigenschaften. Erst wenn die Methoden | 31 beiden zu untersuchenden Proteine tatsächlich interagieren, kommen Amino- und CarboxyTerminus der Fluoreszenzprotein-Fragmente in räumliche Nähe und bilden eine funktionsfähige Einheit, die im Fluoreszenzmikroskop in vivo nachgewiesen werden kann (Abb. 3.1). Dies bietet außerdem die Möglichkeit einer Lokalisation der Proteininteraktion in der Zelle. Abbildung 3.1: Schema zur Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen mit bimolekularer Fluoreszenzkomplementation. Bei dieser Methode werden zwei Fusionsproteine in eukaryote Zellen transfiziert, die jeweils mit dem Aminoterminus bzw. dem Carboxyterminus eines Venus-tag gekoppelt sind. Wenn die beiden Proteine miteinander interagieren, kommen die jeweiligen Fragmente des Venus-Proteins in räumliche Nähe und bilden eine fluoreszierende Einheit. Mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie kann die zelluläre Lokalisation dieser Interaktion dargestellt werden. Für die Durchführung wurden im Rahmen dieser Arbeit folgende DNA-Konstrukte (siehe Kapitel 2.5.4) verwendet: ● pVen1-Flag ● pVen1-Fag- KIBRA (AS 105-1113) ● pVen2-HA-PKMζ Für den Versuch wurden zunächst HeLa-Zellen auf Deckgläschen (1 cm Durchmesser) ausgesät, die dann in einer 24-well Platte platziert wurden. Am nächsten Tag wurden die Konstrukte mithilfe von Lipofectamin 2000 ® in die HeLa-Zellen transfiziert (siehe Kapitel 3.2.7). Nach 24 Stunden wurde das Medium aus den well-Platten abgesaugt und 2-mal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen auf den Deckgläschen mit Formaldehyd (4% in PBS) für 20 Minuten inkubiert, um die Zellen zu fixieren und danach erneut zweimal mit PBS zu waschen. Anschließend wurden die Zellen für 10 Minuten mit 50 mM Ammoniumchlorid inkubiert, um Aminogruppen im Überschuss anzubieten, damit das restliche Formaldehyd abgefangen werden kann (Quenschen). Nach erneutem Waschen mit PBS erfolgte eine Inkubation mit 0,2 % Triton X100 in PBS für 2 Minuten, um die Methoden | 32 Membranen zu permeabilisieren. Anschließend wurde wieder PBS zum Waschen verwendet und 30 Minuten Phalloidin-Alexa 594 zum Anfärben von F-Aktin zugegeben. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Deckgläschen aus der well-Platte gehoben, kurz in demineralisiertes Wasser eingetaucht und schließlich mit der Zellseite auf einen Objektträger gelegt, der zuvor mit einem Tropfen Moviol versehen wurde. Die Moviol-Lösung dient der Fixation des Deckgläschens auf dem Objektträger. Zuletzt wurde der Objektträger 30 Minuten bei 37°C inkubiert, damit das Moviol aushärtet. Im Anschluss konnten die Deckgläschen im Fluoreszenzmikroskop untersucht werden. In dieser Arbeit wurden außerdem CV1-Zellen in einer Ibidi-Schale mit den oben genannten Konstrukten transfiziert und dann unter Live Cell Bedingungen untersucht, damit mögliche Artefakte durch die Fixation ausgeschlossen werden können. 3.3.5 Live Cell Untersuchungen Für Live Cell Analysen wurden im Rahmen dieser Arbeit kultivierte, embryonale Neurone aus den Hippocampi von Mäusen mit Vektoren, die für fluoreszierende Fusionsproteine kodieren, transfiziert (siehe Kapitel 3.2.7). Die Isolation, Transfektion und Kultivierung der Zellen erfolgte durch Frank Erdmann im Institut für Physiologie I, Münster (Direktor: Prof. HansChristian Pape). Für die Vorbereitung des Versuchs werden die isolierten Neurone aus den Hippocampi embryonaler C57BL/6 Mäuse (Tag 18, E18) auf eine Astrogliakultur auf Deckgläschen in einer 24well-Platte ausgesät. Nach 5 Tagen Kultivierung können die Neurone mit Konstrukten für fluoreszierende Fusionsproteine mittels Lipofektion (siehe Kapitel 3.2.7) transfiziert werden. Für die Live Cell Untersuchungen wird die well-Platte 24 Stunden nach Transfektion schonend zum Institut für Molekulare Nephrologie transportiert. In der Zellkultur werden die Deckgläschen mit der Seite der transfizierten Zellen nach unten in eine Ibidi-Schale gelegt. Für die Untersuchungen wird den Zellen NB(Neurobasal)Medium zugegeben (Invitrogen; vom Institut für Physiologie I zur Verfügung gestellt). Anschließend können die Zellen am Flureszenzmikroskop (Axio Observer, siehe Kapitel 2.1) untersucht werden. Für die Live Cell Studien hat es sich als optimal erwiesen mit der Software AxioVison (siehe Kapitel 2.7) ca. 70 Bilder im Abstand von 7 Sekunden aufzunehmen, sodass sich ein Beobachtungszeitraum von 490 Sekunden pro Gesichtsfeld ergibt. Ergebnisse | 33 4. Ergebnisse In dieser Arbeit sollte die Interaktion von KIBRA mit der neuronenspezifischen Proteinkinase M ζ charakterisiert und untersucht werden. Für zukünftige Experimente zur funktionellen Analyse der Interaktion von KIBRA und PKMζ bei LTP-Untersuchungen an Gehirnschnitten oder im Tiermodell ist die Kenntnis der genauen Bindungsstelle sehr wichtig. Zur weiteren Eingrenzung des aPKC-Bindungsmotifs des KIBRA Proteins sollten daher unterschiedliche Expressionsvektoren für Deletionsmutanten des KIBRA Proteins sowie Flag-markierte PKMζ ko-transfiziert und die beiden rekombinanten Proteine mittels Ko-Immunpräzipitation auf ihre Bindungsfähigkeit hin überprüft werden. Außerdem sollte die Auswirkung von KIBRA auf die Proteinstabilität von PKMζ analysiert werden und in einer Primärkultur hippocampaler Mausneurone die Transporteigenschaften von KIBRA und PKMζ untersucht werden. 4.1 Bestimmung der aPKC-Bindungssequenz KIBRA besteht u. a. aus zwei internen WW-Domänen, einer C2 Domäne, einer Glu-reichen Domäne und einem aPKC-Bindungsmotif (Schneider et al., 2010). Wie in der Einleitung (Kapitel 1.3) beschrieben, ist die Proteinkinase C ζ aus einer regulatorischen und einer katalytischen Domäne aufgebaut (Hirai und Chida, 2003). Die regulatorische Domäne beinhaltet eine Pseudosubstrat-Region (PS), die im inaktiven Zustand der Kinase an das aktive Zentrum der katalytischen Domäne bindet. Das Enzym PKMζ ist hingegen nur aus einer katalytischen Domäne aufgebaut und konstitutiv aktiv. 4.1.1 Datenbankanalysen der aPKC-Bindungssequenz Wie in der Einleitung (Kapitel 1.1) erläutert, existieren in der sogenannten WWC Proteinfamilie neben KIBRA die zwei Paraloge WWC2 und WWC3 mit 49% bzw. 39% Sequenzhomologie. Das aPKC-Bindungsmotif des KIBRA Proteins wurde von zwei verschiedenen Autoren auf die Aminosäuren 953-996 bzw. 919-978 eingegrenzt (Büther et al., 2004; Yoshihama et al., 2011). Es gibt Hinweise darauf, dass in WWC2 und WWC3 auch eine aPKC-Bindungssequenz vorhanden ist (J. Kremerskothen, persönliche Mitteilung). Deswegen wurde in dieser Arbeit zunächst der Bereich der Aminosäuren 900-1000 in den humanen WWC Proteinen mithilfe von Datenbankanalysen auf Sequenzhomologien untersucht (Abb. 4.1). Die Aminosäuren, die in allen drei Proteinen identisch sind, wurden rot markiert. Insgesamt zeigte sich eine Homologie von 53% bei allen Proteinen, KIBRA und Ergebnisse | 34 WWC2 sind in diesem Bereich sogar zu 62% homolog. Aminosäuren, die nur in KIBRA und WWC2 identisch sind, wurden grün markiert. Die gelbe Markierung zeigt die Serine S975 und S978, die von PKCζ phosphoryliert werden. Abbildung 4.1: Datenbankanalyse der aPKC Bindungsregion in den humanen WWC Proteinen. Identische Aminosäuren in KIBRA, WWC2 und WWC3 wurden rot gekennzeichnet. Aminosäuren, die nur in KIBRA und WWC2 identisch sind, wurden grün gekennzeichnet. Die gelbe Markierung zeigt die Serine S975 und S978, die von PKCζ phosphoryliert werden. Insgesamt zeigt sich zwischen allen drei Proteinen eine Homologie von 52%, KIBRA und WWC2 sind in diesem Bereich sogar zu 62% identisch. Besonders in den Bereichen der Aminosäuren 937-952, 958-966 und 986-997 von humanem KIBRA weisen die drei Proteine viele identische Aminosäuren auf. Da Büther und Kollegen in ihrer Arbeit die Bindung eines KIBRA Fragments 953-996 an PKCζ in einem Hefe-Screen zeigen konnten (Büther et al., 2004), wurde dieser Bereich im Rahmen dieser Arbeit zunächst näher untersucht. 4.1.2 Bindungsfähigkeit von KIBRA-Deletionsmutanten an PKMζ Um die aPKC-Bindungssequenz in KIBRA genauer zu bestimmen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Ko-Immunpräzipitation (Kapitel 3.3.3) zur Überprüfung der Bindungsfähigkeit drei verschiedener Deletionsmutanten (Abb. 4.2) von KIBRA an PKMζ durchgeführt. Als Positivkontrolle wurden die bereits im Labor verwendeten und überprüften Konstrukte pEGFP-IJ-KIBRA-Fl (Full length) und pExP-Flag-PKMζ eingesetzt. Für den Versuch wurde ein Konstrukt mit einer Deletion in dem von Büther et al. beschriebenen Bereich der AS 953-996 verwendet, um die Notwendigkeit dieses Bereichs für die Bindung an PKMζ in der Immunpräzipitation zu überprüfen. Des Weiteren wurde ein Konstrukt, bei dem nur der vordere Abschnitt dieser Region fehlt (AS 953-974), und ein Konstrukt ohne den hinteren Abschnitt, der in KIBRA, WWC2 und WWC3 100% homolog ist (AS 986-997; siehe Abb. 4.1), verwendet (Abb. 4.2). Ergebnisse | 35 Abbildung 4.2: Schematische Darstellung der drei eingesetzten Deletionsmutanten von KIBRA. Die Deletionsmutanten pEGFP-IJ-KIBRA Δ(953-997), pEGFP-IJ-KIBRA Δ(953-974) und pEGFP-IJ-KIBRA Δ(986-997) wurden zur besseren Illustration maßstabsgetreu dargestellt. Die weißen Balken in den Proteinen stellen die jeweilige Deletion dar. Das Konstrukt pEGFP-IJ-KIBRA Δ(953-997) wurde im Labor der AG Molekulare Nephrologie schon länger verwendet und konnte für den Versuch direkt eingesetzt werden. Die Konstrukte pEGFP-IJ-KIBRA Δ(953-974) und pEGFP-IJ-KIBRA Δ(986-997) wurden von J. Kremerskothen kloniert und zur Verfügung gestellt. Die Plasmid-DNA wurde zunächst in E. coli DH10B transformiert. Nachdem die Bakterien auf einer Agarplatte angezüchtet wurden, konnte von einzelnen Klonen jeweils eine Bakterienkultur angefertigt werden. Mithilfe der Restriktionsenzymbehandlung wurde das Vorhandensein eines korrekten Inserts überprüft: pEGFP-IJ-KIBRA Δ(953-974): Verdau mit EcoRI 1 Fragment: 2357 bp pEGFP-IJ-KIBRA Δ(986-997): Verdau mit SacI 2 Fragmente: 657 und 1543 bp Ergebnisse | 36 Abbildung 4.3: Restriktionsverdau der Konstrukte pEGFP-IJ-KIBRAΔ(953-974) und pEGFP-IJKIBRAΔ(986-997). Aufgereinigte Plasmide aus den transformierten Klonen K1-4 von pEGFP-IJ-KIBRAΔ(953974) wurden mit EcoRI verdaut. Plasmide aus den Klonen K1-6 von pEGFP-IJ-KIBRAΔ(986-997) wurden mit SacI verdaut. Die Proben wurden nach dem Resrtriktionsverdau auf ein 1% Agarosegel aufgetragen. M= Marker (1kB). Die schwarzen Sterne zeigen die Plasmiden der Klone an, bei denen das zu erwartende Bandenmuster erkennbar war und von denen eine Sequenzierungs-PCR angesetzt wurde. Das in Abb. 4.3 dargestellte Ergebnis des Restriktionsverdaus zeigt, dass bei Klon 1 von pEGFP-IJ-KIBRA Δ(953-974) und Klon 1 von pEGFP-IJ-KIBRA Δ(986-997) das entsprechende Bandenmuster nachgewiesen werden konnte. Daraufhin wurde eine Sequenzierungs-PCR mit entsprechenden Primern angesetzt: pEGFP-IJ-KIBRA Δ(953-974) Primer KIBRA S7 und S9 pEGFP-IJ-KIBRA Δ(986-997) Primer KIBRA S8 Die erhaltenen Sequenzen wurden mit der Internetplattform Expert Protein Analysis System (ExPASy) in eine Aminosäurensequenz übersetzt und anschließend kontrolliert. Dabei wurde in beiden Ansätzen eine erfolgreiche Deletion der entsprechenden Abschnitte detektiert, sodass aus den jeweiligen Mini-Kulturen größere Bakterienkulturen inokuliert wurden und eine DNA Isolierung vorgenommen wurde. Für die Transfektion wurden HEK293T-Zellen in Kultur gehalten und auf 6cm-Schalen ausgesät. Bei der Transfektion wurden fünf Ansätze mit folgenden Mengen an DNA verwendet: 1. 5µg pEGFP-IJ-KIBRA 2. 5µg pEGFP-IJ-KIBRA + 5µg pExP-Flag-PKMζ 3. 5µg pEGFP-IJ-KIBRA Δ(953-997) + 5µg pExP-Flag-PKMζ 4. 5µg pEGFP-IJ-KIBRA Δ(953-974) + 5µg pExP-Flag-PKMζ 5. 5µg pEGFP-IJ-KIBRA Δ(986-997) + 5µg pExP-Flag-PKMζ Ergebnisse | 37 Der erste Ansatz stellt die Negativkontrolle dar, um eine unspezifische Bindung des KIBRA Konstrukts an die Anti-Flag-beads auszuschließen. Der zweite Ansatz wurde als Positivkontrolle für den Nachweis der Bindung von KIBRA an PKMζ gewählt. Die Ansätze 3-5 dienen der Überprüfung der Bindungsfähigkeit der oben genannten Deletionsmutanten an PKMζ. Die Konstrukte wurden mithilfe der Calciumphosphat Methode in die HEK293T Zellen transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Platten mit den transfizierten Zellen unter dem Mikroskop auf eine grüne Fluoreszenz überprüft, um eine erfolgreiche Expression der KIBRA-GFP-Fusionsproteine sicherzustellen. Da in allen Ansätzen eine Transfektionsrate >90% vorlag, wurden Zell-Lysate erzeugt, die zunächst mit einem Western Blot auf eine erfolgreiche Expression aller Proteine untersucht wurden. Anschließend wurden mit den Ansätzen eine Immunpräzipitation mit Anti-Flag beschichteten Agarose beads durchgeführt. Daraufhin wurden die Proben des Lysats und der Immunpräzipitation auf ein SDS-Gel aufgetragen, von dem anschließend ein Western Blot angefertigt wurde. Die Membran mit den immobilisierten Proteinen wurde anhand des verwendeten, gefärbten Größenmarkers bei 100 kDa geschnitten. Der obere Teil der Membran wurde mit einem anti-GFP-Antikörper zum Nachweis der KIBRA-Fusionsporteine, der untere Teil mit einem anti-Flag-Antikörper zum Nachweis der Falg-markierten PKMζ-Fusionsproteine inkubiert und anschließend entwickelt (Abb. 4.4). Ergebnisse | 38 Abbildung 4.4: Bestimmung der aPKC-Bindungssequenz von KIBRA durch Ko-Immunpräzipitation mit Flag-Antikörper beads. HEK293T Zellen wurden mit unterschiedlichen Konstrukten zur Expression von EGFP-markierten KIBRA sowie Flag-markierten PKMζ ko-transfiziert. Lysate aus den Zellen wurden in der KoImmunpräzipitationexperimenten eingesetzt und die gewonnenen Präzipitate mittels Western Blot Analyse untersucht. Die unteren beiden Zeilen stellen Signale für die rekombinanten Proteine aus den jeweiligen Lysaten dar, die oberen Zeilen die Signale nach der Ko-Immunpräzipitation. Die erste und dritte Zeile zeigt die Signale der EGFP-Fusionsproteine (nachgewiesen mit einem anti-EGFP-Antikörper), die zweite und vierte Zeile stellt die Signale nach Detektion der Flag-markierten PKMζ dar (nachgewiesen mit einem anti-Flag-Antikörper). Die unteren beiden Zeilen zeigen, dass die rekombinanten Proteine in den einzelnen Ansätzen in etwa gleichen Mengen exprimiert wurden. Die erste Spur zeigt keine Präzipitation und dient zum Ausschluss einer unspezifischen Bindung des EGFP-KIBRA Fusionsprotein an die Flag-beads. In der zweiten Spur wird offensichtlich, dass EGFP-KIBRA Fl mit Flag-PKMζ ko-präzipitiert wurde. Die Spuren 3 – 5 zeigen die unterschiedlichen Deletionsmutanten von KIBRA, von denen nur die letzte (Δ986-997) zusammen mit FlagPKMζ gefällt wurde. Daraus kann abgeleitet werden, dass die aPKC-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 953 - 974 liegt. Die unteren beiden Zeilen zeigen, dass die Expression der rekombinanten Proteine in den Zell-Lysaten aller fünf Ansätze der transfizierten HEK293T-Zellen in vergleichbaren Mengen funktioniert hat. Die beiden oberen Zeilen stellen das Ergebnis der Immunpräzipitation dar. Die Spur des ersten Ansatzes zeigt keine Präzipitation und dient zum Ausschluss einer unspezifischen Bindung des EGFP-KIBRA Fusionsproteins an die Anti-Flag-beads. In der zweiten Spur, die die Positivkontrolle darstellt, wird deutlich, dass EGFP-KIBRA mit FlagPKMζ ko-präzipitiert wurde. In den Spuren 3 – 5 werden die unterschiedlichen Ansätze mit den Deletionsmutanten von EGFP-KIBRA dargestellt, von denen nur die letzte (EGFPKIBRA Δ986-997) zusammen mit Flag-PKMζ gefällt wurde. Aus diesen Ergebnissen kann Ergebnisse | 39 abgeleitet werden, dass die aPKC-Bindungssequenz des KIBRA Proteins im Bereich der Aminosäuren 953-974 liegt. Um das Ergebnis zu verifizieren und die Signifikanz zu erhöhen, wurden in einer erneut durchgeführten Immunpräzipitation anti-EGFP- beschichtete Agarose beads eingesetzt, die in diesem Fall die EGFP-gekoppelten Fusionsproteine fällen (GFP trap). Es wurden folgende Zell-Lysate aus dem oben genannten Versuch verwendet: 1. HEK293T Zellen transfiziert mit pEGFP-IJ-KIBRA + pExP-Flag-PKMζ 2. HEK293T Zellen transfiziert mit pEGFP-IJ-KIBRA Δ(953-974) + pExP-Flag-PKMζ Die Durchführung des Versuchs erfolgte analog zu dem oben beschriebenen Experiment. Nach der Immunpräzipitation und dem Entwickeln des Western Blots konnte im Auftrag der Lysate erneut die erfolgreiche Expression der transfizierten Proteine in etwa gleichen Mengen nachgewiesen werden (Abb 4.5: untere beiden Zeilen). Abbildung 4.5: Bestimmung der aPKC-Bindungssequenz durch Ko-Immunpräzipitation mit anti-EGFPAntikörper beschichteten beads. In den beiden oberen Zeilen sind die Western Blot Signale nach der Immunpräzipitation zu sehen, die unteren beiden Zeilen zeigen die Signale der rekombinanten Proteine in den Lysaten aus den transfizierten Zellen. Die erste und dritte Zeile zeigen Signale nach Verwendung eines antiEGFP-Antikörpers an, die zweite und vierte Zeile Signale nach der Verwendung eines anti-Flag-Antikörpers. In der ersten Spur wurden Proben mit den Volllängenproteinen von EGFP-KIBRA und Flag-PKMζ aufgetragen. Auch nach Inkubation mit anti-EGFP-Antikörper beschichteten beads ist hier noch ein Flag-Signal auf Höhe von Flag-PKMζ (55 kDa) detektierbar. In der zweiten Spur wurde ein Lysat mit der Deletionsmutante EGFP-KIBRA Δ(953-974) eingesetzt. Dort erfolgte keine Bindung an Flag-PKMζ. Ergebnisse | 40 Die erste Zeile zeigt die erfolgreiche Anreicherung der GFP-Fusionsproteine durch die Fällung mit Anti-EGFP beads. Das bei Bindung von Flag-PKMζ zu erwartende Signal auf Höhe von etwa 55 kDa ist nur in der ersten Spur detektierbar, in der zweiten Spur taucht auf gleicher Höhe kein Signal auf. Dies deutet erneut darauf hin, dass die Aminosäuren 953-974 für die Bindung an PKMζ essentiell sind. Des Weiteren wurde die Bindungsfähigkeit eines EGFP-Fusionsproteins, das aus den Aminosäuren 962-974 aus KIBRA besteht, an PKMζ untersucht. Das Konstrukt zur Expression dieses Fusionsproteins wurde von J. Kremerskothen kloniert. Die Klonierung wurde wie oben beschrieben nach Transformation in E.coli und Kultivierung mit einem Restriktionsverdau auf den Einbau des Inserts überprüft. Dazu wurde die Plasmid DNA aus acht Klonen pEGFP-C1-KIBRA 962-974 mit HindIII verdaut (Abb. 4.6). Abbildung 4.6: Restriktionsanalyse des Konstrukts pEGFP-C1-KIBRA 962-974. Aufgereingte Plasmide aus den transformierten Klonen K1-8 wurden mit HindIII verdaut. Die schwarzen Sterne zeigen die Klone an, von denen anschließend eine Sequenzierungs-PCR angesetzt wurde. Für die Auftrennung der Restriktionsansätze wurde ein 1% Agarosegel verwendet. M= Marker (1kB). Es konnte in allen Klonen - außer Klon 5 - ein eingebautes Insert festgestellt werden. Die Klone 1 und 6 wurden mit dem EGFP for. Primer sequenziert. Die Sequenzierung zeigte ein positives Resultat für beide Ansätze, sodass diese Plasmide direkt für eine Transfektion in eukaryotische Zellen verwendet wurden. Für eine geplante Ko-Immunpräzipitation wurden folgende Ansätze in HEK293T-Zellen transfiziert: 1. 5 µg pEGFP-IJ-KIBRA + 5 µg pExP-Flag-PKMζ 2. 5 µg pEGFP-IJ- KIBRA Δ(953-974) + 5 µg pExP-Flag-PKMζ 3. 5 µg pEGFP-C1-KIBRA 962-974 + 5 µg pExP-Flag-PKMζ Ergebnisse | 41 Die ersten beiden Ansätze wurden als Positiv- bzw. Negativkontrolle gewählt, der dritte Ansatz sollte die Bindungsfähigkeit des neu bestimmten KIBRA Abschnittes AS 962-974 an PKMζ überprüfen. Die Lysate aus den Zellen mit den jeweiligen Transfektionsansätzen wurden nach Expressionskontrolle wie oben beschrieben für eine Ko-Immunpräzipitation mit Anti-Flag beads verwendet. Abbildung 4.7: Überprüfung der Bindungsfähigkeit des KIBRA Fragments AS 962 - 974 an Flag-PKMζ. HEK293T Zellen wurden mit Konstrukten für EGFP-markierte KIBRA Fragmente und Flag-PKMζ kotransfiziert. Die Lysate aus den Zellen wurden in einer anti-Flag Ko-Immunpräzipitation verwendet. Die isolierten Immunpräzipitate wurden anschließend im Western Blot analysiert. Die unteren drei Zeilen zeigen Signale der rekombinanten Proteine in den Lysaten der transfizierten Zellen. Die oberen Zeilen zeigen die Ergebnisse der Ko-Immunpräzipitation der einzelnen Ansätze. Die ersten beiden Spuren stellen die Positiv- bzw. Negativkontrolle dar. In letzter Spur erkennt man, dass das 30 kDa schwere KIBRA 962-974 Fusionsprotein mit Flag-PKMζ nicht ko-präzipitiert wird. Das Ergebnis zeigt, dass die Expression aller rekombinanten Proteine in den transfizierten Zellen erfolgreich war (Abb. 4.7: untere drei Zeilen). Bei der Immunpräzipitation zeigt sich wie erwartet eine Fällung von EGFP-KIBRA Fl in Ansatz 1 und keine Fällung von EGFPKIBRA Δ(953-974) im 2. Ansatz. Das Fragment EGFP- KIBRA 962-974 mit einem Ergebnisse | 42 Molekulargewicht von 30 kDa wurde ebenfalls nicht ko-präzipitiert, was auf eine fehlende Bindung der beiden Fusionsproteine (EGFP-KIBRA 962-974 und Flag-PKMζ) hindeutet. Abschließend konnte aufgrund der durchgeführten Ko-Immunpräzipitationen das aPKCBindungsmotif auf die Aminosäuren 953-974 eingegrenzt werden. Die Bindung eines KIBRA Fragments mit den Aminosäuren 962-974 an PKMζ konnte nicht gezeigt werden. 4.1.3 Bindungsfähigkeit der Mutante KIBRA R969W an PKMζ Wie vorher gezeigt konnte die aPKC-Bindungssequenz von KIBRA auf die Aminosäuren 953-974 eingegrenzt werden (Kapitel 4.1.2). Datenbankanalysen dieser Sequenz ergaben eine hohe Homologie in diesem Bereich des humane KIBRA Proteins zu den Orthologen der Spezies Bos taurus, Gallus gallus, Macaca mulatta, Mus musculus, Rattus norvegicus und Xenopus tropicalis (Abb. 4.8). Wie von Xiao und Kollegen beschrieben besteht in diesem Bereich auch eine Homologie zu der Pseudosubstratsequenz von PKCζ (Xiao et al., 2011). Abbildung 4.8: Lokales Alignment der Aminosäuresequenzen 953-974 in KIBRA verschiedener Spezies und der Pseudosubstratregion von PKCζ. Hs = Homo sapiens, Bt = Bos taurus, Gg = Gallus gallus, Mam = Macaca mulatta, Mum= Mus musculus, Rn= Rattus norvegicus, Xt = Xenopus tropicalis. Rot markierte Aminosäuren sind in allen Spezies identisch. Besonders die Arginine R965, R966, R969 und R972 (*) sind in allen Spezies konserviert und kommen in gleichen Abständen wie in der Pseudosubstratsequenz von PKCζ (PKCZ-PS) vor. Die rot markierten Aminosäuren in Abb. 4.7 sind in allen untersuchten Spezies identisch. Die Homologie der Aminosäuren 953-974 in allen Spezies beträgt 73%. Orr und Newton haben gezeigt, dass besonders basische Arginine in der Pseudosubstratregion der Proteinkinase PKCβ wichtig für die Bindung an saure Aminosäuren in der C4-Region der Ergebnisse | 43 katalytischen Domäne sind (Orr und Newton, 1994a). Die Pseudosubstratregion von PKCζ enthält 5 Arginine (Abb. 4.8). In den KIBRA Orthologen verschiedener Spezies findet man im Abschnitt der aPKC-Bindungssequenz bei den Argininen R965, R966, R969 und R972 eine Homologie (* in Abb. 4.8). Auch hier kommen die Arginine in denselben, definierten Abständen wie in der Pseudosubstratsequenz von PKCζ vor. In der NCBI- (National Center for Biotechnology Information) Datenbank für Single nucleotide polymorphisms (SNP) konnte durch Analyse dieser Sequenz ein SNP im WWC1Gen mit der Referenznummer rs139606423 [C/T] gefunden werden, der eine missense Mutation an der Position R969 im KIBRA Protein auslöst, die wiederum einen Austausch des polaren Arginin (R) mit der unpolaren Aminosäure Tryptophan (W) verursacht. Dieses Arginin an Position 969 ist in KIBRA/WWC1, WWC2 und WWC3, sowie in allen gezeigten Spezies konserviert (Abb. 4.8 und 4.9). Da die Arginine in der Pseudosubstratregion von PKC eine große Rolle für die Bindung an das aktive Zentrum spielen und Datenbankanalysen einen SNP mit einer missense Mutation (R969W) gezeigt haben, wurde in dieser Arbeit die Bindungsfähigkeit dieser Mutante an PKMζ mittels Ko-Immunpräzipitation überprüft. Das Konstrukt pEGFP-IJ-KIBRA R969W wurde von J. Kremerskothen zur Verfügung gestellt und im Rahmen dieser Arbeit mithilfe der Kettenabbruchmethode nach Sanger mit den Primern KIBRA S1-S6 und S9 sequenziert, um die spezifische missense Mutation zu überprüfen. An der Position 969 konnte nach Überführung der ermittelten DNA Basenabfolge in eine Aminosäuresequenz (mithilfe der Internetsoftware ExPASy) statt des normalerweise vorhandenen R (Arginin) ein W (Tryptophan) festgestellt werden. Aus entsprechender Bakterienkultur wurde dann zunächst eine Maxiprep DNA-Isolation erstellt. Folgender Ansatz wurde für eine Transfektion in HEK293T-Zellen mit angegebenen DNA-Mengen verwendet: 1. 5µg EGFP-IJ-KIBRA Fl + 5µg pExp-Flag-PKMζ 2. 5µg EGFP-IJ-KIBRA R969W + 5µg pExp-Flag-PKMζ 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Lysate erstellt und zur Kontrolle auf einem Western Blot analysiert. Im Lysat wurde eine geringere Menge von EGFP-KIBRA R969W im Vergleich zu EGFP-KIBRA Fl detektiert (3. Zeile in Abb. 4.9). Anschließend wurde eine KoImmunpräziptation durchgeführt, um die Bindungsfähigkeit der neuen KIBRA Mutante an Ergebnisse | 44 PKMζ zu prüfen (Durchführung wie in Kapitel 4.1.2). Die Proben wurden im Western Blot aufgetragen (Abb. 4.9). Abbildung 4.9: Überprüfung der Bindungsfähigkeit der KIBRA R969W Mutante an PKMζ. HEK293TZellen wurden mit EGFP-KIBRA R969W und Flag-PKMζ ko-transfiziert. Die Lysate aus den Zellen wurden in einer anti-Flag Ko-Immunpräzipitation verwendet. Die isolierten Immunpräzipitate wurden anschließend im Western Blot analysiert. Die unteren beiden Zeilen zeigen die Expression der Proteine aus dem Zell-Lysat, die oberen Zeilen den Proteinnachweis aus der Immunpräzipitation. In der ersten und dritten Zeile sind die Western Blot Signale nach Inkubation mit einem anti-EGFP Antikörper, in der zweiten und vierten Zeile nach Inkubation mit einem anti-Flag Antikörper dargestellt. In der ersten Spur wurden WT Proteine von KIBRA und PKMζ aufgetragen. In der zweiten Spur wurde die EGFP-KIBRA R969W Mutante eingesetzt. Beide KIBRAFusionsproteine wurden zusammen mit PKMζ ko-präzipitiert. Die unteren beiden Zeilen zeigen, dass in beiden Proben mithilfe des anti-EGFP Antikörpers ein Signal auf Höhe von 140 kDa detektiert werden kann und analog mit anti-Flag Antikörper das Flag-PKMζ Fusionsprotein auf Höhe von 55 kDa dargestellt wird. Bei den Proben aus der Immunpräzipitation zeigt die erste Spur auf dem Western Blot als Positivkontrolle, dass nach Inkubation mit den anti-Flag Agarose beads eine Fällung von Flag-PKMζ und EGFP-KIBRA erfolgt. Das KIBRA-Signal der R969W Mutante in der zweiten Spur zeigt eine Bande auf gleicher Höhe. Dieses Ergebnis indiziert, dass der Austausch R→W der Aminosäure 969 nicht zu einem kompletten Abbruch der Bindung von KIBRA an PKMζ führt. Ergebnisse | 45 4.2 Bindungsfähigkeit von KIBRA an die Kinase-defiziente Mutante PKMζ K98W KIBRA wird als Substrat von PKCζ an den Aminosäuren S975 und S978 phosphoryliert (Büther et al., 2004). Deswegen wurde in dieser Arbeit neben der Bestimmung des aPKCBindungsmotifs in KIBRA zusätzlich die Bindungsfähigkeit einer Kinase-defizienten PKMζ Mutante (K98W; Lysin → Tryptophan) an KIBRA überprüft. Diese Mutante entspricht durch Mutation des aktiven Zentrums der dominant negativen Form von PKCζ K281W (Bandyopadhyay et al., 1997). Ein entsprechendes Konstrukt wurde unserem Labor von der SYGNIS Pharma AG, Heidelberg zur Verfügung gestellt. Für die durchgeführte KoImmunpräzipitation wurde folgende Konstrukte in HEK293T-Zellen transfiziert: ● 5µg pEGFP-IJ-KIBRA + 5µg pExP-Flag-PKMζ K98W Die Herstellung des Zell-Lysates und die Durchführung der Immunpräzipitation mit anti-Flag beads erfolgten zusammen mit den Ansätzen aus Kapitel 4.1.2 zur Bestimmung des aPKCBindungsmotifs. Die Ergebnisse wurden im Western Blot analysiert und entsprechende Signale mit anti-EGFP- und anti-Flag- Antikörpern detektiert (Abb. 4.10). In der Abbildung ist zunächst die Positiv- und Negativkontrolle des Versuchs aus Kapitel 4.1.2 mit dargestellt, die zeigen, dass KIBRA mit Flag-PKMζ ko-präzipitiert wird, wenn beide Proteine exprimiert wurden. Daneben befindet sich die Spalte, die den Ansatz mit EGFP-KIBRA und Flag-PKMζ K98W zeigt. Ergebnisse | 46 Abbildung 4.10: Überprüfung der Bindungsfähigkeit der Kinase-defizienten Mutante PKMζ K98W an KIBRA. HEK293T-Zellen wurden mit EGFP-KIBRA und Flag-PKMζ bzw. mit der Mutante Flag-PKMζ K98W ko-transfiziert. Die Lysate aus den Zellen wurden in einer anti-Flag Ko-Immunpräzipitation verwendet. Die isolierten Immunpräzipitate wurden anschließend im Western Blot analysiert. Die unteren beiden Zeilen zeigen die Expression der Proteine aus dem Zell-Lysat, die oberen Zeilen den Nachweis aus der Immunpräzipitation. Die Membranen aus der ersten und dritten Zeile wurden mit einem anti-EGFP-Antikörper inkubiert, die Membranen aus der zweiten und vierten Zeile mit einem anti-Flag-Antikörper. Die erste und zweite Spur zeigen die Negativ- bzw. Positivkontrolle. Bei Verwendung der Kinase-defizienten Variante PKMζ K98W in der dritten Spur wird KIBRA nicht ko-präzipitiert. Die unteren beiden Zeilen zeigen die Expression von EGFP-KIBRA und der Flag-PKMζ K98W Mutante im Lysat. Für die Mutante zeigt sich ein relativ niedriger Proteinlevel, der jedoch zur Durchführung einer Immunpräzipitation ausreichend war. Nach Fällung von FlagPKMζ K98W konnte ein verstärktes Flag-Signal detektiert werden, das auf eine Anreicherung durch die Inkubation mit anti-Flag-Antikörper beschichteten beads hindeutet. Ein EGFPSignal für das KIBRA Protein konnte jedoch nicht nachgewiesen werden, was im Vergleich zur EGFP-KIBRA und Flag-PKMζ Kontrolle (zweite Spur in Abb. 4.10) darauf hindeutet, dass EGFP-KIBRA nicht mehr an die Kinase-defiziente Mutante Flag-PKMζ K98W binden kann. Ergebnisse | 47 4.3 Stabilisierende Wirkung von KIBRA auf PKMζ Bisher wurden in dieser Arbeit die Bindungseigenschaften von KIBRA und PKMζ durch KoImmunpräzipitation verschiedener Mutanten untersucht. Aus Untersuchungen des Instituts für Molekulare Nephrologie ist bekannt, dass KIBRA-defiziente Mäuse im Vergleich zu WildtypMäusen eine geringere Proteinmenge von PKMζ im Gehirnlysat aufweisen (K. Duning, persönliche Mitteilung). Deshalb soll im Rahmen dieser Arbeit die Auswirkung von KIBRA auf PKMζ genauer analysiert werden. In einer Arbeit von Xiao und Kollegen wurde ein stabilisierender Effekt von KIBRA auf die Kinase Lats2 beschrieben (Xiao et al., 2011). Die Autoren zeigten, dass dieser Effekt durch Hemmung des proteasomalen Abbauweges von Lats2 vermittelt wird. Da im Gehirnlysat der KIBRA-defizienten Mäuse niedrigere Mengen PKMζ nachgewiesen wurden, soll im Rahmen dieser Arbeit überprüft werden, ob PKMζ über ähnliche Mechanismen wie Lats2 durch die Anwesenheit des KIBRA Proteins stabilisiert wird. 4.3.1 Auswirkungen der Überexpression von KIBRA auf PKMζ Um den im Mausmodell beobachteten Einfluss von KIBRA auf die Proteinmenge von PKMζ genauer zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit verschiedene Mengen eines Konstruktes zur Expression von V5-markiertem KIBRA und konstante Mengen eines Konstruktes zur Expression von Flag-PKMζ in HeLa-Zellen transfiziert. Zur Durchführung wurden kultivierte HeLa-Zellen in fünf 10cm Schalen ausgesät und mit folgenden Ansätzen transfiziert: 1. nicht transfiziert 2. 4µg pExP-Flag-PKMζ 3. 2µg V5-KIBRA + 4µg pExP-Flag-PKMζ 4. 4µg V5-KIBRA + 4µg pExP-Flag-PKMζ 5. 8µg V5-KIBRA + 4µg pExP-Flag-PKMζ 48 Stunden nach Transfektion wurden die Lysate auf ein SDS-Gel aufgetragen und im Western Blot analysiert. Die Membran mit den immobilisierten Proteinen wurde anhand des gefärbten Molekulargewichtsstandards bei ca. 100 kDa horizontal geschnitten. Anschließend wurde der obere Abschnitt mit einem monoklonalen anti-KIBRA Antikörper, der untere Teil mit einem anti-Flag-M2 Antikörper inkubiert. Um auszuschließen, dass die Ergebnisse durch Ergebnisse | 48 Auftragen verschieden großer Mengen des Lysats entstanden sind, wurde nach Entwickeln des Western Blots der untere Teil der Membran gestripped und über Nacht mit einem βTubulin Antikörper inkubiert. Das β-Tubulin Signal sollte in diesem Versuch als Ladungskontrolle dienen. Die Ergebnisse wurden in einer Grafik zusammengestellt (Abb. 4.11). Abbildung 4.11: Steigende Mengen von V5-markiertem KIBRA führen in trasnfizierten HeLA-Zellen zu erhöhten Mengen an Flag-PKMζ. HeLa-Zellen wurden mit Konstrukten für V5-KIBRA in unterschiedlichen Mengen (0, 2, 4 und 8 µg) und gleichen Mengen Flag-PKMζ ko-transfiziert. Die Lysate aus den Zellen wurden anschließend in einem Western Blot analysiert. Die erste Zeile zeigt die Signale des oberen Teils der Membran, der mit anti-KIBRA Antikörper inkubiert wurde. Die zweite Zeile zeigt die Signale des unteren Teils der Membran nach Inkubation mit anti-Flag Antikörper. Dieser Teil wurde anschließend gestripped und mit einem anti-β-Tubulin Antikörper inkubiert und ist in Zeile drei dargestellt. In den Spuren eins und zwei wurde nur endogenes KIBRA aus HeLa-Zellen nachgewiesen. Die Spuren drei bis fünf zeigen steigende Mengen des V5KIBRA Proteins. Die zweite Zeile zeigt in den Spuren zwei bis fünf das Flag-PKMζ-Signal, das ebenfalls kontinuierlich ansteigt. Die dritte Zeile stellt die β-Tubulin Ladungskontrolle dar, um nachzuweisen, dass in jeder Spur gleiche Mengen des Lysates aufgetragen wurden. Zunächst konnte in diesem Versuch durch Verwendung eines monoklonalen KIBRAAntikörpers die endogene Expression von KIBRA in HeLa-Zellen nachgewiesen werden (Spur 1 und 2, Abb. 4.11). Das Signal für das ubiquitär vorkommende Protein β-Tubulin konnte in allen Spuren mit etwa gleicher Intensität detektiert werden. In den Spuren drei bis fünf konnten steigende Mengen von V5-KIBRA nachgewiesen werden. Korrespondierende Banden von Flag-PKMζ wiesen ebenfalls steigende Proteinmengen auf, obwohl in den Ansätzen wie oben beschrieben jeweils gleiche Mengen von 4 µg PKMζ transfiziert wurden. Aus diesem Ergebnis geht hervor, dass V5-KIBRA möglicherweise einen stabilisierenden Effekt auf Flag-PKMζ hat. Ergebnisse | 49 4.3.2 Einfluss von KIBRA auf die Halbwertszeit von PKMζ Um den Einfluss von KIBRA auf die Stabilität von Flag-PKMζ genauer zu untersuchen, wurde der Translationshemmer Cycloheximid (CHX; Verwendung siehe Xiao et al., 2011) eingesetzt. Durch Applikation dieser Substanz in das Zellkulturmedium wird die Translation neuer Proteine in den kultivierten Zellen unterbunden. Der normalerweise stattfindende turn over eines Proteins, der aus einem Gleichgewicht von Aufbau (Translation) und Abbau besteht, wird durch CHX zugunsten des Abbaus verschoben. Je länger die Substanz die Translation in den Zellen verhindert, desto mehr wird ein jeweiliges Protein abgebaut und ist demzufolge in geringeren Mengen im Western Blot nachweisbar. Xiao und Kollegen zeigten, dass KIBRA die Halbwertszeit von Lats2 verlängert (Xiao et al., 2011). Hier wird der Abbau von Flag-PKMζ in Abhängigkeit von KIBRA unter Verwendung des Translationshemmers Cycloheximid (CHX) untersucht. Für den Versuch wurden HeLaZellen verwendet, da diese eine endogene Expression von KIBRA aufweisen (Kapitel 4.3.1). Für den Versuch wurden folgende Expressionsvektoren Ansätze in HeLa-Zellen transfiziert: 1. 5µg Flag-PKMζ 2. 5µg Flag-PKMζ 3. 5µg Flag-PKMζ 4. 5µg Flag-PKMζ 5. 5µg Flag-PKMζ + 5µg V5-KIBRA 6. 5µg Flag-PKMζ + 5µg V5-KIBRA 7. 5µg Flag-PKMζ + 5µg V5-KIBRA 8. 5µg Flag-PKMζ + 5µg V5-KIBRA 24 Stunden nach Transfektion wurde zunächst ein Zelllysat aus Kulturschale 1 (nur FlagPKMζ) und 5 (Flag-PKMζ + V5-KIBRA) mit 500µl 1x Lämmli-Puffer erzeugt. Zu den restlichen Schalen wurde neues Medium mit 100 µg Cycloheximid / mL Medium gegeben. Ab diesem Zeitpunkt wurden die Zellen aus den restlichen Kulturschalen in einer definierten Zeitreihe nach 5, 15 und 24 Stunden lysiert und jeweils in 500µl 1x Lämmli-Puffer aufgenommen. Die Proben wurden entlang der Zeitachse im SDS-Gel aufgetragen und die Membran mit den immobilisierten Proteinen nach Durchführen eines Western Blots entsprechend mit einem monoklonalen anti-KIBRA und einem anti-Flag Antikörper behandelt. Um sicherzustellen, dass in allen Spuren etwa gleiche Mengen Proteinlysat Ergebnisse | 50 vorhanden waren, wurde der untere Teil der Western Blot-Membran gestripped und mit einem anti-β-Tubulin Antikörper inkubiert. Die Ergebnisse wurden in einer Grafik zusammengefasst (Abb. 4.12A). Abbildung 4.12: Auswirkung von KIBRA auf die Halbwertszeit von PKMζ in transfizierten HeLa-Zellen. A, Zusammengestelltes Ergebnis des Western Blots. Es wurden zwei Ansätze gewählt, die in unterschiedlich langen Zeitenräumen mit dem Translationshemmer Cycloheximid inkubiert wurden. Für den Versuch wurden in den Ansätzen 1-4 HeLa-Zellen mit Flag-PKMζ transfiziert. In den Ansätzen 5-8 wurden die Zellen mit V5KIBRA und Flag-PKMζ ko-transfiziert. Nach der Transfektion wurden Lysate von den Zellen hergestellt. Je 6 µl dieser Lysate wurden auf einem SDS Gel aufgetrennt und mithilfe eines Western Blots auf eine Membran transferiert. Der obere Teil der Membran wurde mit monoklonalem anti-KIBRA Antikörper inkubiert (erste Zeile), der untere Teil zunächst mit anti-Flag Antikörper (zweite Zeile) und nach stripping mit einem anti-βTubulin Antikörper (3. Zeile). Der Abbau von Flag-PKMζ ist bei Anwesenheit von KIBRA verzögert. B, Darstellung des Verhältnisses von Flag-PKMζ Signalstärke zur β-Tubulin Signalstärke der jeweiligen Spur (Signalintensitäten mit ImageJ® gemessen). Rote Kurve = Flag-PKMζ alleine, blaue Kurve = Flag-PKMζ + V5KIBRA. Ergebnisse | 51 Zunächst lässt sich in den Spuren 1 - 4 erkennen, dass sich bei endogenem KIBRA nach 24 Stunden ein deutlich schwächeres Signal nachweisen lässt. Die Überexpression von V5KIBRA in den Spuren 5 - 8 lässt keinen eindeutigen Signalabfall erkennen. Flag-PKMζ weist eine deutlich kürzere Halbwertszeit auf und ist in beiden Zeitreihen nach ca. 24 Stunden fast vollständig abgebaut. Im dargestellten Diagramm (Abb. 4.12B) ist das Verhältnis Flag-PKMζ / β-Tubulin Signal der jeweiligen Spur abgebildet (Messung der Signalintensität mit ImageJ®, Darstellung im Diagramm mit Microsoft Excel 2007®). In Spur 1 und 5 kann ein unterschiedlicher level von Flag-PKMζ ohne Cycloheximid Behandlung erkannt werden. Da die Expression von V5-KIBRA auch ohne CHX Behandlung eine Auswirkung auf die Menge von vorhandenem Flag-PKMζ in der Zelle hat (Kapitel. 4.3.1), wurden die gemessenen Intensitäten von Flag-PKMζ nach 5, 15 und 24 Stunden auf den jeweiligen Intensitätswert von Flag-PKMζ bei Stunde 0 bezogen. Die gemessene Intensität von Flag-PKMζ nach 5 Stunden ohne Überexpression von V5-KIBRA (Spur 2) beträgt noch 19,3% des anfänglichen Wertes (Spur 1). Die Flag-PKMζ Intensität nach 5 Stunden bei Überexpression von V5-KIBRA (Spur 6) beträgt noch 39,1% des anfänglichen Wertes (Spur 5). Nach 15 und 24 Stunden CHX Inkubation sind die Signalintensitäten bereits so niedrig, dass sie sich nicht mehr vergleichen lassen. 4.3.3 Proteasomaler Abbau von PKMζ Für PKCζ wurde bereits eine Degradation durch das Ubiquitin-Proteasom System nachgewiesen (Smith et al., 2000). Die Autoren konnten bei Verwendung des ProteasomHemmstoffs Lactacystin erhöhte Proteinmengen von PKCζ zeigen. Daher soll in dieser Arbeit analysiert werden, ob Flag-PKMζ ebenfalls proteasomal abgebaut wird. Dazu wurde ein FlagPKMζ Konstrukt in HeLa-Zellen transfiziert und in verschiedenen Ansätzen mit DMSO bzw. mit dem Proteasom-Hemmstoff Mg132 behandelt. Folgende Ansätze wurden gewählt: 1. Nicht transfiziert 2. 5µg Flag-PKMζ → DMSO Behandlung 3. 5µg Flag-PKMζ → Mg132 Behandlung DMSO stellt das Lösungsmittel dar, in dem Mg132 gelöst wurde. Die DMSO Behandlung in Ansatz 2 wurde zum Ausschluss unspezifischer Effekte gewählt. Durch Hemmung des Proteasoms nach Zugabe von Mg132 akkumulieren Proteine, die normalerweise durch Ubiquitinierung dem Proteasom zugeführt werden. Nach Inkubation der Zellen im Ergebnisse | 52 Zellkulturmedium mit einer Endkonzentration von 10 mM Mg132 bzw. 10 mM DMSO über Nacht wurden die Zellen in 500µl 1x Lämmli-Puffer aufgenommen und anschließend im Western Blot aufgetragen. Die Membran wurde mit einem anti-Flag Antikörper behandelt und nach Entwickeln gestripped und mit einem β-Tubulin Antikörper erneut für eine Ladungskontrolle inkubiert (Abb. 4.13). Abbildung 4.13: Untersuchung des proteasomalen Abbaus von PKMζ. HeLa-Zellen wurden mit einem Expressionsvektor für Flag-PKMζ transfiziert und nach 24 Stunden entweder mit 10 mM des Lösungsmittels DMSO (Spur 2) oder mit 10 mM des Proteasominhibitors Mg132 (Spur 3) über Nacht behandelt. Anschließend wurden Lysate von den Zellen hergestellt. Je 4 µl dieser Lysate wurden auf einem SDS Gel aufgetrennt und mithilfe eines Western Blots auf eine Membran übertragen. Die Membran wurde zunächst mit einem anti-Flag Antikörper inkubiert (erste Zeile) und nach stripping mit einem anti-β-Tubulin Antikörper. Die erste Spur stellt die Negativkontrolle dar, um eine unspezifische Reaktion des anti-Flag Antikörpers auszuschließen. Das FlagPKMζ Signal ist nach Mg132 Inkubation (dritte Spur) deutlich angereichert im Vergleich zur Inkubation mit dem Lösungsmittel DMSO (zweite Spur). Zunächst kann in allen Spuren eine ähnliche Menge β-Tubulin nachgewiesen werden. Damit kann der Auftrag gleicher Probenmengen in allen drei Spuren sichergestellt werden. Spur 3 zeigt eine deutliche Anreicherung von Flag-PKMζ nach Mg132 Behandlung im Vergleich zu Spur 2 nach Behandlung mit DMSO. Ergebnisse | 53 4.4 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen Im ersten Teil dieser Arbeit wurden das aPKC-Bindungsmotif in KIBRA und die Auswirkungen von KIBRA auf die Proteinstabilität von PKMζ untersucht. Im zweiten Teil wird die Interaktion der beiden Proteine in vivo mit der Technik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC, Kapitel 3.3.4) dargestellt und die Transporteigenschaften von fluoreszenzmarkiertem KIBRA alleine und in Kombination mit fluoreszenzmarkiertem PKMζ in Neuronen mit Live Cell Analysen untersucht. KIBRA ist über die Interaktionen mit den Proteinen DLC1, SNX4 und sec3 an zytoplasmatischen Transportprozessen beteiligt (Rayala et al., 2005; Traer et al., 2006; Rosse et al., 2009). Für genauere Untersuchungen der Transporteigenschaften von KIBRA und PKMζ wurden im Rahmen dieser Arbeit Neurone aus den Hippocampi embryonaler Mäuse isoliert (durchgeführt und bereitgestellt von Frank Erdmann, Institut für Physiologie I, Kapitel 3.3.5) und mit Konstrukten, die für fluoreszierende Fusionsproteine kodieren, transfiziert. 4.4.1 Nachweis der direkten Interaktion von KIBRA mit PKMζ in vivo Yoshihama und Kollegen berichten in ihrer Arbeit von der Ko-Lokalisation von KIBRA und PKMζ in Mausneuronen. Um die direkte Interaktion von KIBRA mit PKMζ in vivo nachzuweisen, wurde im Rahmen dieser Arbeit die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) verwendet. Dabei werden zwei Expressionskonstrukte für Fusionsproteine in Zellen transfiziert, die jeweils für eines der beiden Proteine, deren Interaktion man nachweisen möchte, kodieren. Für die Experimente wurden zunächst HeLa-Zellen kultiviert und einen Tag vor der Transfektion auf Deckgläschen ausgesät, damit eine anschließende Fixierung und Analyse der transfizierten Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop möglich ist. Für die Transfektion wurden die Plasmidkonstrukte pVen1-Flag-KIBRA AS 105-1113, pVen1-Flag Leervektor, pVen2HA-PKMζ verwendet. Die HeLa-Zellen wurden mit folgenden Ansätzen transfiziert: 1. 1µg pVen1-Flag Leervektor, 1µg pVen2-HA-PKMζ 2. 1µg pVen1-Flag-KIBRA AS 105-1113, 1µg pVen2-HA-PKMζ 24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen auf den Deckgläschen mit Formaldehyd fixiert und das F-Aktingerüst mit Alexa594-gekoppelten Phalloidin angefärbt, um die Zellen Ergebnisse | 54 deutlicher darzustellen und die subzelluläre Lokalisation der Fluoreszenzsignale besser darstellen zu können. Anschließend wurden die Deckgläschen unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht (Abb. 4.12A). Abbildung 4.14: Nachweis der direkten Interaktion von KIBRA und PKMζ in HeLa- und CV1-Zellen. A, HeLa-Zellen wurden mit Expressionsvektoren für pVen1-Flag, pVen2-HA-PKMζ und pVen1-Flag-KIBRA AS 105-1113 transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und zur besseren Darstellung des Aktin Zytoskeletts mit Alexa-594-Phalloidin in Rot angefärbt. Die obere Reihe zeigt die Expression des pVen1-Flag-Leervektors, der zusammen mit pVen2-HA-PKMζ zu einem diffusen Fluoreszenzsignal in den Zellen führt. In der unteren Reihe sind die punktförmigen Signale der Aggregate von Ven1-Flag-KIBRA 105-1113 und Ven2-HA-PKMζ dargestellt. B, Zur in vivo Darstellung wurden CV1-Zellen mit den Expressionsvektoren pVen1-KIBRA 105-1113 und pVen2-PKMζ transfiziert und 24 Stunden später im Fluoreszenzmikroskop untersucht. Auch hier konnten punktförmige Signale detektiert werden. Die obere Reihe in Abb. 4.14A zeigt die Expression von Ven1-Flag, das zusammen mit Ven2HA-PKMζ zu einem diffusen Fluoreszenzsignal führt. Dies deutet darauf hin, dass die beiden Fusionsproteine diffus in der Zelle verteilt sind, zu zufälligen Interaktionen der beiden VenusTermini führen und so ein unspezifisches Hintergrundsignal erzeugen. Die zweite Reihe zeigt das Signal nach Expression des Ven1-Flag-KIBRA-Fusionsproteins, das mit dem Aminoterminus von Venus gekoppelt ist, und des Ven2-Ha-PKMζ-Fusionsproteins, das mit dem Carboxyterminus von Venus verbunden ist. Die Fluoreszenzsignale ergaben ein punktförmiges Verteilungsmuster innerhalb des Zytoplasmas. Traer und Kollegen haben nach Transfektion eines EGFP-KIBRA Konstrukts in HeLa-Zellen ein punktförmiges, aggregathaftes Signal beschrieben (Traer et al., 2007). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die detektierten Fluoreszenzsignale durch die Interaktion von KIBRA mit PKMζ ausgelöst, die zur Annäherung der beiden Venus Termini führt. Das punktförmige Auftreten der Signale entsteht möglicherweise durch die von Traer und Kollegen beschriebene Lokalisation des Ergebnisse | 55 KIBRA Proteins in der Zelle, an der auch Interaktionen mit PKMζ stattfinden. Um die Interaktion auch in lebenden Zellen ohne vorherige Fixierung darzustellen, wurden CV1Zellen mit dem oben beschriebenen Ansatz 2 (pVen1-Flag-KIBRA 105-1113, pVen2-HAPKMζ) transfiziert und 24 Stunden später am Fluoreszenzmikroskop untersucht (Abb. 4.14B). Die CV1-Zellen wurden wegen ihrer relativ großen Zelloberflächen gewählt, in dem die Fluoreszenzaggregate noch besser detektierbar sind. Auch hier zeigten sich ähnliche punktförmige, zytoplasmatische Fluoreszenzsignale mit einer Anreicherung um den Zellkern. Somit konnte in dieser Arbeit ein in vivo Nachweis der direkten Interaktion von KIBRA und PKMζ in CV1-Zellen gezeigt werden. 4.4.2 Transporteigenschaften von KIBRA in Neuronen Wie in der Einleitung beschrieben, gibt es verschiedene Hinweise darauf, dass KIBRA an intrazellulären Transportprozessen beteiligt ist (Kapitel 1.3). In einer Arbeit von Rayala und Kollegen wurde gezeigt, dass KIBRA an Dynein light chain 1 bindet (Rayala et al., 2006). Traer und Kollegen zeigten in einer anderen Arbeit, dass KIBRA in einem Komplex mit SNX4 und Dynein den Transport von Transferin-Rezeptoren (TfnR) zum Endocytotic Recycling Compartment (ERC) steuert (Traer et al., 2007). Makuch und Kollegen konnten zeigen, dass KIBRA über die Interaktion mit PICK1 einen Komplex mit AMPA-Rezeptoren bildet und ein knockdown von KIBRA zu erhöhtem Recycling von AMPA-Rezeptoren führt (Makuch et al., 2011). Die intrazelluläre Dynamik von EGFP-markiertem KIBRA wurde in der Arbeitsgruppe Molekulare Nephrologie bislang nur in CV1-Zellen untersucht (K. Duning, persönliche Mitteilung). Um den Transport von KIBRA in Neuronen zu beschreiben, wurden im Rahmen dieser Arbeit kultivierte Primärneurone der Maus mit einem EGFP-KIBRA Fusionsprotein transfiziert und anschließend untersucht (Isolation und Kultivierung der Neurone erfolgten durch Frank Erdmann, Institut für Physiologie I; Kapitel 3.3.5). Für den Versuch wurden die auf Deckgläschen ausgesäten embryonalen (E18) Hippocampusneurone jeweils mit 1,0µg pEGFP-IJ-KIBRA nach fünftägiger in vitro (5 DIV) Kultivierung transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Bei der Beobachtung der transfizierten Neurone fiel zunächst auf, dass EGFP-KIBRA wie von Johannsen und Kollegen beschrieben somatodendritisch lokalisiert ist und eine deutliche perinukleäre Anreicherung aufweist (Johannsen et al., 2008) (Abb. 4.15). Die Autoren hatten Ergebnisse | 56 in ihrer Studie endogenes KIBRA in Neuronen angefärbt. Bei Transfektion von EGFPKIBRA in HeLa-Zellen wurden von ihnen Aggregate beschrieben. Diese EGFP-KIBRAAggregate können in dieser Arbeit auch in den Dendriten sowie im Soma der Neurone beobachtet werden. In den Dendriten fällt auf, dass die EGFP-KIBRA Partikel immer in relativ gleich großen Abständen zueinander homogen verteilt auftreten und sehr oft an den Abgängen von Filopodien oder in Filopodien selbst lokalisiert sind (weiße Pfeile in Abb. 4.15). In den Somata der Neurone sind die EGFP-KIBRA Partikel hingegen oft zu großen, artifiziellen Aggregaten verklumpt. Abbildung 4.15: Verteilung von EGFP-KIBRA in transfizierten Hippocampusneuronen. Für den Versuch wurden Neurone aus den Hippocampi embryonaler Mäuse (E18) mit einem Expressionsvektor für EGFPKIBRA nach fünftägiger in vitro Kultivierung (5 DIV) transfiziert. Nach 24 Stunden erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Analyse. KIBRA tritt in punktförmigen zytoplasmatischen Aggregaten auf, die somatodendritisch lokalisiert sind und sich perinukleär stark anreichern. Zur Verdeutlichung der dendritischen Lokalisation wurde aus dem rechten oberen Bild ein kleiner Ausschnitt vergrößert. Die weißen Pfeile deuten auf die Lokalisation der Partikel an den Abgängen von Filopodia oder in den Filopodia hin. Für die Live Cell Studien zur Untersuchung des Transports von EGFP-KIBRA wurden große Neurone mit langen, dünnen Fortsätzen und möglichst nicht verklumpten Aggregaten Ergebnisse | 57 ausgewählt. Eine jeweilige Zelle wurde über einen Zeitraum von 490 Sekunden beobachtet. Mithilfe der ImageJ® Software wurde anschließend ein Auswahlfeld (Region of interest, ROI) eines horizontal verlaufenden Dendriten ausgewählt, von dem dann mit dem SpotTracker-Plugin (Sage et al., 2003) ein Diagramm mit der Projektion der horizontalen Bewegung der Aggregate (x) auf der Zeitachse (t) erstellt wurde (Kymogramm, Abb. 4.16). Abbildung 4.16: Analyse der Bewegung von EGFP-KIBRA Aggregaten in transfizierten Hippocampusneuronen. Für den Versuch wurden Neurone aus den Hippocampi embryonaler Mäuse (E18) mit einem Expressionsvektor für EGFP-KIBRA nach fünftägiger in vitro Kultivierung (5 DIV) transfiziert. Nach 24 Stunden erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Analyse. Bei der Untersuchung der Dynamik wurde ein Neuron mit möglichst langem Neuriten und kleinen EGFP-Aggregaten ausgewählt (siehe gelber Rahmen). Aus dem gewählten Bereich wurde mithilfe des SpotTracker-Plugins in ImageJ® ein Kymogramm zur Darstellung der Bewegung der Aggregate auf der x-Achse im zeitlichen Verlauf (490s) erstellt. Die beiden gelben Pfeile im Kymogramm zeigen beispielhaft jeweils die Bewegung eines Partikels. In Abb. 4.16 sind zur Demonstration die Bewegungen von zwei Partikeln in einem Kymogramm dargestellt (gelbe Pfeile), die im beobachteten Zeitraum über eine Strecke von ~ 8 µm transportiert werden. Aus der Abbildung wird ersichtlich, dass der Transport sowohl anterograd als auch retrograd (in Richtung des Zellkerns) erfolgt. In einer Untersuchung von n= 354 Partikeln in vier verschiedenen Neuronen wurden die Transporteigenschaften von EGFP-KIBRA analysiert. Es zeigte sich, dass 16,2 % der Aggregate transportiert werden (mobile Fraktion) und die restlichen Aggregate ein stationäres Verhalten aufweisen. Die durchschnittliche Geschwindigkeit der mobilen Fraktion wurde mithilfe des ManualTracker Plugin in ImageJ® ermittelt und beträgt 0,17 µm/s (n = 19), wobei die Schwankungsbreite zwischen der minimal gemessenen Geschwindigkeit (0,04 µm/s) und der maximal gemessenen Geschwindigkeit (0,6 µm/s) sehr groß ist. Mithilfe dieser Ergebnisse | 58 Transportuntersuchungen konnte so gezeigt werden, dass sich die EGFP-KIBRA Partikel überwiegend stationär in den Zellfortsätzen befinden, der Transport einer mobilen Fraktion aber generell sowohl in anterograde, als auch retrograde Richtung möglich ist. Weitere Untersuchungen in transfizierten Neuronen ergaben, dass zwei Transportformen von EGFP-KIBRA beobachtet werden können (Abb. 4.17). Zum einen gab es Aggregate, die über den gesamten Zeitraum von 490 s relativ konstant transportiert werden (Abb. 4.17A, ~ 0,05 µm/s). Andererseits wurden Aggregate beobachtet, die über den größten Zeitraum stationär bleiben und plötzlich mit einer höheren Geschwindigkeit (bis zu 0,6 µm/s) innerhalb von ~ 20 - 30 s transportiert werden (Abb. 4.17B). Die erstgenannte Form des Transports wurde in nur einem von 18 untersuchten Neuron beobachtet, während die letztgenannte Transportform der mobilen Fraktion in allen Neuronen beobachtet werden konnte. Abbildung 4.17: Verschiedene Transportformen von EGFP-KIBRA in transfizierten Hippocampusneuronen. Für den Versuch wurden Neurone aus den Hippocampi embryonaler Mäuse (E18) mit einem Expressionsvektor für EGFP-KIBRA nach fünftägiger in vitro Kultivierung (5 DIV) transfiziert. Nach 24 Stunden erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Analyse mit Live Cell Aufnahmen. Die Darstellung von Transportprozessen erfolgte mithilfe eines Kymogramms. Der Maßstab zeigt jeweils 10 µm. A, konstanter, langsamer Transport. In manchen Zellfortsätzen wird EGFP-KIBRA mit einer konstanten Geschwindigkeit von ~ 0,05 µm/s über den gesamten Beobachtungszeitraum von 490 Sekunden transportiert. B, transienter Transport. Diese Transportform tritt plötzlich aus einer stationären Bewegung auf. Im Kymogramm sind 2 schnelle, retrograde Bewegungen der EGFP-KIBRA Partikel dargestellt (*). Es werden Geschwindigkeiten von bis zu ~ 0,6 µm/s gemessen. Weiterhin konnte beobachtet werden, dass sich kleinere Partikel mit größeren Aggregaten zusammenschließen (Sterne in Abb. 4.18A), aber auch wieder von diesen dissoziieren können (Pfeil in Abb. 4.18A). Außerdem fiel bei manchen EGFP-KIBRA Partikeln eine Assoziation mit kleinen Vakuolen auf (Abb 4.18B). Diese Vakuolen wurden mit den EGFP-KIBRA Ergebnisse | 59 Partikeln ko-transportiert und können von einem Partikel an einen anderen übergeben werden (gelber Pfeil in Abb. 4.18B). Abbildung 4.18: Spezifische Eigenschaften der EGFP-KIBRA Partikel in transfizierten Hippocampusneuronen. Für den Versuch wurden Neurone aus den Hippocampi embryonaler Mäuse (E18) mit einem Expressionsvektor für EGFP-KIBRA nach fünftägiger in vitro Kultivierung (5 DIV) transfiziert. Nach 24 Stunden erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Analyse mit Live Cell Aufnahmen. Die Darstellung von Transportprozessen erfolgte mithilfe eines Kymogramms. A, kleinere KIBRA Partikel können mit größeren Aggregaten fusionieren (Sterne), aber auch von ihnen dissoziieren (Pfeil). Beobachtungszeitraum: 490 Sekunden. Der Maßstab zeigt 10 µm. B, Einzelne EGFP-KIBRA Partikel sind mit Vakuolen assoziiert und werden auch mit diesen ko-transportiert. Hier ist die Übergabe einer Vakuole von einem Partikel an einen anderen dargestellt (Pfeil zeigt den Moment der Übergabe). Beobachtungszeitraum: 490 Sekunden. Der Maßstab zeigt 5 µm. Weiterhin konnte ein Transport von EGFP-KIBRA Partikeln in Filopodien beobachtet werden. In Abb. 4.19 ist der Transport von drei Partikeln (drei Pfeile zu Zeitpunkt 00:00 min in Abb. 4.19) aus einem Filopodium heraus beispielhaft dargestellt. Zum Zeitpunkt 04:54 min sind bereits zwei der Partikel innerhalb des Filopodiums fusioniert. Sieben Sekunden später (05:01 min) tritt eines der Partikel in den Dendriten hervor, nach weiteren 28 Sekunden (05:29 min) fusioniert der bis dahin im Filopodium gelegene Partikel mit dem dendritischen Partikel zu einem größeren Aggregat (05:29 min und 05:36 min). Zusammenfassend konnte beobachtet werden, dass EGFP-KIBRA in kultivierten Neuronen sowohl anterograd als auch retrograd transportiert werden kann (Abb. 4.16), der Transport konstant und transient stattfinden kann (Abb. 4.17) und mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 0,17 µm/s erfolgt, dass die einzelnen Partikel fusionieren und Ergebnisse | 60 voneinander dissoziieren sowie mit Vakuolen assoziiert sein können (Abb. 4.18) und dass ein Transport auch in Filopodien erfolgt (Abb. 4.19). Abbildung 4.19: Transport und Fusion von EGFP-KIBRA Partikeln in den Filopodien kultivierter Hippocampusneurone. Für den Versuch wurden Neurone aus den Hippocampi embryonaler Mäuse (E18) mit einem Expressionsvektor für EGFP-KIBRA nach fünftägiger in vitro Kultivierung (5 DIV) transfiziert. Nach 24 Stunden erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Analyse mit Live Cell Aufnahmen. Die gelben Pfeile zeigen zum Zeitpunkt 00:00 min drei in Filopodien gelegene EGFP-KIBRA Partikel, die sich im Zeitverlauf in den Dendriten bewegen und nacheinander Fusionieren. 4.4.3 Ko-Transport von KIBRA und PKMζ Yoshihama und Kollegen beschreiben die Ko-Lokalisation von endogenem KIBRA und PKMζ in Mausneuronen (Yoshihama et al., 2009). In Kapitel 4.4.2 wurde ein Transport von EGFP-KIBRA in Neuronen beobachtet und analysiert. In dieser Arbeit soll mittels Live Cell Analysen festgestellt werden, ob KIBRA möglicherweise mit PKMζ in kultivierten Neuronen ko-transportiert wird. Um den Transport von KIBRA und PKMζ in Neuronen zu untersuchen, wurden verschiedene Ansätze kultivierter Neuronen mit mCherry-KIBRA und EGFP-PKMζ ko-transfiziert. Vorbereitung und Durchführung der Live Cell Analysen mit den in Ibidi-Schalen gelagerten Deckgläschen wurde wie in Kapitel 4.4.2 beschrieben durchgeführt. Bei der Beobachtung fiel zunächst eine Ko-Lokalisation der beiden Aggregate aus mCherry-KIBRA und EGFP-PKMζ auf (Abb. 4.20). Jedoch sind die Fluoreszenzsignale der beiden Proteine nicht deckungsgleich. Die Partikel treten stattdessen immer in sehr kleinem Abstand zueinander auf. Für eine Transportstudie wurden möglichst kleine Komplexe aus mCherry-KIBRA und EGFP-PKMζ Aggregaten gesucht. Viele der Komplexe befanden sich genau wie EGFPKIBRA alleine in einer stationären Phase ohne nennenswerte Dynamik (Kapitel 4.4.2). In Abb. 4.20 ist der Transport eines mobilen Komplexes für den Zeitraum von 03:30 Minuten Ergebnisse | 61 dargestellt. Der mit dem Pfeil markierte Komplex legt eine Strecke von 1,2 µm im Zeitraum von 03:30 Minuten zurück (0,006 µm/s). Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mCherry-KIBRA und EGFP-PKMζ nicht nur ko-lokalisieren, sondern auch gemeinsam durch die Dendriten von kultivierten Hippocampusneuronen transportiert werden. Abbildung 4.20: Ko-Transport von mCherry-KIBRA und EGFP-PKMζ in kultiverten Hippocampusneuronen. Für den Versuch wurden Neurone aus den Hippocampi embryonaler Mäuse (E18) mit Expressionsvektoren für EGFP-PKMζ und mCherry-KIBRA nach fünftägiger in vitro Kultivierung (5 DIV) transfiziert. Nach 24 Stunden erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Analyse. Es konnte eine gleichmäßige Bewegung eines Komplexes (siehe Pfeil bei 00:00 Minuten und 03:30 Minuten) aus mCherry-KIBRA und EGFP-PKMζ Aggregaten über einen Zeitraum vom 3:30 Minuten detektiert werden. Der Komplex bewegt sich im Bild über eine Strecke von ~ 1,2 µm. Diskussion | 62 5. Diskussion Das zytoplasmatische KIBRA Protein besteht aus mehreren internen Proteinregionen wie den WW-Domänen, der C2-Domäne und der aPKC-Bindungssequenz (Kapitel 1.1: Abb. 1.1; Schneider et al., 2010). Über die aPKC-Bindungssequenz interagiert KIBRA mit PKCζ und mit der neuronenspezifischen und konstitutiv aktiven Isoform PKMζ (Büther et al., 2004; Yoshihama et al., 2009). Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Interaktion von KIBRA mit PKMζ genauer untersucht werden. Diese Kinase ist ein notwendiges Protein für die Induktion der LTP (long term potentiation) und der Gedächtnisbildung (Ling et al., 2002; Pastalkova et al., 2006). In dieser Arbeit wurde zunächst die aPKC-Bindungssequenz in KIBRA genauer charakterisiert und der Einfluss von KIBRA auf die Stabilität von PKMζ untersucht (Kapitel 4.1, 4.2, 4.3). In mikroskopischen Analysen wurde die Interaktion von KIBRA und PKMζ in vivo dargestellt und der Transport von KIBRA alleine und im Komplex mit PKMζ in kultivierten Neuronen untersucht (Kapitel 4.4.1, 4.4.2, 4.4.3). 5.1 Charakterisierung der aPKC-Bindungssequenz Büther und Kollegen beschrieben 2004 erstmals eine aPKC-Bindungssequenz innerhalb des KIBRA Proteins und zeigten, dass KIBRA von aPKC an den Serinen S975 und S978 phosphoryliert wird (Büther et al., 2004). Mit der Hefe-2-Hybrid-Methode konnten die Autoren die Bindung eines KIBRA Fragments mit den AS 953-996 an aPKC nachweisen und somit die Bindungsdomäne auf diese 44 Aminosäuren eingrenzen. Außerdem zeigten sie, dass die Kinasedomäne von PKCζ für die Bindung an KIBRA ausreichte. Durch Immunpräzipitation eines carboxyterminalen KIBRA Fragments mit den AS 661-1113 wurde im Gehirnlysat einer Ratte neben der PKCζ die 55 kDA große Isoform PKMζ ko-präzipitiert. Später wiesen Yoshihama und Kollegen in ihren Untersuchungen eine in vitro Inhibition von PKCζ durch KIBRA nach (Yoshihama et al., 2011). Als Negativkontrolle wurde von ihnen eine Deletionsmutante von KIBRA verwendet, der die Aminosäuren 919-978 fehlen. Zur Feinkartierung der aPKC Bindungssequenz wurden drei verschiedene KIBRA-Mutanten mit partiellen Deletionen (EGFP-KIBRA Δ953-997, EGFP-KIBRA Δ953-974, EGFP-KIBRA Δ986-997) zusammen mit Flag-PKMζ in HEK293T-Zellen exprimiert und mittels Immunpräzipitation auf ihre Bindungsfähigkeit überprüft (Kapitel 4.1.2). Die Immunpräzipitation ist ein häufig verwendetes Verfahren um Protein-Protein Interaktionen zu studieren, wobei hiermit auch indirekte Bindungen über Linker-Proteine detektiert werden (Masters, 2004). In dieser Arbeit wurden die Lysate der Zellen für die Immunpräzipitation mit Diskussion | 63 Anti-Flag beads inkubiert. Als Positivkontrolle diente in diesen Untersuchen ein EGFPmarkiertes komplettes KIBRA Protein. (Kapitel 4.1.2: Abb. 4.4). In den Experimenten stellte sich heraus, dass ein EGFP-KIBRA Fusionsprotein mit einer Deletion der AS 953-974 nicht mehr in der Lage war, an Flag-PKMζ zu binden. Zur Bestätigung dieses Resultats wurde eine Immunpräzipitation auch mit anti-EGFP beads durchgeführt (Kapitel 4.1.2: Abb. 4.5). Die Ergebnisse zeigen, dass ein Bindungsmotif mit den Aminosäuren 953-974 von KIBRA essentiell für die Bindung an PKMζ ist. Das Protein PKMζ ist homolog zur Kinasedomäne von PKCζ und entsteht durch Ablesen einer alternativen Promotorregion innerhalb des PRKCZ Genes, welches für PKCζ kodiert (Hernandez et al., 2003). Da Büther und Kollegen bereits gezeigt haben, dass die katalytische Domäne von PKCζ für die Bindung an die aPKCBindungssequenz des KIBRA Proteins ausreicht, kann darauf geschlossen werden, dass die Experimente zur Interaktion von KIBRA und PKMζ auch zur Beschreibung der aPKCBindungssequenz dienen (Büther et al., 2004). Das Resultat für die neu bestimmte aPKCBindungsregion in dieser Arbeit (AS 953-974) ist ebenfalls vereinbar mit den Ergebnissen aus dem Hefe-2-Hybrid-System mit PKCζ von Büther und Kollegen (AS 953-996) sowie den in vitro Tests von Yoshihama und Kollegen (AS 919-978) (Büther et al., 2004; Yoshihama et al, 2011). Die neu bestimmte Bindungssequenz (AS 953-974) grenzt das bereits vorher grob bestimmte Bindungsmotif weiter ein. Yoshihama und Kollegen beobachteten in ihrer Arbeit eine inhibierende Wirkung von KIBRA auf die Kinaseaktivität von PKCζ und begründen diese Wirkung mit der Homologie der Aminosäuren 962-976 in KIBRA mit der Pseudosubstratsequenz in PKCζ (Yoshihama et al., 2011). Neuere Ergebnisse dieser Arbeitsgruppe deuten ebenfalls auf eine hemmende Wirkung von KIBRA auf PKMζ hin (Yoshihama et al., 2012). In dieser Arbeit wurde die Bindungsfähigkeit des Fusionsproteins EGFP-KIBRA 962-974 mit Flag-PKMζ in einer Ko-Immunpräzipitation überprüft (Kapitel 4.1.2). Allerdings konnte eine Interaktion dieses KIBRA Fragments mit Flag-PKMζ nicht nachgewiesen werden (Kapitel 4.1.2: Abb. 4.7). Möglicherweise stellt das fusionierte, ca. 26 kDa große EGFP Protein ein sterisches Hindernis für die Interaktion des 13 Aminosäuren umfassenden Peptidfragments mit PKMζ dar. Es ist aber auch möglich, dass die AS 953-962 für die PKMζ Bindung essentiell sind. Aufgrund der Sequenzhomologie des neu bestimmten aPKC-Bindungsmotifs KIBRA 953974 mit der PS-Sequenz von PKCζ besteht auch eine Homologie mit dem in der Einleitung beschriebenen ZIP Peptid (Kapitel 1.4). Es wurde bereits von Ling und Kollegen gezeigt, dass die Kinaseaktivität von PKMζ durch eine Applikation von ZIP gehemmt wird (Ling et al., Diskussion | 64 2002). Zudem wird bei LTP-Messungen an Hippocampus-Schnitten durch die Zugabe von ZIP nach der Tetanisierung ein Abfall der LTP-Signale beobachtet. Bei einer stereotaktischen Injektion in die Hippocampi von Ratten führt ZIP zum Vergessen vorher konditionierter Gedächtnisinhalte (Ling et al., 2002; Serrano et al., 2005; Pastalkova et al., 2006; Shema et al., 2009). Aus den Ergebnissen dieser Arbeiten wurde auf die zentrale Rolle von PKMζ bei der Aufrechterhaltung von Langzeitgedächtnisinhalten geschlossen. In neueren Arbeiten wird diese zentrale Rolle jedoch aufgrund des normalen Lernverhaltens von PKCζ/PKMζdefizienten Mäusen angezweifelt, wobei die Injektion des ZIP Peptids bei diesen Mäusen ebenso zum Vergessen vorher erlernter Gedächtnisinhalte führte (Volk et al., 2013; Lee et al., 2013). Möglicherweise wird bei den defizienten Mäusen eine andere atypische Isoform der PKCs, PKCλ, hochreguliert (Glanzmann, 2013). Ren und Kollegen haben gezeigt, dass ZIP in niedriger Dosierung (0.5 µM) PKMζ und in höherer Konzentration (2.0 µM) ebenfalls PKCλ hemmt, was aus einer fast identischen PS-Sequenz von PKCλ und PKCζ resultieren könnte (Ren et al., 2013). Da die PS-Sequenz von PKCζ und PKCλ zu 95 % homolog sind, kann die Hypothese aufgestellt werden, dass sowohl ZIP als auch KIBRA 953-974 nicht nur eine inhibitorische Wirkung auf PKMζ, sondern auch auf PKCλ sowie bislang nicht identifizierte Kinasen haben könnte. In einer Arbeit von Orr und Newton wurde die Bedeutung basischer Arginine in der Pseudosubstratregion von PKCβII für die Bindung sauerer Aminosäuren in der Kinasedomäne beschrieben (Orr und Newton, 1994a). In der Peptidsequenz der Pseudosubstratregion von PKCζ (AS 113-125) kommen fünf Arginine vor (R116, R117, R120, R121 und R123). In dem neu eingegrenzten aPKC-Bindungsmotif von KIBRA kommen die die Arginine R965, R966, R969 und R972 im gleichen Abstand zueinander vor wie entsprechende Arginine der Pseudosubstratregion von PKCζ (Kapitel 4.1.3: Abb. 4.8). Außerdem sind diese Argininreste in den KIBRA Orthologen der Spezies Bos taurus, Gallus gallus, Macaca mulatta, Mus musculus, Rattus norvegicus und Xenopus tropicalis konserviert (Abb. 4.8). Abb. 5.1 zeigt zusammenfassend die Sequenzhomologie des neu bestimmten aPKC-Bindungsmotifs in den Orthologen sowie den anderen Mitgliedern der WWC Familie, WWC2 und WWC3. In einer durchgeführten Datenbankrecherche konnte ein humaner SNP (Referenznummer rs139606423 [C/T]) ermittelt werden, der eine physiologische KIBRA Variante mit einem Austausch der basischen Aminosäure Arginin R969 zu der unpolaren Aminosäure Tryptophan W969 zur Folge hat. Da bereits eine Genvariante von KIBRA mit unterschiedlicher Gedächtnisleistung assoziiert wurde und PKMζ für molekulare Gedächtnisprozesse essentiell ist (Milnik et al., Diskussion | 65 2012; Sacktor, 2011), wurde im Rahmen dieser Arbeit die Bindungsfähigkeit der EGFPKIBRA R969W Mutante an Flag-PKMζ im Vergleich zum KIBRA Wildtyp Protein überprüft (Kapitel 4.1.3). Es konnte gezeigt werden, dass die KIBRA Mutante R969W noch an FlagPKMζ binden kann (Kapitel 4.1.3: Abb. 4.9). Ob diese Mutante eventuell eine schwächere Bindung als das KIBRA Wildtyp Protein aufweist, wurde in dieser Arbeit nicht genauer charakterisiert und kann daher nicht beurteilt werden. Abbildung 5.1: Sequenzhomolgie des aPKC-Bindungsmotifs in den Orthologen und Paralogen von KIBRA. Sequenzvergleich der Aminosäuren 953-974 in KIBRA mit den Paralogen WWC2 und WWC3 sowie den Orthologen der Spezies Bos taurus (Bt), Gallus gallus (Gg), Macaca mulatta (Mam), Mus musculus (Mum), Rattus norvegicus (Rn) und Xenopus tropicalis (Xt). Homologe Aminosäuren wurden rot markiert und die Sterne weisen auf die hochkonservierten Arginine hin. In einem weiteren Versuch wurde geprüft, ob eine Kinase-defiziente Mutante von PKMζ an KIBRA binden kann (Kapitel 4.2). In der ATP-Bindungsregion von PKCζ ist das Lysin K281 für die Kinasefunktion essentiell, da ein Austausch dieses Lysins mit einer anderen Aminosäure zu einer Kinase-defizienten Mutante von PKCζ führt (Hirai und Chida, 2003). Xin und Kollegen untersuchten in ihrer Arbeit die Interaktion der dominant-negativen Mutante PKCζ K281W mit dem Bax Protein (Xin et al., 2007). Dabei konnten sie in einer Immunpräzipitation zeigen, dass PKCζ Wildtyp mit Bax ko-präzipitiert wird, PKCζ K281W jedoch nicht mehr an Bax bindet. Die Autoren schlussfolgern daraus, dass PKCζ aktiv sein muss, um an Bax zu binden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nun gezeigt, dass die entsprechende Kinase-defiziente Form von Flag-PKMζ mit einer Mutation in der ATPBindungsregion (K98W) nicht mehr mit EGFP-KIBRA interagiert (Kapitel 4.2: Abb. 4.10). Aus den Ergebnissen dieser Arbeit kann geschlossen werden, dass PKMζ in aktiver Form vorliegen muss, um an KIBRA zu binden. Diskussion | 66 5.2 Auswirkungen von KIBRA auf die Stabilität von PKMζ Aus Untersuchungen des Instituts für Molekulare Nephrologie ist bekannt, dass KIBRAdefiziente Mäuse im Vergleich zu Kontrolltieren einen geringeren Level an PKMζ Proteinen in Lysaten aus dem Hippocampus aufweisen (K. Duning, persönliche Mitteilung). Deshalb sollten im Rahmen dieser Arbeit eine mögliche Auswirkung von KIBRA auf die Proteinstabilität von PKMζ analysiert werden. In Untersuchungen von Xiao und Kollegen wurde bereits ein stabilisierender Effekt von KIBRA auf die Kinase Lats2 beschrieben (Xiao et al., 2011). Die Autoren zeigten zunächst, dass durch Transfektion steigender Mengen KIBRA in HEK293T-Zellen höhere Mengen des Lats2 Proteins nachweisbar waren. Weiterhin konnte durch Verwendung eines Translationshemmers (Cycloheximid) die Verlängerung der Halbwertszeit von Lats2 durch KIBRA gezeigt werden. Außerdem wurde durch Einsatz des Proteasom-Inhibitors Mg132 nachgewiesen, dass Lats2 nach einer Ubiquitinierung proteasomal abgebaut wird. Eine Überexpression von KIBRA führte in ihren Untersuchungen schließlich zu weniger Ubiquitinierung und nachfolgend zu einem verringerten Abbau von Lats2. Daher kommen die Autoren zu dem Schluss, dass der stabilisierende Effekt von KIBRA auf Lats2 durch eine Hemmung des proteasomalen Abbauweges von Lats2 vermittelt wird. Ob auch PKMζ durch einen ähnlichen, KIBRA vermittelten Mechanismus stabilisiert wird, wurde in dieser Arbeit analysiert. Dazu wurde zunächst untersucht, ob steigende Proteinmengen von V5-KIBRA in HeLa-Zellen zu erhöhten Mengen an Flag-PKMζ führen (Kapitel 4.3.1). Für den Versuch wurden in verschiedenen Ansätzen 0, 2, 4 und 8 µg V5-KIBRA und jeweils 4 µg Flag-PKMζ transfiziert (Kapitel 4.3.1: Abb. 4.11). Dabei fällt auf, dass bei einer verstärkten V5-KIBRA Expression höhere Mengen an Flag-PKMζ nachweisbar sind und eine zweite, im SDS-Gel langsamer laufende FlagPKMζ Bande auftritt (Abb. 4.11). Diese beiden PKMζ Formen können mit den bereits für PKCζ beschrieben Molekülformen verglichen werden, bei denen die größere PKCζ Form den phosphorylierten und somit aktiven Zustand darstellt (Gould et al., 2011). Bei den kleineren Proteinen handelt es sich demnach um die nicht-phosphorylierten Proteine. In einem weiteren Experiment wurde durch Zugabe des Translationshemmers Cycloheximid (CHX) untersucht, obV5-KIBRA die Halbwertszeit von Flag-PKMζ in HeLa-Zellen möglicherweise verlängert (Kapitel 4.3.2). Es zeigte sich zunächst, dass fast die gesamte Menge an exogenem Flag-PKMζ nach 24 Stunden abgebaut war, wohingegen V5-KIBRA 24 Stunden nach CHX Zugabe zwar etwas schwächer, aber trotzdem noch deutlich nachweisbar war. Außerdem konnte bereits ohne CHX Inkubation mehr Flag-PKMζ bei einer parallen V5KIBRA-Überexpression als bei endogenen KIBRA-Mengen gemessen werden, was das Diskussion | 67 Ergebnis des Versuches aus Kapitel 4.3.1 bestätigt (Abb. 4.12). Bei Überexpression von V5KIBRA wird Flag-PKMζ zwar auch nach 24 Stunden fast vollständig abgebaut, jedoch konnte hier bei fünf-stündiger CHX Inkubation eine deutlich höhere Proteinmenge als bei endogener KIBRA Expression nachgewiesen werden. Die Ergebnisse des Versuchs geben einen Hinweis darauf, dass V5-KIBRA stabilisierend auf Flag-PKMζ wirkt, indem es die Proteinhalbwertszeit von Flag-PKMζ erhöht. Ein möglicher Grund hierfür könnte die Hemmung des Proteinabbaus von PKMζ durch KIBRA sein. Da für die verwandte PKCζ bereits ein Abbau über das Ubiquitin-Proteasom System nachgewiesen wurde (Smith et al., 2000), sollte im Rahmen dieser Arbeit geprüft werden, ob auch PKMζ proteasomal abgebaut wird (Kapitel 4.3.3). Durch Zugabe des Proteasominhibitors Mg132 zu transfizierten HeLa-Zellen wurde in Anwesenheit von V5-KIBRA eine deutliche Anreicherung von Flag-PKMζ im Western Blot beobachtet (Kapitel 4.3.3: Abb. 4.13). Diese Ergebnisse zeigen, dass KIBRA einen stabilisierenden Effekt auf PKMζ hat und dass PKMζ proteasomal abgebaut wird. Wie bereits oben genannt, beschrieben Yoshihama und Kollegen eine kompetitive Inhibition von KIBRA auf die Kinaseaktivität von PKCζ und PKMζ sowie eine Homologie der aPKCBindungsregion zur Pseudosubstratregion von PKCζ (Yoshihama et al., 2011; Yoshihama et al., 2012). Im Kontext mit den Ergebnissen der KIBRA-vermittelten Stabilisierung von PKMζ erscheint es zunächst paradox, dass KIBRA zwar die Kinaseaktivität von PKMζ inhibiert, gleichzeitig aber stabilisierend auf die Kinase wirkt. Wie bereits in der Einleitung (Kapitel 1.3) beschrieben, wird PKCζ im Rahmen der Aktivierung in den Regionen des turn motif und des activation loop phosphoryliert (Hirai und Chida, 2003) und auch PKMζ wird bei Aktivierung am activation loop phosphoryliert (Kapitel 1.3; Kelly et al., 2007). Andere Isoformen der PKC werden ebenfalls an entsprechenden Stellen phosphoryliert und es wird angenommen, dass diese Phosphorylierungen neben der Aktivierung der Kinaseaktivität auch vor der Degradation der Enzyme schützen (Gao et al., 2008; Newton, 2010; Gould et al., 2011). In diesem Zusammenhang wurde in einer Arbeit von Gould und Kollegen gezeigt, dass kompetitive Inhibitoren des aktiven Zentrums von PKCβII zu einer konformellen Änderung des Enzyms führen, die vor Dephosphorylierung und damit auch vor der Degradation schützen (Gould et al., 2011). Zusammen mit der Beobachtung der Arbeitsgruppe Molekulare Nephrologie, dass die KIBRA-defizienten Mäuse geringere Mengen am PKMζ im Hippocampus aufweisen, sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit dafür, dass die KIBRA-PKMζ Interaktion zur Stabilisierung von PKMζ durch Blockierung der Dephosphorylierung und anschließender Hemmung des proteasomalen Abbaus führt. Diskussion | 68 In Neuronen wird die PKMζ-mRNA nach der Synthese zu den Dendriten und den sog. dendritic spines transportiert und steht dort zunächst unter einem Translationsblock durch PIN1 (Protein interacting with NIM1) (Muslimov et al., 2004; Westmark et al., 2010). Dendritic spines sind kleinen Ausstülpungen der Dendriten (siehe Abb. 5.2), an denen exzitatorische Synapsen ausgebildet werden (Bosch und Hayashi, 2012). Bei der Induktion von long term potentiation wird PIN1 durch Bindung von Glutamat an postsynaptische NMDA(N-methyl-D-aspartic acid)-Rezeptoren gehemmt, sodass eine lokale Translation von PKMζ in den Dendriten erfolgen kann (Westmark et al., 2010). Nach Translation erfolgt eine Aktivierung durch Phosphorylierung am activtion loop von PKMζ durch PDK1 (Sacktor, 2011). Aktivierte PKMζ Moleküle inhibieren PIN1 durch Phosphorylierung und halten damit die Translation der PKMζ-mRNA im Sinne einer positiven Rückkopplungsschleife aufrecht (Kelly et al., 2007; Sacktor, 2010). Unter den ausgebildeten Synapsen an den dendritic spines befindet sich die sog. postsynaptic density (PSD; postsynaptische Dichte), einer elektronendichten Struktur, die u. A. aus Neurotransmitter-Rezeptoren, Gerüstproteinen und Signaltransduktionsmolekülen sowie zytoskelettalen Komponenten besteht (Bosch und Hayashi, 2012). Johannsen und Kollegen zeigten, dass KIBRA in einer PSD-Präparation stark angereichert ist (Johannsen et al., 2008). Hara und Kollegen konnten nachweisen, dass vor allem phosphorylierte PKMζ ebenfalls in der postsynaptischen Dichte von Affenneuronen angereichert ist (Hara et al., 2012). Dem ständigen turn over von Proteinen, also der Balance von Synthese und Degradation, wird eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung von LTP zugeschrieben (Mabb und Ehlers, 2010). Deswegen wird hier postuliert, dass KIBRA als Gerüstprotein in der postsynaptischen Dichte eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung von LTP besitzt, da KIBRA kontinuierlich eine bestimmte Menge von PKMζ-Molekülen in den dendritic spines bindet und so vor der Degradation schützt. Ein Schema für die KIBRA-vermittelte Stabilisierung von PKMζ in Neuronen ist in Abb. 5.2 dargestellt. Diskussion | 69 Abbildung 5.2: Schema für die Stabilisierung von PKMζ. Zunächst wird die PKMζ-mRNA zu den Dendriten transportiert. Dort wird die Proteinsynthese von PIN1 gehemmt. LTP-Signale lösen die Hemmung durch PIN1 und führen zur lokalen Translation von PKMζ. Die Aktivierung der Kinase erfolgt mittels Phosphorylierung am activation loop durch PDK1. PIN1 wird daraufhin von aktiven PKMζ Molekülen durch Phosphorylierung inaktiviert. Durch die KIBRA-PKMζ Interaktion wird PKMζ im phosphorylierten Zustand gebunden, vor der proteasomalen Degradation geschützt und somit stabilisiert. 5.3 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen Die Interaktion von KIBRA mit PKMζ wurde in dieser Arbeit mit Ko-Immunpräzipitationen und Western Blot Analysen untersucht (Kapitel 5.1, 5.2). Yoshihama und Kollegen beschrieben bereits eine Ko-Lokalisation der beiden Proteine in Mausneuronen, wobei eine direkte Interaktion durch in vivo Untersuchungen nicht gezeigt wurde (Yoshihama et al., 2009). Um die direkte KIBRA-PKMζ Interaktion auch in vivo darzustellen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) in CV1-Zellen durchgeführt (Kerpolla, 2008; Kapitel 4.4.1). Bei der Untersuchung konnten die für EGFPKIBRA in HeLa-Zellen charakteristischen Partikel-artigen, zytoplasmatischen Fluoreszenzsignale detektiert werden, die in diesem Falle jedoch durch eine direkte Interaktion von KIBRA mit PKMζ und einer daraus resultierenden Komplementation der beiden Venus Fragmente entstehen (Kapitel 4.4.1: Abb. 4.14; Traer et al., 2007). Zunächst wurde das Verfahren mithilfe von fixierten HeLa-Zellen (Abb. 4.14A) getestet und dann in lebenden CV1-Zellen (Abb. 4.14B) angewandt, da diese eine größere Zelloberfläche besitzen und sich somit besser für fluoreszenzmikroskopische Auswertung eignen. So konnte zusätzlich zu der von Yoshihama und Kollegen beschrieben Ko-Lokalisation ein Nachweis für die direkte Bindung der beiden Proteine in vivo erbracht werden. Diskussion | 70 Wie bereits beschrieben, ist KIBRA an zellulären Transportprozessen beteiligt (Kapitel 1.2). KIBRA interagiert u.A. mit Dynein light chain 1, einem Bestandteil des DyneinMotorkomplexes, und reguliert zusammen mit SNX4 das Recycling von Transferrin Rezeptoren (Rayala et al., 2006; Traer et al., 2007). Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Transport von KIBRA alleine und in Komplex mit PKMζ in kultivierten Neuronen aus den Hippocampi embryonaler Mäuse (E18) untersucht werden (Kapitel 4.4.2, 4.4.2). Da die Transfektion und Expression exogener Konstrukte in ausdifferenzierten, postmitotischen Neuronen eine sehr niedrige Effizienz zeigt, werden üblicherweise embryonale Neurone verwendet (Karra und Dahm, 2010). Für die Untersuchung der Beweglichkeit von KIBRA wurde ein EGFP-KIBRA Konstrukt nach fünftägiger in vitro Kultivierung in die kultivierten Neurone transfiziert. Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen fanden 24 Stunden später statt, sodass die Neurone 6 Tage in vitro (6DIV= days in vitro) kultiviert wurden (Kapitel 4.4.2). Bei den Analysen konnten zunächst die von Traer und Kollegen beschriebenen punktförmigen EGFP-KIBRA Partikel und eine von Johannsen und Kollegen beschrieben somatodendritische Lokalisation mit Anreicherung um den Zellkern beobachtet werden (Abb. 4.15; Traer et al., 2007; Johannsen et al., 2008). Diese Partikel sind in den Neuriten der Neurone relativ homogen verteilt und auffallend häufig an den Abgängen kleiner Fortsätze, sog. Filopodien, oder in den Filopodien selbst lokalisiert (siehe weiße Pfeile in Abb. 4.15). Die punktförmigen Partikel könnten möglicherweise durch die von Johannsen und Kollegen beschriebene Homodimerisierung von antiparallelen KIBRA-Molekülen an bestimmten, bislang nicht identifizierten Verankerungsstellen in den Dendriten entstehen (Johannsen et al., 2008). Bei den Live Cell Analysen wurden einzelne Neurone für einen Zeitraum von 490 Sekunden beobachtet. Dabei fiel auf, dass die überwiegende Anzahl der EGFP-KIBRA Partikel im gesamten Zeitraum stationär bleibt bzw. in einem kleinen Radius von < 2 µm oszilliert, einige Partikel jedoch sowohl anterograd als auch retrograd transportiert werden (Pfeile in Abb. 4.16). Wie beschrieben, bindet KIBRA an DLC1 (Rayala et al., 2006). DLC Proteine wurden erstmals als Teil des Dynein Motorkomplexes beschrieben, der den retrograden Transport über lange Strecken in Richtung der Minusenden der Mikrotubuli vermittelt (King et al., 1996). Durch diese Interaktion könnte eine Assoziation von KIBRA mit dem Dynein Motorkomplex und somit der retrograde Transport der EGFP-KIBRA Partikel stattfinden. Außerdem können DLC Proteine direkt an GKAP (guanylate kinase domain-associated Diskussion | 71 protein) und in einem Komplex mit PSD-95 und MyosinVa im Gehirnlysat von Ratten kopräzipitiert werden (Naisbitt et al., 2000). Myosin Va dient dem dendritischen Transport über kurze Strecken und kann durch eine Assoziation mit dem Motorprotein Kinesin 5 (KIF5) möglicherweise den anterograden Transport über lange Strecken in Richtung der Plusenden von Mikrotubuli vermitteln (Hirokawa et al., 2010). Der anterograde Transport von EGFPKIBRA könnte aber auch durch eine direkte Interaktion mit Kinesin-assoziierten Proteinen stattfinden, die einen Mikrotubuli abhängigen Transport in Richtung der Plusenden vermitteln (Hirokawa et al., 2010). Letztendlich kann aufgrund der vorliegenden Daten nur spekuliert werden, dass der retrograde Transport von KIBRA über DLC1 vermittelt wird. Durch eine Interaktion mit bisher nicht bekannten Bindungspartnern könnte KIBRA auch unabhängig von DLC1 transportiert werden. Die mobilen EGFP-KIBRA Partikel bewegten sich üblicherweise in einem Zeitfenster von 20-30 s über kurze Strecken (Sterne in Abb. 4.17B), selten aber auch in einer konstanten Bewegungsform über mehrere Minuten (Pfeile in Abb. 4.17A). Bei einer quantitativen Analyse der beweglichen KIBRA Partikel konnte ermittelt werden, dass sich eine mobile Fraktion von ~ 16,2 % aller Partikel transportiert wird (Kapitel 4.4.2). Washbourne und Kollegen haben die mobile Fraktion der AMPA-Rezeptor Untereinheit GluR1 mit 17 % in 3 – 4 DIV Rattenneuronen ähnlich hoch ermittelt, allerdings wurden diese mit durchschnittlich 0,03 µm/s langsamer als die EGFP-KIBRA Partikel transportiert (Washbourne et al., 2002). Die Geschwindigkeit der EGFP-KIBRA Partikel beträgt durchschnittlich 0,17 µm/s, wobei eine große Streubreite zwischen den niedrigsten Werten (min. 0,04 µm/s) und den höchsten Werten (max. 0,6 µm/s) vorliegt (Kapitel 4.4.2). Der durchschnittliche Wert lässt sich annähernd dem Mikrotubuli assoziierten Transport von 0,2 – 1,5 µm/s zuordnen (Hirokawa und Takemura, 2005). Weitere Analysen der mobile Fraktion ergaben, dass die KIBRA Partikel sowohl zu größeren Aggregaten fusionieren (Sterne in Abb. 4.18A und Abb. 4.19), als auch von größeren Aggregaten wieder dissoziieren können (Pfeil in Abb. 4.18A). Ähnliche Prozesse wurden von Maas und Kollegen für das ebenfalls an Dynein light chain 1 bindende Gerüstprotein Gephyrin beschrieben (Maas et al., 2006). Die stationären EGFP-KIBRA Partikel könnten durch eine Verankerung mit der Zellmembran oder Zellmembran-assoziierter Proteine festgehalten werden. Johannsen und Kollegen beschreiben in ihrer Arbeit, dass KIBRA im Gehirnlysat von Ratten besonders stark in der PSD- und der membranösen P2-Präparation nachweisbar ist (Johannsen et al., 2008). Somit Diskussion | 72 kann postuliert werden, dass die immobile KIBRA-Fraktion einen membrangebundenen Anteil der KIBRA Moleküle repräsentiert. Ähnliche wurde auch für das postsynaptische Gerüstprotein Gephyrin beschrieben, dass die immobile Fraktion von Gephyrin die postsynaptischen Glycin-Rezeptoren in inhibitorischen Synapsen bindet und an deren stabiler Verankerung in der Membran beteiligt ist (Maas et al., 2006). Makuch und Kollegen haben in ihrer Arbeit den GluR1-Rezeptor in einem Ko-Präzipitat von KIBRA in der membranösen P2Fraktion eines Gehirnlysats von Mäusen nachgewiesen und stellten außerdem einen Effekt von KIBRA auf das Recycling von AMPA Rezeptoren fest (Makuch et al., 2011). Dies könnte darauf hindeuten, dass die immobile Fraktion von KIBRA die in der postsynaptischen Membran eingebauten GluR1 Untereinheiten der AMPA Rezeptoren stabilisiert. Da KIBRA über seine WW-Domänen an die Aktin-bindenden und dendritisch lokalisierten Proteine Dendrin und Synaptopodin bindet (Kremerskothen et al., 2003; Duning et al., 2008), könnte eine Verankerung in den Dendriten alternativ auch über das Zytoskelett erfolgen. Weitere Analysen zeigten, dass die EGFP-KIBRA Partikel auch in und aus den Filopodien heraus transportiert werden können (Abb. 4.19). Filopodien sind kleine Ausstülpungen an der Zelloberfläche, aus denen nach der frühen postnatalen Periode dendritische Dornfortsätze (Dendritic spines) entstehen (Hotulainen und Hoogenraad, 2010). Das Zytoskelett von Filopodien besteht fast ausschließlich aus Aktin, was auf einen Myosin vermittelten Transport in Filopodien hindeutet (Hotulainen und Hoogenraad, 2010). Für den intrafilopodialen Transport wurde das Motorprotein Myosin-X beschrieben (Berg und Cheney, 2002). Allerdings ist eine Assoziation von KIBRA an Myosin-X bisher nicht bekannt. Aufgrund der Live Cell Ergebnisse dieser Arbeit kann letztendlich nur vermutet werden, dass KIBRA aufgrund der Motilität in Filopodien mit dem Myosin Motorsystem assoziiert ist. Neben den Untersuchungen zum dendritischen Transport von EGFP-KIBRA sollte in der Arbeit auch überprüft werden, ob ein Ko-Transport von KIBRA und PKMζ in Neuronen erfolgt. Dafür wurden Expressionsvektoren für mCherry-KIBRA und EGFP-PKMζ in kultivierte Neurone aus den Hippocampi von Mäusen ko-transfiziert (Kapitel 4.4.3). In den anschließeneden Fluoreszensanalysen fiel zunächst die Ko-Lokalisation der beiden Proteine in den Dendriten der transfizierten Neuronen auf (Abb. 4.20). Yoshihama und Kollegen wiesen in ihrer Arbeit bereits eine partielle Ko-Lokalisation von KIBRA und PKCζ in Mausneuronen nach (Yoshihama et al., 2011). Im Rahmen dieser Arbeit wurden duale Fluoreszenzaufnahmen für die beiden Fusionsproteine angefertigt um die Dynamik beider Diskussion | 73 Proteine darstellen zu können. Es wurde ein Ko-Transport von mCherry-KIBRA und eines angelagerten EGFP-PKMζ Partikels über eine Strecke von 1,2 µm im Zeitraum von 210 Sekunden ermittelt (Kapitel 4.4.3: Abb. 4.20). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass KIBRA möglicherweise die intrazelluläre Lokalisation von PKMζ moduliert oder aber dass KIBRA und PKMζ über den gleichen Mechanismus transportiert werden. Zusammenfassung | 74 6. Zusammenfassung In dieser Arbeit wurde die aPKC-Bindungssequenz des KIBRA Proteins und die Interaktion mit der Proteinkinase M ζ (PKMζ) analysiert. Die aPKC-Bindungssequenz in KIBRA wurde auf die Aminosäuren 953-974 eingegrenzt (Kapitel 4.1.2). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass PKMζ für die Interaktion mit KIBRA in der Kinase-aktiven Form vorliegen muss (Kapitel 4.2) und dass KIBRA den proteasomalen Abbau von PKMζ verzögert (Kapitel 4.3). Mittels fluoreszenzmikroskopischer Analysen wurden die Ko-Lokalisation und die direkte Interaktion von KIBRA mit PKMζ nachgewiesen (Kapitel 4.4.1 und 4.4.3). In Live Cell Analysen wurden der antero- und retrograde Transport von KIBRA sowie der Ko-Transport von KIBRA und PKMζ in kultivierten Neuronen dargestellt (Kapitel 4.4.2 und 4.4.3). Der neuronenspezifischen und konstitutiv aktiven PKMζ wird eine zentrale Rolle bei molekularen Mechanismen für das Langzeitgedächtnis zugschrieben (Sacktor, 2011). Die Besonderheit des Enzyms besteht in einer sich selbst aufrechterhaltenden Translation nach initialer Aktivierung bei LTP Induktion. Durch die anhaltende Phsophorylierung von Rezeptoren für Neurotransmitter wird eine LTP-Aufrechterhaltung vermittelt (Sacktor, 2011). Neben der Aufrechterhaltung einer langfristigen Synthese sind dabei auch Mechanismen, die die Halbwertszeit der Kinase modifizieren von entscheidender Bedeutung. Die stabilisierende Wirkung von KIBRA auf PKMζ und der Ko-Transport der beiden Proteine in Neuronen deuten darauf hin, dass das KIBRA Protein und der KIBRA-PKMζ Komplex eine wichtige Rolle bei physiologischen Prozessen in Neuronen spielen und insbesondere bei der Aufrechterhaltung von LTP beteiligt sein könnten. In nicht-neuronalen Zellen ist PKCζ im Komplex mit PAR3 und PAR6 an tight junctions assoziiert und spielt eine Rolle bei der Zellpolarität epithelialer Zellen, da sowohl die Inhibition als auch die Überaktivierung von PKCζ zu Störungen der Zellpolarität führt (Yoshihama et al., 2011). Da KIBRA über die aPKC-Bindungssequenz auch mit PKCζ interagiert und dessen Kinaseaktivität hemmt, hat der KIBRA-PKCζ Komplex in epithelialen Zellen eine wichtige Funktion. Es kann spekuliert werden, dass die stabilisierende Wirkung von KIBRA auf PKMζ auch auf die KIBRA-PKCζ Interaktion in nicht-neuronalen Zellen übertragbar ist und einen weiteren Mechanismus bei der Aufrechterhaltung von Zellpolarität darstellt. Ausblick | 75 7. Ausblick Das neu bestimmte aPKC-Bindungsmotif des KIBRA Proteins stellt eine Grundlage für weitere Untersuchungen dar. Durch den Austausch einzelner Aminosäuren, insbesondere der hoch konservierten Arginine (Kapitel 5.1), können die biochemischen Eigenschaften der KIBRA-PKCζ/PKMζ Interaktion noch genauer bestimmt werden. Sowohl bei den LTPUntersuchungen zur Funktion von PKMζ in Hirnschnitten als auch bei Gedächtnistests in Ratten wurde das myristoylierte, und damit Zellmembran-gängige, ZIP Peptid verwendet, dass die Pseudosubstratregion von PKCζ darstellt und somit PKMζ in vitro und in vivo hemmt (Sacktor, 2011). Wegen der Ähnlichkeit der aPKC-Bindungssequenz von KIBRA mit der Pseudosubstratregion von PKCζ wären analoge Experimente mit einem ebenfalls myristoylierten Peptid, das aus den AS 953-974 des KIBRA Proteins besteht, von großem Interesse. Die Ergebnisse könnten mit denen des ZIP Peptids verglichen werden und zeigen, ob KIBRA zu einer in vivo Hemmung von PKMζ führt und ob diese Hemmung bei Ratten den Verlust vorher erlernter Gedächtnisinhalte zur Konsequenz hat. Untersuchungen mit diesem Peptid könnten auch die Auswirkungen der in vivo Hemmung von PKCζ auf die Zellpolarität analysieren. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen mit dem Translationshemmer Cycloheximid geben erste Hinweise auf eine Halbwertszeit-verlängernde Wirkung von KIBRA auf PKMζ. Da die Halbwertszeit von PKMζ relativ klein ist, sollte dieser Versuch mit enger gestaffelten Inkubationszeiten wiederholt werden. Wie in Kapitel 5.1 dargestellt, besteht eine Homologie der aPKC-Bindungssequenz von KIBRA mit entsprechenden Sequenzen der Paraloge WWC2 und WWC3. KoImmunpräzipitationen dieser Paraloge mit PKMζ könnten zunächst den Nachweis einer möglichen Bindung liefern. Im Anschluss könnten Experimente mit korrespondierenden Deletionsmutanten folgen, die das Bindungsmotif eingrenzen sowie Untersuchungen zu den Auswirkungen auf die PKMζ Proteinmenge bei Überexpression von WWC2 und WWC3. Ebenso wären Auswirkungen bei Einsatz von Cycloheximid interessant um eine mögliche Stabilisierung auf Proteinebene weiter zu charakterisieren. Die Ergebnisse könnten letztendlich mit denen von KIBRA verglichen werden um mögliche Unterschiede im Ausmaß der Stabilisierung zu bestimmen. Die vorgeschlagenen zumeist biochemischen Untersuchungen könnten Hinweise darauf liefern, wie KIBRA in die PKMζ-vermittelte Langzeitpotenzierung und den Gedächtnisaufbau im Hippocampus eingebunden ist. Durch genauere Kenntnisse dieses Mechanismus wäre eine mögliche therapeutische Einflussnahme der KIBRA-PKMζ Interaktion für neurodegenerative Erkrankungen zukünftig denkbar. Literaturverzeichnis | 76 8. Literaturverzeichnis Almeida, O. P., Schwab, S. G., Lautenschlager, N. T., Morar, B., Greenop, K. R., Flicker, L., & Wildenauer, D. (2008). KIBRA genetic polymorphism influences episodic memory in later life, but does not increase the risk of mild cognitive impairment. Journal of cellular and molecular medicine, 12(5A), 1672–6. doi:10.1111/j.1582-4934.2008.00229.x Assmann, E. M., Alborghetti, M. R., Camargo, M. E. R., & Kobarg, J. (2006). FEZ1 dimerization and interaction with transcription regulatory proteins involves its coiled-coil region. The Journal of biological chemistry, 281(15), 9869–81. doi:10.1074/jbc.M513280200 Bandyopadhyay, G., Standaert, M. L., Zhao, L., Yu, B., Avignon, A., Galloway, L., Karnam, P., et al. (1997). 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The Hippo pathway in organ size control, tissue regeneration and stem cell self-renewal. Nature cell biology, 13(8), 877–83. doi:10.1038/ncb2303 Abbildungsverzeichnis | 84 9. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1.1: Darstellung der Domänen des KIBRA Proteins. ............................................................ 2 Abbildung 1.2: Darstellung der Bindungspartner des KIBRA Proteins. ................................................. 3 Abbildung 1.3: Struktur und Domänen der Proteinkinase C ζ. ............................................................... 6 Abbildung 1.4: Vereinfachte Darstellung der Aktivierung von PKMζ. .................................................. 8 Abbildung 1.5: Schematischer Aufbau von PKCζ und PKMζ. ............................................................... 8 Abbildung 2.1: Verwendete Größenstandards. ..................................................................................... 17 Abbildung 3.1: Schema zur Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen mit bimolekularer Fluoreszenzkomplementation. ............................................................................................................... 31 Abbildung 4.1: Datenbankanalyse der aPKC Bindungsregion in den humanen WWC Proteinen........ 34 Abbildung 4.2: Schematische Darstellung der drei eingesetzten Deletionsmutanten von KIBRA. ...... 35 Abbildung 4.3: Restriktionsverdau der Konstrukte pEGFP-IJ-KIBRAΔ(953-974) und pEGFP-IJKIBRAΔ(986-997). ............................................................................................................................... 36 Abbildung 4.4: Bestimmung der aPKC-Bindungssequenz von KIBRA durch Ko-Immunpräzipitation mit Flag-Antikörper beads. ................................................................................................................... 38 Abbildung 4.5: Bestimmung der aPKC-Bindungssequenz durch Ko-Immunpräzipitation mit antiEGFP-Antikörper beschichteten beads. ................................................................................................ 39 Abbildung 4.6: Restriktionsanalyse des Konstrukts pEGFP-C1-KIBRA 962-974. .............................. 40 Abbildung 4.7: Überprüfung der Bindungsfähigkeit des KIBRA Fragments AS 962 - 974 an FlagPKMζ…………………………………………………………………………………………………..41 Abbildung 4.8: Lokales Alignment der Aminosäuresequenzen 953 – 974 in KIBRA verschiedener Spezies und der Pseudosubstratregion von PKCζ. ................................................................................ 42 Abbildung 4.9: Überprüfung der Bindungsfähigkeit der KIBRA R969W Mutante an PKMζ. ............ 44 Abbildung 4.10: Überprüfung der Bindungsfähigkeit der Kinase-defizienten Mutante PKMζ K98W an KIBRA. ................................................................................................................................................. 46 Abbildung 4.11: Steigende Mengen von V5-markiertem KIBRA führen in trasnfizierten HeLA-Zellen zu erhöhten Mengen an Flag-PKMζ. ..................................................................................................... 48 Abbildung 4.12: Auswirkung von KIBRA auf die Halbwertszeit von PKMζ in transfizierten HeLaZellen. .................................................................................................................................................. 50 Abbildung 4.13: Untersuchung des proteasomalen Abbaus von PKMζ. .............................................. 52 Abbildung 4.14: Nachweis der direkten Interaktion von KIBRA und PKMζ in HeLa- und CV1-Zellen. ............................................................................................................................................................... 54 Abbildung 4.15: Verteilung von EGFP-KIBRA in transfizierten Hippocampusneuronen. .................. 56 Abbildung 4.16: Analyse der Bewegung von EGFP-KIBRA Aggregaten in transfizierten Hippocampusneuronen. ......................................................................................................................... 57 Abbildung 4.17: Verschiedene Transportformen von EGFP-KIBRA in transfizierten Hippocampusneuronen. ......................................................................................................................... 58 Abbildungsverzeichnis | 85 Abbildung 4.18: Spezifische Eigenschaften der EGFP-KIBRA Partikel in transfizierten Hippocampusneuronen. ......................................................................................................................... 59 Abbildung 4.19: Transport und Fusion von EGFP-KIBRA Partikeln in den Filopodien kultivierter Hippocampusneurone. ........................................................................................................................... 60 Abbildung 4.20: Ko-Transport von mCherry-KIBRA und EGFP-PKMζ in kultiverten Hippocampusneuronen. ......................................................................................................................... 61 Abbildung 5.1: Sequenzhomolgie des aPKC-Bindungsmotifs in den Orthologen und Paralogen von KIBRA.. ................................................................................................................................................ 65 Abbildung 5.2: Schema für die Stabilisierung von PKMζ. ................................................................... 69 Lebenslauf | 86 10. Lebenslauf Danksagung | 87 11. Danksagung Ganz herzlich möchte ich mich bei Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Pavenstädt für die Überlassung des Themas und die Unterstützung bei der Durchführung der Dissertation bedanken. Ein ganz besonderer Dank geht an Frau Dr. rer. nat. Kerstin Duning und Herrn Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Joachim Kremerskothen für die kontinuierliche Betreuung und Anleitung bei labortechnischen Arbeiten sowie für die Hilfe bei der Erstellung der Dissertation. Herrn Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Thomas Weide und dem gesamten Team der AG Molekulare Nephrologie danke ich für die Anregungen und Tipps bei der Durchführung der labortechnischen Arbeiten. Ebenfalls einen besonderen Dank richte ich an Frau Nina Meyer für die vielen praktischen Anleitungen, Hinweise und Tipps zu den labortechnischen Arbeiten. Für die Präparation und Kultivierung der Mausneurone möchte ich mich ganz herzlich bei Herrn Dr. rer. nat. Frank Erdmann (Institut für Physiologie I, Münster) bedanken. Frau Anke Michel danke ich sehr herzlich für die aufmerksame Korrektur in Rechtschreibung und Grammatik. Für die Unterstützung während meines Studiums danke ich meiner Frau Claudia Thomas, meinen Eltern Herwig und Hannelore Thomas, meiner Schwester Eva Thomas und meinen Großeltern.
