Von Chorismat abgeleitete funktionalisierte Cyclohexadien-trans

Von Chorismat abgeleitete funktionalisierte
Cyclohexadien-trans-diole:
Optimierung der mikrobiellen Produktion,
Untersuchungen zur Reaktivität und
Synthese beider Enantiomere des Naturstoffs Valienon
Inaugural - Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
vorgelegt von
Simon Eßer
aus Wevelinghoven
Freiburg im Breisgau 2006
Angefertigt mit Genehmigung der
Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
der Albert-Ludwigs-Universität zu Freiburg.
Dekan:
Vorsitzender des Promotionsausschusses:
Referent:
Korreferent:
Dritter Prüfer:
Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses:
Prof. Dr. A. Bechthold
Prof. Dr. G. E. Schulz
Prof. Dr. M. Müller
Prof. Dr. R. Brückner
Prof. Dr. G. Fuchs
14. Dezember 2006
Meinen Eltern
"Das Unverständlichste am Universum ist im Grunde,
dass wir es verstehen."
Albert Einstein
Die vorliegende Arbeit wurden am Lehrstuhl für Biotechnologie der Universität Bonn unter
der Leitung von Prof. Dr. M. Müller und Prof. Dr. C. Wandrey und am Lehrstuhl für Pharmazeutische und Medizinische Chemie der Universität Freiburg unter der Leitung von Prof. Dr.
M. Müller angefertigt. Die praktischen Arbeiten wurden am Institut für Biotechnologie II der
Forschungszentrum Jülich GmbH in der Zeit von Januar 2002 bis November 2004 und am
Institut für Pharmazeutische Wissenschaften der Universität Freiburg in der Zeit von November 2004 bis September 2005 durchgeführt.
Mein Dank gilt:
Herrn Prof. Dr. MICHAEL MÜLLER für die interessante Themenstellung, eine ausgezeichnete
fachliche Betreuung, die stetige Bereitschaft zu Diskussionen und die nicht nur in fachlicher
Hinsicht gewährte Rückendeckung.
Herrn Prof. Dr. CHRISTIAN WANDREY für die Möglichkeit, einen großen Teil der praktischen
Arbeiten am Institut für Biotechnologie II des Forschungszentrums Jülich mit all seinen
technischen Möglichkeiten und Voraussetzungen für interdisziplinäre Kooperationen anzufertigen. Weiterhin danke ich für die Unterstützung zur Finanzierung meines Auslandsforschungsaufenthaltes.
Herrn Prof. Dr. REINHARD BRÜCKNER für die freundliche Übernahme des Korreferats.
Herrn Dr. VOLKER LORBACH und Herrn CHRISTOPH GRONDAL, die auf verwandten Gebieten
forschten, für die sehr gute Zusammenarbeit. Herrn Dr. Lorbach danke ich darüber hinaus für
die schnelle Durchsicht und seine konstruktiven Hinweise während des Verfassens dieser
Schrift.
Frau PETRA GEILENKIRCHEN, Frau LONI KRAUS, Frau SIMONE OLEF und Herrn MARC
REIMANN für die engagierte Hilfe im Labor.
Herrn Prof. Dr. GEORG SPRENGER und Frau ULRIKE DEGNER für die theoretische und
praktische Unterstützung im Erlernen und Durchführen der mikrobiologischen Arbeiten.
Herrn VOLKER BRECHT am Institut für Pharmazeutische Wissenschaften der Universität Freiburg und Frau Dr. SABINE WILLBOLD von der Zentralabteilung für Chemische Analysen des
Forschungszentrums Jülich für die zügige und kompetente Durchführung von NMR-Experimenten zur Strukturaufklärung.
Herrn Dr. MARTIN NIEGER vom Institut für Anorganische Chemie der Universität Bonn wie
auch Frau Prof. Dr. CAROLINE RÖHR vom Institut für Anorganische Chemie der Universität
Freiburg für die hilfreiche Anfertigung von Kristallstrukturuntersuchungen und Unterstützung
in der Interpretation der Daten.
Herrn Dr. ROBERT BUJNICKI und Frau SUSANNE KRÄMER wie auch allen Mitarbeitern der
DSM-Biotech GmbH und Mitarbeitern des CHORUS-Projektes für die gute, vertrauensvolle
und erfolgreiche Zusammenarbeit.
Den Mitarbeitern der Analytischen Laboratorien der Universitäten Bonn und Freiburg für die
zuverlässigen massenspektroskopischen Untersuchungen und Elementaranalysen.
Prof. Dr. MARTIN BANWELL und seinen Mitarbeitern für die freundliche Aufnahme,
persönliche Betreuung und Unterstützung während meines Forschungsaufenthaltes an der
Australian National University, Canberra, und die Möglichkeit, meine organisch-synthetischen Fertigkeiten zu vertiefen.
Allen aktuellen und ehemaligen Kollegen in Freiburg und in Jülich für die hervorragende
Arbeitsatmosphäre und die große Hilfsbereitschaft in fachlichen, logistischen wie auch
persönlichen Fragen.
Meiner Familie für die große persönliche Unterstützung und Rückendeckung.
Von Chorismat abgeleitete funktionalisierte Cyclohexadien-trans-diole:
Optimierung der mikrobiellen Produktion durch Techniken des metabolic engineering,
Untersuchungen zur Reaktivität und Synthese beider Enantiomere des Naturstoffs
Valienon
Chorismat dient in der Natur im Shikimatbiosyntheseweg als zentraler Verzweigungs- und
Ausgangspunkt für die Biosynthese wichtiger aromatischer Metabolite wie etwa der
aromatischen Aminosäuren. Die ersten Folgemetabolite von Chorismat stellen als chirale
Verbindungen wertvolle Bausteine für die chemische Synthese dar. Durch die Kombination
von Genen, deren Expression die Biosynthese von Chorismat verstärkt, mit Genen, welche für
die Umsetzung von Chorismat zu funktionalisierten Cyclohexadien-trans-diolen (trans-CHD)
codieren, auf Plasmiden wurde die Voraussetzung für eine optimierte Bioproduktion zweier
trans-CHD
{(3R,4R)-3,4-Dihydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäure
[3,4-trans-CHD];
(5S,6S)-5,6-Dihydroxycyclohexa-1,3-diencarbonsäure, [2,3-trans-CHD]} geschaffen. Beide
Verbindungen ließen sich durch Ionenaustauschchromatographie aus Fermentationsüberständen aufreinigen. Ein qualitativer Vergleich von Derivaten beider trans-CHD in Reaktionen mit Osmium(VIII)oxid, meta-Chlorperbenzoesäure und N-Bromacetamid weist 3,4trans-CHD als reaktivere und 2,3-trans-CHD als die mit höherer Stereo- und Regioselektivität umsetzbare Verbindung aus. Aufbauend auf diesen Ergebnissen konnte mit der
gezielten Darstellung beider Enantiomere des Naturstoffs Valienon die Eignung und Komplementarität beider trans-CHD als Ausgangsverbindungen für organische Synthesen exemplarisch gezeigt werden.
Aufreinigung der trans-CHD durch
Ionenaustauschchromatographie
CO2H
OH
CO2H
CO2H
OH
Chorismat
OH
OH
3,4-trans-CHD
Biosynthese mit rekombinanten E. coli und
Exkretion der trans-CHD ins Fermentationsmedium
OH
OH
2,3-trans-CHD
Glucose
O
O
OH
CO2H
CH2OH
OH
7 Stufen
36 %
ent-Valienon
11 Stufen
1.4 %
CH2OH
HO
HO
O
OH
Valienon
Untersuchungen zu chemischem Verhalten und
Einsatz in der organischen Naturstoffsynthese
Inhaltsverzeichnis
I
Einleitung ........................................................................................................................... 1
1
Entwicklungen in der Wirkstoffsuche....................................................................... 1
Das Chorus-Projekt ....................................................................................................... 5
1.1
1.2
2
Aufgabenstellung ........................................................................................................... 7
3
Allgemeiner Teil ............................................................................................................. 9
Shikimat-Biosyntheseweg ............................................................................................. 9
Varianten des Shikimat-Biosyntheseweges ............................................................ 13
Einsatz des Shikimat-Biosyntheseweges zur Produktion von
Sekundärmetaboliten .................................................................................................. 17
Cyclitole und Carbazucker ........................................................................................ 18
Naturstoffe mit Cyclohexengrundstruktur ............................................................ 20
Gabosine ......................................................................................................................... 21
Beispiele für mit Chorismat strukturell eng verwandte Verbindungen ......... 22
Kommerziell relevante Aminocarbazucker ........................................................... 23
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.8.1
3.8.2
Validamycin A und Acarbose ................................................................................... 23
Oseltamivir................................................................................................................ 25
Chemische Synthese von Carbazuckern und Cyclitolen .................................... 28
Cyclohexadiendiole (CHD) ........................................................................................ 31
3.9
3.10
3.10.1
3.10.2
3.10.3
3.10.4
Biokatalytischer Zugang zu funktionalisierten cis-CHD .......................................... 33
Biologischer Zugang zu funktionalisierten trans-CHD ............................................ 35
Mikrobielle Produktion von trans-CHD ................................................................... 39
Chemische Synthese von trans-CHD........................................................................ 41
Spezieller Teil................................................................................................................. 50
4
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.1.5
4.1.6
4.2
4.3
4.4
4.4.1
4.4.2
4.4.3
4.4.4
4.4.5
4.5
Mikrobiologische Arbeiten ........................................................................................ 50
Strategie .................................................................................................................... 50
Plasmidkonstruktion.................................................................................................. 53
Sequenzierung des zwischenklonierten PCR-Produktes........................................... 58
Untersuchungen zur Enzymexpression ..................................................................... 59
Untersuchung der Enzymfunktion der Enzyme AroB und AroL.............................. 60
Untersuchung zur Expression und Aktivität der Enzyme EntC und EntB................ 61
Isolierung von trans-CHD aus Fermentationsüberstand .................................... 63
Synthese von racemischen 3,4-trans-CHD ............................................................. 65
Untersuchungen zur Folgechemie von 2,3-trans-CHD und 3,4-trans-CHD ... 68
Schutzgruppenchemie ............................................................................................... 69
Vergleich verschiedener Derivate des 3,4-trans-CHD ............................................. 74
Epoxidierung............................................................................................................. 81
cis-Dihydroxylierung ................................................................................................ 88
Synthese von Bomhydrinen und Derivaten............................................................... 95
Qualitativer Vergleich der Reaktivitäten von Derivaten des 2,3-transCHD und 3,4-trans-CHD .......................................................................................... 105
II
Inhaltsverzeichnis
Synthese von Streptol und Gabosin I / Valienon ................................................ 108
4.6
4.6.1
4.6.2
4.6.3
Synthese von ent-Streptol ....................................................................................... 108
Synthese von ent-Valienon / ent-Gabosin I ............................................................ 109
Synthese von Gabosin I / Valienon ......................................................................... 112
Studien zur Synthese von ent-Valienamin............................................................ 119
Zusammenfassung ..................................................................................................... 126
Ausblick ........................................................................................................................ 127
4.7
4.8
4.9
4.9.1
4.9.2
4.9.3
Optimierung der Metabolit-Produktion................................................................... 127
Erweiterung des biologisch zugänglichen Metabolit-Spektrums............................ 127
Chemie der trans-CHD ........................................................................................... 130
Experimenteller Teil ................................................................................................ 139
5
Biologische Arbeiten .................................................................................................. 139
5.1
5.1.1
5.1.2
5.1.3
5.1.4
5.1.5
Materialien und Methoden ...................................................................................... 139
Klonierungsarbeiten ................................................................................................ 142
Allgemeine mikrobiologische Arbeitstechniken..................................................... 143
Untersuchungen zur Proteinexpression................................................................... 148
Untersuchung zur Metabolitproduktion im Schüttelkolben .................................... 149
Chemische Arbeiten .................................................................................................. 150
5.2
5.2.1
5.2.2
5.2.3
5.2.4
5.2.5
5.2.6
5.2.7
5.2.8
Verwendete Geräte und Chemikalien ..................................................................... 150
Synthese von racemischen 3,4-trans-CHD-Methylester......................................... 154
Mikrobiell produziertes 2,3-trans-CHD, 3,4-trans-CHD und Derivate dieser
Verbindungen.......................................................................................................... 158
Synthese von Valienon............................................................................................ 166
Einzelreaktionen ausgehend von 3,4-trans-CHD.................................................... 179
Synthese von ent-Streptol, ent-Valienon und Studien zur Synthese von entValienamin .............................................................................................................. 188
Tabellarische Auflistung der Reaktionsbedingungen nicht erfolgreich
verlaufener Experimente ......................................................................................... 204
Darstellung von Reagenzien ................................................................................... 207
Anhang ............................................................................................................................ 208
6
Röntgenstrukturuntersuchungen ........................................................................... 208
6.1
6.1.1
6.1.2
(3S,4S,5R,6S)-3-Acetoxy-4-brom-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester...................................................................................................... 208
(5aS,6R,7S,9aR)-6-Brom-5a,6,7,9a-tetrahydro-8-(hydroxymethyl)benzo[f][1,3,5]trioxepin-7-ol................................................................................... 211
NMR-Spektren............................................................................................................ 217
6.2
6.2.1
6.2.2
(3R,4R,5R,6S)-4-Acetoxy-3-azid-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester...................................................................................................... 217
ent-Valienamin-Pentaacetat .................................................................................... 219
7
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis............................................................. 221
8
Literaturverzeichnis ................................................................................................. 232
Abkürzungen, Größen und Maßeinheiten
Verwendete Abkürzungen:
1,4,5-IP3
2,3-trans-CHA
2,3-trans-CHD
3,4-trans-CHA
3,4-trans-CHD
A. mediterranei
Abb.
Ac
Ac2O
AcOH
AcOTf
ADC
ADIC
AHBA
AIBN
Ala
AminoDAHP
AminoDHQ
AminoDHS
AminoF6P
BMBF
Bn
tBu
tBuLi
tBuOH
Bz
bzw.
CD
CHA
CHD
CMe2(OMe)2
CoA
CSA
CsOAc
DAH
DAHP
DBU
DC
DDQ
de
DHQ
DHS
D-myo-Inositol-1,4,5-triphosphat
(5S,6S)-6-Amino-5-hydroxycyclohexa-1,3-diencarbonsäure
(5S,6S)-5,6-Dihydroxycyclohexa-1,3-diencarbonsäure
(3R,4R)-4-Amino-3-hydroxy-1,5-cyclohexadiencarbonsäure
(3R,4R)-3,4-Dihydroxy-1,5-cyclohexadiencarbonsäure
Amycolatopsis mediterranei
Abbildung
Acetyl
Essigsäureanhydrid
Essigsäure
Acetyltrifluormethansulfonat
4-Amino-4-deoxychorismat
2-Amino-2-deoxyisochorismat
3-Amino-5-hydroxybenzoesäure
α,α´-Azobisisobutyronitril
Alanin
4-Amino-3,4-dideoxy-D-arabinoheptulosesäure-7-phosphat
5-Amino-5-deoxy-3-dehydro-chinasäure
5-Amino-5-deoxy-3-dehydro-shikimat
3-Amino-3-deoxy-D-fructose-6-phosphat
Bundesministerium für Bildung und Forschung
Benzyl
tertiär-Butyl
tertiär-Butyllithium
tertiär-Butanol
Benzoyl
beziehungsweise
Circulardichroismus
Cyclohexadienaminoalkohol
Cyclohexadiendiol
2,2-Dimethoxypropan
Coenzym A
Camphersulfonsäure
Cäsiumacetat
3-Deoxy-D-arabino-heptulosesäure
3-Deoxy-D-arabino-heptulosesäure-7-phosphat
1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en
Dünnschichtchromatographie
2,3-Dichloro-5,6-dicyano-p-benzochinon
Diastereomerenüberschuss
Dehydrochinasäure
Dehydroshikimat
III
IV
DIBAL-H
DMAP
DME
DMF
DNA
E. coli
E4P
EDTA
ee
EI
ent
EPSP
eq.
et al.
Et2O
EtOAc
EtOH
Fa.
GCMS
H,H-COSY
HMPT
HMQC
HPLC
HRMS
IminoE4P
IPTG
IR
IUPAC
K6P
Km
LAH
LB
mCPBA
Me
Me2CO
MeCN
MeLi
MeOH
MeI
MOM
MOMCl
MOPS
Ms
Abkürzungen, Größen und Maßeinheiten
Di-iso-butylaluminiumhydrid
4-(Dimethylamino)-pyridin
Dimethoxyethan
N,N-Dimethylformamid
Desoxyribonukleinsäure
Escherichia coli
D-Erythrose-4-phosphat
Ethylendiamintetraessigsäure
Enantiomerenüberschuss
Elektronenstoß-Ionisation (electron impact)
Enantiomer
5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat
Äquivalente
Abkürzung für "et alteri" (lat. "und weitere")
Diethylether
Essigsäureethylester
Ethanol
Firma
Gaschromatographie-Massenspektroskopie
H, H – Korrelationsspektroskopie (H, H – correlation spectroscopy)
Hexamethyl-phosphorsäuretriamid
direkte H, C – Korrelationsspektroskopie (heteronuclear multiple
quantum coherence)
high performance liquid chromatography
high resolution mass spectroscopy
Iminoerythrose-4-phosphat
Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid
Infrarot
International Union of Pure and Applied Chemistry
Kanosamin-6-phosphat
Michaelis-Konstante
Lithiumaluminiumhydrid
Luria-Bertani
meta-Chlorperbenzoesäure (meta-chloroperbenzoic acid)
Methyl
Aceton
Acetonitril
Methyllithium
Methanol
Iodmethan
Methoxymethyl
Chlormethyl-methyl-ether
2-Morpholinoethansulfonsäure
Mesityl
Abkürzungen, Größen und Maßeinheiten
MsOH
MS 4 Å
NaOAc
NBS
NBu4I
NEt3
NMM
NMO
NMR
NOE
NOESY
OD
PAD
PAGE
PCC
PCR
Pd(OAc)2
PEP
PG
Ph
Ph3P
PhMe
QA
quant.
rac
RT
S. collinus
S3P
SA
SAP
Sc(OTf)3
SHCHC
SDS
SN
TBAF
TBDPS
TBME
TBS
TBSCl
TBSOTf
tertTf2O
TfOH
THF
Methansulfonsäure
Molsieb 4 Å
Natriumacetat
N-Bromsuccinimid
Tetrabutylammoniumiodid
Triethylamin
4-Methylmorpholin
4-Methylmorpholin-4-oxid
magnetische Kernresonanz (nuclear magnetic resonance)
Kern-Overhauser-Effekt (nuclear Overhauser effect)
nuclear Overhauser and exchange spectroscopy
Optische Dichte
Kaliumazodicarboxylat
Polyacrylamidgelelektrophorese
Pyridiniumchlorchromat
Polymerasekettenreaktion
Palladium(II)acetat
Phosphoenolpyruvat
Schutzgruppe (protecting group)
Phenyl
Triphenylphosphin
Toluen
Chinasäure
quantitativ
racemisch
Raumtemperatur
Streptomyces collinus
3-Phosphoshikimat
Shikimat
Alkalische Shrimps Phosphatase
Scandium(III)trifluormethansulfonat
(1R,2R)-2-Succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadien-1-carboxylat
Natriumdodecylsulfat
nucleophile Substitutionsreaktion
Tetrabutylammoniumfluorid
tertiär-Butyldiphenylsilanyltertiär-Butylmethylether
tertiär-Butyldimethylsilanyltertiär-Butylchlordimethylsilan
(tertiär-Butyldimethylsilyl)-trifluormethansulfonsäureester
tertiärTrifluormethansulfonsäureanhydrid
Trifluormethansulfonsäure
Tetrahydrofuran
V
VI
Abkürzungen, Größen und Maßeinheiten
TMNO
Thr
Triflat
Tris
TsNCO
TsOH
TSP
WHO
X-Gal
Trimethylamin-N-oxid
Threonin
(Trifluormethan)-sulfonat
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
para-Toluensulfonylisocyanat
para-Toluensulfonsäure
3-(Trimethylsilyl)-propansäure-2,2,3,3-d4 Natriumsalz
World Health Organisation
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid
Basen der Desoxyribonukleinsäure:
A
G
Adenin
Guanin
C
T
Cytosin
Thymin
I
K
L
M
N
P
Q
Isoleucin
Lysin
Leucin
Methionin
Asparagin
Prolin
Glutamin
Aminosäuren:
A
C
D
E
F
G
H
Alanin
Cystein
Asparaginsäure
Glutaminsäure
Phenylalanin
Glycin
Histidin
R
S
T
V
W
Y
Argenin
Serin
Threonin
Valin
Tryptophan
Tyrosin
Symbole für verwendete Einheiten:
Å
bp
cm
d
Da
g
G
h
Hz
kbp
kDa
L
Ångström
Basenpaare
Centimeter
Tage
Dalton
Gramm
Erdbeschleunigung (9.81 m × sec-2)
Stunden
Hertz
1000 Basenpaare
Kilo-Dalton
Liter
M
mg
min
mL
µL
mm
mmol
mol
nm
%
ppm
sec
molar
Milligramm
Minuten
Milliliter
Mikroliter
Millimeter
Millimol
Mol
Nanometer
von Hundert
von einer Million
Sekunde
Abkürzungen, Größen und Maßeinheiten
Symbole für Größen:
α
c
C
δ
∆ε
ε
J
λ
ν~
[° × mL × g-1 × dm-1]
[g × (100 mL)-1]
[mol × L-1]
[ppm]
[L × mol-1 × cm-1]
[F × m-1]
[Hz]
[nm]
spezifischer Drehwert
Konzentration
Konzentration
chemische Verschiebung
molare Absorbtionsdifferenz
Dielektrizitätskonstante
Kopplungskonstante
Wellenlänge
[cm-1]
Wellenzahl
T
t
U
Φ
[° C]
[sec, min, h, d]
[V]
[°]
Temperatur
Zeit
Spannung
Dihedralwinkel
VII
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Entwicklungen in der Wirkstoffsuche
Schon in der Urzeit hat der Mensch gelernt, verschiedene Zubereitungen pflanzlichen und
tierischen Ursprungs zur Behandlung von Krankheiten und Wunden sowie zur Linderung von
Schmerzen einzusetzen. So rät Hyppocrates in seinem Corpus Hyppocraticus werdenden
Müttern, kurz vor der Geburt Weidenrinde zu kauen, um den Wehenschmerz zu lindern.1 Im
frühen 19. Jahrhundert gelang es, Wirkstoffe wie etwa Morphin (Sertürner, etwa 1803),2
Coffein (Runge, 1819), Chinin (Pelletier, 1827), Salicin (Leroux, 1830) oder Salicylsäure
(Cahours, 1844) aus Pflanzenmaterial zu isolieren und zu charakterisieren.3 Mit der raschen
Entwicklung der organischen Chemie im 19. Jahrhundert wurden die Grundlagen zur
Entwicklung und Darstellung synthetischer Wirkstoffe gelegt. So führte etwa die Synthese
von Salicylsäure aus Phenol nach Kolbe und Schmitt4 zu einem industriellen Prozess, wie er
heute noch fast unverändert eingesetzt wird.4c,d Die Entwicklung synthetischer Wirkstoffe
erlaubte erstmals einen vergleichsweise einfachen, jahreszeit- und witterungsunabhängigen
Zugang in großem Maßstab. Dennoch blieb ein großer Anteil an Wirkstoffen wie
beispielsweise das Penicillin natürlichen Ursprungs.
Von der Entwicklung kombinatorischer Ansätze ab den achziger Jahren des letzten
Jahrhunderts, welche die Bildung riesiger Stoffbibliotheken organischer Verbindungen
gestattete, wie auch der Entwicklung von Systemen zum automatisierten Testen vieler
Substanzen auf pharmazeutische Wirkungen ("high throughput screening") versprach man
sich einen einfachen und effektiven Zugang zu neuen Wirstoffen und Leitstrukturen.
Tatsächlich konnten die in diese Verfahren gesetzten Hoffnungen nicht erfüllt werden: Von
868 untersuchten, zwischen 1981 und 2002 eingeführten Wirkstoffen sind 61 % Naturstoffe
oder davon abgeleitete Substanzen, wohingegen keine der untersuchten Substanzen mittels
kombinatorischer Methoden de novo synthetisiert wurde.5 Kombinatorische Methoden
erlauben allerdings eine effektive Optimierung von Wirkstoffen, wenn erst eine Leitstruktur
identifiziert ist.
2
Einleitung
Eine Erklärung hierfür mag darin liegen, dass sich Naturstoffe, Wirkstoffe und Synthetika
strukturell deutlich unterscheiden. In statistischen Untersuchung von Substanzdatenbanken
konnte gezeigt werden, dass Naturstoffe durchschnittlich mehr Stereozentren und stärker
verbrückte Ringsysteme und somit eine größere strukturelle Komplexität und Diversität als
Synthetika aufweisen (Tabelle 1).6
Eigenschaft
Molekulargewicht
kombinatorische
Substanzbibliothek
(n = 670536)b
~
x
x
Wirkstoffe
(n = 10968)b
Naturstoffe
(n = 3287)b
x
~
x
x
~
x
Naturstoffderivate
(n = 27338)b
~
x
x
[g mol-1]
Anzahl chiraler
Zentren
393
389
340
312
414
362
381
134
0.4
0
2.3
1
6.2
4
2.2
1
Anzahl an Ringen
3.2
3
2.6
2
4.1
4
3.6
4
Anzahl an
Ringsystemena
2.6
3
1.7
2
1.7
1
2.0
2
Stickstoffatome
2.7
3
1.6
1
0.8
0
1.9
2
Sauerstoffatome
2.8
3
4.0
3
5.9
5
4.1
4
x ) unterschiedlicher
Tabelle 1: Aufgeführt sind der Durchschnittswert ( x ) und Median ( ~
Strukturmerkmale für verschiedene untersuchte Substanzklassen;6a a) Ringsysteme sind definiert als Unterstruktur aus Ringen, welche über mehr als eine
Einfachbindung verknüpft sind; b) n beschreibt die Anzahl untersuchter, unterschiedlicher Substanzen einer Klasse.
Die meisten mittels kombinatorischer Chemie erhaltenen Substanzen zeigen aufgrund der
grundlegenden strukturellen Unterschiede keinerlei spezifische Wechselwirkungen mit
biologischen Systemen. Naturstoffe hingegen entstehen in komplexen biologischen Stoffwechselnetzwerken und weisen schon von daher ein Potential für biologische Aktivitäten auf.
Naturstoffe als intrinsisch bioaktive Verbindungen und direkt davon abgeleitete Verbindungen sind somit bei der Suche nach neuen Wirkstoffen oder Leitstrukturen für Wirkstoffe
unersetzlich.
Eine konsequente Weiterentwicklung ist daher das Konzept der "kombinatorischen
Biosynthese". Hierbei werden Gene unterschiedlicher Organismen mittels gentechnischer
Methoden zufällig oder gezielt neu kombiniert, um die Diversität zu nutzen, welche die Natur
bereitstellt. Dadurch können Metabolite gezielt strukturell variiert oder neue Strukturen
synthetisiert werden, so dass eine Vielzahl komplexer Naturstoffe und damit Bibliotheken von
Einleitung
3
Substanzen mit biologischer Relevanz zugänglich werden.7 Ein aktuell intensiv bearbeitetes
Gebiet ist die Biosynthese polyketidischer Naturstoffe. Viele Wirkstoffe wie verschiedene
Antibiotika und Antikrebs-Wirkstoffe leiten sich von Polyketiden ab. Die Biosynthese von
Polyketiden erfolgt über Multienzympolyketidsynthasen. Die modulare genetische Architektur dieser Enzymkomplexe erlaubt durch Kombination verschiedener Gene unterschiedlicher
Polyketidcluster in einigen Fällen die Ausbildung funktionsfähiger hybrider Polyketidsynthasen und die Biosynthese neuer polyketidischer Produkte.7b,8
Ein weiteres Beispiel für die Modifikation einer Grundstruktur durch kombinatorische
Biosynthese wurde von Rohr, Salas und Mitarbeitern publiziert.7c Rebeccamycin (1) ist ein
Indolcarbazol Alkaloid und wird von Lechevalieria aerocolonigenes produziert, Staurosporin
(2) wird von Streptomyces longisporoflavus gebildet. Das Interesse an Verbindungen dieses
Typs liegt in den pharmazeutischen Aktivitäten begründet, welche eine Behandlung von
Krebserkrankungen oder neurodegenerativen Erkrankungen versprechen.9 Durch Koexpression ausgewählter Gene der Rebeccamycin- und Staurosporin-Biosynthese mit Tryptophanhalogenasen anderer Mikroorganismen gelingt die Darstellung von mehr als 30
Indolocarbazol-Derivate (Abb. 1.1).
H
N
O
N
H
H
N
O
N
N
H3C
OH
O
O
O
N
H
H3CO
NHCH3
HO
HO
OCH3
Rebeccamycin (1)
H
N
HO2C
CO2H
X
H
N
Staurosporin (2)
O
R1
Cl
N
H
N
H
Abbildung 1.1:
R2
N
H
N
R5
R4
X = CH2, R1 = R2 = R3 = R4 = R5 = H
X = CH2, R1 = R2 = R3 = R4 = H, R5 = Glucose
X = CH2, R1 = R3 = R4 = H, R2 = Cl, R5 = Glucose
1
3
2
4
5
3 X = CH2, R = R = H, R = R = Cl, R = Glucose
R
1
2
3
4
X = CH2, R = Cl, R = R = R = H, R5 = Glucose
X = CO, R1 = R3 = R5 = H, R2 = R4 = Cl, Br
X = CO, R1 = R3 = R4 = R5 = H, R2 = Cl, Br
X = CO, R1 = R3 = H, R2 = R4 = Cl, Br, R5 = Glucose
X = CO, R1 = Cl, R2 = R3 = R4 = H, R5 = Glucose
Die Naturstoffe Rebeccamycin (1) und Staurosporin (2) und eine Auswahl
an Verbindungen, die durch Kombination von Genen verschiedener
Mikroorganismen synthetisiert werden konnten.
4
Einleitung
In dieser Weise sind vielfältige Kombinationen von Enzymen unterschiedlicher Biosynthesen
vorstellbar, welche ein ähnliches Substratspektrum aufweisen. Sinnvoll ist es hierbei, auf
solche Substrate zurückzugreifen, die in der Natur bereits als Verzweigungspunkte in der
Biosynthese dienen, so dass die Natur eine Vielzahl unterschiedlicher Biokatalysatoren zur
Verfügung stellt, die dieses Substrat umzusetzen im Stande sind. Eine solche Substanz ist das
Chorismat (3) (Abb. 1.2).
Phenylalanin,
Tyrosin
Tryptophan
CO2H
O
Folsäure
CO2H
OH
Chorismat (3)
Menachinon,
Enterobactin
Ubichinon
Abbildung 1.2:
Schematische Darstellung der Funktion von Chorismat (3)a als ein
zentraler Verzweigungspunkt in der Biosynthese mit wichtigen aus 3
hervorgehenden Metaboliten.
3 tritt in der Natur als zentrale Vorläufersubstanz vieler zumeist aromatischer Primär- und
Sekundärmetabolite in Bakterien, Algen, Archae, Pilzen und Pflanzen auf und wird daher von
einer Vielzahl von Enzymen mit unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften als Substrat
akzeptiert.10,11 Es eignet sich daher ideal als Ausgangspunkt für eine diversitätsorientierte
Biosynthese, wie im Chorus-Projekt gezeigt wird.
a
In der Abbildung ist nicht wie angegeben Chorismat dargestellt, sondern deren protonierte Form
Chorisminsäure. Im weiteren Verlauf der Arbeit wird dieses Schema beibehalten und im Text die in der Literatur
gebräuchliche Bezeichnung, meist des unter physiologischen Bedingungen vorliegenden Anions, benutzt,
wohingegen in Abbildungen stets die isoelektrische Struktur dargestellt wird.
Einleitung
5
1.2 Das Chorus-Projekt
Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des Chorus-Projektes erstellt. Der Name leitet sich
dabei vom Titel "Chorismat als universeller Synthesebaustein" ab. Ziel des Projektes war, die
in der Natur vorzufindende Diversität der Biosynthesen, in denen Chorismat als Intermediat
eine Rolle spielt, aufzugreifen und zur Bioproduktion interessanter Verbindungen nutzbar zu
machen. Diese sollen als chirale Bausteine Eingang in die organische Synthese finden. Als
mögliche Produktverbindungen kommen dabei alle von Chorismat abgeleiteten Metabolite in
Frage. Für dieses Projekt wurden zunächst die Diole 2,3-trans-CHD (4) und 3,4-trans-CHD
(5) wie auch die Aminoalkohole 3,4-trans-CHA (6) und 2,3-trans-CHA (7) ausgewählt.b
CO2H
OH
OH
4
OH
CO2H
OH
HO
HO
CO2H
OH
5
O
OH
D-Glucose
O
OH
CO2
CO2H
OH
Chorismat (3)
OH
NH3
CO2
NH3
E. coli
6
OH
7
Abbildung 1.3:
Schematische Darstellung einiger von Chorismat abgeleiteter Produktverbindungen des Chorus-Projektes.
Die Produktion der genannten Verbindungen erfolgt, wie schematisch in Abbildung 1.3 angedeutet, durch gezielt deregulierte Escherichia coli Stämme über den gemeinsamen Vorläufermetaboliten Chorismat (3), welcher über den Shikimat-Biosyntheseweg synthetisiert wird.
Die eingesetzten Stämme wurden in interdisziplinärer Zusammenarbeit von Mikrobiologen,
b
Funktionalisierte Cyclohexadiendiole werden in der Literatur auch als Dihydroxydihydrobenzen-Derivate
bezeichnet; in dieser Arbeit wird für diese Verbindungen jedoch die Abkürzung CHD (für Cyclohexadiendiol)
verwendet. Die Abkürzung CHA wird analog für Cycohexadienaminoalkohole verwendet.
6
Einleitung
Chemikern und Biotechnologen erstellt, untersucht und unter optimierten Bedingungen
kultiviert. Partner in diesem vom BMBF geförderten Projekt waren die DSM Biotech GmbH
(Jülich), die Arbeitsgruppe von Professor Dr. G. Sprenger (ehemals Institut für Biotechnologie I, Forschungszentrum Jülich), der Arbeitskreis von Dr. R. Takors (Institut für
Biotechnologie II) und die Arbeitsgruppe von Professor Dr. M. Müller (ehemals Institut für
Biotechnologie II) (Abb. 1.4). Durch die Arbeitsgruppe von Dr. Sell (DECHEMA) wurde
parallel eine Ökobilanzierung der untersuchten Bioproduktionen durchgeführt.
Biologie:
Professor Dr. G. Sprenger, Universität Stuttgart
DSM Biotech GmbH, Jülich
- Kenntnisse über Biosynthese
und Enzyme
- Entwicklung geeigneter
Bakterienstämme
"Chorus"Projekt
pH, pO2,
pCO2, T
Chemie:
Professor Dr. M. Müller, Universität Freiburg
- Erarbeitung der Analytik
für Produkte
Bioingenieurwesen:
Institut für Biotechnologie 2, Jülich
DSM Biotech GmbH, Jülich
- Entwicklung der Aufreinigung
- Optimierung von Fermentations-
- Nutzung der Produkte
- Optimierung der Aufreinigung
in der Naturstoffsynthese
Abbildung 1.4:
Kooperationen im Chorus-Projekt.
protokollen
Aufgabenstellung
7
2 Aufgabenstellung
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, einen effizienteren mikrobiellen Zugang zu den funktionalisierten Cyclohexadienen 2,3-trans-CHD (4) und 3,4-trans-CHD (5) zu ermöglichen. In
vorausgegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass 4 wie auch 5 mit Hilfe von E. coli
durch Überexpression von Enzymen des Enterobactin-Biosyntheseweges und Blockierung
konkurrierender wie auch das Produkt umsetzender Reaktionen fermentativ gewonnen
werden können.12 Durch die Kombination von Genen der Enterobactin-Biosynthese mit
Genen des Shikimat-Biosyntheseweges auf Plasmiden, die in E. coli eingebracht werden und
die Expression der codierten Enzyme ermöglichen sollen, soll der metabolische Fluss zu den
gewünschten Produkten verstärkt werden. Die auf diesem Wege erhaltenen Produkte sollen
aus dem Fermentationsmedium isoliert und gereinigt werden. 2,3-trans-CHD (4) wie auch
3,4-trans-CHD (5) werden als chirale und enantiomerenreine Substanzen auf ihre Reaktivität
unter unterschiedlichen Oxidationsbedingungen hin untersucht und verglichen werden.
Epoxidierung
cis-Dihydroxylierung
Oxidation zu Bromhydrinen
CO2H
OH
OH
?
3,4-trans-CHD (5)
cis-Dihydroxylierung
Oxidation zu Bromhydrinen
CO2H
OH
OH
2,3-trans-CHD (4)
?
Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Untersuchungen werden 4 und 5 als chirale Bausteine
in der organischen Synthese gezielt eingesetzt und weiter funktionalisiert. Hierbei wird mit
der Synthese beider Enantiomere des Naturstoffs Valienon (8) exemplarisch gezeigt werden,
dass die beiden Diole 4 und 5 komplementär zueinander eingesetzt werden können.
CO2H
HO
OH
HO
OH
OH
3,4-trans-CHD (5)
HO
O
OH
Valienon /
Gabosin I (8)
O
OH
CO2H
OH
OH
OH
OH
ent-Valienon /
ent-Gabosin I (ent-8)
2,3-trans-CHD (4)
8
Aufgabenstellung
Insgesamt soll mit diesen Arbeiten gezeigt werden, dass 4 und 5, ähnlich wie die bereits gut
untersuchten und etablierten cis-CHD, wertvolle und breit anwendbare chirale Synthesebausteine darstellen. Damit soll belegt werden, dass eine gezielte Nutzung der Biodiversität – in
diesem Projekt am Beispiel der Modifizierung von Chorismat (3) – einen einfachen Zugang
zu einer Vielzahl von Naturstoffderivaten ermöglicht, welche als chirale Bausteine unterschiedliche sich ergänzende Eigenschaften und Möglichkeiten bieten. Hiermit ergeben sich
durch die Wahl einer passenden Ausgangsverbindung individuelle und einfache synthetische
Zugänge zu vielen pharmazeutisch interessanten Verbindungen.
Allgemeiner Teil
9
3 Allgemeiner Teil
3.1 Shikimat-Biosyntheseweg
Der Shikimat-Biosyntheseweg ist ein Biosyntheseweg, der in der Natur zur Bildung vieler
Metabolite in höheren Pflanzen, Algen, Bakterien und Pilzen genutzt wird.11 Unter evolutiven
Gesichtspunkten handelt es sich um einen alten und ursprünglichen Biosyntheseweg, da er
gemeinsam in sich seit langem getrennt entwickelnden Organismen gefunden wird. Der Name
Shikimat stammt dabei von der Shikimi-Frucht des japanischen Sternanis (Illicium
religiosum), in der Shikimat - ebenso wie in Sternanis (Illicium verum) - in hohen Konzentrationen gefunden wird.13 Die Tatsache, dass der Shikimat-Biosyntheseweg bei vielen
Lebewesen, nicht jedoch bei Menschen und Tieren gefunden wird, macht ihn zu einem
attraktiven Ziel für die Entwicklung von Herbiziden und antimikrobiellen Wirkstoffen.14 Zur
Zeit werden Inhibitoren des Enzyms 3-Dehydrochinasäure Dehydratase des ShikimatBiosyntheseweges als potentielle Wirkstoffe gegen den Tuberculose-Erreger Mycobacterium
tuberculosis untersucht.15
Eine gängige Definition des Shikimat-Biosyntheseweges, der auch diese Arbeit folgt, ist die
Betrachtung beginnend mit Phosphoenolpyruvat (PEP, 9) und D-Erythrose-4-phosphat (E4P,
10) aus dem Pentosephosphatweg bis zu Chrorismat (3) (Abb. 3.1). Hierbei werden 9 und 10
zu 3-Deoxy-D-arabinoheptulosesäure-7-phosphat (DAHP, 11) verknüpft. Dehydroshikimat
Synthase katalysiert die Bildung von Dehydroshikimat (DHQ, 12) unter Bildung des zyklischen Kohlenstoffgerüstes. 12 kann entweder durch Chinasäure Dehydrogenase zu Chinasäure (QA, 13) reduziert werden oder aber unter Eliminierung von Wasser von 3-Dehydrochinasäure Dehydratase katalysiert zu Dehydroshikimat (DHS, 14) weiterreagieren. 14 wird
von Shikimat Dehydrogenase zu Shikimat (SA, 15) reduziert, welche durch das Enzym
Shikimat Kinase durch Verknüpfung mit einem Phosphatrest in 3-Position zu 3-Phosphoshikimat (S3P, 16) aktiviert wird. 16 wird durch EPSP Synthase mit Phosphoenolpyruvat zu
5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat
(EPSP,
17)
umgesetzt.
Abschließend
katalysiert
Chorismat Synthase die 1,4-Eliminierung von Phosphat unter Bildung eines konjugierten
Diens zu Chorismat (3).
10
Allgemeiner Teil
Da Chorismat (3) Ausgangspunkt für die Biosynthese unterschiedlicher Metabolite ist, deren
Bildung weitgehend unabhängig voneinander reguliert werden soll, existieren Regulationsmechanismen für die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren auf DNA-, RNA und
enzymatischer Ebene. In E. coli sind mit den Proteinen TrpR und TyrR zwei transkriptionelle
Repressoren bekannt, welche auf DNA-Ebene regulierend wirken.16 Auf RNA-Ebene findet
beispielsweise eine Tryptophan-abhängige Regulierung am Operon trpEDCBA durch
transkriptionelle Attenuation statt.17 Auf enzymatischer Ebene findet eine Regulierung durch
feedback-Inhibierung statt. Die DAHP Synthase AroF wird durch L-Tyrosin inhibiert, die
Isoenzyme AroG und AroH werden durch L-Phenylalanin beziehungsweise durch L-Tryptophan inhibiert.18 Es existieren somit komplexe Mechanismen, welche eine unabhängige
Regulierung unterschiedlicher Biosynthesen des Biosynthesenetzwerkes erlauben.
CO2H
OPO3H2
HO
aroF
aroG
aroH
PEP (9)
CO2H
HO
O
aroB
OH
OH
H2O3PO
H2O3PO
O
CO2H
quiA
O
OH
OH
HO
OH
OH
OH
DAHP (11)
OH
HO
CO2H
DHQ (12)
QA (13)
E4P (10)
aroD
CO2H
CO2H
CO2H
aroK
aroL
H2O3PO
OH
aroE
HO
OH
OH
O
OH
S3P (16)
OH
OH
SA (15)
DHS (14)
aroA
CO2H
CO2H
aroC
H2O3PO
O
OH
EPSP (17)
Abbildung 3.1:
O
CO2H
CO2H
OH
Chorismat (3)
Shikimat-Biosyntheseweg: Intermediate (Abkürzung): Phosphoenolpyruvat (PEP), D-Erythrose-4-phosphat (E4P), 3-Deoxy-D-arabinoheptulosesäure-7-phosphat
(DAHP),
Dehydrochinasäure
(DHQ),
Chinasäure (QA), Dehydroshikimat (DHS), Shikimat (SA), 3-Phosphoshikimat (S3P), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat (EPSP); Gen (Enzym):
aroF, aroG, aroH (DAHP Synthase); aroB (3-Dehydrochinasäure
Synthase); quiA (Chinasäure Dehydrogenase); aroD (3-Dehydrochinasäure Dehydratase); aroE (Shikimat Dehydrogenase); aroK, aroL
(Shikimat Kinase); aroA (EPSP Synthase); aroC (Chorismat Synthase).
Allgemeiner Teil
11
Die zentrale Bedeutung des Shikimat-Biosyntheseweges wird deutlich, wenn man betrachtet,
welch wichtige Metabolite aus dem Shikimat-Biosyntheseweg hervorgehen. Viele aromatische Primär- und Sekundärmetabolite finden ihren Ursprung im Shikimat-Biosyntheseweg.11,19 Physiologisch wichtige Metabolite sind die aromatischen Aminosäuren Tryptophan,
Phenylalanin und Tyrosin sowie Folsäure (Vitamin B9), Ubichinon (Coenzym Q) und
Menachinon (Vitamin K2). Gemeinsamer Ausgangspunkt ihrer Biosynthesen ist das
Chorismat (3) (Abb. 3.2).
O
CO2H
CO2-
HO2C
NH3+
Phenylalanin,
Tyrosin
Tryptophan
OH
Prephenat (18)
pheA
tyrA
Anthralinat (19)
trpD
trpE
CO2H
ShikimatBiosyntheseweg
O
CO2H
CO2-
pabB
pabA
pabC
Folsäure
OH
NH3+
Chorismat (3)
entC
menF
CO2H
CO2H
Menachinon,
Enterobactin
OH
O
Ubichinon
CO2H
Isochorismat (22)
Abbildung 3.2:
para-Aminobenzoat (20)
ubiC
OH
para-Hydroxybenzoesäure (21)
Chorismat (3) als gemeinsames Zwischenprodukt in den Biosynthesen
verschiedener Metabolite; Enzyme (Gene): Chorismat Mutase (pheA,
tyrA); Anthralinat Synthase (trpD, trpE); Aminodeoxychorismat Synthase
(pabB, pabA), Aminodeoxychorismat Lyase (pabC); Chorismat Lyase
(ubiC); Isochorismat Synthase (menF, entC).
Im Rahmen des Chorusprojektes soll genau diese biologische Diversität genutzt werden und
den Zugang zu unterschiedlichen Metaboliten ausgehend von Chorismat ermöglichen. Dabei
sind vor allem die frühen, nicht aromatischen Metabolite nach Chorismat, die leicht
funktionalisierbare chirale Bausteine darstellen, von besonderem Interesse.
Neben den in dieser Arbeit untersuchten Diolen 2,3-trans-CHD (4) und 3,4-trans-CHD (5)
sind viele weitere interessante Metabolite als Biosyntheseprodukte zugänglich. So sind die
Aminoalkohole 2,3-trans-CHA (6), 3,4-trans-CHA (7) oder (1R,6R)-2-Succinyl-6-hydroxycyclohexa-2,4-dien-1-carboxylat (SHCHC, 23), ein früher Metabolit der Menachinon-
12
Allgemeiner Teil
Biosynthese, Isoprephenat (24),20 welches in einer enzymatisch katalysierten ClaisenUmlagerung aus Isochorismat (22) erhalten werden kann, oder auch Salicylsäure (25)21 als
aromatisches Produkt denkbar (Abb. 3.3). Salicylsäure kann vermutlich mit dem in
Pseudomonas aeruginosa gefundenen Enzym Isochorismat Pyruvat Lyase (PchB)21b oder
dem in P. fluorescens gefundenen Enzym Isochorismat Pyruvat Lyase (PmsB)21c aus Isochorismat (22) oder aber durch ein durch das Gen irp9 codiertes Enzym des pathogenen
Organismus Yersinia enterocolitica21a direkt aus Chorismat (3) erhalten werden. Arbeiten zur
Bioproduktion von SHCHC (23), welches ein Stereozentrum mit drei Kohlenstoffsubstituenten liefert, werden von Frau A. Kurutsch in Kooperation mit Professor Dr. G. Sprenger,
Universität Stuttgart, durchgeführt.
CO2-
CO2-
NH3+
NH3+
PhzD
CO2-
O
OH
ADIC (26)
2,3-trans-CHA (7)
CO2-
PhzE oder
TrpEH398M
CO2-
PabC
CO2-
O
NH3
OH
+
NH3+
ADC (27)
3,4-trans-CHA (6)
CO2H
PabAB
OH
CO2H
EntB
OH
2,3-trans-CHD (4)
O
CO2H
OH
Chorismat (3)
EntC
oder
MenF
O
CO2H
MenD
OH
O
CO2H
Isochorismat (22)
EntB oder
PabC
CO2H
OH
HO2C
SHCHC (23)
X
CO2H
CO2H
O
OH
PchB oder
PmsB
CO2H
Isoprephenat (24)
CO2H
Irp9
OH
OH
OH
3,4-trans-CHD (5)
Abbildung 3.3:
Salicylsäure (25)
Einige von Chorismat (3) aus zugängliche Metabolite; X = bislang nicht
identifiziertes Enzym aus Nicotiana silvestria;20 ––– präparativ
zugänglich; ---- bislang nicht präparativ erschlossen; 2-Amino-2deoxyisochorismat (ADIC, 26); 4-Amino-4-deoxychorismat (ADC, 27).
Allgemeiner Teil
13
3.2 Varianten des Shikimat-Biosyntheseweges
Neben dem hier beschriebenen und weit verbreiteten normalen Shikimat-Biosyntheseweg
werden in der Natur vereinzelt Variationen und Abwandlungen gefunden. So leiten sich
einige Naturstoffe wie die Antibiotika Rifamycin B (28)22 und Geldanamycin (29) von 3Amino-5-hydroxybenzoesäure (AHBA, 30) ab,23 welche über den Aminoshikimat-Biosyntheseweg gebildet wird (Abb. 3.4).23b,c
CH3
CH3
O
HO
AcO
CO2-
OH
CH3
H3C
H3C
OH
CH3
H3CO
O
OH
NH
NH3+
HO
O
CH3
AHBA (30)
Abbildung 3.4:
O
H3C
O
OCH2CO2H
Rifamycin B (28)
N
H
CH3
OCH3
H3CO
O
O
CH3
HO
O
CH3
CH3
O
NH2
Geldanamycin (29)
3-Amino-5-hydroxybenzoesäure (AHBA, 30) und die Antibiotika Rifamycin B (28) und Geldanamycin (29) als Beispiele für Naturstoffe, deren
Biosynthese über den Aminoshikimat-Biosyntheseweg und AHBA (30)
als Intermediat verläuft.
Für diese Variante des Shikimat-Biosyntheseweges wird eine Zyklisierung von in situ
generiertem Iminoerythrose-4-phosphat (IminoE4P, 31) und Phosphoenolpyruvat zu 4Amino-3,4-dideoxy-D-arabinoheptulosesäure-7-phosphat (AminoDAHP, 32) angenommen,
welches zu 5-Amino-5-deoxy-3-dehydrochinasäure (AminoDHQ, 33), 5-Amino-5-deoxy-3dehydroshikimat (AminoDHS, 34) und schließlich AHBA (30) weiterreagiert.23b,c Alternativ
kann Aminodehydroshikimat auch zu Aminoshikimat (AminoSA, 35) reduziert werden (Abb.
3.5).24
In Isotopenverdünnungsexperimenten konnte mit Rohextrakten sowohl von Amycolatopsis
mediterranei als auch von S. collinus ein Einbau von E4P (10), AminoDAHP (32),
AminoDHQ (33) und AminoDHS (34) in 30 nachgewiesen werden.25 Eine Aminierung von
DAHP (11) oder späteren Metaboliten des Shikimat-Biosyntheseweges konnte so ausgeschlossen werden, da für 11 anders als für 10 kein Einbau in 30 beobachtet wurde.25
14
Allgemeiner Teil
CO2CO2H
NH3+
HO
OPO3H2
HO
PEP (9)
rifG
NH3
OH
H2O3PO
HO
CO2
CO2-
HO
O
rifH
NH
CO2-
rifI
OH
AminoSA (35)
rifJ
+
O
OH
NH3
+
NH3+
O
OH
AminoDAHP (32)
-
CO2-
rifK
OH
AminoDHQ (32)
AminoDHS (33)
NH3+
HO
H2O3PO
AHBA (30)
IminoE4P (31)
Schematische Darstellung des Aminoshikimat-Biosyntheseweges in A.
mediterranei; Intermediat (Abkürzung): Phosphoenolpyruvat (PEP), DErythrose-4-phosphat (E4P), Imino-D-erythrose-4-phosphat (IminoE4P),
4-Amino-3,4-dideoxy-D-arabino-heptulosesäure-7-phosphat
(AminoDAHP), Aminodehydrochinasäure (AminoDHQ), Aminodehydroshikimat
(AminoDHS), 3-Amino-5-hydroxybenzoesäure (AHBA), Aminoshikimat
(AminoSA); Enzym (Gen): AminoDAHP Synthase (rifH); AminoDHQ
Synthase (rifG); AminoDHQ Dehydratase (rifJ); AHBA Synthase (rifK);
AminoSA Dehydrogenase (rifI).
Abbildung 3.5:
Aufgrund des beobachteten Einbaus von E4P (10) in 30 und der Identifizierung von Glutamin
als mögliche Stickstoffquelle für die Umsetzung mit Zellrohextrakten von A. mediterranei
wurde zunächst eine Amidohydrolase-Aktivität in der AminoDAHP Synthase vermutet,
welche auch aus anderen Enzymen wie Anthranilat Synthase oder p-Aminobenzoat Synthase
bekannt ist. Das direkt im Enzym freigesetzte Ammoniak könnte mit E4P (10) zu IminoE4P
(31) kondensieren und zu AminoDAHP (32) umgesetzt werden.14
Frost hingegen konnte später den in vitro Einbau von Kanosamin-6-Phosphat (K6P, 36) in 32
zeigen und Kanosamin (37) als mögliche Stickstoffquelle nachweisen (Abb. 3.6).26
H2O3PO
RO
HO
HO
a
O
H2N
OH
OH
RifN
OPO3H2
H2N
OH
b
AminoF6P (38)
c
HO
OH
OH
R=H
Kanosamin (37)
R = PO3H2 K6P (36)
Abbildung 3.6:
O
HN
IminoE4P (31)
OPO3H2
Glutamin
Glutamat
OH
HO
O
E4P (10)
Mögliche Biosynthesen von IminoE4P (31); Enzyme: RifN: Kanosamin
Kinase; a) Phosphokanosamin Isomerase; b) Transketolase; c) Amidohydrolase.
Allgemeiner Teil
15
Interessant ist, dass die Aminoverbindungen AminoDHQ (33) und AminoDHS (34) von E.
coli Enzymen des Shikimatbiosyntheseweges AroD und AroE als Substrat akzeptiert und
analog zu DHQ (12) und DHS (14) umgesetzt werden.25
Der für die Aminoshikimat-Biosynthese codierende Gencluster aus A. mediterranei konnte
lokalisiert, einzelne darin codierte Enzyme identifiziert und in E. coli expremiert werden. So
konnte ein rekombinanter E. coli Stamm generiert werden, der in der Lage ist, Kanosamin in
einer Ganzzelltransformation zu Aminoshikimat bei einer erzielten Produktkonzentration von
1.1 g × L-1 umzusetzen (Abb. 3.7).24a
HO
CO2-
HO
E. coli
O
H2N
OH
OH
Kanosamin (37)
Abbildung 3.7:
NH3+
HO
OH
AminoSA (35)
1.1 g L-1
Schematische Darstellung der Ganzzelltransformation von Kanosamin zu
Aminoshikimat (AminoSA) mit E. coli SP1.1/pJG6181.B.24a
Ergänzend zu den im Chorus-Projekt bereits erschlossenen Metaboliten 2,3-trans-CHA (7)
und 3,4-trans-CHA (6) bietet sich unter Nutzung dieser Biosynthesen die Möglichkeit,
Produkte zu erhalten, die in 3-Position relativ zur Säurefunktion eine Aminofunktion tragen.
In weiteren Variationen des Shikimat-Biosyntheseweges wird Dehydroshikimat (14) als
Verzweigungspunkt genutzt. 14 kann von 3-Dehydroshikimat Dehydratase (aroZ) aus
Klebsiella pneumoniae unter Abspaltung von Wasser zu Protocatechusäure (39) aromatisiert
werden.27 Die im gleichen Organismus gefundene Protocatechusäure Decarboxylase (aroY)
vermag 39 zu Brenzkatechin (40) zu decarboxylieren (Abb. 3.8).27
Durch Mutation des in Pseudomonas aeruginosa gefundenen Gens pobA, welches für paraHydroxybenzoat Hydroxylase codiert (PobA), konnte eine Enzymvariante PobAY201F
generiert werden, welche in der Lage ist, 39 zu Gallussäure (41) zu oxidieren.28 Die
Decarboxylierung von 41 zu Pyrogallol (42) gelingt wie auch die Decarboxylierung von 39
mit AroY und kann in einer an die Biosynthese von Gallussäure (41) nachgeschalteten
Ganzzelltransformation erfolgen.29a
16
Allgemeiner Teil
D-Glucose
CO2H
ShikimatBiosyntheseweg
CO2H
aroZ
O
OH
OH
DHS (14)
H2O
aroY
HO
CO2
OH
Protocatechusäure (39)
HO
OH
Brenzkatechin (40)
pobA*
CO2H
aroY
HO
OH
OH
Gallussäure (41)
Abbildung 3.8:
HO
CO2
OH
OH
Pyrogallol (42)
Biosynthese von Protocatechusäure (39), Brenzkatechin (40), Gallussäure
(41) und Pyrogallol (42) aus Dehydroshikimat (DHS, 14); Enzym (Gen):
3-Dehydroshikimat Dehydratase (aroZ), Protocatechusäure Decarboxylase
(aroY), p-Hydroxybenzoat HydroxylaseY201F (pobA*).
Frost und Mitarbeiter nutzten Kombinationen dieser Enzyme in rekombinanten E. coli und
konnten so Protocatechusäure (39) mit einem Gesamtprodukttiter von 71 g × L-1 produzieren,
was einer Ausbeute von 49 % bezogen auf die umgesetzte Glucose entspricht. Hierzu wurde
das Produkt dem Medium in situ in einer Festphasenextraktion entzogen, und die angegebene
Konzentration umfasst gelöstes wie auch gebundes 39.27b Brenzkatechin (40) konnte unter
Einsatz von in situ Festphasenextraktion in 8.5 g × L-1 (7 % bezogen auf umgesetzte Glucose)
erhalten werden.27b Gallussäure (41) konnte mit einem Produkttiter von 20 g × L-1 (12 %
bezogen auf umgesetzte Glucose) erhalten werden.29a In einer Ganzzelltransformation wurde
41 zu Pyogallol (42) decarboxyliert und in einer Ausbeute von 93 % isoliert.29a
Unter industriell einfach realisierbaren Reaktionsbedingungen können einige fermentativ
erhaltene Metabolite in für die chemische Industrie grundlegende aromatische Substanzen wie
Phenol (43),30 Brenzkatechin (40)27b oder Pyrogallol (42)29b überführt werden (Abb. 3.9). So
lässt sich Shikimat (15) bei Temperaturen von 350 °C in Gegenwart von Wasserdampf und
Kupfer zu Phenol umsetzen.30 Protocatechusäure (39) decarboxyliert in Gegenwart von
Wasser bei 290 °C zu Brenzkatechin (40),27b und Gallussäure (41) setzt bei 50 °C in 85%igem
Essig mit 5 mol% Kupfer(II) und 10 mol% Zink(II) Pyrogallol (42) frei.29b
Allgemeiner Teil
CO2H
1) H2O, 350 °C
2) Cu(0), H2O, 350 °C
A
HO
OH
17
OH
51 %
OH
15
43
CO2H
OH
H2O, 290 °C
B
OH
87 %
HO
OH
39
5 % Cu2+
10 % Zn2+,
AcOH / H2O(85:15),
CO2H
C
HO
OH
40
OH
OH
50 °C, Luft, 70 %
OH
OH
41
42
Abbildung 3.9: Synthese aromatischer Produkte aus biotechnologisch gewonnenen Vorläufersubstanzen; A Phenol (43) aus 15;30 B Brenzkatechin (40) aus 39;27b C
Pyrogallol (42) aus 41.29b
Frost und Mitarbeiter konnten damit einen nachhaltigen Zugang zu aromatischen Substanzen
aufzeigen, der prinzipiell eine Alternative zur Petrochemie darstellen könnte ("green
chemistry").
3.3 Einsatz des Shikimat-Biosyntheseweges zur Produktion
von Sekundärmetaboliten
Einige der im Shikimatbiosyntheseweg generierten Verbindungen werden als chirale
Bausteine in der organischen Synthese genutzt. Dabei werden viele dieser Verbindungen wie
Shikimat (15) oder Chinasäure (13) klassischerweise durch Extraktion aus Pflanzen wie dem
japanischen Sternanis oder der Rinde des Chinabaums gewonnen. Durch das bessere
Verständnis der Biosynthesen und Aufklärung der für die Enzyme des ShikimatBiosyntheseweges codierenden Gene konnten von Frost und Mitarbeitern durch Deregulierung des Stoffflusses E. coli Stämme generiert werden, die Metabolite des Shikimatbiosyntheseweges produzieren (Tabelle 2). Nach Optimierung der Fermentationsbedingungen
und Modifikation des Glucoseaufnahmesystems31 wurden zum Teil bemerkenswerte Produkttiter erhalten. In vielen Fällen geht eine maximierte Produktbildung mit der Bildung erheblicher Mengen strukturell verwandter Nebenprodukten einher (Tabelle 2).
18
Allgemeiner Teil
Produkt
maximaler
Produkttiter
[g × L-1]
Ausbeute
[mol Produkt /
mol Glucose]
Nebenprodukte
(Titer [g × L-1])
Dehydrochinasäure (12)27b
58
28 %
keine Angaben
Chinasäure (13)32
60
23 %
12 (3)
Dehydroshikimat (14)31
69
30 %
11 (10), 12 (12), 41 (13)
Shikimat (15)33
87
33 %
14 (10), 13 (2)
Tabelle 2: Übersicht über die mikrobielle Produktion von Metaboliten des ShikimatBiosyntheseweges und dabei erzielte Produkttiter.
3.4 Cyclitole und Carbazucker
Unter dem Begriff Cyclitole werden polyhydroxylierte zyklische Alkane, die somit strukturell
mit pyranosidisch oder furanosidisch vorliegenden Zuckern verwandt sind, verstanden. Wird
der Begriff weiter gefasst, so fallen auch Verbindungen, die andere Funktionalitäten wie
Aminofunktionen, Carbonsäuren oder Hydroxymethylgruppen tragen, unter diese Verbindungsklasse. Cyclitole sind in der Natur weit verbreitete Substanzen, denen vielfältige
Funktionen in biochemischen Prozessen zukommen (Abb. 3.10).
D-myo-Inositol-1,4,5-
triphosphat (1,4,5-IP3, 44) spielt bei der Calciumausschüttung in Säugetierzellen als "second
messenger" eine Rolle.34 In Pflanzen werden große Mengen des Hexakis-Phosphorsäureesters
Phytinsäure (45) gefunden, welcher vermutlich als Phosphatspeicher dient.35 In reifem
Getreidesaatgut liegen bis zu 95 % des Phosphates in Phytinsäure gebunden vor. (+)-Pinitol
(46), ein in der Rinde von Pinus lambertiana und weiteren Pflanzen gefundenes Cyclitol,
unterdrückt das Wachstum der Larven von Heliothis zea. 36 Weiterhin wurde gezeigt, dass 46
blutdrucksenkende Eigenschaften aufweist.36
OH
HO
H2O3PO
OPO3H2
OH
OPO3H2
H2O3PO
OPO3H2
H3CO
OH
H2O3PO
OPO3H2
HO
OPO3H2
1,4,5-IP3 (44)
OPO3H2
Phytinsäure (45)
Abbildung 3.10: Beispiele für natürlich vorkommende Cyclitole.
OH
OH
OH
(+)-Pinitol (46)
Allgemeiner Teil
19
Einige Cyclitole werden auch als Pseudozucker bezeichnet. Der Begriff Pseudozucker wurde
1966 von McCasland geprägt und beschreibt solche Substanzen, die strukturell der Pyranoseoder Furanose-Form eines Zuckers gleichen, wobei jedoch der Ringsauerstoff gegen eine
andere Funktion ersetzt ist.37 Je nach Natur dieser Funktion werden diese Pseudozucker als
Aza-, Thio- oder Carbazucker bezeichnet (Abb. 3.11).
OH
HO
HO
O
HO
OH
OH
OH
HO
CH2
HO
OH
OH
OH
β-D-Glucose
Carbazucker
HO
S
HO
OH
OH
OH
Thiozucker
NH
HO
OH
OH
Azazucker
Pseudo-β-D-Glucosen
Abbildung 3.11: Beispiele für Pseudo-β-D-Glucosen.
Während glycosidische Bindungen in Oligozuckern aufgrund der Acetalstruktur des Zuckers
leicht hydrolysiert werden können, werden Etherbindungen zu Carbazuckern kaum gespalten.
Aufgrund dieser Eigenschaft und ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu Zuckerverbindungen sind
Carbazuckerverbindungen potentielle Inhibitoren für Enzyme, die Zuckerderivate als Substrate akzeptieren. Von besonderem Interesse sind solche Mimetika, die die Konformation möglicher Übergangszustände, welche Zucker im Verlauf der Reaktion im aktiven Zentrum eines
Enzyms durchlaufen, imitieren. Als solche sind verschiedene Pseudozucker und Zuckermimetika zur Aufklärungen enzymatischer Mechanismen wie auch als wirksame Enzyminhibitoren pharmazeutisch interessante Verbindungen.
20
Allgemeiner Teil
3.5 Naturstoffe mit Cyclohexengrundstruktur
Eine in Pflanzen und Pilzen weit verbreitete Gruppe von Cyclitolen weist als gemeinsame
Grundstruktur einen C7-Körper bestehend aus einem Cyclohexen-Ring und einer Methyl-,
Hydroxymethyl- oder Säurefunktion auf (Abb. 3.12).
So sind Phyllostin (47) und Epoxydon (48) zwei phytotoxische Substanzen, die, wie auch 49,
50 und 51 im Kulturmedium verschiedener Phyllosticta Spezies gefunden wurden.38 Zeylenol
(52) wurde im Methanolextrakt aus Wurzeln von Uvaria zeylanica gefunden,39 und Piperenol
A, B und C (53, 54 und 55) sind aus der indischen Pflanze Piper cubeb isoliert worden.40
Pericosin A und B (56 und 57) wurden aus Persiconia byssoides, einem im Gastrointestinaltrakt des marinen Organismus Aplysia kurodai (Seehase) gefundenen Pilzes, isoliert und
wiesen im Versuch mit Leukämiezelllinien cytotoxische Eigenschaften auf.41 Dargestellt ist
die durch Synthese des Naturstoffs bestimmte und korrigierte Konfiguration für Pericosin A.42
Streptol (58) wurde aus dem Fermentationsüberstand eines unidentifizierten Streptomyces
Stammes isoliert werden und zeigt eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von
Salatkeimlingen.43
O
O
HO
O
O
HO
O
O
Cl
HO
Cl
HO
OH
O
OH
Phyllostin (47)
Epoxydon (48)
O
OAc
HO
HO
OH
OBz
OH
Zeylenol (52)
51
OBz
AcO
OAc
OAc
HO
OAc
Piperenol C (55)
50
OBz
BzO
OH
OH
OH
HO
OBz
OBz
OH
OH
Piperenol A (53)
Piperenol B (54)
CO2Me
Cl
OH
49
OBz
OH
HO
OH
OH
OH
CO2Me
MeO
OH
OH
Pericosin A (56)
OH
HO
OH
OH
Pericosin B (57)
HO
OH
OH
Streptol (58)
Abbildung 3.12: Beispiele für natürlich vorkommende Carbazucker mit ungesättigtem C7Körper.
Allgemeiner Teil
21
3.6 Gabosine
Eine spezielle Untergruppe von Carbazuckern wird als Gabosine zusammengefasst. Der
Begriff wurde von Zeeck und Mitarbeitern für hydroxylierte und mit einer Methyl- oder
Hydroxymethylgruppe substituierte Cyclohexanone und Cyclohexenone geprägt.44 Einzig
Gabosin K weist keine Ketofunktion auf, wird aber aufgrund der gleichen Herkunft und
strukturellen Verwandtschaft ebenfalls als Gabosin bezeichnet (Abb. 3.13). Die Mehrzahl
dieser Verbindungen ist ungesättigt. Bislang wurden 14 Verbindungen dieses Types als
Sekundärmetabolite verschiedener Streptomyces Stämme identifiziert. Die Gruppe der
Gabosine weist eine große Variation in Bezug auf relative und absolute Konfiguration der
Hydroxyfunktionen auf. Mit Gabosin B und Gabosin F werden zwei enantiomere Verbindungen beschrieben, und die Hydroxyfunktionen von Gabosin C und Gabosin O weisen eine
genau entgegengesetzte absolute Konfiguration auf. Gabosin F wurde schon 1986 von KellerSchierlein und Mitarbeitern als Metabolit verschiedener Streptomyces Stämme isoliert und
identifiziert.45 Die Strukturen der Gabosine A,46 B,47 C,48 D,49 E,49 F,44a I,50 N,51 und O51
wurden durch Synthese bestätigt. Die Struktur von Gabosin K wurde von Zeeck und
Mitarbeitern wie dargestellt angenommen, konnte aber durch Synthese der gezeigten
Verbindung widerlegt werden.47,52 Eine Verbindung mit der Bezeichnung Gabosin M ist in
der Literatur nicht beschrieben.
O
HO
O
CH3
HO
HO
O
CH3 HO
HO
O
OH
HO
HO
O
OAc
HO
HO
OH
HO
OH
OH
OH
OH
OH
Gabosin A (59)
Gabosin B (60)
Gabosin C (61)
Gabosin D (62)
Gabosin E (63)
O
O
HO
CH3 HO
HO
HO
OH
OAc
Gabosin H (66)
O
OAc
OH
fälschlicherweise
angenommen für
Gabosin K (68)
CH3
OH
Gabosin G (65)
OH
HO
O
O
HO
OH
HO
HO
CH3
HO
CH3
HO
OH
HO
OH
Gabosin I,
Valienon (8)
O
HO
CH3
OH
HO
OH
Gabosin J (67)
HO
OH
Gabosin L (69)
O
HO
HO
OH
Gabosin F (64)
HO
O
HO
Gabosin N (70)
OH
Gabosin O (71)
Abbildung 3.13: Als Gabosine bezeichnete und aus verschiedenen Streptomyces Stämmen
isolierte Carbazucker.
22
Allgemeiner Teil
Die Biosynthese für Gabosine A – C wurde von Zeeck und Mitarbeitern mittels Verfütterung
isotopenmarkierter Verbindungen aufgeklärt. Hierbei zeigte sich, dass die Biosynthese nicht
wie vermutet über den Shikimat-Biosyntheseweg, sondern vielmehr über den Pentosephosphatweg durch Zyklisierung eines Heptulosephosphat-Intermediates erfolgt.53 Die physiologische Bedeutung der meisten dieser Sekundärmetabolite ist nicht bekannt. Gabosin I (8), in
anderem Zusammenhang auch als Valienon bezeichnet, wird bei der Biosynthese des
Aminocyclitols in Validamycin A als Intermediat gebildet (vgl. Kapitel 3.8.1).
3.7 Beispiele für mit Chorismat strukturell eng verwandte
Verbindungen
Für andere in der Natur gefundene Verbindungen kann aufgrund der strukturellen
Verwandtschaft angenommen werden, dass sie sich direkt von Chorismat (3) oder
Vorläufersubstanzen ableiten und ihren Ursprung somit im Shikimat-Biosyntheseweg haben.
Die hier dargestellten Verbindungen wurden alle aus verschiedenen Pilzen gewonnen und
weisen cytotoxische oder fungizide Eigenschaften auf (Abb. 3.14).54 Die Struktur der Cyathiformine A - C konnte durch Synthese der Verbindungen bestätigt werden.55
CO2H
O
CO2H
OH
Chorismat (3)
CO2Me
CO2Me
CO2Me
HO
Cl
O
O
CO2Me
HO
OH
O
CO2Me
HO
O
OH
Cyathiformin A (59)
Cyathiformin B (60)
O
Cyathiformin C (61)
CO2Me
CO2Me
HO
CO2Me
OH
Cl
CO2Me
OH
Cyathiformin D (62)
HO
O
O
O
Metabolit eines nicht
identifizierten Pilzes (63)
Abbildung 3.14: Chorismat (3) und strukturell verwandte Sekudärmetabolite.41, 54
Allgemeiner Teil
23
3.8 Kommerziell relevante Aminocarbazucker
Aminocyclitole und Aminozuckermimetika von kommerzieller Relevanz sind neben anderen
das Valienamin (64), welches in Acarbose (65) und Validamycin A (66) einen Teil der für die
biologische Aktivität verantwortlichen Substruktur bildet, oder Oseltamivir (67), welches als
Neuramidase-Inhibitor als Wirkstoff im Antiinfluenza-Medikament Tamiflu® große Bedeutung erlangt hat (Abb. 3.15).
Acarbose (65): R =
OH
CO2Et
O
HO
H2N
O
NHAc
∗ H3PO4
Oseltamivir (67)
HO
HO
OH
N
H
HO
O
OH O
HO
HO
OH O
HO
O
OH OH
Validamycin A (66): R =
R
OH
OH
OH
Valienamin (64): R = -H
HO
O
HO
O
OH
OH
Abbildung 3.15: Strukturen von Oseltamivir (67), Valienamin (64), Acarbose (65) und
Validamycin A (66).
Valienamin (64) ist ein in der Natur gefundenes Aminocyclitol, das vielfach in Verbindung
mit anderen Zuckern oder Pseudozuckern auftritt.56 Verbindungen dieses Typs werden nur
von Mikroorganismen, und dabei überwiegend von Actinomyceten gebildet. Im Jahr 1970
wurde Validamycin A (66) als erster Valienamin enthaltender Sekundärmetabolit aus dem
Kulturüberstand von Streptomyces hygroscopicus Subspezies limoneus isoliert und
beschrieben.57
3.8.1
Validamycin A und Acarbose
Die Biosynthese des Aminocarbazuckers Valienamin (64) ist noch nicht abschließend geklärt,
jedoch konnten mittels Fütterungsexperimenten mit
13
C-markierten Kohlenstoffquellen ein
Ursprung im Shikimat-Biosyntheseweg ausgeschlossen und ein Ursprung im Pentosephosphatweg vermutet werden.56a,b Im Falle der Biosynthese von Validamycin A (66) wird
Gabosin I (8), in diesem Zusammenhang als Valienon benannt, als Zwischenstufe angenommen. So wird eine Tritium-Markierung nach Verfütterung von [7-3H]-8 in beiden
Carbazucker-Untereinheiten von Validamycin A (66) gefunden. Eine Bildung von
Carbazuckerdimer 68 kann hiernach entweder über eine Imin-Zwischenstufe oder über eine
SN2-Reaktion erfolgen (Abb. 3.16).58 Bei entsprechenden Experimenten zur Untersuchung
24
Allgemeiner Teil
der Biosynthese von Acarbose wurde für 2-epi-5-epi-Valiolon (69), jedoch für kein
Ketocyclitol eine Inkorporation beobachtet.59
CH2OH
O
HO
OH
OH
OH
CH2O P
Sedoheptulose7-phosphat
OH
HO
HO
HO
OH
O
OH
2-epi-5-epiValiolon (69)
OH
HO
OH
HO
HO
O
HO
HO
OH
O
HO
OR
OH
OH
Valienon (8)
epi-Valienol R = -OH
R = aktivierende Gruppe,
z.B. -PO3H2
OH
HO
HO
IminBildung
OH
OH
HO
HO
N
OH
NH2
SN2
OH
OH
OH
OH
HO
OH
HO
OH
OH
OH
N
H
OH
Validamycin A
(66)
OH
68
Abbildung 3.16: Diskutierte Reaktionswege für die Bildung der Aminocarbazuckeruntereinheit in Validamycin A (66).58
Acarbose (65) ist der Wirkstoff des Medikamentes Glucobay®, welches zur Behandlung von
Diabetes Melitus (Diabetes Typ II) eingesetzt wird, um als kompetetiver Inhibitor von αGlucosidasen den Abbau von Disacchariden aus der Nahrung zu verlangsamen und damit
temporäre Glucosekonzentrationsspitzen im Blut zu vermeiden.60 Nach neueren Studien wird
kontrovers diskutiert, ob das Medikament außerdem den Beginn einer Zuckererkrankung
verzögern und vor Kreislauferkrankungen zu schützen vermag.61 BAYER (Leverkusen) erzielte
mit Glucobay® im Jahre 2004 einen Umsatz von etwa 278 Millionen Euro weltweit.62
Insgesamt war Glucobay® im Jahre 2004 eines der zehn umsatzstärksten Medikamente des
Konzerns. In den ersten drei Quartalen des Jahres 2005 machte der Umsatz des Wirkstoffs
222 Millionen Euro aus, was einer Steigerung von 4.2 % gegenüber dem Vorjahresvergleichszeitraum entspricht.63 Dennoch gilt unter Fachleuten die Wirksamkeit seit längerem als
umstritten.64 Die Produktion von 65 erfolgt mittels eines Actinoplanes Stamms.30
Allgemeiner Teil
25
Validamycin A (66) ist Hauptbestandteil eines seit den achziger Jahren häufig in Asien
eingesetzten Fungizids, welches zur Bekämpfung von Mehltau im Reis-, Getreide-, Zitrusfrucht- und Baumwollanbau eingesetzt wird. Die industrielle Produktion erfolgt fermentativ.65
3.8.2
Oseltamivir
Oseltamivir (67), ein synthetischer Aminocarbazucker, ist der Wirkstoff des Medikamentes
Tamiflu®. Es handelt sich hierbei um einen Hemmstoff für die viral codierte Neuraminidase,
welche für die Replikation des Virus in der Gastzelle essentiell ist. Im Zuge der sich zur Zeit
nach Europa ausbreitenden Vogelgrippe und der Angst vor einer Pandemie stellt Tamiflu®
neben Relenza® eines von zwei antiviralen Medikamenten dar, die zur Behandlung von
Grippekrankheiten zur Verfügung stehen. Während das Vogelgrippevirus selbst zwar in Ausnahmefällen Menschen infizieren kann und dabei in vielen Fällen tödlich verläuft, ist die
Übertragung von Mensch zu Mensch bislang noch nicht belegt worden. Durch Genaustausch
des Vogelgrippeerregers des Typs H5N1 mit einem von Mensch zu Mensch übertragbaren,
humanen Grippevirus könnte allerdings ein neues Grippevirus entstehen, welches das Potential besitzt, die befürchtete Pandemie auslösen zu können.
Das Unternehmen ROCHE (Basel), welches das Medikament Tamiflu® vertreibt, erzielte im
Jahr 2005 eine deutliche Absatzsteigerung, da viele Länder auf Anraten der WHO einen
Vorrat an Tamiflu® anlegen.66 Betrug der Umsatz mit Tamiflu® im Jahre 2004 noch 330
Millionen CHF, so wuchs der Umsatz für die ersten drei Quartale des Jahres 2005 auf 859
Millionen CHF.67 Die Kapazitäten zur Produktion sind ausgereizt, so dass Sublizenzen zur
Produktion des Wirkstoffs an indische und chinesische Unternehmen erteilt wurden.68
Ausgangsmaterial für die Synthese von 67 sind Shikimat (15), welches überwiegend aus
Sternanis isoliert wird, oder die preiswertere Chinasäure (13), die als Nebenprodukt bei der
Extraktion der Rinde des Chinabaumes anfällt. Die bereits in Kapitel 3.3 aufgezeigten
alternativen Zugänge über biotechnologisch mit modifizierten E. coli Stämmen gewonnenes
Shikimat (15) spielen zur Zeit eine untergeordnete Rolle, könnten künftig aber ausgebaut
werden.69
In der Literatur wird eine Synthese von 67 ausgehend von 15 vorgestellt, welche in dieser
Form in Maßstäben von 50 bis 250 kg mit Epoxid 70 als Schlüsselintermediat durchgeführt
wurde (Abb. 3.17).70
26
Allgemeiner Teil
MeO OMe
HO
CO2H EtOH, SOCl2
Reflux
HO
97 %
HO
CO2Et
HO
kat. TsOH
EtOAc, rt
CO2Et
O
MsCl, NEt3
EtOAc, 0 °C
O
95 %
O
89 %
OH
OH
OH
15
71
72
CO2Et
O
OMs
73
Pentanon, kat. CF3SO3H
98 %
O
CO2Et
HO
CO2Et
+
HO
Et3SiH, TiCl4
-34 °C
O
O
OMs
75
CO2Et
O
OMs
76
32
:
OMs
74
1
NaHCO3, EtOH / H2O, 60 °C
80 % für zwei Stufen
O
CO2Et
O
a) Allylamin, MgBr2 × Et2O
TBME / CH3CN 9 : 1
55 °C, 16 h
b) (NH4)2SO4, H2O
O
CO2Et
HO
HN
97 %
70
77
a) Pd/C, H2NCH2CH2OH
EtOH, Reflux, 3 h
b) H2SO4, H2O
O
CO2Et
H2N
a) PhCHO, TBME
b) MsCl, NEt3
c) Allylamin, 112 °C, 15 h
d) HCl, H2O
77 %
O
HO
80 %
HN
CO2Et
NH2
79
78
Ac2O, AcOH, MsOH
TBME, 20 °C, 15 h
83 %
O
CO2Et
AcHN
HN
a) 10 % Pd/C, H2NCH2CH2OH
EtOH, Reflux, 3 h
b) 85 % H3PO4, EtOH
70 %
80
O
CO2Et
AcHN
NH2
∗ H3PO4
67
Abbildung 3.17: Synthese von Oseltamivir (67) im 50-250 kg Maßstab.70
Bei dieser Synthese wird 67 in 11 Stufen in einer Ausbeute von 22 % bezogen auf das
eingesetzte Shikimat (15) erhalten. Auffällig an der gezeigten Syntheseroute zu Epoxid 70 ist,
dass zunächst ein Acetonid gebildet wird, welches wenig später in ein 3-Pentyliden-Ketal
überführt wird. Begründet wird diese zusätzliche Stufe damit, dass 72 eine kristalline
Verbindung ist, welche eine einfache Aufreinigung erlaubt. Wird hingegen gleich ein 3Pentyliden-Ketal gebildet, kann das ölige Produkt nicht in großem Maßstab aufgereinigt
werden und führt zu Qualitätsproblemen. Das 3-Pentyliden-Ketal 74 wird reduktiv zum 3-
Allgemeiner Teil
27
Pentanylether 75 umgesetzt. Als Nebenprodukt im Verhältnis 1 : 32 wird Regioisomer 76
erhalten. Nach einer intramolekularen SN-Reaktion unter Substitution des Mesylatrestes wird
Schlüsselverbindung 70 erhalten. Die Stickstoffsubstituenten werden nacheinander eingeführt. Zunächst wird Epoxid 70 durch nucleophile Öffnung mit Allylamin und reduktive
Spaltung des Allylrestes in β-Aminoalkohol 77 überführt. Dieser wird nach Schützen der
Aminofunktion und Aktivieren des Alkohols zum Aziridin umgesetzt, welches analog zu
Epoxid 70 mit Allylamin nucleophil zu 79 geöffnet wird. Nach Acetylierung des primären
Amins und reduktiver Spaltung des Allylamins wird Oseltamivir (67) aus ethanolischer
Lösung als Dihydrogenphosphat-Salz kristallisiert.
Neben dieser in technischem Maßstab durchgeführten Synthese sind weitere Synthesen von
67, die zum Teil nur im Labormaßstab vollzogen wurden, beschrieben. Als Strategien
kommen dabei Diels-Alder-Reaktionen als Schlüsselschritt zum Aufbau eines Cyclohexenrings71 (Abb. 3.18 A) wie auch die Hydrierung funktionalisierter Aromaten und Desymmetrisierung des erhaltenen, funktionalisierten Cyclohexans71a (Abb. 3.18 B) oder die Desymmetrisierung von meso-Aziridinen72 (Abb. 3.18 C) zum Einsatz.
O
CO2Et
A
AcHN
OEt
O P N
OEt
CO2Et
O
EtO P
N
EtO
OH
NH2
∗ H3PO4
67
O
81
82
OH
O
B
O
CO2Et
CO2Et
O
AcHN
NH2
∗ H3PO4
67
C
AcHN
O
CO2Et
MeO
CO2H
CO2Et
86
N3
NHBoc
87
O
O
NO2
N
H
NHBoc
88
OMe
CO2Et
85
NC
NH2
∗ H3PO4
67
84
OH
O
O
CO2Et
83
HO
NH
O
O
CO2Et
O
EtO2C
+
NO2
N
NO2
NO2
89
90
Abbildung 3.18: Strategien zur Synthese von Oseltamivir (67) A nach Karpf und
Mitarbeitern;71a B nach Wirz und Mitarbeitern;71a C nach Shibasaki und
Mitarbeitern.72
28
Allgemeiner Teil
3.9 Chemische Synthese von Carbazuckern und Cyclitolen
In der Literatur sind vielfältige Synthesestrategien zum Aufbau polyfunktionalisierter
Cyclohexene publiziert (Abb. 3.19).
Einige häufig racemisch durchgeführte Synthesen beginnen mit bicyclischen Verbindungen,
die mittels Diels-Alder-Reaktionen erhalten und nach Funktionalisierung zu substituierten
Cyclohexenen geöffnet werden.73,47 Andere Synthesen gehen von in großem Maßstab zugänglichen Verbindungen des "chiral pool" wie Zuckern oder den Produkten strukturell ähnlichen
Metaboliten des Shikimat-Biosyntheseweges aus.74 Während der Schlüsselschritt bei Synthesen, welche mit Zuckern starten, in der Bildung eines Cyclohexenrings liegt, verlaufen Synthesen, die von Substanzen wie Shikimat ausgehen, welche bereits einen zyklischen C6Körper enthalten, geradliniger. Eine dritte Gruppe von Synthesen geht von funktionalisierten
Aromaten aus. Diese können mittels Birch-Reduktion in funktionalisierte 1,4-Cyclohexadiene
überführt und mit asymmetrischen Methoden enantioselektiv umgesetzt werden,75 oder über
Ganzzellbiotransformation enantioselektiv zu funktionalisierten Cyclohexadien-cis-diolen
oxidiert werden (siehe Kapitel 3.10.1).
Neben Synthesen, die direkt von funktionalisierten Cyclohexadienen ausgehen, treten solche
Verbindungen auch als Zwischenprodukte in verschiedenen Naturstoffsynthesen auf (vgl.
Kap. 3.10).
aus Aromaten mittels Reduktion oder
Oxidation erhaltene funktionalisierte Cyclohexadiene
I
SiMe2OH
OH
OH
OH
O
O
HO
OH
OH
ungesättigte
C7-Cyclitole
OH
bicyclische, mittels
Diels-Alder-Reaktion
gewonnene Edukte
CO2H
OH
O
HO
OH
OH
Shikimat und andere
Metabolite des ShikimatBiosynthese-Weges
Glucose oder
andere Zucker
O
Edukte des
"chiral pool"
CO2H
Abbildung 3.19: Auswahl der in der Synthese ungesättigter Carbazucker eingesetzten
Edukte.
Allgemeiner Teil
29
Synthesen, die von Zuckerverbindungen ausgehen, erlauben häufig durch Variation der
Ausgangsverbindung Zugang zu Produkten unterschiedlicher absoluter Konfiguration.
Weiterhin sind die Ausgangsverbindungen einfach und in vielen Fällen preiswert erhältlich.
Nachteile dieser Synthesen sind jedoch der hohe Aufwand, der bis zur Ringschlussreaktion
betrieben werden muss. Beispielhaft sei die Synthese von Gabosin I (8) ausgehend von
2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranose (91) nach Lubineau und Billault vorgestellt (Abb.
3.20).50 Nach Bildung von Keton 93 wird mittels Wittig-Reaktion Vinylbromid 94 erzeugt.
Dieses wird im ringschließenden Schlüsselschritt dieser Sequenz mittels Nozaki-KishiReaktion in Gegenwart von Chrom(II)chlorid und Nickel(II)chlorid umgesetzt. Die erhaltenen
Alkohole 96 werden mit Pyridiniumchlorchromat (PCC) zum geschützten Gabosin I oxidiert.
Abschließend werden die Benzylether mit Bortrichlorid gespalten und Carbazucker 8
freigesetzt. Die Synthese von 8 erfolgt über 9 Stufen in einer Gesamtausbeute von 15.5 %.
OBn
BnO
a) NaBH4, THF-H2O, 98 %
b) TBSCl, Pyridin, 97 %
O
BnO
OBn
OH
BnO
OH
BnO
OBn
91
OBn
PCC, NaOAc, MS 4 Å
CH2Cl2, 90 %
OTBS
BnO
O
BnO
OBn
92
OTBS
OBn
93
Ph3PCHBr, THF, 74 %
OBn
OBn
BnO
CrCl2, 0.1 % NiCl2
DMF, 61 %
BnO
OH
OBn
BnO
BnO
Br
CHO
OBn
95
96
OBn
a) TBAF, THF, 80 %
b) Swern-Oxidation, 89 %
BnO
Br
BnO
OTBS
OBn
94
a) PCC, NaOAc, MS 4 Å
CH2Cl2, 76 %
b) BCl3, CH2Cl2, 74 %
OH
HO
HO
O
OH
8
Abbildung 3.20: Synthese von Gabosin I (8) ausgehend von 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-Dglucopyranose (91) nach Lubineau und Billault.50
Singh und Mitarbeiter synthetisierten Carbazucker 68, der die ursprünglich für Gabosin K
angenommene Struktur aufweist, ausgehend von Shikimat (15) (Abb. 3.21).52 Hierzu wurde
nach Schutzgruppeneinführung durch Eliminierung von Trifluormethansulfonsäure Dien 88
erhalten, welches katalytisch mit Osmium(VIII)oxid zu Diol 99 oxidiert wird. Diese
Oxidation verläuft nicht regioselektiv, und neben 99 wird Diol 100 in etwa gleichem Maße
30
Allgemeiner Teil
gebildet. Nach Trennung beider Diole wird 99 mit 2,2-Dimethoxypropan säurekatalysiert in
Acetonid 101 überführt. Die Synthese wird mit der Reduktion der Esterfunktion zum
primären Alkohol mittels Di-iso-butylaluminiumhydrid (DIBAL-H), Acetylierung des freien
Alkohols und Spaltung der Acetonide abgeschlossen. Hierbei wird 68 über 6 Stufen in einer
Gesamtausbeute von 16.4 % bezogen auf das eingesetzte Shikimat (15) erhalten.
a) CSA, MeOH, reflux
10 h, 96 %
b) CMe2(OMe)2, CSA, rt
2 h, 95 %
CO2H
HO
CO2Me
O
OH
a) Tf2O, DMAP, Pyridin,
CH2Cl2, -20 °C, 40 min
98 %
b) CsOAc, DMF, rt
2 h, 81 %
OH
15
OH
CO2Me
O
O
O
97
98
OsO4, NMO
tBuOH - H2O (10:1)
rt, 8 h
38 % 89, 35 % 90
CO2Me
O
CO2Me
OH
CMe2(OMe)2, CSA
rt, 3 h
98 % bezogen auf 89
O
O
O
O
101
OH
O
99
HO
+
CO2Me
HO
O
O
100
DIBAL-H, THF
-10 °C, 1.5 h, 99 %
OH
O
O
O
O
102
a) Ac2O, DMAP, Pyridin
CH2Cl2, rt, 2.5 h, 93 %
b) aq. AcOH (80 %)
60 °C, 4.5 h, 66 %
OAc
OH
HO
OH
OH
68
Abbildung 3.21: Synthese der für Gabosin K angenommenen Struktur 68 nach Singh et
al.52
Hudlicky und Entwistle stellen die Synthese der peracetylierten pseudo-Hexapyranose 103
ausgehend von Iodcyclohexadien-cis-diol 104 vor (Abb. 3.22).76 Diol 104 wird zunächst
säurektalysiert mit 2,2-Dimethoxypropan in Acetonid 95 überführt. Durch OsO4-katalysierte
Oxidation einer Doppelbindung in 105 wird stereo- und regioselektiv eine cis-DiolFunktionalität eingeführt. Nach Überführen des erhaltenen Diols in Acetonid 106 und
Substitution von Iod gegen Lithium wird durch Reaktion mit Kohlendioxid eine
Säurefunktion installiert und dabei der C7-Grundkörper erhalten. Die Säure wird mit
Iodmethan zum Methylester 101 umgesetzt und abschließend mit DIBAL-H nach Hydrogenolyse der Doppelbindung zum primären Alkohol 107 reduziert. Nach saurer Hydrolyse der
Acetonidfunktion und peracetylierung des erhaltenen Pentols wird Verbindung 103 erhalten.
Allgemeiner Teil
31
Anders als in den zuvor dargestellten Beispielen wird ein gesättigter Carbazucker erhalten. Da
jedoch in dieser und der Synthese von Singh und Mitarbeitern die identische Zwischenstufe
101 durchlaufen wird, kann formal eine Synthese des ungesättigten Carbazuckers 68
formuliert werden. Die Umsetzung von Dien 104 zu Bisacetonid 101 erfolgt in 5 Stufen mit
einer Ausbeute von 67.5 %, so dass für die formale achtstufige Synthese von Carbazucker 68
eine Ausbeute von 41.0 % bezogen auf Dien 104 angenommen werden kann.
I
OH
CMe2(OMe)2, TsOH
O
O
O
O
OH
I
a) OsO4, NMO, tBuOH, H2O
b) CMe2(OMe)2, TsOH
75 % für drei Stufen
I
O
O
106
105
104
a) tBuLi, Et2O, -78 °C, CO2
b) MeI, K2CO3, Me2CO, 90 %
OAc
OAc
AcO
OH
a) Amberlite 15 saures Ionentauscherharz, MeOH, H2O
b) Ac2O, DMAP, Pyridin, 89 %
O
O
OAc
OAc
103
a) Pd/C, H2 (ca. 3.5 kPa)
EtOAc, 92 %
b) DIBAL-H, PhMe
78 °C, 74 %
O
CO2Me
O
O
O
107
O
O
101
Abbildung 3.22: Synthese des peracetylierten Carbazuckers 103 nach Hudlicky und Entwistle.76
3.10 Cyclohexadiendiole (CHD)
Am Diensystem funktionalisierte Cyclohexadiendiole stellen als chirale und mit
unterschiedlich reaktiven Doppelbindungen flexibel zu modifizierende Verbindungen hervorragende Ausgangsmaterialien in der organischen Synthese dar (Abb. 3.23). Je nach relativer
Stereochemie der Diolfunktion wird zwischen cis- oder trans-CHD unterschieden. Für die
organische Synthese wäre ein flexibeler Zugang zu allen vier möglichen absoluten
Konfigurationen der Diolfunktion wünschenswert.
R
OH
R
OH
OH
OH
cis-CHD
R
OH
R
OH
OH
OH
trans-CHD
Abbildung 3.23: Schematische Darstellung aller möglichen relativen und absoluten
Konfigurationen von cis- und trans-CHD.
32
Allgemeiner Teil
In der Literatur gibt es vielfältige Beispiele für Substanzen, in deren Synthese CHD eine
zentrale Rolle spielen. In Abbildung 3.24 sind einige Beispiele für solche Produkte
abgebildet.77,78
O
A
OH
OH
HN
HO
OH
OH
Mannojirimycin (108)
O
O
HO
OH
HO
OH
OH
B
H2N
OH
OH
Valienamin (64)
HO
C13H27
NH2
OH
allo-Inositol (110) D-erythro-Sphingosin (111)
OH
OH
O
Zeylena (113)
N
(-)-Trihydroxyheliotridan (109)
OBz
O
OH
H
CH3 OH N(CH )
3 2
H
H
OH
OH
O
O
OBz
OAc
OAc
iso-Crotepoxid (114)
O
OBz
OAc
OAc
Senepoxid (115)
NH2
O
OH O
OH O
O
H
(-)-Doxytetracyclin (112)
CO2H
O
CO2H
OH
Chorismat (3)
Abbildung 3.24: Beispiele für Produkte, die über CHD synthetisiert wurden; A Synthesen
über cis-CHD;77 B Synthesen über trans-CHD;78 113 wurde ausgehend
von einem cis-CHD über ein trans-CHD synthetisiert.
Dabei wird die große Bandbreite unterschiedlicher Substanzklassen deutlich, die aus CHD
abgeleitet werden können. cis-CHD sind einfacher zugänglich und als chirale Bausteine
länger etabliert als trans-CHD. Dies spiegelt sich auch in der strukturellen Vielfalt der
erhaltenen Produkte wider, in welchen die Struktur des eingesetzten cis-CHD so weit
modifiziert wurde, dass diese nicht gleich wiederzuerkennen ist. So wurden neben
Carbazuckern auch Lactame77a und Heterocyclen,77b offenkettige Systeme77d oder Tetracycline77e ausgehend von enantiomerenreinen cis-CHD synthetisiert (Abb. 3.24 A).
Der Zugang zu trans-CHD war bislang limitiert und kompliziert, so dass für diese
Substanzklasse erst wenige Beispiele für Synthesen, in deren Verlauf trans-CHD verwendet
wurden, bekannt sind (Abb. 3.24 B). Einige Cyclitole und Epoxycyclitole wie Valienamin
(64)78b oder Senepoxid (115)78d wurden über Synthesen mit enantiomerenreinen trans-CHD
als Zwischenstufen erhalten. iso-Crotepoxid wurde ausgehend von mikrobiell produziertem 4
synthetisiert.78c In einigen Fällen wurden trans-CHD oder direkt davon abgeleitete Strukturen
wie Chorismat (3)78e in zum Teil racemischer Form zur Untersuchung biologischer Fragestellungen synthetisiert.
Allgemeiner Teil
33
3.10.1 Biokatalytischer Zugang zu funktionalisierten cis-CHD
Funktionalisierte cis-CHD sind als chirale Bausteine in der organischen Synthese etabliert,
einfach zugänglich und kommerziell erhältlich.c Gewonnen werden cis-CHD aus aromatischen, mit Halogenen, Alkylgruppen oder Säurefunktionen substituierten Kohlenwasserstoffen, die in einer Ganzzelltransformation mit einer bakteriellen Toluendioxygenase oder
verwandten Enzymen oxidiert werden.79 Gefunden wurde das Enzym Toluendioxygenase in
Pseudomonas putida F1, einem Mikroorganismus, der mit Benzen oder Toluen als einziger
Kohlenstoffquelle wachsen kann. Hierbei wird Benzen zunächst zu cis-CHD 116 oxidiert,
welches zu Brenzkatechin (40) weiteroxidiert wird und in den Stoffwechsel eingeht (Abb.
3.25 A). Die Mutante P. putida F39/D besitzt keine funktionsfähige cis-Dioldehydrogenase,
vermag daher diese Folgreaktion nicht zu katalysieren und akkumuliert cis-CHD 116 im
Medium (Abb. 3.24 B).
Toluendioxygenase
OH
A
cis-Dioldehydrogenase
OH
OH
OH
116
Toluendioxygenase
40
OH
B
cis-Dioldehydrogenase
OH
116
Abbildung 3.25: Oxidation von Benzol mit unterschiedlichen Stämmen von Pseudomonas
putida; A P. putida F1; B P. putida F39/D.79
Das hierfür entscheidende Enzym Toluendioxygenase wie auch weitere Dioxygenasen
anderer Mikroorganismen sind identifiziert, charakterisiert und optimiert worden, so dass
verschiedene Enzyme rekombinant zur Verfügung stehen, die eine Oxidation unterschiedlicher Aromaten zu substituierten cis-CHD erlauben (Abb. 3.26). Diese Oxidationen erfolgen
in vielen Fällen mit hoher Enantioselektivität.
c
cis-CHD werden von verschiedenen Anbietern vertrieben. Katalogpreise Aldrich 2005/2006: (1S-cis)-3Chlorcyclohexadien-1,2-diol: 187.30 €/g; (1S-cis)-3-Bromcyclohexadien-1,2-diol: 200.40 €/g.
34
Allgemeiner Teil
I
OH
OH
OH
OH
121
OH
119
HO2C OH
OH
CO2H
OH
OH
CH3
118
OH
Br
OH
OH
Br
117
CO2H
OH
CH3
120
HO2C OH
OH
OH
Cl
122
123
124
Abbildung 3.26: Auswahl verschiedener cis-CHD, die durch enzymatische Oxidation von
aromatischen Kohlenwasserstoffen gebildet wurden.79
Die Enantioselektivität der enzymatischen Oxidation wird durch den sterischen Anspruch von
Substituenten am zu oxidierenden Aromaten bestimmt. Durch geschickte Wahl von Edukt
und Folgereaktionen lässt sich Zugang zu enantiomeren cis-CHD erhalten. Die mikrobielle
Oxidation von Brombenzen (125) mit P. putida UV4 führt zu enantiomerenreinem (2S,3S)-1Brom-2,3-dihydroxy-2,3-dihydrobenzen (120).80 Boyd und Mitarbeiter konnten das aus der
mikrobiellen Oxidation von 1-Brom-4-iodbenzen (126) entstandene cis-CHD 117 hydrogenolytisch zu ent-110 umsetzen (Abb. 3.27). Dabei ist der in der mikrobiellen Oxidation erzielte
Enantiomerenüberschuss mit 22 % gering. Wird das Enantiomerengemisch in einem zweiten
Fermentationsschritt von P. putida NCIMB 8859 umgesetzt, so wird 120 selektiv zu 1-Brom2,3-dihydroxybenzen oxidiert, und ent-120 verbleibt mit hohem Enantiomerenüberschuss, in
einer Ausbeute von 30 %.81
Br
Br
E. coli JM 109
(pDTG601A)
Br
OH
HO
OH
HO
120 (99 % ee)
125
ent-120 (99 % ee)
P. putida
NCIMB 8859
I
E. coli JM 109
(pDTG601A)
I
OH
OH
Br
126
Br
117 (22 % ee)
OH
H2, Pd/C
OH
Br
ent-120 (22 % ee)
Abbildung 3.27: Darstellung beider Enantiomere von 120 nach Boyd et al.80,81
Allgemeiner Teil
35
3.10.2 Biologischer Zugang zu funktionalisierten trans-CHD
3.10.2.1 trans-CHD als Abbauprodukte von Aromaten
trans-CHD werden in der Natur als Abbauprodukte von Aromaten in eukaryontischen Zellen
gebildet. trans-CHD 101 wurde in geringen Mengen neben weiteren Metaboliten wie Muconsäure, Brenzkatechin (40), Phenol (43) oder Benzochinon beim in vivo Abbau von Benzen aus
dem Urin von Hasen isoliert,82 und in vitro konnte die Bildung mit Mikrosomen aus
Hasenleberzellen nachvollzogen werden (Abb. 3.28).83 Ähnliche Umsetzungen werden auch
für substituierte Aromaten wie beispielsweise Chlorbenzen beobachtet.
im Hasen in vivo
metabolisiert
i
ii
O
OH
O
125
OH
127
126
mit Mikrosomen aus Rattenleberzellen
und Epoxidhydrolase in vitro umgesetzt
Abbildung 3.28: Teilschritte des Abbaus aromatischer Systeme in Säugetierzellen; i Oxidation mittels Monooxygenase; ii Epoxidhydrolase.82,83
Der oxidative Abbau des aromatischen Systems beginnt mit der Oxidation mittels Monooxygenase,84 einem Cytochrom P450-Enzym, zu Benzenoxid (125). Boyd und Mitarbeiter
untersuchten die säurekatalysierte Aromatisierung von 125 im Vergleich zur säurekatalysierten Dehydratisierung von Cyclohexadienol (128) (Abb. 3.29).
H3O+
OH
O
125
H3O+
langsamer
- H2O
schneller
OH
128
43
Abbildung 3.29: Benzenoxid (125) aromatisiert in saurer Lösung langsamer als Cyclohexadienol 128.85
Während aliphatische Epoxide in saurer Lösung in der Regel reaktiver sind als aliphatische
Alkohole, erweist sich Benzenoxid (125) als stabiler als Cyclohexadienol (128).85 Aufgrund
der
gefundenen
unerwartet
geringen
Reaktivität
wird
eine
wenigstens
teilweise
36
Allgemeiner Teil
homoaromatische Stabilisierung postuliert.85 Verbindungen dieses Typs sind so stabil, dass es
Boyd und Mitarbeitern gelang, substituierte Benzenoxide als Metaboliten des Abbaus von
para-Halogenbenzoesäuren aus einem Pilz zu isolieren.86 In einer von verschiedenen möglichen Folgereaktion wird Benzenoxid (125) von einer Epoxidhydrolase zu trans-CHD 127
umgesetzt. Dabei wird sowohl in vivo wie auch in vitro bevorzugt das (R,R)-Enantiomer
gebildet, wobei in vitro ein Enantiomerenüberschuss von etwa 50 % gefunden wird; für in
vivo gewonnenes trans-CHD wurde der Enantiomerenüberschuss nicht ermittelt.87 Eine nichtenzymatische Hydrolyse zu racemischem trans-CHD wird unter den angewandten Versuchsbedingungen nicht beobachtet. Bislang ist es nicht gelungen, diese Reaktion zur präparativen
Produktion von trans-CHD einzusetzen.
3.10.2.2 trans-CHD als Metabolite in Mikroorganismen
Neben dem enzymatischen Abbau von Aromaten werden trans-CHD auch als Metabolite in
der Aromatenbiosynthesen in Mikroorganismen gefunden. 2,3-trans-CHD (4) wird als Metabolit in der Biosynthese von Enterobactin (129), einem Siderophor aus E. coli, gefunden
(Abb. 3.30).88
CO2H
CO2H
EntC / MenF
Mg2+
O
CO2H
EntB
OH
CO2H
O
CO2H
OH
Chorismat (3)
OH
Pyruvat
Isochorismat (22)
CO2H
EntA
OH
OH
3 NAD+ 3 NADH
2,3-trans-CHD (4)
OH
2,3-Dihydroxybenzoesäure (130)
OH
O
HO
HO
O
OH HN
H
N
O
O
O
O
O
O
O
NH
OH
OH
Enterobactin (129)
Abbildung 3.30: Die ersten enzymatischen Schritte der Enterobactin-Synthese aus Chorismat (3); EntC, MenF: Isochorismat Synthase, EntB: Isochorismat Lyase;
EntA: 2,3-Dihydroxy-2,3-dihydrobenzoat Dehydrogenase.
Allgemeiner Teil
37
Enterobactin (129) wird von E. coli in Eisen-armer Umgebung gebildet und exkretiert, um
Eisenionen zu chelatisieren und als Komplex in die Zelle aufzunehmen.89 Dabei katalysieren
Isochorismat Synthasen (EntC, MenF) in Gegenwart von Magnesiumionen einleitend die
reversibele Umlagerung von Chorismat (3) zu Isochorismat (22), welches durch Spaltung des
Enolpyruvylethers durch Isochorimat Lyase (EntB) zu 2,3-trans-CHD (4) umgesetzt und dem
Gleichgewicht entzogen wird. 4 wird mittels 2,3-Dihydroxy-2,3-dihydrobenzoat Dehydrogenase (EntA) zu 2,3-Dihydroxybenzoesäure (131), einem Vorläufer von Enterobactin (129),
aromatisiert.
Die enzymatische Umsetzung von Chorismat (3) mit Isochorismat Lyase (EntB) führt zur
Hydrolyse des Enolethers unter Freisetzung von 3,4-trans-CHD (5) und Pyruvat (Abb. 3.31).
Chorismat (3) wird nach Untersuchungen von Walsh und Mitarbeitern von Isochorismat
Lyase zwar als Substrat akzeptiert, der Km-Wert liegt jedoch um etwa den Faktor 2500 über
dem für das natürliche Substrat Isochorismat (22) gefundenen.90 Im Wildtyp ist die
Chorismatkonzentration jedoch so gering, dass 5 in E. coli natürlicherweise nicht gefunden
werden kann. 5 wurde jedoch als Metabolit im Medium von unter Eisenmangel gewachsenen
Klebsiella pneumoniae (ehemals bezeichnet als Aerobacter aerogenes) nachgewiesen.91
ShikimatBiosyntheseweg
CO2H
CO2H
EntC / MenF
Mg2+
EntB
OH
OH
Pyruvat
3,4-trans-CHD (5)
O
CO2H
OH
Chorismat (3)
CO2H
CO2H
OH
O
EntB
CO2H
Isochorismat (22)
OH
OH
Pyruvat
2,3-trans-CHD (4)
Abbildung 3.31: Biosynthese von 5 und 4 aus Chorismat (3); EntB: Isochorismat Lyase;
EntC, MenF: Isochorismat Synthase.
In den Biosynthesen von Ansatrienin A (131) und Ascomycin (132), zweier Sekundärmetabolite verschiedener Streptomyces Arten, fungieren Cyclohexancarbonsäure beziehungsweise die zu 3,4-trans-CHD analoge Cycohexandiolcarbonsäure als Startereinheit für die
Polyketidsynthese der Makrolactone (Abb. 3.32).14
38
Allgemeiner Teil
MeO
O
Me
MeO
Me
HO
O
O
O
O
OH
O
N
Me
O
O
H
N
Me
NH
Me
H
Et
OMe
O
OH
O
O
OMe
O
Me
Me
Me
OH
Ascomycin (132)
Ansatrienin A (131)
Abbildung 3.32: Die polyketidischen Naturstoffe Ansatrienin A (131) und Ascomycin
(132), die eine mono- oder trisubstituierte Cyclohexaneinheit mit Ursprung aus dem Shikimat-Biosyntheseweg enthalten; diese Substituenten
sind in den Strukturen der Naturstoffe hervorgehoben.
Die Biosynthesen der Startereinheiten konnten von Reynolds, Floss und Mitarbeiter durch
Verfütterungsexperimente mit isotopenmarkierten Substanzen aufgeklärt werden.92 In beiden
Fällen konnte der Einbau von Shikimat (15) und 3,4-trans-CHD (5) nachgewiesen werden.
Floss und Moore konnten nachweisen, dass Chorismat (3) im Falle von Ansatrienin A (131)
nicht eingebaut wird, und dass die Biosynthese von 5 folglich direkt aus Shikimat (15) oder
Shikimat-5-phosphat erfolgt (Abb. 3.33).93
CO2H
CO2H
AnsK
ChcA
AnsJ
HO
OH
COSCoA
AnsL
OH
OH
OH
OH
15
COSCoA
OH
OH
133
5
134
AnsM
COSCoA
ChcB
ChcA
COSCoA
COSCoA
AnsJ (?)
COSCoA
ChcA
OH
138
137
136
OH
135
Abbildung 3.33: Angenommene Biosynthese der Polyketid-Startereinheit 138 von Ansatrienin A (131).14,94
Angenommen wird, dass 5 über eine stereoselektive 1,4-anti-Eliminierung von Wasser aus
Shikimat (15) erhalten wird. Ein Enzym, welches diesen Schritt katalysiert, konnte bislang
nicht identifiziert werden. Aufgrund von Sequenzvergleichen wird jedoch vermutet, dass das
Enzym AnsJ, welches Homologien zu 3-Enolpyruvylshikimat-5-phosphat Synthase aufweist,
Allgemeiner Teil
39
die Dehydratisierung katalysiert.14,94 5 wird in einen Coenzym A-Thioester (CoA-Thioester)
überführt und in mehreren Schritten zu 138 dehydratisiert und reduziert.
In analoger Weise wird die Biosynthese der Startereinheit für die polyketidische Biosynthese
von Ascomycin (132) und verwandter Makrolactone aus Streptomyces hygroscopicus
angenommen (Abb. 3.34).95
CO2H
CO2H
CO2H
i
HO
CO2H
ii
OH
iii
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
15
5
139
140
Abbildung 3.34: Angenommene Biosynthese der Polyketid-Startereinheit 140 von
Ascomycin (132);95 i 1,4-anti-Eliminierung von Wasser, ii Reduktion der
dreifach substituierten Doppelbindung und anschließende Isomerisierung,
iii Reduktion der verbliebenen Doppelbindung.
Anders als für Ansatrienin A (131) wird angenommen, dass kein CoA-Thioester gebildet wird
und statt dessen die freie Säure 5 zu 140 reduziert wird. Da für 139 deutlich höhere Einbauraten in 132 gefunden werden als für 140, wird vermutet, dass 139 die eigentliche Startereinheit der Polyketidsynthese darstellt. Der Einbau von 140 hingegen deutet auf ein breites
Substratspektrum einer Carbonsäureligase hin, welche für die Aktivierung und Bindung der
Startereinheit an Polyketidsynthesecluster verantwortlich gemacht wird.95b
3.10.3 Mikrobielle Produktion von trans-CHD
Bei Untersuchungen zur Siderophor-Biosynthese in Klebsiella pneumoniae fanden Young
und Gibson 2,3-trans-CHD (4) als Metabolit.96 Nach Identifizierung des der Biosynthese von
Enterobactin (129) zugrunde liegenden Genclusters,88a,97 konnten durch Leistner und
Mitarbeiter mit rekombinanten K. pneumoniae Stämmen 2,3-trans-CHD (4) und 3,4-transCHD (5) in Konzentrationen von 0.2 g × L-1 und 0.15 g × L-1 produziert werden.98 Die hierbei
eingesetzten Mikroorganismen weisen zwei für die Produktion dieser Metabolite wichtige
Eigenschaften auf. Einerseits besitzen sie Defizite in der Biosynthese aromatischer
Aminosäuren, welche einen Abfluss von Chorismat (3) in deren Biosynthese verhindern, und
andererseits wurden Gene des Enterobactin-Biosyntheseweges überexpremiert. Ein gravierender Nachteil der eingesetzten Organismen liegt in ihrer potentioell patogenen Natur.99
40
Allgemeiner Teil
Mit dieser Strategie konnten in unserer Arbeitsgruppe von Dr. D. Franke 4 und 5 mit
rekombinanten, nicht patogenen E. coli-Stämmen produziert werden.12,100 Grundlage für einen
Produzenten von 4 ist der Stamm AN193, der einen Defekt im chromosomalen Gen entA
aufweist, welches für 2,3-Dihydro-2,3-dihydroxybenzoat Dehydrogenase codiert. Bei
Kultivierung im Minimalmedium unter Komplementierung mit essentiellen Substanzen wird
bei Überexpression der Gene entC (Isochorismat Synthase) und entB (Isochorismat Lyase) in
40 Stunden eine Konzentration von 4.6 g × L-1 4 im Medium erzielt (Abb. 3.35).12,100a
CO2NH3+
O
CO2-
HO2C
O
CO2H
OH
18
TyrA
PheA
PabA
PabB
PabC
TrpE
TrpD
OH
NH3+
23
20
MenD
CO2H
EntC / MenF
Mg2+
ShikimatBiosyntheseweg
O
CO2H
OH
OH
OH
HO2C
19
CO2H
CO2H
130
EntA
CO2H
CO2H
OH
O
EntB
CO2H
OH
OH
Pyruvat
Chorismat (3)
Isochorismat (22)
2,3-trans-CHD (4)
UbiC
HO2C
OH
21
Abbildung 3.35: Von Dr. D. Franke genutzte Strategie zur mikrobiellen Produktion von
2,3-trans-CHD (4).12,100a
Wird mit E. coli BN117 ein Stamm eingesetzt, der aufgrund chromosomaler Defekte
Chorismat (3) weder zu Prephenat (18) noch zu para-Aminobenzoat (20) oder Anthranilat
(19) umsetzten kann und daher einen geringeren Abfluss von Chorismat in konkurrierende
Biosynthesen als der Wildtyp aufweist, so wird nach Expression des Gens entB (Isochorismat
Lyase) Chorismat (3) zu 3,4-trans-CHD (5) umgesetzt, welches in Konzentrationen von
790 mg × L-1 im Kulturmedium gefunden wird (Abb. 3.36).12,100b
Allgemeiner Teil
41
CO2NH3+
O
CO2-
HO2C
O
CO2H
19
PabA
PabB
PabC
18
TyrA
PheA
NH3+
20
130
EntA
ShikimatBiosyntheseweg
CO2H
EntC / MenF
Mg2+
O
CO2H
O
Chorismat (3)
UbiC
CO2H
OH
OH
OH
OH
23
MenD
CO2H
CO2H
OH
HO2C
TrpE
TrpD
OH
CO2H
EntB
CO2H
Isochorismat (22)
OH
OH
Pyruvat
2,3-trans-CHD (4)
EntB
HO2C
Pyruvat
CO2H
OH
21
OH
OH
3,4-trans-CHD (5)
Abbildung 3.36: Von Dr. D. Franke genutzte Strategie zur mikrobiellen Produktion von
3,4-trans-CHD (5).12,100b
3.10.4 Chemische Synthese von trans-CHD
3.10.4.1 Zugang aus cis-CHD
Da cis-CHD schon als chirale Bausteine etabliert waren, wurden einige Versuche unternommen, diese Bausteine in trans-CHD zu überführen. Zentrale Reaktion hierbei ist die Invertierung eines Stereozentrums der Ausgangsverbindung unter Mitsunobu-Bedingungen.101
Da Diene wie 120 unter den Bedingungen einer Mitsunobu-Invertierung ausschließlich
aromatisieren, muss das Diensystem zunächst geschützt werden.
Boyd und Mitarbeiter haben trans-CHD 142 durch Invertierung eines Stereozentrums der
Ausgangsverbindung cis-CHD 120 erhalten, nachdem die elektronenreichere Doppelbindung
hydriert wurde (Abb. 3.37 A).101 Der erhaltene Allylalkohol kann nach Aktivierung unter
42
Allgemeiner Teil
Mitsunobu-Bedingungen selektiv mit Acetat als Nucleophil invertiert werden. Nach
Peracetylierung wird Bisessigsäureester 141 erhalten. Durch Bromierung in allylischer
Position und Eliminierung von Bromwasserstoff wird das Diensystem wieder hergestellt. Auf
diesem Wege erhielten Boyd und Mitarbeiter in einer siebenstufigen Synthese 120 in einer
Gesamtausbeute von 35 – 50 %.
Pearson und Mitarbeiter schützten das Diensystem von cis-CHD 143 als Tricarbonyleisenkomplex (Abb. 3.37 B).102 Unter Einfluss von Hexafluorphosphorsäure wird nach
Wassereliminierung Carbokation 144 erhalten, welches mit NaHCO3-Puffer zu trans-CHDKomplex 145 weiterreagiert. Der Tricarbonyleisenkomplex 145 konnte in einer dreistufigen
Synthese in einer Gesamtausbeute von 51 % erhalten werden. Der abschließende Schritt zur
Freisetzung des trans-CHD, etwa durch photochemisch induzierten Ligandenaustausch mit
Acetonitril und anschließender Demetallierung,103 wird jedoch nicht beschrieben.
Hudlicky und Mitarbeiter schützten Dien 120 mittels einer reversiblen Cycloaddition (Abb.
3.37 C).104 Hierzu wird nach Schützen beider Alkoholfunktionen mit orthogonalen Schutzgruppen das Diensystem in einer Hetero-Diels-Alder-Reaktion mit 4-Phenyl-1,2,4-triazolin3,5-dion zum Trizyklus 146 umgesetzt. Hieran anschließend wird eine Schutzgruppe entfernt,
der freigesetzte Alkohol in eine Abgangsgruppe überführt und das Stereozentrum in einer
SN2-Reaktion invertiert. Abschließend wird bei hohen Temperaturen ent-142 in einer RetroHetero-Diels-Alder-Reaktion freigesetzt. In dieser Sequenz wird ent-142 in einer siebenstufigen Synthese mit einer Gesamtausbeute von 9 % erhalten.
Br
OH
A
1. Rh/Al2O3 - H2
2. Mitsunobu
3. K2CO3
4. Ac2O
OAc
OH
OH
OH
141
CF3
OH
1. Fe2CO9
2. HPF6
OH
142
CF3
CF3
OH
(OC)3Fe
OH
NaOH
144
Br
OH
C
OH
OH
(OC)3Fe
143
120
Br
OAc
120
B
1. NBS
2. Li2CO3/LiCl
3. K2CO3
Br
1. THSCl
2. R-Cl
3. 4-Ph-1,2,4-triazolin-3,5-dion
O
N
N
145
OR
OTHS
N
Ph O
R = -CH2OCH2CH3
146
1. TBAF
2. Tf2O, CsOAc
3. TBSOTf
4. Collidin, 175 °C
Br
OH
OH
ent-142
Abbildung 3.37: Beispiele für Synthesen von trans-CHD aus cis-CHD A nach Boyd et
al.;101 B nach Pearson et al.;102 C nach Hudlicky et al.104
Allgemeiner Teil
43
Angewandt wurde ein davon abgeleitetes Verfahren in der Synthese von (-)-Zeylena (113)
durch Hudlicky und Mitarbeiter.78a 113 ist einen Naturstoff aus den Wurzeln von Uvaria
zeylanica mit vicinalen trans-ständigen Sauerstofffunktionalitäten. Ausgangspunkt für die
Synthese ist die mikrobielle Oxidation von Styrol (147) zu cis-CHD 148, welches in einer
sechsstufigen Sequenz mit 31 % Ausbeute in trans-CHD 151 überführt wird (Abb. 3.38).
Hierbei wird das konjugierte Triensystem zunächst in einer Hetero-Diels-Alder-Reaktion in
das nicht-konjugierte Dien 149 überführt, um nach Schutzgruppenoperationen eine Inversion
der allylischen Alkoholfunktion zu 150 zu ermöglichen. Durch Abbau des entstandenen
Heterozyklus unter Freisetzung von Stickstoff wird anschließend das konjugierte Triensystem
151 wiederhergestellt. Die Synthese des Naturstoffs wird mit einer intramolekularer DielsAlder-Reaktion, der Ozonolyse der terminalen Doppelbindung, Reduktion des erhaltenen
Aldehyds und Schutzgruppenmodifikationen abgeschlossen.
Pseudomonas putida F39/D
900 mg L-1, 0.5 g batch-1
OH
a) Bis-(2,2,2-trichlorethyl)azodicarboxylat, THF, 0 °C, 95 %
b) THSCl, Imidazol, DMF
4 °C, 89 %
RN
c) Ac2O, Pyridin, DMAP
4 °C, 95 %
RN
d) TBAF, THF, rt, 65 %
OH
Styrol (147)
OAc
OH
149
R = -CO2CH2CCl3
148
Ph3P, DEAD, Zimtsäure
THF, rt, 10 - 60 %
OBz
OH
O
OAc
PhCH3, 110 °C, 15 h, 94 %
O
O
113
RN
RN
OAc
5 Stufen
Ph
O
O
151
Ph
O
150
Abbildung 3.38: Synthese von (-)-Zeylena (113) aus Styrol nach Hudlicky et al.78a
3.10.4.2 Chemische Synthese von Derivaten des 2,3-trans-CHD
Im Rahmen einer Synthese von Valienamin (64) durch Trost und Mitarbeiter wurde transCHD ent-160 als Zwischenstufe erhalten und umgesetzt.78b Die Synthese von 64 und damit
des trans-CHD erfolgt sowohl racemisch (Abb. 3.39 A) als auch enantioselektiv (Abb. 3.39
B). Im Ansatz zur racemischen Synthese wird Dien rac-151 in einer Diels-Alder-Reaktion
erhalten. Eine Methode zur Durchführung einer enantioselektiven Diels-Alder-Reaktion
konnte nicht gefunden werden, so dass eine andere Route erarbeitet wurde, um 158 und damit
Valienaminpentaacetat (163) enantiomerenrein zu erhalten. Schlüsselschritt dieser Sequenz ist
44
Allgemeiner Teil
eine Palladium-katalysierte allylische Substitution, die in Anwesenheit eines chiralen Liganden zu 153 mit einem Enantiomerenüberschuss von wenigstens 99 % führt. Nach Desoxylieren, Substitution des Phenylsulfins gegen eine Methoxygruppe und alkalischer Hydrolyse
des Heterozyklus 155 wird der allylische Alkohol 156 erhalten. Dieser wird stereoselektiv mit
2,2-Diphenyldiselenid zu 157 umgesetzt. Nach Einführen einer TBS-Schutzgruppe und
Oxidation zum Selenoxid wird durch Elimination das enantiomerenreine Dien 158 erhalten.
OTBS
A
149
OTBS
CO2Et
CO2Et
+
80 °C, Methylenblau
150
rac-151
O
O
NH HN
NO2
PhO2S
+
B
L=
PPh2 Ph2P
0.25 % [n3-C3H5PdCl2]2
0.5 % L, THF, H2O 3:1
87 %, > 99 % ee
OBz
O
O N
O N
SO2Ph
SO2Ph
SnCl2, MeCN
94 %
BzO
152
153
OH
O N
KOMe, MeOH
50 °C, 91 %
Mo(CO)6, MeCN
84 %
OMe
CO2Me
156
155
mCPBA, 2-Methoxypropen
CH2Cl2, 78 °C - 0 °C
154
a) 2,2-Diphenyldiselenid, THF
b) TBSOTf, NEt3
DMAP, 0 °C
CH2Cl2
OH
CO2Me
SePh
157
OTBS
CO2Me
158
Abbildung 3.39: Synthese der Diene rac-151 bzw. 158 nach Trost et al.;78b A Synthese von
racemischen 151 mittels Diels-Alder-Reaktion; B enantioselektive
Synthese von 158 über Palladium-katalysierte allylische Substitution.
Zur Synthese von Valienaminpentaacetat (163) wird 158 mit meta-Chlorperbenzoesäure
(mCPBA) zu 159 epoxidiert.78b Die Oxidation erfolgt hoch regioselektiv mit einer Diastereoselektivität von 80 %. Das erhaltene Hauptprodukt tautomerisiert in Gegenwart einer Base
und TBSCl zu trans-CHD ent-160. ent-160 wird mit mCPBA regio- und stereoselektiv zu
Epoxid ent-161 oxidiert, welches im Schlüsselschritt dieser Synthese Palladium-katalysiert
zum Allylkationalkoholat geöffnet wird (Abb. 3.40). Das Alkoholat reagiert unter optimierten
Reaktionsbedingungen mit N-Tosylisocyanat, welches in einer intramolekularen Reaktion
unter Substitution der Palladiumspezies das zyklische Carbamat 162 bildet. Die Carbamatfunktion wie auch die Methylesterfunktion werden mit DIBAL-H reduziert, die Schutzgruppen werden entfernt, und das erhaltene Valienamin wird zum Pentaacetat 163 umgesetzt.
Die Synthese racemischen Valienaminpentaacetats (rac-163) erfolgt analog aus rac-151.78b
Allgemeiner Teil
OTBS
CO2Me
OTBS
CO2Me
mCPBA
CH2Cl2, 78 %
TBSCl, DBU
kat. DMAP
CH2Cl2, 90 %
O
CO2Me
TBSO
TBSO
L=
O
O
P
O
O
O
P
ent-160
O
5 % Pd(OAc)2, 15 % L
10 % Sn(CH3)3OAc
TsNCO, 70 %
O
CO2Me
TBSO
TBSO
de 80 %
159
158
mCPBA, 88 %
45
CO2Me
TBSO
CO2Me
TBSO
Pd L
TBSO
Pd L
TBSO
O
O
ent-161
NTs
CO2Me
TBSO
TBSO
O
O
NTs
a) 5.5 eq DIBAL-H, -78 °C
b) HF, CH3CN
c) Na, NH3, -78 °C
d) Ac2O, Pyridin, DMAP
31 % über vier Stufen
OAc
AcO
AcO
NHAc
OAc
O
162
163
Abbildung 3.40: Synthese von Valienaminpentaacetat (163) aus 158 mit trans-CHD ent160 als Zwischenstufe nach Trost et al.78b
In der Literatur werden weitere Beispiele für die Synthese von Derivaten des 2,3-trans-CHD
(4) gegeben, welche in der folgenden Tabelle zusammengefasst sind (Tabelle 3).
ent-2,3-transCHDa,c
rac-2,3-transCHDb,c
Arbeitsgruppe
(Publikationsjahr)
Berchtold et al.105
(1974)
White et al.106
(1978)
Ganem et al.107
(1979)
Schlessinger und
Lopes108
(1981)
Ogawa und
Takagaki109
(1981)
Shing und Tam110
(1996)
Trost et al.78b
(1998)
ent-2,3-transCHDb,c
Trost et al.78b
(1998)
Produkt
rac-2,3-transCHD
rac-2,3-transCHDa
rac-2,3-transCHDa
rac-2,3-transCHDa
2,3-trans-CHDa
Zielverbindungen
Synthesestrategie
Stufen
(Ausbeute)
rac-2,3-trans-CHD
über Oxepin
4 (7 %)
Cyclohexanepoxide
Diels-AlderReaktion
5 (40 %)
Cyclohexanepoxide
über Oxepin
10 (1 %)
Cyclohexanepoxide
Diels-AlderReaktion
5 (52 %)
Cyclohexanepoxide
reduktive
Debromierung
4 (7 %)
Cyclohexanepoxide
aus Chinasäure
11 (16 %)
Diels-AlderReaktion
enantioselekt.
allylische
Substitution
4 (36 %)
rac-Valienamin
Valienamin
8 (44 %)
Tabelle 3: Synthese von Derivaten des 2,3-trans-CHD; die Vorsilbe "ent-" beschreibt, dass
die zu 4 entgegengesetzte absolute Konfiguration vorliegt, die Vorsilbe "rac-"
bedeutet, dass die racemische Substanz synthetisiert wurde; a) statt der Carbonsäure liegt eine Hydroxymethylgruppe vor; b) statt der freien Carbonsäure liegt
ein Ester vor; c) statt freier Hydroxygruppen liegen Ether oder Ester vor.
46
Allgemeiner Teil
3.10.4.3 Chemische Synthese von Derivaten des 3,4-trans-CHD
Für die Synthese von Derivaten des 3,4-trans-CHD existieren weit weniger Beispiele. Synthesen erfolgen zumeist in racemischer Form und überwiegend zur Untersuchung biologischer
Fragestellungen.
3,4-trans-CHD (5) wurde erstmals von Berchtold und Chiasson als Zwischenprodukt zur
Synthese racemischen Chorismats synthetisiert (Abb. 3.41).111 Hierzu wird Cyclohexadientrans-carboxylat rac-164 mit mCPBA stereoselektiv zu Diepoxid rac-165 oxidiert. Dieses
wird mit Perfluoressigsäureanhydrid in Anhydrid rac-166 überführt, welches durch Solvolyse
in Methanol zu Monoester rac-167 reagiert. Die freie Carbonsäure wird nach Barton112 zu
Iodverbindung rac-168 decarboxyliert. Nach Dehalogenierung mit Zink und Eisessig und
Behandlung mit Triethylamin wird Methylester rac-170 erhalten. Hydrolyse des Methylesters
mit Kaliumhydroxid liefert racemisches 3,4-trans-CHD (rac-5), welches über sieben Stufen
in einer Ausbeute von 20 % erhalten wird.
CO2H
O
mCPBA
EtOAc, 84 %
CO2H
O
rac-164
CO2H
(CF3CO2)2,
2 h, 85 %
CO2H
O
O
O
O
rac-165
O
CO2Me
MeOH, rt, 1.5 h
80 %
CO2H
O
O
rac-166
rac-167
tBuOK, I2
C6H6, 30 °C, h×v
CO2H
CO2Me
HO
CO2Me
NEt3, Et2O, rt
20 min, 51 %
KOH, H2O, rt
3 h, 74 %
Zn, AcOH
Et2O, rt, 45 min
O
HO
OH
rac-5
OH
rac-170
OH
rac-169
O
O
CO2Me
I
rac-168
Abbildung 3.41: Chemische Synthese von racemischem 3,4-trans-CHD nach Berchtold und
Chiasson.111
Ganem und Ikota synthetisierten racemisches 3,4-trans-CHD ausgehend von Benzoesäure
(171).113 Nach Birch-Reduktion zu 1,4-Dihydrobenzoesäure (172) wird mit Brom zu Dibromverbindung rac-173 oxidiert. Diese wird unter pH-Kontrolle zu Lacton rac-174 umgesetzt,
welches in allylischer Position mit N-Bromsuccinimid (NBS) radikalisch zu rac-175 bromiert
wird. Unter Retention wird das allylische Bromid gegen Acetat substituiert, wobei zwei
Diastereomere Essigsäureester rac-176 und rac-177 im Verhältnis 1 : 1 erhalten werden.
Allgemeiner Teil
47
Nach Hydrolyse des Lactons rac-176 und Eliminierung von Bromwasserstoff wird rac-5 in
einer Ausbeute von 9 % über sechs Stufen erhalten (Abb. 3.42).
CO2H
CO2H
Li, NH3
- 78 °C, 79 %
CO2H
Br
Br2, CHCl3
0 °C, 43 %
O
NaOH, H2O
64 %
Br
O
Br
171
172
rac-173
rac-174
NBS, AIBN, 52 %
CO2H
O
O
KOH, H2O
35 %
Br
O
AcO
OH
+
OH
O
Br
O
Br
O
NaOAc, HMPT
48 %
OAc
rac-5
rac-177
Br
rac-176
rac-175
Abbildung 3.42: Chemische Synthese von racemischem 3,4-trans-CHD nach Ganem und
Ikota.113
Schlüsselverbindung in der Synthese von rac-185 nach Posner und Mitarbeitern ist Thioether
rac-184, welcher nach Oxidation zum Sulfoxid und Eliminierung das geschützte trans-CHD
rac-185 liefert.114 Thioether rac-182 wird in einer Cycloaddition von 3-(p-Tolylsulfinyl)-2pyron (181) und Phenylvinylthioether bei 6.8 kbar erhalten.114b In einer achtstufigen Synthese
wird hierbei rac-185 in 7 % Ausbeute aus 2H-Pyran-2-on 178 erhalten (Abb. 3.43).
O
O
Br2, CCl4
reflux, 40 h
57 %
178
O
Br
O
CuI2, MeLi
Et2O, - 78 °C
2.5 h, 67 %
O
TolS
179
O
mCPBA, CH2Cl2
0 °C, 1.5 h
81 %
O
TolS
O
O
180
181
CH2=CHSPh, rt, 6.8 kbar
CO2Me
OTBS
OTBS
rac-185
a) mCPBA, 83 %
b) MeOH, 75 °C PhS
40 %
CO2Me
CO2Me
TBSOTf, NEt3
98 %
OTBS
OTBS
rac-184
PhS
NaOMe, MeOH
66 % für zwei Stufen
OH
OH
rac-183
O
O
O
STol
SPh
rac-182
Abbildung 3.43: Chemische Synthese eines racemischen Derivates des 3,4-trans-CHD nach
Posner et al.114
Roberts und Mitarbeiter gewinnen den Methylester des racemischen 3,4-trans-CHD 170
durch Cycloaddition des cis-CHD-Derivats 186 mit einem Keten.115 Nach Oxidation mit
mCPBA wird Lacton rac-188 erhalten, welches mit Methanolat zu racemischen 3,4-trans-
48
Allgemeiner Teil
CHD-Methylester (rac-170) umgesetzt wird. In einer dreistufigen Synthese wird so
racemischer 3,4-trans-CHD-Methylester (rac-170) in 14 % Ausbeute erhalten (Abb. 3.44).
Nachteile dieser Synthese sind einerseits der Einsatz des nicht kommerziell erhältlichen
Acetonides 186 wie auch Schwierigkeiten bei der Kontrolle der [2+4]-Cycloaddition, die mit
einer [2+2]-Cycloaddition konkurriert und Produktgemische im Verhältnis 1 : 1 liefert.
Ph
O
Ph2C=CO, THF
reflux, 48 h
45 %
Ph
O
O
O
mCPBA, CH 2Cl2
pH 7.5 Phosphatpuffer
0 °C, 1 h, 55 %
O
O
O
O
O
186
NaOMe, MeOH
CH2Cl2, 0 °C, 1.5 h
67 %
rac-187
CO2Me
HO
OH
rac-188
rac-170
Abbildung 3.44: Synthese des racemischen Methylesters rac-170 nach Roberts et al.115
Boyd und Mitarbeiter erhalten 5 enantiomerenrein aus cis-CHD 104.116 104 wird in
Gegenwart
katalytischer
Mengen
Osmium(VIII)oxids
mit
Trimethylamin-N-oxid
dihydroxyliert. Erhalten werden zwei diastereomere Tetrole 189 und 190 im Verhältnis 85:15
in 80 % Ausbeute. Die beiden allylischen Alkoholfunktionen des Tetrols 190 werden aktiviert
und in einer SN2-Reaktion gegen Brom zu Dibromid 191 substituiert, und nach
intramolekularen SN-Reaktionen wird Bisepoxid 192 erhalten. In Gegenwart von Palladium(II)-acetat und unter Kohlenmonoxidatmosphäre erfolgt eine rasche Tautomerisierung zu
trans-CHD 193. In einer Palladium-katalysierten Reaktion von 193 mit Kohlenmonoxid in
Methanol wird Methylester 170 über fünf Stufen in einer Ausbeute von 8 % erhalten (Abb.
3.45).
I
OH
I
OsO4, TMNO
CH2Cl2, rt
80 %
I
OH
OH
+
HO
OH
OH
OH
85
189
104
O H3C CH3
H3C
O
I
Br
Br
O
HO
:
OH
MeCN
OH
15
190
Br
OH
OH
191
NaOMe, Et2O
78 % über zwei Stufen
CO2Me
CO, Pd(OAc)2, NaOAc
MeOH, rt, 18 h
85 %
I
OH
OH
170
I
CO, Pd(OAc)2,
K2CO3, THF-H2O
0.75 h, 85 %
OH
OH
193
O
O
192
Abbildung 3.45: Synthese des Methylesters 170 von 3,4-trans-CHD nach Boyd et al.116
Allgemeiner Teil
49
Eine Zusammenstellung literaturbeschriebener chemischer Synthesen von 3,4-trans-CHD
wird in Tabelle 4 gegeben.
Produkt
rac-3,4-transCHD
rac-3,4-transCHD
rac-3,4-transCHDa,b
rac-3,4-transCHDa
3,4-trans-CHDa
Arbeitsgruppe
SyntheseZielverbindungen
(Publikationsjahr)
strategie
Berchtold und
EpoxidChiasson
rac-3,4-trans-CHD
Tautomerisierung
(1974)111
Bromierung und
Ganem und Ikota
rac-3,4-trans-CHD
allylische
(1978)113
Substitution
Posner et al.
rac-3,4-trans-CHD
Cycloaddition
(1987)114
Roberts et al.
mechanistische
Cycloaddition
(1996)115
Untersuchung
eines Ketens
Boyd et al.
3,4-trans-CHD
aus cis-CHD
(2000)116
Stufen
(Ausbeute)
7 (20 %)
6 (9 %)
8 (7 %)
3 (14 %)
5 (8 %)
Tabelle 4: Synthese von Derivaten des 3,4-trans-CHD; die Vorsilbe "rac-" bedeutet, dass die
racemische Verbindungen synthetisiert wurden; a) statt der freien Carbonsäure
liegt ein Ester vor; b) statt freier Hydroxygruppen liegen Ester oder Ether vor.
50
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
4 Spezieller Teil
4.1 Mikrobiologische Arbeiten
4.1.1
Strategie
Aufbauend auf den Arbeiten von Dr. D. Franke soll ein effektiverer Zugang zu den transCHD 4 und 5 geschaffen werden. Dies geschieht mittels metabolic engineering, also der gezielten Änderung von Stoffflüssen der Biosynthesewege durch gentechnische Modifikationen.117 Ein Ziel besteht darin, die Biosynthese von Chorismat über den Shikimat-Biosyntheseweg zu verstärken und den Abfluss von Chorismat in andere Biosynthesen zu minimieren.
Literaturdaten118 und Untersuchungen der zeilichen Änderungen der Metabolit-Pools des
Shikimat-Biosyntheseweges, die bei Glucosepuls-Experimenten gewonnen wurden,119 legen
nahe, dass die durch die Enzyme 3-Dehydrochinasäure Synthase (AroB), Shikimat Kinase
(AroL) und DAHP Synthase (AroF) katalysierten Umsetzungen die in der Biosynthese limitierenden Schritte sind. Daher sollen die Gene aroB, aroL und aroF mit den Genen entC und
entB, welche für die zur Umsetzung von Chorismat zu den Zielmetaboliten eingesetzten
Enzyme codieren, kombiniert und gemeinsam überexprimiert werden (Abb. 4.1). Zur Produktion von 2,3-trans-CHD (4) soll ein Plasmid erstellt werden, welches die Gene aroF, aroB,
aroL, entC und entB trägt. Für die Produktion des Diols 3,4-trans-CHD (5) soll ein Plasmid
konstruiert werden, welches die Gene aroF, aroB, aroL und entB trägt. Da nicht ausgeschlossen werden kann, dass Plasmide mit fünf oder vier Genen micht stabil sind oder nicht
effektiv abgelesen werden, werden alternativ Plasmide generiert, bei denen auf das Gen aroL
verzichtet wird. Alle Plasmide werden vom Vektor pJF119EH1 abgeleitet.120 Es handelt sich
dabei um ein high-copy Plasmid mit Polylinker-Sequenz, die von einem kontrollierenden tacPromotor121 und zwei transkriptionalen Terminatoren flankiert wird. Eine Induktion des tacPromotors erfolgt mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG). Das Plasmid trägt zudem
das für β-Lactamase codierende Gen bla. β-Lactamase, welche von Wildstämmen von E. coli
nicht gebildet wird, ermöglicht den Abbau von β-Lactam-Antibiotika wie Ampicillin und
erlaubt so die Selektion von Plasmid-tragenden Stämmen. Nur Stämme, welche nach erfolgreicher Transformation das Gen bla tragen, weisen eine Antibiotikaresistenz gegen Ampicillin
auf und wachsen auf mit Ampicillin versetztem Medium. Als Produktionsstämme werden von
E. coli LJ110122 abgeleitete Organismen eingesetzt. Dieser Stamm ist als nicht pathogen ein-
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
A
B
PEP (9) E4P (10)
aroF, aroG, aroH
PEP (9) E4P (10)
aroF, aroG, aroH
DAHP (11)
DAHP (11)
aroB
aroB
51
C
PEP (9) E4P (10)
aroF, aroG,
aroH
DAHP (11)
aroB
DHQ (12)
DHQ (12)
DHQ (12)
aroD
aroD
aroD
DHS (14)
DHS (14)
DHS (14)
aroE
aroE
aroE
SA (15)
SA (15)
aroK, aroL
S3P (16)
aroK, aroL
S3P (16)
SA (15)
aroK, aroL
S3P (16)
aroA
aroA
aroA
EPSP (17)
EPSP (17)
EPSP (17)
aroC
aroC
aroC
Chorismat (3)
Chorismat (3)
entC, menF
Isochorismat (22)
Chorismat (3)
entB
3,4-trans-CHD (5)
entB
2,3-trans-CHD (4)
Abbildung 4.1:
A Fließschema des Shikimatbiosyntheseweges; B Strategie zur Überexpression von Genen zur Produktion von 2,3-trans-CHD (4); C Strategie
zur Überexpression von Genen zur Produktion von 3,4-trans-CHD (5);
hervorgehobene Pfeile symbolisieren einen durch Überexpression hervorgehoben dargestellter Gene verstärkten metabolischen Fluss; Intermediate
(Abkürzung): Phosphoenolpyruvat (PEP, 9), D-Erythrose-4-phosphat
(E4P, 10), 3-Deoxy-D-arabinoheptulosesäure-7-phosphat (DAHP, 11), Dehydrochinasäure (DHQ, 12), Dehydroshikimat (DHS, 14), Shikimat (SA,
15), 3-Phosphoshikimat (S3P, 16), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat
(EPSP, 17); Enzym (Gen): DAHP Synthase (aroF, aroG, aroH), 3Dehydrochinasäure Synthase (aroB), 3-Dehydrochinasäure Dehydratase
(aroD), Shikimat Dehydrogenase (aroE), Shikimat Kinase (aroK, aroL),
EPSP Synthase (aroA), Chorismat Synthase (aroC), Isochorismat
Synthase (entC, menF), Isochorismat Lyase (entB).
gestuft (S1-Einstufung nach deutschem Gentechnikgesetz) und weist damit eine Voraussetzung für die Zulassung biotechnologisch produzierter Substanzen als GRAS-Substanzen
("generally recognised as safe") auf. Des weiteren ist dieser Organismus gut untersucht und
52
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
lässt sich mit gentechnischen Standardmethoden verändern. Zudem hat sich E. coli als
Produzent verwandter Substanzen bewährt.27,31,33
Zur Produktion beider trans-CHD sollen E. coli-Stämme eingesetzt werden, die chromosomale Deletionen in den Eingangsreaktionen der Biosynthesewege der aromatischen Aminosäuren Tryptophan, Phenylalanin und Tyrosin besitzen, um den Abfluss von Chorismat in
diese konkurrierenden Biosynthesen zu verhindern. In diesen Stämmen verbleiben als native,
Chorismat konsumierende Biosynthesen die Stoffwechselwege zur Bildung von Menachinon,
Enterobactin, Folsäure und Ubichinon (Abb. 4.2). Der Fluss in diese Biosynthesewege ist
vernachlässigbar gegen den Abfluss in die Biosynthesen der aromatischen Aminosäuren, so
dass auf eine Deregulierung verzichtet wird.
O
CO2H
CO2-
HO2C
NH3+
Phenylalanin,
Tyrosin
Tryptophan
OH
Prephenat (18)
pheA
tyrA
trpD
trpE
Anthranilat (19)
CO2H
CO2-
pabA,B
ShikimatBiosyntheseweg
O
Folsäure
CO2H
OH
NH3+
Chorismat (3)
para-Aminobenzoat (20)
ubiC
entC
menF
CO2H
Menachinon,
Enterobactin
OH
O
Ubichinon
CO2H
Isochorismat (22)
Abbildung 4.2:
CO2H
OH
para-Hydroxybenzoesäure (21)
Chromosomale Deletionen in E. coli Stämmen, die zur Produktion von 4
und 5 eingesetzt werden sollen; Enzym (Gen): Chorismat Mutase (pheA,
tyrA), Anthranilat Synthase (trpD, trpE), Aminodeoxychorismat Synthase
(pabA,B), Chorismat Lyase (ubiC), Isochorismat Synthase (menF, entC).
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
4.1.2
53
Plasmidkonstruktion
Alle in dieser Arbeit zusammengeführten Gene lagen auf Plasmiden aus dem Arbeitskreis von
Professor Dr. G. Spenger kloniert vor, welche zur Durchführung der vorgestellten Arbeiten
freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurden. Im Folgenden werden linearisierte DNAAbschnitte durch ein nachgestelltes Sternchen (*) kenntlich gemacht.
Ausgangspunkt der Klonierungsarbeiten waren die Vektoren pF109, pF81 und pDF3, die alle
vom Vektor pJF119EH1120 abgeleitet sind. Die Gene aroB und aroF lagen kloniert auf dem
Vektor pF109 vor, der lineare Genabschnitt aroL*, der das Gen aroL trägt, wurde durch
Schneiden des vorliegenden Vektors pF81 mit dem Enzym HindIII erhalten.
4.1.2.1 Klonierung des Vektors pF112
Nach Linearisieren des Vektors pF109 mit HindIII und Dephosphorylierung der 5´-Enden mit
Alkalischer Shrimps Phosphatase (SAP), um einen Ringschluss des offenkettigen Vektors
ohne Insertion zu verhindern, erfolgt die Ligation mit aroL* mittels T4-DNA-Ligase. Nach
P-tac
lacIq
aroF
8000
pheA'
pF81
2000
1. Restriktion pF81 mit HindIII
9091 bps
6000
aroB
P-tac
4000
rrnB
aroL
bla T1T2 5S
lacIq
3529
4. Ligation mit T4-DNA-Ligase
4090
P-tac
lacIq
6000
7000
8114 bps
aroB
2000
5S
3000 rrnB
T1T2
4000
aroB
2000
aroL
1192
rrnB 5S
T1T2
4000
1000 tyrA'
7553 bps
pF112
Bam HI
aroF
pF109
5000
6000
1192
tyrA'
HindIII
HindIII
BamHI
aroF
8000
bla
2. Linearisieren von pF109 mit HindIII
3. Dephosphorylieren der 5´-Enden mit SAP
HindIII
2318
bla
Abbildung 4.3:
Schema zur Klonierung des Vektors pF112 ausgehend von pF81 und
pF109.
54
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
Transformation des Ligationsproduktes in kompetente DH5α-Zellen und Selektion der
erhaltenen Stämme auf Ampicillin-haltigem Medium werden 12 von 284 gefundene Stämme
in flüssigem Ampicillin-haltigem Medium vermehrt. Per Kontrollrestriktion der isolierten
Plasmid-DNA (NruI, AvaI) werden 4 Stämme als Träger des gesuchten Plasmides pF112
identifiziert (Abb. 4.3).
4.1.2.2 Klonierung des Vektors pUCBM20-entC-entB
Die für die Umsetzung von Chorismat (3) zu den Zielmetaboliten 4 und 5 genutzten Gene
entC und entB lagen auf dem Vektor pDF3 vor.12 Da diese Gene von keiner zu den Vektoren
pF109 und pF112 kompatiblen Schnittstelle flankiert werden, die eine direkte Klonierung von
entC und entB erlaubt, wurden mit den verwendeten Primern per Polymerasekettenreaktion
(PCR) zwei endständige BglII-Schnittstellen mit der DNA-Sequenz "AGATCT" eingefügt. Für
diese PCR-Reaktion wurde die thermophile Pyrococcus woesei DNA-Polymerase (Pwo)
eingesetzt, welche eine vollständige Kettenverlängerung zu doppelsträngigen Enden ("blunt
ends") erlaubt. Das PCR-Produkt wird mit T4-Polynukleotid-Kinase (T4-PNK) am 5´-Ende
phosphoryliert und mit T4-DNA-Ligase in den Vektor pUCBM20, welcher zuvor mit EcoRV
linearisiert wurde, und dessen doppelsträngige Enden mit SAP dephosphoryliert wurden, in
einer Ligationsreaktion eingeführt. Nach Transformation in kompetente DH5α-Zellen wird
auf einer mit Ampicillin, IPTG und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal)
versetzten LB-Medium-Agarplatte selektiert. Nur solche Zellen, die durch Aufnahme eines
Vektors auch eine Ampicillin-Resistenz erworben haben, zeigen auf dem Medium normales
Wachstum. Weiterhin färben sich Kolonien von Zellen, die das unveränderte Plasmid
pUCBM20 tragen, blau, wohingegen solche Zellen, die rekombinante Plasmide tragen, eine
ungefärbte Kolonie bilden. Ursächlich hierfür ist die Insertion des PCR-Produktes in das Gen
lacZa. E. coli DH5α besitzt kein vollständiges Gen für das Enzym β-Galactosidase. Das
plasmidische Gen lacZa komplementiert jedoch das chromosomal vorhandene Gen, so dass in
Kombination eine funktionsfähige β-Galactosidase gebildet wird. Diese baut das LactoseAnalogon X-gal unter Bildung eines blauen Farbstoffs ab. Ist das Gen lacZa nun durch
Insertion des PCR-Fragmentes geteilt, wird keine funktionsfähige β-Galactosidase gebildet,
und eine Blaufärbung tritt nicht ein.123 12 Kolonien, die keinen blauen Farbstoff zu bilden
imstande waren, wurden vermehrt und deren Plasmid-DNA isoliert. Eine Restriktionskontrolle dieser Plasmide (PvuI, HindIII) ergibt 2 Stämme, die das erwartete Fragmentmuster
zeigen (Abb. 4.4).
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
P-tac
lacIq
entC
Bam HI
1231
7000
1000
6000
entB
pDF3
Ava I
5405
1. Linearisieren mit AvaI
2. PCR mit Pwo
(Primer: EntCupBbgl, EntBdownBgl)
3. Phosphorylieren
des 5´-Endes mit T4-Polynucleotid-Kinase
2000
7393 bps
5000
5SrrnBT1T2
4000
55
3000
BglII
4
5´- P -CCCAGATCT3´-GGGTCTAGA-
bla
BglII
BamHI
2116
-AGATCTGGG-3´
-TCTAGACCC- P -5´
1215
entC
500
1000
1500
entB
2000
PCR-Produkt (2124 bps)
BamHI
Reverse Primer 240 BglII
311
Reverse Primer
Eco RV
305
Universe Primer
2500
lacZa
500
2000
pUCBM20
2722 bps
1000
1. Linearisieren mit EcoRV
2. Dephosphorylierung der 5´-Enden
mit SAP
3. Ligation mit PCR-Produkt mit
T4-DNA-Ligase
lacZa'
entC
4000
bla
pUCBM20-1000
entC-entB
4846 bps
3000
1500
Universe
Primer
BamHI
1522
entB
'lacZa
bla
BamHI BglII
2430
Abbildung 4.4:
2000
2423
PCR-Reaktion zur Amplifikation der Gene entC und entB unter Einfügung
flankierender Schnittstellen und Zwischenklonierung des erhaltenen PCRProduktes in den Vektor pUCBM20.
4.1.2.3 Klonierung der Vektoren pC19, pC20, pC21 und pC22
Um den linearen Genabschnitt entC-entB* zu isolieren, wird Plasmid pUCBM20-entC-entB
präparativ mit BglII geschnitten und das Fragment der erwarteten Größe von 2112 bp mittels
Gelelektrophorese aufgereinigt. Durch Schneiden des Plasmides pUCBM20-entC-entB mit
BglII und BamHI wird nach Aufreinigung per Gelelektrophorese das 901 bp große Fragment
entB*, welches das Gen entB trägt, erhalten. Da Restriktionen sowohl mit BglII als auch mit
BamHI zu gleichen Endsequenzen führen, lassen sich sowohl entC-entB* als auch entB* in
eine BamHI Schnittstelle insertieren.
Um die gewünschten Gene des Shikimat- und des Enterobactin-Biosyntheseweges auf einem
Plasmid zu kombinieren, werden die Vektoren pF109 und pF112 mit BamHI linearisiert, mit
SAP dephosphoryliert und danach mit den DNA-Fragmenten entB* und entC-entB* kombiniert, um mit Hilfe von T4-DNA-Ligase verknüpft zu werden. Erhalten werden die Plasmide
pC19 und pC20, welche zur Biosynthese von 4 eingesetzt werden, und pC21 und pC22,
welche zur Biosynthese von 5 genutzt werden (Abb. 4.5).
56
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
5´-GATC3´-
entC
1000
1500
entB
-3´
5´-GATC-CTAG-5´
3´2000
200
P-tac
6000
P-tac
Bam HI
aroF
1192
lacIq
5000
9665 bps
entB
5S
3000 rrnB
P-tac
lacIq
Bam HI
aroF
8000
1192
P-tac
lacIq
T1T2
bla
tyrA'
aroB
2000
8114 bps
8000
pC20
10226 bps
rrnB 5S
T1T2
bla
Abbildung 4.5:
P-tac aroF
lacIq
tyrA'
8000
2000
entB
pC22
2000
9015 bps
entB
6000
aroL
4000
2000
8454 bps
4000 rrnB
5S
aroF
10000
tyrA'
pF112
6000
4000
entC
6000
pC21
rrnB
aroB
T1T2
bla
5S
bla
tyrA'
aroB
6000
T1T2
4000
aroF
8000
entB
2000
pC19
2000
7553 bps
lacIq
entC
8000
aroB
800
P-tac
1000 tyrA'
pF109
600
aroF
tyrA'
7000
400
entB* (901 bps)
entC-entB* (2112 bps)
lacIq
-3´
-CTAG-5´
entB
6000
4000
rrnB
aroB
T1T2 aroL
bla
5S
aroB
4000
rrnB aroL
5S
bla T1T2
Schema zur Klonierung der Vektoren pC19 – pC22. Hierzu wurden die
Vektoren pF109 und pF112 je mit BamHI linearisiert und mit SAP
desphosphoryliert, um mit den linearen DNA-Fragmenten entC-entB*
bzw. entB* mittels Ligation mit T4-DNA-Ligase kombiniert zu werden.
Die Ligationsprodukte wurden in kompetente DH5α-Zellen eingebracht, welche auf
Ampicillin-haltigem LB-Medium auf Plasmid-tragende Stämmen selektioniert wurden. Von
den gefundenen Kolonien wurden im Falle von pC19 und pC20 je 6 Ampicillin-resistente
Stämme, im Falle von pC21 und pC22 je 12 Ampicillin-resistente Stämme in je 5 mL mit
Antibiotikum versetztem LB-Medium vermehrt, die Plasmid-DNA isoliert und analytisch per
Restriktion (BssHII, SspI) untersucht. Identifiziert wurden zwei DH5α/pC19, vier DH5α/
pC20, ein DH5α/pC21 und ein DH5α/pC22 E. coli Stämme (Abb. 4.6A, B).
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
pC19
57
pC20
M
6.0 kbp
M 4.0 kbp
3.0 kbp
2.0 kbp
1.0 kbp
0.5 kbp
Abbildung 4.6A
Untersuchung der isolierten Plasmid-DNA per Restriktionsanalyse
(BssHII) und Gelelektrophorese; mit M ist aufgetragener DNAGrößenmarker gekennzeichnet, mit sind Bahnen markiert, die
Fragmente der erwarteten Größe zeigten. Größe der erwarteten Fragmente
[bp]: pC19: 868, 905, 2563, 5329; pC20: 868, 905, 2563, 5890.
pC21
M pC22
M 5.0 kbp
4.0 kbp
3.0 kbp
2.0 kbp
1.0 kbp
0.5 kb
Abbildung 4.6B
Untersuchung der isolierten Plasmid-DNA per Restriktionsanalyse
(BssHII) und Gelelektrophorese; mit M ist aufgetragener DNAGrößenmarker gekennzeichnet, mit sind Bahnen markiert, die
Fragmente der erwarteten Größe zeigten. Größe der erwarteten Fragmente
[bp]: pC21: 868, 905, 1352, 5329; pC22: 868, 905, 1352, 5890.
58
4.1.3
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
Sequenzierung des zwischenklonierten PCR-Produktes
Nach Abschluss der Klonierungsarbeiten wurde der Vektor pUCBM-entC-entB von der Fa.
AGOWA (Berlin) in einer Doppelstrangsequenzierung untersucht. Hierbei zeigte sich, dass in
der PCR-Reaktion eine Punktmutation auftrat (Abb. 4.7). An Position 677 wurde im codierenden Strang das Codon ACC statt GCC gefunden. Diese Änderung auf DNA-Ebene führt zu
einem Austausch der Aminosäure Alanin194 gegen Threonin in EntC. Um die Auswirkungen
dieser Mutation zu untersuchen, wurde in der Arbeitsgruppe von Professor Dr. G. Sprenger
eine Rückmutation durchgeführt und das Plasmid pC88 generiert, welches pC20 nach Korrektur der Mutation in entC entspricht. Obwohl die gefundene Mutation in einem als konserviert
anzusehenden Bereich eintrat, wurde in Vergleichsexperimenten mit den Produktionsstämmend F82/pC20 und F82/pC88 bzw. F111/pC20 und F111/pC88 kein verändertes Produktionsverhalten für 2,3-trans-CHD 4 beobachtet.124
Abbildung 4.7:
d
Screenshots aus den gegenläufigen Sequenzierungen beider komplementärer Stränge des Plasmides pUCBM20-entC-entB. Hervorgehoben ist
jeweils das mutierte Codon.
Die Produktionsstämme tragen folgende genetischen Charakteristika F82 = LJ110 ∆ (trpE) ∆ (pheA tyrA aroF)
∆ (entCEBA)::cat), F111 = (LJ110 ∆ (pheA tyrA aroF) ∆ (entCEBA)::FRT ∆ (gcd)::cat).
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
4.1.4
59
Untersuchungen zur Enzymexpression
Die Stämme DH5α/pC19, DH5α/pC20, DH5α/pC21 und DH5α/pC22 wurden in Ampicillinhaltigem LB-Medium angezüchtet und nach Induktion der Genexpression plamidischer Gene
mittels IPTG zusammen mit Stämmen, die ohne Zusatz von IPTG wuchsen, per SDS-PAGE
auf Änderungen der ausgeprägten Enzymkonzentrationen hin untersucht (Abb. 4.8).
pC19
-IPTG
pC19
pC20 pC20 Marker pC21 pC21
pC22 pC22 Marker
+IPTG -IPTG +IPTG
-IPTG +IPTG -IPTG +IPTG
97.4 kDa
kD
66.2 kDa
kD
39.2 kDa
kD
26.6 kDa
kD
21.5 kDa
kD
Abbildung 4.8:
SDS-PAGE-Gel zum Nachweis der Bildung durch die Plasmide pC19 –
22 codierter Proteine. Erwartete Banden: EntC 42.9 kDa, AroB 38.9 kDa,
AroF 38.8 kDa, EntB 32.6 kDa, AroL 19.2 kDa. Gefunden wird in allen
Fällen nach Induktion eine deutlich sichtbare Bande bei 39 kDa. Bei pC21
und pC22 wird weiterhin eine Bande bei 33 kDa gefunden, die auf die
Expression des Genes entB zurückgeführt werden kann.
Die auf dem Gel gefundenen Banden zeigen in allen Fällen bei Induktion eine vermehrte
Bildung von Proteinen von etwa 39 kDa an. Dies entspricht der erwarteten Größe der Enzyme
AroB und AroF. Weiterhin wird bei Induktion für die Plasmide pC21 und pC22 eine
Plasmidbande gefunden, die auf eine vermehrte Bildung von Proteinen der Größe 33 kDa
hinweist. Dies entspricht der für das Enzym EntB erwarteten Größe. Für die Plasmide pC19
und pC 20 wird diese Bande nicht gefunden, was auf eine deutlich schwächere Expression des
Genes entB hindeutet. Ursache hierfür könnte die Position des Genes in den Plasmiden sein.
Während entB in den Plasmiden pC21 und pC22 als zweites Gen hinter dem Promotor liegt,
60
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
befindet sich entB in den Plasmiden pC19 und pC20 als drittes Gen weiter vom Promotor
entfernt, so dass eine schwächere Expression zu erwarten ist.
Nicht beobachtet werden eine verstärkte Proteinbildung von Proteinen der Größe 43 kDa, wie
es für EntC für die Plasmide pC19 und pC20 erwartet wird, wie auch eine Proteinbildung von
Proteinen der Größe 19 kDa, wie es bei der Bildung von AroL für die Plasmide pC20 und
pC22 erwartet wird.
Dass die Bildung von Proteinen der entsprechenden Größe nicht in jedem Fall beobachtet
wird, bedeutet nicht, dass entsprechende Proteine nicht gebildet werden, sondern zunächst
nur, dass das Expressionsniveau nicht hoch genug ist, um sich deutlich vom Hintergrund
anderer Proteinen abzuheben. Da auf jedem Plasmid drei bis fünf Enzyme codiert sind, überrascht es nicht, dass die Expression von in größerem Abstand zum Promotor befindlichen
Genen nicht deutlich zu erkennen ist. Weiterhin ist verständlich, dass die Enzyme AroB und
AroF, die beide eine Masse von etwa 39 kDa aufweisen, sich auf dem Gel überlagern und
daher am ehesten detektiert werden.
4.1.5
Untersuchung der Enzymfunktion der Enzyme AroB und AroL
Die Expression und Funktionsfähigkeit der auf den Plasmiden codierten Enzyme AroB und
AroL wurde durch Transformation der Plasmide in Stämme gezeigt, welche keine chromosomalen Gene besitzen, die zur Expression funktionsfähiger Enzyme AroB beziehungsweise
AroF befähigen. Diese Ursprungsstämme leiten sich alle vom Stamm E. coli LJ110 ab. Die
Plasmide pC19, pC20, pC21 und pC22 wurden in den E. coli Stamm F5 transformiert. Dieser
Stamm weist eine Deletion des Genes aroB auf. Weiterhin wurden die Plasmide pC20 und
pC22 in den E. coli Stamm F12 transformiert, der das Enzym AroL nicht expremieren kann.
Alle Stämme wurden auf Agarplatten mit zwei unterschiedlich komplementierten Minimalmedien ausgebracht. Ein Minimalmedium war mit 0.2 % Glucose, 0.1 mg × mL-1 Ampicillin,
je 0.04 % Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin, je 0.01 % para-Aminobenzoesäure und
para-Hydroxybenzoesäure komplementiert, das andere enthielt 0.2 % Glucose, 0.1 mg × mL-1
Ampicillin und 0.1 mM IPTG. In allen Fällen wurde Wachstum von Kolonien beobachtet. Da
ein Wachstum auf Minimalmedium ohne Suplementierung mit Tyrosin, Tryptophan und
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
61
Phenylalanin nur erfolgen kann, wenn der Organismus in der Lage ist, die aromatischen
Aminosäuren zu synthetisieren, kann gefolgert werden, dass die auf den Plasmiden vorliegenden Gene aroL und aroB gelesen werden und für funktionsfähige Enzyme codieren.
Für das Enzym AroF konnte auf diesem Wege keine Aussage getroffen werden, da ein
Bakterienstamm hätte eingesetzt werden müssen, der neben aroF auch Deletionen der Gene
aroH und aroK aufweist, welche wie auch aroF für eine DAHP Synthase codieren.
4.1.6
Untersuchung zur Expression und Aktivität der Enzyme EntC und EntB
Zur Produktion von 4 und 5 wurde der E. coli Stamm F68 (LJ110 ∆ (trpE) ∆ (pheA tyrA
aroF)::kan) mit den Plasmiden pC20 und pC22 transformiert. F68 weist chromosomale
Deletionen der Gene trpE, pheA und tyrA auf. Hierdurch wird ein Abfluss von Chorismat in
die Biosynthese aromatischer Aminosäuren verhindert.
Die Stämme F68/pC20 und F68/pC22 wurden in je zwei Schüttelkolben mit 100 mL Minimalmedium, welches mit 0.2 % Glucose und den aromatischen Aminosäuren Tryptophan,
Phenylalanin und Tyrosin, mit Ampicillin und Thiamin versetzt war, angezogen. Nach achtstündigem Wachstum wurden bei einer optischen Dichte von 0.8 eine der beiden Kulturen des
Stammes F68/pC20, und bei einer optischen Dichte von 1.3 eine der beiden Kulturen des
Stammes F68/pC22 mit 0.1 mM IPTG induziert. Nach einer Inkubation von 16 Stunden
wurden die Zellen bei einer Optischen Dichte von etwa 3 geerntet, gewaschen und in je
100 mL ampicillinhaltigem Minimalmedium mit 1 % Glucose ohne weitere Zusätze resuspendiert und bei 37 °C inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Überstände per HPLC untersucht
(Abb. 4.9). Dabei ist bei Zusatz von IPTG zum Fermentationsmedium deutlich die Bildung je
eines Hauptproduktes als intensiver Peak bei einer Detektionswellenlänge von λ = 275 nm zu
erkennen. 4 wird hierbei bei einer Retentionszeit von 4.45 min. detektiert (Abb. 4.9 A), 5
weist eine Retentionszeit von 5.90 min. auf (Abb. 4.9. B). Laut HPLC wurden in diesen
Experimenten 1.6 g × L-1 4 und 0.5 g × L-1 5 produziert.125 Die Identität der Produkte wurde
später durch Gefriertrocknung der zellfreien Überstände und Untersuchung der Rückstände
per NMR bestätigt. Somit wurde gezeigt, dass die plasmidisch eingeführten Gene, welche für
die Enzyme EntC und EntB codieren, zur Expression funktionsfähiger Enzyme führen und
zur Biosynthese von 4 und 5 befähigen.
62
Spezieller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
A
4.45
mAU
1000
mAU
800
1400
CO2H
OH
1200
1000
600
800
OH
600
400
2,3-trans-CHD (4)
200
400
0
200
220
240
260
280
300
320
340 nm
UV-Spektrum bei 4.45 min
200
0
0
5
10
15
20
25
30
35
min
35
min
B
5.90
mAU
300
250
mAU
1600
1400
CO2H
200
1200
1000
800
OH
150
600
OH
400
200
3,4-trans-CHD (5)
0
100
200
220
240
260
280
300
320
340 nm
UV-Spektrum bei 5.90 min
50
0
0
Abbildung 4.9:
5
10
15
20
25
30
HPLC-Chromatogramm von Fermentationsüberständen und UV-Spektren
der Hauptfermentationsprodukte; aufgetragen sind die Absorption bei
einer Wellenlänge von λ = 275 nm in relativen Einheiten gegen die Retentionszeit; A F68/pC20 ----- ohne Induktion, –––– nach Induktion mit
IPTG; B F68/pC22 ----- ohne Induktion, –––– nach Induktion mit IPTG;
deutlich ist jeweils die Bildung je eines neuen Hauptproduktes nach
Induktion zu erkennen.
Spezieller Teil – Isolierung von CHD aus Fermentationsüberstand
63
4.2 Isolierung von trans-CHD aus Fermentationsüberstand
Die Isolierung von 2,3-trans-CHD (4) aus Fermentationsüberständen wurde bereits von Dr.
D. Franke untersucht. Dabei konnten verschiedene Verfahren etabliert werden: Die Extraktion
aus angesäuerter, wässriger Phase mit polaren Lösungsmitteln, die Reaktivextraktion aus
neutraler Lösung mit Tetraoctylammonium-Ionen als kationischen Löslichkeitsvermittlern
und die Ionenaustauschchromatographie.12 Als für den Labormaßstab am besten geeignetes
Verfahren stellte sich die Ionenaustauschchromatographie heraus. Dieses Verfahren konnte
analog auf das 3,4-trans-CHD (5) übertragen und genutzt werden, um alle im Rahmen dieser
Arbeit eingesetzten, mikrobiell gewonnenen trans-CHD aufzureinigen (Abb. 4.10).
CO2H
CO2H
OH
Fermentationsüberstand
OH
OH
OH
5
4
I
II
III
Zentrifugation, Filtration
basisches Anionentauscherharz
Aufkonzentrieren,
gefriertrocknen
Gehalt 82 % (1H-NMR),
frei von organischen
Verunreinigungen
Aufkonzentrieren,
bei 4 °C auskristallisieren
Gehalt > 98 % (1H-NMR),
frei von organischen
Verunreinigungen
Abbildung 4.10: Schematische Darstellung der Aufreinigung der trans-CHD 4 und 5 aus
Fermentationsüberständen; I Abtrennen der Biomasse; II Aufreinigung der
trans-CHD über Ionenaustauschchromatographie an basischem Anionentauscherharz; III Isolierung der trans-CHD aus dem Eluat.
Die trans-CHD 4 und 5 wurden aus biomassefreien Fermentationsüberständen aufgereinigt,
die durch die Arbeitsgruppe von Dr. R. Takors unter optimierten Fermentationsbedingungen
erhalten wurden. Der erhaltene Überstand wird filtriert, um verbliebene Zellfragmente und
Schwebstoffe abzutrennen. Die Aufreinigung der trans-CHD von organischen Verunreinigungen erfolgt über basisches Anionentauscherharz des Typs DOWEX® 1×8 (Chlorid-Form).
Dieses wird mit 50 mM Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 8 eingestellt. Beim Auftragen
64
Spezieller Teil – Isolierung von CHD aus Fermentationsüberstand
von zellfreiem und verdünntem Fermentationsüberstand verdrängt das bei diesem pH-Wert
deprotoniert vorliegende trans-CHD Chlorid und bindet an das Harz. Die Elution der transCHD erfolgt mit 50 mM – 100 mM Ameisensäure und wird mittels UV-Durchflusszelle bei
einer Wellenlänge von λ = 280 nm verfolgt. Unspezifisch gebundene Verunreinigungen aus
dem Fermentationsüberstand werden zuerst vom Harz eluiert, wohingegen 4 und 5 erst bei
pH-Werten von unter 2.8 bzw. 2.6 im Eluat gefunden werden. Das saure Eluat wird unter
vermindertem Druck bei maximal 40 °C auf etwa ein Zehntel des Ausgangsvolumens aufkonzentriert. Eine vollständige Trocknung unter diesen Bedingungen führt im Falle des 2,3-transCHD zu unerwünschten Nebenreaktionen wie der Dimerisierung mittels Diels-Alder-Reaktion
oder Aromatisierung. Das 3,4-trans-CHD zeigt unter diesen Bedingungen keine Tendenz zur
Dimerisierung, allerdings findet ebenfalls eine langsame Aromatisierung statt.
In einer typischen Aufreinigung des 2,3-trans-CHD (4) werden 8 L Fermentationsüberstand
mit einem Produkttiter von 4.6 g × L-1 4 (entspricht insgesamt 36.8 g 4) auf die konditionierte
Säule aufgetragen. Bei einem pH-Wert von 2.8 werden etwa 13 L einer Produktfraktion mit
deutlich erhöhter UV-Absorption bei λ = 280 nm erhalten. Nach Aufkonzentrieren unter
vermindertem Druck bei 40 °C wird das erhaltene Konzentrat in flachen Schalen gefroren und
gefriergetrocknet. Erhalten werden 26.7 g 4 als blassgelber Schaum, der keine NMRdetektierbaren Verunreinigungen enthält (1H-NMR). Der Gehalt wird mittels 1H-NMR durch
Vergleich mit 3-(Trimethylsilyl)-propionsäure-2,2,3,3-d4 Natriumsalz (TSP) als internem
Standard zu 82 % ermittelt, was auf noch enthaltene Salze zurückzuführen sein dürfte. Dies
entspricht einer erzielten Ausbeute von 59 % bezogen auf die mit dem Fermentationsüberstand aufgetragene Menge an 4.
In einer typischen Aufreinigung des 3,4-trans-CHD (5) werden 4.2 L Fermentationsüberstand
mit einer Produktkonzentration von 7.8 g × L-1 5 (entspricht insgesamt 33 g 5) auf die
konditionierte Säule aufgetragen und mit 94 mM Ameisensäure eluiert. Bei einem pH-Wert
von 2.5 werden etwa 10 L einer Produktfraktion mit deutlich erhöhter UV-Absorption bei
λ = 280 nm erhalten. Nach Aufkonzentrieren unter vermindertem Druck bei 40 °C auf etwa
300 mL kristallisiert 5 aus dem sauren Konzentrat aus. Bei 4 °C kristallisiert 5 über zwei Tage
aus. Nach Aufkonzentrieren der Mutterlauge und erneuter Kristallisation, Filtration und
Waschen des Rückstands mit wenig kaltem Wasser werden 19.7 g 5 als blassgelbes Pulver
mit einem Gehalt von wenigstens 98 % (1H-NMR mit internem Standard TSP) erhalten. Dies
entspricht einer Ausbeute von 60 % bezogen auf das aufgetragene trans-CHD 5.
Spezieller Teil – Synthese racemischer Vergleichssubstanz
65
4.3 Synthese von racemischen 3,4-trans-CHD (rac-5)
Viele enzymatische Umsetzungen zeichnen sich durch hohe Enantioselektivitäten aus.
Speziell Reaktionen des Primärmetabolismus verlaufen oft hoch selektiv, so dass viele
Primärmetaboliten im Rahmen der Nachweisgrenzen enantiomerenrein Gebildet werden. Es
gibt jedoch auch Beispiele für Naturstoffe, die nicht enantiomerenrein oder gar in racemischer
Form isoliert werden. Im Falle von Duftstoffen oder Pheromonen ist die Enantiomeren- oder
auch Diastereomerenzusammensetzung, in der diese Verbindungen vorliegen, in vielen Fällen
für ihre biologische Wirkung entscheidend.126
Der Enantiomerenüberschuss des in der Biosynthese erhaltenen 2,3-trans-CHD (4) wurde von
Dr. V. Lorbach mittels chiraler HPLC und Vergleich mit chemisch synthetisierter,
racemischer Vergleichssubstanz mit über 99 % ermittelt.127 In ähnlicher Weise wird hier der
Enantiomerenüberschuss des mikrobiell produzierten 3,4-trans-CHD (5) bestimmt.
Unter den zuvor beschriebenen Syntheserouten wurden die Synthesen nach Roberts115 oder
Boyd116 zur Herstellung racemischer Vergleichsverbindungen ausgeschlossen, da hierbei
schwer zugängliche Ausgangsverbindungen eingesetzt werden. Wegen schwierig zu realisierender Reaktionsbedingungen wie Drücken von 6.8 kbar wurde auch die Synthese nach
Posner114 verworfen. Im Vergleich der verbleibenden beiden Syntheserouten erscheint die von
Berchtold und Chiasson111 verfolgte als längere Syntheseroute weniger geeignet, so dass die
Synthese nach Ganem und Ikota113 zur Erzeugung racemischer Referenzsubstanz herangezogen wurde (Abb. 4.11).
CO2H
CO2H
Br
2 Stufen
0.1 M NaOH
H2O, 0 °C
171
Br
O
70 %
Br
O
O
NBS, AIBN
CCl4, reflux
Br
O
64 %
Br
rac-173
(de > 95%)
rac-174
rac-175
NaOAc
HMPT, rt
65 %
O
CO2H
CO2H
HO
OH
OH
rac-5
+
OH
rac-194
0.1 M KOH
NH4Cl, H2O, rt
O
Br
O
36 %
O
OAc
rac-176
3
Br
AcO
+
rac-177
:
2
Abbildung 4.11: Nachvollzogene Synthese von rac-5 nach Ganem und Ikota.113
66
Spezieller Teil – Synthese racemischer Vergleichssubstanz
Erster Schritt ist eine Birch-Reduktion von Benzoesäure (171) mit Lithium in flüssigem
Ammoniak. Das erhaltene Dien wird mit Brom zu rac-173 (de > 95 %, 1H-NMR) oxidiert.12
Diese Substanz wurde von Dr. D. Franke und Dr. V. Lorbach für diese Arbeit freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Unter pH-Kontrolle wird rac-173 mit Natriumhydroxid in
Lacton rac-174 überführt, welches in allylischer Position mit N-Bromsuccinimid (NBS)
radikalisch zu rac-175 bromiert wird. In einer SN1-Reaktion wird Bromid unter Retention der
Konfiguration gegen Acetat substituiert. Diese Reaktion erfordert den Einsatz von Hexamethylphosphor-säuretriamid (HMPT) als Lösungsmittel. Versuche, HMPT gegen ungiftigere
aprotische Lösungsmittel wie Aceton oder N,N-Dimethylformamid (DMF) zu substituieren,
schlugen fehl. Das intermediär gebildete Carbeniumion kann in zwei Positionen angegriffen
werden, so dass die regioisomeren Bicyclen rac-176 und rac-177 im Verhältnis von 3 : 2 (1HNMR) erhalten werden. Eine chromatographische Trennung beider Isomere gelang nicht.
Durch Hydrolyse des Lactons, Eliminierung von Bromwasserstoff und Verseifung des Essigsäureesters unter alkalischen Bedingungen in einem Schritt werden rac-194 und rac-5 im
Verhältnis 1 : 1 (1H-NMR) erhalten.
Insgesamt wird rac-5 aus rac-173 in einer Ausbeute von 5 % über vier Stufen erhalten
(Literatur 13 %).113 In dieser Synthese limitierend ist der Schritt der abschließenden Hydrolyse von rac-176 und rac-177, die in 36 % zu Carbonsäure rac-5 und rac-194 führt.
Die in dieser Reaktion erhaltene Mischung von rac-5 und rac-194 wird ohne weitere Aufreinigung in trockenem methanolischen Chlorwasserstoff aufgenommen und zu Methylester rac-
170 neben zum Teil aromatischen, nicht identifizierten Nebenprodukten umgesetzt (Abb.
4.12).
CO2H
CO2H
HO
+
OH
OH
1
rac-5
OH
:
1
rac-194
0.3 M HCl
CH3OH, rt
CO2Me
OH
2d
OH
rac-170
Abbildung 4.12: Veresterung von rac-5 zu rac-170 mit methanolischem Chlorwasserstoff;
eine Ausbeute wurde nicht bestimmt.
Die Untersuchung des Enantiomerenüberschusses erfolgte am nicht weiter aufgereinigten
Rohprodukt. Über einen HPLC-Lauf an achiraler Phase mit einer Detektion bei verschiedenen
Wellenlängen konnte gezeigt werden, dass keines der enthaltenen Nebenprodukte eine im
Vergleich zu rac-170 nennenswerte Absorption bei λ = 280 nm aufweist. Eine vollständige
Spezieller Teil – Synthese racemischer Vergleichssubstanz
67
Trennung der beiden Enantiomere der gesuchten Verbindung gelingt an chiraler Phase
(Chiracel OD-H – Säule der Fa. DAICEL). Als stationäre Phase kommt darin auf Kieselgel
aufgezogene Tris-(3,5-dimethylphenyl-carbamat)-zellulose zum Einsatz (Abb. 4.13).128
OR
RO
Zellulose-tris-(3,5-dimethylphenylcarbamat) auf 5 µm
Kieselgelsubstrat
O
H
N
O
OR
R:
Me
O
Kieselgel
Me
Abbildung 4.13: Zur Enantiomerentrennung von 5 genutzte chirale Phase.
Als Eluent wird eine Mischung von n-Hexan und iso-Propanol (95:5 v/v) isokratisch bei
40 °C eingesetzt. Dabei werden für die racemische Substanz zwei basisliniengetrennte Peaks
gleicher Fläche und gleichen UV-Spektrums nach 33.9 min und 42.3 min detektiert (Abb.
4.14). Für den Methylester des mikrobiell gewonnenen 3,4-trans-CHD 170 wird nur eines der
beiden Enantiomere detektiert. Somit weist das aus Fermentationsüberstand gewonnene transCHD 5 einen Enantiomerenüberschuss von wenigstens 99 % auf.
mAU
25
mAU
CO2Me
CO2Me
CO2Me
140
20
120
15
OH
OH
10
100
OH
OH
ent-170
170
OH
80
OH
60
170
40
5
20
0
0
32
34
36
38
40
42
44
46
min
32
34
36
38
40
42
44
46
min
Abbildung 4.14: HPLC-Chromatogramme von rac-170 (links) und 170 (rechts) im
Vergleich; aufgetragen ist die Absorption bei einer Wellenlänge von
λ = 280 nm in relativen Einheiten [mAU] gegen die Retentionszeit [min];
stationäre Phase: Chiracel OD-H Chromatographiesäule (250 mm ×
4.6 mm) der Fa. DAICEL, mobile Phase: n-Hexan und 2-Propanol (95:5
v/v), 0.5 mL × min-1, T = 40 °C.
68
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
4.4 Untersuchungen zur Folgechemie von 2,3-trans-CHD und
3,4-trans-CHD
Wird die Struktur der beiden mikrobiell gewonnenen Verbindungen 4 und 5 betrachtet, dann
ist deren Potential als Bausteine für chemische Synthesen leicht ersichtlich. Beide Moleküle
sind hochfunktionalisiert und erlauben vielfältige Umsetzungen (Abb. 4.15).
i
i
CO2H
OH
iv
iii
OH
ii
4
i
CO2H
ii
iv
OH
OH iii
Säurefunktion
- Transformation in ein Amid, Ester oder Thioester
- Reduktionen zum Aldehyd oder Alkohol
- Wittig- oder Tebbe-Reaktion
ii unterschiedlich elektronenreiche Doppelbindungen
- regio- und stereoselektive Epoxidierung, cisDihydroxylierung, Aminohydroxylierung,
Bromhydroxylierung oder Dibromierung
- Hydrierung
- Metathese-Reaktion
- Ozonolyse
iii Alkoholfunktionen
- Schutzgruppenchemie
- Substitutions-Reaktionen
- Oxidation zum Keton
5
iv Diensystem
- Diels-Alder-Reaktionen und weitere
Cycloadditionen
Abbildung 4.15: Funktionelle Gruppen der trans-CHD 4 und 5 sowie Beispiele für
mögliche Reaktionen, in welchen diese eingesetzt werden können.
Mit der trans-Diol-Funktionalität sind chirale Zentren im Molekül implementiert, welche als
Strukturmotiv in vielen Naturstoffen zu finden sind.129 Diese Chiralität kann unter geeigneten
Reaktionsbedingungen für eine intramolekulare Übertragung von Stereoinformation und so
für stereoselektive Reaktionen genutzt werden. Zudem weisen beide Verbindungen zwei
konjugierte Doppelbindungen wie auch eine Säurefunktion auf. Die Doppelbindungen lassen
sich auf unterschiedliche Arten oxidieren oder reduzieren, und die Säurefunktion lässt sich
zum Aldehyd, welcher Ausgangspunkt für Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verknüpfungen sein
kann, oder zur in Naturstoffen oft zu findenden Hydroxymethylgruppe reduzieren. Ist
wenigstens eine der Kohlenstoffdoppelbindungen oxidiert oder reduziert, und ist folglich eine
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
69
sonst bevorzugte Aromatisierung vernachlässigbar, so lassen sich auch die Alkoholfunktionen mittels Mitsunobu-Reaktion invertieren, substituieren oder zum Keton oxidieren. Das
Diensystem kann in Cycloadditionen wie Diels-Alder- oder Hetero-Diels-Alder-Reak-tionen
als Dien eingesetzt werden.127,130 Es sind aber auch Beispiele bekannt, in denen eine der
Doppelbindung als Dienophil reagiert.127
Insgesamt versprechen 4 und 5 eine große Vielfalt an Reaktionsmöglichkeiten, die an die in
der Biosynthese genutzte biologische Diversität des Chorismats anknüpfen und ein weites
Spektrum an Strukturen in wenigen Schritten zugänglich macht.
4.4.1
Schutzgruppenchemie
Um 4 und 5 in weiteren Reaktionen modifizieren zu können, ist es vorteilhaft, zunächst
Schutzgruppen einzuführen. Im allgemeinen erleichtern diese die Handhabung der Verbindungen durch eine Reduktion der Polarität. Darüber hinaus sollen Schutzgruppen der Alkoholfunktionen eine Aromatisierung verhindern und die Stereoselektivität nachfolgender Reaktionen beeinflussen. Sterisch anspruchsvolle Silylether wie tertiär-Butyldimethylsilylether
(TBS-Ether) eignen sich besonders für die Abschirmung einer Seite einer Doppelbindung und
ermöglichen eine stereoselektive Reaktionsführung.
Zunächst wird die Säurefunktion als Methylester geschützt (Abb. 4.16). Hierbei ist die Wahl
der Reaktionsbedingungen entscheidend, um Verluste durch Aromatisierung zu vermeiden.
An 4 wurden unterschiedliche Methoden zur Veresterung getestet. Dr. D. Franke untersuchte
die Veresterung des 2,3-trans-CHD mit (Trimethylsilyl)-diazomethan.12 Hierbei wird
Methylester 186 unter milden Bedingungen in hohen Ausbeuten ohne Nebenreak-tionen
gewonnen. Allerdings verbietet sich dieses Reagenz aus ökonomischen und ökolo-gischen
Aspekten für größere Ansätze. Daher wurde die sauer katalysierte Veresterung in trockenem
Methanol etabliert. Dr. D. Franke erreichte dies durch den Einsatz von Trimethy-lsilylchlorid,
welches durch Reaktion mit dem Alkohol Chlorwasserstoff freisetzt.12 Hierbei wird eine
teilweise Aromatisierung als unerwünschte Nebenreaktion gefunden. Diese Reaktionsbedingungen wurden als Ausgangspunkt gewählt und optimiert. Es zeigte sich, dass sowohl
eine Reaktionsbeschleunigung durch Erhitzen wie auch zu saure Bedingungen wie
beispielsweise durch Einsatz von Thionylchlorid zur Eliminierung von Wasser und schnellen
Aromatisierung führen. Als geeignet erwies sich letztlich der Einsatz von 0.3 M
70
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
methanolischer Chlorwassestoff-Lösung bei Raumtemperatur, welcher in einer mehrtägigen
Reaktion in quantitativer Ausbeute zum gewünschten Produkt führt. Aromatisierte
Nebenprodukte werden nicht gefunden. Problematisch bei dieser Reaktion bleibt die
Aufarbeitung. Nach Neutralisation mit 0.5 M wässriger Ammoniak-Lösung, Entfernen eines
großen Teils des Methanols unter vermindertem Druck bei 40 °C und Zusatz von NaClLösung gelingt auch bei vielfacher Wiederholung keine vollständige Extraktion des Produktes
mit Ethylacetat. Daher wurde durch Zusatz equimolarer Mengen Triethylamin eine
wasserfreie Aufarbeitung etabliert. Das Produkt wird nach erfolgter Neutralisation bei 40 °C
unter vermindertem Druck auf Kieselgel aufgezogen und anschließend chromatographisch
aufgereinigt. Auf diesem Wege lässt sich Methylester 196 quantitativ bezogen auf die
eingesetzte Säure 4 isolieren. Der erhaltene wachsartige Feststoff lässt sich aus Diethylether
und Dichlormethan (1:1, v/v) zu farblosen Kristallen umkristallisieren.
Die Veresterung von 5 zu Methylester 170 erfolgt unter den gleichen Bedingungen sauer
katalysiert in trockenem Methanol. Hier wird eine quantitative Umsetzung in zwei Tagen
beobachtet. Die Aufarbeitung dieser Reaktion gestaltet sich hingegen unkomplizierter als im
Falle des 2,3-trans-CHD. Da Methylester 170 im Gegensatz zu 196 mit Ethylacetat leicht aus
wässriger Phase extrahiert werden kann, wird die Reaktionslösung mit 0.5 M wässriger
Ammoniak-Lösung neutralisiert und mit gesättigter NaCl-Lösung versetzt. Unter vermindertem Druck wird der überwiegende Teil des Methanols entfernt, und das Produkt wird
durch dreifache Extraktion mit Ethylacetat quantitativ gewonnen. Das so erhaltene gelbe
Rohprodukt besitzt eine hohe Reinheit und weist außer Resten an Ethylacetat keine weiteren
NMR-detektierbaren Verunreinigungen auf. Es wird ohne weitere Aufreinigung in Folgereaktionen eingesetzt. Für analytische Zwecke kann der Ester chromatographisch an Kieselgel
aufgereinigt werden, wobei ein blassgelber Wachs erhalten wird.
CO2H
OH
0.3 M HCl
MeOH
rt, 72 h, quant.
CO2Me
OH
OH
4
OH
196
CO2H
0.3 M HCl
MeOH
rt, 48 h, quant.
CO2Me
OH
OH
OH
OH
5
170
Abbildung 4.16: Sauer katalysierte Veresterung der Säurefunktionen von 4 und 5 zu
Methylester 196 und 170.
Die Alkoholfunktionen der erhaltenen Methylester 196 und 170 werden vor weiteren Umsetzungen mit Schutzgruppen versehen. Bereits etabliert ist die Einführung von tertiär-Butyldi-
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
71
methylsilyl-Ethern als Schutzgruppen für die Alkoholfunktionen des Methylesters 196.12,127
Dies gelingt unter Einsatz von 2.2 Äquivalenten TBS-Triflat und 2.3 Äquivalenten Triethylamin bei Raumtemperatur in Dichlormethan in 96 % isolierter Ausbeute an 160 (Abb. 4.17).
Eine Übertragung dieser Reaktionsbedingungen auf 170 führt hingegen zu beinahe vollständiger Aromatisierung. Erst der Einsatz der sterisch anspruchsvolleren Hünig-Base (Ethyldiiso-propylamin) bei 0 °C verhindert dies. Unter diesen Bedingungen gelingt die Einführung
der TBS-Schutzgruppen in 89 % isolierter Ausbeute (Abb. 4.17).
CO2Me
OH
OH
2.2 eq. TBSOTf, 2.3 eq. NEt3
CH2Cl2, 0 °C
rt, 1 h
CO2Me
CO2Me
OTBS
96 %
OH
OTBS
196
2.2 eq. TBSOTf, 2.3 eq. NEt(iPr)2
CH2Cl2, 0 °C, 1 h
89 %
OH
170
160
CO2Me
OTBS
OTBS
185
Abbildung 4.17: Einführung von TBS-Gruppen als Alkoholschutzgruppen an 196 und 170.
Im Gegensatz zu Diol 196, bei dem unter Einsatz eines Äquivalents TBS-Triflat eine selektive
Einführung der TBS-Gruppe gelingen soll,131 wird bei 170 in Reaktion mit einem Äquivalent
TBS-Triflat bei 0 °C keine regioselektive Reaktion beobachtet. Vielmehr werden beide
monogeschützten Produkte etwa im gleichen Verhältnis erhalten. Daneben werden als
Nebenprodukt geringe Mengen der doppelt geschützten Verbindung 185 wie auch nicht
umgesetztes Diol 170 gefunden.
Neben Bis-TBS-Ether 185 wurden Derivate von 170 mit alternativen Alkoholschutzgruppen
synthtisiert. Die Alkoholfunktionen wurden als Methoxymethylether (MOM), als zyklischer
Ether und als Bisessigsäureester geschützt. Der Bismethoxymethylether wurde unter
Standardbedingungen132 mit einem sechsfachen Überschuss an Chlormethylmethylether
(MOMCl) und sieben Äquivalenten Hünig-Base in Dichlormethan bei Raumtemperatur
eingeführt. Die Reaktion liefert das erwartete Produkt 197 in 73 % Ausbeute (Abb. 4.18).
Eine Ausbeutesteigerung war trotz Variation der Reagenzienverhältnisse nicht möglich.
CO2Me
OH
OH
170
6 eq. MOMCl, 7 eq. NEt(iPr)2
CH2Cl2, rt, 16 h
73 %
CO2Me
OMOM
OMOM
197
Abbildung 4.18: Einführung von MOM-Gruppen als Alkoholschutzgruppen an 180.
72
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
Werden zusätzlich zwei Äquivalente Tetrabutylammoniumiodid zugesetzt, wird neben dem
erwarteten Bismethoxymethylether überraschenderweise in 45 % Ausbeute der zyklische
Ether 198 als Hauptprodukt erhalten (Abb. 4.19). Literaturbeschrieben ist eine Beschleunigung der Reaktion zum Methoxymethylether in Gegenwart von Iodid, wobei in situ eine
Umsetzung des Chlormethylethers zum reaktiveren Iodmethylether angenommen wird.133
Eine befriedigende Erklärung für die gefundene Reaktion liefert diese Annahme allerdings
nicht.
CO2Me
CO2Me
5 eq. MOMCl, 2.5 eq. NEt(iPr)2
2 eq. NBu4I
CH2Cl2, 0 °C
rt, 16 h
OH
O
45 %
OH
O
170
O
198
Abbildung 4.19: Bildung des 1,3,5-Trioxepins 198 aus 170.
Für Chlormethylmethylether ist beschrieben, dass in dem Reagenz technischer Qualität stets
mit einem bis zu 8 % betragenden Anteil an Bis(chlormethyl)ether zu rechnen sei,134 der
direkt für die Bildung des Trioxepins verantwortlich sein kann. Dieser kann in Gegenwart von
Säure, welche durch Feuchtigkeit oder während der Reaktion mit den Alkoholfunktionen aus
dem Reagenz freigesetzt wird, oder einer Lewis-Säure über eine Gleichgewichtsreaktion
entstehen (Abb. 4.20 A).134,135
Denkbar ist zunächst die Bildung von Bis-MOM-Ether 197, welcher zu 198 zyklisiert.
Versuche, das zyklische Produkt unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen aus dem
isolierten Bis-MOM-Ether 197 herzustellen, waren jedoch nicht erfolgreich (Abb. 4.20 B).
A
2
O
Cl
O
CO2Me
B
O
197
O
O
TiCl4
H3O+ oder
Lewissäure
O
+
O
Cl
O
O
Cl
CO2Me
O
O
O
+
CH3OCH3
O
198
Abbildung 4.20: A Lewissäure-katalysierte Disproportionierung von MOMCl;135
B Schematische Darstellung der versuchten Überführung von 197 in 198.
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
73
Wird eine Lösung von 197 in Dichlormethan mit fünf Äquivalenten MOMCl, zwei Äquivalenten Hünig-Base und Tetrabutylammoniumiodid versetzt, so wird nach drei Tagen keine
Umsetzung zum zyklischen Produkt 198 beobachtet. Der Einsatz von Chlorwasserstoff führt
ebenso wenig zum Erfolg wie der Einsatz von Scandium(III)triflat, welches als Lewissäure
die Bildung eines Methoxymethylethers katalysiert.136 Ebenfalls nicht erfolgreich waren
Versuche, das freie Diol direkt säure- oder lewissäurekatalysiert mit Paraformaldehyd137,
Formaldehyddimethylacetal138 oder DMSO139 in Trioxepin 198 oder den Bismethoxymethylether 197 zu überführen. Aufgrund der hohen Toxizität der Reagenzien, welche zur Einführung des 1,3,5-Trioxepins und der MOM-Schutzgruppen nötig sind, wurde von einem
breiteren Einsatz in den im folgenden beschriebenen Umsetzungen abgesehen.
Die Veresterung von 170 gelingt nicht unter basischen Standardbedingungen mit Acetanhydrid und Pyridin.140 Statt dessen wird die vollständige Aromatisierung des Eduktes gefunden. Erfolgreich verläuft die Reaktion hingegen nach einer Methode, bei der das Diol in Acetanhydrid gelöst und nach Zugabe von 0.05 mol% der Lewis-Säure Scandium(III)triflat zu
Bisessigsäureester 199 umgesetzt wird (69 % Ausbeute) (Abb. 4.21).141 Markó und Dumeunier stellten die Hypothese auf, dass das in situ gebildete gemischte Anhydrid AcOTf im
wesentlichen für die Katalyse verantwortlich sei.142 Versuche, Scandium(III)triflat durch neutrales Lithiumtriflat als Katalysator zu ersetzen,143 waren bei dieser Umsetzung nicht
erfolgreich. In diesem Fall wird über drei Stunden keine Reaktion beobachtet.
CO2Me
OH
OH
170
0.05 mol % Sc(OTf)3
Ac2O, 0 °C, 1 h
CO2Me
OAc
69 %
OAc
199
Abbildung 4.21: Veresterung der Alkoholfunktionen in 170 mit Acetanhydrid.
Der erhaltene Bisessigsäureester 199 erweist sich aufgrund der elektronenziehenden Eigenschaften der Acetylgruppen als recht empfindlich und neigt zur Aromatisierung. Im Vergleich
zu allen anderen hier getesteten Schutzgruppen stellen Acetylgruppen die bei weitem besten
Abgangsgruppen dar und begünstigen somit unerwünschte Eliminierungsreaktionen.
Als Ausgangsverbindung für Untersuchungen zur Folgechemie wurde aus Gründen der Handhabbarkeit und der Vergleichbarkeit zu den an 160 untersuchten Reaktionen der Bis-TBSEther 185 ausgewählt.
74
4.4.2
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
Vergleich verschiedener Derivate des 3,4-trans-CHD
Für Derivate des 3,4-trans-CHD sind zwei bevorzugte Konformationen denkbar (Abb.
4.22).144 In Konformationsisomer I sind die Sauerstoffsubstituenten pseudo-axial ausgerichtet,
wohingegen diese Funktionen in Konformationsisomer II pseudo-äquatorial orientiert sind.
Da im vorhandenen Diensystem keine anderen axialständigen Reste vorhanden sind, führt
Konformation I anders als bei Cyclohexanderivaten nicht zu Abstoßungen pseudo-axial orientierter Substituenten und ist energetisch günstig. Eine Betrachtung der potentiellen Energie
der Moleküle in Abhängigkeit des Diederwinkels mittels einfacher Kraftfeld-Analyse unterstützt die Annahme zweier Möglicher Vorzugskonformationen.
MeO2C
O
O
R
R
I
II
Abbildung 4.22: Schematische Darstellung zweier energieminimierter Konformationen;e im
Konformationsisomer I weisen die rot dargestellten Sauerstoffsubstituenten eine pseudo-axiale Ausrichtung bezogen auf den Cyclohexadienring auf, im Konformationsisomer II wird eine pseudo-äquatoriale
Anordnung gefunden.
So werden für 185, 197 und 199 je nach Ausgangskonformation vor der iterativen Energieminimierung je ein lokales Energieminimum für Konformation I und II gefunden.
Der Circulardichroismus mit unterschiedlichen Schutzgruppen versehener Derivate des 3,4trans-CHD wurde in Acetonitril vermessen und verglichen. Als Chromophore treten dabei die
konjugierten Doppelbindungen und die Esterfunktion in Erscheinung, wobei die isolierten
Esterfunktionen der Acetyl-geschützten Verbindung 199 als Chromophore keinen wesentlichen Einfluss auf den Verlauf des erhaltenen Spektrums haben.
Es zeigt sich, dass alle mit konformativ nicht fixierten Schutzgruppen versehenen Derivate
ein vom Verlauf her vergleichbares Spektrum und daher eine vergleichbare mittlere Konformation und ein Minimum bei λ ≈ 235 nm aufweisen, wohingegen die Spektren des freien
Diols 170 und des rigiden Bicyclus 198 einen von den anderen Derivaten deutlich abweichene
Alle 3D-Modelle sind Gasphasenstrukturen und wurden mit dem Computerprogramm "MM2 force field"
berechnet, welches Bestandteil von "CS Chem3D Ultra 8.0", Cambridgesoft Corporation, Cambridge, USA,
2003 ist. Hierzu wurden die sterischen Abstoßungen wie auch die Hybridisierungsenergien aller Atome iterativ
minimiert.
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
75
den Verlauf zeigen und bei λ = 301 nm bzw. λ = 283 nm ein lokales Maximum zeigen (Abb.
4.23).
9
MeO2C
O
O
∆ε
[L×mol-1 0
-1
]
×cm
Mol. CD
198 R = -CH2-O-CH2170 R = -H
197 R = -MOM
185 R = -TBS
199 R = -Ac
-10
-12
210
R
R
250
300
350
Wavelength[nm]
λ [nm]
Abbildung 4.23: Dargestellt sind die molekularen CD-Spektren von 170, 185, 197, 198 und
199 gemessen in Acetonitril.
Nach der "Dien-Helizitäts-Regel"145 für verzerrte, konjugierte Diene gilt, dass positive
Cotton-Effekte durch Anregung eines π-π*-Übergangs für solche Diensysteme erwartet
werden, die einen positiven Torsionswinkel Θ aufweisen, wohingegen negative CottonEffekte auf einen negativen Torsionswinkel hindeuten.146 Der Torsionswinkel Θ des Diensystems nimmt für Konformationsisomer II positive Werte an, für Konformationsisomere I
hingegen werden negative Werte für Θ erwartet (Abb. 4.24).
OR
MeO2C
H
H
H
Θ
MeO2C
OR
OR
Θ
H
OR
Konformation I
Konformation II
Θ < 0°
Θ > 0°
Abbildung 4.24: Schematische Darstellung der Konformationsisomere I und II für Derivate
des 3,4-trans-CHD und der Dihedralwinkel Θ des Diensystems; R = -H,
-TBS, -Ac, -MOM, -CH2OCH2-.
76
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
Burgstrahler und Mitarbeiter beobachteten einen wesentlichen Beitrag allylischer, pseudoaxialständiger Substituenten zum Circulardichroismus von Cyclohexadien-Verbindungen und
formulierten die "Allyl-Axial-Chiralitäts-Regel".147 Danach führen allylische, pseudo-axialständige Substituenten X mit positivem bzw. negativen Dihedralwinkel Θ´ Xaxial-Callyl-C=C zu
einem positiven bzw. negativen Cottoneffekt. Die Rotationsstärke nimmt mit von Wasserstoff
abweichenden, pseudo-axialständigen Substituenten zu und wird auch für allylische Sauerstoffsubstituenten gefunden.148 Für Derivate des 3,4-trans-CHD werden im Falle des Konformationsisomers I zwei pseudo-axialständige Sauerstoffsubstituenten erwartet, die beide einen
negativen Dihedralwinkel mit der jeweils benachbarten Doppelbindung bilden (Abb. 4.25).
Nach der "Allyl-Axial-Chiralitäts-Regel" wird in diesem Fall ein deutlicher negativer
Cottoneffekt erwartet. Für Konformationsisomer II weisen die beiden allylischen Wasserstoffe eine pseudo-axiale Ausrichtung auf und schließen mit der jeweils benachbarten
Doppelbindung einen positiven Dihedralwinkel ein. Erwartet wird in diesem Fall ein betraglich geringer, positiver Cottoneffekt.
H Θ´
H
RO
Θ´
RO
Konformation I
Konformation II
Θ´ < 0°
Θ´ > 0°
Abbildung 4.25: Schematische Darstellung der für Konformationsisomer I und II für
Derivate des 3,4-trans-CHD zwischen pseudo-axialständigem Substituenten und einer Doppelbindung gefundenen Dihedralwinkel Θ´; R = -H,
-TBS, -Ac, -MOM, -CH2OCH2-.
Dies wird qualitativ anhand der vermessenen Derivate des 3,4-trans-CHD bestätigt. Die
molekulare Absorbtionsdifferenz ∆ε für das konformativ fixierte bicyclische System 198,
welches ausschließlich als Konformationsisomer II vorliegt, ist mit ∆ε (λ = 283 nm) = + 2.6
betraglich deutlich kleiner als der negative Cotton-Effekt ∆ε (λ = 267 nm) = – 8.7, der für
Bis-TBS-Ether 185 gefunden wird. Wie später in diesem Kapitel diskutiert liegt auch 170 in
verschiedenen Lösungsmitteln überwiegend als Konformationsisomer II vor, was den
betraglich bedeutenden Effekt verdeutlicht, der von den pseudo-axialständigen Sauerstoffsubstituenten ausgeht und der dafür verantwortlich ist, dass das geringer populierte Konforma-
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
77
tionsisomer I, für das sich die Effekte des verdrillten Diensystems wie auch der allylischen
Substituenten additiv verstärken, den Verlauf des CD-Spektrums dominiert.
Aufschlussreich ist ein Vergleich der 3JH,H-Kopplungen, die zwischen den allylischen Protonen des Cyclohexadienrings verschiedener Derivate des 3,4-trans-CHD gefunden werden.
Wird näherungsweise angenommen, dass Hydroxy- und Etherfunktionen aufgrund des –IEffektes einen vergleichbaren Einfluss auf die Kopplungskonstanten haben, lassen sich die
gefundenen Werte direkt vergleichen. Der für den Triester 199 gefundene Wert ist tendenziell
niedriger, da beschrieben ist, dass elektronegative Sustituenten an der für die 3JH,H-Kopplung
maßgeblichen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung den Betrag der Kopplungskonstante
verringern.149
Für das konformativ rigide Trioxepinsystem 198 wird im Vergleich aller untersuchter Derivate von 170 mit 3JH,H = 14.1 Hz die größte vicinale Kopplungskonstante der allylischen Protonen gefunden. Es wird angenommen, dass Trioxepin 198 in Lösung ausschließlich als Konformationsisomer II vorliegt. Aufgrund der gefundenen vicinalen Kopplungskonstanten der
allylischen Protonen für die untersuchten Derivat von 170, die in allen Fällen über 8 Hz
liegen, kann ausgeschlossen werden, dass eine dieser Verbindungen in Lösung ausschließlich
als Konformationsisomer I vorliegt. Für Konformationsisomer I wird für die pseudo-äquatorial orientierten allylischen Protonen nach der von Karplus aufgestellten Beziehung zwischen
Diederwinkel und 3JH,H-Kopplungen eine deutlich kleinere Kopplungskonstante erwartet.150
Für den vom 2,3-trans-CHD abgeleiteten Bis-TBS-Ether 160 wird hingegen eine sehr kleine
Kopplungskonstante von 3JH,H = 1.6 Hz zwischen den allylischen Protonen des Cyclohexadienringes gefunden. Nach Karplus150 wird ein Diederwinkel zwischen 60° und 120° erwartet,
wie er im energieminimierten Gasphasenmodell, das Konformationsisomer I entspricht, mit
64° auch gefunden wird. Daher wird angenommen, dass 160 in Lösung ausschließlich als
Konformationsisomer I vorliegt. In Übereinstimmung mit dieser Annahme und dem oben
erläuterten Einfluss pseudo-axial-ständiger Substituenten auf den Circulardichroismus wird
für 160 mit ∆ε (λ = 282 nm) = + 16.8 ein betraglich deutlich größerer Cotton-Effekt als für
alle untersuchten Derivate von 170 gefunden.
Weiterhin wird angenommen, dass für Derivate von 170, welche als Konformationsisomer I
vorliegen, eine vergleichbare Kopplungskonstante der allylischen Protonen wie für 160 zu erwarten ist. Mit Hilfe dieser Annahmen und den für 198 und 160 beobachteten Kopplungskonstanten lassen sich näherungsweise Aussagen über das Verhältnis beider Konformationsisomere zueinander aus der im 1H-NMR gefundenen mittleren Kopplungskonstante herleiten.
78
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
Es wird angenommen, dass die untersuchten Substanzen in einer der beiden Konformationen I
oder II vorliegen, und dass übergangsweise durchlaufene Konformationen keinen wesentlichen Beitrag zur mittleren Kopplungskonstante liefern und vernachlässigt werden dürfen.
Eine Berechnung der Konformationsverteilung aus der gefundenen mittleren Kopplungskonstante erfolgt daher unter der Annahme des folgenden Zusammenhangs,f
3
JH,H = x • 3JH,H II + (1 – x) • 3JH,H I
wobei x der Anteil der Substanz ist, welcher als Konformationsisomer II vorliegt. Als 3JH,H II
wird die im Trioxepinsystem 198 gefundene vicinale Kopplungskonstante von 14.1 Hz eingesetzt, als 3JH,H I wird die Kopplungskonstante des 2,3-trans-CHD mit TBS-Ethern 160 von
1.6 Hz angenommen. Eine Auswertung der gefundenen Kopplungskonstanten nach diesem
Schema führt zu folgenden zu erwartenden Verteilungen (Tabelle 5).
3
Verbindung
JH,H [Hz]
(CDCl3)
Anteil der
Konformationsisomere
I : II
198
14.1
0 : 100
170
13.7
3 : 97
185
11.6
20 : 80
197
10.1
32 : 68
199
8.5
45 : 55a
160b
1.6
100 : 0
Tabelle 5: Vergleich der 3JH,H-Kopplungskonstanten (400 MHz, CDCl3) und der daraus
abgeleiteten Verhältnisse der Konformationsisomere zueinander. a) Da durch den
elektronenziehenden Effekt der Acetylgruppen eine Veringerung der beobachteten
Kopplungskonstante zu erwarten sind, ist dieser rechnerisch ermittelte Anteil für
Konformationsisomer II tendenziell zu klein; b) 160 ist ein von 2,3-trans-CHD
abgeleitetes Derivat, das zum Vergleich mit aufgeführt wird.
Werden die Ergebnisse der NMR-Messungen mit den qualitativen Aussagen verglichen, die
mittels Circulardichroismus erhaltenen werden, so zeigt sich ein ähnliches Bild, wonach der
Anteil an Konformationsisomer II laut 1H-NMR in der Reihenfolge 198 > 170 > 185 > 197 >
199 (198 > 170 > 197 > 185 > 199 qualitativ nach Vergleich der CD-Spektren) abnimmt. Der
beobachtete Positionstausch von 197 und 185 in beiden Messreihen kann auf unterschiedliche
f
Die dargestellte Formel wird analog der Beziehung zur Bestimmung mittlerer Kopplungskonstanten nach E.
Breitmaier, "Vom NMR-Spektrum zur Strukturformel organischer Verbindungen", 2. Auflage, B. G. Teubner
Verlag, Stuttgart, 1992, 40-43 aufgestellt.
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
79
Populationen der Konformationsisomere in Abhängigkeit vom Lösungsmittel zurückzuführen
sein.
Die Abhängigkeit der Lage des Konformationsgleichgewichtes vom Lösungsmittel wurde
durch NMR-Messungen von Diol 170 und Bis-TBS-Ether 185 in verschiedenen deuterierten
Lösungsmitteln bei Raumtemperatur bestätigt. Es wird beobachtet, dass die 3JH,H-Kopplungen
der allylischen Protonen tendenziell mit steigender Polarität des Lösungsmittels kleiner
werden und folglich der Anteil des Konformationsisomers mit pseudo-äquatorial orientierten
Protonen zunimmt (Tabelle 6). Hauptkonformationsisomer bleibt aber in allen Fällen das
Konformationsisomer II mit pseudo-axial orientierten allylischen Protonen.
170
Lösungsmittel
(Dielektrizitätskonstante
ε [F × M-1])a
3
JH,H [Hz]
185
abgeleitetes
Verhältnis der
Konformationsisomere
3
JH,H [Hz]
I : II
abgeleitetes
Verhältnis der
Konformationsisomere
I : II
Benzen-d6 (2.3)
13.6
4 : 96
11.3
22 : 78
CDCl3 (4.8)
13.7
3 : 97
11.6
20 : 80
Aceton-d6 (21.0)
-
-
10.0
33 : 67
MeOH-d4 (33.0)
12.1
16 : 84
10.5
29 : 71
DMSO-d6 (47.2)
11.8
18 : 82
10.1
32 : 68
Tabelle 6: Vergleich vicinaler Kopplungskonstanten der allylischen Protonen bei 170 und
185 in unterschiedlichen Lösungsmitteln und der aus den vicinalen Kopplungskonstanten abgeleiteten Konformationsisomeren-Anteile; a) Die Dielektrizitätskonstante der nicht deuterierten Lösungsmittel dient als Maß für die Polarität.151
Im Falle von Verbindung 185 wurde versucht, das Vorliegen der beiden Konformationsisomere in einem 1H-NMR-Experiment in Aceton-d6 bei – 21 °C nachzuweisen. Bei diesem
Experiment wurde jedoch keine Aufspaltung der Signale der beiden allylischen Protonen
beobachtet. Vermutlich sind tiefere Temperaturen notwendig, um den Konformationswechsel
langsam im Vergleich zur Relaxationszeit der Protonen und somit in 1H-NMR-Experimenten
sichtbar werden zu lassen. Beobachtet wurde jedoch eine Änderung der vicinalen Kopplungskonstante von
3
JH,H 23 °C = 10.0 Hz auf
3
JH,H - 21 °C = 11.7 Hz, was unter den gemachten
Annahmen einer Zunahme des als Konformationsisomer II vorliegenden Anteils von 67 % auf
80
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
81 % entspricht. Somit scheint Konformationsisomer II das thermodynamisch bevorzugte
Konformationsisomer zu sein.
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
4.4.3
81
Epoxidierung
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Methoden untersucht, verschiedene CHD-Derivate in Epoxide zu überführen. Angewandt wurden die Oxidation mittels
mCPBA, die Oxidation über ein in situ gebildetes Dioxiran, wie auch die Umsetzung einer βAcetoxy-Bromverbindung zum Epoxid via intramolekularer SN-Reaktion. Diese Methoden
und Verfahren werden im Folgenden vorgestellt und diskutiert.
4.4.3.1 Oxidation mittels meta-Chlorperbenzoesäure
Dr. D. Franke und Dr. V. Lorbach untersuchten bereits ausführlich die Oxidation von
Derivaten des 2,3-trans-CHD zu Epoxiden.12,127 Dabei wurde gefunden, dass 160 mit mCPBA
in Dichlormethan unter Zusatz von festem Natriumhydrogencarbonat hoch regio- und
stereoselektiv zu 161 oxidiert werden kann. Die Regioselektivität lässt sich durch den –MEffekt der Carbonylgruppe auf die dreifach substituierte Doppelbindung erklären. Die
gefundene Stereoselektivität kann mit dem sterischen Anspruch des allylischen TBS-Ethers
begründet werden, welcher einen suprafacialen Angriff verhindert.
Wird statt des TBS-geschützten Derivates 160 das freie Diol 196 oxidiert, so findet die Oxidation mit gleicher Regio- aber entgegengesetzter Stereoselektivität statt. Die Doppelbindung
wird suprafacial zum allylischen Alkohol angegriffen, und die Epoxidfunktion wird cisständig zu diesem eingeführt. 200 wird als einziges Produkt gefunden. Erklären lässt sich die
dirigierende Wirkung der Alkoholfunktion über eine Wasserstoffbrückenbindung, mit der das
Oxidationsmittel mCPBA am allylischen Alkohol koordiniert (Abb. 4.26).152
CO2Me
OTBS
OTBS
160
mCPBA, NaHCO3
CH2Cl2, rt,
74 %
CO2Me
OTBS
CO2Me
OH
OTBS
OH
O
161
196
CO2Me
OH
mCPBA, NaHCO3
CH2Cl2, rt
56 %
OH
O
200
Abbildung 4.26: Oxidation von Derivaten des 2,3-trans-CHD mit mCPBA nach Dr. D.
Franke.12
Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, Derivate des 3,4-trans-CHD unter vergleichbaren
Bedingungen zu oxidieren. Wird das freie Diol 170 mit mCPBA in Gegenwart von Natriumhydrogencarbonat in Dichlormethan oxidiert, so werden zwei Regioisomere im Verhältnis 3:1
(1H-NMR) erhalten. Eine Trennung wie auch ein Beweis der Stereochemie beider Epoxide
82
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
gelangen nicht. In Analogie zum 2,3-trans-CHD ist anzunehmen, dass es sich um die Epoxide
201 und 202 handelt (Abb. 4.27).
mCPBA
NaHCO3
CH2Cl2, rt
16 h
CO2Me
OH
CO2Me
O
+
O
OH
87 %
OH
170
MeO2C
OH
OH
201
OH
202
3
:
1
Abbildung 4.27: Oxidation von 170 mit mCPBA; dargestellt sind die analog zur Epoxidation von 196 angenommene Stereochemie der Produkte 201 und 202.
Für diese Annahme spricht auch die von Campbell und Mitarbeiter untersuchte Oxidation von
cis-CHD 203 mit mCPBA. Dabei wurde die Bildung zweier Regioisomere 204 und 205 im
Verhältnis 1:1 beobachtet, deren Stereochemie jeweils als all-cis bestimmt wurde (Abb.
4.28).153
CO2Me
mCPBA
CH2Cl2, rt, 12 h
OH
CO2Me
MeO2C
O
+
O
OH
52 %
OH
203
OH
204
1
OH
OH
205
1
:
Abbildung 4.28: Epoxidierung von cis-CHD 203 mit mCPBA nach Campbell et al.153
Versuche, 185 unter den gleichen Bedingungen mit mCPBA umzusetzen, verliefen im
Gegensatz zur analogen Reaktion beim 2,3-trans-CHD weder regio- noch stereoselektiv. Es
werden vier isomere Produkte im Verhältnis 38:26:22:14 (1H-NMR) zueinander gebildet.
Eine chromatographische Trennung der Isomere gelingt nicht. Der Vergleich mit auf anderem
Wege erhaltenen Referenzsubstanzen erlaubt die Zuordnung der beiden Epoxide 206 und 207
(Abb. 4.29).
CO2Me
OTBS
OTBS
185
mCPBA
NaHCO3
CH2Cl2, rt,
16 h
50 %
CO2Me
O
CO2Me
+ O
OTBS
OTBS
206
:
38
MeO2C
+
OTBS
OTBS
207
:
26
MeO2C
O
O
+
OTBS
OTBS
208
:
22a
OTBS
OTBS
209
14a
Abbildung 4.29: Oxidation von 185 mit mCPBA; a) eine Zuordnung der Stereochemie zu
beiden Produkten gelang nicht; dargestellt ist die angenommene Stereochemie.
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
83
Wird das bicyclische 3,4-trans-CHD-Derivat 198 mit mCPBA oxidiert, so werden zwei
Oxidationsprodukte im Verhältnis 2 : 1 (1H-NMR) erhalten. Die Regiochemie ist eindeutig
aus den NMR-Spektren zu ermitteln, die Stereochemie der Produkte kann aus den NMRDaten nicht eindeutig geklärt werden. Weiterhin ist eine Verbindung in etwa 4 % bezogen auf
das Hauptprodukt entstanden, die als Diastereomer des Hauptproduktes interpretiert werden
kann. In Analogie zu im Folgenden dargestellten Ergebnissen kann vermutet werden, dass in
beiden Hauptprodukten die Epoxide cis zur jeweils benachbarten Etherfunktion eingeführt
wurden (Abb. 4.30).
CO2Me
O
O
mCPBA
NaHCO3
CH2Cl2, rt
CO2Me
MeO2C
O
+
O
O
65 %
O
O
198
O
O
O
210
2
O
211
:
1
Abbildung 4.30: Epoxidierung von 198 mit mCPBA; die Stereochemie der Produkte wurde
nicht bewiesen; dargestellt ist die angenommene Stereochemie der
Produkte.
4.4.3.2 Oxidation mit Caro´scher Säure mittels eines Dioxirans
Die regioselektive Oxidation der zweifach substituierten Doppelbindung im 3,4-trans-CHD
gelingt unter den von Yang und Mitarbeitern publizierten Bedingungen über ein in situ
gebildetes Dioxiran.154 Dieses geht aus der Oxidation von Trifluoraceton mit Caro´scher
Säure hervor (Abb. 4.31). Nach der Übertragung eines Sauerstoffatoms auf die zu oxidierende
Doppelbindung wird das Keton zurückerhalten und steht erneut als Sauerstoffmediator zur
Verfügung.
KHSO5
KHSO4
O O
F3C
CH3
O
O
F3C
CH3
Abbildung 4.31: Schematische Darstellung der Oxidation eines Olefins mittles in situ
erzeugtem Dioxiran zum Epoxid.
84
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
Das Keton wird dennoch in vielen Fällen im Überschuss zugesetzt, da es durch stark pHabhängige Nebenreaktionen, zu denen die Baeyer-Villiger-Oxidation maßgeblich beiträgt,
kontinuierlich dem Reaktionsgemisch entzogen wird.155
Erste Versuche von Curci und Mitarbeitern, eine stereoselektive Übertragung des Sauerstoffs
auf prochirale Alkene mittels chiraler Ketone durchzuführen, waren wenig erfolgreich und
führten zu Produkten mit einem Enantiomerenüberschuss von bis zu 20 %.156 Deutlich höhere
Enantiomerenüberschüsse erzielten Yang und Mitarbeiter durch den Einsatz des zyklischen
BINAP-Ketons 212157 wie auch Shi und Mitarbeiter mit einem von Fructose abgeleiteten
chiralen Keton 213.158 Durch Optimierung der Reaktionsbedingungen gelang es, den Verlust
an Keton durch Nebenreaktionen zu minimieren, so dass in vielen Fällen das Keton mit etwa
10 mol% substöchiometrisch eingesetzt werden kann.157 Bloch und Mitarbeiter beschreiben in
einem Fall die direkte Oxidation von Alkenen mittels Persulfat in methanolisch-wässriger
Lösung ohne Anwesenheit eines Ketons.159
Über den genauen Mechanismus der Reaktion ist wenig bekannt, und zwei mögliche Übergangszustände wurden postuliert. So könnte der Übergangszustand im Moment der Sauerstoffübertragung eine planare Konformation aufweisen, oder das Dioxiran und die zu oxidierende Doppelbindung bilden einen rechten Winkel zueinander (Abb. 4.32).160
O
O
"butterfly"Übergangszustand
(in einer Ebene)
O
O
SpiroÜbergangszustand
Abbildung 4.32: Schematische Darstellung beider für die Epoxidierungsreaktion mittels
Dioxiran vorgeschlagenen Übergangszustände.160
Experimentelle Befunde161 wie auch theoretische Betrachtungen162 führen zum Ergebnis, dass
der Spiroübergangszustand wahrscheinlicher ist. Bei der Umsetzung von trans-Stilben (214)
mit dem axial chiralen Keton 215 (ee 98 %) wurde (2S,3S)-2,3-Diphenyloxiran mit einem
Enantiomerenüberschuss von 80 % erhalten (Abb. 4.33 A).157 Dies spricht für den Spiroübergangszustand, bei dem für die Umsetzung zum im Überschuss gefundenen Produkt eine
geringere sterische Abstoßung der Phenylgruppen erwartet wird ("matched pair") als bei der
Oxidation zum enantiomeren Epoxid ("mismatched pair"). Würde ein planarer Übergangszustand durchlaufen, so wäre unter den gleichen Reaktionsbedingungen ein Überschuss des
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
85
(R,R)-Produktes zu erwarten gewesen. Analog wird für die Oxidation von trans-Stilben in
Gegenwart des chiralen Ketons 213 (2R,3R)-2,3-Diphenyloxiran mit einem Enantiomerenüberschuss von 97 % erhalten (Abb. 4.33 B).158b Neben sterischen Einflüssen werden auch
elektronische Wechselwirkungen für eine Bevorzugung des Spiroübergangszustand verantwortlich gemacht.158c
Br
O
O
O
O
O
Br
O
212
10 mol%
A
trans-Stilben (214)
10 eq. Caro´sche Säure, 3.1 eq. NaHCO3,
0.4 mM wässrige Na2EDTA Lösung,
DME (2:3)
0 °C, 25 h, 94 %
O
O
O
(2S,3S)-2,3-Diphenyloxiran
(215)
80 % ee
O
O
O
O
213
30 mol%
B
trans-Stilben (214)
1.4 eq. Caro´sche Säure, 5.8 eq. K2CO3,
CH3CN, wässrige Lösung mit 0.4 mM Na2EDTA
und 50 mM Na2B4O7 (5:2)
rt, 1.5 h, 75 %
(2R,3R)-2,3-Diphenyloxiran
(ent-215)
97 % ee
Abbildung 4.33: Oxidation von trans-Stilben (214) mit Caro´scher Säure in Gegenwart
chiraler Ketone A nach Yang et al.157 B nach Shi et al.158b
Wird 185 mit Caro´scher Säure in Anwesenheit von 1,1,1-Trifluoraceton und Na2EDTA in
Acetonitril und Wasser oxidiert, so findet eine regioselektive und mäßig stereoselektive
Oxidation zu 206 und 207 im Verhältnis 5 : 2 statt (Abb. 4.34).
5 eq. Caro´sche Säure, 15 eq. NaHCO3,
CF3COCH3,
0.4 mM wässrige Na2EDTA-Lösung,
CH3CN (1 : 2 : 10)
O
0 °C, 1 h
OTBS
86 % bei 63 % Umsatz
OTBS
185
CO2Me
CO2Me
CO2Me
+
OTBS
OTBS
206
:
5
O
OTBS
OTBS
207
2
Abbildung 4.34: Oxidation von 185 mittels eines Dioxirans zu den Epoxiden 206 und 207.
86
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
4.4.3.3 Überführung einer β-Acetoxy-Bromverbindung in ein Epoxid
Alternativ zu den beiden erwähnten Oxidationsmethoden besteht die Möglichkeit, das zu 206
diastereomere Epoxid 207 mittels intramolekularer SN-Reaktion darzustellen. Hierzu wird der
Essigsäureester der Verbindung 216 (Kapitel 4.4.5) in einer methanolischen Na2CO3-Suspension verseift. Der freigesetzte Alkohol wird im alkalischen Milieu partiell deprotoniert und
vermag das Bromid in einer intramolekularen SN-Reaktion zu verdrängen. Erhalten wird Epoxid 207 (Abb. 4.35). In einer Nebenreaktion vermag Essigsäure in einer syn-Eliminierung zu
eliminieren, und erhalten wird das Brom-substituierte trans-CHD 218.
CO2Me
CO2Me
OAc
AcO
Br
OTBS
OTBS
216
3
+
Br
:
OTBS
OTBS
217
1
CO2Me
Na2CO3,
MeOH
16 h, rt
O
OTBS
OTBS
207
66 %
CO2Me
+
Br
OTBS
OTBS
218
15 %
Abbildung 4.35: Darstellung von Epoxid 207 und Brom-CHD 218 aus 216 und 217.
216 liegt in Chloroform in unterschiedlichen, langsam wechselnden Konformationen vor
(Abb. 4.36). Gestützt wird diese Annahme durch die Beobachtung, dass im 1H-NMR bei
Raumtemperatur zum Teil unscharfe Signale erhalten werden, welche erst bei höherer
Temperatur klare Signalaufspaltungen zeigen. Weiterhin werden bei Raumtemperatur im 13CNMR für die sp2-hybridisierten Kohlenstoffe der Doppelbindung vermutlich aufgrund einer
starken Signalverbreiterung keine Signale gefunden. Bei 60 °C scheinen die Konformationsisomere hingegen schnell gegen die Zeitskala der NMR-Messung ineinander überführt zu
werden, so dass die Signale beider sp2-hybridisierten Kohlenstoffe detektiert werden können.
Für 216 wird bei einer Temperatur von 60 °C eine Kopplungskonstante der beiden Protonen
an C-5 und C-6 von 3JH5,H6 = 4.5 Hz gefunden, welche für 216-II mit pseudo-äquatorialer und
äquatorialer Ausrichtung der TBS-Ether erwartet wird. Für die pseudo-axial und axial
orientierten Protonen H-6 und H-5 in 216-I sollte eine deutlich größere Kopplungskonstante
gefunden werden, so dass diese Konformation nur in untergeordnetem Maße vorliegen kann.
In 216-II wird für den pseudo-äquatorial orientierten Acetoxy-Rest und das äquatorial
orientierte Brom ein Diederwinkel von ΦBr,O6 = 107° erwartet, welcher eine intramolekulare
SN-Reaktion zum Epoxid zulässt. Der Acetoxy-Rest und das Proton an C-5 weisen ebenso wie
Brom und das Proton an C-6 einen kleinen Diederwinkel auf, so dass in dieser Konformation
eine syn-Eliminierung von Essigsäure oder Bromwasserstoff möglich scheint (Abb. 4.36).
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
87
CO2Me
OAc
6
5
TBSO
Br
OTBS
Konformation
216
6
I
5
6
II
φH5,H6
φBr,H6
φH5,O6
φBr,O6
= 174°
= 71°
= 66°
= 50°
φH5,H6
φBr,H6
φH5,O6
φBr,O6
= 127°
= 14°
=
7°
= 107°
5
Abbildung 4.36: Energieminimierte Konformationen von 216 und Diederwinkel entlang
der Bindung zwischen C-5 und C-6; TBS-Ether, Methylester und nicht an
C-5 und an C-6 gebundene Protonen wurden ausgeblendet.
Die zu 216 isomere Bromverbindung 217 (Kapitel 4.4.5), kann unter den gleichen
Reaktionsbedingungen nicht zu einem Epoxid reagieren. Vielmehr bestehen die Möglichkeit
der Verseifung der Acetoxyfunktion oder einer 1,4-Eliminierung, so dass das Bromsubstituierte trans-CHD 218 entstehen kann. Hydrolyse des Methylesters wird unter diesen
Reaktionsbedingungen nicht beobachtet.
Da sich die beiden Produkte 207 und 218 in ihrer Polarität deutlich voneinander unterscheiden, gelingt eine chromatographische Trennung dieser Produkte problemlos. Eine
genaue Zuordnung der Stereochemie von Epoxid 207 und damit Bromverbindung 216 gelingt
über die sauer katalysierte Öffnung des Epoxids mit Essigsäure (Kapitel 4.6.3). Die Aufklärung der Struktur von Brom-CHD 218 ist eindeutig aus den NMR-Daten unter Kenntnis
der absoluten Konfiguration der allylischen Kohlenstoffe möglich. Aufgrund der chemischen
Verschiebung der sp3-hybridisierten Kohlenstoffe ist ausgeschlossen, dass einer dieser
Kohlenstoffe Brom-substituiert ist. Für diesen Fall würde eine chemische Verschiebung von
etwa 45 ppm erwartet, gefunden werden jedoch Verschiebungen von 72.1 ppm und 77.1 ppm,
wie sie für Kohlenstoffe mit Sauerstoffsubstituenten typisch sind. Aufgrund der beobachteten
Protonen-Kopplungen kann die Konstitution des Moleküls eindeutig ermittelt werden.
88
4.4.4
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
cis-Dihydroxylierung
Während Epoxide durch nucleophile Öffnung des Ringes mit Sauerstoffnucleophilen in transDiole überführt werden können, sind vicinale cis-Diole durch cis-Dihydroxylierung der
Alkene direkt zugänglich.
Alkene lassen sich mit stöchiometrischen Mengen an Permanganat zum Diol oxidieren.
Hierbei werden jedoch häufig Nebenreaktionen aufgrund des hohen Oxidationspotentials des
Permanganats gefunden. Unter anderem kann das erhaltene Diol unter Spaltung der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung zu zwei Carbonsäuren weiter oxidiert werden.163
In den dreißiger Jahren des letzten Jahrhunderts wurden von Criegee stöchiometrische
Mengen an Osmiumtetroxid als selektives Oxidationsmittel eingesetzt.164 Hierbei wurden die
mit Kaliumpermanganat gefundenen Neben- und Folgereaktionen nicht beobachtet. Aufgrund
der hohen Toxizität und Flüchtigkeit des Osmiumtetroxids brachte aber erst die Entwicklung
katalytischer Methoden einen Durchbruch für eine breitere Anwendung. Die Weiterentwicklung und Erforschung dieser Methoden ist maßgeblich mit den Arbeiten von Sharpless
verbunden.165 Mechanistische Untersuchungen ergaben, dass zunächst ein zyklischer Osmatester gebildet wird, welcher im folgenden unter Freisetzung des cis-Diols und Osmats
hydrolysiert wird.
Mechanistisch wurden zwei Wege, welche zur Bildung des zyklischen Esters führen,
diskutiert (Abb. 4.37). Böseken und Criegee postulierten einen konzertierten [3+2]
Mechanismus,164,166 wohingegen Sharpless von einer stufenweisen Reaktion ausging, welche
zunächst mit einer [2+2] Addition zum Osmaoxetan eingeleitet wird.167 Dieses lagert sich
zum zyklischen Ester um.
R
R
O
O Os O +
O
A
R
L
B
O
O Os
O
O
L
O R
O Os
OL O
R
R
O
O
Os O
O
L
R
R
Abbildung 4.37: Diskutierte Mechanismen zur Bildung des zyklischen Osmatesters; A konzertierter [3+2] Mechanismus;164,166 B stufenweiser [2+2] Mechanismus.167
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
89
Die Untersuchung kinetischer Isotopeneffekte und der Vergleich mit berechneten Werten
stützen die Hypothese der [3+2] Addition als durchlaufenen Reaktionsweg.168
Unter typischen Reaktionsbedingungen ist ein Anteil des in der Reaktion eingesetzten
Osmiumsalzes von 0.2 mol% bis 2 mol% bezogen auf das zu oxidierende Alken üblich. Zur
Reoxidation des Osmium(VI) zum Osmium(VIII) sind unterschiedliche Wege etabliert.
Standardmäßig werden hierzu K3Fe(CN)6 oder 4-Methylmorpholin-4-oxid (NMO) eingesetzt.
Beschrieben sind beispielsweise auch die Oxidation mittels Trimethylamin-N-oxid,169a mit
NaIO4,169a NaOCl,169b oder kaskadenartig mit H2O2 in Gegenwart von Flavin und 4-Methylmorpholin.169c In einigen Fällen wurden Unterschiede in der gefundenen Stereoselektivität der
Oxidation in Abhängigkeit von Oxidationsmittel und Reaktionsbedingungen gefunden.169a
Durch den Einsatz chiraler Liganden ist eine enantioselektive Reaktion möglich. So wurden
verschiedene chirale Amine als Liganden untersucht. Als besonders geeignet erwiesen sich
Dihydrochinidin- und Dihydrochininliganden.170 Die erreichbare Enantioselektivität ist durch
die Hintergrundreaktion ohne Einfluss des chiralen Liganden limitiert, welche als sekundärer
katalytischer Zyklus bezeichnet wird (Abb. 4.38).170 Hierbei findet keine effektive chirale
Induktion durch den Glycolatester statt. Sharpless und Mitarbeiter beschreiben ein Beispiel
für die Bildung eines Produktes mit einem Enantiomerenüberschuss von 7 % über diesen
Reaktionsweg.171 Neuere Entwicklungen führten zu zweiphasigen Reaktionssystemen, in
denen das Durchlaufen dieses unerwünschten sekundären Zyklus unterdrückt wird.172
R
hoher ee
R
R
HO
OH
H2O
R
O
O
O
Os
O
O
R
R
Trioxo-Os(VIII)-glycerat
O
Os
O
O
O
Primärer
Katalysezyklus
NMM
L*
Sekundärer
Katalysezyklus
NMO
R
R
O
O
O
Os
O
O
R
R
R
O
O
Os O
O
L*
L*
R
L*
R
R
R
HO
R
H2O
OH
geringer oder kein ee
Abbildung 4.38: Die beiden katalytischen Zyklen, welche bei der asymmetrischen Dihydroxylierung mit NMO als Kooxidationsmittel durchlaufen werden.165
90
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
Aufgrund der weiten Verbreitung und Bedeutung dieser Reaktion werden fertige Reaktionsgemische vertrieben, die unter dem Namen AD-Mix α und AD-Mix β K2OsO4 als Vorläufer
für den Katalysator, einen chiralen Liganden (Dihydrochinidin ist bei AD-Mix α, Dihydrochinin bei AD-Mix β der chirale Reste des Liganden) und das Oxidationsmittel K3Fe(CN)6
enthalten.
In Gelen und an Polymeren173 gebundenes Osmat wurde erfolgreich als Katalysator eingesetzt
und rückgehalten. Eine Rückgewinnung des Katalysators wird ebenfalls durch Ionentauscherharzadsorption174 oder den Einsatz ionischer Flüssigkeiten als Reaktionsmedium erzielt.175
In der Literatur sind Untersuchungen zur Oxidation unterschiedlich substituierter cis-CHD
unter Osmiumtetroxid-Katalyse beschrieben. Carless und Mitarbeiter haben die Abhängigkeit
der Stereoselektivität der Oxidation von der Art und Größe des Substituenten des eingesetzten
cis-CHD untersucht (Abb. 4.39 A).176 Dabei zeigte sich, dass stets ein Gemisch diastereomerer Produkte erhalten wurde. Das 4,5-trans-Tetrol 219 ist dabei stets Hauptprodukt. Mit
zunehmender Größe des Substituenten R nimmt die Diastereoselektivität ab, der Anteil beider
Diastereomere 219 und 220 nähert sich einem Verhältnis von 1:1 an und weicht damit von der
durch Kishi formulierten Regel ab, nach der eine Oxidation an Cyclohex-2-enolen bevorzugt
trans zu allylischen Alkoholen stattfindet.177
Sutherland und Mitarbeiter untersuchten die Oxidation substituierter cis-CHD mit geschützten
Alkoholfunktionen (Abb. 4.39 B).178 Wird dabei das zu 185 analoge cis-CHD-Derivat 222
unter Standardbedingungen oxidiert, so werden die beiden Regioisomere 223 und 224 im
Verhältnis 10:1 gefunden.
R
R
OH
A
NMO
cat. OsO4
HO
OH
R
OH
21 6
34 5
OH
HO
OH
B
OTBS
222
220 a-d
CO2Me
OTBS
NMO
cat. OsO4
OH
OH
219 a-d
CO2Me
OTBS
21 6
34 5
+
+
HO
R
isolierte
Ausbeute [%]
219 : 220
116
-H
64
71 : 29
118
-CH3
57
67 : 33
221
-Cl
88
55 : 45
120
-Br
84
53 : 47
HO CO2Me
HO
OTBS
OTBS
OH
223
10
Edukt
OH
OTBS
:
224
1
Abbildung 4.39: A Untersuchungen von Carless et al. zur Oxidation unterschiedlich
substituierter cis-CHD;176 B Untersuchungen zur Oxidation von Sutherland et al. zur Oxidation von cis-CHD 222.178
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
91
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Oxidation mittels NMO in Anwesenheit katalytischer
Mengen K2OsO4 untersucht. Wird das freie Diol 196 in Anwesenheit von zwei Äquivalenten
NMO und katalytischer Mengen K2OsO4 in Aceton / t-Butanol / Wasser (10:9:1) oxidiert, so
wird ein Gemisch der beiden diastereomerern Tetrole 225 und 226 im Verhältnis von 5 : 1
isoliert, wobei das Hauptprodukt die nach Kishi erwartete Stereochemie aufweist. Wird statt
des freien Diols das TBS-geschützte 2,3-trans-CHD 160 eingesetzt, so wird – anders als von
Sutherland und Mitarbeitern für cis-CHD 222 beobachtet – selektiv Diol 227 erhalten. Durch
Entfernen der Schutzgruppen mit Flusssäure in Acetonitril konnte gezeigt werden, dass beide
Hauptprodukte 225 und 227 die gleiche Stereochemie aufweisen (Abb. 4.40). Eine Aussage
über die Regiochemie der Oxidation ist über 1H-NMR möglich; in allen Fällen wird nur ein
Proton mit einer chemischen Verschiebung gefunden, wie sie für olefinische Protonen typisch
ist. Bewiesen wurde die angenommene Stereochemie durch die Überführung von Diol 227 in
die Naturstoffe ent-Streptol (ent-58) und ent-Valienon (ent-8) (vgl. Kapitel 4.6.1 und Kapitel
4.6.2).
CO2Me
OTBS
CO2Me
OTBS
3 eq. NMO
kat. K2OsO4
OTBS Aceton / t-BuOH / H2O
10 : 9 : 1, rt, 4 d, 80 %
HO
45
OTBS
OH
227
160
HF
CH3CN, 0 °C
CO2Me
OH
OH
196
CO2Me
OH
2 eq. NMO
kat. OsO4
iso-BuOH / Aceton / H2O
10 : 9 : 1, rt, 7 d, 28 %
HO
45
CO2Me
OH
+
OH
HO
OH
225
5
45
OH
OH
226
:
1
Abbildung 4.40: Übersicht über die Produkte der Osmiumtetroxid-katalysierten cisDihydroxylierung ausgehend von Derivaten des 2,3-trans-CHD.
Wird 185 unter analogen Bedingungen oxidiert, entsteht hauptsächlich 228. In untergeordnetem Maße wird auch die zweifach substituierte Doppelbindung oxidiert, wobei Nebenprodukt 229 im Verhältnis 1 : 4 (1H-NMR) entsteht (Abb. 4.41).
Eine Trennung der erhaltenen Isomere 228 und 229 gelingt nach Überführung der Diole in die
Acetonide 230 und 231. Nach Abspaltung der TBS-Schutzgruppen wird Diol 232 erhalten,
welches von Myers und Mitarbeiter dargestellt und charakterisiert wurde.179 Da von Myers
92
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
beide für 232 aus der Dihydroxylierungsreaktion denkbaren Diastereomere synthetisierte und
eine Röntgenstrukturanalyse der zu 232 diastereomeren Verbindung publiziert wurde, ist die
zunächst überraschende Stereochemie, nach der die Oxidation cis zum benachbarten TBSEther erfolgt, zweifelsfrei belegt. Die NMR-Daten für Verbindung 231 erlauben keine
eindeutige Aussage über deren Stereochemie. Nach Spaltung der TBS-Ether von 231 wird
Diol 233 erhalten, dessen Konstitution über NMR-Untersuchungen ermittelt werden konnte.
CO2Me
2 eq. NMO
kat. K2OsO4
OH
MeO2C
OTBS Aceton / t-BuOH / H2O
5 : 4 : 1, rt, 2 h, 70 %
OTBS
185
CO2Me
OH
OTBS
OTBS
228
4
HO
+
HO
:
OTBS
OTBS
229
1
(CH3)2C(OCH3)2
kat. TFA, rt, 2 h
73 %
MeO2C
O
O
TBAF,
THF, 0 °C, 1 h
42 %
MeO2C
O
CO2Me
O
OH
OTBS
OTBS
232
230
OH
O
+
O
OTBS
OTBS
CO2Me
TBAF,
THF, 0 °C, 3 h
O
49 %
O
231
OH
OH
233
Abbildung 4.41: Produkte der Osmiumtetroxid-katalysierten cis-Dihydroxylierung von BisTBS-Ether 185 und nachfolgende Reaktionen zum Beweis der Stereochemie der Produkte.
Eine Zuordnung des vinylischen Protons gelingt über die chemische Verschiebung von
δ = 6.93 ppm. Über ein H,H-COSY-Experiment können die weiteren Signale des 1H-NMR
eindeutig den Protonen Ha bis Hd zugeordnet werden. Eine Aussage über die Konfiguration
von 233 gelingt über ein NOESY-Experiment. Einen entscheidenden Hinweis auf die
vorliegende Konfiguration liefert ein NOE-Kontakt zwischen Ha und Hc. Dieser Effekt wird
nur für den Fall erwartet, dass Ha und Hc gleichzeitig eine axiale bzw. pseudo-axiale
Orientierung annehmen. Dies ist nur dann möglich, wenn die durch Oxidation mit
Osmiumtetroxid erhaltene cis-Diol-Funktion wie dargestellt cis zum benachbarten allylischen
TBS-Ether eingeführt wurde. Einen weiteren Hinweis liefern NOE-Kontakte der Methylgruppen des Acetonids und der Protonen des Kohlenstoffsechsrings. Nur die dargestellte
Konfiguration erklärt, dass ein Kontakte zwischen den Protonen Ha und Hb und einer
Methylgruppe gefunden werden, während sich das Proton Hd in räumlicher Nähe zur anderen
der beiden Acetonid-Methylgruppen befindet und wechselwirkt (Abb. 4.42).
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
93
c
a
CO2Me
O
O
a
b
c
e
d
OH
OH
233
H
H
OH
O H
b
O
H3C
CH3
exo
endo
OH
H d
angeregtes Proton
gefundene NOE-Kontakte
(chemische Verschiebung)
(chemische Verschiebung)
Hd (4.53 ppm)
CH3 endo (1.36 ppm)
Ha (5.11 ppm)
CH3 exo (1.41 ppm)
Hb (4.62 ppm)
CH3 exo (1.41 ppm)
Ha (5.11 ppm)
Hc (3.61 ppm)
Abbildung 4.42: Konformation von 233 und wichtige im NOESY-Experiment gefundene
Signalverstärkungen (NOE-Kontakte) in Abhängigkeit zur Anregungsfrequenz (CDCl3, 400 MHz), welche gemeinsam nur durch die dargestellte
Konfiguration und Konformation von 233 erklärt werden können.
Die deutlich höhere Reaktivität der dreifach substituierten Doppelbindung in 185 entspricht
nicht dem Reaktionsverhalten, welches von Singh und Mitarbeitern für das analoge cis-CHD
98 beschrieben wird.52 In diesem Fall entstehen zwei Konstitutionsisomere 99 und 100 im
Verhältnis von etwa 1 : 1 (Abb. 4.43).
CO2Me
O
98
O
CO2Me
NMO
OsO4
HO
t-BuOH / H2O
10 : 1, 20 °C, 8 h, 73 %
HO
MeO2C
OH
+
O
99
1
O
O
:
OH
O
100
1
Abbildung 4.43: Dihydroxylierung von 3,4-cis-CHD 98 nach Singh et al.52
Neben der Osmiumtetroxid-katalysierten Oxidation ist von Shing und Mitarbeitern auch die
Oxidation von Alkenen mittels katalytischer Mengen von Rutheniumoxid zu cis-Diolen
untersucht worden.180 Shing beschreibt die hoch stereo- und regioselektive und schnelle
Oxidation des substituierten Cyclohexensystems 234 zu Cyclohexan-cis-diol 235 (Abb. 4.44);
94
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
die beschriebene Verbindung reagiert träge und recht unselektiv mit Osmiumtetroxid. Zur
Umsetzung wird eine Lösung des Alkens unter Eiskühlung mit einer wässrigen 5 %igen
Natriumperiodat-Lösung und 6 mol% Ruthenium(III)chlorid versetzt, welches das katalytisch
aktive Ruthenium(VIII)oxid liefert. Das zweiphasige System wird wenige Minuten heftig
gerührt, und durch Zusatz von Thiosulfat-Lösung wird die Reaktion abgebrochen.
OBn
OBn
OAc
OBn
OBn
OAc
OBn
kat. RuCl3
NaIO4
EtOAc, CH3CN, H2O
0 °C, 3 min., 81 %
HO
OBn
OH
234
235
Abbildung 4.44: Dihydroxylierung nach Shing et al. mit in situ generiertem RuO4.180
Obwohl die vorgestellte Methode in diesem Fall Vorteile gegenüber der Oxidation mit
Osmiumtetroxid bietet, hat sie bislang keine weite Verbreitung gefunden. Der Mechanismus
der Reaktion ist nicht vollständig verstanden. Es wird angenommen, dass ähnlich wie bei der
zuvor beschriebenen Oxidation mit Osmiumtetroxid zunächst eine [2+3]-Cycloaddition mit
dem Alken unter Bildung eines zyklischen Ruthenatesters erfolgt, welcher hydrolytisch
gespalten wird.181 Überoxidationen zu α-Ketoalkoholen und die oxidative Spaltung der
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung sind beobachtete Nebenreaktionen, die durch Variation der Reaktionsbedingungen diskriminiert werden können.181,182
Versuche, Bis-TBS-Ether 160 unter den von Shing publizierten Bedingungen180 zum cis-Diol
zu oxidieren, waren nicht erfolgreich. Vielmehr erfolgte auch nach vier Stunden unter Erwärmen auf Raumtemperatur keine Reaktion (Abb. 4.45).
CO2Me
OTBS
OTBS
5 mol% RuCl3
1.7 eq. NaIO4
CCl4, CH3CN (1:1)
0 °C
rt, 4 h
CO2Me
OTBS
HO
OTBS
OH
160
227
Abbildung 4.45: 160 zeigt in Gegenwart von RuO4 über 4 Stunden keine Reaktion.
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
4.4.5
95
Synthese von Bomhydrinen und Derivaten
Um präparativen Zugang zum 4,5-cis-Diastereomer zu 227 zu erhalten, wurde versucht, das
TBS-geschützte Dien 160 in einer Variante der Woodward-cis-Dihydroxylierungs-Reaktion
umzusetzen.183 Hierbei wird durch Oxidation des Alkens mit N-Bromacetamid intermediär
ein Bromonium-Ion gebildet, welches nach Silber(I)-assistierter nucleophiler Substitution
durch Acetat und Reaktion mit Wasser zu einem Dioxolanol umgesetzt wird. Dieses lagert
sich zum anti-β-Acetoxyalkohol um (Abb. 4.46).
Ag
Br
R
R
+
O
δ+
δ- Br
N
H
AgOAc
AcOH
R
R
+
O
O
Br
R
O
+
R
O
AgBr
2 H2O
+
R
R
O
O
R
H3O+ O
R
O
R
R
HO
OAc
+ AgBr
OH
Abbildung 4.46: Angenommener Mechanismus der Woodward-cis-Dihydroxylierung.
Von Granger et al. wurde eine Modifikation der Reaktionsbedingungen publiziert, bei der
Essigsäure als Sauerstoffnucleophil eingesetzt wurde.183b Unter diesen Reaktionsbedingungen
wurde für 236 die Oxidation zu 237 mit einer isolierten Ausbeute von mehr als 90 %
beobachtet. Als Produkt wird im Gegensatz zu Umsetzungen unter den von Woodward publizierten Bedingungen ausschließlich Diol 237 gebildet (Abb. 4.47).183b
H3C
H
236
1. AcNHBr
AgOAc, AcOH
2. 93 % AcOH, ∆T
3. LiAlH4
> 90 %
H3C
OH
OH
H
237
Abbildung 4.47: Variante der Woodward-cis-Dihydroxylierung nach Granger et al.183b
Wird 160 in Dichlormethan und unter Einsatz von Silber(trifluoracetat) mit N-Bromacetamid
umgesetzt, entsteht trans-β-Acetoxybromverbindung 238 in 86 % Ausbeute, ohne dass eine
Weiterreaktion zu einem Bisessigsäureester beobachtet wird. Auf den Einsatz von Silbersalzen wurde später verzichtet, da die Reaktion zu 238 auch ohne Zusatz eines Silbersalzes
erfolgt (Abb. 4.48).
96
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
CO2Me
OTBS
OTBS
160
1.2 eq. AcNHBr
1.2 eq. Ag(CO2CF3)
CH2Cl2, AcOH (1 : 1)
0 °C rt, 24 h, 86 %
oder
2.5 eq. AcNHBr
30 eq. AcOH
CH2Cl2, rt, 16 h, 59 %
CO2Me
OTBS
AcO
OTBS
Br
238
Abbildung 4.48: Oxidation von Dien 160 zu β- Acetoxybromverbindung 238.
Die gefundene Selektivität ist durch sterische und elektronische Effekte erklärbar. Der
sterische Anspruch des TBS-Ethers, welcher für den Angriff des positiv polarisierten Broms
an die Doppelbindung selektiv von der entgegengesetzten Seite verantwortlich ist, behindert
einen nachfolgenden Angriff von Acetat vicinal zum TBS-Ether. Aufgrund des stabilisierenden Effektes der π-Elektronen der benachbarten Doppelbindung für die positive Ladung
des Bromoniumions ist die Kohlenstoff-Brom-Bindung in allylischer Position aktiviert. So
erfolgt der Angriff von Acetat in einer SN2-Reaktion selektiv in allylischer Position.
Konformation und Konfiguration von 238 ließen sich eindeutig bestimmen, nachdem die
TBS-Gruppen durch Reaktion mit Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) entfernt wurden. Diol
239 wurde aus Diethylether und Ethylacetat umkristallisiert, und ein erhaltener Einkristall per
Röntgenstrukturuntersuchung vermessen. Aufgrund des im Molekül enthaltenen Schweratoms
gelingt hierbei neben der Aufklärung der relativen Konfiguration auch eine zweifelsfreie
Aussage über die absolute Konfiguration (Abb. 4.49).
CO2Me
OTBS
AcO
OTBS
HF
CH3CN, H2O
0 °C, 4 h
74 %
CO2Me
OH
AcO
Br
238
OH
Br
239
O12
O31
O11
O6
O3
O5
Br4
Abbildung 4.49: Spaltung der TBS-Ether in 238; unten dargestellt ist die durch Röntgenstrukturuntersuchung erhaltene Kristallstruktur von Verbindung 239;
Ellipsoide entsprechen einer 50%igen Aufenthaltswahrscheinlichkeit.
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
97
Unter ähnlichen Reaktionsbedingungen wie Dien 160 wurde Dien 185 mit N-Bromacetamid
in Gegenwart von Essigsäure umgesetzt. Hierbei erfolgt die Oxidation regioselektiv an der
disubstituierten Doppelbindung, wobei zwei isomere Produkte 216 und 217 im Verhältnis 3:1
in einer Gesamtausbeute von 79 % erhalten werden (Abb. 4.50). Die Reaktion ist bereits nach
drei Stunden beendet und verläuft damit trotz eines geringeren Überschusses an Oxidationsmittel deutlich schneller als die Oxidation von 160.
CO2Me
1.3 eq. AcNHBr
30 eq. AcOH
CH2Cl2, rt, 3 h
AcO
79 %
Br
OTBS
OTBS
185
CO2Me
CO2Me
OAc
OTBS
OTBS
216
3
Br
:
OTBS
OTBS
217
1
Abbildung 4.50: Oxidation von 185 mit N-Bromacetamid in Gegenwart von Essigsäure zu
den beiden Isomeren 216 und 217.
Eine Aufklärung der Konstitution von 216 erfolgt über NMR-Experimente. Das zum Essigsäureester geminale Proton ist aufgrund der extremen Tieffeldverschiebung mit δ = 5.97 ppm
eindeutig zu identifizieren. Über die 3JH,H-Kopplungskonstanten lässt sich die Konstitution
von 216 aufklären. Ein Beweis der Konfiguration erfolgt über die Ermittlung der Stereochemie von Epoxid 207 (vgl. Kapitel 4.6.3), welches sich in alklischer Lösung aus 216
erhalten lässt (vgl. Kapitel 4.4.3.3).
Die Aufklärung der Konstitution von Verbindung 217 erfolgt ebenfalls über NMR-Experimente. Eindeutig zu erkennen ist ein vinylisch gebundenes Proton, so dass 217 entweder ein
Regio- oder Diastereomer zu 216 sein kann. Damit ergeben sich vier mögliche Konstitutionen
für 217 (Abb. 4.51).
CO2Me
Br
AcO
OTBS
OTBS
217a
CO2Me
OAc
Br
OTBS
OTBS
217b
CO2Me
AcO
Br
CO2Me
Br
OTBS
OTBS
217c
AcO
OTBS
OTBS
217d
Abbildung 4.51: Mögliche isomere Strukturen für Verbindung 217.
Die zu Brom und dem Essigsäureester geminalen Protonen lassen sich über ein HMQCExperiment und die dabei gefundenen direkten C,H-Korrelationen eindeutig zuordnen. Die
chemischen Verschiebungen der Kohlenstoffsignale von δ = 48.3 ppm und δ = 67.6 ppm
erlauben eine eindeutige Unterscheidung. Somit kann das Protonensignal bei δ = 5.37 ppm
98
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
dem zu Essigsäureester geminalen Proton zugeordnet, und dem Signal mit einer chemischen
Verschiebung von δ = 4.93 ppm das zu Brom geminale Proton zugewiesen werden. Eine
Ermittlung der Konstitution gelingt weder über eine Zuordnung der Protonenkopplungen noch
ein H,H-COSY-Experiment, da intensive Fernkopplungen keinen Ausschluss einer der Möglichen Konstitutionen zulassen. Gegen Verbindung 217c sprechen die zu 216 deutlich
unterschiedlichen chemischen Verschiebungen der zu Brom und dem Essigsäureester geminalen Protonen. Das zu Brom geminale Proton weist gegenüber 216 eine deutliche Tieffeldverschiebung auf, während das zur Essigestergruppe geminale Proton gegenüber dem
entsprechenden Proton in Verbindung 216 eine deutliche Hochfeldverschiebung aufweist. In
NOE-Differenz-Experimenten konnten durch Anregung einzelner Protonen über den KernOverhauser-Effekt räumlich benachbarte Protonen identifiziert und damit die Konstitution
eindeutig zu 217b bestimmt werden (Abb. 4.52).
CO2Me
OAc
Br
a e
bcd
OTBS
OTBS
217
angeregtes Proton
gefundene NOE-Kontakte
(chemische Verschiebung)
(chemische Verschiebung)
Ha (7.09 ppm)
Hb (4.93 ppm)
He (5.37 ppm)
Hd (3.99 ppm)
Hb (4.93 ppm)
Ha (7.09 ppm), Hc (3.88 ppm)
Abbildung 4.52: In NOE-Differenz-Experimenten für 217 gefundene Signalverstärkungen
(NOE-Kontakte) in Abhängigkeit zur Anregungsfrequenz (CDCl3,
400 MHz).
Aufgrund der gefundenen Konstiution ist eindeutig, dass 217 in einer 1,4-Addition von Acetat
an ein intermediär gebildetes Bromoniumion unter Verschiebung der Doppelbindung gebildet
wird. Eine Aussage über die Konfiguration ist hingegen nicht möglich, da die gefundenen
3
JH,H-Kopplungen keine Aussage über die relative Stereochemie zulassen. Nach Abspalten der
TBS-Ether mit Flusssäure in Acetonitril und Peracetylierung mit Acetanhydrid in Anwesenheit katalytischer Mengen Scandium(III)triflat wird Triacetat 240 erhalten (Abb. 4.53).
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
CO2Me
OAc
Br
99
CO2Me
OAc
1. 50 %ig HF, CH3CN, 0 °C rt, 8 h
2. Ac2O, kat. Sc(OTf)3, rt, 16 h
25 %
OTBS
OTBS
Br
OAc
OAc
240
217
Abbildung 4.53: Spalten der TBS-Ether aus 217 mit Flusssäure und Peracetylierung zu 240.
Über NMR-Messungen kann die Konfiguration von Triacetat 240 nicht eindeutig ermittelt
werden. Ogawa und Mitarbeiter synthetisierten Verbindungen, die bis auf eine vinylische
Brommethylfunktion statt des in 240 enthaltenen vinylischen Methylesters die gleiche Konstitution aufweisen.184 Angenommen wird, dass beide vinylischen Substituenten einen ähnlichen Einfluss auf die in Chloroform vorliegende Konformation haben. Zum Vergleich der
NMR-Daten wurden vier diastereomere Verbindungen 241 I-IV ausgewählt, deren nicht
allylische Essigsäureester trans-ständig angeordnet sind, und deren Konfiguration in den
allylischen Positionen variiert (Tabelle 7).
Br
CO2Me
OAc
a
b
Br
7.10
Hb
5.01
OAc
Br
c
a
b
OAc
Br
c
OAc
OAc
241 I
241 II
241 III
3
JH,H
[Hz]
δ
[ppm]
3
JH,H
[Hz]
5.61
5.62
6.7
6.00
JH,H
[Hz]
(5.94)a
6.19
4.755.06
4.755.06
δ
[ppm]
3
5.5
δ
[ppm]
Br
e
d
240
4.92
6.08
OAc
OAc
e
d
OAc
10.4
He
c
a
b
OAc
4.3
Hd
Br
OAc
e
d
OAc
5.8
Hc
a
b
Br
OAc
δ
[ppm]
Ha
c
e
d
Br
(5)
(5.205.50)a
unklar
(unklar)a
(5.205.50)a
10
(5)a
(5.63)a
7
(2.5-3)a
(5.87)a
Br
OAc
241 IV
3
JH,H
[Hz]
δ
[ppm]
3
JH,H
[Hz]
6.13
3
4.54
unklar
4.67
7.5
5.63
7
5.10
10.5
5.02
10
5.55
4
5.80
c
e
d
OAc
6.12
a
OAc
a
b
5.856.08
8
Tabelle 7: Vergleich der 1H-NMR-Daten von 240 (CDCl3, 400 MHz) mit literaturbeschriebenen,184 strukturell ähnlichen Verbindungen (CDCl3, 241 II und 241 III:
90 MHz, 241 I und 241 IV: 60 MHz); a) eine sichere Zuordnung anhand der
Literaturdaten ist nicht möglich.
Die für Verbundung 241 II beschriebenen Daten lassen sich nicht eindeutig zuzuordnen;
bereits die Zuordnung des vinylischen Protons ist aufgrund der ähnlichen chemischen
Verschiebung zweier Protonen mit δ = 5.94 ppm bzw. δ = 5.89 ppm nicht möglich. Alle
100
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
Verbindungen bis auf 241 II weisen für die Protonen Hc und Hd eine Kopplungskonstante
3
JH-c,H-d von etwa 10 Hz auf. Dies spricht für eine bisaxiale Orientierung dieser Protonen, die
für Verbindung 241 II nicht beobachtet wird. Verbindung 241 II weist daher eine von 240
grundsätzlich verschiedene Konformation auf. Deutliche Unterschiede der vicinalen
Kopplungskonstanten 3JH-a,H-b, 3JH-b,H-c und 3JH-d,H-e für 241 III und 230 schließen aus, dass
Verbindung 241 III eine ähnliche Konformation wie 240 aufweist. Die für 241 IV beobachtete vicinale Kopplungskonstante 3JH-b,H-c = 7 Hz weicht deutlich von der für 240 gefundenen
vicinalen Kopplung von 3JH-b,H-c = 4.3 Hz ab. Für Verbindung 241 I ist diese Kopplungskonstante nicht angegeben. Die für 241 I beobachtete vicinale Kopplungskonstante
3
JH-a,H-b = 5.5 Hz stimmt gut mit der für 240 gefundenen vicinalen Kopplungskonstante von
3
JH-a,H-b = 5.8 Hz überein. Für Verbindung 241 IV ist diese Kopplungskonstante nicht
beschrieben.
Verbindungen 241 II und 241 III können als Verbindungen vergleichbarer Konformationen
ausgeschlossen werden. Verbindung 241 IV zeigt eine teilweise Übereinstimmung, weicht
aber in der vicinalen Kopplung der Protonen Hb und Hc deutlich von 240 ab. Die größte
Ähnlichkeit in den chemischen Verschiebungen und Aufspaltungen der Protonensignale wird
zwischen 240 und Verbindung 241 I gefunden, so dass eine analoge Konfiguration für 240
angenommen wird. Falls diese Annahmen richtig sind, entsteht 217 aus dem gleichen
Bromoium-Intermediat wie Regioisomer 216. Die Reaktion von Dien 185 mit Bromacetamid
verläuft unter diesen Reaktionsbedingungen also stereoselektiv (Abb. 4.54).
CO2Me
AcO
SN2-Reaktion
CO2Me
CO2Me
+ AcNHBr
OTBS
OTBS
185
- AcNH
Br
+ AcO
Br
OTBS
OTBS
OTBS
OTBS
216
CO2Me
OAc
suprafaciale
1,4-Addition
Br
OTBS
OTBS
217
Abbildung 4.54: Angenommene Stereochemie von 217 und der sich daraus ergebende
Reaktionsverlauf zur Bildung von 216 und 217 aus 185 mit N-Bromacetamid in Gegenwart von Essigsäure.
Die Oxidation des konformativ fixierten 3,4-trans-CHD 198 mit N-Bromacetamid in Gegenwart von Essigsäure führt zu einem Hauptprodukt 242 mit einer zu 216 vergleichbaren Konfiguration. Die Aufklärung von Konstitution und absoluter Konfiguration gelang zweifelsfrei
mittels Röntgenstrukturuntersuchung eines Einkristalls des nach Reduktion mit DIBAL-H der
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
101
beiden vorhandenen Esterfunktionen erhaltenen Diols 243. Hierbei wurden die Konfiguration
der in der Oxidation gebildeten Stereozentren bestimmt wie auch der Trioxepinring als
Strukturelement bestätigt (Abb. 4.55).
CO2Me
AcO
50 %
Br
O
O
CO2Me
AcNHBr, AcOH
CH2Cl2, 0 °C, 2 h
O
O
O
198
OH
DIBAL-H, CH2Cl2,
-78 °C, 1.5 h
HO
34 %
Br
O
O
O
242
O
243
O81
O7
O1
O5
Br6
O3
Abbildung 4.55: Oxidation von 198 zur Bromverbindung 242 und deren Reduktion zu Diol
243 sowie die aus der Röntgenstrukturuntersuchung erhaltene Struktur von
243; Ellipsoide entsprechen einer 50%igen Aufenthaltswahrscheinlichkeit.
Corey und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die Oxidation von Olefinen mit N-Bromacetamid
in feuchtem Acetonitril in Gegenwart einer Lewis-Säure zur Bildung von β-Acetaminobromverbindungen führt.71b,185 Hierbei greift Acetonitril das postulierte intermediär gebildete
Bromoniumion in einer SN2-Reaktion an und wird mit Wasser zum Acetamid hydrolysiert.
Die Anwendung ähnlicher Reaktionsbedingungen auf die Oxidation von 160 führt zur
Bildung der erwarteten β-Acetaminobromverbindung 244 in 49 % Ausbeute (Abb. 4.56).
Unterschiede zur von Corey publizierten Methode sind die Durchführung bei Raumtemperatur, der Einsatz von Kupfer(II)bromid statt Zinn(IV)bromid als Lewissäure und der
Verzicht auf den Zusatz von Wasser während der Oxidation. Mit dieser Reaktion konnte hier
erstmals eine Stickstofffunktion in einem Schritt in γ-Position zur Carboxylfunktion, wie sie
beispielsweise in Valienamin oder Oseltamivir gefunden wird, eingeführt werden. Ohne
Zusatz einer Lewis-Säure wurde über zwei Tage keine Umsetzung des Eduktes beobachtet.
Ob sich unter den gewählten Bedingungen – wie von Corey für Zinn(IV)bromid postuliert –
102
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
wirklich ein durch die Lewissäure aktivierter N-Bromacetamidkomplex für die Bromierungsreaktion verantwortlich zeigt, oder ob N-Bromacetamid und Kupfer(II)bromid lediglich
elementares Brom in einer Synproportionierungsreaktion freisetzen, wurde nicht näher
untersucht.
CO2Me
OTBS
OTBS
1. 2.2 eq. AcNHBr
1.1 eq. CuBr2
CH3CN, rt, 48 h
2. H2O
49 %
CO2Me
OTBS
AcHN
OTBS
Br
160
244
Abbildung 4.56: Oxidation von Dien 160 mit N-Bromacetamid in Acetonitril.
Ein Zugang zu allylischen Bromverbindungen gelingt durch nucleophile Öffnung eines
Epoxids mit Li(CuX4) [X = Br, Cl] in Tetrahydrofuran (THF).12,127 Diese Reaktionen
verlaufen an sterisch anspruchsvollen Systemen extrem langsam. Die Reaktion von 161 unter
diesen Bedingungen verläuft über 7 Tage bei einer isolierten Ausbeute von 10 %.127
Ein eigener Versuche unter diesen Bedingungen liefert ähnliche Ergebnisse (Abb. 4.57). Nach
vier Tagen konnte Bromhydrin 245 mit einer Ausbeute von 22 % neben 26 % Edukt isoliert
werden.
CO2Me
OTBS
OTBS
O
161
3 eq. LiBr
1.5 eq. CuBr2
4 d, rt, THFabs.
22 %
CO2Me
OTBS
Br
OTBS
OH
245
Abbildung 4.57: Darstellung von Bromhydrin 245 aus Epoxid 161.
Alternativ kann eine Bromfunktion ausgehend von cis-Diol 227 in allylischer Position
eingeführt werden. Hierzu wird das Diol säurekatalysiert mit Trimethyl-ortho-essigsäureester
in den zyklischen ortho-Essigsäureester 246 überführt. Nach Entfernen des überschüssigen
Trimethyl-ortho-essigsäureesters unter vermindertem Druck wird das nicht weiter aufgereinigte Rohprodukt in Dichlormethan aufgenommen und mit Acetylbromid und katalytischen
Mengen para-Toluolsulfonsäure unter Erhitzen zum Rückfluss zur β-Acetoxybromverbindung 247 umgesetzt, welche über diese beiden Stufen in einer Ausbeute von 58 % erhalten
wird. NMR-Untersuchungen des Zwischenproduktes belegen, dass die diastereomeren
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
103
zyklischen ortho-Ester 246 in einem Verhältnis von 3:2 gebildet werden (Abb. 4.58). Die
Reaktion verläuft verglichen mit der Epoxidöffnung schnell und in guten Ausbeuten.
CO2Me
OTBS
HO
CO2Me
OTBS
CH3C(OCH3)3
kat. CF3CO2H
CH2Cl2, rt, 16 h
O
OTBS
OH
OTBS
O
OMe
246
de 30 %
227
3 eq. AcBr
kat. TsOH
CH2Cl2, reflux, 1 h
58 %
über 2 Stufen
CO2Me
OTBS
Br
OTBS
OAc
247
Abbildung 4.58: Umsetzung von Diol 227 zur Bromverbindung 247.
Wird unter diesen Bedingungen Diol 248 umgesetzt, das nach Reduktion der Esterfunktion
mit DIBAL-H und selektiver Schutzgruppeneinführung aus 227 erhalten werden kann (vgl.
Kapitel 4.6.1 und Kapitel 4.6.2), so wird neben der gewünschten Einführung von Brom in
allylischer Position auch die Spaltung des primären TBS-Ethers unter Bildung eines Essigsäureesters beobachtet (Abb. 4.59). 250 wird mit 42 % in geringerer Ausbeute erhalten als 247.
OTBS
OTBS
HO
OTBS
OH
248
OTBS
CH3C(OCH3)3
kat. CF3CO2H
CH2Cl2, rt, 16 h
OTBS
O
OTBS
O
OMe
249
OAc
3 eq. AcBr
kat. TsOH
CH2Cl2, reflux, 1 h
42 %
über 2 Stufen
OTBS
Br
OTBS
OAc
250
Abbildung 4.59: Umsetzung von Diol 248 zu Bromverbindung 250.
Ein Beweis der Konstitution von 247 und 250 gelingt über NMR-Exprimente. Über HMQCEsperimente lässt sich das zu Brom geminale Proton aufgrund der chemischen Verschiebung
des Brom tragendenden Kohlenstoffs (δ = 39.6 ppm bzw. 40.6 ppm) eindeutig identifizieren.
In beiden Fällen kann über ein H,H-COSY-Experiment gezeigt werden, dass sich das zu
Brom geminale Proton in allylischer Position befindet. Ein Vergleich der 1H-NMR-Daten der
Bromverbindungen 247 und 250 belegt Ähnlichkeiten in chemischer Verschiebung und 3JH,HKopplungskonstanten der Protonen des Kohlenstoffrings (Tabelle 8). Das vinylische Proton
Ha und das allylische Protonen He weisen für 250 im Vergleich zu 247 eine Hochfeldverschiebung von etwa 1.0 ppm bzw. 0.5 ppm auf, was auf die für 250 zu erwartende höhere
Elektronendichte der Doppelbindung zurückzuführen ist. Die Protonen Hb (δ = 4.53 ppm bzw.
δ = 4.64 ppm), Hc (δ = 5.30 ppm bzw. δ = 5.31 ppm) und Hd (δ = 4.07 – 4.15 ppm bzw.
104
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
δ = 4.15 ppm) zeigen in 250 bzw. 247 ähnliche chemische Verschiebungen, was für eine
vergleichbare Konstitution spricht. Das zu Brom geminale Proton Hc in 238 weist mit einer
chemischen Verschiebung von δ = 3.84 ppm eine im Vergleich zu Hb in 247 und 250 deutliche Hochfeldverschiebung auf. Analog hierzu weisen die zu den Acetoxyresten geminalen
Protonen Hc für 247 und 250 mit δ = 5.31 ppm bzw. δ = 5.30 ppm nahezu gleiche chemische
Verschiebungen auf, für 238 wird mit δH-b = 5.89 ppm hingegen eine deutliche Tieffeldverschiebung beobachtet. Erklärt werden diese Unterschiede durch den entschirmenden Effekt
der Doppelbindung auf Protonen in allylischer Position.
Für eine vergleichbare Konfiguration von 247 und 250 sprechen die – soweit aus den
Spektren ermittelbar – sehr ähnlichen vicinalen Protonenkopplungskonstanten. Gefunden
werden für 247 3JH-a,H-b = 4.3 Hz und 3JH-b,H-c = 1.3 Hz und für 250 3JH-a,H-b = 4.1 Hz und
3
JH-b,H-c = 1.2 Hz. Da die Konfiguration der Edukte 227 und 248 in den Positionen c, d und e
bekannt und eindeutig bestimmt sind (vgl. Synthese von ent-Streptol (ent-58) und entValienon (ent-8), Kapitel 4.6), ergibt sich die Konfiguration für Position b aus der Annahme
einer SN2-Reaktion zur Einführung von Brom. Gegen einen SN1-Mechanismus in dieser
Reaktion spricht die Tatsache, dass für 247 ein nahezu Nebenprodukt-freies Rohprodukt
erhalten wurde. Ein weiteres Indiz für die dargestellte Konfiguration ist die Überführung und
Charakterisierung von Folgeprodukten aus 247 (Kapitel 4.7).
a
b
Proton
AcO
c
e
d
OTBS
a
b
Br
3
JH,H [Hz]
6.88
δ [ppm]
5.89
Tabelle 8:
4.63
1
δ [ppm]
JH,H [Hz]
4.1
4.53
1.2
5.30
4.15
unklar
4.07-4.15
2.1
4.55
3
5.98
unklar
2.7
He
JH,H [Hz]
5.31
4.40
OTBS
250
3
1.3
2.1
OTBS
e
d
OAc
4.64
3.84
Hd
c
Br
4.3
5.4
Hc
OTBS
7.04
3.1
Hb
a
b
247
238
Ha
c
e
d
OAc
Br
δ [ppm]
OAc
CO2Me
OTBS
CO2Me
OTBS
unklar
4.07-4.15
H-NMR-Daten (CDCl3, 400 MHz) der Verbindungen 238, 247 und 250.
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
105
4.5 Qualitativer Vergleich der Reaktivitäten von 160 und 185
In der Tabelle 9 wird die gefundene Regio- und Stereoselektivität untersuchter Oxidationsreaktionen an den TBS-geschützten trans-CHD 160 und 185 gegenübergestellt.
Reaktion
Epoxidierung
Edukt
(II)
CO2Me
OTBS
CO2Me
OTBS
OTBS
(I)
Bromhydroxylierung
CO2Me
OTBS
AcO
OTBS
O
CO2Me
(II)
(I)
CO2Me
CO2Me
OTBS
HO
OTBS
MeO2C
CO2Me
O
OTBS
OH
227
Br
238
161
160
Dihydroxylierung
CO2Me
AcO
OAc
MeO2C
OH
CO2Me
OH HO
O
OR
OR
OR
R = -TBS
185
OR
OR
OR
38 : 26
206
207
:
209
3
216
OR
Br
OR
22 : 14
208
OR
Br
OR
:
OR HO
OR
1
4
217*
228
OR
OR
:
1
229
Tabelle 9: Gegenüberstellung von Produkten aus Oxidationsreaktionen ausgehend von 160
und 185; *) dargestellt ist die angenommene Stereochemie.
Werden die beobachteten Regio- und Stereoselektivitäten verglichen, so fällt auf, dass
ausgehend von 160 stets die elektronenreichere und geringer substituierte Doppelbindung (I)
oxidiert wird. Die gefundene Stereoselektivität lässt sich gut mit dem sterischen Anspruch des
zur oxidierten Doppelbindung allylischen TBS-Ethers erklären. Dieser schirmt bei axialer
Konformation eine Seite der Doppelbindung ab, so dass ein Angriff stets trans-ständig zum
benachbarten TBS-Ether erfolgt.
Reagiert 185 unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen, werden davon abweichende
Beobachtungen gemacht. Während 160 unter allen untersuchten Bedingungen mit identischer
Regioselektivität reagiert, wechselt die gefundene Regioselektivität der Reaktionen für 185 in
Abhängigkeit der Oxidationsbedingungen. Wird unter den Bedingungen der cis-Dihydroxylierung überwiegend Doppelbindung (II) oxidiert, so findet bei der Oxidation zum Bromhydrin mit N-Bromacetamid ausschließlich eine Oxidation der Doppelbindung (I) statt. Bei
Verwendung von mCPBA zur Oxidation zum Epoxid wird eine in jeder Hinsicht unselektive
Reaktion bei leichter Bevorzugung der Oxidation der Doppelbindung (I) gefunden. Über den
106
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
sterischen Anspruch der TBS-Gruppe lässt sich in diesem Fall keine Diastereoselektivität
induzieren. Bei den untersuchten Reaktionen erfolgt der Angriff des Oxidationsmittels in
allen Fällen, in denen eine Aussage über die Konfiguration des Produktes getroffen werden
konnte, bevorzugt cis zum zur angegriffenen Doppelbindung allylischen TBS-Ether. Einen
Erklärungsansatz hierfür liefert die oben erläuterte Annahme zweier Konformationsisomere
von 185, bei denen das überwiegend vorliegende Konformationsisomer, in dem die TBSEther pseudo-äquatorial orientiert sind, bevorzugt reagiert (Abb. 4.60).
TBS
stark
abgeschirmte
Seite
MeO2C
für elektrophile
Angriffe sterisch
bevorzugte Seite
für elektrophile
Angriffe sterisch
bevorzugte Seite
O
H
H
OTBS
für 160 angenommene
Vorzugskonformation
H
OTBS
OTBS
MeO2C
schwach
abgeschirmte
Seite
H
für 185 angenommene
Vorzugskonformation
Abbildung 4.60: Schematische Darstellung der bevorzugten Konformationsisomere von
160 und 185 unter Andeutung der sterischen Effekte pseudo-axialständiger
Reste.
Wird die Reaktivität von 160 und 185 qualitativ verglichen, so fällt auf, dass 185 unter ähnlichen Reaktionsbedingungen reaktiver ist und eine Umsetzung schneller gelingt. Überraschend an diesen Ergebnissen ist die Tatsache, dass aufgrund der gefundenen Selektivität
bei Reaktionen des 2,3-trans-CHD anzunehmen ist, dass sich beide Doppelbindungen in ihrer
Elektronendichte deutlich unterscheiden, und dass die elektronenreichere Doppelbindung bevorzugt reagiert. Da Dr. V. Lorbach zeigen konnte, dass das Dien-System des 2,3-trans-CHD
nach Reduktion der Carbonylfunktion zur Hydroxymethylfunktion in einer Oxidation mit
mCPBA schnell und selektiv an Doppelbindung (II) reagiert,127 sollten sterische Gründe für
die beobachtete Regioselektivität bei dieser Reaktion eine untergeordnete Rolle spielen. Dies
wird im Falle von 185 durch die geringe Regioselektivität in der Reaktion mit mCPBA
bestätigt. Da die Regioselektivität im Falle von Derivaten des 3,4-trans-CHD mit den Oxidationsmethoden variiert, kann angenommen werden, dass sich beide Doppelbindungen in ihrer
Elektronendichte ähneln. Weiterhin kann angenommen werden, dass die Esterfunktion auf
Spezieller Teil – Reaktivitätsuntersuchungen
107
beide Diensysteme in der Summe einen ähnlichen elektronenziehenden Effekt hat.g Wäre die
Elektronendichte beider Diensysteme vergleichbar, so wäre zu erwarten, dass die im Falle des
2,3-trans-CHD 160 reaktivere Doppelbindung elektronenreicher ist als jede der beiden
Doppelbindungen des 3,4-trans-CHD 185. Dies widerspricht allerdings der im Experiment
beobachteten höheren Reaktivität von 185 im Vergleich zu 160.
g
Für die Carbonylkohlenstoffe werden im 13C-NMR chemische Verschiebungen von δ = 167.5 ppm für 160 und
δ = 165.5 ppm für 185 gefunden. Diese im Vergleich zu alkylischen Esterfunktionen gefundene Hochfeldverschiebung deutet auf eine deutliche Konjugation der Carbonylgruppen mit dem Diensystem hin. Somit kann
von einem vergleichbaren elektronischen Einfluss in beiden Systemen ausgegangen werden. Nach E. Breitmaier,
"Vom NMR-Spektrum zur Strukturformel organischer Verbindungen", 2. Auflage, B. G. Teubner Verlag,
Stuttgart, 1992, S. 48.
108
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
4.6 Synthese von Streptol (58) und Gabosin I / Valienon (8)
Synthese von ent-Streptol (ent-58)
4.6.1
Das Enantiomer des Naturstoffs Streptol (58) wurde ausgehend von 4 synthetisiert. Dargestellt ist die Retrosynthese von ent-58 zu 2,3-trans-CHD (4) (Abb. 4.61).
OH
CO2Me
OTBS
OH
HO
HO
OH
CO2Me
OTBS
CO2H
OH
OTBS
OH
OTBS
OH
OH
ent-Streptol (ent-58)
227
160
2,3-trans-CHD (4)
Abbildung 4.61: Die Struktur von ent-Streptol (ent-58) wird retrosynthetisch auf 4 zurückgeführt.
Die Ausgangsverbindung 4 enthält bereits zwei Alkohole mit passender relativer Stereochemie. Nach Schutzgruppeneinführung besteht der Schlüsselschritt der Synthese in einer
stereo- und regioselektiven Oxidation der zweifach substituierten Doppelbindung zu einem
vicinalen cis-Diol. Durch anschließende Reduktion der Esterfunktion wird die Methylalkoholfunktion erhalten. Abgeschlossen wird die Synthese von ent-Streptol (ent-58) durch die
Spaltung der TBS-Ether.
Die ersten Stufen der Synthese sind in Abbildung 4.62 zusammengefasst und wurden in
Kapitel 4.4.1 und 4.4.4 ausführlich diskutiert.
CO2H
OH
MeOH, HCl
rt, 3d, quant.
CO2Me
OH
OH
4
2.3 eq. NEt3
2.2 eq. TBSOTf
CH2Cl2, 0 °C rt, 1 h
96 %
CO2Me
OTBS
OTBS
OH
196
160
3 eq. NMO, K2OsO4
Aceton / tBuOH / H2O
(10:9:1)
rt, 4 d, 80 %
CO2Me
OTBS
HO
OTBS
OH
227
Abbildung 4.62: Synthese von 227 ausgehend von 4.
Verbindung 227 wird bei – 78 °C in Dichlormethan mit einem vierfachen Überschuss an
DIBAL-H zu Triol 251 reduziert (Abb. 4.63). Aus der Literatur ist bekannt, dass TBS-Ether
von DIBAL-H bei Raumtemperatur angegriffen werden, bei tiefen Temperaturen jedoch in
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
Gegenwart von DIBAL-H stabil sind.186
109
Eine Reduktion der Kohlenstoff-Kohlenstoff-
Doppelbindung ist unter den gewählten Bedingungen nicht zu erwarten.78a Tatsächlich
werden in einer Reduktion von 227 mit DIBAL-H bei – 78 °C weder eine Spaltung der
sekundären TBS-Ether noch eine Reduktion der Doppelbindung beobachtet. Nach Hydrolyse
und Extraktion erfolgt eine Aufreinigung des Rohproduktes durch Umkristallisation aus
Isohexan / Ethylacetat 20:1 (v/v). Hierbei wird Triol 251 in 92 % Ausbeute in Form farbloser
Nadeln erhalten.
CO2Me
OTBS
HO
OTBS
OH
4.4 eq. DIBAL-H
- 78 °C, CH2Cl2, 3 h
92 %
OTBS
HO
OH
OH
HF, MeCN
0 °C, 2.5 h
62 %
OH
OTBS
HO
OH
227
251
OH
OH
ent-Streptol (ent-58)
Abbildung 4.63: Reduktion und TBS-Etherspaltung als abschließende Stufen zur Synthese
von ent-Streptol (ent-58).
Die anschließende Spaltung der TBS-Ether gelingt mit einigen Tropfen 40%iger Flusssäure in
Acetonitril bei 0 °C mit 62 % isolierter Ausbeute. Nach Aufreinigung wird der Naturstoff entStreptol (ent-58) in einer Ausbeute von 44 % über fünf Stufen erhalten. Die NMR-Daten
stimmen gut mit den publizierten Literaturwerten überein.43 Ein Drehwert wurde für den
Naturstoff nicht bestimmt und die absolute Konfiguration über den Circulardichroismus eines
perbenzoylierten und hydrierten Derivates des Naturstoffes aufgeklärt.43 Der für ent-58
20
gefundene Drehwert von [α ]D = – 92.5 (c = 0.2 in H2O) wurde durch die Synthese des natürlichen Enantiomers bestätigt (Lit. [α ]D = + 91.8 (c = 0.25 in H2O)).187
20
4.6.2
Synthese von ent-Valienon / ent-Gabosin I (ent-8)
Das Enantiomer des Naturstoffs Valienon / Gabosin I (8) wurde ausgehend von 4 synthetisiert. Dargestellt ist die Retrosynthese von ent-8 zu Triol 251 (Abb. 4.64). 251 ist über vier
Stufen mit einer Gesamtausbeute von 70 % aus 2,3-trans-CHD (4) zugänglich (vgl. Kapitel
4.6.1).
Um die allylische sekundäre Alkoholfunktion in 251 selektiv zu einem Keton oxidieren zu
können, muss zunächst die reaktivere allylische primäre Alkoholfunktion geschützt werden.
110
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
OH
OTBS
OH
O
OH
OH
ent-Valienon /
ent-Gabosin I (ent-8)
OH
OTBS
HO
OTBS
OTBS
HO
OTBS
OH
OH
248
251
Abbildung 4.64: Die Struktur von ent-Valienon / ent-Gabosin I (ent-8) wird retrosynthetisch auf 251 zurückgeführt.
Als Schutzgruppe für diesen Alkohol wird ein TBS-Ether gewählt, der gemeinsam mit den
beiden bereits im Molekül enthaltenen TBS-Ethern in einem Schritt gespalten werden kann.
Eine Einführung der TBS-Schutzgruppe sollte aufgrund des sterischen Anspruchs der einzuführenden Gruppe selektiv am primären Alkohol gelingen. Tatsächlich wird beim Einsatz des
reaktiven TBS-Triflats keine ausreichende Selektivität erzielt. Bei Verwendung des weniger
reaktiven TBS-Chlorids, Triethylamins und katalytischer Mengen 4-(Dimethylamino)pyridins (DMAP) in Dichlormethan gelingt eine hochselektive Schutzgruppeneinführung an
der primären Alkoholfunktion zu Tri-TBS-Ether 248 in 87 % isolierter Ausbeute (Abb. 4.65).
OH
OTBS
HO
OTBS
OTBS
1.5 eq. TBSCl, 1.6 eq. NEt3
kat. DMAP
CH2Cl2, 0 °C rt, 16 h, 87 %
OH
251
OTBS
HO
OTBS
OH
248
Abbildung 4.65: Selektive Schutzgruppeneinführung am primären Alkohol von 251 zu 248.
Analog lässt sich die primäre Alkoholfunktion mit tertiär-Butyldiphenylchlorsilan (TBDPSCl), Triethylamin und katalytischen Mengen DMAP in vier Tagen bei 56 % isolierter
Ausbeute zu TBDPS-Ether 252 umsetzen.
Die selektive Oxidation des allylischen sekundären Alkohols in Gegenwart eines zweiten
sekundären, aliphatischen Alkohols wurde für 227, 248 und 252 unter verschiedenen Bedingungen untersucht (Abb. 4.66). Allylische Alkohole weisen eine höhere Reaktivität in
Oxidationsreaktionen als aliphatische sekundäre Alkohole auf und können in manchen Fällen
bei Raumtemperatur in einer Suspension mit Braunstein (MnO2) in Dichlormethan zum Keton
oxidiert werden.188 Unter diesen Bedingungen gelingt die Oxidation des allylischen Alkohols
227 in einer langsamen Reaktion mit 36 % isolierter Ausbeute nach 16 Stunden. 248 und 252
reagieren aber auch nach mehreren Tagen nicht mit Braunstein, so dass alternative Methoden
untersucht wurden. Die Oxidation mit 2,3-Dichloro-5,6-dicyano-p-benzochinon (DDQ) nach
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
111
einer von Ganem und Mitarbeitern189 publizierten Methode gelingt aufgrund der elektronenziehenden Carbonylfunktion bei 227 mit 81 % isolierter Ausbeute. Das Oxidationsprodukt des
durch die elektronenreichere Doppelbindung weniger aktivierten Allylalkohols 252 wird unter
diesen Bedingungen nach 64 Stunden in einer Ausbeuten von 35 % erhalten.
CO2Me
OTBS
A
HO
CO2Me
OTBS
OTBS
O
OTBS
OH
OH
227
253
OR
OR
OTBS
B
HO
OTBS
OTBS
O
OH
248 R = TBS
252 R = TBDPS
A
248, 252
B
OTBS
OH
254 R = TBS
255 R = TBDPS
10 eq. MnO2, CH2Cl2, rt, 16 h
36 %
2.5 eq. DDQ, THF, reflux, 12 h
81 %
10 eq. MnO2, CH2Cl2, rt, 2 d
keine Reaktion
252
2.5 eq. DDQ, THF, reflux, 64 h
35 %
248
2 eq. 4-Acetamido-TEMPO, 2 eq. TsOH,
CH2Cl2, 0 °C, 1 h
86 %
Abbildung 4.66: Oxidation der Allylalkohole 227, 248 und 252 zu α,β-ungesättigten
Ketonen.
Selektiv und in guten Ausbeuten verläuft die Oxidation des allylischen Alkohols 248
hingegen nach einem von Banwell und Mitarbeitern publizierten Protkoll unter Einsatz von je
zwei Äquivalenten p-Toluensulfonsäure und 4-Acetamino-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1oxyl (4-Acetamino-TEMPO, 256) als Oxidationsmittel.190 Hierbei disproportioniert 256 in
Gegenwart der Säure zu Oxoammoniumkation 257, welches das eigentliche Oxidationsmittel
darstellt, und 258 (Abb. 4.67).
NHCOCH3
+
2
N
O
256
NHCOCH3
NHCOCH3
+
2 TsOH
N
O
257
+
2
TsO
N
H OH
258
Abbildung 4.67: in situ Generierung des Oxoammoniumkations 257 aus 256 und paraToluensulfonsäure.
112
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
Nach einer Stunde wird unter diesen Bedingungen Keton 254 in einer Ausbeute von 86 %
bezogen auf den eingesetzten Allylalkohol 248 isoliert.
Die Synthese von ent-Valienon / ent-Gabosin (ent-8) wird durch die Entfernung der
Schutzgruppen abgeschlossen. Die Spaltung der TBS-Ether von 248 zu Tetrol ent-8 verläuft
unter Einsatz von Tetrabutylammoniumfluorid in THF bei 0 °C glatt. Nach einer Stunde
werden 69 % des Produktes ent-8 isoliert.
ent-Valienon (ent-8) wird hierbei über 7 Stufen in einer Ausbeute von 36 % gewonnen. Die
analytischen Daten bis auf den Dehwert sind in Übereinstimmung mit publizierten Daten zum
20
20
Naturstoff. Der Drehwert wurde mit [α ]D = + 56.6 (c = 1.1 in MeOH) (Lit. [α ]D = – 61.4
(c = 1.0 in MeOH))44a ermittelt.
4.6.3
Synthese von Gabosin I / Valienon (8)
Neben ent-8 wurde auch das natürlich vorkommende Enantiomer 8 ausgehend von 3,4-transCHD (5) synthetisiert (Abb. 4.68).
OH
O
OH
O
OH
OH
Valienon /
Gabosin I (8)
CO2Me
OAc
O
HO
OH
OH
259
CO2Me
CO2H
O
TBSO
OH
OTBS
260
TBSO
HO
OTBS
207
OH
3,4-trans-CHD (5)
Abbildung 4.68: Die Struktur von Valienon (8) wird retrosynthetisch auf 3,4-trans-CHD
(5) zurückgeführt.
Eine der Alkoholfunktionen von 5 weist die in Valienon (8) enthaltene Stereochemie auf. Der
zweite Alkohol wird in eine Ketofunktion überführt. Nach Schutzgruppeneinführungen wird
die zweifach substituierte Doppelbindung zu Epoxid 207 oxidiert. Die Epoxidfunktion wird
hierbei trans zum benachbarten TBS-Ether eingeführt. Epoxid 207 wird säurekatalysiert in
den vicinalen trans-β-Acetoxy-Alkohol 260 überführt. Nach Reduktion der Methylesterfunktion zu einer Hydroxymethylgruppe kann nach Schutzgruppentransformationen der freigesetzte allylische sekundäre Alkohol in 259 zum Keton oxidiert werden. Durch Entfernen
der Schutzgruppen wird Valienon / Gabosin I (8) erhalten (Abb. 4.68).
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
113
Die Transformation von Bis-TBS-Ether 185 zu Epoxid 207 wurde in den Kapiteln 4.4.3.3 und
4.4.5 diskutiert und ist hier zusammengefasst (Abb. 4.69). Ausgehend von 3,4-trans-CHD (5)
wird Epoxid 207 über vier Stufen in einer Gesamtausbeute von 46 % erhalten.
CO2Me
TBSO
OTBS
185
1.3 eq. AcNHBr
30 eq. AcOH
CH2Cl2, rt, 16 h
79 %
CO2Me
OAc
CO2Me
AcO
+
TBSO
Br
OTBS
3
216
TBSO
:
Br
OTBS
1
217*
CO2Me
MeOH, Na2CO3
rt, 16 h, 66 %
O
TBSO
OTBS
207
Abbildung 4.69: Die ersten Stufen der Synthese von Valienon (8) ausgehend von Bis-TBSEther 185; *) angenommene Stereochemie.
Die Öffnung von Epoxid 207 zum vicinalen trans-Alkohol-Essigsäureester 260 erfolgt unter
stark aciden Bedingungen (Abb. 4.70). Eine Regioselektivität der Reaktion wird aufgrund der
Aktivierung der allylischen Position des Epoxides erwartet. Eine Reaktion mit Lithiumacetat
in N,N-Dimethylformamid findet nicht statt. In Eisessig wird nach einem Tag ebenfalls keine
Reaktion beobachtet. Erst der Zusatz katalytischer Mengen einer stärkeren Säure zum Eisessig führt zur gewünschten Reaktion. Einige Säuren wurden hierbei in analytischen Ansätzen
eingesetzt, und die Reaktion mittels GCMS untersucht. Dabei zeigt sich, dass die Reaktion
unter Bildung erheblicher Mengen unterschiedlicher, vermutlich isomerer Nebenprodukte
verläuft, die nicht identifiziert wurden. Der Einsatz von Trifluorboran-Etherat oder Acetylchlorid führt zur Zersetzung des Eduktes unter Spaltung der TBS-Ether. Die besten Resultate
verspricht der Einsatz von Trifluoressigsäure. Im präparativen Maßstab wird unter Einsatz
von 7.5 Volumenprozent Trifluoressigsäure in Eisessig über 3.5 Stunden bei Raumtemperatur
eine isolierte Ausbeute von 37 % 260 erzielt.
Die Konstitution des erhaltenen Alkohols 260 lässt sich aufgrund der elektronenziehenden
Wirkung des Essigsäureesters und der damit verbundenen Tieffeldverschiebung des zum
Acetoxyrest geminalen Protons über
1
H-NMR und H,H-COSY-Experimente eindeutig
bestimmen. Die Konfiguration von 260 wie auch 207 wird durch die im Folgenden
beschriebene Überführung in literaturbeschriebene Verbindungen bewiesen. 260 wird unter
Einsatz von TBS-Triflat, Triethylamin und katalytischer Mengen DMAP in Tris-TBS-Ether
261 überführt, welcher in 91 % isoliert wurde. Die Reduktion der Esterfunktionen mit 6
Äquivalenten DIBAL-H bei – 78 °C liefert nach zwei Stunden unter Erwärmen auf – 50 °C
Diol 252 in 77 % (Abb. 4.71). Verbindung 262 ist literaturbeschrieben, und die gefundenen
analytischen Daten stehen hiermit in guter Übereinstimmung.191 Für 262 wird ein Drehwert
von [α ]D = – 59.8 (c = 1.0 in CHCl3) gefunden (Lit.: [α ]D = – 58 (c = 0.94 in CHCl3).191
24
20
114
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
CO2Me
CO2Me
AcO
O
OTBS
OTBS
HO
207
OTBS
OTBS
260
AcOH, rt, 24 h
keine Reaktion
AcOH, kat. 85% H3PO4, rt, 1 h
keine Reaktion
AcOH, kat. MsOH, rt, 1 h
34 %
AcOH, kat. TsOH, rt, 1h
37 %
AcOH, kat. BF3 × Et2O, rt, 1 h
Zersetzung
AcOH, kat. AcCl, rt, 1 h
Zersetzung
AcOH, kat. CF3CO2H, rt, 1 h
54 %
Abbildung 4.70: Nucleophile Öffnung von Epoxid 207 mit Acetat unter sauren Bedingungen in analytischen Ansätzen. Neben den Reaktionsbedingungen ist
der Flächenanteil des für das Produkt gefundenen Peaks im Verhältnis zur
Summe aller Produkte laut GCMS.
Die Konstitution des erhaltenen Alkohols 260 lässt sich aufgrund der elektronenziehenden
Wirkung des Essigsäureesters und der damit verbundenen Tieffeldverschiebung des zum
Acetoxyrest geminalen Protons über 1H-NMR und H,H-COSY-Experimente eindeutig bestimmen. Die Konfiguration von 260 wie auch 207 wird durch die im Folgenden beschriebene
Überführung in literaturbeschriebene Verbindungen bewiesen. 260 wird unter Einsatz von
TBS-Triflat, Triethylamin und katalytischer Mengen DMAP in Tris-TBS-Ether 261 überführt,
welcher in 91 % isoliert wurde. Die Reduktion der Esterfunktionen mit 6 Äquivalenten
DIBAL-H bei – 78 °C liefert nach zwei Stunden unter Erwärmen auf – 50 °C Diol 252 in
77 % (Abb. 4.71). Verbindung 262 ist literaturbeschrieben, und die gefundenen analytischen
Daten stehen hiermit in guter Übereinstimmung.191 Für 262 wird ein Drehwert von [α ]D =
24
– 59.8 (c = 1.0 in CHCl3) gefunden (Lit.: [α ]D = – 58 (c = 0.94 in CHCl3).191
20
CO2Me
OAc
TBSO
OH
OTBS
260
CO2Me
OAc
2 eq. TBS-OTf
2.2 eq. NEt3, kat. DMAP
CH2Cl2, rt, 3 h, 91 %
TBSO
6 eq. DIBAL-H
CH2Cl2
-78 °C -50 °C
2 h, 77 %
OTBS
OTBS
261
Abbildung 4.71: Überführung von 260 in 262 über zwei Stufen.
OH
OH
TBSO
OTBS
OTBS
262
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
115
Durch die Synthese der literaturbeschriebenen Verbindung 262 ist auch die Stereochemie von
Epoxid 207 eindeutig bestimmt. So kann Verbindung 262 nur erhalten werden, wenn Epoxid
207 in allylischer Position durch einen nucleophilen Angriff der Essigsäure erhalten wird, und
die dritte TBS-Gruppe somit in Nachbarschaft zum vorhandenen TBS-Ether eingeführt werden kann. Ein nucleophiler Angriff in Nachbarschaft zum TBS-Ether kann ausgeschlossen
werden, da in diesem Fall ein allylischer Alkohol erhalten würde und eine Einführung einer
weiteren TBS-Gruppe nicht in Verbindung 262 resultieren könnte. Da die TBS-Ether in
Verbindung 262 all-trans zueinander angeordnet sind, ist auch klar, dass die Epoxidfunktion
in Verbindung 207 trans-ständig zum benachbarten TBS-Ether angeordnet war, und die
Stereochemie ist eindeutig belegt. 262 wurde bereits in der Synthese von Valienamin (58)
erfolgreich eingesetzt.191
Mit der Klärung der Stereochemie von Epoxid 207 ist auch die Konfiguration von Bromverbindung 216 unter Kenntnis der Konstitution eindeutig bestimmt (vgl. Kapitel 4.4.5).
Zur Synthese von Valienon (8) müssen die allylischen Alkohole in Verbindung 262 mit zu
den bereits enthaltenen TBS-Ethern orthogonalen Schutzgruppen versehen werden. Als zu
den TBS-Ethern orthogonale Schutzgruppen werden Methoxymethylether (MOM) wie auch
ein Acetonid eingeführt (Abb. 4.72).
OH
OH
A
TBSO
OTBS
OTBS
OMOM
TBSO
262
OH
OH
B
TBSO
OTBS
OTBS
262
OMOM
OMOM
15 eq. MOMCl, 17 eq. NEt(iPr)2
3 eq. NBu4I, CHCl3
reflux, 3 d, 76 %
9 eq. 2,2-Dimethoxypropan
kat. TsOH, CH2Cl2, rt
2.5 h, 72 %
HO
OTBS
OTBS
OH
OH
263
264
O
O
O
TBSO
OMOM
10 eq. TBAF, THF
0 °C rt, 3h, 71 %
OTBS
OTBS
265
6 eq. TBAF, THF
-78 °C rt, 16 h, 83 %
O
HO
OH
OH
259
Abbildung 4.72: Einführen von zu TBS-Ethern orthogonalen Schutzgruppen und anschließendes Spalten der TBS-Ether; A Einführen von Methoxymethylethern; B Einführen einer Acetonidschutzgruppe.
Hierzu wurde 262 zunächst mit portionsweise zugesetzten 15 eq. Chlormethylmethylether
und 17 eq. Hünig-Base in refluxierendem Chloroform über drei Tage in 76 % in den literaturbeschriebenen Bis-MOM-Ether 263 überführt.191 Nach der Schutzgruppeneinführung werden
die TBS-Ether mit Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) in Tetrahydrofuran bei 0 °C gespal-
116
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
ten und Triol 264 in 71 % Ausbeute isoliert. Wird die Diolfunktion in 262 mit 2,2-Dimethoxypropan säurekatalysiert zum Acetonid umgesetzt, wird 265 nach 2.5 Stunden in 72 %
Ausbeute isoliert. Das Spalten der TBS-Ether mit Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF)
erfolgt in Tetrahydrofuran bei – 78 °C und liefert Triol 259 in 83 % Ausbeute.
Die Oxidation der allylischen Alkoholfunktion von 264 scheitert mit Braunstein,188 Bariummangan(VI)oxid192 oder 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-benzochinon,189 und auch die Oxidation mit
4-Acetamino-TEMPO (256) und para-Toluolsulfonsäure190 verläuft anders als die Oxidation
von 248 nicht befriedigend. Mit 256 wird das erwartete allylische Keton 266 nach
mehrfachem Nachdosieren des Oxidationsreagenzes und verlängerter Reaktionsdauer in einer
mäßigen Ausbeute von 33 % isoliert (Abb. 4.74 A). Von einem Erhitzen der Lösung wurde
aufgrund von Hinweisen in der Literatur,190 wonach bei Erwärmen auf 40 °C schlechtere
Ausbeuten als bei Raumtemperatur erzielt wurden, abgesehen.
Die Ursache für die unterschiedlichen Reaktivitäten von 248 und 264 ist vermutlich in den
unterschiedlichen Vorzugskonformation beider Verbindungen zu finden. Während für 264
eine pseudo-axiale Ausrichtung des allylischen Alkohols erwartet wird, wird für 248 eine
pseudo-äquatoriale Ausrichtung erwartet (Abb. 4.73).
OMOM
OMOM
HO
OH
OH
264
OTBS
OTBS
HO
OTBS
OH
248
O
O
HO
OH
OH
259
Abbildung 4.73: Energieminimierte 3D-Modelle der in der Oxidationsreaktion eingesetzten
Allylalkohole; aus Gründen der Übersicht wurden TBS-, MOM- und
Methyl-Gruppen wie auch Wasserstoffatome ausgeblendet; zu erkennen
ist, dass für die markierten allylischen Alkoholfunktionen für 248 und 259
eine pseudo-äquatoriale Ausrichtung zu erwarten ist, der allylische
Alkohol im Falle von 264 jedoch bevorzugt pseudo-axial orientiert
erwartet wird.
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
117
Aufgrund der Probleme, die bei der Oxidation des Allylalkohols 264 mit 4-AcetaminoTEMPO und para-Toluolsulfonsäure gefunden werden, wurde Triol 259 mit Pyridiniumchlorchromat (PCC) zu Keton 267 oxidiert (Abb. 4.74 B). Die Reaktion gelingt nach Reaktionskontrolle per Dünnschichtchromatographie vollständig und selektiv, allerdings gestaltete sich
die Aufarbeitung der polaren Substanz 267 in Gegenwart der Pyridiniumsalze als schwierig,
so dass 267 lediglich in 38 % Ausbeute isoliert werden konnte. Eine nachträgliche Betrachtung der zu erwartenden Konformationen der oxidierten allylischen Alkohole 248, 259 und
264 lässt vermuten, dass eine Oxidation von 259 auch unter besser handhabbaren Reaktionsbedingungen und mit milderen Oxidationsmitteln hätte gelingen können, da für 248 im
Gegensatz zu 264 keine pseudo-axiale Ausrichtung des allylischen Alkohols zu erwarten ist
(Abb. 4.73).
Die abschließende Solvolyse der Methoxymethylether in 266 wurde mit Chlorwasserstoff in
Methanol bei Raumtemperatur versucht. Dabei erwies sich der sekundäre Methoxymethylether als unter den eingesetzten Versuchsbedingungen stabil und wurde nicht solvolysiert
(Abb. 4.74 A).
OMOM
A
OMOM
6 eq. 4-Acetamino-2,2,6,6-tetramethylOMOM
piperidin-1-oxyl, 7 eq. TsOH
CH2Cl2, 0 °C rt, 2 d, 33 %
HO
OH
OMOM
O
OH
OH
MeOH, HCl, rt, 16 h
OH
O
OH
266
264
O
O
O
B
OH
HO
OH
OH
259
2 eq. PCC, DMF
rt, 95 min., 38 %
OH
O
O
OH
OH
267
OH
OH
Valienon /
Gabosin I (8)
MeOH, kat. CF3CO2H
rt, 5 h, 50%
OH
O
OH
OH
Valienon /
Gabosin I (8)
Abbildung 4.74: Oxidation des allylischen Alkohols und Schutzgruppenabspaltung ausgehend von A Allylalkohol 264; B Allylalkohol 259.
Das Abspalten der Acetonid-Schutzgruppe in 267 gelingt mit Trifluoressigsäure in Methanol
mit etwa 50 % isolierter Ausbeute. Erhalten wird das natürlich gefundene Enantiomer Valienon (8) über 11 Stufen in einer Gesamtausbeute von 1.4 %. Die spektroskopischen Daten
gleichen denen der zuvor synthetisierten Verbindung ent-8. Der Circulardichroismus der
Verbindungen 8 und ent-8 ist bei umgekehrtem Vorzeichen identisch, die UV-Spektren sind
nahezu deckungsgleich (Abb. 4.75). Somit ist belegt, dass beide Enantiomere von 8 synthetisiert wurden.
118
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
Trotz nominell gleicher Konzentration von 0.03 mg × mL-1 sind Intensitätsunterschiede
erkennbar, die auf Wägefehler oder auf nicht NMR-detektierbare Verunreinigungen in 8
zurückzuführen sind. Aufgrund des Einsatzes enantiomerenreiner Vorstufen, wie die mit
Literaturwerten identischen Drehwerte direkter Vorstufen belegen, ist ein Enantiomerengemisch als Ursache für die geringere gefundene Intensität auszuschließen.
4
2
∆ε
-1
-1
Mol.
[M
cmCD
]
0
-2
-4
200
300
400
500
Wavelength[nm]
λ [nm]
Valienon (8)
ent-Valienon (ent-8)
Abbildung 4.75: Dargestellt sind die molaren CD-Absorptionskoeffizienten (∆ε [M-1 cm-1])
von 8 und ent-8 gegen die Wellenlänge (λ [nm]) bei einer eingewogenen
Konzentration von je 0.03 mg × mL-1 in Acetonitril.
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
119
4.7 Studien zur Synthese von ent-Valienamin (ent-64)
Zur Synthese von ent-Valienamin (ent-64) müssen die Säurefunktion zu einer Methylalkoholfunktion reduziert und die elektronenreichere Doppelbindung in eine cis-ständige,
vicinale Aminoalkoholfunktion überführt werden (Abb. 4.76). Die Aminofunktion muss sich
hierbei in allylischer Position befinden. Dies wurde auf unterschiedliche Arten versucht.
OH
CO2Me
OH
OH
H2N
N3
OH
OH
ent-Valienamin (ent-64)
CO2Me
OTBS
OH
Br
OTBS
CO2Me
OTBS
HO
CO2H
OH
OTBS
OAc
OAc
OH
268
247
227
OH
2,3-trans-CHD (4)
Abbildung 4.76: ent-Valienamin (ent-64) wird retrosynthetisch auf trans-CHD 4 zurückgeführt.
Versuche, Diol 227 in einer Ritter-Reaktion193 in Aminoalkohol 269 zu überführen, waren
nicht erfolgreich. In der Ritter-Reaktion wird unter sauren Bedingungen Wasser eliminiert
und intermediär ein Carbokation gebildet, welches in einer SN1-Reaktion mit Acetonitril
reagiert. Für benzylische vicinale Diole wird in einigen Fällen eine hohe Stereoselektivität
beobachtet.194 Angenommen wird eine dirigierende Wirkung des zweiten Alkohols durch
Addition an Acetonitril. Nach Reaktion des Stickstoffs mit dem Benzylkation soll ein
Oxazolin-Intermediat gebildet werden, welches nach saurer Hydrolyse einen vicinalen
Aminoalkohol freisetzt. Unter den untersuchten Bedingungen wurde für das allylische System
227 jedoch keine Produktbildung, sondern die Zersetzung des Eduktes gefunden (Abb. 4.77).
CO2Me
OTBS
HO
OTBS
OH
227
CO2Me
OTBS
CH3CN
H2SO4
0 °C
4h
N
H3C
OTBS
O
CO2Me
OTBS
HCl
Reflux
H2N
OTBS
OH
269
Abbildung 4.77: Versuche zur Überführung des vicinalen Diols 227 in den vicinalen
Aminoalkohol 269 mittels Ritter-Reaktion.193
Weder TBS-Ether noch Methylester erwiesen sich unter den Reaktionsbedingungen als
ausreichend stabil.
Da gezeigt werden konnte, dass die geringer substituierte Doppelbindung in 160 unter
Os(VIII)-Katalyse selektiv in das vicinale Diol 227 überführt werden kann (Kapitel 4.4.4),
120
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
wurde die der Dihydroxylierung verwandte Osmium(VIII)-katalysierte Aminohydroxylierung
mit unterschiedlichen Oxidationsmitteln untersucht. In den meisten Fällen erfolgt eine langsame Reaktion zu Produktgemischen, deren überwiegendes Hauptprodukt das vicinale Diol
227 darstellt (Abb. 4.78). Eine Isolierung und Identifizierung der erhaltenen Nebenprodukte,
unter denen auch der erwartete Aminoalkohol enthalten sein könnte, gelang nicht. Als Oxidationsmittel wurden Chloramin-T,195 N-Chlor-methansulfonamid196 wie auch N-Bromacetamid195 eingesetzt.
CO2Me
OTBS
HO
OTBS
OH
227
Hauptprodukt
R = pTolSO2, X = Cl, M = Na
R = CH3SO2, X = Cl, M = Na
R = Ac, X = Br, M = Li
OTBS
160
CO2Me
OTBS
kat. K2OsO4
RNX- M+
Abbildung 4.78: Versuche zur Osmium(VIII)-katalysierten Aminohydroxylierung von 160
mit unterschiedlichen Oxidationsmitteln.
Da keine selektive Methode zur direkten Einführung der Aminofunktion gefunden wurde,
sollte eine Stickstofffunktionalität durch nucleophile Substitution von Bromid gegen Azid
eingeführt werden. Der Einsatz von Lithiumazid in N,N-Dimethylformamid bei 0 °C führt im
Falle von Bromverbindung 247 zur syn-Eliminierung von Essigsäure unter Ausbildung des
bromierten Dien 270. Die Eliminierung konnte auch durch Zusatz von Ammoniumchlorid als
schwache Säure nicht verhindert werden (Abb. 4.79). Brom-CHD 270 wurde in dieser
Reaktion in einer Ausbeute von 65 % isoliert.
CO2Me
OTBS
Br
OTBS
OAc
247
CO2Me
OTBS
LiN3, NH4Cl
DMF, 0 °C
65 %
Br
OTBS
270
Abbildung 4.79: Versuch zur nucleophilen Substitution von Brom gegen Azid ausgehend
von 247 bei gefundener Eliminierung von Essigsäure.
Um die beobachtete Eliminierung zu vermeiden, wurde statt des Essigsäureesters 247 Bromhydrin 245 (Kapitel 4.4.5) unter analogen Bedingungen eingesetzt (Abb. 4.80). Die freie
Alkoholfunktion stellt eine schlechte Abgangsgruppe dar, so dass eine Eliminierung in
schwach basischem Milieu nicht erwartet wird. Tatsächlich konnte die Bildung von Azid 271
nachgewiesen und dieses in 50 % Ausbeute isoliert werden. Ein Nachweis der Azidgruppe
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
121
erfolgt zweifelsfrei über IR-Spektroskopie, bei der eine für Azide typische starke
Schwingungsbande bei ν~ = 2100.3 cm-1 beobachtet wird. Epoxid 161 wurde als Nebenprodukt in 14 % Ausbeute bezogen auf 245 isoliert. Daher ist sowohl denkbar, dass das
erhaltene Azid mittels nucleophiler Substitution des Bromids direkt eingeführt wurde, als
auch dass eine nucleophile Öffnung des Epoxids mit Azid erfolgt sein könnte. Die
Konstitution von Verbindung 271 ist über ein H,H-COSY-Experiment eindeutig zu
bestimmen, eine Klärung der Konfiguration am Azid-tragenden Kohlenstoff gelingt jedoch
nicht. Da die NMR-Daten des Produktes aus der Behandlung von Epoxid 161 mit
Tributylzinnazid12 deutlich von den für 271 gemessenen Werten abweichen, ist die
Stereochemie von 271 vermutlich die hier dargestellte.
CO2Me
OTBS
Br
OTBS
+
OTBS
O
OH
245
CO2Me
OTBS
CO2Me
OTBS
10 eq. LiN3
DMF, rt, 1h
N3
OTBS
OH
271
50 %
161
14 %
Abbildung 4.80: Umsetzung von 245 mit LiN3 zu 161 und 271.
Bessere Ergebnisse werden erzielt, wenn zunächst die TBS-Ether in Bromverbindung 247 mit
Flusssäure in Acetonitril gespalten und das erhaltene Produkt mit Lithiumazid in N,NDimethylformamid umgesetzt wird (Abb. 4.81).
CO2Me
OTBS
Br
OTBS
OAc
247
CO2Me
OH
HF
CH3CN, rt, 6h
75 %
Br
OH
OAc
272
10 eq. LiN3
16 eq. NH4Cl
DMF, rt, 3 h
74 %
CO2Me
OH
N3
OH
OAc
268
Abbildung 4.81: Darstellung von 268 ausgehend von 247 in zwei Stufen.
Das Entfernen der Schutzgruppen verläuft unter diesen Bedingungen glatt, jedoch wurde bei
längeren Reaktionszeiten und Einsatz des basischen Tetrabutylammoniumfluorid als Fluoridquelle eine Wanderung der Acetylgruppe auf die allylische Alkoholfunktion beobachtet. Wird
die Reaktion mit Flusssäure durchgeführt und nach 6 Stunden beendet, werden 75 % des
gewünschten Produktes 272 erhalten, ohne dass eine Wanderung der Acetylgruppe beobachtet
wird. Die anschließende Substitutionsreaktion mit Lithiumazid in N,N-Dimethylformamid
liefert nach drei Stunden bei Raumtemperatur Azid 268 in 74 % isolierter Ausbeute, wobei
122
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
keine Eliminierung als Nebenreaktion beobachtet wird. Die relative Konfiguration und
Konformation von 268 lassen sich über die im 1H-NMR gefundenen Verschiebungen und
3
JH,H-Kopplungen bestimmen, und anhand der NMR-Daten kann 3-epi-268 als theoretisch
denkbares Produkt einer SN1-Reaktion ausgeschlossen werden (Abb. 4.82, 4.83, 4.84).
Hc
Hb
AcO
CO2CH3
OH
He
N3
Hd
OH
OH
N3
N3
AcO
Hb
Hd
OH
OAc
II
CO2CH3
OH
He
OH
OH
N3
III
He
Hd
OH
Hc
N3
OAc
258
I
Hc
a e
bc d
OH
Hb
OH
N3
a e
bc d
Hc
Hb
OH
OAc
3-epi-258
OH
He
Hd
OAc
IV
Abbildung 4.82: Schematische Darstellung möglicher Konformationsisomere von 268 und
3-epi-268.
g
h
CO2CH3
x 0.355
5.00
4.90
4.80
4.70
4.60
4.50
4.40
4.30
4.20
N3
4.10
OH
a f e
b c d
O
OH
i
CH3
j
O
CHCl3
a
c
b
e d
h
j
-OH
PPM
6.8
6.4
6.0
5.6
5.2
4.8
4.4
4.0
3.6
-OH
3.2
2.8
2.4
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 2.19 (s, 3H, CH3), 3.04 (bs, 1H, OH), 3.82 (bs, 1H, OH),
3.83 (s, 3H, CH3), 4.14 (dd, J = 10.2, 6.7 Hz, 1H, CH), 4.44-4.50 (m, 2H, 2 × CH), 4.99 (dd,
J = 10.2, 4.5 Hz, 1H, CH), 6.79 (dd, J = 5.3, 1.3 Hz, 1H, CH).
Abbildung 4.83:
1
H-NMR-Spektrum von 268.
PPM
CDCl3 ced
160.0
150.0
140.0
130.0
120.0
110.0
100.0
90.0
80.0
70.0
20.9042
71.6945
71.4125
69.8197
fa
52.7489
134.4998
132.6290
i g
123
56.6967
166.1414
170.8210
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
b h
60.0
50.0
j
40.0
30.0
20.0
10.0
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 20.9 (CH3), 52.7 (CH3), 56.7 (CH), 69.8 (CH), 71.4
(CH), 71.7 (CH), 132.6 (CH), 134.5 (Cq), 166.1 (CO), 170.8 (CO).
Abbildung 4.84:
13
C-NMR-Spektrum von 268.
Das Signal des vinylischen Protons Ha kann aufgrund seiner Verschiebung von δ = 6.79 ppm
eindeutig zugeordnet werden. Das Signal von Proton Hc weist aufgrund des elektronenziehenden Effektes des Acetoxyrestes mit δ = 4.99 ppm eine deutliche Tieffeldverschiebung
auf und ist somit ebenfalls eindeutig zuzuordnen. Über ein H,H-COSY-Experiment lassen
sich die Position der Acetylfunktion im Molekül bestätigt, und die Protonensignale den
Protonen Hb, Hd und He zuordnen. 3JH-c,H-d = 10.2 Hz weist einen Betrag auf, wie er für die
Kopplung zweier vicinaler axialer Protonen typischerweise erwartet wird. Somit können
Konformationsisomere II und IV, in denen für Hc und Hd je äquatoriale Ausrichtungen
erwartet werden, ausgeschlossen werden. Konformationsisomer III kann ebenfalls ausgeschlossen werden, da
3
JH-b,H-c = 4.5 Hz auf die vicinale Kopplung eines pseudo-axial
orientierten Protons mit einem äquatorialen Proton oder zweier vicinaler (pseudo-)äquatorial
orientierter Protonen hinweist. Ein Wert von 4.5 Hz ist hingegen für die Kopplung zweier
(pseudo-)axial bzw. axial orientierter Protonen, wie sie für III erwartet werden, zu klein.
Somit kann aus den NMR-Daten eindeutig die für 268 gezeigte relative Konfiguration
abgeleitet und 3-epi-268 als Produktstruktur ausgeschlossen werden. Da die absolute Konfiguration in den Positionen c, d und e aus 4 und durch die Synthese der Naturstoffe ent-
124
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
Streptol (ent-58) und ent-Valienon (ent-8) bekannt und belegt ist, ist die absolute Konfiguration des Produktes eindeutig geklärt.
Weiterhin weisen die vicinalen Protonen-Kopplungen für 268 und Literaturdaten197 zu
Valienamin (64) eine große Ähnlichkeit auf und stützen ebenfalls die für 268 ermittelte
Konfiguration (Tabelle 8).
CO2CH3
N3
a e
bc d
CH2OH
OH
OH
H 2N
a e
bc d
OAc
Tabelle 10:
3
OH
OH
OH
268
CDCl3
Valienamin (64)
D2O
3
JH-a,H-b [Hz]
5.3
5.1
3
JH-b,H-c [Hz]
4.5
3.8
3
JH-c,H-d [Hz]
10.2
10.3
3
JH-d,H-e [Hz]
6.7
5.6
JH,H-Kopplungen von 268 (CDCl3) und Valienamin (64, D2O).197
Um eine der beiden Azidverbindungen 271 oder 268 in ent-Valienamin (ent-64) zu überführen, sollten diese unter reduzierenden Bedingungen umgesetzt werden (Abb. 4.85).
CO2Me
OTBS
N3
OH
271
N3
OH
Reduktion
CO2Me
OH
OH
OAc
OH
OTBS
H2N
OH
OH
ent-Valienamin
(ent-64)
OAc
Peracetylierung
AcHN
OAc
OAc
ent-ValienaminPentaacetat
(ent-163)
OAc
268
Abbildung 4.85: Reduktion von 268 oder 271 und anschließende Peracetylierung zur
Synthese von ent-Valienamin-Pentaacetat (ent-163).
Hierbei soll einerseits das Azid zum primären Amin und andereseits der Methylester unter Erhalt der Doppelbindung zu einer Methylalkoholgruppe reduziert werden. Für diese Reaktion
geeignete Reagenzien sind Aluminiumhydride wie DIBAL-H oder das stärkere Reduktions-
Spezieller Teil – Naturstoffsynthesen
125
mittel Lithiumaluminiumhydrid (LAH), wobei mit LAH eine Reduktion der KohlenstoffKohlenstoff-Doppelbindung als Nebenreaktion erwartet werden muss.198 Weiterhin ist bekannt und wurde bereits beobachtet, dass TBS-Ether bei Raumtemperatur durch Aluminiumhydride gespaltet werden.186 Das erhaltene polare Rohprodukt soll in Pyridin aufgenommen
und mit Essigsäureanhydrid in Gegenwart katalytischer Mengen 4-(Dimethylamino)pyridin
peracetyliert werden.
Zunächst wurde analog zu 227 und 260 versucht, die Reduktion von 271 in Gegenwart eines
Überschusses DIBAL-H bei – 78 °C durchzuführen. Die erhaltenen NMR-Daten des nach
Peracetylierung isolierten Rohprodukt lassen vermuten, dass wie erhofft die Doppelbindung
nicht angegriffen wurde. Mit dem erwarteten Produkt stimmen die NMR-Daten allerdings
nicht überein; vielmehr scheint der Methylester nicht reduziert sondern hydrolysiert worden
zu sein, da weder eine Methylengruppe noch die Methylgruppe des Methylesters identifiziert
werden konnten. Bei Versuchen zur Aufreinigung des erhaltenen Produktes an Kieselgel
zersetzte sich dieses teilweise.
Auch die Wahl des stärkeren Reduktionsmittels LAH zur Reduktion von 268 bei Raumtemperatur über Nacht führte nicht zu nennenswerten Produktmengen. Nach Umsatz des Rohproduktes mit Essigsäureanhydrid und Pyridin konnte eine Mischung verschiedener Substanzen
detektiert werden. Nach chromatographischer Fraktionierung dieser Substanzmischung wurde
in den Fraktionen mit dem erwarteten Retentionsfaktor78b tatsächlich das erwartete Produkt
neben einer gesättigten Verbindung identifiziert (vgl. Anhang 6.2.2).
126
Spezieller Teil – Zusammenfassung
4.8 Zusammenfassung
Ausgehend vom bekannten biosynthetischen Zugang zu 2,3-trans-CHD (4) (4.6 g × L-1 mit
AN193/pDF3 im 300 L Maßstab)12,100a und 3,4-trans-CHD (5) (0.8 g × L-1 mit BN117/pDF1
im 100 mL Maßstab)12,100b konnten in mikrobiologischen Arbeiten die Vektoren pC19-22
kloniert und damit die Voraussetzungen für eine effektivere Produktion beider trans-CHD
geschaffen werden. Unter Einsatz dieser Vektoren wurden Produktionsstämme generiert, die
von Dr. R. Takors und Mitarbeitern unter optimierten Fermentationsbedingungen 2,3-transCHD (4) mit 15.8 g × L-1 (eingesetzter Stamm: F111/pC20) und 3,4-trans-CHD (5) mit
14.5 g × L-1 (eingesetzter Stamm: F82/pC22) in 300 L - Fermentationen produzierten.199
Untersuchungen zur Reaktivität von Derivaten von 4 und 5 zeigen, dass 4 zu einer
selektiveren, aber tendenziell langsameren Reaktionen neigt als 5. Die in verschiedenen
Reaktionen variierende Regioselektivität wie auch die Bildung von Diastereomerengemischen
ausgehend von Derivaten von 5 kann als Folge einer geringeren Polarisierung des
Diensystems in 5 wie auch des Vorliegens zweier im Gleichgewicht befindlicher Konformationsisomere verstanden werden, welche unterschiedlich schnell und selektiv reagieren.
Für das Vorliegen dieser Konformationsisomere konnten mittels NMR-Untersuchungen und
CD-Messungen Hinweise erhalten werden.
Beide trans-CHD 4 und 5 konnten erfolgreich als Ausgangsverbindungen in Naturstoffsynthesen eingesetzt werden. ent-Streptol (ent-58) wie auch beide Enantiomere von Valienon
(8) wurden ausgehend von 4 und 5 erhalten. Mit der enantioselektiven Synthese beider
Enantiomere von Valienon (8) ausgehend von 4 bzw. 5 konnte die Komplementarität beider
trans-CHD als Ausgangsverbindungen in der Synthese demonstriert werden. Eine Synthese
von ent-Valienamin (ent-64) konnte grundsätzlich gezeigt werden. Mit 268 und 271 wurden
Verbindungen erhalten, in denen Sauerstoff- und Stickstoffsubstituenten die gleiche Konstitution und Konfiguration aufweisen wie in ent-64. Der abschließende reduktive Schritt
liefert neben anderen Verbindungen das Enantiomer des Naturstoffs.
Ausblick
127
4.9 Ausblick
Die mikrobiell produzierten trans-CHD 4 und 5 bieten weit mehr Möglichkeiten zu chemischen Modifikationen und zum Einsatz als chirale Bausteine in der Natur- oder Wirkstoffsynthese als bislang untersucht wurden. Durch Erweiterung des Spektrums mikrobiell
zugänglicher Verbindungen wie auch durch einen breiten Einsatz unter bislang nicht untersuchten Reaktionsbedingungen werden Verbindungen wie 4 und 5 künftig wertvolle chirale
Synthesebausteine darstellen. Einige Möglichkeiten für weiterführende Untersuchungen
werden in diesem Kapitel vorgestellt.
4.9.1
Optimierung der Metabolit-Produktion
Um noch höhere Produkttiter zu erzielen, sollten Gene des Shikimatbiosyntheseweges nicht
plasmidisch, sondern chromosomal in Produktionsstämmen integriert und amplifiziert werden. Dadurch wird eine höhere Expression plasmidisch codierter Enzyme zur Modifikation
von Chorismat ermöglicht. Ein solcher Stamm wäre im Idealfall auch in der Lage, ohne
Plasmidzusatz als Chorismatproduzent zu fungieren. Erste Versuche in dieser Richtung
wurden durch Dr. J. Bongaerts (DSM BIOTECH GMBH, Jülich) durchgeführt.200
Für 3,4-trans-CHD (5) wird neben der Bioynthese aus Chorismat (3) eine weiterer
biosynthetischer Zugang direkt aus Shikimat (15) vermutet.14,94,95 Diese bislang nicht gut
untersuchten Biosynthesen versprechen eine direktere und damit effektivere Biosynthese von
5, falls eine präparative Nutzung gelingt.
4.9.2
Erweiterung des biologisch zugänglichen Metabolit-Spektrums
Neben der Optimierung der Produktion der Diole wird die Biosynthese neuer Zielsubstanzen
unter Nutzung weiterer Biotransformationen ausgehend von Chorismat untersucht (vgl. Abb.
4.86). So wurde der Zugang zu Aminoalkohol 7 von Dr. V. Lorbach, Professor Dr. G.
Sprenger und Dr. J. Bongaerts erarbeitet,127 die Biosynthese von Aminoalkohol 6 wird von
Professor Dr. G. Sprenger und Dr. J. Bongaerts200,201 untersucht, und A. Kurutsch beschäftigt
sich mit der Umsetzung von Chorismat zu SHCHC (23).
128
Ausblick
Isoprephenat (24)20 und Salicylat (25)21 sind Beispiele für weitere interessante Zielprodukte.
Im Falle von 24 sind einerseits der bislang nicht identifizierte Biokatalysator, der für die
Umsetzung von Isochorismat zu 24 verantwortlich ist, wie auch andererseits die hohe
Tendenz zur Aromatisierung des Produktes zu 3-Carboxyphenylpyruvat202 problematisch.
Die Produktion von Salicylsäure (25) mit rekombinanten Bakterien konnte prinzipiell gezeigt
werden,21 problematisch ist hierbei aber die bakteriostatische Wirkung von 25,203 welche das
Erzielen hoher Produkttiter unwahrscheinlich erscheinen lässt.
O
CO2H
OH
HO2C
CO2H
OH
SHCHC (23)
Salicylsäure (25)
CO2H
EntC oder MenF
MenD
Irp921a oder
(EntC oder MenF) und
(PchB21b oder PmsB21c)
OH
EntC oder MenF
EntB
CO2-
OH
2,3-trans-CHD (4)
O
CO2H
X
O
CO2-
OH
EntB
Chorismat (3)
CO2H
OH
PabAB
Isoprephenat (24)
CO2-
EntC oder MenF
PhzE oder TrpEH398M
CO2H
OH
OH
3,4-trans-CHD (5)
CO2NH3+
OH
NH3+
3,4-trans-CHA (6)
OH
2,3-trans-CHA (7)
Abbildung 4.86: Beispiele für aus 3 biosynthetisch zugängliche Verbindungen; X: nicht
identifiziertes Enzym aus Nicotiana silvestria;20 Irp9: für die Umsetzung
von Chorismat zu Salicylat verantwortlich gemachtes Enzym aus Yersinia
enterocolitica;21a PchB: für die Umsetzung von Isochorismat zu Salicylat
verantwortlich gemachtes Enzym aus Pseudomonas aeruginos;21b PmsB:
für die Umsetzung von Isochorismat zu Salicylat verantwortlich
gemachtes Enzym aus P. fluorescens.21c
In allen diesen Fällen kann später die Kombination der gefundenen Enzymsysteme mit
Enzymen des Shikimat-Biosyntheseweges, wie sie etwa auf pF112 vereint sind (Kapitel
4.1.2.1), zu einer effektiveren Produktion beitragen.
Ausblick
129
Neben den zum Teil gut untersuchten Biosynthesewegen, in denen Chorismat umgesetzt wird,
sind auch einige Sekundärmetabolite beschrieben, deren Biosynthese noch nicht aufgeklärt
wurde, deren Ursprung aber aufgrund struktureller Ähnlichkeit im Shikimat-Biosyntheseweg
zu finden sein dürfte. Beispiele hierfür sind etwa die Cyathiformine,54 die darauf schließen
lassen, dass es bislang nicht identifizierte Halogenasen gibt, welche Chorismat oder einen
Vorläufer dieser Verbindung als Substrat akzeptieren und modifizieren (Abb. 4.87).
Die Biosynthese von Echinosporin (273), einem antibakteriell und antitumoral wirkenden
trizyklischen Naturstoff, wird zur Zeit untersucht. In Isotopenmarkierungsexperimenten
konnte gezeigt werden, dass 273 über den Shikimatbiosyntheseweg und vermutlich aus 3
gebildet wird.204 Interessant an dieser Biosynthese ist vor allem die völlige Umstrukturierung
des Kohlenstoffgerüstes.
O
HO
O
O
NH2
O
Echinosporin (273)
CO2H
CO2Me
Cl
O
CO2H
OH
Chorismat (3)
HO
O
CO2Me
OH
Cyathiformin C (61)
CO2Me
HO
O
CO2Me
OH
Cyathiformin D (62)
Abbildung 4.87: Weitere vermutlich von 3 oder dessen Vorläufern abgeleitete Metabolite,
deren Biosynthesen bislang nicht detailliert untersucht sind.54,204
Das Konzept der diversitätsorientierten Biosynthese ist natürlich nicht auf Chorismat (3)
beschränkt und kann analog auf andere Biosynthesewege und Metaboliten übertragen werden.
Die Nutzung des Aminoshikimat-Biosyntheseweges (Kapitel 3.2) bietet sich beispielsweise
zur Biosynthese chiraler Stickstoffverbindungen an. 3,4-trans-CHD (5) wiederum kann durch
Kombination mit Enzymen aus der Ascomycin-Biosynthese aus S. hygroscopicus zu weiteren
chiralen Alkoholen umgesetzt werden (vgl. Kapitel 3.10.2.2; Abb. 4.88).95
130
Ausblick
CO2H
CO2H
CO2H
i
über den ShikimatBiosyntheseweg und
Chorismat
ii
OH
OH
OH
OH
OH
OH
5
139
140
Abbildung 4.88: Hypothetische Transformation von 5 mit Enzymen aus der AscomycinBiosynthese;95 i Reduktion der dreifach substituierten Doppelbindung und
anschließende Isomerisierung, ii Reduktion der verbliebenen Doppelbindung.
Denkbar sind aber auch ganz andere Biosynthesewege, wie am Beispiel des gut untersuchten
Butanoat-Metabolismus gezeigt. Dieser ermöglicht die Produktion von chiralen Alkoholen
wie etwa (R,R)-Butan-2,3-diol oder (R)-Acetoin.205
4.9.3
Chemie der trans-CHD
Das Potential der beiden trans-CHD 4 und 5 als Ausgangsverbindungen in der Synthese
unterschiedlicher Cyclitole und Carbazucker wurde an verschiedenen Beispielen gezeigt.
Während schon einige Untersuchungen zu Umsetzungen des 2,3-trans-CHD vorliegen,12,127,130,206 konnten im Rahmen dieser Arbeit erste grundlegende Untersuchungen zur
Reaktivität des 3,4-trans-CHD durchgeführt werden.
4.9.3.1 Schutzgruppenchemie
Der zum Schutz der Säurefunktion eingeführte Methylester erweist sich in manchen
Reduktionsreaktionen (vgl. Kapitel 4.7) oder Hydrolysen zur freien Carbonsäure127 als
reaktionsträge,12,127,206 so dass in problematischen Systemen wie im Falle der ent-ValienaminSynthese der Einsatz anderer Ester erwogen werden sollte. Ein sterisch anspruchsvoller Ester
könnte auch Einfluss auf die Stereoselektivität bei Reaktionen von Derivaten des 3,4-transCHD haben. Durch die Installation einer voluminöseren Esterfunktion könnte eine deutliche
Verschiebung des Verhältnisses beider Konformationsisomere und somit eine positive
Beeinflussung der Stereoselektivität sich anschließender Folgereaktionen erzielt werden.
Wie die Ergebnisse andeuten, sind die TBS-Ether in vielerlei Hinsicht geeignete Schutzgruppen, die leicht und in hohen Ausbeuten einzufügen und wieder zu entfernen sind. Sie
Ausblick
131
bieten eine hohe Stabilität unter vielfältigen Reaktionsbedingungen. Ein gravierender Nachteil
dieser Schutzgruppe besteht darin, dass im Falle des 3,4-trans-CHD - wie im Falle der
Epoxidierungen gezeigt - keine hoch stereoselektiven Umsetzungen erzielt werden (Kapitel
4.4.3.1).
Eine höhere Selektivität verspricht der Einsatz eines konformativ fixierenden Systems, wie es
in Trioxepin 198 gegeben ist. Hier birgt die Untersuchung alternativer überbrückender
Schutzgruppen sicher ein hohes Optimierungspotential, und vielleicht gelingt auch die Einführung des Trioxepins unter veränderten Bedingungen, die den Einsatz weniger toxischer
Verbindungen beinhaltet.
trans-Diole können in zyklische 1,2-Diacetale, welche von Steven Ley und Mitarbeitern als
Schutzgruppe etabliert wurden, überführt werden.207 Erste Versuche in diese Richtung unter
von Gonzales und Mitarbeitern beschriebenen Bedingungen208 waren im Falle des 3,4-transCHD 170 nicht erfolgreich. Die Tatsache, dass sich mit dem Trioxepinsystem ein sonst häufig
kinetisch ungünstiger Siebenring bildet, lässt die Überlegung zu, dass bei dem vorliegenden,
konformativ nicht freien System die Bildung eines 1,2-Diacetals unvorteilhaft ist, ein 1,3Diacetal jedoch gebildet werden könnte (Abb. 4.89). Beispiele für solch eine Reaktion
wurden allerdings bislang nicht publiziert.
O
CO2Me
OH
OH
170
Ph
Ph
O
TMS-OMe
kat. TMS-OTf
CO2Me
CO2Me
O
O
MeO Ph
274
OMe
Ph
OH
OH
O
O
TMS-OMe
kat. TMS-OTf
?
170
CO2Me
O
O
OMe
MeO
275
Abbildung 4.89: Alternative zyklische Schutzgruppen für Diol 170.
Alternativ könnte die Einführung eines zyklischen Malonsäureesters als Schutzgruppe für das
trans-Diol Erfolg versprechen. Aufgrund der beiden sp2-hybridisierten Carbonylkohlenstoffen, die im Trioxepinsystem nicht gefunden werden, ist fraglich, ob sich beide Systeme
konformativ so ähnlich sind, dass dieses System tatsächlich gebildet wird. Ein zyklischer
Malonsäureester verspricht keine große Stabilität unter alkalischen oder reduktiven Bedingungen, ermöglicht aber ähnlich dem Trioxepin-Ring eine konformative Fixierung und
daher selektivere Reaktionsführungen. Ein Zugang zu alternativen konformativ fixierten
Verbindungen wäre zudem für Strukturuntersuchungen interessant. Sollte eine Einführung,
etwa mit Malonsäuredichlorid in Gegenwart der Hünig-Base, erfolgreich verlaufen, bleibt zu
132
Ausblick
überlegen, ob die CH-acide Malonsäureestergruppe durch eine 2,2-Dimethylmalonsäureesterfunktion, welche keine CH-aciden Protonen aufweist, substituiert werden sollte (Abb. 4.90).
CO2Me
CO2Me
ClOC
COCl
NEt(iPr)2
OH
OH
CO2Me
CO2Me
ClOC
COCl
NEt(iPr)2
O
?
OH
O
O
?
OH
O
170
276
O
O
170
O
O
277
Abbildung 4.90: Einführung zyklischer Malonsäureesters als Schutzgruppen in 170.
4.9.3.2 Reduktionen und daran anschließende Reaktionen
Zur Modifikation des Diensystems wurden im Rahmen dieser Arbeit ausschließlich
Oxidationsreaktionen untersucht. Nicht untersucht wurde die Reduktion einzelner Doppelbindungen, wie sie von Dr. D. Franke bereits für 2,3-trans-CHD 196 mit elementarem
Wasserstoff in Gegenwart von Palladium auf Kohle gezeigt wurde (Abb. 4.91).12
CO2Me
OH
OH
H2 (5 bar)
Pd/C, 23 °C
CO2Me
OH
89 %
OH
278
196
Abbildung 4.91: Hydrierung von trans-CHD 196 mit Wasserstoff an Palladium.12
Neben der Hydrogenolyse von Doppelbindungen bieten andere reduzierende oder disproportionierende Reaktionen wie etwa die Hydroborierung209 oder die reduktive Epoxidöffnung210
Potential zur Erweiterung der zugänglichen Palette an Cyclitolen (Abb. 4.92).
CO2Me
OR
OR
CO2Me
OR
O
OR
1) BHR2
2) H2O2
?
H2, Pd/C
CO2Me
OR
OR
OH
CO2Me
OR
?
OR
OH
Abbildung 4.92: Erwartete Produkte aus Hydroborierung209 und reduktiver Epoxidöffnung.210
Ausblick
133
Die über Hydroborierung211 zwischenzeitig erzeugten Borane sollten außer in Alkohole211b,c,d
auch in Amine212 überführt werden können (Abb. 4.93).
CO2Me
OR
CO2Me
OR
OR
BHR2
?
CO2Me
OR
OR
BR2
H2O2
NaOH
OR
?
OH
?
CO2Me
OR
NH2OSO3H
OR
NH2
Abbildung 4.93: Beispiele für funktionelle Gruppen, die über Borane eingeführt werden
können.211b,c,d,212
Analog lassen sich auch Reaktionen mit Derivaten des 3,4-trans-CHD (5) untersuchen.
4.9.3.3 Erweiterung des Cyclohexanrings
Ganz neue Substanzklassen werden zugänglich, wenn der Kohlenstoffsechsring verändert
wird. Hierzu bietet sich die Einführung eines geminal-Dihalocyclopropanrings durch
Reaktion mit in situ gebildeten Dihalocarbenen an. Eine vergleichbare Umsetzung mit cisCHD 279 ist beschrieben (Abb. 4.94 A).213 Die Produkte dieser Reaktion können in
unterschiedlicher Weise weiterreagieren. Der erhaltene Bizyklus kann unter Einsatz von
Silber(I) unter Öffnung des Cyclopropanrings und gleichzeitiger Erweiterung des zweiten
Zyklus umgesetzt werden. Dies wurde bislang vorwiegend an kleineren Ringen gezeigt,214
auch wenn Beispiele für Sechsringsysteme wie beispielsweise 281 bekannt sind (Abb. 4.94
B).215 Wenn die Öffnung des Cyclopropanrings unter Ringerweiterung erfolgt, ist die Bildung
zweier Regioisomere denkbar. Es könnten sowohl das thermodynamisch bevorzugte
konjugierte Dien als auch das unter kinetischer Kontrolle entstehende diskrete Dien gebildet
werden (Abb. 4.94 C).
Anwendung finden könnte diese Reaktion beispielsweise in der Synthese verschiedener Wirkund Naturstoffe. Zyklische polyfunktionalisierte Verbindungen mittlerer Ringgröße werden
zur Zeit als mögliche Carbohydrat-Analoga untersucht.216 Andere Verbindungen wie etwa
Keisslon (283) weisen eine entsprechende Struktur und interessante pharmakologische
Wirkungen auf. Keisslon (283) ist ein antimikrobiell wirksamer Metabolit eines marinen
filamentösen Pilzes.217
134
Ausblick
Br
Br
CHBr3
NaOH
OTBS
A
OTBS
OTBS
Br
279
B
282
CO2Me
OR
CHBr3
NaOH
?
OR
OAc
Br
Br
281
C
Br
280
AgOAc
AcOH
∆T
Br
CO2Me
OR
OTBS
OR
Br
AgBF4
Nu-
MeO2C
MeO2C
OR
OR
OR +
?
Br
Br
OR
Nu
Nu
Br
Abbildung 4.94: Literaturbeschriebene Bildung und Umsetzung von geminal-Dihalocyclopropanen; A Reaktion eines cis-CHD mit in situ gebildetem
Carben;213 B Reaktion mit Essigsäure unter Ringerweiterung;215a
C mögliche Reaktion eines trans-CHD unter Ringerweiterung.
Eine Synthese von 283 könnte ausgehend von 2,3-trans-CHD (4) unter Ringerweiterung zu
einem Cyclohepten-Ring gelingen. Eine hypothetische Synthese ist in Abbildung 4.95
dargestellt.
CH3
O
CH3
HO
HO
O
Keisslon (283)
RO
RO
O
CO2H
CO2H
RO
i
CH3
O
RO
RO
ii
RO
Br
Br
CH3
CH3
iii
RO
Br
Br
O
iv
RO
Br
Br
RO
CH3
v
RO
HO
Br
CH3
O
CH3
CH3
RO
RO
O
Abbildung 4.95: Hypothetische Synthese von Keisslon aus 2,3-trans-CHD; i CH2Br2,
NaOH; ii MeLi; iii CuI, BrMgCH3; iv a) AcOH, AgBF4; b) NaOH; v a)
DIBAL-H; b) TBS-OTf, NEt3; c) nBuLi; d) H2O, HF; e) Swern-Oxidation.
Ausblick
135
4.9.3.4 Ringöffnende Reaktionen
Eine Möglichkeit zur Öffnung der Cyclohexan-Grundstruktur unter Aufbruch einer
Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung bietet die Baeyer-Villiger-Oxidation mit mCPBA, welche
die Reaktion des Kohlenstoffrings zu einem zyklischen Lacton unter Insertion des Sauerstoffs
in allylischer Position, wie an den Literaturbeispielen 284 und 286 illustriert, erlauben sollte
(Abb. 4.96).218
Br
Br
CF3CO3H
Na2HPO4
A
O
68 %
O
O
285
284
OCH3
(CF3CO)2O
CO(NH2)2*H2O2
Na2HPO4
O
B
Et
92 %
O
O
O
O
286
OCH3
Et
287
Abbildung 4.96: Beispiele für Baeyer-Villiger-Oxidationen an substituierten Cyclohexenonen; A nach Krafft;218f B nach Schultz.218d
Das durch die Hydrolyse des erhaltenen Lactons freigesetzte Enol tautomerisiert zum
Aldehyd. Dabei wird ein neues Stereozentrum erhalten, welches aber nach Hydrolyse des
Methylesters und Decarboxylierung verloren gehen sollte (Abb. 4.97).
CO2Me
OR
O
OR
OR
MeO2C
mCPBA
?
OR
OR
O
O
OR
1. NaOH
2. AcOH, ∆T
?
O
OR OR
CO2H
OR
Abbildung 4.97: Hypothetische oxidative Ringöffnung durch Baeyer-Villiger-Oxidation zu
einem Lacton und dessen Hydrolyse.
136
Ausblick
Weitere oxidative Ringöffnungen könnten beispielsweise mittels Ozonolyse einer Doppelbindung oder Periodat-Spaltung vicinaler cis-Diole mittels Periodsäure (Malaprade-Reaktion)219 oder Blei(IV)acetat220 erfolgen (Abb. 4.98 A, B). Die hierbei zugänglichen Aldehyde
lassen vielfältige Folgereaktionen zu.
CO2Me
OR
A
RO
OR OR
1) O3
2) H2O2
MeO2C
?
OR
CO2H
O
OR OR
OR
CO2Me
OR
B
HO
CO2Me
OR
NaIO4
oder Pb(OAc)4
?
OR
O
OR
O
OH
Abbildung 4.98: Beispiele für mögliche oxidative Ringöffnungsreaktionen: A Ozonolyse;
B Periodat- oder Blei(IV)acetatspaltung von aus 4 abgeleiteten Verbindungen.
Ein Beispiel für einen aus trans-CHD 4 mittels Ozonolyse und reduktiver Aufarbeitung
erhaltenen offenkettigen Baustein beschreiben Banwell und Mitarbeiter (Abb. 4.99).221
CO2Me
OTBS
OH
DIBAL-H
OTBS
160
OTBS
88 %
OH
PDA, AcOH
OTBS
1. O3
2. NaBH4
86 %
74 %
OTBS
OTBS
288
289
OTBS
HO
OH
OTBS
OH
290
Abbildung 4.99: Selektive Reduktion der geringer substituierten Doppelbindung und
anschließende Ozonolyse mit reduktiver Aufarbeitung zur Überführung
des aus 2,3-trans-CHD (4) abgeleiteten Diens 288 in ein offenkettiges
System nach Banwell et al.;221 PAD: Kaliumazodicarboxylat.
Einen anderen Ansatz zur Ringöffnung bietet auch die Untersuchung der Metathesereaktion
in verdünnter Lösung unter Ethen-Atmosphäre zu einem offenkettigen 1,5-Dien (Abb. 4.100).
In konzentrierter Lösung ist mit Polymerisation zu rechnen.222 Aus sterischen Gründen sollte
ein Ringschluss mittels Metathesereaktion zu einem Cyclobutenderivat als Folgereaktion
kaum erfolgen.
CO2Me
OR
OR
H2C CH2
OR
Grubb´s Katalysator
?
MeO2C
Abbildung 4.100: Ringöffnung mittels Metathesereaktion.
OR
Ausblick
137
4.9.3.5 Cycloadditionen
Weitere Reaktionen, in denen das konjuguierte Diensystem funktionalisierter Cyclohexadiene
reagiert, sind Diels-Alder- und Hetero-Diels-Alder-Reaktionen. Dr. V. Lorbach und Dr. C.
Grondal haben solche Reaktionen an Derivaten von 2,3-trans-CHD (4) und 2,3-trans-CHA
(8) untersucht. 4 und 8 und Derivate hiervon können in einer Diels-Alder-Reaktion sowohl als
Dien wie auch als Dienophil reagieren und dimerisieren. Weiterhin sind diese Substanzen in
Hetero-Diels-Alder-Reaktionen eingesetzt worden, wo sie mit Nitrosoverbindungen regiound stereoselektiv eine Cycloaddition eingehen (Abb. 4.101 A, B).127,130
CO2Me
NH2
A
2
CO2Me
LiCl, H2O
65 °C
H2N
CO2Me
HO
OH
NH2
291
292
CO2Me
OH
B
OH
196
O
tBuO
NO
O
tBuO
OH
CO2Me
OH
O
N
OH
293
Abbildung 4.101: Cycloadditionen mit funktionalisierten Cyclohexadienen; A Dimerisierung des Methylesters 291 in einer Diels-Alder-Reaktion zu 292;127 B
ein Beispiel für eine Hetero-Diels-Alder-Reaktion mit Dien 196.130
5 zeigt hingegen keine Tendenzen, unter milden Bedingungen in einer Diels-Alder-Reaktion
zu dimerisieren und wurde bislang nicht erfolgreich in weiteren Cycloadditionen eingesetzt.
Eine Ursache hierfür mag in der vermuteten geringen Polarisierung des Diensystems in 5
liegen (vgl. Kapitel 4.5). Aus der Literatur ist ein Beispiel bekannt, in dem Cyclohexa-1,5dien-1-carbonsäuremethylester (294) in Cycloadditionen eingesetzt wird (Abb. 4.102).223
Hierbei wurden vielfach neue und interessante Strukturen – wenn auch nach teilweise mehrtägigen Reaktionen – erhalten.
138
Ausblick
CO2Me
CO2Me
1
294
O2
Hetero-DielsAlder-Reaktion
OO
295
CH2N2
1,3-dipolare
Cycloaddition
N
N
CO2Me
O O
296
Abbildung 4.102: Reaktion von Cyclohexa-1,5-dien-1-carbonsäuremethylester (294) mit
Singulett-Sauerstoff in einer Hetero-Diels-Alder-Reaktion und nachfolgende 2,3-dipolare Cycloaddition von Diazomethan an die entstandene
Doppelbindung.223
Wie dargestellt versprechen 4 und 5 vielfältige Möglichkeiten zum Einsatz als chirale Bausteine in der organischen Synthese und werden künftig sicher ähnlich wertvolle und verbreitete chirale Synthesebausteine wie funktionalisierte cis-CHD77,79 darstellen.
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
139
5 Experimenteller Teil
5.1 Biologische Arbeiten
5.1.1
Materialien und Methoden
Mikroorganismen und Plasmide
Die im Folgenden aufgeführten E. coli-Stämme und Vektoren wurden im Rahmen dieser
Arbeit eingesetzt.
Stamm
Relevanter Genotyp
Referenz
DH5α
224
supE44 ∆lacU169(Φ80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 gyrA96 thi-1 relA1 Hanahan
LJ110
W3110 fnr+ prototroph
Jahreis122
F5
LJ110 ∆(aroB)
Sprenger225
F12
LJ110 ∆(aroL)::T00 ∆(aroK)::kan
Sprenger225
F68
LJ110 ∆(trpE) ∆(pheA tyrA aroF)::kan
Sprenger226
F85
LJ110 ∆(trpE) ∆(pheA tyrA aroF)::kan ∆(entCEBA)::cat
Sprenger226
F111
LJ110 ∆(pheA tyrA aroF) ∆(entCEBA)::FRT ∆(gcd) ::cat
Sprenger226
Plasmid
Größe [bp]
Relevante Merkmale
Referenz
pUCBM20
2722
Klonierungsvektor auf pBR322-Basis
Boehringer
Mannheim
pJF119EH1
5428
AmpR, lacIq, Ptac, ori colE1
Fürste120
pF81
9091
pJF119EH1-aroF-pheA-aroB-aroL
Sprenger225
pF109
7553
pJF119EH1-aroF-aroB
Sprenger225
pF112
8114
pJF119EH1-aroF-aroB-aroL
diese Arbeit
pUCBM20-entC-entB
4846
pUCBM20-entC-entB
diese Arbeit
pDF3
7537
pJF119EH1-entC-entB
Franke12
pC19
9665
pJF119EH1-aroF-entC-entB-aroB
diese Arbeit
pC20
10226
pJF119EH1- aroF-entC-entB-aroB-aroL
diese Arbeit
pC21
8454
pJF119EH1-aroF-entB-aroB
diese Arbeit
pC22
9015
pJF119EH1- aroF-entB-aroB-aroL
diese Arbeit
140
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die hier angeführten PCR-Primer (MWG BIOTECH GMBH,
Ebersberg) eingesetzt. Restriktionsschnittstellen sind fett und kursiv dargestellt.
EntCupbgl
5´-CCC AGA TCT TTA TCA TTT TGT GGA GGA TGA-3´
BglII Tm = 64.0 °C
EntBdownbgl 5´-CCC AGA TCT GAA ATC CAT TAT TTC ACC TCG-3´ BglII Tm = 66.8 °C
Stammhaltung
Zur Stammhaltung werden E. coli-Kulturen bis zur mittellogarithmischen Wachstumsphase
bei einer optischen Dichte von 2.5 in LB-Medium angezogen. Die Zellsuspension wird mit
gleichem Volumen einer 87 %igen Glycerinlösung versetzt und in Aliquots von 2 mL bei
– 80 °C gelagert. Für Zeiträume von bis zu 4 Wochen werden die E. coli-Kulturen auf
Agarplatten bei 4 °C aufbewahrt.
Chemikalien
Chemikalien wurden von den Firmen ACROS (Geel, Belgien), ALDRICH (Seelze), FLUKA (NeuUlm), MERCK (Darmstadt), SIGMA (Deisenhofen) und TOKYO KASEI KOGYO CO. LTD. (Tokyo,
Japan) in p.a.-Qualität bezogen und soweit nicht anders angegeben ohne weitere Aufreinigung
eingesetzt.
Kohlenstoffquelle, Lösungen, Puffer und Medien
Ampicillin
100 mg × mL-1, sterilfiltriert, bei 4 °C gelagert
Glucose
20 % (w/v) in Wasser, 20 Minuten bei 121 °C sterilisiert
IPTG
100 mM, sterilfiltriert, bei 4 °C gelagert
Thiamin (Vitamin B1)
10 mg × mL-1, sterilfiltriert, bei 4 °C gelagert
AS-Lösungen (Tryptophan, je 4 mg × mL-1, sterilfiltriert, bei 4 °C gelagert
Tyrosin, Phenylalanin)
SDS-Probenpuffer
120 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20 % [v/v] Glycerin, 6 % [w/v] SDS,
10 % β-Mercaptoethanol, 50 ppm [w/v] Bromphenolblau
Sammelgelpuffer
0.5 m Tris, mit 36 %iger HCl auf pH 6.6 eingestellt
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
Trenngelpuffer
1.5 M Tris, mit 36 %iger HCl auf pH 8.8 eingestellt
Laufpuffer (10 ×)
250 mM Tris, 1.92 M Glycin, 1 % (w/v) SDS
TAE-Puffer
40 mM Tris-HCl, 20 mM Essigsäure, 1 mM EDTA, pH 8
141
LB-Medium (Luria-Bertani-Medium nach Sambrook227)
Zur Herstellung des Mediums werden 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid
mit demineralisiertem Wasser auf 1 L aufgefüllt und unter Erwärmen gelöst. Zur Herstellung
von Kultivierungsplatten werden dem Medium 1.5 % (w/v) Agar zugefügt. Das Medium wird
unmittelbar nach dem Ansetzen 20 Minuten bei 121 °C autoklaviert. Zur Selektion auf
ampicillinresistente Stämme wurde Ampicillin (100 mg × L-1) steril zugegeben. Zur Selektion
auf β-Galactosidase-Aktivität werden 0.03 % (w/v) 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) und 330 µ M IPTG zugesetzt.
Minimalmedium (nach Tanaka228)
Lösung A: Eine 340 mM NaH2PO4, 660 mM K2HPO4 und 200 mM (NH4)2SO4 Lösung in
demineralisiertem Wasser. Diese wird bei 121 °C für 20 Minuten autoklaviert.
Lösung B: Eine 30 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 0.1 mM ZnCl2, 0.1 mM FeSO4 und 1 mM HCl
Lösung in Wasser.
Für 100 mL Minimalmedium werden 1 mL Lösung B und 87 mL H2Odem. für 20 Minuten bei
121 °C autoklaviert und mit 10 mL Lösung A, 1 mL Thiaminlösung (10 mg × mL-1) und
1 mL Glucoselösung (20 % w/v) steril versetzt. Zur Herstellung von Kultivierungsplatten
werden dem Medium 1.5 % (w/v) Agar zugefügt.
Weitere Bestandteile wie Aminosäuren oder Antibiotika können ebenfalls als Lösungen steril
zugesetzt werden. Die Menge des zu Lösung B zugesetzten Wassers wird in diesem Fall um
das Volumen dieser Lösungen verringert.
Lösungen zur Erzeugung kompetenter Zellen (nach Hanahan229)
RF1-Lösung: Eine 100 mM RbCl, 100 mM MnCl2, 30 mM KOAc, 10 mM CaCl2 und 15 %
(v/v) Glycerin enthaltende wässrige Lösung, welche mit 200 mM Essigsäure auf einen pHWert von 5.8 eingestellt wird. Die Lösung wird sterilfiltriert und bei 4 °C gelagert.
142
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
RF2-Lösung: Eine 10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2 und 15 % (v/v) Glycerin
enthaltende wässrige Lösung. Mit 100 mM NaOH wird ein pH-Wert von 6.8 eingestellt. Die
Lösung wird sterilfiltriert und bei 4 °C gelagert.
5.1.2
Klonierungsarbeiten
pF112
Der das Gen aroL tragende DNA-Abschnitt wird mit HindIII aus dem Plasmid pF81
geschnitten und aufgereinigt. Das erhaltene Fragment aroL* wird in die singuläre HindIIISchnittstelle des Plasmides pF109 kloniert. Hierzu wird pF109 mit HindIII linearisiert, mit
SAP dephosphoryliert und mit T4 DNA-Ligase mit aroL* ligiert. Kompetente DH5α-Zellen
werden mit dem Ligationsprodukt transformiert und auf Ampicillin-haltigem Medium auf
plasmidtragende Stämme selektiert. Die korrekte Ligation und Transformation werden durch
Restriktionskontrolle (NruI, AvaI) bestätigt.
pUCBM20-entC-entB
Via PCR-Reaktion mit Pwo DNA-Polymerase wird der Genabschnitt des mit AvaI linearisierten Plasmids pDF3, welcher die Gene entC und entB trägt, unter Einfügen endständiger
BglII-Schnittstellen amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit T4 Polynucleotid-Kinase (T4
PNK) am 5´-Ende phosphoryliert. Der Vektor pUCMB20 wird mit EcoRV linearisiert, die 5´Enden mit SAP dephosphoryliert und mit T4 DNA-Ligase mit dem PCR-Produkt ligiert.
Kompetente DH5α-Zellen werden mit dem Ligationsprodukt transformiert und auf Ampicillin-, X-Gal und IPTG-haltigem Medium selektiert. Die korrekte Ligation und Transformation werden durch Restriktionskontrolle (PvuI, HindIII) bestätigt.
entC-entB*, entB*
Das Plasmid pUCBM20-entC-entB wird präparativ mit BglII geschnitten. Das dabei
entstandene 2.1 kbps große DNA-Fragment entC-entB* wird per Gelelektrophorese und
Gelextraktion aufgereinigt. Das 901 bps große Fragment entB* wird analog durch präparative
Restriktion von pUCBM20-entC-entB mit BglII und BamHI erhalten.
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
143
Klonierung von pC19, pC20, pC21 und pC22
Die Plasmide pF109 und pF112 werden jeweils mit BamHI linearisiert und mit SAP
dephosphoryliert. Beide DNA-Stränge werden mit T4-DNA-Ligase je mit entC-entB* und
entB* kombiniert. Kompetente DH5α-Zellen werden mit dem Ligationsprodukt transformiert
und auf Ampicillin-haltigem Medium selektiert. Die korrekte Ligation und Transformation
werden durch Restriktionskontrolle (BssII, SspI) bestätigt.
5.1.3
Allgemeine mikrobiologische Arbeitstechniken
Standardtechniken für das Arbeiten mit Nukleinsäuren
Alle Arbeiten werden in sterilen Gefäßen durchgeführt. Die Auftrennung, Größen- und
Konzentrationsabschätzung von linearen DNA-Fragmenten erfolgt per elektrophoretischer
Auftrennung nach Sambrook.227 Für analytische Ansätze wird hierbei in 0.8 % (w/v)
Agarosegel in TAE-Puffer bei einer Spannung von U = 100 – 120 V gearbeitet. Präparative
Ansätze werden in 1 % (w/v) Agarosegel unter ansonsten identischen Bedingungen gereinigt.
Die Detektion der DNA erfolgt nach Interkalieren mit Ethidiumbromid unter UV-Licht. Zur
Größen- und Konzentrationsabschätzung wird eine 1 Kbp DNA Ladder der Fa. BIOMOL
GMBH (Hamburg) mit aufgetragen.
Aufreinigung von Plasmiden und DNA
Zu analytischen Zwecken wird Plasmid-DNA mit dem "QIAprep Spin Miniprep Kit" der Fa.
QIAGEN (Hilden) nach Vorgabe des Herstellers aus 1.5 mL einer über Nacht bei 37 °C in mit
Ampicillin versetztem LB-Medium gewachsenen Kultur isoliert. Zu präparativen Zwecken
wird Plasmid-DNA mit dem "QIAGEN Plasmid Midi Kit" desselben Herstellers nach
Vorgaben des Herstellers aus 50 mL einer über Nacht in mit Ampicillin versetztem LBMedium angewachsenen Kultur isoliert.
Lineare DNA-Fragmente aus PCR-Reaktionen und aus präparativen Restriktionen werden mit
dem "QIAquick Gel Extraction Kit" desselben Herstellers nach Herstellerangaben aus
Agarosegelen isoliert. Nach enzymatischen Modifikationen werden Enzyme mittels
"QIAquick PCR Purification Kit" desselben Herstellers abgetrennt.
144
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
Restriktionsanalyse
Zur analytischen Restriktion werden Enzyme der Firmen ROCHE CORPORATE (Basel,
Schweiz), PROMEGA (Mannheim) und NEW ENGLAND BIOLABS (Schwalmbach) nach Vorgabe
des Herstellers eingesetzt. Analytische Restriktionen werden im Maßstab von 10 µL durchgeführt. Dabei werden etwa 1 µg DNA mit 2-5 U × µg-1 Enzym im vom Hersteller empfohlenen Puffer bei 37 °C für zwei Stunden inkubiert. Eine Kontrolle der Größe der erhaltenen
DNA-Fragmente erfolgt per Gelelektrophorese.
Präparative Restriktionsansätze werden typischerweise mit etwa 10 – 15 µg DNA durchgeführt. Die Restriktionsenzyme werden nach der Reaktion thermisch nach Herstellerangabe
deaktiviert. Eine Isolierung von DNA-Fragmenten erfolgt durch Gelelektrophorese, Ausschneiden und Extraktion aus dem Gelanteil, der DNA der erwarteten Größe enthält.
Dephosphorylieren des 5´-Endes von DNA
Die Dephosphorylierung des 5´-Endes wird mit Shrimp alkalischer Phosphatase (SAP) der Fa.
BOEHRINGER MANNHEIM (Mannheim) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Typischerweise werden 10 – 15 µg DNA in Puffer aufgenommen und mit 8 U des Enzyms 45 Minuten
bei 37 °C behandelt. Eine Deaktivierung des Enzyms erfolgt durch Erhitzen auf 65 °C für 15
Minuten.
Phosphorylieren des 5´-Endes von DNA
100 µL einer 20 pM DNA und 20 pM ATP Pufferlösung werden bei 0 °C mit 10 U T4 Polynucleotid-Kinase (T4 PNK) der Fa. BOEHRINGER MANNHEIM (Mannheim) nach Angabe des
Herstellers versetzt, eine Stunde bei 37 °C inkubiert, danach auf 0 °C abgekühlt und aufgereinigt.
Ligationsansätze
DNA-Ligation wird mit dem "rapid ligation kit" der Fa. ROCHE DIAGNOSTICS (Mannheim)
nach Herstellerangaben durchgeführt. Hierbei werden Vektor (typische Konzentrationen 6 –
13 ng × µL-1) und Insert (typische Konzentration 25 – 80 ng × µL-1) in einem Massenverhältnis von 1 : 5 bis 1 : 12 in einem Puffer für 16 Stunden bei 16 °C inkubiert. Bei geringeren
DNA-Konzentrationen wird die Reaktionstemperatur auf 4 °C reduziert. Das Reaktionsprodukt wird unmittelbar nach der Reaktion ohne weitere Aufreinigung in kompetente Zellen
transformiert.
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
145
PCR-Reaktion mit Pwo DNA Polymerase
Die in der PCR-Reaktion eingesetzten Primer werden von der Fa. MGW-BIOTECH AG
(Ebersberg) synthetisiert und ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Die Amplifikation der
DNA wird mit einem "Pwo DNA Polymerase Kit" der Fa. ROCHE DIAGNOSTICS (Mannheim)
in einem Thermocycler "Peltier Thermal Cycler PTC 200" der Fa. MJ RESEARCH (Waltham,
USA) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Das Synthesevolumen beträgt 25 µL. Die
eingesetzte Konzentration an Templat-DNA (mit AvaI linearisierter Vektor pDF3) beträgt
8 ng × µL-1. Es werden 0.6 pmol × µL-1 der verwendeten Primer eingesetzt.
Nach einem Denaturierungsschritt von 2 Minuten bei 94 °C werden nacheinander die Primer
an das Templat für eine Minute bei 60 °C angelagert, dann 90 Sekunden bei 72 °C prolongiert
und 15 Sekunden bei 94 °C denaturiert. Dieser Zyklus wird zehn mal durchlaufen. Hieran
schließen sich weitere 15 Zyklen an, bei denen die Prolongationszeit mit 120 Sekunden
beginnt und mit jedem Zyklus um 20 Sekunden verlängert wird. Abschließend wird für 7 Minuten auf 72 °C gehalten, um eine vollständige Prolongation zu gewährleisten, bevor auf 4 °C
gekühlt wird.
Transformation von E. coli
Kompetente Zellen über die Rubidiumchlorid-Methode nach Hanahan229 werden erhalten,
indem eine Zellkultur in 50 mL LB-Medium bei einer OD600 von 0.5 fünfzehn Minuten auf
Eis gekühlt und zentrifugiert (2300 G, 4 °C, 15 Minuten) wird. Der Überstand wird verworfen, die Zellen werden in 16 mL RF1-Lösung resuspendiert und eine Stunde bei 0 °C
inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation (2300 G, 4 °C, 15 Minuten) wird der Überstand
verworfen, und die Zellen werden in 4 mL RF2-Lösung resuspendiert und 15 Minuten auf Eis
inkubiert. Die Suspension kompetenter Zellen wird in 200 µL aliquotiert und sofort transformiert oder bis zu 6 Monate bei – 80 °C gelagert.
Zur Transformation werden 200 µL kompetente Zellen auf Eis aufgetaut und mit etwa 500 ng
Plasmid-DNA oder 10 µL Ligationslösung versetzt. Nach vorsichtigem Mischen wird das
Plasmid eine Stunde bei 0 °C angelagert, bevor die Suspension für 90 Sekunden auf 42 °C
erwärmt wird. Hiernach werden 600 µL steriles LB-Medium zugesetzt und für eine Stunde
bei 37 °C inkubiert. Die Zellen werden geerntet und in 200 µL sterilem LB-Medium resuspendiert. 180 µL und 20 µL der Suspension werden auf mit Ampicillin versetzten LB-Platten
ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
146
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
Sequenzierung
Das in den Vektor pUCBM20 insertierte PCR-Produkt entC-entB* wurde von der Fa. AGOWA
(Berlin) mit zum Plasmid pUCBM20 kompatiblen Standardprimern in einer Doppelstrangsequenzierung sequenziert. Hierbei wurde folgende Sequenz ermittelt:
1
51
101
151
201
251
301
351
401
451
501
551
601
651
701
751
801
851
901
951
1001
1051
1101
1151
1201
1251
1301
1351
1401
1451
1501
1551
1601
1651
1701
1751
1801
1851
1901
1951
2001
2051
2101
2151
ATCCACGCGT
TCTGCAGGCA
GATACGTCAC
CAATCGCTTT
GTTTCGCCCG
CCCTTCCAGC
CATCAAAAAT
CTTCGTCGCT
AAACAAGCTT
GGAACGCCAG
GCGCCGCCGC
CGGTTGATTG
GGAACGGTTG
TGGCTGATGG
AAAGACGGCG
TCAGCCGGAT
CAGAAAAAGA
GTACTGCGCG
GATCACCACG
CGAATTCGCA
CCCGCGCTGA
ACTGGAACCG
ACAGCGAAGG
CGGGAAAATC
GTCACCGTTG
TGAACGTTTT
GAAGGAGAGA
GGAGTCTCAC
AACGTGCCGC
TGGGGCGAGA
GCTGCGCGAC
AGCCGAAAGA
GGGCCGGGCC
GACGCCAGAT
TTCATCGTTC
CTGATTATTA
CGACGCATTT
CCGATTTCAG
CGTTCTGGCC
CGCCAGCAAA
CCGATGAACC
GTGCGCATGA
CGACTTTGTC
TACTCTCCCG
CTTAAGGCGG
TGCGATCCCA
TGGCTGAGGA
TTCTTTATGT
CTTCGATGAA
AAAAACTCGC
CCGGTGATGG
GTATATTCCT
CCGCACGCCG
GCAATTCCGG
ACTTACCGCC
ATATCACCAC
ATTGCGCAAA
TGGCGTCCTG
AGCGTTTTAG
GAAGTGCTCG
TCGCCATGAA
AACGCAGTAG
CCGACGCTGT
AGAAAACGCA
GCGGTTTCCC
TTCGACCGCG
TAACGGCGAA
AGGTGCGTCT
GGTGAGTGGC
TGGATTGCAT
ACACGATGGC
GATATTCCGC
GTTGTTAATC
ACTGCCCGAT
TACTGCAAAC
GCAGAGCGAT
TGACCCGCTC
GCCGACGACA
TCCGCTGGAG
CCGGGGTATA
ATGCGCGATA
CCGTGACGAG
GGGTGGTGAT
GCGGCGCTGC
GTTCGATGAC
TGGCGCTGGC
ATGCTGGCGA
CGAGGTGAAA
CCGCGGTACC
GATCTTTATC
AGTACAGCAG
CGCCGTACCG
CCGGCTGTGA
CGCGCTGTTT
TCGGGGCGAT
GAATCCTGGC
TTTCACCCGC
AGCAAACCAC
ACGCCGCAGG
TGACGCCGCC
ACCCGGTTAG
CTGGGGACCA
CTCCATTCCG
ATCGCGAAGC
CATGAACTGG
TGAGTTACAC
GGCATCTCGC
CTGACTCTGG
GCATCAGGCC
AACTGTTTGG
TGGGTGGTGA
GTTTGCCGGA
GCGAAACAGG
TAAGGAGCGA
TATTCCAAAA
AGAATAAAGT
CATGATATGC
GATGGAGCAG
AGCACAATAT
GAAGATCGGG
GCCGGAACAG
CGGTGCTGGT
CAAATGCTGA
TGCCCACATT
TTAAACCGTT
CATTTGATGT
GACTGAAGAA
GTGAGGTGAT
GACAACCTGA
GGCGCGCTGG
AAAACCCGAC
TAATGGATTT
GGGCCCGTCG
ATTTTGTGGA
ACCATGGCAA
CAGTTTTACG
ACGGGGATTC
GCCGATGCCA
TCCCTTCGAT
AGTCGTTCTC
AGCCAGTCGC
GTTTGAACAG
TCGACAAAGT
ATTGATAGTG
TTACAACTTC
GCCCGGAACT
TTAGCCGGTT
AGGTAATCGT
TGACTCAGGC
GTTCCTTCTT
AACTCCCTTT
CCTGTCTGCT
GCGACCCAGG
CGGCATTGTG
CCATCCGCTG
GCGGGGATTG
CGTCAAACTT
GGATCCACGC
TTACAGGCTT
TGACTGGGCC
AGGACTATTT
GTGATCGCGA
CCCGGTTTAT
CGCTGTTGAA
CAAAAGGTGG
GAAGTGGCGC
AAGAGAGTGG
GGCTGTATGA
TATGGTGGCG
CGCTGAAATA
TTACTGCCAG
CCTGCCGTTG
TCGACTACGG
CGCAAAGTGC
CATCGACGCC
CAGATCTGGG
ACTCTAGAGC
GGATGATATG
CACTTGCGCC
ACGTCAGGAT
GCCCGACAGT
AAGCGCAGGG
CCACGTCAGC
CCGTCAGGAA
TGAATGTGGT
ATGGTTGCCC
GGTGTTGTCA
GCGTATTGCT
CATGTTCCGC
GCTGCTACGT
CCGCGCGTCG
CTGCTGGCGT
GATGAAAGAG
CTCCACAGCT
GAAGGTAAAG
GCATCCGACC
TTATTGCTGA
GGTTGGTGTG
CGCGAAGCTG
TGCCTGCGTC
TCTACCATGT
GCATCAGCCT
ACGCACTGCC
TTTGAACCGC
TGTCAGCTTC
ATATTGCTGC
TACACCGCCC
TGATATGTGG
TGGATCGCCT
TACAGCGCGT
ACGTAACCAG
CCACCGCAAC
GATGCGCTGG
TGTGGCCGGA
CACCTATCCC
CTGGACGAGT
TCTGGATTCG
ATGGTGATAT
TGGTGGAAGC
ATCCCATG
Grau hervorgehoben sind die für die Enzyme EntCA194 → T (Basenpaare 98 bis 1273) und EntB
(Basenpaare 1316 bis 2173) codierenden Bereiche. Die Startcodons sind fett und kursiv
hervorgehoben, Stoppcodons wurden fett und unterstrichen herausgestellt. Die Sequenz
weicht in Position 677 von der erwarteten Sequenz ab. Statt Guanin wurde Adenin gefunden
und bestätigt, womit das hervorgehobene Codon für Threonin statt Alanin codiert.
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
147
Die sich daraus ergebenden Aminosäuresequenzen für EntCA194 → T mit der hervorgehobenen
Aminosäure Threonin 194 und EntB lauten:
EntCA194 → T:
1
41
81
121
161
201
241
281
321
361
MDTSLAEEVQ
EPAVNGDSPD
DPRQPSSLYI
QAIPEQTTFE
AIDSGVLLER
RKDGERFSSI
EHELVTQAMK
FEGKANSQEN
PFDRELFGGI
GAGIVPASSP
QTMATLAPNR
SPFQQKLAAL
PESWQSFSRQ
QMVARAAALT
LIAQNPVSYN
PLAGSARRQP
EVLRERSSEL
ALTLACLLHP
VGWCDSEGNG
LGEWRETGVK
FFFMSPYRSF
FADAKAQGIK
EKQASARRFT
ATPQVDKVVL
FHVPLADGGV
DEVLDREAGN
HVPSSPQLIT
TPALSGFPHQ
EWVVTIRCAK
LSTMLNVFGL
TTSGCFARFD
NPVMVGAIPF
RSQSLNVVER
SRLIDITTDA
LLGTSPELLL
RLLASEKDRH
TPTLWHLATP
AATQVIAELE
LRENQVRLFA
H
1
41
81
121
161
201
241
281
MAIPKLQAYA
YFVSFWGENC
KEQSDEDRAL
LVKWRYSAFH
ATDAFMRDIK
VMTEELLPAP
YGLDSVRMMA
SREVK
LPESHDIPQN
PMMEQVIANI
LNDMWGPGLT
RSPLEQMLKE
PFMVADALAD
IPASKAALRE
LAARWRKVHG
KVDWAFEPQR
AALRDYCKQH
RSPEQQKVVD
SGRNQLIITG
FSRDEHLMSL
VILPLLDESD
DIDFVMLAKN
AALLIHDMQD
NIPVYYTAQP
RLTPDADDTV
VYAHIGCMTT
KYVAGRSGRV
EPFDDDNLID
PTIDAWWKLL
EntB:
148
5.1.4
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
Untersuchungen zur Proteinexpression
Herstellung einer zellfreien Proteinlösung
Je zwei Kulturen der Stämme DH5α/pC19, DH5α/pC20, DH5α/pC21 und DH5α/pC22
werden in je 50 mL LB-Medium mit 100 mg × L-1 Ampicillin bei 37 °C über 280 Minuten bis
zu einer OD600 von 0.5 bis 0.7 angezogen. Je eine Kultur jedes Stammes wird mit 100 nM
IPTG suplementiert. Bei einer OD600 von 2.2 bis 3.3 werden die Zellen nach 8 Stunden
zentrifugiert (5000 G, 4 °C, 20 Minuten), in 0.7 % (w/v) NaCl-Lösung resuspendiert und
mittels Ultraschall unter Eiskühlung aufgeschlossen. Hiefür wird ein "Sonifier 250" der Fa.
BRANSON (Danbury, USA) bei 20 % Arbeitszyklus und Beschallungsstufe 2 in acht Zyklen
von 30 Sekunden Beschallung und 30 Sekunden Pause genutzt. Der proteinhaltige Überstand
wird durch Zentrifugation (19000 G, 4 °C, 20 Minuten) von den Zellfragmenten getrennt und
bei 4 °C für 24 Stunden gelagert.
Ermittlung des Gesamtproteingehaltes
Der Gesamtproteingehalt wird nach Bradford230 bei λ = 595 nm ermittelt. Eine Kalibrierung
erfolgte mit Bovin Serum Albumin-Standardlösungen (25 – 100 µg × L-1).
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page)
Zur Größentrennung von Proteinen wird die Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach
Lämmli231 angewandt. Dazu werden 10 µL Proteinlösung mit einer Gesamtproteinkonzentration von 2 g × L-1 mit 10 µL SDS-Probenpuffer versetzt. Die Proben werden für 5 Minuten
bei 98 °C denaturiert und auf ein 4 %iges Polyacrylamid-Sammelgel aufgetragen, welches auf
ein 10 %iges Trenngel gegossen ist. Die elektrophoretische Trennung erfolgt in einer
„Protean Mini Cell“ der Firma BIORAD (Hercules, USA) bei einer Spannung von 200 V. Als
Größenstandard wird der "Low-Range-Marker" (14.4 – 97.4 kDa) der Fa. BOEHRINGER
MANNHEIM (Mannheim) eingesetzt. Das Gel wird gemäß Herstellerangaben mit "Coomassie
Brilliantblau R-250" der Fa. SERVA ELECTROPHORESIS GMBH (Heidelberg) gefärbt,
getrocknet und fotografiert.
Experimenteller Teil – Mikrobiologische Arbeiten
149
Untersuchung der Enzymfunktion der Enzyme AroB und AroL
Die durch Transformation erhaltenen Stämme F5/pC19, F5/pC20, F5/pC21, F5/pC22,
F12/pC20 und F12/pC22 werden auf Minimalmedium, welches mit 0.2 % Glucose,
0.1 mg × mL-1 Ampicillin, je 0.04 % Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin, je 0.01 % paraAminobenzoesäure und para-Hydroxybenzoesäure komplementiert ist, und auf Minimalmedium, welches 0.2 % Glucose, 0.1 mg × mL-1 Ampicillin und 0.1 mM IPTG enthält, ausgestrichen. In allen Fällen wird auf Vollmedium und mit IPTG versetztem Minimalmedium ein
Wachstum von Kolonien beobachtet.
5.1.5
Untersuchung zur Metabolitproduktion im Schüttelkolben
Die Stämme F68/pC20 und F68/pC22 werden in je zwei Schüttelkolben in mit 0.2 % (w/v)
Glucose, 100 mg × L-1 Ampicillin, je 10 mg × L-1 Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan und
10 mg × L-1 Thiamin suplementiertem Minimalmedium bei 37 °C angezogen. Nach sechs
Stunden wird bei einer OD600 von 0.75 (F68/pC20) und 1.25 (F68/pC22) je eine Kultur jedes
Stammes mit 0.1 mM IPTG induziert. Nach 12 Stunden werden 0.2 % (w/v) Glucose nachdosiert. Nach einer Wachstums- und Proteinbildungszeit von 16 Stunden werden die Zellen
bei 30 °C bei einer OD600 von 3.2 (F68/pC20) und 2.8 (F68/C22) geerntet, mit aminosäurefreiem Minimalmedium gewaschen und zur Produktion in je 50 mL aminosäurefreiem Minimalmedium mit 100 mg × L-1 Ampicillin und 1 % (w/v) Glucose resuspendiert. Nach einer
Produktionsphase von 22 Stunden bei 37 °C, in deren Verlauf nach 6 Stunden 1 % Glucose
(w/v) nachdosiert wird, verbleibt ein Restglucosegehalt von etwa 0.5 % (w/v). Die Zellen
werden abgetrennt, und die zellfreien Überstände der Stämme mit und ohne Induktion per
HPLC untersucht und verglichen. Die Produktion unterschiedlicher Metaboliten mit und ohne
Induktion ist deutlich zu erkennen. Hierin werden im Falle des Stammes F68/pC20 mit
Induktion 2,3-trans-CHD in einer Konzentration von etwa 1.6 g × L-1 und im Falle des
Stammes F68/pC22 mit Induktion 3,4-trans-CHD in einer Konzentration von etwa 0.5 g × L-1
nachgewiesen. Die hierbei verwandte HPLC-Methode ist im chemischen experimentellen Teil
beschrieben.
150
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
5.2 Chemische Arbeiten
5.2.1
Verwendete Geräte und Chemikalien
NMR-Spektren
wurden mit den Spektrometern "Bruker AMX 300" der Fa. BRUKER
(Rheinstetten) (1H: 300 MHz, 13C: 75.5 MHz), "Varian Unity 300" der
Fa. VARIAN (Palo Alto, USA) (1H: 300 MHz,
13
C: 75.5 MHz) sowie
"Bruker DRX 400" der Fa. BRUKER (Rheinstetten) (1H: 400 MHz, 13C:
100.7 MHz) aufgenommen. Angegeben werden die chemischen Verschiebungen δ in ppm, Kopplungskonstanten in Hz sowie Multiplizitäten: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett), qui (Quintett), sep (Septett), m (Multiplett). Fallen Kopplungen zu scheinbar
höheren Multipliztäten zusammen, wird die beobachtete Multiplizität in
Anführungszeichen angegeben.
Als Lösungsmittel wurden Chloroform-d1 (CDCl3; 1H ≡ 7.27 ppm, 13C
≡ 77.23 ppm), Methanol-d4 (MeOH-d4;
1
H ≡ 4.87 ppm,
13
C ≡
1
49.2 ppm) und Deuteriumoxid (D2O; H ≡ 4.81 ppm) verwendet. Zu
quantitativen Messungen wird 4 mM 3-(Trimethylsilyl)-propionsäure2,2,3,3-d4 Natriumsalz (TSP) als interner Standard in D2O zugesetzt.
GC/MS-Analysen
wurden mit dem "HP 6890 Series GC-System" sowie dem "HP 5973
Mass Selective Detector" der Fa. AGILENT (HP) (Palo Alto, USA)
durchgeführt. Es wurde die Säule HP-5MS (5 % Phenyl Methyl Siloxan / Kapillare 30.0 m × 250 µm) der Fa. AGILENT (HP) verwendet.
Das Injektionsvolumen betrug 1 µL. Weitere Parameter der angewandten Methode waren V& = 1 mL × min-1 (konstant), Helium als Trägergas,
TGC (Injektor) = 250 °C, TMS (Ionenquelle) = 200 °C, Ionisationsenergie 70 eV, Zeitprogramm (Ofen): T0min = 60 °C, T3min = 60 °C,
T14min = 280 °C (Aufheizrate: 20 °C × min-1), T19min = 280 °C.
HPLC-Analysen
erfolgten auf einem "HP-Serie 1100 System" der Fa. AGILENT (HP)
(Palo Alto, USA) mit einem Photodiodenarraydetektor (DAD) anhand
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
151
der UV-Absorption bei λ = 275 nm. Die Trennung erfolgte über eine
LiChrospher® 100 RP 8 EC 5µ
Chromatographiesäule (250
mm × 3 mm, 5 µm Partikelgröße) der Fa. CS CHROMATOGRAPHIE
SERVICE bei einer Säulentemperatur von 23 °C. Als Vorsäule wurde
eine LiChro-spher® 100 RP 8 EC 5µ Chromatographiesäule (20 mm × 3
mm, 5 µm Partikelgröße) der Fa. CS CHROMATOGRAPHIE SERVICE
verwandt. Das Injektionsvolumen betrug 5 µL. Weitere Parameter der
angewandten Messmethode waren der Fluss der mobilen Phase
V& = 0.45 mL × min-1
(konstant),
wobei
die
mobile
Phase
aus
Mischungen (v/v) der Lösungen A: Reinstwasser mit 0.1 %
Trifluoressigsäure
Abhängigkeit
von
(v/v)
der
und
B:
Messzeit
Methanol
bestand:
(HPLC-Grade)
in
(vA/vB)0min = 100:0,
(vA/vB)5min = 100:0 → (vA/vB)30 min = 36:64, (vA/vB)35min = 36:64 →
(vA/v B)36min = 100:0, (vA/vB)37min = 100:0. Zwischen zwei Messungen
wurde 10 Minuten mit Lösung A gespült.
chirale HPLC
Die Messungen erfolgten auf einem "HP-Serie 1100 System" der Fa.
AGILENT (HP) (Palo Alto, USA) mit einem Photodiodenarraydetektor
(DAD) anhand der UV-Absorption bei λ = 280 nm. Die Trennung
erfolgte über eine Chiracel OD-H Chromatographiesäule (250
mm × 4.6 mm) der Fa. DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES LTD. EUROPE
(Illkirch-Cedex, Frankreich) bei einer Säulentemperatur von 40 °C. Als
Vorsäule wurde eine Chiracel OD-H Chromatographiesäule (20
mm × 4.6
mm)
des
gleichen
Anbieters
verwandt.
Das
Injektionsvolumen betrug 5 µL. Als mobile Phase wurde eine Mischung
von n-Hexan und 2-Propanol (95:1 v/v) bei einem konstanten Fluss von
0.5 mL × min-1 eingesetzt. Zwischen zwei Messungen wurde 10
Minuten mit dem Laufmittel equillibriert.
MS-Spektren
wurden in der Analytikabteilung des Kekulé-Instituts für Organische
Chemie und Biochemie der Universität Bonn mit einem AEI MS-50 der
Firma Kratos (Manchester, Großbritannien) und einem MAT95XL der
Firma THERMO-FINNIGAN (Bremen) sowie in der Analytikabteilung des
Instituts für Organische Chemie und Biochemie der Universität
152
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
Freiburg an einem TSQ700 der Firma THERMO-FINNIGAN (Waltham,
USA) aufgenommen. Die Ionisation erfolgte jeweils mittels Elektronenstoß-Ionisation (EI) mit 70 eV.
HRMS-Messungen
wurden in der Analytikabteilung des Kekulé-Instituts für Organische
Chemie und Biochemie der Universität Bonn mit einem AEI MS-50 der
Firma Kratos (Manchester, Großbritannien) und einem MAT95XL der
Firma THERMO-FINNIGAN (Bremen) sowie in der Analytikabteilung des
Instituts für Organische Chemie und Biochemie der Universität Freiburg mit einem MAT95XL der Firma THERMO-FINNIGAN (Bremen)
durchgeführt.
IR-Spektren
wurden mit den Infrarot-Spektrometern "Avatar 360 FT-IR" (A360) der
Fa. NICOLET (THERMO) von KBr-Presslingen der Substanz und "PerkinElmer 1605 FT" (P1065) der Fa. PERKIN-ELMER (Wellesley, USA) von
einem Film der Reinsubstanz aufgenommen. Angegeben werden die
Wellenzahl in cm-1 sowie die Intensitäten als ss (sehr stark), s (stark), m
(mittel), w (schwach), gegebenenfalls mit dem Präfix b für verbreiterte
Banden.
Optische Drehwerte wurden mit dem Polarimeter "P-1020" der Firma JASCO INTERNATIONAL
CO. LTD. (Tokyo, Japan) bestimmt. Alle Werte wurden mit der D-
Linie einer Na-Lampe bei einer Schichtdicke von 1 dm oder 0.5 dm
gemessen. Angegeben sind die spezifische Drehung [α] in der Einheit
[Grad × mL × dm-1 × g-1], die Temperatur, die Konzentration in
g × 100 mL-1 und das verwandte Lösungsmittel.
CD-Spektren
wurden mit einem Spektralpolarimeter "J-810" der Firma JASCO
INTERNATIONAL CO. LTD. (Tokyo, Japan), mit folgenden Parametern
gemessen: Länge der Zelle = 1.0 cm, Empfindlichkeit = Standard,
Messgeschwindigkeit = 100 nm × min-1, Data Pitch = 1 nm, Bandbreite
1 nm, Response = 2 s, je nach Intensität der Peaks zwischen 3 und 10
Akkumulationen. Jeweils angegeben sind das verwendete Lösungsmittel (HPLC-Grade), die Konzentration der Lösung sowie die
Messtemperatur.
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
Schmelzpunkte
153
wurden mit den Schmelzpunktapparaturen "B-540" der Fa. BÜCHI
(Flawil, Schweiz) oder "Melting Point Apparatus SMP 2" der Fa.
STUART SCIENTIFIC (Watford Herts, UK) gemessen.
Analytische
Dünnschichtchromatographie
erfolgte auf DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 der Fa. MERCK
(Darmstadt). Eine Detektion erfolgte wenn möglich durch Fluoreszenzlöschung (λ = 254 nm). Im Bedarfsfall wurde durch Eintauchen der
Folie in Kaliumpermanganatlösung (3 g KMnO4, 20 g K2CO3, 300 mL
Wasser), Anisaldehydlösung (1.5 mL Anisaldehyd, 3 mL H2SO4,
300 mL
Eisessig)
oder
Cer-Molybdat-Färbelösung
(0.8
g
Ce(SO4)2 × 4 H2O, 20 g (NH4)6Mo7O24 × 4 H2O, 20 g H2SO4, 400 mL
Wasser) und anschließendes Erhitzen mit einer Heißluftpistole
angefärbt.
Elementaranalysen
wurden mit einem Vario EL der Firma HERAEUS (Hanau) in der Zentralanalytik der Chemischen Institute der Universität Bonn aufgenommen.
Einkristall-Röntgenstrukturanalysen
wurden mit einem Vierkreisdiffraktometer KappaCCD der Firma
NONIUS (Delft, Niederlande) am Institut für Anorganische Chemie der
Universität Bonn oder an einem IPDS2 der Firma STOE & CIE
(Darmstadt) am Institut für Anorganische Chemische der Universität
Freiburg aufgenommen.
SäulenChromatographie
erfolgte wenn nicht anders angegeben an Kieselgel 60 der Fa. MERCK
(Darmstadt) mit einer Korngrösse des verwendeten Kieselgels von 40 –
60 µm.
Lösungsmittel
wurden von den Firmen ALDRICH (Seelze), FLUKA (Neu-Ulm), HOESCH
(Düren) und MERCK (Darmstadt) in analytischer Qualität bezogen und
bei Bedarf mit literaturüblichen Methoden getrocknet.
154
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
5.2.2
Synthese von racemischen 3,4-trans-CHD-Methylester (rac-170)
8-Brom-6-oxabicyclo[3.2.1]oct-2-en-7-on (rac-174)
Darstellung: Eine Lösung von 10.0 g (35.3 mmol) Dibromverbindung rac-
O
173 in 400 mL Wasser wird bei 0 °C heftig gerührt. Der pH-Wert wird durch
Br
O
Zudosieren von 0.5
M
NaOH-Lösung über 8 Stunden zwischen pH 5 und 9
gehalten, wobei die Temperatur der Lösung auf Raumtemperatur ansteigt.
rac-174
Sobald der pH-Wert von 6.5 unverändert bleibt, wird die Lösung dreimal mit
je 200 mL Et2O extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen werden über MgSO4
getrocknet. Nach Aufkonzentrieren unter vermindertem Druck werden 5.00 g (70 %) rac-174
als farbloser Wachs isoliert, der ohne weitere Aufreinigung eingesetzt wird.
DC
Rf = 0.45 (Cyclohexan / Ethylacetat 2:1 v/v)
mp
53.0 – 54.2 °C
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 2.61 (ddd, J = 19.2, 3.4,
1.5 Hz, 1H, CHH), 2.70 (ddd, J = 19.2, 5.2, 2.7 Hz, 1H, CHH), 3.29
(bd, J = 7.2 Hz, 1H, CH), 4.41 (s,1 H, CH), 4.89 ("sep", J = 1.3 Hz,
1H, CH), 5.81 (d"t"d, J = 9.2, 3.1, 1.4 Hz, 1H, CH) 5.95 (dd"t",
J = 9.2, 7.2, 1.9 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 33.3 (CH2), 47.8 (CH), 50.6
(CH), 81.9 (CH), 125.2 (CH), 127.3 (CH), 174.1 (CO).
GCMS
Rt = 9.31 min; m/z (%): 159 (0.5), 157 (0.5), 147 (1), 145 (1), 123
(0.5) [M–Br•]+, 95 (5) [M–Br•, CO]+, 79 (100) [M–Br•, CO2]+, 77
(50), 65 (8), 51 (7).
C7H7O2Br
[203.03]
4,8-Dibrom-6-oxabicyclo[3.2.1]oct-2-en-7-on (rac-175)
O
Br
O
Br
rac-175
Darstellung: 2.5 g (8.9 mmol) rac-174, 4.38 g (25 mmol) N-Bromsuccinimid
und 30 mg α,α´-Azobisisobutyronitril (AIBN) werden in 40 mL trockenem
CCl4 vorgelegt und für 18 Stunden bis zum Rückfluss erhitzt. Nach dem
Abkühlen wird ausgefallenes Succinimid abfiltriert und mit 10 mL CCl4
gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden mit NaCl-Lösung
gewaschen, über MgSO4 getrocknet und aufkonzentriert. Nach chromatographischer Reinigung (SiO2, Isohexan / Ethylacetat 8:1 v/v) werden 2.34 g (64 %) rac-175 als farbloser Wachs
erhalten.
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
155
DC
Rf = 0.40 (Isohexan / Ethylacetat 8:1 v/v)
mp
62.5 – 64.5 °C
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 3.23 (bd, J = 6.7 Hz, 1H, CH),
4.63 ("t", J = 3.1 Hz, 1H, CH), 4.72 (s, 1H, CH), 4.82 (d"t", J = 3.0,
1.4 Hz, 1H, CH), 5.85 (dm, J = 9.2 Hz, 1H, CH), 5.91 (dd, J = 9.2,
6.7 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 43.0 (CH), 46.4 (CH), 47.2
(CH), 83.2 (CH), 126.9 (CH), 128.5 (CH), 172.8 (CO).
GCMS
Rt = 10.27 min; m/z (%): 252 (1) [M–CO]•+, 227 (1), 225 (2), 223
(1), 203 (3) [M–Br•]+, 201 (3) [M–Br•]+, 175 (10) [M–CO, Br•]+,
173 (10) [M–CO, Br•]+, 159 (76) [M–CO2, Br•]+, 157 (100) [M–
CO2, Br•]+, 146 (4), 144 (4), 78 (92), 77 (97), 65 (17), 51 (19).
C7H6O2Br2
[281.93]
Essigsäure-(8-brom-7-oxo-6-oxabicyclo[3.2.1]oct-2-en-4-yl)ester (rac-176) und Essigsäure(8-brom-6-oxo-7-oxabicyclo[3.2.1]oct-2-en-4-yl)ester (rac-177)
O
Br
O AcO
Darstellung: 614 mg (2.2 mmol) rac-175 werden in 1 mL
O
Br
O
OAc
Hexamethylphosphorsäuretriamid (HMPT) gelöst und portionsweise mit 1.5 g (19 mmol) NH4OAc versetzt. Die gelbe Lösung
wird nach 2 Tagen mit 10 mL Wasser verdünnt und dreimal mit
rac-176
rac-177
je 15 mL Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden
unter vermindertem Druck von flüchtigen Bestandteilen befreit und chromatographisch
gereinigt (SiO2, Isohexan / Ethylacetat 3:1 → 1:1 v/v). Dabei werden 370 mg (65 %) rac-176
und Regioisomer rac-177 im Verhältnis von 2:3 als farbloses Öl erhalten.
Analytische Daten (rac-176):
DC
Rf = 0.38 (Isohexan / Ethylacetat 3:1 v/v)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 1.92 (s, 3H, CH3), 3.27 (bd,
J = 7.3 Hz, 1H, CH), 4.49 (s, 1H, CH), 4.68 ("qui", J = 1.5 Hz, 1H,
CH), 5.26 ("t", J = 3.3 Hz, 1H, CH), 5.78 (m, 1H, CH), 6.15 (dd,
J = 9.3, 7.3 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
GCMS
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 20.9 (CH3), 47.6 (CH), 52.9
(CH), 68.3 (CH), 81.6 (CH), 126.2 (CH), 129.9 (CH), 169.4 (CO),
172.9 (CO).
Rt = 10.69 min; m/z (%): 158 (17) [M–CO2, AcOH]•+, 156 (17) [M–
156
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
CO2, AcOH]•+,139 (37), 121 (54) [M–Br•, AcOH]+, 95 (100) [M–
Br•, CO, AcOH]+, 77 (39) [M–Br•, CO2, AcOH]+.
C9H9O4Br
[261.07]
Analytische Daten (rac-177):
DC
Rf = 0.38 (Isohexan / Ethylacetat 3:1 v/v)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 2.01 (s, 3H, CH3), 3.20 ("qui",
J = 1.5 Hz, 1H, CH), 4.76 (s, 1H, CH), 4.83 (bd, J = 5.7 Hz, 1H,
CH), 5.33 ("t", J = 3.2 Hz, 1H, CH), 5.81 (m, 1H, CH), 6.37 (dd, J =
9.3, 6.0 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 20.7 (CH3), 47.5 (CH), 52.9
(CH), 68.0 (CH), 78.2 (CH), 128.5 (CH), 132.8 (CH), 169.5 (CO),
172.7 (CO).
GCMS
Rt = 10.61 min; m/z (%): 262 (1) [M]•+, 260 (1) [M]•+, 234 (1) [MCO2]•+, 232 (1) [M–CO2]•+, 158 (17) [M–CO2, AcOH]•+, 156 (17)
[M–CO2, AcOH]•+, 139 (5), 111 (14), 95 (100) [M–Br•, CO,
AcOH]+, 77 (42) [M–Br•, CO2, AcOH]+.
C9H9O4Br
[261.07]
3,4-trans-Dihydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäure (rac-5) und 3,6-trans-Dihydroxycyclohexa-1,4-diencarbonsäure (rac-194)
CO2H
CO2H
HO
OH
OH
OH
rac-5
rac-194
Darstellung: 108 mg (0.4 mmol) rac-176 und rac-177
werden in 5 mL Wasser gelöst und mit 1 mL gesättigter
NH4Cl-Lösung versetzt. Unter heftigem Rühren wird die
Lösung mit 1 N KOH auf pH 12 gebracht. Nach 4 Stunden
wird die gelbe Lösung eingeengt und das erhaltene Produkt
chromatographisch gereinigt (SiO2, Ethylacetat / Methanol 4:1 v/v). Erhalten werden 23 mg
rac-5 und rac-194 im Verhältnis 1:1 (36 %).
Analytische Daten (rac-5):
DC
Rf = 0.35 (Ethylacetat / Methanol 4:1 v/v)
1
(300 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 4.25 (d"t", J = 12.1, 2.3 Hz,
1H, CH), 4.34 (dd, J = 12.1, 2.5 Hz, 1H, CH), 5.85 (dd, J = 10.0,
2.4 Hz, 1H, CH), 6.15 (d"t", J = 10.0, 2.0 Hz, 1H, CH), 6.69 (m, 1H,
CH).
H-NMR
C7H8O4
[156.14]
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
157
Analytische Daten (rac-194):
DC
Rf = 0.35 (Ethylacetat / Methanol 4:1 v/v)
1
(300 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 4.51 (m, 1H, CH), 4.70 (m,
1H, CH), 5.93 (m, 2H, 2 × CH), 6.48 (m, 1H, CH).
H-NMR
C7H8O4
[156.14]
3,4-trans-Dihydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäuremethylester (rac-170)
CO2Me
Darstellung: 20 mg rac-5 und rac-194 werden in 10 mL trockenem Methanol
gelöst und mit 3.5 mL methanolischem Chlorwasserstoff (~1.25
OH
OH
rac-170
Nach 2 Tagen bei Raumtemperatur wird mit 0.5
M
M)
versetzt.
NH3 neutralisiert, Methanol
unter vermindertem Druck entfernt und die wässrige Lösung zweimal mit je
5 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über
MgSO4 getrocknet und eingeengt. Erhalten werden 18 mg eines braunen Öls, welches nach
1
H-NMR rac-170 neben weiteren Verbindungen enthält. Eine Untersuchung per HPLC und
chiraler HPLC erfolgt ohne weitere Aufreinigung.
Analytische Daten (rac-170):
DC
Rf = 0.50 (Ethylacetat)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 3.72 (s, 3H, CH3), 4.44 (d"t",
J = 10.0, 2.5 Hz, 1H, CH), 4.55 (dd, J = 10.0, 3.2 Hz, 1H, CH), 5.94
(dd, J = 10.1, 3.1 Hz, 1H, CH), 6.34 (d"t", J = 10.1, 1.6 Hz, 1H,
CH), 6.86 (m, 1H, CH).
H-NMR
chirale HPLC
Rt = 33.6 min, 42.2 min; λ (rel Int.) [nm]: 205 (100), 278 (18).
C8H10O4
[170.16]
158
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
5.2.3
Mikrobiell produziertes 2,3-trans-CHD (4), 3,4-trans-CHD (5) und
Derivate dieser Verbindungen
(5S,6S)-5,6-Dihydroxycyclohexa-1,3-diencarbonsäure (4) und (3R,4R)-3,4-Dihydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäure (5)
CO2H
OH
OH
4
CO2H
Isolierung: Der biomassenfreie Fermentationsüberstand mit
einem Produktgehalt von etwa 35 g 4 oder 5 wird filtriert und
mit entionisiertem Wasser im Verhältnis 1:1 verdünnt. Diese
OH
OH
5
Lösung wird mit einem Fluss von 100 mL × min-1 über 2.4 L
sedimentiertes, regeneriertes und konditioniertes basisches
Anionentauscher-Harz DOWEX® 1×8 (Cl-) 100-200 mesh
geleitet. Nach dem Auftragen wird mit 60 L wässriger 50 mM – 100 mM Ameisensäurelösung
(pH ~ 2.3) bei einem Fluss von 100 mL × min-1 eluiert. Das Ionentauscherharz wird nach der
Aufreinigung über Nacht mit 5 L 2
M
NaCl-Lösung, die im Kreis über die Säule geführt
werden, regeneriert. Gelagert wird das Harz unter Wasser / Ethanol 1:1 v/v. Vor dem
neuerlichen Auftragen von Fermentationsüberstand wird mit 60 L einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 8.0) mit einem Fluss von 100 mL × min-1 konditioniert.
4: Aufgegeben werden 8 L mit einem Produkttiter von 4.6 g × L-1 4 (entspricht 36.8 g 4). Die
Produktfraktion von etwa 13 L wird bei einem pH-Wert von 2.8 bis 2.5 mit 50 mM wässriger
Ameisensäure eluiert und zeigt eine deutlich erhöhte UV-Absorption bei λ = 280 nm. Die
gesammelte Produktfraktion wird unter vermindertem Druck bei 40 °C auf 500 mL
aufkonzentriert, und das Konzentrat wird gefriergetrocknet. Erhalten werden 26.7 g eines
schaumigen, beigen Feststoffs, der laut
1
H-NMR-Analyse mit internem Standard (3-
(Trimethylsilyl)-propionsäure-2,2,3,3-d4 Natriumsalz, TSP) einen Produktgehalt von 82 %
ohne weitere NMR-aktive Verunreinigungen aufweist. Dies entspricht einer Ausbeute von
59 % bezogen auf das aufgetragene trans-CHD 4.
5: Aufgetragen werden 4.2 L mit einem Produkttiter von 7.8 g × L-1 5 (entspricht insgesamt
33 g 5). Die Produktfraktion von 10 L wird bei einem pH-Wert von 2.6 bis 2.3 mit 94 mM
wässriger Ameisensäure eluiert und weist eine deutlich erhöhte UV-Absorption bei
λ = 280 nm auf. Die gesammelte Produktfraktion wird unter vermindertem Druck bei 40 °C
auf etwa 300 mL aufkonzentriert, wobei 5 aus der Lösung auszukristallisieren beginnt. Bei
4 °C wird 5 aus der Mutterlauge auskristallisiert. Innerhalb von 48 Stunden kristallisiert das
Produkt in Form eines blassgelben Feststoffs. Durch Abfiltrieren des Produktes, wiederholtes
Aufkonzentrieren der Mutterlauge unter vermindertem Druck bei 40 °C und Kühlen auf 4 °C
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
159
werden nach Waschen des Rückstandes mit wenig kaltem Wasser insgesamt 19.7 g 5 (60 %
Ausbeute) in Form eines gelben, pulvrigen Feststoffs mit einer Reinheit von > 98 % nach 1HNMR-Analyse mit TSP als internem Standard gewonnen.
Analytische Daten (4):
DC
Rf = 0.17 (Ethylacetat / Methanol 8:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = + 724.6 (c = 0.9 in Wasser)h
mp
79.0 – 81.1 °C
1
(400 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 4.28 (dd, J = 4.2, 2.8 Hz,
1H, CH), 4.60 (d, J = 2.8 Hz, 1H, CH), 6.29 (m, 2H, CH), 7.16 (m,
1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
HPLC
IR (KBr)
(100 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 68.8 (CH), 70.3 (CH), 124.9
(CH), 130.7 (Cq), 134.1 (CH), 134.3 (CH), 170.1 (CO).
Rt = 4.5 min, λ (rel Int.) [nm]: 200 (30), 282 (100).
ν~ (cm-1): 3288.5 (bm), 1685.3 (s), 1643.3 (m), 1583.8 (m), 1411.0
(bm), 1234.9 (bs), 1001.6 (s).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 276 (+ 19.0), 218 (– 5.8), 210 (– 5.4); (c = 8.5 × 10-5 M,
CH3CN, 23 °C).h
C7H8O4
[156.13]
Analytische Daten (5):
DC
Rf = 0.33 (Ethylacetat / Methanol 8:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = + 164.8 (c = 1.2 in EtOH)
mp
157.5 – 159.5 °C
1
(400 MHz, D2O, 23 °C) δ [ppm] = 4.46 (d"t", J = 10.6, 2.7 Hz, 1H,
CH), 4.55 (dd, J = 10.6, 3.3 Hz, 1H, CH), 6.01 (ddm, J = 10.1,
3.0 Hz, 1H, CH), 6.34 (d"t"m, J = 10.1, 1.9 Hz, 1H, CH), 6.90 (m,
1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, D2O, 23 °C) δ [ppm] = 74.4 (CH), 75.2 (CH), 124.8
(CH), 131.2 (Cq), 133.6 (CH), 141.8 (CH), 171.7 (CO).
HPLC
Rt = 5.9 min, λ (rel Int.) [nm]: 205 (100), 278 (30).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 300 (+ 1.3), 256 (– 4.5), 207 (+ 12.1);
(c = 1.06 × 10-4 M, CH3CN, 23 °C).
Massenanalyse
m/z (%): 156.0 (58) [M]•+, 138.0 (66) [M–H2O]•+, 110.0 (100) [M–
HCO2H]•+, 82.0 (64), 81.0 (66).
Elementaranalyse erwartet: C: 53.85 %, H: 5.16 %; gefunden: C: 53.58 %, H: 5.12 %.
C7H8O4
h
[156.13]
Eingesetzt wurde eine Probe, die laut 1H-NMR und Abgleich mit einem internen Standard einen Gehalt von
77 % 4 ohne NMR-aktive Verunreinigungen aufweist. Die angegebene Konzentration bezieht sich auf die Einwaage gewichtet mit dem Gehalt an 4. Der gemessene Wert weicht signifikant vom Literaturwert [α = – 1.6 (c =
0.1 in Wasser)] ab.98
160
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(5S,6S)-5,6-Dihydroxycyclohexa-1,3-diencarbonsäuremethylester (196)
CO2Me
OH
OH
196
Darstellung: 3.00 g (15.4 mmol) Säure 4 (Gehalt laut 1H-NMR 81 % w/w)
werden in 70 mL trockenem Methanol gelöst. Nach Zugabe von 40 mL methanolischer Chlorwasserstoff-Lösung (∼1.25
M)
wird die gelbbraune Lösung
bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt. Nach vollständiger Reaktion
(Kontrolle per DC) wird mit 6.0 mL (44 mmol) Triethylamin neutralisiert, auf Kieselgel
aufgezogen und per Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat / Methanol 10:1 v/v) gereinigt.
Erhalten werden 2.71 g (quantitativ bezogen auf die eingesetzte Säure) eines blassgelben
Wachses 196, der zu analytischen Zwecken aus Diethylether / Ethylacetat umkristallisiert
werden kann, wobei klare, farblose Kristalle erhalten werden.
DC
Rf = 0.50 (Ethylacetat)
Drehwert
[α ]24D = + 342.0 (c = 1.0 in CHCl3)
mp
78.0 – 80.0 °C
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 3.37 (bs, 1H, OH), 3.81 (s, 3H,
CH3), 4.00 (bs, 1H, OH), 4.55 (ddd, J = 9.7, 3.3, 2.0 Hz, 1H, CH),
4.75 (dd, J = 9.7, 1.4 Hz, 1H, CH), 6.08 (ddd, J = 9.7, 5.6, 2.0 Hz,
1H, CH), 6.28 (ddd, J = 9.7, 3.3, 1.0 Hz, 1H, CH), 6.99 (d"t",
J = 5.6, 1.2 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR (KBr)
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 51.9 (CH3), 71.4 (CH), 71.6
(CH), 122.8 (CH), 129.0 (Cq), 133.1 (CH), 135.8 (CH), 167.6 (CO).
ν~ (cm-1): 3384.0 (bm), 2953.8 (w), 1693.4 (s), 1647.6 (m), 1584.9
(m), 1437.8 (m), 1253.9 (bs), 1006.2 (s).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 277 (+ 19.1), 218 (– 3.54), 213 (– 3.48);
(c = 1.7 × 10-4 M, CH3CN, 25 °C).
GCMS
Rt = 9.18 min; m/z (%): 170.1 (12) [M]•+, 152.0 (80) [M–H2O]•+,
138.0 (32) [M–CH3OH] •+, 121.0 (100), 110.0 (47), 105.0 (90), 77
(55).
C8H10O4
[170.16]
(3R,4R)-3,4-Dihydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäuremethylester (170)
CO2Me
OH
OH
170
Darstellung: 2.01 g (12.9 mmol) Säure 5 werden in 20 mL trockenem
Methanol suspendiert. Nach Zugabe von 10 mL methanolischer Chlorwasserstoff-Lösung (∼1.25
M)
löst sich das Edukt vollständig. Die blassgelbe
Lösung wird bei Raumtemperatur 2 Tage lang gerührt. Nach vollständiger
Reaktion wird mit 0.5
M
Ammoniaklösung neutralisiert, zweimal mit je
10 mL Chloroform und zweimal mit je 10 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
161
organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wird
unter vermindertem Druck entfernt. Erhalten werden 2.21 g (quant.) 170 in Form eines
blassgelben Wachses, der noch Reste von Ethylacetat enthält und ohne weitere Aufreinigung
in Folgereaktionen eingesetzt wird. Zur Charakterisierung wird das Rohprodukt per
Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat / Methanol 8:1 v/v) gereinigt.
DC
Rf = 0.50 (Ethylacetat)
Drehwert
[α ]24D = – 70.8 (c = 1.1 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 3.75 (s, 3H, CH3), 4.35 (s, b,
2H, 2 × OH), 4.51 (d"t", J = 13.8, 1.8 Hz, 1H, CH), 4.60 (dd,
J = 13.8, 2.0 Hz, 1H, CH), 5.92 (dd, J = 10.0, 1.6 Hz, 1H, CH), 6.27
(d"t", J = 10.0, 2.0 Hz, 1H, CH), 6.87 (m, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 52.4 (CH3), 74.0 (CH), 75.0
(CH), 122.2 (CH), 128.3 (CH), 132.1 (Cq), 140.2 (CH), 165.4 (CO).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 301 (+ 1.03), 252 (– 3.36); (c = 3.65 × 10-4 M, CH3CN,
23 °C).
Massenanalyse
m/z (%): 170.1 (20) [M]•+, 152.0 (66) [M–H2O]•+, 138.0 (56) [M–
H3OH]•+, 121.0 (100), 110.0 (68), 92.9 (47), 81.0 (63), 65.0 (52),
53.0 (43).
chirale HPLC
Rt = 33.2 min; λ (rel Int.) [nm]: 205 (100), 278 (18).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C8H10O4): 170.0579; gefunden: 170.0574.
C8H10O4
[170.16]
(5S,6S)-5,6-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cyclohexa-1,5-diencarbonsäuremethylester
(160)
CO2Me
OTBS
OTBS
160
Darstellung: 2.70 g (15.9 mmol) Diol 196 und 5.0 mL (36.9 mmol)
Triethylamin werden bei 0 °C in 30 mL trockenem Dichlormethan vorgelegt und über 20 Minuten tropfenweise mit 8.0 mL (34.8 mmol) tertButyldimethylsilyltrifluormethansulfonsäureester (TBS-OTf) versetzt. Nach
60 Minuten unter Erwärmen auf Raumtemperatur ist die Reaktion voll-
ständig (Kontrolle per DC), und es wird mit 30 mL Ethylacetat verdünnt und mit NH4ClLösung und Wasser gewaschen. Die wässrigen Phasen werden einmal mit 15 mL Ethylacetat
extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet, im Vakuum
von flüchtigen Bestandteilen befreit und per Flashchromatographie (SiO2, Isohexan /
Ethylacetat 15:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 6.08 g (96 %) 160 als farbloses Öl.
162
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
DC
Rf = 0.33 (Isohexan / Ethylacetat 19:1 v/v)
Drehwert
[α ]25D = + 401.5 (c = 1.0 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.05 (s, 3H, CH3), 0.09 (s, 3H,
CH3), 0.12 (s, 3H, CH3), 0.17 (s, 3H, CH3), 0.83 (s, 9H, C(CH3)3),
0.87 (s, 9H, C(CH3)3), 3.69 (s, 3H, OCH3), 4.11 (dd, J = 4.8, 1.6 Hz,
1H, CH), 4.57 (m, 1H, CH), 6.18 (m, 2H, 2 × CH), 7.10 (dd, J = 5.0,
1.7 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.6 (CH3), – 4.30 (CH3),
– 4.26 (CH3), – 4.0 (CH3), 18.3 (Cq), 18.4 (Cq), 25.9 (C(CH3)3), 26.0
(C(CH3)3), 51.7 (CH3), 68.2 (CH), 70.1 (CH), 123.8 (CH), 129.6
(Cq), 133.0 (CH), 133.2 (CH), 167.5 (CO).
ν~ (cm-1): 2952.9 (w), 2929.2 (w), 2887.8 (w), 2857.2 (w), 1713.6
IR (KBr)
(m), 1251.1 (bs), 1066.6 (bs), 832.8 (ss), 773.0 (ss).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 282 (+ 16.8), 240 (+ 0.4), 228 (+ 0.9);
(c = 3.09 × 10-4 M, CH3CN, 25 °C).
GCMS
Rt = 12.40 min; m/z (%): 398 (8) [M]•+, 383 (3) [M–CH3•]+, 341
(100) [M–tBu•]+, 309 (8), 267 (2) [M–OTBS•]+, 209 (25), 105 (10),
89 (14), 73 (50).
Massenanalyse
m/z (%): 398.2 (10) [M]•+, 383.2 (3) [M–CH3•]+, 341.1 (100) [M–
tBu•]+, 309.1 (9) [M–CH3OH, tBu•]+, 209.0 (11), 73.0 (15).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C20H38O4Si2): 398.2309; gefunden: 398.2312.
C20H38O4Si2
[398.68]
(3R,4R)-3,4-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cyclohexa-1,5-diencarbonsäuremethylester
(185)
CO2Me
OTBS
OTBS
185
Darstellung: 1.46 g (8.6 mmol) Diol 170 und 3.4 mL (19.9 mmol) N-Ethyl-
diisopropylamin werden bei 0 °C in 50 mL trockenem Dichlormethan vorgelegt und über 20 Minuten tropfenweise mit 3.3 mL (19.2 mmol) TBSOTf versetzt. Nach vollständiger Umsetzung (Kontrolle per DC) wird nach
60 Minuten auf Kieselgel aufgezogen und per Flashchromatographie (SiO2,
Isohexan / Ethylacetat 25:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 3.06 g (89 %)
185 als farbloses Öl.
DC
Rf = 0.34 (Isohexan / Ethylacetat 25:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 122.2 (c = 1.2 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.09 (s, 3H, CH3), 0.10 (s, 3H,
CH3), 0.12 (s, 6H, 2 × CH3), 0.92 (s, 9H, C(CH3)3), 0.93 (s, 9H,
C(CH3)3), 3.78 (s, 3H, CH3), 4.49 (d"t", J = 11.6, 2.2 Hz, 1H, CH),
4.58 (dd, J = 11.6, 2.6 Hz, 1H, CH), 5.86 (dd, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H,
CH), 6.26 (d"t", J = 10.0, 1.9 Hz, 1H, CH), 6.78 (m, 1H, CH).
H-NMR
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
13
C-NMR
163
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.43 (CH3), – 4.42 (CH3),
– 4.02 (CH3), – 3.98 (CH3), 18.32 (Cq), 18.36 (Cq), 26.2
(6 × C(CH3)3), 52.2 (CH3), 73.9 (CH), 74.9 (CH), 121.4 (CH), 127.6
(Cq), 133.8 (CH), 141.6 (CH), 165.5 (CO).
GCMS
Rt = 12.96 min (breit); m/z (%): 398 (80) [M]•+, 367 (12) [M–
CH3O•]+, 341 (100) [M–C(CH3)3•]+, 235 (44), 209 (48), 195 (98),
147 (55), 121 (28), 73 (93).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 312 (+ 0.4), 267 (– 8.7), 222 (+ 1.6), 214 (+ 1.3);
(c = 3.92 × 10-4 M, CH3CN, 23 °C).
Massenanalyse
m/z (%): 398.2 (98) [M]•+, 367.2 (5) [M–OCH3•]+, 341.1 (51) [M–
tBu•]+, 275.1 (9), 235.1 (10), 209.0 (23), 195.0 (26), 147.0 (83),
121.0 (40), 73.0 (100).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C20H38O4Si2): 398.2309; gefunden: 398.2308.
C20H38O4Si2
[398.68]
(3R,4R)-3,4-Diacetoxycyclohexa-1,5-diencarbonsäuremethylester (199)
CO2Me
Darstellung: 528 mg (3.1 mmol) Diol 170 werden bei 0 °C in 5 mL Essig-
säureanhydrid vorgelegt und mit einer Lösung von 1 mg (0.002 mmol)
Scandium(III)triflat in 1 mL Essigsäureanhydrid versetzt. Die Lösung wird
OAc
OAc
199
über 60 Minuten bei 0 °C gerührt und färbt sich dabei gelb. Nach vollständigem Umsatz (DC-Kontrolle) wird mit 15 mL Ethylacetat verdünnt und
30 mL halbgesättigte NaHCO3 zugegeben. Nach einer Stunde werden die
Phasen getrennt, die wässrige Phase wird zweimal mit je 10 mL Ethylacetat extrahiert, und
die vereinigten organischen Phasen werden dreimal mit NaHCO3 gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und nach Zusatz von 10 mL Toluen unter vermindertem Druck eingeengt. Das erhaltene Öl wird per Flashchromatographie (SiO2, Isohexan / Ethylacetat 3:1 v/v)
gereinigt. Erhalten werden 621 mg (69 %) 199 als farbloses Öl.
DC
Rf = 0.48 (Isohexan / Ethylacetat 3:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 380.0 (c = 1.2 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 2.06 (s, 3H, CH3), 2.08 (s, 3H,
CH3), 3.78 (s, 3H, CH3), 5.63 (ddd, J = 8.5, 3.5, 1.8 Hz, 1H, CH),
5.73 (dd, J = 8.5, 3.7 Hz, 1H, CH), 5.92 (ddd, J = 10.0, 3.5, 0.8 Hz,
1H, CH), 6.52 (d"t", J = 10.0, 1.6 Hz, 1H, CH), 6.80 (ddd, J = 3.5,
1.4, 0.8 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 21.0 (CH3), 21.1 (CH3), 52.4
(CH3), 71.1 (CH), 71.4 (CH), 123.7 (CH), 126.2 (CH), 129.4 (Cq),
133.1 (CH), 165.0 (CO), 170.2 (CO), 170.3 (CO).
164
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
GCMS
Rt = 11.04 min; m/z (%): 212 (1) [M–CH2CO]•+, 194 (8) [M–
AcOH]•+, 163 (7) [M–CH3OH, AcO•]+, 152 (100) [M–AcOH,
CH2CO]•+, 138 (8), 121 (65), 105 (7), 93 (6), 77 (5).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 312 (+ 0.05), 266 (– 11.2), 232 (– 4.8), 221 (– 5.3);
(c = 3.15 × 10-4 M, CH3CN, 23 °C).
Massenanalyse
m/z (%): 254.1(0.4) [M]•+, 212.1 (0.6) [M–CH2CO]•+, 194.1 (4) [M–
AcOH]•+, 170.1 (7), 152.1 (100), 138.1 (14), 121.0 (60), 105 (21),
77 (12).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C12H14O6): 254.0790; gefunden: 254.0805.
C12H14O6
[254.24]
(3R,4R)-3,4-Bis(methoxy)-cyclohexa-1,5-diencarbonsäuremethylester (197)
CO2Me
Darstellung: 220 mg (1.3 mmol) Diol 170 und 1.6 mL (9.4 mmol) N-
Ethyldiisopropylamin werden bei 0 °C in 10 mL trockenem CH2Cl2 vorgelegt und mit 660 µL (7.8 mmol) Chlormethylmethylether versetzt. Nach
OMOM
OMOM
197
16 Stunden wird mit NH4Cl und Wasser gewaschen und die wässrigen
Phasen zweimal mit je 5 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über MgSO4 getrocknet, unter vermindertem
Druck aufkonzentriert und per Flashchromatographie (SiO2, Cyclohexan / Ethylacetat 5:1 v/v)
gereinigt. Erhalten werden 188 mg (73 %) 197 als farbloses Öl.
DC
Rf = 0.24 (Cyclohexan / Ethylacetat 5:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 157.6 (c = 1.4 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 3.39 (s, 3H, CH3), 3.40 (s, 3H,
CH3), 3.76 (s, 3H, CH3), 4.48 (ddd, J = 10.1, 2.9, 2.2 Hz, 1H, CH),
4.59 (dd, J = 10.1, 3.4 Hz, 1H, CH), 4.74 (m, 4H, 4 × CHH), 5.98
(dd, J = 10.1, 3.1 Hz, 1H, CH), 6.38 (d"t", J = 10.1, 1.8 Hz, 1H,
CH), 6.90 (m, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 52.1 (CH3), 55.7 (CH3), 55.8
(CH3), 76.4 (CH), 76.8 (CH), 96.2 (CH2), 96.3 (CH2), 122.4 (CH),
128.3 (Cq), 129.4 (CH), 137.0 (CH), 165.3 (CO).
IR (KBr)
2951.6 (w), 2890.9 (w), 2824.4 (w), 1721.6 (s), 1438.8 (w), 1252.2
(s), 1149.5 (s), 1028.9 (ss), 918.0 (m), 720.8 (m).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 309 (+ 0.3), 263
(c = 3.66 × 10-4 M, CH3CN, 23 °C).
Massenanalyse
m/z (%): 258.1 (1) [M]•+, 196.1 (0.5), 165.0 (5), 152.0 (2), 124.0 (2),
104.9 (4), 77.0 (5), 45.2 (100).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C12H18O6): 258.1103; gefunden: 258.1115.
C12H18O6
[258.27]
(– 7.3),
217
(+
4.3);
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
165
(5aR,9aR)-5a,9a-Dihydrobenzo[f][1,3,5]trioxepin-7-carbonsäuremethylester (198)
Darstellung: 1.08 g (6.4 mmol) Diol 170, 2.75 mL (16.1 mmol) N-EthyldiisoCO2Me
O
O
O
198
propylamin und 4.7 g (12.7 mmol) Tetrabutylammoniumiodid werden bei 0 °C
in 20 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 3.5 mL (technisch, ≥ 31 mmol)
Chlormethylmethylether versetzt. Nach 16 Stunden unter Erwärmen auf Raumtemperatur (Kontrolle per DC) ist das Edukt vollständig umgesetzt, und überschüssiges Reagenz wird durch Zusatz von 5 mL 2 M Salzsäure hydrolysiert. Im
Vakuum werden alle flüchtigen Bestandteile entfernt, und das Rohprodukt wird per Flashchromatographie (SiO2, Isohexan / Ethylacetat 4:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 604 mg
(45 %) 198 als farbloser Feststoff.
DC
Rf = 0.63 (Isohexan / Ethylacetat 2:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 115.6 (c = 1.1 in CHCl3)
mp
98.5 – 99.0 °C
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 3.74 (s, 3H, CH3), 4.54 (dm,
J = 14.0 Hz, 1H, CH), 4.62 (dd, J = 14.0, 1.6 Hz, 1H, CH), 4.86 ("t",
J = 5.7 Hz, 2H, 2 × CHH), 5.02 (d, J = 5.8 Hz, 1H, CHH), 5.03 (d,
J = 6.0 Hz, 1H, CHH), 5.89 (dm, J = 10.1 Hz, 1H, CH), 6.27 (ddd,
J = 10.1, 2.5, 1.7 Hz, 1H, CH), 6.84 (m, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 52.2 (CH3), 80.7 (CH), 81.6
(CH), 92.0 (CH2), 92.3 (CH2), 122.6 (CH), 128.6 (Cq), 130.1 (CH),
137.9 (CH), 164.8 (CO).
GCMS
Rt = 10.60 min; m/z (%): 212 (2) [M]•+, 182 (13) [M–OCH2]•+, 152
(100) [M–2 × OCH2]•+, 124 (67) [M–CO, 2 × OCH2]•+, 121 (36)
[M–CH3O•, 2 × OCH2]+, 109 (15), 93 (17), 65 (20).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 283 (+ 2.6), 243 (– 2.0), 214 (+ 7.3); (c = 3.92 × 10-4 M,
CH3CN, 23 °C).
Massenanalyse
m/z (%): 212.0 (3) [M]•+, 182.0 (16) [M–OCH2]•+, 152.0 (100) [M–
2 × OCH2]•+, 124.0 (62) [M–2 × OCH2, CO]•+, 121.0 (19), 93.0
(11), 65.1 (14).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C10H12O5): 212.0685; gefunden: 212.0685.
C10H12O5
[212.20]
166
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
5.2.4
Synthese von Valienon (8)
(3R,4S,5R,6S)-6-Acetoxy-5-brom-3,4-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cyclohex-1-encarbonsäuremethylester (216) und (3R,4S,5R,6S)-6-Acetoxy-3-brom-4,5-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cyclohex-1-encarbonsäuremethylester (217)
CO2Me
CO2Me
OAc
AcO
Br
OTBS
OTBS
Br
216
OTBS
OTBS
217
Darstellung: 11.75 g (29.5 mmol) 185 werden
in einer Mischung aus 115 mL Dichlormethan
und 50 mL Essigsäure vorgelegt und mit 5.25 g
(38.1 mmol) N-Bromacetamid versetzt. Bei vollständigem Umsatz (Reaktionskontrolle per GCMS) nach drei Stunden bei Raumtemperatur
wird die Lösung mehrfach mit je 30 mL Toluen versetzt und unter vermindertem Druck eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt wird per Flashchromatographie (SiO2, Isohexan / Ethylacetat 15:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 12.57 g (79 %) eines Gemisches von 216 und 217
im Verhältnis 3:1 als gelbes Öl.
Zur Charakterisierung der Produkte wurden reine Fraktionen von 216 (späte Produktfraktionen) und 217 (frühe Produktfraktionen) per GCMS bestimmt und separiert.
Analytische Daten (216):
DC
Rf = 0.26 (Isohexan / Ethylacetat 15:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 25.4 (c = 1.0 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 60 °C) δ [ppm] = 0.12 (s, 6H, 2 × CH3), 0.15 (s,
3H, CH3), 0.17 (s, 3H, CH3), 0.92 (s, 9H, C(CH3)3), 0.94 (s, 9H,
C(CH3)3), 2.06 (s, 3H, CH3), 3.76 (s, 3H, CH3), 3.87 (dd, J = 6.2,
3.5 Hz, 1H, CH), 4.26 (dd, J = 4.5, 2.5 Hz, 1H, CH), 4.38 (dd,
J = 6.2, 3.0 Hz, 1H, CH), 5.97 (d, J = 4.5 Hz, 1H, CH), 6.90 (d,
J = 3.0 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 60 °C) δ [ppm] = – 4.6 (CH3), – 4.4 (CH3), – 4.1
(CH3), – 4.0 (CH3), 18.3 (2 × Cq), 20.7 (CH3), 26.06 (C(CH3)3),
26.13 (C(CH3)3), 52.3 (OCH3), 53.0 (CH), 70.7 (CH), 71.3 (CH),
72.9 (CH), 127.4 (Cq), 143.7 (CH), 165.4 (CO), 170.1 (CO).
GCMS
Rt = 14.45 min; m/z (%): 481 (4) [M–tBu•]+, 479 (4) [M–tBu•]+, 449
(1), 447 (1), 421 (25) [M–AcOH, tBu•]+, 419 (24) [M–AcOH,
tBu•]+, 397 (15) [M–AcOH, Br•]+, 193 (22), 147 (78), 117 (47), 73
(100).
Massenanalyse
m/z (%): 538.2 (0.1) [M]•+, 536.2 (0.1) [M]•+, 523.2 (0.4) [M–
CH3•]+, 521.2 (0.4) [M–CH3•]+, 507.2 (1.3) [M–OCH3•]+, 505.2
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
167
(1.1) [M–OCH3•]+, 481.1 (35) [M–tBu•]+, 479.1 (33) [M–tBu•]+,
421.1 (100) [M–AcOH, tBu•]+, 419.1 (93) [M–AcOH, tBu•]+,
397.2 (38) [M–AcOH, Br•]+, 367.2 (15), 347.1 (11), 283.2 (16),
255.2 (11), 225.1 (15), 193.1 (20), 147.1 (100), 117.1 (56), 73.1
(85).
HRMS
berechnet für [M–tBu•]+ (C18H3279BrO6Si2): 479.0915; gefunden:
479.0918.
C22H41BrO6Si2
[537.63]
Analytische Daten (217):
DC
Rf = 0.26 (Isohexan / Ethylacetat 15:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = + 0.4 (c = 1.0 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.07 (s, 3H, CH3), 0.12 (s, 3H,
CH3), 0.16 (s, 3H, CH3), 0.17 (s, 3H, CH3), 0.87 (s, 9H, C(CH3)3),
0.92 (s, 9H, C(CH3)3), 2.04 (s, 3H, CH3), 3.76 (s, 3H, OCH3), 3.88
("t"d, J = 4.1, 1.0 Hz, 1H, CH), 3.99 (dd, J = 4.5, 2.1 Hz, 1H, CH),
4.93 (d"t", J = 3.7, 2.1 Hz, 1H, CH), 5.37 (m, 1H, CH), 7.09 ("qui",
J = 1.1 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 5.0 (CH3), – 4.7 (CH3), – 4.6
(CH3), – 3.8 (CH3), 18.0 (Cq), 18.4 (Cq), 21.2 (CH3), 25.9 (C(CH3)3),
26.1 (C(CH3)3), 48.3 (CH), 52.3 (CH3), 67.6 (CH), 70.4 (CH), 71.7
(CH), 127.3 (Cq), 141.2 (CH), 165.3 (CO), 170.5 (CO).
GCMS
Rt = 14.37 min; m/z (%): 481 (10) [M–tBu•]+, 479 (9) [M–tBu•]+,
449 (7), 447 (7), 421 (41) [M–AcOH, tBu•]+, 419 (38) [M–AcOH,
tBu•]+, 398 (15), 367 (53), 347 (44), 345 (41), 193 (62), 147 (25),
117 (100), 73 (96).
Massenanalyse
m/z (%): 521.2 (0.2) [M–CH3•]+, 519.2 (0.2) [M–CH3•]+, 507.1 (0.7)
[M–OCH3•]+, 505.1 (0.7) [M–OCH3•]+, 481.1 (18) [M–tBu•]+, 479.1
(18) [M–tBu•]+, 449.1 (6) [M–HOCH3, tBu•]+, 447.1 (6) [M–
HOCH3, tBu•]+, 421.1 (38) [M–AcOH, tBu•]+, 419.1 (35) [M–
AcOH, tBu•]+, 367.2 (40), 347.0 (35), 345.0 (31), 339.0 (33), 193.0
(30), 117.1 (100), 73.1 (56).
HRMS
berechnet für [M–tBu•]+ (C18H3279BrO6Si2): 479.0915; gefunden:
479.0920.
C22H41BrO6Si2
[537.63]
168
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(3R,4S,5R,6S)-4,5,6-Triacetoxy-3-brom-cyclohex-1-encarbonsäuremethylester (240)
CO2Me
OAc
Br
OAc
Darstellung: 20 mg (0.04 mmol) 217 werden in 1 mL Acetonitril bei
0 °C mit 4 Tropfen 50 %iger Flusssäure versetzt. Nach 8 Stunden unter
Erwärmen auf Raumtemperatur wird mit 5 mL Wasser versetzt und
OAc
dreimal mit je 5 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen
240
Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet und unter verminder-
tem Druck bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 2 mL Acetanhydrid aufgenommen und mit 1 mg Sc(OTf)3 versetzt. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wird nach
Zusatz von 5 mL Ethylacetat mit wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung hydrolysiert.
Die Phasen werden getrennt, und die organische Phase dreimal mit je 5 mL Natriumhydrogencarbonat gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase über Magnesiumsulfat
wird unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingeengt. Erhalten werden 4 mg (25 %)
240 als blassgelbes Öl, das ohne weitere Aufreinigung vermessen wird.
DC
Rf = 0.58 (Cyclohexan / Ethylacetat 2:1 v/v)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 2.05 (s, 3H, CH3), 2.07 (s, 3H,
CH3), 2.14 (s, 3H, CH3), 3.78 (s, 3H, OCH3), 4.92 (dd, J = 10.4, 4.3
Hz, 1H, CH), 5.01 (m, 1H, CH), 5.62 (dd, J = 10.4, 6.7 Hz, 1H, CH),
6.08 (dm, J = 6.7 Hz, 1H, CH), 7.10 (dd, J = 5.8, 1.5 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 20.9 (CH3), 21.0 (2 × CH3),
43.4 (CH), 52.6 (CH3), 68.4 (CH), 69.3 (CH), 70.6 (CH), 130.0 (Cq),
137.3 (CH), 164.1 (CO), 169.9 (CO), 170.0 (CO), 170.2 (CO).
C14H17BrO8
[393.18]
(1S,4R,5R,6S)-4,5-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-7-oxabicyclo[4.1.0]hept-2-en-2-carbonsäuremethylester (207) und (3R,4S)-5-Brom-3,4-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cyclohexa1,5-diencarbonsäuremethylester (218)
CO2Me
CO2Me
Darstellung: 1.15 g (2.2 mmol) einer Mischung
der isomeren Bromalkohole 216 und 217 im VerO
OTBS
OTBS
207
Br
OTBS
OTBS
218
hältnis 3:1 werden in 30 mL Methanol und 2 mL
Wasser gelöst. 500 mg (4.7 mmol) festes Natriumcarbonat werden zugesetzt. Die Suspension wird
bei Raumtemperatur heftig gerührt und nach 23 Stunden durch Zugabe von methanolischem
Chlorwasserstoff (~1.25 M) neutralisiert. Das Rohprodukt wird auf Kieselgel aufgezogen und
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
169
per Flashchromatographie (SiO2, Isohexan / Ethylacetat 10:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden
155 mg (15 %) 218 als blassgelbes Öl und 590 mg (66 %) 207 als farbloses Öl.
Analytische Daten (207):
DC
Rf = 0.27 (Isohexan / Ethylacetat 15:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = – 48.4 (c = 1.3 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.09 (s, 6H, 2 × CH3), 0.11 (s,
3H, CH3), 0.16 (s, 3H, CH3), 0.90 (s, 9H, C(CH3)3), 0.92 (s, 9H,
C(CH3)3), 3.36 (dd, J = 4.1, 1.4 Hz, 1H, CH), 3.64 (dd, J = 4.1, 1.0
Hz, 1H, CH), 3.73 (dd, J = 7.1, 1.4 Hz, 1H, CH), 3.79 (s, 3H, CH3),
4.41 (dd, J = 7.1, 2.6 Hz, 1H, CH), 6.83 (dd, J = 2.6, 1.0 Hz, 1H,
CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.7 (CH3), – 4.6 (CH3), – 4.4
(CH3), – 4.2 (CH3), 18.2 (Cq), 18.3 (Cq), 26.03 (C(CH3)3), 26.05
(C(CH3)3), 46.9 (CH), 52.3 (CH3), 59.0 (CH), 72.0 (CH), 73.1 (CH),
128.9 (Cq), 147.9 (CH), 165.4 (CO).
GCMS
Rt = 13.56 min; m/z (%): 414 (1) [M]•+, 398 (3) [M–"O"]•+, 385 (17),
357 (42) [M–tBu•]+, 341 (4), 325 (10), 225 (32), 211 (15), 147
(100), 73 (95).
Massenanalyse
m/z (%): 414.3 (0.6) [M]•+, 399.2 (1.2) [M–CH3•]+, 385.3 (38), 357.2
(62) [M–tBu•]+, 325.2 (8) [M–CH3OH, tBu•]+, 225.1 (17), 147.1
(100), 73.1 (55).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C20H38O5Si2): 414.2258; gefunden: 414.2247.
C20H38O5Si2
[414.68]
Analytische Daten (218):
DC
Rf = 0.49 (Isohexan / Ethylacetat 15:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 272.6 (c = 1.1 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.09 (s, 3H, CH3), 0.13 (s, 3H,
CH3), 0.17 (s, 3H, CH3), 0.19 (s, 3H, CH3), 0.880 (s, 9H, C(CH3)3),
0.885 (s, 9H, C(CH3)3), 3.80 (s, 3H, CH3), 4.19 (d, J = 2.7 Hz, 1H,
CH), 4.26 (dd, J = 5.2, 2.7 Hz, 1H, CH), 6.87 (m, 1H, CH), 6.89 (d,
J = 5.4 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.3 (2 × CH3), – 3.92 (CH3),
– 3.89 (CH3), 18.27 (Cq), 18.34 (Cq), 25.95 (C(CH3)3), 25.98
(C(CH3)3), 52.4 (CH3), 72.1 (CH), 77.1 (CH), 124.0 (CH), 126.9
(Cq), 128.1 (Cq), 134.3 (CH), 165.3 (CO).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 284 (– 21.6), 239
(c = 5.37 × 10-5 M, CH3CN, 23 °C).
GCMS
Rt = 13.45 min; m/z (%): 478 (5) [M]•+, 476 (4) [M]•+, 421 (4) [M–
tBu•]+, 419 (3) [M–tBu•]+, 397 (55) [M–Br•]+, 365 (3), 339 (30), 289
(+
0.2),
218
(– 2.5);
170
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(18), 287 (17), 275 (16), 201 (6), 199 (6), 193 (100), 147 (31), 73
(62).
Massenanalyse
m/z (%): 478.2 (2.5) [M]•+, 476.2 (2) [M]•+, 437.1 (16), 435.1 (15),
397.3 (18) [M–Br•]+, 357.2 (9), 147.1 (45), 73.0 (100).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C20H3779BrO4Si2): 476.1414; gefunden:
476.1416.
C20H37BrO4Si2
[477.58]
(3R,4R,5S,6R)-6-Acetoxy-3,4-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-5-hydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (260)
CO2Me
AcO
HO
OTBS
OTBS
260
Darstellung: 1.37 g (2.9 mmol) Epoxid 207 werden in 15 mL Eis-
essig gelöst und tropfenweise mit 1.13 mL (15 mmol) Trifluoressigsäure (7.5 % v/v) versetzt. Die Lösung wird 3.5 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 15 mL
Ethylacetat verdünnt und mit gesättigter NaHCO3 versetzt. Nach 30
Minuten werden die Phasen getrennt, die organische Phase wird zweimal mit NaHCO3
gewaschen, und die vereinigten wässrigen Phasen werden dreimal mit je 10 mL Ethylacetat
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet und
unter vermindertem Druck eingeengt. Das erhaltene Öl wird per Flashchromatographie (SiO2,
Cyclohexan / Ethylacetat 6:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 582 mg (37 %) eines gelben Öls.
DC
Rf = 0.24 (Cyclohexan / Ethylacetat 6:1 v/v)
Drehwert
[α ]22D = – 60.4 (c = 1.1 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.10 (s, 3H, CH3), 0.11 (s, 3H,
CH3), 0.16 (s, 6H, 2 × CH3), 0.89 (s, 9H, C(CH3)3), 0.91 (s, 9H,
C(CH3)3), 2.04 (s, 3H, CH3), 3.15 (bs, 1H, OH), 3.77 (s, 3H, CH3),
3.80-3.85 (m, 2H, 2 × CH), 4.24 (m, 1H, CH), 5.76 (d, J = 4.0 Hz,
1H, CH), 6.94 (d, J = 3.6 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.6 (CH3), – 4.55 (CH3),
– 4.46 (CH3), – 4.3 (CH3), 18.00 (Cq), 18.02 (Cq), 20.9 (CH3), 25.7
(C(CH3)3), 25.8 (C(CH3)3), 52.1 (CH3), 69.7 (CH), 70.3 (CH), 72.4
(CH), 72.9 (CH), 127.9 (Cq), 141.0 (CH), 165.6 (CO), 170.3 (CO).
GCMS
Rt = 14.19 min; m/z (%): 417 (2) [M–tBu•]+, 399 (6) [M–tBu•,
H2O]+, 383 (4), 357 (100) [M–tBu•, AcOH]+, 325 (18), 301 (14),
271 (16), 225 (100), 211 (50), 193 (43), 169 (20), 147 (91), 117
(23), 73 (93).
C22H42O7Si2
[474.74]
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
171
(3R,4S,5S,6R)-6-Acetoxy-3,4,5-tris-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cyclohex-1-encarbonsäuremethylester (261)
CO2Me
AcO
TBSO
OTBS
OTBS
261
Darstellung: 582 mg (1.23 mmol) Alkohol 260, 370 µL
(2.73 mmol) Triethylamin und 5 mg (0.04 mmol) 4-(Dimethylamino)-pyridin (DMAP) werden bei Raumtemperatur in 5 mL Dichlormethan vorgelegt und tropfenweise mit 565 µL (2.46 mmol)
TBS-OTf versetzt. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wird 1 mL
NH4Cl-Lösung zugegeben und die organische Phase mit 10 mL Ethylacetat verdünnt. Nach
Zusatz von 10 mL Wasser werden die Phasen getrennt, und die wässrige Phase dreimal mit je
5 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat
getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt und per Flashchromatographie (SiO2,
Cyclohexan / Ethylacetat 20:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 660 mg (91 %) eines gelben
Öls.
DC
Rf = 0.13 (Cyclohexan / Ethylacetat 20:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = – 82.2 (c = 0.8 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.07 (s, 3H, CH3), 0.11 (s, 6H,
2 × CH3), 0.136 (s, 3H, CH3), 0.140 (s, 3H, CH3), 0.16 (s, 3H, CH3),
0.87 (s, 9H, C(CH3)3), 0.88 (s, 9H, C(CH3)3), 0.91 (s, 9H, C(CH3)3),
2.00 (s, 3H, CH3), 3.78 (s, 3H, CH3), 3.88 (m, 1H, CH), 4.03 (dd,
J = 2.8, 2.2 Hz, 1H, CH), 4.23 (dd, J = 4.0, 1.2 Hz, 1H, CH), 5.53
(m, 1H, CH), 7.07 (dd, J = 4.0, 1.0 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.92 (CH3), – 4.88 (CH3),
– 4.8 (CH3), – 4.5 (CH3), – 4.4 (CH3), – 4.3 (CH3), 17.9 (Cq), 18.0
(Cq), 18.2 (Cq), 21.0 (CH3), 25.7 (C(CH3)3), 25.8 (C(CH3)3), 25.9
(C(CH3)3), 52.0 (CH3), 67.5 (CH), 69.9 (CH), 71.2 (CH), 74.9 (CH),
125.9 (Cq), 142.4 (CH), 166.3 (CO), 170.2 (CO).
GCMS
Rt = 14.62 min; m/z (%): 531 (4) [M–tBu•]+, 471 (58) [M–tBu•,
AcOH]+, 397 (46) [M–AcOH, OTBS•]+, 385 (24), 339 (28), 288
(22), 251 (20), 231 (22), 193 (57), 147 (48), 117 (44), 73 (100).
Massenanalyse
m/z (%): 588.4 (1) [M]•+, 531.3 (6) [M–tBu•]+, 471.3 (59) [M–tBu•,
AcOH]+, 457.2 (9) [M–OTBS•]+, 397.2 (42) [M–AcOH, OTBS•]+,
339.2 (23), 288.2 (20), 251.1 (22), 231.2 (26), 193.1 (68), 149.1
(31), 147.1 (53), 117.0 (45), 73.1 (100).
HRMS
berechnet für [M–tBu•]+ (C24H47O7Si3): 531.2624; gefunden:
531.2627.
C28H56O7Si3
[589.00]
172
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(1R,4R,5S,6S)-4,5,6-Tris-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-2-hydroxymethylcyclohex-2-en-1-ol (262)
OH
HO
Darstellung: 229 mg (0.39 mmol) Methylester 261 werden bei
– 78 °C in 10 mL trockenem Dichlormethan vorgelegt und tropfenweise mit 2.5 mL (2.5 mmol) einer 1
TBSO
OTBS
OTBS
262
M
Lösung von Di-iso-butyl-
aluminiumhydrid (DIBAL-H) in Dichlormethan versetzt. Die Lösung wird über 2 Stunden auf – 50 °C erwärmt. Nach vollständigem
Umsatz (DC-Kontrolle) wird überschüssiges DIBAL-H durch
tropfenweise Zugabe von 2 mL Methanol und 10 mL 2 M Salzsäure hydrolysiert. Die Suspension wird gerührt, bis nach einer Stunde alle Aluminiumsalze gelöst sind. Nach Phasentrennung wird die wässrige Phase mit 2 mL gesättigter Natriumchloridlösung versetzt und
dreimal mit je 5 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über
Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck aufkonzentriert und per Flashchromatographie (SiO2, Cyclohexan / Ethylacetat 3:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 155 mg
(77 %) eines farblosen Feststoffs.
DC
Rf = 0.50 (Cyclohexan / Ethylacetat 3:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = – 59.8 (c = 1.3 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.09 (s, 3H, CH3), 0.097 (s, 3H,
CH3), 0.099 (s, 3H, CH3), 0.11 (s, 3H, CH3), 0.15 (s, 3H, CH3), 0.16
(s, 3H, CH3), 0.87 (s, 9H, C(CH3)3), 0.90 (s, 18H, 2 × C(CH3)3), 2.22
(bs, 2H, 2 × OH), 3.84 (dd, J = 2.1, 1.2 Hz, 1H, CH), 3.96 (m, 1H,
CH), 4.04 (dd, J = 3.5, 2.4 Hz, 1H, CH), 4.06 (m, 1H, CH), 4.20
(d"t", J = 13.0, 1.1 Hz, 1H, CH), 4.33 (d"t", J = 13.0, 1.2 Hz, 1H,
CH), 5.75 (d"q", J = 4.2, 1.2 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 5.1 (CH3), – 4.9 (CH3), – 4.8
(CH3), – 4.56 (CH3), – 4.54 (CH3), – 4.2 (CH3), 17.8 (Cq), 18.1
(2 × Cq), 25.7 (C(CH3)3), 25.86 (C(CH3)3), 25.94 (C(CH3)3), 66.2
(CH2), 69.5 (CH), 69.9 (CH), 70.8 (CH), 75.5 (CH), 123.5 (CH),
137.8 (Cq).
ν~ (cm-1): 3445.8 (bw), 2953.8 (m), 2929.5 (m), 2886.7 (w), 2857.9
(m), 1255.6 (m), 1067.5 (s), 834.8 (ss), 776.3 (s).
GCMS
Rt = 14.94 min; m/z (%): 461 (1) [M–tBu•]+, 443 (4) [M–H2O, tBu•]+,
369 (4) [M–H2O, OTBS•]+, 329 (16), 311 (10), 288 (22), 255 (9), 235
(27), 197 (18), 155 (33), 147 (47), 133 (17), 123 (20), 75 (45), 73
(100).
Massenanalyse
m/z (%): 443.2 (18) [M–H2O, tBu•]+, 369.1 (8) [M–H2O, OTBS•]+,
329.1 (29), 311.1 (23), 288.1 (36), 255.1 (23), 235.1 (45), 197.0 (28),
155.0 (54), 147.0 (53), 122.9 (30), 73.0 (100).
HRMS
berechnet für [M–tBu•]+ (C21H45O5Si3): 461.2575; gefunden:
461.2574.
C25H54O5Si3
[518.95]
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
173
(3R,4S,5S,6R)-3,4,5-Tris-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-6-(methoxymethoxy)-1-((methoxymethoxy)methyl)cyclohexen (263)
OMOM
MOMO
TBSO
Darstellung: 127 mg (0.21 mmol) Diol 262 werden in 20 mL
Chloroform gelöst, mit 320 mg (0.87 mmol) Tetrabutylammoniumiodid, 550 µL (3.2 mmol) N-Ethyldiisopropylamin und 210 µL
OTBS
OTBS
263
(technisch, ≥ 3.0 mmol) Chlormethylmethylether versetzt und für
eine Stunde zum Rückfluss erhitzt. Hiernach wird auf 50 °C abgekühlt. Bei dieser Temperatur werden über 72 Stunden insgesamt
1.65 mL (9.6 mmol) N-Ethyldiisopropylamin und 630 µL (technisch, ≥ 9.0 mmol) Chlormethylmethylether portionsweise nachdosiert. Nach vier Tagen (Kontrolle per GCMS) wird
die Reaktionsmischung nach Abkühlen auf Raumtemperatur auf Kieselgel aufgezogen und
per Flashchromatographie (Cyclohexan / Ethylacetat 16:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden
113 mg (76 %) eines farblosen Öls.
DC
Rf = 0.30 (Cyclohexan / Ethylacetat 16:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = – 32.3 (c = 1.4 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.087 (s, 3H, CH3), 0.090 (s,
3H, CH3), 0.093 (s, 3H, CH3), 0.098 (s, 6H, 2 × CH3), 0.11 (s, 3H,
CH3), 0.86 (s, 9H, C(CH3)3), 0.889 (s, 9H, C(CH3)3), 0.900 (s, 9H,
C(CH3)3), 3.37 (s, 3H, CH3), 3.40 (s, 3H, CH3), 3.86 (m, 1H, CH),
3.97 (bd, J = 2.1 Hz, 1H, CH), 3.99 ("t", J = 2.6 Hz, 1H, CH), 4.10
(m, 2H, 2 × CH), 4.18 (dm, J = 12.7 Hz, 1H, CH), 4.57 (d, J = 6.3
Hz, 1H, CHH), 4.61 (d, J = 6.8 Hz, 1H, CHH), 4.67 (d, J = 6.3 Hz,
1H, CHH), 4.74 (d, J = 6.8 Hz, 1H, CHH), 5.84 (m, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.9 (CH3), – 4.6 (CH3), – 4.5
(CH3), – 4.42 (CH3), – 4.36 (CH3), – 4.1 (CH3), 18.0 (Cq), 18.1
(2 × Cq), 25.8 (C(CH3)3), 25.9 (C(CH3)3), 26.0 (C(CH3)3), 55.3
(CH3), 55.7 (CH3), 68.0 (CH2), 71.0 (CH), 71.2 (CH), 72.9 (CH),
76.2 (CH), 94.6 (CH2), 95.9 (CH2), 128.9 (CH), 132.4 (Cq).
ν~ (cm-1): 2952.0 (m), 2929.2 (m), 2886.1 (w), 2857.5 (m), 1255.4
(m), 1098.4 (bs), 1042.3 (ss), 832.2 (ss), 772.0 (ss).
GCMS
Rt = 15.13 min; m/z (%): 487 (12), 443 (26), 425 (24), 351 (28), 318
(45), 281 (34), 207 (100), 155 (72), 73 (85).
Massenanalyse
m/z (%): 549.3 (3) [M–tBu•]+, 487.3 (19), 443.3 (19), 425.3 (27),
413.3 (13), 355.2 (11), 351.2 (31), 319.2 (22), 318.2 (100), 311.2
(21), 275.2 (25), 209.1 (27), 155 (100), 147.0 (41), 73.0 (44).
HRMS
berechnet für [M–tBu•]+ (C25H53O7Si3): 549.3099; gefunden:
545.3079.
C29H62O7Si3
[607.05]
174
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(1R,2S,3R,6R)-6-(Methoxymethoxy)-5-((methoxymethoxy)methyl)cyclohex-4-en-1,2,3-triol (264)
OMOM
Darstellung: 113 mg (0.19 mmol) des Tri-TBS-Ethers 263 werden
in 2 mL trockenem THF gelöst und bei 0 °C mit 1.9 mL einer Tetra-
MOMO
butylammoniumfluoridlösung (TBAF) (1
HO
OH
OH
264
M
in THF) versetzt. Die
sich gelb färbende Lösung wird nach drei Stunden bei Raumtemperatur nach vollständiger Reaktion (DC-Kontrolle) auf Kieselgel
aufgezogen. Nach Flashchromatographie (SiO2, Gradient Cyclohexan / Ethylacetat 1:1 v/v →
Ethylacetat / Methanol 7:1 v/v) werden 35 mg (71 %) eines blassgelben Öls erhalten.
DC
Rf = 0.15 (Ethylacetat)
Drehwert
[α ]22D = – 71.5 (c = 1.2 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 3.36 (s, 3H, CH3), 3.47 (s, 3H,
CH3), 3.54-3.65 (m, 2H, 2 × CH), 3.90 (bs, 3H, 3 × OH), 4.00 (d,
J = 12.5 Hz, 1H, CHH), 4.04 (bd, J = 6.8 Hz, 1H, CH), 4.14 (d,
J = 12.5 Hz, 1H, CHH), 4.25 (bd, J = 6.8 Hz, 1H, CH), 4.60 (d,
J = 6.5 Hz, 1H, CHH), 4.64 (d, J = 6.5 Hz, 1H, CHH), 4.75 (d,
J = 7.0 Hz, 1H, CHH), 4.81 (d, J = 7.0 Hz, 1H, CHH), 5.75 (m, 1H,
CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 55.4 (CH3), 56.0 (CH3), 66.8
(CH2), 71.1 (CH), 74.7 (CH), 75.7 (CH), 83.2 (CH), 95.8 (CH2),
98.3 (CH2), 128.1 (CH), 134.0 (Cq).
ν~ (cm-1): 3397.9 (bm), 2891 (m), 1149.0 (s), 1097.9 (bs), 1044.9
IR
(bss), 1022.6 (bss).
Massenanalyse
m/z (%): 248.1 (3), 204.1 (49), 172.0 (23), 170.0 (21), 155.0 (32),
142.0 (40), 141.0 (67), 140.0 (89), 128.0 (51), 123.0 (30), 122.0
(37), 113.0 (25), 112.0 (26), 111.0 (100), 98.0 (79), 96.9 (19), 95.0
(27), 83.0 (15), 81.0 (17), 45.1 (78) [CH2OCH3]•+.
C11H20O7
[264.27]
(4R,5R,6R)-5,6-Dihydroxy-4-(methoxymethoxy)-3-[(methoxymethoxy)methyl]cyclohex-2enon (266)
OMOM
Darstellung: 35 mg (0.13 mmol) Allylalkohol 264 werden in 2 mL
Dichlormethan bei 0 °C vorgelegt. 62 mg (0.29 mmol) 4-Acetamino-
MOMO
2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl und 53 mg (0.28 mmol) 4-ToluHO
O
OH
266
110 mg
(0.51
ensulfonsäure Monohydrat werden in 5 mL Dichlormethan gelöst
und zugetropft. Über 24 Stunden werden portionsweise insgesamt
mmol)
4-Acetamino-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl
und
90
mg
(0.47 mmol) 4-Toluensulfonsäure Monohydrat gelöst in 10 mL Dichlormethan nachdosiert.
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
175
Die Reaktionslösung wird bis zum Rückluss erhitzt. Nach 48 Stunden wird die Reaktionsmischung auf Kieselgel aufgezogen und per Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat)
gereinigt. Erhalten werden 11.4 mg (33 %) eines blassgelben Wachses.
DC
Rf = 0.38 (Ethylacetat)
Drehwert
[α ]22D = – 40.9 (c = 1.3 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 3.39 (s, 3H, CH3), 3.50 (s, 3H,
CH3), 3.68 (bs, 1, OH), 3.86 (dd, J = 10.8, 8.0 Hz, 1H, CH), 4.12 (d,
J = 10.8 Hz, 1H, CH), 4.25 (bs, 1H, OH), 4.27 (d"t", J = 17.1, 1.5
Hz, 1H, CH), 4.36 (dm, J = 8.0 Hz, 1H, CH), 4.45 (dm, J = 17.1 Hz,
1H, CH), 4.70 (s, 2H, CH2), 4.81 (d, J = 7.0 Hz, 1H, CHH), 4.96 (d,
J = 7.0 Hz, 1H, CHH), 6.35 ("q", J = 2.0 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 55.6 (CH3), 56.5 (CH3), 66.0
(CH2), 76.1 (CH), 77.7 (CH), 81.3 (CH), 96.3 (CH2), 98.6 (CH2),
122.0 (CH), 159.7 (Cq), 196.5 (CO).
ν~ (cm-1): 3382.3 (bm), 2940.3 (m), 2892.6 (m), 2827.1 (m), 1682.0
(s), 1149.1 (s), 1110.6 (ss), 1050.9 (bss), 1013.2 (s), 917.7 (s).
Massenanalyse
m/z (%): 248.1 (1), 202.1 (42), 199.1 (14), 172.1 (35), 157.0 (45),
140.0 (41), 139.0 (26), 126.0 (26), 111.0 (19), 96.0 (70), 45.1 (100)
[CH2OCH3]•+.
C11H18O7
[262.26]
(6R,7S,8S,8aR)-6,7,8-Tris-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-2,2-dimethyl-6,7,8,8a-tetrahydro4H-benzo[1,3]dioxin (265)
Darstellung: 485 mg (0.94 mmol) Diol 262 werden in 25 mL
O
Dichlormethan vorgelegt. Die Lösung wird mit 1 mL (8.2 mmol)
O
TBSO
2,2-Dimethoxypropan und 5 mg 4-Toluensulfonsäure Monohydrat
OTBS
OTBS
265
versetzt und 150 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion
wird durch Zugabe von 10 mL halbgesättigter NaHCO3 abgebrochen. Die Phasen werden separiert, und die wässrige Phase wird
zweimal mit je 5 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über
Magnesiumsulfat getrocknet, im Vakuum von flüchtigen Substanzen befreit und per
Flashchromatographie (SiO2, Cyclohexan / Ethylacetat 40:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden
288 mg (72 % bezüglich des umgesetzten Eduktes) Produkt in Form eines farblosen Öls und
92 mg des eingesetzten Eduktes.
DC
Rf = 0.34 (Cyclohexan / Ethylacetat 40:1 v/v)
Drehwert
[α ]22D = – 69.0 (c = 1.0 in CHCl3)
176
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
1
H-NMR
13
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.11 (s, 12H, 4 × CH3), 0.12 (s,
3H, CH3), 0.14 (s, 3H, CH3), 0.91 (s, 9H, C(CH3)3), 0.92 (s, 9H,
C(CH3)3), 0.93 (s, 9H, C(CH3)3), 1.40 (s, 3H, CH3), 1.50 (s, 3H,
CH3), 3.52 (dd, J = 9.4, 7.1 Hz, 1H, CH), 3.65 (dd, J = 9.4, 7.1 Hz,
1H, CH), 4.05 (d, J = 13.6 Hz, 1H, CHH), 4.21 (dm, J = 7.1 Hz, 1H,
CH), 4.28 (dm, J = 7.1 Hz, 1H, CH), 4.43 (d"q", J = 13.6, 1.5 Hz,
1H, CHH), 5.37 (m, 1H, CH).
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.3 (CH3), – 3.9 (CH3), – 3.3
(CH3), – 3.1 (CH3), – 2.7 (CH3), – 2.2 (CH3), 18.1 (Cq), 18.3 (Cq),
18.6 (Cq), 19.3 (CH3), 26.3 (C(CH3)3), 26.5 (C(CH3)3), 26.7
(C(CH3)3), 28.6 (CH3), 63.0 (CH2), 73.3 (CH), 73.9 (CH), 75.5
(CH), 76.3 (CH), 98.8 (Cq), 124.4 (CH), 131.0 (Cq).
ν~ (cm-1): 2954.6 (m), 2929.5 (m), 2891.6 (w), 2856.3 (m), 1472.6
IR
(w), 1462.9 (w), 1380.2 (w) 1371.0 (w), 1251. (m), 1156.8 (m),
1112.7 (m), 1067.8 (s), 1013.4 (m), 832.7 (s), 775.6 (s).
Massenanalyse
m/z (%): 485.3 (2), 443.3 (78), 349.2 (17), 311.2 (75), 288.2 (36),
285.2 (37), 270.2 (32), 231.2 (17), 212.1 (82), 155.0 (100), 147.0
(30), 73.0 (46).
C28H58O5Si3
[559.01]
(6R,7S,8R,8aR)-6,7,8,8a-Tetrahydro-2,2-dimethyl-4H-benzo[d][1,3]dioxin-6,7,8-triol (259)
Darstellung: 280 mg (0.50 mmol) Tri-TBS-Ether 265 werden in 5 mL
O
trockenem THF bei – 78 °C vorgelegt und mit 3 mL TBAF-Lösung (1 M
O
in THF) versetzt. Die Lösung wird über 16 Stunden auf Raumtemperatur
HO
OH
OH
259
erwärmt. Nach Ende der Reaktion (Kontrolle per DC) wird die
Reaktionsmischung nach Zusatz von 50 µL NH4Cl-Lösung auf Kieselgel
aufgezogen und per Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat / Methanol 9:1 v/v) gereinigt.
Erhalten werden 120 mg eines blassgelben Feststoffes, der erhebliche Anteile eines Tetrabutylammoniumsalzes enthält. Nach erneuter chromatographischer Aufreinigung (SiO2,
Ethylacetat / Methanol 9:1 v/v) werden 90 mg (83 %) eines farblosen Feststoffs gewonnen.
DC
Rf = 0.32 (Ethylacetat / Methanol 9:1 v/v)
Drehwert
[α ]22D = – 116.2 (c = 1.0 in MeOH)
mp
155.7 – 157.0 °C
1
(400 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 1.36 (s, 3H, CH3), 1.52 (s,
3H, CH3), 3.38 (dd, J = 10.5, 7.6 Hz, 1H, CH), 3.49 (dd, J = 10.5,
7.7 Hz, 1H, CH), 4.08 (m, 2H, CH, CHH), 4.38 (dm, J = 7.6 Hz, 1H,
CH), 4.48 (d"q", J = 13.8, 1.7 Hz, 1H, CHH), 5.37 (m, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 20.2 (CH3), 28.6 (CH3),
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
177
63.5 (CH2), 73.2 (CH), 73.7 (CH), 74.9 (CH), 77.0 (CH), 100.4 (Cq),
123.8 (CH), 133.2 (Cq).
ν~ (cm-1): 3366.6 (bm), 2991.7 (w), 2857.9 (w), 1472.6 (w), 1462.9
IR
(w), 1380.5 (m), 1273.5 (m), 1227.0 (m), 1196.8 (s), 1156.8 (m),
1103.7 (s), 1050.7 (ss), 1001.3 (ss), 851.4 (s).
Massenanalyse
m/z (%): 201.0 (56) [M–CH3•]+, 156.0 (100) [M–(CH3)CHOH]•+,
141.0 (16), 122.9 (32), 97.9 (97), 95.0 (39), 59.0 (72), 43.2 (52).
HRMS
berechnet für [M–CH3•]+ (C9H13O5): 201.0763; gefunden: 201.0767.
C10H16O5
[216.23]
(7R,8R,8aR)-8,8a-Dihydroxy-2,2-dimethyl-4H-benzo[d][1,3]dioxin-6(7H)-on (267)
Darstellung: 8 mg (0.04 mmol) Allylalkohol 259 werden in 600 µL N,N-
O
DMF gelöst und mit 35 mg (0.09 mmol) Pyridiniumchlorchromat versetzt.
O
Die dunkelbraune Lösung wird nach 95 Minuten bei Raumtemperatur auf
HO
O
OH
267
eine mit trockenem Kieselgel gepackte Chromatographiesäule (Durchmesser 1 cm, Höhe 8 cm) aufgetragen. Das Produkt wird mit Ethylacetat
von der Säule gewaschen. Erhalten werden 3 mg (38 %) eines gelben Öls.
DC
Rf = 0.60 (Ethylacetat / Methanol 9:1 v/v)
Drehwert
[α ]22D = – 136.5 (c = 0.8 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 1.47 (s, 3H, CH3), 1.57 (s, 3H,
CH3), 3.03 (bs, 1H, OH), 3.70 (bs, 1H, OH), 3.92 (dd, J = 10.7,
8.2 Hz, 1H, CH), 4.12 (d, J = 10.7 Hz, 1H, CH), 4.46 (d"t", J = 16.6,
1.9 Hz, 1H, CHH), 4.55 (d"t", J = 16.6, 1.5 Hz, 1H, CHH), 4.63
(d"q", J = 8.2, 1.8 Hz, 1H, CH), 5.94 ("q", J = 1.8 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 22.4 (CH3), 25.3 (CH3), 61.4
(CH2), 71.2 (CH), 76.38 (CH), 76.41 (CH), 101.0 (Cq), 119.1 (CH),
160.3 (Cq), 195.9 (CO).
ν~ (cm-1): 3438.2 (bm), 2990.9 (w) 2854.0 (w), 1683.0 (ss), 1379.0
(m), 1220.2 (s), 1159.0 (m), 1116.3 (ss), 1062.8 (s), 1020.9 (s),
866.7 (m).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 327 (– 0.96), 278 (+ 0.19), 230 (– 14.27);
(c = 1.75 × 10-4 M, CH3CN, 23 °C).
Massenanalyse
m/z (%): 214.0 (7) [M]•+, 199.0 (100) [M–CH3•]+, 196.0 (32) [M–
H2O]•+, 156.0 (43) [M–(CH3)2CO]•+, 153.9 (70) [M–
(CH3)2CHOH]•+, 138.0 (79) [M–H2O, (CH3)2CO]•+, 126.9 (28),
111.0 (30), 95.9 (65), 68.0 (38), 59.1 (57), 43.1 (69).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C10H14O5): 214.0841; gefunden: 214.0840.
C10H14O5
[214.22]
178
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(4R,5S,6R)-4,5,6-Trihydroxy-3-(hydroxymethyl)cyclohex-2-enon (Valienon, 8)
Darstellung: 7 mg (0.03 mmol) des Acetonids 267 werden in 2 mL
HO
Methanol und 1 mL Wasser gelöst und mit 50 µL (0.67 mmol)
HO
Trifluoressigsäure versetzt. Nach 5 Stunden bei Raumtemperatur wird
HO
O
OH
Valienon, 8
nach Zusatz von 3 mL Toluen unter vermindertem Druck eingeengt, und
das Rohprodukt per Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat / Methanol
4:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 3 mg (50 %) eines braunen Feststoffs,
der keine NMR-detektierbaren Verunreinigungen enthält.
DC
Rf = 0.60 (Ethylactat / Methanol 2:1 v/v)
1
(400 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 3.61 (dd, J = 10.8, 8.3 Hz,
1H, CH), 4.03 (d, J = 10.8 Hz, 1H, CH), 4.31 – 4.39 (m, 2H, CH,
CHH), 4.51 (d"t", J = 18.2, 1.6 Hz, 1H, CHH), 6.16 ("q", J = 2.0 Hz,
1H).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 62.0 (CH2), 73.7 (CH), 78.0
(CH), 79.4 (CH), 121.4 (CH), 168.0 (Cq), 199.6 (CO).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 322 (– 0.5), 272 (0.0), 241 (– 2.3), 209 (+ 1.94), 205
(+ 1.88); (c = 1.75 × 10-4 M, CH3CN, 23 °C).
C7H10O5
[214.22]
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
5.2.5
179
Einzelreaktionen ausgehend von 3,4-trans-CHD (5)
(1R,4R,5R,6R)-4,5-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-7-oxabicyclo[4.1.0]hept-2-en-2carbonsäuremethylester (206)
CO2Me
Darstellung: 104 mg (0.26 mmol) Dien 185 werden in einer Mischung
von 2 mL Acetonitril, 0.8 mL wässriger NatriumethylendiamintetraO
OTBS
OTBS
196
acetatlösung (Na2-EDTA) (0.4 mM) und 0.4 mL (4.5 mmol) 1,1,1Trifluoraceton bei 0 °C vorgelegt. Es werden 250 mg (3.9 mmol)
NaHCO3 und 1.6 g (2.6 mmol) Caro´sche Säure (ALDRICH, Steinheim,
Deutschland) zugesetzt. Die Suspension wird über 45 Minuten bei 0 °C gerührt. Es werden
20 mL Chloroform und 6 g wasserfreies Natriumsulfat zugegeben, die Suspension wird
filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum von flüchtigen Bestandteilen befreit. Das Rohprodukt, welches nach 1H-NMR das Edukt, 206 und 207 im Verhältnis 4:5:2 enthält, wird
mittels Flashchromatographie (SiO2, Isohexan / Ethylacetat 12:1 v/v) gereinigt. Erhalten
werden 44 mg einer Produktmischfraktion und 15 mg reines 206 als farbloses Öl. Damit
ergibt sich eine kombinierte Ausbeute für 206 und 207 von 86 % bezogen auf einen Umsatz
von 64 %.
DC
Rf = 0.28 (Isohexan / Ethylacetat 12:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 79.3 (c = 1.1 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.12 (s, 6H, 2 × CH3), 0.15 (s,
3H, CH3), 0.18 (s, 3H, CH3), 0.92 (s, 9H, C(CH3)3), 0.97 (s, 9H,
C(CH3)3), 3.46 (d, J = 4.3 Hz, 1H, CH), 3.82 (s, 3H, CH3), 3.92 (dd,
J = 7.6, 1.1 Hz, 1H, CH), 3.99 (dd, J = 4.3, 2.4 Hz, 1H, CH), 4.32
(dd, J = 7.6, 1.5 Hz, 1H, CH), 6.82 ("t", J = 2.1 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.6 (CH3), – 4.2 (CH3), – 4.0
(CH3), – 3.7 (CH3), 18.2 (Cq), 18.4 (Cq), 26.16 (C(CH3)3), 26.20
(C(CH3)3), 49.2 (CH), 52.4 (CH3), 55.1 (CH), 71.3 (CH), 73.9 (CH),
127.3 (Cq), 147.3 (CH), 165.5 (CO).
GCMS
Rt = 13.96 min; m/z (%): 398 (3) [M–"O"]•+, 385 (11), 357 (20) [M–
tBu•]+, 325 (11) [M–CH3OH, tBu•]+, 225 (29), 147 (100), 73 (82).
Massenanalyse
m/z (%): 414.3 (0.5) [M]•+, 398.3 (4) [M–"O"]•+, 385.3 (37), 357.2
(70) [M–tBu•]+, 325.2 (17) [M–CH3OH, tBu•]+, 225.1 (28), 147.1
(100), 73.1 (60).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C20H38O5Si2): 414.2258; gefunden: 414.2259.
C20H38O5Si2
[414.68]
180
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(5aR,8S,9R,9aS)-8-Acetoxy-9-brom-5a,8,9,9a-tetrahydrobenzo[f][1,3,5]trioxepin-7-carbonsäuremethylester (242)
CO2Me
AcO
O
Br
O
O
242
Darstellung: 95 mg (0.45 mmol) Dien 198 werden in einer Mischung von
5 mL Dichlormethan und 3 mL Eisessig vorgelegt und mit 124 mg
(0.90 mmol) N-Bromacetamid versetzt. Zu dieser Lösung werden 200 mg
(0.90 mmol) Silbertrifluoracetat, gelöst in 2 mL Eisessig, zugetropft. Zu
der sich langsam trübenden Lösung werden nach 2 Stunden bei Raumtemperatur 20 mL Natriumhydrogencarbonatlösung zugesetzt. Nach Neu-
tralisation der Essigsäure werden die Phasen getrennt und die wässrige Phase mit 10 mL
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat
getrocknet und unter vermindertem Druck aufkonzentriert. Das Produkt wird per Flashchromatographie (SiO2, Isohexan / Ethylacetat 5:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 79 mg
(50 %) eines farblosen Feststoffs.
DC
Rf = 0.31 (Isohexan / Ethylacetat 4:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = + 16.2 (c = 1.2 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 2.07 (s, 3H, CH3), 3.76 (dd,
J = 7.7, 2.9 Hz, 1H, CH), 3.78 (s, 3H, CH3), 4.36 ("t", J = 2.7 Hz,
1H, CH), 4.53 (dd, J = 7.7, 2.0 Hz, 1H, CH), 4.96 (d, J = 5.7 Hz, 1H,
CHH), 4.98 (d, J = 6.1 Hz, 1H, CHH), 5.08 (d, J = 5.7 Hz, 1H,
CHH), 5.13 (d, J = 6.1 Hz, 1H, CHH), 5.97 (dd, J = 2.6, 1.0 Hz, 1H,
CH), 7.11 (d, J = 2.3 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 20.9 (CH3), 48.4 (CH), 52.6
(CH3), 69.9 (CH), 75.2 (CH), 76.3 (CH), 92.0 (CH2), 92.9 (CH2),
126.9 (Cq), 141.7 (CH), 164.7 (CO), 169.5 (CO).
GCMS
Rt = 13.11 min; m/z (%): 321 (1) [M–CH3O•]+, 319 (1) [M–CH3O•]+,
292 (1) [M–AcOH]•+, 290 (1) [M–AcOH]•+, 271 (9) [M–Br•]+, 211
(14) [M–AcOH, Br•]+, 181 (100) [M–AcOH, CH2O, Br•]+, 169 (13),
149 (21), 107 (19).
Massenanalyse
m/z (%): 321.1 (1) [M–OCH3•]+, 319.1 (1) [M–OCH3•]+, 292.1 (1)
[M–AcOH]•+, 290.1 (1) [M–AcOH]•+, 271.1 (10) [M–Br•]+, 211.1
(14) [M–Br•]+, 181.1 (100) [M–CH2O, AcOH, Br•]+, 169.1 (12),
149.1 (21), 127.1 (8), 107.1 (13), 59.1 (6).
C12H15BrO7
[351.15]
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
181
(5aS,6R,7S,9aR)-6-Brom-5a,6,7,9a-tetrahydro-8-(hydroxymethyl)benzo[f][1,3,5]trioxepin-7ol (243)
OH
Darstellung: 75 mg (0.21 mmol) Methylester 242 werden in 10 mL
Dichlormethan bei – 78 °C vorgelegt und tropfenweise mit 1.1 mL
HO
(1.1 mmol) einer 1
O
Br
O
O
243
M
Lösung von DIBAL-H in Dichlormethan versetzt.
Nach 90 Minuten wird auf Raumtemperatur erwärmt, und je 2 mL
Methanol und 2
M
Salzsäure werden zugegeben. 30 Minuten nach Zugabe
von 10 mL einer wässrigen 0.2
M
Dinatriumtartratlösung werden die
Phasen getrennt, und die wässrige Phase wird dreimal mit je 10 mL Ethylacetat extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck aufkonzentriert. Das Rohprodukt wird per Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat / Petrolether 1:2 v/v) gereinigt. Erhalten werden 24 mg (35 %) eines farblosen Feststoffs, der für eine Einkristall-Röntgenstrukturuntersuchung aus Chloroform umkristallisiert
wird.
DC
Rf = 0.30 (Cyclohexan / Ethylacetat 1:2 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 13.0 (c = 0.84 in MeOH)
mp
138.0 – 139.5 °C
1
(400 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 3.82 (dd, J = 7.6, 2.8 Hz,
1H, CH), 4.13 (m, 2H, 2 × CHH), 4.30 ("t", J = 2.5 Hz, 1H, CH),
4.35 (m, 1H, CH), 4.42 (d, J = 2.3 Hz, 1H, CH), 4.91 (d, J = 5.7 Hz,
1H, CHH), 4.98 (d, J = 6.3 Hz, 1H, CHH), 5.01 (d, J = 5.7 Hz, 1H,
CHH), 5.05 (d, J = 6.3 Hz, 1H, CHH), 5.76 ("q", J = 1.7 Hz, 1H,
CH).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 54.8 (CH), 63.4 (CH2), 71.6
(CH), 77.0 (CH), 78.5 (CH), 92.7 (CH2), 93.7 (CH2), 124.3 (CH),
139.3 (Cq).
Massenanalyse
m/z (%): 252.0 (4) [M–CH2O]•+, 250.0 (5) [M–CH2O]•+, 234.0 (10)
[M–CH2O, H2O]•+, 232.0 (12) [M–CH2O, H2O]•+, 221.0 (20) [M–
CH2O, CH3O•]+, 219.0 (22) [M–CH2O, CH3O•]+, 171.0 (83) [M–
Br•]+, 153.0 (24) [M–H2O, Br•]+, 141.0 (72) [M–2 × CH2O, Br•]+,
123.0 (100) [M–H2O, 2 × CH2O, Br•]+, 111.0 (88) [M–CH2O,
CH3OH, CO, Br•]+, 95.0 (79), 81.0 (67), 67.0 (85), 65.0 (67), 55.0
(96), 43.1 (63).
HRMS
berechnet für [M–CH2O]•+ (C8H1179BrO4): 249.9841; gefunden:
249.9838.
C9H13BrO5
[281.10]
182
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(5aS,6S,7R,9aR)-6-Epoxy-5a,6,7,9a-tetrahydrobenzo[f][1,3,5]trioxepin-8-carbonsäuremethylester (210) und (5aR,6S,7R,9aR)-6-Epoxy-5a,6,7,9a-tetrahydrobenzo[f][1,3,5]-trioxepin7-carbonsäuremethylester (211)
CO2Me
Darstellung: 104 mg (0.43 mmol) Dien 198 und 68 mg
MeO2C
O
(0.81 mmol) festes Natriumhydrogencarbonat werden bei
O
O
O
O
210
O
O
O
211
Raumtemperatur in 5 mL Dichlormethan vorgelegt und
mit 182 mg (≤ 0.74 mmol) mCPBA (≤ 70 %ig) versetzt.
Nach 16 Stunden wird abfiltriert und der Rückstand mit
5 mL Dichlormethan gewaschen. Die vereinigten Filtrate
werden unter vermindertem Druck aufkonzentriert und per Flashchromatographie (SiO2, Isohexan / Ethylacetat 4:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 73 mg (65 %) einer Mischung der
Epoxide 210 und 211 im Verhältnis 2:1 (1H-NMR).
Analytische Daten (210):
DC
Rf = 0.31 (Isohexan / Ethylacetat 4:1 v/v)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 3.66 (dd, J = 4.2, 1.0 Hz, 1H,
CH), 3.82 (s, 3H, CH3), 3.94 (dd, J = 7.9, 1.1 Hz, 1H, CH), 4.06 (dd,
J = 4.3, 2.4 Hz, 1H, CH), 4.35 (dd, J = 7.9, 1.9 Hz, 1H, CH), 4.90
(d, J = 6.1 Hz, 1H, CHH), 4.97 (d, J = 5.8 Hz, 1H, CHH), 5.05 (d,
J = 6.1 Hz, 1H, CHH), 5.14 (d, J = 5.8 Hz, 1H, CHH), 6.97 ("t",
J = 2.1 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 48.5 (CH), 52.5 (CH3), 53.2
(CH), 76.3 (CH), 79.0 (CH), 92.3 (CH2), 92.7 (CH2), 128.3 (Cq),
142.2 (CH), 165.1 (CO).
GCMS
Rt = 11.52 min; m/z (%): 228 (1) [M]•+, 210 (1) [M–H2O]•+, 198 (2)
[M–OCH2]•+, 180 (2) [M–H2O, OCH2]•+, 166 (42) [M–CO2, H2O]•+,
139 (100) [M–CO2CH3•, OCH2]+, 136 (52) [M–CO2, OCH2, H2O]•+,
125 (12), 109 (16) [M–CO2CH3•, 2 × OCH2]+, 72 (22).
C10H12O6
[228.20]
Analytische Daten (211):
DC
Rf = 0.31 (Isohexan / Ethylacetat 4:1 v/v)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 3.80 (s, 3H, CH3), 3.90 (m, 2H,
2 × CH), 4.22 (d"t", J = 8.2, 2.4 Hz, 1H, CH), 4.87 (d, J = 6.0 Hz,
1H, CHH), 4.95 (d, J = 6.0 Hz, 1H, CHH), 5.03 (d, J = 6.0 Hz, 1H,
CHH), 5.12 (d, J = 6.0 Hz, 1H, CHH), 5.97 (dd, J = 10.1, 1.6 Hz,
1H, CH), 6.35 (dd, J = 10.1, 2.9 Hz, 1H, CH).
H-NMR
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
13
C-NMR
183
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 53.0 (CH3), 54.8 (CH), 58.7
(Cq), 76.8 (CH), 78.7 (CH), 92.3 (CH2), 92.6 (CH2), 122.0 (CH),
133.9 (CH), 168.8 (CO).
GCMS
Rt = 11.05 min; m/z (%): 228 (1) [M]•+, 210 (1) [M–H2O]•+, 198 (1)
[M–OCH2]•+, 180 (2) [M–H2O, OCH2]•+, 166 (7) [M–CO2, H2O]•+,
139 (100) [M–CO2CH3•, OCH2]+, 125 (4), 109 (9) [M–CO2CH3•,
2 × OCH2]+, 81 (10).
C10H12O6
[228.20]
(1R,4R,5R,6S)-4,5-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-1,6-dihydroxycyclohex-2-encarbonsäuremethylester (228) und (3R,4R,5R,6R)-3,4-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (229)
MeO2C
OH
OH
CO2Me
HO
OTBS HO
OTBS
OTBS
OTBS
228
229
Darstellung: 297 mg (0.75 mmol) Dien 185 und
202 mg (1.5 mmol) 4-Methylmorpholin-4-oxid
(NMO) werden in 5 mL Aceton und 4 mL tertButanol vorgelegt und mit einer Lösung von
3 mg (1 mol%) Kaliumosmat(VI) in 1 mL Was-
ser versetzt. Nach zwei Stunden wird im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Das Rohprodukt enthält laut 1H-NMR 228 und 229 im Verhältnis 4:1. Per Flashchromatographie
(SiO2, Isohexan / Ethylacetat 12:1 v/v) werden 227 mg (70 %) einer Mischung von 228 und
229 im Verhältnis 4:1 getrennt.
Analytische Daten 228:
DC
Rf = 0.34 (Cyclohexan / Ethylacetat 8:1 v/v)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.05 (s, 3H, CH3), 0.06 (s, 3H,
CH3), 0.09 (s, 3H, CH3), 0.12 (s, 3H, CH3), 0.85 (s, 18 H,
2 × C(CH3)3), 1.62 (bs, 1H, OH), 2.75 (bs, 1H., OH), 3.76 (s, 3H,
CH3), 4.00 (dd, J = 3.2, 2.3 Hz, 1H, CH), 4.11 (m, 1H, CH), 4.29 (d,
J = 2.3 Hz, 1 H, CH), 5.82 (m, 2H, 2 × CH).
H-NMR
13
C-NMR
C20H40O6Si2
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.8 (CH3), – 4.7 (CH3), – 4.5
(CH3), – 4.3 (CH3), 17.9 (Cq), 18.0 (Cq), 25.8 (2 × C(CH3)3), 53.0
(CH3), 68.4 (CH), 69.6 (CH), 74.8 (Cq), 76.2 (CH), 129.3 (CH),
129.7 (CH), 172.2 (CO).
[432.70]
184
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
Analytische Daten 229:
DC
Rf = 0.34 (Cyclohexan / Ethylacetat 8:1 v/v)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.10 (CH3), 0.11 (CH3), 0.12
(CH3), 0.16 (CH3), 0.89 (s, 9H, C(CH3)3), 0.91 (s, 9H, C(CH3)3),
3.11 (bd, J = 9.5 Hz, 1H, OH), 3.70 (bs, 1H, OH), 3.79 (s, 3H, CH3),
3.91 (m, 2H, 2 × CH), 4.25 (dd, J = 4.4, 3.5 Hz, 1H, CH), 4.46 (d,
J = 4.0 Hz, 1H, CH), 5.27 (m, 1 H, CH), 6.79 (d, J = 4.5 Hz, 1H,
CH).
H-NMR
C20H40O6Si2
[432.70]
(3aR,6R,7R,7aS)-6,7-Bis-(tert-butyldimethylsilanoxy)-2,2-dimethyl-3a,6,7,7a-tetrahydrobenzo[d][1,3]dioxol-3a-carbonsäuremethylester (230) und (3aR,6R,7R,7aR)-6,7-Bis-(tertbutyldimethylsilanoxy)-2,2-dimethyl-3a,6,7,7a-tetrahydrobenzo[d][1,3]dioxol-4-carbonsäuremethylester (231)
MeO2C
O
CO2Me
O
OTBS
OTBS
230
O
O
OTBS
OTBS
231
Darstellung: 133 mg (0.31 mmol) der Diole
228 und 229 im Verhältnis 4 : 1 werden in
5 mL Dichlormethan gelöst und mit 1.4 mL
(11 mmol) 2,2-Dimethoxypropan und drei
Tropfen Trifluoressigsäure versetzt. Nach
einer Stunde bei Raumtemperatur wird mit 5 mL halbkonzentrierter NaHCO3 neutralisiert.
Die Phasen werden getrennt, und die wässrige Phase wird zweimal mit je 10 mL Ethylacetat
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet und
unter vermindertem Druck eingeengt. Nach Trennung durch Flashchromatographie (SiO2,
Isohexan / Ethylacetat 17:1 v/v) werden 91 mg (63 %) 230 als farbloser Wachs und 16 mg
(10 %) 231 als farbloses Öl erhalten.
Analytische Daten 230:
DC
Rf = 0.36 (Isohexan / Ethylacetat 17:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 25.7 (c = 1.2 in CHCl3)
mp
102.0 – 104.0 °C
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.120 (s, 3H, CH3), 0.124 (s,
3H, CH3), 0.15 (s, 3H, CH3), 0.16 (s, 3H, CH3), 0.91 (s, 9H,
C(CH3)3), 0.94 (s, 9H, C(CH3)3), 1.40 (s, 3H, CH3), 1.42 (s, 3H,
CH3), 3.78 (s, 3H, CH3), 3.96 (dd, J = 8.0, 2.4 Hz, 1H, CH), 4.40
(d"t", J = 8.0, 2.0 Hz, 1H, CH), 4.50 ("t", J = 2.1 Hz, 1H, CH), 5.53
(d"t", J = 10.2, 1.9 Hz, 1H, CH), 5.73 (dd, J = 10.2, 1.6 Hz, 1H,
CH).
H-NMR
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
13
C-NMR
185
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.74 (CH3), – 4.66 (CH3),
– 3.9 (CH3), – 3.6 (CH3), 18.3 (Cq), 18.5 (Cq), 26.16 (C(CH3)3),
26.19 (C(CH3)3), 26.3 (CH3), 27.8 (CH3), 53.0 (CH3), 69.2 (CH),
74.3 (CH), 79.8 (CH), 82.1 (Cq), 110.9 (Cq), 124.2 (CH), 134.8
(CH), 170.4 (CO).
GCMS
Rt = 13.47 min; m/z (%): 457 (4) [M–CH3•]+, 415 (16) [M–
C(CH3)3•]+, 397 (8) ) [M–(CH2)CO(CH3)•, H2O]+, 357 (100), 314
(37), 225 (34), 193 (19), 147 (44), 73 (41).
Massenanalyse
m/z (%): 457.3 (2) [M–CH3•]+, 357.2 (100), 314.3 (31), 225.1 (38),
147.1 (53), 73.1 (36).
HRMS
berechnet für [M–CH3•]+ (C22H41O6Si2): 457.2436; gefunden:
457.2444.
C23H44O6Si2
[472.76]
Analytische Daten 231:
DC
Rf = 0.30 (Isohexan / Ethylacetat 17:1 v/v)
Drehwert
[α ]25D = – 40.8 (c = 1.3 in CHCl3)i
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.14 (s, 6H, 2 × CH3), 0.15 (s,
3H, CH3), 0.17 (s, 3H, CH3), 0.93 (s, 9H, C(CH3)3), 0.95 (s, 9H,
C(CH3)3), 1.35 (s, 3H, CH3), 1.37 (s, 3H, CH3), 3.71 (dd, J = 8.2,
2.3 Hz, 1H, CH), 3.80 (s, 3H, CH3), 4.47 (dd, J = 5.2, 2.3 Hz, 1H,
CH), 4.55 (d"t", J = 8.2, 1.7 Hz, 1H, CH), 4.95 (dd, J = 5.2, 1.8 Hz,
1H, CH), 6.67 (d, J = 1.6 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
i
C-NMR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.7 (CH3), – 4.6 (CH3), – 3.9
(CH3), – 3.5 (CH3), 18.3 (Cq), 18.6 (Cq), 26.17 (C(CH3)3), 26.23
(C(CH3)3), 26.3 (CH3), 27.9 (CH3), 52.4 (CH3), 69.5 (CH), 73.0
(CH), 74.7 (CH), 77.1 (CH), 109.9 (Cq), 129.3 (Cq), 142.7 (CH),
166.4 (CO).
GCMS
Rt = 13.90 min; m/z (%): 457 (2) [M–CH3•]+, 397 (8) [M–
(CH2)CO(CH3)•, H2O]+, 357 (38), 325 (32), 225 (61), 215 (78), 147
(100), 73 (83).
Massenanalyse
m/z (%): 472.3 (2) [M]•+, 457.3 (4) [M–CH3•]+, 441.3 (2) [M–
CH3O•]+, 357.2 (80), 325.2 (21), 225.1 (45), 215.2 (100), 147.1 (79),
73.1 (55).
HRMS
berechnet für [M]•+ (C23H44O6Si2): 472.2676; gefunden: 472.2665.
C23H44O6Si2
[472.76]
Der Drehwert wurde von einer Probe ermittelt, die zu 9 % (1H-NMR) Verbindung 230 enthielt. Es wurde eine
Additivität der optischen Aktivitäten unterstellt und der auf Verbindung 230 zurückzuführende Anteil am
Gesamtdrehwert herausgerechnet.
186
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(3aR,6R,7S,7aS)-3a,6,7,7a-Tetrahydro-6,7-dihydroxy-2,2-dimethylbenzo[d][1,3]dioxol-3acarbonsäuremethylester (232)
Darstellung: 64 mg (0.14 mmol) Bis-TBS-Ether 230 werden bei 0 °C in
MeO2C
O
2 mL trockenem THF vorgelegt und tropfenweise mit 680 µL
O
(0.68 mmol) TBAF (1
OH
OH
232
M
Lösung in THF) versetzt. Die Reaktion wird
nach einer Stunde durch Zugabe von 3 Tropfen gesättigter NH4ClLösung abgebrochen, und die Substanzmischung auf Kieselgel aufgezogen. Nach Reinigung per Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat /
Isohexan 5:1 v/v) werden 14 mg (42 %) eines farblosen Feststoffs erhalten.
DC
Rf = 0.54 (Ethylacetat)
Drehwert
[α ]24D = + 58.0 (c = 0.4 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 1.40 (s, 3H, CH3), 1.44 (s, 3H,
CH3), 3.58 (bd, J = 5.3 Hz, 1H, OH), 3.69 (bd, J = 7.5 Hz, 1H, OH),
3.80 (s, 3H, CH3), 3.88 (m, 1H, CH), 4.40 (m, 1H, CH), 4.59 (dd,
J = 2.4, 1.6 Hz, 1H, CH), 5.61 (ddd, J = 10.2, 2.3, 1.6 Hz, 1H, CH),
5.88 (dd, J = 10.2, 1.7 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 26.3 (CH3), 27.6 (CH3), 53.3
(CH3), 68.5 (CH), 73.6 (CH), 78.6 (CH), 82.4 (Cq), 111.5 (Cq),
125.4 (CH), 132.5 (CH), 170.7 (CO).
Massenanalyse
m/z (%): 229.1 (100) [M–CH3•]+, 185.2 (63) , 157.1 (63), 139.1 (67),
137.1 (74), 109.1 (98), 59.2 (51).
HRMS
berechnet für
229.0711.
C11H16O6
[244.24]
[M–CH3•]+
(C10H13O6):
229.0707;
gefunden:
(3aR,6R,7S,7aS)-6,7-Dihydroxy-2,2-dimethyl-3a,6,7,7a-tetrahydrobenzo[d][1,3]dioxol-4carbonsäuremethylester (233)
CO2Me
Darstellung: 27 mg (0.06 mmol) Bis-TBS-Ether 231 werden bei 0 °C
in 1 mL trockenem THF vorgelegt und tropfenweise mit 130 µL
O
O
OH
OH
233
(0.13 mmol) TBAF (1
M
Lösung in THF) versetzt. Die Reaktion wird
nach drei Stunden durch Zugabe von 5 mL gesättigter NH4Cl-Lösung
und 5 mL Ethylacetat abgebrochen. Die Phasen werden getrennt und
die organische Phase dreimal mit je 4 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet, aufkonzentriert und per Flashchromatographie
(SiO2, Ethylacetat) gereinigt. Erhalten werden 6.8 mg (49 %) eines farblosen Feststoffs.
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
187
DC
Rf = 0.24 (Ethylacetat)
Drehwert
[α ]24D = – 22.6 (c = 0.7 in CHCl3)
mp
147.0 – 150.0 °C
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 1.36 (s, 3H, CH3), 1.41 (s, 3H,
CH3), 2.87 (bs, 2H, 2 × OH), 3.61 (dd, J = 8.7, 2.8 Hz, 1H, CH),
3.81 (s, 3H, CH3), 4.53 (dm, J = 8.7 Hz, 1H, CH), 4.62 (dd, J = 5.9,
3.0 Hz, 1H, CH), 5.11 (dd, J = 5.9, 1.6 Hz, 1H, CH), 6.93 (d,
J = 1.7 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 25.9 (CH3), 27.4 (CH3), 52.5
(CH3), 68.7 (CH), 72.8 (CH), 74.4 (CH), 75.1 (CH), 110.3 (Cq),
129.7 (Cq), 141.7 (CH), 166.1 (CO).
ν~ (cm-1): 3424.3 (bm), 2988.4 (w), 2934.9 (w), 1720.0 (s), 1655.5
(w), 1437.8 (m), 1372.6 (m), 1250.0 (bs), 1163.2 (m), 1100.2 (s),
1069.6 (s), 1039.4 (s), 1020.3 (s), 888.2 (m), 857.2 (m), 751.5 (bm),
721.7 (w).
C11H16O6
[244.24]
188
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
Synthese von ent-Streptol (ent-58), ent-Valienon (ent-8) und Studien zur
Synthese von ent-Valienamin (ent-64)
5.2.6
(3R,4R,5R,6S)-3,4,5,6-Tetrahydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (225)
CO2Me
OH
HO
OH
Darstellung: a) 400 mg (2.35 mmol) 2,3-trans-CHD-Methylester 196 und
636 mg (4.7 mmol) 4-Methylmorpholin-4-oxid werden in 50 mL isoButanol / Aceton / Wasser (10:9:1 v/v/v) gelöst und mit einer Spatelspitze
OH
Osmiumtetroxid versetzt. Die sich rasch schwarz färbende Lösung wird
225
nach einer Woche bei Raumtemperatur mit einem Spatel Natriumsulfit
versetzt und bis zur Trockene eingeengt. Das Rohprodukt wird chromatographisch (SiO2,
Ethylacetat / Methanol 4:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 134 mg (28 %, de = 67 %) 225 als
hygroskopischer Feststoff.
b) 100 mg Bis-TBS-Ether 227 (0.23 mmol) werden bei 0 °C in 5 mL Acetonitril vorgelegt
und mit einigen Tropfen 40%iger Fluorwasserstofflösung versetzt. Nach 2 Stunden wird mit
gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung neutralisiert und unter vermindertem Druck bis
zur Trockene eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt wurde ohne weitere Auftreinigung mittels
1
H-NMR untersucht.
DC
Rf = 0.61 (Ethylacetat / Methanol 4:1 v/v)
1
(300 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 3.76 (dd, J = 7.5, 4.1 Hz,
1H, CH), 3.81 (s, 3H, CH3), 4.00 (dd, J = 7.5, 4.9 Hz, 1H, CH), 4.32
(d, J = 4.9 Hz, 1H, CH), 4.40 ("t", J = 4.0 Hz, 1H, CH), 6.78 (d,
J = 4.0 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 52.4 (CH3), 67.1 (CH), 70.3
(CH), 71.4 (CH), 72.8 (CH), 134.0 (Cq), 139.0 (CH), 168.3 (CO).
C11H16O6
[244.24]
(3R,4R,5S,6S)-5,6-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-3,4-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (227)
CO2Me
OTBS
HO
OTBS
Darstellung: 1.54 g (3.9 mmol) Dien 160 und 785 mg (5.8 mmol) 4-
Methylmorpholin-4-oxid (NMO) werden in 10 mL Aceton und 9 mL
tert-Butanol vorgelegt und mit einer Lösung von 4 mg (11 µmol)
OH
Kaliumosmat(VI) in 2 mL Wasser versetzt, wonach sich die Lösung
227
schnell gelbbraun färbt. Nach 48 h bei Raumtemperatur werden 760 mg
(5.8 mmol) NMO nachdosiert. Nach weiteren 48 h bei Raumtemperatur wird auf Kieselgel
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
189
aufgezogen und per Flashchromatographie (SiO2, Isohexan / Ethylacetat 10:1 v/v) gereinigt.
Isoliert werden 640 mg (80 %) eines farblosen Öls.
DC
Rf = 0.23 (Isohexan / Ethylacetat 10:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 14.0 (c = 0.9 in CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.09 (s, 3H, CH3), 0.10, (s, 3H,
CH3), 0.11 (s, 3H, CH3), 0.24 (s, 3H, CH3), 0.84 (s, 9H, C(CH3)3),
0.87 (s, 9H, C(CH3)3), 2.92 (d, J = 11.2 Hz, 1H, OH), 3.78 (s, 3H,
CH3), 3.93 (m, 1H, CH), 4.04 (d, J = 9.5 Hz, 1H, OH), 4.21 (dd,
J = 4.2, 2.9 Hz, 1H, CH), 4.37 (m, 1H, CH), 4.46 (m, 1H, CH), 6.89
(dd, J = 2.2, 1.6 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.81 (CH3), – 4.76 (2 × CH3),
– 4.69 (CH3), 18.0 (Cq), 18.2 (Cq), 25.77 (C(CH3)3), 25.81
(C(CH3)3), 52.1 (CH3), 66.8 (CH), 68.1 (CH), 70.1 (CH), 70.9 (CH),
129.3 (Cq), 141.6 (CH), 168.5 (CO).
Rt = 13.75 min; m/z (%): 432 (1) [M]•+, 417 (1) [M–CH3•]+, 400 (1)
[M–CH3OH]•+, 399 (1) [M–H2O, CH3•]+, 375 (76) [M–tBu•]+, 357
(100) [M–H2O, tBu•]+, 301 (6) [M–OTBS•]+, 283 (6) [M–H2O,
OTBS•]+, 271 (25) [M–CO, H2O, OTBS•]+, 243 (16), 73 (40).
ν~ (cm-1): 3456.3 (bw), 2953.0 (m), 2930.2 (m), 2896.6 (w), 2858.4
GCMS
IR (KBr)
(m), 1720.1 (s), 1251.8 (s), 1049.8 (ss), 833.1 (ss), 777.8 (ss).
Massenanalyse
m/z (%): 432.2 (0.4) [M]•+, 417.2 (2) [M–CH3•]+, 399 (1.7) [M–
H2O,CH3•]+, 375.1 (76) [M–tBu•]+, 357.1 (100) [M–H2O,tBu•]+,
271.1 (22), 243.0 (18), 225.0 (14), 215.0 (11), 197.0 (11), 183.0 (9),
147.0 (14), 75.0 (20), 73.0 (35).
C20H40O6Si2
[432.70]
(2S,3S,4S)-3,4-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-2-hydroxycyclohex-5-enon-5-carbonsäuremethylester (253)
CO2Me
OTBS
O
OTBS
Darstellung: a) 870 mg (2.0 mmol) Diol 227 werden unter Argon in
20 mL absolutiertem THF vorgelegt, mit 1.35 g (5.9 mmol) 2,3-Dichlor5,6-dicyanobenzochinon versetzt und über 12 Stunden refluxiert. Das
OH
Rohprodukt wird auf Kieselgel aufgezogen und chromatographisch
253
(SiO2, Isohexan / Ethylacetat 17:1 → 5:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden
699 mg (68.5 %) eines gelben Öls.
b) 145 mg (0.34 mmol) 227 werden in 8 mL Dichlormethan gelöst und mit 1.07 g (12 mmol)
aktiviertem Braunstein (Fluka) versetzt. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wird die
Suspension filtriert, die Salze mit 10 mL Dichlormethan gewaschen, und die vereinigten
organischen Phasen unter vermindertem Druck eingeengt. Das erhaltene gelbe Öl wird
190
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
chromatographisch (SiO2, Ethylacetat / Isohexan 1:12 v/v) gereinigt. Erhalten werden 51 mg
(35 %) eines gelben Öls.
DC
Rf = 0.55 (Isohexan / Ethylacetat 10:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 6.7 (c = 1.0, CHCl3)
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.09 (s, 6H, 2 × CH3), 0.14, (s,
3H, CH3), 0.26 (s, 3H, CH3), 0.81 (s, 9H, C(CH3)3), 0.88 (s, 9H,
C(CH3)3), 3.86 (dd"t", J = 9.9, 3.8, 1.2 Hz, 1H, CH), 3.87 (s, 3H,
CH3), 4.21 (d, J = 9.9 Hz, 1H, OH), 4.26 ("t", J = 3.5 Hz, 1H, CH),
4.71 (dd, J = 3.2, 1.3 Hz, 1H, CH), 6.80 (d, J = 1.2 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.8 (2 × CH3), – 4.74 (CH3),
– 4.72 (CH3), 18.0 (Cq), 18.1 (Cq), 25.7 (C(CH3)3), 25.8 (C(CH3)3),
52.9 (CH3), 68.1 (CH), 71.1 (CH), 74.4 (CH), 132.0 (Cq), 143.1
(CH), 166.3 (CO), 197.2 (CO).
GCMS
Rt = 13.15 min; m/z (%): 415 (4) [M–CH3•]+, 399 (2), 373 (100) [M–
tBu•]+, 355 (20) [M–H2O, tBu•]+, 341 (100) [M–CH3OH, tBu•]+, 323
(25) [M–H2O, CH3OH, tBu•]+, 313 (17), 285 (13), 269 (38), 256
(50), 241 (100), 213 (100), 199 (65), 197 (44), 181 (33), 147 (49),
89 (36), 75 (96), 73 (100).
C20H38O6Si2
[430.68]
(1R,2R,5S,6S)-5,6-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-4-hydroxymethyl-cyclohex-3-en-1,2-diol
(251)
OH
OTBS
HO
OTBS
OH
251
Darstellung: 200 mg (0.46 mmol) Diol 227 werden unter Stickstoff-
atmosphäre bei – 78 °C in 5 mL Dichlormethan vorgelegt und
tropfenweise mit 2 mL (2 mmol) einer 1
M
Lösung von DIBAL-H in
Dichlormethan versetzt. Die blassgelbe Lösung wird nach 3 Stunden
mit je 2 mL Methanol und 2
M
Salzsäure versetzt. Nach Zugabe von
5 mL Wasser werden nach 30 Minuten die klaren Phasen getrennt
und die wässrige Phase zweimal mit je 5 mL Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck bis zur
Trockene eingeengt und durch Umkristallisieren in Isohexan / Ethylacetat (20:1 v/v)
gereinigt. Das Produkt wird in Form farbloser Nadeln in einer Ausbeute von 173 mg (92 %)
erhalten.
DC
Rf = 0.38 (Isohexan / Ethylacetat 4:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = + 13.5 (c = 1.1 in CHCl3)
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
191
mp
110.5 – 112.0 °C
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.08 (s, 6H, 2 × CH3), 0.14 (s,
3H, CH3), 0.18 (s, 3H, CH3), 0.83 (s, 9H, C(CH3)3), 0.88 (s, 9H,
C(CH3)3), 1.82 (bs, 1H, OH), 2.85 (bd, J = 11.1 Hz, 1H, OH), 3.73
(d, J = 9.9 Hz, 1H, OH), 3.87 (d"t""t", J = 9.9, 4.3, 1.3 Hz, 1H, CH),
4.03 (m, 1H, CH), 4.09 (bs, 2H, CH2), 4.13 (dd, J = 4.3, 2.6 Hz, 1H,
CH), 4.27 (bd, J = 8.4 Hz, 1H, CH), 5.70 (d"t", J = 3.4, 1.3 Hz, 1H,
CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR (KBr)
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 5.0 (CH3), – 4.7 (CH3), – 4.6
(CH3), – 4.4 (CH3), 18.0 (2 × Cq), 25.7 (C(CH3)3), 26.8 (C(CH3)3),
64.1 (CH2), 66.4 (CH), 68.9 (CH), 70.7 (CH), 71.1 (CH), 127.1
(CH), 136.3 (Cq).
ν~ (cm-1): 3440.8 (bw), 2953.5 (m), 2929.6 (m), 2886.8 (w), 2858.3
(m), 1253.1 (m), 1105.3 (bm), 1038.2 (bs), 830.7 (ss), 775.3 (ss).
Massenanalyse
m/z (%): 375 (1), 357 (1), 329 (40), 255 (14), 243 (36), 197 (76),
169 (36), 155 (20), 75 (58), 73 (100).
Elementaranalyse berechnet C: 56.39 % H: 9.96 %, gefunden C: 56.10 % H: 9.84 %.
C19H40O5Si2
[404.69]
(1R,2R,3R,4S)-5-hydroxymethyl-cyclohex-5-en-1,2,3,4-tetraol (ent-Streptol, ent-58)
OH
OH
HO
OH
OH
ent-Streptol, ent-58
Darstellung: 52 mg (0.13 mmol) Bis-TBS-Ether 251 werden bei 0 °C
in 3 mL Acetonitril vorgelegt und mit 1.2 mL (1.2 mmol) TBAF (1M
in THF) versetzt. Nach 2.5 Stunden (DC-Kontrolle) wird mit gesättigter NaHCO3-Lösung neutralisiert, und flüchtige Bestandteile werden
unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wird per Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat / Methanol 3:1 v/v) gereinigt.
Erhalten werden 14 mg (62 %) eines farblosen Öls.
DC
Rf = 0.16 (Ethylacetat / Methanol 4:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = – 92.5 (c = 0.2 in H2O)
1
(400 MHz, D2O, 23 °C) δ [ppm] = 3.59 (dd, J = 10.7, 4.2 Hz, 1H,
CH), 3.71 (dd, J = 10.7 , 7.8 Hz, 1H, CH), 4.09 (dd, J = 7.8, 0.9 Hz,
1H, CH), 4.15 (bd, J = 14.2 Hz, 1H, CHH), 4.25 dm, J = 14.2 Hz,
1H, CHH), 4.29 ("t", J = 4.8 Hz, 1H, CH), 5.86 (dm, J = 5.5 Hz, 1H,
CH).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, D2O, 23 °C) δ [ppm] = 61.6 (CH2), 66.4 (CH), 71.0
(CH), 72.5 (CH), 72.8 (CH), 122.4 (CH), 142.4 (Cq).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 207 (+ 0.49); (c = 9.1 × 10-4 M, H2O, 23 °C).
C7H12O5
[176.17]
192
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(3S,4S,5S,6S)-4-Acetoxy-3-brom-5,6-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cyclohex-1-encarbonsäuremethylester (247)
CO2Me
OTBS
Br
OTBS
Darstellung: 3.14 g (7.3 mmol) Diol 227 werden in 20 mL trockenem
Dichlormethan bei 0 °C vorgelegt, mit 9.1 mL (72 mmol) Trimethylorthoacetat und 12 µL (0.15 mmol) Trifluoressigsäure versetzt und
OAc
über 16 Stunden unter Erwärmen auf Raumtemperatur gerührt. Nach
247
Zugabe von 5 mL Toluen werden unter vermindertem Druck alle
flüchtigen Bestandteile entfernt. Das verbleibende Öl wird in 20 mL Dichlormethan
aufgenommen, mit 1.65 mL (22 mmol) Acetylbromid und 20 mg (0.22 mmol) 4-Toluensulfonsäuremonohydrat versetzt und für eine Stunde zum Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wird mit 10 mL gesättigter NaHCO3-Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wird
zweimal mit je 10 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über
Magnesiumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck aufkonzentriert und per Flashchromatographie (SiO2, Cyclohexan / Ethylacetat 16:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 2.26 g
(58 %) eines farblosen Feststoffs.
DC
Rf = 0.30 (Cyclohexan / Ethylacetat 16:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = + 106.6 (c = 1.1 in CHCl3)
mp
85.0 – 86.3 °C
1
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.09 (s, 3H, CH3), 0.137 (s,
3H, CH3), 0.143 (s, 3H, CH3), 0.18 (s, 3H, CH3), 0.84 (s, 9H,
C(CH3)3), 0.90 (s, 9H, C(CH3)3), 2.05 (s, 3H, CH3), 3.80 (s, 3H,
CH3), 4.15 ("t", J = 2.6 Hz, 1H, CH), 4.55 (dd, J = 2.1, 0.9 Hz, 1H,
CH), 4.64 (dd, J = 4.2, 1.3 Hz, 1H, CH), 5.31 (m, 1H, CH), 7.04 (dd,
J = 4.2, 0.9 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 5.07 (CH3), – 5.05 (CH3),
– 4.62 (CH3), – 4.59 (CH3), 18.0 (2 × Cq), 21.0 (CH3), 25.65
(C(CH3)3), 25.74 (C(CH3)3), 39.6 (CH), 51.9 (CH3), 66.0 (CH), 70.4
(CH), 73.9 (CH), 131.4 (Cq), 136.2 (CH), 166.3 (CO), 169.7 (CO).
ν~ (cm-1): 2953.0 (m), 2929.7 (m), 2895.8 (w), 2857.6 (m), 1748.7
(m), 1723.9 (s), 1254.4 (ss), 1230.7 (s), 1093.4 (s), 1069.4 (m),
834.6 (ss), 776.6 (s).
Massenanalyse
m/z (%): 523.2 (1) [M–CH3•]+, 521.2 (1) [M–CH3•]+, 481.1 (50) [M–
tBu•]+, 479.1 (46) [M–tBu•]+, 457.3 (6) [M–Br•]+, 421.1 (100) [M–
AcOH, tBu•]+, 419.1 (90) [M–AcOH, tBu•]+, 397.2 (18) [M–AcOH,
Br•]+, 283.1 (17), 251.1 (17), 149.0 (13), 117.1 (92), 89.0 (11), 75.0
(22), 73.1 (45).
HRMS
berechnet für [M–tBu•]+ (C18H3279BrO6Si2): 479.0921; gefunden:
479.0917.
C22H41BrO6Si2
[537.63]
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
193
(3S,4S,5S,6S)-3-Brom-5,6-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-4-hydroxy-cyclohex-1-encarbonsäuremethylester (245)
CO2Me
OTBS
Br
OTBS
Darstellung: 890 mg (4.0 mmol) Kupfer(II)bromid und 692 mg
(8.0 mmol) Lithiumbromid werden in 15 mL trockenem THF bei 0 °C
unter Stickstoffatmosphäre gelöst. Nach dem Erwärmen der Lösung auf
OH
Raumtemperatur werden 1.10 g (2.7 mmol) Epoxid 161 gelöst in
245
10 mL trockenem THF zugetropft. Nach 4 Tagen wird die Reaktion
durch Zugabe von 20 mL Phosphatpuffer (pH 7.0) abgebrochen und dreimal mit je 15 mL
Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat
getrocknet, unter reduziertem Druck eingeengt und per Flashchromatographie (SiO2, Gradient
Cyclohexan / Ethylacetat 16:1 → 4:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 283 mg (22 %) eines
farblosen Öls. 287 mg (26 %) des Eduktes 161 werden zurück erhalten.
DC
Rf = 0.15 (Cyclohexan / Ethylacetat 12:1 v/v)
Drehwert
[α ]22D = + 114.3 (c = 0.9 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.11 (s, 3H, CH3), 0.14 (s, 3H,
CH3), 0.15 (s, 3H, CH3), 0.25 (s, 3H, CH3), 0.87 (s, 9H, C(CH3)3),
0.90 (s, 9H, C(CH3)3), 3.82 (s, 3H, CH3), 4.25 ("t", J = 3.0 Hz, 1H,
CH), 4.32 (dm, J = 10.1 Hz, 1H, CH), 4.41 (d, J = 10.1 Hz, 1H,
OH), 4.65 (dd, J = 2.7, 1.3 Hz, 1H, CH), 4.73 (dd, J = 4.3, 0.6 Hz,
1H, CH), 7.13 (dd, J = 4.3, 1.3 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 5.13 (CH3), – 5.12 (CH3),
– 4.97 (CH3), – 4.7 (CH3), 17.8 (Cq), 18.1 (Cq), 25.5 (C(CH3)3), 25.7
(C(CH3)3), 42.4 (CHBr), 52.0 (CH3), 66.8 (CH), 69.6 (CH), 73.0
(CH), 129.4 (Cq), 137.5 (CH), 166.2 (CO).
ν~ (cm-1): 3470.2 (bw), 2952.7 (m), 2930.3 (m), 2887.6 (w), 2858.4
(m), 1720.8 (s), 1472.0 (w), 1437.3 (w), 1389.3 (w), 1362.5 (w),
1252.0 (s), 1122.5 (m), 1058.9 (s), 886.7 (m), 834.6 (s), 777.1 (s).
GCMS
Rt = 13.84 min; m/z (%): 439 (15), 437 (13), 357 (7), 341 (52), 277
(12), 235 (15), 209 (29), 147 (21), 89 (28), 73 (100).
Massenanalyse
m/z (%): 481.1 (2) [M–CH3•]+, 479.1 (2) [M–CH3•]+, 439.1 (100)
[M–tBu•]+, 437.1 (96) [M–tBu•]+, 357.1 (20) [M–HBr, tBu•]+, 307.0
(34), 305.0 (32), 279.0 (25), 277.0 (24), 147.0 (15), 75.0 (20), 73.0
(46).
HRMS
berechnet für [M–tBu•]+ (C16H2679BrO5Si2): 437.0815; gefunden:
437.0807.
C20H35BrO5Si2
[495.60]
194
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(3R,4R,5R,6S)-4-Hydroxy-3-azido-5,6-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cyclohex-1-encarbonsäuremethylester (271) und (1R,4S,5S,6R)-4,5-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-7oxabicyclo[4.1.0]hept-2-en-3-carbonsäuremethylester
CO2Me
OTBS
CO2Me
OTBS
OTBS
OTBS
N3
OH
271
Darstellung: 188 mg (0.38 mmol) Bromid 245
werden in 5 mL DMF vorgelegt und mit 186 mg
(3.8 mmol) Lithiumazid versetzt. Die gelbe Lösung
O
161
wird nach einer Stunde bei Raumtemperatur mit
10 mL Ammoniumchloridlösung verdünnt und zwei-
mal mit je 10 mL Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck von flüchtigen Bestandteilen befreit. Das Rohprodukt wird per Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat / Cyclohexan 22:1 → 12:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 87 mg (50 %) 271 als farbloses Öl neben
22 mg (14 %) Epoxid 161.
Analytische Daten 271:
DC
Rf = 0.47 (Cyclohexan / Ethylacetat 12:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = – 14.3 (c = 1.1 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.09 (s, 6H, 2 × CH3), 0.10 (s,
3H, CH3), 0.11 (s, 3H, CH3), 0.83 (s, 9H, C(CH3)3), 0.86 (s, 9H,
C(CH3)3), 3.80 (s, 3H, CH3), 3.96 (m, 1H, CH), 4.08 (m, 1H, CH),
4.16 (dd, J = 4.1, 2.8 Hz, 1H, CH), 4.46 (m, 1H, CH), 6.91 ("t",
J = 1.8 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.9 (CH3), – 4.8 (CH3), – 4.7
(CH3), – 4.6 (CH3), 18.0 (Cq), 18.2 (Cq), 25.7 (C(CH3)3), 25.8
(C(CH3)3), 52.2 (CH3), 58.3 (CH), 68.0 (CH), 70.8 (CH), 71.4 (CH),
132.1 (Cq), 136.5 (CH), 165.9 (CO).
ν~ (cm-1): 2953.4 (m), 2929.5 (m), 2858.3 (m), 2100.3 (m), 1724.4
(m), 1471.8 (w), 1463.8 (w), 1437.5 (w), 1388.5 (w), 1361.9 (w),
1336.0 (w), 1302.1 (w), 1252.1 (ss), 1109.0 (s), 1058.1 (ss),
1005.8(w), 973.9 (w), 910.9 (m), 872.9 (s), 833.5 (ss), 809.1 (s),
779.7 (ss).
Massenanalyse
m/z (%): 442.2 (3) [M–CH3•]+, 421.1 (12), 219.1 (11), 401.2 (28),
400.2 (100) [M–tBu•]+, 373.2 (13), 357.2 (17), 341.1 (13), 268.1
(10), 240.1 (22), 212.1 (19), 198.1 (27), 147.0 (29), 89.0 (21), 75.0
(41), 73.0 (92).
C20H39N3O5Si2
[457.71]
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
195
Analytische Daten 161:12,127
DC
Rf = 0.46 (Cyclohexan / Ethylacetat 8:1 v/v)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.01 (s, 3H, CH3), 0.12 (s, 3H,
CH3), 0.13 (s, 3H, CH3), 0.17 (s, 3H, CH3), 0.87 (s, 18H,
2 × C(CH3)3), 3.43 ("t", J = 4.0 Hz, 1H, CH), 3.54 (d"t", J = 3.7, 2.4
Hz, 1H, CH), 3.78 (s, 3H, CH3), 4.27 ("t", J = 2.2 Hz, 1H, CH), 4.58
("t", J = 2.1 Hz, 1H, CH), 7.29 (d, J = 4.2 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
C20H38O5Si2
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.7 (CH3), – 4.5 (CH3), – 4.4
(CH3), – 4.1 (CH3), 18.1 (Cq), 18.2 (Cq), 25.89 (C(CH3)3), 25.93
(C(CH3)3), 45.4 (CH), 52.1 (CH3), 58.3 (CH), 68.4 (CH), 69.6 (CH),
134.2 (Cq), 137.7 (CH), 166.7 (CO).
[414.68]
(3S,4R,5R,6S)-3-Acetoxy-4-brom-5,6-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cyclohex-1-encarbonsäuremethylester (238)
CO2Me
OTBS
AcO
OTBS
Br
238
Darstellung: 320 mg (0.8 mmol) Dien 160 werden in 10 mL Dichlor-
methan und 730 µL (46 mmol) Eisessig bei 0 °C vorgelegt. Nach
Zugabe von 280 mg (2 mmol) N-Bromacetamid wird über 8 Stunden
auf Raumtemperatur erwärmt. Nach 16 Stunden werden 20 mL Toluen zugegeben und flüchtige Bestandteile unter vermindertem Druck
entfernt. Das Rohprodukt wird per Flashchromatographie (SiO2, Cyclohexan / Ethylacetat
16:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 254 mg (59 %) eines blassgelben Öls.
DC
Rf = 0.33 (Cyclohexan / Ethylacetat 16:1 v/v)
Drehwert
[α ]22D = + 58.3 (c = 1.0 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.06 (s, 3H, CH3), 0.12 (s, 3H,
CH3), 0.13 (s, 3H, CH3), 0.16 (s, 3H, CH3), 0.86 (s, 9H, C(CH3)3),
0.89 (s, 9H, C(CH3)3), 2.13 (s, 3H, CH3), 3.78 (s, 3H, CH3), 3.84
(ddd, J = 5.4, 2.1, 0.7 Hz, 1H, CH), 4.40 (dd, J = 2.7, 2.1 Hz, 1H,
CH), 4.63 (dm, J = 2.7 Hz, 1H, CH), 5.89 (dd, J = 5.4, 3.1 Hz, 1H,
CH), 6.88 (d, J = 3.1 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 5.05 (CH3), – 5.01 (CH3),
– 4.9 (CH3), – 4.8 (CH3), 17.8 (Cq), 17.9 (Cq), 20.8 (CH3), 25.5
(C(CH3)3), 25.6 (C(CH3)3), 49.3 (CHBr), 51.8 (CH3), 68.0 (CH),
72.0 (CH), 76.4 (CH), 134.4 (Cq), 137.7 (CH), 165.4 (CO), 169.7
(CO).
ν~ (cm-1): 2953.5 (m), 2930.2 (m), 2888.3 (w), 2858.1 (m), 1751.8
(m), 1723.8 (s), 1472.6 (w), 1446.8 (w), 1437.4 (w), 1371.3 (w),
1253.4 (s), 1220.0 (s), 1092.7 (bs), 888.0 (m), 835.1 (ss), 777.7 (s).
196
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
GCMS
Rt = 14.11 min; m/z (%): 523 (1) [M–CH3•]+, 521 (1) [M–CH3•]+,
481 (100) [M–tBu•]+, 479 (92) [M–tBu•]+, 421 (28) [M–tBu•,
AcOH]+, 419 (25) [M–tBu•, AcOH]+, 399 (100) [M–HBr, tBu•]+,
383 (21), 341 (18) [M–HBr, AcOH, tBu•]+, 283 (21), 251 (20), 73
(32).
Massenanalyse
m/z (%): 523 (1) [M–CH3•]+, 521 (1) [M–CH3•]+, 481 (64) [M–
tBu•]+, 479 (60) [M–tBu•]+, 399 (100) [M–HBr, tBu•]+, 341 (25)
[M–HBr, AcOH, tBu•]+, 283 (31), 251 (34), 225 (15), 193 (11), 147
(8), 117 (13), 89 (14), 73.0 (49).
HRMS
berechnet für [M–tBu•]+ (C18H3279BrO6Si2): 479.0921; gefunden:
479.0935.
C22H41BrO6Si2
[537.63]
(3S,4R,5R,6S)-3-Acetamino-4-brom-5,6-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cyclohex-1-encarbonsäuremethylester (244)
CO2Me
OTBS
AcHN
OTBS
Br
244
Darstellung: 10.0 mg (0.025 mmol) Dien 160 und 7.6 mg
(0.055 mmol) N-Bromacetamid werden bei 0 °C in 3 mL Acetonitril
vorgelegt, 15 Minuten gerührt und dann mit 6.2 mg (28 mmol)
Kupfer(II)bromid versetzt. Die orange-braune Lösung wird unter
Erwärmen auf Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Zum
Quenchen wird mit 5 mL Ethylacetat verdünnt und 7 mL Wasser und 25 mg Natriumhydrogensulfit werden zugesetzt. Nach 5 Minuten wird die Lösung dreimal mit je 10 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet,
filtriert und flüchtige Bestandteile werden unter vermindertem Druck entfernt. Erhalten
werden 13 mg eines grünen Öls, das per Flashchromatographie (SiO2, Cyclohexan / Ethylacetat 3:1 v/v) gereinigt wird. Als Produkt werden 6.6 mg (49 %) eines bräunlichen Feststoffs
isoliert.
DC
Rf = 0.32 (Cyclohexan / Ethylacetat 3:1 v/v)
Drehwert
[α ]22D = + 92.2 (c = 0.9 in CHCl3)
mp
106.0 – 108.0 °C
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.09 (s, 3H, CH3), 0.17 (s, 3H,
CH3), 0.18 (s, 3H, CH3), 0.20 (s, 3H, CH3), 0.87 (s, 9H, C(CH3)3),
0.91 (s, 9H, C(CH3)3), 1.93 (s, 3H, CH3), 3.79 (s, 3H, CH3), 4.02 (m,
1H, CH), 4.33 (dd, J = 2.9, 1.9 Hz, 1H, CH), 4.47 (m, 1H, CH), 5.18
(ddd, J = 9.5, 5.0, 1.2 Hz, 1H, CH), 6.02 (d, J = 9.5 Hz, 1H, NH),
6.85 (dd, J = 5.0, 1.0 Hz, 1H, CH).
H-NMR
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
13
C-NMR
197
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.7 (CH3), – 4.6 (CH3), – 4.4
(CH3), – 4.3 (CH3), 18.2 (Cq), 18.3 (Cq), 23.3 (CH3), 25.9 (C(CH3)3),
26.0 (C(CH3)3), 43.5 (CHBr), 48.7 (CHN), 52.1 (CH3), 67.2 (CH),
74.2 (CH), 131.5 (Cq), 134.4 (CH), 166.9 (CO), 168.4 (CO).
GCMS
Rt = 14.43 min (breit); m/z (%): 455 (2) [M–HBr]•+, 398 (93) [M–
HBr, tBu•]+, 357 (13), 292 (29), 266 (100), 209 (25), 207 (55), 75
(83).
IR
3283.2 (bw), 2952.3 (m), 2929.3 (m), 2896.2 (w), 2857.4 (m),
1721.5 (m), 1655.7 (bm), 1537.1 (w), 1472.0 (w), 1463.4 (w),
1436.5 (w), 1363.3 (w), 1250.4 (s), 1088.0 (bs), 889.5 (m), 832.6
(ss), 776.0 (ss), 666.0 (w).
C22H42BrO5NSi2
[536.65]
(3S,4S,5R,6S)-3-Acetoxy-4-brom-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (239)
CO2Me
OH
AcO
OH
Br
239
Darstellung: 189 mg (0.35 mmol) Bis-TBS-Ether 238 werden in 5 mL
Acetonitril vorgelegt, mit 1 mL wässriger Fluorwasserstoffsäure
(50 %ig) versetzt und 4 Stunden bei Raumtemperatur heftig gerührt. Die
Reaktionsmischung wird auf Kieselgel aufgezogen und per Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat / Cyclohexan 2:1 v/v) gereinigt. Erhalten
werden 80 mg (73 %) eines farblosen Feststoffs. Einkristalle zur Röntgenstrukturuntersuchung wurden durch Umkristallisation aus Cyclohexan / Diethylether erhalten.
DC
Rf = 0.33 (Ethylacetat / Cyclohexan 2:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = + 32.3 (c = 1.1 in CHCl3)
mp
124.8 – 126.9 °C
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 2.14 (s, 3H, CH3), 3.77 (bs,
1H, OH), 3.79 (s, 3H, CH3), 3.94 (dd, J = 11.6, 7.3 Hz, 1H, CH),
4.04 (dd, J = 11.6, 9.3 Hz, 1H, CH), 4.18 (bs, 1H, OH), 4.55 (ddd,
J = 7.4, 2.7, 1.6 Hz, 1H, CH), 5.75 (d"t", J = 9.3, 2.5 Hz, 1H, CH),
6.59 ("t", J = 1.9 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 20.6 (CH3), 52.4 (CH3), 53.5
(CH), 70.9 (CH), 73.1 (CH), 74.7 (CH), 132.5 (Cq), 136.2 (CH),
165.8 (CO), 169.8 (CO).
ν~ (cm-1): 3455.4 (bm), 2954.3 (w), 1750.4 (s), 1718.0 (s), 1437.9
(m), 1373.3 (m), 1263.8 (s), 1223.7 (ss), 1090.8 (m), 1051.9 (s),
1023.0 (s), 971.1 (m), 888.0 (m), 87.6 (w), 800.2 (m).
C10H13BrO6
[309.11]
198
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
(1R,2R,5S,6S)-5,6-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-4-(tert-butyldimethylsilanyloxymethyl)cyclohex-3-en-1,2-diol (248)
OTBS
OTBS
HO
OTBS
OH
248
Darstellung: 477 mg (1.18 mmol) Triol 251, 250 µL (1.78 mmol)
Triethylamin und 5 mg 4-(Dimetylamino)pyridin (DMAP) werden in
5 mL Dichlormethan gelöst und bei 0 °C tropfenweise mit einer
Lösung von 258 mg (1.71 mmol) tert-Butyldimethylchlorsilan in 5 mL
Dichlormethan versetzt. Der Ansatz wird über 16 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt. Die Reaktionslösung wird mit 0.1
M
HCl ge-
waschen, und die wässrige Phase wird einmal mit 5 mL Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten
organischen
Phasen
werden
über
Magnesiumsulfat
getrocknet,
unter
vermindertem Druck aufkonzentriert und per Flashchromatographie (SiO2, Isohexan /
Ethylacetat 10:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 450 mg (87 %) eines farblosen Öls.
DC
Rf = 0.43 (Isohexan / Ethylacetat 10:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = + 10.9 (c = 1.3 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.05 (s, 3H, CH3), 0.06 (s, 3H,
CH3), 0.08 (s, 3H, CH3), 0.09 (s, 3H, CH3), 0.14 (s, 3H, CH3), 0.19
(s, 3H, CH3), 0.85 (s, 9H, C(CH3)3), 0.90 (s, 18H, 2 × C(CH3)3),
2.76 (bd, J = 11.2 Hz, 1H, OH), 3.73 (d, J = 9.9 Hz, 1H, OH), 3.89
(d"t""t", J = 9.9, 4.3, 1.3 Hz, 1H, CH), 4.02 (m, 1H, CH), 4.05 (bd,
J = 13.2 Hz, 1H, CHH), 4.12 (dd, J = 4.3, 2.6 Hz, 1H, CH), 4.17
(d"t", J = 13.2, 1.9 Hz, 1H, CHH), 4.29 (bd, J = 8.0 Hz, 1H, CH),
5.65 (m, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 5.5 (CH3), – 5.2 (CH3), – 5.1
(CH3), – 5.0 (CH3), – 4.8 (CH3), – 4.6 (CH3), 17.8 (2 × Cq), 18.3
(Cq), 25.5 (C(CH3)3), 25.6 (C(CH3)3), 25.8 (C(CH3)3), 63.9 (CH2),
66.2 (CH), 68.3 (CH), 70.7 (CH), 70.9 (CH), 125.3 (CH), 135.9
(Cq).
ν~ (cm-1): 2954.1 (w), 2929.5 (w), 2887.0 (w), 2858.1 (w), 1472.1
(w), 1463.4 (w), 1252.6 (m), 1104.0 (m), 1038.6 (s), 1004.8 (w),
831.0 (ss), 774.0 (ss).
Massenanalyse
m/z (%): 486.4 (2), 443.3 (66) [M–H2O, tBu•]+, 329.0 (17), 311.1
(84), 231.1 (18), 209.0 (22), 197.0 (29), 155.0 (17), 147.0 (30), 75.0
(42), 73.0 (100).
HRMS
berechnet für [M–H2O, tBu•]+ (C21H43O4Si3): 443.2469; gefunden:
443.2469.
C25H54O5Si3
[518.95]
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
199
(3S,4S,5R,6S)-4-Acetoxy-3-brom-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (272)
CO2Me
OH
Br
OH
OAc
272
Darstellung: 1.13 g (2.1 mmol) der Bromverbindung 247 werden in
25 mL Acetonitril gelöst und tropfenweise mit 800 µL einer 50 %igen
Fluorwasserstoffsäurelösung versetzt. Nach 6 Stunden wird mit 25 mL
halbgesättigter NaHCO3-Lösung versetzt. Die Lösung wird drei-mal mit
je 20 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
werden über Magnesiumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck aufkonzentriert und per
Flashchromatographie (Cyclohexan / Ethylacetat 1:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 486 mg
(75 %) eines farblosen Feststoffs.
DC
Rf = 0.14 (Ethylacetat / Cyclohexan 1:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = + 38.8 (c = 1.2 in CHCl3)
mp
125.0 – 126.0 °C
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 2.18 (s, 3H, CH3), 3.70 (bs,
2H, 2 × OH), 3.75 (dd, J = 10.7, 7.8 Hz, 1H, CH), 3.83 (s, 3H, CH3),
4.64 (ddd, J = 7.8, 2.8, 1.6 Hz, 1H, CH), 4.72 (d"t", J = 8.7, 2.6 Hz,
1H, CH), 5.32 (dd, J = 10.7, 8.7 Hz, 1H, CH), 6.88 (dd, J = 2.4,
1.6 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 20.8 (CH3), 45.6 (CHBr), 52.5
(CH3), 71.4 (CH), 73.8 (CH), 75.2 (CH), 131.4 (Cq), 137.2 (CH),
165.7 (CO), 170.4 (CO).
ν~ (cm-1): 3440.6 (bm), 2953.5 (w), 1716.6 (bss), 1437.3 (m), 1365.7
IR
(m), 1231.9 (bss), 1084.5 (s), 1043.8 (s), 1020.6 (s).
Massenanalyse
m/z (%): 279.0 (2) [M–OCH3•]+, 277.0 (2) [M–OCH3•]+, 250.0 (2)
[M–AcOH]•+, 248.0 (2) [M–AcOH]•+, 211.1 (2) [M–Br•,H2O]+,
208.0 (5), 205.9 (5), 186.0 (6), 169.0 (73) [M–AcOH,Br•]+, 157.0
(16) , 139.0 (22), 137.0 (100), 127.0 (17), 124.9 (12), 109.0 (39),
43.1 (12).
C10H13BrO6
[309.11]
(3R,4R,5R,6S)-4-Acetoxy-3-azid-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (268)
CO2Me
OH
N3
OH
OAc
268
Darstellung: 150 mg (0.49 mmol) Bromid 272 und 400 mg (7.5 mmol)
NH4Cl werden in 5 mL DMF vorgelegt und mit 240 mg (4.9 mmol)
Lithiumazid versetzt. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur werden 10 mL
Wasser zugesetzt und dreimal mit je 10 mL Ethylacetat extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet
und unter vermindertem Druck von flüchtigen Bestandteilen befreit. Das Rohprodukt wird per
200
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat / Cyclohexan 2:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden
98 mg (74 %) eines farblosen Feststoffs.
DC
Rf = 0.33 (Ethylacetat / Cyclohexan 2:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = – 212.9 (c = 1.2 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 2.19 (s, 3H, CH3), 3.04 (bs,
1H, OH), 3.82 (bs, 1H, OH), 3.83 (s, 3H, CH3), 4.14 (dd, J = 10.2,
6.7 Hz, 1H, CH), 4.44-4.50 (m, 2H, 2 × CH), 4.99 (dd, J = 10.2, 4.5
Hz, 1H, CH), 6.79 (dd, J = 5.3, 1.3 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 20.9 (CH3), 52.7 (CH3), 56.7
(CH), 69.8 (CH), 71.4 (CH), 71.7 (CH), 132.6 (CH), 134.5 (Cq),
166.1 (CO), 170.8 (CO).
ν~ (cm-1): 3450.9 (m), 2954.9 (w), 2104.0 (s), 1716.7 (bs), 1656.0
(w), 1437.8 (m), 1370.9 (m), 1233.9 (ss), 1077.5 (m), 1043.0 (s),
791.2 (m), 762.5 (m).
Massenanalyse
m/z (%): 240.1 (4) [M–OCH3•]+, 199.1 (13) [M–N2,CH3COH]•+,
169.0 (22) [M–AcOH,N3•]+, 151.0 (24), 137.0 (25), 123.0 (35),
108.9 (100), 43.2 (38).
C10H13N3O6
[271.23]
(5S,6S)-3-Brom-5,6-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-cycohexa-1,3-diencarbonsäuremethylester (270)
CO2Me
OTBS
Br
OTBS
270
Darstellung: 112 mg (0.21 mmol) 247 werden in 2 mL DMF gelöst.
Unter Rühren wird über 10 Minuten eine Lösung von 10.2 mg
(0.21 mmol) Lithiumazid in 2 mL DMF zugetropft, wobei sich die
Reaktionslösung gelb färbt. Nach 90 Minuten werden 10 mL Wasser
zugegeben und zweimal mit je 10 mL Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck aufkonzentriert. Nach Reinigung per Flashchromatographie (SiO2, Cyclohexan / Ethylacetat 23:1 v/v)
werden 65 mg (65 %) eines farblosen Öls erhalten.
DC
Rf = 0.48 (Cyclohexan / Ethylacetat 23:1 v/v)
Drehwert
[α ]23D = + 265.8 (c = 0.9 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.05 (s, 3H, CH3), 0.08 (s, 3H,
CH3), 0.11 (s, 3H, CH3), 0.15 (s, 3H, CH3), 0.83 (s, 9H, C(CH3)3),
0.86 (s, 9H, C(CH3)3), 3.80 (s, 3H, CH3), 4.10 (dd, J = 5.8, 1.5 Hz,
1H, CH), 4.51 (dd, J = 1.5, 1.1 Hz, 1H, CH), 6.42 (ddd, J = 5.8, 1.5,
1.0 Hz, 1H, CH), 7.08 (d, J = 1.5 Hz, 1H, CH).
H-NMR
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
13
C-NMR
IR
201
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 4.9 (CH3), – 4.6 (CH3), – 4.5
(CH3), – 4.3 (CH3), 18.05 (Cq), 18.13 (Cq), 25.69 (C(CH3)3), 25.74
(C(CH3)3), 51.9 (CH3), 67.1 (CH), 71.8 (CH), 118.8 (Cq), 131.3
(Cq), 132.5 (CH), 136.1 (CH), 166.0 (CO).
ν~ (cm-1): 2953.3 (m), 2929.7 (m), 2893.8 (w), 2857.9 (m), 1719.4
(s), 1362.5 (ss), 1079.6 (ss), 835.8 (s), 777.3 (s).
GCMS
Rt = 12.70 min; m/z (%): 463 (2) [M–CH3•]+, 461 (2) [M–CH3•]+,
421 (73) [M–tBu•]+, 419 (68) [M–tBu•]+, 397 (17) [M–Br•]+, 389 (6)
[M–CH3OH, tBu•]+, 387 (6) [M–CH3OH, tBu•]+, 339 (8), 315 (8),
313 (8), 289 (19), 287 (19), 251 (43), 185 (11), 183 (12), 147 (16),
133 (16), 115 (11), 89 (26), 73 (100), 59 (11), 57 (11).
Massenanalyse
m/z (%): 463.1 (2) [M–CH3•]+, 461.1 (2) [M–CH3•]+, 421.1 (100)
[M–tBu•]+, 419.1 (94) [M–tBu•]+, 397.2 (20) [M–Br•]+, 289.0 (7),
287.0 (7), 251.1 (20), 73.0 (28).
HRMS
berechnet für [M–tBu•]+ (C16H2879BrO4Si2): 419.0710; gefunden:
419.0713.
C20H37BrO4Si2
[477.58]
(1S,2S,5S,6S)-Essigsäure-4-acetoxymethyl-2-brom-5,6-bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)cyclohex-3-enylester (250)
OAc
OTBS
Br
OTBS
OAc
250
Darstellung: 429 mg (0.82 mmol) Diol 248 werden bei 0 °C mit
1.25 mL (9.9 mmol) Trimethylorthoacetat in 5 mL Dichlormethan
vorgelegt und mit 12 µL (0.16 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Nach
16 Stunden bei Raumtemperatur wird unter vermindertem Druck aufkonzentriert und alle flüchtigen Bestandteile im Vakuum entfernt. Das
Reaktionsgemisch wird in 5 mL Dichlormethan aufgenommen, mit
220 µL (3 mmol) Acetylbromid und 1 mg 4-Toluensulfonsäure versetzt und für eine Stunde
zum Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wird mit gesättigter NatriumhydrogencarbonatLösung gewaschen. Die wässrige Phase wird zweimal mit je 5 mL Dichlormethan extrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck konzentriert und per Flashchromatographie (SiO2, Cyclohexan / Ethylacetat
10:1 v/v) gereinigt. Erhalten werden 190 mg (42 %) eines farblosen Öls.
DC
Rf = 0.28 (Cyclohexan / Ethylacetat 20:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = + 141.3 (c = 1.1 in CHCl3)
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.09 (s, 3H, CH3), 0.10 (s, 3H,
CH3), 0.13 (s, 3H, CH3), 0.18 (s, 3H, CH3), 0.87 (s, 9H, C(CH3)3),
0.90 (s, 9H, C(CH3)3), 2.03 (s, 3H, CH3), 2.06, (s, 3H, CH3), 4.07-
H-NMR
202
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
4.15 (m, 2H, 2 × CH), 4.53 (dd, J = 4.1, 1.2 Hz, 1H, CH), 4.59 (d,
J = 13.2 Hz, 1H, CHH), 4.61 (d"t", J = 13.2, 1.7 Hz, 1H, CHH), 5.30
(m, 1H, CH), 5.98 (d, J = 4.1 Hz, 1H, CH).
13
C-NMR
IR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 5.2 (CH3), – 5.0 (CH3), – 4.3
(CH3), – 4.0 (CH3), 17.87 (Cq), 17.92 (Cq), 20.7 (CH3), 21.0 (CH3),
25.68 (C(CH3)3), 25.70 (C(CH3)3), 40.6 (CH), 64.6 (CH2), 67.5
(CH), 70.4 (CH), 73.7 (CH), 125.1 (CH), 134.8 (Cq), 169.6 (CO),
170.2 (CO).
ν~ (cm-1): 2954.0 (m), 2930.1 (m), 2894.8 (w), 2857.9 (m), 1745.9
(s), 1371.1 (m), 1251.6 (s), 121.5 (ss), 1081.9 (s), 1027.5 (m), 833.2
(ss), 775.6 (s).
C23H43BrO6Si2
[551.66]
(4S,5S,6S)-4,5-Bis-(tert-butyldimethylsilanyloxy)-3-(tert-butyldimethylsilanyloxymethyl)-6hydroxy-cyclohex-2-enon (254)
OTBS
OTBS
Darstellung: 94 mg (0.18 mmol) Allylalkohol 248 werden in 3 mL
Dichlormethan bei 0 °C vorgelegt und mit 69 mg (0.36 mmol) 4-Toluolsulfonsäure versetzt. Hierzu wird eine Lösung von 77 mg (0.36 mmol)
O
OTBS
OH
254
4-Acetamino-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl getropft. Nach 60 Minuten werden 2 mL Ethanol zugegeben, und nach weiteren 20 Minuten
wird mit 10 mL Wasser und 10 mL gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die
vereinigten wässrigen Phasen werden zweimal mit je 5 mL Dichlormethan extrahiert, und die
vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Aufkonzentrieren unter vermindertem Druck wird per Flashchromatographie gereinigt (SiO2, Isohexan /
Ethylacetat 25:1 v/v). Dabei werden 81 mg (86 %) eines farblosen Feststoffs erhalten.
DC
Rf = 0.43 (Cyclohexan / Ethylacetat 15:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = + 42.8 (c = 1.0 in CHCl3)
mp
78.5 – 79.0 °C
1
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 0.08 (s, 3H, CH3), 0.09 (s, 3H,
CH3), 0.10 (s, 3H, CH3), 0.12 (s, 3H, CH3), 0.16 (s, 3H, CH3), 0.22
(s, 3H, CH3), 0.89 (s, 9H, C(CH3)3), 0.92 (s, 9H, C(CH3)3), 0.94 (s,
9H, C(CH3)3), 3.72 (d, J = 5.6 Hz, 1H, OH), 3.87 (dd, J = 7.4,
5.6 Hz, 1H, CH), 3.95 (dd, J = 7.4, 6.0 Hz, 1H, CH), 4.30 (ddd,
J = 17.8, 1.8, 0.9 Hz, 1H, CHH), 4.31 (bd, J = 6.0 Hz, 1H, CH), 4.49
(dd, J = 17.8, 1.3 Hz, 1H, CHH), 6.26 (dd, J = 3.1, 1.8 Hz, 1H, CH).
H-NMR
13
C-NMR
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = – 5.5 (CH3), – 5.4 (CH3), – 4.4
(CH3), – 4.1 (CH3), – 3.6 (CH3), – 3.2 (CH3), 18.0 (Cq), 18.3
(2 × Cq), 25.8 (C(CH3)3), 25.9 (C(CH3)3), 26.1 (C(CH3)3), 63.2
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
203
(CH2), 72.1 (CH), 76.4 (CH), 76.7 (CH), 120.7 (CH), 163.3 (Cq),
196.9 (CO).
ν~ (cm-1): 2953.7 (m), 2929.7 (m), 2886.3 (w), 2857.7 (m), 1682.0
(m), 1472.5 (w), 1463.4 (w), 1253.0 (s), 1146.1 (s), 1095.1 (s),
833.5 (ss), 775.5 (ss).
IR
Massenanalyse
m/z (%): 459.2 (23) [M–tBu•]+, 342.2 (46) [M–OHCCH2OTBS]•+,
327.1 (98), 299.1 (38), 285.1 (50), 195.9 (25), 167.0 (19), 147.0
(35), 75.0 (51), 73.0 (100).
HRMS
berechnet für [M–tBu•]+ (C21H43O5Si3): 459.2418; gefunden:
459.2426.
C25H52O5Si3
[516.31]
(4S,5R,6S)-4,5,6-Trihydroxy-3-(hydroxymethyl)cyclohex-2-enon (ent-Valienon, ent-8)
OH
OH
O
OH
OH
ent-Valienon, ent-8
Darstellung: 68 mg (0.13 mmol) 254 werden in 4 mL Tetrahydro-
furan bei 0 °C vorgelegt und mit 1 mL (1 mmol) einer Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung (1
M
in THF) versetzt. Nach einer Stunde
wird nach Zusatz von 500 µL gesättigter NH4Cl-Lösung unter vermindertem Druck aufkonzentriert und per Flashchromatographie (SiO2,
Ethylacetat / Methanol 2:1 v/v, dann Sephadex LH20, Methanol)
gereinigt. Erhalten werden 16 mg (69 %) eines farblosen Öls.
DC
Rf = 0.62 (Ethylacetat / Methanol 2:1 v/v)
Drehwert
[α ]24D = + 56.6 (c = 1.1 in CH3OH)
1
(400 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 3.61 (dd, J = 10.8, 8.3 Hz,
1H, CH), 4.03 (d, J = 10.8 Hz, 1H, CH), 4.32 (m, 2H, CHH, CH),
4.52 (d"t", J = 18.2, 1.6 Hz, 1H, CHH), 6.16 ("q", J = 2.0 Hz, 1H,
CH).
H-NMR
13
C-NMR
IR
(100 MHz, MeOH-d4, 23 °C) δ [ppm] = 62.1 (CH2), 73.7 (CH), 78.1
(CH), 79.5 (CH), 121.3 (CH), 167.9 (Cq), 199.4 (CO).
ν~ (cm-1): 3324.4 (s), 2883.4 (w), 1669.1 (ss), 1433.1 (m), 1348.9
(m), 1287.2 (m), 1239.5 (m), 1100.5 (ss), 1061.1 (s), 1009.6 (s),
919.2 (m), 885.1 (m), 853.4 (w).
Mol. CD
λ (∆ε) [nm]: 321 (+ 0.7), 275 (0.0), 241 (+ 3.6), 210 (– 2.7), 206
(– 2.6); (c = 1.7 × 10-4 M, CH3CN, 23 °C).
Massenanalyse
m/z (%): 156.0 (7) [M–H2O]•+, 144.0 (18) [M–H2CO]•+, 138.0 (95)
[M–2 × H2O]•+, 136.9 (100), 108.9 (25), 95.9 (14), 108.9 (25), 81.0
(23), 55.1 (22).
HRMS
berechnet für [M–2 × H2O]•+ (C7H6O3): 138.0317; gefunden:
138.0313.
C7H10O5
[174.15]
204
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
5.2.7
Tabellarische Auflistung der Reaktionsbedingungen nicht erfolgreich
verlaufener Experimente
CO2Me
OMOM
OMOM
197
CO2Me
O
O
O
198
Bedingungen
Bemerkungen
a
5 % Sc(OTf)3, CH2Cl2, 40 °C, 16 h
keine Reaktion
b
einige Tropfen methanolisches HCl in
Methanol, CH2Cl2, 40 °C, 16 h
keine Reaktion
c
3 eq. MOMCl, 4 eq. NEt(iPr)2, 1 eq.
NBu4I, CH2Cl2, rt, 16 h
keine Reaktion
CO2Me
OH
OH
170
CO2Me
O
O
O
198
a
CH3OCH2OCH3, CH2C2 (1:1), kat.
CF3SO3H, kat. NBu4I, rt, 16 h
Aromatisierung
b
(CH2O)n, kat. NBu4I, kat. BF3 × Et2O,
AcOEt, 0 °C, 2 h
Aromatisierung
c
(CH2O)n, kat. NBu4I, DOWEX® 50×8,
AcOEt, 0 °C, 2 h
Aromatisierung
d
DMSO, kat. SOCl2, rt, 16 h
Aromatisierung
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
CO2Me
HO
CO2Me
CO2Me
OTBS
205
OTBS
OTBS
OTBS
RHN
OTBS
OH
227
OTBS
OH
160
a
1.5 eq. Chloramin-T, 4 mol% K2OsO4, komplexes Produktgemisch, Diol 227
Aceton, H2O, i-BuOH (10:1:9 v/v/v), ist eines der überwiegend gebildeten
16 h, rt
Produkte
b
1.5 eq. Chloramin-M, 4 mol% komplexes Produktgemisch, Diol 227
K2OsO4, Aceton, H2O, tert-BuOH ist eines der überwiegend gebildeten
(10:1:9 v/v/v), 16 h, rt
Produkte
c
1.1 eq. N-Bromacetamid, 1 eq. LiOH,
4 mol% K2OsO4, H2O, tert-BuOH (1:1 komplexes Produktgemisch
v/v), 0 °C, 16 h
CO2Me
CO2Me
OTBS
OTBS
OTBS
160
HO
OTBS
OH
227
5 mol% RuCl3, 1.7 eq. NaIO4 aq, CCl4, CH3CN
(1:1 v/v), kräftiges Rühren, 0 °C, 4 h
keine Reaktion, Edukt isoliert
OAc
CO2Me
OH
N3
OH
OAc
AcHN
OAc
OAc
OAc
268
ent-163
1. 10 eq. DIBAL-H, CH2Cl2, 0 °C – rt, 16 h
2. C5H5N, kat. DMAP, Ac2O, rt, 16 h
Nachgewiesen wurde ein Produkt,
dessen NMR-Daten eine CH2-Gruppe
zeigt, die eine Claisen-Umlagerung
vermuten lassen.
206
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
OAc
CO2Me
OTBS
N3
OTBS
OAc
AcHN
OAc
OAc
OAc
271
ent-163
als Nebenprodukt
identifiziert
1. 10 eq. LAH, CH2Cl2, rt, 16 h
2. C5H5N, kat. DMAP, Ac2O, rt, 16 h
Isoliert wurde ein komplexes Produktgemisch teilweise gesättigter Verbindungen; nach Fraktionierung wird entValienamin-Pentaacetat (ent-163) als
Nebenprodukt nachgewiesen.
OMOM
OH
OMOM
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
266
8
Methanol, 1 % HCl in Methanol, rt, 16 h
Der sekundäre MOM-Ether wurde
nicht solvolysiert.
CO2Me
CO2Me
O
OH
OH
O
OMe
Ph
MeO Ph
170
1.5 eq. Benzil, 8 eq. TMS-OCH3, 0.1 eq. TMSOTf, CH2Cl2, 0 °C, 3 h
keine Produktbildung beobachtet, teilweise Aromatisierung
Experimenteller Teil – Chemische Experimente
5.2.8
207
Darstellung von Reagenzien
Lithiumazid232
13.0 g Natriumazid (200 mmol) und 14.1 g Lithiumsulfat (110 mmol) werden in 70 mL
Wasser unter Rühren und Erhitzen auf 50 °C gelöst. 350 mL Ethanol werden unter starkem
Rühren zugesetzt. Nach 10 Minuten wird filtriert und der Rückstand mit wenig 96 %igem
Ethanol gewaschen. Das vereinigte Filtrat wird unter vermindertem Druck aufkonzentriert
und im Vakuum getrocknet. Der farblose Feststoff wird mit 100 mL 96 %igem Ethanol 2
Minuten bei 35 °C digeriert und filtriert. Nach Einengen des Filtrates und Trocknen des
Rückstandes werden 9.8 g (quantitativ) eines farblosen Feststoffs erhalten, für den eine
Reinheit von 99.5 % erwartet wird.232 Das Reagenz wird ohne Gehaltsbestimmung eingesetzt.
tert-Butylhypochlorit233
In einem Dreihalskolben mit KPG-Rührer wird eine Lösung von 16.0 g Natriumhydroxid
(0.4 mol) in 180 mL Wasser bei 0 °C mit 14.8 g tert-Butanol (200 mmol) versetzt. Unter
Rühren wird Chlorgas durch die Lösung geleitet, wobei ein gelbes Öl entsteht. Nach einer
Stunde wird die ölige Phase in einem Scheidetrichter abgetrennt, dreimal mit wässriger
Natriumcarbonat-Lösung und viermal mit Wasser gewaschen und über Calciumchlorid gelagert. Erhalten werden 12 mL tert-Butylhypochlorit als gelbes Öl, das ohne weitere Aufreinigung eingesetzt wird.
1
H-NMR
13
C-NMR
(300 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 1.33 (s, CH3).
(75 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 27.0 (CH3), 84.1 (Cq).
N-Chlor-methansulfonamid Natriumsalz, "Chloramin-M"234
4.81 g (50 mmol) Methansulfonamid und 2.0 g (50 mmol) Natriumhydroxid werden in 40 mL
Wasser vorgelegt. 5.6 mL tert-Butylhypochlorit werden zugetropft. Nach einer Stunde wird
unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingeengt, und der feste Rückstand mit Diethylether gewaschen. Erhalten werden 7.2 g eines blassgelben Feststoffs, der bei – 18 °C gelagert
und ohne weitere Aufreinigung eingesetzt wird.
208
Anhang
6 Anhang
6.1 Röntgenstrukturuntersuchungen
6.1.1
(3S,4S,5R,6S)-3-Acetoxy-4-brom-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (239)
Geeignete Kristalle zur Röntgenstrukturuntersuchung werden durch Kristallisation aus
Diethylether / Cyclohexan erhalten.
C12
O12
O31
C11
O11
C1
O6
C6
C2
C3
C5
C31
C32
O3
C4
Br4
O5
Abbildung 6.1:
Kristallstruktur von (3S,4S,5R,6S)-3-Acetoxy-4-brom-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbon-säuremethylester (239); dargestellt sind Ellipsoide mit
50% Aufenthaltswahrscheinlichkeit.
Identification code
SI 404
Empirical formula
C10 H13 Br O6
Formula weight
309.11
Wavelength
0.71073 Å (Mo-Kα)
Crystal system, space group
Monoclinic, P21 Nr. 4
Unit cell dimensions
a = 492.8(7) pm
b = 1311.7(14) pm
c = 944(2) pm
alpha = 90°.
beta = 97.92(3)°.
gamma = 90°.
Anhang
209
Volume
0.610(2) [106 pm3]
Z, Calculated density
2, 1.682 Mg/m3
Absorption coefficient
3.318 mm-1
F(000)
312
Diffractometer
Stoe IPDS2
Theta range for data collection
2.16° to 25.63°.
Limiting indices
-5<=h<=5, -15<=k<=15, -11<=l<=11
Reflections collected / unique
7385 / 2277 [Rint = 0.0477]
corrections
Lorentz, Polarisation, Absorption (Xshape)
Max. and min. transmission
0.58160 and 0.37799
Refinement method
Full-matrix least-squares on F2
parameters
155
Goodness-of-fit on F2
0.696
Final R indices [I>2sigma(I)]
R1 = 0.0352, wR2 = 0.1057
R indices (all data)
R1 = 0.0434, wR2 = 0.1123
Largest diff. peak and hole
0.418 and -0.398 [e- 10-6 pm-3]
Tabelle 11:
Atom
Br(4)
C(1)
O(6)
C(2)
O(5)
C(3)
O(11)
C(4)
O(12)
C(5)
O(3)
C(6)
O(31)
C(11)
C(12)
C(31)
C(32)
Tabelle 12:
Kristallographische Daten und Angaben zur Datensammlung und Strukturbestimmung von 239.
WyckoffLage
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
2a
X
y
z
Uäquiv.
0.38915(11)
-0.1021(9)
-0.1315(8)
-0.0953(10)
0.2696(8)
0.0515(10)
-0.1441(9)
0.2432(10)
-0.4374(9)
0.0987(11)
0.2152(7)
0.0360(11)
-0.0040(9)
-0.2272(11)
-0.5531(15)
0.1684(11)
0.3565(13)
0.28049(5)
0.0389(3)
0.1604(3)
0.0315(3)
0.2840(3)
0.1062(3)
-0.0695(3)
0.1712(3)
-0.0875(3)
0.2131(3)
0.0481(2)
0.1233(3)
0.1164(4)
-0.0438(3)
-0.1763(5)
0.0605(4)
-0.0025(5)
0.00877(5)
0.2681(5)
0.4606(4)
0.1266(5)
0.3225(3)
0.0366(4)
0.4677(4)
0.1255(5)
0.2867(4)
0.2532(5)
-0.0610(3)
0.3516(4)
-0.2481(4)
0.3527(5)
0.3531(6)
-0.1999(5)
-0.2856(6)
661(2)
459(9)
609(9)
475(9)
684(9)
455(10)
712(11)
456(9)
617(9)
496(11)
495(7)
465(10)
742(11)
514(11)
714(15)
515(11)
685(15)
Atomkoordinaten und äquivalente isotrope Verschiebungsparameter [pm2] in
der Kristallstruktur von 239.
210
Anhang
Atome
C(1)
C(1)
C(1)
C(3)
C(3)
O(3)
Br(4)
C(4)
C(5)
C(5)
C(6)
C(6)
C(11)
C(11)
O(12)
C(31)
C(31)
Tabelle 13:
- C(2)
- C(6)
- C(11)
- C(2)
- O(3)
- C(31)
- C(4)
- C(3)
- C(4)
- O(5)
- C(5)
- O(6)
- O(11)
- O(12)
- C(12)
- O(31)
- C(32)
Abstand
134.1(7)
151.4(6)
148.7(7)
149.1(7)
145.0(5)
133.9(7)
195.3(5)
151.7(7)
151.4(7)
140.9(6)
153.4(6)
141.6(6)
120.3(6)
133.0(7)
144.5(6)
120.6(6)
149.0(7)
Ausgewählte interatomare Abstände [pm] in der Kristallstruktur der
Verbindung 239.
Anhang
6.1.2
211
(5aS,6R,7S,9aR)-6-Brom-5a,6,7,9a-tetrahydro-8-(hydroxymethyl)benzo[f][1,3,5]trioxepin-7-ol (243)
Zur Röntgenstrukturuntersuchung geeignete Kristalle wurden durch Kristallisation aus
Chloroform erhalten.
O81'
C81'
O1
Br6'
C8'
C7'
C2
O3
C4
O7'
C9a
C9'
C6'
C9
O81
C9a'
C8
C5a'
O1'
O5'
O5
C5a
C81
C6
O7
C7
Br6
C2'
C4'
O3'
Abbildung 6.2:
Kristallstruktur von (5aS,6R,7S,9aR)-6-Brom-5a,6,7,9a-tetrahydro-8-(hydroxymethyl)-benzo[f][1,3,5]trioxepin-7-ol (243); dargestellt sind Ellipsoide mit 50% Aufenthaltswahrscheinlichkeit, Wasserstoffatome sind
ausgeblendet.
Identification code
mm13_m
Empirical formula
C9 H13 Br O5
Formula weight
281.10
Temperature
123(2) K
Wavelength
0.71073 Å (MoKα)
Crystal system, space group
Monoclinic, P2(1) No.4)
Unit cell dimensions
a = 12.3858(3) Å
b = 6.8558(2) Å
c = 12.5028(4) Å
Volume
1051.98(5) Å3
Z, Calculated density
4, 1.775 Mg/m3
Absorption coefficient
3.907 mm-1
alpha = 90°.
beta = 97.746(1)°.
gamma = 90°.
212
Anhang
F(000)
568
Crystal size
0.35 × 0.15 × 0.10 mm
Diffractometer
Nonius KappaCCD
Theta range for data collection
3.29° to 25.02°.
Limiting indices
-14<=h<=14, -8<=k<=7, -14<=l<=14
Reflections collected / unique
8802 / 3662 [R(int) = 0.0502]
Completeness to theta = 25.02
99.3 %
Absorption correction
Empirical from multiple refl.
Max. and min. transmission
0.58160 and 0.37799
Refinement method
Full-matrix least-squares on F2
Data / restraints / parameters
3662 / 11 / 283
Goodness-of-fit on F2
1.046
Final R indices [I>2sigma(I)]
R1 = 0.0288, wR2 = 0.0650
R indices (all data)
R1 = 0.0337, wR2 = 0.0661
Absolute structure parameter
0.010(8)
Largest diff. peak and hole
0.446 and -0.585 e.A-3
Tabelle 14:
Kristalldaten und Strukturverfeinerung.
________________________________________________________________
x
y
z
U(eq)
________________________________________________________________
O(1)
C(2)
O(3)
C(4)
O(5)
C(5A)
C(6)
Br(6)
C(7)
O(71)
H(71)
C(8)
C(81)
O(81)
H(81)
C(9)
C(9A)
O(1')
C(2')
2445(2)
2202(4)
1861(2)
1254(4)
1939(2)
2504(4)
3188(3)
4383(1)
3716(3)
2900(2)
2960(30)
4117(3)
4811(4)
4943(2)
5400(30)
3859(3)
3169(3)
3331(2)
3196(4)
6429(4)
6890(7)
5227(4)
3782(7)
2360(4)
2944(6)
1272(6)
677(1)
1806(6)
1607(4)
590(40)
3885(6)
4271(6)
6300(4)
6850(40)
5193(5)
4812(7)
2612(4)
1176(6)
8591(2)
9641(3)
10188(2)
9532(4)
9186(2)
8316(3)
8011(3)
9177(1)
6990(3)
6068(2)
5720(30)
7004(3)
6124(4)
5916(2)
6370(30)
7683(3)
8557(3)
2638(2)
1800(3)
21(1)
25(1)
24(1)
26(1)
20(1)
15(1)
16(1)
24(1)
17(1)
19(1)
29
17(1)
20(1)
22(1)
33
15(1)
17(1)
21(1)
21(1)
Anhang
213
O(3')
2825(2)
-583(5)
2173(2)
26(1)
C(4')
1673(4)
-864(6)
2068(4)
25(1)
O(5')
1098(2)
932(4)
2144(2)
20(1)
C(5A')
1478(3)
2067(6)
3074(3)
16(1)
C(6')
528(4)
3078(6)
3454(3)
17(1)
Br(6')
-230(1)
4760(1)
2309(1)
21(1)
C(7')
853(3)
4373(6)
4450(3)
19(1)
O(71')
893(2)
3199(4)
5415(2)
21(1)
H(71')
1507(19)
2660(60)
5560(30)
31
C(8')
1907(3)
5416(6)
4406(3)
15(1)
C(81')
2111(4)
7053(6)
5236(3)
20(1)
H(81')
3651(14)
7600(50)
5380(40)
33
O(81')
3069(3)
8161(4)
5153(3)
22(1)
C(9')
2566(3)
5028(6)
3685(3)
15(1)
C(9A')
2322(3)
3539(6)
2802(3)
17(1)
_____________________________________________________________
Tabelle 15: Atomkoordinaten ( × 104) und äquivalente isotrope Ersatzparameter (Å2 × 103)
für mm13. U(eq) ist definiert als 1/3 der Spur des orthogonalisierten UijTensors.
Bindung
Länge [Å]
_________________________________________________________________________________
O(1)-C(2)
O(1)-C(9A)
C(2)-O(3)
O(3)-C(4)
C(4)-O(5)
O(5)-C(5A)
C(5A)-C(6)
C(5A)-C(9A)
C(6)-C(7)
C(6)-Br(6)
C(7)-O(71)
C(7)-C(8)
O(71)-H(71)
C(8)-C(9)
C(8)-C(81)
C(81)-O(81)
O(81)-H(81)
C(9)-C(9A)
O(1')-C(2')
O(1')-C(9A')
C(2')-O(3')
O(3')-C(4')
C(4')-O(5')
O(5')-C(5A')
C(5A')-C(6')
1.421(5)
1.429(5)
1.422(5)
1.432(5)
1.399(5)
1.427(5)
1.504(6)
1.531(6)
1.555(6)
1.974(4)
1.434(5)
1.508(6)
0.828(10)
1.305(5)
1.507(6)
1.428(5)
0.834(10)
1.497(5)
1.430(5)
1.441(5)
1.393(5)
1.428(5)
1.432(5)
1.426(5)
1.497(6)
214
Anhang
C(5A')-C(9A')
C(6')-C(7')
C(6')-Br(6')
C(7')-O(71')
C(7')-C(8')
O(71')-H(71')
C(8')-C(9')
C(8')-C(81')
C(81')-O(81')
O(81')-H(81')
C(9')-C(9A')
1.524(6)
1.538(6)
1.975(4)
1.446(5)
1.496(6)
0.844(10)
1.323(5)
1.526(6)
1.425(5)
0.832(10)
1.504(6)
Bindungen
Winkel [°]
_________________________________________________________________________________
C(2)-O(1)-C(9A)
O(1)-C(2)-O(3)
C(2)-O(3)-C(4)
O(5)-C(4)-O(3)
C(4)-O(5)-C(5A)
O(5)-C(5A)-C(6)
O(5)-C(5A)-C(9A)
C(6)-C(5A)-C(9A)
C(5A)-C(6)-C(7)
C(5A)-C(6)-Br(6)
C(7)-C(6)-Br(6)
O(71)-C(7)-C(8)
O(71)-C(7)-C(6)
C(8)-C(7)-C(6)
C(7)-O(71)-H(71)
C(9)-C(8)-C(81)
C(9)-C(8)-C(7)
C(81)-C(8)-C(7)
O(81)-C(81)-C(8)
C(81)-O(81)-H(81)
C(8)-C(9)-C(9A)
O(1)-C(9A)-C(9)
O(1)-C(9A)-C(5A)
C(9)-C(9A)-C(5A)
C(2')-O(1')-C(9A')
O(3')-C(2')-O(1')
C(2')-O(3')-C(4')
O(3')-C(4')-O(5')
C(5A')-O(5')-C(4')
O(5')-C(5A')-C(6')
O(5')-C(5A')-C(9A')
C(6')-C(5A')-C(9A')
C(5A')-C(6')-C(7')
C(5A')-C(6')-Br(6')
C(7')-C(6')-Br(6')
O(71')-C(7')-C(8')
114.3(3)
112.3(4)
116.5(3)
111.5(4)
114.9(3)
109.3(3)
113.0(3)
112.4(3)
110.0(3)
111.2(3)
107.4(3)
107.1(3)
108.0(3)
112.8(3)
113(2)
124.6(4)
123.2(4)
112.1(3)
113.2(3)
114(2)
124.7(4)
108.0(3)
109.4(3)
110.3(3)
113.0(3)
111.2(3)
117.2(4)
112.2(4)
114.2(3)
109.0(3)
109.9(3)
110.9(3)
113.2(3)
110.9(3)
107.3(3)
111.4(3)
Anhang
215
O(71')-C(7')-C(6')
109.3(3)
C(8')-C(7')-C(6')
112.4(3)
C(7')-O(71')-H(71')
111(2)
C(9')-C(8')-C(7')
123.5(4)
C(9')-C(8')-C(81')
123.4(4)
C(7')-C(8')-C(81')
113.1(3)
O(81')-C(81')-C(8')
113.9(3)
C(81')-O(81')-H(81')
115(2)
C(8')-C(9')-C(9A')
123.7(4)
O(1')-C(9A')-C(9')
108.2(3)
O(1')-C(9A')-C(5A')
112.0(3)
C(9')-C(9A')-C(5A')
111.2(3)
_____________________________________________________________
Tabelle 16:
Bindungslängen [Å] und Winkel [°].
Bindungen
Torrsionswinkel [°]
______________________________________________________________
C(9A)-O(1)-C(2)-O(3)
O(1)-C(2)-O(3)-C(4)
C(2)-O(3)-C(4)-O(5)
O(3)-C(4)-O(5)-C(5A)
C(4)-O(5)-C(5A)-C(6)
C(4)-O(5)-C(5A)-C(9A)
O(5)-C(5A)-C(6)-C(7)
C(9A)-C(5A)-C(6)-C(7)
O(5)-C(5A)-C(6)-Br(6)
C(9A)-C(5A)-C(6)-Br(6)
C(5A)-C(6)-C(7)-O(71)
Br(6)-C(6)-C(7)-O(71)
C(5A)-C(6)-C(7)-C(8)
Br(6)-C(6)-C(7)-C(8)
O(71)-C(7)-C(8)-C(9)
C(6)-C(7)-C(8)-C(9)
O(71)-C(7)-C(8)-C(81)
C(6)-C(7)-C(8)-C(81)
C(9)-C(8)-C(81)-O(81)
C(7)-C(8)-C(81)-O(81)
C(81)-C(8)-C(9)-C(9A)
C(7)-C(8)-C(9)-C(9A)
C(2)-O(1)-C(9A)-C(9)
C(2)-O(1)-C(9A)-C(5A)
C(8)-C(9)-C(9A)-O(1)
C(8)-C(9)-C(9A)-C(5A)
O(5)-C(5A)-C(9A)-O(1)
C(6)-C(5A)-C(9A)-O(1)
O(5)-C(5A)-C(9A)-C(9)
C(6)-C(5A)-C(9A)-C(9)
-50.6(5)
-33.4(5)
91.0(4)
-77.3(4)
-178.8(4)
55.3(5)
174.2(3)
-59.5(4)
-67.0(4)
59.3(4)
-77.7(4)
161.1(2)
40.4(5)
-80.7(4)
105.9(4)
-12.7(6)
-72.2(4)
169.2(3)
-14.9(6)
163.2(4)
179.9(4)
2.1(7)
-146.2(4)
93.7(4)
-138.6(4)
-19.1(6)
-69.2(4)
166.6(3)
172.2(3)
48.0(5)
216
Anhang
C(9A')-O(1')-C(2')-O(3')
-80.7(4)
O(1')-C(2')-O(3')-C(4')
90.8(4)
C(2')-O(3')-C(4')-O(5')
-31.1(5)
O(3')-C(4')-O(5')-C(5A')
-52.1(4)
C(4')-O(5')-C(5A')-C(6')
-144.8(3)
C(4')-O(5')-C(5A')-C(9A')
93.5(4)
O(5')-C(5A')-C(6')-C(7')
-179.1(3)
C(9A')-C(5A')-C(6')-C(7')
-58.1(4)
O(5')-C(5A')-C(6')-Br(6')
-58.5(4)
C(9A')-C(5A')-C(6')-Br(6')
62.5(4)
C(5A')-C(6')-C(7')-O(71')
-85.9(4)
Br(6')-C(6')-C(7')-O(71')
151.5(3)
C(5A')-C(6')-C(7')-C(8')
38.3(5)
Br(6')-C(6')-C(7')-C(8')
-84.4(4)
O(71')-C(7')-C(8')-C(9')
112.8(4)
C(6')-C(7')-C(8')-C(9')
-10.2(5)
O(71')-C(7')-C(8')-C(81')
-70.6(4)
C(6')-C(7')-C(8')-C(81')
166.5(3)
C(9')-C(8')-C(81')-O(81')
1.2(6)
C(7')-C(8')-C(81')-O(81')
-175.4(3)
C(7')-C(8')-C(9')-C(9A')
1.9(6)
C(81')-C(8')-C(9')-C(9A')
-174.3(4)
C(2')-O(1')-C(9A')-C(9')
-179.2(3)
C(2')-O(1')-C(9A')-C(5A')
57.9(4)
C(8')-C(9')-C(9A')-O(1')
-144.1(4)
C(8')-C(9')-C(9A')-C(5A')
-20.7(5)
O(5')-C(5A')-C(9A')-O(1')
-70.8(4)
C(6')-C(5A')-C(9A')-O(1')
168.7(3)
O(5')-C(5A')-C(9A')-C(9')
168.1(3)
C(6')-C(5A')-C(9A')-C(9')
47.6(4)
________________________________________________________________
Tabelle 17:
Torsionswinkel [°].
___________________________________________________________________________
D-H...A
d(D-H)
d(H...A)
d(D...A)
<(DHA)
O(71)-H(71)...O(81')a
0.828(10)
1.824(13)
2.646(4)
171(4)
b
O(81)-H(81)...O(1')
0.834(10)
1.941(15)
2.758(4)
166(4)
O(71')-H(71')...O(71)
0.844(10)
1.899(12)
2.737(4)
173(5)
O(81')-H(81')...O(81)
0.832(10)
1.875(11)
2.707(4)
178(4)
___________________________________________________________________________
Symmetrie-Transformationen, die genutzt wurden, um äquivalente Atome zu erzeugen:
a) x,y-1,z b) -x+1,y+1/2,-z+1
Tabelle 18:
Wasserstoffbrückenbindungen [Å und °].
Anhang
217
6.2 NMR-Spektren
6.2.1
(3R,4R,5R,6S)-4-Acetoxy-3-azid-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (268)
g
h
CO2CH3
OH
a f e
b c d
N3
O
OH
CH3
i
j
O
268
1
H-NMR:
x 0.355
5.00
4.90
CHCl3
a
4.80
4.70
4.60
4.50
4.40
4.30
c
4.20
b
4.10
e d
h
j
-OH
PPM
6.8
6.4
6.0
5.6
5.2
4.8
4.4
4.0
3.6
-OH
3.2
2.8
2.4
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 2.19 (s, 3H, CH3), 3.04 (bs, 1H, OH), 3.82 (bs, 1H, OH),
3.83 (s, 3H, CH3), 4.14 (dd, J = 10.2, 6.7 Hz, 1H, CH), 4.44-4.50 (m, 2H, 2 × CH), 4.99 (dd,
J = 10.2, 4.5 Hz, 1H, CH), 6.79 (dd, J = 5.3, 1.3 Hz, 1H, CH).
Abbildung 6.3:
1
H-NMR-Spektrum von (3R,4R,5R,6S)-4-Acetoxy-3-azid-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (268).
218
PPM
CDCl3 ced
160.0
150.0
140.0
130.0
120.0
110.0
100.0
90.0
80.0
70.0
20.9042
71.6945
71.4125
69.8197
fa
52.7489
134.4998
132.6290
i g
56.6967
166.1414
C-NMR:
170.8210
13
Anhang
b h
60.0
50.0
j
40.0
30.0
20.0
10.0
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) δ [ppm] = 20.9 (CH3), 52.7 (CH3), 56.7 (CH), 69.8 (CH), 71.4
(CH), 71.7 (CH), 132.6 (CH), 134.5 (Cq), 166.1 (CO), 170.8 (CO).
Abbildung 6.4:
13
C-NMR-Spektrum von (3R,4R,5R,6S)-4-Acetoxy-3-azid-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (268).
Anhang
219
ent-Valienamin-Pentaacetat (ent-163)
6.2.2
OAc
OAc
AcHN
OAc
OAc
Literatur-Daten zu Valienamin-Pentaacetat:78b
1
H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ [ppm] = 5.89 (q, J = 1.4 Hz, 1 H), 5.69 (db, J = 8.7 Hz, 1 H),
5.46 (dd, J = 9.4, 6.4 Hz, 1H), 5.36 (db, J = 6.7 Hz, 1 H), 5.11 (d, J = 4.6 Hz, 1 H), 5.09 –
4.98 (m, 1 H), 4.65 (dq, J = 13.2, 1.1 Hz, 1 H), 4.39 (d, J = 13.3 Hz, 1 H), 2.07 (s, 9 H), 2.06
(s, 3 H), 2.02 (s, 3 H).
Vermessene Spektren:
H-NMR:
6.8
6.4
6.0
5.6
4.8
5.0
4.8
1.008
4.6
4.4
4.2
4.0
1.008
1.075
5.2
*
1.075
1.225
1.166
0.981
5.2
*
* *
5.4
1.095
0.981
5.6
0.998
5.8
PPM
*
1.095
1.166
0.998
x 8.000
*
*
1.166
1.225
*
1.166
1
4.4
4.0
3.6
3.2
2.8
2.4
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
(400 MHz, CDCl3, 23 °C) zugeordnete Signale: δ [ppm] = 4.40 (d, J = 13.3 Hz, 1H, CHH),
4.65 (dm, J = 13.3 Hz, 1H, CHH), 5.04 (m, 1H, CH), 5.09 (dd, J = 9.9, 4.7 Hz, 1H, CH), 5.38
(db, J = 5.6 Hz, 1H, CH), 5.45 (dd, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H, CH), 5.75 (db, J = 8.8 Hz, 1H, NH),
5.89 (m, 1H, CH).
Abbildung 6.5:
1
H-NMR-Spektrum von ent-Valienamin-Pentaacetat (ent-163).
220
Anhang
Literatur-Daten zu Valienamin-Pentaacetat:78b
13
C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ [ppm] = 171.1, 170.5, 170.3, 170.2, 170.1, 134.2, 126.2, 70.7,
68.9, 68.2, 62.7, 44.6, 22.9, 20.6, 20.4.
PPM
170.0
160.0
150.0
140.0
130.0
*** *
120.0
110.0
100.0
90.0
80.0
70.0
60.0
23.4034
23.2018
20.9819
20.7141
20.6785
20.6636
20.6203
20.5567
14.1453
28.3368
35.1121
46.6605
44.8485
*
71.5355
71.3211
69.0397
68.4301
63.0680
62.8742
60.3479
126.1349
*
77.3182
77.0000
76.6831
134.2728
C-NMR:
170.6998
170.4384
170.2990
170.1031
169.8776
169.8635
169.7468
169.5239
13
*
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
(100 MHz, CDCl3, 23 °C) zugeordnete Signale: δ [ppm] = 45.1, 63.2, 68.7, 69.3, 71.6, 126.4,
134.5.
Abbildung 6.6:
13
C-NMR-Spektrum von ent-Valienamin-Pentaacetat (ent-163).
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
221
7 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildungen:
Abbildung 1.1:
Die Naturstoffe Rebeccamycin (1) und Staurosporin (2) und eine
Auswahl an Verbindungen, die durch Kombination von Genen verschiedener Mikroorganismen synthetisiert werden konnten.___________ 3
Abbildung 1.2:
Schematische Darstellung der Funktion von Chorismat (3) als ein
zentraler Verzweigungspunkt in der Biosynthese mit wichtigen aus 3
hervorgehenden Metaboliten.___________________________________ 4
Abbildung 1.3:
Schematische Darstellung einiger von Chorismat abgeleiteter Produktverbindungen des Chorus-Projektes. _________________________ 5
Abbildung 1.4:
Kooperationen im Chorus-Projekt. ______________________________ 6
Abbildung 3.1:
Shikimat-Biosyntheseweg: Intermediate (Abkürzung): Phosphoenolpyruvat (PEP), D-Erythrose-4-phosphat (E4P), 3-Deoxy-D-arabinoheptulosesäure-7-phosphat (DAHP), Dehydrochinasäure (DHQ), Chinasäure (QA), Dehydroshikimat (DHS), Shikimat (SA), 3-Phosphoshikimat (S3P), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat (EPSP); Gen
(Enzym): aroF, aroG, aroH (DAHP Synthase); aroB (3-Dehydrochinasäure Synthase); quiA (Chinasäure Dehydrogenase); aroD (3Dehydrochinasäure Dehydratase); aroE (Shikimat Dehydrogenase);
aroK, aroL (Shikimat Kinase); aroA (EPSP Synthase); aroC (Chorismat Synthase). _____________________________________________ 10
Abbildung 3.2:
Chorismat (3) als gemeinsames Zwischenprodukt in den Biosynthesen verschiedener Metabolite; Enzyme (Gene): Chorismat Mutase
(pheA, tyrA); Anthralinat Synthase (trpD, trpE); Aminodeoxychorismat Synthase (pabB, pabA), Aminodeoxychorismat Lyase
(pabC); Chorismat Lyase (ubiC); Isochorismat Synthase (menF,
entC). ____________________________________________________ 11
Abbildung 3.3:
Einige von Chorismat (3) aus zugängliche Metabolite; X = bislang
nicht identifiziertes Enzym aus Nicotiana silvestria;20 ––– präparativ
zugänglich; ---- bislang nicht präparativ erschlossen; 2-Amino-2-deoxyisochorismat (ADIC, 26); 4-Amino-4-deoxychorismat (ADC, 27). _ 12
Abbildung 3.4:
3-Amino-5-hydroxybenzoesäure (AHBA, 30) und die Antibiotika
Rifamycin B (28) und Geldanamycin (29) als Beispiele für Naturstoffe, deren Biosynthese über den Aminoshikimat-Biosyntheseweg
und AHBA (30) als Intermediat verläuft. ________________________ 13
Abbildung 3.5:
Schematische Darstellung des Aminoshikimat-Biosyntheseweges in
A. mediterranei; Intermediat (Abkürzung): Phosphoenolpyruvat
(PEP), D-Erythrose-4-phosphat (E4P), Imino-D-erythrose-4-phosphat
(IminoE4P), 4-Amino-3,4-dideoxy-D-arabino-heptulosesäure-7-phosphat (Amino-DAHP), Aminodehydrochinasäure (AminoDHQ), Aminodehydroshikimat (AminoDHS), 3-Amino-5-hydroxybenzoesäure
(AHBA), Aminoshikimat (AminoSA); Enzym (Gen): AminoDAHP
Synthase (rifH); AminoDHQ Synthase (rifG); AminoDHQ Dehydratase (rifJ); AHBA Synthase (rifK); AminoSA Dehydrogenase (rifI). ___ 14
222
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildung 3.6:
Mögliche Biosynthesen von IminoE4P (31); Enzyme: RifN: Kanosamin Kinase; a) Phosphokanosamin Isomerase; b) Transketolase; c)
Amidohydrolase. ___________________________________________ 14
Abbildung 3.7:
Schematische Darstellung der Ganzzelltransformation von Kanosamin zu Aminoshikimat (AminoSA) mit E. coli SP1.1/pJG6181.B.24a __ 15
Abbildung 3.8:
Biosynthese von Protocatechusäure (39), Brenzkatechin (40), Gallussäure (41) und Pyrogallol (42) aus Dehydroshikimat (DHS, 14);
Enzym (Gen): 3-Dehydroshikimat Dehydratase (aroZ), Protocatechusäure Decarboxylase (aroY), p-Hydroxybenzoat HydroxylaseY201F
(pobA*). __________________________________________________ 16
Abbildung 3.9:
Synthese aromatischer Produkte aus biotechnologisch gewonnenen
Vorläufersubstanzen; A Phenol (43) aus 15;30 B Brenzkatechin (40)
aus 39;27b C Pyrogallol (42) aus 41.29b ___________________________ 17
Abbildung 3.10: Beispiele für natürlich vorkommende Cyclitole. ___________________ 18
Abbildung 3.11: Beispiele für Pseudo-β-D-Glucosen. ____________________________ 19
Abbildung 3.12: Beispiele für natürlich vorkommende Carbazucker mit ungesättigtem
C7-Körper. ________________________________________________ 20
Abbildung 3.13: Als Gabosine bezeichnete und aus verschiedenen Streptomyces Stämmen isolierte Carbazucker.____________________________________ 21
Abbildung 3.14: Chorismat (3) und strukturell verwandte Sekudärmetabolite.41, 54______ 22
Abbildung 3.15: Strukturen von Oseltamivir (67), Valienamin (64), Acarbose (65) und
Validamycin A (66). ________________________________________ 23
Abbildung 3.16: Diskutierte Reaktionswege für die Bildung der Aminocarbazuckeruntereinheit in Validamycin A (66).58 ___________________________ 24
Abbildung 3.17: Synthese von Oseltamivir (67) im 50-250 kg Maßstab.70 ____________ 26
Abbildung 3.18: Strategien zur Synthese von Oseltamivir (67) A nach Karpf und Mitarbeitern;71a B nach Wirz und Mitarbeitern;71a C nach Shibasaki und
Mitarbeitern.72 _____________________________________________ 27
Abbildung 3.19: Auswahl der in der Synthese ungesättigter Carbazucker eingesetzten
Edukte. ___________________________________________________ 28
Abbildung 3.20: Synthese von Gabosin I (8) ausgehend von 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-Dglucopyranose (91) nach Lubineau und Billault.50 _________________ 29
Abbildung 3.21: Synthese der für Gabosin K angenommenen Struktur 68 nach Singh
et al.52 ____________________________________________________ 30
Abbildung 3.22: Synthese des peracetylierten Carbazuckers 103 nach Hudlicky und
Entwistle.76 ________________________________________________ 31
Abbildung 3.23: Schematische Darstellung aller möglichen relativen und absoluten
Konfigurationen von cis- und trans-CHD. _______________________ 31
Abbildung 3.24: Beispiele für Produkte, die über CHD synthetisiert wurden; A Synthesen über cis-CHD;77 B Synthesen über trans-CHD;78 113 wurde
ausgehend von einem cis-CHD über ein trans-CHD synthetisiert. _____ 32
Abbildung 3.25: Oxidation von Benzol mit unterschiedlichen Stämmen von Pseudomonas putida; A P. putida F1; B P. putida F39/D.79 ________________ 33
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
223
Abbildung 3.26: Auswahl verschiedener cis-CHD, die durch enzymatische Oxidation
von aromatischen Kohlenwasserstoffen gebildet wurden.79 __________ 34
Abbildung 3.27: Darstellung beider Enantiomere von 120 nach Boyd et al.80,81 ________ 34
Abbildung 3.28: Teilschritte des Abbaus aromatischer Systeme in Säugetierzellen;
i Oxidation mittels Monooxygenase; ii Epoxidhydrolase.82,83 _________ 35
Abbildung 3.29: Benzenoxid (125) aromatisiert in saurer Lösung langsamer als Cyclohexadienol 128.85 ___________________________________________ 35
Abbildung 3.30: Die ersten enzymatischen Schritte der Enterobactin-Synthese aus
Chorismat (3); EntC, MenF: Isochorismat Synthase, EntB: Isochorismat Lyase; EntA: 2,3-Dihydroxy-2,3-dihydrobenzoat Dehydrogenase. _ 36
Abbildung 3.31: Biosynthese von 5 und 4 aus Chorismat (3); EntB: Isochorismat
Lyase; EntC, MenF: Isochorismat Synthase. ______________________ 37
Abbildung 3.32: Die polyketidischen Naturstoffe Ansatrienin A (131) und Ascomycin
(132), die eine mono- oder trisubstituierte Cyclohexaneinheit mit Ursprung aus dem Shikimat-Biosyntheseweg enthalten; diese Substituenten sind in den Strukturen der Naturstoffe hervorgehoben. _________ 38
Abbildung 3.33: Angenommene Biosynthese der Polyketid-Startereinheit 138 von
Ansatrienin A (131).14, _______________________________________ 38
Abbildung 3.34: Angenommene Biosynthese der Polyketid-Startereinheit 140 von
Ascomycin (132);95 i 1,4-anti-Eliminierung von Wasser, ii Reduktion
der dreifach substituierten Doppelbindung und anschließende Isomerisierung, iii Reduktion der verbliebenen Doppelbindung. ___________ 39
Abbildung 3.35: Von Dr. D. Franke genutzte Strategie zur mikrobiellen Produktion
von 2,3-trans-CHD (4).12,100a __________________________________ 40
Abbildung 3.36: Von Dr. D. Franke genutzte Strategie zur mikrobiellen Produktion
von 3,4-trans-CHD (5).12,100b __________________________________ 41
Abbildung 3.37: Beispiele für Synthesen von trans-CHD aus cis-CHD A nach Boyd et
al.;101 B nach Pearson et al.;102 C nach Hudlicky et al.104 ____________ 42
Abbildung 3.38: Synthese von (-)-Zeylena (113) aus Styrol nach Hudlicky et al.78a _____ 43
Abbildung 3.39: Synthese der Diene rac-151 bzw. 158 nach Trost et al.;78b A Synthese
von racemischen 151 mittels Diels-Alder-Reaktion; B enantioselektive Synthese von 158 über Palladium-katalysierte allylische Substitution. ____________________________________________________ 44
Abbildung 3.40: Synthese von Valienaminpentaacetat (163) aus 158 mit trans-CHD
ent-160 als Zwischenstufe nach Trost et al.78b _____________________ 45
Abbildung 3.41: Chemische Synthese von racemischem 3,4-trans-CHD nach Berchtold und Chiasson.111 ________________________________________ 46
Abbildung 3.42: Chemische Synthese von racemischem 3,4-trans-CHD nach Ganem
und Ikota.113 _______________________________________________ 47
Abbildung 3.43: Chemische Synthese eines racemischen Derivates des 3,4-trans-CHD
nach Posner et al.114 _________________________________________ 47
Abbildung 3.44: Synthese des racemischen Methylesters rac-170 nach Roberts et al.115 _ 48
224
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildung 3.45: Synthese des Methylesters 170 von 3,4-trans-CHD nach Boyd et
al.116 _____________________________________________________ 48
Abbildung 4.1:
A Fließschema des Shikimatbiosyntheseweges; B Strategie zur Überexpression von Genen zur Produktion von 2,3-trans-CHD (4);
C Strategie zur Überexpression von Genen zur Produktion von 3,4trans-CHD (5); hervorgehobene Pfeile symbolisieren einen durch
Überexpression hervorgehoben dargestellter Gene verstärkten metabolischen Fluss; Intermediate (Abkürzung): Phosphoenolpyruvat
(PEP, 9), D-Erythrose-4-phosphat (E4P, 10), 3-Deoxy-D-arabinoheptulosesäure-7-phosphat (DAHP, 11), Dehydrochinasäure (DHQ,
12), Dehydroshikimat (DHS, 14), Shikimat (SA, 15), 3-Phosphoshikimat (S3P, 16), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat (EPSP, 17);
Enzym (Gen): DAHP Synthase (aroF, aroG, aroH), 3-Dehydrochinasäure Synthase (aroB), 3-Dehydrochinasäure Dehydratase (aroD),
Shikimat Dehydrogenase (aroE), Shikimat Kinase (aroK, aroL),
EPSP Synthase (aroA), Chorismat Synthase (aroC), Isochorismat
Synthase (entC, menF), Isochorismat Lyase (entB). ________________ 51
Abbildung 4.2:
Chromosomale Deletionen in E. coli Stämmen, die zur Produktion
von 4 und 5 eingesetzt werden sollen; Enzym (Gen): Chorismat Mutase (pheA, tyrA), Anthranilat Synthase (trpD, trpE), Aminodeoxychorismat Synthase (pabA,B), Chorismat Lyase (ubiC), Isochorismat
Synthase (menF, entC). ______________________________________ 52
Abbildung 4.3:
Schema zur Klonierung des Vektors pF112 ausgehend von pF81 und
pF109. ___________________________________________________ 53
Abbildung 4.4:
PCR-Reaktion zur Amplifikation der Gene entC und entB unter
Einfügung flankierender Schnittstellen und Zwischenklonierung des
erhaltenen PCR-Produktes in den Vektor pUCBM20. ______________ 55
Abbildung 4.5:
Schema zur Klonierung der Vektoren pC19 – pC22. Hierzu wurden
die Vektoren pF109 und pF112 je mit BamHI linearisiert und mit
SAP desphosphoryliert, um mit den linearen DNA-Fragmenten entCentB* bzw. entB* mittels Ligation mit T4-DNA-Ligase kombiniert zu
werden. ___________________________________________________ 56
Abbildung 4.6A
Untersuchung der isolierten Plasmid-DNA per Restriktionsanalyse
(BssHII) und Gelelektrophorese; mit M ist aufgetragener DNAGrößenmarker gekennzeichnet, mit sind Bahnen markiert, die Fragmente der erwarteten Größe zeigten. Größe der erwarteten Fragmente
[bp]: pC19: 868, 905, 2563, 5329; pC20: 868, 905, 2563, 5890. ______ 57
Abbildung 4.6B
Untersuchung der isolierten Plasmid-DNA per Restriktionsanalyse
(BssHII) und Gelelektrophorese; mit M ist aufgetragener DNAGrößenmarker gekennzeichnet, mit sind Bahnen markiert, die Fragmente der erwarteten Größe zeigten. Größe der erwarteten Fragmente
[bp]: pC21: 868, 905, 1352, 5329; pC22: 868, 905, 1352, 5890. ______ 57
Abbildung 4.7:
Screenshots aus den gegenläufigen Sequenzierungen beider komplementärer Stränge des Plasmides pUCBM20-entC-entB. Hervorgehoben ist jeweils das mutierte Codon. ___________________________ 58
Abbildung 4.8:
SDS-PAGE-Gel zum Nachweis der Bildung durch die Plasmide pC19
– 22 codierter Proteine. Erwartete Banden: EntC 42.9 kDa, AroB
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
225
38.9 kDa, AroF 38.8 kDa, EntB 32.6 kDa, AroL 19.2 kDa. Gefunden
wird in allen Fällen nach Induktion eine deutlich sichtbare Bande bei
39 kDa. Bei pC21 und pC22 wird weiterhin eine Bande bei 33 kDa
gefunden, die auf die Expression des Genes entB zurückgeführt
werden kann. ______________________________________________ 59
Abbildung 4.9:
HPLC-Chromatogramm von Fermentationsüberständen und UVSpektren der Hauptfermentationsprodukte; aufgetragen sind die
Absorption bei einer Wellenlänge von λ = 275 nm in relativen
Einheiten gegen die Retentionszeit;
A F68/pC20 ----- ohne
Induktion, –––– nach Induktion mit IPTG; B F68/pC22 ----- ohne
Induktion, –––– nach Induktion mit IPTG; deutlich ist jeweils die
Bildung je eines neuen Hauptproduktes nach Induktion zu erkennen. __ 62
Abbildung 4.10: Schematische Darstellung der Aufreinigung der trans-CHD 4 und 5
aus Fermentationsüberständen; I Abtrennen der Biomasse; II Aufreinigung der trans-CHD über Ionenaustauschchromatographie an
basischem Anionentauscherharz; III Isolierung der trans-CHD aus
dem Eluat. ________________________________________________ 63
Abbildung 4.11: Nachvollzogene Synthese von rac-5 nach Ganem und Ikota.113 _______ 65
Abbildung 4.12: Veresterung von rac-5 zu rac-170 mit methanolischem Chlorwasserstoff; eine Ausbeute wurde nicht bestimmt._______________________ 66
Abbildung 4.13: Zur Enantiomerentrennung von 5 genutzte chirale Phase. ___________ 67
Abbildung 4.14: HPLC-Chromatogramme von rac-170 (links) und 170 (rechts) im
Vergleich; aufgetragen ist die Absorption bei einer Wellenlänge von
λ = 280 nm in relativen Einheiten [mAU] gegen die Retentionszeit
[min]; stationäre Phase: Chiracel OD-H Chromatographiesäule
(250 mm × 4.6 mm) der Fa. DAICEL, mobile Phase: n-Hexan und 2Propanol (95:5 v/v), 0.5 mL × min-1, T = 40 °C. ___________________ 67
Abbildung 4.15: Funktionelle Gruppen der trans-CHD 4 und 5 sowie Beispiele für
mögliche Reaktionen, in welchen diese eingesetzt werden können. ____ 68
Abbildung 4.16: Sauer katalysierte Veresterung der Säurefunktionen von 4 und 5 zu
Methylester 196 und 170._____________________________________ 70
Abbildung 4.17: Einführung von TBS-Gruppen als Alkoholschutzgruppen an 196 und
170.______________________________________________________ 71
Abbildung 4.18: Einführung von MOM-Gruppen als Alkoholschutzgruppen an 180. ___ 71
Abbildung 4.19: Bildung des 1,3,5-Trioxepins 198 aus 170. _______________________ 72
Abbildung 4.20: A Lewissäure-katalysierte Disproportionierung von MOMCl;135 B
Schematische Darstellung der versuchten Überführung von 197 in
198.______________________________________________________ 72
Abbildung 4.21: Veresterung der Alkoholfunktionen in 170 mit Acetanhydrid. ________ 73
Abbildung 4.22: Schematische Darstellung zweier energieminimierter Konformationen; im Konformationsisomer I weisen die rot dargestellten Sauerstoffsubstituenten eine pseudo-axiale Ausrichtung bezogen auf den
Cyclohexadienring auf, im Konformationsisomer II wird eine pseudoäquatoriale Anordnung gefunden. ______________________________ 74
226
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildung 4.23: Dargestellt sind die molekularen CD-Spektren von 170, 185, 197, 198
und 199 gemessen in Acetonitril._______________________________ 75
Abbildung 4.24: Schematische Darstellung der Konformationsisomere I und II für
Derivate des 3,4-trans-CHD und der Dihedralwinkel Θ des Diensystems; R = -H, -TBS, -Ac, -MOM, -CH2OCH2-. _________________ 75
Abbildung 4.25: Schematische Darstellung der für Konformationsisomer I und II für
Derivate des 3,4-trans-CHD zwischen pseudo-axialständigem Substituenten und einer Doppelbindung gefundenen Dihedralwinkel Θ´;
R = -H, -TBS, -Ac, -MOM, -CH2OCH2-. ________________________ 76
Abbildung 4.26: Oxidation von Derivaten des 2,3-trans-CHD mit mCPBA nach Dr. D.
Franke.12 __________________________________________________ 81
Abbildung 4.27: Oxidation von 170 mit mCPBA; dargestellt sind die analog zur
Epoxidation von 196 angenommene Stereochemie der Produkte 201
und 202. __________________________________________________ 82
Abbildung 4.28: Epoxidierung von cis-CHD 203 mit mCPBA nach Campbell et al.153 __ 82
Abbildung 4.29: Oxidation von 185 mit mCPBA; a) eine Zuordnung der Stereochemie
zu beiden Produkten gelang nicht; dargestellt ist die angenommene
Stereochemie. ______________________________________________ 82
Abbildung 4.30: Epoxidierung von 198 mit mCPBA; die Stereochemie der Produkte
wurde nicht bewiesen; dargestellt ist die angenommene Stereochemie
der Produkte. ______________________________________________ 83
Abbildung 4.31: Schematische Darstellung der Oxidation eines Olefins mittles in situ
erzeugtem Dioxiran zum Epoxid. ______________________________ 83
Abbildung 4.32: Schematische Darstellung beider für die Epoxidierungsreaktion
mittels Dioxiran vorgeschlagenen Übergangszustände. _____________ 84
Abbildung 4.33: Oxidation von trans-Stilben (214) mit Caro´scher Säure in Gegenwart chiraler Ketone A nach Yang et al.157 B nach Shi et al.158b _______ 85
Abbildung 4.34: Oxidation von 185 mittels eines Dioxirans zu den Epoxiden 206 und
207.______________________________________________________ 85
Abbildung 4.35: Darstellung von Epoxid 207 und Brom-CHD 218 aus 216 und 217. ___ 86
Abbildung 4.36: Energieminimierte Konformationen von 216 und Diederwinkel entlang der Bindung zwischen C-5 und C-6; TBS-Ether, Methylester und
nicht an C-5 und an C-6 gebundene Protonen wurden ausgeblendet. ___ 87
Abbildung 4.37: Diskutierte Mechanismen zur Bildung des zyklischen Osmatesters; A
konzertierter [3+2] Mechanismus;164,166 B stufenweiser [2+2]
Mechanismus.167 ___________________________________________ 88
Abbildung 4.38: Die beiden katalytischen Zyklen, welche bei der asymmetrischen Dihydroxylierung mit NMO als Kooxidationsmittel durchlaufen werden.165 ____________________________________________________ 89
Abbildung 4.39: A Untersuchungen von Carless et al. zur Oxidation unterschiedlich
substituierter cis-CHD;176 B Untersuchungen zur Oxidation von
Sutherland et al. zur Oxidation von cis-CHD 222.178 _______________ 90
Abbildung 4.40: Übersicht über die Produkte der Osmiumtetroxid-katalysierten cisDihydroxylierung ausgehend von Derivaten des 2,3-trans-CHD.______ 91
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
227
Abbildung 4.41: Produkte der Osmiumtetroxid-katalysierten cis-Dihydroxylierung von
Bis-TBS-Ether 185 und nachfolgende Reaktionen zum Beweis der
Stereochemie der Produkte. ___________________________________ 92
Abbildung 4.42: Konformation von 233 und wichtige im NOESY-Experiment gefundene Signalverstärkungen (NOE-Kontakte) in Abhängigkeit zur
Anregungsfrequenz (CDCl3, 400 MHz), welche gemeinsam nur durch
die dargestellte Konfiguration und Konformation von 233 erklärt
werden können. ____________________________________________ 93
Abbildung 4.43: Dihydroxylierung von 3,4-cis-CHD 98 nach Singh et al.52 ___________ 93
Abbildung 4.44: Dihydroxylierung nach Shing et al. mit in situ generiertem RuO4.180 ___ 94
Abbildung 4.45: 160 zeigt in Gegenwart von RuO4 über 4 Stunden keine Reaktion. ____ 94
Abbildung 4.46: Angenommener Mechanismus der Woodward-cis-Dihydroxylierung. __ 95
Abbildung 4.47: Variante der Woodward-cis-Dihydroxylierung nach Granger et al.183b__ 95
Abbildung 4.48: Oxidation von Dien 160 zu β- Acetoxybromverbindung 238. ________ 96
Abbildung 4.49: Spaltung der TBS-Ether in 238; unten dargestellt ist die durch Röntgenstrukturuntersuchung erhaltene Kristallstruktur von Verbindung
239; Ellipsoide entsprechen einer 50%igen Aufenthaltswahrscheinlichkeit.___________________________________________________ 96
Abbildung 4.50: Oxidation von 185 mit N-Bromacetamid in Gegenwart von Essigsäure zu den beiden Isomeren 216 und 217. ______________________ 97
Abbildung 4.51: Mögliche isomere Strukturen für Verbindung 217. _________________ 97
Abbildung 4.52: In NOE-Differenz-Experimenten für 217 gefundene Signalverstärkungen (NOE-Kontakte) in Abhängigkeit zur Anregungsfrequenz
(CDCl3, 400 MHz). _________________________________________ 98
Abbildung 4.53: Spalten der TBS-Ether aus 217 mit Flusssäure und Peracetylierung zu
240.______________________________________________________ 99
Abbildung 4.54: Angenommene Stereochemie von 217 und der sich daraus ergebende
Reaktionsverlauf zur Bildung von 216 und 217 aus 185 mit N-Bromacetamid in Gegenwart von Essigsäure._________________________ 100
Abbildung 4.55: Oxidation von 198 zur Bromverbindung 242 und deren Reduktion zu
Diol 243 sowie die aus der Röntgenstrukturuntersuchung erhaltene
Struktur von 243; Ellipsoide entsprechen einer 50%igen Aufenthaltswahrscheinlichkeit. ________________________________________ 101
Abbildung 4.56: Oxidation von Dien 160 mit N-Bromacetamid in Acetonitril.________ 102
Abbildung 4.57: Darstellung von Bromhydrin 245 aus Epoxid 161. ________________ 102
Abbildung 4.58: Umsetzung von Diol 227 zur Bromverbindung 247. _______________ 103
Abbildung 4.59: Umsetzung von Diol 248 zu Bromverbindung 250. _______________ 103
Abbildung 4.60: Schematische Darstellung der bevorzugten Konformationsisomere
von 160 und 185 unter Andeutung der sterischen Effekte pseudoaxialständiger Reste. _______________________________________ 106
Abbildung 4.61: Die Struktur von ent-Streptol (ent-58) wird retrosynthetisch auf 4
zurückgeführt. ____________________________________________ 108
228
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildung 4.62: Synthese von 227 ausgehend von 4. ___________________________ 108
Abbildung 4.63: Reduktion und TBS-Etherspaltung als abschließende Stufen zur Synthese von ent-Streptol (ent-58). _______________________________ 109
Abbildung 4.64: Die Struktur von ent-Valienon / ent-Gabosin I (ent-8) wird retrosynthetisch auf 251 zurückgeführt. _______________________________ 110
Abbildung 4.65: Selektive Schutzgruppeneinführung am primären Alkohol von 251 zu
248._____________________________________________________ 110
Abbildung 4.66: Oxidation der Allylalkohole 227, 248 und 252 zu α,β-ungesättigten
Ketonen. _________________________________________________ 111
Abbildung 4.67: in situ Generierung des Oxoammoniumkations 257 aus 256 und paraToluensulfonsäure. _________________________________________ 111
Abbildung 4.68: Die Struktur von Valienon (8) wird retrosynthetisch auf 3,4-transCHD (5) zurückgeführt. _____________________________________ 112
Abbildung 4.69: Die ersten Stufen der Synthese von Valienon (8) ausgehend von BisTBS-Ether 185; *) angenommene Stereochemie. _________________ 113
Abbildung 4.70: Nucleophile Öffnung von Epoxid 207 mit Acetat unter sauren Bedingungen in analytischen Ansätzen. Neben den Reaktionsbedingungen ist der Flächenanteil des für das Produkt gefundenen Peaks
im Verhältnis zur Summe aller Produkte laut GCMS.______________ 114
Abbildung 4.71: Überführung von 260 in 262 über zwei Stufen.___________________ 114
Abbildung 4.72: Einführen von zu TBS-Ethern orthogonalen Schutzgruppen und anschließendes Spalten der TBS-Ether; A Einführen von Methoxymethylethern; B Einführen einer Acetonidschutzgruppe. ___________ 115
Abbildung 4.73: Energieminimierte 3D-Modelle der in der Oxidationsreaktion eingesetzten Allylalkohole; aus Gründen der Übersicht wurden TBS-,
MOM- und Methyl-Gruppen wie auch Wasserstoffatome ausgeblendet; zu erkennen ist, dass für die markierten allylischen Alkoholfunktionen für 248 und 259 eine pseudo-äquatoriale Ausrichtung zu
erwarten ist, der allylische Alkohol im Falle von 264 jedoch bevorzugt pseudo-axial orientiert erwartet wird. ______________________ 116
Abbildung 4.74: Oxidation des allylischen Alkohols und Schutzgruppenabspaltung
ausgehend von A Allylalkohol 264; B Allylalkohol 259. ___________ 117
Abbildung 4.75: Dargestellt sind die molaren CD-Absorptionskoeffizienten (∆ε [M-1
cm-1]) von 8 und ent-8 gegen die Wellenlänge (λ [nm]) bei einer
eingewogenen Konzentration von je 0.03 mg × mL-1 in Acetonitril. __ 118
Abbildung 4.76: ent-Valienamin (ent-64) wird retrosynthetisch auf trans-CHD 4
zurückgeführt. ____________________________________________ 119
Abbildung 4.77: Versuche zur Überführung des vicinalen Diols 227 in den vicinalen
Aminoalkohol 269 mittels Ritter-Reaktion.193 ____________________ 119
Abbildung 4.78: Versuche zur Osmium(VIII)-katalysierten Aminohydroxylierung von
160 mit unterschiedlichen Oxidationsmitteln. ____________________ 120
Abbildung 4.79: Versuch zur nucleophilen Substitution von Brom gegen Azid
ausgehend von 247 bei gefundener Eliminierung von Essigsäure. ____ 120
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
229
Abbildung 4.80: Umsetzung von 245 mit LiN3 zu 161 und 271. ___________________ 121
Abbildung 4.81: Darstellung von 268 ausgehend von 247 in zwei Stufen. ___________ 121
Abbildung 4.82: Schematische Darstellung möglicher Konformationsisomere von 268
und 3-epi-268. ____________________________________________ 122
Abbildung 4.83:
Abbildung 4.84:
1
H-NMR-Spektrum von 268. _________________________________ 122
13
C-NMR-Spektrum von 268. ________________________________ 123
Abbildung 4.85: Reduktion von 268 oder 271 und anschließende Peracetylierung zur
Synthese von ent-Valienamin-Pentaacetat (ent-163). ______________ 124
Abbildung 4.86: Beispiele für aus 3 biosynthetisch zugängliche Verbindungen; X:
nicht identifiziertes Enzym aus Nicotiana silvestria;20 Irp9: für die
Umsetzung von Chorismat zu Salicylat verantwortlich gemachtes Enzym aus Yersinia enterocolitica;21a PchB: für die Umsetzung von Isochorismat zu Salicylat verantwortlich gemachtes Enzym aus Pseudomonas aeruginos;21b PmsB: für die Umsetzung von Isochorismat zu
Salicylat verantwortlich gemachtes Enzym aus P. fluorescens.21c ____ 128
Abbildung 4.87: Weitere vermutlich von 3 oder dessen Vorläufern abgeleitete
Metabolite, deren Biosynthesen bislang nicht detailliert untersucht
sind.54,204 _________________________________________________ 129
Abbildung 4.88: Hypothetische Transformation von 5 mit Enzymen aus der Ascomycin-Biosynthese;95 i Reduktion der dreifach substituierten Doppelbindung und anschließende Isomerisierung, ii Reduktion der verbliebenen Doppelbindung. ______________________________________ 130
Abbildung 4.89: Alternative zyklische Schutzgruppen für Diol 170.________________ 131
Abbildung 4.90: Einführung zyklischer Malonsäureesters als Schutzgruppen in 170. __ 132
Abbildung 4.91: Hydrierung von trans-CHD 196 mit Wasserstoff an Palladium.12 ____ 132
Abbildung 4.92: Erwartete Produkte aus Hydroborierung209 und reduktiver Epoxidöffnung.210 _______________________________________________ 132
Abbildung 4.93: Beispiele für funktionelle Gruppen, die über Borane eingeführt werden können.211b,c,d,212 _______________________________________ 133
Abbildung 4.94: Literaturbeschriebene Bildung und Umsetzung von geminal-Dihalocyclopropanen; A Reaktion eines cis-CHD mit in situ gebildetem
Carben;213 B Reaktion mit Essigsäure unter Ringerweiterung;215a
C mögliche Reaktion eines trans-CHD unter Ringerweiterung. ______ 134
Abbildung 4.95: Hypothetische Synthese von Keisslon aus 2,3-trans-CHD; i CH2Br2,
NaOH; ii MeLi; iii CuI, BrMgCH3; iv a) AcOH, AgBF4; b) NaOH; v
a) DIBAL-H; b) TBS-OTf, NEt3; c) nBuLi; d) H2O, HF; e) SwernOxidation.________________________________________________ 134
Abbildung 4.96: Beispiele für Baeyer-Villiger-Oxidationen an substituierten Cyclohexenonen; A nach Krafft;218f B nach Schultz.218d ________________ 135
Abbildung 4.97: Hypothetische oxidative Ringöffnung durch Baeyer-Villiger-Oxidation zu einem Lacton und dessen Hydrolyse.___________________ 135
230
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildung 4.98: Beispiele für mögliche oxidative Ringöffnungsreaktionen: A Ozonolyse; B Periodat- oder Blei(IV)acetatspaltung von aus 4 abgeleiteten
Verbindungen. ____________________________________________ 136
Abbildung 4.99: Selektive Reduktion der geringer substituierten Doppelbindung und
anschließende Ozonolyse mit reduktiver Aufarbeitung zur Überführung des aus 2,3-trans-CHD (4) abgeleiteten Diens 288 in ein
offenkettiges System nach Banwell et al.;221 PAD: Kaliumazodicarboxylat.______________________________________________ 136
Abbildung 4.100: Ringöffnung mittels Metathesereaktion. ________________________ 136
Abbildung 4.101: Cycloadditionen mit funktionalisierten Cyclohexadienen; A Dimerisierung des Methylesters 291 in einer Diels-Alder-Reaktion zu 292;127
B ein Beispiel für eine Hetero-Diels-Alder-Reaktion mit Dien 196.130 _ 137
Abbildung 4.102: Reaktion von Cyclohexa-1,5-dien-1-carbonsäuremethylester (294)
mit Singulett-Sauerstoff in einer Hetero-Diels-Alder-Reaktion und
nachfolgende 2,3-dipolare Cycloaddition von Diazomethan an die
entstandene Doppelbindung.223 _______________________________ 138
Abbildung 6.1:
Kristallstruktur von (3S,4S,5R,6S)-3-Acetoxy-4-brom-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (239); dargestellt sind Ellipsoide mit 50% Aufenthaltswahrscheinlichkeit. ___________________ 208
Abbildung 6.2:
Kristallstruktur von (5aS,6R,7S,9aR)-6-Brom-5a,6,7,9a-tetrahydro-8(hydroxymethyl)-benzo[f][1,3,5]trioxepin-7-ol (243); dargestellt sind
Ellipsoide mit 50% Aufenthaltswahrscheinlichkeit, Wasserstoffatome
sind ausgeblendet. _________________________________________ 211
Abbildung 6.3:
Abbildung 6.4:
Abbildung 6.5:
Abbildung 6.6:
1
H-NMR-Spektrum von (3R,4R,5R,6S)-4-Acetoxy-3-azid-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (268).______________ 217
13
C-NMR-Spektrum von (3R,4R,5R,6S)-4-Acetoxy-3-azid-5,6-dihydroxycyclohex-1-encarbonsäuremethylester (268).______________ 218
1
H-NMR-Spektrum von ent-Valienamin-Pentaacetat (ent-163).______ 219
13
C-NMR-Spektrum von ent-Valienamin-Pentaacetat (ent-163). _____ 220
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
231
Tabellen:
Tabelle 1:
Aufgeführt sind der Durchschnittswert ( x ) und Median ( ~
x ) unterschiedlicher Strukturmerkmale für verschiedene untersuchte Substanzklassen.6a ______________________________________________ 2
Tabelle 2:
Übersicht über die mikrobielle Produktion von Metaboliten des Shikimat-Biosyntheseweges und dabei erzielte Produkttiter. _____________ 18
Tabelle 3:
Synthese von Derivaten des 2,3-trans-CHD.______________________ 45
Tabelle 4:
Synthese von Derivaten des 3,4-trans-CHD.______________________ 49
Tabelle 5:
Vergleich der 3JH,H-Kopplungskonstanten (400 MHz, CDCl3) und der
daraus abgeleiteten Verhältnisse der Konformationsisomere zueinander. ____________________________________________________ 78
Tabelle 6:
Vergleich vicinaler Kopplungskonstanten der allylischen Protonen bei
170 und 185 in unterschiedlichen Lösungsmitteln und der aus den
vicinalen Kopplungskonstanten abgeleiteten KonformationsisomerenAnteile.___________________________________________________ 79
Tabelle 7:
Vergleich der 1H-NMR-Daten von 240 (CDCl3, 400 MHz) mit
literaturbeschriebenen,184 strukturell ähnlichen Verbindungen (CDCl3,
241 II und 241 III: 90 MHz, 241 I und 241 IV: 60 MHz).___________ 99
Tabelle 9:
Gegenüberstellung von Produkten aus Oxidationsreaktionen ausgehend von 160 und 185. ____________________________________ 105
Tabelle 10:
3
JH,H-Kopplungen von 268 (CDCl3) und Valienamin (64, D2O).197 ___ 124
Tabelle 11:
Kristallographische Daten und Angaben zur Datensammlung und
Strukturbestimmung von 239. ________________________________ 209
Tabelle 12:
Atomkoordinaten und äquivalente isotrope Verschiebungsparameter
[pm2] in der Kristallstruktur von 239. __________________________ 209
Tabelle 13:
Ausgewählte interatomare Abstände [pm] in der Kristallstruktur der
Verbindung 239.___________________________________________ 209
Tabelle 14:
Kristalldaten und Strukturverfeinerung. ________________________ 211
Tabelle 15:
Atomkoordinaten ( × 104) und äquivalente isotrope Ersatzparameter
(Å2 × 103) für mm13. U(eq) ist definiert als 1/3 der Spur des orthogonalisierten Uij-Tensors. ___________________________________ 213
Tabelle 16:
Bindungslängen [Å] und Winkel [°]. ___________________________ 215
Tabelle 17:
Torsionswinkel [°]._________________________________________ 216
Tabelle 18:
Wasserstoffbrückenbindungen [Å and °]. _______________________ 216
232
Literaturverzeichnis
8 Literaturverzeichnis
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
Jourdier, S., Chem. in Britain 1999, 35, 33-35.
a) Holzgraben, U. Pharm. Ztg. 2005, 30-38; b) Sertürner, F. Journal der Pharmacie 1806, 14, 47-93.
Issekutz B. Die Geschichte der Arzneimittelforschung, Akadémiai Kiadó: Budapest 1971.
a) Kolbe, H. A. W.; Lautemann, E. Ann. 1860, 113, 125-127; b) Schmitt, R. J. Prakt. Chem. 1885, 31, 397; c)
Lindsey, A. S.; Jeskey, H. Chem. Rev. 1957, 57, 583-620; d) Kuhnert, N. Pharmazie in unserer Zeit 2000, 29,
32-39.
Newman, D. J.; Cragg, G. M.; Snader, K. M. J. Nat. Prod. 2003, 66, 1022-1037.
a) Feher, M.; Schmidt, J. M. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2003, 43, 218-227; b) Henkel, T.; Brunne, R. M.;
Müller, H.; Reichel, F. Angew. Chem. 1999, 111, 688-691.
a) Rohr, J. Angew. Chem. 1995, 107, 963-967; b) Weissman, K. J.; Leadlay, P. F. Nature Rev. Microbiol.
2005, 3, 925-936; c) Sánchez, C.; Zhu, L.; Braña, A. F.; Salas, A. P.; Rohr, J.; Méndez, C.; Salas, J. A. Proc.
Nat. Acad. Sci.USA 2005, 102, 461-466.
Oliynyk, M.; Brown, M. J. B.; Cortés, J.; Stauton, J.; Leadlay, P. F. Chem. Biol. 1996, 3, 833-839.
a) Akinaga, S.; Sugiyama, K.; Akiyama, T. Anti-Cancer Drug Design 2000, 15, 43-52; b) Prudhomme, M.
Eur. J. Med. Chem. 2003, 38, 123-140; c) Denny, W. A. IDrugs 2004, 7, 173-177.
Bult, C. J.; White, O.; Olsen, G. J.; Zhou, L.; Fleischmann, R. D.; Sutton, G. G.; Blake, J. A.; Fitzgerald, L.
M.; Clayton, R. A.; Gocayne, J. D.; Kerlavage, A. R.; Dougherty, B. A.; Tomb, J. F.; Adams, M. D.; Reich,
C. I.; Overbeek, R.; Kirkness, E. F.; Weinstock, K. G.; Merrick, J. M.; Glodek, A.; Scott, J. L.; Geoghagen,
N. S. M.; Venter, J. C. Science 1996, 273, 1058-1073.
Haslam, E. Shikimic Acid: Metabolism and Metabolites, Chichester: John Wiley and Sons, 1993.
Dirk Franke, Dissertation, Rheinische Friedrich Wilhelms Universität Bonn, 2000.
Eykmann, J. F. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1891, 24, 1278-1303.
Floss, H. G. Nat. Prod. Rep. 1997, 14, 433-452.
Coggins, J. R.; Abell, C.; Evans, L. B.; Frederickson, M.; Robinson, D. A.; Roszak, A. W.; Lapthorn, A. P.
Biochem. Soc. Trans. 2003, 31, 548-552.
a) Otwinowski, Z.; Schevitz, R. W.; Zhang, R. G.; Lawson, C. L.; Jochimiak, A.; Marmorstein, R. Q. Nature
1988, 335, 321-329; b) Pittard, A. J.; Davidson, B. E. Mol. Microbiol. 1991, 5, 1585-1592.
a) Jackson, E. N.; Yanofsky, C. J. Mol. Biol. 1973, 76, 89-101; b) Yanofsky, C. Nature 1981, 289, 751-758;
c) Keller, E. B.; Calvo, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76, 6186-6190.
Ogino, T.; Garner, C.; Markley, J. L.; Herrmann, K. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, 79, 5828-5832.
a) Dosselaere, F.; Vanderleyden, J. Crit. Rev. Microbiol. 2001, 27, 75-131; b) Bentley, R. Crit. Rev.
Biochem. Mol. Biol. 1990, 25, 307-384.
Zamir, L. O.; Nikolakakis, A.; Bonner, C. A.; Jensen, R. A. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3, 1441-1446.
a) Pelludat, C.; Brem, D.; Heesemann, J. J. Bacteriol. 2003, 185, 5648-5653; b) Gaille, C.; Kast, P.; Haas, D.
J. Biol. Chem. 2002, 277, 21768-21775; c) Mercado-Blanco, J.; van der Drift, K. M.G. M.; Olsson, P. E.;
Thomas-Oates, J. E.; van Loon, L. C.; Bakker, P. A. H. M. J. Bacteriol. 2001, 183, 1909-1920.
Yu, T. W.; Shen, Y.; Doi-Katayama, Y.; Tang, L.; Park, C.; Moore, B. S.; Hutchinson, C. S.; Floss, H. G.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 9051-9056.
a) Chen, S.; von Bamberg, D.; Hale, V.; Breuer, M.; Hardt, B.; Müller, R.; Floss, H. G.; Reynolds, K. A.;
Leistner, E. Eur. J. Biochem. 1999, 261, 98-107; b) Floss, H. G. J. Nat. Prod. 2006, 69, 158-169; c) Floss, H.
G.; Yu, T. W. Chem. Rev. 2005, 105, 621-632.
a) Guo, J.; Frost, J. W. Org. Lett. 2004, 6, 1585-1588; b) August, P. R.; Tang, L.; Yoon, Y. J.; Ning, S.;
Müller, R.; Yu, T.-W.; Taylor, M.; Hoffmann, D.; Kim, C.-G.; Zhang, X.; Hutchinson, C. R.; Floss, H. G.
Chem. Biol. 1998, 5, 69.
Kim, C. G.; Kirschning, A.; Bergon, P.; Zhou, P.; Su, E.; Sauerbrei, B.; Ning, S.; Ahn, Y.; Breuer, M.;
Leistner, E.; Floss, H. G. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7486-7491.
Guo, J.; Frost, J. W. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 10642-10643.
a) Draths, K. M.; Frost, J. W. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2395-2400; b) Li, W.; Xie, D.; Frost, J. W. J.
Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2874-2882.
Eschrich, K.; van der Bolt, F. J. T.; de Kok, A.; van Berkel, W. J. H. Eur. J. Biochem. 1993, 216, 137-146.
a) Kambourakis, S.; Draths, K. M.; Frost, J. W. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 9042-9043; b) Kambourakis,
S.; Frost, J. W. J. Org. Chem. 2000, 65, 6904-6909.
Gibson, J. M.; Thomas, P. S.; Thomas, J. D.; Barker, J. L.; Chandran, S. S.; Harrup, M. K.; Draths, K. M.;
Frost, J. W. Angew. Chem. 2001, 113, 1999-2002.
Yi, J.; Draths, K. M.; Li, K.; Frost, J. W. Biotechnol. Prog. 2003, 19, 1450-1459.
Draths, K. M.; Knop, D. R.; Frost, J. W. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1603-1604.
Literaturverzeichnis
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
233
Chandran, S. S.; Yi, J.; Draths, K. M.; von Daeniken, R.; Weber, W.; Frost, J. W. Biotechnol. Prog. 2003, 19,
808-814.
Downes, C. P. Biochem. Soc. Trans. 1989, 17, 259-268.
Raboy V.; Young, K. A.; Dorsch J. A.; Cook, A. J. Plant Physiol. 2001, 158, 489-497 und darin zitierte
Referenzen.
a) Ley, S.; Sternfeld, F. Tetrahedron 1989, 45, 3463-3476 und darin zitierte Referenzen; b) Bieleski, R. L.
New Zealand Journal of Botany 1994, 32, 73-78.
McCasland, G. E.; Furuta, S.; Durham, L. J. J. Org. Chem. 1966, 31, 1516-1521.
Sakamura, S.; Nabeta, K.; Yamada, S.; Ichihara, A. Agr. Biol. Chem. 1971, 35, 1639-1640 und darin zitierte
Referenzen.
a) Jolad, S. D.; Hoffmann, J. J.; Schram, K. H.; Cole, J. R.; Tempesta, M. S.; Bates, R. B. J. Org. Chem.
1981, 46, 4267-4272; b) Takeuchi, Y.; Cheng, Q.; Shi, Q.; Sugiyama, T.; Oritani, T. Biosci. Biotechnol.
Biochem. 2001, 65, 1395-1398.
a) Taneja, S. C.; Koul, S. K.; Pushpangadan, P.; Dhar, K. L.; Daniewski, W. M.; Schilf, W. Phytochemistry
1991, 30, 871-874; b) Koul, J. L.; Koul, S. K.; Taneja, S. C.; Dhar, K. L. Phytochemistry 1996, 41, 10971099.
Numata, A.; Isitani, M.; Yamada, T.; Minoura, K.; Matsumura, E.; Yamori, T.; Tsuruo, T. Tetrahedron Letters 1997, 38, 8215-8218.
Usami, Y.; Horibe, Y.; Takaoka, I.; Ichikawa, H.; Arimoto, M. Synlett 2006, 1598-1600.
Isogai, A.; Sakuda, S.; Nakayama, J.; Watanabe, S.; Suzuki, A. Agric. Biol. Chem. 1987, 51, 2277-2279.
a) Bach, G.; Breiding-Mack, S.; Grabley, S.; Hammann, P.; Hütter, K.; Thiericke, R.; Uhr, H.; Wink, J.;
Zeeck, A. Liebigs Ann. Chem. 1993, 241-250; b) Tang, Y.; Maul, C.; Höfs, R.; Sattler, I.; Grabley, S.; Feng,
X.; Zeeck, A.; Thiericke, R. Eur. J. Org. Chem. 2000, 149-153.
Müller, A.; Keller-Schierlein, W.; Bielecki, J.; Rak, G.; Stuempfel, J.; Zaehner, H. Helv. Chim. Acta 1986,
69, 1829-1832.
Banwell, M. G.; Bray, A. M.; Wong, D. J. New J. Chem. 2001, 25, 1251-1254.
Mehta, G.; Lakshminath, S. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 3509-3512.
a) Ramana, G. V.; Rao, B. V. ChemInform 2005, 36, 3049-3051; b) Takahashi, T.; Yamakoshi, Y.; Ge, W.Y.; Sugita, J.; Okayama, K.; Koizumi, T. Heterocycles 2002, 56, 209-220; c) Tatsuta, K.; Yasuda, S.; Araki,
N.; Takahashi, M.; Kamiya, Y. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 401-402.
Shinada, T.; Fuji, T.; Ohtani, Y.; Yoshida, Y.; Ohfune, Y. Syn. Lett. 2002, 8, 1341 - 1343.
Lubineau, A.; Billault, I. J. Org. Chem. 1998, 63, 5668-5671.
Alibés, R.; Bayón, P.; de March, P.; Figueredo, M.; Font, J.; Marjant, G. Organic Letters 2006, 8, 16171620.
Song, C; Jiang, S.; Singh, G. Synlett 2001, 1983-1985.
Höfs, R.; Schoppe, S.; Thiericke, R.; Zeeck, A. Eur. J. Org. Chem. 2000, 1883-1887.
a) Arnone, A.; Cardillo, R.; Nasini, G.; de Pava, O. V. Tetrahedron 1993, 49, 7251-7258; b) Kitamura, E.;
Hirota, A.; Nakagawa, M.; Nakayama, M.; Nozaki, H.; Tada, T.; Nukina, M.; Hirota, H. Tetrahedron Letters
1990, 31, 4605-4608.
Meier, R. M.; Ganem, B. Tetrahedron 1994, 50, 2715-2720.
a) Mahmud, T. Nat. Prod. Rep. 2003, 20, 137-166; b) Mahmud T.; Lee, S.; Floss, H. G. Chem. Rec. 2001, 1,
300-310; c) Fukuhara, K.; Murai, H.; Murao, S. Agric. Biol. Chem. 1982, 46, 1941-1945; d) Vertesy, L.;
Fehlhaber, H.; Schulz, A. Angew. Chem. 1994, 106, 1936-1937; e) Zhong, D.; Si, D.; He, W.; Zhao, L.; Xu,
Q. Carbohyd. Res. 2001, 331, 69-75; f) Si, D.; Zhong, D.; Xu, Q. Carbohyd. Res. 2001, 335, 127-132;
Iwasa, T.; Yamamoto, H.; Shibata, M. J. Antibiot. 1970, 23, 595-602; b) Iwasa, T.; Higashide, E.; Yamamoto, H.; Shibata, M. J. Antibiot. 1971, 24, 107-113.
Dong, H.; Mahmud, T; Tornus, I.; Lee, S.; Floss, H. G. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 2733-2742.
a) Zhang, G. S.; Stratmann, A.; Block, O.; Brückner, R.; Podeschwa, M.; Altenbach, H. J.; Wehmeier, U. F.;
Piepersberg, W. J. Biol. Chem. 2002, 277, 22853-22862; b) Mahmud, T; Tornus, I.; Egelkrout, E.; Wolf, E.;
Uy, C.; Floss, H. G.; Lee, S. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 6973-6983.
Wehmeier, U. F.; Piepersberg, W. Appl. Microiol. Biotechnol. 2004, 63, 613-625.
a) Chiasson, J. L.; Josse, R. G.; Gomis, R.; Hanefeld, M.; Karasik, A.; Laakso, M. J. Am. Med. Ass. 2003,
290, 486-494; b) Kaiser, T.; Sawicki, P. T. J. Am. Med. Assoc. 2003, 290, 3066.
Bayer Geschäftsbericht 2004.
Bayer Zwischenbericht III/2005.
a) Arznei-Telegramm 1996, 116; b) Arznei-Telegramm 1990, 95-97.
a) Tengerdy, R. P.; Szakács, G. J. Biotechnol. 1998, 66, 91-99; b) Asano, N. Glycobiology 2003, 13, 93-104.
"WHO global influenza preparedness plan", WHO, Schweiz, Mai 2005, WHO/CDS/CSR/GIP/2005.5 und
darin zitierte Referenzen.
a) Roche Geschäftsbericht 2004; b) Roche Zwischenbericht III/2005.
234
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
Literaturverzeichnis
a) Konzerninformation Roche 2005, Basel, 23.12.2005, http://www.roche.com/de/med-cor-2005-12-23,
abgerufen 29.5.2006; b) Konzerninformation Roche 2005, Basel, 12.12.2005, http://www.roche.com/de/medcor-2005-12-12, abgerufen 29.5.2006.
Graciela Flores, "Getting around flu drug shortage", The Scientist, 4.1.2006, http://www.thescientist.com/news/display/22917/, aberufen 29.5.2006.
a) Federspiel, M.; Fischer, R.; Hennig, M.; Mair, H. J.; Oberhauser, T.; Rimmler, G.; Albiez, T.; Bruhin, J.;
Estermann, H.; Gandert, C.; Göckel, V.; Götzö, S.; Hoffmann, U.; Huber, G.; Janatsch, G.; Lauper, S.;
Röckel-Stäbler, O.; Trussardi, R.; Zwahlen, A. G. Org. Proc. Res. Dev. 1999, 3, 266-274; b) Karpf, M.;
Trussardi, R. J. Org. Chem. 2001, 66, 2044-2051.
a) Abrecht, S.; Harrington, P.; Iding, H.; Karpf, M.; Trussardi, R.; Wirz, B.; Zutter, U. Chimia 2004, 58, 621629 und darin zitierte Referenzen; b) Yeung, Y.-Y.; Hong, S.; Corey, E. J. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128,
6310-6311.
Fukuta, Y.; Mita, T.; Fukuda, N.; Kanai, M.; Shibasaki, M. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 6312-6313.
a) Mehta, G.; Mohal, N.; Lakshminath, S. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 3505-3508; b) Afrinkia, K.;
Mahmood, F. Tetrahedron 1999, 55, 3129-3140; c) Aceña, C. L.; Arjona, O.; de la Pradilla, R. F.; Plumet, J.;
Viso, A. J. Org. Chem. 1994, 59, 6419-6424.
a) Letellier, P.; Ralainirina, R.; Beaupère, D.; Uzan, R. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 4555-4558; b) Tatsuta,
K.; Takahashi, M.; Tanaka, N. The Journal of Antibiotics 2000, 53, 88-92; c) Tatsuta, K.; Mukai, H.;
Takahashi, M. The Journal of Antibiotics 2000, 53, 430-435; d) Otero, J. M.; Fernández, F.; Estévez, J. C.;
Estévez, R. Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 4045-4049; e) Gómez, A. M.; Moreno, E.; Valverde, S.;
López, J. C. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 7863-7866; f) Gómez, A. M.; Moreno, E.; Uriel, C.; Jarosz, S.;
Valverde, S.; López, J. C. Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 2401-2407.
Landais, Y. Chimia 1998, 52, 104-111.
Entwistle, D. H.; Hudlicky, T. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 2591-2594.
a) Hudlicky, T.; Rouden, J.; Luna, H. J. Org. Chem. 1993, 58, 985-987; b) Hudlicky, T.; Luna, H.; Price, J.
D.; Rulin, F. J. Org. Chem. 1990, 55, 4683-4687; c) Hudlicky, T.; Entwistle, D. A.; Pitzer, K. K.; Thorpe, A.
J. Chem. Rev. 1996, 96, 1195-1220; d) Nugent, T. C.; Hudlicky, T. J. Org. Chem. 1998, 63, 510-520; e)
Charest, M. G.; Lerner, C. D.; Brubaker, J. D.; Siegel, D. R.; Myers, A. G. Science 2005, 308, 395-398.
a) Hudlicky, T.; Seoane, G.; Pettus, T. J. Org. Chem. 1989, 54, 4239-4243; b) Trost, B. M.; Chupak, L. S.;
Lübbers, T. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1732-1740; c) Lorbach, V.; Franke, D.; Nieger, M.; Müller, M.
Chem. Commun. 2002, 494-495; d) Shing, T. K. M.; Tam, E. K. W. J. Org. Chem. 1998, 63, 1547-1554; e)
Ganem, B.; Ikota, N.; Muralidharan, V. B.; Wade, W. S.; Young, S. D.; Yukimoto, Y. J. Am. Chem. Soc.
1982, 104, 6787-6788.
Hudlicky, T.; Gonzales, D.; Gibson, D. T. Aldrichimica Acta 1999, 32, 35-62 und darin zitierte Referenzen.
Boyd, D. R.; Hand, M. V.; Sharma, N. D.; Chima, J.; Dalton, H.; Sheldrake, G. N. J. Chem. Soc. Chem.
Commun. 1991, 22, 1630-1632.
Allen, C. C.; Boyd, D. R.; Dalton, H.; Sharma, N. D.; Brannigan, I.; Kerley, N. A.; Sheldrake, G. N.; Taylor,
S. C. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1995, 117-118.
Smith, J. N.; Spencer, B.; Williams, R. T.; Biochem. J. 1950, 47, 284-293.
Jerina, D. M.; Ziffer, H.; Daly, J. W. J. Am. Chem. Soc. 1969, 92, 1056-1061.
Johansson, I.; Ingelman-Sundberg, M. Cancer. Res. 1988, 48, 5387-5390.
a) Jia, Z. S.; Brandt, P.; Thibblin, A. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 10147-10152; b) Rao, S. N.; O´Ferrall, R.
A. M.; Kelly, S. C.; Boyd, D. R.; Agarwal, R. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 5458-5465.
Boyd, D. R.; Hamilton, J. T. G.; Sharma, N. D.; Harrison, J. S.; McRoberts, W. C.; Harper, D. B. Chem.
Commun. 2000, 16, 1481-1482.
Jerina, D. M.; Ziffer, H.; Daly, J. W. J. Am. Chem. Soc. 1970, 92, 1056-1061.
a) Nahlik, M. S.; Brickman, T. J.; Ozenberger, B. A.; McIntosh O. A. J. Bact. 1989, 171, 784-790; b) Staab,
J. F.; Earhart, C. F. J. Bact. 1990, 172, 6403-6410; c) Gehring, A. M.; Bradley, K. A.; Walsh, C. T.
Biochemistry 1997, 36, 8495-8503; d) Gehring, A. M.; Mori, I.; Walsh, C. T. Biochemistry 1998, 37, 26482659.
O´Brian, I. G.; Cox, G. B.; Gibson, F. Biochim. Biophys. Acta 1970, 201, 453-460.
Rusnak, F.; Liu, J.; Quinn, N.; Berchtold, G. A.; Walsh, C. T. Biochemistry 1990, 29, 1425-1435.
Young, I.G., Gibson, F. and MacDonald, C.G. Biochim. Biophys. Acta 1969, 192, 62-72 und darin zitierte
Referenzen..
a) Reynolds, K. A.; Wilson, D. J.; Cropp, T. A. Nature Biotechnol. 2000, 18, 980-983; b) Reynolds, K. A.;
Wallace, K. K.; Handa, S.; Brown, M. S.; McArthur, H. A. I.; Floss, H. G. J. Antibiot. 1997, 50, 701-703.
Moore, B. S.; Floss, H. G. J. Nat. Prod. 1994, 57, 382-386.
Moore, B. S.; Hertweck, C. Nat. Prod. Rev. 2002, 19, 70-99 und darin zitierte Referenzen.
Literaturverzeichnis
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
235
a) Lowden, P. A. S.; Böhm, G. A.; Staunton, J.; Leadlay, P. F. Angew. Chem. 1996, 108, 2395-2397; b)
Lowden, P. A. S.; Wilkinson, B.; Böhm, G. A.; Handa, S.; Floss, H. G.; Leadley, P. F.; Staunton, J. Angew.
Chem. 2001, 113, 799-801.
Young, I. G.; Gibson, F. Biochim. Biophys. Acta 1969, 177, 182-183.
Walsh, C. T.; Liu, J.; Rusnak, F.; Sakaitani, M. Chem. Rev. 1990, 90, 1105-1129 und darin zitierte
Referenzen.
Müller, R.; Breuer, M.; Wagener, A.; Schmidt, K.; Leistner, E. Microbology 1996, 142, 1005-1012.
Richtlinie 2000/54/EG des europäischen Parlaments und Rates vom 18.09.2000 über den Schutz der
Arbeitnehmer gegen Gefährdung durch biologische Arbeitsstoffe bei der Arbeit. Amtsblatt der Europäischen
Gemeinschaften Nr. L 262/21 vom 17.10.2000;
http://www.umwelt-online.de/regelwerk/eu/00_04/00_54gs.htm; abgerufen 7.8.2006
a) Franke, D.; Sprenger, G. A.; Müller, M. Angew. Chem. 2001, 113, 578-581 (Angew. Chem. Int. Ed. 2001,
40, 555-557); b) Franke, D.; Sprenger, G. A.; Müller, M. ChemBioChem 2003, 4, 775-777.
Boyd, D. R.; Sharma, N. D.; Dalton, H.; Clarke, D. A. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1996, 45-46.
Pearson, A. J.; Gelormini, Ann M.; Pinkerton, A. A. Organometallics 1992, 11, 936-938.
Knölker, H. J.; Goesmann, H.; Klauss, R. Angew. Chem. 1999, 111, 727-731.
McKibben, B. P.; Barnosky, G. S.; Hudlicky, T. Synlett 1995, 806-807.
DeMarinis, R. M.; Filer, C. N.; Waraszkiewicz, S. M.; Berchtold, G. A. J. Am. Chem. Soc. 1974, 96, 11931197.
Demuth, M. R.; Garrett, P. E.; White, J. D. J. Am. Chem. Soc. 1976, 98, 634-635.
a) Holbert, G. W.; Ganem, B.; Borsub, L.; Chantrapromma, K.; Van Engen, D.; Clardy, J.; Sadavongvivad,
C.; Thebtaranonth, Y. Tetrahedron Letters 1979, 8, 715-718; b) Holbert, G. W.; Ganem, B. J. Am. Chem.
Soc. 1978, 100, 352-353.
Schlessinger, R. H.; Lopes, A. J. Org. Chem. 1981, 46, 5253-5254.
Ogawa, S.; Takagaki, T. J. Org. Chem. 1985, 50, 2356-2359.
Shing, T. K. M.; Tam, E. K. W. Tetrahedron: Asymmetry 1996, 7, 353-356.
Chiasson, B. A.; Berchtold, G. A. J. Am. Chem. Soc. 1974, 96, 2898-2901.
Barton, D. H. R.; Faro, H. P.; Serebryakov, E. P.; Woolsey, N. F. J. Chem. Soc. 1965, 2438-2444.
Ikota, N.; Ganem, B. J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 351-352.
a) Posner, G. H.; Haces, A.; Harrison, W.; Kinter, C. M. J. Org. Chem. 1987, 52, 4836-4841; b) Posner, G.
H.; Harrison, W.; Wettlaufer, D. G. J. Org. Chem. 1985, 50, 5041-5044.
a) Roberts, S. M.; Sutton, P. W.; Wright, L. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1996, 1157-1165; b) Roberts, S.
M.; Sutton, P. W.; Williams, J. O. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994, 803-804.
Boyd, D. R.; Sharma, N. D.; O´Dowd, C. R.; Hempenstall, F. Chem. Commun. 2000, 2151-2152.
Bailey, J. E. Science 1991, 252, 1668-1675.
Draths, K. M.; Pompliano, D. L.; Frost, J. W.; Berry, A.; Disbrow, G. L.; Staversky, R. J.; Lievense, J. J. Am.
Chem. Soc. 1992, 114, 3956-3962.
Marco Oldiges, Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, 2004.
Fürste, J. P.; Pasegrau, W.; Frank, R.; Blöcker, H.; Scholz, P.; Bagdasarian, M.; Lanke, E. Gene 1986, 48,
119-131.
a) De Boer, H. A.; Comstock, L. J.; Vasser, M. Proc. Nat. Acad. Sci.USA 1983, 80, 21-25; b) Brosius, J.;
Holy, A. Proc. Nat. Acad. Sci.USA 1984, 81, 6929-6933.
Zeppenfeld, T.; Larisch, C.; Lengeler, J. W.; Jahreis, K. J. Bacteriol. 2000, 182, 4443-4452.
Brown, T. A. "Gentechnologie für Einsteiger", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin,
2002, 3. Auflage, S. 118f.
Nicht publizierte Ergebnisse von Professor Dr. G. Sprenger.
Persönliche Mitteilung von R. Bujnicki. Den Berechnungen der Konzentrationen der CHD liegen HPLCEichungen durch R. Bujnicki zugrunde. Hiernach gilt: c (2,3-trans-CHD) [mg×L-1] = Fläche
[mAU×sec] × 0.05429 [mg×L-1×mAU-1×sec-1] und c (3,4-trans-CHD) [mg×L-1] = Fläche
[mAU×sec] × 0.1954 [mg×L-1×mAU-1×sec-1].
Norin, T. Pure & Appl. Chem. 1996, 68, 2043-2049.
Volker Lorbach, Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, 2005.
Daicel Produktinformation; gefunden unter http://www.daicel.co.jp/chiral/e/product/instruction/odh.html
Beispiele für von trans-CHD abgeleiteten, isolierten Naturstoffen: Rapamycin: a) Sehgal, S. N.; Baker, H.;
Vézina, C. J. Antibiot. 1975, 28, 727-732; b) Findlay, J. A.; Radics, L. Can. J. Chem. 1980, 58, 579-590; c)
Gregory, M. A.; Gaisser, S.; Lill, R. E.; Hong, H.; Sheridan, R. M.; Wilkinson, B.; Petkovic, H.; Weston, A.
J.; Carletti, I.; Lee, H.; Staunton, J.; Leadlay, P. F. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 2551-2553 (Angew.
Chem. 2004, 116, 2605-2607); FK506: Tanaka, H.; Kuroda, A.; Marusawa, H.; Hatanaka, H.; Kino, T. J. Am.
Chem. Soc. 1987, 109, 5031-5033; iso-FK506: Grassberger, M. A.; Fehr, T.; Horvath, A.; Schulz, G.
236
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
Literaturverzeichnis
Tetrahedron 1992, 48, 413-430; Guanianin E: Viqar Uddin, A.; Nasreen, B,; Fatima, I.; Bano, S.
Tetrahedron 1988, 44, 247-252.
Christoph Grondal, Diplomarbeit, Rheinische Friedrich Wilhelms Universität Bonn, 2003.
Song, C.; Jiang, S.; Singh, G. Chem. Res. Chinese U. 2002, 18, 146-152.
Stork, G.; Takahashi, T. J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 1275-1276.
Narasaka, K.; Sakakura, T.; Uchimaru, T.; Guédin-Vuong, D. J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 2954-2961.
Travenius, S. Z. M. Scand. J. Work Environ. Health 1982, 8, 1-86.
Talzi, V. P.; Ignashin, S. V. Russian J. Appl. Chem. 1999, 72, 1832-1835.
Karimi, B.; Ma´mani, L. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 6051-6053.
a) Spescha, M. Helv. Chim. Acta 1993, 76, 1832-1846; b) Merrer, Y. L.; Gauzy, L.; Gravier-Pelletier, C.;
Depezay, J. C. Bioorg. Med. Chem. 2000, 8, 307-320.
Groziak, M. P.; Koohang, A. J. Org. Chem. 1992, 57, 940-944.
Guiso, M.; Procaccio, C.; Fizzano, M. R.; Piccioni, F. Tetrahedron Lett. 1997, 38 (24), 4291-4294.
Zhdanov, R. I.; Zhenodarova, S. M. Synthesis 1975, 222-245.
a) Shiina, I.; Mukaiyama, T. Chem. Lett. 1994, 677; b) Izumi, J.; Shiina, I.; Mukaiyama, T. Chem. Lett. 1995,
141; c) Ishihara, K.; Kubota, M.; Kurihara, H.; Yamamoto, H. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 4413-4414; d)
Ishihara, K.; Kubota, M.; Kurihara, H.; Yamamoto, H. J. Org. Chem. 1996, 61, 4560-4567.
Dumeunier, R.; Markó, I. E. Tetrahedron Letters 2004, 45, 825-829.
Karimi, B.; Maleki, J. J. Org. Chem. 2003, 68, 4951-4954.
Gaweonski, J. K.; Kwit, M.; Boyd, D. R.; Sharma, N. D.; Malone, J. F.; Drake, A. F. J. Am. Chem. Soc.
2005, 127, 4308-4319.
Moscowitz, A.; Charney, E.; Weiss, U.; Ziffer, H. J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 4661-4663.
Berova, N.; Nakanishi, K.; Woody, R. W. "Circular Dichroism" 2000, 2. Auflage, Wiley-VCH, New York,
Chinchester, Weinheim, Brisbane, Singapore, Toronto, 305-335.
Gawronski, J.; Gawronska, K.; Buczak, G.; Katrusiak, A.; Skowronek, P.; Suemune, H. Tetrahedron:
Asymmetry 1996, 7, 301-306.
Gawronski, J.; Gawronska, K.; Buczak, G.; Katrusiak, A.; Skowronek, P.; Suemune, H. Tetrahedron:
Asymmetry 1996, 7, 301-306.
Günther, H. "NMR-Spektroskopie" 1992, 3. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 112-113.
Karplus, M. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2870-2871.
Lide, D. R. "Handbook of Organic Solvents" 1995, CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo.
McDonald, R. N.; Steppel, R. N.; Dorsey, J. E. Org. Synth. 1970, 50, 15 - 16.
Bowles, S. A.; Campbell, M. M.; Sainsbury, M. Tetrahedron 1990, 46, 3981-3992.
Yang, D.; Wong, M. K.; Yip Y. C. J. Org. Chem. 1995, 60, 3887-3889.
Curci, R.; Fiorentino, M.; Troisi, L. J. Org. Chem. 1980, 45, 4758-4760.
a) Curci, R.; Fiorentino, M.; Serio, M. R. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1984, 155-156; b) Curci, R.;
D’Accolti, L.; Fiorentino, M.; Rosa, A. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 5831-5834.
Yang, D.; Wong, M. K.; Yip, Y. C.; Wang, X. C.; Tang, M. W.; Zheng, J. H.; Cheung K. K. J. Am. Chem.
Soc. 1998, 120, 5943-5952.
a) Tu, X.; Wang, Z. X.; Shi, Y. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 9806-9807; b) Wang, Z. X.; Tu, Y.; Frohn, M.;
Shi, Y. J. Org. Chem. 1997, 62, 2328-2329; c) Hickey, M.; Goeddel, D.; Crane, Z.; Shi, Y. Nat. Acad.
Sci.USA 2004, 101, 5794-5798.
Bloch, R.; Abecassis, J.; Hassan, D. J. Org. Chem. 1985, 50, 1544-1545.
Houk, K. N.; Liu, J.; DeMello, N. C.; Condroski, K. R. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 10147-10152.
z. B. a) Murray, R. W. Chem. Rev. 1989, 89, 1187-1201; b) Curci, R. Dinoi, A.; Rubino, M. F. Pure Appl.
Chem. 1995, 67, 811-822; c) Yang, D.; Wang, X. C.; Wong, M. K.; Yip, Y. C.; Tang, M. W. J. Am. Chem.
Soc. 1996, 118, 11311-11312.
z. B. a) Bach, R. D.; Andrés, J. L.; Owensby, A. L.; Schlegel, H. B.; McDouall, J. J. B. J. Am. Chem. Soc.
1992, 114, 7207-7217; b) Houk, K. N.; Liu, J.; DeMello, N. C.; Condroski, K. R. J. Am. Chem. Soc. 1997,
119, 10147-10152; c) Jenson, C.; Liu, J.; Houk, K. N.; Jorgensen, W. L. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119,
12982-12983.
Review: Fatiadi, A. J. Synthesis 1987, 2, 85-127.
Criegee, R. Liebigs Ann. Chem. 1936, 522, 75-96.
Review: Kolb, C. K.; VanNieuwenhze, M. S.; Sharpless, K. B. Chem. Rev. 1994, 94, 2483-2547.
Böseken, J. Recl. Trav. Chim.Pays-Bas 1922, 41, 199-207.
Sharpless, K. B.; Teranishi, A. Y.; Bäckvall, J. E. J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 3120-3128.
DelMonte, A. J.; Haller, J.; Houk, K. N.; Sharpless, K. B.; Singleton, D. A.; Strassner, T.; Thomas, A. A. J.
Am. Chem. Soc. 1997, 119, 9907-9908.
Literaturverzeichnis
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
205
206
237
a) Carballido, M.; Castedo, L.; González, C. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 3973-3976; b) Mehltretter, G. M.;
Bhor, S.; Klawonn, M.; Döbler, C.; Sundermeier, U.; Eckert, M.; Militzer, H. C.; Beller, M. Synthesis 2003,
295-301; c) Jonsson, S. Y.; Färnegårdh, K.; Bäckvall, J. E. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1365-1371.
Sharpless, K. B.; VanNieuwenhze, M. S.; Kolb, H. C. Chem. Rev. 1994, 94, 2483-2547.
Wai, J. S. M.; Markó, I.; Svendsen, J. S.; Finn, M. G.; Jacobsen, E. N.; Sharpless, K. B. J. Am. Chem. Soc.
1989, 111, 1123-1125.
Sharpless, K. B.; Kwong, H. L.; Sorato, C.; Ogino, Y.; Chen, H. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2999-3002.
z. B. a) Kim, B. M.; Sharpless, K. B. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 3003-3006; b) Song, C. E.; Roth, E. J.; Lee,
S. G.; Kim, I. O. Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 2687-2694; c) Bolm, C.; Gerlach, A. Angew. Chem. 1997,
109, 773-775.
Choudary, B. M.; Chowdary, N. S.; Jyothi, K.; Kantam, M. L. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 5341-5349.
a) Yao, Q. Org. Lett. 2002, 4, 2197-2199; b) Yanada, R.; Takemoto, Y. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 68496852; c) Song, C. E.; Jung, D. U.; Roh, E. J.; Lee, S. G.; Chi, D. Y. Chem. Commun. 2002, 24, 3038-3040.
Carless, H. A. J.; Busia, K.; Dove, Y.; Malik, S. S. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1993, 2505-2506.
a) Cha, J. K.; Christ, J. K.; Kishi, Y. Tetrahedron Lett. 1983, 24, 3943-3947; b) Christ, J. K.; Cha, J. K.;
Kishi, Y. Tetrahedron Lett. 1983, 24, 3947-3950; c) Cha, J. K.; Christ, J. K.; Kishi, Y. Tetrahedron 1984, 40,
2247-2255.
Blacker, A. J.; Booth, R. J.; Davies, G. M.; Sutherland, J. K. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1995, 22, 28612870.
Myers, A. G.; Siegel, D. R.; Buzard, D. J.; Charest, M. G. Organic Letters 2001, 3, 2923-2926.
Kok, S. H. L.; Lee, C. C.; Shing, T. K. M. J. Org. Chem. 2001, 66, 7184-7190.
Plietker, B.; Niggemann, M.; Pollrich, A. Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 1116-1124.
Plietker, B.; Niggemann, M. Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 2403-2407.
a) Original Referenz: Woodward, R. B.; Brutcher, F. V. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 209-211; b) Jasserand,
D.; Girard, J. P.; Rossi, J. C.; Granger, R. Tetrahedron Lett. 1976, 19, 1581-1584.
a) Ogawa, S.; Hattori, T.; Toyokuni, T.; Suami, T. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1983, 56, 2077-2081; b) Toyokuni,
T.; Abe, Y.; Ogawa, S.; Suami, T. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1983, 56, 505-513.
Yeung, Y.-Y.; Gao, X.; Corey, E. J. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 9644-9645.
Corey, E. J.; Jones, G. B. J. Org. Chem. 1992, 57, 1028-1029.
Mehta, G.; Pujar, S. R.; Ramesh, S. S.; Islam, K. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 3373-3376.
z. B. a) Sondheimer, F.; Amendolla, C.; Rosenkranz J. Am. Chem. Soc. 1953, 75, 5930-5932; b) Gritter, R. J.;
Wallace, T. J. J. Org. Chem. 1959, 24, 1051–1056; c) Haugan, J. A. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 3887-3890.
McKittrick, B. A.; Ganem, B. J. Org. Chem. 1985, 50, 5898-5900.
Banwell, M. G.; Bridges, V. S.; Dupuche, J. R.; Richads, S. L.; Walter, J. M. J. Org. Chem. 1994, 59, 63386343.
Tatsuta, K.; Mukai, H.; Takahashi, M. J. Antibiot. 2000, 53, 430-435.
z. B. a) Gilchrist, T. L.; Tuddenham, D. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1981, 657-658; b) Burke, S. D.;
Piscopio, A. D.; Kort, M. E.; Matulenko, M. A.; Parker, M. H.; Armistead, D. M.; Shankaran, K. J. Org.
Chem. 1994, 59, 332-347; c) Review: Fatiadi, A. J. Synthesis 1987, 85-127.
a) Ritter, J. J.; Minieri, P. P. J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 4045-4048; b) Tongco, E. C.; Prakash, G. K. S.;
Olah, G. A. Synlett 1997, 1193-1195.
a) Voronkov, M.V.; Gontcharov, A. V.; Wang, Z. M. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 407-409; b) Senanayake,
C. H.; Roberts, F. E.; DiMichele, L. M.; Ryan, K. M.; Liu, J.; Fredenburgh, L. E.; Foster, B. S.; Dougas, A.
W.; Larsen, R. D.; Verhoeven, T. R.; Reider, P. J. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3993-3995.
Bodkin, J. A.; McLeod, M. D. J. Chem. Soc., Perkin Trans. I 2002, 2733-2746 und darin zitierte Referenzen.
Rudolph, J.; Sennhenn, P. C.; Vlaar, C. P.; Sharpless, K. B. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 28102813 und darin ziterte Referenzen.
Fukase, H.; Horii, S. J. Org. Chem. 1992, 57, 3651-3658.
Brückner, R. Reaktionsmechanismen, 3. Auflage, 2004, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 790791.
Bujnicki, R.; Takors, R., nicht publizierte Daten des Chorus-Projektes.
Bongaerts, J. DSM Biotech GmbH Jülich 2004, nicht publizierte Ergebnisse.
Stefan Kozak, Dissertation, Universität Stuttgart, 2006.
DeClue, M. S.; Baldridge, K. K.; Kast, P.; Hilvert, D. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 2043-2051.
Ivanovics, G. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 1949, 70, 462-463.
Dübeler, A.; Krastel, P.; Floss, H. G.; Zeeck, A. Eur. J. Org. Chem. 2002, 983-987.
Syu, M. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, 55, 10-18.
Christian Dose, Diplomarbeit, Fachhochschule Jülich, 2001.
238
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
226
227
228
229
230
231
232
233
234
Literaturverzeichnis
a) Ley, S. V.; Leslie, R.; Tiffin, P. D.; Woods, M. Tetrahedron Lett. 1992, 33, 4767-4770; b) Ley, S. V.;
Baeschlin, D. K.; Dixon, D. J.; Foster, A. C.; Ince, S. J.; Priepke, H. W. M.; Reynolds, D. J. Chem. Rev.
2001, 101, 53-80.
Lence, E.; Castedo, L.; Gonzales, C. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 7917-7918.
a) Brown, H. C.; Jadhav, P. K.; Bhat, K. S. J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 2564-2565; b) Brown, H.C.; Bhat,
K. S. J. Chem. Soc, Perkin Trans. I. 1991, 2633-2638; c) Zaidlewicz, M.; Walasek, Z. Pol. J. Chem. 1994,
68, 2489-2496.
a) Oshima, M.; Yamazaki, H.; Shimizu, I.; Nisar, M.; Tsuji, J. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6280-6287; b)
Dragovich, P. S.; Prins, T. J.; Zhou, R. J. Org. Chem. 1995, 60, 4922-4924.
a) Knights, E. F.; Brown,H. C. J. Am. Chem. Soc. 1968, 90, 5280-5281; b) Knights, E. F.; Brown,H. C. J.
Am. Chem. Soc. 1968, 90, 5281-5283; c) Brown, H. C.; Chen, J. C. J. Org. Chem. 1981, 46, 3978-3988; d)
Brown, H. C.; Jadhav, P. K.; Bhat, K. S. J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 2564-2565.
Brown, H. C.; Heydkamp, W. R.; Breuer, E.; Murphy, W. S. J. Am. Chem. Soc. 1964, 86, 3565-3566.
Banwell, M.; Forman, G. S. J. Chem. Soc., Perkin Trans. I 1996, 2565-2566.
Taylor, R. M. Aust. J. Chem. 2003, 56, 631.
z. B. a) Sandler, R. S. J. Org. Chem. 1967, 32, 3876-3881; b) Vogel,E.; Königshaufen, H.; Müllen, K.; Oth,
J. F. M. Angew. Chem. 1974, 86, 229-231; c) Ito, S.; Ziffer, H.; Box, A. J. Org. Chem. 1986, 51, 1130-1133;
Nwokogu, G. C. J. Org. Chem. 1985, 50, 3900-3908.
a) Rassu, G.; Auzzas, L.; Battistini, L.; Casiraghi, G. Mini-Rev. Org. Chem. 2004, 1, 343-357; b) Wang, W.;
Zhang, Y.; Sollogoub, M.; Sinay, P. Angew. Chem. 2000, 112, 2588-2590.
Liu, C. H.; Liu, Y. J.; Huang, L. L.; Zou, W. X.; Tan, R. X Planta Med. 2003, 69, 481-483.
a) Koch, S. S. C.; Chamberlin, A. R. Synth. Commun. 1989, 19, 829-834; b) Astudillo, L.; Galindo, A.;
Gonzalez, A. G.; Mansilla, H. Heterocycles 1993, 36, 1075-1080; c) Goettlich, R.; Yamakoshi, K.; Sasai, H.;
Shibasaki, M. Syn. Lett. 1997, 8, 971-973; d) Schulz, A. G.; Pettus, L. J. Org. Chem. 1997, 62, 6855-6861; e)
Kotsuki, H.; Arimura, K.; Araki, T.; Shinohara, T. Syn. Lett. 1999, 4, 462-464; f) Krafft, G. A.;
Katzenellenbogen, J. A. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 5459-5466.
L. Malaprade, Bull. Soc. Chim. France 1928, 43, 683-696.
a) Yeo, J. E.; Yang, X.; Kim, H. J.; Koo, S. Chem. Commun. 2004, 236-237; b) Sesenogul, Ö.; Lena, J. I.C.;
Altinel, E.; Birlirakis, N.; Arseniyadis, S. Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16 (5), 995-1015.
Banwell, M. G.; Edwards, A. J.; Loong, D. T. J. Arkivoc 2004, (x), 53-67.
z. B. a) Schrock, R. R. Pure Appl. Chem. 1994, 66, 1447-1454; b) Randall, M. L.; Tallarico, J. A.; Snapper,
M. L. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9610-9611.
Gandolfi, R.; Amade, M. S.; Rastelli, A.; Bagatti, M.; Montanari, D. Tetrahedron Lett. 1996, 37 (4), 517-520.
Hanahan, D. J. Mol. Biol. 1983, 166, 557-580.
Professor Dr. G. Sprenger, Dr. J. Bongaerts, persönliche Mitteilung.
Professor Dr. G. Sprenger, Dr. J. Bongaerts, unveröffentlichte Ergebnisse im Rahmen des Chorus-Projektes.
Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989, 2. Auflage, Cold
Spring Harbor, New York.
Tanaka, S.; Lerner, S. A.; Lin, E. C. C. J. Bacteriol. 1967, 93, 642-648.
Hanahan, D. DNA Cloning, Vol. 1; IRL Press Oxford, Washington, 1985.
Bradford, M. M. Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254.
Lämmli, U. K. Nature 1970, 227, 680-685.
Hofman-Bang, N. Acta Chem. Scand. 1957, 11, 582-583.
Teeter, H. M.; Bell, E. W. Org. Synth. Coll. IV 1963, 125-127.
analog zur Darstellung von N-Chlorcarbamat-Salzen: Herranz, E.; Biller, S. A.; Sharpless, K. B. J. Am.
Chem. Soc. 1978, 100, 3596-3598.