Einfluss von klarzelligen Nierenkarzinomzellen auf die
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Einfluss von klarzelligen Nierenkarzinomzellen auf die immunmodulatorischen Fähigkeiten von humanen 6-sulfo LacNAc+ dendritischen Zellen DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der Technischen Universität Dresden von Anja Kloß geboren am 04. September 1987 in Löbau Eingereicht am: 17. April 2015 Tag der Verteidigung: 02. September 2015 Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Michael Göttfert Prof. Dr. med. Marc Schmitz Die Dissertation wurde in der Zeit von Januar 2012 bis April 2015 im Institut für Immunologie der Technischen Universität Dresden angefertigt. Aus aktuellen Gründen wurden Teile dieser Arbeit bereits präsentiert: Veröffentlichung: Toma M*, Wehner R*, Kloß A*, Hübner L, Fodelianaki G, Erdmann K, Füssel S, Zastrow S, Meinhardt M, Seliger B, Brech D, Noessner E, Tonn T, Schäkel K, Bornhäuser M, Bachmann MP, Wirth MP, Baretton G, Schmitz M. *Diese Autoren trugen zu gleichen Teilen zum Manuskript bei. “Accumulation of tolerogenic human 6-sulfo LacNAc dendritic cells in renal cell carcinoma is associated with poor prognosis” Oncoimmunology. 2015; Manuskript akzeptiert und im Druck. Poster: Kloß A, Wehner R, Hübner L, Günther K, Löbel B, Toma M, Füssel S, Seliger B, Wirth MP, Baretton G, Schmitz M. “Renal cell carcinoma cells efficiently inhibit the immunostimulatory capacities of 6-sulfo LacNAc+ dendritic cells” 3rd Bioscience PhD Students (BiPS) Retreat, 2. - 3. September 2013, Görlitz. Wehner R, Toma M, Kloß A, Füssel S, Schäkel K, Seliger B, Wirth MP, Baretton G, Schmitz M. “Increased frequencies of 6-sulfo LacNAc+ dendritic cells in tissues of patients with renal cell carcinoma are associated with poor prognosis” 13th International Conference on Progress in Vaccination Against Cancer (PIVAC-13), 02. - 04. Oktober 2013, Amsterdam. Wehner R, Toma M, Kloß A, Erdmann K, Füssel S, Seliger B, Brech D, Noessner E, Schäkel K, Wirth MP, Baretton G, Schmitz M. “Accumulation of tolerogenic human 6-sulfo LacNAc+ dendritic cells in renal cell carcinoma is associated with poor prognosis” 13th International Symposium on Dendritic Cells, 14. - 18. September 2014, Tours. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis ............................................................................................. IV Tabellenverzeichnis .................................................................................................. VI Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... VII 1 Einleitung............................................................................................................ 1 1.1 Das Immunsystem des Menschen ...................................................................... 1 1.2 Dendritische Zellen ............................................................................................. 2 1.2.1 Phänotypische und funktionelle Charakteristika von DCs ............................. 3 1.2.2 Aktivierung von T-Lymphozyten durch DCs .................................................. 5 1.2.3 Interaktion von DCs und NK-Zellen ............................................................... 7 1.2.4 slanDCs – eine Subpopulation humaner DCs im Blut ................................... 8 1.3 Interaktion von DCs und Tumorzellen ................................................................11 1.3.1 Tumorabwehr durch das Immunsystem .......................................................11 1.3.2 Immunescape-Mechanismen von Tumoren .................................................13 1.4 Nierenzellkarzinome ...........................................................................................15 1.4.1 Charakterisierung und Klassifikation von NZKs............................................16 1.4.2 Therapeutische Strategien für NZK-Patienten ..............................................19 1.5 Zielstellung .........................................................................................................22 2 Material und Methoden .................................................................................... 24 2.1 Material ..............................................................................................................24 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien ......................................................................24 2.1.2 Grundmedien und Medienzusätze ...............................................................25 2.1.3 Medienzusammensetzung ...........................................................................26 2.1.4 Lösungen und Puffer....................................................................................27 2.1.5 Antikörper und Antikörper-gekoppelte „MicroBeads“ ....................................29 2.1.5.1 Antikörper zur Zellisolation ...........................................................................29 2.1.5.2 Antikörper zur Detektion von Oberflächenmolekülen ...................................30 2.1.5.3 Antikörper für Intrazelluläre Färbungen ........................................................32 2.1.5.4 Stimulationsbeads .......................................................................................33 2.1.5.5 Blockierungsantikörper ................................................................................33 2.1.6 Testkitsysteme .............................................................................................33 2.1.7 Zytokine .......................................................................................................33 2.1.8 Humane Tumorzelllinien ..............................................................................34 2.1.9 Geräte .........................................................................................................34 I Inhaltsverzeichnis 2.1.10 2.2 Sonstige Materialien ....................................................................................35 Methoden ...........................................................................................................36 2.2.1 Kultivierung von Tumorzelllinien ..................................................................36 2.2.2 Isolation mononukleärer Zellen des peripheren Blutes .................................37 2.2.3 Immunmagnetische Isolation verschiedener Immunzellpopulationen aus PBMCs ..................................................................................................38 2.2.3.1 Isolation von slanDCs ..................................................................................40 2.2.3.2 Isolation von CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Lymphozyten und CD56+ CD3NK-Zellen.....................................................................................................41 2.2.4 Durchflusszytometrie ...................................................................................42 2.2.4.1 Analyse von Oberflächenmolekülen .............................................................42 2.2.4.2 Analyse von intrazellulären Molekülen .........................................................43 2.2.4.3 Charakterisierung von slanDCs aus frischem NZK-Gewebe ........................44 2.2.5 Kokultivierung von slanDCs und NZK-Zellen ...............................................46 2.2.6 T-Zell-Proliferationstest mit eFluor® 670.......................................................48 2.2.7 Programmierung naϊver CD4+ T-Zellen durch slanDCs ................................49 2.2.8 SlanDC-vermittelte IFN-γ-Produktion durch NK-Zellen .................................50 2.2.9 „Enzyme-linked Immunosorbent Assay“ .......................................................51 2.2.10 Immunhistochemie .......................................................................................52 2.2.11 Isolierung von Leukozyten aus Gewebe.......................................................54 2.2.12 Statistik ........................................................................................................55 3 Ergebnisse........................................................................................................ 56 3.1 Nachweis von slanDCs in klarzelligem NZK-Gewebe .........................................56 3.2 Charakterisierung von slanDCs aus klarzelligem NZK-Gewebe .........................60 3.3 Einfluss von NZK-Zellen auf die slanDC-induzierte T-Zell-Proliferation ..............63 3.3.1 Wirkung von NZK-Zellen auf die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ T-Zellen ..............................................................................................63 3.3.2 Effekt von NZK-Zellen auf die slanDC-vermittelte Proliferation von CD8+ T-Zellen ..............................................................................................68 3.3.3 Bedeutung des direkten Zell-Zell-Kontaktes bei der funktionellen Inhibition von slanDCs durch NZK-Zellen.....................................................72 3.4 Die Rolle koinhibitorischer B7-Moleküle bei der funktionellen Hemmung von slanDCs durch NZK-Zellen .................................................................................74 3.4.1 Expression von koinhibitorischen B7-Molekülen auf NZK-Zellen ..................74 II Inhaltsverzeichnis 3.4.2 Einfluss von B7-H1 sowie B7-H3 auf die Hemmung der slanDCvermittelten CD4+ T-Zell-Proliferation durch NZK-Zellen ..............................79 3.5 Wirkung von NZK-Zellen auf die slanDC-vermittelte Programmierung von naïven CD4+ T-Zellen .........................................................................................84 3.6 Modulation der slanDC-induzierten IFN-γ-Produktion von NK-Zellen durch NZK-Zellen .........................................................................................................89 4 Diskussion ........................................................................................................ 94 4.1 DCs – die zentralen Mediatoren der antitumoralen Immunantwort .....................94 4.2 Humane DCs als Bestandteil des Immunzellinfiltrates von NZKs .......................95 4.3 NZK-infiltrierende slanDCs prägen einen tolerogenen Phänotyp aus .................98 4.4 NZK-Zellen inhibieren die immunstimulatorischen Fähigkeiten von slanDCs ....102 4.4.1 Modulation der slanDC-vermittelten Aktivierung sowie Differenzierung von T-Lymphozyten durch NZK-Zellen .......................................................102 4.4.2 Zugrunde liegende Mechanismen der Inhibition von slanDCs durch NZKs .........................................................................................................104 4.4.3 Hemmung der slanDC-induzierten Aktivierung von NK-Zellen durch NZK-Zellen ................................................................................................107 4.5 Bedeutung von slanDCs in NZKs – zwischen Tumorabwehr und Tumorprogression ............................................................................................109 5 Zusammenfassung ........................................................................................ 111 6 Literaturverzeichnis ....................................................................................... 113 Versicherung….. ...................................................................................................... 133 Danksagung……...................................................................................................... 135 III Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Prinzip der immunmagnetischen Isolation von Zellen aus PBMCs am Beispiel von slanDCs ....................................................................39 Abbildung 2: „Gating“-Strategie zur Charakterisierung von NZK-infiltrierenden slanDCs ..............................................................................................46 Abbildung 3: Immunhistochemischer Nachweis von slanDCs in primären NZKGeweben ............................................................................................57 Abbildung 4: Immunhistochemischer Nachweis von slanDCs in NZK- Metastasen .........................................................................................59 Abbildung 5: SlanDCs in klarzelligen NZKs weisen einen tolerogenen Phänotyp auf ......................................................................................62 Abbildung 6: Inhibition der slanDC-vermittelten Proliferation von CD4+ T-Zellen durch NZK-Zellen................................................................................65 Abbildung 7: Einfluss von NZK-Zellen auf die Proliferation aktivierter CD4+ T-Zellen ..............................................................................................67 Abbildung 8: Hemmung der slanDC-vermittelten Proliferation von CD8+ T-Zellen durch NZK-Zellen ..................................................................69 Abbildung 9: Wirkung von NZK-Zellen auf die Proliferation aktivierter CD8+ T-Zellen ..............................................................................................71 Abbildung 10: Einfluss einer separierenden Membran auf die Hemmung der slanDC-vermittelten Proliferation von CD4+ T-Zellen durch NZKZellen..................................................................................................74 Abbildung 11: Expression von koinhibitorischen B7-Molekülen durch die NZKZelllinie ACHN ....................................................................................76 Abbildung 12: Ausprägung von koinhibitorischen B7-Molekülen durch die Tumorzelllinie Caki-1 ..........................................................................77 Abbildung 13: Expression von koinhibitorischen B7-Molekülen durch Zellen der primären NZK-Linie MZ1257RC..........................................................78 Abbildung 14: Ausprägung von koinhibitorischen B7-Molekülen durch die primäre Tumorzelllinie MZ2877RC .....................................................79 Abbildung 15: PD-1-Expression auf slanDCs ............................................................80 Abbildung 16: Wirkung von B7-H1 und B7-H3 bei der NZK-vermittelten funktionellen Hemmung von slanDCs .................................................84 Abbildung 17: Inhibition der slanDC-vermittelten Programmierung naïver CD4+ T-Zellen durch NZK-Zellen ..................................................................87 IV Abbildungsverzeichnis Abbildung 18: Wirkung von NZK-Zellen auf die Differenzierung naïver CD4+ T-Zellen ..............................................................................................89 Abbildung 19: Hemmung der slanDC-vermittelten Aktivierung von NK-Zellen durch die NZK-Zelllinie ACHN.............................................................90 Abbildung 20: Inhibition der slanDC-induzierten Aktivierung von NK-Zellen durch die NZK-Zelllinie Caki-1 ............................................................91 Abbildung 21: Beeinträchtigung der slanDC-vermittelten Aktivierung von NK-Zellen durch die primäre NZK-Zelllinie MZ1257RC .......................91 Abbildung 22: Hemmung der slanDC-vermittelten Aktivierung von NK-Zellen durch die primäre NZK-Zelllinie MZ2877RC........................................92 Abbildung 23: Einfluss der NZK-Zelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC und MZ2877RC auf die IFN-γ-Sekretion aktivierter NK-Zellen ...................93 Abbildung 24: Immunsuppressives Potenzial von NZKs auf den Phänotyp und die Funktion von slanDCs (A) tolerogener Phänotyp klarzelliger NZK-Gewebe infiltrierender slanDCs in situ (B) Einfluss klarzelliger NZK-Zelllinien auf slanDCs in vitro ..................................110 V Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Klassifikation des NZKs auf Grundlage der UICC-Kriterien .................18 Tabelle 2: Reinheitsfärbungen.............................................................................42 Tabelle 3: Schema zur Färbung von TILs ............................................................45 Tabelle 4: Anzahl der slanDCs in Gewebeschnitten von NZK-Patienten .............60 Tabelle 5: Einfluss einer Blockierung von B7-H1 bzw. B7-H3 auf NZK-Zellen bei der Hemmung der slanDC-vermittelten Proliferation von CD4+ T-Zellen durch NZK-Zellen ..................................................................82 VI Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ACK Ammonium-Chlorid-Kalium AP Alkalische Phosphatase APC Allophycocyanin APC-H7 APC-Hilite®7 APCs „antigen-presenting cells“ (Antigen-präsentierende Zellen) ATCC „American Type Culture Collection“ B7-H B7-Homolog BDCA „blood dendritic cell antigen“ (Antigen dendritischer Zellen des Blutes) bidest. bidestilliert BSA Bovines Serumalbumin CAFs „cancer-associated fibroblasts“ (Tumor-assoziierte Fibroblasten) CCR „C-C chemokine receptor“ (C-C Chemokinrezeptor) CD „cluster of differentiation“ (Differenzierungsmuster) CP Citrat-Phosphat CTLA „cytotoxic T-lymphocyte-associated protein“ CTLs „cytotoxic T lymphocytes“ (zytotoxische T-Lymphozyten) DAMP „danger-associated molecular patterns“ (Gefahren-assoziierte molekulare Muster) DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol DCs „dendritic cells“ (dendritische Zellen) dest. destilliert DMEM „Dulbecco's Modified Eagle Medium“ DMSO Dimethylsulfoxid DNA „deoxyribonucleic acid“ (Desoxyribonukleinsäure) DNase Desoxyribonuklease EDTA „ethylenediaminetetraacetic acid“ (Ethylendiamintetraessigsäure) VII Abkürzungsverzeichnis ELISA „enzyme-linked immunosorbent assay“ ercDCs „enriched-in-renal-cell-carcinoma DCs“ et al. „et alii“ (und andere) FACS „fluorescence-activated cell sorter“ (Durchflusszytometer) FasL Fas-Ligand Fc „fragment crystallizable“ (kristallisierbares Fragment der Antikörper) FcR Fc-Rezeptor FITC Fluorescein-5-isothiocyanat FKS Fetales Kälberserum FSC „forward scatter“ (Vorwärtsstreulicht) GM-CSF „granulocyte-macrophage colony-stimulating factor“ (GranulozytenMakrophagen Kolonie-stimulierender Faktor) HBSS „Hank’s Balanced Salt Solution“ HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-ethansulfonsäure HIER „heat induced epitope retrieval“ (Hitzevorbehandlung) HIF „hypoxia-inducible factor“ (Hypoxie-induzierter Faktor) HLA „human leukocyte antigen“ (humanes Leukozytenantigen) HMGB „high mobility group box“ HS Humanserum HSP „heat shock protein“ (Hitzeschockprotein) ICAM „intercellular adhesion molecule“ (Zelladhäsionsmolekül) ICOS „inducible T-cell costimulator“ ICOSL ICOS-Ligand IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin ILT „immunoglobulin-like transcript“ LAMP „lysosome-associated membrane protein“ VIII Abkürzungsverzeichnis LFA „lymphocyte function-associated antigen“ LPS Lipopolysaccharid MACS „magnetic-activated cell sorting“ (magnetische Zellseparierung) M-CSF „macrophage-colony stimulating factor“ (Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor) mDCs myeloide DCs MDSC „myeloid-derived suppressor cells“ (Myeloide Suppressorzellen) MEM „Minimum Essential Medium“ MFI Mittlere Fluoreszenzintensität MHC „major histocompatibility complex“ (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIC „MHC class I chain-related antigen“ MoDCs von Monozyten abgeleitete DCs mTOR „mammalian target of rapamycin“ NEA Nicht-essenzielle Aminosäuren NK-Zellen Natürliche Killerzellen NLR „NOD-like receptor“ NOD „nucleotide-binding oligomerization domain“ NZK Nierenzellkarzinom PAMP „pathogen-associated molecular patterns“ (Pathogen-assoziierte molekulare Muster) PBMC „peripheral blood mononuclear cells“ (mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) PBS „phosphate buffered saline“ (Phosphat-gepufferte Salzlösung) PD „programmed cell death“ (programmierter Zelltod) pDCs plasmazytoide DCs PD-L PD-Ligand PE Phycoerythrin PerCP Peridinin chlorophyll PFA Paraformaldehyd IX Abkürzungsverzeichnis PGE2 Prostaglandin E2 pH potentia Hydrogenii PMA Phorbol-12-Myristyl-13-Azetat PRR „pattern recognition receptor“ PSGL-1 P-Selektin-Glycoprotein-Ligand-1 RIG-I „retinoic-acid-inducible protein 1“ RLR „RIG-I-like receptor“ RPMI „Roswell Park Memorial Institute“ RT Raumtemperatur slan 6-sulfo LacNAc SSC „side scatter“ (Seitwärtsstreulicht) TAA „tumor-associated antigen“ (Tumor-assoziiertes Antigen) TAM Tumor-assoziierte Makrophagen TCR „T cell receptor“ (T-Zell Rezeptor) TECs „tumor endothelial cells“ (Tumor-Endothelzellen) TGF „transforming growth factor“ (Transformierender Wachstumsfaktor) TH T-Helferzelle TILs Tumor-infiltrierende Leukozyten TLR „Toll-like receptor“ TNF Tumornekrosefaktor TNM „tumor-nodes-metastases“ (Tumor-Lymphknoten-Metastasen) TRAIL „TNF-related apoptosis-inducing ligand“ Treg Regulatorische T-Zelle UICC „Union internationale contre le cancer“ VEGF „vascular endothelial growth factor“ VHL von Hippel-Lindau w/v „weight per volume“ (Massenprozent in einer Lösung) xg Vielfaches der Erdbeschleunigung (g = 9,81 m/s2) X Einleitung 1 Einleitung 1.1 Das Immunsystem des Menschen Das Immunsystem dient dem Schutz des menschlichen Organismus vor schädigenden inneren und äußeren Einflüssen. Es stellt ein komplexes Netzwerk aus löslichen und zellulären Komponenten mit spezialisierten Aufgaben zur Verteidigung gegen Bakterien, Parasiten, Pilze, Viren und Tumorzellen dar. Diese Komponenten können dem angeborenen bzw. dem adaptiven Immunsystem zugeordnet werden [ABBAS et al., 2012; MURPHY et al., 2012]. Die erste Abwehr wird durch das angeborene Immunsystem gebildet und eliminiert Pathogene sowie Tumorzellen Antigen-unspezifisch. Die Reaktion hat einen stereotypen Charakter, bietet jedoch durch die Erkennung von evolutionär konservierten Pathogenstrukturen einen schnellen und wirkungsvollen ersten Schutz gegen die Ausbreitung von Erregern. Zu den löslichen Faktoren des angeborenen Immunsystems zählen verschiedene Serumbestandteile wie Komplementfaktoren, Akute-Phase-Proteine, Kollektine und Zytokine. Zytokine dienen der Kommunikation zwischen den Zellen des Immunsystems. Diese Proteine sind beispielsweise in der Lage, die Aktivierung und Differenzierung von Zielzellen zu regulieren oder Immunzellen zu rekrutieren [ABBAS et al., 2012; MURPHY et al., 2012]. Zu den Zellen des angeborenen Immunsystems zählen unter anderem dendritische Zellen (DCs), Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, und Natürliche Killer (NK)-Zellen. NK-Zellen sind durch ihr zytotoxisches Potenzial in der Lage, Virus-infizierte und maligne Zellen zu lysieren. Des Weiteren können NK-Zellen die Immunantwort durch die Produktion des proinflammatorischen Zytokins Interferon (IFN)-γ beeinflussen [VIVIER et al., 2011]. DCs wiederum gehören wie Granulozyten, Monozyten und Makrophagen zu den phagozytierenden Zellen. Sie können Erreger oder Tumorzellen aufnehmen und eliminieren sowie Chemokine und proinflammatorische Zytokine sezernieren. Zytokine wie Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interleukin (IL)-6 und IFN-γ rekrutieren und aktivieren anschließend zusätzliche Immunzellen. Weiterhin vermögen DCs durch die Präsentation von Pathogen- oder Tumor-spezifischen Peptiden auf sogenannten „major histocompatibility complex“ (MHC)-Molekülen, die Aktivierung und Expansion von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten zu vermitteln. Durch ihre besondere Stellung als professionelle 1 Einleitung Antigen-präsentierende Zellen (APCs) und als zentrale Regulatoren des Immunsystems wirken DCs als Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem [BANCHEREAU et al., 2000; SCHÄKEL et al., 2009; MELLMAN, 2013]. Das adaptive Immunsystem wird durch Komponenten des angeborenen Immunsystems aktiviert. Es zeichnet sich durch die spezifische Erkennung von Antigenen sowie die Anpassung an Antigenstrukturen aus und umfasst sowohl Lymphozyten als auch deren lösliche Produkte [ABBAS et al., 2012; MURPHY et al., 2012]. Neben Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten gehören dem adaptiven Immunsystem auch T-Lymphozyten an, welche gemäß ihrer Funktion sowie abhängig von ihren Oberflächenmolekülen in immunmodulatorische „cluster of differentiation“ (CD)4+ T-Helfer (TH)-Zellen und CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) eingeteilt werden. Mithilfe ihrer T-Zell-Rezeptoren (TCRs) können sie spezifisch die von APCs präsentierten MHC-Peptid-Komplexe erkennen und werden auf diese Weise aktiviert. Aktivierte CD4+ T-Lymphozyten unterscheiden sich funktionell untereinander und werden entsprechend ihrem Zytokinexpressionsprofil in TH1-, TH2-, TH17- und regulatorische T-Lymphozyten (Tregs) untergliedert. Aktivierte CD8+ CTLs sind im Stande, Antigen-spezifisch die Apoptose infizierter Zellen oder Tumorzellen zu induzieren [BERKE, 1994; ZHU UND PAUL, 2008; WALSH UND MILLS, 2013]. Neben diesen spezifischen Reaktionen und der Anpassung gegen Antigenstrukturen ist es T-Lymphozyten ebenso wie B-Zellen möglich, ein immunologisches Gedächtnis auszubilden und somit bei erneuter Infektion mit einer schnelleren und stärkeren Immunantwort zu reagieren [SALLUSTO et al., 2010; FABER et al., 2014]. 1.2 Dendritische Zellen DCs gehören dem angeborenen Immunsystem an und gehen aus CD34+ Stammzellen im Knochenmark hervor. Als die potentesten professionellen APCs zeichnen sie sich durch ihre zentrale Stellung in der Regulation der Immunantwort aus und verbinden angeborene und adaptive Immunantwort an entscheidender Stelle [BANCHEREAU UND STEINMAN, 1998; PALUCKA UND BANCHEREAU, 2012]. 2 Einleitung 1.2.1 Phänotypische und funktionelle Charakteristika von DCs DCs liegen prinzipiell in zwei Entwicklungsstadien – unreif bzw. reif – vor, die jeweils durch die Ausprägung bestimmter Oberflächenmoleküle und durch charakteristische Funktionen definiert sind [DALOD et al., 2014]. So zeichnen sich unreife DCs durch die geringe Expression von kostimulatorischen Molekülen und MHC-Molekülen aus. DCs mit diesem Phänotyp weisen eine geringe Fähigkeit zur Induktion einer Antigenspezifischen T-Zell-Antwort auf. Durch den Besitz von Kollektin-, Pentraxin-, Komplement- und Fc-Rezeptoren verfügen unreife DCs jedoch über eine hohe Kapazität zur Aufnahme von opsonisierten Antigenen. Über den Blutweg gelangen die unreifen DCs vom Knochenmark in nicht-lymphatische Gewebe wie den Respirationstrakt, den Gastrointestinaltrakt und die Haut, wo sie mit Antigenen konfrontiert werden. Die Fähigkeit zur Endozytose, Phagozytose und Pinozytose ermöglicht es den DCs, in den peripheren Geweben mikrobielle oder Tumor-assoziierte Proteine aufzunehmen [BRODE UND MACARY, 2004; SABATTÉ et al., 2007; HOPKINS UND CONNOLLY, 2012; STRIOGA et al., 2013]. Sowohl extrazelluläre Proteine als auch zytoplasmatische Proteine werden prozessiert und die daraus generierten Peptide mithilfe von MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche der DCs präsentiert. Peptide aus extrazellulären Proteinen werden schließlich auf MHC-Klasse II-Molekülen präsentiert und können von TCRs der CD4+ T-Zellen erkannt werden. Peptide von intrazellulär entstandenen Proteinen, wie virale oder zelleigene Proteine, werden hingegen auf MHC-Klasse I-Molekülen präsentiert und interagieren mit den TCRs von CD8+ T-Lymphozyten. Durch die sogenannte Kreuzpräsentation ist es insbesondere DCs möglich, Peptide extrazellulärer Proteine mit MHC-Klasse I-Molekülen zu assoziieren sowie Peptide intrazellulär gebildeter Proteine auf MHC-Klasse II-Molekülen zu präsentieren. Dies befähigt DCs zur simultanen Antigen-spezifischen Aktivierung von CD4+ und CD8+ T-Zellen gegen Tumorantigene [VYAS et al., 2008; JOFFRE et al., 2012]. Voraussetzung für die effiziente Ausreifung der DCs ist das Vorhandensein von „danger“-Signalen zum Zeitpunkt der Antigenaufnahme. Dazu zählen konservierte Strukturen, wie bakterielle Zellwandbestandteile und bakterielle oder virale Desoxyribonukleinsäuren bzw. Ribonukleinsäuren, die als „pathogen-associated molecular patterns“ (PAMPs) zusammengefasst werden. Den „danger“-Signalen gehören weiterhin „danger-associated molecular patterns“ (DAMPs) an. Als DAMPs werden endogene Strukturen wie beispielsweise „heat shock“-Proteine (HSPs) und das „high mobility group box“ (HMGB)-1 Protein zusammengefasst. Diese werden während 3 Einleitung einer Zellschädigung, bei Nekrose oder Zellstress, wie etwa bei dem Auftreten eines Tumors, in den Extrazellularraum freigesetzt. Sowohl PAMPs als auch DAMPs binden an „pattern recognition receptors“ (PRRs) der DCs, zu denen beispielsweise neben den im Zytosol vorliegenden „RIG-I-like“-Rezeptoren (RLRs) und „NOD-like“Rezeptoren (NLRs) auch die auf der Zelloberfläche bzw. in den Endosomen lokalisierten „Toll-like“-Rezeptoren (TLRs) zählen. Während TLR3, -7, -8 und -9 hauptsächlich in Endosomen vorliegen und Nukleinsäuren detektieren, erkennen die auf der Zelloberfläche lokalisierten TLR1, -2, -4, -5 und -6 unter anderem bakterielle Zellwandbestandteile. TLR4 beispielsweise bindet das von gramnegativen Bakterien gebildete Lipopolysaccharid (LPS). Die aus der Aktivierung eines TLRs resultierende Signalkaskade führt zur Transkriptionsinduktion von Genen, die für Zytokine, Chemokine und Oberflächenmoleküle kodieren, welche charakteristisch für reife DCs sind [AKIRA et al., 2006; NACE et al., 2012; ESCAMILLA-TILCH et al., 2013; DUDEK et al., 2013]. Durch die Aufnahme von Antigenen und die gleichzeitige Erkennung von PAMPs oder DAMPs wird folglich die Aktivierung sowie Ausreifung der DCs induziert. Aber auch Zytokine wie IL-1, IL-4, „granulocyte-macrophage colony-stimulating factor“ (GM-CSF), Typ-I-IFN, IFN-γ und TNF-α stimulieren die Reifung von DCs [MACAGNO et al., 2007; JOFFRE et al., 2009; TUFA et al., 2014; VISPERAS et al., 2014]. Als Marker für reife DCs dient das Oberflächenmolekül CD83 [BRELOER UND FLEISCHER, 2008]. Weiterhin geht die Ausreifung mit einer verstärkten Expression von MHC-Molekülen, Adhäsionsmolekülen, kostimulatorischen Molekülen wie CD40, CD80 und CD86, sowie einer erhöhten Sekretion von immunmodulatorischen Zytokinen wie TNF-α, IL-12 und Typ-I-IFN einher. Die Phagozytoseaktivität hingegen wird durch die verminderte Expression von phago- und endozytotischen Rezeptoren reduziert [BANCHEREAU et al., 2000; MACAGNO et al., 2007; HOPKINS UND CONNOLLY, 2012; STRIOGA et al., 2013]. Ein weiterer wichtiger Schritt während der Reifung von DCs ist die verstärkte Ausprägung des „C-C chemokine receptor type 7“ (CCR7) auf der Zelloberfläche. Dieser Rezeptor befähigt reifende DCs zur Migration in die T-Zell-Zonen der drainierenden Lymphknoten, wo schließlich die Peptid-spezifische Aktivierung von CD4+ sowie CD8+ T-Lymphozyten stattfindet [BACHMANN et al., 2006; DIEBOLD, 2008; HEUZÉ et al., 2013; COMERFORD et al., 2013]. Ferner ist es ausgereiften DCs durch die Sekretion von Zytokinen wie TNF-α, IL-4, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23 und IFN-α möglich, die Differenzierung von aktivierten CD4+ T-Zellen anzustoßen sowie weitere Zellen des angeborenen Immunsystems zu stimulieren [MORETTA, 2005; REIS E SOUSA, 2006; GALLOIS UND BHARDWAJ, 2013]. 4 Einleitung 1.2.2 Aktivierung von T-Lymphozyten durch DCs Charakteristisch für T-Lymphozyten ist die Expression von CD3-Molekülen auf der Zelloberfläche, welche als CD3-Komplex mit dem TCR assoziiert und an der Signalübertragung dieses Rezeptors beteiligt sind. Abhängig von ihrer Funktion sowie der Expression weiterer + Oberflächenmoleküle werden T-Lymphozyten in + immunmodulatorische CD4 TH-Zellen und CD8 CTLs unterteilt. Nach der Reifung der T-Zellen im Thymus zirkulieren die naïven (nicht aktivierten) T-Lymphozyten zwischen peripherem Blut und lymphatischem Gewebe [ABBAS et al., 2012; MURPHY et al., 2012]. Voraussetzung für die Aktivierung von naïven CD4+ oder CD8+ T-Lymphozyten ist der Kontakt mit professionellen APCs, wie DCs, die das jeweils spezifische Antigen in Form eines Peptides auf MHC-Molekülen präsentieren. Dieser Kontakt findet in der Regel im Parakortex der Lymphknoten statt [GUERMONPREZ et al., 2002]. Dort kommt die erste Kontaktaufnahme durch so genannte Adhäsionsmoleküle wie dem „intercellular adhesion molecule“ (ICAM)-1 (CD54) auf DCs zu Stande, welches mit dem Integrin „lymphocyte function-associated antigen“ (LFA)-1 (CD11a / CD18) auf T-Zellen interagiert [BANCHEREAU et al., 2000, FOOKSMAN et al., 2010]. Die Induktion einer Antigen-spezifischen T-Zell-Antwort beruht auf der zwei-Signal-Hypothese. Das erste Signal besteht aus der Interaktion des MHC-Peptid-Komplexes auf DCs mit einem affinen TCR auf naïven T-Lymphozyten. Diese Bindung wird durch die Korezeptormoleküle CD4 bzw. CD8 stabilisiert. Durch die Interaktion dieser Korezeptormoleküle mit den MHC-Molekülen wird weiterhin sichergestellt, dass naïve CD8+ T-Lymphozyten nur dann Peptide mit ausreichender Affinität binden, wenn diese auf MHC-Klasse I-Molekülen präsentiert werden, während CD4+ T-Zellen Peptide erkennen, die auf MHC-Klasse II-Molekülen gebunden sind. Das zweite Signal, welches für die erfolgreiche Aktivierung einer naïven T-Zelle erforderlich ist, wird durch die Interaktion der kostimulatorischen Moleküle der B7-Familie (CD80 oder CD86) auf reifen DCs mit dem Rezeptor CD28 auf T-Lymphozyten bereitgestellt. Beide Signale sind notwendig, um die Proliferation und die Differenzierung von naïven T-Zellen zu Effektorzellen zu induzieren und somit essenziell für eine effiziente Immunantwort [KEIR UND SHARPE, 2005; REIS E SOUSA, 2006]. Erkennen naïve T-Zellen unreife DCs, die durch das Fehlen von PAMPs und DAMPs zum Zeitpunkt der Antigenaufnahme gekennzeichnet sind und somit keine kostimulatorischen Moleküle exprimieren, so fehlt das zweite Aktivierungssignal und es kommt zur Anergisierung oder zur Apoptose der T-Lymphozyten. Dieser Mechanismus wird als periphere Toleranz bezeichnet und stellt sicher, dass das Immunsystem nicht gegen körpereigene Strukturen aktiviert wird 5 Einleitung [POWELL, 2006; XING UND HOGUIST, 2012]. DCs, welche in der Lage sind Toleranz zu induzieren, werden auch als tolerogen bezeichnet [STEINMAN et al., 2003]. Im Falle von CD4+ T-Lymphozyten lenkt schließlich ein drittes Signal zum Zeitpunkt der Aktivierung die Differenzierung in funktionsfähige Effektor-TH-Zellen. Dieses wird von reifen DCs in Form von Zytokinen bereitgestellt. Das Profil der durch DCs sezernierten Zytokine ist wiederum von der Polarisierung der DCs durch PAMPs oder DAMPs abhängig. Auf diese Weise erfolgt die Abstimmung der T-Zell-Antwort spezifisch auf das vorliegende Pathogen bzw. auf den vorliegenden Gewebeschaden. So führt beispielsweise die Bereitstellung von IL-12 durch DCs im Zuge einer Immunreaktion gegen intrazelluläre Pathogene zur Induktion einer TH1-Antwort. Charakteristisch für TH1-Zellen ist die Sekretion der Zytokine IFN-γ sowie TNF-α, welche wiederrum zur Aktivierung von DCs führen. Auch die Stimulierung von CTLs und die B-Zell-Hilfe zum Klassenwechsel zu Immunglobulin (Ig)G gehören zu den Kapazitäten von T H1-Zellen. Durch DCs produziertes IL-4 begünstigt in Abwesenheit von IL-12 eine TH2-Antwort. Diese Effektor-TH-Zellen sezernieren selbst IL-4 sowie IL-5 und IL-13 und vermitteln somit in B-Zellen den Klassenwechsel zu IgE sowie die Rekrutierung von basophilen und eosinophilen Granulozyten. Genannte Effektorfunktionen spielen besonders bei der Immunantwort gegen Parasiten und bei Allergien eine Rolle. Die Zytokine IL-6 und IL-23 fördern die Differenzierung von TH17-Zellen, welche IL-17, IL-21 sowie IL-22 produzieren. Auf diese Weise rekrutieren TH17-Zellen neutrophile Granulozyten zur Elimination von extrazellulären Bakterien und Pilzen. Das Vorliegen von IL-10 zum Zeitpunkt der T-Zell-Aktivierung resultiert hingegen in der Entwicklung von IL-10- und „transforming growth factor“ (TGF)-β-sezernierenden Tregs. Diese Effektor-T-Zellen nehmen eine wichtige Rolle im Rahmen der peripheren Toleranz ein, indem sie die Proliferation und die Funktionen anderer T-Lymphozyten sowie weiterer Zellpopulationen des Immunsystems hemmen und somit deren Immunantworten supprimieren [REINER, 2007; W ALSH UND MILLS, 2013; W HITESIDE, 2014]. Die Interaktion zwischen DCs und T-Zellen ist nicht einseitig. Nach ihrer Aktivierung sind CD4+ T-Helferzellen selbst in der Lage, die Funktionalität aktivierter DCs zu stimulieren [BEHRENS et al., 2004]. Dies erfolgt über die Ligation von CD40 auf DCs mit CD40L (CD154), welches von aktivierten T-Lymphozyten exprimiert wird. Dieser „T-Zell-Feedback“-Mechanismus ist für die Kapazität der DCs zur effizienten Aktivierung von CD8+ T-Zellen essenziell und steigert die Fähigkeit zur Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten [RIDGE et al., 1998; MA UND CLARK, 2009; AHMED et al., 2012]. Des Weiteren stimuliert das von TH1-Zellen sezernierte IFN-γ DCs zur vermehrten 6 Einleitung Präsentation von Antigenen, was ebenfalls in einer effizienteren Aktivierung von naïven T-Lymphozyten resultiert [FRÜH UND YANG, 1999; ZAIDI UND MERLINO, 2011]. 1.2.3 Interaktion von DCs und NK-Zellen NK-Zellen spielen als Zellen des angeborenen Immunsystems eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Virus-infizierten Zellen und Tumorzellen. Charakteristisch für NK-Zellen ist die spezifische Ausprägung des aktivierenden Rezeptors NKp46 [KOCH et al., 2013]. Weiterhin sind NK-Zellen durch die Expression des neuronalen Adhäsionsmoleküls CD56 sowie durch das Fehlen des Oberflächenmoleküls CD3 gekennzeichnet [COOPER UND CALIGIURI, 2004]. Entsprechend der Dichte des Moleküls CD56 auf der Zelloberfläche werden humane NK-Zellen des Blutes in zwei Subpopulationen unterteilt. Mit 90 % aller humanen NK-Zellen im Blut zeichnet sich der größte Anteil durch eine hohe Dichte des Fc gamma Rezeptors III (FcγRIII; CD16) sowie eine geringe Ausprägung von CD56 aus. Dagegen sind 5 - 10 % der NK-Zellen im Blut durch das Fehlen von CD16 und eine hohe Expression von CD56 charakterisiert. Beide Subpopulationen unterscheiden sich in ihrer Funktionalität. So produzieren CD56+ CD16++ NK-Zellen vermehrt zytotoxische Moleküle sowie GranzymPerforin-Granula, was sie zur Lyse von Tumor- oder Virus-infizierten Zellen befähigt, während CD56++ CD16- NK-Zellen nach Ihrer Aktivierung besonders auf die Sekretion der immunmodulatorischen Zytokine IFN-γ sowie TNF-α spezialisiert sind [COOPER et al., 2001; ZANONI et al., 2007; FAURIAT et al., 2010; MORETTA et al., 2014]. Die Aktivierung von NK-Zellen erfolgt Antigen-unspezifisch und wird über die Balance von aktivierenden sowie inhibierenden Signalen reguliert. Diese Signale werden über eine Reihe von Oberflächenmolekülen wahrgenommen, welche mit den Oberflächenmolekülen von Zielzellen interagieren. Auf diese Weise können NK-Zellen beispielsweise zwischen normalen MHC-Klasse I-positiven Zellen und Zellen unterscheiden, welche durch Virusinfektionen oder maligne Veränderungen keine MHC-Klasse I-Moleküle ausprägen [MORETTA et al., 2014; W ATZL et al., 2014]. Die Intensität und die Qualität der Effektorfunktionen von NK-Zellen hängt zudem maßgeblich von dem Vorhandensein proinflammatorischer Zytokine sowie von Interaktionen mit weiteren Immunzellen ab [MARCENARO et al., 2006; ZHANG et al., 2008; VIVIER et al., 2008]. Aktivierte NK-Zellen zeichnen sich durch die zytotoxische Aktivität gegenüber ihren Zielzellen aus. So produzieren sie zytotoxische Moleküle wie 7 Einleitung den Fas-Ligand (FasL), „TNF-related apoptosis-inducing ligand“ (TRAIL) und TNF-α und setzen Granzym-Perforin-Granula frei. Weiterhin sezernieren aktivierte NK-Zellen Zytokine wie IFN-γ sowie TNF-α und beteiligen sich auf diese Weise an der Steuerung der antiviralen bzw. antitumoralen Immunantwort [ZANONI et al., 2007; VIVIER et al., 2011]. Neben der Fähigkeit von DCs mit Zellen des adaptiven Immunsystems zu interagieren, sind sie auch dazu in der Lage, mit Effektorzellen des angeborenen Immunsystems – insbesondere mit NK-Zellen – in Wechselbeziehung zu treten. Neben dem direkten Zell-Zell-Kontakt zwischen DCs und NK-Zellen ist auch die Zytokinvermittelte Interaktion wichtig für eine gegenseitige Stimulierung [MORETTA, 2005; ZITVOGEL et al., 2006; FERLAZZO UND MORANDI, 2014]. So ist es aktivierten DCs durch die Sekretion von Zytokinen wie IL-15, IL-18, TNF-α, Typ-I-IFN und besonders IL-12 bei zeitgleichem direktem Zell-Zell-Kontakt möglich, NK-Zellen zu stimulieren. Stimulierte NK-Zellen sind durch eine gesteigerte Proliferationsrate, eine erhöhte Sekretion von IFN-γ bzw. eine vermehrte Zytotoxizität gegenüber Virus-infizierten Zellen sowie Tumorzellen gekennzeichnet [FERLAZZO et al., 2002; BORG et al., 2004; FERLAZZO et al., 2004; MÜNZ et al., 2005; W EHNER et al., 2009; TUFA et al., 2014]. Durch die Sekretion der Zytokine IFN-γ und TNF-α in Verbindung mit direktem ZellZell-Kontakt sind aktivierte NK-Zellen in der Lage, die proinflammatorischen Eigenschaften von DCs zu stimulieren. So vermitteln aktivierte NK-Zellen eine Erhöhung der IL-12-Sekretion aktivierter DCs und begünstigen die spontane Ausreifung von DCs, indem sie die Expression von MHC-Klasse II-Molekülen, kostimulatorischen Molekülen und Adhäsionsmolekülen auf DCs anregen [GEROSA et al., 2002; W EHNER et al., 2009; FERLAZZO UND MORANDI, 2014]. Die Kommunikation zwischen DCs und NK-Zellen findet folglich auf wechselseitiger Ebene statt. 1.2.4 slanDCs – eine Subpopulation humaner DCs im Blut DCs stellen eine heterogene Population innerhalb der Immunzellen dar, die durch das Fehlen der spezifischen Zellmarker anderer Blutzellen, wie CD3 (T-Lymphozyten), CD14 (Monozyten), CD19 (B-Zellen) und CD56 (NK-Zellen), sowie durch die starke Ausprägung von MHC-Klasse I- und MHC-Klasse II-Molekülen definiert sind. Auf dieser Grundlage wurden bisher verschiedene native DC-Subpopulationen des Blutes identifiziert und charakterisiert. Nach dem derzeitigen Kenntnisstand werden diese 8 Einleitung Subpopulationen aufgrund ihrer Oberflächenmoleküle in zwei Hauptgruppen, plasmazytoide DCs (pDCs) und myeloide (auch konventionelle oder klassische) DCs (mDCs), unterteilt [MACDONALD et al., 2002; JU et al., 2010; MERAD et al., 2013; MCGOVERN et al., 2014]. Zur Subpopulation der pDCs zählen Zellen, die eine hohe Expression des spezifischen Oberflächenmarkers IL-3Rα (CD123) aufweisen, bei denen jedoch typische myeloide Marker wie CD11c, CD13 und CD33 fehlen. Charakteristisch für pDCs ist weiterhin die Expression von „blood dendritic cell antigen“ (BDCA)-2 (CD303) und BDCA-4 (CD304) [SCHREIBELT et al., 2010; SALVADOR et al., 2012; DEMOULIN et al., 2013]. Das TLRRepertoire von pDCs beschränkt sich auf das Vorkommen von TLR7 sowie TLR9 [SCHREIBELT et al., 2010; TEL et al., 2012]. Obwohl pDCs einen Anteil von nur 0,2 - 0,8 % der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) darstellen, zählen sie bei Stimulation durch TLR7- und TLR9-Agonisten zu den Hauptproduzenten von Typ-I-IFN. Darüber hinaus wird die Proteinbiosynthese von infizierten Zellen und aktivieren NK-Zellen gehemmt. Somit gelten pDCs als wichtige professionelle APCs bei der Immunreaktion gegen Viren [SCHMIDT et al., 2006; LANDE UND GILLIET, 2010; SCHREIBELT et al., 2010; TEL et al., 2012]. Die heterogene Population der mDCs ist durch eine hohe Dichte CD11c, CD13 und CD33 auf ihrer Oberfläche gekennzeichnet und weist CD123 nur in geringem Maße auf [MACDONALD et al., 2002; SCHREIBELT et al., 2010; SALVADOR et al., 2012]. Abgesehen vom TLR9 prägen mDCs alle bekannten TLRs aus [MATSUMOTO et al., 2003; TAKEDA et al., 2003; SCHREIBELT et al., 2010]. mDCs werden weiterhin in drei Kategorien untergliedert: CD16+ DCs, CD1c+ DCs und BDCA-3(CD141)+ DCs. BDCA-3+ DCs entsprechen dem kleinsten Anteil der mDCs im Blut (3 - 5 % der mDCs) [SCHREIBELT et al., 2010] und besitzen durch ihre ausgeprägte Kapazität zur Kreuzpräsentation von Antigenen die Fähigkeit zur hocheffizienten Aktivierung von CTLs [ZIEGLER-HEITBROCK et al., 2010; HANIFFA et al., 2012]. 10 - 20 % der mDCs gehören der CD1c+ Subpopulation an [SCHREIBELT et al., 2010], welche für die Spezialisierung zur Sekretion des Chemokins IL-8 bekannt sind. Auf diese Weise vermitteln sie die Migration von Monozyten, Granulozyten und Lymphozyten in betroffene Gewebe [PICCIOLI et al., 2007]. Die größte Untergruppe der mDCs exprimiert den Oberflächenmarker CD16 (65 - 75 % der mDCs) [SCHREIBELT et al., 2010] und beinhaltet mit 6-sulfo LacNAc+ (slan)DCs auch eine der größten DC-Subpopulation des Blutes. SlanDCs entsprechen 0,6 - 2 % der Gesamtmenge der PBMCs [SCHÄKEL et al., 2002]. 9 Einleitung SlanDCs werden durch die selektive Expression der slan-Modifikation am P-SelektinGlycoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) definiert. Diese Modifikation ist nicht nur namensgebend, sondern ermöglicht zudem die spezifische immunmagnetische Isolation von slanDCs aus dem Blut. Neben der Expression der typischen myeloiden Marker sind slanDCs auch durch die Ausprägung der Rezeptoren für die Anaphylatoxine C5a und C3a (C5aR und C3aR) gekennzeichnet, wodurch ein schnelles Einwandern der Zellen in ein Entzündungsgebiet ermöglicht wird [SCHÄKEL et al., 1998; SCHÄKEL et al., 2002; SCHÄKEL et al., 2006]. SlanDCs prägen mit Ausnahme von TLR3 und TLR9 alle bekannten TLRs aus [HÄNSEL et al., 2013]. Durch Stimulation mittels TLR-Agonisten erfolgt die Aktivierung der slanDCs [HÄNSEL et al., 2011; HÄNSEL et al., 2013; JÄHNISCH et al., 2013]. Die Ausreifung von slanDCs im Blut wird durch Erythrozyten blockiert, woraus resultiert, dass slanDCs erst nach der Auswanderung aus dem Blut in umliegende Gewebe in der Lage sind, eine effiziente Immunantwort zu induzieren [SCHÄKEL et al., 2006]. Nach Stimulation des TLR4 durch LPS sezernieren slanDCs große Mengen an proinflammatorischen Zytokinen wie TNF-α und IL-12, aber auch IL-1β, IL-6 sowie IL-23 [SCHÄKEL et al., 2002; SCHÄKEL et al., 2006; HÄNSEL et al., 2011]. Die Stimulation mit den TLR7/8 Agonisten Imiquimod und Resiquimod führt ebenfalls zur Produktion von erheblichen Mengen proinflammatorischer Zytokine [HÄNSEL et al., 2011; HÄNSEL et al., 2013; JÄHNISCH et al., 2013]. Während TNF-α grundlegend an der Aufrechterhaltung einer Entzündungsreaktion beteiligt ist, stimuliert IL-12 die Differenzierung von naïven CD4+ T-Lymphozyten in TH1-Zellen. Funktionelle Untersuchungen zeigten, dass slanDCs dazu befähigt sind, T-Lymphozyten effizient gegen Neo- und Recall-Antigene zu stimulieren [SCHÄKEL et al., 2002; SCHÄKEL et al., 2006]. Auch die Aktivierung von Tumor-reaktiven CD8+ T-Lymphozyten zählt zu den funktionellen Charakteristika von slanDCs [SCHÄKEL et al., 1998]. Weiterhin stimulieren slanDCs die Proliferation sowie die IFN-γ-Produktion von NK-Zellen und sind durch die Produktion von IL-12 in der Lage, die Tumor-gerichtete Zytotoxizität dieser Zellpopulation zu fördern [SCHMITZ et al., 2005; WEHNER et al., 2009]. Darüber hinaus besitzen slanDCs die Kapazität, selbst eine Antikörper-abhängige sowie eine Antikörper-unabhängige Lyse von Tumorzellen zu induzieren [SCHMITZ et al., 2002; SCHMITZ et al., 2005]. Durch ihr außerordentliches Potenzial bei der Initiation und Aufrechterhaltung sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems könnten slanDCs wesentlich an der Immunabwehr von Tumoren beteiligt sein. 10 Einleitung 1.3 Interaktion von DCs und Tumorzellen Als professionelle APCs spielen DCs neben zahlreichen weiteren Immunzellen eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr von malignen Zellen. Durch den direkten Kontakt mit zellulären sowie löslichen Komponenten des Tumorgewebes können DCs jedoch in ihrer Migration, Differenzierung, Ausreifung und der Funktionalität beeinflusst werden [MA et al., 2011]. 1.3.1 Tumorabwehr durch das Immunsystem Die Aufgabe des Immunsystems besteht nicht nur in der Bekämpfung von Pathogenen, sondern beinhaltet ebenfalls die Elimination von Tumorzellen. Eine Tumor-gerichtete Immunantwort schließt eine Vielzahl von Immunzellen ein. Bei der Initiation und Regulation einer effizienten sowie anhaltenden Tumor-spezifischen Immunantwort nehmen DCs eine zentrale Rolle ein [STEINMAN UND BANCHEREAU, 2007]. Über den Blutweg ist es DCs möglich, in Tumorgewebe einzuwandern, wo die Konfrontation mit apoptotischen und nekrotischen Tumorzellfragmenten stattfindet. Abgestorbene Tumorzellen werden mittels Phagozytose von den DCs aufgenommen und enthalten Tumor-assoziierte Antigene (TAAs), welche in Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen überexprimiert werden. Sind zeitgleich mit der Aufnahme der TAAs auch Tumorabgeleitete DAMPs wie beispielsweise HSPs oder HMGB-1 vorhanden, so werden die DCs aktiviert und reifen aus. Die Ausreifung wird zusätzlich durch das Vorliegen eines proinflammatorischen Zytokinmilieus begünstigt [BANCHEREAU UND STEINMAN, 1998; GABRILOVICH, 2004; DHODAPKAR et al., 2008]. Tumorzellfragmente können durch Nekrosen, beispielsweise in Folge von Nährstoffund Sauerstoffmangel aufgrund einer Mangelversorgung mit Blut, entstehen. Dies ist nicht selten bei schnell wachsenden Tumoren der Fall [GAMREKELASHVILI et al., 2015]. Besonders während der frühen antitumoralen Immunantwort werden auch apoptotische Tumorzellfragmente durch Tumor-infiltrierende NK-Zellen generiert. Dabei werden die NK-Zellen direkt über MHC-Klasse I-ähnliche Moleküle auf der Oberfläche von Tumorzellen, sogenannte „MHC class I chain-related antigens“ (MIC)-A und MIC-B aktiviert, die mit dem aktivierenden Rezeptor NKG2D auf NK-Zellen interagieren [VIVIER et al., 2002; VITALE et al., 2014]. Die Expression von MIC-A und MIC-B wird bei verschiedenen Formen von Zellstress und einer Vielzahl von humanen primären 11 Einleitung Tumoren epithelialen Ursprungs erhöht [GROH et al., 1999; FERNÁNDEZ-MESSINA et al., 2012; EL-GAZZAR et al., 2013]. Über NKG2D aktivierte NK-Zellen entfalten umgehend zytotoxische Wirkung [MORETTA et al., 2006; LE MAUX CHANSAC et al., 2008]. Die entstehenden Tumorzellfragmente können anschließend durch Tumor-infiltrierende DCs aufgenommen werden [FERLAZZO UND MORANDI, 2014]. Darüber hinaus wird die antitumorale Immunantwort durch Mechanismen gegenseitiger Verstärkung zwischen DCs und NK-Zellen potenziert. So stimulieren aktivierte DCs die zytolytische Aktivität der NK-Zellen durch die Produktion proinflammatorischer Zytokine wie IL-12, während aktivierte NK-Zellen mithilfe von Membran-assoziierten Molekülen sowie der Sekretion von IFN-γ die Aktivierung und somit die IL-12-Produktion der DCs begünstigen. Auf diese Weise wird die Tumorzelllyse gefördert [MORETTA, 2005; W EHNER et al., 2011; BODDULURU et al., 2015]. Während ihrer Ausreifung wandern aktivierte DCs über afferente Lymphgefäße in regionäre Lymphknoten ein, wo sie die aufgenommenen und prozessierten TAAs im Komplex mit MHC-Klasse I- oder MHC-Klasse II-Molekülen auf ihrer Zelloberfläche präsentieren. In den Lymphknoten erfolgt die Aktivierung Tumorantigen-spezifischer T-Lymphozyten, die daraufhin in das maligne Gewebe einwandern, um den Tumor durch Tumorzelllyse sowie die Förderung einer lokalen Entzündungsreaktion zu bekämpfen [KNUTSON UND DISIS, 2005; MANTOVANI et al., 2008; W ALSH UND MILLS, 2013]. Eine DC-vermittelte IL-12-Produktion während der Immunreaktion führt zur Differenzierung aktivierter CD4+ T-Lymphozyten in TH1-Zellen. Diese Effektor-T-Zellen sind wiederum direkt über die Sekretion der Zytokine IL-2 sowie IFN-γ [KNUTSON UND DISIS, 2005; ZHU UND PAUL, 2008] oder indirekt über die Stimulation von DCs in der Lage, die Aktivierung Tumor-reaktiver CTLs und somit die antitumorale Zytotoxizität zu verstärken [BEHRENS et al., 2004]. CTLs induzieren in Tumorzellen den programmierten Zelltod durch die Freisetzung von Zytotoxinen wie Granzym und Perforin aus zelleigenen Granula oder über die Produktion von Molekülen der TNFSuperfamilie wie TNF-α, FasL oder TRAIL, welche mit den korrespondierenden Todesrezeptoren auf Tumorzellen interagieren. Als Reaktion auf die Stimulation der Todesrezeptoren werden sequenziell Tumorzell-eigene Caspasen aktiviert, die letztendlich zur Apoptose der Zielzellen führen [SPENCER UND SORGER, 2011; W EIGELIN et al., 2011]. Durch ihre ausgeprägte Fähigkeit zur Aktivierung von T-Lymphozyten gelten DCs als vielversprechendes Werkzeug für die Tumortherapie [PALUCKA UND BANCHEREAU, 2012]. 12 Einleitung 1.3.2 Immunescape-Mechanismen von Tumoren Trotz der umfassenden Mechanismen, über die das Immunsystem zur Bekämpfung von Tumorzellen verfügt, sind viele Tumorarten mithilfe diverser Escape-Mechanismen in der Lage, sich der Immunabwehr zu entziehen. Das Ergebnis dieser durch Selektionsdruck des Immunsystems entstandenen Strategien ist die Progression des Tumors. Dem Phänomen liegen vielfältige Mechanismen zugrunde, die individuell und abhängig von der Art des Tumors unterschiedliche Ausprägungen besitzen [W HITESIDE, 2009]. Eine Strategie, um der Erkennung durch das Immunsystem auszuweichen, ist die Hemmung der Antigenpräsentation auf der Zelloberfläche der Tumorzelle. So ist es möglich, dass bei Tumorzellen Abnormalitäten in der Expression oder der Prozessierung zum partiellen bzw. totalen Verlust der MHC-Klasse I-Moleküle führen. Auf diese Weise wird die Erkennung der Tumorzellen durch aktivierte CTLs erschwert [GARCIA-LORA et al., 2003; LEONE et al., 2013]. Auch kostimulatorische Moleküle wie das B7-Homolog 2 (B7-H2 = ICOSL) können auf der Tumorzelloberfläche teilweise oder gänzlich fehlen. Die Interaktion von B7-H2 mit dessen Rezeptoren (ICOS oder CD28) auf aktivierten T-Zellen stimuliert die Proliferation, Differenzierung sowie Zytokinsekretion der Effektor-T-Lymphozyten. Das Fehlen von B7-H2 führt entsprechend zu einer verminderten Tumor-spezifischen T-Zell-Antwort [YAO et al., 2011; YAO UND CHEN, 2013]. Weiterhin wurde gezeigt, dass bei Tumoren die Expression von Genen herunterreguliert wird, die für die Prozessierung von aufgenommenen oder zelleigenen Proteinen mitverantwortlich sind. So ist die Präsentation von TAA-abgeleiteten Peptiden besonders in der frühen Phase des Tumorwachstums gering [GABRILOVICH, 2004; VESELY et al., 2011; SELIGER, 2012]. In einigen Fällen findet sogar ein gezielter Abbau von Antigenen statt, gegen die bereits eine DC-vermittelte Aktivierung von T-Zellen stattgefunden hat. Auf diese Weise erhält die betroffene Tumorzelle einen Selektionsvorteil, da so die Erkennung durch Antigenspezifische T-Zellen nicht möglich ist [KHONG UND RESTIFO, 2002]. Aufgrund der genetischen Instabilität von Tumorzellen entstehen weiterhin Mutationen, die zu Antigenvariationen oder zum Verlust von TAAs führen. Durch diese entziehen sich Tumorzellen ebenfalls der Detektion durch aktivierte T-Lymphozyten [DUNN et al., 2004; VESELY et al., 2011; MORIN et al., 2011]. Eine Vielzahl an Immunescape-Mechanismen von Tumoren resultiert aus Strategien, die unter normalen Umständen der Selbstkontrolle des Immunsystems dienen und 13 Einleitung folglich eine unverhältnismäßig starke Immunantwort sowie Autoimmunität unterbinden. So haben sich Tumorzellen verschiedenste Mechanismen zunutze gemacht, wie die Produktion von immunsupprimierenden Zytokinen, die Rekrutierung von regulatorischen Immunzellen oder die Ausprägung von Liganden für inhibitorische Rezeptoren [W HITESIDE, 2009]. Die von Tumorzellen sowie Tumor-assoziierten Zellen produzierten immunsupprimierenden Faktoren wie TGF-β, IL-10 und Prostaglandin E2 (PGE2) führen in Anwesenheit von TAAs zur Differenzierung von naïven CD4+ T-Lymphozyten in Tregs. Tregs, die normalerweise ein Bestandteil der peripheren Toleranz darstellen, wirken inhibierend auf die Proliferation sowie die Funktionalität anderer Immunzellen [MOUGIAKAKOS et al., 2010; W HITESIDE, 2014]. Infolge der Sekretion von TGF-β, IL-10, „vascular endothelial growth factor” (VEGF), IL-6 und PGE2 durch Tumorzellen werden weiterhin myeloide Suppressorzellen (MDSCs) rekrutiert. Neben der Ausübung von immunsuppressiven Funktionen, wie der Inhibition einer Tumor-gerichteten T-Zell-Antwort, fördern MDSCs die Angiogenese und die Metastasierung von Tumoren [MURDOCH et al., 2008; GABRILOVICH UND NAGARAJ, 2009; KESKINOV UND SHURIN, 2015]. Neben Tregs, MDSCs und Tumorzellen selbst sezernieren viele weitere Zellen der Tumorumgebung immunmodulatorische Faktoren, welche das Tumorwachstum begünstigen. Dazu zählen unter anderem TumorEndothelzellen (TECs), Tumor-assoziierte Fibroblasten (CAFs), Adipozyten und Tumor-assoziierte Makrophagen (TAMs) [SICA UND BRONTE, 2007; SHOJAEI et al., 2008; QUAIL UND JOYCE, 2013; ICARD et al., 2014]. Auch einige Mitglieder der B7-Familie sind an der Hemmung einer Tumor-gerichteten Immunantwort beteiligt. Häufig sind die koinhibitorischen Moleküle B7-DC („programmed cell death ligand 2“ [PD-L2]), B7-H1 (PD-L1), B7-H3 sowie B7-H4 auf Tumorzellen sowie auf Zellen der Tumorumgebung verstärkt ausgeprägt. Die Ligation der entsprechenden Rezeptoren beispielsweise auf T-Lymphozyten oder NK-Zellen führt zur funktionellen Inhibition der Immunzellen [FLIES UND CHEN, 2007; SELIGER UND QUANDT, 2012; MAJ et al., 2013]. Durch die Expression von FasL sind Tumorzellen weiterhin sogar zur aktiven Elimination von Tumor-infiltrierenden CTLs im Stande [O’CONNELL et al., 1999; WHITESIDE, 2007]. All diese Strategien tragen zur Schaffung eines immunsupprimierenden Tumormilieus bei, welches eine erfolgreiche antitumorale Immunantwort hemmt und so die Progression des Tumors ermöglicht. Entsprechend der zentralen Rolle, die DCs im Zuge einer antitumoralen Immunantwort einnehmen, hat eine Vielzahl von immunsupprimierenden Faktoren im Tumorgewebe einen Einfluss auf DCs. So hemmen VEGF, „macrophage-colony stimulating factor” 14 Einleitung (M-CSF), Ganglioside, PGE2 sowie die Zytokine IL-10, IL-6 und TGF-β die Differenzierung, Ausreifung und Funktionalität von DCs [KURMARTSEV UND GABRILOVICH, 2006; MA et al., 2011; DUDEK et al., 2013; SELIGER UND MASSA, 2013]. Daraus resultiert eine Akkumulation unreifer DCs im Tumorgewebe. Die geringe Fähigkeit dieser DCs zur Antigenpräsentation sowie die fehlende Ausprägung von kostimulatorischen Molekülen sowie Zytokinen führt letztendlich zur Induktion einer T-Zell-Toleranz und zur Entwicklung immunsuppressiver Tregs [GABRILOVICH, 2004; BENENCIA et al., 2012; SELIGER UND MASSA, 2013]. 1.4 Nierenzellkarzinome Maligne Entartungen der Niere stellen europaweit die siebthäufigste humane Krebserkrankung dar. Damit ist der Nierentumor nach dem Prostata- und dem Blasenkarzinom das dritthäufigste urologische Malignom. Die Zahl der Neuerkrankungen lag europaweit im Jahr 2012 bei 115.200 Patienten. Weiterhin waren im Jahr 2012 in Europa 49.000 auf Nierentumore zurückführbare Todesfälle zu verzeichnen [FERLAY et al., 2013]. Mit annähernd 90 % umfassen Nierenzellkarzinome (NZKs) die überwiegende Mehrheit aller malignen Nierentumore. Der verbleibende Anteil aller Nierenkrebsfälle wird durch familiär bedingte oder seltene Tumore wie beispielsweise Nephroblastome und Angiomyolipome gebildet [EBLE et al., 2004; LJUNGBERG et al., 2010]. Im Hinblick auf das Alter aller NZK-Patienten liegt der Höhepunkt der Inzidenz zwischen 60 und 70 Jahren [MOTZER et al., 1997; LJUNGBERG et al., 2010]. Bei einem Geschlechterverhältnis von 1,5:1 erkranken Männer häufiger an NZKs, als Frauen [LJUNGBERG et al., 2010]. Zu den Risikofaktoren, welche bisher vermehrt mit dem Auftreten von NZKs in Verbindung gebracht wurden, zählen der Genuss von Tabak, Adipositas sowie Hypertonie [MOTZER et al., 1997; CHOW et al., 2010; ZNAOR et al., 2015]. Auch genetische Dispositionen spielen eine Rolle bei der Entwicklung von NZKs. Ein Beispiel hierfür ist die Mutation des auf dem Chromosom 3 lokalisierten von HippelLindau (VHL) Tumorsuppressorgens. Neben der Prädisposition zu verschiedenen anderen Neoplasmen entwickeln über 30 % der Patienten mit VHL-Syndrom im Laufe ihrer Krankheit NZKs [MAHER et al., 2011; CHOU et al., 2013]. 15 Einleitung 1.4.1 Charakterisierung und Klassifikation von NZKs NZKs gehen aus Epithelzellen der Nierentubuli hervor [DE VIVAR CHEVEZ et al., 2014]. Der Begriff des NZKs umfasst eine heterogene Gruppe von Tumoren. Neben histologischen Unterschieden zeigt sich die Diversität von NZKs in der Pathogenität der Krankheit, den genetischen Hintergründen sowie im klinischen Verlauf [CHEVILLE et al., 2003; LEE et al., 2010; LJUNGBERG et al., 2010]. Mit 80 - 90 % zeichnet sich der größte Anteil der NZKs durch eine klarzellige Histologie aus [LJUNGBERG et al., 2010]. Namensgebend ist das im mikroskopischen Bild helle, klare Zytoplasma der Zellen, welches aus dem hohen Gehalt an Lipiden sowie Glycogen resultiert. Makroskopisch sind klarzellige NZKs als gelbliche, kugelförmige Tumoren mit einer klaren Abgrenzung zum benachbarten Nierengewebe charakterisiert. Häufig kommen auch Nekrosen, Zysten, Kalzifizierungen und Blutungen vor [EBLE et al., 2004; MOCH, 2013; SHUCH et al., 2015]. Dieser klarzellige Subtyp tritt meist spontan auf und ist in 70 % der sporadisch auftretenden Fälle auf den Funktionsverlust des VHL-Gens zurückzuführen. In selteneren Fällen handelt es sich um eine erbliche Erkrankung [COHEN UND MCGOVERN, 2005; PRENEN et al., 2009; MOCH, 2013]. Neben klarzelligen NZKs treten mit papillären und chromophoben NZKs zwei weitere Haupttypen auf. Der papilläre Typ wird bei 10 - 15 % aller NZKs diagnostiziert und tritt überwiegend sporadisch, in seltenen Fällen auch hereditär auf [COHEN UND MCGOVERN, 2005; LJUNGBERG et al., 2010]. Die Tumorzellen formen papilläre und tubuläre Strukturen. Wie bei klarzelligen NZKs werden bei papillären NZKs häufig Blutungen, Kalzifizierungen und Nekrosen beobachtet. Des Weiteren sind oftmals Makrophagen-Aggregate vorhanden [EBLE et al., 2004; MOCH, 2013; SHUCH et al., 2015]. Der chromophobe NZK-Subtyp tritt mit 4 - 5 % selten auf [LJUNGBERG et al., 2010]. Die großen, polygonalen Tumorzellen von chromophoben NZKs weisen stark ausgeprägte Zellmembranen auf. Nekrosen und Kalzifizierungen kommen kaum vor [EBLE et al., 2004; MOCH, 2013]. Zusätzlich zu den genannten NZK-Haupttypen zählen einige seltenere Tumore wie das Ductus-Bellini-Karzinom und einige unklassifizierte Karzinome zur Gruppe der NZKs [LJUNGBERG et al., 2010; BELLMUNT et al., 2014]. Entsprechend der „Union internationale contre le cancer“ (UICC) erfolgt die Einteilung von NZKs mithilfe von klinischen Untersuchungen und bildgebenden Verfahren nach der „tumor – nodes – metastases“ (TNM)-Klassifizierung (Tabelle 1). Diese Klassifizierung schließt drei TNM-Kategorien ein: T = das Verhalten und die 16 Einleitung Ausdehnung des Primärtumors, N = die Einbeziehung von regionären Lymphknoten sowie M = das Auftreten von Fernmetastasen. Das UICC-System ermöglicht die Zusammenfassung der entscheidenden Merkmale von Tumoren und ist somit essenziell zur Abschätzung der Prognose von NZK-Patienten sowie für die Planung einer geeigneten Therapie [SOBIN et al., 2009; LJUNGBERG et al., 2010]. Die Beurteilung von NZKs kann weiterhin nach dem Fuhrman System erfolgen. Dieses beruht auf dem Erscheinungsbild der Tumorzellen unter dem Mikroskop und gibt ebenfalls Auskunft über die Prognose, hat jedoch keinen Einfluss auf die Therapie des NZK-Patienten. Je stärker sich die Zellkerne der Tumorzellen in ihrer Größe und ihrer Morphologie von denen im Normalgewebe unterscheiden, desto höher ist der Grad des Tumors. Die Einteilung von NZK-Zellen nach Fuhrman reicht von Grad 1 (gut differenziert) bis Grad 4 (undifferenziert) [FUHRMAN et al., 1982]. In den frühen Stadien der malignen Erkrankung wachsen NZKs häufig unbemerkt. Dies ist auf die Symptomarmut der lokalisierten Tumore zurückzuführen. Kleine, lokalisierte NZKs werden aus diesem Grund häufig nur durch Zufall im Rahmen von bildgebenden Untersuchungen anderer Krankheiten entdeckt. Entsprechend ist der Tumor bei 20 % der NZK-Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose bereits invasiv und bei weiteren 30 - 40 % der Patienten sind darüber hinaus schon Metastasen vorhanden [MOTZER et al., 1997; ZISMAN et al., 2002; LJUNGBERG et al., 2010]. Diese können in beinahe allen Regionen des Körpers auftreten. Neben dem Vorkommen von Metastasen in Tumor-drainierenden Lymphknoten zählen auch die Nebenniere, die Lunge, die Leber, das Skelett sowie das Gehirn zu den am häufigsten involvierten Strukturen bei der Metastasierung von NZKs [MOTZER et al., 2011]. Symptome treten bei NZKs in der Regel oft erst bei fortgeschrittenen Tumoren auf. Es können sich unter anderem eine tastbare Raumforderung, Flankenschmerzen sowie Makrohämaturie manifestieren. Hinzu kommen Metastasen-bedingte Erscheinungen wie Knochenschmerzen und paraneoplastische Symptome, zu denen beispielsweise Anämie, Fieber, Gewichtsverlust und Leberdysfunktion zählen [MOTZER et al., 1997; LJUNGBERG et al., 2010]. 17 Einleitung Tabelle 1: Klassifikation des NZKs auf Grundlage der UICC-Kriterien T – Primärtumor TX Primärtumor kann nicht klassifiziert werden T0 keine Hinweise für einen Primärtumor vorhanden T1 Tumor in größter Ausdehnung ≤ 7 cm, auf die Niere begrenzt T1a Tumor ≤ 4 cm T1b T2 T3 Tumor > 4 cm, aber ≤ 7 cm Tumor in größter Ausdehnung > 7 cm, auf die Niere begrenzt T2a Tumor > 7 cm, aber ≤ 10 cm T2b Tumor > 10 cm Tumor breitet sich in größere Venen aus oder wächst direkt in Nebenniere oder in das perirenale Gewebe ein, Gerota-Faszie ist nicht infiltriert T4 T3a Tumor wächst direkt in Nebenniere oder in das perirenale Gewebe ein T3b Tumor breitet sich in stark renale Venen / in Vena cava unterhalb des Zwerchfells aus T3c Tumor breitet sich in Vena cava oberhalb des Zwerchfells aus / Befall der Venenwand Tumor durchdringt die Gerota-Faszie N – regionale Lymphknoten NX keine Aussage über Metastasen in regionalen Lymphknoten möglich N0 keine regionalen Lymphknoten befallen N1 Metastasen in regionalen Lymphknoten vorhanden M – Fernmetastasen MX keine Aussagen über Fernmetastasen möglich M0 keine Fernmetastasen vorhanden M1 Fernmetastasen vorhanden UICC-Stadien 5-Jahres-Überlebensrate Stadium I T1 N0 M0 81 % Stadium II T2 N0 M0 74 % Stadium III T3 alle N M0 53 % T1 - T3 N1 M0 T4 alle N M0 alle T alle N M1 Stadium IV 10 % modifiziert nach SOBIN et al., 2009 18 Einleitung Die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit lokalisiertem NZK liegt bei etwa 75 - 80 %. Bei Patienten mit Fernmetastasen dagegen fällt die 5-Jahres- Überlebensrate auf unter 10 % [DRUCKER, 2005; BELLMUNT et al., 2014]. Ein großes Problem stellt hierbei die Resistenz der Metastasen gegenüber Strahlentherapie oder Chemotherapie dar [MOTZER et al., 1997; DRUCKER, 2005]. NZKs werden als stark immunogene Tumoren eingestuft. Dies ist auf eine ausgeprägte Infiltration durch Zellen des angeborenen sowie adaptiven Immunsystems zurückzuführen. Diese Tumorinfiltrierenden Immunzellen enthalten einen besonders großen Anteil an CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten [NAKANO et al., 2001; GEIGER et al., 2009; HOTTA et al., 2011; REMARK et al., 2013]. In den meisten NZKs sind auch NK-Zellen in erheblicher Zahl unter den zellulären Infiltraten vertreten [SCHLEYPEN et al., 2003; CÓZAR et al., 2005, SCHLEYPEN et al., 2006; GEIGER et al., 2009; REMARK et al., 2013]. Die beobachtete Immunogenität von NZKs begründet möglicherweise auch die selten auftretenden Fälle spontaner Regression sowie das Ansprechen eines Teils der NZK-Patienten auf immuntherapeutische Strategien [ITSUMI UND TATSUGAMI, 2010; JANISZEWSKA et al., 2013]. Doch trotz der hohen Zahl an infiltrierenden Immunzellen in NZK-Geweben ist das Immunsystem von NZK-Patienten in der Regel nicht in der Lage, das Tumorwachstum zu kontrollieren. Der Grund dafür scheint das in der Tumorumgebung vorliegende komplexe Netzwerk an immunsuppressiven Komponenten zu sein [FRANKENBERGER et al., 2007]. 1.4.2 Therapeutische Strategien für NZK-Patienten Die Prognose für NZK-Patienten ist von verschiedenen Charakteristika des Tumors abhängig. Neben histologischen, klinischen und molekularen Merkmalen spielen hauptsächlich die anatomischen Gegebenheiten eine entscheidende Rolle, welche im Zuge der Klassifizierung nach dem UICC-System (Tabelle 1) erfasst werden. Genannte Kriterien fließen weiterhin in die Wahl einer geeigneten Behandlung ein. Dementsprechend sind die Größe des Tumors und das Vorliegen von Metastasen im Lymphsystem oder in anderen Organen von großer Bedeutung. Aber auch die Funktion der betroffenen Niere, die Lokalisation des Tumors sowie der Leistungsstatus des Patienten sollte bei der Abstimmung der optimalen Therapieform bedacht werden [ERDOĞAN et al., 2004; LJUNGBERG et al., 2010; PINTO et al., 2014]. Mittel der Wahl und Standardtherapie bei Patienten mit lokalisierten Tumoren (Stadium I und Stadium II) ist eine komplette Entfernung des NZK-Gewebes im Zuge einer partiellen oder radikalen 19 Einleitung Nephrektomie. In den frühen Stadien der Erkrankung verspricht diese Art der Behandlung eine sehr gute Prognose und ist derzeit die einzige kurative Therapieoption [PRENEN et al., 2009; LJUNGBERG et al., 2010; DEVITA et al., 2011]. Da NZKs kein Ansprechen auf Chemotherapie, Bestrahlung oder Hormontherapien zeigen, existieren für Patienten mit fortgeschrittenem NZK nur eine begrenzte Anzahl an Therapieoptionen [MOTZER UND RUSSO, 2000; SCHLEYPEN et al., 2006; DIAMOND et al., 2014; PINTO et al., 2014]. Auch eine Nephrektomie sowie die operative Entfernung von befallenen Lymphknoten und Fernmetastasen stellen bei fortgeschrittenem NZK in der Regel nur palliative Maßnahmen dar. Aus diesem Grund war die Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung von metastasierenden NZKs in den letzten Jahrzehnten Bestandteil intensiver Forschung [MOTZER et al., 1997; LJUNGBERG et al., 2010; SU et al., 2014]. Bei der größten Subpopulation der NZKs, dem klarzelligen NZK, ist die am häufigsten auftretende genetische Disposition die Mutation des VHL-Gens [KEEFE et al., 2013; SU et al., 2014]. Der Verlust oder die Inaktivierung dieses Genes resultiert in einem erhöhten Aufkommen des Transkriptionsfaktors „hypoxia-inducible factor“ (HIF) und letztendlich in einer gesteigerten Produktion von proangiogenen Faktoren wie dem VEGF [ARJUMAND UND SULTANA, 2012; CHOU et al., 2013]. Die Aktivierung des „mammalian target of rapamycin“ (mTOR)-Signalweges beispielsweise durch Wachstumsfaktoren oder Sauerstoffmangel kann die Synthese von HIF erhöhen [KEEFE et al., 2013; DIAMOND et al., 2014]. Sowohl VHL, als auch mTOR spielen eine wichtige Rolle bei der Angiogenese und somit bei der Progression von NZKs. Aus diesem Grund wurde in den letzten Jahren besonderes Augenmerk auf die Entwicklung von gezielten Therapien gelegt, die den VHL-HIF-Signalweg modulieren oder sich gegen mTOR richten. Diese brachten deutliche Fortschritte mit signifikanten Verlängerungen des progressionsfreien Überlebens mit sich, jedoch auch enorme systemische Nebenwirkungen. Der VEGF-Inhibitor Bevacizumab ist ein monoklonaler Antikörper, der VEGF neutralisiert. Sorafenib, Sunitinib, Pazopanib und Axitinib zählen weiterhin zu den Multikinase-Inhibitoren und hemmen die Signalweiterleitung bei Ligation des VEGF-Rezeptors durch VEGF. Zu den ebenfalls bereits für die Therapie von NZKs zugelassenen Medikamenten zählen die mTOR-Inhibitoren Temsirolimus sowie Everolimus [CONTI et al., 2013; DUTCHER, 2013; DIAMOND et al., 2014, SU et al., 2014]. Auf der Grundlage verschiedener klinischer Studien betitelte die Fachzeitschrift Science die Immuntherapie von Krebs als Durchbruch des Jahres 2013 [COUZINFRANKEL, 2013]. Angesichts der ausgeprägten Infiltration von NZK-Geweben durch 20 Einleitung Immunzellen sowie die vereinzelt auftretenden Fälle spontaner Tumorrückbildung, stellt die Immuntherapie auch ein vielversprechendes Instrument zur Behandlung von NZKs dar [GEIGER et al., 2009; JANISZEWSKA et al., 2013; DE VIVAR CHEVEZ et al., 2014]. Lange Zeit war die systemische, unspezifische Behandlung mit IL-2 und/oder IFN-α Standardtherapie für Patienten mit metastasierendem NZK. Die Therapie mit hochdosiertem IL-2 hatte die in vivo-Stimulierung von Tumor-reaktiven T-Lymphozyten sowie NK-Zellen und somit die Elimination von Tumorzellen zum Ziel. IFN-α sollte NK-Zellen stimulieren, die Immunogenität der Tumorzellen erhöhen und auf direktem Wege die Apoptose der Tumorzellen induzieren [VUKY UND MOTZER, 2000; GEIGER et al., 2009; ITSUMI UND TATSSUGAMI, 2010]. Mit Ansprechraten von 10 - 20 % bei der Therapie mit IFN-α bzw. von 10 - 15 % bei der systemischen Verabreichung von IL-2 ist die Effektivität der Behandlung mit IL-2 und/oder IFN-α allerdings gering [MOTZER et al., 1997; COPPIN et al., 2005; DIAMOND et al., 2014]. Aufgrund der starken systemischen Nebenwirkungen wird heutzutage weitestgehend von der Behandlung mit IFN-α abgesehen. Da bei einigen NZK-Patienten im Zusammenhang mit einer IL-2-Therapie eine komplette Remission beobachtet wurde, wird IL-2 in Kombination mit einer Nephrektomie noch heute bei Patienten mit gutem Allgemeinzustand zur Behandlung eingesetzt [PARTON et al., 2006; GEIGER et al., 2009; HANZLY et al., 2014; DIAMOND et al., 2014]. Aufgrund der zentralen Rolle von DCs bei der Initiation sowie Aufrechterhaltung einer antitumoralen Immunantwort wurden in den letzten Jahren auch therapeutische Strategien entwickelt, die sich auf DCs stützen [BANCHEREAU UND PALUCKA, 2005; STEINMAN UND BANCHEREAU, 2007; RADFORD et al., 2014]. Dabei ist zwischen zwei unterschiedlichen Vorgehensweisen zu unterscheiden. Zum einen kann die Rekrutierung sowie Aktivierung von bereits im Körper des Patienten vorhandenen DCs erfolgen. Eine weitere Option ist die Verabreichung ex vivo generierter DCs. Beides hat die Induktion einer Tumor-spezifischen T-Zell-Antwort zum Ziel [PALUCKA UND BANCHEREAU, 2012; SELIGER UND MASSA, 2013]. Der Großteil der bisher durchgeführten Studien ist auf DCs gestützt, die in vitro unter Nutzung von Wachstumsfaktoren sowie Zytokinen aus Monozyten bzw. hämatopoetischen Vorläuferzellen generiert wurden. Diese artifiziellen DCs werden durch Kultivierung mit proinflammatorischen Zytokinen ausgereift, in vitro mit individuellen TAAs beladen und daraufhin dem Patienten verabreicht [SCHENDEL, 2007; DRAUBE et al., 2011; PALUCKA UND BANCEREAU, 2012; ANGUILLE et al., 2014]. Auf diese Art und Weise werden in vitro generierte Antigene genutzt, um eine Tumor-gerichtete Immunreaktion einzuleiten. Der 21 Einleitung Zusatz des immunogenen Proteins „keyhole limpted hemocyanin“ (KLH), die Kombination der Peptid-beladenen DCs mit IFN-α oder mit monoklonalen Antikörpern gegen „cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4“ (CTLA-4) bzw. „programmed cell death protein 1“ (PD-1) kann weiterhin zu einer Verbesserung der Immunreaktion führen [SCHENDEL, 2007, ANGUILLE et al., 2014; SHIN UND RIBAS, 2015]. DC-basierte Behandlungsstrategien zeigen in der Regel nur wenige Nebenwirkungen und führen zu Tumor-gerichteten Immunreaktionen. Jedoch sind deren Therapieerfolge bisher limitiert [ANGUILLE et al., 2014; RADFORD et al., 2014]. Um die Erfolgschancen einer Therapie von einem fortgeschrittenen NZK zu erhöhen, werden häufig verschiedene Behandlungsarten miteinander kombiniert [GEIGER et al., 2009; ITSUMI UND TATSUGAMI, 2010; DUTCHER, 2013]. Dennoch sind die bisherigen Erfolge bei der Bekämpfung dieser malignen Erkrankung ernüchternd. Nur wenige Behandlungsmethoden führten in den bisher durchgeführten Patientenstudien zu einer Ansprechrate von über 20 %. Metastasierendes NZK ist in der Regel nach wie vor unheilbar [MOTZER et al., 1997; LJUNGBERG et al., 2010; SU et al., 2014]. Es besteht weiterhin die Notwendigkeit zur Entwicklung neuer Therapien, die auch bei metastasierendem NZK effizient ansprechen. 1.5 Zielstellung NZKs zählen zu den stark immunogenen Tumoren. Verschiedenste Immunzellen, darunter NK-Zellen sowie T-Lymphozyten, wurden bereits in NZK-Geweben detektiert. Bisher ist jedoch nur wenig über das Vorkommen und die Eigenschaften von nativen humanen DCs in malignen Entartungen der Niere bekannt. Aus diesem Grund sollten im Rahmen der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in die potenzielle Rolle von DCs bei der immunologischen Kontrolle von NZKs gewonnen werden. Dafür sollte besonderes Augenmerk auf die Wechselwirkungen zwischen DCs und Tumorzellen gelegt werden. Als professionelle APCs nehmen DCs eine Schlüsselposition bei der Aktivierung von Antigen-spezifischen CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten sowie der Stimulierung von NK-Zellen ein. Somit spielen sie eine zentrale Rolle bei der Induktion sowie Aufrechterhaltung einer antitumoralen Immunantwort. DCs stellen eine sehr heterogene Population dar, was sich sowohl phänotypisch als auch funktionell manifestiert. Dabei bilden slanDCs eine der größten Subpopulationen humaner Blut-DCs. Es wird vermutet, dass diese proinflammatorische Subpopulation aufgrund 22 Einleitung ihrer ausgeprägten antitumoralen Kapazitäten maßgeblich zu der Elimination von malignen Zellen beitragen. Daher sollte zunächst das Vorhandensein von slanDCs in NZK-Geweben untersucht werden. Da der größte prozentuale Anteil aller NZKs eine klarzellige Histologie aufweist, sollte das klarzellige NZK Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen sein. Ziel war es, die Präsenz von slanDCs im Tumorgewebe sowie im Tumor-freien Nierengewebe zu untersuchen und potenzielle Unterschiede zu evaluieren. Weiterhin sollte der Phänotyp von slanDCs im Tumorgewebe klarzelliger NZKs analysiert werden. In den letzten Jahren wurde zunehmend deutlich, dass Tumorzellen die Funktionalität von Immunzellen modulieren. Daher sollte ein zweiter Schwerpunkt dieser Dissertation durch die Untersuchung des Einflusses von NZK-Zellen auf die immunstimulatorischen Eigenschaften von frisch isolierten slanDCs gesetzt werden. Die Verwendung dieser nativen DCs bietet gegenüber in vitro generierten DCs den Vorteil, dass die durchgeführten Untersuchungen die in vivo Situation besser reflektieren. Für die in vitro-Experimente bestand neben dem Einsatz von kommerziell erhältlichen NZKLinien weiterhin die Möglichkeit zur Analyse von primären NZK-Linien vom klarzelligen Typ. SlanDCs besitzen die Fähigkeit, sowohl Neoantigen-spezifische CD4+ T-Lymphozyten, als auch Tumor-reaktive CD8+ T-Lymphozyten effizient zu aktivieren. Deshalb war der Einfluss von NZK-Zellen auf die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen von großem Interesse. Da LPS-stimulierte slanDCs weiterhin in der Lage sind, die Differenzierung von naïven CD4+ T-Lymphozyten in TH1-Zellen zu induzieren, sollte ebenfalls die Wirkung von NZK-Zellen auf die slanDC-vermittelte Programmierung naïver CD+ T-Lymphozyten analysiert werden. Eine weitere wichtige antitumorale Kapazität von slanDCs stellt ihre Fähigkeit zur Stimulation von NK-Zellen dar, wodurch die IFN-γ-Produktion von NK-Zellen gefördert wird. Aufgrund dieser Fähigkeit sollte bei weiteren Analysen der Einfluss von NZK-Zellen auf die slanDCinduzierte IFN-γ-Sekretion durch NK-Zellen im Mittelpunkt stehen. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten sollen helfen, ein besseres Verständnis der Interaktion zwischen slanDCs und NZK-Zellen zu erlangen sowie die Rolle von slanDCs in der Tumorumgebung von NZKs besser zu beurteilen. Diese neuen Erkenntnisse können einen wesentlichen Beitrag zur Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien für die Behandlung von NZK-Patienten leisten. 23 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 3, 3´, 5, 5´-Tetramethylbenzidin-Tabletten Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI, Trockensubstanz) AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland „Aqua ad iniectabilia“ (Aqua bidest.) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland „Biocoll Separating Solution“ (Ficoll-Trennlösung; 1,077 g/ml) Biochrom KG, Berlin, Deutschland Bovines Serumalbumin (BSA, Trockensubstanz) Gerbu, Biotechnik GmbH, Geiberg, Deutschland Citronensäure-Monohydrat Merck, Darmstadt, Deutschland Desoxyribonuklease (DNase) I, Typ IV (vom bovinen Pankreas) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Dihydrogensulfat (Schwefelsäure, 95 - 97%ig) Riedel-de Haen-AG, Seelz-Hannover, Deutschland Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt, Deutschland DinatriumhydrogenphosphatDodecahydrat Merck, Darmstadt, Deutschland eFluor® 670 (5 mM) eBioscience, Frankfurt, Deutschland Eindeckmedium Dako, Carpinteria, CA, USA Ethanol (absolut, 96%ig und 80%ig, vergällt) Berkel AHK, Ludwigshafen, Deutschland Ethanol (absolut, unvergällt) Klinik Apotheke des Universitätsklinikum Carl Gustav Carus, Dresden, Deutschland Ethansäure (Essigsäure) Merck, Darmstadt, Deutschland Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Biochrom KG, Berlin, Deutschland Hämalaunlösung nach Mayer Merck, Darmstadt, Deutschland 24 Material und Methoden Kollagenase I-A (von Clostridium histolyticum) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2ethansulfonsäure (HEPES, Trockensubstanz) Promega, Madison, WI, USA Natriumazid Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Natriumcarbonat Riedel-de Haen AG, Seelz-Hannover, Deutschland Natriumhydrogencarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland Paraformaldehyd (PFA, Trockensubstanz) Merck, Darmstadt, Deutschland „Phosphate buffered saline“ (PBS, Trockensubstanz) Biochrom KG, Berlin, Deutschland Saponin (Trockensubstanz) Merck, Darmstadt, Deutschland Trypanblaulösung (0,5%ig [w/v]) Biochrom KG, Berlin, Deutschland Trypsin/EDTA-Lösung (0,5 g Schweine-Trypsin; 0,2 g EDTA) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Tween® 20 Serva, Heidelberg, Deutschland Wasser für Injektionszwecke Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Deutschland Wasserstoffperoxid-Lösung (30%ig) Klinik-Apotheke des Universitätsklinikums Carl Gustav Carus, Dresden, Deutschland Xylol VWR International S.A.S., Fontenay-sousBois, Frankreich 2.1.2 Grundmedien und Medienzusätze Brefeldin A Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/l Glucose) Gibco Life Technologies GmbH, Grand Island, NY, USA Fetales Kälberserum (FKS) Biochrom KG, Berlin, Deutschland Humanserum (HS) CC pro, Neustadt, Deutschland Ionomycin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland 25 Material und Methoden Lipopolysaccharid (LPS) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland McCoy’s 5A-Medium Gibco Life Technologies GmbH, Grand Island, NY, USA Minimum Essential Medium (MEM) Alpha (1x) Gibco Life Technologies GmbH, Grand Island, NY, USA Natriumpyruvat (100 mM) Biochrom KG, Berlin, Deutschland Nicht-essenzielle Aminosäuren (NEA, 100x) Biochrom KG, Berlin, Deutschland Penicillin/Streptomycin (10 mg/ml, 100x) Biochrom KG, Berlin, Deutschland Phorbol-12-Myristyl-13-Azetat (PMA) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland „Roswell Park Memorial Institute” (RPMI) 1640-Medium Biochrom KG, Berlin, Deutschland Stabiles Glutamin (N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin, 200 mM) Biochrom KG, Berlin, Deutschland 2.1.3 Medienzusammensetzung Alle Medien wurden steril filtriert, bei 4 °C gelagert und vor Gebrauch im Wasserbad auf 37 °C erwärmt. DMEM, komplett DMEM (4,5 g/l Glucose)-Medium 10 % FKS (inaktiviert) 1 % NEA (100x) 1 % Penicillin/Streptomycin (100x) McCoy’s 5A, komplett McCoy’s 5A-Medium 10 % FKS (inaktiviert) 1 % Penicillin/Streptomycin (100x) MEM Alpha, komplett MEM Alpha-Medium 10 % FKS (inaktiviert) 1 % Penicillin/Streptomycin (100x) RPMI 1640, komplett RPMI 1640-Medium 1 % 200 mM stabiles Glutamin 1 % 100 mM Natriumpyruvat 1 % NEA (100x) 1 % Penicillin/Streptomycin (100x) 26 Material und Methoden 2.1.4 Lösungen und Puffer Puffer sowie Lösungen wurden, soweit nicht anders angegeben, bei 4 °C gelagert. Alle für die Zellisolation verwendeten Puffer und Lösungen wurden zudem steril filtriert. Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK)-Lysepuffer (Lagerung bei Raumtemperatur [RT] unter Lichtabschluss) Gibco Life Technologies GmbH, Grand Island, NY, USA AutoMACS® Pro Waschpuffer Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Beschichtungspuffer (ELISA) 1 l Lösung: 8,40 g Natriumhydrogencarbonat 10,50 g Natriumcarbonat 1 l Aqua dest. pH 9,5 Blockierungspuffer (ELISA) siehe Verdünnungspuffer (ELISA) Citrat-Phosphat-Puffer (CP-Puffer, ELISA) 100 ml Lösung: 24,3 ml 0,1 M Citronensäure-Monohydrat 25,7 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat 50 ml Aqua dest. pH 5,0 DAPI-Lösung (Durchflusszytometrie) 10 ml Lösung: 2 mg DAPI (Trockensubstanz) 400 µl Aqua dest. 9,6 ml PBS-Lösung (erst nach Lösung des DAPI in Aqua dest. zugeben) „Hank’s Balanced Salt Solution“ 10x (HBSS) [+] CaCl2 [+] MgCL2 (Lagerung bei RT) Gibco Life Technologies GmbH, Grand Island, NY, USA „Hank’s Balanced Salt Solution“ 10x (HBSS) [-] CaCl2 [-] MgCL2 (Lagerung bei RT) Gibco Life Technologies GmbH, Grand Island, NY, USA HIER Zitratpuffer („heat induced epitope retrieval”) (Immunhistochemische Färbung) Zytomed Systems GmbH, Berlin, Deutschland 27 Material und Methoden Isolationspuffer (Zellisolation bzw. Leukozytenisolation aus Gewebe) 100 ml Lösung: 97,5 ml PBS-Lösung 2 ml 100 mM EDTA-Lösung 0,5 g BSA Laufpuffer (Zellisolation) 1 l Lösung: 880 ml PBS-Lösung 20 ml 100 mM EDTA-Lösung 50 ml FKS PFA-Lösung (4%ig) 25 ml Lösung: 1 g PFA (Trockensubstanz) 25 ml PBS-Lösung PFA-Lösung (0,5%ig) 8 ml Lösung: 1 ml PFA-Lösung 4%ig 7 ml PBS-Lösung PBS-Lösung 1 l Lösung: 9,55 g PBS (Trockensubstanz) 1 l Aqua dest. Reinigungslösung (Zellisolation) 1 l Lösung: 700 ml Ethanol unvergällt, absolut 300 ml Aqua dest. Saponin (0,1%ig) 50 ml Lösung: 0,05 g Saponin (Trockensubstanz) 50 ml Waschpuffer-4 500 µl FKS Stopplösung (ELISA) 0,5 M Schwefelsäure Substratpuffer (ELISA) 10 ml Lösung (jeweils frisch herzustellen): 10 ml CP-Puffer 1 Tetramethylbenzidin-Tablette 3 μl Wasserstoffperoxid Verdau-Puffer (Lagerung bei RT) (Leukozytenisolation aus Gewebe) 500 ml Lösung: 490 ml RPMI 1640-Medium 0,5 g BSA 5 ml Penicillin/Streptomycin (10 mg/ml) 5 ml 1 M HEPES Verdau-Puffer mit Enzymlösung (Leukozytenisolation aus Gewebe) 30 ml Lösung (jeweils frisch herzustellen): 150 µl Kollagenase IA (0,1 g/ml) 600 µl DNase I (9,28 mg/ml) 30 ml Verdau-Puffer 28 Material und Methoden Verdünnungspuffer (Immunhistochemische Färbung) Zytomed Systems GmbH, Berlin, Deutschland Verdünnungspuffer (ELISA) 100 ml Lösung: 90 ml PBS-Lösung 10 ml FKS Waschpuffer-1 (Leukozytenisolation aus Gewebe) 1 l Lösung: 980 ml PBS-Lösung 20 ml 100 mM EDTA-Lösung Waschpuffer-2 (ELISA) 1 l Lösung: 1 l PBS-Lösung 500 µl Tween® 20 Waschpuffer-3 (Immunhistochemische Färbung) Zytomed Systems GmbH, Berlin, Deutschland Waschpuffer-4 (Durchflusszytometrie) 1 l Lösung: 1 l PBS-Lösung 0,5 g Natriumazid (Trockensubstanz) 2.1.5 Antikörper und Antikörper-gekoppelte „MicroBeads“ 2.1.5.1 Antikörper zur Zellisolation Anti-slan Hybridomaüberstand, Isotyp: IgM; Klon M-DC8 (10 μg/ml) Institut für Immunologie, Medizinische Fakultät, Technische Universität Dresden, Dresden, Deutschland MACS CD4+-T-Zell-Isolationskit II, human Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland MACS CD8+-T-Zell-Isolationskit, human Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland MACS Naive-CD4+-T-Zell-Isolationskit II, human Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland MACS NK-Zell-Isolationskit II, human Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland MACS Ratten-anti-Maus-IgM „MicroBeads“ Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland 29 Material und Methoden 2.1.5.2 Antikörper zur Detektion von Oberflächenmolekülen Allophycocyanin-Hilite®7 (APC-H7)markierter Maus-anti-human CD3-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon SK7 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC)markierter Maus-anti-human CD3-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon BW264/56 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Phycoerythrin (PE)-markierter Maus-anti-human CD3-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon BW264/56 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human CD4-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon MT466 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland PE-markierter Maus-anti-human CD4-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon RPA-T4 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human CD8-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon B9.11 Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland Allophycocyanin (APC)-markierter Maus-anti-human CD11c-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon B-ly6 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human CD16-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon 3G8 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human CD40-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon 5C3 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland Peridinin chlorophyll (PerCP)-markierter Maus-anti-human CD45-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon 2D1 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland 30 Material und Methoden FITC-markierter Maus-anti-human CD45RA-Antikörper Isotyp: IgG2bκ; Klon HI100 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland PE-markierter Maus-anti-human CD56-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon NCAM16.2 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland PE-markierter Maus-anti-human CD80-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon L307.4 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human CD83-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon HB15e BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human CD86-Antikörper Isotyp: IgG1κ, Klon 2331(FUN-1) BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland PE-markierter Maus-anti-human CD273(B7-DC, PD-L2)-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon MIH18 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland PE-markierter Maus-anti-human CD274(B7-H1, PD-L1)-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon MIH1 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human CD276(B7-H3)-Antikörper Isotyp: IgG2b; Klon FM276 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human CD279(PD-1)-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon MIH4 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland PE-markierter Maus-anti-human B7-H4(VTCN1, B7S1)-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon MIH43 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland PE-markierter Ratten-anti-human CCR7(CD197)-Antikörper Isotyp: IgG2aκ; Klon 3D12 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland APC-markierter Maus-anti-human „human leukocyte antigen“ (HLA)-DRAntikörper Isotyp: IgG1; Klon G46-6 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland 31 Material und Methoden FITC-markierter Maus-anti-human HLA-DR-Antikörper Isotyp: IgG2bκ; Klon TU36 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland PE-markierter Maus-anti-human HLA-DR-Antikörper Isotyp: IgG2bκ; Klon TU36 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human ILT3(CD85k)-Antikörper Isotyp: IgG2a; Klon 293623 R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human ILT4(CD85d)-Antikörper Isotyp: IgG2a; Klon 287219 R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland FITC-markiertes Ziege-anti-Maus IgM(Fcgamma)-F(ab`)2-Fragment Isotyp: Ig; polyklonal Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland PE-markierter Ziege-anti-Maus IgM(Fcgamma)-F(ab`)2-Fragment Isotyp: Ig; polyklonal Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland Maus-anti-human slan-Antikörper (Hybridomaüberstand); Isotyp: IgM; Klon DD2 Institut für Immunologie, Medizinische Fakultät, Technische Universität Dresden, Dresden, Deutschland 2.1.5.3 Antikörper für Intrazelluläre Färbungen FITC-markierter Maus-anti-human IFN-γ-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon 4S.B3 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland PE-markierter Ratten-anti-human/antiVirus IL-10-Antikörper Isotyp: IgG1; Klon JES3-9D7 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland FITC-markierter Maus-anti-human IL-12(p40/p70)-Antikörper Isotyp: IgG1; Klon C11.5 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland PE-markierter Maus-anti-human IL-4-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon 8D4-8 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland 32 Material und Methoden FITC-markierter Maus-anti-human TNF-Antikörper Isotyp: IgG1κ; Klon MAb11 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland 2.1.5.4 Stimulationsbeads Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 Gibco Life Technologies, Oslo, Norwegen 2.1.5.5 Blockierungsantikörper „Purified“ Maus-anti-human CD274(B7-H1, PD-L1)-Antikörper Isotyp: IgG2bκ; Klon 29E.2A3 BioLegend, San Diego, CA, USA „Functional Grade Purified” Ratten-antihuman/Maus CD276(B7-H3)-Antikörper Isotyp: IgG2aκ; Klon MIH35 eBioscience, Frankfurt, Deutschland 2.1.6 Testkitsysteme EnVisionTM G|2 System/AP, Rabbit/Mouse (Permanent Red) Dako, Glostrup, Dänemark MACS „fragment crystallizable“-Rezeptor (FcR)-Blockierungs-Reagenz, human Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland OptEIATM Human IFN-γ ELISA Set BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland 2.1.7 Zytokine Interleukin-2 (IL-2) R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland Interleukin-12 (IL-12) R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland 33 Material und Methoden 2.1.8 Humane Tumorzelllinien ACHN (MEM Alpha-Medium, komplett) American Type Culture Collection (ATCC)-Nummer: CRL-1611; klarzelliges NZK Caki-1 (McCoy’s 5A-Medium, komplett) ATCC-Nummer: HTB-46; klarzelliges NZK MZ1257RC (DMEM-Medium, komplett) Zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Barbara Seliger, Institut für Medizinische Immunologie, Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg; primäres klarzelliges NZK MZ2877RC (DMEM-Medium, komplett) Zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Barbara Seliger, Institut für Medizinische Immunologie, Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg; primäres klarzelliges NZK 2.1.9 Geräte AutoMACS® Pro Separator Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Brutschrank (37 °C, 5 % CO2) Heraeus, Hanau, Deutschland Dampfkocher MultiGourmet Braun GmbH, Kronberg im Taunus, Deutschland Eismaschine SCOTSMAN, Mailand, Italien FACSCaliburTM (Durchflusszytometer) BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland MACSQuantTM Analyzer (Durchflusszytometer) Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Mikroskopsystem für Zellkulturen CK 30/CK 40 Olympus Optical Co. GmbH, Hamburg, Deutschland Mikroskopsystem zur Gewebeanalyse AxioCam Cc1 Carl Zeiss AG, Jena, Deutschland Mikroskopsystem zur Gewebeanalyse Axioskop Carl Zeiss AG, Jena, Deutschland 34 Material und Methoden Rotator CAT RM5-30V (Labor-Rollmischer) CAT Ingenieurbüro M. Zipper GmbH, Staufen, Deutschland SunriseTM Mikroplatten-Lesegerät für ELISA Assays TECAN Group Ltd., Männedorf, Schweiz Tischzentrifuge T54, Ausschwenkrotor für Mikrotiterplatten VEB MLW Prüfgeräte-Werk Medingen, Freital, Deutschland Wärmeschrank (60 °C) Heraeus, Hanau, Deutschland Wasserbad GLF Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel, Deutschland Werkbank Heraeus, Hanau, Deutschland Zentrifuge Rotixa 120S, Rotor 4294, Gehänge 4295, Einsätze 4232 und 4254 Hettich, Tuttlingen, Deutschland 2.1.10 Sonstige Materialien 96 Well BD NuncTM ELISA Platten Thermo Fisher Scientific (Nunc GmbH & Co. KG), Langenselbold, Deutschland Combitips advanced® (5 ml) Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Costar® Stripette® (Serologische Pipetten; 5 ml, 10 ml bzw. 25 ml) Corning Incorporated, Corning, NY, USA Easypet® Pipettierhilfe Eppendorf-Nethler-Hinz-GmbH, Hamburg, Deutschland Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml bzw. 0,5 ml) Eppendorf-Nethler-Hinz-GmbH, Hamburg, Deutschland FACS-Messröhrchen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Flachbodenplatte (96 Vertiefungen) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Kryogefäße (1,8 ml) TPP Techno Plastic Products, Trasadingen, Schweiz Kryokarussell Nalge Company, Rochester, NY, USA Millicell Zellkulturplatten-Einsätze, 12 mm, HA-Zellulosemischester (Porendurchmesser: 0,45 µm) Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland 35 Material und Methoden Multipette® plus Eppendorf-Nethler-Hinz-GmbH, Hamburg, Deutschland Neubauer-Zählkammer LO-Labortechnik GmbH, Friedrichsdorf, Deutschland Pipettensatz (0,1-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl; 10-100 µl; 50-250 µl; 200-1000 µl) Eppendorf-Nethler-Hinz-GmbH, Hamburg, Deutschland Pipettenspitzen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Rundboden Zellkulturplatten (96 Vertiefungen), steril Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Spitzbodenplatten (96 Vertiefungen) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Zellkulturflaschen (250 ml, 75 cm2 bzw. 50 ml, 25 cm2) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Zellkulturplatten (24 Vertiefungen), steril Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Zellsieb (Porendurchmesser: 40 µm bzw. 70 µm) Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA Zentrifugenröhrchen (15 ml bzw. 50 ml) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland 2.2 Methoden 2.2.1 Kultivierung von Tumorzelllinien Die Kultivierung der adhärenten NZK-Zellen erfolgte im entsprechenden Medium (siehe 2.1.8.) in mittleren Zellkulturflaschen (Fläche: 75 cm2) bei 37 °C und 5 % CO2. Die Dauer der Kultivierung richtete sich nach dem Wachstumsverhalten der jeweiligen Tumorzelllinie. War das Umsetzen der Zellen zur Bereitstellung für Experimente bzw. aufgrund des Erreichens einer Konfluenz von 90 % nötig, wurde zunächst das Medium verworfen, die Zellen mit 7 ml vorgewärmter, steriler PBS-Lösung gewaschen und 5 ml Trypsin/EDTA-Lösung zugefügt. Nach fünfminütiger Inkubation bei 37 °C erfolgte das Abstoppen der Trypsin-Reaktion durch Zugabe von 7 ml des entsprechenden KulturMediums. Im Anschluss an das Überführen der Zellsuspension in ein 50 ml 36 Material und Methoden Zentrifugenröhrchen und einen Zentrifugationsschritt (10 min, 360 x g, RT) wurde das Zellpellet in 1 ml Medium resuspendiert und die Zellzahl mittels Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Langzeitlagerung der NZK-Zellen fand bei -80 °C statt. Dafür wurden 2 - 5 x 106 Zellen in 900 µl Medium aufgenommen, in ein Kryogefäß überführt und nach Zugabe von 10 % DMSO zum Schutz der Zellen vor einer Kristallbildung sofort mithilfe eines Kryokarussells eingefroren. Um eingefrorene Tumorzellen wieder in Kultur zu bringen, erfolgte das Auftauen des Kryogefäßes unter leichtem Schwenken bei 37 °C im Wasserbad. Die Zellen wurden zügig mit 10 ml des entsprechenden Kultur-Mediums in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen gewaschen (8 min, 360 x g, RT) und im Anschluss in 1 ml frischem Medium in eine neue Zellkulturflasche (Fläche 25 cm2) mit 7 ml Medium überführt. 2.2.2 Isolation mononukleärer Zellen des peripheren Blutes Zur Gewinnung von slanDCs sowie weiteren Leukozytenpopulationen war es notwendig, zunächst die Gesamtfraktion der mononukleären Zellen aus aufkonzentriertem Spenderblut von gesunden Spendern („Buffy-coat“, zur Verfügung gestellt vom Blutspendedienst des deutschen Roten Kreuzes) zu isolieren. Die Zellsuspension des „Buffy-coat“ wurde in eine 500 ml Glasflasche überführt und mit PBS-Lösung (RT) auf ein Volumen von 200 ml aufgefüllt. Je 100 ml dieser verdünnten Zellsuspension wurden im Anschluss auf 75 ml Ficoll-Trennlösung in Zentrifugenbechern geschichtet, ohne Blut und Ficoll zu mischen. Es folgte eine Dichtegradientenzentrifugation (20 min, 980 x g, RT) bei ausgeschalteter Zentrifugenbremse. Während dieser passierten Erythrozyten, Retikulozyten und polymorphkernige Zellen, wie Granulozyten, aufgrund ihrer hohen Dichte die FicollTrennlösung und sedimentierten. Die mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), zu denen DCs, Monozyten, T-Zellen, B-Zellen sowie NK-Zellen zählen, sammeln sich zwischen Plasma- und Ficoll-Phase. Die PBMCs dieser Interphase wurden separiert und mit kalter PBS-Lösung gewaschen (15 min, 360 x g, 4 °C). Das Zellpellet wurde in 50 ml frischer PBS-Lösung aufgenommen und in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Zur Zellzahlbestimmung dieser PBMCs mithilfe einer 37 Material und Methoden Neubauer-Zählkammer wurde ein Aliquot in 5%iger Essigsäure verdünnt, um Retikulozyten sowie verbleibende Erythrozyten zu lysieren. 2.2.3 Immunmagnetische Isolation verschiedener Immunzellpopulationen aus PBMCs Die immunmagnetische Isolation von T-Zellen, NK-Zellen sowie von slanDCs aus PBMCs erfolgte durch „magnetic-activated cell sorting“ (MACS) (Abbildung 1). Diese Methode beruht auf der Markierung von Zellen mit Antikörper-gekoppelten magnetischen Partikeln, den sogenannten „MicroBeads“. Markierte Zellen werden durch das Anlegen eines starken Magnetfeldes in einer Säule zurückgehalten, während Zellen, welche nicht spezifisch Antikörper-gekoppelte „MicroBeads“ binden, die Säule passieren. Durch das Entfernen des Magnetfeldes um die Säule ist es möglich, markierte Zellen zu eluieren. 38 Material und Methoden Abbildung 1: Prinzip der immunmagnetischen Isolation von Zellen aus PBMCs am Beispiel von slanDCs. (A) Die indirekte magnetische Markierung der Zielzellen erfolgte durch Maus-IgM-Antikörper, die als Epitop den slanDC-spezifischen Oberflächenmarker „slan“ erkannten sowie durch anti-Maus-IgM-gekoppelte „MicroBeads“. Während die Zielzellen durch das angelegte magnetische Feld in der Säule zurückgehalten wurden, passierten unmarkierte nicht-Zielzellen die Säule als Negativfraktion. Die Elution der slanDCs als Positivfraktion erfolgte durch das Entfernen des Magnetfeldes. (B) Zur Analyse der Isolation von slanDCs aus PBMCs erfolgte die Färbung der verschiedenen Zellfraktionen (PBMCs, Negativfraktion und Positivfraktion) mit Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Antikörpern gegen HLA-DR und gegen Maus-IgM. Anschließend fand die durchflusszytometrische Bestimmung des prozentualen + + Anteils der in den Zellfraktionen enthaltenen slanDCs (HLA-DR slan ) statt. 39 Material und Methoden 2.2.3.1 Isolation von slanDCs Die magnetische Separation der slanDCs von den übrigen mononukleären Blutzellen mittels AutoMACS® Pro Separator wurde durch die Markierung der slanDCs mit „MicroBeads“ ermöglicht. Dafür wurden zunächst frisch isolierte PBMCs (siehe 2.2.2) pelletiert (10 min, 360 x g, 4 °C) und pro 1 x 108 Zellen in 2 ml Antikörperlösung aufgenommen. Diese setzte sich aus dem Kulturüberstand des M-DC8-Hybridoms (Antikörperkonzentration: 10 µg/ml) und PBS-Lösung im Verhältnis 1:60 zusammen. Das Epitop für den verwendeten IgM-Antikörper stellt die slan-Modifikation des PSGL-1 auf der Oberfläche von slanDCs dar. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 4 °C wurden die Zellen mit kalter PBS-Lösung gewaschen (10 min, 360 x g, 4 °C) und im Anschluss pro 1 x 108 Zellen 12 µl sekundärer Antikörper sowie 100 µl PBS-Lösung zugegeben. Während der folgenden Inkubationszeit von 15 min bei 4 °C detektierte dieser sekundäre „MicroBead“-gekoppelte Ratten-anti-Maus-IgM Antikörper den Fc-Teil des primären Antikörpers. Anschließend folgte erneut die Entfernung von nicht gebundenem Antikörper durch das Waschen der Zellen mit PBS-Lösung (10 min, 360 x g, 4 °C). Um Zellaggregate zu vermeiden, wurde das Zellpellet in 2 ml Isolationspuffer aufgenommen und schließlich durch ein Zellsieb mit 40 µm Porendurchmesser filtriert. Die Zellsuspension wurde entsprechend der Herstellerangaben unter automatischer Verwendung von Lauf- und Waschpuffer sowie Reinigungslösung in den AutoMACS® Pro Separator eingespeist. Die resultierende slanDC-positive Fraktion wurde zentrifugiert (5 min, 360 x g, 4 °C) und in 1 ml RPMI 1640-Medium mit 10 % HS aufgenommen. Die Bestimmung der Zellzahl dieser slanDCs erfolgte nach Verdünnung eines Aliquots in Trypanblaulösung mithilfe einer Neubauer-Zählkammer. Das Trypanblau ermöglichte die Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen, da es als nicht membrangängiger Farbstoff nur tote Zellen anfärbt. Um die Reinheit der frisch isolierten slanDCs zu ermitteln, wurde je ein Aliquot mit Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Antikörpern gegen HLA-DR und gegen Maus-IgM gefärbt (siehe 2.2.4.1). Die durchflusszytometrische Analyse ergab, dass das angewendete Isolationsverfahren Reinheiten von ≥90 % der slanDCs gewährleistete. 40 Material und Methoden 2.2.3.2 Isolation von CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Lymphozyten und CD56+ CD3NK-Zellen Während slanDCs mittels Positivselektion isoliert wurden, erfolgte die Isolation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, von naϊven CD4+ T-Lymphozyten sowie von NK-Zellen nach dem Prinzip der Negativdepletion. Zunächst wurde jeweils eine entsprechende Menge der aus „Buffy-coats“ gewonnenen PBMCs (siehe 2.2.2) zentrifugiert (10 min, 360 x g, 4 °C) und je 1 x 107 Zellen in 40 µl Isolationspuffer resuspendiert. Weiterhin wurden 10 µl Biotin-gekoppelter AntikörperCocktail pro 1 x 107 PBMCs zugesetzt. Die darin enthaltenen Antikörper markierten während der folgenden 10-minütigen Inkubationszeit bei 4 °C alle Zellen mit Ausnahme der jeweils zu isolierenden Zellen. Es folgte die Zugabe von 30 µl Isolationspuffer und 20 µl „MicroBead“-gekoppelten anti-Biotin Antikörpern zu der Zellsuspension. Während einer Inkubationszeit von 15 min bei 4 °C lagerten sich die „MicroBead“-gekoppelten Antikörper an die Biotinstruktur des primären Antikörpers an. Im Falle der Isolation von CD4+ sowie CD8+ T-Lymphozyten folgte an dieser Stelle ein Waschschritt mit kalter PBS-Lösung (10 min, 360 x g, 4 °C) und die anschließende Aufnahme der pelletierten Zellen in 1 ml Isolationspuffer. Bei der Isolation von naϊven CD4+ T-Lymphozyten bzw. von NK-Zellen entfiel dieser Zwischenschritt. Die Zellsuspensionen wurden mit kaltem Isolationspuffer auf ein Gesamtvolumen von 1 ml aufgefüllt. Die Separation der Zellen fand mittels AutoMACS® Pro Separator unter automatischer Verwendung von Lauf-, Spül- und Reinigungspuffer statt. Es folgte die Zentrifugation der eluierten Zell-Fraktion (5 min, 360 x g, 4 °C) und im Anschluss die Aufnahme der pelletierten Zellen in 1 ml RPMI 1640 mit 10 % HS. Zur Zellzahlbestimmung mithilfe einer Neubauer-Zählkammer wurde je ein Aliquot der isolierten Zellen verdünnt in Trypanblaulösung eingesetzt. Weiterhin wurde die Reinheit der frisch angereicherten Zellen durch Färbung eines Aliquots mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Durchflusszytometrie Antikörpern (siehe und 2.2.4.1) anschließende ermittelt. Die Analyse mittels Ergebnisse dieser Reinheitsfärbungen sind in Tabelle 2 dargestellt. 41 Material und Methoden Tabelle 2: Reinheitsfärbungen Zellart eingesetzte Antikörper Reinheit der isolierten Zellen Maus-anti-human CD4 (PE) Maus-anti-human CD45 RA (FITC) 92 - 98 % + Maus-anti-human CD3 (PE) Maus-anti-human CD4 (FITC) 91 - 99 % CD8 T-Lymphozyten + Maus-anti-human CD3 (PE) Maus-anti-human CD8 (FITC) 93 - 95 % NK-Zellen Maus-anti-human CD56 (PE) Maus-anti-human CD3 (FITC) 90 - 99 % + naϊve CD4 T-Lymphozyten CD4 T-Lymphozyten 2.2.4 Durchflusszytometrie Die Reinheit frisch isolierter bzw. bereits kultivierter Zellen und das Vorhandensein spezifischer Oberflächenmoleküle sowie intrazellulärer Moleküle wurde nach entsprechender Färbung mittels „fluorescence-activated cell sorter“ (FACS) analysiert. Das Verfahren der Durchflusszytometrie beruht auf der Unterscheidung von Zellen innerhalb einer Suspension anhand ihrer Größe und Granularität sowie Fluoreszenzmarkierung. Dabei passieren die Zellen nacheinander einen Laserstrahl. Eine einzelne Zelle erzeugt abhängig von ihrer Beschaffenheit ein charakteristisches Streulichtmuster, wodurch die Abgrenzung verschiedener Zellpopulationen möglich wird. So gibt das Vorwärtsstreulicht („forward scatter“; FSC) Auskunft über die Größe der Zellen während das Seitwärtsstreulicht („side scatter“; SSC) mit der Granularität der Zellen korreliert. Weiterhin können spezifische Oberflächenmoleküle oder intrazelluläre Moleküle mittels Antikörpern markiert werden, an die Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt sind. Werden diese Farbstoffe wie beispielsweise FITC, PE oder APC, von einem Laserstrahl angeregt, so emittieren sie Licht einer spezifischen Wellenlänge, welche durch Detektoren gemessen wird. 2.2.4.1 Analyse von Oberflächenmolekülen Zur Untersuchung von zellulären Oberflächenmolekülen wurde zunächst eine Zellsuspensionen mit bis zu 2 x 105 frisch isolierten bzw. kultivierten Zellen in die Vertiefung einer 96-Well-Spitzbodenplatte überführt. Die Zellen wurden in 150 µl kalter 42 Material und Methoden PBS-Lösung gewaschen (3 min, 360 x g, 4 °C) und mit je 1 µl der entsprechenden Antikörperlösung versetzt. Um Antikörper unterschiedlicher Spezifität zur Färbung einer Zellprobe zu kombinieren, wurden monoklonale Antikörper ausgewählt, die mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert waren. Im Anschluss an die 15-minütige Inkubation bei 4 °C unter Lichtabschluss folgte ein Waschschritt mit je 150 µl PBS-Lösung (3 min, 360 x g, 4 °C), um ungebundene Antikörpermoleküle zu entfernen. Die pelletierten Zellen wurden zur Fixierung in 200 µl PFA-Lösung (0,5%ig) aufgenommen und in FACS-Röhrchen überführt. Schließlich wurden die gefärbten Zellen mittels FACSCaliburTM gemessen und die gewonnenen Daten mit der Software WIN-MDI 2.9 ausgewertet. Durch die Darstellung der Zellen im Streubild wurden anhand von Zellgröße und Granularität einzelne Zellpopulationen voneinander und von Zellfragmenten abgegrenzt. Weiterhin ermöglichte die Auswahl spezifischer Regionen im „forward / side scatter“ die Analyse von Zellen spezifischer Populationen in Bezug auf antikörpermarkierte Negativkontrolle und Oberflächenmoleküle. ermöglichten eine Ungefärbte statistische Zellen Analyse dienten der als gefärbten Zellsuspension im Hinblick auf die prozentuale Verteilung der Zellen im Streubild oder im Histogramm. Weiterhin wurde der Mittelwert der Einzelfluoreszenzen, die sogenannte Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) aller Zellen einer definierten Population bestimmt. Sie gibt Aufschluss über die (mittlere) Dichte des fluoreszenzmarkierten Moleküls auf der Zelloberfläche. 2.2.4.2 Analyse von intrazellulären Molekülen Die Analyse von intrazellulären Molekülen mittels Durchflusszytometrie wurde im Rahmen dieser Arbeit genutzt, um die Zytokinproduktion individueller Zellen zu überprüfen. Zu diesem Zweck wurden die zu untersuchenden Zellen in Vertiefungen einer 96-Well-Spitzbodenblatte überführt und zur Fixation in je 100 µl PFA-Lösung (4%ig) aufgenommen. Nach einer 15-minütigen Inkubation auf Eis wurden die Zellen pelletiert (3 min, 360 x g, 4 °C) und anschließend in 100 µl Saponin (0,1%ig) aufgenommen. Während der folgenden Inkubationszeit von 3 min bei 4 °C war das Saponin in der Lage, zellmembraneigenes Cholesterin zu komplexieren, was zur Bildung von Poren in der Membran der behandelten Zellen führte. Die Zellen wurden zentrifugiert (3 min, 360 x g, 4 °C) und mit je 10 µl Antikörper-Lösung versetzt. Diese setzte sich aus FITC- oder PE-markierten Antikörpern sowie Saponin (0,1%ig) im 43 Material und Methoden Verhältnis 1:40 zusammen. Als Negativkontrolle dienten Zellen, die mit 10 µl Saponin (0,1%ig) ohne Antikörper versetzt wurden. Nach 15-minütiger Inkubation bei 4 °C wurden die Zellen mit kalter PBS-Lösung gewaschen (3 min, 360 x g, 4 °C), in 200 µl PBS-Lösung aufgenommen und in FACS-Röhrchen überführt. Die Analyse der intrazellulären Färbung fand mittels FACSCaliburTM statt. Ausgewertet wurden die gewonnenen Daten anschließend mit der Software WIN-MDI 2.9. Die Darstellung im Streubild ermöglichte die Abgrenzung der Zellen von Zellfragmenten anhand von Zellgröße und Granularität. Die Auswahl einer Zell-Region wiederum machte die Analyse der antikörpermarkierten intrazellulären ZytokinMoleküle im Bezug auf die prozentuale Verteilung der Zytokine innerhalb der Zellpopulation möglich. 2.2.4.3 Charakterisierung von slanDCs aus frischem NZK-Gewebe Die Methode der Durchflusszytometrie wurde zur phänotypischen Charakterisierung von Tumor-infiltrierenden slanDCs genutzt, welche im Rahmen der Isolierung von Leukozyten durch mechanische Verfahren sowie enzymatische Behandlung aus frischem, klarzelligen NZK-Gewebe (siehe 2.2.11) gewonnen wurden. Dafür wurden pro Probe zunächst 5 - 10 x 105 frisch isolierte Tumor-infiltrierende Leukozyten (TILs) in eine Vertiefung einer 96-Well-Spitzbodenplatte überführt, zentrifugiert (3 min, 360 x g, 4 °C) und der Überstand verworfen. Die Pellets wurden in je 100 µl Hybridomaüberstand (Klon DD2; 1:100 in PBS-Lösung verdünnt) resuspendiert und für 30 min bei 4 °C inkubiert. Das Epitop dieses primären Antikörpers stellt die slan-Modifikation des PSGL-1 auf der Oberfläche von slanDCs dar. Nach der Entfernung von nicht gebundenem Antikörper durch zwei Waschschritte mit Waschpuffer-1 (3 min, 360 x g, 4 °C) folgte eine 30-minütige Inkubation mit 50 µl sekundärem FITC- bzw. PE-markiertem anti-IgM-Antikörper (1:600 in PBS-Lösung verdünnt) bei 4 °C. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit Waschpuffer-1 gewaschen (3 min, 360 x g, 4 °C) und daraufhin für 20 min bei 4 °C mit verschiedenen Antikörpern (siehe Tabelle 3, Schritt 2) gefärbt. Im Falle einer Färbung der Zytokine TNF-α, IL-12 und IL-10 fand im Anschluss an die Färbung von Oberflächenmolekülen zusätzlich eine entsprechend Kapitel 2.2.4.2 durchgeführte intrazelluläre Färbung statt (siehe Tabelle 3, Schritt 3). 44 Material und Methoden Tabelle 3: Schema zur Färbung von TILs Intrazelluläre Färbung Färbung von Oberflächenmolekülen Schritt 1 100 µl primärer Antikörper (1:100) Schritt 2 Schritt 3 50 µl sekundärer Antikörper (1:600) 1 µl 0,5 µl 1 µl 1 µl 10 µl (1:40 in Saponin) IgM-PE IgM-FITC CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC - - DD2 IgM-PE CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC HLA-DRFITC - DD2 IgM-PE CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC CD86-FITC - DD2 IgM-PE CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC CD83-FITC - DD2 IgM-PE CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC ILT3-FITC - DD2 IgM-PE CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC ILT4-FITC - DD2 IgM-PE CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC CD40-FITC - DD2 IgM-PE CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC CD16-FITC - DD2 IgM-FITC CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC CCR7-PE - DD2 IgM-FITC CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC CD80-PE - IgM-PE IgM-FITC CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC - - DD2 IgM-PE CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC - TNF-α-FITC DD2 IgM-PE CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC - IL-12-FITC DD2 IgM-FITC CD45PerCP CD3APC-H7 CD11cAPC - IL-10-PE Kontrolle: - Kontrolle: - Nach der Färbung wurden ungebundene Antikörper durch einen Waschschritt mit 150 µl Waschpuffer-1 entfernt (3 min, 360 x g, 4 °C) und die TILs anschließend in je 45 Material und Methoden 150 µl Waschpuffer-1 in eine Flachbodenplatte (96 Wells) überführt. Zur Markierung toter Zellen wurden pro Probe 15 µl DAPI-Lösung (entsprechend 3 ng DAPI pro Probe) zugegeben. Die Antikörper-gefärbten Zellen wurden mittels MACSQuantTM analysiert. Ausgewertet wurden die gewonnenen Daten schließlich mit der Software FlowJo vX.0.7 entsprechend der „Gating“-Strategie in Abbildung 2. Abbildung 2: „Gating“-Strategie zur Charakterisierung von NZK-infiltrierenden slanDCs. Aus frischem NZK-Gewebe wurde durch mechanische Verfahren sowie enzymatische Behandlung eine Zellsuspension gewonnen. Die Analyse der Zellsuspension fand mittels Durchflusszytometer statt. Nach der Ausgrenzung von Zellfragmenten sowie Zellaggregaten und toten Zellen erfolgte die Auswahl von hämatopoetischen Zellen über den Marker CD45. + + SlanDCs wurden weiterhin als CD3 CD11c DD2(slan) Zellen definiert. 2.2.5 Kokultivierung von slanDCs und NZK-Zellen Um die Wirkung von NZK-Zellen auf die Funktionalität von slanDCs zu analysieren, fand die Kokultivierung von Zellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC und MZ2877RC mit slanDCs statt. Dafür wurden zunächst 3 x 105 Tumorzellen in 500 µl RPMI 1640 + 10 % HS pro Vertiefung einer Zellkulturplatte (24 Wells) ausgesät und für 2 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Währenddessen adhärierten die Zellen am Boden der Vertiefung und bildeten einen Tumorzellrasen. Anschließend erfolgte die Zugabe von 1 x 106 frisch isolierten slanDCs in weiteren 500 µl RPMI 1640 + 10 % HS. Als 46 Material und Methoden Kontrolle dienten slanDCs, welche ohne NZK-Zellen in 1 ml RPMI 1640 + 10 % HS inkubiert wurden. Um B7-Moleküle auf der Zelloberfläche der NZK-Zelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC sowie MZ2877RC zu blockieren, wurden ebenfalls 3 x 105 Tumorzellen in 500 µl RPMI 1640 + 10 % HS ausgesät. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 erfolgte für einen Teil der Wells die Zugabe neutralisierender Antikörper gegen B7-H1 bzw. B7-H3 in einer Endkonzentration von 10 µg/ml. Nach einer weiteren Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 fand die Zugabe von 1 x 106 frisch isolierten slanDCs in 500 µl RPMI 1640 + 10 % HS entsprechend mit oder ohne anti-B7-H1 bzw. anti-B7-H3 (10 µg/ml) statt. Um die Bindung der neutralisierenden Antikörper durch Fc-Rezeptoren der slanDCs zu verhindern, wurden die slanDCs im Vorfeld der Kokultivierung mit NZKZellen mittels FcR-Blockierungs-Reagenz behandelt. Dafür erfolgte die Aufnahme von je 1 x 107 slanDCs in 60 µl Isolationspuffer und die Zugabe von 20 µl FcRBlockierungs-Reagenz. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 4 °C wurden die Zellen zweimal mit 10 ml Isolationspuffer gewaschen (8 min, 360 x g, 4 °C) und im Anschluss in 1 ml RPMI 1640 + 10 % HS resuspendiert. Zur Zellzahlbestimmung der slanDCs in einer Neubauer-Zählkammer wurde je ein Aliquot der isolierten Zellen verdünnt in Trypanblaulösung eingesetzt. Mit dem Ziel, eine Interaktion von slanDCs mit Tumorzellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC bzw. MZ2877RC über direkten Zell-Zell-Kontakt zu unterbinden, erfolgte weiterhin die Kokultivierung im Zuge von Transwell-Experimenten. Dafür wurden zunächst 1 x 106 frisch isolierte slanDCs in 300 µl RPMI 1640 + 10 % HS pro Vertiefung einer Zellkulturplatte (24 Wells) ausgesät. Anschließend wurden Zellkulturplatten-Einsätze (Porengröße 0,45 µm) in die Wells gesetzt und 3 x 105 Tumorzellen in 400 µl RPMI 1640 + 10 % HS in die Einsätze gegeben. Die Kokultivierung von Tumorzellen und slanDCs ohne Zellkultur-Einsätze als Kontrollansatz erfolgte gemäß der obigen Beschreibung im 1. Absatz, jedoch in einem Gesamtvolumen von 700 µl RPMI 1640 + 10 % HS. Nach sechsstündiger Kokultur bei 37°C und 5 % CO2 wurden die slanDCs durch vorsichtiges resuspendieren von den adhärenten Tumorzellen separiert. Im Falle einer Kultivierung der slanDCs in Gegenwart von neutralisierenden Antikörpern folgte an dieser Stelle die Entfernung von ungebundenen Antikörpern durch dreimaliges Waschen der Zellen mit RPMI 1640-Medium (10 min, 360 x g, RT). Anschließend wurden die mit Tumorzellen vorbehandelten slanDCs zentrifugiert (10 min, 360 x g, 47 Material und Methoden RT) und in RPMI 1640 + 10 % HS aufgenommen. Ein Aliquot dieser slanDCs wurde in Trypanblaulösung verdünnt und die Zellzahl mithilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Ermittlung von eventuellen Verunreinigungen der slanDCs durch Tumorzellen erfolgte durch eine Reinheitsfärbung mit anti-HLA-DR-PE sowie antiCD86-FITC und eine anschließende durchflusszytometrische Analyse (siehe 2.2.4.1). Die Reinheiten der mit Tumorzellen vorkultivierten slanDCs beliefen sich auf 85 - 98 %. Die mit NZK-Zellen vorbehandelten slanDCs wurden schließlich hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen (siehe 2.2.6), NK-Zellen (siehe 2.2.8) oder einer Programmierung naϊver CD4+ T-Lymphozyten (siehe 2.2.7) untersucht. 2.2.6 T-Zell-Proliferationstest mit eFluor® 670 Um den Einfluss der verschiedenen NZK-Linien auf die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ bzw. CD8+ T-Lymphozyten zu analysieren, wurde ein T-Zell-Proliferationstest durchgeführt. Dafür wurde der Lebendfarbstoff eFluor® 670 eingesetzt. Dieser lagert sich an intrazelluläre Proteine an, welche primäre Amine beinhalten, und wird bei Zellteilung zu gleichen Anteilen an die Tochterzellen weitergegeben. Durch diesen Umstand kann die Teilung von Zellen als sukzessive Abnahme des MFI gemessen werden. Zunächst wurden slanDCs mit Tumorzellen der NZK-Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC sowie MZ2877RC vorbehandelt (siehe 2.2.5). Dabei erfolgte teilweise der Einsatz von neutralisierenden Antikörpern gegen B7-H1 und B7-H3 oder von Transwell-Einsätzen (siehe 2.2.5). Während der Kokultivierung von NZK-Zellen und slanDCs wurden CD4+ bzw. CD8+ T-Lymphozyten immunmagnetisch isoliert (siehe 2.2.3.2) und daraufhin mit dem Proliferationsfarbstoff eFluor® 670 gefärbt. Für die Färbung wurden je 1 x 107 frisch isolierte T-Lymphozyten in 500 µl PBS-Lösung aufgenommen und mit 500 µl 10 µM eFluor® 670 in PBS-Lösung versetzt. Nach 10 min bei 37 °C wurde die Färbung durch die Zugabe von 5 ml RPMI 1640 + 5 % HS und eine Inkubationsphase von 3 min auf Eis gestoppt. Es schloss sich die Zugabe weiterer 5 ml RPMI 1640 + 5 % HS und eine Zentrifugation für 10 min bei 360 x g und 4 °C an. Nach zwei weiteren Waschschritten mit je 5 ml RPMI 1640 + 5 % HS wurde das Pellet in 1 ml RPMI 1640 + 10 % HS aufgenommen und die Zellzahl mittels Neubauer-Zählkammer bestimmt. In einer Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen wurden 1 x 105 dieser allogenen eFluor® 670-gefärbten CD4+ T-Lymphozyten mit 1 x 104 vorbehandelten slanDCs bzw. 48 Material und Methoden 1 x 105 allogene eFluor® 670-gefärbte CD8+ T-Zellen mit 2 x 104 vorbehandelten slanDCs in je 200 µl RPMI 1640 + 10 % HS bei 37 °C und 5 % CO2 kokultiviert. Der mögliche direkte Einfluss einer 15%igen Verunreinigung von slanDCs durch Tumorzellen auf die T-Zell-Proliferation wurde durch Kontrollexperimente untersucht. Dafür wurden 1 x 105 eFluor® 670-gefärbte CD4+ T-Lymphozyten mit 1,5 x 103 NZKZellen bzw. 1 x 105 eFluor® 670-gefärbte CD8+ T-Zellen mit 3 x 103 Tumorzellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC oder MZ2877RC in je 200 µl RPMI 1640 + 10 % HS bei 37 °C und 5 % CO2 kokultiviert. Zur Stimulation der T-Zell-Proliferation erfolgte die Zugabe von 4 x 104 anti-CD3/CD28 Dynabeads® pro Well sowie 100 U/ml IL-2. Nach 7 d in Kultur wurden die T-Zellen geerntet. Im Anschluss an eine Färbung mit anti-CD4-FITC respektive anti-CD8-FITC (siehe 2.2.4.1) erfolgte die durchflusszytometrische Ermittlung der Proliferationsrate der T-Zellen durch die Bestimmung des MFI von eFluor® 670. 2.2.7 Programmierung naϊver CD4+ T-Zellen durch slanDCs Durch die Quantifizierung der von CD4+ T-Lymphozyten gebildeten Zytokine IFN-γ bzw. IL-4 kann auf die slanDC-abhängige Differenzierung naïver CD4+ T-Zellen in TH1bzw. TH2-Zellen geschlossen werden. Um den Einfluss von NZK-Zellen auf diese slanDC-vermittelte Differenzierung von CD4+ T-Zellen zu untersuchen, wurden slanDCs zunächst mit Zellen der NZK-Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC sowie MZ2877RC inkubiert (siehe 2.2.5). Im Anschluss wurden 1 x 104 dieser präinkubierten slanDCs mit 1 x 105 frisch isolierten allogenen, naϊven CD4+ T-Lymphozyten kokultiviert. Die Kokultivierung über 7 d fand in einem Gesamtvolumen von 200 µl RPMI 1640 + 10 % HS pro Vertiefung mit 1 µg/ml LPS zur Stimulation der slanDCs in einer Rundbodenplatte (96 Wells) statt. Um einen potenziellen direkten Einfluss einer 15%igen Verunreinigung der slanDCs durch NZK-Zellen auf die Differenzierung naϊver CD4+ T-Lymphozyten zu ermitteln, wurden Kontrollexperimente durchgeführt. Dazu wurden 1 x 105 naϊve CD4+ T-Zellen mit 1,5 x 103 Tumorzellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC oder MZ2877RC in je 200 µl RPMI 1640 + 10 % HS bei 37 °C und 5 % CO2 kokultiviert. Die Aktivierung der T-Zellen fand durch die Zugabe von 4 x 104 anti-CD3/CD28 Dynabeads® pro Well sowie 0,2 ng/ml IL-12 statt. 49 Material und Methoden Im Anschluss an die siebentägige Kultivierung wurden die CD4+ T-Zellen geerntet, zentrifugiert (10 min, 360 x g, RT) und gezählt. Es folgte eine vierstündige Inkubation von 2 x 105 CD4+ T-Lymphozyten pro Vertiefung in 200 µl RPMI 1640 + 10 % HS mit Ionomycin (1 µg/ml) und PMA (10 ng/ml) bei gleichzeitiger Anwesenheit von Brefeldin A (1 µg/ml) in einer Rundbodenplatte (96 Wells). Dabei fungieren Ionomycin und PMA gemeinsam als Stimulatoren, die die Produktion von Zytokinen anregen. Brefeldin A dient als Exozytoseblocker und inhibiert den Proteintransport vom Endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat, wodurch die in der Zelle produzierten Zytokine nicht sezerniert werden, sondern im Zytoplasma akkumulieren. Nach 4 h erfolgte die intrazelluläre Färbung der Zytokine IFN-γ und IL-4 sowie die anschließende Analyse der Färbung mittels Durchflusszytometer (siehe 2.2.4.2). 2.2.8 SlanDC-vermittelte IFN-γ-Produktion durch NK-Zellen Nach ihrer Aktivierung produzieren NK-Zellen das Zytokin IFN-γ. Über die Quantifizierung der IFN-γ-Produktion ist es möglich, einen Rückschluss auf die slanDC-vermittelte Aktivierung von NK-Zellen zu ziehen. Um den Einfluss von Tumorzellen auf die slanDC-abhängige NK-Zell-Stimulation zu untersuchen, erfolgte zunächst die Vorbehandlung von slanDCs mit NZK-Zellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC sowie MZ2877RC (siehe 2.2.5). 2 x 104 dieser mit Tumorzellen vorkultivierten slanDCs wurden in einer Rundbodenplatte (96 Wells) mit 5 x 104 frisch isolierten, autologen NK-Zellen in 200 µl RPMI 1640 + 10 % HS inkubiert. Zur Stimulation der slanDCs wurde zusätzlich 1 µg/ml LPS zugefügt. Die Kokultivierung der Zellen fand über einen Zeitraum von 42 h statt. Eine mögliche direkte Beeinflussung einer 15%igen Verunreinigung von slanDCs durch Tumorzellen auf die IFN-γ-Sekretion von NK-Zellen wurde durch Kontrollexperimente analysiert. Dafür wurden 5 x 104 NK-Zellen mit 3 x 103 NZK-Zellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC oder MZ2877RC in je 200 µl RPMI 1640 + 10 % HS bei 37 °C und 5 % CO2 kokultiviert. Die Stimulation der NK-Zellen zur IFN-γ-Produktion fand durch die Zugabe von 500 U/ml IL-2 sowie 5 ng/ml IL-12 zum Kulturmedium statt. Nach der Kokultur über 42 h bei 37 °C und 5 % CO2 wurde die IFN-γ-Konzentration der Zellkulturüberstände mittels „Enzyme-linked Immunosorbent Assay“ (ELISA, siehe 2.2.9) bestimmt. 50 Material und Methoden 2.2.9 „Enzyme-linked Immunosorbent Assay“ Der ELISA diente dem quantitativen Nachweis der Zytokinproduktion von NK-Zellen. Um die Konzentration von IFN-γ zu bestimmen, wurden die Zellen nach der Kultivierung in einer 96-Well-Rundbodenplatte (bei 37 °C und 5 % CO2) zentrifugiert (5 min, 360 x g, RT) und die Zellkulturüberstände anschließend in eine FlachbodenZellkulturplatte mit 96 Vertiefungen überführt. Bei einer Temperatur von -20 °C wurden die Zellkulturüberstände in einer verschlossenen Zellkulturplatte bis zur Messung aufbewahrt. Für den IFN-γ ELISA wurde das Kitsystem „OptEIATM Human IFN-γ ELISA Set“ verwendet. Zunächst wurden 96 Well BD NuncTM ELISA Platten mit 100 µl „captureantibody“-Lösung pro Vertiefung beschichtet. Diese enthielt Antikörper, die gegen das humane Zytokin IFN-γ gerichtet waren und Beschichtungspuffer im Verhältnis 1:250. Nach der Inkubation bei 4 °C für etwa 18 h wurde die Lösung entfernt und die beschichtete Platte dreimal mit je 300 µl Waschpuffer-2 pro Vertiefung gespült. Um falsch positive Ergebnisse während des Assays zu vermeiden, folgte anschließend die Blockierung aller unspezifischen Bindungsstellen der ELISA-Platte durch Inkubation mit 200 µl Blockierungspuffer pro Vertiefung für 1 h. Nach drei weiteren Waschschritten mit je 300 µl Waschpuffer-2 pro Vertiefung wurden 100 µl des jeweiligen Standards in Doppelbestimmung bzw. 100 µl der verdünnten Proben pro Vertiefung aufgetragen. Die Verdünnung der Zellkulturüberstände mit Verdünnungspuffer war abhängig von der zu erwartenden Zytokinkonzentration und entsprach im Falle des IFN-γ ELISA nach Kultur von slanDC-aktivierten NK-Zellen 1:250. Die Standardreihe mit den Konzentrationen von 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,6 und 7,8 pg/ml resultierte aus der Verdünnung der Ausgangskonzentration des Standards (500 pg/ml) mit Verdünnungspuffer im Verhältnis 1:2. Als Null-Wert diente Verdünnungspuffer. Nach einer Inkubation von 2 h bei RT schlossen sich fünf Waschschritte mit Waschpuffer-2 und die darauf folgende Detektion der Zytokinmoleküle an. Dafür wurde der Zytokinspezifische Biotin-gekoppelte Detektionsantikörper und die Streptavidin-assoziierte Enzymreagenz 250-fach in Verdünnungspuffer verdünnt und die ELISA-Platte mit 100 µl dieses Konjugats pro Vertiefung für 1 h bei RT inkubiert. Im Anschluss erfolgten sieben weitere Waschschritte mit Waschpuffer-2 und das Zusetzen von 100 µl Substratpuffer pro Vertiefung. Die Farbreaktion, bei der das im Substratpuffer enthaltene 3, 3´, 5, 5´-Tetramethylbenzidin in einen blauen Farbstoff umgewandelt wurde, erfolgte unter Lichtabschluss bei RT und wurde je nach Farbintensität, jedoch 51 Material und Methoden spätestens nach 30 min durch Zugabe von 50 µl Stopplösung pro Vertiefung beendet. Anschließend ermöglichte die photometrische Messung der optischen Dichten bei 450/570 nm mittels TECAN SunriseTM die Berechnung der Zytokinkonzentrationen mithilfe der Standardreihe. 2.2.10 Immunhistochemie Die Methode der Immunhistochemie dient dem Nachweis von spezifischen Molekülen in Gewebeschnitten mithilfe von Antikörpern. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das immunhistochemische Färbeverfahren angewendet, um die Inzidenz nativer slanDCs im malignen Nierengewebe zu untersuchen. Dazu wurden im Zuge der Routinediagnostik Gewebeproben von Patienten mit klarzelligen NZKs entnommen. Von diesen Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Tumor-Biopsien wurden 3 - 4 µm dünne Schnitte angerfertigt, auf Objektträger überführt und vom Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Dresden zur Verfügung gestellt. Die Studie wurde durch die Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden genehmigt und die Patienten gaben ihre schriftliche Einwilligungserklärung. Zunächst fand die Entparaffinierung der Gewebeschnitte statt, indem die Objektträger mit den Schnitten im Wärmeschrank bei 60 °C und zweimal 15 min in Xylol (RT) inkubiert wurden. Anschließend erfolgte die Rehydrierung der Gewebeschnitte unter Verwendung einer absteigenden Alkoholreihe. Dafür wurden die Objektträger für jeweils 10 min zuerst in absolutem, vergällten Ethanol, dann zweimal in 96%igem Ethanol, anschließend in 80%igem Ethanol und schließlich in destilliertem Wasser inkubiert. Das für die Fixierung der Gewebeschnitte verwendete Formalin bedingt eine Quervernetzung der Proteine, wodurch die Erkennung von Epitopen durch entsprechende Antikörper behindert wird. Diese Quervernetzung wird durch eine sogenannte Antigendemaskierung teilweise wieder aufgehoben. Dazu wurden die Objektträger in eine Küvette mit vorgewärmtem Zitratpuffer gestellt und für 20 min in einem Dampfkocher inkubiert. Nach dem Abkühlen der Küvette auf RT wurden die Objektträger für 5 min in Waschpuffer-3 gespült. Die entparaffinierten und rehydrierten Gewebeschnitte wurden mit jeweils 200 µl des monoklonalen Antikörpers DD2 (in Verdünnungspuffer; 1:10) bedeckt und in einer Feuchtkammer über Nacht bei 4 °C inkubiert. Das Epitop für diesen primären 52 Material und Methoden Antikörper stellt die slan-Modifikation des PSGL-1 auf der Oberfläche von slanDCs dar. Nicht gebundene Antikörper wurden anschließend durch zweimal dreiminütiges Spülen mit Waschpuffer-3 entfernt. Es folgte die Inkubation der Gewebeschnitte mit 200 µl eines sekundären Dextran-markierten anti-Maus Antikörpers des auf Alkalischer Phosphatase (AP) basierenden EnVisionTM G|2 Detektions-Systems für 30 min bei RT in einer Feuchtkammer. Nach zwei weiteren dreiminütigen Waschschritten wurden die Gewebeschnitte mit je 200 µl Enzymlösung des EnVisionTM G|2 Detektions-Systems überschichtet und erneut für 30 min bei RT in der feuchten Kammer inkubiert. Es schlossen sich nochmals zwei dreiminütige Waschschritte an, bevor je 200 µl der Substratlösung auf die Objektträger gegeben wurde. Die Substratlösung setzte sich aus dem Substrat „Permanent-Red-Chromogen“ des EnVisionTM G|2 DetektionsSystems sowie Verdünnungspuffer im Verhältnis 1:100 zusammen. Die in der Enzymlösung enthaltene Alkalische Phosphatase führte während der 10-minütigen Reaktion zur Umsetzung des Substrates in ein stabiles, rot gefärbtes Endprodukt. Die Färbereaktion wurde durch Überführen der Objektträger in destilliertes Wasser abgestoppt. Durch eine 20- bis 50-sekündige Gegenfärbung der Gewebeschnitte mit Hämalaunlösung (1:10 verdünnt in Aqua dest.) und anschließendes Spülen der Objektträger mit destilliertem Wasser erfolgte schließlich die Visualisierung der Zellkerne des Gewebes. Die noch feuchten Gewebeschnitte wurden mit Eindeckmedium bedeckt und mit einem Deckgläschen versehen. Anschließend fand die Auswertung sowie Fotografie der Gewebeschnitte mithilfe des Mikroskops Axioskop, der Kamera AxioCam Cc1 sowie der Software AxioVision LE statt. Für die Quantifizierung von slanDCs in Gewebe-Biopsien klarzelliger NZKs wurden pro Tumorgewebe Schnitte von zwei bis fünf verschiedenen Bereichen im NZK untersucht. Die Bestimmung der slanDC-Zahl in angrenzenden Tumor-freien Geweben erfolgte durch die Untersuchung von zwei bis drei unterschiedlichen Bereichen pro Gewebe. Die positiv gefärbten Zellen in den Gewebeschnitten wurden gezählt und die durchschnittliche Anzahl der slanDCs pro Gewebeschnitt wurde ermittelt. Dieses arithmetische Mittel der slanDCs in einem NZK-Gewebe bzw. in einem Tumor-freien Gewebe (Fläche der Gewebeschnitte: 0,28 mm2) wurde auf die Fläche von 1 mm2 hochgerechnet. 53 Material und Methoden 2.2.11 Isolierung von Leukozyten aus Gewebe Die Isolierung von TILs diente der Charakterisierung von slanDCs in frischen klarzelligen NZK-Geweben. Die Grundlage bildete dabei der Gewebeaufschluss durch mechanische Verfahren sowie die Behandlung mit Enzymen. Maligne Nierengewebe wurden im Rahmen einer Nephrektomie von Patienten mit klarzelligem NZK erhalten. Frische, histopathologisch bestätigte klarzellige NZK-Gewebe wurden von der Klinik und Poliklinik für Urologie des Universitätsklinikums Dresden zur Verfügung gestellt. Genehmigt wurde diese Studie durch die Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden. Weiterhin gaben die Patienten eine schriftliche Einwilligungserklärung ab. Frisches NZK-Gewebe wurde in vorgekühltem HBSS-Puffer mit Calcium und Magnesium (HBSS + Ca/Mg) auf eine Größe von circa 1 mm3 zerkleinert und in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Nach viermaligem Waschen der Gewebestücken mit je 30 ml HBSS + Ca/Mg (2 min, 530 x g, 4 °C) wurde das Gewebe-Pellet in 30 ml Verdau-Puffer mit Enzymlösung aufgenommen und für 20 min bei RT auf dem Rotator inkubiert. Die in der Lösung enthaltenen Enzyme Kollagenase I-A sowie DNase I dienen dem Abbau von Kollagen im Bindegewebe und der Beseitigung freier DNA, was zum Aufschluss des Gewebes führt. Der durch eine Zentrifugation (5 min, 530 x g, 4 °C) gewonnene Überstand entsprach der ersten Fraktion TILs und wurde auf Eis aufbewahrt. Um die Calcium-Ionen für nachfolgende Schritte zu entfernen, wurde das Pellet für 5 min mit 30 ml HBSS ohne Ca/Mg auf dem Rotator inkubiert und anschließend zentrifugiert (5 min, 530 x g, 4 °C). Der Überstand (TIL-Fraktion 2) wurde auf Eis gestellt und das Gewebe für 20 min bei RT auf dem Rotator in 30 ml 5 mM EDTA in HBSS geschwenkt. Das Pellet wurde durch Zentrifugation (5 min, 530 x g, 4 °C) vom Überstand separiert (TIL-Fraktion 3) und erneut für 5 min mit 30 ml HBSS + Ca/Mg auf dem Rotator inkubiert, um die für die Kollagenase notwendigen Magnesium-Ionen einzubringen. Nach einem Zentrifugationsschritt (5 min, 530 x g, 4 °C) (Überstand = TIL-Fraktion 4) erfolgte wiederum der Gewebeverdau in 30 ml Verdau-Puffer mit Enzymlösung für 20 min bei RT auf dem Rotator. Der anschließend durch Zentrifugation (5 min, 530 x g, 4 °C) gewonnene Überstand (TIL-Fraktion 5) wurde ebenfalls bis zur weiteren Verwendung auf Eis aufbewahrt. Schließlich wurde das Pellet mithilfe eines sterilen Spritzen-Kolbens in HBSS + Ca/Mg durch ein Zellsieb (Porengröße 70 µm) passiert, um verbleibende Zellen zu vereinzeln und von Bindegewebsresten zu separieren. Die aufgefangene Zellsuspension (TIL-Fraktion 6) wurde gründlich resuspendiert, um durch die Scherkräfte einem Verklumpen der Zellen 54 Material und Methoden entgegenzuwirken. Alle TIL-Fraktionen wurden pelletiert (10 min, 530 x g, 4 °C), in HBSS + Ca/Mg über ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 µm gegeben und schließlich vereint. Die in der Zellsuspension vorhandenen Erythrozyten wurden durch eine 10-minütige Inkubation in 15 ml ACK-Lysepuffer bei RT unter Lichtabschluss lysiert. Es folgten zwei Waschschritte mit Waschpuffer-1 in einem Gesamtvolumen von 50 ml (10 min, 530 x g, 4 °C) und die Aufnahme der Zellen in Isolationspuffer. Anschließend wurde die Zellzahl eines Aliquots dieser Zellen verdünnt in Trypanblaulösung mittels Neubauer-Zählkammer bestimmt. Zur phänotypischen Charakterisierung wurden die frisch isolierten TILs unmittelbar mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert (siehe 2.2.4.3). 2.2.12 Statistik Unter Zuhilfenahme des Programmes „Microsoft Excel“ wurde die statistische Beurteilung der Zytokinquantifizierung im Zuge eines ELISA (siehe 2.2.9) vorgenommen. Bei der Darstellung der Ergebnisse handelt es sich um arithmetische Mittel aus Doppel- oder Dreifachbestimmungen. durchschnittlichen absoluten Abweichungen dieser Weiterhin wurden Messwerte vom die Mittelwert berechnet und als Fehlerbalken dargestellt. Da die Messwerte zwischen den untersuchten Spendern aufgrund von biologischen Schwankungen keine zusammenfassende Darstellung der Daten zuließen, wurden repräsentativ die Ergebnisse von drei Spendern abgebildet. Zur Berechnung der statistischen Signifikanz wurde basierend auf der Anzahl der Einzelmessungen der studentische t-Test unter der Annahme angewendet, dass die Stichproben einer normalverteilten bzw. annähernd normalverteilten Grundgesamtheit entstammen. Die Nullhypothese geht davon aus, dass die Differenzen der Messwertpaare gleich Null sind, während die Alternativhypothese einen Unterschied der beiden Größen beschreibt. Der zweiseitige, gepaarte studentische t-Test gibt die Wahrscheinlichkeit p an, mit der die Nullhypothese zutreffend ist. Das Signifikanzniveau wurde in den grafischen Abbildungen der Ergebnisse mit p ≤ 0,05 als signifikant (*) angegeben. 55 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Nachweis von slanDCs in klarzelligem NZK-Gewebe NZKs gelten als besonders immunogene Tumore. Diese Charakterisierung ist unter anderem auf die ausgeprägte Infiltration von NZK-Gewebe durch verschiedene Immunzellpopulationen zurückzuführen [GEIGER et al., 2009]. So wurden in zahlreichen Studien sowohl T-Lymphozyten als auch NK-Zellen in hoher Frequenz in NZK-Gewebe nachgewiesen [SCHLEYPEN et al., 2003; CÓZAR et al., 2005; REMARK et al., 2013]. Bisher ist jedoch nur sehr wenig über das Auftreten und die Eigenschaften von klassischen Subpopulationen humaner DCs in NZK-Geweben bekannt. SlanDCs stellen eine große Subpopulation humaner DCs im Blut dar und prägen verschiedenste proinflammatorische Eigenschaften aus, welche auch bei der antitumoralen Immunantwort eine wesentliche Rolle spielen könnten [SCHÄKEL et al., 1998; SCHMITZ et al., 2002; SCHMITZ et al., 2005; SCHÄKEL et al., 2006; WEHNER et al., 2009]. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden in ersten Experimenten NZK-Gewebe auf das Vorhandensein von slanDCs untersucht. Dafür wurden in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte von 10 Patienten mit klarzelligem NZK einem etablierten immunhistochemischen Färbeverfahren unterzogen (siehe 2.2.10). SlanDCs grenzen sich von anderen Zellpopulationen durch die selektive Ausprägung der slan-Modifikation am PSGL-1 ab [SCHÄKEL et al., 2002]. Die Färbung von im Gewebe vorhandenen slanDCs erfolgte aus diesem Grund mit einem spezifischen Antikörper gegen diese slan-Modifikation und einer anschließenden auf Alkalischer Phosphatase basierenden Enzymreaktion. Mittels Hämalaunlösung fand die Markierung von Zellkernen statt. Die in Abbildung 3 dargestellten mikroskopischen Aufnahmen zeigen repräsentativ den Nachweis von slanDCs in primären klarzelligen NZK-Geweben sowie in histologisch bestätigten Tumor-freien Geweben. 56 Ergebnisse Abbildung 3: Immunhistochemischer Nachweis von slanDCs in primären NZK-Geweben. Die Detektion von slanDCs in klarzelligen NZK-Geweben sowie angrenzenden Tumor-freien Geweben von 10 Patienten fand mittels immunhistochemischer Färbung statt. Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebsschnitte wurden entparaffiniert sowie rehydriert. Im Anschluss an eine Antigendemaskierung erfolgte die Detektion von slanDCs in den Gewebeschnitten mit dem slanDC-spezifischen monoklonalen Antikörper DD2. Zur Visualisierung der slanDCs wurde TM das „EnVision G|2 System/AP, Rabbit/Mouse (Permanent Red)“ Detektionssystem verwendet. Die Zellkernfärbung aller Gewebe fand mittels Hämalaunlösung nach Mayer statt. Dargestellt ist das Vorkommen von slanDCs in primärem klarzelligem NZK-Gewebe (A – 100-fache Vergrößerung, B – 200-fache Vergrößerung und G – 400-fache Vergrößerung). Als Kontrollen dienen Tumor-freies Gewebe (C – 100-fache Vergrößerung und D – 200-fache Vergrößerung) sowie klarzelliges NZK-Gewebe, bei dem die immunhistochemische Färbung ohne den monoklonalen Antikörper DD2 durchgeführt wurde (E – 100-fache Vergrößerung und F – 200-fache Vergrößerung). Neben der Präsenz von slanDCs im Stroma (B, D und G; schwarze Pfeile) wurde auch das Vorhandensein von slanDCs in Blutgefäßen nachgewiesen (G; weißer Pfeil). 57 Ergebnisse SlanDCs konnten in allen der 10 primären klarzelligen NZK-Gewebe nachgewiesen werden (Abbildung 3A, 3B und 3G). Die Anzahl der slanDCs im primären Tumorgewebe lag im Durchschnitt bei 4,41 slanDCs pro mm2 (Spanne: 2 1,57 - 10,11 Zellen/mm ; Tabelle 4). Neben dem Vorkommen von slanDCs im Stroma der untersuchten Tumorgewebe, konnten einzelne slanDCs im Lumen von Blutgefäßen detektiert werden (Abbildung 3G). In 8 der 10 untersuchten Tumor-freien Gewebe wurden ebenfalls slanDCs detektiert (Abbildung 3C und 3D). Mit durchschnittlich 1,78 slanDCs pro mm2 (Spanne: 0 - 5,14 Zellen/mm2; Tabelle 4) war das Vorkommen von slanDCs in den Schnitten der Tumor-freien Gewebe jedoch geringer, als in den analysierten NZK-Gewebeschnitten. NZK-Gewebeschnitte, welche ebenfalls dem immunhistochemischen Färbeverfahren – jedoch ohne Zugabe des slanDC- spezifischen monoklonalen Antikörpers DD2 – unterzogen wurden, dienten als Negativkontrolle. In den als Negativkontrolle eingesetzten Gewebeschnitten wurden keine Zellen gefärbt (Abbildung 3E und 3F). Die dargelegten Ergebnisse zeigen erstmals die Präsenz von slanDCs in primären klarzelligen NZK-Geweben. Zusätzlich zu den primären NZK-Geweben wurden 3 Lymphknotenmetastasen sowie 9 Fernmetastasen (darunter unter anderem Knochen-, Lungen- und Nebennierenmetastasen) der insgesamt 10 NZK-Patienten auf das Vorliegen von slanDCs untersucht. Die in Abbildung 4 dargestellten mikroskopischen Aufnahmen zeigen exemplarisch die Präsenz von slanDCs in Gewebeschnitten von Lymphknotenmetastasen (Abbildung 4A und 4B) und Nebennierenmetastasen (Abbildung 4C und 4D). In allen untersuchten Lymphknotenmetastasen sowie in 8 der 9 Fernmetastasen konnten slanDCs nachgewiesen werden. Durchschnittlich konnten in den Lymphknotenmetastasen 2,61 slanDCs pro mm2 (Spanne: 1,39 - 4,08 Zellen/mm2) und in den Fernmetastasen 2,67 slanDCs pro mm2 (Spanne: 0 - 5,55 Zellen/mm2) detektiert werden (Tabelle 4). Die Beobachtungen lassen darauf schließen, dass slanDCs in primären klarzelligen NZK-Geweben akkumulieren und zudem in Lymphknotenmetastasen sowie Fernmetastasen von Patienten mit klarzelligem NZK vorliegen. 58 Ergebnisse Abbildung 4: Immunhistochemischer Nachweis von slanDCs in NZK-Metastasen. Das immunhistochemische Färbeverfahren wurde eingesetzt, um slanDCs in Gewebeschnitten von 3 Lymphknotenmetastasen sowie 9 Fernmetastasen von insgesamt 10 Patienten zu detektieren. Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte der NZK-Metastasen wurden entparaffiniert und rehydriert. Es folgte eine Antigendemaskierung und im Anschluss die Detektion von slanDCs mit dem monoklonalen Antikörper DD2. Die Visualisierung der slanDCs TM erfolgte daraufhin mit dem „EnVision G|2 System/AP, Rabbit/Mouse (Permanent Red)“ Detektionssystem. Mittels Hämalaunlösung nach Mayer wurden die Zellkerne gefärbt. Dargestellt ist die Präsenz von slanDCs (schwarze Pfeile) in Lymphknotenmetastasen (A –100-fache Vergrößerung und B – 400-fache Vergrößerung) und Nebennierenmetastasen (C – 100-fache Vergrößerung und D – 400-fache Vergrößerung) von NZK-Patienten. 59 Ergebnisse Tabelle 4: Anzahl der slanDCs in Gewebeschnitten von NZK-Patienten Patienten Nummer Anzahl an slanDCs pro mm 2 primäres NZK Tumor-freies Gewebe Lymphknotenmetastase 1 9,89 0,79 4,75 2 1,57 3,57 1,18 3 5,54 5,14 5,36 4 3,54 1,18 0,59 5 1,99 0 0 6 2,75 4,16 2,36 2,19 7 10,11 1,18 1,39 1,09 8 2,78 0,6 9 3,54 1,18 10 2,38 0 4,08 3,28 Mittelwert 4,41 1,78 2,61 2,67 Fernmetastase 5,55 Immunhistochemische Färbungen wurden durchgeführt, um slanDCs in Geweben von 10 Patienten mit klarzelligem NZK zu detektieren. Positiv gefärbte slanDCs wurden gezählt und ihre Anzahl pro Quadratmillimeter wurde ermittelt. Mittelwert = arithmetisches Mittel. 3.2 Charakterisierung von slanDCs aus klarzelligem NZKGewebe DCs stellen maßgebliche Akteure bei der Induktion und Regulation sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems dar. Auf diese Weise übernehmen sie eine bedeutende Rolle bei der Tumor-gerichteten Immunantwort. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden slanDCs mithilfe eines etablierten immunhistochemischen Färbeverfahrens in klarzelligen NZK-Geweben nachgewiesen (siehe 3.1). Um tiefere Einblicke in die in vivo-Situation von slanDCs in klarzelligen NZK-Geweben zu erlangen, erfolgte die Untersuchung von Oberflächenmolekülen sowie der Zytokinexpression von NZK-infiltrierenden slanDCs. Dazu wurden mittels Gewebeaufschluss Zellsuspensionen aus frischen, klarzelligen NZK-Geweben von 10 Patienten gewonnen. Der Gewebeaufschluss fand durch mechanische Behandlung 60 Ergebnisse sowie die Verwendung von Kollagenase I-A und DNase I statt (siehe 2.2.11). Die gewonnene Zellsuspension wurde mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gefärbt und schließlich durchflusszytometrisch analysiert (siehe 2.2.4.3). Mithilfe der in Abbildung 2 (siehe 2.2.4.3) dargestellten „Gating“-Strategie erfolgte die Identifikation von slanDCs als CD45+ CD3- CD11c+ slan+ Zellen. Abbildung 5 gibt die Charakterisierung der NZK-infiltrierenden slanDCs in Bezug auf ausgewählte Oberflächenmoleküle sowie Zytokine wieder. Etwa 100 % der slanDCs exprimierten den Fcγ-Rezeptor CD16 (Abbildung 5). Das MHC-Klasse II-Molekül HLA-DR wurde ebenfalls von annähernd 100 % der Zellen ausgeprägt, während die Expression des kostimulatorischen Moleküls CD86 bei 84 % der slanDCs nachgewiesen werden konnte. Interessanterweise waren weder die kostimulatorischen Moleküle CD40 und CD80 detektierbar, noch war der Reifungsmarker CD83 bei mehr als 5 % der slanDCs nachweisbar. Der Chemokinrezeptor CCR7 war ebenfalls nicht detektierbar. Dahingegen konnte die Expression der beiden inhibitorischen Rezeptoren „immunoglobulin-like transcript“ (ILT)3 und ILT4 auf 71 % bzw. 99 % der slanDCs nachgewiesen werden. Im Hinblick auf die Bildung proinflammatorischer Zytokine durch NZK-infiltrierende slanDCs war zu beobachten, dass weder TNF-α, noch IL-12 produziert wird. Stattdessen wurde von 24 % der Zellen das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 gebildet. Dieser in Abbildung 5 illustrierte Phänotyp lässt darauf schließen, dass es sich bei den klarzelligen NZKs-infiltrierenden slanDC um unreife DCs handelt, welche zusätzlich aufgrund der Expression von ILT3 und ILT4 sowie der Produktion von IL-10 durch anti-inflammatorische Eigenschaften gekennzeichnet sind. Die beschriebenen Eigenschaften der slanDCs deuten auf einen tolerogenen Phänotyp hin. 61 Ergebnisse Abbildung 5: SlanDCs in klarzelligen NZKs weisen einen tolerogenen Phänotyp auf. Durch enzymatische Behandlung sowie mechanische Verfahren wurden Zellsuspensionen aus frischen klarzelligen NZK-Geweben gewonnen. Die Analyse der Zellen fand durch Färbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und anschließende Messung mittels Durchflusszytometer + + + statt. Die in den Zellsuspensionen enthaltenen slanDCs wurden als CD45 CD3 CD11c slan Zellen definiert. Diese wurden auf die Expression weiterer Oberflächenmoleküle sowie Zytokine untersucht. Dargestellt sind die Ergebnisse eines repräsentativen NZK-Gewebes aus einer Auswahl von 10 Geweben mit ähnlichen Ergebnissen. Es ist der prozentuale Anteil der, für das jeweilige Molekül, positiv gefärbten Zellen angegeben. Gefärbte slanDCs (schwarz gefüllte Graphen) sind im Vergleich zu ungefärbten slanDCs als Kontrollen dargestellt (graue Graphen). 62 Ergebnisse 3.3 Einfluss von NZK-Zellen auf die slanDC-induzierte T-ZellProliferation Aktivierte slanDCs sind in der Lage, Effektorzellen des adaptiven Immunsystems zu stimulieren und deren Expansion zu induzieren. Sie gelten als effiziente Stimulatoren sowohl von Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen als auch von Tumor-reaktiven CD8+ T-Lymphozyten [SCHÄKEL et al., 1998; SCHÄKEL et al., 2002]. Vorherige Experimente zeigten, dass NZK-infiltrierende slanDCs einen tolerogenen Phänotyp ausprägen (siehe 3.2). Aufbauend auf diesen Grundlagen war ein Ziel der vorliegenden Arbeit, die Wirkung der kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Linien ACHN und Caki-1 sowie der primären klarzelligen NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC auf die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten zu evaluieren. 3.3.1 Wirkung von NZK-Zellen auf die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ T-Zellen Über die Peptidpräsentation mittels MHC-Klasse II-Molekülen ist es slanDCs möglich, CD4+ T-Zellen zu aktivieren. Weiterhin fördern slanDCs die Differenzierung von aktivierten CD4+ T-Lymphozyten in funktionell unterschiedliche Populationen, zu denen unter anderem TH1-Zellen zählen [SCHÄKEL et al., 2002; SCHÄKEL et al., 2006; HÄNSEL et al., 2011]. Besonders diese Subpopulation CD4+ Effektor-T-Zellen erfüllt wichtige Aufgaben im Zuge einer antitumoralen Immunantwort. Dazu zählt neben der Modulation von Immunantworten durch die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen auch die Stimulation von aktivierten Antigen-spezifischen APCs, was in einer gesteigerten Kapazität der APCs zur Aktivierung von CD8+ T-Zellen resultiert [OSTRAND-ROSENBERG, 2005]. Die selektive Ausprägung der slan-Modifikation am PSGL-1 von slanDCs und die damit verbundene Abgrenzung von anderen DC-Subpopulationen ermöglicht die Isolation und somit die phänotypische sowie funktionelle Charakterisierung von slanDCs. Über diese spezifische Modifikation wurden slanDCs immunmagnetisch aus dem Blut gesunder Spender isoliert (siehe 2.2.3.1). Um den Effekt von NZK-Zellen auf die Funktionalität von slanDCs zur Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten zu untersuchen, wurden diese frisch isolierten slanDCs in An- oder Abwesenheit der Zelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC oder MZ2877RC kultiviert (siehe 2.2.5). Ausgehend von der 63 Ergebnisse Beobachtung durch Schäkel et al., dass frisch aus PBMCs isolierte slanDCs innerhalb von 6 h in vitro einer spontanen Reifung unterliegen [SCHÄKEL et al., 2006], erfolgte die Kokultivierung von slanDCs und NZK-Zellen für 6 h. Anschließend wurden die slanDCs von den NZK-Zellen separiert und daraufhin mit allogenen eFluor® 670-gefärbten CD4+ T-Zellen inkubiert (siehe 2.2.6). Nach 7 d erfolgte die Analyse der T-Zellen durch Färbung mit einem fluoreszenzmarkierten anti-CD4-Antikörper und anschließender Messung mittels Durchflusszytometer (siehe 2.2.4.1). Die in Abbildung 6 dargestellten Ergebnisse bestätigten zunächst, dass slanDCs in der Lage sind, die Proliferation von CD4+ T-Zellen anzuregen. Dies war in der Reduktion des MFI vom Lebendfarbstoff eFluor® 670 zu erkennen. Die alleinige Kultivierung von CD4+ T-Zellen führte hingegen zu keiner T-Zell-Expansion und diente als Bezugspunkt für die Auswertung stimulierter CD4+ T-Lymphozyten. Interessanterweise hatten die Tumorzellen der Linien ACHN (Abbildung 6A), Caki-1 (Abbildung 6B), MZ1257RC (Abbildung 6C) und MZ2877RC (Abbildung 6D) eine inhibierende Wirkung auf die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ T-Lymphozyten, was an einer deutlichen Abnahme der Prozente proliferierter Zellen zu beobachten war. 64 Ergebnisse + Abbildung 6: Inhibition der slanDC-vermittelten Proliferation von CD4 T-Zellen durch 5 NZK-Zellen. NZK-Zellen (3 x 10 Zellen/Well) der Linien ACHN (A), Caki-1 (B), MZ1257RC (C) 6 bzw. MZ2877RC (D) wurden für 6 h mit slanDCs (1 x 10 Zellen/Well) kokultiviert. Im Anschluss 4 an die Separation der slanDCs von den Tumorzellen erfolgte die Kultivierung von 1 x 10 ® + 5 slanDCs/Well mit allogenen, eFluor 670-gefärbten CD4 T-Zellen (1 x 10 Zellen/Well) für 7 d. + Die Bestimmung der Proliferationsrate der CD4 T-Zellen erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Pro NZK-Zelllinie ist ein repräsentativer slanDC-Spender aus einer Auswahl von vier Spendern + mit ähnlichen Ergebnissen dargestellt. Angegeben ist der prozentuale Anteil proliferierter CD4 + T-Zellen. Graue Graphen repräsentieren nicht proliferierte CD4 T-Zellen und dienen als Bezug + für die Bestimmung der Anzahl proliferierter CD4 T-Zellen, die als schwarz gefüllte Graphen dargestellt sind. 65 Ergebnisse Eine Reinheitsfärbung der geernteten slanDCs nach der sechsstündigen Kokultivierung mit Tumorzellen ergab eine Verunreinigung der slanDCs mit 2 - 15 % NZK-Zellen. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde in weiteren Experimenten untersucht, ob eine 15%ige Verunreinigung der slanDCs durch Tumorzellen einen direkten Einfluss auf die Expansion von CD4+ T-Lymphozyten hat. Dafür wurden eFluor® 670-gefärbte CD4+ T-Zellen mit 1,5 x 103 Zellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC oder MZ2877RC inkubiert. Die Aktivierung der T-Lymphozyten in diesem Kontrollexperiment erfolgte mit anti-CD3/CD28 Dynabeads® sowie dem T-Zell-Wachstumsfaktor IL-2 (siehe 2.2.6). Die Analyse der T-Zellen nach 7 d in Kokultur ergab keine relevanten Unterschiede in den Proliferationsraten allein kultivierter und mit NZK-Zellen kultivierter CD4+ T-Lymphozyten (Abbildung 7). Diese Ergebnisse zeigen, dass die NZK-Zellen bei einer 15%igen Verunreinigung der slanDCs durch Tumorzellen keinen direkten Einfluss auf die Proliferation von stimulierten CD4+ T-Lymphozyten haben. Zusammenfassend weisen die gewonnenen Erkenntnisse darauf hin, dass die vier untersuchten NZK-Zelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC und MZ2877RC in der Lage sind, die Kapazität von slanDCs zur Induktion der Proliferation von CD4+ T-Lymphozyten zu hemmen. 66 Ergebnisse + Abbildung 7: Einfluss von NZK-Zellen auf die Proliferation aktivierter CD4 T-Zellen. ® + 5 eFluor 670-gefärbte CD4 T-Zellen (1 x 10 Zellen/Well) wurden mit anti-CD3/CD28 Beads 3 sowie IL-2 stimuliert und für 7 d mit NZK-Zellen (1,5 x 10 Zellen/Well) der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC bzw. MZ2877RC kokultiviert. Anschließend erfolgte die Bestimmung der + Proliferationsrate der CD4 T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Abgebildet ist ein repräsentativer Spender aus drei Spendern mit vergleichbaren Ergebnissen. Der Anteil + proliferierter CD4 T-Zellen ist in Prozent angegeben. Graue Graphen stellen nicht proliferierte + CD4 T-Zellen dar und bilden den Bezugspunkt für die Bestimmung der Anzahl proliferierter + CD4 T-Zellen, welche als schwarz gefüllte Graphen dargestellt sind. 67 Ergebnisse 3.3.2 Effekt von NZK-Zellen auf die slanDC-vermittelte Proliferation von CD8+ T-Zellen Neben ihrer Fähigkeit CD4+ T-Lymphozyten zu stimulieren, sind slanDCs als Schnittstelle zwischen angeborener und adaptiver Immunabwehr auch in der Lage, Alloantigen-spezifische CD8+ T-Zellen zu aktivieren [SCHÄKEL et al., 1998; SCHÄKEL et al., 2002]. CD8+ T-Lymphozyten zählen durch ihre zytotoxischen Fähigkeiten zu den wichtigsten antitumoralen Effektorzellen des Immunsystems [RUFFELL et al., 2010]. Um den Effekt der NZK-Zelllinien ACHN und Caki-1 sowie der primären NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC auf die slanDC-vermittelte Proliferation von + CD8 T-Lymphozyten zu untersuchen, erfolgte die immunmagnetische Isolation von slanDCs und CD8+ T-Zellen aus dem Blut gesunder Spender (siehe 2.2.3). Die slanDCs wurden in An- oder Abwesenheit von NZK-Zellen kultiviert (siehe 2.2.5). Nach 6 h folgte die Separation der slanDCs von den adhärenten Tumorzellen und ihre Kokultivierung mit allogenen, eFluor® 670-gefärbten CD8+ T-Lymphozyten für 7 d (siehe 2.2.6). Der prozentuale Anteil proliferierender T-Zellen wurde durch Färbung mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen CD8 und anschließende Durchflusszytometrie bestimmt (siehe 2.2.4.1). Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analysen sind in Abbildung 8 dargestellt. Die Inkubation von allogenen slanDCs mit CD8+ T-Lymphozyten führte zu einer effizienten Aktivierung und Proliferation der T-Zellen, was in einer Abnahme der Fluoreszenzintensität des Lebensfarbstoffes eFluor® 670 in den betreffenden Zellen erfasst werden konnte. Während die Proliferationsrate von CD8+ T-Zellen nach Kultivierung der slanDCs in Anwesenheit von Caki-1 bzw. ACHN im Vergleich zu allein inkubierten slanDCs deutlich geringer war (Abbildung 8A und 8B), schienen die primären Zelllinien MZ1257RC (Abbildung 8C) sowie MZ2877RC (Abbildung 8D) keinen Einfluss auf die slanDC-induzierte CD8+ T-Zell-Proliferation auszuüben. 68 Ergebnisse + Abbildung 8: Hemmung der slanDC-vermittelten Proliferation von CD8 T-Zellen durch 5 NZK-Zellen. Es erfolgte die Kokultivierung von NZK-Zellen (3 x 10 Zellen/Well) der Linien 6 ACHN (A), Caki-1 (B), MZ1257RC (C) bzw. MZ2877RC (D) mit slanDCs (1 x 10 Zellen/Well) 4 für 6 h. Anschließend an die Separation der slanDCs von den Tumorzellen wurden 2 x 10 ® + 5 slanDCs/Well für 7 d mit allogenen, eFluor 670-gefärbten CD8 T-Zellen (1 x 10 Zellen/Well) + inkubiert. Zur Evaluation der Ergebnisse fand die Bestimmung der Proliferationsrate der CD8 T-Zellen mittels Durchflusszytometrie statt. Pro NZK-Zelllinie ist ein repräsentativer Spender + aus vier Spendern mit ähnlichen Ergebnissen abgebildet. Der Anteil proliferierter CD8 T-Zellen + ist in Prozent angegeben. Schwarz gefüllte Graphen repräsentieren proliferierte CD8 T-Zellen, + als Bezug dienen nicht proliferierte CD8 T-Zellen, welche als graue Graphen dargestellt sind. 69 Ergebnisse Eine Reinheitsfärbung der slanDCs nach der Trennung von den adhärenten Tumorzellen verdeutlichte, dass eine Verunreinigung der slanDCs mit Tumorzellen von 2 - 15 % vorlag. Um einen direkten Einfluss dieser NZK-Zellen auf CD8+ T-Zellen auszuschließen, wurden eFluor® 670-gefärbte CD8+ T-Lymphozyten mit Tumorzellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC bzw. MZ2877RC inkubiert. Die Aktivierung der T-Lymphozyten bei diesem Kontrollexperiment erfolgte durch anti-CD3/CD28 ® Dynabeads sowie dem T-Zell-Wachstumsfaktor IL-2 (siehe 2.2.6). Nach 7 d in Kultur fand die Ermittlung der Proliferationsrate von CD8+ T-Zellen statt. Die in Abbildung 9 dargestellten Resultate machten deutlich, dass die untersuchten NZK-Zelllinien nicht zu einer direkten Hemmung der Proliferation von stimulierten CD8+ T-Lymphozyten fähig sind. Eine 15%ige Verunreinigung der slanDCs durch NZK-Zellen hat folglich keinen direkten Einfluss auf die Proliferation von stimulierten CD8+ T-Lymphozyten. Zusammenfassend deuten die Beobachtungen darauf hin, dass die NZK-Zelllinien ACHN sowie Caki-1 die Fähigkeit besitzen, das Potenzial von slanDCs zur Aktivierung von CD8+ T-Lymphozyten zu inhibieren. 70 Ergebnisse + Abbildung 9: Wirkung von NZK-Zellen auf die Proliferation aktivierter CD8 T-Zellen. ® + 5 eFluor 670-gefärbte CD8 T-Zellen (1 x 10 Zellen/Well) wurden mit anti-CD3/CD28 Beads und 3 IL-2 aktiviert und für 7 d mit NZK-Zellen (3 x 10 Zellen/Well) der Linien ACHN, Caki-1, + MZ1257RC bzw. MZ2877RC kokultiviert. Die Ermittlung der Proliferationsrate der CD8 T-Zellen erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Repräsentativ ist das Ergebnis von einem Spender aus einer Auswahl von drei Spendern mit vergleichbaren Ergebnissen dargestellt. Der + Anteil proliferierter CD8 T-Zellen ist in Prozent angegeben. Graue Graphen stellen nicht + proliferierte CD8 T-Zellen dar und repräsentieren den Bezug für die Bestimmung der Anzahl + proliferierter CD8 T-Zellen, welche als schwarz gefüllte Graphen abgebildet sind. 71 Ergebnisse 3.3.3 Bedeutung des direkten Zell-Zell-Kontaktes bei der funktionellen Inhibition von slanDCs durch NZK-Zellen Ausgehend von der Erkenntnis, dass alle vier untersuchten NZK-Zelllinien in der Lage waren, die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ T-Lymphozyten zu inhibieren (siehe 3.3.1), ergab sich die Fragestellung, ob lösliche oder membranständige Moleküle der Tumorzellen für die Hemmung der Funktionalität der slanDCs verantwortlich sind. Um dies zu überprüfen, wurden frisch isolierte slanDCs aus gesunden Spendern mit den Tumorzelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC oder MZ2877RC inkubiert (siehe 2.2.5). Die sechsstündige Kokultivierung fand entweder mit oder ohne eine separierende Membran (Transwell) statt, welche den direkten Zell-Zell-Kontakt zwischen slanDCs und Tumorzellen verhinderte, jedoch den Austausch von löslichen Molekülen wie Zytokinen ermöglichte (siehe 2.2.5). Die slanDCs wurden anschließend geerntet und mit allogenen, eFluor® 670-gefärbten CD4+ T-Lymphozyten kokultiviert (siehe 2.2.6). Die Analyse der T-Zellen nach 7 d erfolgte wiederum durch Färbung mit einem fluoreszenzmarkierten anti-CD4-Antikörper und anschließender Messung mittels Durchflusszytometer (siehe 2.2.4.1). In der Abbildung 10 sind pro NZK-Zelllinie die Ergebnisse für einen repräsentativen Spender dargestellt. Die Resultate bestätigten die unter Gliederungspunkt 3.3.1 nachgewiesene inhibierende Wirkung der NZK-Zelllinien ACHN und Caki-1 sowie der primären NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC auf die slanDC-induzierte + Proliferation von CD4 T-Zellen. Weiterhin wurde deutlich, dass die im Zuge der Transwell-Untersuchungen mittels Membran von den slanDCs getrennten NZK-Zellen keinen hemmenden Einfluss auf die slanDC-vermittelte Expansion von CD4+ T-Lymphozyten haben. Für die Zelllinien ACHN (Abbildung 10A), Caki-1 (Abbildung 10B), MZ1257RC (Abbildung 10C) und MZ2877RC (Abbildung 10D) konnte die inhibierende Wirkung der Tumorzellen auf die Funktionalität der slanDCs durch die Anwesenheit eines separierenden Transwells aufgehoben werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass membranständige Moleküle der vier NZK-Zelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC und MZ2877RC für die Inhibition der slanDC-vermittelten Proliferation von CD4+ T-Zellen verantwortlich sind. 72 Ergebnisse 73 Ergebnisse Abbildung 10: Einfluss einer separierenden Membran auf die Hemmung der slanDC+ 5 vermittelten Proliferation von CD4 T-Zellen durch NZK-Zellen. NZK-Zellen (3 x 10 Zellen/Well) der Linien ACHN (A), Caki-1 (B), MZ1257RC (C) bzw. MZ2877RC (D) wurden in An- oder Abwesenheit von separierenden Zellkulturplatten-Einsätzen (Transwells, 6 Porendurchmesser 0,45 µm) für 6 h mit slanDCs (1 x 10 Zellen/Well) kultiviert. Anschließend 4 ® wurden die slanDCs geerntet und 1 x 10 slanDCs/Well mit allogenen, eFluor 670-gefärbten + 5 + CD4 T-Zellen (1 x 10 Zellen/Well) inkubiert. Die Bestimmung der Proliferationsrate der CD4 T-Zellen erfolgte nach 7 d mittels Durchflusszytometrie. Pro NZK-Zelllinie ist ein repräsentativer Spender aus einer Auswahl von vier Spendern mit analogen Ergebnissen dargestellt. + Angegeben ist der Anteil proliferierter CD4 T-Zellen in Prozent. Graue Graphen repräsentieren + nicht proliferierte CD4 T-Zellen und dienen als Bezug für die Bestimmung der Anzahl + proliferierter CD4 T-Zellen, die als schwarz gefüllte Graphen dargestellt sind. 3.4 Die Rolle koinhibitorischer B7-Moleküle bei der funktionellen Hemmung von slanDCs durch NZK-Zellen Vier koinhibitorisch wirkende B7-Moleküle wurden in den letzten Jahren besonders häufig im Zusammenhang mit einer Modulation der antitumoralen Immunantwort und einer Immunevasion durch Tumore diskutiert. Eine Vielzahl von Studien demonstrierten eine erhöhte Expression der Moleküle B7-H1, B7-H3, B7-H4 sowie B7-DC in verschiedensten humanen Tumoren und zeigten zum Teil darüber hinaus einen Zusammenhang der B7-Moleküle mit der Pathogenese oder der Progression entsprechender Tumore [FLIES UND CHEN, 2007; SELIGER UND QUANDT, 2012]. Aus diesem Grund wurde im Folgenden die Rolle von B7-H1, B7-H3, B7-H4 und B7-DC bei der Wechselwirkung der NZK-Linien ACHN und Caki-1 sowie der primären NZKZelllinien MZ1257RC und MZ2877RC mit slanDCs untersucht. 3.4.1 Expression von koinhibitorischen B7-Molekülen auf NZK-Zellen Die Ausprägung koinhibitorischer B7-Moleküle durch NZK-Zellen wurde in vergangenen Studien unter anderem bereits für die Moleküle B7-H1 [THOMPSON et al., 2004; THOMPSON et al., 2005; THOMPSON et al., 2006; JILAVEANU et al., 2014], B7-H3 [CRISPEN et al., 2008; QIN et al., 2013] sowie B7-H4 [KRAMBECK et al., 2006; JUNG et al., 2011; ZHANG et al., 2013] nachgewiesen. Um einen potenziellen Zusammenhang zwischen den koinhibitorischen B7-Molekülen und der funktionellen Hemmung von slanDCs durch NZK-Zellen zu ermitteln, wurde zunächst die Expression von B7-H1, B7-H3, B7-H4 sowie B7-DC auf Zellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC und 74 Ergebnisse MZ2877RC bestimmt. fluoreszenzmarkierten Dafür erfolgte Antikörpern und die Färbung der die anschließende Tumorzellen Analyse mit mittels Durchflusszytometrie (siehe 2.2.4.1). In den Abbildung 11 bis 14 sind die Resultate der durchflusszytometrischen Analysen der NZK-Zellen dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Molekül B7-H1 mit 29 - 58 % deutlich auf der Oberfläche der Tumorzelllinien ACHN (Abbildung 11A), Caki-1 (Abbildung 12A), MZ1257RC (Abbildung 13A) und MZ2877RC (Abbildung 14A) exprimiert wird. Darüber hinaus fand die Ausprägung des Moleküls B7-H3 bei etwa 100 % der Tumorzellen von den Linien ACHN (Abbildung 11B), Caki-1 (Abbildung 12B), MZ1257RC (Abbildung 13B) und MZ2877RC (Abbildung 14B) statt. Die Expression des koinhibitorischen Moleküls B7-H4 konnte hingegen für keine der vier untersuchten Tumorzelllinien nachgewiesen werden (Abbildung 11C, Abbildung 12C, Abbildung 13C und Abbildung 14C). Auch der prozentuale Anteil B7-DC-exprimierender Tumorzellen war mit maximal 6 % bei den vier untersuchten NZK-Zelllinien gering (Abbildung 11D, Abbildung 12D, Abbildung 13D und Abbildung 14D). 75 Ergebnisse Abbildung 11: Expression von koinhibitorischen B7-Molekülen durch die NZK-Zelllinie ACHN. Die Analyse der Oberflächenmoleküle B7-H1 (A), B7-H3 (B), B7-H4 (C) sowie B7-DC (D) erfolgte durch Färbung der ACHN-Zellen mit FITC- bzw. PE-markierten Antikörpern und anschließende Messung mittels Durchflusszytometer. Repräsentativ ist das Ergebnis einer Färbung von Zellen der NZK-Linie ACHN aus vier Experimenten mit ähnlichen Resultaten abgebildet. Gegen das entsprechende Oberflächenmolekül gefärbte Tumorzellen (schwarz gefüllte Graphen) sind im Vergleich zu den analogen ungefärbten NZK-Zellen als Kontrollen dargestellt (graue Graphen). Die angegebenen Werte repräsentieren den Anteil positiv gefärbter Zellen in Prozent sowie deren MFI. 76 Ergebnisse Abbildung 12: Ausprägung von koinhibitorischen B7-Molekülen durch die Tumorzelllinie Caki-1. Zellen der NZK-Linie Caki-1 wurden mit FITC- bzw. PE-markierten Antikörperm gegen die Oberflächenmoleküle B7-H1 (A), B7-H3 (B), B7-H4 (C) sowie B7-DC (D) gefärbt. Die Analyse der Zellen fand anschließend durchflusszytometrisch statt. Dargestellt ist das repräsentative Ergebnis einer Färbung von Caki-1-Zellen aus vier Experimenten mit vergleichbaren Resultaten. Die Graphen der gefärbten Zellen (schwarz gefüllte Graphen) im Vergleich zu den entsprechenden ungefärbten Zellen als Kontrolle (graue Graphen) sind abgebildet. Die angegebenen Werte repräsentieren den Anteil positiv gefärbter Zellen in Prozent sowie deren MFI. 77 Ergebnisse Abbildung 13: Expression von koinhibitorischen B7-Molekülen durch Zellen der primären NZK-Linie MZ1257RC. Die Oberflächenmoleküle B7-H1 (A), B7-H3 (B), B7-H4 (C) sowie B7-DC (D) auf MZ1257RC-Zellen wurden mit FITC- bzw. PE-markierten Antikörpern gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Die Resultate einer repräsentativen Färbung von Zellen der NZK-Linie MZ1257RC aus einer Auswahl von vier Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen sind abgebildet. Dargestellt sind die gefärbten Tumorzellen (schwarz gefüllte Graphen) sowie die als Kontrolle eingesetzten ungefärbten NZK-Zellen (graue Graphen). Angegebenen sind weiterhin die Werte der prozentualen Anteile positiv gefärbter Zellen sowie deren MFI. 78 Ergebnisse Abbildung 14: Ausprägung von koinhibitorischen B7-Molekülen durch die primäre Tumorzelllinie MZ2877RC. Die Analyse der Oberflächenmoleküle B7-H1 (A), B7-H3 (B), B7-H4 (C) sowie B7-DC (D) erfolgte durch Färbung der MZ2877RC-Zellen mit FITC- bzw. PEmarkierten Antikörpern und anschließende Messung mittels Durchflusszytometer. Abgebildet ist eine repräsentative Färbung von Zellen der NZK-Linie MZ2877RC aus einer Auswahl von vier Experimenten mit vergleichbaren Ergebnissen. In den Histogrammen sind die schwarz gefüllten Graphen gefärbter Zellen im Vergleich zu den entsprechenden ungefärbten Zellen als Kontrolle (graue Graphen) dargestellt. Die angegebenen Werte repräsentieren den Anteil positiv gefärbter Zellen in Prozent sowie deren MFI. 3.4.2 Einfluss von B7-H1 sowie B7-H3 auf die Hemmung der slanDCvermittelten CD4+ T-Zell-Proliferation durch NZK-Zellen Die Vorbehandlung von slanDCs mit den NZK-Zelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC oder MZ2877RC führte jeweils zu einer deutlichen Inhibition der slanDC-induzierten Proliferation von CD4+ T-Zellen (siehe 3.3.1). Weitere Experimente demonstrierten, dass diese funktionelle Hemmung der slanDCs durch das Unterbinden eines direkten Zell-Zell Kontaktes zwischen slanDCs und Tumorzellen aufgehoben wird (siehe 3.3.3). In diesem Zusammenhang sollte die Rolle der koinhibitorischen Moleküle B7-H1 sowie B7-H3 untersucht werden, welche beide auf allen vier untersuchten NZK-Zelllinien exprimiert werden (siehe 3.4.1). Der Rezeptor für B7-H3 wurde bisher nicht identifiziert. Mit PD-1 ist jedoch der koinhibitorische Rezeptor für B7-H1 bekannt [MOMTAZ UND POSTOW , 2014]. Aus diesem Grund wurde die Ausprägung von PD-1 auf slanDCs 79 Ergebnisse durch die Färbung mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper und anschließende Durchflusszytometrie (siehe 2.2.4.1) bestimmt. Die in der Abbildung 15 dargestellten Ergebnisse der durchflusszytometrischen Untersuchung zeigten, dass annähernd 100 % der slanDCs auf ihrer Zelloberfläche PD-1 exprimieren. Abbildung 15: PD-1-Expression auf slanDCs. SlanDCs wurden mit einem FITC-markierten Antikörper gegen das Oberflächenmolekül PD-1 gefärbt. Anschließend fand die durchflusszytometrische Analyse der Zellen statt. Repräsentativ ist das Ergebnis von einem aus fünf slanDC-Spendern mit ähnlichen Resultaten dargestellt. Die Graphen der gefärbten Zellen (schwarz gefüllte Graphen) sind im Vergleich zu den entsprechenden ungefärbten Zellen als Kontrolle (graue Graphen) abgebildet. Die angegebenen Werte repräsentieren den Anteil positiv gefärbter Zellen in Prozent sowie deren MFI. Um den Einfluss von B7-H1 sowie B7-H3 auf NZKs bei der Hemmung der slanDCvermittelten Proliferation von CD4+ T-Zellen zu analysieren, wurden neutralisierende Antikörper eingesetzt. Dafür fand die Kokultivierung von frisch isolierten slanDCs aus dem Blut gesunder Spender und NZK-Zellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC sowie MZ2877RC in An- oder Abwesenheit von neutralisierenden B7-H1- und B7-H3Antikörpern statt (siehe 2.2.5). Nach 6 h wurden die slanDCs von den Tumorzellen separiert und mit allogenen, eFluor® 670-gefärbten CD4+ T-Lymphozyten kokultiviert (siehe 2.2.6). Die Analyse der T-Zellen nach 7-tägiger Kultivierung erfolgte durch Färbung mit einem FITC-markierten anti-CD4-Antikörper und anschließender Messung mittels Durchflusszytometer (siehe 2.2.4.1). Die Resultate von einem repräsentativen Spender pro NZK-Zelllinie sind in Tabelle 5 bzw. Abbildung 16 dargestellt. Diese Ergebnisse bestätigten die unter Gliederungspunkt 3.3.1 dargelegte inhibierende Wirkung der NZK-Zelllinien auf die slanDC-induzierte Proliferation von CD4+ T-Zellen. Bei ersten Experimenten, während denen die separate Blockade von B7-H1 oder B7-H3 auf den NZK-Zelllinien realisiert 80 Ergebnisse wurde, wurde jedoch keine Aufhebung der Tumorzell-vermittelten funktionellen Hemmung von slanDCs beobachtet (Tabelle 5). Um ein mögliches Zusammenspiel der beiden koinhibitorischen B7-Moleküle bei der NZK-induzierten funktionellen Hemmung der slanDCs zu untersuchen, erfolgten weiterhin Experimente, bei denen beide Blockierungsantikörper zeitgleich zum Einsatz kamen. Doch auch die gleichzeitige Blockierung von B7-H1 und B7-H3 auf der Oberfläche der NZK-Zelllinien ACHN (Abbildung 16A), Caki-1 (Abbildung 16B), MZ1257RC (Abbildung 16C) oder MZ2877RC (Abbildung 16D) führte zu keiner Veränderung im prozentualen Anteil proliferierter CD4+ T-Zellen nach Stimulation mit Tumorzell-behandelten slanDCs. Die geschilderten Beobachtungen weisen darauf hin, dass die koinhibitorischen Oberflächenmoleküle B7-H1 und B7-H3 der NZK-Zelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC sowie MZ2877RC nicht wesentlich an der Hemmung der slanDC-vermittelten CD4+ T-Zell-Proliferation beteiligt sind. 81 Ergebnisse Tabelle 5: Einfluss einer Blockierung von B7-H1 bzw. B7-H3 auf NZK-Zellen bei der Hemmung der slanDC-vermittelten Proliferation von CD4 + T-Zellen durch NZK-Zellen ACHN + + CD4 T-Zellen CD4 T-Zellen + DCs + (ACHN-) DCs + (ACHN-) DCs (+ anti-B7-H1) + DCs + (ACHN-) DCs + (ACHN-) DCs (+ anti-B7-H3) 53 % 12 % 13 % 56 % 15 % 13 % Caki-1 + + CD4 T-Zellen CD4 T-Zellen + DCs + (Caki-1-) DCs + (Caki-1-) DCs (+ anti-B7-H1) + DCs + (Caki-1-) DCs + (Caki-1-) DCs (+ anti-B7-H3) 53 % 16 % 12 % 74 % 11 % 9% MZ1257RC + + CD4 T-Zellen CD4 T-Zellen + DCs + (MZ1257RC-) DCs + (MZ1257RC-) DCs (+ anti-B7-H1) + DCs + (MZ1257RC-) DCs + (MZ1257RC-) DCs (+ anti-B7-H3) 53 % 32 % 32 % 56 % 36 % 33 % MZ2877RC + + CD4 T-Zellen CD4 T-Zellen + DCs + (MZ2877RC-) DCs + (MZ2877RC-) DCs (+ anti-B7-H1) + DCs + (MZ2877RC-) DCs + (MZ2877RC-) DCs (+ anti-B7-H3) 43 % 14 % 12 % 66 % 52 % 47 % SlanDCs wurden über 6 h in An- oder Abwesenheit von neutralisierenden Antikörpern (anti-B7-H1 bzw. anti-B7-H3) mit NZK-Zellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC oder + MZ2877RC vorbehandelt und anschließend mit allogenen CD4 T-Zellen inkubiert. Angegeben + ist der Anteil proliferierter CD4 T-Zellen in Prozent nach 7 d in Kokultur. Für jeden Blockierungsantikörper sind pro NZK-Zelllinie die Resultate von einem repräsentativen slanDCSpender aus einer Auswahl von drei Spendern mit vergleichbaren Ergebnissen dargestellt. 82 Ergebnisse 83 Ergebnisse Abbildung 16: Wirkung von B7-H1 und B7-H3 bei der NZK-vermittelten funktionellen 6 Hemmung von slanDCs. SlanDCs (1 x 10 Zellen/Well) und Zellen der NZK-Linien ACHN (A), 5 Caki-1 (B), MZ1257RC (C) bzw. MZ2877RC (D) (3 x 10 Zellen/Well) wurden in An- oder Abwesenheit von neutralisierenden Antikörpern gegen B7-H1 sowie B7-H3 kokultiviert. Nach 4 6 h wurden die slanDCs von den Tumorzellen separiert, gewaschen und 1 x 10 slanDCs/Well ® + 5 mit allogenen, eFluor 670-gefärbten CD4 T-Zellen (1 x 10 Zellen/Well) inkubiert. Die + Proliferationsrate der CD4 T-Zellen wurde anschließend durchflusszytometrisch ermittelt. Pro NZK-Linie ist ein repräsentativer Spender aus drei Spendern mit vergleichbaren Ergebnissen + dargestellt. Der Anteil proliferierter CD4 T-Zellen ist in Prozent angegeben. Graue Graphen + stellen nicht proliferierte CD4 T-Zellen dar und bilden den Bezugspunkt für die Bestimmung der + Anzahl proliferierter CD4 T-Zellen, welche als schwarz gefüllte Graphen dargestellt sind. 3.5 Wirkung von NZK-Zellen auf die slanDC-vermittelte Programmierung von naïven CD4+ T-Zellen Neben der effizienten Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten spielen DCs eine bedeutende Rolle bei der Differenzierung aktivierter CD4+ T-Zellen in unterschiedliche T-Helferzell-Populationen, welche sich durch die Sekretion charakteristischer Zytokine voneinander abgrenzen. So kann unter anderem zwischen IFN-γ-produzierenden TH1-Zellen und IL-4-sezernierenden TH2-Zellen unterschieden werden [STEINMAN UND BANCHEREAU, 2007]. Nach Stimulation mit dem TLR4 Liganden LPS [POLTORAK et al., 1998] steuern slanDCs auf effiziente Weise die Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten zu IFN-γ-produzierenden TH1-Zellen. Dies ist auf das proinflammatorische Zytokin IL-12 zurückzuführen, welches slanDCs nach ihrer Aktivierung in Anwesenheit von LPS sezernieren [SCHÄKEL et al., 2006; HÄNSEL et al., 2011]. Kondo et al. wiesen nach, dass eine TH1-Typ Immunantwort im Zuge eines NZKs mit einer für den Patienten positiven Prognose einher geht [KONDO et al., 2006]. TH1-Zellen erfüllen folglich eine bedeutende Rolle bei der NZK-gerichteten Immunantwort. Aus diesem Grund wurde während weiterer Experimente der Einfluss der NZK-Zelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC sowie MZ2877RC auf die slanDC-induzierte Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten in TH1-Zellen evaluiert. Dafür erfolgte die immunmagnetische Isolation von slanDCs aus dem Blut gesunder Spender (siehe 2.2.3.1) und die anschließende Kokultivierung mit NZK-Zellen (siehe 2.2.5). Nach 6 h wurden die slanDCs von den adhärenten Tumorzellen separiert und in Anwesenheit von LPS für 7 d mit allogenen, naïven CD4+ T-Lymphozyten inkubiert. Anschließend wurden die CD4+ T-Zellen geerntet und für 4 h mit PMA und Ionomycin in Gegenwart des Exozytoseblockers Brefeldin A stimuliert (siehe 2.2.7). Die Bestimmung der 84 Ergebnisse prozentualen Verteilung IFN-γ- bzw. IL-4-produzierender CD4+ T-Zellen fand durch intrazytoplasmatische Färbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen IFN-γ und IL-4 sowie die durchflusszytometrische Analyse der gefärbten CD4+ T-Lymphozyten statt (siehe 2.2.4.2). In der Abbildung 17 sind die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Untersuchungen dargestellt. Wie erwartet, wurde nach TLR4-Stimulation der slanDCs eine deutliche slanDC-induzierte Differenzierung von naϊven CD4+ T-Zellen in IFN-γ-produzierende Zellen nachgewiesen. Für alle Spender wurden über 40 % der slanDC-stimulierten CD4+ T-Lymphozyten als IFN-γ-produzierende TH1-Zellen identifiziert. Mit weniger als 5 % IL-4-produzierender CD4+ T-Zellen war der Anteil von TH2-Zellen gering. Aus den Ergebnissen ging weiterhin hervor, dass der prozentuale Anteil IFN-γ-positiver T-Lymphozyten nach Kokultur von slanDCs und NZK-Zellen sowohl für die Zelllinien ACHN (Abbildung 17A) und Caki-1 (Abbildung 17B), als auch für die primären NZKLinien MZ1257RC (Abbildung 17C) sowie MZ2877RC (Abbildung 17D) deutlich vermindert ist. Diese Resultate lassen darauf schließen, dass die Zellen der vier untersuchten NZK-Linien eine inhibierende Wirkung auf die slanDC-vermittelte Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten in IFN-γ-produzierende TH1-Zellen ausüben. 85 Ergebnisse 86 Ergebnisse + Abbildung 17: Inhibition der slanDC-vermittelten Programmierung naïver CD4 T-Zellen 6 5 durch NZK-Zellen. SlanDCs (1 x 10 Zellen/Well) wurden für 6 h mit 3 x 10 Tumorzellen der NZK-Linien ACHN (A), Caki-1 (B), MZ1257RC (C) bzw. MZ2877RC (D) pro Well inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Separation der slanDCs von den NZK-Zellen sowie die Kultivierung von 4 5 + 1 x 10 dieser slanDCs mit 1 x 10 allogenen naïven CD4 T-Zellen in Anwesenheit von LPS. + Nach 7 d wurde der prozentuale Anteil an IFN-γ- und IL-4-produzierenden CD4 T-Lymphozyten durchflusszytometrisch bestimmt. Pro NZK-Zelllinie sind die Ergebnisse eines repräsentativen Spenders aus einer Auswahl von vier Spendern mit ähnlichen Resultaten dargestellt. Durch eine Reinheitsfärbung der slanDCs nach Separation von den NZK-Zellen stellte sich heraus, dass eine 2 - 15%ige Verunreinigung der slanDCs durch Tumorzellen vorlag. Um eine direkte Wirkung dieser NZK-Zellen auf die Differenzierung stimulierter CD4+ T-Zellen auszuschließen, erfolgte die Inkubation von naïven CD4+ T-Lymphozyten mit Zellen der NZK-Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC und MZ2877RC. Die Stimulation der T-Zellen fand in Gegenwart von aktivierenden anti-CD3/CD28 Dynabeads® sowie des TH1-triggernden Zytokins IL-12 statt (siehe 2.2.7). Die Analyse der T-Zellen dieses Kontrollexperiments nach siebentägiger Kultur erfolgte wie nach der Kultivierung von slanDCs mit naïven CD4+ T-Lymphozyten beschrieben. Die Resultate dieser Untersuchungen von je einem repräsentativen Spender pro NZKZelllinie sind in Abbildung 18 illustriert. Es war erkennbar, dass die eingesetzte Zellzahl der NZK-Linien (Abbildung 18C) ACHN und (Abbildung 18A), MZ2877RC Caki-1 (Abbildung 18D) (Abbildung 18B), keinen MZ1257RC Einfluss auf die Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten in TH1-Zellen hat. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass alle vier untersuchten NZKZelllinien in der Lage sind, die Fähigkeit von slanDCs zur Programmierung naϊver CD4+ T-Lymphozyten zu inhibieren. 87 Ergebnisse 88 Ergebnisse + Abbildung 18: Wirkung von NZK-Zellen auf die Differenzierung naïver CD4 T-Zellen. Es 5 + erfolgte die Kultivierung von 1 x 10 naïven CD4 T-Lymphozyten pro Well mit Zellen der NZK3 Zelllinien ACHN (A), Caki-1 (B), MZ1257RC (C) bzw. MZ2877RC (D) (1,5 x 10 Zellen/Well) in ® Anwesenheit von anti-CD3/CD28 Dynabeads sowie IL-12. Nach 7 d wurde der prozentuale + Anteil IFN-γ- sowie IL-4-produzierender CD4 T-Zellen mittels Durchflusszytometer bestimmt. Pro NZK-Zelllinie ist ein repräsentativer Spender aus drei Spendern mit vergleichbaren Ergebnissen abgebildet. 3.6 Modulation der slanDC-induzierten IFN-γ-Produktion von NK-Zellen durch NZK-Zellen Aktivierte NK-Zellen zeichnen sich durch ihr direktes zytotoxisches Potenzial sowohl gegenüber Virus-infizierten Zellen als auch Tumorzellen aus. Weiterhin sezernieren aktivierte NK-Zellen wichtige immunmodulatorische Zytokine wie IFN-γ. NK-Zellen sind somit von großer Bedeutung für die Entstehung und Aufrechterhaltung einer antitumoralen Immunantwort [SCHOENBORN UND WILSON, 2007; W EHNER et al., 2011]. Neben der Schlüsselrolle, die slanDCs bei der Initiation und Regulation von adaptiven Immunantworten einnehmen, besitzen slanDCs ebenso die Fähigkeit, zelluläre Komponenten des angeborenen Immunsystems wie NK-Zellen zu stimulieren. So wurde in vorherigen Studien gezeigt, dass LPS-aktivierte slanDCs effizient die Produktion von IFN-γ durch NK-Zellen erhöhen [SCHMITZ et al., 2005; WEHNER et al., 2009]. Ausgehend von dieser Beobachtung wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit der Einfluss von NZK-Zellen auf die slanDC-vermittelte Aktivierung von NK-Zellen untersucht. Dafür erfolgte die Kultivierung frisch isolierter slanDCs von gesunden Spendern in An- oder Abwesenheit der klarzelligen NZK-Linien ACHN und Caki-1 sowie der primären NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC (siehe 2.2.5). Nach 6 h erfolgte die Trennung der slanDCs von den Tumorzellen und die Inkubation mit autologen, frisch isolierten NK-Zellen (siehe 2.2.8). Diese Kultivierung fand in Gegenwart von LPS statt. Nach 42-stündiger Kokultur von slanDCs und NK-Zellen wurde die IFN-γ-Konzentration in den Zellkulturüberständen mittels ELISA (siehe 2.2.9) analysiert. Die in den Abbildung 19 bis 22 dargestellten Resultate bestätigten, dass es durch Kokultivierung von LPS-stimulierten slanDCs und NK-Zellen zu einer starken IFN-γProduktion kommt. Eine Kultivierung von NK-Zellen mit unstimulierten slanDCs führte im Zuge der durchgeführten Experimente hingegen zu keiner detektierbaren Zytokinkonzentration. Interessanterweise resultierte eine Vorbehandlung der slanDCs 89 Ergebnisse sowohl mit den Tumorzelllinien ACHN (Abbildung 19) und Caki-1 (Abbildung 20), als auch mit den primären NZK-Linien MZ1257RC (Abbildung 21) und MZ2877RC (Abbildung 22) in einer signifikanten Verringerung der slanDC-vermittelten IFN-γProduktion durch NK-Zellen. Abbildung 19: Hemmung der slanDC-vermittelten Aktivierung von NK-Zellen durch die 6 5 NZK-Zelllinie ACHN. SlanDCs (1 x 10 Zellen/Well) wurden für 6 h mit NZK-Zellen (3 x 10 Zellen/Well) kokultiviert. Im Anschluss erfolgte die Separation der slanDCs von den 4 4 Tumorzellen. 2 x 10 slanDCs/Well wurden für weitere 42 h mit autologen NK-Zellen (5 x 10 Zellen/Well) in An- oder Abwesenheit von LPS kultiviert. Die Bestimmung der IFN-γKonzentration in den Zellkulturüberständen erfolgte mittels ELISA. Dargestellt sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen für drei Spender sowie die durchschnittliche absolute Abweichung der Messwerte vom Mittelwert. Asteriske weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin (studentischer t-Test; p < 0,05). 90 Ergebnisse Abbildung 20: Inhibition der slanDC-induzierten Aktivierung von NK-Zellen durch die 5 6 NZK-Zelllinie Caki-1. NZK-Zellen (3 x 10 Zellen/Well) und slanDCs (1 x 10 Zellen/Well) wurden für 6 h gemeinsam kultiviert. Daraufhin wurden die slanDCs von den Tumorzellen 4 getrennt. 2 x 10 slanDCs/Well wurden anschließend für weitere 42 h mit autologen NK-Zellen 4 (5 x 10 Zellen/Well) in Gegenwart oder Abwesenheit von LPS inkubiert. Mittels ELISA erfolgte die Bestimmung der IFN-γ-Konzentration in den Zellkulturüberständen. Dargestellt sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen für drei Spender sowie die durchschnittliche absolute Abweichung der Messwerte vom Mittelwert. Auf statistisch signifikante Unterschiede weisen Asteriske hin (studentischer t-Test; p < 0,05). Abbildung 21: Beeinträchtigung der slanDC-vermittelten Aktivierung von NK-Zellen durch die primäre NZK-Zelllinie MZ1257RC. Es erfolgte die Kokultivierung von slanDCs 6 5 (1 x 10 Zellen/Well) und NZK-Zellen (3 x 10 Zellen/Well) über 6 h. Anschließend wurden die 4 slanDCs von den Tumorzellen separiert. 2 x 10 slanDCs/Well wurden für weitere 42 h mit 4 autologen NK-Zellen (5 x 10 Zellen/Well) mit oder ohne LPS inkubiert. Mittels ELISA erfolgte die Bestimmung der IFN-γ-Konzentration in den Zellkulturüberständen. Es werden die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen für drei Spender sowie die durchschnittliche absolute Abweichung der Messwerte vom Mittelwert gezeigt. Statistisch signifikante Unterschiede sind durch Asteriske markiert (studentischer t-Test; p < 0,05). 91 Ergebnisse Abbildung 22: Hemmung der slanDC-vermittelten Aktivierung von NK-Zellen durch die 6 primäre NZK-Zelllinie MZ2877RC. SlanDCs (1 x 10 Zellen/Well) wurden für 6 h mit NZK5 Zellen (3 x 10 Zellen/Well) kokultiviert und anschließend von den Tumorzellen separiert. In An4 oder Abwesenheit von LPS wurden 2 x 10 dieser slanDCs/Well für weitere 42 h mit autologen 4 NK-Zellen (5 x 10 Zellen/Well) kultiviert. Mittels ELISA fand die Bestimmung der IFN-γKonzentration in den Zellkulturüberständen statt. Abgebildet sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen für drei Spender sowie die durchschnittliche absolute Abweichung der Messwerte vom Mittelwert. Asteriske weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin (studentischer t-Test; p < 0,05). Eine Reinheitsfärbung der slanDCs im Anschluss an die Separation von den Tumorzellen wies Verunreinigungen durch NZK-Zellen von 2 - 15 % nach. Um einen direkten Einfluss einer 15%igen Verunreinigung der slanDCs durch Tumorzellen auf die IFN-γ-Produktion der NK-Zellen zu evaluieren, wurden Kontrollexperimente durchgeführt. Dafür erfolgte neben der alleinigen Kultivierung von NK-Zellen auch eine Kokultur von NK-Zellen mit Tumorzellen der Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC bzw. MZ2877RC. Die Stimulation der NK-Zellen fand durch Zugabe der Zytokine IL-2 und IL-12 statt (siehe 2.2.8). Mittels ELISA (siehe 2.2.9) fand nach 42 h die Analyse der IFN-γ-Konzentration in den Zellkulturüberständen statt. Abbildung 23 stellt die Ergebnisse von je einem repräsentativen Spender pro NZK-Zelllinie dar. Nicht stimulierte NK-Zellen produzierten kaum IFN-γ, während die Kultivierung von NK-Zellen in Gegenwart der Zytokine IL-2 und IL-12 in den eingesetzten Konzentrationen zu einer vergleichbar starken IFN-γ-Sekretion führte, wie es bei der Kokultivierung von NK-Zellen mit slanDCs der Fall war (Vergleich Abbildung 23 mit Abbildung 19 bis 22). Weiterhin zeigte sich, dass die Tumorzelllinien ACHN, Caki-1 und MZ1257RC keinen direkten Einfluss auf die IFN-γ-Produktion der aktivierten NK-Zellen besitzen (Abbildung 23). Die NZK-Linie MZ2877RC hingegen übte einen signifikanten direkten inhibitorischen Effekt auf stimulierte NK-Zellen aus. 92 Ergebnisse Die Beobachtungen weisen darauf hin, dass die NZK-Zelllinien ACHN, Caki-1 und MZ1257RC in der Lage sind, die slanDC-vermittelte Aktivierung von NK-Zellen effizient zu inhibieren. Abbildung 23: Einfluss der NZK-Zelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC und MZ2877RC auf 4 die IFN-γ-Sekretion aktivierter NK-Zellen. NK-Zellen (5 x 10 Zellen/Well) wurden in 3 Gegenwart der stimulierenden Zytokine IL-2 sowie IL-12 für 42 h mit Tumorzellen (3 x 10 Zellen/Well) kokultiviert. Die Bestimmung der IFN-γ-Konzentration in den Zellkulturüberständen erfolgte anschließend mittels ELISA. Pro NZK-Zelllinie ist ein repräsentativer Spender aus drei Spendern mit ähnlichen Resultaten abgebildet. Illustriert sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen sowie die durchschnittliche absolute Abweichung der Messwerte vom Mittelwert. Der Asterisk weist auf einen statistisch signifikanten Unterschied hin (studentischer t-Test; p < 0,05). 93 Diskussion 4 Diskussion 4.1 DCs – die zentralen Mediatoren der antitumoralen Immunantwort DCs nehmen eine entscheidende Rolle bei der Initiation und Regulation der angeborenen sowie adaptiven Immunantwort ein. Aufgrund dieser Schlüsselrolle tragen DCs maßgeblich zur antitumoralen Immunabwehr bei [STEINMAN UND BANCHEREAU, 2007; PALUCKA UND BANCHEREAU, 2012]. Im Rahmen einer malignen Entartung sind im Blut zirkulierende DCs in der Lage, in Tumorgewebe einzuwandern [BANCHEREAU UND PALUCKA, 2005]. Unreife DCs besitzen eine ausgeprägte Fähigkeit zur Aufnahme von Tumormaterial. Diese apoptotischen oder nekrotischen Tumorzellfragmente enthalten Tumorproteine, welche durch DCs prozessiert und als Komplex mit MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert werden [MELLMAN UND STEINMAN, 2001; STRIOGA et al., 2013]. Die Reifung von intratumoralen DCs wird durch Faktoren wie HSPs oder HMGB-1 induziert [KONO UND ROCK, 2008; NACE et al., 2012]. Proinflammatorische Zytokine, welche durch Tumorinfiltrierende Immunzellen sezerniert werden, stimulieren das Ausreifen von DCs ebenfalls [JOFFRE et al., 2009; VISPERAS et al., 2014]. Die Reifung von DCs geht mit einer reduzierten Fähigkeit zur Phagozytose sowie einer gesteigerten Kapazität zur Antigenpräsentation einher. Ausgereifte DCs zeichnen sich zudem durch die Sekretion proinflammatorischer Zytokine und die Migration aus dem Tumorgewebe in drainierende Lymphknoten aus. Dort sind sie als professionelle APCs in der Lage, naïve Tumorantigen-spezifische CD4+ oder CD8+ T-Lymphozyten zu aktivieren [MELLMAN UND STEINMAN, 2001; HEUZÉ et al., 2013; STRIOGA et al., 2013]. Für die antitumorale Immunantwort ist die DC-vermittelte Differenzierung von aktivierten CD4+ Lymphozyten in TH1-Zellen von Bedeutung [KNUTSON UND DISIS, 2005; RUFFELL et al., 2010]. TH1-Zellen und Tumor-reaktive CD8+ CTLs gelangen über die Blutbahn in das Tumorgewebe [OELKRUG UND RAMAGE, 2014]. Während CD8+ CTLs dort ein ausgeprägtes zytotoxisches Potenzial gegenüber Tumorzellen zeigen, stimulieren T H1Zellen die Antigen-präsentierenden Eigenschaften von DCs und fördern die Aktivierung von CD8+ T-Zellen [BEHRENS et al., 2004; ZHU UND PAUL, 2008; W EIGELIN et al., 2011]. Darüber hinaus besitzen DCs die Fähigkeit, das immunmodulatorische sowie zytotoxische Potenzial von NK-Zellen zu stimulieren [MORETTA, 2005; WEHNER et al., 2011]. Diese Zellen des angeborenen Immunsystems tragen ebenfalls zur Elimination 94 Diskussion von Tumorzellen bei [BODDULURU et al., 2015]. Durch diese außergewöhnlichen Fähigkeiten im Rahmen einer Tumor-gerichteten Immunantwort stehen DCs im Fokus der Forschung im Bereich der Tumorimmunologie. Des Weiteren macht sie ihre ausgeprägte Fähigkeit zur T-Zell- und NK-Zell-Aktivierung zu vielversprechenden Kandidaten für immuntherapeutische Ansätze zur Behandlung von Tumoren. 4.2 Humane DCs als Bestandteil des Immunzellinfiltrates von NZKs In den letzten Jahren stellte sich die außerordentliche Bedeutung von Immunzellen als Komponente der Tumorumgebung heraus. Nicht nur Tumorzellen, sondern auch Tumor-infiltrierende Zellen des angeborenen und des adaptiven Immunsystems gelten als wichtige Regulatoren der Tumorentwicklung und sind mit dem klinischen Verlauf maligner Erkrankungen assoziiert [MANTOVANI et al., 2008; DISIS, 2010; FRIDMAN et al., 2012]. Zu den Zelltypen, die in Tumorgeweben gefunden werden, zählen unter anderem T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, NK Zellen, Makrophagen und DCs. Sowohl die Dichte, als auch die Zusammensetzung der Immunzellinfiltrate unterscheiden sich zwischen den verschiedenen Tumorentitäten und variieren ebenfalls von Patient zu Patient [GALON et al., 2012; GIRALDO et al., 2014]. So geht beispielsweise die Infiltration von primären Tumorgeweben verschiedenen Ursprungs durch eine hohe Anzahl CD45RO+ Gedächtnis-T-Zellen mit einer zytotoxischen CD8+ oder einer TH1-spezifischen Orientierung mit einer guten Prognose einher [GALON et al., 2006; PAGÈS et al., 2009; FRIDMAN et al., 2012; FRIDMAN et al., 2014]. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde der Begriff „Immunoscore“ als prognostischer Faktor etabliert, welcher die Lokalisation, die Frequenz sowie die funktionelle Orientierung von infiltrierenden CD8+ T-Lymphozyten und Gedächtnis-T-Zellen einschließt [PAGÈS et al., 2009; MLECNIK et al., 2011; GALON et al., 2012; GALON et al., 2013]. Eine interessante Ausnahme bildet das NZK, bei dem die starke Infiltration durch CD8+ oder CD45RO+ T-Lymphozyten mit einer schlechten Überlebensrate der Patienten assoziiert ist [NAKANO et al., 2001; HOTTA et al., 2011]. NZKs zählen zu den häufigsten adulten urologischen Tumoren in Europa [FERLAY et al., 2013]. Während Patienten mit lokal begrenztem NZK meist erfolgreich mittels Nephrektomie behandelt werden, sind die therapeutischen Möglichkeiten bei 95 Diskussion metastasierenden Tumoren begrenzt [LJUNGBERG et al., 2010]. NZKs gelten als stark immunogene Tumore. Dieses wichtige Merkmal ist auf selten auftretende spontane Regressionen [JANISZEWSKA et al., 2013] sowie auf eine ausgeprägte Infiltration durch verschiedene Immunzellpopulationen [GEIGER et al., 2009] zurückzuführen. CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten sowie NK-Zellen stellen wesentliche Bestandteile vom Immunzellinfiltrat in NZKs dar [NAKANO et al., 2001; SCHLEYPEN et al., 2003; CÓZAR et al., 2005; SCHLEYPEN et al., 2006; FIGEL et al., 2011; HOTTA et al., 2011; ECKL et al., 2012]. Neben diesen Effektorzellen wurden in ersten Studien auch DCs als natürliche Komponente des Immunzellinfiltrates von NZKs beschrieben. Beispielsweise detektierten Figel et al. ungewöhnlich differenzierte DCs in NZK-Geweben. Diese „enriched-in-renal-cell-carcinoma“ (erc)-DCs exprimieren den DC- und Makrophagenspezifischen Marker CD209 sowie die Makrophagen-typischen Oberflächenmoleküle CD14 und CD163 [FIGEL et al., 2011]. Thurnher et al. wiesen ebenfalls Zellen in NZKGewebe nach, welche typische Oberflächencharakteristika von DCs ausprägen. Dazu zählt die Ausprägung von MHC-Klasse II-Molekülen, des Adhäsionsmoleküls CD54, des Reifungsmarkers CD83 sowie des kostimulatorischen Moleküls CD86. Diese DCs bilden nur ein geringes Potenzial zur Antigenaufnahme aus, sind jedoch in vitro in der Lage, naïve allogene T-Zellen zu aktivieren [THURNHER et al., 1996]. Auch Kobayashi et al. dokumentierten CD83+ DCs in NZK-Geweben [KOBAYASHI et al., 2007]. Troy et al. zeigten wiederrum, dass lediglich ein kleiner Teil der potenziellen DCs (CD45+ HLA-DR+ lin-) in NZK-Geweben den Aktivierungsmarker CMRF-44 oder den Reifungsmarker CD83 ausprägen [TROY et al., 1998]. Im Einklang mit diesen Ergebnissen ist auch die Beobachtung, dass im NZK-Gewebe vermehrt unreife CD1a+ DCs vorliegen [MIDDEL et al., 2010]. Ausgereifte DCs hingegen treten vornehmlich in Tumor-freien Bereichen auf, welche an NZK-Gewebe angrenzen. Diese DCs liegen in Assoziation mit T-Lymphozyten vor [TROY et al., 1998; MIDDEL et al., 2010]. Die bisherigen Studien unterscheiden sich hinsichtlich der Frequenz der Tumorinfiltrierenden DCs. So beobachteten Troy et al. keinen Unterschied zwischen der Anzahl von DCs im NZK-Gewebe und der im Tumor-freien Nierengewebe [TROY et al., 1998]. Andere Studien wiesen jedoch signifikant erhöhte DC-Zahlen in den Tumorgeweben von NZK-Patienten nach [THURNHER et al., 1996; MIDDEL et al., 2010]. Diese vorrausgehenden Studien stützen sich auf den Nachweis von allgemeinen DC-charakterisierenden Oberflächenmolekülen. Bisher ist jedoch kaum etwas über das Vorliegen von definierten Subpopulationen humaner DCs in NZKs bekannt. In diesem Zusammenhang liegt eine Studie vor, die die Akkumulation von klassischen humanen DC-Populationen in NZK-Geweben durch die immunhistochemische Detektion von 96 Diskussion mDCs sowie pDCs nachweist [GIGANTE et al., 2009]. In genannter Studie wurde gezeigt, dass in NZK-Geweben im Vergleich zu Tumor-freien Nierengeweben eine erhöhte Anzahl an pDCs und mDCs vorliegt, während die durchflusszytometrisch ermittelte Frequenz von pDCs und mDCs im peripheren Blut von NZK-Patienten gegenüber der Frequenz im peripheren Blut von gesunden Probanden verringert ist. Weiterhin wurde demonstriert, dass NZK-infiltrierende mDCs und pDCs einen unreifen Phänotyp ausprägen (DC-LAMP-) [GIGANTE et al., 2009]. Gigante et al. detektierten pDCs anhand des Oberflächenmoleküls BDCA-4 und definierten durch den Nachweis von CD1c sowie BDCA-3 zwei Subpopulationen von mDCs. Über den dritten und größten Subtyp humaner mDCs (CD16+ DCs) und das Vorliegen dieser Zellen in primären NZK-Geweben wird in der Studie von Gigante et al. jedoch nicht berichtet. Zu den CD16+ mDCs zählen slanDCs, welche zugleich eine der größten Subpopulationen humaner DCs des Blutes darstellen [SCHÄKEL et al., 1998; SCHÄKEL et al., 2002]. Sie zeichnen sich durch die Produktion wesentlicher Mengen proinflammatorischer Zytokine, eine Tumor-gerichteten Zytotoxizität sowie die effiziente Stimulation von T-Lymphozyten und NK-Zellen aus [SCHÄKEL et al., 1998; SCHÄKEL et al., 2002; SCHMITZ et al., 2005; SCHÄKEL et al., 2006; W EHNER et al., 2009; HÄNSEL et al., 2011; HÄNSEL et al., 2013; JÄHNISCH et al., 2013]. Entsprechend dieser außergewöhnlichen Fähigkeiten wird vermutet, dass slanDCs eine zentrale Rolle bei der Tumor-gerichteten Immunantwort spielen. Auf dieser Grundlage wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit mittels immunhistochemischer Färbung die Präsenz von slanDCs in NZKGeweben analysiert. Durch die Verwendung eines primären, gegen die slan-Modifikation von slanDCs gerichteten Antikörpers war die spezifische Detektion dieser proinflammatorischen DC-Subpopulation möglich. Interessanterweise wurden sowohl in den untersuchten primären Tumorgeweben, als auch in den analysierten Lymphknoten- und Fernmetastasen von Patienten mit klarzelligem NZK slanDCs nachgewiesen. Die Anzahl der in den Tumorgeweben vorhandenen slanDCs war im Durchschnitt höher, als die Zahl der slanDCs in den Tumor-freien Nierengewebeproben. Diese ersten Untersuchungen erbringen den Nachweis, dass slanDCs eine Komponente des Immunzellinfiltrates von NZKs darstellen und eine Rolle bei der Immunabwehr von NZKs spielen können. Weiterführende Analysen durch Toma et al. bestätigen die im Rahmen der vorliegenden Dissertation gewonnenen Erkenntnisse und bekräftigen diese statistisch. Die durch Toma et al. durchgeführte Untersuchung von 263 primären NZK-Geweben mittels Tissue-Microarray zeigte im Tumorgewebe eine im Vergleich zu den 227 Tumor-freien Nierengeweben signifikant erhöhte Frequenz von slanDCs. Im größten Teil der insgesamt 91 analysierten 97 Diskussion Lymphknoten- und Fernmetastasen von klarzelligen NZK-Patienten wurden ebenfalls slanDCs nachgewiesen [TOMA et al., 2015]. Diese jüngsten Ergebnisse stehen im Einklang mit der Studie von Vermi et al., die kürzlich eine Akkumulation von slanDCs in Metastasen Tumor-drainierender Lymphknoten von verschiedenen Tumorentitäten nachwiesen. In Metastasen-freien Tumor-drainierenden Lymphknoten war die Zahl der slanDCs sehr gering oder es waren keine slanDCs detektierbar [VERMI et al., 2014]. Aufgrund der ausgeprägten Fähigkeit von slanDCs zur Aktivierung und Regulierung einer Immunantwort könnte vermutet werden, dass die dargestellte Akkumulation von DCs in Tumorgeweben einen positiven Effekt auf die Prognose von NZK-Patienten ausübt. Vergangene Studien sprechen jedoch gegen diese Hypothese. So stellten Toma et al. erst kürzlich dar, dass eine höhere Frequenz slanDCs in primären klarzelligen NZK-Geweben signifikant mit fortgeschrittenen UICC-Stadien sowie hohen Fuhrman-Graden der Tumore assoziiert ist. Die Anzahl an slanDCs in primären NZKGeweben metastasierender Tumoren war darüber hinaus im Vergleich zu Tumoren ohne Lymphknoten- oder Fernmetastasen signifikant erhöht. Weiterhin wurde gezeigt, dass eine höhere Anzahl von Tumor-infiltrierenden slanDCs mit einem verringerten progressionsfreien Überleben, einem reduzierten Tumor-spezifischen Überleben sowie einem verminderten Gesamtüberleben der NZK-Patienten korreliert [TOMA et al., 2015]. Im Einklang mit diesen Beobachtungen demonstrierten Figel et al., dass eine hohe Anzahl von CD209+ ercDCs häufig mit fortgeschrittenen UICC-Stadien der NZKs assoziiert ist [FIGEL et al., 2011]. Auch eine hohe Anzahl LAMP+ DCs in Lungenmetastasen von NZK-Patienten geht mit einer schlechten Prognose einher [REMARK et al., 2013]. 4.3 NZK-infiltrierende slanDCs prägen einen tolerogenen Phänotyp aus Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass slanDCs eine Komponente des Immunzellinfiltrates von klarzelligen NZKs darstellen. Weiterführende statistische Analysen durch Toma et al. haben gezeigt, dass eine höhere Anzahl NZKinfiltrierender slanDCs mit einer schlechten Prognose für die Patienten einhergeht [TOMA et al., 2015]. In dieser Dissertation war es daher von besonderem Interesse, den Zusammenhang zwischen einer erhöhten Frequenz von slanDCs im Tumorgewebe und einer schlechten Prognose zu evaluieren. 98 Diskussion In den vergangenen Jahren wurde in diesem Kontext deutlich, dass die Tumorumgebung zu Veränderungen von Tumor-infiltrierenden DCs führt. Diese DC-Modifikationen hinsichtlich der Ausreifung, Differenzierung sowie Funktionalität gehören zu den Immunescape-Mechanismen und fördern schließlich das Tumorwachstum [APETOH et al., 2011; MA et al., 2011; BENENCIA et al., 2012; SELIGER UND MASSA, 2013]. Nach dem derzeitigen Kenntnisstand existieren keine Studien, die umfangreiche phänotypische Analysen von nativen NZK-infiltrierenden DCs einer spezifischen Subpopulation beinhalten. Durch Teng et al. liegt jedoch eine Untersuchung vor, die den Einfluss von NZK-konditioniertem Medium auf den Phänotyp von Monozyten-abgeleiteten DCs (MoDCs) thematisiert [TENG et al., 2014]. Da diese artifiziellen DCs in vitro über mehrere Tage in Gegenwart von Zytokinen sowie Wachstumsfaktoren aus Monozyten generiert werden, lässt der Einsatz von MoDCs nur bedingt Rückschlüsse auf die in vivo-Situation im Menschen zu. Aus diesem Grund erfolgte im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmals die Analyse des Reifungsstatus sowie des Zytokinexpressionsprofils von frisch aus klarzelligen NZKBiopsien isolierten slanDCs. SlanDCs wurden über die slan-Modifikation am PSGL-1 definiert und auf diese Weise von Tumorzellen, Stromazellen sowie anderen Tumor-infiltrierenden Immunzellen abgegrenzt. Diese slanDCs exprimierten das MHC-Klasse II-Molekül HLA-DR, welches eine wichtige Rolle bei der Präsentation von Peptiden zur T-Zell-Aktivierung spielt. Durch Figel et al. wurde HLA-DR auch auf der Oberfläche von ercDCs nachgewiesen [FIGEL et al., 2011]. Thurnher et al., zeigten zudem ein starkes Vorkommen dieses MHC-Klasse II-Moleküls auf DCs, die während einer Organkultur aus NZK-Explantaten migriert waren [THURNHER et al., 1996]. Die in dieser Arbeit analysierten NZKinfiltrierenden slanDCs waren außerdem durch die starke Ausprägung des Fcγ-Rezeptors CD16 charakterisiert. Döbel et al. demonstrierten, dass CD16 für die Bindung und die Phagozytose von Immunkomplexen durch slanDCs verantwortlich ist. Weiterhin wurde gezeigt, dass die starke Expression von CD16 auf unreife slanDCs beschränkt ist und die Ausreifung von slanDCs den Verlust dieses Oberflächenmoleküls zur Folge hat [DÖBEL et al., 2013]. Das Vorkommen von CD16 auf den NZK-infiltrierenden slanDCs spricht folglich für einen unreifen Phänotyp der Zellen. Im Laufe der Ausreifung von DCs wird normalerweise die Expression von CCR7, CD40, CD80, CD83 sowie CD86 verstärkt [SABATTÉ et al., 2007; DALOD et al., 2014]. Die im Rahmen der vorliegenden Dissertation aus NZK-Geweben isolierten slanDCs prägten kein CCR7 aus. Als Rezeptor für die in sekundären lymphatischen Organen produzierten Chemokine CCL19 und CCL21 spielt CCR7 eine wichtige Rolle 99 Diskussion bei der Migration von aktivierten DCs in drainierende Lymphknoten [FÖRSTER et al., 2008; COMERFORD et al., 2013; HEUZÉ et al., 2013]. Im Einklang mit diesem Ergebnis ist die Studie von Middel et al., die in NZK-Geweben mittels Immunhistochemie CCR7-negative CD1a+ DCs nachwiesen. DCs im Tumor-angrenzenden Gewebe zeigten hingegen eine starke CCR7-Expression [MIDDEL et al., 2010]. Vermi et al. demonstrierten, dass die Zahl der slanDCs in Metastasen-freien Tumor-drainierenden Lymphknoten von Patienten mit verschiedensten Primärtumoren entweder sehr gering ist oder keine slanDCs detektierbar sind [VERMI et al., 2014]. Das in dieser Arbeit beobachtete Fehlen des Chemokinrezeptors CCR7 auf der Zelloberfläche von slanDCs könnte auf eine eingeschränkte Migration der Zellen in NZK-drainierende Lymphknoten hindeuten. Auf den analysierten NZK-infiltrierenden slanDCs wurde weiterhin kein CD40 nachgewiesen. Aktivierte DCs erhalten über die Ligation dieses kostimulatorischen Moleküls mit CD40L auf CD4+ T-Lymphozyten ein sogenanntes „T-Zell-Feedback“. Dieses induziert eine gesteigerte Sekretion von Chemokinen sowie proinflammatorischen Zytokinen und resultiert in der erhöhten Ausprägung von kostimulatorischen Molekülen durch DCs. Solche DCs sind zur effizienten Aktivierung von CD8+ CTLs lizensiert [MA UND CLARK, 2009; AHMED et al., 2012]. Das Defizit von CD40 auf NZK-infiltrierenden slanDCs könnte auf eine verminderte slanDC-vermittelte Aktivierung Tumor-spezifischer T-Lymphozyten in vivo hindeuten. CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) stellen wichtige kostimulatorische Moleküle dar, da sie als zweites Aktivierungssignal neben der Antigenpräsentation bei der Aktivierung von T-Lymphozyten durch DCs von großer Bedeutung sind. Bleibt dieses über die Ligation von CD28 auf T-Lymphozyten vermittelte zweite Aktivierungssignal aus, so wird in der T-Zelle Toleranz induziert [MUELLER, 2010; XING UND HOGQUIST, 2012]. Für Tumorinfiltrierende DCs verschiedener Tumorentitäten wurde beschrieben, dass CD80 sowie CD86 nur in geringen Mengen exprimiert werden oder ganz fehlen [GABRILOVICH, 2004]. In der vorliegenden Arbeit war CD86 in einer niedrigen Dichte auf NZKinfiltrierenden slanDCs vorhanden und CD80 wurde nicht detektiert. Auf den frisch aus NZK-Geweben isolierten slanDCs fehlte weiterhin die Expression von CD83. CD83 wird als Marker für aktivierte humane DCs beschrieben [BRELOER UND FLEISCHER, 2008]. In vorangegangenen Studien zeigte sich, dass das Vorliegen von Tumorinfiltrierenden DCs mit einer hohen Ausprägung des Reifungsmarkers CD83 mit einem verbesserten Ansprechen von NZKs auf immuntherapeutische Strategien [KOBAYASHI et al., 2007] sowie mit einem längeren Gesamtüberleben von Magenkrebs- [ANANIEV et al., 2011] und Brustkrebspatienten [IWAMOTO et al., 2003] assoziiert ist. Das Fehlen der Oberflächenmoleküle CD40, CD80 sowie CD83 auf NZK-infiltrierenden slanDCs 100 Diskussion lässt auf einen unreifen Phänotyp schließen. Dieser unterscheidet sich von dem Phänotyp der durch Figel et al. untersuchten ercDCs, welche sowohl CD40 als auch CD80 und CD86 exprimieren [FIGEL et al., 2011]. Teng et al. demonstrierten hingegen, dass NZK-konditioniertes Medium die Expression von CD80, CD83 sowie CD86 durch LPS-stimulierte MoDCs inhibiert [TENG et al., 2014]. Die im Rahmen dieser Arbeit aus klarzelligen NZKs isolierten slanDCs waren durch die Ausprägung der inhibitorischen Moleküle ILT3 und ILT4 charakterisiert. In der Literatur wird die erhöhte Expression dieser beiden inhibitorischen Rezeptoren im Zusammenhang mit einem tolerogenen Zustand von DCs dargestellt [CHANG et al., 2002; MANAVALAN et al., 2003; VLAD et al., 2009; WU et al., 2009; MALDONADO UND VON ANDRIAN, 2010; SHURIN et al., 2013]. Im Einklang mit den Ergebnissen dieser Dissertation zeigten Suciu-Foca et al., dass tolerogene DCs neben der Ausprägung von ILT3 sowie ILT4 durch eine geringe Dichte der kostimulatorischen Moleküle CD40, CD80 und CD86 gekennzeichnet sind [SUCIU-FOCA et al., 2005]. Verschiedene Studien berichten weiterhin, dass tolerogene DCs, welche ILT3 sowie ILT4 überexprimieren, nicht in der Lage sind, eine effiziente CD4+ T-Zell-Antwort zu induzieren. Stattdessen führten diese DCs zu T-Zell-Anergie oder Antigen-spezifischen Tregs [CHANG et al., 2002; MANAVALAN et al., 2003; BRENK et al., 2009; GREGORI et al., 2010]. Die in der vorliegenden Arbeit als ILT3+ sowie ILT4+ identifizierten slanDCs könnten entsprechend den Angaben in der Literatur in ihrer Fähigkeit zur Induktion einer effizienten NZK-gerichteten T-Zell-Antwort eingeschränkt sein. In vitro aktivierte slanDCs sezernieren große Mengen proinflammatorischer Zytokine, wie TNF-α und IL-12 [SCHÄKEL et al., 2002; SCHÄKEL et al., 2006; HÄNSEL et al., 2011]. SlanDCs in Geweben von Psoriasis- sowie Lupus Erythematodes-Patienten sind ebenfalls in der Lage, das proinflammatorische Zytokin TNF-α zu bilden [HÄNSEL et al., 2011; HÄNSEL et al., 2013]. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen wurde in der vorliegenden Arbeit die Zytokinexpression von frisch aus klarzelligen NZKs isolierten slanDCs untersucht. Die NZK-infiltrierenden slanDCs produzierten weder IL-12, noch TNF-α. Stattdessen wurde bei einem Teil der slanDCs die Produktion des immunsuppressiven Zytokins IL-10 nachgewiesen. Teng et al. machten eine ähnliche Beobachtung bei der Kultivierung von MoDCs in NZK-konditioniertem Medium. Diese MoDCs zeichneten sich nach LPS-Behandlung durch eine verringerte IL-12-Sekretion sowie eine erhöhte IL-10-Freisetzung aus [TENG et al., 2014]. 101 Diskussion Diese Daten zeigen, dass NZK-infiltrierende slanDCs einen unreifen Phänotyp ausprägen. SlanDCs mit diesem Phänotyp sind möglicherwiese nicht zur Induktion einer effizienten Tumor-gerichteten Immunantwort in der Lage. Die Ausprägung von ILT3, ILT4 und IL-10 weist auf einen tolerogenen Phänotyp der NZK-infiltrierenden slanDCs hin. Entsprechend ist die Induktion von Toleranz oder Immunsuppression durch slanDCs in klarzelligen NZK-Gewebe denkbar. 4.4 NZK-Zellen inhibieren die immunstimulatorischen Fähigkeiten von slanDCs SlanDCs sind nach ihrer Aktivierung effizient in der Lage, Neoantigen-spezifische CD4+ T-Zellen sowie Tumor-reaktive CD8+ T-Lymphozyten zu aktivieren [SCHÄKEL et al., 1998; SCHÄKEL et al., 2002; SCHÄKEL et al., 2006] und die Differenzierung naïver CD4+ T-Zellen in TH1-Zellen zu induzieren [SCHÄKEL et al., 2006; HÄNSEL et al., 2011]. Weitere Studien zeigten, dass aktivierte slanDCs effizient NK-Zellen stimulieren [SCHMITZ et al., 2005; W EHNER et al., 2009]. Aufgrund dieser ausgeprägten immunstimulatorischen Fähigkeiten können slanDCs eine zentrale Rolle bei der Tumor-gerichteten Immunantwort spielen. Der im Rahmen der vorliegenden Arbeit identifizierte Phänotyp von frisch aus klarzelligen NZK-Geweben isolierten slanDCs hatte jedoch einen unreifen sowie tolerogenen Charakter. Ausgehend von diesen Erkenntnissen wurde der Einfluss von NZK-Zelllinien auf wichtige immunstimulatorische Eigenschaften von slanDCs untersucht. Dafür erfolgte erstmals der Einsatz von primären Zelllinien, die aus dem Tumorgewebe von Patienten mit klarzelligen NZK etabliert wurden [SELIGER et al., 2007], in Kombination mit nativen, frisch isolierten slanDCs. 4.4.1 Modulation der slanDC-vermittelten Aktivierung sowie Differenzierung von T-Lymphozyten durch NZK-Zellen Eine der wichtigsten Funktionen von DCs im Rahmen einer Tumor-gerichteten Immunreaktion ist die effiziente Aktivierung von TAA-spezifischen T-Lymphozyten [MA et al., 2013]. T-Zellen stellen bedeutende Effektorzellen der antitumoralen Immunantwort dar. Aktivierte Tumor-reaktive CD8+ CTLs führen durch die gerichtete Freisetzung zytotoxischer Moleküle wie beispielsweise Granzym und Perforin sowie 102 Diskussion durch die Produktion von FasL, TRAIL oder TNF-α zur Antigen-spezifischen Lyse von Tumorzellen [SPENCER UND SORGER, 2011; WEIGELIN et al., 2011]. CD4+ T-Zellen unterstützen die Tumor-gerichtete Immunantwort entscheidend, indem sie die Antigenpräsentation durch professionelle APCs sowie die Aktivierung und Proliferation von CD8+ T-Lymphozyten fördern [BEHRENS et al., 2004; ZAIDI UND MERLINO, 2011; AHMED et al., 2012]. Verschiedene Studien berichten, dass professionelle APCs unter dem Einfluss von Tumorzellen in ihrer Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen gehemmt sind [SELIGER UND MASSA, 2013]. Ausgehend von diesen Fakten und dem unreifen Phänotyp, den NZK-infiltrierende slanDCs ausprägen, wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals der Einfluss von primären klarzelligen NZK-Linien sowie kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Linien auf die slanDC-vermittelte Aktivierung von CD4+ sowie CD8+ T-Lymphozyten analysiert. Interessanterweise besaßen sowohl die kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Linien ACHN und Caki-1, als auch die primären klarzelligen NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC die Fähigkeit, die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ T-Zellen zu hemmen. Weiterhin waren die beiden klarzelligen NZK-Linien ACHN und Caki-1 in der Lage, die slanDC-mediierte Proliferation von CD8+ T-Lymphozyten zu inhibieren. Im Einklang mit diesen Ergebnissen sind die Beobachtungen von Teng et al.. Sie zeigten, dass die Behandlung von MoDCs mit NZK-konditioniertem Medium zu einer Hemmung der MoDC-vermittelten T-Zell-Proliferation führt [TENG et al., 2014]. ercDCs hingegen übten keinen inhibitorischen Einfluss auf CTLs aus [FIGEL et al., 2011]. Das in dieser Arbeit beobachtete Defizit an kostimulatorischen Molekülen auf NZK-infiltrierenden slanDCs deutet darauf hin, dass die durch die Tumorumgebung beeinflussten slanDCs in vivo analog zu den in vitro Experimenten in ihrer Fähigkeit zur Induktion einer T-ZellAntwort gehemmt sein könnten. SlanDCs besitzen die Fähigkeit, die Differenzierung von naïven CD4+ T-Lymphozyten in TH1-Zellen zu induzieren [SCHÄKEL et al., 2006]. TH1-Zellen stellen wichtige Effektoren einer Tumor-gerichteten Immunantwort dar. Sie fördern die Entwicklung Tumor-reaktiver CTLs und sezernieren IFN-γ. Die durch TH2-Zellen sezernierten Zytokine IL-4 und IL-10 hingegen hemmen die Tumor-spezifische Immunantwort, indem sie die Produktion TH1-spezifischer Zytokine inhibieren [KNUTSON UND DISIS, 2005; RUFFELL et al., 2010]. In weiteren Untersuchungen dieser Dissertation wurde daher der Einfluss von ACHN, Caki-1, MZ1257RC sowie MZ2877RC auf die slanDC-vermittelte Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten analysiert. Bemerkenswerterweise wurde für alle vier untersuchten klarzelligen NZK-Zelllinien die 103 Diskussion Fähigkeit zur Inhibition der slanDC-vermittelten Programmierung naïver CD4+ T-Lymphozyten zu IFN-γ-produzierenden TH1-Zellen nachgewiesen. Eine vorherige Studie der Arbeitsgruppe hat gezeigt, dass slanDCs zur Produktion von IL-12 in der Lage sind. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass dieses Zytokin eine wichtige Rolle bei der slanDC-vermittelten Induktion einer effizienten TH1-Antwort spielt [SCHÄKEL et al., 2006]. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten NZK-infiltrierenden slanDCs zeigten einen IL-12-negativen Phänotyp. SlanDCs könnten in vivo folglich ebenfalls ein Defizit bei der Programmierung von naïven CD4+ T-Lymphozyten zu TH1-Zellen aufweisen. Unterstützt wird diese Vermutung durch die erst kürzlich veröffentlichte Studie von Li et al., die bei NZK-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden einen signifikant verringerten prozentualen Anteil an TH1-Zellen im peripheren Blut nachwiesen [LI et al., 2015]. Vergangene Studien zeigten weiterhin, dass das Vorliegen von TH1-Zellen bzw. die Expression von TH1-assoziierten Chemokinen in NZK-Geweben mit einer vorteilhaften Prognose für die Patienten assoziiert ist [CÒZAR et al., 2005; KONDO et al., 2006]. Fortgeschrittenere Tumore sowie die Ausbildung von Metastasen waren durch eine TH2-gerichtete T-Zell-Antwort charakterisiert [CÒZAR et al., 2005]. Còzar et al. stellten die Hypothese auf, dass sich eine anfängliche TH1-gerichtete Immunantwort in NZKs während des Krankheitsverlaufes schließlich in eine TH2-gerichtete Immunantwort wandelt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Differenzierung in IL-4-produzierende TH2-Zellen durch den Einfluss von NZK-Zellen auf slanDCs jedoch nicht gefördert. Diese Ergebnisse erbringen den Nachweis, dass klarzellige NZK-Zellen zu einer deutlichen Hemmung der slanDC-vermittelten Proliferation sowie Programmierung von T-Lymphozyten fähig sind. 4.4.2 Zugrunde liegende Mechanismen der Inhibition von slanDCs durch NZKs Die Tumorumgebung, welche auf NZK-infiltrierende DCs einwirkt, besteht aus einem großen, komplexen Netzwerk löslicher und zellulärer Komponenten. Die funktionelle Inhibition bzw. die funktionelle Modulation von Tumor-infiltrierenden DCs durch Komponenten der Tumorumgebung wird als wichtiger Prozess bei der Hemmung einer antitumoralen Immunantwort und der Progression von Tumoren angesehen [MA et al., 2013; STRIOGA et al., 2013]. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde 104 Diskussion nachgewiesen, dass klarzellige NZK-Zellen die Fähigkeit besitzen, die slanDCvermittelte Aktivierung von T-Lymphozyten effizient zu inhibieren. Im Folgenden wurde der zugrunde liegende Mechanismus dieser Inhibition untersucht. Verschiedene Studien berichten besonders von löslichen Tumor-abgeleiteten Molekülen wie Ganglioside, VEGF, TGF-β, PGE2, IL-6 und IL-10 im Kontext mit einer funktionellen Hemmung von DCs in Tumor-Geweben [KUSMARTSEV UND GABRILOVICH, 2006; MA et al., 2011; DUDEK et al., 2013; SELIGER UND MASSA, 2013]. Figel et al. zeigten, dass die Veränderungen von ercDCs in NZK-Geweben durch die Kombination der löslichen Faktoren IL-6, IL-8 und VEGF vermittelt werden. Darüber hinaus konnte der Phänotyp von ercDCs in Monozyten in vitro durch die Kultivierung mit IL-6, IL-8 sowie VEGF induziert werden [FIGEL et al., 2011]. Cabillic et al. beobachteten einen Zusammenhang zwischen einer hohen Sekretion von IL-6 sowie VEGF durch NZKZellen und einer Hemmung der DC-vermittelten Zytotoxizität von CTLs [CABILLIC et al., 2006]. Ausgehend von diesen Resultaten wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation untersucht, ob die funktionelle Hemmung von slanDCs durch NZK-Zellen ebenfalls über lösliche Faktoren vermittelt wird. Bei Transwell-Experimenten wurde dafür der direkte Zell-Zell-Kontakt zwischen slanDCs und Tumorzellen verhindert. Erstaunlicherweise führte die Unterbindung des direkten Zell-Zell-Kontaktes dazu, dass der inhibitorische Effekt von NZK-Zellen auf die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ T-Lymphozyten aufgehoben wurde. Dies lässt auf die Notwendigkeit von Oberflächenmolekülen bei der funktionellen Inhibition von slanDCs durch NZK-Zellen schließen. Bisher liegen nur wenige Studien vor, die einen inhibitorischen Effekt von Membrangebundenen Faktoren im Tumorgewebe auf die Funktionalität von DCs nachweisen. Die koinhibitorischen Oberflächenmoleküle der B7-Familie stellen jedoch aussichtsreiche Kandidaten für bedeutende Tumor-vermittelte immunsuppressive Effekte dar [FLIES UND CHEN, 2007; SELIGER UND QUANDT, 2012]. Für B7-H1 wurde demonstriert, dass eine hohe Expression auf NZK-Zellen sowie auf Tumorinfiltrierenden Immunzellen in der Regel mit einer schlechten Prognose für den Patienten einher geht [THOMPSON et al., 2004; THOMPSON et al., 2005; THOMPSON et al., 2006; KRAMBECK et al., 2007]. Antikörper, welche gegen B7-H1 oder gegen dessen Rezeptor PD-1 gerichtet sind, finden bereits in Form von klinischen Studien in der Therapie von NZKs Verwendung [BRAHMER et al., 2012; TOPALIAN et al., 2012; LIPSON et al., 2013]. Über eine Bedeutung von B7-DC im NZK wurde bislang nichts berichtet. Die Ausprägung von B7-DC im NZK-Gewebe wurde jedoch bereits 105 Diskussion nachgewiesen [ZHANG et al., 2006]. Darüber hinaus bindet B7-DC wie B7-H1 am Rezeptor PD-1 [LATCHMAN et al., 2001; MOMTAZ UND POSTOW , 2014]. Die Rezeptoren für B7-H3 sowie B7-H4 sind bisher unbekannt. Ein erhöhtes Vorkommen der beiden koinhibitorischen Moleküle auf NZK-Zellen ist jedoch mit der Progression des Tumors und mit einer verkürzten Lebenserwartung der Patienten assoziiert [KRAMBECK et al., 2006; CRISPEN et al., 2008; JUNG et al., 2011; QIN et al., 2013]. Auf dieser Grundlage erfolgte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Analyse der Expression von B7-H1, B7-H3, B7-H4 sowie B7-DC auf den NZK-Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC sowie MZ2877RC. Im Gegensatz zu B7-DC und B7-H4 wurde sowohl die Ausprägung von B7-H1, als auch die starke Expression von B7-H3 auf allen vier klarzelligen NZKLinien nachgewiesen. Im Einklang mit diesen Ergebnissen sind die Resultate von Quandt et al., die erst kürzlich die Ausprägung der koinhibitorischen B7-Moleküle B7-H1, B7-H3 und B7-H4 auf verschiedenen primären NZK-Zelllinien, darunter auch MZ1257RC sowie MZ2877RC, bestimmten. Dabei wurde gezeigt, dass B7-H3 gefolgt von B7-H1 die höchsten Expressionslevel auf den untersuchten NZK-Zellen aufweist, während eine nur schwache Ausprägung von B7-H4 detektiert werden konnte [QUANDT et al., 2014]. Crispen et al. wiesen ebenfalls die Koexpression von B7-H1 sowie B7-H3 und das Fehlen von B7-H4 auf einer kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Zelllinie namens Caki-2 nach [CRISPEN et al., 2008]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich die Expression des B7-H1-Rezeptors PD-1 auf frisch isolierten slanDCs demonstriert. Mit Peña-Cruz et al. zeigte erst eine weitere Arbeitsgruppe das Vorkommen von PD-1 auf humanen DCs. Sie stellten dar, dass PD-1 auf unreifen Langerhanszellen als koinhibitorischer Rezeptor wirkt und TLR-vermittelte Signale hemmt. Die Ligation von PD-1 durch B7-H1 hatte jedoch keinen Einfluss auf die Ausprägung der Marker CD83, CD80 sowie CD86 auf Langerhanszellen [PEÑA-CRUZ et al., 2010]. Weitere Studien wiesen das Vorkommen von PD-1 auf DCs in Mausmodellen nach und demonstrierten einen Zusammenhang zwischen der Expression dieses Rezeptors und der funktionellen Inhibition der DCs [YAO et al., 2009; KREMPSKI et al., 2011; PARK et al., 2014]. Entsprechend dieser Beobachtungen ist die funktionelle Modulation von slanDCs durch die Ligation von PD-1 mittels B7-H1 denkbar. Bisherige Studien zur Wirkung von B7-H1 und B7-H3 beziehen sich vor allem auf ihren Effekt auf T-Lymphozyten. So zeigten Quandt et al., dass die Expression von B7-H1 auf NZK-Zelllinien eine Hemmung der Proliferation allospezifischer CD8+ T-Lymphozyten zur Folge hat [QUANDT et al., 2014]. B7-H3 führte ebenfalls zur Hemmung der T-Zell-Proliferation sowie zur Inhibition der Zytokinproduktion 106 Diskussion stimulierter CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten [LEITNER et al., 2009]. Dong et al. demonstrierten weiterhin, dass Tumorzell-assoziiertes B7-H1 die Apoptose von Antigen-spezifischen T-Zellen fördert [DONG et al., 2002]. Über eine Wirkung von B7-H1 sowie B7-H3 auf humane DCs ist bisher kaum etwas bekannt. Um die Rolle von B7-H1 und B7-H3 bei der funktionellen Hemmung von slanDCs durch NZK-Zellen zu analysieren, kamen im Rahmen der vorliegenden Dissertation neutralisierende Antikörper zum Einsatz. Weder die Blockierung von B7-H1, noch von B7-H3 auf den NZK-Linien ACHN, Caki-1, MZ1257RC oder MZ2877RC hatte einen Einfluss auf die Inhibition der slanDC-vermittelten Proliferation von CD4+ T-Lymphozyten durch die NZK-Zellen. Auch die gleichzeitige Blockade von B7-H1 und B7-H3 führte zu keiner Aufhebung der NZK-induzierten funktionellen Hemmung der slanDCs. Aufgrund dieser Resultate ist davon auszugehen, dass die Interaktion von anderen Oberflächenmolekülen auf NZKs und slanDCs verantwortlich für die funktionelle Inhibition der slanDCs ist. Denkbar ist auch das Zusammenspiel verschiedener inhibitorischer Moleküle auf NZK-Zellen. 4.4.3 Hemmung der slanDC-induzierten Aktivierung von NK-Zellen durch NZK-Zellen Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit haben gezeigt, dass NZK-Zellen effizient die slanDC-vermittelte Proliferation sowie Differenzierung von T-Lymphozyten inhibieren. Frühere funktionelle Analysen der Arbeitsgruppe demonstrierten, dass slanDCs neben der Aktivierung von CD4+ sowie CD8+ T-Zellen auch zur Interaktion mit NK-Zellen fähig sind [SCHMITZ et al., 2005; W EHNER et al., 2009]. Durch ihre ausgeprägten zytotoxischen Effektorfunktionen übernehmen NK-Zellen eine außerordentlich wichtige Rolle in der antitumoralen Immunantwort. Neben der Fähigkeit, Tumorzellen der verschiedensten Entitäten Antigen-unspezifisch auf direktem Wege abzutöten, zeichnen sich aktivierte NK-Zellen durch die Sekretion großer Mengen des immunmodulatorischen Moleküls IFN-γ aus [LEVY et al., 2011; VIVIER et al., 2011]. Vermi et al. zeigten kürzlich, dass slanDCs in Lymphknotenmetastasen verschiedener Tumorentitäten in Kontakt mit NK-Zellen vorliegen [VERMI et al., 2014]. Bisher ist jedoch nur wenig über die Beeinflussung von NK-Zellen durch DCs bekannt, welche der Wirkung von Tumorzellen ausgesetzt waren [VITALE et al., 2014]. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation erstmals der Einfluss von primären klarzelligen NZK-Linien sowie von 107 Diskussion kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Linien auf die slanDC-vermittelte Aktivierung von autologen NK-Zellen untersucht. Frühere funktionelle Analysen ergaben, dass LPS-stimulierte slanDCs durch die Produktion von IL-12 sowie direkten Zell-ZellKontakt effizient in der Lage sind, NK-Zellen zu aktivieren. Diese slanDC-vermittelte Aktivierung war mit einer erhöhten IFN-γ-Produktion durch die NK-Zellen assoziiert [SCHMITZ et al., 2005; W EHNER et al., 2009]. Die in vorliegender Dissertation untersuchten klarzelligen NZK-Zelllinien ACHN, Caki-1, MZ1257RC und MZ2877RC riefen eine signifikante Hemmung der slanDC-vermittelten IFN-γ-Produktion durch NK-Zellen hervor. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass NZK-Zellen neben der Inhibition der slanDC-vermittelten T-Zell-Aktivierung auch auf andere Fähigkeiten der slanDCs, wie die Aktivierung von NK-Zellen, eine hemmende Wirkung ausüben. Vorherige Studien haben gezeigt, dass NZK-Zellen die Kapazität besitzen, NK-Zellen auf direktem Wege zu hemmen. Beispielsweise wird die Expression des Rezeptors CD94 auf NK-Zellen durch die Kultivierung mit NZK-Zellen erhöht, was in einer Reduktion der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen resultiert [STANLEY et al., 2001]. Bukur et al. demonstrierten, dass durch NZK-Zellen gebildetes HLA-G die Funktionalität von NK-Zellen inhibiert [BUKUR et al., 2003]. Kawasaki et al. zeigten weiterhin eine hemmende Wirkung von durch NZKs produzierten Gangliosiden auf NK-Zellen [KAWASAKI et al., 2010]. Während der Experimente für die vorliegende Doktorarbeit mussten die slanDCs von den adhärenten Tumorzellen separiert werden, bevor die Kultivierung mit autologen NK-Zellen erfolgte. Aufgrund dieses Schrittes lag eine Verunreinigung der slanDCs mit Tumorzellen von maximal 15 % vor. Ausgehend davon wurde der Einfluss einer 15%igen Verunreinigung durch Tumorzellen auf die Aktivierung von NK-Zellen untersucht. Die Kultivierung von NK-Zellen mit NZK-Zellen der Linien ACHN, Caki-1 und MZ1257RC hatte keinen Einfluss auf die Aktivierung von NK-Zellen. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass der inhibitorische Effekt dieser Tumorzellen auf NK-Zellen auf die NZK-vermittelte Modulation von slanDCs zurückzuführen ist. Die primäre NZK-Zelllinie MZ2877RC führte jedoch zur signifikanten Inhibition der IFN-γ-Produktion durch stimulierte NK-Zellen. Bei der Inhibition der slanDC-vermittelten NK-Zell-Aktivierung durch die primäre NZK-Linie MZ2877RC kann der direkte Einfluss der Tumorzellen auf die NK-Zellen daher nicht ausgeschlossen werden. 108 Diskussion 4.5 Bedeutung von slanDCs in NZKs – zwischen Tumorabwehr und Tumorprogression Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse über den Einfluss von NZKs auf den Phänotyp sowie die immunmodulatorischen Fähigkeiten von slanDCs sind in Abbildung 24 zusammengefasst. Sie geben neue Einblicke in die Interaktion zwischen NZKs und Tumor-infiltrierende DCs. SlanDCs, welche durch ausgeprägte antitumorale Eigenschaften gekennzeichnet sind, akkumulieren in primären klarzelligen NZK-Geweben. Zudem sind slanDCs in Lymphknotenmetastasen sowie Fernmetastasen von NZK-Patienten nachweisbar. NZK-infiltrierende slanDCs prägen einen unreifen Phänotyp aus. Dieser ist durch das Fehlen von CCR7, CD40, CD80 sowie CD83 und die geringe Expression von CD86 gekennzeichnet. SlanDCs im NZK-Gewebe sind weiterhin durch die fehlende Sekretion der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-12 charakterisiert. Diese phänotypischen Eigenschaften deuten auf ein geringes Potenzial zur Induktion einer effizienten antitumoralen T-Zell-Antwort sowie eine eingeschränkte Migration von slanDCs in Tumor-drainierende Lymphknoten hin. Diese unreifen slanDCs im NZKGewebe exprimieren darüber hinaus ILT3 sowie ILT4 auf ihrer Zelloberfläche und produzieren IL-10, was auf einen tolerogenen Phänotyp der DCs schließen lässt. Zudem besitzen klarzellige NZK-Zellen die Kapazität sowohl die slanDC-vermittelte Proliferation und Programmierung von T-Lymphozyten, als auch die Aktivierung von NK-Zellen inhibieren. Obwohl T-Lymphozyten sowie NK-Zellen NZK-Gewebe in großer Zahl infiltrieren [GEIGER et al., 2009], weisen die vorliegenden Untersuchungen darauf hin, dass diese Immunzellen nicht ausreichend durch Tumor-infiltrierende DCs aktiviert und stimuliert werden. Diese neuen Erkenntnisse deuten auf einen bisher unbekannten ImmunescapeMechanismus klarzelliger NZKs hin. Dieser besteht in der Induktion eines tolerogenen Phänotyps bei Tumor-infiltrierenden slanDCs und einem daraus resultierenden Defizit zur Aktivierung einer angeborenen sowie einer adaptiven Tumor-gerichteten Immunantwort. Der tolerogene Phänotyp der slanDCs könnte zu der durch Toma et al. beobachteten Korrelation zwischen einer hohen Dichte NZK-infiltrierender slanDCs und einer schlechten Prognose [TOMA et al., 2015] beitragen. Die dargelegten Erkenntnisse können förderlich für die Entwicklung von immuntherapeutischen Strategien zur Behandlung von NZKs sein, welche auf einer Verstärkung der antitumoralen Eigenschaften von DCs beruhen. 109 Diskussion Abbildung 24: (A) tolerogener Phänotyp klarzelliger NZK-Gewebe infiltrierender slanDCs in situ. SlanDCs akkumulieren sowohl in primären NZK-Geweben, als auch in Fernmetastasen + + sowie Lymphknotenmetastasen von NZK-Patienten. Tumor-infiltrierende CD16 HLA-DR slanDCs sind durch einen unreifen Phänotyp charakterisiert. Dieser zeichnet sich durch eine geringe Expression von CD86 sowie das Fehlen von CD40, CD80, CD83 und CCR7 auf der Zelloberfläche der slanDCs aus. Die proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-12 werden nicht produziert. Hingegen prägen die slanDCs ILT3 sowie ILT4 aus und produzieren IL-10. (B) Einfluss klarzelliger NZK-Zelllinien auf slanDCs in vitro. Aus humanem Blut gesunder + Spender isolierte slanDCs besitzen die Fähigkeit zur Stimulation der Proliferation von CD4 und + + CD8 T-Lymphozyten, zur Programmierung naïver CD4 T-Lymphozyten in IFN-γproduzierende TH1-Zellen sowie zur Aktivierung von NK-Zellen. Sowohl die kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Zelllinien ACHN und Caki-1, als auch die primären klarzelligen NZK-Zelllinien MZ1257RC und MZ2877RC hemmen das Potenzial von slanDCs, die + Proliferation sowie die Programmierung von CD4 T-Lymphozyten zu induzieren und die mit einer IFN-γ-Produktion einhergehende Aktivierung von NK-Zellen zu stimulieren. ACHN und + Caki-1 sind weiterhin in der Lage, die slanDC-vermittelte Proliferation von CD8 T-Zellen zu + inhibieren. Für die Hemmung der slanDC-vermittelten CD4 T-Zell-Proliferation durch klarzellige NZK-Zellen ist ein direkter Zell-Zell-Kontakt über Oberflächenmoleküle essenziell. 110 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Nierenzellkarzinome (NZKs) gelten als stark immunogene Tumore. Dies ist insbesondere auf die Infiltration durch verschiedene Immunzellpopulationen, wie T-Lymphozyten und Natürliche Killer (NK)-Zellen, sowie das klinische Ansprechen auf immuntherapeutische Strategien zurückzuführen. Bisher existieren jedoch nur sehr wenige Studien zur Rolle von humanen nativen dendritischen Zellen (DCs) in NZKGeweben und über die Tumor-vermittelte Modulation dieser DCs. DCs nehmen als professionelle Antigen-präsentierende Zellen eine zentrale Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der angeborenen sowie adaptiven Immunantwort ein. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der Effekt von klarzelligen NZKs auf den Phänotyp sowie die immunmodulatorischen Fähigkeiten von 6-sulfo LacNAc+ (slan)DCs evaluiert. SlanDCs, welche eine große Subpopulation humaner Blut-DCs darstellen, sind neben der Sekretion großer Mengen proinflammatorischer Zytokine dazu befähigt, Tumorzellen direkt zu lysieren. Des Weiteren sind slanDCs in der Lage, die antitumoralen Effekte von NK-Zellen zu fördern und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie Tumor-reaktive CD8+ T-Lymphozyten effizient zu stimulieren. Angesichts dieser proinflammatorischen Eigenschaften können slanDCs wesentlich an einer Tumorgerichteten Immunantwort beteiligt sein. Auf dieser Grundlage erfolgte im Rahmen der vorliegenden Arbeit der immunhistochemische Nachweis von slanDCs in klarzelligen NZK-Geweben. Im Vergleich zu Tumor-freiem Nierengewebe trat in den primären Tumorgeweben eine erhöhte Zahl infiltrierender slanDCs auf. Zudem wurde die Präsenz von slanDCs in Lymphknoten- sowie Fernmetastasen von NZK-Patienten beobachtet. Weiterführende Untersuchungen an frischen klarzelligen NZK-Geweben demonstrierten, dass NZK-infiltrierende slanDCs einen unreifen Phänotyp ausprägen und Interleukin-10 produzieren. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten funktionelle Analysen, bei denen der Einfluss der kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Linien ACHN und Caki-1 sowie der primären klarzelligen NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC auf bedeutende immunmodulatorische Fähigkeiten von slanDCs untersucht wurde. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass NZK-Zellen effektiv in der Lage sind, sowohl die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, als auch die slanDC-induzierte Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten in proinflammatorische T-Helfer 1-Zellen zu inhibieren. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass NZK-Zellen das Potenzial von slanDCs zur Aktivierung von NK-Zellen hemmen. Untersuchungen der zugrunde liegenden Mechanismen zeigten, 111 Zusammenfassung dass die funktionelle Inhibition von slanDCs durch klarzellige NZK-Zellen über membranständige Moleküle vermittelt wird. Die im Rahmen dieser Dissertation gewonnenen Erkenntnisse weisen darauf hin, dass NZKs die Ausreifung sowie wesentliche funktionelle Eigenschaften von DCs inhibieren. Dies deutet auf einen neuen Immunescape-Mechanismus klarzelliger NZKs hin, welcher auf einer Tumorzell-vermittelten Generierung von tolerogenen slanDCs basiert und eine unzureichende Aktivierung der angeborenen sowie adaptiven Tumorgerichteten Immunantwort zur Folge hat. Diese neuen Erkenntnisse können einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Interaktion von NZKs mit nativen humanen DCs leisten und die Konzeption neuer therapeutischer Strategien ermöglichen, welche auf einer Verstärkung der antitumoralen Eigenschaften von DCs beruhen. 112 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and molecular immunology. 7th edition. Philadelphia: Elsevier Saunders 2012. Ahmed KA, Wang L, Xiang J. A new dynamic model of three cell interactions for CTL responses. Oncoimmunology. 2012;1(8):1430-32. Akira S, Uematsu S, Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell 2006;124(4):783-801. Ananiev J, Gulubova MV, Manolova IM. 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Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Immunologie der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden unter der wissenschaftlichen Betreuung von Herrn Prof. Dr. med. M. Schmitz angefertigt. Ich erkläre hiermit, dass zuvor keine erfolglosen Promotionsverfahren stattgefunden haben. Ich erkenne die Promotionsordnung der Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften an der Technischen Universität Dresden an. Dresden, den 17. April 2015 __________________________ Anja Kloß 133 134 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich während der letzten Jahre unterstützt haben. Mein erster und besonderer Dank gebührt Prof. Dr. Marc Schmitz, der mich in seiner Arbeitsgruppe aufgenommen und mir dieses spannende Projekt anvertraut hat. Durch seine kompetente Unterstützung, seine ständige Diskussionsbereitschaft, seine offene sowie konstruktive Kritik und nicht zuletzt seine stete Motivation hat er wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Vielen Dank für diese lehrreiche Zeit! Prof. Dr. Michael Göttfert danke ich für sein Interesse an dieser Dissertation, seine Ratschläge und die angenehmen Pläuschchen mit ihm. Zudem bin ich dankbar für die Erstellung des Erstgutachtens sowie die freundliche Bereitschaft, diese Arbeit vor der biologischen Fakultät der TU Dresden zu vertreten. Für die hervorragende Betreuung und stete Unterstützung während der gesamten Zeit meiner Doktorarbeit möchte ich mich bei Frau Dr. Rebekka Wehner bedanken. Sie stand mir jederzeit sowohl bei praktischen, als auch bei theoretischen Problemen zur Seite. Aber auch ihre vielen lieben Worte und das ein oder andere Stück Motivationsschokolade haben bedeutend dazu beigetragen, dieses Kapitel meines Lebens zu bewältigen. Des Weiteren danke ich Prof. Dr. Barbara Seliger vom Institut für Medizinische Immunologie der Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg für die Bereitstellung der primären NZK-Linien sowie Prof. Dr. Torsten Tonn vom DRK-Blutspendedienst NordOst in Dresden für die Versorgung mit frischem Spenderblut in Form von „Buffy-coats“. Zudem bin ich Frau PD Dr. Susanne Füssel und Prof. Dr. Dr. Manfred Wirth der Klinik und Poliklinik für Urologie des Universitätsklinikums Carl Gustav Carus Dresden für das zur Verfügung stellen der frischen NZK-Gewebe dankbar. Frau Dr. Marieta Toma und Prof. Dr. Gustavo Baretton vom Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Carl Gustav Carus Dresden möchte ich für die Bereitstellung der Gewebeschnitte danken. Darüber hinaus gebührt Frau Dr. Marieta Toma mein Dank für die kompetente Unterstützung bei der Analyse der slanDCs im Gewebe. Mein Dank gilt zudem allen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern der AG Schmitz für das angenehme und offene Arbeitsklima, die große Hilfsbereitschaft und die vielen produktiven sowie spaßigen Stunden gemeinsam Stuhl an Stuhl vor der Sterilbank – den Laboralltag mit euch vermisse ich jetzt bereits sehr! Besonders hervorheben 135 möchte ich Karin Günther, die mir meine Arbeit im Labor mit ihrer warmherzigen Art und ihrer Unterstützung sehr erleichtert hat. Eine außerordentliche Freude war für mich die Zusammenarbeit mit Antje Tunger, die mich während meiner gesamten bisherigen wissenschaftlichen Laufbahn nicht nur als Studien- und Arbeitskollegin, sondern auch als beste Freundin begleitet hat. Sie war mir stets sowohl in fachlichen, als auch in privaten Belangen eine wertvolle Stütze. Ich wünsche Ihr beim Abschluss ihrer eigenen Dissertation viel Schaffenskraft und Erfolg. Ganz herzlich möchte ich mich bei meinen Freunden und meiner Familie dafür bedanken, dass sie immer für mich da sind. Meinen Eltern, die mir durch ihre fortwährende Liebe und Unterstützung meinen Lebensweg geebnet und ermöglicht haben, gilt besonderer Dank. Meiner Schwester Dr. Katrin Neumann bin ich ebenfalls zu großem Dank verpflichtet. Sie war mir bisher in vielen Gesichtspunkten ein großes Vorbild und hat auch meinen wissenschaftlichen Werdegang wesentlich geprägt. Der größte Dank gebührt meinem Partner Tony für die Liebe und die Geduld, die er in den letzten Jahren immer wieder für mich aufbrachte, auch wenn er mich oft entbehren musste. Danke dafür, dass du mich stets motivierst und es dennoch nie aufgibst, mich ab und an auf andere Gedanken zu bringen, dass ich neue Kraft schöpfen kann. 136
