Klonierung, Sequenzierung und Charakterisierung eines neuen
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Aus dem Institut für Virologie der Universität zu Köln Direktor: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Dr. h. c. H. Pfister Klonierung, Sequenzierung und Charakterisierung eines neuen kutanen Humanen Papillomvirus Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Marko Werner aus Zeitz promoviert am 10. Juni 2015 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2015 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatterin: Frau Professor Dr. med. U. Wieland 2. Berichterstatterin: Frau Professor Dr. rer. nat. D. Mörsdorf Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten: Frau Prof. Dr. med. U. Wieland, Frau Dr. rer. nat. S. Silling und den medizinischtechnischen Assistentinnen Frau Monika Junk und Frau Nabila Ristow. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den 16.12.2014 Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind von mir mit Unterstützung von Frau Prof. Dr. med. U. Wieland, Frau Dr. rer. nat. S. Silling und den medizinischtechnischen Assistentinnen Frau Monika Junk und Frau Nabila Ristow durchgeführt worden. Danksagung Frau Prof. Dr. med. U. Wieland danke ich für die Überlassung des Arbeitsthemas sowie für ihre ständige Unterstützung während des gesamten Zeitraumes, über den sich diese Arbeit erstreckt hat. Frau Dr. rer. nat. Steffi Silling danke ich für die engagierte Betreuung während des gesamten Zeitraumes, insbesondere bei der Einarbeitung in die Arbeitsmethoden sowie bei der Auswertung der Ergebnisse. Bei Frau Monika Junk (MTA) und Frau Nabila Ristow möchte ich mich ebenfalls für die geduldige Unterstützung und die Einweisung in verschiedene Arbeitstechniken bedanken. Herrn Prof. Dr. med. A. Kreuter und seinen Mitarbeitern, sowie der Patientin danke ich für die zur Verfügung gestellten Proben. Denen gewidmet, die mich begleiten Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Seite 1. Einleitung 1.1. Aufbau, Einteilung und Phylogenese humaner Papillomviren 1 1.2. Klinik Humaner Papillomvirus-Infektionen 4 1.3. HPV-induzierte Warzen bei Immunsupprimierten 8 1.4. Krankengeschichte einer Patientin mit generalisierter Verrucosis 10 1.5. Zielsetzung der Arbeit 12 2. Material 2.1. Geräte 13 2.2. Laborbedarf 13 2.3. Reagenzien und Medien 14 2.4. Enzyme und Reagenziensysteme 14 2.5. Primer 15 2.6. Puffer und Lösungen 16 2.7. Software 17 2.8. Patientenproben 17 . 3. Methoden 3.1. DNA-Extraktion aus Hautwarzen-Biopsien 18 3.2. Rolling Circle Amplification (RCA) 18 3.2.1. Prinzip der RCA 18 3.2.2. RCA-Ansatz 18 3.3. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 19 3.3.1. Prinzip der PCR 19 3.3.2. PCR-Ansätze 21 3.3.2.1. Ansatz für 1 kb-Fragmente (für Sequenzanalysen) 21 3.3.2.2. Ansatz für 3 kb-Fragmente (für Klonierungsansätze) 21 3.3.3. PCR-Thermoprofile 22 3.3.4. PCR-Produkt-Detektion (Agarose-Gelelektrophorese) 23 3.4. Sequenzierung 23 3.5. Klonierung 24 3.5.1. Ligation 24 3.5.2. Transformation 24 3.6. Isolierung von Plasmid-DNA 24 3.7. Restriktionsanalysen 25 4. Ergebnisse 4.1. HPV-Typisierung 26 4.2. Rolling Circle Amplification 27 4.3. Bestimmung der HPVXS2-Sequenz 29 4.4. Klonierung des HPVXS2-Genoms 36 4.5. HPVXS2 Genomanalyse 38 4.5.1. Open Reading Frames (ORFs) 38 4.5.2. Nicht kodierende Region (NCR) von HPVXS2 40 4.5.3. Phylogenetische Analyse 41 4.5.4. L1-Aminosäure Alignment 42 5. Diskussion 44 6. Zusammenfassung 48 7. Literaturverzeichnis 50 8. Vorabveröffentlichung von Ergebnissen 61 9. Lebenslauf 62 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung AIN anale intraepitheliale Neoplasie AS Aminosäure bp Basenpaare bzw. beziehungsweise CIN cervicale intraepitheliale Neoplasie CIS Carcinoma in situ CLL chronische lymphatische Leukämie dNTP Desoxynukleosidtriphosphat(e) dATP Desoxyadenosintriphoshat dCTP Desoxycytidintriphoshat dGTP Desoxyguanosintriphoshat dTTP Desoxythymidintriphoshat d.h. das heißt DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EV Epidermodysplasia verrruciformis fw forward (vorwärts) HCl Salzsäure HIV Humanes Immundefizienz Virus HPV Humanes Papillomvirus HR Hochrisiko (high risk) IN intraepitheliale Neoplasie kb Kilobasen KCl Kaliumchlorid kD Kilodalton L Liter LCR Long control region LB Luria-Bertani-Medium LR Niedrigrisiko (low risk) μl Mikroliter µg Mikrogramm M Mol m milli ml Milliliter MgCl2 Magnesiumchlorid MSM Männer, die Sex mit Männern haben NCBI National Center for Biotechnology Information NCR nicht-kodierende Region ng Nanogramm ORF Open reading frame (offener Leserahmen) OTRs Organtransplantat-Empfänger PCR Polymerase-Kettenreaktion PEK Plattenepithelkarzinom PIN penile intraepitheliale Neoplasie pRB Retinoblastoma-Protein PV Papillomviren RCA Rolling Circle Amplifikation rev reverse (rückwärts) RNA Ribonukleinsäure s.o. siehe oben Tab. Tabelle TE Tris-EDTA-Puffer Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan u.a. unter anderem UA Unterarm UpM Umdrehungen pro Minute URR Upstream regulatory region VAIN vaginale intraepitheliale Neoplasie VIN vulväre intraepitheliale Neoplasie Z.n. Zustand nach z.B. zum Beispiel Einleitung 1. Einleitung 1.1. Aufbau, Einteilung und Phylogenese humaner Papillomviren Papillomviren (PV) bilden die Familie der Papillomaviridae. Es sind kleine, unbehüllte Viren, welche einen Durchmesser von ungefähr 55-60 nm besitzen. Ihr Genom besteht aus ringförmig geschlossener, doppelsträngiger DNA von zirka 7000-8000 Basenpaaren (bp). Die virale Nukleinsäure liegt in einem ikosaedrischen Kapsid verpackt vor (Wieland & Pfister, 2009; IARC, 2011). Gegenwärtig sind 199 komplett klassifizierte Humane Papillomvirus (HPV)-Genotypen und eine Vielzahl an partiellen HPV-DNA-Sequenzen bekannt, die wahrscheinlich noch nicht klassifizierte HPV-Typen darstellen (de Villiers, 2013; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/ > Viruses > Papillomaviridae, http://ki.se/en/labmed/international-hpv-reference-center). Die einzelnen HPV-Typen unterscheiden sich definitionsgemäß in über 10% ihrer L1Gen-Sequenz (de Villiers et al., 2004; Bernard, 2013). Das Genom von Humanen Papillomviren kann in eine kodierende und eine nicht-kodierende Region eingeteilt werden. Der kodierende Abschnitt setzt sich aus den frühen („early“, E) sowie den späten („late“, L) Genen zusammen. Die frühe Region kodiert für die Proteine E1, E2, E4, E5, E6 und E7 (Doorbar, 2005). E1, E2 und E4 sind für die Replikation der viralen DNA, für die Transkription der viralen Gene und für die Virusfreisetzung notwendig (Wieland & Pfister, 2009). Die viralen Onkoproteine E6 und E7 inaktivieren Tumorsuppressor-Proteine wie p53 (E6) und pRB (Retinoblastoma-Protein; E7). Das Onkoprotein E5 fehlt bei manchen kutanen HPV-Typen (Tab. 1). Die späte Region kodiert für die Kapsidproteine L1 (Hauptkapsidprotein) und L2 (Nebenkapsidprotein) (Doorbar, 2005). Die Funktionen der HPV-Genprodukte sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Der nicht-kodierende Abschnitt (NCR), auch LCR (long control region) oder URR (upstream regulatory region) genannt, ist wichtig für die Regulation der Expression aller HPV-Gene, da dieser Bereich u.a. Promotoren und Bindestellen für Transkriptionsfaktoren enthält (Lazarczyk et al., 2009). 1 Einleitung Genprodukt Funktion E1 Initiation der Replikation der viralen DNA, Helikase-Aktivität E2 Regulation der Transkription, Unterstützung der viralen DNAReplikation, Enkapsidation der viralen DNA in neue Virionen E4 Kollaps des Zytokeratin-Netzwerkes (Virusfreisetzung) E5 Onkoprotein, membranständig, schwach transformierend, aktiviert Wachstumsfaktor-Rezeptoren wie EGFR, stimuliert die zelluläre DNA-Synthese; das E5-Gen fehlt bei EV-assoziierten HPV-Typen (HPV Spezies B1) E6 Onkoprotein, immortalisiert Keratinozyten in Kooperation mit E7, u.a. p53-Bindung und -Degradierung E7 Onkoprotein, immortalisiert Keratinozyten in Kooperation mit E6, u.a. pRB-Inaktivierung, transkriptioneller Transaktivator L1 Hauptkapsid-Protein, 80% der gesamten viralen Proteinmasse, 55 kD, trägt die immundominanten neutralisierenden Epitope L2 Nebenkapsidprotein (Interaktion mit L1), 70 kD, Erhöhung der Infektiosität der Viruspartikel durch Unterstützung des Einbaus der viralen DNA in das Kapsid; trägt auch neutralisierende Epitope Tab. 1: HPV-Genprodukte (nach Wieland & Pfister, 2003; Bergvall et al., 2013; Doorbar, 2013; McBride, 2013; Buck et al., 2013; Roman & Munger, 2013; DiMaio & Petti, 2013; Vande & Klingelhutz, 2013; Wang & Roden, 2013). Die verschiedenen Gewebetropismus HPV-Typen unterscheiden (schleimhautassoziierte und sich kutane voneinander in ihrem HPV-Typen), in ihrem onkogenen Potenzial und in der klinischen Manifestation (de Villiers et al., 2004). Phylogenetisch werden die bisher bekannten HPV-Typen in fünf verschiedene Genera (Alpha, Beta, Gamma, Mu und Nu) eingeteilt (Bernard, 2013). Alpha-HPV rufen vorwiegend genitale/schleimhautassoziierte Läsionen hervor. Alpha-HPV werden gemäß ihrem onkogenem Potenzial in Niedrigrisiko (LR)-Typen und Hochrisiko (HR)HPV-Typen unterteilt. HR-Typen, wie z.B. HPV16 und HPV18 werden in anogenitalen Karzinomen gefunden, LR-Typen (u.a. HPV6, 11) hingegen in gutartigen Läsionen (Warzen) oder in niedrig-gradigen (Grad 1, low-grade) anogenitalen intraepithelialen Dysplasien (Muñoz et al., 2003). Die anderen Genera umfassen kutane HPV-Typen (Wieland & Pfister, 2006). HPVs des Genus Beta sind mit Läsionen von Patienten mit 2 Einleitung der seltenen Genodermatose Epidermodysplasia verrruciformis (EV) assoziiert (Cardoso & Calonje, 2011), man findet sie aber auch regelmäßig auf gesunder Haut (Rübben, 2011). Die Rolle von Beta-HPVs bei der Entstehung kutaner Plattenepithelkarzinome (PEK) bei Nicht-EV Patienten ist Gegenstand aktueller Forschung (Arron et al., 2011; Neale et al., 2013; Ding et al., 2014; Wieland et al., 2014). Gamma-, Mu- und Nu-HPVs sind in verschiedenen Formen von Hautwarzen zu finden (Wieland & Pfister, 2006; Rübben, 2011). Der phylogenetische Baum der humanen und einiger animaler Papillomviren ist in Abbildung 1 zu sehen. Abb. 1: Phylogenetische Einteilung von 170 humanen und einzelnen animalen (rosa markiert) Papillomviren (L1-Gen) (Stammbaum aus de Villiers, 2013). HPV finden sich in den Genera Alpha, Beta, Gamma, Mu und Nu. 3 Einleitung 1.2. Klinik Humaner Papillomvirus-Infektionen In Abhängigkeit vom vorliegenden Typ können HPV benigne oder maligne Tumoren der Haut oder der Schleimhäute hervorrufen (Wieland & Pfister 2006; Wieland & Pfister, 2009; IARC, 2011). Zu den benignen, kutanen HPV-Läsionen werden verschiedene Formen von Warzen gezählt. Die häufigsten sind dabei Verrucae plantares (Plantarwarzen), Verrucae vulgares (Vulgärwarzen) und Verrucae planae juveniles. Plantarwarzen machen 30% aller Warzen aus. Der Prävalenzgipfel liegt im jungen Erwachsenenalter. Die meisten Verrucae plantares tragen HPV1, seltener auch HPV4 (Cardoso & Calonje, 2011). Verrucae planae juveniles kommen überwiegend multipel im Gesicht vor und enthalten vor allem HPV3 und HPV10. Betroffen sind vor allem Jugendliche und junge Erwachsene. Die Warzen können auch an den Handrücken auftreten und werden dort als Intermediärwarzen bezeichnet (Rübben, 2011). Vulgärwarzen haben eine hohe Inzidenz in jüngeren Altersgruppen der Normalbevölkerung. Am häufigsten sind sie bei Kindern. Schätzungen gehen von einer Prävalenz von 3,5% bei Erwachsenen bis zu 33% bei Schulkindern aus. Am häufigsten kommen sie an den Händen vor, vorzugsweise an den Fingern (Cardoso & Calonje, 2011). Metzgerwarzen stellen eine Sonderform der Vulgärwarzen dar. Sie werden durch HPV7 verursacht und finden sich an den Händen von Metzgern, Fleischfabrikarbeitern und Fischhändlern. Die Inkubationszeit für Hautwarzen beträgt 3 bis 4 Monate. Die meisten Hautwarzen persistieren für einige Monate und heilen bei Immunkompetenten in der Regel innerhalb von zwei Jahren spontan ab, sie können aber auch wesentlich länger vorhanden sein (Wieland & Pfister, 2006; Wieland & Pfister, 2009; Rübben, 2011). Tabelle 2 gibt einen Überblick über die in Warzen gefundenen HPV-Typen. HPV-Typen in Warzen Klinische Manifestation HPV-Typen (häufige Typen sind fett gedruckt) Vulgärwarzen (Verrucae vulgares) 1, 2, 4, 26, 27, 28, 29, 41, 57, 75-78, 117 Tiefe Plantarwarzen (Myrmezien) 1, 2, 4, 63 Mosaikwarzen (plantar) 2, 4, 27, 57 Einschlußwarzen der Fußsohle 60, 63, 65 Verrucae planae juveniles 3, 10, 28, 29, 41, 49 4 Einleitung Metzgerwarzen 7 Pigmentierte Warzen 4, 60, 65 Hautwarzen von Transplantierten/ Immunsupprimierten 1-6, 8, 10, 12, 15-17, 25, 27-29, 41, 49, 57, 75-78, 117, 128-134 Tab. 2: Klinische Manifestation und HPV-Typen in Warzen (nach Kruger-Corcoran et al., 2010; Rübben, 2011 und nach dem Leistungsverzeichnis des Instituts für Virologie der Uniklinik Köln unter http://virologie.uk-koeln.de/diagnostik). Bei den genitalen HPV kann man LR-HPV von HR-HPV unterscheiden, abhängig von ihrem onkogenen Potential. LR-Typen kommen vor allem in Kondylomen (Genitalwarzen, Feigwarzen, spitze Kondylome, Condylomata acuminata) vor (Stanley, 2010). Im Anogenitalbereich sind Kondylome die häufigsten gutartigen Tumore. Sie kommen überwiegend bei sexuell aktiven Personen vor. Die Inkubationszeit beträgt etwa drei Monate (Wieland & Pfister, 2006). Kondylome enthalten in über 90% HPV6 und HPV11 (Daniel & Murrell, 2013). Bei Männern sind Kondylome gewöhnlich an der Glans penis und am Penisschaft lokalisiert. Sie sind bei unbeschnittenen Männern häufiger als bei Beschnittenen. Bei Frauen findet man Kondylome überwiegend am externen Genitale, wobei Läsionen auch an der Zervix gefunden werden (Cardoso & Calonje, 2011). HR-HPV (u.a. 16, 18, 31, 33, 35, 45, 56, 58) sind für anogenitale Karzinome und intraepitheliale Neoplasien, vor allem des Gebärmutterhalses verantwortlich (Stanley, 2010). HPV-induzierte anogenitale Karzinome entstehen aus Vorläuferläsionen, den intraepithelialen Neoplasien (IN). Histologisch werden die IN in drei Grade eingeteilt, abhängig von der Ausbreitung der dysplastischen Zellen im Epithelverbund (Fenger & Nielsen, 1981). IN1 werden als gering-gradige (low-grade) Dysplasien, IN2 und IN3 als hochgradige (high-grade) Dysplasien bezeichnet (Fenger & Nielsen, 1981; Solomon et al., 2002). Das Zervixkarzinom ist das häufigste HPV-induzierte Karzinom und der zweithäufigste maligne Tumor bei Frauen weltweit (Clark et al., 2004). An der Cervix uteri induzieren HR- und LR-HPV zunächst milde Dysplasien, die jedoch im Fall der HR-HPV eine Progression zum Karzinom nehmen können (Schiffman et al., 2007; Wieland & Pfister, 2009). HIV-positive Männer, die Sex mit Männern haben (MSM), haben ein hohes Risiko für ein HPV-bedingtes Analkarzinom. Mehr als 90% der HIV-positiven Männer haben Infektionen mit oftmals multiplen HPV-Typen im Analbereich. Bei ungefähr einem Drittel findet man hochgradige anale intraepitheliale Neoplasien (AIN) (Clark et 5 Einleitung al., 2004; Kreuter et al., 2010). In Karzinomvorstufen von Penis (PIN), Vulva (VIN) und Vagina (VAIN) lässt sich oft HR-HPV-DNA nachweisen, aber nicht mit solcher Regelmäßigkeit wie bei zervikalen intraepithelialen Neoplasien (CIN) oder analen intraepithelialen Neoplasien. Larynxpapillome und die fokale epitheliale Hyperplasie Heck sind die wichtigsten HPV-bedingten gutartigen Tumore im Kopf-Hals Bereich (Wieland & Pfister, 2009). HR-HPV, insbesondere HPV16, findet man auch regelmäßig in malignen Tumoren des Kopf-Hals Bereichs, wie z.B. in Tonsillen- oder Zungenwurzelkarzinomen (Panwar et al., 2014). Bei immungesunden Personen sind anogenitale Infektionen mit HPV meistens transient. Nur ein kleiner Prozentsatz der Infizierten entwickelt ein Karzinom, dem eine mehrjährige persistierende Infektion mit einem Hochrisiko HPV-Typ vorausgeht (Clark et al., 2004; Schiffman et al., 2007). Immunsupprimierte Menschen wie HIV-Infizierte oder Organtransplantierte (OTRs) haben höhere Raten persistierender HPVInfektionen und somit auch ein wesentlich höheres Risiko für HPV-bedingte Karzinome. Dies gilt für alle HPV-assoziierten anogenitalen Karzinome (Zervix, Vulva, Vagina, Penis, Anus), wie auch für Karzinome des Mundbodens und des Oropharynx (Grulich et al., 2007; Abraham et al., 2013). Wie bereits oben erwähnt, spielen Beta-Papillomviren möglicherweise eine Rolle bei der Entstehung von Plattenepithelkarzinomen der Haut. Immunsupprimierte, organtransplantierte Patienten haben ein 250-fach erhöhtes Risiko für die Entwicklung von aktinischen Keratosen, die als präkanzeröse Läsionen angesehen werden und sich zum Carcinoma in situ (CIS) und zum invasiven PEK der Haut entwickeln können (Stockfleth et al., 2002; Ackerman, 2003; Euvrard et al., 2003; Wieland et al., 2014). Verglichen mit der immunkompetenten Population haben diese Patienten ein 100- bis 250-fach höheres Risiko für die Entstehung von invasiven kutanen PEK (Stockfleth et al., 2002; Euvrard et al., 2003). Die Inzidenz von PEK steigt mit den Jahren nach Beginn der Immunsuppression stetig an und ist zudem auch abhängig von klimatischen Bedingungen. In Ländern mit viel Sonnenlichtexposition findet man höhere Inzidenzraten als in Ländern mit weniger UV-Strahlung (Bouwes et al., 1996; Jensen et al., 1999; Ramsay et al., 2002; Proby et al., 2009). In Tabelle 3 sind HPV-assoziierte benigne und maligne Erkrankungen, sowie die jeweils auslösenden HPV-Typen zusammengefasst. 6 Einleitung LÄSIONEN HPV-TYPEN (häufige Typen sind fett gedruckt) Benigne anogenitale Läsionen Feigwarzen (Condylomata acuminata) 6, 11, 2, 16, 27, 30, 40-42, 44, 45, 54, 55, 57, 61, 90 Anogenitale Krebsvorstufen Cervikale (CIN), vaginale (VAIN), vulväre (VIN), 6, 11, 16, 18, 26-27, 30-35, 39, 40, 42-45, 51-59, anale (AIN), penile (PIN) intraepitheliale 61-62, 64, 66-74, 81-87, 89-91, 97, 101, 108, 114, # Neoplasien Anogenitale Karzinome Zervixkarzinom 16, 18, 31, 33, 45, seltener: HPV26, 33, 35, 39, 51-53, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 70, 73, 82 Vagina-, Vulva-, Anal-, Peniskarzinome 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 Buschke-Löwenstein-Tumoren 6, 11 Kutane Krebsvorstufen Aktinische Keratose und M. Bowen 1-8, 11, 12, 14-22, 24-25, 31, 34-38, 40, 73, 93-94, 98-100, 107, # Kutane Karzinome Basaliome und Plattenepithelkarzinome von 1, 2, 4-9, 11, 14-25, 27-29, 32, 33, 34, 36-38, Transplantierten und Immunkompetenten 41-42, 48, 51, 54, 56, 58, 60, 61, 65, 69, 70, 77, 92, 94, 96, 98-100, 104, 105, 109-111, 113, # Digitale Plattenepithelkarzinome 2, 16, 18, 26, 31, 34, 35, 73, # Plattenepithelkarzinome von 5, 8, 14, 17, 20, 47 EV*-Patienten Benigne Kopf- und Hals-Tumoren Larynxpapillome 6, 11 Konjunktivalpapillome 6, 11 Nasalpapillome 6, 11, 57 Fokale epitheliale Hyperplasie Heck 13, 32 Orale Papillome und Leukoplakien 1, 2, 6, 7, 11, 13, 16, 18, 32, 57, 72, 73 Sonstige Karzinome Larynxkarzinome 6, 11, 16, 18, 30, 31, 33, 35, 45 Orale und Pharynxkarzinome 16, 6, 11, 18 Tonsillenkarzinome 16, 5, 6, 11, 18, 31, 33, # Ösophaguskarzinome 6, 11, 9, 13, 16, 18, 20, 24, 25, 30, 31, 33, 38, 39, 51, 52. 57, 73, # Nasale/ Sinonasale Karzinome 6, 11, 16, 18, 57 Konjunktival-, Lid-, Tränensackkarzinome 6, 11, 14, 16, 18, 24, 36-38, # Tab. 3: HPV-induzierte Läsionen und verursachende Virustypen. (nach dem Leistungsverzeichnis des Instituts für Virologie der Uniklinik Köln unter http://virologie.uk-koeln.de/diagnostik). 7 Einleitung # unklassifizierte HPV-Typen; * Epidermodysplasia verrruciformis. In der Tabelle nicht aufgeführte HPV-Typen: HPV88 und HPV95 sind kutane HPVs, zu denen bisher keine weiteren Informationen veröffentlicht wurden. HPV79 wurde aus dem Genitalbereich und HPV80 aus normaler Haut isoliert. HPV97, 102 und 103 wurden aus normalen zervikovaginalen Zellen isoliert. HPV156, 161-166 und 169-170 wurden aus gesunder Haut isoliert. 1.3. HPV-induzierte Warzen bei Immunsupprimierten Chronische Immunsuppression ist ein wichtiger Risikofaktor für eine persistierende HPV-Infektion und für die Entstehung von HPV-induzierten Erkrankungen. Ursächlich für eine chronische Immunschwäche sind vererbte Immundefekte, iatrogene Immunsuppression (immunsuppressive Therapie bei organtransplantierten Patienten, Patienten mit Autoimmunerkrankungen, Krebspatienten unter Chemotherapie) oder erworbene Krankheiten wie eine Infektion mit dem Humanen Immundefizienz Virus (HIV) Typ 1 oder 2. Abhängig von der Schwere und der Art der Immunsuppression überwiegen verschiedene HPV-assoziierte Erkrankungen (Wieland et al., 2014). Im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung haben immunsupprimierte Patienten ein erhöhtes Risiko für das Auftreten von Genitalwarzen (Condylomata acuminata) und Hautwarzen. Dies betrifft HIV-Infizierte und Organtransplantierte, ebenso wie Patienten mit einer angeborenen Immunschwäche (Dolev et al., 2008; Kruger-Corcoran et al., 2010; Johnston et al., 2011; Low et al., 2011; Leiding & Holland, 2012; Sri et al., 2012; Wieland et al., 2014). In zwei Studien konnte innerhalb einer Zeit von 8 Jahren gezeigt werden, dass über 25% der Frauen und mehr als 50% der Männer mit einer HIVInfektion, Genitalwarzen aufwiesen (Dolev et al., 2008; Wieland & Kreuter, 2011). Die Inzidenz von Genitalwarzen ist bei HIV-positiven Patienten im Vergleich zu HIVNegativen um das Zehnfache (8,2 gegenüber 0,8 pro 100 Personenjahren) erhöht (Chirgwin et al., 1995). HPV6 und HPV11 sind die vorherrschenden HPV-Typen in Genitalwarzen, sowohl bei immungesunden als auch bei HIV-positiven Patienten. Es werden aber auch andere HPV-Typen, wie z.B. HPV42 oder HPV61 in einem Drittel der Genitalwarzen HIV-Infizierter gefunden (Wieland & Kreuter, 2011). HIV-positive Patienten haben auch ein erhöhtes Risiko für Hautwarzen (Verrucae vulgares, Verrucae plantares, periorale und Gesichtswarzen) im Vergleich zu HIV-negativen Individuen (Dolev et al., 2008; Zancanaro et al., 2006; Johnston et al., 2011). Die Verteilung der einzelnen HPV-Typen, die in Hautwarzen von HIV-positiven Patienten zu finden sind, scheinen dem der Normalbevölkerung sehr ähnlich zu sein (Greenspan et al., 1988; Völter et al., 1996; Cameron & Hagensee, 2008). Hautwarzen findet man häufig bei Organtransplantierten, wobei in verschiedenen Studien die Zahlen von 12% (Dicle et al., 2008), 28% (Kinder nach Nierentransplantation; Lunn et al., 2010) über 8 Einleitung 52% (Zachariae et al., 2012) bis zu 92% (Dyall-Smith et al., 1991) reichen. Bei OTRs findet man häufig multiple und disseminierte Hautwarzen, die oftmals ein schnelles Wachstum aufweisen und in der Behandlung sehr hartnäckig sind. Sie werden auch an atypischen Lokalisationen gefunden, wie z.B. am Rücken. Ihre Anzahl steigt mit den Jahren nach Transplantation an und beeinträchtigt die Lebensqualität der Patienten deutlich (Dyall-Smith et al., 1991; Moloney et al., 2005; Kruger-Corcoran et al., 2010; Zachariae et al., 2012). In Folge der höheren Immunsuppressiva-Gabe bei Herz- oder Lungentransplantierten im Vergleich zu Lebertransplantierten, besteht bei Ersteren beiden ein höheres Risiko für die Entstehung von Warzen (Kruger-Corcoran et al., 2010). Die HPV-Typen in Hautwarzen bei organtransplantierten Patienten entsprechen in der Regel denen der Normalbevölkerung (HPV1, 2, 4, 10, 27, 57), aber auch seltene Typen wie HPV28, 29, 77, 94, 117 (Alpha-PV), zahlreiche Beta-Papillomviren oder neue Gamma-HPV-Typen wurden in Hautwarzen Organtransplantierter entdeckt (siehe dazu auch Tab. 2) (Gassenmaier et al., 1986; Dyall-Smith et al., 1991; Obalek et al., 1992; Harwood et al., 1999; Köhler et al., 2010 und 2011). Genitalwarzen wurden auch bei OTRs beschrieben. Sie treten jedoch nicht so häufig auf wie Hautwarzen bei diesem Patientenkollektiv und sind seltener als bei HIV-Infizierten. Genitalwarzen wurden bei 1,7% von 173 Nierentransplantierten gefunden, während Hautwarzen bei 32,4% dieser Patienten aufgetreten sind (Moloney et al., 2005). In einer anderen Studie hatten 1,9% von 1002 OTRs innerhalb von 6 Jahren nach Transplantation anogenitale Warzen (Euvrard et al., 1997). Patienten mit einer angeborenen Immunschwäche können eine generalisierte Verrucosis entwickeln. Mutationen in bestimmten Genen wie EVER1, EVER2 oder DOCK8 (Hyper-IgE Syndrom) sind mit symptomatischen HPV-Infektionen neben weiteren dermatologischen und hämatologischen Manifestationen, oder auch anogenitalen Dysplasien assoziiert (Low et al., 2011; Leiding & Holland, 2012; Sri et al, 2012). Im Falle von generalisierter Verrucosis können sich die Warzen auf mehrere Körperregionen ausbreiten oder sich auf ein akrales Verteilungsmuster beschränken und hauptsächlich die Finger befallen (Sri et al., 2012). In den Warzen von Patienten mit generalisierter Verrucosis werden gewöhnlich dieselben HPV-Typen gefunden wie in Warzen der Allgemeinbevölkerung (Potthoff et al., 2012; Sri et al., 2012). Generalisierte Verrucosis kann auch bei erworbenen Immunschwächen wie chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) oder Organtransplantation auftreten (Sri et al., 2012). 9 Einleitung 1.4. Krankengeschichte einer Patientin mit generalisierter Verrucosis Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Warzen-Biopsien stammten von einer 1938 geborenen Patientin mit generalisierter Verrucosis. Ihre Krankengeschichte beinhaltete eine langjährige Immunsuppression. 1979 wurde die Diagnose einer chronisch lymphatischen B-Zell Leukämie gestellt. Die Behandlung erfolgte mit Chlorambucil und Prednisolon, gefolgt von einer Radiatio und einer Splenektomie. Dies führte zu einer kompletten Remission der Leukämie. Im Oktober 2002 wurde ein Karzinom der Mamma diagnostiziert. Die Therapie beinhaltete eine chirurgische Entfernung der Brust, Lymphknotenextirpationen und eine sich anschließende Chemotherapie mit sechs Zyklen zwischen November 2002 und März 2003. Nach über 12 Jahren langsam fortschreitender Entwicklung von Hautwarzen, begab sich die Patientin im Februar 2010 in erneute medizinische Versorgung. Bereits von Oktober 2005 bis Dezember 2009 waren topische und ablative Maßnahmen erfolgt, aber eine klinische Verbesserung der Verrucosis wurde nicht erreicht. Es zeigten sich zahlreiche flache, rote, zum Teil konfluierende disseminierte Warzen an den Unterarmen, den beiden Handrücken und den Fingern (Abb. 2). Die in dieser Arbeit untersuchten Warzen-Biopsien wurden zwischen 2009 und 2011 gesammelt (siehe 2.8.). Zum Zeitpunkt der ersten Biopsie-Entnahme (2009) war die Patientin 71 Jahre alt. Immunologisch fiel eine deutliche Erniedrigung des CD4/CD8-Quotienten auf 0,28 auf (Normwert: 0,8-2,0). Histopathologisch zeigten die Warzen, die für gutartige Hautwarzen charakteristischen Merkmale (Abb. 3) (Silling et al., 2014). 10 Einleitung Abb. 2: Unterarm der Patientin mit generalisierter Verrucosis. Zu sehen sind zahlreiche flache, erythematöse Papeln und Plaques im Juni 2010. Abb. 3: Der histopathologische Befund zeigt typische Merkmale von gutartigen Hautwarzen wie Akanthose, Parakeratose und zahlreiche Koilozyten. In den Zellen sind Keratohyalin-Granula zu sehen, welche typisch für eine HPV-Infektion sind (Hämatoxylin-Eosin-Färbung, Vergrößerung 200-fach) 11 Einleitung 1.5. Zielsetzung der Arbeit Für die vorliegende Arbeit lagen Biopsien von Hautwarzen einer immunsupprimierten Patientin mit generalisierter Verrucosis vor. Alle mittels PCR und Sequenzierung untersuchten Warzen der Patientin enthielten eine kurze, bisher nicht näher charakterisierte HPV-Sequenz, die vermutlich einen neuen, warzen-induzierenden HPV-Typ repräsentierte. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das komplette Genom des neuen HPV-Typs kloniert, sequenziert, charakterisiert und phylogenetisch eingeordnet werden. 12 Material 2. Material 2.1. Geräte Sequencer 3130x2 Genetic Analyser Applied Biosystems, Carlsbad, USA Biometra T3 Thermocycler Biometra, Göttingen Elektrophorese-Kammer für Agarosegele Bio-Rad, München Netzgerät für Gelkammer Gibco BRL, Karlsruhe Pipetus-Akku Eppendorf, Hamburg Schüttelgerät Certomat R H B.Braun, Melsungen AG Sartorius Waage BP 61 S Sartorius, Göttingen Zentrifuge 5415 C Eppendorf, Hamburg Zentrifuge 5417 R Eppendorf, Hamburg Nano Drop Spectrophotometer ND-1000 peQ Lab Biotechnologie Gmbh Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg 2.2. Laborbedarf Eppendorf PCR-tube 0,2 ml Eppendorf, Hamburg Eppendorf Safe Lock 0,5 ml 1,5 ml Eppendorf, Hamburg Mikrotube 2,0 ml Sarstedt, Nürnbrecht Glaspipetten 1/2/5/10/20 ml Faust, Köln Pipettenspitzen (gestopft) 0,5 μl-10 μl Greiner, Nütringen Pipettenspitzen (gestopft) 10 μl-100 μl Sarstedt, Nürnbrecht Pipettenspitzen (gestopft) 100 μl-1000 μl Greiner, Nütringen Pipette "Reference“ 2/10/100/1000 Eppendorf, Hamburg 13 ml-Röhrchen Sarstedt, Nürnbrecht 13 Material 2.3. Reagenzien und Medien Ultra Pure Distilled Water Invitrogen, Karlsruhe Ampuwa Fresenius AG, Bad Homburg Essigsäure Sigma, München Ethanol (99,8%) Carl Roth, Karlsruhe EDTA 0,5 M; pH 8,0 Invitrogen, Karlsruhe Tris Sigma, München dATP, dCTP, dGTP, dTTP je 10 mM Roche Molecular Biochemicals, Mannheim Magnesiumchlorid 25 mM Qiagen, Hilden DMSO Sigma, Deisenhofen 1 Kb DNA Ladder, 1Kb Plus DNA Ladder Invitrogen, Karlsruhe DNA Loading Dye (6x) Fermentas, St. Leon-Rot Big Dye Terminator v.1.1 ready Applied Biosystems, Carlsbad, USA DNA Typing GradeTM Agarose Gibco BRL, Karlsruhe Difco LB Broth, Miller BD, Heidelberg Difco LB Agar, Miller BD, Heidelberg E.coli Top 10 Bakterien Invitrogen, Karlsruhe Ampicillin Natriumsalz (100 mg/ml in H2O Stocklösung) Sigma, München 2.4. Enzyme und Reagenziensysteme BamHI fast digest Fermentas, St. Leon-Rot HindIII fast digest Fermentas, St. Leon-Rot XhoI fast digest Fermentas, St. Leon-Rot EcoRI fast digest Fermentas, St. Leon-Rot Phusion Hot Start II HF Polymerase (2U/ µl) Fermentas, St. Leon-Rot QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden DyeEx 2.0 Spin Kit Qiagen, Hilden QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden 14 Material QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden pJET cloning Kit 1.2 Fermentas, St. Leon-Rot Illustra TempliPhi Amplification Kit 100 GE Healthcare, Freiburg 2.5. Primer Primer Sequenz 5´-3´ Lage im HPVXS2-Genom (Nukleotid-Positionen von:bis) XS2-M1 rev ATGGTGTCCCCGACAACCC 6552:6534 XS2-M2 fw CCTTTGTGTCTCCTGTGGATG 5768:5787 XS2-M3 rev TAGAAAGCAGCACGACCG 7787:7768 XS2-M4 fw CGCCTGAAAAGCAGGATCCC 7044:7063 XS2-M5 fw CTTCTGGGCCCAACTTATTATG 7654:7676 XS2-M6 rev GCACTCTACCACCAGTCGCAG 714:694 XS2-M7 fw AAGAATAGAATTGAGTCTTGCACC 551:575 XS2-M8 rev ACCAAATTGTTCTTTAAACTTACC 1477:1453 XS2-M9 fw GGAGCGTGCGGAGGGGATG 1338:1357 XS2-M10 rev AATGGCTGAACCAAAAATGGC 2366:2345 XS2-M11 fw AAAGTGTTAGTGTTTTATGGACC 2237:2261 XS2-M12 rev CTCGTGTGCTAGATACAGGGTC 3341:3320 XS2-M14 rev GCGATGCACGCTTGCGAC 4377:4358 XS2-M15 fw GTATCTAGCACACGAGAAGTAC 3326:3347 XS2-M16 rev GGGAACATAGCCTGTGCGTC 4554:4535 XS2-M17 fw CCTGCATATACAGAACCATCTTTG 4816:4839 XS2-M18 rev CCAAACAAGACGTTCAGTGTCAG 6040:6018 XS2-M19 fw GAATTGAGTCTTGCACCAGAGG 559:580 XS2-M20 rev CCATCCCCTCCGCACGCTC 1358:1339 XS2-M21 fw ATGGCCAAACACAGGTGGATAC 1205:1226 XS2-M22 rev CAGGTAGCATCATCTAGTAATCC 2405:2383 XS2-M24 rev ACCACAATTCTACTTACACC 5008:4987 15 Material XS2-M25 fw CTGCATGTTGTGATTGGGTTG 1520:1540 XS2-M26 rev CACTCTGACATGTTCATGCGG 2102:2082 XS2-M27 fw GCCGCAGGCACATGCCCTC 4402:4420 XS2-BamHI fw GGATCCCTTCTCTAAATTTAAC 7057:7078 XS2-BamHI rev GGATCCTGCTTTTCAGGCG 7062:7044 XS2-XhoI fw CTCGAGGCGGTCGACG 3444:3462 XS2-XhoI rev CTCGAGTCGCTGTCGTTT 3451:3433 XS2-6258 fw CACCATGTAAACAGACTGCGTC 6258:6279 XS2-6413 rev AAATGTCTAAAGGGACGTCAG 6413:6393 2.6. Puffer und Lösungen TE-Puffer 10 mM Tris HCl 1mM EDTA (pH 8,0) TAE-Puffer 1x 40 mM Tris (pH 8,3) 40 mM Essigsäure 1 mM Na2EDTA (pH 8,0) 10x Pharmacia Puffer 100 mM Tris HCl (pH 9,0) 500 mM KCl 15 mM MgCl2 10x „ter Schegget“ Puffer 100 mM Tris HCl (pH 8,8) 500 mM KCl 36 mM MgCl2 0,05 % (w/v) Gelatine 10x PCR-Puffer Invitrogen, Karlsruhe 200 mM Tris-HCl (pH 8,4) 500 mM KCL 10x Puffer fast digest Fermentas, St. Leon-Rot 5x Phusion HF buffer Fermentas, St. Leon-Rot Ethidiumbromidstammlösung 10 mg/ml Aqua dest. 16 Material 2.7. Software Mac Vector, 12.7.3 Mac Vector, Inc. Cary, NC, USA Quantity One 4.4.0 Biorad, München Blast-Search National Center for Biotechnology Information (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi), USA 2.8. Patientenproben Die in dieser Arbeit untersuchten Warzen-Biopsien stammten von einer Patientin mit generalisierter Verrucosis infolge langjähriger Immunsuppression (siehe Kapitel 1.4.). Tabelle 4 gibt einen Überblick über die entnommenen Biopsien. Probennummer Abnahmedatum Entnahmestelle B-6179 03.12.09 Unterarm (UA) links B-6180 03.12.09 UA rechts R-674 20.07.10 Handrücken links R-675 20.07.10 UA rechts, Beugeseite R-676 20.07.10 UA rechts, Streckseite R-677 20.07.10 Daumen rechts R-678 20.07.10 Daumen links R-939 09.02.11 nicht protokolliert R-940 09.02.11 nicht protokolliert R-941 09.02.11 nicht protokolliert R-942 09.02.11 nicht protokolliert Tab. 4: Hautbiopsien der Patientin von 2009 bis 2011. 17 Methoden 3. Methoden Alle verwendeten Testkits und Reagenziensysteme wurden gemäß Herstellerprotokoll benutzt. 3.1. DNA-Extraktion aus Hautwarzen-Biopsien Die Biopsien wurden nativ bei Raumtemperatur in sterilen Einmalgefäßen versandt. Zur DNA-Extraktion aus den Patientenproben wurde der QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben verwendet. Die extrahierte DNA wurde in 100 μl AEPuffer (Qiagen) eluiert. Anschließend wurde die DNA direkt in die PCR-Analysen eingesetzt oder bei -20°C gelagert. Im Falle hoher DNA-Konzentrationen wurden die Proben verdünnt eingesetzt (z.B. 1:10-Verdünnung: 1 µl DNA plus 9 µl Aqua dest.). 3.2. Rolling Circle Amplification (RCA) 3.2.1. Prinzip der RCA Mit der Rolling Circle Amplification (RCA) kann man sowohl einzel-, als auch doppelsträngige zirkuläre DNA in vitro vervielfältigen. Das Prinzip der RCA beinhaltet, dass sich Random Hexamer Primer (6 Nukleotide mit zufälliger Sequenz) an verschiedene Stellen der zirkulären DNA anlagern. Die Phi29 DNA-Polymerase verlängert nun jeden dieser Primer. Ist der nachfolgende Primer erreicht, wird der neu synthetisierte Strang von der Phi29 DNA-Polymerase (diese hat die Fähigkeit, neu erschaffene Stränge von der Matrize zu verdrängen) abgesetzt und fungiert jetzt weiter als Einzelstrang (Abb. 4). Es können sich abermals neue Primer an den Strang anlagern, der Prozess wird wiederholt, und es findet eine kontinuierliche DNASynthese statt. 3.2.2. RCA-Ansatz Als Reagenziensystem wurde der Illustra TempliPhi Amplification Kit 100 verwendet. Für einen RCA-Ansatz wurden 1 µl der aus einer Biopsie extrahierten DNA und 5 µl Sample Buffer, welcher die Random Hexamer Primer enthielt, vorgelegt. Die Probe wird für 3 Minuten auf 95°C erhitzt und anschließend für 5 Minuten langsam auf Eis 18 Methoden abgekühlt. Optimale Reaktionsbedingungen werden durch Zugabe von 5 µl Reaction Buffer geschaffen. Um den Reaktionsansatz zu komplettieren, werden 0,2 µl eines Enzym-Mix, mit der darin enthaltenen Phi29 DNA-Polymerase und 1 µl Nukleotide (10 mM) der Probe beigefügt. Die Reaktion erfolgt isotherm mit linearer Amplifikation bei 30°C für 16h in einem Thermocycler. Zuletzt erfolgt noch eine zehnminütige Inaktivierung der Reaktion bei 65°C. Zum Nachweis der RCA-Produkte werden die Ansätze auf 0,8% Agarosegele aufgetragen. Abb. 4: Schema der Rolling Circle Amplification (nach Amersham Biosciences, Instruction TempliPhi 100 Amplification Kit). Links: Anlagerung der Primer an die zirkuläre DNA und Verlängerung durch die Phi29 DNA-Polymerase (schwarze, gefüllte Kreise). Rechts: Die verdrängten Einzelstränge sind für weitere Amplifikationen verfügbar. 3.3. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 3.3.1. Prinzip der PCR Mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann man beliebige DNA-Abschnitte z.B. eines Genoms in definierter Länge, in vitro, vervielfältigen. Die PCR findet in einem Thermocycler statt, welcher die Reaktionsgefäße exakt auf die Temperatur erhitzt bzw. kühlt, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird. Ein PCR-Ansatz beinhaltet die zu vervielfältigende DNA („Template“), ein Primerpaar, das den zu amplifizierenden Abschnitt festlegt, Nukleotide und eine DNA-Polymerase, welche die fehlenden Nukleotide entlang der Stränge auffüllt. Optimale Reaktionsbedingungen werden durch entsprechende Puffer geschaffen. Durch Zugabe von DMSO (Dimethylsulfoxid), 19 Methoden welches die Ausbildung von Sekundärstrukturen der Template-DNA unterbindet, wird die Amplifikation erleichtert. Die PCR-Reaktion beinhaltet drei Schritte (Abb. 5). Zu Beginn erfolgt die Denaturierung, bei der die doppelsträngige DNA auf 95°C erhitzt wird, um die DNA-Stränge voneinander zu trennen. Die beiden Einzelstränge fungieren in den folgenden Schritten als Vorlage (Matrize). Nach dieser ersten Phase erfolgt das sogenannte Annealing. Die Temperatur wird auf z.B. 56°-64°C abgekühlt, um eine spezifische Anlagerung der Primer (einzelsträngige DNA-Moleküle mit einer Länge von zirka 20 Basen) an die DNA zu erlauben. Bei der Extension werden an die freien 3’Enden der Primer die passenden komplementären Nukleotide an den Strang geknüpft. Sie findet bei 72°C statt. Am Ende des ersten Zyklus liegen zwei komplementäre Doppelstränge vor, die genetische Information des durch die Primer festgelegten Abschnittes wurde somit verdoppelt. Im nächsten Schritt fungieren die Stränge wieder als Matrize, der Reaktionszyklus startet erneut. Es resultiert eine exponentielle Amplifikation des nachzuweisenden DNA-Abschnitts. 20 Methoden Abb. 5: Schematische Darstellung eines PCR-Zyklus. Die DNA-Polymerase ist als grüner Kreis, die Primer sind als rote Pfeile und die neu synthetisierten Stränge als grüne Pfeile dargestellt. 3.3.2. PCR-Ansätze Die einzelnen Reagenzien der PCR-Ansätze wurden zu einem "Mastermix" zusammen pipettiert und gemischt, um maximale Homogenität der Reagenzien zu gewährleisten. Im nächsten Schritt erfolgte die Verteilung auf die PCR-Reaktionsgefäße (PCR-Labor Bereich I). Das zu untersuchende, aufgearbeitete Probenmaterial (extrahierte DNA) wurde danach im PCR-Labor Bereich II in den Reaktionsansatz pipettiert. Die Amplifikations-Reaktion wurde anschließend im PCR-Labor Bereich III durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden entsprechend 3.3.4. gelelektrophoretisch überprüft. Zur Vermeidung von Kontaminationen mit probenfremder DNA wurden vor Betreten des Laborbereichs Schutzkittel und Einmalhandschuhe benutzt. Es wurden nur gestopfte Einmalpipettenspitzen verwendet, die Hände wurden regelmäßig gewaschen und sorgfältig desinfiziert und die Einmalhandschuhe wurden nach jeder Probe gewechselt. Alle Arbeitsflächen wurden nach Beendigung der Tätigkeiten desinfiziert. 3.3.2.1. Ansatz für 1 kb-Fragmente (für Sequenzanalysen) Ein 20 µl Ansatz für die PCR bestand aus 11 µl Aqua dest., 4 µl Phusion HF buffer (5x), 0,4 µl dNTPs (10 mM), 0,6 µl DMSO 5%, 0,2 µl Phusion Hot Start II HF DNAPolymerase (2 U/ µl), je 0,9 µl spezifischer Primer (10 µM) und 2 µl extrahierte ProbenDNA. Die verwendeten Primer sind im Ergebnisteil (Tab. 8, Kapitel 4.3.) aufgeführt. Nach dem PCR-Lauf (Thermoprofil siehe Tab. 5) wurden die Amplifikate entsprechend 3.4. zur Sequenzierung weiterverarbeitet. 3.3.2.2. Ansatz für 3 kb-Fragmente (für Klonierungsansätze) Für die Generierung 3 kb großer Fragmente wurden 11 µl Aqua dest., 4 µl Phusion HF Buffer (5x), 0,4 µl dNTPs (10 mM), 1 µl MgCl2 (25 mM), 0,5 µl Phusion Hot Start II HF DNA-Polymerase (2 U/ µl), je 0,9 µl spezifischen Primer (10 µM) und 2 µl extrahierte Proben-DNA gemischt. Die verwendeten Primer sind im Ergebnisteil (Tab. 9, Kapitel 21 Methoden 4.4.) aufgeführt. Nach dem PCR-Lauf (Thermoprofil siehe Tab. 6) wurden die PCRProdukte gemäß 3.5. zur Klonierung weiterverarbeitet. 3.3.3. PCR-Thermoprofile Zieltemperatur (in °C) Inkubationszeit (in Min.) Prädenaturierung: 98 5 Denaturierung: 98 1 Annealing: 56 0,5 Extension: 72 1 72 4 Anzahl Zyklen 1 40x 1 Tab. 5: PCR-Bedingungen für die Amplifizierung kurzer Fragmente (1 kb). Zieltemperatur (in °C) Inkubationszeit (in Min.) Prädenaturierung: 95 10 Denaturierung: 95 1 Annealing: 56 0,5 Extension: 72 3,20 Anzahl Zyklen 1 45x Tab. 6: PCR-Bedingungen für die Amplifizierung langer Fragmente (3 kb). Zieltemperatur (in °C) Inkubationszeit (in sec.) Prädenaturierung: 96 10 Denaturierung: 96 10 Annealing: 56 10 Extension: 60 180 Anzahl Zyklen 1 29x Tab. 7: Zyklus-Bedingungen der Sequenzierreaktion für aufgereinigte PCR-Produkte (siehe 3.4.) 22 Methoden 3.3.4. PCR-Produkt-Detektion (Agarose-Gelelektrophorese) In Agarosegelen wandern Nukleinsäuren beim Anlegen eines elektrischen Feldes aufgrund ihrer negativen Ladung zur Anode und werden dabei nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Um die PCR-Produkte nachzuweisen wurden 0,8% Agarosegele verwendet. Zur Herstellung wurde Agarose in 1xTAE-Puffer im Mikrowellenherd so lange aufgekocht, bis sich die Agarose vollständig gelöst hatte. Nachdem die Agaroselösung etwas abgekühlt war, wurde sie in den Gelbehälter gegossen und die Kämme in das Gel eingetaucht, um die Geltaschen zu bilden. Die PCR-Produkte wurden in die verschiedenen Geltaschen pipettiert (1 kb-Fragmente: 4 µl Amplifikat mit 1 µl Loading-Dye, 3 kb-Fragmente: gesamter PCR-Ansatz mit 4 µl Loading-Dye). Zur Überprüfung der Größe der PCR-Produkte wurde der 1 kb DNALeiter-Größenmarker in die erste Geltasche der jeweiligen Reihe aufgetragen. Die Laufzeit betrug zirka eine Stunde bei einer Spannung von 100 V und einer Stromstärke von 125 mA. Als Laufpuffer wurde 1xTAE-Puffer verwendet. Anschließend wurde das Gel 20 Minuten in eine Ethidiumbromidlösung (1 mg/l) eingelegt und danach unter UVLicht betrachtet. Ethidiumbromid interkaliert mit der DNA und kann diese aufgrund seiner fluoreszierenden Eigenschaften unter UV-Licht sichtbar machen. Digitale Fotos der Gele wurden mit Hilfe der Software Quantity One angefertigt. 3.4. Sequenzierung Nach der Generierung der zirka 1 kb langen PCR-Fragmente erfolgte, sofern die Agarosegelelektrophorese die erwartete Fragmentlänge ergab, die Aufreinigung des zu sequenzierenden PCR-Ansatzes mit dem Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen). Im nächsten Schritt wurden 2 µl der aufgereinigten DNA, 2 µl d“Seq“-Fluoreszenzfarbstoff und 1 µl 10 µM Primer für den jeweiligen Reaktionsansatz für die Sequenzierung vorbereitet (Thermoprofil siehe Tab. 7). Für jeden Sequenzierungs-Primer wurden getrennte Reaktionsansätze pipettiert. Es waren somit zwei Ansätze für jeden zu sequenzierenden Abschnitt der DNA erforderlich (mit Forward bzw. Backward-Primer). Nach dem Lauf wurden die Proben mit dem DyeEx 2.0 Spin Kit weiterverarbeitet und anschließend zentral auf einen Sequencer des Servicelabors des Instituts für Virologie der Uniklinik Köln verteilt. Die Sequenzanalyse erfolgte mit dem „Sequencer 3130x2 Genetic Analyser“ von Applied Biosystems, USA. Die dabei erhaltenen Chromatogramme wurden mittels Blast-Search und MacVector ausgewertet (siehe dazu auch Kapitel 4.3.). 23 Methoden 3.5. Klonierung 3.5.1. Ligation Die für eine Klonierung vorgesehenen 3 kb PCR-Produkte (Ansätze siehe 3.3.2.2.) wurden in einem Agarosegel (0,8%) unter Verwendung von frischem Laufpuffer aufgetrennt. Die DNA-Fragmente wurden mit einem neuen Einmalskalpell ausgeschnitten, in ein Eppendorfgefäß überführt und gewogen. Anschließend wurde eine Gelextraktion mit dem QIAquick Gel Extractions Kit gemäß Herstellerangaben durchgeführt. Die Ligation der aufgereinigten PCR-Produkte erfolgte in das Plasmid pJET1.2/blunt mit 50 ng Vektor-DNA, 10 µl Reaction Buffer (2x), 1 µl pJET1.2/blunt, 1 µl DNA-Ligase ad 20 µl Aqua (siehe Kapitel 4.4. für weitere Details). Die Ansätze kamen in ein Dewar-Gefäß mit 16°C warmen Wasser und wurden über Nacht in einem 4°C Raum inkubiert. 3.5.2. Transformation Nach der Ligation erfolgte die Transformation der pJET1.2/blunt-Ligationsansätze in kompetente E. coli TOP10 Bakterien. Dazu wurden 5 µl DNA des Ligationsansatzes (siehe 3.5.1.) mit 50 µl Bakterien 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien einem 30-sekündigen Hitzeschock bei 42°C ausgesetzt, um die Bakterienmembranen für die DNA durchlässig zu machen. Der Ansatz kam für 2 Minuten auf Eis. Nach Zugabe von 250 µl S.O.C.-Medium, welches bereits auf Raumtemperatur angewärmt worden war, erfolgte eine Inkubation von einer Stunde bei 37°C unter leichtem Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute (UpM). Der Ansatz wurde auf eine vorgewärmte, selektive LB-Agar-Platte (mit 100 µg/ml Ampicillin) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. 3.6. Isolierung von Plasmid-DNA Nach der erfolgten Transformation der pJET1.2/blunt-Ligationsansätze in E.coli TOP10 Bakterien, wurden einzelne Klone von der Agarplatte gepickt und in 6 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin in einem 13 ml Sarstedt-Röhrchen bei 37°C über Nacht unter leichtem Schütteln bei 200 UpM inkubiert. Aus 4 ml der frischen ÜbernachtBakterienkultur wurde mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) DNA extrahiert. Die Elution der DNA erfolgte in 30 µl EB-Puffer. Die Messung der DNA-Konzentrationen 24 Methoden sowie die Bestimmung des Reinheitsgrades der DNA fanden nach der Elution im Nano Drop Spektrophotometer statt. 3.7. Restriktionsanalysen Die Klonierung wurde nach der Plasmid-DNA-Extraktion durch einen Restriktionsverdau überprüft. Ein Ansatz für eine Restriktionsanalyse beinhaltete 100 ng extrahierte DNA, 1,5 µl Fast Digest Puffer, 0,5 µl Restriktionsenzym (BamHI, HindIII, XhoI oder EcoRI) ad 15 µl Aqua dest. Eine Negativkontrolle enthielt 0,5 µl Aqua dest. anstelle des Restriktionsenzyms. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 20 Minuten. Danach folgten 80°C für 20 Minuten zur Inaktivierung der Restriktionsenzyme. Anschließend wurden die Proben auf ein 0,8% Agarosegel appliziert, um die klonierten, geschnittenen Fragmente auf Vorhandensein und erwartete Größe zu überprüfen. 25 Ergebnisse 4. Ergebnisse 4.1. HPV-Typisierung Die initial eingesandten Biopsien wurden mittels gruppenspezifischer PCRs zum Nachweis von HPVs aller bekannten Genera untersucht (Wieland et al., 2000; Berkhout et al., 2000). Die gruppenspezifischen PCRs zum Nachweis von Alpha-HPVs (A5/A10-A6/A8-PCR; Wieland et al., 2000) und zum spezifischen Nachweis von Alpha2 und Alpha-4 HPVs (A2/A4-PCR; Berkhout et al., 2000) waren bei allen 11 untersuchten Biopsien (Tabelle 4, siehe 2.8.) positiv. Jedoch wurde bei der Typisierung mittels Sondenhybridisierung (Schmitt et al., 2006) und Sequenzierung kein bekannter HPV-Typ nachgewiesen. Beta-HPVs (Boxman et al., 1997) und Mu/Nu-HPVs (Harwood et al., 1999) ließen sich in den untersuchten Biopsien nicht nachweisen. Die A5/A10-A6/A8-PCR generierte ein zirka 270 bp großes internes PCR-Produkt (Amplimer), die A2/A4-PCR ergab ein internes Fragment von zirka 710 bp. Die internen PCR-Produkte wurden wie unter 3.4. beschrieben sequenziert. Die Sequenzanalyse beider PCR-Produkte mit der internetbasierten Software BLASTn ergab, dass sie jeweils 100% homolog zu einem 261 bp großen HPV-DNA Fragment namens HPVXS2 waren (Berkhout et al., 2000). Aus den A2/A4-PCR-Produkten der Proben B-6179 und B-6180 wurde eine Konsensus-Sequenz mit einer Länge von 615 bp ermittelt. Diese wurde ebenfalls mit bekannten HPV-Sequenzen verglichen (BLASTn). Die Suche ergab eine partielle Homologie mit HPV94 (nächster Verwandter), einem Alpha-2 HPVTyp. Hier ergab sich über eine Länge von 574 Nukleotiden der Konsensus-Sequenz eine 81%ige Übereinstimmung (Abb. 6). 26 Ergebnisse Abb. 6: Ergebnis des BLASTn-Search mit der Konsensus-Sequenz der A2/A4 PCR-Produkte („Query“) der Proben B-6179 und B-6180. Es ergibt sich eine 81%ige Homologie (Identities) mit dem entsprechenden L1-Genabschnitt von HPV94 („Sbjct“). Da bei einem mehr als 10%igen Unterschied der L1 Nukleotidsequenz zum nächsten Verwandten vermutlich ein neuer HPV-Typ vorliegt, sollte das gesamte Genom von HPVXS2 isoliert, kloniert, sequenziert und charakterisiert werden. 4.2. Rolling Circle Amplification Mittels Rolling Circle Amplification konnte aus den Proben R-674, R-675, R-676, R-677 und R-678 (Tab. 4, siehe 2.8.) ein Amplifikat erzeugt werden, das nach Linearisierung mit den Restriktionsenzymen HindIII bzw. XhoI zirka 8 kb groß war (Abb. 7, Spuren 3 und 4), und somit der Größe eines kompletten HPV-Genoms entsprach. Der 27 Ergebnisse Restriktionsverdau mit BamHI generierte zwei Fragmente von 2,5 und 5,2 kb (Spur 2). Eine Schnittstelle für EcoRI konnte nicht nachgewiesen werden (Spur 5). Abb. 7: 0,8%-iges Agarosegel nach Restriktionsverdau eines RCA-Produkts der Probe R- 674. Spur 1: 1kb DNA-Leiter (Größenmarker), Spur 2: BamHI-, Spur 3: HindIII-, Spur 4: XhoI-, Spur 5: EcoRI-Verdau. Die oben beschriebenen Fragmente konnten nicht erfolgreich aus dem Gel isoliert und in einen Vektor kloniert werden (siehe Diskussion). Daher wurde versucht, die Sequenz des neuen HPV-Genoms mittels PCR und Primer-Walking direkt aus extrahierter Biopsie-DNA zu ermitteln. 28 Ergebnisse 4.3. Bestimmung der HPVXS2-Sequenz Die Ermittlung der HPVXS2-Sequenz erfolgte ausgehend von dem A2/A4-PCRFragment in beide Richtungen mit Hilfe des sogenannten „Primer Walking“, d.h. eine neue Primer-Sequenz wurde am 3´-Ende bzw. am 5´-Ende der bereits ermittelten Sequenz ausgewählt, um in den noch unbekannten Genombereich zu sequenzieren. Um die HPVXS2-Sequenz zu ermitteln, wurde zusätzlich ein Sequenzvergleich (Alignment) der vermutlich nächsten Verwandten von HPVXS2 (Spezies Alpha-2, s.o.) mit den HPV-Typen 3, 10, 28, 29, 77, 94, 117 und 125 durchgeführt. Im Sequenzvergleich der Alpha-2 HPV-Typen zeigten sich Abschnitte, die sehr konserviert sind, wie auch Bereiche, die weniger homolog zueinander sind (Abb. 8). HPVXS2 HPV125 HPV117 HPV94-1 HPV94-2 HPV77 HPV29 HPV28 HPV10 HPV3 Consensus Abb. 8: Ausschnitt aus dem Alignment aller bekannten Alpha-2 HPV-Typen im Vergleich zu HPVXS2 mit schematischer Darstellung eines Sequenzierprimers (schwarzer Pfeil, Primer M9 fw (Kapitel 2.5.), 20 Nukleotide mit einem Mismatch A C in HPVXS2). Gelb: A= Adenin, Rot: T= Thymin, Grün: G= Guanin, Blau: C= Cytosin. Aus Bereichen mit einer großen Homologie wurden im Abstand von jeweils etwa 1000 Basen Primer entworfen (Abb. 9 und Tab. 8). Bei einigen der so entworfenen Primern ergaben sich Mismatches (Fehlpaarungen) zu HPVXS2, die aber für die Bindung nicht relevant waren (Abb. 8), da sie weder den 3´-Bereich des jeweiligen Primers umfassten, noch mehrere benachbarte Nukleotide betrafen. 29 Ergebnisse Abb. 9: Schematische Darstellung der Lage der Primer in der HPVXS2-Sequenz, die für die Generierung der PCR-Produkte für die Sequenzanalysen verwendet wurden. Forward-Primer; Reverse Primer (vergleiche Tab. 8). 30 Ergebnisse Abschnitt Primername XS2-M5 fw Primersequenz (5` 3`) Amplifikatgröße (bp) CTTCTGGGCaCCAACTTATTATG 1 891 XS2-M6 rev GCACTCTACCACCAGTCGCAG XS2-M7 fw AAGAtATAGAATTGAGTCTTGCACC XS2-M8 rev AcCCAAATTGTTCTTTAAACTTACC XS2-M9 fw GGAGCGTGCaGGAGGGGATG 2 927 3 1029 XS2-M10 rev AATGGCTGcAACCAAAAATGGC XS2-M11 fw AAAGtTGtTTAGTGTTTTATGGACC XS2-M12 rev CTCGTGTGCTAGATACAGGGTC XS2-M15 fw GTATCTAGCACACGAGAAGTAC 4 1105 5 1229 XS2-M16 rev GGGAACATAGCCTGTGCGTC XS2-M27 fw GCCGCAGGCACATGCCCTC XS2-M24 rev gACCAgCAATTCTACTTACACC XS2-M17 fw CCTGCATATACAGAACCATCTTTG 6 607 7 1225 XS2-M18 rev CCAAACAAGACGTTCAGTGTCAG XS2-6258 fw CACCATGTAAACAGACTGCGTC 8 295 XS2-M1 rev ATGGTGTCCCCGACAACCC XS2-6258 fw CACCATGTAAACAGACTGCGTC 9 805 XS2-BamHI rev GGATCCTGCTTTTCAGGCG XS2-M4 fw CGCCTGAAAAGCAGGATCCC 10 744 XS2-M3 rev TAGAAAGCaAGCAgCGACCG Tab. 8: Primerpaare für die Generierung von 10 überlappenden PCR-Fragmenten für die Sequenzierung des gesamten HPVXS2-Genoms. Abweichungen zu der später gefundenen HPVXS2-Sequenz sind durch rote Kleinbuchstaben markiert. Vergleiche 31 Ergebnisse Kapitel 2.5. und Abb. 9 zur Lage der Primer im HPVXS2-Genom. fw = forward; rev = reverse (backward). Als Matrize für die Synthese der 295 bis 1229 bp großen Fragmente, wurden die aus den Biopsien R-674, R-675, R-941, B-6179 und B-6180 (Tab. 4) isolierten DNAs verwendet. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese auf Vorhandensein und Größe überprüft (Abb. 10). Beim Nachweis von Fragmenten der erwarteten Größe im Agarosegel wurden die Proben für die Sequenzierungsreaktion aufbereitet (siehe Kapitel 3.4.). Abb. 10: Agarosegel mit 744 bp PCR-Produkten der Probe R-941 in zwei verschiedenen Verdünnungen (Fragment 10, siehe Tab. 8). Spur 1: 1kb DNA-Leiter. In den Spuren 2 (Primer XS2-M2 fw und XS2-M1 rev, siehe 2.5.) und 3 (Primer XS2-M4 fw und XS2-M3 rev; siehe 2.5. und Tab. 8) wurden 1:10 32 Ergebnisse Verdünnungen verwendet. In den Spuren 4 (Primer XS2-M2 fw und XS2-M1 rev) und 5 (Primer XS2-M4 fw und XS2-M3 rev) wurden 1:50 Verdünnungen eingesetzt. Die erwarteten 744 bp Fragmente waren in den Spuren 3 und 5 zu sehen. In den Spuren 2 und 4 sind keine PCR-Fragmente sichtbar, da sich der Primer XS2-M2 fw als ungeeignet erwies. Die erhaltenen Sequenzen der 10 in Tabelle 8 aufgelisteten DNA-Fragmente wurden mit dem Suchprogramm BLASTn mit allen vorhandenen bisher bekannten HPVGenomen verglichen, um die nahe Verwandtschaft zu den Alpha-2 HPV-Typen zu bestätigen. Die überlappenden Sequenzen der einzelnen Chromatogramme wurden mit Hilfe des MacVector-Programms zu einer Konsensus-Sequenz zusammengefügt. Zur weiteren Überprüfung und Bestätigung der HPVXS2-Sequenz wurden einige Genomabschnitte unter Verwendung folgender Primer (Kapitel 2.5.) erneut sequenziert: XS2-M14 rev, XS2-M20 rev, XS2-M21 fw, XS2-M22 rev, XS2-M25 fw, XS2-M26 rev, XS2-BamHI fw, XS2-XhoI fw. Bei diesen Überprüfungen ergaben sich keine Abweichungen von den zuvor ermittelten Sequenzen. Die Größe des gesamten HPVXS2-Genoms betrug 7830 Basenpaare. Die ermittelte HPVXS2-Sequenz wurde in „GenBank“ hinterlegt und unter der Zugangsnummer KC138720 veröffentlicht (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KC138720). Die mit Hilfe der Rolling Circle Amplification (siehe Abb. 7) ermittelte Anzahl an RestriktionsSchnittstellen sowie die Abwesenheit einer EcoRI-Schnittstelle konnten bestätigt werden. Die zwei BamHI-Schnittstellen zerteilen das Genom in zwei Abschnitte von 2.538 bp und 5.292 bp. Für HindIII und XhoI findet sich jeweils eine Schnittstelle, die das 7830 bp große Genom linearisiert. Die gesamte ermittelte Sequenz des HPVXS2Genoms ist in Abbildung 11 gezeigt. 33 Ergebnisse 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 ttataaacta aggggtacat aggcccaaaa cttacactgc aagagaattg attgctacat cgtggaagaa caaaccactg gattgctggg cccacaataa gagcaattag gtggtaacac tcagatataa tgtgtgtgac gaacgggctg atatctagta gatgacaggc gcagcagatg tttagccctg ataaagcttg gggtatggcc gacacggtgt catggctgtc gcagaatcca gcgactttac ccttttaaaa tgcacagtgg caagtgttgt aaaaacaggg atgcttatag agcttgtcta atagtaggac tatgaccacg acagactcca gcctgcacaa tggatatggt tttttaagat cagggcatac tatttctgca agcagccatt acctgtcagt gtgtgcattg acaaccaaca gtgtttacat aatgaccaaa cctgaagagg aatgctagaa cctggtgcgt tggccatcag agtgcatgta gcgggacaca tgtcaccgtg gaaagaaatt gtcgcacgag agatgatgca aattcacaaa tttgtgcacc ggaaccagaa gcgacagccc tggcaggccc tgactgtgca cagattgcaa ctgtgaatct tgcagagttt gtctatgttc gcctattttg tatctggcta tcacgtattg acaatggtga tactgttttt ctgacattgt gtatgccttt ttaaataaat cagctttatc taatcaacag atataaagaa aacatattta atttattgca aatttggtgt ggcatctcgc gaaactaagg gtgaaagaag ttttggagag aagaaataga atgaagaaga agtgtccaaa gggcattcca aggacatgga gaggatggtt gtgatgatga ctgtggggga atgatgtagc tgtgtgagca ggagacagtc aaacacaggt cacaagatgg aggaggagga acaaaggagc tgggtaagtt gcagtaaaac cagagggcat cctgccaatg agacagtagc agccaccaaa attgtagtga acgcactaga acattacaga atgccgctgc tgtgcagaca ttagagggga atcaggacgt ccaaaaaaag tgagtctgct tttggttaca gttggtgcta acagaaagca taaatccgtt ttaaaaacac attggaaatc aggaggaaaa ctatatgaaa gtagaaaatg gtggtgccac gctttgcaac tcacgagaaa gaagttagat attgtgcaga gggctatatt tatgtgtacg catgcatttg tacaccagta caaaaacgac acccagccct aacgactgtg cctgtaatac aatggtaaaa gaaaaccaag ttgcaaacag acgtgacggt tgttgctgct ttgtgctgtg 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ctgtgggtca aggtgtctgc gactgcccga gggttgaagt acaagctaga gtgacaatat ccatggggga attgtcctcc ggtatggtgc tttgtcagtc acagtatgtt ctggggttgt gcagggatgt ccgaggctca gtatttgttg tgtccttgtg atttgagaca taacaccaga actttggaat cttcggctat aatttaactt ctttgggtag gcaaacgatc aataaccaca tatattgtat gtggttgtgt ttcctgtgag ccgttgcagg atcacgcagt tgctacctgg attatgacta aactgtgctt ataattaatg Abb. 11: Sequenz des gesamten HPVXS2-Genoms (7830 bp). Das bisher bekannte, von Berkhout et al. (2000) ermittelte, 261 bp Fragment im L1Gen ist grün unterlegt (HPVXS2 Nukleotide 6776 – 7036). 35 Ergebnisse 4.4. Klonierung des HPVXS2-Genoms Für die Klonierung des HPVXS2-Genoms wurden anhand der ermittelten Sequenz von HPVXS2 drei Primerpaare ausgewählt, die das gesamte Genom in drei sich überlappenden Fragmenten abdeckten (Tab. 9, Abb. 12). Fragmente Primer-forward Primer-reverse Fragment 1 XS2-M19 XS2-XhoI Fragment 2 XS2-M15 XS2-6413 Fragment 3 XS2-6258 XS2-M8 Tab. 9: Fragmente und zugehörige Primerpaare für die Klonierung des HPVXS2Genoms. Die Oligonukleotidsequenzen der Primer sind in Kapitel 2.5. aufgeführt. Als Matrize für die Synthese der 3 kb großen Fragmente mit einer „long distance“ PCR wurden die extrahierte DNA der Biopsien R-674 und R-941 (Tab. 4) verwendet. Zur Amplifizierung wurde die Phusion Hot Start II HF DNA-Polymerase benutzt, die eine Autokorrektureinheit („proofreading“) besitzt (siehe 3.3.2.2.). Die Aufreinigung der PCR-Fragmente erfolgte nach der Auftrennung mittels Agarosegelelektrophorese mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (siehe 2.4.). Die Ligation erfolgte in einem molaren Verhältnis von Vektor zu Insert von 1:1 über glatte Enden („blunt end“) in das Plasmid pJET1.2/blunt (siehe 3.5.1.). Die klonierten Fragmente von HPVXS2 sind in Abbildung 12 schematisch dargestellt. 36 Ergebnisse Abb. 12: Fragmente für die Klonierung von HPVXS2. Die für die Generierung der einzelnen Fragmente verwendeten Primer sind unterstrichen. Die Schnittstellen für BamHI, HindIII und XhoI sind gezeigt. Die Länge der drei Klonierungsfragmente in Basenpaaren ist unter dem jeweiligen Fragment angezeigt. Die erfolgreiche Klonierung der 3 kb-Fragmente wurde durch einen Restriktionsverdau mit den oben genannten Restriktionsenzymen (Abb. 12), sowie mittels Sequenzierung des Übergangs von Vektor (pJET1.2/blunt) zu Insert (HPVXS2) mit dem pJET1.2 forward bzw. reverse Primer überprüft und bestätigt. Als Beispiel ist in Abbildung 13 der BamHI-Verdau zwei verschiedener Klone von Fragment 3 in pJET1.2/blunt zu sehen. BamHI konnte in diesem Fall als Restriktionsenzym zur Linearisierung verwendet werden, da Fragment 3 eine Schnittstelle für BamHI aufweist (Abb. 12), der Vektor hingegen keine Schnittstelle für dieses Enzym besitzt. 37 Ergebnisse Abb. 13: Agarosegel nach Restriktionsverdau zweier identischer Klone von Fragment 3 in Vektor pJET1.2/blunt. Spuren 1/3: unverdautes Plasmid, Spuren 2/4: BamHI-Verdau, Spur 5: 1 kb+ DNALeiter. In den Spuren 2 und 4 sind Vektor (pJET 1.2/blunt, 2974 bp) und Insert (Fragment 3, 3049 bp) nach Linearisierung mit BamHI bei zirka 6 kb zu sehen. Nach erfolgreicher Sequenzierung und Klonierung von HPVXS2, sollte mittels Analyse der potentiellen offenen Leserahmen (ORFs) die strukturelle Verwandtschaft zu den bekannten Alpha-2 HPVs analysiert werden. 4.5. HPVXS2 Genomanalyse 4.5.1. Open Reading Frames (ORFs) Die Analyse der ermittelten DNA-Sequenz von HPVXS2 mit Hilfe der MacVectorSoftware ergab 19 durchgängige, unterschiedlich lange, potentielle offene Leserahmen (ORFs; Abb. 14). 38 Ergebnisse Abb. 14: Neunzehn potentielle ORFs nach Analyse der DNA-Sequenz von HPVXS2. Leserahmen 1: blau; Leserahmen 2: grün; Leserahmen 3: rot; Die Zuordnung der einzelnen Leserahmen zu den bekannten HPV-Genprodukten (Tab. 1) erfolgte über einen Sequenzvergleich von HPVXS2 mit den nächsten verwandten Alpha-2 HPV-Typen (HPV 3, 10, 28, 29, 77, 94, 117, 125). Nach diesen Analysen ergaben sich für HPVXS2 acht auch bei anderen Alpha-HPVs in vergleichbarer Länge vorhandene ORFs: das Hauptkapsidprotein L1, das Nebenkapsidprotein L2, die frühen Genprodukte E1, E2, E4 und die Onkoproteine E5, E6 und E7 sowie die nichtkodierende Region (NCR) (Abb. 15). 39 Ergebnisse Abb. 15: Genomorganisation von HPVXS2. Die HPV-Onkogene E5, E6 und E7 sind blau dargestellt, die Gene für das Haupt- (L1) und Neben-Kapsidprotein (L2) gelb. E1, E2 und E4 sind grün abgebildet. In den Klammern ist die Position der Genprodukte im Genom von HPVXS2 (7830 bp) aufgeführt. NCR: nicht-kodierende Region. 4.5.2. Nicht kodierende Region (NCR) von HPVXS2 Die NCR von HPVXS2 ist 678 bp lang (Abb. 16) und befindet sich zwischen dem L1 und dem E6 Gen (Abb. 15). Die NCR enthält vier Bindestellen (ACCN6GGT) für das für die Transkription der HPV-Gene zuständige HPV-kodierte E2-Protein an den Positionen 7467, 7760, 40 und 55. Zwei weitere potentielle Bindestellen für das E2Protein befinden sich außerhalb der NCR an den Positionen 1236 im E6-ORF und 6347 im L1-ORF. Die TATA-Box befindet sich 34 bp vor dem Start Codon des E6ORFs und dient als Startpunkt für die Assemblierung von Transkriptionsfaktoren (Abb. 16). In der NCR von HPVXS2 befinden sich außerdem potenzielle Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren Nuclear Factor 1 (NF1), Activator Protein 1 (AP1), Oct1 und CCAAT/Enhancer-Binding-Proteine (C/EBP). Weitere Bindestellen für diese und für weitere zelluläre Transkriptionsfaktoren wie Specificity Protein 1 (SP1) und Yin Yang 1 (YY1) sind außerhalb der NCR von HPVXS2 vorhanden. 40 Ergebnisse Abb. 16: Darstellung der NCR-Sequenzen von HPVXS2 im Vergleich zu einem seiner nächsten Verwandten, HPV94. Die Nukleotid-Positionen im jeweiligen HPV-Genom sind am Anfang und am Ende jeder Zeile angezeigt. Potentielle Bindestellen für das E2-Protein sind grün unterlegt, für NF-1 rot, für AP-1 türkis. Die TATA-Box ist gelb hervorgehoben. Das Stopp-Codon von L1 und das Start-Codon von E6 sind jeweils fett gedruckt und unterstrichen. 4.5.3. Phylogenetische Analyse Eine phylogenetische Analyse der L1-Gene der Alpha-2 und Alpha-4 HPVs, sowie der HPV-Typen 6 (Alpha-10), 11 (Alpha-10), 16 (Alpha-9), und 18 (Alpha-7) mit Hilfe des MacVector Programmes, ergab die Einordnung von HPVXS2 in die HPV Spezies Alpha-2 (Abb. 17). Im Vergleich zu den Alpha-2 HPV-Typen war in jedem einzelnen Fall der L1-ORF mehr als 10% unterschiedlich zu HPVXS2, so dass HPVXS2 definitionsgemäß einen neuen HPV-Typ darstellt (Bernard et al., 2013). 41 Ergebnisse Abb. 17: Stammbaum auf Basis der gesamten L1-Gensequenz (1515 Nukleotide) von HPVXS2 sowie aller bisher bekannten Alpha-2 und Alpha-4 HPV-Typen und der im quadrivalenten HPV-Impfstoff enthaltenen HPV-Typen von 6 (Alpha-10), 11 (Alpha-10), 16 (Alpha-9) und 18 (Alpha-7). Methode: Neighbor Joining Tree mit Tamura-Nei Entfernungen. Die Sequenzen von HPV2, 3, 6, 10, 16, 18, 27, 28, 29, 57, 77, 94, 117, und 125 stammen aus der Papillomavirus Episteme Datenbank (http://pave.niaid.nih.gov). 4.5.4. L1-Aminosäure Alignment Nachdem die Homologie des L1-Gens von HPVXS2 und den restlichen Alpha-2 HPVs aufgezeigt wurde, sollte die vermutlich hohe funktionelle Stabilität von L1 anhand der Homologien der Aminosäuresequenzen dargestellt werden. In Abbildung 18 sind die abgeleiteten L1-Aminosäuresequenzen aller Alpha-2 HPVs inklusive HPVXS2 im Einbuchstabencode dargestellt. Als erstes Codon (sog. Startcodon, Basentriplett) eines offenen Leserahmens auf der mRNA kodiert ATG die Aminosäure (AS) Methionin (M). Als Software für die Darstellung der L1Aminosäuresequenzen diente das MacVector-Programm. Weite Abschnitte des L1 42 Ergebnisse Proteins sind innerhalb der Alpha-2 Spezies konserviert (Abb. 18). HPXS2 unterschied sich in der abgeleiteten L1-Aminosäuresequenz (507 Aminosäuren) von seinen beiden nächsten Verwandten, HPV3 und HPV125, auf Aminosäureebene in 62/507 (12,2%) bzw. 64/507 (12,6%) Aminosäuren. Abb. 18: Darstellung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der L1- Hauptkapsidproteine von HPVXS2 und von den Alpha-2 HPV-Typen HPV3, 125, 117, 94, 77, 29, 28, und 10 (Einbuchstabencode). Unpolare AS: A=Alanin, G=Glycin, I=Isoleucin, L=Leucin, P=Prolin, V=Valin. Polare AS: N=Asparagin, F=Phenylalanin, M=Methionin. Q=Glutamin, W=Tryptophan, Saure AS: S=Serin, Y=Tyrosin. D=Asparaginsäure, T=Threonin. Schwefelhaltige Aromatische AS: E=Glutaminsäure. AS: C=Cystein, Basische AS: H=Histidin, K=Lysin, R=Arginin. Sowohl die phylogenetische Analyse der viralen DNA-Sequenz, als auch die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz zeigten, dass es sich bei HPVXS2 um einen neuen Alpha-2 HPV-Typ handelt. 43 Diskussion 5. Diskussion Bestimmte Papillomviren wie z.B. HPV1, 2 oder 3 verursachen Hautwarzen (Tab. 2), die bei immunkompetenten Personen in der Regel nach einigen Monaten spontan abheilen (Wieland & Pfister, 2006). Bei immunsupprimierten Patienten kann es zu persistierenden Hautwarzen kommen, die sich über mehrere Körperareale ausdehnen können (Kruger-Corcoran et al., 2010; Zachariae et al., 2012). Von generalisierter Verrucosis spricht man, wenn eine ausgedehnte Infektion mit Papillomviren zu multiplen Warzen in mehreren Körperregionen führt (Sri et al., 2012). Die HPV-Typen, die man in Hautwarzen von Patienten mit generalisierter Verrucosis findet, entsprechen in der Regel denen, die man in Hautwarzen von immunkompetenten Patienten nachweisen kann (Potthoff et al., 2012; Sri et al., 2012). In der vorliegenden Arbeit wurden Warzen-Biopsien einer immunsupprimierten Patienten mit generalisierter Verrucosis untersucht, in denen sich HPV-Sequenzen nachweisen ließen, die keinem bisher bekanntem HPV-Typ zugeordnet werden konnten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplette Genom des möglicherweise neuen HPV-Typs zu klonieren, zu sequenzieren, zu charakterisieren und phylogenetisch einzuordnen. Die hier untersuchte Patientin hatte seit über 12 Jahren langsam fortschreitende und sich ausbreitende Warzen an beiden Unterarmen, Handrücken und Fingern und erfüllte folgende Kriterien einer generalisierten Verrucosis (Sri et al., 2012): die Anzahl der Warzen lag (deutlich) über 20, mehr als eine Körperregion war betroffen, an den Akren trugen die meisten Finger Warzen, das Geschehen war progressiv und die Warzen widerstanden zahlreichen topischen und ablativen Therapieversuchen (siehe auch 1.4.). In allen Warzen-Biopsien der Patientin lies sich mittels gruppenspezifischer HPVScreening-PCR eine keinem bekannten HPV-Typ zuordenbare kurze HPV-Sequenz namens HPVXS2 nachweisen. HPVXS2-Fragmente wurden ursprünglich von Berkhout et al. (2000) in gutartigen hyperkeratotischen Papillomen, in Plattenepithelkarzinomen der Haut, und in Dermatitis-Biopsien von verschiedenen Körperregionen von drei nierentransplantierten Patienten entdeckt. Das bisher bekannte Fragment umfasste nur 261 bp (Berkhout et al., 2000). Aus zwei der hier vorliegenden Warzen-Biopsien wurde zunächst mittels gruppenspezifischer PCR ein über 600 bp langes HPV-L1-Gen Fragment generiert, das in dem entsprechenden 261 bp-Abschnitt 100% identisch mit der von Berkhout et al. gefundenen Sequenz 44 Diskussion war. Die nächsten Verwandten von HPVXS2 waren die Alpha-2 HPV-Typen 3, 10, 94 und 125 (jeweils 81% identisch im L1-Gen). HPV3 und HPV10 wurden ursprünglich in flachen juvenilen Warzen gefunden (Kremsdorf et al., 1983). HPV94 wurde ursprünglich in periläsionaler gesunder Haut, in gutartigen Läsionen und in kutanen Plattenepithelkarzinomen gefunden (de Villiers & Gunst, 2009). HPV125 wurde aus der Handwarze eines immunkompetenten Mannes isoliert (Kovanda et al., 2011). Da sich der generierte 600 bp L1-Gen-Sequenzabschnitt von HPVXS2 um mehr als 10% von dem seiner nächsten Verwandten unterschied, stellte das vorliegende kurze HPVXS2-Fragment vermutlich einen neuen HPV-Typ dar (de Villiers et al., 2004; Bernard, 2013). Um das komplette Genom von HPVXS2 zu erhalten wurden die Methoden der Rolling Circle Amplifikation sowie der (Long-Distance) PCR mit „Primer-Walking“ (siehe 3.2. und 4.3.) angewandt. Diese Methoden haben sich bereits bei der Klonierung etlicher neuer Papillom- und Polyomaviren wie zum Beispiel HPV-RTRX7, HPyV6, HPyV7 und TSPyV bewährt (Bens et al., 1998; Schowalter et al., 2010; van der Meijden et al., 2010). Mittels Rolling Circle Amplification konnte gezeigt werden, dass in den analysierten Warzen-Biopsien tatsächlich ein zirka 8000 bp zirkuläres Doppel-StrangDNA Genom vorlag, wie es typisch für Papillomviren ist (Wieland & Pfister, 2009; IARC, 2011). Da sich das mittels Rolling Circle Amplification gefundene 8000 bp Fragment nicht direkt klonieren ließ, wurde das neue HPV-Genom mittels PCR und Primer-Walking ermittelt. Folgende Gründe für die Nicht-Klonierbarkeit des RCAFragments könnten vorgelegen haben: 1.) Das zu klonierende Insert von 7830 bp könnte für den deutlich kleineren Vektor (2974 bp) zu groß gewesen sein, so dass möglicherweise ein sterisches Problem vorlag. 2.) Die DNA-Struktur des Inserts könnte durch die Interkalierung von Ethidiumbromid beschädigt worden sein. 3.) Ein DNA-Verlust bei der Gelextraktion könnte erfolgt sein. 4.) UV-Schäden der DNA könnten bei dem Sichtbarmachen der DNA im Agarosegel entstanden sein. 5.) Zu niedrige DNA-Konzentrationen könnten vorgelegen haben. 6.) Ein nicht adäquates Aneinanderfügen der Enden von Insert (keine „Blunt ends“) und Vektor könnten vorgelegen haben. Für das weitere Vorgehen mittels PCR und Primer-Walking wurden, ausgehend von dem ursprünglich beschriebenen HPVXS2-Fragment (Berkhout et al., 2000), in beide Richtungen im Abstand von zirka 1000 Basen PCR-Primerpaare entworfen, die an innerhalb der Alpha-2 HPV-Gruppe möglichst konservierte Regionen banden. Die so erhaltenen 10 PCR-Produkte, die das gesamte HPVXS2-Genom abdeckten, wurden jeweils in beide Richtungen sequenziert und die erhaltenen Sequenzen 45 Diskussion computergestützt zu einem 7830 bp umfassenden HPV-Genom zusammengesetzt (siehe 4.3.). Anschließend gelang es, das gesamte HPVXS2-Genom mittels LongDistance-PCR zu amplifizieren und in drei überlappenden Fragmenten von 2893, 3050 bzw. 3088 bp zu klonieren (siehe 4.4.). Nachdem die komplette DNA-Sequenz von HPVXS2 ermittelt und kloniert war, erfolgte die computergestützte Analyse des HPVXS2 Genoms (siehe 4.5.). HPVXS2 hatte den für Alpha HPV-Typen charakteristischen Genomaufbau. Die zu erwartenden acht offenen Leserahmen für die Kapsidproteine L1 und L2, sowie für die frühen Gene E1, E2, E4, E5, E6 und E7, lagen jeweils an den üblichen Positionen im HPV-Genom vor (siehe Abb. 15). Wie bei allen Papillomviren befand sich die nicht-kodierende Region zwischen dem L1 und dem E6 Gen und war 678 bp lang. Sie trug neben der TATA-Box in der Promotorregion für die frühen Gene, die zu erwartenden potenziellen Bindestellen für Transkriptionsfaktoren wie AP1 und NF1, sowie mehrere potenzielle Bindestellen für das für die Transkription der HPV-Gene zuständige HPV-kodierte E2Protein. Die phylogenetische Analyse ergab, dass HPVXS2 der HPV Spezies Alpha-2 zugeordnet werden kann (siehe Abb. 17). Seine nächsten Verwandten waren in dem auf dem kompletten HPV-L1-Gen basierenden Stammbaum HPV3, HPV10, HPV28, HPV94, HPV117 und HPV125, alles Zugehörige der HPV Spezies Alpha-2. Die HPV Spezies Alpha-2 umfasst Viren, die bei Immunkompetenten und/oder Immunsupprimierten gutartige Hautwarzen induzieren. Dazu gehören HPV3, 10, 28, 29, 77, 94, 117, und 125 (Gross et al., 1997; de Villiers & Gunst, 2009; Köhler et al., 2010; Kovanda et al., 2011; Wieland et al., 2014). Der gesamte L1-ORF (1515 bp) von HPVXS2 unterschied sich von allen anderen HPV-Typen um mehr als 10% (weniger als 90% homolog zu den nächsten Verwandten). Somit stellt HPVXS2 definitionsgemäß einen vermutlich neuen HPV-Typ dar (Bernard et al., 2010 und 2013). Auch in seiner abgeleiteten L1-Aminosäuresequenz unterschied sich HPVXS2 um mehr als 10% von seinen beiden nächsten Verwandten, HPV3 und HPV125. Nach dem Vorliegen der HPVXS2-Sequenz konnte von Frau Dr. Silling aus dem Institut für Virologie der Uniklinik Köln die Verbreitung von HPVXS2 in verschiedenen klinischen Proben mittels quantitativer typ-spezifischer Echtzeit-PCR untersucht werden (Silling et al., 2014). HPVXS2 ließ sich in drei Hautwarzen von drei verschiedenen HIV-positiven Frauen nachweisen, wobei in der Studie insgesamt 62 46 Diskussion Hautwarzen von 17 immunkompetenten und 24 immunsupprimierten Patienten untersucht wurden. Zwei der HPVXS2-positiven Warzen waren mit HPV57 koinfiziert und die HPVXS2-DNA-Lasten in diesen Warzen waren sehr niedrig (0,0002 bzw. 0,034 HPVXS2-DNA-Kopien pro ß-Globingen-Kopie). Diese beiden Warzen wurden somit vermutlich durch HPV57 und nicht durch HPVXS2 verursacht (Silling et al., 2014). Die dritte HPVXS2-positive Warze aus der Studie von Dr. Silling enthielt nur HPVXS2 und hatte eine hohe HPVXS2-Last (6,9 HPVXS2-DNA-Kopien pro ß-Globingen-Kopie). Somit kann diese Warze als HPVXS2-induziert gelten. Auch in 17 analysierten Hautwarzen der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Patientin lagen hohe HPVXS2-DNA Lasten vor (Spannbreite 903 bis 99.571 HPVXS2-DNA-Kopien pro ßGlobingen-Kopie; Median 14.534) (Silling et al., 2014). Diese Viruslasten ähneln Viruslasten, die in durch andere kutane HPV-Typen induzierten Warzen gefunden wurden (Köhler et al., 2009). Somit kann HPVXS2 als neues warzen-induzierendes Virus gelten. Darüber hinaus kommt HPVXS2 auch auf normaler, läsionsfreier Haut vor. In der oben erwähnten Arbeit von Dr. Silling wurden 449 Hautabstriche von normaler Stirnhaut von 210 HIV-positiven Männern und 239 HIV-negativen männlichen Kontrollpersonen untersucht. HPVXS2-DNA war bei 16,2% (34/210) der HIV-positiven Männer und bei 0,8% (2/239) der HIV-negativen Männer nachweisbar (p < 0,001). HIVpositive Männer mit CD4-Zellzahlen unterhalb von 350 Zellen/μl waren häufiger HPVXS2-positiv als solche mit CD4-Zellzahlen über 350 Zellen/μl (25,0% versus 13,5%, p = 0,101) (Silling et al., 2014). In den zwei HPVXS2-positiven Proben der HIVnegativen Männer waren die Viruslasten sehr gering (0,014 bzw. 0,023 HPVXS2-DNAKopien pro ß-Globingen-Kopie), während bei den HIV-positiven Männern HPVXS2Lasten über 1,0 bei 10 der 34 HPVXS2-positiven Männern gefunden wurde (Spannbreite 0,002 – 35,0; Median: 0,107 HPVXS2-DNA-Kopien pro ß-GlobingenKopie) (Silling et al., 2014). Dies zeigt, dass bei immunkompromittierten Patienten die kutane Suppression und Elimination von HPVXS2 schwieriger zu sein scheint als bei Immunkompetenten. Allerdings verursacht HPVXS2 bei der Mehrheit der mit diesem Virus infizierten Immunsupprimierten keine klinisch apparenten kutanen Läsionen, da keiner der 34 HPVXS2-positiven HIV-infizierten Männern Hautwarzen hatte (Silling et al., 2014). Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit ein neues Humanes Papillomvirus aus Hautwarzen einer immunsupprimierten Patientin isoliert, kloniert, sequenziert, charakterisiert und phylogenetisch als kutanes Alpha-2 Papillomvirus eingeordnet. Außer bei onkologischen Patienten kann das neue Humane Papillomvirus HPVXS2 auch bei HIV-infizierten Patienten kutane Warzen verursachen. 47 Zusammenfassung 6. Zusammenfassung Humane Papillomviren (HPV) infizieren mehrschichtige Plattenepithelien von Haut und Schleimhaut. Neben malignen Erkrankungen wie dem Zervixkarzinom können bestimmte Papillomviren auch gutartige Läsionen wie Genitalwarzen (Condylomata acuminata) oder Hautwarzen (Verrucae) verursachen. Immunsupprimierte Patienten haben ein erhöhtes Risiko für HPV-assoziierte Erkrankungen. Ausgedehnte Warzenbildung – generalisierte Verrucosis - ist in den meisten Fällen mit einer Immunsuppression assoziiert. Für die vorliegende Arbeit lagen mehrere Hautwarzen-Biopsien einer immunsupprimierten onkologischen Patientin mit langjährig bestehender generalisierter Verrucosis vor. Alle mittels PCR und Sequenzierung untersuchten Warzen der Patientin enthielten eine kurze, bisher nicht näher charakterisierte HPV-Sequenz namens HPVXS2. HPVXS2 repräsentierte vermutlich einen neuen, warzen- induzierenden HPV-Typ, da sich der vorliegende HPVXS2-DNA Sequenzabschnitt um mehr als 10% von dem entsprechenden L1-Gen Abschnitt der nächsten verwandten HPV-Typen aus der HPV Spezies Alpha-2 unterschied. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das komplette Genom des vermutlich neuen HPV-Typs kloniert, sequenziert, charakterisiert und phylogenetisch eingeordnet werden. Um das komplette Genom von HPVXS2 zu erhalten, wurden die Methoden der Rolling Circle Amplifikation (RCA) sowie der „Long-Distance“ PCR mit „Primer-Walking“ angewandt, die sich bereits bei der Klonierung neuer Papillomviren bewährt haben. Mittels RCA konnte gezeigt werden, dass in den analysierten Warzen-Biopsien tatsächlich ein zirka 8000 bp zirkuläres Doppel-Strang-DNA Genom vorlag, wie es typisch für Papillomviren ist. Da sich das mittels RCA gefundene 8000 bp Fragment nicht direkt klonieren ließ, wurde die Sequenz des neuen HPV-Genoms mittels PCR und Primer-Walking ermittelt. Dabei wurden, ausgehend von dem ursprünglich beschriebenen HPVXS2-Fragment, im Abstand von zirka 1000 Nukleotiden PCR-Primerpaare entworfen, die an innerhalb der HPV Spezies Alpha-2 möglichst konservierte Regionen banden. Die so erhaltenen PCR-Produkte, die das gesamte HPVXS2-Genom überlappend abdeckten, wurden jeweils in beide Richtungen sequenziert und die erhaltenen DNA-Sequenzen computergestützt zu einem 7830 bp umfassenden HPV-Genom zusammengesetzt. Anschließend gelang es, das gesamte HPVXS2-Genom mittels „Long-Distance“ PCR zu amplifizieren und in drei überlappenden Fragmenten von 2893, 3050 und 3088 Basenpaaren zu klonieren. Nachdem die komplette DNA-Sequenz von HPVXS2 ermittelt und kloniert war, erfolgte die computergestützte Analyse des HPVXS2 Genoms. HPVXS2 hatte den für Alpha HPV-Typen charakteristischen Genomaufbau. 48 Zusammenfassung Die zu erwartenden acht offenen Leserahmen für die Kapsidproteine L1 und L2, sowie die frühen Gene E1, E2, E4, E5, E6 und E7, lagen jeweils an den üblichen Positionen im HPV-Genom vor. Wie bei anderen Papillomviren befand sich die nicht-kodierende Region (NCR) zwischen dem L1- und dem E6-Gen. Die NCR trug neben der TATABox potenzielle Bindestellen für Transkriptionsfaktoren wie AP1 und NF1, sowie mehrere Bindestellen für das für die virale Transkription zuständige HPV E2-Protein. Die phylogenetische Analyse ergab, dass HPVXS2 eindeutig der HPV Spezies Alpha-2 zugeordnet werden kann. Seine nächsten Verwandten waren in einem auf der kompletten HPV L1-Gen Sequenz basierenden Stammbaum HPV3, HPV10, HPV28, HPV94, HPV117 und HPV125, alles Zugehörige der HPV Spezies Alpha-2. Diese umfasst Papillomviren, die bei Immunkompetenten und Immunsupprimierten gutartige Hautwarzen induzieren. Der gesamte L1-ORF (1515 bp) von HPVXS2 unterschied sich sowohl auf DNA Ebene, als auch in der abgeleiteten L1-Aminosäuresequenz, von allen anderen bekannten HPV-Typen um mehr als 10%. Damit stellt HPVXS2 definitionsgemäß einen neuen HPV-Typ dar. In sich an die vorliegende Arbeit anschließenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass HPVXS2 außer bei onkologischen Patienten auch bei HIV-Infizierten kutane Warzen verursachen kann. HPVXS2 kann somit als neues warzen-induzierendes Alpha-Papillomvirus gelten. 49 Literaturverzeichnis 7. Literaturverzeichnis 1. Abraham AG, D'Souza G, Jing Y, Gange SJ, Sterling TR, Silverberg MJ, Saag MS, Rourke SB, Rachlis A, Napravnik S, Moore RD, Klein MB, Kitahata MM, Kirk GD, Hogg RS, Hessol NA, Goedert JJ, Gill MJ, Gebo KA, Eron JJ, Engels EA, Dubrow R, Crane HM, Brooks JT, Bosch RJ, Strickler HD. 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Krankenhaus Köln-Kalk 2006-2013: Studium der Medizin an der Universität zu Köln 2009: Ärztliche Basisprüfung 2012-2013: Praktisches Jahr: Anästhesie, Krankenhaus Porz am Rhein, Köln Innere Medizin, Krankenhaus der Augustinerinnen, Köln Chirurgie, St. Vinzenz Hospital, Köln 12/2013: Ärztliche Prüfung 01/2014: Approbation seit 08/2014: Assistenzarzt am Helios Klinikum Erfurt Klinik für Anästhesiologie, Intensivmedizin und Schmerztherapie Köln, den 16.12.2014 62
