NUCLEINSÄUREN
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NUKLEINSÄUREN-KERNSÄUREN DIE NUKLEOTIDE Nucleotide sind die Bausteine von DNA und RNA; sie haben viele Funktionen. Ihre Hauptaufgabe liegt in der Speicherung der biologischen Information, sie sind die chemische Basis unseres Erbmaterials. Die Fähigkeit der Basen, sich durch bestimmte chemische Wechselwirkungen zu erkennen, ist die Grundlage von Vererbung und Evolution. Daneben spielen die Nucleotide als Energieträger im Stoffwechsel eine wichtige Rolle. In Verbindung mit anderen Gruppen bilden sie wichtige Coenzyme, die für den Ablauf eines regulären Zellstoffwechsels von großer Bedeutung sind (ATP). Innerhalb der Zelle können Nucleotide auch als spezifische Signalmoleküle (second messengers, cAMP) erwendet werden. Nucleotide bestehen aus drei Bauelementen. Das Hauptelement ist ein Zucker, der aus fünf Kohlenstoffatomen besteht (Ribose, Desoxyribose*; Unterschied siehe weiter unten). Daran angehängt sind eine oder mehrere Phosphatgruppen sowie stickstoffhältige Ringverbindungen, die häufig als Stickstoffbasen bezeichnet werden. Zwischen jenen Basen, die in den Kernsäuren gefunden werden, zeigen sich starke Familienähnlichkeiten. Die einen leiten sich von einem Sechserring ab: Cytosin (C), Thymin (T) und Uracil (U). Bei den Verbindungen Adenin (A) und Guanin (G) tritt zum Sechserring noch ein Fünferring hinzu. Die Phosphatgruppe kann sich sehr leicht mit einem anderen Zucker verbinden. Dadurch werden die einzelnen Nucleotide zu einem Großmolekül, einer Kernsäure verknüpft. Abbildung: Buch Seite 6/2 1 Am 1´-C-Atom der Desoxiribose (Zucker) bindet die Stickstoffbase Am 2´-C-Atom hängt an der rot markierten Stelle ein H. Am 3´-C-Atom der Desoxiribose wird die Verbindung zur Phosphatgruppe des folgenden Nukleotids hergestellt. An den jeweiligen 3´-C-Atomen erfolgt also die Verknüpfung der einzelnen Nukleotide des DNA-Einzelstranges Am 5´-C-Atom hängt die Phosphatgruppe des Nukleotids es entsteht ein Polynukleotidstrang. Diese DNA-Einzelstränge sind sehr stabil und können nur durch Enzyme gespalten werden Nukleotidbau: AUG STRUKTUR UND ORIENTIERUNG DER DNA-EINZELSTRÄNGE Jeder Polynukleotidstrang besitzt an einem Ende ein Nukleotid, dessen Zucker am 5´-CAtom eine Phosphatgruppe hat, die keine Verknüpfung zu einem vorangegangen Nukleotid besitzt. Dieses Ende des DNA-Einzelstranges nennt man das 5´-Ende. Am anderen Ende liegt ein Nukleotid, dessen Zucker ein freies 3´-C-Atom besitzt, da es kein folgendes Nukleotid gibt. Dieses Ende nennt man das 3´-Ende. Die Verknüpfung zweier Nukleotide erfolgt über die Phospahatgruppe des einen Nukleotids. Der Polynukleotidstrang besitzt nun 2 Enden. An einem Ende ist die Phospatgruppe des 5´-CAtoms frei man spricht vom 5´- Ende der DNA. Am anderen Ende ist die OH-Gruppe des 3´-CAtoms frei. Man spricht vom 3´-Ende der DNA. 2 DER DNA-DOPPELSTRANG Zwei Polynukleotidstränge werden über die N-Basen durch WasserstoffbrückenBindungen verknüpft, wobei zwischen A-T zwei, zwischen G-C drei Wasserstoffbrücken-Bindungen entstehen. Durch diese WasserstoffbrückenBindungen entsteht die räumliche Struktur der Doppelhelix. (Diese Kräfte, die ein komplementäres Basenpaar zusammenhalten, sind im Gegensatz zu den Bindungen innerhalb eines Stranges sehr schwach. Durch Erhitzen oder durch hohe Salzkonzentrationen kann die DNA in ihre beiden Einzelstränge getrennt werden. Senkt man Temperatur oder den Salzgehalt wieder, so finden sich die Einzelstränge aufgrund der Basenkomplementarität wieder zu einem Doppelstrang. Diese Eigenschaften werden in der Gentechnologie stark genutzt.) Das DNA-Molekül besteht also aus 2 Strängen, die schraubenförmig umeinander gewunden sind. Entspiralisiert man die Schraube, so kann man die leiterförmige Struktur der beiden Stränge erkennen . Beide Stränge sind in ihrer Laufrichtung antiparallel, d.h. der eine Strang verläuft in 5´-3´-Richtung, der zweite in 3´-5´-Richtung. In der Basensequenz( Aufeinanderfolge der N-Basen) sind die beiden Stränge zueinander komplementär und nicht identisch! 3 DIE VERPACKUNG DER DNA-MOLEKÜLE Die DNA-Moleküle haben Längen bis in den cm-Bereich. Die einzelnen DNAMoleküle einer menschlichen Zelle sind etwa 2 Meter lang. Im Zellkern, der nur einen Durchmesser von einem Tausendstel Millimeter hat, sind sie aber engstens verpackt. Während die DNA für Kopiervorgänge in einer gestreckten Form vorliegen soll, muss sie bei der Zellteilung eine möglichst kompakte Struktur annehmen. In der Telophase der Mitose z.B. wird der DNA-Faden von 10-20 cm auf 50 m verkürzt. Dieser hohe Verpackungsgrad wird durch weitere Verdrillungen des bereits gedrehten DNA-Fadens (Doppelhelix) erreicht. Zunächst windet sich die Doppelhelix um kugelige Strukturen, die aus bestimmten Proteinen, den Histonen aufgebaut sind. Ein Histonpaket und die darum herum gewickelte DNA wird als Nukleosom, der Grad der Verpackungsdichte von DNA-Histon wird als Chromatin bezeichnet. Auch diese DNA-Histon Struktur ist wieder verdrillt und ergibt die Superhelix. Es existieren noch zahlreiche, wesentlich kompliziertere Verpackungsstrukturen. Entsprechende Abbildungen gibt es im Buch Seite 7/6 DER GENETISCHE CODE Die genetische Information der DNA besteht aus der ganz genau definierten Reihenfolge der 4 versch. Nukleotid-Typen. Der genetische Code erklärt das Prinzip der Verschlüsselung und die Art der Umsetzung dieser Information. Drei aufeinanderfolgende Nukleotide werden als ein Triplett zusammengefasst Ein Triplett stellt den Code für eine AMS dar Die bestimmte Aufeinanderfolge der einzelnen Tripletts (Nukleotidsequenz) und die Festlegung der Leserichtung der Tripletts bestimmen sowohl die Art der jeweiligen AMS als auch die genaue Reihenfolge (AMS-Sequenz), in welcher die AMS zum Protein zusammengebaut werden. Das informationstragende Triplett auf der DNA wird als Codogen, das auf die mRNA kopierte, als Codon bezeichnet. Die Gegenkopie zum Codon sitzt auf der TransferRNA (t-RNA) und heißt Anticodon . Jede Nucleotidsequenz auf der RNA kann in drei verschiedenen Leserastern abgelesen werden, je nachdem wo man mit der Decodierung beginnt. Es wird aber nur einer dieser Raster ein funktionstüchtiges Protein produzieren. Buch Seite 8/2 und3 DIE EIGENSCHAFTEN DES GENETISCHEN CODES Der genetische Code ist eindeutig: Niemals gilt ein Codon für zwei Aminosäuren. (z.B.: UUU codiert nur für Phenylalanin) Weiters ist er universell, d.h. er ist bei allen Lebewesen, vom Bakterium bis zum Menschen und Pflanzen gleich. Ausnahmen von diesen beiden ersten Eigenschaften gibt es bei Mitochondrien, Chloroplasten und einigen Protozooen. Der genetische Code ist degeneriert. Es können mehrere Codons einer Aminosäure zugeordnet werden (z.B.: Für Phenylalanin gilt neben dem oben genannte Code UUU auch UUC). Das ergibt sich daraus, dass es nur zirka 20 Aminosäuren gibt, aber 64 Kombinationsmöglichkeiten. 4 So gibt es noch Platz für Stoppsignale, die am Ende jedes Gens stehen und das Ende des Proteins signalisieren (UAA, UAG, UGA). AUG codiert für Methionin und gilt gleichzeitig als Startcodon Achtung!!!! Die Nukleotidsequenzen, die man braucht um die AMS-Sequenz zu beschreiben, werden in mRNA-Sprache angegeben. Es handelt sich also um Codons und nicht um Codogene!!!!!! Man nennt sie ja auch Codons (Startcodon, Stopcodon usw.). Siehe Buch Seite 8/1! DIE FUNKTIONEN DER DNA In der DNA ist unsere gesamte Erbinformation in Form von Untereinheiten, den Genen, gespeichert. Da diese Erbinformation im Prozess der Vererbung genau kopiert und auf die Nachkommen übertragen werden muss, liefert die Struktur der DNA eine gute Erklärung für den molekularen Ablauf der Vererbung. Die Weitergabe der Information erfolgt durch eine Matrizentechnik. Aufgrund der Basenpaarung (A-T bzw. C-G) kann jeder Einzelstrang wieder zu einer Doppelhelix ergänzt werden. Der Vorgang wird als Replikation bezeichnet. Jede Tochter-DNA enthält einen Mutterstrang und einen neuen, aus Nucleotiden der Zelle aufgebauten Tochterstrang. Dafür ist ein aufwendiger enzymatischer Apparat benötigt. Fehler, die während des Kopiervorganges auftreten, werden als Mutationen bezeichnet. Eigene Enzyme können fehlerhafte DNA-Sequenzen erkennen und repariere. Die Umsetzung der in der DNA gespeicherten Information erfolgt durch die Eiweißsynthese. Die Nucleotidfolge eines Gens bestimmt die Folge der Aminosäuren in einem Eiweiß. Aus dieser Abfolge der Aminosäuren ergeben sich die Eigenschaften und Fähigkeiten des Proteins. Der Übersetzungsschlüssel ist der genetische Code. Eine Kombination von drei Nucleotiden ist jeweils einer Aminosäure zugeordnet. (Siehe oben) 1. DIE VERDOPPLUNG DER DNA - REPLIKATION Bei der Zellteilung muss die komplette genetische Information an die beiden Tochterzellen weitergegeben werden, d.h. die DNA muss zuvor verdoppelt werden. Diese Verdopplung der DNA vor einer Zellteilung bezeichnet man als Replikation. Das spiralig gewundene DNA-Molekül wird aufgedrillt, und die Holme der Strickleiter, d.h. die Basenpaare, weichen vergleichbar einem sich öffnenden Reißverschluss, auseinander. Die beiden Einzelstränge dienen jeweils als Matrize zur Synthese eines Tochterstranges; man bezeichnet die Replikation daher als »semikonservativ«. Die entstehenden Doppelstränge bestehen aus je einem alten (Matrizen) und einem neusynthetisierten Strang. Zur Replikation der DNA muss die komplexe Überstruktur der Chromosomen zunächst bis zum DNA-Doppelstrang aufgelöst werden. 5 Anschließend wird die DNA-Doppelhelix in Teilbereichen entdrillt und der Doppelstrang so aufgeweitet, dass die Basen der Einzelstränge abgelesen werden können. Zum Kopieren von 10 Nucleotiden muss die DNA dabei um eine Windung entdrillt werden. Das Enzym Topoisomerase I verhindert die daraus resultierende stärkere Verdrillung des restlichen Stranges, indem es das Zucker-Phosphat-Rückgrat des Moleküls an einer Stelle spaltet und nach dem Kopiervorgang wieder zusammenfügt. Gelegentliche Verknotungen im DNAFaden entwirrt das Enzym Topoisomerase II. Die Replikation beginnt gleichzeitig an verschiedenen Stellen der DNA. An diesen als Replikationsgabeln bezeichneten Startpunkten weitet das Enzym Helicase den Doppelstrang zu Einzelsträngen auf. Diese Reaktion verbraucht chemische Energie in Form von ATP, während die Rückbildung des Doppelstranges spontan verläuft. Die für das exakte Kopieren der DNA nötige lineare Ausrichtung gewährleistet eine dritte Gruppe von Proteinen, die sog. »DNA-Einzelstrang-bindendenEnzyme«. An der so präparierten DNA kann nun die eigentliche Replikation beginnen. Zunächst werden an den Startpunkten durch das Enzym Primase bestimmte Startmoleküle, sog. »Primer«, gebildet. Diese bestehen aus RNA. An die RNA-Startermoleküle knüpft das Enzym DNA-Polymerase anschließend die (dem Matrizenstrang komplementären) Desoxyribonucleotide an. Die zuerst gebildeten RNA-Fragmente werden danach wieder von der DNA entfernt. Der neu zu synthetisierende Strang wächst durch sequentielles Anfügen von Nucleotiden an die Kette. Dabei bilden die Basen der Nucleotide mit denen des Matrizenstranges Paare aus, die durch Wasserstoffbrücken-Bindungen zusammengehalten werden. Vom Nucleotid (dem Nucleosidtriphosphat) wird dann ein Diphosphatrest abgespalten und gleichzeitig eine Phosphatbrücke (Esterbindung) zu dem vorhergehenden (zuletzt angefügten) Baustein der Kette gebildet. Die DNA-Polymerase liest den Matrizenstrang stets in 3' - 5'-Richtung ab, d.h. der neue Strang wird immer in 5'- 3'-Richtung synthetisiert. Infolgedessen kann nur einer der beiden neuen Stränge - der »leading strand« - kontinuierlich zusammengeknüpft werden. Die Synthese des zweiten neuen Stranges - des »lagging strand« -, die ja ebenfalls in 5' - 3'-Richtung erfolgen muss, verläuft fragmentiert: Es werden kurze Stücke von ca. 1000 Nucleotiden Länge (»Okazaki-Fragmente«) synthetisiert, die dann in einer durch das Enzym DNA-Ligase katalysierten Folgereaktion zu einem durchgehenden Strang verknüpft werden. Das Enzym DNA-Polymerase katalysiert nicht nur die Verknüpfung der einzelnen Nucleotide, sondern kontrolliert auch die Genauigkeit: Bei Bakterien unterläuft pro 1 Million Kopiervorgänge (mit jeweils 16 000 Nucleotiden pro Minute) nur ein einziger Fehler. Der als »proof reading« (Korrekturlesen) bezeichnete Kontrollprozess gewährleistet auch bei Eukaryonten das exakte Kopieren des genetischen Materials. So wird bei der Verdopplung des menschlichen Chromosomensatzes, beim Zusammenfügen von 3 Milliarden Nucleotiden, nur ein einziger Fehler gemacht. Die eukaryontische Kopiergeschwindigkeit ist mit 2000 Nucleotiden pro Minute zwar langsamer als bei Bakterien, es existieren hier aber weitaus mehr Replikationsgabeln (Startpunkte; engl.: »origins of replication«) 6 7 2. DIE EIWEISSYNTHESE Die Proteinproduktionsmaschine, die Ribosomen von Bakterien bestehen aus 60 Einzelteilen. Wenn man diese unter bestimmten Bedingungen mischt, lagern sie sich sofort zu einem funktionstüchtigen Teilchen zusammen. Chemisch bestehen sie etwa zur Hälfte aus RNA und Proteinen. Unermüdlich erledigen zehn Millionen Ribosomen in der Zelle ihre Routinearbeit. Mit einer Geschwindigkeit von 10 - 15 Nucleotiden pro Sekunde wandern sie den RNA-Strang entlang. Bei 10 000 Einzelschritten tritt höchstens ein Fehler auf, dies ist eine Genauigkeit, die von keiner Druckerei erreicht wird. Jede Zelle benötigt etwa eine Minute, um ein Protein aus 1000 Aminosäuren aufzubauen. Die Synthese verläuft jedoch parallel an vielen Ribosomen, die gleichzeitig die Information von der Boten-RNA ablesen Polysomen. Die Proteinsynthese erfolgt in 3 großen Schritten, wobei jeder noch aus verschiedenen Einzelschritten zusammen gesetzt ist: Transkription Prozessierung Translation 2.1. Die Transkription Der Vorgang des Ablesens der Information und des Aufbaus einer neuen Kernsäure wird von der Enzymfamilie der Polymerasen besorgt. Wird eine neue DNA aufgebaut, spricht man von einer Replikase (DNA-abhängige DNAPolymerase). Entsteht eine mRNA, heißt das Enzym Transkriptase (DNAabhängige RNA-Polymerase). Einige Viren, die Retroviren wie z.B. das AIDS-Virus, besitzen eine spezielle Polymerase (RNA-abhängige DNAPolymerase = Reverse Transkriptase), die aus einer RNA-Vorlage eine DNA aufbauen kann. So gefährlich die Tätigkeit dieses Enzyms für uns ist, so wichtig ist sie in der Gentechnologie. Jener Strang, der als Vorlage benutzt wird, heißt Matrize. Es wird immer nur ein Strang als Matrize benutzt. (Bei der Replikation dienen beide Stränge gleichzeitig als Matrize.) Dabei müssen aber benachbarte Gene nicht am gleichen Strang sitzen. Die Polymerase, die die mRNA bildet, muss den codogenen Strang "erkennen". Dazu dient eine besondere DNA-Sequenz, die dem Gen vorgeschaltet ist und die Polymerase besonders stark an sich bindet (Promotor). Diese Promotorregion enthält bestimmte Basensequenzen (Schallerbox), welche die Affinität der Transkriptase zum Promotor und damit die Zahl der produzierten m-RNA-Moleküle bestimmt. Ein spezielles Protein, der Sigmafaktor, dirigiert die Transkriptase exakt an die Anfangsposition des Promotors. Die Promotorregion enthält nicht nur den Startpunkt für die RNA-Synthese, sondern zwingt das Enzym in die richtige Ableserichtung 3' - 5'. Dabei trennt es den Doppelstrang, die Nucleotide des codogenen Stranges liegen offen und werden nun mit freien, komplementären Nucleotiden verknüpft. Dann rutscht die Polymerase ein Stück weiter, die mRNA wächst Nucleotid um Nucleotid (5' - 3' Richtung). Beim Stoppsignal löst sich das Enzym von beiden Kernsäuren, die DNA erhält wieder die helikale Struktur. Noch während der Transkription erhält das 5´-Ende der mRNA die cap-Zone (ein Guanin mit Methylgruppe), sie ist für das Einfädeln am Ribosom und somit für die Translation wichtig. 8 Die Transkription ist beendet. Das 3´-Ende bekommt noch eine Poly-A-Zone angehängt, beide Enden dienen als Erkennungszonen für bestimmte Enzyme und verhindern so den Abbau der m-RNA im Zellplasma. Die RNA-Moleküle liegen nun als hnRNA( heterogene nucleare RNA)-Moleküle vor. Bei „Organismen“ mit geringer DNA-Kapazität kann der Leseraster um ein bis zwei Nukleotide verschoben werden und es entsteht trotzdem ein funktionstüchtiges Protein. Bei Eukaryonten wird ein Gen (Cistron) in codierende (Exons) und nicht codierende (Introns) Abschnitte gegliedert. Man nennt solche Gene Mosaikgene. 2.2. Die Prozessierung (processing): Auf dem Weg vom Zellkern zum Zellplasma erfolgt die Prozessierung der hnRNA, die Introns werden entfernt und die Exons zusammengefügt. Durch variable Rekombinationen der Exons können bei Viren und bei der Antikörper-Synthese unterschiedliche Proteine synthetisiert werden. Wenn man an mRNA mit Hilfe der reversen Transkriptase (RNA-abhängige DNAPolymerase) DNA herstellt, so erhält man die Sequenz der DNA ohne Introns. Solche DNA-Moleküle werden in der Gentechnik eingesetzt (copy-DNA = cDNA). Buch Seite 15/4 bis 6 2.3. Die Translation: Translation bedeutet Übersetzung der genetischen Information in die AMSSequenz der Proteine. Als Matrize fungiert die der DNA komplementäre mRNA. Die Translation findet im Zellplasma (Cytoplasma ) statt. Hier wird mRNA an die Ribosomen gebunden, dabei in die richtige Position gebracht, und aufgrund der Codonabfolge innerhalb der mRNA werden die entsprechenden AMS unter Ausbildung von Peptidbindungen miteinander zu einem Protein verknüpft. Die Translation erfolgt in 3 Teilschritten: Initiation Elongation Termination Die Transfer-RNA: Für die Übersetzung eines Nucleotid-Codes in eine AMS-Sequenz werden Adaptor-Moleküle, die tRNAs benötigt. tRNAs sind kleine Moleküle aus 70 - 90 Nucleotiden mit einer Kleeblattstruktur. Da jede tRNA einer bestimmten Aminosäure zugeordnet ist, gibt es mindestens 20 verschiedene tRNA-Moleküle in jeder Zelle. Vier wichtige Stellen ermöglichen die Funktion der tRNA. Am 3´-Ende ist die Akzeptorstelle, die Bindungsstelle für die Aminosäure. Sie beginnt stets mit der Basensequenz ACC. Die Sequenz der Schleife 1 sorgt dafür, dass ein spezielles Enzym (insgesamt gibt es 20, für jede tRNA eines) die richtige Aminosäure anbindet. Die Schleife 2 ist der Sitz des Anticodons, das sich mit dem Codon der mRNA verknüpft. Die Schleife 3 enthält die Kontaktstelle zum Ribosom Das Ribosom: Die Zusammensetzung von Proteinen geschieht an einer Struktur aus Proteinen und RNA, den Ribosomen. Die ribosomale RNA (rRNA) übernimmt dabei die wichtige Katalysatorfunktion. Jedes Ribosom enthält drei Bindungsstellen für RNAMoleküle. Eine für die mRNA, eine A-Bindungsstelle, an die die neue tRNA gebunden wird, und eine P-Bindungsstelle, an die die vorhergehende tRNA gebunden wird, die noch mit der wachsenden Proteinkette verbunden ist. 9 DIE PROTEINBIOSYNTHESE AM RIBOSOM Ribosomen sind ca. 20 Nanometer große Zellorganellen, die sich aus 50 bis 70 Proteinen und 3 bis 4 Ribonukleinsäuren zusammensetzen. Eine Bakterienzelle enthält etwa 15 000 Ribosomen. Eukaryontische Ribosomen sind komplexer. Die Funktionsweise bei der Dechiffrierung der mRNA ist aber im wesentlichen gleich. Ribosomen erkennen den Anfang auf der mRNA und rastern damit die Nucleotidschrift zu Tripletts: Aufgrund der Codierung in Dreiereinheiten muss während der Translation der Leserahmen unbedingt eingehalten werden. Bei Verschiebung des Rasters um nur ein einziges Nucleotid entsteht ein völlig anderes, zumeist funktionsloses Protein. Außerdem knüpfen die Ribosomen die Peptidbindung zwischen den einzelnen Aminosäuren. Da die Ablesung der mRNA stets mit dem Startcodon AUG beginnt, fangen dementsprechend alle Proteine mit der Aminosäure Methionin an, die nach der Translation jedoch oft wieder vom Protein abgespalten wird. Ribosomem liegen nicht dauernd als funktionierende Zellorganellen vor, sondern in entsprechenden „Bausteinen“, der rRNA, den großen und kleinen Untereinheiten aus Proteinen. 2.3.1. Initiation Die Startreaktion erfolgt an der sog. kleinen ribosomalen Untereinheit und wird von drei Proteinen, den sog. Initiationsfaktoren, genau überprüft. 2.3.1.1.Ein Initiationsfaktor sorgt dafür, dass das Startcodon AUG (Initiationscodon) der mRNA exakt an der richtigen Position der ribosomalen Untereinheit, der Position P (Erklärung siehe unten) zu liegen kommt. 2.3.1.2. Der Initiations-Komplex (mRNA/kleine Untereinheit) assoziiert mit der großen Untereinheit zum intakten Ribosom. Die Met-tRNA bindet an das Startcodon. 2.3.2. Elongation An den Komplex aus mRNA und Ribosom bindet nun eine AA-tRNA ( Eine AAtRNA besteht aus einer tRNA, an die 1 AMS gebunden ist): Zwischen dem mRNACodon und dem dazu komplementären Anticodon der AA-tRNA entsteht ein drei Nucleotide langer Doppelstrang. Neben dieser spezifischen Codon-AnticodonBeziehung ist die AA-tRNA auch durch unspezifische Wechselwirkungen am Ribosom fixiert. Auf einem Ribosom existieren zwei Dechiffrier-Stellen, und es werden auch zwei tRNA-Moleküle auf die beschriebene Weise an den mRNA/Ribosomen-Komplex gebunden. Der erste Bindeplatz wird als Peptidyl-tRNA-Stelle (P-Stelle), der zweite als Aminoacyl-tRNA-Stelle (A-Stelle) bezeichnet. Die Aminosäuren der ersten beiden, in diese Bindeplätze fixierten AA-tRNAs befinden sich hier in enger Nachbarschaft und werden durch Katalyse des ribosomalen Enzyms Peptidyltransferase über eine Peptidbindung verknüpft. Dabei löst sich die Bindung zwischen der Aminosäure und der tRNA in Position P, während diese Bindung in Position A erhalten bleibt. Infolge der Peptidyltransferase-Reaktion ist aus der AAtRNA in Position P eine deacylierte (aminosäurefreie) tRNA geworden, während die AA-RNA in Position A jetzt zwei Aminosäuren trägt. 2.3.3. Translokation: Zur Verlängerung des Dipeptids um eine weitere Aminosäure muss das nächste mRNA-Codon in die A-Stelle rücken. Diese Weiterbewegung der mRNA am Ribosom um genau ein Codon bezeichnet man als Translokation. Dabei wird die deacylierte tRNA aus der P-Stelle freigesetzt, und das mRNA-Codon der A-Stelle gleitet mitsamt der über das Anticodon gebundenen Dipeptidyl-tRNA in Position P. In die nun freie Position A bindet wieder eine aminosäurebeladene tRNA, deren Anticodon dem jetzt hier befindlichen mRNA-Codon komplementär ist. In erneuter Peptidyl-transferase-Reaktion bildet sich ein Tripeptid. 10 Das Dipeptid wird von der Peptidyl-tRNA in Position P gelöst, und die Carboxylatgruppe der zweiten Aminosäure wird mit der Aminogruppe der Aminosäure in Position A verknüpft. Nach erneuter Translokation kann die nächste Aminosäure angefügt werden. Dieser als Elongation bezeichnete Vorgang wiederholt sich so oft, bis schließlich sämtliche Codons der mRNA in die entsprechenden Aminosäuren übersetzt sind, und das Terminationscodon der mRNA in die A-Stelle gelangt. Für Terminationscodons existieren keine tRNAMoleküle, sondern jetzt binden sog. Terminationsfaktoren an das Ribosom, die das fertiggestellte Protein von der tRNA ablösen Wird ein spez. Protein in hoher Anzahl benötigt, wird das entsprechende mRNAMolekül simultan an mehreren hintereinanderliegenden Ribosomen gebunden und in Proteinmoleküle übersetzt. Diese Anordnung nennt man Polysomen. Da die verschiedenen Proteine unterschiedliche Funktionen und damit auch unterschiedliche Wirkorte haben, gibt es eine besondere „Einrichtung“, die gewährleistet, dass das spezielle Protein auch zum entsprechenden Wirkort gelangt. Diese „Einrichtung“ ist eine besondere AMS-Sequent an einem Ende des Proteins, die man Signalsequenz nennt. Sie ist sozusagen die Postleitzahl des Proteins. Ist das Protein am Wirkort angekommen, so wird diese Signalsequenz abgebaut und das Protein wird funktionstüchtig. Die Polypeptidketten werden nun noch räumlich gefaltet und teilweise modifiziert. Die Modifizierung kann unterschiedlich verlaufen: Anhängen von Kohlenhydrat-Seitenketten (Glycoproteine: Faktor VIII) Anhängen von Metallionen Anhängen von prosthetischen Gruppen (Enzyme) usw. 11 Schema eines x-beliebigen DNA-Abschnittes Intergenische Region Nachspann Vorspann GEN 3´ 5´ AUG UAG Exon Intron Intergenische Region: Enthält Pseudogene und repititive Sequenzen Schema eines Gens auf der DNA: Terminations-/ Stopcodon Promotor incl. Schallerbox Exon Startcodon Signalsequenz Intron Schema der entsprechenden hnRNA: Poly-A-Zone Schema der entsprechenden mRNA: Cap Schema des Praeproteins Schema des fertigen Proteins: 12 VIREN: Sind molekulare Komplexe, die sich in geeigneten Wirtszellen vermehren können. Sie bestehen aus DNA oder RNA, die einzel- oder doppelsträngig, linear oder ringförmig sein kann. Die Nukleinsäure ist von einer Schutzhülle aus Proteinen, dem Capsid, und in manchen Fällen zusätzlich von einer Membran umschlossen. Viren mit einfacher Hülle dringen samt Hülle in die Wirtszelle ein, die mit doppelter Hülle injizieren nur ihren Inhalt. Viren kommen in 2 Zuständen vor. Außerhalb der Zelle, in der sie entstanden sind, handelt es sich um unbelebte Partikel, Virionen genannt, mit rglm. Größe, Form und Zusammensetzung, die man kristallisieren kann. Hat sich ein Virus oder ein Nukleinsäurebestandteil jedoch Zutritt zu einer spezifischen Wirtszelle verschafft, wird es zum Zellparasiten. Viruspartikel, die sofort nach der Infektion aktiv werden nennt man virulente Viren. Seine Nukleinsäure benutzt Enzyme und Ribosomen der Wirtszelle so, dass sie nicht mehr ihre normalen Aufgaben erfüllen kann, sondern viel neue VirusTochterpartikel herstellt. In manchen Virus-Wirt-Systemen gelangen die Viruspartikel durch die Tellmembran nach außen. Andere Viren sorgen bei ihrer Freisetzung für die Lyse, das heißt für die Auflösung der Membran und den Tod der Zelle. Bei manchen Virusinfektionen spielt es sich anders ab: Temperente Viren werden nach der Infektion nicht sofort aktiv. Die Virus-DNA wird in das Wirtsgenom eingebaut und mit ihren Gene repliziert, man nennt sie dann Proviren. Solche Virusgene wirken sich vielfach nicht oder nur geringfügig auf die Lebensfähigkeit der Zelle aus, sorgen aber oft für eine tiefgreifende Veränderung des Aussehens und Aktivität der Zelle. Durch äußere Einflüsse kann der normale Zyklus wieder aktiviert werden. Abb.10 Infektion einer Bakterien- und einer Tierzelle durch ein Virus Viren, die sich auf Bakterien spezialisiert haben, nennt man Phagen Bei der Verpackung der Phagen-DNA in die Phagenhülle kann es manchmal auch zum Verpacken von Wirts-DNA kommen Diese Beobachtung führte zur Entwicklung von Phagen als Vektoren. Vektoren: Sind DNA-Moleküle, die den Einbau beliebiger Gene oder Regulator-Sequenzen erlauben. Sie müssen bestimmte Eigenschaften haben: Befähigung zur autonomen Replikation Möglichkeit der Isolierung ohne chromosomale DNA Verleihung eines Phänotyps nach Einbringen in vermehrungsfähige Zellen Einige menschen-pathogene Viren sind Erreger von: Kinderlähmung, Herpes, Hepatitis, AIDS, gewöhnlichen Erkältungen, Schnupfen, Gürtelrose, Masern, Röteln, verschiedene Krebsformen. Bei Viren ist es möglich, dass ein bestimmter Abschnitt auf der DNA durch Verwendung zweier Leseraster für zwei verschiedene Proteine codiert, die Gene überlappen sich. Virengene sind nicht in Introns und Exons gegliedert. Beispiel: Met His Phe Thr Asn Arg Tyr Ser 5´ AUG CAC UUU ACU AAC CGC UAU UCC 3 Cys Thr Leu Leu Thr Ala Ile 5´ UGC ACU UUA CUA ACC GCU AUU 13 Leseraster 1 Leseraster 2 BAKTERIENGENETIK: Bakterien besitzen ein doppelsträngiges Ringchromosom. Daneben enthalten viele Bakterienstämme zusätzlich ein oder mehrere ringförmige DNA-Moleküle, die sich frei im Zellplasma befinden. Man nennt sie Plasmide. Sie tragen genetische Information (z.B.: Resistenzgene und Fertilisationsfaktoren)und werden repliziert. Plasmide werden an Tochterzellen weitergegeben. Plasmide mit Fertilitätsfaktoren können eine Bindung mit Zellen ohne diesen Faktor eingehen und mit dieser Zelle Plasmide austauschen. Plasmide werden manchmal sogar zwischen Vertretern verschiedener Arten ausgetauscht. Harmlose Darmbakterien haben zwischendurch Plasmide mit Antibiotika-Resistenzgenen, die sie auf krankheitserregende Bakterien übertragen. Die Krankheitserreger vererben dann ihre erworbene Resistenz Plasmide spielen heute in der Gentechnik eine wichtige Rolle als Vektoren. Man kann verschieden Gene in Plasmide einfügen, es entsteht die rekombinante DNA. Das veränderte Plasmid wird in eine normale Wirtszelle eingeschleust. Weitergabe der genetischen Information erfolgt durch: Transformation (Spender-DNA wird aufgenommen) Transduktion (Bakterien-DNA wird durch einen Phagen von einem Bakterium auf ein anderes übertragen) Konjugation (Plasmide werden von einem Spenderbakterium auf ein Empfängerbakterium übertragen) 14 GENSTEUERUNG: 1. Bei Prokaryonten Ebenso wie der Bedarf der Zelle an verschiedenen Proteinen variieren auch die Mechanismen, über die die entsprechenden Gene reguliert werden. Das Ausmaß und die Art der Regulation spiegeln die Funktion des Proteinprodukts eines Gens wider. Einige Genprodukte werden ständig benötigt, und ihre Gene werden daher in praktisch allen Zellen eines Organismus auf einem mehr oder weniger gleichbleibenden Niveau exprimiert. In diese Kategorie fallen viele Gene für Enzyme, die Schritte in zentralen Stoffwechselwegen wie dem CitronensäureCyclus katalysieren. Diese Gene werden häufig als Haushalts-Gene (englisch housekeeping genes) bezeichnet. Die konstante, scheinbar unregulierte Expression eines Gens wird konstitutive Genexpression genannt. Die Menge der anderen Genprodukte steigt und fällt als Reaktion auf molekulare Signale. Genprodukte, deren Konzentration unter ganz bestimmten molekularen Bedingungen steigt, werden als induzierbar bezeichnet, und der Vorgang, durch den die Expression des Gens erhöht wird, heißt Induktion. So wird etwa die Expression vieler Gene, die DNA-Reparaturenzyme codieren, als Reaktion auf hochgradige DNA-Schäden induziert. Umgekehrt werden Genprodukte, deren Konzentration als Reaktion auf ein molekulares Signal sinkt, als repressibel bezeichnet, und eine Verringerung der Genexpression heißt Repression. Bei Bakterien führt zum Beispiel die Anwesenheit ausreichender Mengen der Aminosäure Tryptophan zur Repression der Gene für die Enzyme, welche die Tryptophanbiosynthese katalysieren. Die Transcription wird von Protein-DNA-Wechselwirkungen vermittelt und reguliert. Die zentrale Komponente ist hier die RNA-Polymerase Die Aktivität der RNA-Polymerase wird reguliert RNA-Polymerasen binden an spezifischen, Promotoren genannten Stellen an die DNA und leiten dort die Transcription ein. Promotoren befinden sich im allgemeinen ganz in der Nähe der Stelle, wo die RNA-Synthese an der DNAMatrize beginnt. Die Regulation der Transcriptionsinitiation ist eigentlich eine Regulation der Wechselwirkung zwischen der RNA-Polymerase und ihrem Promotor. Die Nucleotidsequenz der Promotoren schwankt beträchtlich. Sie beeinflusst die Bindungsaffinität der RNA-Polymerasen und damit die Häufigkeit der Transcriptionsinitiation. Bei E. coli werden einige Gene einmal pro Sekunde, andere weniger als einmal in jeder Zellgeneration transcribiert. Dieser Unterschied beruht hauptsächlich auf verschiedenen Promotorsequenzen. In Abwesenheit regulatorischer Proteine können Unterschiede in der Sequenz zweier Promotoren die Häufigkeit der Transcriptionsinitiation um einen Faktor von 1000 oder mehr beeinflussen. Wie wir bereits gesehen haben, haben die Promotoren von E. coli eine Consensussequenz. Promotoren, deren Sequenz genau dem Consensus entspricht, weisen im allgemeinen die größte Affinität zur RNA-Polymerase und somit die größte Initiationshäufigkeit bei der Transcription auf. Mutationen, die ein Consensusbasenpaar in ein Nichtconsensuspaar umwandeln, vermindern im allgemeinen die Funktionsfähigkeit des Promotors, während die Mutation eines Nichtconsensuspaares zu einem Consensuspaar diese gewöhnlich verbessert. Die Initiation der Transcription wird durch Proteine reguliert, die an Promotoren oder in deren Nähe binden. 15 Mindestens drei Typen von Proteinen regulieren die Initiation der Transcription durch die RNA-Polymerase: 1) Spezifitätsfaktoren verändern die Spezifität der RNA-Polymerase für einen bestimmten Promotor oder für eine Reihe von Promotoren; 2) Repressoren binden an einen Promotor und blockieren so den Zugang für die RNA-Polymerase; 3) Aktivatoren binden in der Nähe eines Promotors und verstärken die Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und Promotor Die Steuerung der Genexpressivität läuft bei versch. Prokaryonten sehr unterschiedlich ab. Viele Bereiche laufen auch bei Eukaryonten in ähnlicher Weise ab. Bakterien-DNA kann folgend aufgebaut sein: Regulatorgene: Sie codieren für Proteine, die die Expression steuern. Diese Proteine sind Aktivatoren oder Repressoren. Je nach Gentyp kann der Repressor in 2 verschiedenen Formen hergestellt werden in inaktiver Form, dann muss er erst durch einen Ko-Repressor in die aktive Form umgewandelt werden, um den Operator blockieren zu können. SUBSTRAT-INDUKTION. Das Substrat ( Milchzucker) löst die Genaktivität und damit die Produktion der Enzyme (lactoseabbauend) aus; die Lactose ist der Induktor. Die Gensteuerung durch Induktion erfolgt hpts. im abbauenden Stoffwechsel. in aktiver Form, dann kann er den Operator sofort blockieren und wird erst durch einen Induktor in die inaktive Form umgewandelt und in dieser Form vom Operator gelöst. ENDPRODUKT-REPRESSION. Bakterien können Histidin (AMS) über eine Enzymkette herstellen. Fügt man von außen Histidin zu, so wird die Produktion jener Enzyme, die Histidin synthetisieren, eingestellt. Das Endprodukt ( Histidin) hemmt seine eigene Produktion, in dem es als KoRepressor den inaktiven Repressor aktiviert. Diese Gensteuerung findet im aufbauenden Stoffwechsel statt. Strukturgene: Sie codieren für Proteine, die für den Stoffwechsel oder Zellbau notwendig sind ( Enzyme, Hormone, Muskeleiweiß usw.). Promotor: Ist die Bindestelle für RNA-Polymerase; hier startet die Transkription. Operator: Ist die Bindestelle für regulierende Proteine (Repressor) Bindestelle für Aktivator: Wenn vorhanden, dann liegt sie vor dem Promotor Abb.11 Substrat-Induktion Abb.12 Endproduktrepression Bei Eukaryonten: Eukaryonten verwenden ähnliche Reaktionsschemata, wobei die positive Steuerung überwiegt (bei der großen Anzahl von Genen wären zu viele unterschiedliche Repressormoleküle nötig!).Für die Tätigkeit der RNA-Polymerase 16 sind im allgemeinen Transcriptions-Aktivatorproteine notwendig, tlw. Hormone, tlw. hellrotes Licht. 17
