Zellkern (Nucleus)
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Zellkern (Nucleus)(Interphasekern) • Chromatin • Kernhülle mit Kernporen • Kernlamina • Nucleolus Hauptaufgaben des Zellkerns • Informationsspeicherung • Transkription • Processing Zellkern An der Doppelmembran der Kernhülle liegt innen die Kernlamina (aus Intermediärfilamenten bestehend) an die Kernhülle wird durch Kernporen durchbrochen Metaphasechromosom besteht aus: • zwei Schwesterchromatiden (haben die identische genetische Information) • aus kurzen (p) und langen (q) Armen • aus der Zentromer-Region und den Telomer-Regionen Chromatin • Euchromatin • Heterochromatin – konstitutives – fakultatives Chromosomenstruktur durch Spiralisierung und Faltung des DNA-Doppelstranges kommt es in Metaphasechromosomen zu einer mehr als 10.000-fachen Verkürzung der Länge des DNAStranges Chromatinaufbau • DNA • Histone (basische Proteine) H1, H2A, H2B, H3 und H4 • Nicht-Histon-Proteine (unter anderem saure Proteine, Polymerasen usw.) • RNA Nucleosomen werden aufgebaut aus Histonoktamer (aus 8 Histonuntereinheiten, je 2 x die Histone H2a, H2b, H3 und H4) und DNA Histon H1- DNA Kontakt die Bindung von Histon H1 an die DNA ist für Gen-Regulation bzw. Gen-Abschaltung wesentlich und wird durch Methylierung und Acetylierung von Histon H1 beeinflusst Chromatinorganisation • die Dichte der Packung (Kondensation) des Chromatins hängt unter anderem von der DNASequenz (repetitive oder single copy), der Genaktivität, DNAMethylierung, DNA-bindenden Proteinen und weiteren Faktoren ab. • Für die Transkription muß das Chromatin im entsprechenden Bereich aufgelockert sein Euchromatin Heterochromatin • Besteht aus Genreicherem, früh replizierenden Chromatin • DNA enthält mehr G-C • ist G-Band negativ • mit Kernfarbstoff schwach angefärbt • Aus Gen-ärmerem, oder Gen-freiem spät replizierendem Chromatin • DNA enthält mehr A-T • ist G-Band positiv • mit Kernfarbstoff stark angefärbt Humanes Genom • Fast alle Gene des Menschen enthalten Introns (nicht codierende Abschnitte) • zwischen den Exons (codierende Abschnitte) • die Größe der Gene und die Zahl der Introns - Exons ist sehr unterschiedlich • besteht zu etwa 70% aus sogenannten single copy („einzigartigen“) DNA-Sequenzen (unter anderem Exons , Introns und regulatorische Abschnitte von (single copy) Genen) • etwa 30% repetitiven (sich wiederholenden) DNA-Sequenzen (=Satelliten-DNA) zB. SINES wie Alu-repeats ((etwa 500.000 x etwa 300bps - ungefähr 5% des Genoms!)), LINES, VNTRs (variable number of tandem repeats) wie Di-,Tri-, Tetra- usw. Nucleotidrepeats Ribosomale RNA-Arten • Die Gene (etwa 300) für die 45s rRNA liegen an den kurzen Armen der akrocentrischen Chromosomen (13,14,15,21,22) (NOR-Region) • werden in die 28s, 18s und 5.8s rRNA gespalten und für den Aufbau der großen (28s und 5.8s) und der kleinen Ribosomenuntereinheit verwendet • auch die 5s rRNA (von Gen-Cluster am Chromosom 1) beteiligt sich am Aufbau der großen Ribosomenuntereinheit Genetische Grundmechanismen • Replikation • Reparatur • Transkription • Translation Humanes Genom • 46 Chromosomen (22 Autosomenpaare, 1 Gonosomenpaar) und mt-DNA • ca 6 x 109 bp / diploidem Genom entspricht etwa 35.000 – 100.000 Genen • DNA = Informationsspeicher (daher höchste Anforderungen an DNA-Replikation und DNARepair) DNA-Aufbau • aus den Basen gebunden über glycosidische Bindung an Desoxyribose und über Phosphodiesterbindung an Phosphat (bildet DNA-Einzelstrang) • Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen verbinden zwei Einzelstränge zu DNA-Doppelhelix DNA-Basen • Purinbasen: –Adenin, Guanin • Pyrimidinbasen: –Cytosin, Thymin pro Basenpaarungen Adenin – Thymin (A – T) • bei Oligonucleotiden „Schmelztemperatur“ etwa 2º Celsius Cytosin – Guanin (C – G) • bei Oligonucleotiden „Schmelztemperatur“ etwa 4º Celsius • daher sind C-G Bindung mit drei statt A-T mit zwei Wasserstoffbrücken etwas stabiler • dies ist bei C-G reichen DNA-Abschnitten relevant DNA-Synthese • Beginnt an spezifischen Startpunkten („origin“) • Synthese in 5‘ -> 3‘ Richtung • Verläuft semikonservativ • Am Leitstrang kontinuierlich, am Folgestrang abschnittsweise („Okazaki- Fragmente“) Primase • Bildet kurze (etwa 10 Basen lange) RNA Primer an einzelsträngiger DNA • dadurch Startpunkt für DNA Polymerase mit entsprechendem 3‘ Ende vorhanden • am Leitstrang von dort durchgehende Synthese • am Folgestrang Bildung von Okazaki-Fragmenten Proteine bei DNA-Synthese • Helicasen • Primase • Einzelstrang- Bindungsproteine (SSBP) • DNA-Polymerase • Ligase • Topoisomerasen DNA-Replikation, Telomerregion • das Enzym Telomerase (zB. exprimiert in Spermatogonien) verlängert die Telomer-Repeats und damit die Telomere der Chromosomen • dies ist für die vollständige Replikation beider DNA-Stränge bei der DNA-Synthese wichtig • ansonsten käme (bzw. kommt) es bei jeder DNA-Replikation zur Verkürzung der Enden der Chromosomen und dann nach Verlust der Telomer-Repeats zum Genverlust • ua. hängt die Zellalterung damit zusammen Korrektur bei Replikation • ein Replikationsfehler etwa auf 107 Basenpaare • niedrige Fehlerquote durch Korrekturlesefunktion der DNA-Polymerase bedingt • dabei Überprüfung ob die zuletzt eingebaute Base korrekt gepaart wurde, sonst durch zusätzlich vorhandene 3‘ → 5‘ Nucleaseaktivität Abbau und richtiger Neueinbau durch die 5‘ → 3‘ Polymeraseaktivität • Mismatch-Korrektur reduziert auf etwa einen Fehler auf 109 Basenpaare DNA-Reparatur zur Korrektur • von fehlerhaftem Einbau bei DNA-Synthese • oder einer Veränderung entstanden ua. durch - Depurinierung - chemische Veränderungen von Basen - Pyrimidindimere • wenn Korrektur nicht erfolgt - Mutation Gen • Gene weisen regulatorische sowie codierende DNA-Sequenzen auf • vor den codierenden Sequenzen liegt die Promotorsequenz (der Startpunkt der Transkription) • die codierende Sequenz menschlicher Gene bestehen zumeist aus Exons und Introns Transkription • Findet durch „Abschreiben“ der DNA-Sequenz unter Herstellung einer komplementären RNA (hnRNA) als primäres Genprodukt statt • Normalerweise werden nur Gene transkripiert, wobei diese unter der Kontrolle regulatorischer DNA-Sequenzen stehen und letztere über Proteine wie Transkriptionsfaktoren und reprimierende Faktoren gesteuert also reguliert werden Transkription • Bei Eukaryonten müssen zuerst Initiationsproteine an den Promotor binden bevor die RNAPolymerase binden kann • alle drei RNA-Polymerasen sind aus mehreren Untereinheiten aufgebaut RNA-Polymerase I RNA-Polymerase II RNA-Polymerase III • etwa 30 Ribonucleotide werden pro Sekunde in das RNA-Transkript eingebaut • es können mehrere RNA-Polymerasen gleichzeitig ein Gen transkribieren, weil die gebildete RNA gleich von der DNA getrennt wird • das RNA-Transkript ist einzelsträngig, bildet aber häufig durch kurze doppelsträngige Abschnitten aufgrund von Basenpaarung dreidimensionale Strukturen aus RNA-Arten • mRNA: codiert für Protein • hn-RNA (primär bei höheren Eukaryonten) • rRNA: Teil des Ribosoms • tRNA: Adaptor bei Translation • snRNA: für Spleißen Transkription RNA-Polymerase I für große (45 S) ribosomale RNAs RNA-Polymerase II für Protein-codierende Gene und snRNAs RNA-Polymerase III für kleine 5 SrRNAs und tRNAs Transkription bei Prokaryten • erfolgt zwischen Promotor und Terminator • Aktivatorprotein (bindet vor Promotor) kann die Transkription fördern • Repressor bindet an Operator (innerhalb des Promotors) und kann damit Transkription verhindern; durch Wechselwirkung des Repressorproteins mit Genprodukt Rückkoppelung zur Aktivierung des Repressors möglich Regulation der Genaktivität bei Eukaryonten kann bei Transkription, Processing, Translation, Proteinaktivität erfolgen Introns • (erst 1977 entdeckt) • in bakteriellen Genen nicht vorhanden • auch in einfachen Eukaryontengenomen kaum zu finden • in den meisten Genen höherer (mehrzelliger) Eukaryonten vorhanden • sind beteiligt an der Regulation der Genexpression • Splice Mutationen an der Intron-Exon Grenze der Introns können den normalen SpleißVorgang beeinträchtigen und auch Erbkrankheiten bedingen Bildung der mRNA aus der hnRNA werden die den Introns entsprechenden Abschnitte herausgespleißt und ein Poly-A-tail wird am 3‘-Ende und ein Cap am 5‘-Ende angefügt Cap-Struktur und Poly-A-Tail • „Cap“ besteht aus 7-Methylguanosin, • wird nach Synthese (über Triphosphatbrücke) an 5‘ Ende der neuen mRNA angehängt • dient der Bindung der mRNA an Ribosom • nach Termination der RNA-Synthese wird am 3‘ Ende nach Abspaltung von terminalen Sequenzen eine Kette von etwa 100-200 AMPs (poly A-tail) ans 3‘-Ende angehängt → (erhöht die Stabilität der mRNA) Genregulation bei Eukaryonten • Transkriptionsfaktoren • Promotoren • Enhancer • Silencer • in gewebsspez. exprim. Genen: TATA-Box • GC-Box • CAT-Box • CpG Islands (ev. methyliert) mRNA-Spleißen <<Introns beginnen mit GT (GU in der RNA) und enden mit AG, wobei knapp davor (etwa 30 bps) eine „branch site“ (Verzweigungsstelle liegt)>> es erfolgt unter Hilfe von snRNPs die Spaltung an Donor site (GU) vermittelt durch aktiviertes „A“ in branch-site mit „Lasso“-Bildung und dann Schnitt an (3‘AG-Acceptor) Splice site mit Verbindung der beiden flankierenden Exons (Begriffe in Klammer „(und < “ auf dieser Folie nicht lernen) SnRNPs • Small nuclear ribonucleoprotein particles → „snurps“ • aus snRNA und Proteinen aufgebaut • am Spleißing beteiligt Splicing • Spleißen hat für die Evolution eine beträchtliche Bedeutung, weil bei Mutationen, aber vor allem durch genetische Rekombination von Intron- Exon-Sequenzen die Neukombination von Protein-Untereinheiten relativ leicht möglich wird • Dadurch Entstehen von Proteinen, welche aus ähnlichen Untereinheiten aufgebaut sind, mit neuen Eigenschaften • Auch Möglichkeit des alternativen Spleißen in verschiedenen Geweben Moleküle für Translation • mRNA • Ribosomen • aktivierte tRNA Translation • „Übersetzen“ der mRNA Information (Sequenz) in eine Aminosäurekette mit entsprechender Sequenz) • 3 Basen (=Codon) der mRNA codieren für eine bestimmte Aminosäure findet an Ribosomen statt tRNA = Transfer-RNA (aus etwa 80 Nucleotiden aufgebaut) (beim Menschen 31 tRNAs und 61 Codons daher Wobble (Mismatch) bei Codonbindung bei mehreren tRNAs möglich) • weist 4 kurze doppelsträngige Abschnitte auf und bildet daher Kleeblattform das Anticodon an der Anticodonschleife am 3‘-Ende Bindung spezifischer Aminosäure durch AminoacyltRNA-Synthetase
