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alkalische Phosphatase, setzt den Substrat-Mix NBT/BCIP (NitroblauTetrazoliumchlorid/5-Brom-4-Chlor-3-Indoxylphosphat) um. NBT, eine quartäre Ammoniumverbindung, ist ein Di-Tetrazoliumsalz und Redoxfarbstoff. Bei Substratumsetzung durch die AP entsteht über die Zwischenstufe eines roten Monoformazanfarbstoffes ein blauer Di-Formazanfarbstoff. BCIP ist ein artifizielles, chromogenes Substrat der AP. Bei der Substratumsetzung hydrolysiert AP Indoxylphosphat zu Indoxyl und Phosphat. Das Indoxyl wird nun vom O2 der Luft über Indigoweiß zu Indigoblau oxidiert. Die Embryonen werden drei Mal in NTMT jeweils 10 Minuten bei RT unter schütteln gewaschen. Darauf folgt die Inkubation des schon gebrauchsfertigen NBT/BCIP-Mix, die Tubes mit den Embryonen werden im Dunkeln etwa 20 Minuten geschüttelt, der Reaktionsprozeß dann über eine Stunde beobachtet (abgedeckt auf dem Schüttler). Wenn das Farbergebnis ausreichend ist (dauert auch schon Mal etwas länger als eine Stunde), können die Embryonen zwei Mal in NTMT jeweils 10 Minuten im Dunkeln unter Schütteln gewaschen werden, bevor sie einen erneuten Waschgang mit PBT pH 5,5 10 Minuten lang bei RT durchgehen. Entgegen der Anleitung im Skript werden die Embryonen nicht extra mit PFA nachfixiert, sondern werden in einer Pufferlösung (PBS) direkt fotografiert. NTMT 2 ml 5M NaCl 5 ml 2M Tris/HCl pH 9,5 5 ml 1M MgCl 1 ml Tween 20 0,048 g Levamisol 88 ml H2O NTB BCIP 0,075 NBT/1 ml 70% Dimethylformamid 0,050 g BCIP/1 ml Dimethylformamid Reaktions-Mix 6,75 µl NBT 5,25 µl BCIP 2 ml NTMT 1.1.1 (100mM) (100mM) (50mM) (1%) (2mM) Ergebnisse I. Sondengenerierung Die Auftrennung der Sondenproben der Gruppe 2 befindet sich in den beiden äußerst links gelegenen Taschen (siehe Abb. 1.5, mit Pfeilen markiert). Leider scheint zum einen ganz links kein Marker aufgetragen worden zu sein (dafür wohl in der 9. Tasche), außerdem ist die linke Sondenauftrennung nur sehr schwach zu erkennen. In der rechten Tasche kann man aber gut die Auftrennung zwischen der kürzeren Sonden-RNA (obere Bande) und der längeren, bzw. schwereren template cDNA erkennen. 1 Abb.:2.1 Gelelektrophoretische Prüfung der Sondengenerierung Sondenproben der Gr. 2 sind in den ersten beiden linken Taschen II. WISH unbekannte Probe Die Visualisierung des unbekannten Gens erfolgt durch Hybridisierung mit der komplementären und markierten unbekannten Sonde. Ein Expressionsmuster kann als farbiges Ergebnis im Mausembryo des Entwicklungsstadiums E13,5 am besten beobachtet werden. Dort findet man ein Farbereignis in den Hirnbläschen, eine farbige Linie auf der Rückseite des Embryos, in den Extremitäten, dem Schwanz, in der Schnauze und ganz leicht im Auge (siehe Abb. 1.6-1.9). Abb. 2.2 Mausembryo E13,5 Expression Abb. 2.3 Mausembryo E13,5 Ausschnitt unbekannte Sonde Expressionsmuster unbekannte Sonde Abb. 2.4 Mausembryo E13,5 Expression Abb. 2.5 Mausembryo E13,5 Ausschnitt unbekannte Sonde Expressionsmuster unbekannte Sonde III. WISH für das Gen twist Bei dieser Hybridisierungsreaktion ist der Name des zu detektierenden Gens bekannt. In diesem Fall Twist. Die unbekannte Parabel ist nun das Expressionsmuster von Twist, dies gilt es mit der Hybridisierung einer markierten komplementären Sonde rauszufinden. 2 Das Expressionsmuster von Twist zeigt sich in den Extremitäten, der Schnauze, dem Schwanz, den Somiten und im Bereich des späteren Ohres (siehe Abb. 1.10-1.13). Abb. 2.6 Mausembryo E12,5 Expression von Abb. 2.7 Mausembryo E12,5 Ausschnitt Twist Expressionsmuster Twist Abb. 2.8 Mausembryo E13,5 Expression von Abb. 2.9 Mausembryo E13,5 Ausschnitt Twist Expressionsmuster Twist, vordere linke Extremität 1.1.2 Diskussion Die Expression der unbekannten Sonde zeigt sich in den Hirnbläschen, eine farbige Linie auf der Rückseite des Embryos, vermutlich das Neuralrohr, in den Extremitäten, dem Schwanz, in der Schnauze und ganz leicht im Auge. Bei der Anfärbung der Hirnbläschen und vorderen Extremität handelt es sich um eine unspezifische Anfärbung, das kann mit der Zeit passieren. Das restliche Expressionsmuster (zumindest im Neuralrohr, Gehirn, Schwanz, Somiten, posteriorer Teil der Gliedmaßenknospe) passt zum Expressionsmuster des Gens patched (Ptch). Das Expressionsmuster von Twist soll sich in den anterioren Gliedmaßen zeigen und den Somiten. Dies deckt sich mit dem Farbergebnis, das wir erhalten (siehe Abb. 1.13). Das Twist Protein fungiert als Regulator der mesodermalen Differenzierung und der Myogenese. Erwartet wird die stärkste Expression in den Vorläufern somatischer Muskulatur. 1.2 Versuch III: Histologische Analyse Um histologische Schnittpräparate herzu stellen gibt es verschiedene Möglichkeiten. Eine Möglichkeit ist der Parafinschnitt, bei dem das zu untersuchende Gewebe in vier Schritten präpariert wird. 3 Die Fixierung durch PFA (Paraformaldehyd) macht das Gewebe haltbar und verhindert autolytische Vorgänge, die das Gewebe zersetzen würden. Da Paraffin ein Wachs ist und nicht wasserlöslich ist muss das Wasser im Gewebe nach und nach durch eine aufsteigende Alkoholreihe mit Ethanol ersetzt wird. Ethanol wird anschließen durch ein Intermedium wie z.B. Xylol ersetzt. Erst jetzt ist die Einbettung des Gewebes in Paraffin (C22 Wachs) möglich. Durch das Aushärten des Paraffins ist ein Parafinblock mit harter Konsistenz entstanden. Mit Hilfe eines Rotations-Mikrotoms ist es nun möglich aus dem Paraffinblock bis zu 5µm dicke Gewebeschnitten zu fertigen, die anschließend auf einem Objektträger aufgetragen werden. Um die histologischen Strukturen des Gewebes unter dem Lichtmikroskop besser sehen zu können wird eine Hämatoxylinfärbung nach Bayer vorgenommen. Um eine Färbung zu ermöglichen, muss das Gewebe mit Xylol und einer absteigenden Alkoholreihe mit Ethanol zuvor entparaffiniert werden, da der Farbstoff nicht fettlöslich ist. Die Hämatoxilinlösung enthält den alkalischen Farbstoff Hämalaun und den sauren Farbstoff Eosin. Hämalaun bindet an saure Strukturen des Gewebes - die DNA, sodass der Zellkern blau gefärbt wird. Eosin färbt basische zytoplasmatische Bestandteile der Zelle rötlich. Das Ergebnis sind gefärbte histologische Präparate, die über Jahre haltbar sind. 1.2.1 Materialien und Methoden H2O Xylol Ethanol PFA Paraffinwachs (C22) Hamatoxylinlösung I. Schneiden Für das Praktikum bekamen wir Mausembryonen E 14.5 sowie die Vorderläufe der Mausembryonen E 16.5, die bereits im Parafinblock eingebettet waren. Mit einer scharfen Klinge wird überstehendes Parafin vom Block entfernt. Der Block wird anschließend in das Rotations-Mikrotom eingespannt, das anschließend auf die gewünschte Dicke eingestellt wird. Mit dem Rotationshebel wird durch eine Umdrehung eine Scheibe des Blocks abgeschnitten. Die Gewebeschnitte werden mit einem Pinsel vorsichtig in ein erwärmtes Wasserbad gelegt. Von dort können die Schnitte vorsichtig auf einen Objektträger aufgetragen werden. Um die Schnitte zu trocknen, werden sie bei ca. 90° C auf eine Heizplatte gelegt. II. Entparaffinieren Nach dem Trocknen werden die Schritte wie folgt entparaffiniert. Die Schnitte werden für 10 min in Xylol gelegt, dann für je 5 min in ein 100% Ethanol-, 95% Ethanol -und 70% Ethanolbad gelegt. Anschließend wird der Alkohol 3 mal 5 min mit Leitungswasser abgespült. III. Hämatoxylinfärbung 4 Nachdem die Schnitte 5 min mit Hämatoxylin gefärbt werden, wird das überschüssige Hämatoxylin 10 min mit Leitungswasser abgespült. Nun werden die Schnitte mit 1%igem Eosin für 3-5 min gefärbt und anschließen wieder mit Leitungswasser abgespült. Um die Färbung haltbar zu machen werden die histologischen Schnitte für 5 min in 70% Ethanol, 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol gebadet. Bevor die Präparate vollständig getrocknet sind werden sie mit DPX eingedeckt. Die Präparate können nun unter dem Lichtmikroskop betrachtet und fotografiert werden. 1.2.2 Ergebnisse Die Parafinschnitte der Limbs sind gleichmäßig geschnitten und gefärbt. Sie weisen kaum Artefakte oder Luftblasen auf. Die verschiedenen Gewebestrukturen sind sichtbar und die verschiedenen Knorpel -und Knochenanlagen sehr gut erkennbar. Abb. 2.10 Mausembryo E 14,5 Gesamtübersicht Abb. 2.11 Mausembryo E 14,5 Ausschnittsvergrößerung 5 Abb. 2.12 Maus limb E 16,5 Übersicht Abb. 2.13 Maus limb E 16,5 Vergrößerung der Finger und Handwurzelknochen Abb. 2.14 Maus limb E 16,5 Diaphyse, Abb. 2.15 Maus limb E 16,5 oben Ulna, unten Vergrößerung des Knochenschaftes Radius Abb. 2.17 Maus limb E 16,5 Humerus mit Abb. 2.16 Maus limb E 16,5 Fortschreiten der Ellbogengelenk. Vergrößerung der Diaphysenverknöcherung 1.2.3 Knorpelanlage Diskussion Die Hämatoxylinfärbung hat bei unseren Präparaten sehr gut funktioniert. Lediglich die Haut wurde an einigen Stellen beim Schneiden durch das Rotations - Mikrotom vom Arm abgelöst. 6 2 Huhn 2.1 Huhn als Modellorganismus – Allgemeine Einleitung Vogelembryonen, so wie die der Gattung Huhn (bzw. Haushuhn, Gallus gallus domesticus) ähneln in ihrer morphologischen Komplexität und dem generellen Verlauf der embryonalen Entwicklung sehr den Säugetierembryonen. Allerdings sind sie einfacher zu erhalten und zu beobachten. Viele Manipulationen und Beobachtungen können schon allein durch die Öffnung des Eies ausgetragen werden, der Embryo kann aber auch außerhalb des Eies erfolgreich kultiviert werden. Dies ist nun sehr nützlich für die Durchführung mancher mikrochirurgischer Eingriffe oder um herauszufinden, wie der Embryo auf verschiedene Bestandteile von Kultivierungsmedien und anderer Chemikalien reagiert. Trotz der erheblichen Unterschiede in den sehr frühen Stadien der Entwicklung von Maus und Huhn, ähneln sich Gastrulation und auch spätere Stadien, so dass die Verwendung des Huhns als Modellorganismus eine sinnvolle Ergänzung zu den Objektstudien am Modell Maus darstellt. Die Entwicklung des Hühnerembryos vom befruchteten Ei im Eileiter der Mutterhenne bis zum geschlüpften Kücken dauert ungefähr 21 Tage. Nach der Befruchtung im Eileiter vollziehen sich auch dort die ersten Teilungen bis zur Ausbildung der Keimscheibe. Während der 20stündigen Eileiterpassage wird das Ei von Albumin, den Schalenhäuten und der Eischale umringt. Nach der Eiablage beginnt an der posterioren Marginalzone, einem verdickten Bereich des Epiblasten (daraus entwickelt sich dann der Embryo) die Gastrulation, gekennzeichnet durch die Entwicklung des Primitivstreifens (ein Vorbote der Hauptkörperachse). Beim Hühnerembryo entwickelt sich der Streifen ab dem Kollerschen Halbmond und formt eine Furche in der dorsalen Epiblastenoberfläche. Die nach innen gerichtete Bewegung von Zellen in der sich weiter nach vorne ausdehnenden Primitivrinne nennt man Ingression. Nach innen wandernde Zellen bilden später das Mesenchym und das Endoderm, während die Zellen an der Oberfläche des Epiblasten das Ektoderm ausbilden. Die Formierung der Primitivrinne ist nach 16 Stunden beendet, am anterioren Ende bildet sich der Hensensche Knoten, ein wichtiges Organisationszentrum für die Embryonalentwicklung. Wenn die Ingression der Zellen beendet ist, bildet sich der Primitivstreifen zurück, der Hensensche Knoten bewegt sich in Richtung posteriores Ende des Embryos. Wenn sich der Knoten zurückgebildet hat, bildet sich anterior davon das Notochord aus, zu diesem frühen Zeitpunkt auch „Kopffortsatz“ genannt. Das Mesenchym beidseitig entlang der Mittellinie beginnt sofort Somiten zu bilden. Das lateral gelegene Mesenchym bildet die Organe, das Blutgefäßsystem und das Blut. Zu dem Zeitpunkt, wenn sich das Notochord bildet, beginnt sich auch das Neuralrohr zu bilden, aus zwei Falten die auf der dorsalen Mittellinie des neuralen Plattenektoderms fusionieren. Bei der fortschreitenden Neurulation bildet sich die Kopffalte aus. Drei Tage nach der Eiablage haben sich 40 Somiten gebildet, die Extremitäten beginnen sich zu entwickeln, das Herz hat sich gebildet, Blutgefäßsystem und Blutinseln zur Blutzellbildung haben sich im extraembryonalen Gewebe formiert. Die Gefäße verbinden sich mit denen des Embryos um den Kreislauf zum Herzen zu schließen. Das Amnion bildet die Flüssigkeit gefüllte Amnionhöhle als Schutz vor mechanischer Beeinträchtigung, ein Chorion umgibt den Embryo, ein Dottersack hat sich ausgebildet und durch einen Allantois werden Ausscheidungsprodukte abgegeben und Sauerstoffund 7 Kohlendioxidaustausch geregelt. Vor dem Schlüpfen bilden sich nun noch die Augen aus den optischen Vesikeln, sowie das innere Ohr, der Embryo legt an Größe zu, die Organogenese wird beendet, Flügel, Beine und Daunenfedern bilden sich aus, bis schließlich das Küken schlüpft. Die Vertebratenextremität ist ein sehr komplexes Organ mit einem asymmetrischen Arrangement der Anteile in allen drei Dimensionen. Die erste ist die proximo-distale Achse (SchulterFinger, HüfteZehe). Die Knochenanteile werden über die enchondrale Ossifikation gebildet (siehe Kapitel 1.1). Die zweite Dimension ist die anterior- posteriore Achse (Daumenkleiner Finger). Dabei markieren die kleinen Finger bzw. Zehen die posteriore Seite, während der Daumen oder große Zeh das anteriore Ende bildet. Die dritte und finale Achse ist die dorso-ventrale Achse. Dabei ist die Handinnenfläche (ventral) leicht von der dorsalen Seite mit den Fingerknöcheln zu unterscheiden. Abb. 2.1 zeigt die skelettalen Anteile des Hühnerflügels (Gilbert, Developmental Biology) Bildung der proximo-distalen Achse der Extremität: das AER Wenn mesenchymale Zellen die Zone erreichen, in der sich die Extremität entwickeln soll, sekretieren sie Fibroblast growth factor 10 (Fgf10), welches die darüber liegende ektodermale Schicht dazu anregt eine Struktur zu bilden, die apical ectodermal ridge (AER) genannt wird. In einer positiven Rückkopplung bildet das AER Fgf8, welches wiederum die mesenchymalen Zellen durch stimulierte Mitose dazu anregt weiterhin Fgf10 zu bilden. Somit induziert das eine Fgf das andere und umgekehrt. Das AER verläuft am distalen Rand der Extremitätenknospe und entwickelt sich zu einem bedeutenden Signalzentrum für die sich bildende Extremität. Durch das AER wir das Mesenchym, welches daran grenzt in einem plastischen und proliferierenden Zustand gehalten, der es ermöglicht, dass die Extremität linear auswachsen kann (proximo-distal). Des weiteren werden durch das AER die Expression bestimmter Stoffe aufrecht erhalten, welche für die anterior-posteriore Achse zuständig sind und zuletzt kommt es zu einer Interaktion mit den Proteinen, die für das anterior-posteriore und dorso-ventrale Auswachsen verantwortlich sind. Somit ergibt sich ein festgelegter Differenzierungsplan für jede daran beteiligte Zelle. Das proximodistale Auswachsen und die Ausdifferenzierung der Extremitätenknospe machen eine Interaktion des AER mit dem Mesenchym der Knospe, auch Progresszone genannt, notwendig. Die Progresszone ermöglicht durch seine proliferierende Aktivität das Auswachsen und somit die „Verlängerung“ der Extremitätenknospe. Experimente zeigten die Wichtigkeit der Interaktion zwischen AER und Progresszone (siehe Abb. 2.2) 8 Abb. 2.2 zeigt die Zusammenfassung der Effekte der AER auf das darunter liegende Mesenchym (aus Gilbert, Developmental Biology) Spezifizierung der anterior-posterioren Extremitätenachse: die ZPA Im Huhn wird sehr früh, kurz bevor die Extremitätenknospe sichtbar wird, schon dessen Achse spezifiziert. Viele Experimente deuten darauf hin, dass die anterior-posteriore Achse spezifiziert wird durch einen schmalen Block mesodermalen Gewebes nahe der posterioren Verbindung der jungen Extremitätenknospe mit der Körperwand. Wird Gewebe dieser posterioren Region in einem frühen Stadium entnommen und an vorderer Stelle in eine andere Extremitätenknospe (limb bud) transplantiert, so verdoppelt sich die Zahl der gebildeten Finger des sich entwickelnden Flügels spiegelbildlich. Zu verdanken ist dieser Effekt der Aufrechterhaltung der Polarität, wobei die Information ja nun aber aus vorderer, und der normalen hinteren Richtung kommt. Die dafür verantwortliche Region des Mesoderms wurde demzufolge zone of polarizing activity (ZPA) genannt. Abb. 2.3 Schema der Transplantation einer ZPA in das anteriore limb bud Mesoderm. Daraus resultiert eine spiegelbildliche Verdopplung der normal gebildeten Finger (Gilbert, Developmental Biology) Molekular gesehen wurde 1993 durch in situ Hybridisierung eine spezifische Expression von sonic hedgehog (shh) in der ZPA nachgewiesen (Riddle et al, 1993). Shh ist ein Vertebraten-Homologon eines hedgehog Gens, das in Drosophila entdeckt wurde. Weiterhin wurde bewiesen, dass die Sekretion des Shh Proteins ausreicht um die polarisierende Aktivität der ZPA zu erklären. Es existiert eine positive Rückkopplungsschleife zwischen der ZPA und der AER: 9 das Shh Signal der ZPA moduliert das Konzentrationslevel von Fgf4 in der posterioren Kante, während Fgf4 selbst die Expression von Shh aufrecht erhält. Zusätzlich spielen Signale von Bone morphogenic Proteins (BMPs) eine entscheidende und komplexe Rolle in der limb bud Spitze, denn ein minimales BMP Level wird zur Aufrechterhaltung der Progresszone benötigt, aber bei zu hoher Konzentration bildet sich die apikale Kante zurück. Demzufolge ist auch hier ein Rückkopplungsmechanismus nötig, und zwar in Form von Shh, welches die Expression von Genen des Proteins Gremlin induziert. Gremlin wiederum blockt BMP Aktivität und demzufolge auch die Signale der apikalen Kante. Die Fingeridentitäten sind verschieden abhängig von Shh, bezogen auf die Zeit und die Konzentration. Der am weitesten posterior positionierte Finger 5 enthält Zellen, die sehr lange Shh exprimieren, außerdem werden sie auch sehr lange einer selbst herbeigeführten andauernden Shh_Konzentration ausgesetzt. Finger 4 ist auch Shh abhängig, aber die Expressionszeit ist kürzer als bei Finger 5. In Finger 3 sekretieren nicht alle Zellen Shh und diese exprimieren Shh über einen kürzeren Zeitraum im Vergleich zu Finger 4. Außerdem sind sie von der Shh-Diffusion durch die ZPA abhängig. Finger 2 ist gänzlich abhängig von einer Shh-Diffusion, während Finger 1 vollständig unabhängig von Shh seine Spezifizierung erlangt. 2.2 Versuch I: Entfernen der ZPA (Zone of Polarizing Activity) In diesem Versuch geht es um die Auswirkung auf die Determinierung der anterior-posterioren Achse der sich entwickelnden vorderen Gliedmaße, wenn die ZPA bei Hühnerembryonen im Hamburger-Hamilton Stage 20-21mit einer Wolfram-Nadel entfernt wird. Zu diesem frühen Zeitpunkt (HH-Stadium 20-21) soll die ZPA Entfernung zum Verlust der posterioren Fingeridentität führen. 2.2.1 Materialien und Methoden Hühnerembryonen HH Stage 20-21 im SPS-Ei (frei von bestimmten Viren) 70 % EtOH Pinzette PBS (mit Penicillin/Streptomycin) Präparierlöffel 4% PFA PBS Wolfram-Nadel Alcian grün Farblösung: für 100 ml: 0,1% Alcian Green 70 ml 95% Ethanol 1 ml konz. HCl EtOH (70%, 85%, 95% und 100%) 1% KOH Zu aller erst müssen die Eier vorsichtig mit einem in 70 %igem EtOH getränkten Tuch abgewischt werden, um jegliche spätere Kontamination mit Bakterien zu vermeiden, welche den nach der Manipulation zugänglichen und nicht mehr durch seine komplette Schale geschützten Embryo töten könnten. Nun muss der Hühnerembryo im Ei lokalisiert werden, damit dort die Schale aufgebrochen und die Vitellinmembran für die spätere Manipulation entfernt 10 werden kann. Mit der flexiblen Leuchte des Mikroskops kann, wenn die Kaltlichtquelle an die Schale des Eis gehalten wird, der Embryo als dunklere Erscheinung mit einem Bleistift markiert werden. Somit kann auch geprüft werden, ob sich der Embryo im richtigen Stadium der Entwicklung befindet. Des weiteren kann so festgestellt werden, ob der Embryo zusammen mit dem Dotter frei im Ei rotieren kann, also nirgendwo an der Schale festklebt, was beim Öffnen dann zum Tod des Embryos führen kann, wenn lebenswichtige Blutgefäße zerrissen werden. Vor dem Aufbrechen der Schale kann, wenn die Lichtquelle an einen Pol des Eies gehalten wird, ausgemacht werden wo sich die Luftblase befindet. Dort wird (an der dickeren Unterseite des Eies) mit einer Nadel ein kleines Loch eingebohrt, damit die Luft, die sich zwischen den beiden Eimembranen befindet, abgelassen werden kann, somit kann man den Embryo vor dem Öffnen des Eies (Windowing) absinken lassen. Nun wird an der markierten Stelle per Nadel ein Loch in die Schale gebohrt, welches dann mit der Pinzette zu einem Fenster vergrößert werden kann, so dass der ganze Embryo sichtbar wird. Nun wird vorsichtig mit der Pinzette bereits oben erwähnte Vitellinmembran entfernt, damit die Manipulation vollzogen werden kann. Dazu benutzt man eine Wolfram-Nadel. Man positioniert sich das Ei auf einem Plastiknest unter dem Mikroskop so, dass der komplette Embryo unter der Vergrößerung gut sichtbar ist. Wie man sich den Embryo zu Entfernung der ZPA unter dem Mikroskop ausrichtet ist jedem selbst überlassen, hier hat sich eine parallele Ausrichtung bewährt, bei der nun mit der Wolfram-Nadel versucht werden soll, den posterioren Teil der Gliedmaßenknospe auf einer Seite des Embryos zu entfernen. Dafür stehen (zusammen mit dem nachfolgenden Versuch) 19 Eier zur Verfügung. Abwechselnd wir von den beiden Teilnehmern der Gruppe versucht die ZPA zu entfernen oder die Manipulation des nächsten Versuches durchzuführen. Nach erfolgreicher Manipulation müssen ein paar Tropfen PBS mit 1% Pen/Strep auf den Embryo getropft werden um ihn vor bakteriellem Befall und resultierendem vorzeitigen Sterben zu bewahren. Nun werden die Fenster in der Eierschale mit einem Streifen Klebeband verschlossen und in einem Inkubator bei 38°C zur Weiterentwicklung der Embryonen erst einmal belassen. Nach der Manipulation werden die Hühnerembryonen am 9.5 Tag ihrer Entwicklung geerntet. Mit Hilfe eines Präparierlöffels werden sie aus dem Ei heraus geholt. Nun werden die Embryonen mit Alcian grün angefärbt (färbt die Knorpelanlagen). Dazu werden die Embryonen etwa drei Stunden in 4% PFA bei RT fixiert und anschließend drei Mal mit PBS gewaschen um das PFA zu entfernen. Bei sanftem Schütteln werden die Embryonen für etwa vier Stunden in der Alcian grün Farblösung getränkt. Darauf folgt das dreimalige Waschen mit 70 % EtOH, dieser Schritt kann mehrere Stunden oder auch über Nacht vollzogen werden. Nun werden die Embryonen in einer aufsteigenden Alkoholreihe (85%, 95% und schließlich 100% EtOH) jeweils mehrere Stunden belassen. Dieser Schritt kann auch über Nacht vollzogen werden. Nach einem Waschschritt mit 1% KOH, welcher der Aufklärung des Gewebes dient, folgt schließlich die Einbettung in einer 100% EtOH-Lösung und anschließende fotografische Auswertung. 2.2.2 Ergebnisse Neun der 19 Eier stehen für diesen Versuch der ZPA Entfernung zur Verfügung. Etwa vier Tage lang werden die manipulierten Embryonen bei 38°C im Inkubator zur Weiterentwicklung belassen. Nachfolgende Tabelle gibt Auskunft über das Schicksal jedes dieser Eier. 11 EiNr. 2 5 6 7 9 13 14 15 19 Ergebnis tot positiv negativ unbefruchtet negativ untergegangen untergegangen untergegangen Herz getroffen negativ nein ja ja ja ja ja ja ja ja Abb. 2.4 Ergebnistabelle der ZPA-Entfernung Nur bei dem Hühnerembryo in Ei Nr. 2 ist die ZPA Entfernung an der rechten Extremitätenknospe erfolgreich verlaufen und der Embryo überlebte lange genug, dass ein Ergebnis der ZPA Entfernung gewonnen werden konnte. Zu sehen ist, dass eigentlich nur noch ein Teil des Humerus (Stylopod) zu erkennen ist. Alle anderen Anteile der ausgewachsenen Extremität, wie Ulna und Radius (Zeugopod) oder die Handwurzel- und Fingerknochen (Autopod) sind nicht mehr zu erkennen. Bei der nicht manipulierten linken Seite ist gut zu erkennen, dass alle drei Extremitätenanteile (Stylopod, Zeugopod und Autopod) der Flügelentwicklung gut zu erkennen sind (siehe Abb. 2.5 und 2.6). Abb. 2.5 zeigt Ausschnitt Hühnerembryo Abb. 2.6 zeigt Ausschnitt Hühnerembryo Nr. 2. Nr.2, HH Stage 20-21 zum Zeitpunkt der HH Stage 20-21 zum Zeitpunkt der Manipulation. Zu sehen ist die erfolgreich Manipulation. Zu sehen ist die nicht verlaufene ZPA Entfernung (inklusive AER) manipulierte linke normal entwickelte an der rechten Extremitätenknospe Flügelextremität. 2.2.3 Diskussion In wieweit ein Ei von neun Eiern mit erfolgreicher ZPA Entfernung ein guter Schnitt ist sei dahin gestellt. Vermutlich mangelnde Erfahrung und Praxis im Bereich der Hühnerembryonenmanipulation ist hier ausschlaggebend. Trotzdem ist die ZPA Entfernung an dem Embryo aus Ei Nr. 2 geglückt. Dass nur noch ein Teil des Oberarms übrig geblieben ist, lässt darauf schließen, dass neben der ZPA auch die komplette AER, die für das Auswachsen der Extremität verantwortlich ist, mit entfernt wurde. Somit können sich die mesenchymalen Zellen in der Progresszone nicht mehr teilen (Fgf 8 fällt weg, keine positive Rückkopplung) und es werden keine weiter distal gelegenen Strukturen mehr 12 gebildet. Wäre nur die ZPA entfernt worden, hätte man zumindest noch anteriore Fingerstrahlidentität erkennen müssen. Abb. 2.7 zeigt das Ausmaß der Extremitätenverkürzung in Korrelation zu dem Zeitpunkt der Entfernung der AER (aus Wolpert, Principles of Development) 2.3 Versuch II:RCAS- GFP-Injektion Ziel der GFP-Virusinjektion ist ein Kontrollexperiment. Es soll mit Hilfe von GFP unter dem Fluoreszenzmikroskop gezeigt werden, ob eine richtige einseitige Injektion in den anterioren limb bud möglich ist, und nicht dass nur der ganze Embryo infiziert wird. Andere Teilnehmer des Praktikums infizieren Hühnerembryonen per Injektion mit RCAS-Ihh, welches Auswirkung auf die Flügelentwicklung und demzufolge den Phänotyp hat (Injektion von Ihh in den anterioren Teil des limb buds). RCAS bedeutet Replication-Competent-ASLV-longterminal-repeat-with-asplice-acceptor. Im Allgemeinen ist hier ein reproduktionskompetenter Vogelretrovirus gemeint, der eine reverse Transkriptase zur Umschreibung seiner RNA in DNA im Wirtsorganismus enthält. Daraus resultiert der Einbau 13
