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PHILIPPS-UNIVERSITÄT MARBURG FACHBEREICH CHEMIE _____________________________________________________________________________________________________________________________ ______________________ Chromatographie-Seminar – GC, HPLC und DC - Prof. Dr. Thomas Schrader Fachbereich Chemie, Universität Marburg Hans-Meerwein-Straße Phone: int. + 6421 / 28-25544 fax: int. + 6421 / 28-28917 e-mail: [email protected] ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 1. Literatur: Problem: viele gute Monographien von Einzelgebieten, wenig Übersichten. a) allgemein: E. Heftmann (Hrsg.): Chromatography, part A: Fundamentals and Techniques, part B: Applications. Elsevier 1983. G. Schwedt, Chrom. Trennmethoden, 2. Aufl. 1986, Thieme-Verlag. H. Naumer, W. Heller (Hrsg.): Untersuchungsmethoden in der Chemie, ThiemeVerlag 1986. D. A. Skoog, J. J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer-Verlag, Berlin 1996. b) speziell: G. Schomburg: Gaschromatographie, VCH, Weinheim 1987. K. K. Unger (Hrsg.): Handbuch der HPLC, Merck, GIT Verlag, Darmstadt 1989. U. Gruber, W-. Klein (Hrsg.): W. Gottwald, GC für Anwender, VCH, Weinheim 1995. 2. Inhalt: a) Definition und Illustration (Boote) b) Thermodynamik = Lage der Peaks: Kapazitätsfaktor k', Trennfaktor , Verteilungskoeffizient K in versch. Systemen c) Kinetischer Teil = Form der Peaks: Standardabweichung , Basisbreite w, Auflösung RS, theoretische Bodenzahl Ntheor., effektive Bodenzahl Neff., van Deemter-Gleichung, HETP, Entwicklung zur HPLC (Huber) d) GC: Aufbau eines GC-Geräts, Trägergas, Strömungsmessung und -konstanthaltung, Probengeber, Säulen (-ofen), Detektoren, Praxistips (Derivatisierung, Headspace etc.), Quantitative GC (Response-Wert, innerer Standard) e) HPLC: Pumpe, Injektionsventil, Trennsäule, Detektor, Praxistips, Lösungsmittel, stationäre Phasen (Reversed phase). f) DC: Prinzip, Reaktionsverfolgung, Anfärbereagenzien --------------------------------------------------------------------3. Definition und Illustration: Chromatographie ist: eine Trennmethode, bei der eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) und einer sich bewegenden (mobilen) Phase erfolgt, die an der ruhenden vorbeigleitet. Illustration: Bootsrennen! Ziel: t = tR Boote = Stoffe Fluß = Trägergas oder Eluens Raststätten = stat. Phase v0 Start: t=0 t0 + tR' = tR (Gesamtreisezeit = Retentionszeit) Rf = DR/D0 (Relate to front) k' = tR' / t0 = tR - t0 / t0 = VR - V0 / V0 = 1 / Rf - 1 (Kapazitätsfaktor = Rückhaltevermögen) Abbildung: GC und DC! 4. Thermodynamik: k' = K Vstat / Vmobil K = Verteilungskoeffizient Vstat = Menge an stationärer Phase Vmobil = Menge an mobiler Phase VR = K Vstat + Vmobil VR = Elutionsvolumen Thermodynamischer Beitrag der Trennleistung: Verhältnis der Kapazitätsfaktoren = Trennfaktor = k1' / k2' = K1 Vstat / Vmobil : K2 Vstat / Vmobil = K1 / K2 K = Verteilungskoeffizient - 4 Fälle: mobil 1 Adsorption flüssig 2 Adsorption gas 3 Verteilung flüssig stationär fest fest flüssig 4 Absorption gas flüssig Technik DC, Säulenchr., HPLC GC (gepackt für Gase) Ionenaustausch, Molekularsieb, Elektrophorese GC (Kapillar, Standard) zu 1) und 2): Adsorptionsisotherme von Freundlich, Langmuir, BET. Achtung: Nur bei sehr niedrigen Konzentrationen (oder p0), d.h. bis zur Monoschicht, ist K linear. Also mit sehr geringen Mengen arbeiten (sonst tailing) cf Rechts: cf/p0-Diagramm ! Mono- Mehrfachschichten p0 zu 3) und 4): Henry'sches Gestz: K = cfl / p Nernst'scher Verteilungssatz: K = cfl (stat) / Cfl (mobil) Vorteil: K = kaum konzentrationsabhängig cfl (stat) (cfl) Rechts: cfl (stat)/cfl(mobil) bzw. cfl/p-Diagramm ! 5. Kinetik: cfl (mobil) (p ) 0 Kinetischer Beitrag zur Trennleistung = Peakbreite = Geschwindigkeit der Verteilungsgleichgewichte Abbildung: scharfe und breite Peaks mit gleichem ! Standardabweichung (Bestimmung aus Glockenkurve über Basisbreite 4 Auflösung RS = 2 (tR2-tR1 / w2 + w1) = tR2 - tR1 / 4 RS = 1: RS = 1.5: tR = (Thermodynamik) w1 + w2 = Peakbreite (Kin.) tR = 4 nur 2% Peaküberlappung) tR = 6 nur 0.3% Peaküberlappung) Abbildung: Glockenkurve / zwei Glockenkurven! Wichtig: Da tR proportional mit der Wanderungslänge wächst, w dagegen nur mit deren Wurzel, wird eine Trennung im allg. mit der Vergrößerung der Säulenlänge besser, sie dauert nur länger! Phänomen der Auflösung auf eine kinetische Größe zurückführen: RS = (- 1 / ) (k2' / 1 + k2') ( Ntheor. / 16) 0.5 Thermodyn.: Kinetik: Selektivität Trennleistung Ntheor. = theoretische Bodenzahl = Zahl der Gleichgewichtseinstellungen = Zahl der Peaks, die nebeneinander aufgelöst werden können. Neff = Ntheor. (k2' / 1 + k2')2 Kapazitätseinfluß mit in die Bodenzahl einbezogen Neff ist leicht zu ermitteln. Damit kann man RS bestimmen: RS = (-1 / (Neff / 16)0.5 Praktische Anwendung: Für eine ausreichende Auflösung RS ist bei einem bestimmten Trennproblem ( = x) eine bestimmte Trennstufenzahl Neff nötig, d.h. eine Säule mit bestimmter Trennleistung: 1.01 1.05 1.10 1.15 1.20 van Deemter-Gleichung: nötiges Neff 160.000 6800 1940 940 575 Technik Optimum in der GC GC leicht, gute HPLC HPLC DC Säulenchromatographie Ntheor. ist noch von der Säulenlänge abhängig. Reduzierte Größe ist daher: H = L / Ntheor. = HETP (Height equivalent of a theoretical plate = Strecke, auf der sich gerade einmal das Gleichgewicht einstellt. Wovon ist H abhängig? H = A + B /v + C v Abhängigkeit von der Strömungsgeschwindigkeit! Unterschied zwischen GC und LC: Bei GC werden die Peaks wieder breiter, wenn v zu klein wird, bei LC nicht! Genauer: H = A + A' + B / v + (C + C') v Abbildung: H/v-Diagramm für GC und LC! A = Streudiffusionskoeffizient (Maß für die Güte der Packung) = 2 dp A' = Wulff-Faktor = alle Effekte, die außerhalb der Säule den Peak verbreitern B = Longitudinal-Diffusionskoeffizient = Bandenverbreiterung bei kleinem v = 2 DM. DM = Diffusionskoeff. in der mobilen Phase. Wichtig: DM ist in Gasen (GC, empfindlich gegen B) 105mal größer als in Flüssigkeiten (LC, unempfindlich gegen B)! C = Gleichgewichtseinstellungs-Koeffizient = Maß für die Schnelligkeit das Massenübergangs von mobiler zu stationärer Phase und zurück. Abhängig von: a) vDiff. d. Substanz in der mobilen Phase: Radialdiffusion soll schnell sein (Strömungsprofil!). Konvektion an und durch die Partikel soll schnell sein. Also: C = dp2 / DM dp = Partikeldurchmesser DM = Diffusionskoeff. in mobiler Phase b) vDiff. d. Substanz in der stationären Phase: c) Kinetik des Absorptions- und Desorptions-Vorgangs: Dicke der flüssigen Phase und Diff.koeffizient wichtig. Also: C' = q k' / (1 + k')2 (d2 / DS) d = Dicke der fl. stat. Phase DS = Diffusionskoeff. in dieser Phase d) Verhalten in der nichtbewegten mobilen Phase: In den Poren des Adsorbens ist mobile Phase gar nicht mobil (langsameres Gleichgewicht). Abhilfe: kleine, regelmäßige Partikel - möglichst wenig unbewegte Flüssigkeit - schnelle Gleichgwichtseinstellung: C'' Also lautet die Gesamtformel der van Deemter-Gleichung: H = 2 dp + A' + 2 DM / v + [q k' / (1 + k')2 (d2 / DS) + dp2 / DM + C''] v Entwicklung zur flash- und HPLC-Chromatographie: Huber fand, daß beim Übergang zu sehr kleinen Teilchen (5m) die Abhängigkeit der Größe von H von der Strömungsgeschwindigkeit abnimmt. Also kann man schneller chromatographieren, wenn man kleine Partikel hat. Nachteil: Man braucht höhere Drücke (High Performance Liquid Chromatography) (oder High pressure oder high pleasure oder high price!) Abbildung: H/v-Diagramm bei kleineren Korngrößen! 6. Gaschromatographie: Inhalt GC: Aufbau eines GC-Geräts, Trägergas, Strömungsmessung und -konstanthaltung, Probengeber, Säulen (ofen), Detektoren, Praxistips (Derivatisierung, Headspace etc.), Quantitative GC (Response-Wert, innerer Standard) Prinzip: Probe wird am Anfang der Säule verdampft. Elution durch den Fluß eines inerten Gases als mobiler Phase; keine Wechselwirkung mit Analyt! 2 Arten: GC an festen Phasen (gas solid chromatography, gsc: Gase) GC an flüssiger Phase (gas liquid chrom., glc: alles flüchtige) Erfinder: A.J.P. Martin und R. L. M. Synge (1941). Aufbau eines GC-Geräts: Abbildung 25.1. Skoog-Leary! Trägergase: Helium, Argon, Stickstoff, Kohlendioxid, Wasserstoff (detektorabhängig). Druckreglung und -Messung. Hohe Reinheit wichtig! Strömungsgeschwindigkeit: extrem wichtig (van Deemter!) Einstellung über Zweistufen-Druckregler an Gasflasche und Druck-bzw. Strömungsregler im GC. Eingangsdrücke von 1.53.5 bar ~ Fließgeschwindigkeiten von 25-150 mL/min bei gepackten und 1-25 mL/minbei Kapillarsäulen. Annahme: Strömungsgeschwindigkeit bei konstantem p auch konstant! Messung am genauesten mit einem einfachen Seifenblasenzähler am Ausgang des Detektors. Injektionssystem: Möglichst geringe Probemenge, als Dampfpfropfen injizieren, sonst Bandenverbreiterung. Mikroliterspritze (vorsichtig, teuer!) durch eine Membran aus Silicongummi, Septum in einen Einspritzblock (Verdampfungskammer) oder direkt in die Säule (on-column). Temperatur soll hier 50°C über dem Siedepunkt der am wenigsten flüchtigen Substanz liegen. Probenvolumina 0,3-20 L bei gepackten und ~1 nl bei Kapillarsäulen. Zur Verhinderung der Überbeladung: Split = Stromteiler, der den größten Teil der Probe wieder aus dem GC abführt. Direkteinspritz-Injektionssystem: Abb. 25.3. Skoog-Leary Trennsäulen und Öfen: Gepackte Säulen 2-10 m, Kapillarsäulen ~50 m lang. Säulenmaterial früher Edelstahl, Glas, heute auch Quarz und Teflon. Meist zu einer Spirale von 10-30 cm Durchmesser zusammengerollt. Zur Thermostatisierung in einem Säulenofen, der die Temperatur genau regelt. Temperatur soll gleich oder etwas höher sein als Siedetemperatuer der Probe (320 min Elutionszeit). Bei weit auseinanderliegenden Siedepunkten Zeitraffer durch T-Programm. Beste Auflösung natürlich bei niedrigster Temperatur. T-Einfluß auf Gasachromatogramme: Abb. 25.4. Skoog-Leary! Detektoren: ein idealer Detektor ist: a) hochempfindlich; b) stabil und reproduzierbar; c) kurze Ansprechzeit; ähnliche Responsewerte für unterschiedliche Analyte; d) zerstört Probe nicht. - (kein Detektor schafft das alles!) Flammen-Ionisations-Detektor (FID): am weitesten verbreitet. Prinzip: Ausströmendes Gas wird mit Wasserstoff und Luft vermischt und im Brenner angezündet. Bei der Verbrennung entstehen vor allem aus C-Atomen Ionen und Elektronen, die Elektrizität durch die Flamme leiten. Zwischen dem Brennerende und einer Sammelelektrode wird eine Spannung von einigen Hundert Volt angelegt. Stromfluß von ~ 10 -12 Volt wird verstärkt und als Signal aufgezeichnet. FID-Aufbau: Abb. 25.5. Skoog-Leary! Zahl der erzeugten Ionen = proportional der Zahl von reduzierten C-Atomen. C-reiche Substanzen geben ein starkes Signal, also eher massenabhängiger Detektor. Funktionelle Gruppen geben fast überhaupt kein Signal: Universeller Detektor. Hohe Empfindlichkeit: 10-13 g/s und großer dynamischer Bereich (~107). Robust und einfach. Nachteil: zerstört die Probe. Wärmeleitfähigkeits-Detektor (WLD): älterer Detektor. Prinzip: Wärmeleitfähigkeit des Gastroms sinkt stark bei Anwesenheit von Probenmolekülen. Der Widerstand eines dünnen Drahts (Pt, Au) gibt die Wärmeleitfähigkeit des Gases wieder; bei Probendurchgang heizt sich der Draht auf. Nachteil: Nur bei Wasserstoff oder Helium ist die eigene WLF viel höher als die von organischen Proben. Außerdem relativ wenig empfindlich - keine Kapillar-GC (10-8 g/ mL). Vorteil: zerstörungsfrei präparative GC. Thermionischer Detektor (TID): hochselektiv für P und N-haltige Verbindungen (gut für Pflanzenschutzmittel). Prinzip: ähnlich dem FID. Das Gas fließt um eine geheizte Rubidiumperle bei 180V Spannung gegenüber der Sammelelektrode. Dabei bildet sich ein Plasma mit 600-800°C. Hohe Ionenströme besonders bei N- und P-haltigen Verbindungen. Elektroneneinfang-Detektor (ECD): Säuleneluat strömt über einen -Strahler (z.B. 63Ni oder 3H, absorbiert an PtFolie). Elektronen des -Strahlers ionisieren das Trägergas (N2) und erzeugen langsame Elektronen. Diese werden von elektronegativen Atomen und elektronenziehenden Gruppen organischer Moleküle eingefangen (Halogenide, Peroxide, Cinone, Nitroverbb. etc.). Damit sinkt ein vorher konstant gehaltener Nullstrom zwischen einem Elektrodenpaar. Selektiv also für Halogenide etc. (gut für chlorhaltige Insektizide etc., z.B. PCB's etc.) Atomemissions-Detektor (AED): neuere Entwicklung. Prinzip: Eluat wird in ein Heliumplasma geleitet, das mit einem Diodenarray Emissionsspektrometer gekoppelt ist. Alle Elemente der Probe werden atomisiert und strahlen ihr charakteristisches Atomemissionsspektrum aus. Diese Spektren werden mit einem Diodenarray beobachtet, das von 170-780 nm mißt. Jeweils 2-4 Elemente gleichzeitig beobachtbar. Leistungsfähigkeit: Man kann z.B. aus einem wilden Benzingemisch die in kleinen Mengen vorhandenen Alkohol-Verunreinigungen selektiv detektieren , indem man die O-Linie verfolgt. Aufbau und Chromatogramm eines AED's: Abb. 25.7 und 25.8 Skoog-Leary! GC-Säulen und stationäre Phasen: Gepackte Säulen: aus Glas, Metall, oder Teflon, 2-3 m lang, Innendurchmesser: 2-4 mm. feinverteiltes Trägermaterial (Kieselgur = Skelette einzelliger Meerespflanzen) mit dünnem Film (1m) aus stationärer Phase. Spulen mit 15 cm Durchmesser. Trägermaterial immobilisiert die stationäre Phase auf größtmöglicher Oberfläche, kleine Kügelchen 0.15-0.25 mm. Kapillarsäulen: a) wandbeschichtet (wall-coated open tubular, WCOT, dünner Film direkt an der Wand) oder b) trägerbeschichtet (support-coated open tubular, SCOT, dünne Schicht Kieselgur mit stationärer Phase). Entweder höhere Kapazität oder Trennleistung - je nach Problem. c) Quarzkapillaren (fused silica open tubular, FSOT) viel dünner als normale Glaskapillaren, durch Polyimidbeschichtung trotzdem stabil, heute weitverbreitet. Innendurchmesser 0.3 mm! Problem der Adsorption von polaren Molekülen an den Säulenpackungen und Kapillarwänden gelöst durch Verkappung der freien Silanol-OH-Gruppen mit Alkylsilanen. Charakteristika typischer GC-Säulen: Tabelle 25.1 Skoog-Leary! Stationäre Phase: Bedingungen: a) geringe Flüchtigkeit (Siedepunkt >100°C höher als Ofen-T (bis 250°C)!) b) thermisch stabil 200-300°C) c) chemisch inert d) geeignete Kapazitätsfaktoren Substanz muß in der stationären Phase gelöst werden (gleiche Polarität), aber auch wieder herausgehen. Polarität von Molekülen (~Dipolmoment) dem Säulenmaterial anpassen. Unpolare Materialien enthalten viele Alkylgruppen (vor allem Dialkylsiloxane), polare vor allem viele OH-Gruppen (vor allem Polyethylenglykole). Bei guter genereller Übereinstimmung eluieren die Analyten in der Reihenfolge ihrer Siedepunkte. Oft gebraucht werden nur 6 Typen: 5 sind Polysiloxane mit Resten R = Alkyl, Phenyl, Trifluoropropyl und Cyanopropyl, in steigender Polarität. 6. ist Polyethylenglykol. Allgem. Formel: R R Si O R R Si O R R Si R R n Stationäre Phasen in der GC: Tabelle 25.2 Skoog-Leary! Chemisch gebundene und vernetzte stationäre Phasen: Sinn: Verhinderung des Ausblutens der stationären Phase bei Auswaschen mit Lösungsmittel etc. längere Lebensdauer. Entweder monomolekulare Schicht stationärer Phase kovalent ans Glas gebunden. Oder nachträgliche Vernetzung der Polysiloxae mit Peroxid (radikalische Alkylvernetzung). Chirale Phasen: Enantiomerenanalytik sehr wichtig (Medikamente, Futter, Kosmetika)! Viel einfacher als chirale Derivatisierung der Probe ist chirale Säule der unbehandelten Probe. Bsp. Polysiloxan mit Aminosäurederivaten; in jüngerer Zeit viele Cyclodextrin-Phasen mit speziell geschützten OH-Gruppen am oberen oder unteren Rand. Cyclodextrin: Aminosäuresiloxan: O Si O Si N H H N O Qualitative Analyse: besser mit Spektroskopie; aber man kann Reinheitskontrolle sehr einfach durchführen. Bei Verwendung eines inneren Standards auch Identitätsprüfung leicht möglich (Anwachsen des gewünschten Peaks). Retentionsindex I: 1958 erstmals von Kovats eingeführt (Kovats-Index). Parameter zur Identifizierung von Substanzen aus dem GC. Chromatogramm aus Gemisch von unverzweigten Alkanen mit größerer und kleinerer Retentionszeit als die Probe. Nettoretentionszeiten von unverzweigten Alkanen gegen die Anzahl der C-Atome aufgetragen ergibt eine Gerade. Interpolation der gemessenen Proben-tR's ergibt die Kovats-Indices, die unabhängig von den Chromatographiebedingungen sind. Sie bilden aber ein gutes Maß für die Polarität des Säulenmaterials (Rohrschneider-Index). Graphische Bestimmung des Kovats-Index: Abb. 25.10. Skoog-Leary! Quantitative Analyse: Sehr wichtig, viele standardisierte Bestimmungen, z.B. in der Lebensmittelchemie. Für uns vor allem: relatives Verhältnis von Reaktionsprodukten aus der Integration der Peaks (automatisch im Chromatogramm angegeben). Gekoppelte Techniken: GC-MS-Kopplung: vereinigt die Trennleistung der GC mit der Analytik der MS (siehe Versuch); dito GC-IR (vgl. Spektrosk. Kurs). 7. HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Inhalt HPLC: Pumpe, Injektionsventil, Trennsäule, Detektor, Praxistips, Lösungsmittel, stationäre Phasen (Reversed phase). Trick: Partikelverkleinerung von 0.1-0.2 mm zu 3-10 m - kaum Vergrößerung der theoretischen Bodenhöhe (HETP). Aber: hohe Drücke nötig: Teure Stahlapparaturen, die Drücke bis 400 bar aushalten! Heute > 1 Mrd. DM-Umsatz jährlich. Anwendung sehr universell auch für nichtflüchtige und thermisch empfindliche Substanzen wie Aminosäuren, Nucleinsäuren, Kohlenwasserstoffe, Kohlenhydrate, Arzneimittel, Steroide, Insektizide metallorganische Verbindungen etc. Aufbau einer HPLC-Anlage: ● bei isokratischer Elution nur ein, bei Gradientenelution mehrere Vorratsbehälter aus Glas oder Stahl für ultrareine Lösungsmittel mit Gasduschen Schema eines HPLC-Geräts: Abb. 26.4. Skoog-Leary! Gradientenelution: Abb. Skoog-Leary 26.5. ● Pumpen müssen: - Drücke bis 400 bar erzeugen - einen pulsationsarmen Fluß erzeugen - Fließgeschwindigkeiten zwischen 0.1 mL/min und 10 mL/min erreichen - Flußkontrolle und Reproduzierbarkeit von 0.5% aufweisen - korrosionsbeständig sein. Aber: keine Explosionsgefahr, denn Flüssigkeiten sind kaum kompressibel! Hubkolbenpumpen: kleine Kammer, in die das Eluens mit einem motorgetriebenen Kolben hinein- und herausgepumpt wird. Kugelventile öffnen zur Apparatur und zum Reservoir. Vorteil: kleine Volumina < 1mL, hohe Drücke. Nachteil: pulsierender Fluß - deswegen meist Doppelhubkolbenpumpen. Hubkolbenpumpe Abb. 26.6. Skoog-Leary! ● Probeneinlaßsystem: Heute allgemein übliche Probenschleifen mit geringem Volumen (1-500 L) = Rheodyne. Probeninjektionssystem: Abb. 26.7. Skoog-Leary! Säulen: Rostfreie Stahlrohre mit ebenen Innenflächen (300 - 2000.- DM). 25 cm lang, Innendurchmesser 5 mm, Teilchengröße der Packungen 3-10 m. Dabei haben sie ~50.000 theoretische Böden. Hochgeschwindigkeitsttrennung: Abb 26.8. Skoog-Leary! HPLC-Säule: Abbildung S. 72, Eppert! Vorsäulen: erhöhen die Lebensdauer der Trennsäulen: Entfernung fester Teilchen und Lösungsmittel-Verunreinigungen. Säulenpackungen: a) filmüberzogene (Vorsäulen) oder b) poröse Teilchen (Trennsäulen): gleichmäßig dicke kleine Kügelchen aus Kieselgel, Aluminiumoxid oder Ionentauscherharz. Gewinnung aus Kieselgel mit 1 m Durchmesser durch Agglomeration (sehr einheitliche Größe). Oft mit dünnem organischen Filmen beschichtet. Detektoren: ● kein universell einsetzbarer Detektor - Lösungsmittel in großem Überschuß vorhanden! 2 Arten: Lösungsensitive Detektoren sprechen auf Brechungsindex (RI, 5% verbreitet), Dielektrizitätskoeffizient oder Dichte an. Analytsensitive Detektoren sprechen auf UV (78% verbreitet), Fluoreszenz (15% verbreitet) oder Diffusion des Analyten an. UV-Detektor: kleine Zelle, Z-förmiger Fluß, Zweistrahlgeräte mit reinem Eluens als Referenz, oft Hg-Lichtquelle, aus der mit Filtern oder einem Monochromator eine Wellenlänge (meist im Bereich von 250 - 365 nm) ausgewählt wird. Besser: Diodenarray-Detektoren: Schar von Photoelementen nimmt bei jedem Peak ein ganzes UV-Spektrum auf - so hat man gleichzeitig die Substanzen charakterisiert! UV-Durchflusszelle: Abb. 26.9. Skoog-Leary! Diodenarray-Detektor: Abb. 7.22. Skoog-Leary! und 26.10. Skoog-Leary! IR-Detektor: FT-IR-Geräte können auch von jedem Peak durch schnelles Pulsen ein ganzes IR-Spektrum aufnehmen. Nachteil: Wasser, Alkohole etc. absorbieren zu stark - unmögliche LM. Fluoreszenzdetektor: Anregung der Substanz in der Durchflußzelle mit UV/VisStrahlung, und Messung der Fluoreszenz senkrecht dazu: Hg-, Xe- oder Laserlicht. Vorteil: Sehr hohe Empfindlichkeit! Nachteil: nicht alle Substanzen fluoreszieren. Abhilfe: Derivatisierung mit Dansylchlorid (5-Dimethylamino-1naphthylsulfonylchlorid) o.ä. (Amine, Aminososäuren, Phenole). Brechungsindex (RI)-Detektor: Lösungsmittel und Eluat wandern auf unterschiedlichen Wegen durch je eine Hälfte der Zelle. Dabei wird der Strahl der Lichquelle gekrümmt, wenn er durch die Trennwand aus Glas dringt und die Brechungsindices sich unterscheiden. Die Verschiebung des Strahls wird als Signal aufgezeichnet. Vorteil: universell für alle Verbindungen und LM einsetzbar. Nachteil: sehr genaue Thermostatisierung nötig (1/1000°C) und nicht sehr empfindlich. Schema eines RI-Detektors: Abb. 29.11. Skoog-Leary! Reversed Phase HPLC: Bei sehr polaren Verbindungen wird das Kieselgel mit langkettigen Alkylgruppen verkappt, und mit einem polaren Laufmittel (Wasser, Methanol, Acetonitril) eluiert, so daß nun die polarsten Verbindungen am schnellsten eluieren und danach die unpolareren, je nach van-der-Waals und hydrophoben Wechselwirkungen. Polysiloxane mit R = C8 (n-Octyl-) oder C18 (n-Octadecyl-): Alkylreste stehen parallel nebeneinander wie bei einer Bürste. Vorteile auch: größere Probenmengen toleriert! Heute etwa 3/4 aller Phasen = RP-Phasen! 8. Dünnschichtchromatographie (TLC): Oft unterschätzte schnelle, hochempfindliche Analytik; besonders wertvoll zur direkten Reaktionsverfolgung! Prinzip: Ein Adsorbens (Kieselgel etc.) befindet sich in dünner Schicht auf einem Aluminium- oder Glasträger. Auf der Startlinie werden die zu trennenden Gemische als Punkt aufgetragen. Nach Eintauchen in das Eluens wird die Laufmittelfront durch Kapillarkräfte hochgesaugt. Kleinste Mengen im ng-Bereich und gute Trennleistung (1 - 50 m große Partikel). Für höchste 1:1 Ansprüche gibt es HPTLC (höchste Trennstufenzahl, mitEA/HX GC vergleichbar). Nutzen Sie DC intensiv! Tüpfeln Sie Edukt, Produkt (falls schon vorhanden), Reaktionsgemisch und verfolgen Sie den Reaktionsverlauf! Cospotten: Wenn nicht klar ist, welcher Fleck das Edukt ist, tüpfeln Sie zu dem Fleck der Reaktionsmischung das Edukt hinzu: Dieser Fleck sollte dicker werden, sonst käme ein anderer hinzu! E R C P E = Edukt R = Reaktion C = Cospot mit Produkt P = Produkt 2D-Technik: Art Gradientenelution: Man läßt erst in einem Laufmittel laufen, trocknet das DC und läßt in einem anderen Laufmittel (z.B. polarer) senkrecht dazu laufen: 2D-Chromatogramm. 2D-Chromatogramm: 3. Aceton 1.EA/HX 1:1 5 1 4 2. 90° drehen 4 2 3 3 2 1 Start 5 Start Nachweis von Substanzklassen durch Ansprühen oder Eintauchen in FärbeReagenzien: a) Amine: Ninhydrin (lila) b) Zucker: Cerammoniummolybdat (CAM, blau) c) Alkene, Alkine: KMnO4: weiß braun (MnO2). d) Phosphorhaltige Verbb: Molybdato-Phosphorsäure in Ethanol (PME, blau). e) viele org. Verbb.: Iodkammer braun (reversibel abphönen). f) alle organische Verbb: konz. Schwefelsäure (schwarz)
