HPLC High Performance Liquid Chromatography
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HPLC High Performance Liquid Chromatography Fette Geräte Seminar 02.03.2009 Bertram Barnickel Gliederung • • • • • Chromatographie Basics Warum HPLC? Wie funktioniert HPLC? Scope & Limitations Beispielanalyse Chromatographie Basics I Flash-Säule = Normalphase (NP) Trennleistung abhängig von: • Probenmenge pro Gramm Silica (üblich ~1:50) • Säulenlänge • Partikelgröße (Silica) • Flussrate •Solvent Chromatographie Basics II Reversed Phase Chromatographie (RP) • Stationäre Phase bei RP-Chromatographie: – Silica als Grundmaterial – „Beschichtung“ mit organischen Molekülen • Alkane (z.B. C-4, C-8, C-12, C18), Phenyl, CN • Chirale Moleküle (Cyclodextrine, Zucker etc.) – Endcapping mit Trimethylsilan • Solvent immer H2O und ein mischbares Lösungsmittel (MeCN, MeOH, THF, IPA) Warum (RP)-HPLC? • Trennung komplexer Stoffgemische – Unabhängig von Molmasse und funktionellen Gruppen • • • • Geringer Substanzbedarf (10–100 µl einer 1‰ Lsg.) Hohe Reproduzierbarkeit (speziell bei RP) Quantifizierbar Bestimmung von ee und dr Wie funktioniert HPLC? Lösungsmittel Säule Pumpen UV/VIS Wie funktioniert HPLC? II • Höhere Trennleistung durch kleinere SilicaPartikel (3-10 µm, vergl. Flash-Säule 40-60 µm) • Gradienten ermöglichen besser Trennungen • Druck ist nur Bedingung für vernünftige Flussraten (0,5 – 2 ml/min) Æ bringt keine Trennleistung • Detektion mittels UV/VIS statt DC-Platte Scope • Ca. 80 % aller Verbindungen geeignet für HPLC Analytik (GC nur ca. 15-20 %) • Hoch komplexe Mischungen trennbar (> 20 Verbindungen) • Einfache Probenpräparation (wenn löslich!!!) • Sehr hohe Reproduzierbarkeit • Quantitative Analytik möglich (mit Standard) • Präparative HPLC im Gramm-Maßstab möglich Limitations • Methodenentwicklung sehr (Zeit-)aufwändig – Säulenmaterial und Hersteller – Lösungsmittel, Mischung, Gradient – pH, Flussrate, Temperatur • Trotz hohem Aufwand keine Erfolgsgarantie • Hoher Preis – Analytische Säulen ca. 400 – 700 € – HPLC-Lösungsmittel (2,5 l MeCN 80 €; THF 115 €) – Präparative HPLC entsprechend teurer Beispiel: Analyse von Heroin 250/4 mm Nucleosil® 100-5µm C-18 HD A) 2 mmol NaH2PO4, adjusted to pH 2.5 with H3PO4 B) Acetonitrile Gradient: 8 – 33% B in 30 min Sample volume: 100 μl Flow rate: 0.8 mL/min Detection: UV, 210 nm 1) Paracetamol 2) Caffeine 3) 6-Monoacetylmorphine 4) Thebaine 5) Heroin 6) Papaverine 7) Noscapine http://www.mn-net.com/DesktopModules/TabID/9661/defauld.aspx Danke für die Aufmerksamkeit!
