HPLC - AH

Praktikum Instrumentelle Analytik
Protokoll:
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
15.04.15
Juliana Storka (741708)
Luisa Telpl (741024)
Hochschule Darmstadt
Fachbereich CuB
Biotechnologie, 2. Semester
Laborbetreuer:
Herr Prof. Dr. Hüttenhain
Herr Dipl.-Ing. Kruse
HPLC
Juliana Storka, Luisa Telpl
Inhalt
1. Informationen zu Coffein .................................................................................................... 3
1.1. Chemische Eigenschaften .............................................................................................. 3
1.2. Geschichte ....................................................................................................................... 3
1.3. Wirkung auf den Körper ............................................................................................... 3
2. Materialien und Methoden .................................................................................................. 4
2.1. Verwendete Chemikalien mit H-Sätzen ....................................................................... 4
2.2. Theorie der HPLC ......................................................................................................... 4
2.3. Aufbau ............................................................................................................................. 5
2.4. Chromatographische Bedingungen .............................................................................. 6
3. Vorbereitung ......................................................................................................................... 6
4. Durchführung ....................................................................................................................... 7
5. Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................... 8
6. Quellen................................................................................................................................. 14
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1. Informationen zu Coffein
1.1. Chemische Eigenschaften
Abbildung 1: Struktur von Coffein [1]
Coffein 1 ist ein Alkaloid, welches in 63 verschiedenen Pflanzen zu finden ist. Es gehört zu
der Stoffgruppe der Xanthine, welche stimulierend wirken. Unter IUPAC wird es als 1,3,7Trimethylpurin-2,6-dione bezeichnet. Es ist ein weißes Kristallpulver ohne Geruch, dafür mit
bitterem Geschmack. Der Schmelzpunkt liegt bei 235°C, es sublimiert bei 178°C. Es ist am
besten in kochendem Wasser löslich. In Alkohol wird es in kleinen Mengen gelöst und in
Ether gar nicht. Die Molare Masse des C8H10N4O2 beträgt 194,19 g/mol. Mit Säuren kann
Coffein Salze bilden, welche jedoch leicht wieder zu lösen sind [2].
1.2. Geschichte
1820 gelang es dem Chemiker Friedlieb Runge das erste Mal Coffein 1 aus Kaffeebohnen zu
isolieren. 1832 bestimmten Christoph Pfaff und Justus von Liebig die Summenformel von
Coffein: C8H10N4O2. Beweisen konnten sie dies allerdings nicht. Dies gelang Emil Fischer erst
im Jahr 1895. Durch eine erste Vollsynthese konnte die bis dato nur vermutete Formel
bewiesen werden. Seit diesem Zeitpunkt erfreut sich das Coffein 1 immer größerer
Beliebtheit. Heute ist es in sehr vielen Lebensmitteln wie Schokolade, Kaffee, Schwarzem
Tee und zahlreichen Energy-Drinks zu finden [3].
1.3. Wirkung auf den Körper
Coffein 1 wurde durch die Tatsache Populär, dass es die Müdigkeit hemmt. Dies geschieht
durch die kompetitive Hemmung der Adenosin-Rezeptoren des Nervensystems, welche
erhöhte Herztätigkeit bewirken. Auch der Stoffwechsel und die Atmung werden
beschleunigt. Die Aufmerksamkeit und die Konzentration werden ebenfalls gesteigert.
Coffein 1 gelangt in alle Organe, da es auch die Blut-Hirn-Schranke überwindet. Somit kann
es auch den sensorischen Teil des Gehirns beeinflussen und zu guter Laune führen. Die
tödliche Dosis liegt beim Menschen bei 10g Coffein 1. Dies entspricht ca. 100 Tassen Kaffee.
Doch auch bei kleineren Dosen können Nebenwirkungen auftreten. Einige sind zum Beispiel
Schlaflosigkeit, Magen-Darm-Probleme, Kopfschmerzen und Reizbarkeit. Bei zu hohem
Konsum kann es außerdem zu starkem Zittern und sogar zu leichten Herzbeschwerden
führen. Coffein 1 ist zwar kein Suchtmittel kann jedoch nach regelmäßigem Nutzen und
nachfolgendem Verzicht einige Wirkungen zeigen wie zum Beispiel Reizbarkeit, Nervosität
und Konzentrationsbeschwerden [2-4].
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2. Materialien und Methoden
2.1. Verwendete Chemikalien mit H-Sätzen
Acetonitril 2 (Methylcyanid):
H225: Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar.
H332: Gesundheitsschädlich bei Einatmen.
H302: Gesundheitsschädlich bei Verschlucken.
H312: Gesundheitsschädlich bei Hautkontakt.
H319: Verursacht schwere Augenreizung.
Coffein 1:
H302: Gesundheitsschädlich bei Verschlucken. [2]
2.2. Theorie der HPLC
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid
chromatography, Abkürzung: HPLC) ist eine Methode für qualitative und quantitative
Bestimmungen und Trennungen von Substanzen, welche im Gegensatz zur
Gaschromatographie nicht flüchtig sein müssen. Die Auftrennung findet dabei aufgrund der
unterschiedlichen Art und Stärke der Wechselwirkungen der Stoffkomponenten mit der
stationären Phase und der mobilen Phase statt . Die HPLC ist heutzutage die am häufigsten
verwendete analytische Trenntechnik die es gibt, sie wird zum Beispiel auch für die
Synthesekontrolle eingesetzt. Sie entwickelte sich aus der Flüssigkeitschromatographie, bei
der die Teilchengröße der stationären Phase im Bereich von 150 – 200 µm liegt. HPLC
Kieselgele haben eine Partikelgröße von 3-5 µm. Je größer die Teilchen, desto größer ist auch
die Streudiffusion, Eddy-Diffusion genannt. In den großen Teilchen ist es möglich, dass
Poren sehr tief in den Kern des Teilchens hineinragen. Wenn die aufzutrennende Substanz in
so eine Pore diffundiert, dauert es eine Weile bis sie diese wieder durch Eigendiffusion
verlassen kann. In dieser Zeit strömt das Lösungsmittel mit den anderen Komponenten an
der Pore vorbei. Das bedeutet im Endeffekt, dass die Banden der einzelnen Komponenten
breiter und damit unscharf werden. Als Folge der kleineren Korngröße reicht der
hydrostatische Druck nicht mehr, um die mobile Phase durch die Säule fließen zu lassen,
man verwendet Pumpen, die Drücke bis 400 bar aufbringen. Heute verwendet man in der
UHPLC auch schon Partikel die kleiner sind als 2 µm mit Drücken bis zu 1000 bar. Man ist so
in der Lage, Ergebnisse in einer deutlich kürzeren Analysendauer und mit einer verbesserten
Nachweisempfindlichkeit zu produzieren.
Die Wahl der mobilen Phase hängt von den Eigenschaften, dabei vor allem von der Polarität
der stationären Phase und der zu trennenden Substanz, ab. Mit ihr lässt sich die
Retentionszeit der Stoffkomponenten steuern, denn ein zu schneller Durchfluss würde eine
unsaubere Trennung mit sich ziehen [5].
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2.3. Aufbau
Die Trennleistung einer HPLC-Säule hängt maßgeblich von der Größe und Homogenität der
Partikel des Packungsmaterials ab. Je kleiner die Teilchen, umso größer ist auch die
Trennleistung. Um trotzdem eine sinnvolle Fließgeschwindigkeit zu erreichen genügt nicht
nur die Schwerkraft. Es werden Pumpen eingesetzt, welche einen Druck von bis zu 400 bar
realisieren. Zudem sollten die Pumpen einen möglichst pulsationsfreien Fluss ermöglichen
und aus korrosionsbeständigen Bauteilen wie Teflon bestehen. Es gibt 3 verschiedene
Pumpsysteme: Hubkolbenpumpen, Verdrängerpumpen und Pneumatische Pumpen. Hinter
der Pumpe ist ein Restriktor geschaltet, der aufgrund des Drucks Rückschlüsse auf die
Fließgeschwindigkeit ziehen kann und somit die Pumpe auf den eingestellten Wert reguliert.
Vor der Pumpe befindet sich noch ein Membrandegaser, der das Elutionsmittel entgast,
welches aus einem oder mehreren Behältern herausgepumpt wird. Dies kann alternativ auch
durch Spülen mit Helium, Destillationssystemen, Erhitzen und Rühren oder einer Gasdusche
erreicht werden; bzw. durch Ultraschallbehandlung der mobilen Phase. Würde man diesen
Schritt weglassen, würde die Pumpe durch die Luftbläschen im Lösungsmittel
diskontinuierlich arbeiten und es würden Pulsationen im System auftreten, die das
Messergebnis verfälschen.
Nun folgt die Injektion der Probe auf das Probenaufgabeventil mit Drehdosierschleife,
welche sich in Ladeposition befindet. Nach dem Betätigen eines Hebels gelangt die
Drehdosierschleife in die Injektionsstellung und das Elutionsmittel strömt in die Schleife und
befördert die Probe zur Trennsäule. Dadurch wird ein konstantes Probenvolumen
gewährleistet und ein Druckaufbau bei der Probenaufgabe verhindert.
Die eigentliche Auftrennung der Stoffkomponenten findet in der Trennsäule
beziehungsweise einer zusätzlichen Vorsäule statt. Je nach Retentionszeit (Zeit von der
Injektion bis zur Detektion) gelangen die aufgetrennten Substanzen zu anderen Zeitpunkten
zum Detektor. Dieser ist in den meisten Fällen ein UV-Detektor mit Gittermonochromator, es
existieren jedoch auch Varianten mit Filtern. Einige weitere Varianten sind der DAD und der
RI Detektor sowie der Massenselektive Detektor [5-7].
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Abbildung 2, HPLC Aufbau
2.4. Chromatographische Bedingungen
Bei der Bestimmung wird eine HPLC im Reversed-Phase-Modus durchgeführt ( MachereyNagel, Nucleosil 120-5 RP-18 ), das bedeutet, dass die stationäre Phase aus chemisch
modifizierten unpolarem Kieselgelen besteht. Die mobile Phase dagegen besteht aus einem
polaren Gemisch aus Wasser und Acetonitril mit einem Volumenverhältnis von 80:20. Es
wird isokratisch gearbeitet, was wiederum bedeutet, dass die Konzentration des
Lösungsmittels konstant bleibt, da die Retentionszeitendifferenz der einzelnen
Stoffkomponenten nicht kritisch ist. Anderenfalls wäre eine Gradientenelution von Vorteil
gewesen. Die Flussrate wird mit einer Pumpe der Firma Knauer auf 1 ml/min eingestellt,
während der Druck 13,3 MPa beträgt. Das Probenschleifenvolumen liegt in diesem Versuch
bei 20 µl. Die Signale wurden mit dem UV-Vis-Spektrometer der Fa. Jasco ( FP-6200)
aufgenommen.
3. Vorbereitung
Als erstes wird die Stammlösung zur Kalibrierung vorbereitet, aus der später die
gewünschten Konzentrationen hergestellt werden können. Hierzu werden 100 mg Coffein 1
eingewogen, in einen 100 ml-Erlenmeyerkolben vorgelegt, bis zur Eichmarke mit VE-Wasser
aufgefüllt und schließlich im Ultraschallbad gelöst. Hieraus resultiert eine Konzentration von
1000 ppm bzw. mg/l.
Um die drei Messlösungen für die Kalibrierung herzustellen, werden je ein ml Stammlösung
mit einer Hubkolbenpipette abpipettiert und anschließend in je einen Messkolben gegeben.
Die Genauigkeit des Pipettierens wird außerdem noch auf der Waage kontrolliert. Die drei
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Messkolben werden anschließend mit VE-Wasser bis zur Eichmarke von 25 ml, 50 ml und
100 ml aufgefüllt, was den Konzentrationen von 40, 20 und 10 ppm entspricht.
Danach werden die Getränkeproben wie folgt hergestellt: der Kaffee wird 1:50 verdünnt (1 g
Kaffee und 49 g VE-Wasser) und Cola und Tee jeweils 1:10 (3 g Probe und 27 g VE-Wasser).
Um einem Verstopfen im Gerät vorzubeugen, werden die Proben noch filtriert. Hierzu
werden je 2 mal 10 ml Probe mit einer Spritze aufgezogen und dann mit einem
Membranfilter (Macherey & Nagel, PET-Membran, Porengröße: 0,45 μm, d=25 mm) filtriert.
4. Durchführung
Jede Kalibrier- und jede Messlösung wird zweimal chromatographiert und bei den
Wellenlängen 273 nm und 245 nm gemessen. Dabei wird mit der kleinsten Konzentration
von 10 ppm begonnen. Würde man mit der höchsten Konzentration beginnen, wäre danach
ein häufiges Spülen der Spritze mit der neuen, niedriger konzentrierten Lösung notwendig,
um eine Verfälschung der Konzentration ausschließen zu können. Wird mit der kleinsten
Konzentration begonnen, genügt beim Wechsel der Kalibrierlösung ein zweimaliges Spülen
der Spritze mit der höheren Konzentration.
Die Auswertung der Chromatogramme geschieht mit der Clarity Auswerte-Software
DataApex 2006.
Bei der Darstellung ist auf der x-Achse die Zeit in Minuten und auf der y-Achse die Spannung
in mV aufgetragen, die dem Messwert der Konzentration in der UV Messzelle entspricht. Vor
der Messung ist ein „Auf Null setzen“ der beiden UV-Geräte notwendig. Des Weiteren wird
vor jeder Messung der „Set Zero“-Befehl am Computer vorgenommen, um die Kurven auf
die x-Achse zu stellen. Die Laufzeit wird auf 6 min eingestellt.
Bei der Messung der Kalibrierlösungen werden ca. 0,5 ml mit einer Spritze am
Probenaufgabeventil eingefüllt. Nach ca. 2,5 min wird der Injektionspeak (Totzeit) als kleiner
Ausschlag registriert, nach einer Retentionszeit von ca. 4 min eluiert das Coffein von der
Säule. Da die automatische Integration den Negativpeak der Injektion mitintegriert wird die
Messung manuell bearbeitet. Die Integrationsgrenzen werden neu jeweils vor und hinter
den Coffein Peaks gesetzt, sodass für jeden Peak die Fläche (Area, in mV·s) berechnet wird.
Abbildung 3 zeigt die Chromatogramme.
Der bei den Stammlösungen aus Abbildung 3 entstandene, erstmalige Ausschlag bei ca.
2,5 min ist der Totpunkt. Dieser kommt zustande, da sich das Lösungsmittel schneller durch
die Säule bewegt und zuerst detektiert wird. Nach einer Retentionszeit von ca. 4 min wird
das Coffein 1 detektiert. Für das Molekül ist spezifisch, dass es die Wellenlängen 273 nm und
245 nm absorbiert. Die beiden Wellenlängen werden jedoch nicht im gleichen Maße
absorbiert. Dies ist daran zu erkennen, dass bei 273 nm ein deutlich höherer Peak entsteht
und somit auch eine größere Fläche unter dem Peak als bei 245 nm. Das liegt daran, dass
Coffein 1 sein Absorptionsmaximum bei 273 nm hat. Zudem ist auch eine Abhängigkeit der
Konzentration von der Höhe des Peaks zu beobachten: Je höher die Konzentration und somit
die Anzahl der Teilchen von Coffein 1, desto mehr Licht wird logischerweise auch absorbiert
und desto höher fällt auch der Peak aus.
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Abbildung 3, zweifache Messung von Coffeinlösungen mit den Konzentrationen 10 ppm,
20 ppm und 40 ppm jeweils bei den Wellenlängen 273 nm und 245 nm
5. Ergebnisse und Diskussion
Um Rückschlüsse auf die Konzentration von Coffein 1 in den drei Proben ziehen zu können,
wird eine Coffein-Kalibriergerade bei 273 nm und 245 nm berechnet. Dazu wird für jede der
drei Stammlösung-Konzentrationen und jeder der beiden Wellenlängen aus beiden
Messungen ein Mittelwert der Fläche errechnet, sodass sich insgesamt 6 Zahlenwerte
ergeben (Tab. 1, Tab.2).
Konzentration Coffein 1[ppm]
0
10
20
40
Area [mV*s]
0
762
1529,18
3024,866
Tabelle 1, Peakfläche in Abhängigkeit von der Konzentration von Coffein bei 273
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Konzentration Coffein 1 [ppm]
0
10
20
40
Area [mV*s]
0
229,27
454,52
88,667
Tabelle 2, Peakfläche in Abhängigkeit von der Konzentration von Coffein bei 245 nm
In Excel wird dann für jede Wellenlänge eine Tabelle erstellt von der Fläche der Peaks in
Abhängigkeit von der Konzentration. Die Tabelle wird dann in ein Diagramm überführt,
wobei die einzelnen Punkte miteinander verbunden werden und eine Geradengleichung
berechnet wird. Jeder Graph wird zudem auch mit erzwungenem Nulldurchgang dargestellt,
woraus eine andere Geradengleichung hervorkommt (Abb. 4-7).
Kalibriergerade 273 nm o.N.
3500
y = 75,62x + 5,6628
R2 = 1
Area [mV*s]
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Konzentration [ppm]
Abbildung 4, Kalibriergerade von Coffein von der Peakfläche in Abhängigkeit von der
Konzentration bei 273 nm und ohne Nulldurchgang
Kalibriergerade 273 nm m.N.
3500
y = 75,809x
R2 = 1
Area [mV*s]
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Konzentration [ppm]
Abbildung 5, Kalibriergerade von Coffein von der Peakfläche in Abhängigkeit von der
Konzentration bei 273 nm und mit Nulldurchgang
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Kalibriergerade 245 nm o.N.
Area [mV*s]
1000
900
y = 22,211x + 4,6786
800
700
2
R = 0,9998
600
500
400
300
200
100
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Konzentration [ppm]
Abbildung 6, Kalibriergerade von Coffein von der Peakfläche in Abhängigkeit von der
Konzentration bei 245 nm und ohne Nulldurchgang
Kalibriergerade 245 nm m.N.
1000
900
y = 22,367x
R² = 0,9997
800
Area [mV*s]
700
600
500
400
300
200
100
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Konzentration [ppm]
Abbildung 7, Kalibriergerade von Coffein von der Peakfläche in Abhängigkeit von der
Konzentration bei 245 nm und mit Nulldurchgang
Im Anschluss an die Kalibrierlösungen wurden die einzelnen Getränkeproben zweimal bei
beiden Wellenlängen mittels HPLC analysiert. Für jede Probe ergab sich ein spezifisches
Diagramm mit mehreren Peaks (Abb. 8-10). Bei allen drei Diagrammen ist jedoch der
Coffein-Peak nach ca. 4 min gut aufgelöst zu erkennen.
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Abbildung 8, zweimalige UV-Detektion von Kaffee jeweils bei den Wellenlängen 275 nm und
245 nm
Abbildung 9, zweimalige UV-Detektion von Cola jeweils bei den Wellenlängen 275 nm und
245 nm
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Abbildung 10, zweimalige UV-Detektion von Tee jeweils bei den Wellenlängen 275 nm und
245 nm
Die drei Getränkeproben aus Abbildung 8-10 weisen spezifische Diagramme auf, da jede
Probe durch andere Stoffe zusammengesetzt ist, die aufgrund ihrer chemischen
Eigenschaften eine unterschiedlich stark mit der stationären Phase wechselwirken und
dadurch auch unterschiedliche Retentionszeit aufweisen und die zwei Wellenlängen im
unterschiedlichen Maß absorbieren. Lediglich nach einer Retentionszeit von ca. 4 min
weißen alle drei Stoffe einen Peak auf, wodurch im Vergleich zu den Stammlösungen das
Coffein 1 identifiziert werden kann. Jedoch sind die Flächen unter diesem Peak sehr
unterschiedlich, nämlich bei den Peaks bei 275 nm 1012,63 mV*s bei Cola, 2422,15 mV*s bei
Tee und 1548,20 mV*s bei Kaffee bei der ersten Messung.
Für jede Getränkeprobe wird der Mittelwert der Fläche der Peaks bei jeder Wellenlänge
berechnet und kann für y in die entsprechende Kalibriergleichung eingesetzt werden. Am
Ende müssen die Werte noch mit dem Verdünnungskoeffizienten der jeweiligen Probe
multipliziert werden, um die endgültige Konzentration bestimmen zu können. Der
Verdünnungskoeffizient beträgt bei Cola und Tee 10 und bei Kaffee 50.
Die Endergebnisse der Konzentrationen der Getränkeproben sind in Tabelle 3
veranschaulicht. Den geringsten Coffeingehalt hat danach die Cola light mit ca. 132 ppm,
gefolgt vom Tee mit ca. 327 ppm und schließlich dem Kaffee mit ca. 1028 ppm.
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Juliana Storka, Luisa Telpl
273 nm
Anregungswellenlänge,
ohne Nulldurchlauf
(in ppm)
273 nm
Anregungswellenlänge,
mit Nulldurchlauf
(in ppm)
245 nm
Anregungswellenlänge,
ohne Nulldurchlauf
(in ppm)
245 nm
Anregungswellenlänge,
mit Nulldurchlauf
(in ppm)
Cola light
Tee
Kaffee
131,277
320,271
1032,865
131,026
320,249
1033,520
132,026
333,326
1020,880
133,197
333,093
1024,220
Tabelle 3: Konzentrationen von Coffein in den Proben
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Juliana Storka, Luisa Telpl
6. Quellen
[1] http://www.chemie-im-alltag.de/articles/0125/Coffein.png
[2]
http://gestis.itrust.de/nxt/gateway.dll/gestis_de/000000.xml?f=templates$fn=default.htm$
3.0
[3] http://www.pharmazeutische-zeitung.de/index.php?id=2523
[4] http://flexikon.doccheck.com/de/Koffein
[5] Instrumentelle Analytik, Skoog Leary, 4. Auflage, S.675 ff
[6] http://analytik.pharmaziestudenten-hd.de/ms/theorie/theorie.htm
[7] http://www.uni-jena.de/unijenamedia/HPLC
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