HPLC

HPLC
High performance liquid chromatography
Alt:
Hochdruck – flüssig – chromatographie
Allgemein:
-
Sonderform der Säulenchromatographie, unter zu Hilfenahme von Druck
Wird zur Trennung verwendet und damit zur qualitativen und quantitativen
Analyse von Substanzgemischen
klassische Säulenchromatographie:
Elutionsmittel fließt aufgrund der Schwerkraft durch die mit der stationären
Phase gefüllten Trennsäule.
Zu beachten: 1. Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase muß ausreichen
2. Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung der stationären
Phase hat Einfluß auf die Trennleistung (je kleiner, desto besser)
Achtung: kleinere Partikelgröße bedeutet größere Packungsdichte in der Trennsäule
Elutionsmittel wird mit Hilfe der Pumpe durch die
Säule gedrückt
Einteilung der Säulenchromatographie unter Druck, siehe Tab. 1
Aufbau / Funktion:
(siehe Bild 1)
Bestandteile:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
Elutionsmittel
Pumpsystem
(Gradientenmischer)
Probeneinlasssystem
Trennsäule
Detektor
Schreiber, Integrator
a) Elutionsmittel:
- müssen sehr rein sein  HPLC – Reinheitsgrad
(z.B. best. Methanol nur für HPLC  sehr teuer!!)
- dürfen keine Störsignale im Detektor verursachen
- Störungen: Luft, Sauerstoff, Gasblasen
Abhilfe: Entgasung
- vorherige Filtration durch engporige Fritte
b) Pumpsystem:
- Drücke zwischen 300 und 400 bar
- konst. Flussgeschwindigkeit (ca. 0,1 - 10 ml/min)
- soll pulsationsarm arbeiten
1
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4 Arten: 1. Langhubkolbenpumpe
2. Kurzhubkolbenpumpe (Analytik)
3. Kolbemembranpumpe (Analytik)
4. gasbetriebene Verdrängungspumpe
c) Gradientenmischer: (s. Bild 2)
- zur Veränderung des Mischungsverhältnisses des Elutionsmittels
- 2 Komponenten  binärer Gradient
3 Komponenten  tertiärer Gradient
d) Probeneinlasssystem:
- durch Einspritzen (Mikroliterspritze)
Nachteil:
- Septum nicht inert gegenüber Lösungsmittel
- erzeugter Druckstoß (Störsignal)
- durch Dosierschleifen (s. Bild 3)
e) Trennsäule:
- aus Stahl mit Innenbeschichtung (Glas)
- 5 – 30 cm lang (Innendurchmesser: 2 – 8 mm)
- am Ende befinden sich Metallfritten (sehr empfindlich)
- neue Säulentechnologie (Kartuschensysteme)
 Glassäulen in Metallhülsen eingespannt
Vorteil:
- glatt und inert
- bessere visuelle Überprüfung
- Mikrobore-Säulen (enger Durchmesser, ca. 1mm)
- Highspeedchromatographie-Säulen
f) Detektor:
Definition: Meßanordnungen, die auf die Substanzen ansprechen, die nachgewiesen
oder quantitativ bestimmt werden sollen.
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UV- / Vis
Fluoreszenz
chemische Reaktionsdetektoren
Brechzahldetektoren (Brechungsindex)
Leitfähigkeitsdetektoren
elektrochemische Detektoren
massenselektive Detektoren
1. Messung der Lichtabsorption des Eluats im sichtbaren und UV-Spektralbereich.
D.h. nur Substanzen mit Chromophor. Das Lösungsmittel darf keine Eigenabsorption
zeigen und keine Verunreinigung.
 gute Aussage über Identität und Reinheit
Speziell: Filter Photometer
Spektral Photometer
Dioden-Array
2. Substanzen, die fluoreszieren, werden gemessen. Im Gegensatz zu 1 besitzen sie 2
Monochromatoren (Anregungs- und Messwellenlänge)
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Vorteil: bei hoher Empfindlichkeit, sehr selektive Messung
3. Zur Analyse von Aminosäuren (und Zucker)
 zur Identifizierung von Substanzen ohne Chromophore, d.h. Substanzen werden
umgewandelt in absorbierende oder fluoreszierende Derivate, so dass sie anschl.
mit 1 oder 2 gemessen werden können.
4. Weniger selektiv und empfindlich.
Anhand der Änderung der Brechzahl des Gemisches aus Elutionsmittel und Probe
gegenüber der Brechzahl des reinen Elutionsmittels (möglichst groß).
Man muß Druck, Temperatur konstant halten.
Nicht anwendbar bei Gradientenelution! (wird noch erklärt)
5. Sehr empfindlich, hohe Selektivität
Messung von dissoziierten Verbindungen (Ionen)
- isobar und Wechselstrom (um Polarisation zu vermeiden)
- je geringer die Ionenkonz. der Lösung, umso höher ist der elektrische Widerstand
der Messstrecken und umso geringer ist die elektrische Leitfähigkeit
6. Voltametrisches Verfahren , zum Nachweis von oxidierbaren / reduzierbaren
Substanzen
Hohe Empfindlichkeit, Selektivität
7. Ist eine Kopplung zwischen HPLC – Säule und Massenspektrometer
Nachteil:
- entstehende Dämpfe können das Hochvakuum im Massenspektrometer
zerstören (Verdampfung ist aber notwendig)
- schwierig bei flüchtigen Substanzen
Optimierung
Wichtigste Voraussetzungen:
- kleine Partikelgröße (3-10 m), dadurch höhere Trennstufenzahl
- Durchmesser möglichst gleichmäßig, da sonst zu hoher Druckabfall in der Säule
 schlechte Trennleistung
- möglichst einheitliche Porengröße
Problem:
1. Isokratische Elution (Methode )
(unveränderbares Lösungsmittelgemisch)
Peaks entweder zu nah beieinander
(schlechte Trennung) oder Peaks zu weit
voneinander entfernt und zu flach
(s. Bild 2)
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Lösung:
Gradientenelution (Methode )
(verändertes Lösungsmittelgemisch)
Schwaches Elutionsmittel (Retentionszeit verlängert sich, Peaks gehen auseinander) und starkes Elutionsmittel
(Retentionszeit verkürzt sich, Peaks
verschmälern sich) (s. Bild 2)
Wichtig:
Man beginnt immer mit einem Elutionsmittel geringerer Elutionskraft und wird
dann immer stärker.
2. Das Lösungsmittel (siehe Tab. 2)
Ein unpolares Lösungsmittel ist besser
als ein polares!
Z.B. hat Aceton eine sehr starke EigenAdsorption, da es sehr gut mit Wasser
mischbar ist. Es ist also ungeeignet!
Daher eher Acetonitril verwenden!
(s.Tab. 2)
3. Zu schmale Peaks
Van Deemter Kurve: (s. Bild 4)
HETP = A + B/u + C * u
wobei
A = Eddy – Diffusion (A-Term), abhängig
von der Partikelgröße (je kleiner, desto
genauer die Trennleistung und desto
kleiner die Eddy-Diffusion) sowie abhängig von der Packung der Trennsäule
B/u = Längsdiffusion (B-Term), abh. von
der Geschwindigkeit der mobilen Phase
und Trennstufenhöhe
C * u = Massenübergang (C-Term), abh.
von der Geschwindigkeit der mobilen
Phase
Jan Simons / Babette Wolf
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