Untersuchungsmethoden / Analysenverfahren
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Untersuchungsmethoden / Analysenverfahren Chemische Untersuchungsmethoden - Titrimetrische Verfahren - Gravimetrische Verfahren - Elektrische Verfahren Physikalische Untersuchungsmethoden - Spektrometrische Verfahren - chromatographische Verfahren Biologische Untersuchungsmethoden - Bioteste mit Lebewesen - Enzymimmunoassays Mikrobiologische Untersuchungsmethoden - Kolonienzahl - Bakterien- und Pilzwachstum Spektrometrische Analysenverfahren und zugehörige umweltrelevante Analysenparameter UV/VISSpektrometrie Anionen Kationen Färbung Organische Verbindungen Detektoren für die HPLC InfrarotSpektrometrie Kohlenwasserstoffe, Tenside Detektor für die GC (HPLC) Detektor für TOC- und DOC-Messungen FluoreszenzSpektrometrie Kationen Organische Verbindungen Detektor für die HPLC AtomabsorptionsSpektrometrie Flamme Graphitrohrofen Quecksilber-Hydrid-System Zeeman-AAS Metalle und Nichtmetalle Flamme, Funken, Bogen ICP ICP/MS Metalle und Nichtmetalle (S;P) EmissionSpektrometrie Bereiche des elektromagnetischen Spektrums 1021 1019 1017 1015 1013 1011 109 107 Frequenz v, Hz γ - Strahlen Röntgenstrahlen Ultraviolett Sichtbar Infrarot Mikrowellen Radiowellen Wellenlänge ,cm 10-11 10-9 10-7 10-5 10-3 10-1 101 103 1011 109 107 105 103 101 10-1 -1 10-3 Wellenzahl v,cm Funktionsprinzip der Spektrometrie Strahlung Temperatur Messzelle Analysenprobe Detektion Auswertung Dokumentation Aufbau des Massenspektrometers Beschleunigungsplatten Magnet Probe Einlaßsystem Trennsystem Ionenquelle Verstärkung/ Registrierung Massenspektrum Massenspektrometrie Messprinzip: - Analyt wird in sich schnell bewegende ionisierende Gase überführt, an Hand des Masse-Ladungsverhältnisses detektiert Geräte: - Vakuum Kollision der Ionen verhindern (bis 10-8 Pa) - verschiedene Ionisierungsarten (Elektronen, Hochspannung, Atome, thermisches Plasma, Sekundärionenanregung) - Einlasssystem, Ionenquelle, Trenn- und Analysatorsystem, Detektor, Auswertesystem Anwendung: - Strukturaufklärung von organischen Molekülen und Molmassenbestimmung - qualitative und quantitative Analyse anorganischer und organischer Bestandteile - Ermittlung von Isotopenverhältnissen - Struktur und Zusammensetzung von Oberflächen Massenspektrometrie ICP-MS Funktionsprinzip: das Plasma ist ein im Hochfrequenzfeld ionisiertes Gas (Argon) und dient als Anregungsmedium für die eingesprühte flüssige oder gelöste Probe System: Massenspektrometer (Quadrupol, Auflösung bis 0,5 Masseeinheiten) Interface (Ionenoptik, zwei Metallkegel mit Bohrungen 1 mm damit Ionen gebündelt das Massenspektrometer erreichen) Plasma (Hochfrequenzgenerator) Querschnitt durch den ICP-Brenner 6000 – 8000 K Induktionsspule Quarzrohr Plasma Argon Aerosol Probe Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) - gebräuchliches Verfahren zum quantitativen Nachweis von Metallen und Halbmetallen bis hin zum Ultraspurenbereich - Prinzip: Atome können nur Licht ganz spezifischer Wellenlänge absorbieren bzw. emittieren - mögliche Atomisierungsarten: Flamme, Graphitrohrofen, Hydridkaltdampftechnik - Flamme z.B Luft-Acetylen-Flamme (2145-2400 °C) Lachgas-Acetylen-Flamme (2650-2800°C) - Graphitrohrtechnik: bis 3000°C im Argongasstrom, Verbesserung der NG um ca. 2 Größenordnungen, Analysenlösung 5-100µl - Hybridbildung durch NaBH4 (z.B. Sb, As, Se, Te, Bi, Sn, Pb, Ge, P) Flammen-AAS Monochromator Flamme Absorption Photodetektor und Anzeige Elektrodenlose Entladungslampe (EDL) Hohlkathodenlampe (HKL) Emission Zerstäubung von Probenund Kalibrierlösungen in der Flamme Atomabsorptions-Spektroskopie Chromatographie Durchführung einer DC-Trennung Gaschromatographie Prinzip: - Trennverfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Stoffgemischen - Verteilung von Substanzen zwischen zwei nicht mischbaren Phasen (Konz. stationäre Phase/Konz. in Gasphase = K) - Trägergase: Helium, Argon, Methan, Wasserstoff, Stickstoff - Trennsäulen: in Umweltanalytik meist Dünnfilm-Trennkapillaren aus Quarzglas, polyamidummantelt, Länge 10-200 m, Durchmesser innen 0,1-0,5 mm, Oberfläche mit stationärer Flüssigkeit benetzt - unterschiedliche Detektorsysteme - Anwendung: z.B. Deponiegasbestimmung Gaschromatographie in der Umweltanalytik Trennsäule Proben-Dosierung Detektor WLD FID PND Adsorptionemittel ECD PID FPD Edelstahlröhrchen Hall-D MS Auswertung Manuell Probenautomat GC-Detektoren und ihre Einsatzbereiche Detektion Kurzform Substanzen Empfindlichkeit WärmeleitfähigkeitsDetektor WLD ∗ Bodenluft ∗ Deponiegase ∗ Biogase mittelmäßig FlammenionisationsDetektor FID ∗ Kohlenwasserstoffe ∗ Lösemittel ∗ Benzol, Toluol, Xylol, ethylenbenzol gut Phosphor-StickstoffDetektor PND ∗ Pflanzenbehandlungsmittel ∗ Nitrilotrieessigsäure ElektroneneinfangDetektor ECD ∗ Leichtflüchtige halogenierte Kohlenwasserstoffe ∗ Pflanzenbehandlungsmittel ∗ Phenole nach Derivatisierung ∗ Schwerflüchtige halogenierte Kohlenwasserstofe ∗ Polychlorierte KohlenwasserStoffe Photoionisations Detektor PID ∗ aromatische KohlenwasserStoffe Kombination von GasChromatographie mit FTIR FTIR ∗ Kohlenwasserstoffe Kombination von GasChromatographie mit ….-Spektrometer MS ∗ Dioxine, Furane ∗ Pflanzenbehandlungsmittel ∗ Polychlorierte Biphenyle, usw. sehr gut gut Kapillarelektrophorese - neueste Technik elektrophoretischer Verfahren (1979) - verknüpft Vorteile der elektrophoretischen Trennmethoden mit den Möglichkeiten der einfachen direkten Quantifizierung und Automatisierung - ermöglicht Auftrennung von Komponentengemischen über weiten Molekulargewichtsbereich (anorganischen Ionen bis hin zu Biopolymeren) - Ersatz oder Ergänzung der Ionenchromatographie (ideales Referenzverfahren) - Nutzung in Kopplungstechniken (Massenspektrometrie) - Detektoren (Fluoreszenz, Leitfähigkeit, UV, MS) Aufbau eines Kapillarelektrophoresesystems - Apparatur - Zugabe Kapillarelektrophorese Trennung von aromatischen Carbonsäuren Bestimmung von Anionen in einem Flusswasser mit der Kapillarelektrophorese UV/VIS-Spektrometrie - beruht auf spezifischer Absorption elektromagnetischer Strahlung in den Wellenlängenbereichen: ∗ λ = 200 – 400 nm (ultravioletter Bereich, UV) ∗ λ = 400 – 800 nm (sichtbarer Bereich, VIS) - Strahlungsenergien 650 330 kJ/mol bzw. 330 – 160 kJ/mol - Anregung von energiereichen Valenzelektronen (π – Elektronen von Doppelbindungen, freie Elektronenpaare von Heteroatomen) - Plank`scher Gleichung eigentlich Linienspektrum, in der Praxis aber breite Banden, da sich durch Aufspaltung von Grund- und Anregungsniveaus durch sich ändernde Rotation und Schwingung der Moleküle nahe beieinander liegende Übergänge UV/VIS-Spektrometrie Bandenspektrum - charakteristische Daten (Amax. = Absorption im Maximun, λmax. = Wellenlänge des Maximums) A λmax. λ -kann zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der zugehörenden Substanzen herangezogen werden UV/VIS-Spektrometrie Photometrische Kalibrierfunktion A = Absorption c = Konzentration A Ax cx c (%) UV/VIS-Spektrometrie UV/VIS-Spektrometer (schematischer Aufbau) Spalt Polychrom. A Strahlung Spalt Monochromator Anzeigeinstrument Meßküvette (Probe) Detektoren Registrierung Lichtquelle (D2 und/oder Wolframlampe) Vergleichsküvette (Blindlösung) Strahlungsteiler (50:50) λmax. Monochromatische Strahlung λ - Schreiber - Plotter - Drucker - PC UV/VIS-Spektrometrie Einsatzbereiche in der Umweltanalytik -Bestimmung von: Anionen Kationen Färbung organische Verbindungen enzymatische Reaktionen - Spektrometer eignen sich auch als Detektoren für HPLC - hohe Bedienfreundlichkeit, niedrige Investitionskosten Laserspektroskopische Methoden ∙ Während die herkömmliche UV-Vis-Spektroskopie unter der Voraussetzung der Gültigkeit des Lambert-Beer`schen Gesetzes die Absorption als Differenz aus austretendem zu eintretendem Lichtstrahl bestimmt, nutzt die Laserspektroskopie direkte Methoden um die Absorption zu bestimmen. ∙ Das erhaltene Signal ist proportional zur eingestrahlten Lichtenergie, deshalb ist stets der Bezug zu dieser herzustellen. - Photoakustische Spektroskopie (LIPAS) - Fluoreszenzspektroskopie (TRLFS) - Thermal Lensing Spektroskopie (TLS) - (Multi Photon Absorption Spektroskopie) Laserinduzierte Fluoreszenzspektroskopie -„Absorbiertes Licht wird als Licht wieder ausgestrahlt.“ - Anregung der zu untersuchenden Uranverbindung mit einem Laserpuls - Detektion des ausgesendeten Fluoreszenzlichtes unter einem Winkel von 90 ° zur Einstrahlungsrichtung. - Zerlegung des Fluoreszenzlichtes in einem Monochromator, Detektion mit einem Diodenarray bzw. CCD-Kamera - Für eine zeitaufgelöste Spektroskopie ist die Belichtungsdauer und der Zeitpunkt der Belichtung des Diodenarrays relativ zum Laserpuls einstellbar. (gatebarer Bildverstärker – Prinzip des Kameraverschlusses) - Flureszenzspektren können einer zeitaufgelösten Peakentfaltung unterzogen werden. -unterschiedliche Spezies weisen neben unterschiedlichen Spektren auch unterschiedliche Lebensdauern auf Æ Bestimmung mehrerer Spezies nebeneinander in einer Probe Schema Laserspektroskopie Zeitaufgelöste Fluoreszenz/Photoakustik Time-Resolved Laser-Induced Fluorescence Spectrum Mining Water Königstein Verfahrensanwendung - durch Anwendung von fluoreszierenden Organika ist die indirekte Bestimmung von Metallionen möglich (Al, Li, Sn z.B.) niedrige Nachweisgrenzen pg/L, Störionen sind zu berücksichtigen - Pestizide, Aminosäuren, Nukleinsäuren haben oftmals selbst ausgeprägte Phosphoreszenz, die zur Bestimmung ausgenutzt wird - Messung erfolgt mit SEV (Sekundärelektronenvervielfacher) Photoakustische Spektroskopie - "Absorbiertes Licht wird als Schallwelle wieder abgegeben." • Aufnahme der Schallwelle durch ein an der Küvette angebrachtes "Mikrofon" (piezokeram. Detektor) und Umwandlung in ein elektrisches Signal. • Da es sich bei der Schallwelle um eine auf den Laserpuls folgende, gedämpfte Schwingung handelt, wird durch ein "Boxcar„-System ein zeitliches Tor zur Messung nur der ersten (intensivsten) Schwingungsamplitude gesetzt. - Durch Abstimmen des OPO-Lasersystems über den interessierenden Wellenlängenbereich lassen sich im Punktverfahren Absorptionsspektren aufnehmen, - Die maximal mögliche Wellenlängenauflösung des Spektrums wird dabei im wesentlichen durch die Bandbreite des Laserpulses und die Abstimmgenauigkeit bestimmt. Photoakustische Spektroskopie – Cell Design Lichtquellen für PA/TLS-Spektroskopie ∙ Farbstofflaser (Dye) - Nutzung organischer Farbstoffe als abstimmbares Medium - in der Regel kanzerogen und mutagen - methanolische Lösungen - begrenzte Haltbarkeit = speziell zu entsorgende Abfälle - enger Abstimmbereich (~ 30…400 nm) - tiefste erreichbare Wellenlänge 410 nm (mit Nd-YAG) ∙ Solid State Laser (OPO) - Festkörperkristalle als abstimmbares Medium - keine Abfallmengen - theoretisch unbegrenzt nutzbar - großer Abstimmbereich (~250 nm) Jablonski-Termschema S2 3 2 1 0 interne Konversion S1 Intersystem Crossing 2 1 0 Interne und externe Konversion S0 V=3 V=2 V=1 V=0 Absorption Fluoreszenz Phosphoreszenz Elektronenspins für den Singulettund Triplettzustand SingulettGrundzustand angeregter Singulettzustand angeregter Triplettzustand Fluoreszenz Phosphoreszenz 2 1 0 3 2 1 0 T2 T1 Röntgenabsorptionsspektroskopie h·γ SE PE Folgeprozesse der Absorption von Röntgenstrahlung (hγ): M PE: Photoelektron FS: Fluoreszenzstrahlung AE: Augerelektronen SE: Sekundärelektronen K, L, M - Schale L K AE FS Synchrotron - Elektronen-Synchrotron - Protonen-Synchrotron - Teilchen laufen auf Kreisbahnen, sind vom Impuls unabhängig, Umlauffrequenz ändert sich ständig - Elektronen-Beschleuniger ∗ Geschwindigkeit praktisch Lichtgeschwindigkeit ∗ erste Phase der Elektronenbeschleuniger ist ein vorgeschalteter Beschleuniger (z.B. Betatron) ∗ weitere Beschleunigung erfolgt durch ein hochfrequentes elektrisches Feld (Erhöhung der magnetischen Feldstärke bei konstanter Frequenz) - Speicherringe: in diesen laufen die Teilchen im Magnetfeld um , bei Elektronen Energiezufuhr durch Hochfrequenz-Beschleunigungssystem Synchrotronstrahlung (elektromagnetische Strahlung relativisitischer Elektronen, die sich in einem Magnetfeld bewegen) Eigenschaften: - sehr intensive, laserähnlich gebündelte Strahlung, die sich über den gesamten Spektralbereich von Infrarotbereich bis zum Röntgenstrahlungsbereich erstreckt - typische Energie der Elektronen im Speicherring: ca. 100 MeV - lineare Polarisation der Strahlung - gepulste Strahlung (Lichtblitze ca. 100 ps) - hohe Stabilität der Lichtquelle Röntgenabsorptionsspektroskopie mittels Synchrotronstrahlung Spektrum (allg.) Detektion Röntgenabsorptionsmethoden - Absorption von Röntgenstrahlung durch Atome ist energieanhängig - bei bestimmten Energien treten Sprünge (Absorptionskanten) auf, die durch die Photoionisation innerer Elektronen bedingt sind - bei genauer Untersuchung des kantennahen Bereiches ist charakteristische Strukturierung zu erkennen XANES (X-ray Absorption Near Edge Structure) ∗ Informationen zu: Bindungsernergien Valenzzustände - Strukturierung oberhalb der Kante (Bereich 50 eV – 200 eV oberhalb der Photoionisationsschwelle), Rückstreuung der Elektronen EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure) ∗ Informationen zu: Nahordnung Bindungsabstände Koordination EXAFS-Strukturparameter der Uranylkomplexe Aliphatische Carbonsäuren und Huminsäuren Modellkomplex von UO22+ mit Koordination von –COOH pH U-O äq R (Å) N Maleinsäure Malonsäure Bernsteinsäure Huminsäure mono mono/oxo bi mono 4,2 3,9 4,9 4,0 2,37 2,36 2,48 2,38 6 5 5 6 U-X Atom R (Å) U C Identische Strukturparameter für U-O axial: N=2, R=1,78 Å 3,96 4,37 As K-Kante XANES Spektren von Referenzproben Röntgenabsorptionsspektroskopie (XANES, EXAFS) - monochromatische Röntgenstrahlung wird beim Durchgang durch Materie geschwächt - der lineare Absorptionskoeffizient nimmt mit zunehmender Energie ab, bis zu der Energie, die ausreicht, um ein Elektron aus einer inneren Schale freizusetzen - starker Anstieg des Absorptionskoeffizienten, danach wieder Abfall - befinden sich Nachbaratome in der Umgebung des Absorberatoms sind feine Oszillationen oberhalb der Kante sichtbar = Feinstruktur - Oszillationen hängen von Abstand, der Zahl und der Art der benachbarten Atome ab Forderungen an moderne Speziationsmethoden - Probe nicht verändern, in-situ Bestimmung, vor-Ort-Bestimmung ∗ sorgfältige Probennahme und Probenvorbereitung - Messung bei sehr geringen Konzentrationen ∗ 10-5 bis 1010 mol/L - Hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit ∗ Senkung der Matrixeffekte - Automatisierung und on-line Datenauswertung ∗ schnelle Bearbeitung von großen Probenzahlen Kopplungstechniken zur Elementspeziesanalytik - Definition - - Kopplungstechniken sind aus mehreren hintereinander geschalteten analytischen Methoden bestehende Systeme - Methoden können auch unabhängig voneinander eingesetzt werden - Synergieeffekt der Kopplung (Information größer als bei getrennter Methodenanwendung) ➙ System bestehend aus Trenn- und Detektionsmodulen, die über ein Interface verbunden sind und die Analyte in einem meist automatisierten, geschlossenen System bestimmen Vorteile der Kopplungstechniken ∗ Verkürzung des Zeitbedarfs pro Bestimmung ∗ Verringerung des Arbeitsaufwandes ∗ Automatisierbarkeit ∗ Weitgehende Vermeidung von Kontaminationen durch Abschirmung der getrennten Bestandteile von der Umgebungsluft und Gefäßoberflächen ∗ Vermeidung von Analytverlusten durch Verwendung eines quasi-geschlossenen Systems ∗ Reproduzierbarkeit durch identische Analysenbedingungen ∗ Vermeidung einer Zwischenlagerung nach Fraktionierung ∗ Änderung der Spezies oder der Bindungspartner durch oxidativen oder mikrobiellen Einfluss wird verringert Trennmethoden zur Speziesanalytik können sein: - Extraktion - Sequentielle Extraktion - Filtration - HPLC - GC - Elektrophorese für Probenvorbereitung besonders wichtig: Einhaltung der nativen Bedingungen (pH, Redoxbedingungen, Ionenstärke u.a.), auch kann Derivatisierung notwendig sein, Methodenvergleich, Wiederfindungs- und Spike-Experimente Häufige Trennmodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse - Methoden Trennprinzip/Besonderheiten Flüssigkeitschromatographie – LC Gelpermeationschromatographie Ionenaustauschchromatographie Reversed-phase-Chromatographie Ionenpaarchromatographie Gaschromatographie – GC Säulen niedriger Polarität Säulen hoher Polarität Kapillarzonenelektrophorese –CZE Quarzkapillaren Beschichtete Kapillaren Gelgefüllte Kapillaren Anodic Stripping Voltammetry – ASV Differential Pulse Interfacemodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse - Methoden Technik Flammen-Atomabsorptionsspektroskopie – F-AAS Pneumatischer Zerstäuber (Flammen-Atomfluoreszenzspektrometrie – F-AFS) Hydraulische Hochdruckzerstäuber (HHPN) Kaltdampf-Atomabsorptionsspektrometrie – CV-AAS) Fließinjektion (FIA) (Kaltdampf-Atomfluoreszenzspektrometrie – CV-AFS) elektrothermale Atomabsorptionsspektrometrie On-stream (Probengeber) -ET-AAS Off-stream (Fraktionssammler) Plasma-Atomemissionsspektrometrie – Plasma-AES Pneumatischer Zerstäuber Ultraschallzertäuber Direktinjektion (DIN) Hydraulische Hochdruckzerstäubung (HHPN) Chemischer Reaktionsdetektor – CRD Continuous-flow (CFA) Fließinjektion (FIA) Organische Massenspektrometrie – MS Particle-beam Thermospray Elektrosüray Fourier-Transformation-Infrarot – FT-IR Flusszelle (Fourier-Raman-FT-Raman) Nuklearmagnetische Resonanzspektroskopie – NMR Flusszelle Detektormodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse Elementselektiv: Methoden Technik / Besonderheiten Atomabsorptionsspektrometrie – AAS Flamme (F) Hydrid (HD) Kaltdampf (CV) Elektrothermal (ET) Flamme (F) Hydrid (HD) Induktiv gekoppeltes Plasma (ICP) Mikrowellenplasma (MIP, CPM) Gleichstromplasma (DCP) Wechselstromplasma (ACP) Induktivgekoppeltes Plasma (ICP) Mikrowelleninduziertes Plasma (MIP) Induktiv gekoppeltes Plasma (ICP) Continuos-flow (CFA) Fließinjektion (FIA) Atomfluoreszenzspektrometrie – AFS Plasma-AtomemissionsspektrometriePlasma-AES Quadrupol-Massenspektrometrie Quadrupol-MS Sektorfeld-Massenspektrometrie Chemischer Reaktionsdetektor – CRD Detektormodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse Molekülselektiv: Methoden Technik / Besonderheiten Massenspektrometrie –MS Particle-beam (PB) Thermospray (TS) Elektrospray (ES) Fourier-Transformation-Infrarot- He-Cd-Te-Detektor / Durchflusszelle Spektroskopie / Raman – FT-IR/Raman Nuklearmagnetische ResonanzSpektroskopie – NMR Durchflusszelle Ultraviolett (UV) – Spektrometrie mit Diodenarraytechnik Polytetrafluorethylen (PTFE)- oder Polyetheretherketon (PEEK)-Kapillare, Durchflusszelle Fluoreszenz Polytetrafluorethylen (PTFE)- oder Polyetheretherketon (PEEK)- Kapillare, Durchflusszelle Kopplung der HPLC mit plasmaspektrometrischen Multielementverfahren zur Elementspeziesanalyse Spurenanalytische Bestimmung von sechs Arsenspezies mittels HPLC/Q-ICP-MS 3 1 6 2 4 0 4 5 8 min 1 – Arsenocholin, 2 – Arsenobetain, 3 – As(III), 4 – Dimethylarsinsäure (DMAA), 5 – Monomethylarsonsäure (MMAA), 6 – As(V); je 5 g/l aus Demesmay et al. [4.65] Biologische, mikrobiologische und biochemische Methoden Biologische Verfahren: - Bioteste mit Lebewesen Fischtest, Bakterientest, Algentest Mikrobiologische Verfahren: - Bestimmung der Kolonienzahl - Bestimmung coliformer Keime - Bestimmung ausgewählter Bakterienstämme (Escheria coli, Fäkalstreptokokken z.B.) Biochemische Verfahren: - Immunochemische Verfahren Ökotoxikologische Tests Organismus Methode, Messgröße Zeit, Parameter Akute Toxizität Bakterien Leuchtbakterientest, Stoffwechselaktivität Algen Wachstumshemmtest Daphnien Immobilisierung, Mortalität Fische akute Toxizität, Mortalität 15-60 min, EC501 72 h, EC50 24 h, LC50 96 h, LC50 Chronische Toxizität Bakterien Wachstumshemmung Algen Wachstumshemmung Daphnien Reproduktion Fische verlängerter Fischtest, Mortalität Stunden, NOEC2 72 h, NOEC 21 d, NOEC 14 d, 21 d, NOEC Toxizitätsprüfung an Fischen Algentest mit Fluoreszenzmessung Grundlage: Eigenschaft des Chlorophylls grüner Pflanzen nach einer Anregung im sichtbaren Teil des Spektrums (rotes oder blaues Licht) eine Fluoreszenzstrahlung (rot) bei 685 nm auszusenden Verfahren zur Bestimmung von toxischen Effekten chemischer Verbindungen auf das Wachstum planktonischer Süßwasseralgen - zur Beurteilung der Photosyntheseaktivität - zum Nachweis von Photosyntheseblockern wie z.B. Herbiziden Biolumineszenz - Strahlungsemission wird oft im biologischen System beobachtet (Leuchtkäfer, Glühwürmchen) Intensität der Lichtemission bei enzymkatalysierten Reaktionen messen: z.B. Luciferase (aus Leuchtkäfern) katalysiert die Oxidation des Luciferins in einer ATP verbrauchten Reaktion (Bestimmung von ATP): Luciferin + (ATP) + O2—Luciferase → Oxyluciferin + (AMP + Ppi) + CO2 + h·v AMP = Adenosis-5-monophosphat ATP = Adenosin-5-triphosphat Ppi = anorg. Diphosphat Leuchtbakterientest - gram-negative fakultativ-anaerobe Meeresbakterien aus der Familie der Vibronaceae (Verwandt mit terrestrischen Bakterien die in Böden und Gewässern leben) - Leuchtvorgang (Biolumineszenz) Teil des Bakterienstoffwechsels - Leuchten: Oxidation der Leuchtstoffe (Luciferine) unter katalytischer Wirkung des Enzyms Luciferase - wird Stoffwechsel durch Anwesenheit toxischer Stoffe gestört, verringert sich die Leuchtkraft - Prinzip: Abnahme der Biolumineszenz während der 30minütigen Testzeit im Vergleich zu unbehandelten Bakterienproben (Bakterien-Lagerung bei -20°C) Schematischer Ablauf des LUMISmini - Test Reaktivieren und Vorbereiten 2 Je 0,5 ml Kontrolllösung (2%) NaCl) in Messküvetten Reihe A geben A B Probe aufsalzen und je 0,5 ml in Messküvetten Reihe B geben 1 Start bei 0 Minuten 4,5 ml Reaktivierungslösung zur Bakterienkonserve geben 3 A B Je 0,5 ml Bakterien zu Messküvetten in Reihe A und B geben Ende nach 15 Minuten Testen 15 Minuten warten Messen: Kontrolle Probe Ergebnis Kontrolle Probe Ergebnis usw. Leuchtbakterientest Beispiele: - Toxizität von Schwermetallen - Toxizität von Kohlenwasserstoffen, Pestiziden, org. Lösungsmitteln Test von: - Wässern - Klärschlämmen - Gewässersedimenten - Böden (Altlasten) - Leuchtbakterien sind bisher nie als Krankheitserreger aufgetreten ! - Immunologie - beschäftigt sich mit Mechanismen der Immunantworten, mit der sich der lebende Organismus gegen eine Infektion durch Fremdkörper zur Wehr setzt - zwei grundsätzliche Immunantworten * humorale Abwehr (durch Antikörper vermittelt) * zellständige Abwehr - Prozess dringt Antigen oder artfremde Verbindung in Organismus ein, so kommt es zur Teilung und Differenzierung von Lymphozyten bei humoraler Abwehr kommt es zur Reifung von Plasmazellen, die ihrerseits spezifische Antikörpermoleküle generieren, diese verbinden sich mit dem Antigen und bewirken seine Ausfällung, seine Neutralisation oder seinen Tod, abhängig ob Antigen ein Makromolekül, ein Toxin oder ein Mikroorganismus ist kaum kovalente Bindungen, sterische Effekte – Schlüssel/Schloss/Prinzip – Antikörper sind Mitglieder der Familie der Immunoglobuline (4 Polypeptidketten) Immunologie (Fortsetzung 2) - Herstellung von Antikörpern: Injektion einer Lösung oder Suspension des Antigens (z.B. Klasse der Protoine, Polysaccharide, hohe MG) in ein Kaninchen, nach erforderlicher Zeit werden 5-50 mL Blut vom immunisierten Tier abgenommnen, Blutgerinnung, Serum etwa 2-25 mL durch Zentrifugation abgetrennt, bei ca. 56°C inkubiert, portioniert und bei -20°C eingefroren - Radioimmunoassay klinische Praxis, biochemische Forschung z.B. quantitative Analyse von Hormonen, Steroiden, Medikamenten Verbund von Spezifität der Immunreaktion mit der Empfindlichkeit der Radioaktivitätsmessung *Bestimmung: unmarkiertes Antigen (unbekannte Menge) und radioaktiv markiertes Antigen (bekannte Menge) konkurrieren um die begrenzte Anzahl von Antikörperbindungsstellen in einer vorgegebenen Menge Antiserum, bei Steigerung des unmarkierten Antigens (Menge radioaktiv markierten Antigen bleibt gleich) wird die Menge an Radioaktivität im gebundenen Antikörper-Antigenkomplex abnehmen, aus Eichkurve ist die zu bestimmende Antigenmenge ermittelbar Bioimmunoassay - Prinzip ist dem Immunsystem von Mensch und Tier abgeschaut, körperfremde Stoffe nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip zu erkennen und durch spezifische Antikörper zu binden - bisher insbesondere Drogen und Hormone analysiert - Fortschritte in der Antikörpertechnologie ermöglichen auch die Analyse von nichtimmunogenen, d.h. niedermolekularen Stoffen – die Haptene – durch Entwicklung dafür spezifischer Antikörper ELISA-Verfahren: (enzyme linked immunoabsorbent assay) - Antikörper an festen Phase sorbiert, aber auch durch kovalente Bindung nach Reaktion z.B. mit Cyanogenbromid (Cellulose, quervernetzte Dextrane, Polystyrol, Propylen u.a.) Festphase nur einmal einsetzbar Anwendung: - Klinische Biochemie: Globuline im Blut, Insulin, verschiedene Viren, usw. - Umweltanalytik: Atrazin, Huminsäuren, TNT, Pyrene, Sulfonylharnstoffherbizide, PAH z.B. Immunochemische Verfahren Motivation: Immunochemische Reaktionsprinzipien auch zum Nachweis umweltrelevanter Stoffe (z.B. Pflanzenschutzmittel, Sprengstoffe usw.) zu nutzen Entwicklung von relativ unkomplizierten Testbestecken vor allem zur vor-Ort-Analytik Grundlagen: Sind immunochemischer Reaktionen: Antigen (AG) provoziert die Bildung von Antikörpern (AK), Antigen und Antikörper bilden einen Komplex AGAK, ist ein Bestandteil AG oder AK in irgend einer Form markiert, dann ist Komplex quantifizierbar (radioaktiv – RIA, Fluoreszenz – FIA) Immunochemische Methoden
