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Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie Kennzeichnung des Versuchs: Versuch A (Nervenphysiologie) Datum der Versuchsdurchführung: Mittwoch, den 19. März 2008 Gruppennummer: A1d Gruppenleiter: Anne Eberle [email protected] Namen der Versuchsteilnehmer: Benjamin Schubert Björn Petri Tran Minh Do 2008 Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie INHALTSVERZEICHNIS 0. Theoretischer Hintergrund (S. 3) 1. Versuch 1 (S. 9): Übungen zum Kennenlernen des Reizgerätes und des Oszilloskops 2. 3. Versuch 2 (S. 10): Passive Eigenschaften der Nervenzellmembran a. Spannungsverlauf b. Maximalamplitude c. maximalen Abstand d. Zeitkonstante e. Auswirkungen der Zeitkonstante f. Spannungsverlauf über Ort und Zeit Versuch 3 (S. 13): Messung des Reizartefakts 4. Versuch 4 (S. 14): Ableitung eines fortgeleiteten diphasischen Summenpotentials unterschiedlichen Reizstärken a. Amplitude des SAPs in Abhängigkeit b. typisches SAP c. Zunahme der SAP-Amplitude 5. Versuch 5 (S. 16): Bestimmung der Geschwindigkeit der Erregungsleitung a. Ableitung des SAPs b. Zeitdifferenz der SAP-Gipfel c. allgemeiner Vergleich 6. Versuch 6 (S. 17): Bestimmung der Refraktärzeit beim Froschnerven a. SAP-Antworten auf Doppelreiz b. absolute und relative Refraktärzeit c. maximale Reizfrequenz 7. Versuch 7 (S. 18): Umwandlung des diphasischen SAPs in ein monophasisches SAP a. diphasisches SAP b. Vergleich von mono-/diphasischen SAPs 8. Versuch 8 (S. 19): Leitungsanästhesie am peripheren Nerven a. SAP unter Xylocaineinfluss b. Auswertung 9. Versuch 9 (S. 22): Betäubung eines Nerven mit Äther a. Reizung des Präparates b. Diagramm der SAP-Amplitude c. Wirkung von Äther 10. Quellenangaben (S. 24) 2008 Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 0. Theoretischer Hintergrund Allgemeiner Aufbau eines Neurons: Ein Neuron (Nervenzelle) ist eine auf Erregungsweiterleitung spezialisierte Zelle. Die Gesamtheit aller vorkommenden Neurone in einem Organismus bildet das Nervensystem. Man schätzt die Anzahl der Nervenzellen im menschlichen Körper auf ca. 100 Milliarden. Das Neuron besteht aus einem Zellkörper, auch Soma oder Perikard genannt, in dem sich der Zellkern und weitere Organellen wie das rau und glatte endoplasmatische Retikulum, der Golgiapparat und Mitochondrien. Auffallend bei einem Neuron ist jedoch die hohe Anzahl endoplasmatischer Retikula, die sich zu so genannten Nissl-Schollen, bzw. zur Nissl-Substanz zusammenschließen. Der Durchmesser des Soma variiert zwischen 5100 µm, je nach Neurontype. Abbildung 1: Allgemeiner Aufbau eines Neurons [1] An das Soma schließen sich die Dendriten an, feine plasmatisch Verzweigungen, die über Synapsen mit anderen Nervenzellen in Kontakt stehen und durch diese erregt werden. Ein Dendritenbaum einer einzigen menschlichen Nervenzelle kann mit bis zu 200.000 weiteren Neuronen in Kontakt stehen. Ein besonderes Areal des Neurons ist der Axonhügel. Es dient als Initialsegment des Aktionspotentials der Nervenzelle. Ist die, über den Soma elektrotonisch weitergeleitete, Erregung ausreichend, um das Schwellenpotentials des Axonhügels zu überschreiten, wird ein Aktionspotential nach dem Allesoder-Nichts-Prinzip ausgelöst und über das Axon weitergeleitet. Man unterscheidet hierbei zwischen markhaltigen (vor allem bei Wirbeltieren zu finden) und marklosen Axone. Die markhaltigen Axone sind von Myelinscheiden (im ZNS gebildet aus Oligodentrozyten und peripheren Nervensystem aus Schwann‘schen Zellen gebildet) umschlossen und dienen der Isolation. Jeweils zwischen zwei aufeinander folgenden Myelinscheiden liegt ein Ranvierscher -Schnürring, welcher wichtig ist für die saltatorische Weiterleitung des Aktionspotentials. Die marklosen Nervenfasern hingegen besitzen keine zusätzliche Isolation. Die Länge eines Axons kann zwischen 1µm bis 1m und höher liegen. Die durchschnittliche Dicke eines Axons liegt bei Säugetieren zwischen 0,5 und 10µm. An dem stark verzweigten Ende des Axons befinden sich die Endköpfchen, welche den präsynaptischen Teil der Synapse bilden. Die wichtigste Funktion ist die Freisetzung von Neurotransmittern, die in Vesikeln lagern und durch Ca2+ zur Exozytose mit der präsynaptischen Membran bewegt werden. Bei so genannten elektrischen Neuronen wird die Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Neurotransmitterübertragung durch Gap Junctions ersetzt (kanalbildender Komplex, welcher zwei Zellen intrazellulär miteinander verbindet). Den postsynaptischen Teil bildet, wie schon erwähnt, ein Dendritast eines weiteren Neurons. Dies ist aber nicht zwingen notwendig. So gibt es ebenfalls Axo-Soma-Synapsen und Axo-Axonal-Synapsen, die, wie der Name schon angibt, entweder direkt am Soma der nachfolgenden Nervenzelle anliegen oder mit einem Axon verschaltet sind. Ebenfalls gibt es zwischen Muskelzellen und deren Motoneuronen Synapsen. [2] Ruhepotential Das Ruhepotential beschreibt das Membranpotential bei elektrisch erregbaren Zellen, wenn keine Erregung durch eine andere Zelle stattfindet. Der Ausbildung eines Ruhepotentials liegen die unterschiedlichen Ionengradienten des extrazellulären und des intrazellulären Raums zugrunde. Tabelle 1: Ionenkonzentration des intrazellulären und extrazellulären Raumes[3] Ionenarten Ionenkonzentration in der Gewebsflüssigkeit (in mmol/l) Ionenkonzentration im Plasma der Nervenfaser (in mmol/l) Größe der hydratisierten Ionen (10^[-10] m) Natriumion (Na+) Kalziumionen (K+) Chloridionen (Cl-) Organsiche Anionen (A-) 460 10 540 - 350 400 55 350 12 7 8 (über 15) Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Grundlegend für die Ausbildung ist die Semipermeabilität der Zellmembran. So ist die Membran der Nervenzelle für die Anionen im Zellinneren unpassierbar, für die Kaliumionen hingegen schon. Die elektrische Anziehungskraft der Anionen wirkt durch die Membran hindurch und bindet die Kaliumionen an die Membranaußenseite. Somit entsteht ein an der Außenmembran elektropositives und im Inneren elektronegatives Gefälle (ca. -70mV). Die Natrium- und Chlorionen verhalten sich in etwa genauso, wobei es den Chlorionen möglich ist die Membran zu durchdringen und in den intrazellulären Raum zu gelangen. Dabei wurde festgestellt, dass es einen sehr geringen Einfluss von Na-Ionen gibt (Leckstrom). Es überlagern sich also zwei elektrische Felder. Da sie beide das gleiche elektrische Gefälle aufweisen verstärken sie sich gegenseitig. Durch die Diffusion der beiden Ionen würde es schnell zu einem Konzentrationsausgleich und somit zu einem Zusammenbruch des Ruhepotentials kommen. Also muss es einen Mechanismus geben, der aktiv (durch Energieverbrauch) künstlich das Konzentrationsgefälle wiederherstellt. Die NatriumKalium-Pumpe erfüllt diese Bedingungen. Sie transportiert unter ATP Verbrauch und gegen den Diffusionsgradienten Na-Ionen in den extrazellulären Raum und K-Ionen in den Intrazellulären Raum, wodurch es zu einer Aufrechterhaltung des Ruhepotentials kommt. Durch die Nernstgleichung, die von dem Physiker und Chemiker Walter Nernst im Jahre 1889 entwickelt wurde, lässt sich das Membranpotential eines Redox-Paares (z.B. ) leicht feststellen: Formel 1: Nernst-Gleichung [4] E E° R T ze F a Elektrodenpotential Standardelektrodenpotential Universelle oder molare Gaskonstante, R = 8,31447 J mol−1 K−1 absolute Temperatur (=Temperatur in Kelvin) Anzahl der übertragenen Elektronen (auch Äquivalentzahl) Faraday-Konstante, F = 96485,34 C mol−1 Aktivität des betreffenden Redox-Partners Um das Membranpotential unter Einbeziehung mehrerer Ionen zu berechnen, nutzt man die Goldmann-, bzw. Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichung, die von David E. Goldman, Alan Lloyd Hodgkin und Bernard Katz entwickelt wurde. Formel 2: Goldmann-Gleichung [5] R = allgemeine Gaskonstante T = absolute Temperatur in Kelvin F = Faradaysche Konstante P = Permeabilität K = Kalium Na = Natrium Cl = Chlorid Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Aktionspotential: Das Aktionspotential (AP) ist eine kurze Spannungsumkehrung des Ruhepotentials, die in einer charakteristischen Form abläuft. Das AP ermöglicht eine Erregungsleitung im Nervensystem und die Kontraktion der Muskulatur. Die Entstehung eines Aktionspotentials ist durch spannungsgesteuerte Ionenkanäle, sowie den Diffusionsgradienten zu erklären. Verändert sich das Membranpotential um 20mV, so tritt ein Porenblock der -Kanäle durch Spermin ein und es kommt zur Depolarisation und zum Erreichen des Schwellenwerts der spannungsgesteuerten Natriumkanäle (Initialsphase). Bei ca. -60mV öffnen sich langsam die spannungsgesteuerten -Kanäle und Natrium strömt in die Zelle ein. Die Zelle depolarisiert, wodurch noch mehr -Kanäle geöffnet werden. Abbildung 2: Charakteristischer Amplitudenverlauf eines AP [6] Noch bevor das Potentialmaximum (von ca. +20-30mV) erreicht wird, beginnen die spannungsgesteuerten - Kanäle sich wieder zu schließen. Zugleich öffnen sich langsam spannungsgesteuerte -Kanäle und die Repolarisation wird eingeleitet. Die -Kanäle besitzen zwar in etwa den gleichen Schwellenwert wie die -Kanäle, brauchen aber bedeutend länger zur Aktivierung. Dadurch kommt eine starke Zeitverzögerung zustande. So sind beim Erreichen des Maximums an geöffneten -Kanälen erst ca. die Hälfte an -Kanälen geöffnet. Ihr Maximum liegt etwa in der Phase der steilsten Repolarisierung. Während der Repolarisierung nähert sich das Potential dem Ruhepotential wieder an. Die spannungsgesteuerten -Kanäle schließen sich und der Porenblock durch Spermin wird aufgehoben. Es tritt zusätzlich eine Nachhyperpolarisation ein, die sich durch eine erhöhte Kaliumpermeabilität nach Erreichen des Ruhepotentials erklären lässt. Auch eine erhöhte Aktivität der Natrium-KaliumPumpe kann zur Hyperpolarisation beitragen. Durch die Hyperpolarisation werden die bis dato deaktivierten spannungsgesteuerten Na-Kanäle in einen aktiven Zustand überführt. Nach einem Zeitraum von ca. 4ms ist das Neuron wieder bereit ein AP zu bilden. Diese Zeit nennt man Refraktärzeit. Sie stellt sicher, dass das erzeugte AP nicht „rückläufig“ ist und nur in eine Richtung fortlaufen kann. Man unterscheidet hierbei zwischen absoluter und relativer Refraktärzeit. Während der absoluten Refraktärzeit, die etwa 2ms dauert, kann kein neues AP gebildet werden. In der darauf folgenden 2ms andauernden, relativen Refraktärzeit, kann ein AP nur durch einen erhöhten Reiz ausgelöst werden. Die Amplitude des so erzeugten APs ist ebenfalls vermindert. Dies lässt sich durch die, während der absoluten Refraktärzeit noch geschlossenen, spannungsgesteuerten -Kanäle erklären. Während der relativen Refraktärzeit sind noch nicht alle Natriumkanäle wieder in einem aktiven Zustand, weshalb dann eine erhöhte Reizung benötigt wird, um ein AP zu bilden. Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Die Fortleitung des APs: Die AP-Bildung ist auf einen kleinen Bereich der Membran beschränkt, muss sich aber zur Informationsweiterleitung über die gesamte Länge des Axons ausbreiten. Hierbei spielt die Dicke des Axons, sowie gegebenfalls eine Myelinisierung eine wichtige Rolle. Allgemein kann man sagen, je dicker das Axon ist, desto schneller wird das AP weitergeleitet. Bei marklosen Nervenfasern breitet sich das AP über die ganze Membran des Axons aus, wodurch Übertragungsgeschwindigkeiten von maximal 20 m/s erreicht werden. Das generierte AP löst an Abbildung 3: AP-Fortleitung an einer marklosen Nervenfaser[7] benachbarten, noch unerregten Membranstellen, durch Reduzierung der Membranspannung, infolge der Verschiebung von Ladungsträgern, den Ablauf eines weiteren Aktionspotentials aus. Auf diese Weise läuft das AP an einem nicht myelinisierten Axon, entlang der gesamten Nervenfaser weiter, ohne Verminderung der Signalstärke. Abbildung 4: Erregungsweiterleitung bei markhaltigen Nervenfasern [8] Die Übertragungsgeschwindigkeit von myelinisierten Axone ist ca. fünfmal höher als bei marklosen Axone und kann Höchstgeschwindigkeiten von bis zu 180 m/s erreichen. Die erhöhte Erregungsweiterleitung ist durch die Myelinisierung zu erklären. So „springt“ das AP von Ranvierschen-Schnürring zu Ranvierschen-Schnürring, da die Myelinscheiden die Nervenfaser isolieren und einen Ionenaustausch verhindern. Im Bereich der Ranvierschen-Schnürringe findet sich eine 100fach größere Dichte an -Kanälen, wodurch dieser Bereich besonders gut zur Ausbildung eines AP geeignet ist. Durch Öffnung der spannungsgesteuerten -Kanäle strömt ein und verdrängen gleichgeladene Teilchen. Auf der Außenseite der Membran werden hingegen, durch den Abfluss positiver -Ionen, andere positive Ladungsträger aus der Umgebung nachgezogen. Viele der verdrängten Ionen werden auf der Innenseite zum nächsten Ravierschen Schnürring gedrängt. Es kommt zu einer Depolarisation des zweiten Schnürrings und, beim Überschreiten der Feuerschwelle, zu einem AP. Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Währenddessen wurde am ersten Schnürring das Maximum der Amplitude erreicht und es kommt zu Repolarisation durch Kaliumeinstrom. Dieser Zyklus setzt sich fort, bis das AP an den synaptischen Endköpfen angelangt ist. Membranlängskonstante: Diese Konstante gibt an, nach welcher Strecke ein Potenzial auf gefallen ist. [10] Membranzeitkonstante: Die Konstante gibt die Zeit an, wann das Potential auf 63% gefallen ist. [10] Synaptische Erregungsübertragung: Das ankommende AP öffnet Kanäle, wodurch es in das Synaptische Endköpfchen eindringen kann. Das veranlasst Vesikel, welche mit Neurotransmittern gefüllt sind, zur präsynaptischen Membran zu diffundieren und dort durch Exocytose mit der Membran zu verschmelzen, um ihren Inhalt in den synaptischen Spalt freizugeben. Jedes dieser Vesikel enthält zwischen 2.000 und 40.000 Signalmoleküle. Diese Neurotransmitter diffundieren durch den synaptischen Spalt an die postsynaptische Membran und setzen sich dort an spezielle Rezeptoren, wodurch diese dann eine Konformationsänderung erfahren. Es kommt zur Öffnung von ligandenabhängigen Ionenkanälen und zur Änderung des Membranpotentials der postsynaptischen Membran. Alternativ können über eine SecondMessenger-Kaskade Ionenkanäle geöffnet werden. Abbildung 5: Chemische Synapse bei der Erregungsweiterleitung[7] Die Neurotransmitter werden durch spezielle Enzyme in ihre Einzelteile gespalten und an der präsynaptischen Membran wieder durch Endocytose aufgenommen, um neu gebildet zu werden. Es reicht aber nicht aus, wenn nur ein AP an der neuen Nervenzelle ankommt. Erst die Summe aller erregenden (exzitatorischen) und hemmenden (inhibitorischen) Synapsen, die an einer Nervenzelle anliegen, entscheiden, ob das am Axonhügel ankommende Potential ausreicht, um ein neues AP zu generieren. Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 1. Übungen zum Kennenlernen des Reizgerätes und des Oszilloskops Einleitung: Es werden die Dauer und die Amplituden von Signalen bestimmt. Dafür werden die Fertigkeiten an den Oszilloskopen trainiert. Material und Methoden: Abbildung 6: Aufbau des Versuches Mit dem Reizgerät lassen sich elektrische Einzelreize erzeugen, die teilweise fest eingestellt sind. Eigenschaften wie Amplituden und Anzeigedauer sollen manuell nach Ermessen eingestellt werden. Ergebnisse: Abbildung 7: Frosch SAP Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 2. Passive Eigenschaften der Nervenzellmembran Einleitung: Membranmodell: Es wird an einem Modell der Nervenzellmembran, welche aus einer Kette von RC-Gliedern besteht, abgeleitet. Diese Glieder sollen zusammen eine Membran simulieren mit Membranwiderstand und Membrankapazität. Untereinander sind die einzelnen Glieder durch den Innenwiderstand der "Intrazellulärflüssigkeit" verbunden. Dieser Versuchsteil soll an Nervenzellen das Praktizieren von Ableitmethoden und Messungen von passiven Membraneigenschaften dienen. Material und Methoden: Abbildung 8: Versuchsaufbau Dieser Versuch besteht aus mehreren Teilversuchen mit unterschiedlichen Einstellungen der Geräte. Der Versuchsaufbau ist dabei zu konstruieren wie auf Abbildung 8. Dabei sind feste Einstellungen für die Reizamplitude von 5 V und eine Reizdauer von 200ms (nicht veränderbar) einzustellen. Es soll der Spannungsverlauf registriert werden. Dafür wir gemessen, wie sich die Amplitude in Abhängigkeit zur Entfernung zwischen zwei Messpunkten verhält. Es werden die wichtigen Unterschiede registriert. Dann wird aus den Messpunkten, mit Hilfe eines Computerprogramms die Längskonstante des Modells ermittelt. Mithilfe dieser Längskonstante wird ermittelt, bis zu welchem maximalen Abstand vom Reizort bei den Modellen mit einem Schwellenwert von 0,4V ein AP ausgelöst werden würde. Es wird nun die Zeitkonstante am ersten Messpunkt nach dem Reizort bestimmt. Dieser Wert wird dann mit der Membranzeitkonstante verglichen. Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Ergebnisse: Tabelle 2: Passive Eigenschaften der Nervenzellmembran, Messpunkt 0-6 Messpunkt Abstand [cm] Amplitude [V] 0 0 5 1 3 2 Abbildung 9: Passive Eigenschaften d. Nervenzellmembran Messpunkt 1 2 6 0,8 3 9 0,345 32,91mm 5 15 0,064 6 18 0,036 Abbildung Error! No text of specified style in document.10: Passive Eigenschaften d. Nervenzellmembran Messpunkt 6 Abbildung 11: Spannungsverlauf über Ort Membranlängskonstante: 4 12 0,14 Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie Membranzeitkonstante: 2008 8ms Berechnung des Schwellenwertes Bei einem Schwellenwert von 0,4 V kann nur bei einem Abstand von maximal 3cm ein Aktionspotential ausgelöst werden, da bei einer höheren Entfernung die Feuerschwelle nicht erreicht wird. Diskussion Wie man der Tabelle 2 und der Abbildung 11 entnehmen kann, wird bei zunehmender Länge des Nervs die Reizamplitude geringer. Dieses liegt daran, dass die Spannung bei größerer Entfernung vom Reizort durch den erhöhten Membraninnenwiderstand abnimmt. Je größer der Abstand zur Reizamplitude wird, umso geringer die ankommende Erregung. Die Kurve gleicht der Funktion (Abb. 4) Der Wert kann verändert werden durch eine Erhöhung der Durchmesser der Nervenfaser. (hier Formel für die Dicke des dingens einfügen) Durch Isolation von Myelin-Scheiden (Schwann’sche Zellen und Oligo blabla) Berechnung des maximalen Abstandes zum Reizort: Bei einem Schwellenwert von 0,4 V kann nur bei einem Abstand von maximal 3cm ein Aktionspotential ausgelöst werden, da bei einer höheren Entfernung die Feuerschwelle nicht erreicht wird. Die Geschwindigkeit der Erregungsleitung ist von der Zeitkonstante abhängig, da die Zeitkonstante beschreibt, wann 63% der Maximalamplitude erreicht wurde. Das heißt, je niedriger die Zeitkonstante, desto schneller ist die Erregungsleitung. Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 3. Messung des Reizartefakts Einleitung: Bei diesem Versuch wird das Reizartefakt gemessen. Material und Methoden: Abbildung 12: Versuchsaufbau Um die Charakteristika eines Reizartefaktes identifizieren zu können, wurde ein in Ringer-Lösung getränkter Faden auf die Elektroden des Membranmodells gelegt und mit einer Reizamplitude von 3V gereizt. Ergebnisse: Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Abbildung 13: Messung eines Reizartefakts Diskussion Die zu sehenden Ausschläge sind durch die Konzentration von und in der Ringer-Lösung zu erklären. Die zu sehenden Ausschläge beginnen bei Reizanfang und Reizende. (eventuelle Begründung für dieses Faktum) Die nicht vorhandene Latenz des ersten Peaks ist dadurch zu erklären, dass die Reizung vor Ort stattfand. Da die elektrische Leitfähigkeit des Fadens so gering ist, dass sie zu vernachlässigen ist. 4. Ableitung eines fortgeleiteten diphasischen Summenpotentials unterschiedlichen Reizstärken Einleitung: Ein Summenaktionspotential (SAP) entsteht bei synchroner Erregung mehrerer oder sämtlicher Axone eines Nervs. Die Ableitung erfolgt extrazellulär. Die Amplitude des SAPs hängt von der Anzahl und Dicke der erregten Axone und damit von der Reizamplitude ab. Bei der Reizamplitude unterscheidet man zwischen der Schwellenreizstärke (kleinste Reizamplitude, die eben noch ein messbares SAP auslöst) und der Maximalreizstärke (Reizamplitude, ab der eine weitere Vergrößerung keine Zunahme der SAP-Amplitude bewirkt). Material und Methoden: Erst wird der Nerv platziert, eine Messreihe zügig durchgemessen, und dann der Nerv in die Ringerlösung zurückgelegt. Zwischen zwei Messreihen – jedoch nie innerhalb einer Messreihe – kann der Nerv auch mit Ringerlösung beträufelt werden. Ergebnisse: Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Tabelle 3: Ergebnisse der SAP-Reizungen Reiz [V] SAP [mV] 0,14 260 0,25 1100 0,26 2900 0,76 3000 1,12 3000 Abbildung 14: Ergebnisse als Graph Abbildung 15: minimale Reizamplitude [0,14V] Abbildung 16: maximale Reizamplitude [0,76V] Diskussion Minimalreizstärke ist ab der Intensität, wann die Nervenfaser ein messbares SAP abbildet, also wenn genau ein Axon über den Schwellenwert depolarisiert wird. Maximalreizstärke entsteht bei synchroner Erregung sämtlicher Axone. Sollte nach logistischem Wachstum verlaufen, da die Nervenfaser aus unterschiedlich-gut erregbaren Axonen besteht, werden zu Beginn mehrere Axone gleichzeitig erregt. Bei weiterer Erhöhung der Reizintensität nimmt die Anzahl der zu erregenden Axone bis zu einem Maximalwert ab, bei dem alle Axone erregt sind. Auf Abbildung 14 ist dies schwer zu erkennen, da zu wenige Messwerte zur Verfügung standen. Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 5. Bestimmung der Geschwindigkeit der Erregungsleitung Einleitung: Dieser Versuch soll darüber Aufschluss geben, wie schnell ein AP in einem Forschnerv fortgeleitet wird. Material und Methoden: Um allgemeine Geschwindigkeiten zu berechnen, benötigt man nur eine Strecke und die Zeit, in der diese Strecke bewältigt wurde. Bei dem Froschnerv leitet man dafür einmal reizortnah und reizortfern (am besten mit weit möglichsten Abstand) ab, um die nötigen Daten zu bekommen. Dabei soll die Reizung mit der ermittelten Maximalreizstärke erfolgen. Dann extrahiert man aus den erhaltenen Informationen die Zeitdifferenz beider SAP-Gipfel und den Abstand der abgeleiteten Elektrodenpaare. Daraus kann man die Geschwindigkeit berechnen . Ergebnisse: Leitungsgeschwindigkeit des Nervus Ischiadicus: Abbildung 17: reizferne Ableitung eines SAPs Diskussion Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 In der Literatur wird die durchschnittliche Leitungsgeschwindigkeit dieses Nerves [literaturangebe suchen] angegeben. Da der Nerv aber aus mehreren verschieden schnellen Fasern besteht kann dieser Wert variieren. Die Leitungsgeschwindigkeit kann auch durch die Präparation beeinflusst worden sein. 6. Bestimmung der Refraktärzeit beim Froschnerven Einleitung: Bei der relativen Refraktärzeit ist es dem Nerv möglich ein neues AP zu erzeugen, aber unter Verwendung einer höheren Reizamplitude oder Verlustes der Amplitude des SAPs bei gleicher Reizamplitude. Diese Erscheinung soll in diesem Versuch nachgewiesen werden. Material und Methoden: Um dieses Phänomen visualisieren zu können, sind zwei Reize mit maximaler Reizamplitude benötigt, deren zeitlichen Abstand man so wählen kann, sodass man die refraktären Eigenschaften identifizieren kann. Wenn man die Amplituden des zweiten SAPs messen und dann die Werte in eine Tabelle eintragen, kann man damit ein entsprechendes Diagramm für die Refraktärzeit erstellen. Mit dieser Messreihe kann man die absolute und relative Refraktärzeit bestimmen. Ergebnisse: Tabelle 4: Refraktärzeit Reizabst. [ms] SAP [mV] 1 400 1,1 800 1,25 1050 1,6 2600 Abbildung 18: Refraktärzeit 1,9 2700 2 2800 3,1 3000 Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie Abbildung 19: relative Refraktärzeit Abbildung 20: absolute Refraktärzeit 2008 Abbildung 21: keine Refraktärzeit Diskussion Aus den Messungen ergibt sich eine absolute Refraktärzeit im Bereich von 0,1-1ms Reizabstand, da es bis 1ms Reizabstand keine zweite Amplitude zu erkennen war. Die absolute Refraktärzeit ist demnach 0,9ms lang. Die relative Refraktärzeit liegt im Reizabstandsbereich von 1,1 bis 3ms; hat also eine Länge von 1,9ms. Es ist zwar eine zweite Reizamplitude zu erkennen, diese ist aber schwächer als die erste. Dies lässt sich durch die, nach einer Depolarisation noch ganz oder teilweise inaktivierten spannungsgesteuerten -Kanäle erklären (siehe Theoretischer Hintergrund). Um die maximale Amplitude des SAP zu erreichen muss jedes Axon des Nervs seine Refraktärzeit durchlaufen haben, ansonsten ergibt sich eine Senkung der Amplitude wie es in Abbildung 21 zu sehen ist. 7. Umwandlung des diphasischen SAPs in ein monophasisches SAP Einleitung: Wenn eine Erregung entlang des Axons über zwei voneinander verschieden positionierte Ableitelektroden hinweg wandert, dann entsteht ein diphasisches SAP. Dabei entsteht die erste Phase normal wie bei einem monophasischen SAP, aber beim vorbei wandern an der zweiten Elektrode wird sie der anderen negativ. Somit ist es möglich ein diphasisches SAP in ein monophasisches SAP zu konvertieren, welches auch in diesem Versuch gezeigt werden soll. Material und Methoden: Um ein aus einem diphasischen SAP ein monophasisches SAP zu generieren, muss die zweite Ableitelektrode an einer Stelle des Nervs installiert sein, wo sie unerregbar ist. Das ist möglich, indem wir in unserem Versuch den zweiten Abschnitt des Nervs soweit abklemmen, sodass eine Fortleitung einer Erregung nicht mehr möglich ist. Dabei ist zu beachten, dass die Lage des Präparates nicht verändert werden darf. Ergebnisse: Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie Abbildung 22: monophasisches SAP 2008 Abbildung 23: diphasisches SAP Diskussion Bei einem diphasischen Summenaktionspotenzial wird die Erregung zwei Stellen des Nervs mit abgeleitet. Das Oszillogramm entsteht hierbei dadurch, dass die beiden Elektroden im Bezug auf die jeweils andere Elektrode negativ werden. Abbildung 23 zeigt ein solches diphasisches SAP. Hier kann man auch erkennen, dass in Repolarisationsphase noch eine kleine Depolarisation stattfindet. Dies erklärt sich dadurch, dass das AP der langsameren Axone in diesem Moment ankommt. Bei einem monophasischen SAP wird die Erregung nur an einer Elektrode abgenommen. Um also ein diphasisches in ein monophasisches SAP umzuwandeln muss der Nerv an einer Stelle abgeklemmt werden. Wie man in Abbildung 22 erkennen kann bleibt die 2. Phase des SAPs dadurch aus. Ein weiterer Unterschied ist die deutlich stärkere Depolarisation und Hyperpolarisation beim diphasischen SAP, was wahrscheinlich durch das Abklemmen des Nervs hervorgerufen wurde. Da hierbei an der Außenseite gemessen wurde, sieht man auf dem Oszillogramm die Potentialveränderung an der anliegenden Zelle. Da die gereizte Zelle depolarisiert wird, wird die äußere auf Grund des Konzentrationsgradienten hyperpolarisiert. Man erhält deshalb ein gespiegeltes Bild. 8. Leitungsanästhesie am peripheren Nerven Einleitung: In diesem Versuch wird ein Nerv mit Xylocain anästhetisiert. Die Wirkung wird nicht sofort eintreten, sondern zeigt nur nach und nach ihren Effekt. Diesen Verlauf der Betäubung wird somit festgehalten. Material und Methoden: Der Nerv wird anfangs mit Xylocain betröpfelt. Danach werden alle 30 Sekunden eine Messung mit Einzelreizen mit gleicher Reizamplitude durchgeführt, sodass am Ende ein Diagramm daraus erstellt werden kann und die vollständige Betäubung daraus entnommen werden kann. Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Ergebnisse: Tabelle 5: entnommene SAP-Amplitudenwerte Zeit [s] Amplitude [V] Zeit [s] Amplitude [V] 0 1,5 300 0,15 30 1 330 0,12 60 0,7 360 0,1 90 0,55 390 0,08 120 0,5 420 0,07 150 0,375 180 0,3 210 0,235 Abbildung 24: SAP-Amplitude in Abhängigkeit der Zeit unter Xylocaineinfluss 240 0,2 270 0,19 Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Abbildung 25 Abbildung 26 Abbildung 27 Abbildung 28 Abbildung 29 Abbildung 30 Abbildung 31 Abbildung 32 Abbildung 33 Abbildung 34 Abbildung 35 Abbildung 36 Abbildung 37 Abbildung 38 Abbildung 39 allgemeine Werte: Zeit [0,5ms], Reiz [0,2V], Messung [0,5V] Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Diskussion Bei diesem Versuch wurde das Betäubungsmittel Xylocain auf den Nerven gespritzt. Wie man auf den Abbildung 25 bis Abbildung 39 sehen kann, setzt Xylocain die Leitung des Nervens herab, bis keine Erregung mehr messbar ist. Dies kommt daher, dass Xylocain die Nikotinische Acetylcholinrezeptoren blockiert und so die Leitung des Potentials über den synaptischen Spalt verhindert. Es werden nach und nach alle Kanäle besetzt, wodurch die Leitfähigkeit nicht sofort zerstört wird. Im Körper wird dieser Stoff in der Leber abgebaut, doch da es sich hierbei nur um ein Nervenpräparat handelt ist dieser Vorgang irreversibel. 9. Betäubung eines Nerven mit Äther Einleitung: In diesem Versuch wird der Nerv mit Äther betäubt und dessen Auswirkungen beobachtet. Dabei sollte irgendwann kein messbares SAP auf den Oszilloskopen erkennbar sein. Material und Methoden: Es wird nun zwischen der Abdeckplatte und der Kammer ein mit Äther getränktes Filterpapier zwischen gelegt. Anschließend wird er bei gleichbleibender Reizstärke in Abständen von 10 s mit Einzelreizen gereizt, solange bis kein SAP mehr ausgelöst wird, der Nerv also vollständig betäubt ist. Ergebnisse Abbildung 40: Beginn und Anfangsintervalle der Messung der SAPs bei einem konstanten Reiz von 2V Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Abbildung 41: weitere SAPs zu späteren Zeitpunkten des Versuchs Zur Auswertung der Ergebnisse wurde ein Diagramm der SAP-Amplitude als Funktion der Zeit vor (Punkt mit dem x-Wert 0) und während der Ätherwirkung erstellt. Tabelle 6: Auswertung der SAP-Ausdrücke Zeit [s] Amp [mV] 0 1500 10 1150 20 1000 30 900 40 750 50 650 60 600 70 450 80 400 Abbildung 42: SAP-Amplitude über einen Zeitraum von 100s 90 350 100 300 110 250 Tierphysiologie Praktikum für Bioinformatiker | Nervenphysiologie 2008 Diskussion In der Abbildung 43 wird, was bereits in den Oszilloskop-Ausdrucken zu sehen ist, deutlich, dass die Amplitude eines monophasischen SAPs unter Äthereinwirkung rasch abnimmt. Ab 100 s nach der Ätherapplikation kann man nur noch das Reizartefakt aber kein SAP mehr erkennen. Diese Wirkung beruht auf einer Abnahme der Membranflexibilität durch Ablagerung der Äthermoleküle in der Membran. Dadurch können sich die Na+-Kanäle nicht mehr alle öffnen (der Platz ist einfach nicht mehr vorhanden) und die einzelnen APs fallen nach und nach aus, was zur langsamen Abnahme der SAP-Amplitude führt. Mit fortschreitender Zeit können sich immer weniger Na+-Kanäle öffnen bis sich gar keine mehr öffnen können, dann ist der Zeitpunkt der vollständigen Betäubung erreicht. In diesem Versuch wurde dieser Zeitpunkt nach ca. 2 Minuten erreicht. 10. Quellenangaben [1] Original von LadyofHats, 2007-09-10 [2] Robert F. Schmidt, Gerhard Thews, Florian Lang (Hrsg.): Physiologie des Menschen. 28. Aufl. Springer, Berlin 2000 (Springer-Lehrbuch) ISBN 3-540-66733-4 . [3]Hartmut Scholbach: Vita Nova. 2.Aufl. C.C.Buchners Verlag, Bamberg 2002 ISBN 3-7661-3323-3 [4]Nernstgleichung Verweis noch suchen hab nur Wiki und da steht nichts [5] Goldman, D. E. (1943): Potential, impedance, and rectification in membranes. Journal of General Physiology 27:37-60 [6] http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:Aktionspotential.svg [7] http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:Propagation_d%27un_potentiel_d%C3%A9cr%C3%A9mentiel.svg [8] http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:Propagation_influx_nerveux_axone_my%C3%A9linis%C3%A9.svg [9] http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:Synapse2.svg [10] www.bestimmungsbuecher.de/staatsexamen/NERVEN.DOC
