1.1 Zellstämme Wi38 VA13E und F
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1.1 ZELLSTÄMME WI38 VA13E UND F 1.1.1 FRAGESTELLUNG Der Zellstamm Wi38 VA13F ist eine SV40-transformierte Zellinie und ist wie fast alle SV40transformierten Zellinien durch das Vorhandensein großer p53-Mengen gekennzeichnet (i). Das Interesse dieser Arbeit bestand u.a. darin, die Unterschiede bezüglich der p53-Menge bzw. des p53Nachweises bei diesen SV40-transformierten Zellinien zu untersuchen. Weiterhin diente der veränderte Zellstamm Wi38 VA13E im Vergleich zum Ursprungsstamm Wi38 VA13F als interessantes Untersuchungsobjekt im Hinblick auf den Einfluß des p53-Proteins auf die Zellzyklusregulation. 1.1.2 ERGEBNISSE DER WI38 VA13 ZELLSTÄMME 1.1.2.1 Mikroskopisches Erscheinungsbild Die folgenden Abbildungen geben die mikroskopische Erscheinung der beiden Wi38 VA13 Zellstämme wieder. Abbildung 1: Zellstamm Wi38 VA13 E - 400-fache Vergrößerung. Abbildung 2: Zellstamm Wi38 VA13 F - 400-fache Vergrößerung. Das mikroskopische Aussehen der beiden Zellstämme unterscheidet sich sehr deutlich. Die Zellen der Zellinie Wi38 VA13E sind kleiner und zeigen eine schlankere Form. Dagegen sind die Zellen der Zellinie Wi38 VA13F deutlich größer als die Zellen der Zellinie Wi38 VA13E und sind zudem durch das Vorhandensein einer, häufig bei Zellkulturen auftretenden „Spiegeleierform“ gekennzeichnet. Wi38 VA13E-Zellen zeichneten sich, im Gegensatz zu den Wi38 VA13F-Zellen, durch eine verringerte Fähigkeit zur Adhärenz, insbesondere an die Polystyroloberfläche der Zellkulturflaschen aus. Die höhere Fähigkeit zur Adhärenz der Zellinie Wi38 VA13F wurde auch durch die vermehrte Zellaggregation der Einzelzellen in der Einzelzellsuspension deutlich. Ein weiterer Unterschied der beiden Zellstämme wurde bei der Akzeptanz verschiedener Serumkonzentrationen im Zellkulturmedium festgestellt. Wi38 VA3E-Zellen wuchsen verhältnismäßig schlecht bei einer Serumkonzentration von 0,5% FKS im Medium und schienen somit einen höheren Bedarf an Serumbestandteilen zu haben. Das schlechtere Wachstum zeigte sich in Form eines hohen Anteils abgelöster Zellen und durch das schlechte Aussehen der Zellen (Schrumpfung des Zytoplasmas und des Zellkerns). Dagegen konnte bei einer Serumkonzentration von 1% FKS, dieses, zum normalen Ausehen deutlich veränderte Aussehen, nicht mehr beobachtet werden. Die Zellen des Zellstamms Wi38 VA13F wiesen im Zellpellet nach Trysinisierung eine weißlich beige Färbung auf, dagegen waren die Zellen des Zellstamms Wi38 VA13E im Zellpellet braun gefärbt. Diese Braunfärbung ist vermutlich auf einen größeren Anteil an Pigmenten zurückzuführen. 1.1.2.2 Zytometrie Mittels einer durchflußzytometrischen DNA-Messung wurde der DNA-Gehalt der beiden Wi38 VA13 Zellstämme einer 24 Stunden Kultur bestimmt und als DNA-Histogramm dargestellt. Die Aufnahme und Analyse mit Hilfe des Datenverarbeitungsprograms „AHRENS ACAS System“ erbrachte folgende Resultate. (Abbildung 38 und 39; Tabelle 7) Abbildung 3: DNA-Histogramm des Zellstamms Wi38 VA13E nach einer 24 Stunden Kultur. 3,04c Abbildung 4: DNA-Histogramm des Zellstamms Wi38 VA13F nach 24 Stunden Kultur. Die zytometrischen Daten, die für die beiden Zellstämme nach einer 24 Stunden Kultur und nach erfolgter Analyse erhalten wurden, sind in folgender Tabelle dargestellt. Zellstamm Wi38 VA13E Wi38 VA13F Ploidie [c] 3,04 3,36 G1/G0-Phase Zellen [%] 38,8 53,6 S-Phase Zellen [%] 42,2 25,8 G2/M-Phase Zellen [%] 19,0 20,6 Tabelle 1: Zytometrische Daten der beiden Wi38 VA13 Zellstämme E und F nach einer 24 Stunden Kultur und einer durchflußzytometrischen DNA-Bestimmung. Der Zellstamm Wi38 VA13F hat eine um den Faktor 1,1 größere Ploidie. Der Anteil der G 1/G0-Phase Zellen ist beim Zellstamm Wi38 VA13E um den Faktor 1,3 kleiner. Dagegen ist der Anteil der SPhase Zellen beim Zellstamm Wi38 VA13E um den Faktor 1,6 größer. Der Anteil der G2/M-Phase Zellen ist bei beiden Zellstämmen etwa gleich. 1.1.2.3 Zellkinetik Das Wachstumsverhalten der beiden Zellstämme ist in folgendem Diagramm in Form von Wachstumskurven dargestellt. Wachstumskurve Zellstämme Wi38 Va13 1,0E+07 Wi38 VA13E log Zellzahl Wi38 VA13F 1,0E+06 1,0E+05 0 24 48 72 96 120 144 168 Zeit [h] Abbildung 5: Wachstumskurven der Zellstämme Wi38 VA13 E und F. Das Wachstumsverhalten der beiden Zellstämme unterscheidet sich sehr deutlich. Der Zellstamm Wi38 VA13E erbringt für den Beobachtungszeitraum einen deutlich höheren Zuwachs an Zellzahlen. Die Unterschiede in der Zellzahl werden, ausgehend von der Phase des exponentiellen Wachstums bis hinein in die Plateauphase, zunehmend größer. Die Zellzyklusverteilung wurde bei beiden Zellstämmen ebenfalls für den Zeitraum 24 bis 168 Stunden untersucht und ist nachfolgend in den beiden Diagrammen dargestellt (Abbildung 40 und 41). Die prozentualen Anteile der Zellzyklusphasen konnten, nach einer Markierung der Zellen mit Bromdesoxyuridin (S-Phase Zellen) und Propidiumjodid (G1/G0-Phase Zellen und G2/M-Phase Zellen), durchflußzytometrisch analysiert werden. Zellzyklusverteilung bei Wi38 VA13E 100 Zellzyklusphase [%] 80 60 40 20 0 24 48 72 96 120 144 168 Zeit [h] S G1/G0 G2/M S0 Abbildung 6: Zellzyklusverteilung des Zellstamms Wi38 VA13E über den Zeitraum 24 bis 168 Stunden (24 Stunden Intervalle) nach einer Markierung mit Bromdesoxyuridin und Propidiumjodid. Zellzyklusverteilung bei Wi38 VA13F 100 Zellzyklusphase [%] 80 60 40 20 0 24 48 72 96 120 144 168 Zeit [h] S G1/G0 G2/M S0 Abbildung 7: Zellzyklusverteilung des Zellstamms Wi38 VA13F über den Zeitraum 24 bis 168 Stunden (24 Stunden Intervalle) nach einer Markierung mit Bromdesoxyuridin und Propidiumjodid. Das schwächere bzw. langsamere Wachstum des Zellstamms Wi38 VA13F wird ebenfalls bei dieser Analyse deutlich. Der prozentuale Anteil der S-Phase Zellen der Zellinie Wi38 VA13E ist über den gesamten Beobachtungszeitraum größer als bei der Zellinie Wi38 VA13F. Entsprechend umgekehrt verhält es sich mit dem Anteil der G1/G0-Phase Zellen. Die G1/G0-Phase Zellen des Zellstamms Wi38 VA13F erreichen im gesamten Beobachtungszeitraum höhere prozentuale Werte als die G1/G0-Phase Zellen des Zellstamms Wi38 VA13F. 1.1.2.4 Normale p53-Menge Die normale (konstitutive) p53-Menge wurde nach einer 24 Stunden Kultur bei den Zellstämmen Wi38 VA13 E und F mit Hilfe der Durchflußzytometrie, des „Western blottings“ und der Fluoreszenzmikroskopie analysiert. 1.1.2.4.1 Durchflußzytometrie Das folgende Digramm gibt die p53-Fluoreszenzindizes, die für die Zellstämme Wi38 VA13 E und F nach Inkubation mit vier verschiedenen p53-Antikörpern bestimmt wurden, wieder. Die Analyse erfolgte an Zellen einer 24 Stunden Kultur. p53 Fluoreszenzindizes - Wi38 VA13 -Zellstämme 28 Wi38 VA13E Wi38 VA13F Fluoreszenzindex 22,11 22,28 21 14 7,89 5,95 7 4,86 3,37 0,78 0,56 0 PAb421 PAb1801 PAb240 Antikörper - clone Do-1 Abbildung 8: p53-Fluoreszenzindizes bei den beiden Wi38 VA13 Zellstämmen. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von den Mittelwerten. Alle Fluoreszenzindizes sind stets größer als 0,5 und stellen somit einen positiven p53-Nachweis wieder dar. Bis auf den Antikörper PAb240 werden beim Vergleich der beiden Stämme jeweils höhere Fluoreszenzindizes für den Zellstamm Wi38 VA13F erhalten. Die Unterschiede belaufen sich auf das 14,1-fache beim Antikörper PAb421, das 3,7-fache beim Antikörper PAb420 und das 28,6-fache beim Antikörper Do-1. Eine statistischer Vergleich der Fluoreszenzindizes der einzelnen p53-Antiköper wurde mit Hilfe des Student t-Tests durchgeführt. Die ermittelten p-Werte sind in folgenden Tabellen dargestellt. P-Werte kleiner als 0,05 (5% Signifikanzniveau) sind grau unterlegt. Zellstamm Antikörper PAb421 PAb421 0,0413 Wi38 VA13E Wi38 VA13F PAb1801 PAb1801 PAb240 Do-1 0,0014 PAb240 0,2090 Do-1 p<0,001 Tabelle 2: P-Werte für den Vergleich verschiedener p53-Fluoreszenzindizes von p53-Antikörpern bei den Wi38 VA13 Zellstämmen. 1.1.2.4.2 „Western blot“ Das p53-Protein wurde mit Hilfe des „Western blots“ beim Zellstamm Wi38 VA13F untersucht. Die Induktion des p53-Protein ist in einem „Western blot“ Experiment mit den Antikörpern PAb240 und Do-1 dargestellt. Die Inkubationen erfolgten jeweils mit einem unspezifischen Negativ-Antikörper (Kontroll-Antikörper) und einem spezifischen p53-Antikörper. Im Folgenden ist zuerst ein „Western blot“, inkubiert mit dem p53-Antikörper PAb240, dargestellt. Daran anschließend ist ein „Western blot“ aufgeführt, der mit dem p53-Antikörper Do-1 inkubiert wurde. Für diese Analyse wurden Zellen einer 24 Stunden Kultur benutzt. Wi38 VA13F Negativ-Antikörper p53-Antikörper PAb240 20µ 40µ 20µ 40µ l l l l 20µl 40µl 20µl 40µl 66 46 30 21,5 14,3 Abbildung 9: „Western blot“ des Zellstamms Wi38 VA13F inkubiert mit einem Kontroll-Antikörper und dem p53-Antikörper PAb240 (24h Kultur). Es wurden pro Zellinie und Antikörper jeweils 20 und 40 µl aus einem 500 µl Zelllysatansatz aufgetragen. Wi38 VA13F Negativ-Antikörper p53-Antikörper - Do-1 20µ 40µ 20µ 40µl 20µl 40µ 20µl 40µl l l l l 66 46 30 21,5 14,3 Abbildung 10: „Western blot“ des Zellstamms Wi38 VA13F inkubiert mit einem Kontroll-Antikörper und dem p53-Antikörper Do-1 (24h Kultur). Es wurden pro Zellinie und Antikörper jeweils 20 und 40 µl aus einem 500µl Zelllysatansatz aufgetragen. Die Berechnung der Fluoreszenzindizes der „Western blots“ der Inkubation mit dem Antikörper PAb240 und Do-1 erfolgte nach einer densitometrischen Bestimmung der einzelnen Banden im Bereich 53kD. Die Fluoreszenzindizes sind in folgendem Diagramm dargestellt. p53 Fluoreszenzindizes - "Western Blot" - Wi38 VA13F 3,66 2,35 Fluoreszenzindex 4,0 2,58 3,0 1,36 2,0 40µl Volumen Zellysat 1,0 20µl 0,0 Do-1 PAb240 Antikörper Abbildung 11: p53-Fluoreszenzindizes des Zellstamms Wi38 VA13F aus einem „Western blot“ Experiment mit den p53-Antikörpern Pab240 und Do-1 (24h Kultur). Dieses Ergebnis zeigt, daß die p53-Fluoreszenzindizes für den Zellstamm Wi38 VA13F mit den Antikörpern PAb240 und Do-1 bei diesen „Western blots“ alle größer als 0,5 sind und somit für einen positiven p53-Nachweis stehen. Die Fluoreszenzindizes, die aus der Inkubation mit dem Antikörper PAb240 resultieren, sind um den Faktor 1,9 (20 µl Zellysatvolumen) und 1,6 (40 µl Zellysatvolumen) größer als die p53-Fluoreszenzindizes der Inkubation mit dem p53-Antikörper Do-1. Dieses „Western blot“ Experiment zeigt, daß mit dem p53-Antikörper PAb240 ein besserer p53-Nachweis beim Zellstamm Wi38 VA13F erbracht werden kann, als mit dem p53-Antikörper Do-1. 1.1.2.4.3 Fluoreszenzmikroskopie Bei der Zellinie Wi38 VA13F wurde ebenfalls mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie das p53-Protein nach einer 24 Stunden Kultur untersucht. Zellen des Stamms Wi38 VA13F wurden mit den p53Antikörpern PAb240 und Do-1 inkubiert. Das folgende Bildpaar zeigt die Fotografien, die nach der Inkubation mit dem spezifischen Antikörper PAb240 bzw. seinem Kontroll-Antikörper erhalten wurden. Das daran anschließende Bildpaar gibt die Fotografien wieder, die nach der Inkubation mit dem spezifischen Antikörper Do-1 und seinem Kontroll-Antikörper aufgenommen wurden. Abbildung 12: Immunfluoreszenz mit einem Kontroll-Antikörper IgG1 (links) und mit dem p53Antikörper PAb240 (rechts) bei der Zellinie Wi38 VA13F - 400-fache Vergrößerung. Unspezifische Fluoreszenz in den Zellen im linken Bild. Spezifische Fluoreszenz in den Zellen im rechten Bild. Abbildung 13: Immunfluoreszenz mit einem Kontroll-Antikörper IgG2A (links) und mit dem p53Antikörper Do-1 (rechts) bei der Zellinie Wi38 VA13F - 400-fache Vergrößerung. Unspezifische Fluoreszenz in den Zellen im linken Bild. Spezifische Fluoreszenz in den Zellkernen der Zellen im rechten Bild. Das erste Bildpaar zeigt keinen deutlichen Unterschied zwischen der Inkubation des spezifischen Antikörpers PAb240 und seinem unspezifischen Antikörper. Bei der Inkubation mit dem spezifischen Antikörper PAb240 ist lediglich eine sehr schwache Grünfluoreszenz zu erkennen. Im Gegensatz dazu zeigt die Inkubation mit dem Antikörper Do-1 eine sehr starke Grünfluoreszenz, die sich in erheblichem Maß von der unspezifischen Fluoreszenz der entsprechenden Inkubation mit dem unspezifischen Antikörper unterscheidet. Diese ausgeprägte Grünfluoreszenz ist vor allem über dem Zellkern zu sehen. 1.1.2.5 Nachweis des großen T-Antigens Der Nachweis des großen T-Antigens mit Hilfe der Durchflußzytometrie sollte zum einen klären, ob dieses in den Wi38 VA13 Zellstämmen vorhanden ist. Zum anderen hatten diese Untersuchungen zum Ziel den Nachweis des großen T-Antigen, mit dem Hintergrund, daß das Vorhandensein des großen TAntigens bei vielen SV40-transformierten Zellen bereits beschrieben wurde, zu vergleichen. Großes T-Antigen-Menge 17,37 18 Fluoreszenzindex [Fi] 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 Wi38 VA13E Wi38 VA13F Abbildung 14: Große T-Antigen- Fluoreszenzindizes bei den Wi38 VA13 Zellstämmen. Diese Ergebnisse zeigen, daß bei dem Zellstamm Wi38 VA13E kein Nachweis des großen T-Antigens möglich ist. Dagegen konnte eine extrem große Menge des großen T-Antigens (großer Fluoreszenzindex) beim Zellstamm Wi38 VA13F nachgewiesen werden. 1.1.2.6 Strahlensensitivität der Wi38 VA13 Zellstämme Die Strahlensensitivität der beiden Zellstämme wurde mit Hilfe des Koloniebildungstests analysiert. Die Dosiswirkungskurven mit einem Dosisbereich von 0 bis 8Gy sind in folgendem Diagramm gezeigt. Dosiswirkungskurve Wi38 VA13 Stämme Überlebensfraktion [%] 100 10 Wi38 VA13 E Wi38 VA13F 1 0 2 4 6 8 Dosis [Gy] Abbildung 15: Zelluläres Überleben in Abhängigkeit von der Dosis (Röntgenstrahlung) der beiden Zellstämme Wi38 VA13 E und F. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von den Mittelwerten. Die Strahlensensitivität der beiden Wi38 VA13 Stämme ist unterschiedlich. Der Zellstamm Wi38 VA13F zeigt eine höhere Strahlensensitivität. Ferner zeichnet sich die Überlebenskurve des Zellstamms Wi38 VA13E, im Gegensatz zur Überlebenskurve des Zellstamms Wi38 VA13F, durch das Vorhandensein einer Schulter im niedrigen Dosisbereich aus. 1.1.2.7 Zellzyklusverteilung Die Versuche mit niedrigen Serumkonzentrationen (Mangelmedium-Versuche) und anschließender Bestrahlung mit 4Gy Röntgenstrahlen dienten dazu, die Fähigkeit der beiden Zellstämme zur Zellzyklusblockierung zu untersuchen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist in den folgenden Graphen auf das Einfügen von Standardabweichungen an die Mittelwerte (aus drei unabhängigen Versuchen) verzichtet worden. Es werden zuerst in Abbildung 50 die prozentualen Anteile der G1/G0-Phase Zellen und anschließend in Abbildung 51 der Anteil der S-Phase Zellen der beiden Zellstämme graphisch dargestellt. G1/G0-Phase Zellen bei den Wi38 VA13 Zellstämmen 70 G1/G0-Phase Zellen [%] 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 Wi38 VA13E 8 10 12 14 16 18 20 22 Zeit nach Mangelmedium und Bestrahlung [h] Wi38 VA13E - 4Gy Wi38 VA13F 24 26 28 30 Wi38 VA13F - 4Gy Abbildung 16: Prozentuale Anteile der G1/G0-Phase Zellen der beiden Wi38 VA13 Zellstämme nach Mangelmedium und Bestrahlung. Der zuvor abgebildete Graph gibt zum einen wieder, daß der Anteil der Zellen in der G 1/G0-Phase beim Zellstamm Wi38 VA13E deutlich größer ist als beim Zellstamm Wi38 VA13F. Die Zellen des Zellstamms Wi38 VA13F treten durch die Mangelmedium Behandlung nicht in die Ruhephase ein (niedriger Prozentsatz G1/G0-Phase Zellen). Zum anderen führt eine Bestrahlung mit 4Gy Röntgenstrahlen beim Zellstamm Wi38 VA13E zu einem um 2 Stunden verzögerten Eintritt in die SPhase. Diese strahlenbedingte Verzögerung des Eintritts der Zellen in die S-Phase (G1-Block) wird auch im folgenden Graph, der den prozentualen Anteil der S-Phase Zellen darstellt, deutlich. S-Phase Zellen bei den Wi38 VA13 Zellstämmen 70 60 S-Phase Zellen [%] 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Zeit nach Mangelmedium und Bestrahlung [h] Wi38 VA13E Wi38 VA13 E - 4Gy Wi38 VA13F Wi38 VA13F - 4Gy Abbildung 17: Prozentuale Anteile der S-Phase Zellen der beiden Wi38 VA13 Zellstämme nach Mangelmedium und Bestrahlung. Die Zellen des Zellstamms Wi38 VA13F sind im Vergleich zum Zellstamm Wi38 VA13E über den ganzen Beobachtungszeitraum zu einem größeren Prozentsatz in der S-Phase. Weiterhin läßt sich festhalten, daß die Bestrahlung beim Zellstamm Wi38 VA13F über den ganzen Beobachtungszeitraum zu einer Reduzierung des prozentualen S-Phase Anteils, sowie ab 10 Stunden zu einer Reduzierung des prozentualen G1/G0-Phase Anteils (siehe Abbildung 50), führt. 1.1.3 DISKUSSION Eine Stabilisierung bzw. eine Verlängerung der Halbwertzeit des p53-Wildtypproteins kann nicht nur durch eine Reihe verschiedener zellulärer Faktoren oder durch DNA-Schäden erreicht werden, sondern kann auch durch die Interaktion mit viralen Proteinen zustande kommen. Die Erhöhung der p53-Menge (bzw. des nachgewiesenen Proteins) wird unter anderem durch die Interaktion mit dem großen T-Antigen des DNA-Virus SV40 erreicht. Viele Autoren schrieben und schreiben dieser Interaktion des p53-Proteins mit dem großen T-Antigen eine funktionelle Inaktivierung des p53 zu (ii, iii). Der Zusammenhang zwischen p53-Menge und der Menge des großen T-Antigens (bzw. deren Nachweisbarkeit) wurde von Laffin et al. (1989) dokumentiert (iv). Halevy et al. (1989) deuten ihre Ergebnisse allerdings so, daß die Komplexbildung mit dem großen T-Antigen das p53 nicht direkt stabilisiert (v). Deppert und Steinmayer (1989) vermuten sogar, daß die Stabilisierung des p53 in SV40-transformierten Zellen unabhängig von der Komplexbildung ist (vi). Auch sollte in diesem Zusammenhang nicht unerwähnt bleiben, daß einige nicht transformierte Zellinien eine erhöhte p53-Expression im Vergleich zu transformierten Zellinien zeigen (vii). Von erheblicher Bedeutung für die zellulären Mechanismen SV40-transformierter Zellen scheint die Tatsache zu sei, daß neben der komplexierten p53-Form noch eine zweite nicht komplexierte („freie“), ebenfalls stabile Form, existiert. (viii, ix). Auch die hier vorgestellten Ergebnisse sprechen für diesen Befund. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß die Qualität des Nachweises des p53-Proteins vom verwendeten Antikörper abhängt. Die Kombination der beiden Antikörper PAb240 und Do-1 ermöglicht nicht nur bei den Tumorzellinien mit mutiertem p53-Protein und p53-Wildtypprotein (s.o.), sondern auch bei SV40-transformierten Zellinien eine differenziertere Aussage über das p53-Protein. Die Informationen zu der Spezifität des Antikörpers PAb240 sind, wie auch schon in den Abschnitten 3.1.3 und 3.2.3 erwähnt sehr unterschiedlich. Einige Autoren behaupten, daß der Antikörper PAb240 unter bestimmten Bedingungen eine selektive Spezifität für verschiedene Mutanten besitzt. Außerdem scheint der p53-Antikörper PAb240 für einige Methoden besser und für andere weniger gut geeignet zu sein, wie schon in den vorangegangenen Teilen dieser Arbeit gezeigt werden konnte. Beim „Western blot“ zum Beispiel kann der Antikörper PAb240 mit mutiertem p53 und p53-Wildtypprotein reagieren. Gannon et al. (1990) vermuten, daß der Antikörper PAb240 sein Epitop in verschiedenen Konformationen und sogar nach Denaturierung oder auch im Falle von Mutationen erkennt (x). Der monoklonale Antikörper Do-1 erkennt das p53-Protein zwischen den Aminosäuren 21 und 25 am aminoterminalen Ende des Proteins. Die Firma Oncogene Science schlägt im Falle dieses Antikörpers eine Spezifität des Antikörpers für mutiertes und Wildtypprotein vor. Andere Autoren erwähnen eine Reaktion des Antikörper Do-1 mit einer denaturierungsstabilen Determinante des p53-Proteins (xi). Die Anwendung des Antikörpers Do-1 erbrachte extrem niedrige Fluoreszenzindizes für den Zellstamm Wi38 VA13E und 28-fach höhere Fluoreszenzindizes für den Zellstamm Wi38 VA13F. Diese Ergebnisse stehen im starken Kontrast zu den niedrigen Fluoreszenzindizes die mit dem Antikörper PAb240 für die beiden Zellstämme erhalten wurden. Diese p53-Antikörperreaktivitäten, sowie die Tatsache, daß beim Zellstamm Wi38 VA13F ebenfalls eine hohe Menge des großen TAntigens nachgewiesen werden konnte, steht im Einklang mit Ergebnissen einer Arbeit von Schmieg und Simmons (1993). Diese Arbeit beschreibt einen Zusammenhang zwischen geringer PAb240 Antikörperreaktivität und großer T-Antigen-Nachweisbarkeit (xii). Der Umstand, daß beide Zellstämme ungefähr gleiche Mengen an p53-Protein besitzen, nachgewiesen mit dem Antikörper PAb240, läßt zunächst vermuten, daß eine „Promotorfunktion“, deren Erkennung dem Antikörper PAb240 zugeschrieben wird, bei beiden Zellstämmen gleich hoch ist. Die Tatsache, daß der Zellstamm Wi38 VA13F zusätzlich einen starken p53-Nachweis mit dem Antikörper Do-1 zeigt, könnte dann so gedeutet werden, daß dieses, mit dem Do-1 Antikörper nachgewiesene p53-Protein die geringere Menge des p53-Proteins, das mit dem Antikörper PAb240 erkannt wird und dessen „Promotorfunktion“, überdeckt. Somit wäre eine „Promotorfunktion“ des p53-Proteins im Zellstamm Wi38 VA13E erklärbar, welche nicht durch eine andere Form des p53-Proteins, nachgewiesen durch den Antikörper Do-1, negativ beeinflußt wird. Diese mögliche Promotorfunktion des p53 im Zellstamm Wi38 VA13E wird durch die Ergebnisse, die bei der Analyse des Wachstumsverhaltens erhalten wurden, unterstützt. Der Zellstamm Wi38 VA13E zeigt einen höheren Anteil an S-Phase Zellen (Abb. 46) und erbringt deutlich höhere Zelldichten in der exponentiellen Wachstumsphase sowie in der Plateauphase (Abb. 45). Von besonderem Interesse bleibt weiterhin die Frage nach der Form des nachgewiesenen p53-Proteins. Vor allem scheint interessant zu sein, ob komplexiertes oder freies p53 oder beide Formen in diesen beiden SV40transformierten Zellstämmen mit den beiden Antikörpern nachgewiesen werden können. Die relative Menge von freiem oder komplexiertem p53 wird durch die p53- und die große T-AntigenKonzentration bestimmt (xiii). Kuhar und Lehman (1991) finden, daß 50% des großen T-Antigens im Komplex mit p53 in SV40-transformierten Fibroblasten vorliegt (xiv). Lehman et al. (1996) dokumentieren in einer späteren Arbeit, daß die Mehrheit des p53 mit dem großen T-Antigen komplexiert ist (xv). Andererseits zeigt eine Arbeit von Ozer et al. (1996) in Wi38 VA13 Zellen, die wahrscheinlich identisch sind mit dem hier verwendeten Zellstamm Wi38 VA13F, daß 70% des p53-Proteins frei sind und nur 30% mit dem großen T-Antigen komplexiert sind (xvi). Das freie p53-Protein scheint in diesen Zellen metabolisch stabil zu sein (vi), wohingegen in normalen Zellen die Halbwertzeit des freien p53 geringer zu sein scheint und der daraus resultierende Nachweis sich schwieriger gestalten kann (xvii). Der Grund für diesen Unterschied ist bisher noch nicht bekannt. Es besteht die Möglichkeit, daß der Antikörper PAb240 nur nicht-komplexiertes freies p53 erkennt (xii). Dies wäre verständlich angesichts der Tatsache, daß die Bindungsorte des Antikörpers PAb240 und des großen T-Antigens auf dem p53-Protein sehr nahe beieinander liegen. Der Antikörper PAb240 bindet im Bereich der Aminosäuren 212 bis 217 und das große T-Antigen im Bereich der Aminosäuren 100 bis 200. Eine Arbeit von Jaquemier et al. (1994) erwähnen die Möglichkeit, daß die Präsenz des großen T-Antigens die Konformation des p53 ändern kann und daß dieses durch den Antikörper PAb240 erkannt werden kann (xviii). Dagegen behaupten Gannon et al. (1990), daß der Antikörper PAb240 p53 im Komplex mit dem großen T-Antigen nicht binden kann (x). Wenn tatsächlich nur das freie p53 durch den Antikörper PAb240 gebunden wird, so kann man zu dem Schluß kommen, daß die beiden Wi38 VA13 Zellstämme ähnliche Mengen an freiem p53 enthalten. Dagegen differieren sie jedoch in der durch den Antikörper Do-1 nachgewiesenen Gesamtmenge an p53. Da der Bindungsort für den Antikörper Do-1 am aminoterminalen Ende des Protein (Aminosäuren 21 bis 25) liegt, kann man in diesem Fall annehmen, daß jede Form des p53 (gebunden sowie frei) erkannt wird. Das unterschiedliche Verhalten der beiden Wi38 VA13 Zellstämme kann dann dem unterschiedlichen Gehalt an großem T-Antigen und großem T-Antigen p53-Komplexen zugeschrieben werden. Schließlich gilt es die Frage zu diskutieren, ob p53 entweder in einem funktionellen oder einem nichtfunktionellen Zustand vorliegt. In vielen Studien konnte gezeigt werden, daß p53 im Komplex mit dem großen T-Antigen, bedingt durch die Blockierung des DNA-sequenzspezifischen Bindungsortes durch das große T-Antigen, funktionell inaktiviert ist (xix). In der Proteinkonformation, welche durch den Antikörper PAb240 erkannt wird, scheint das p53-Protein funktionell aktiv zu sein, so daß die Fähigkeit zur Bindung des p53 durch den Antikörper PAb240 mit einer verhinderten Tumorsuppressoraktivität bzw. mit einer aktiven Zellproliferation gleichzusetzen ist (siehe oben „Promotorfunktion“) (xx). Auch sollte nicht unerwähnt bleiben, daß schon Milner in einer Arbeit von 1991 dem Antikörper PAb240 die Erkennung eines Wildtypproteins zuschreibt, welches als „Promotor“ der Proliferation fungiert. (xxi). Es scheint auch in diesen SV40-transformierten Zellen die Möglichkeit zu bestehen, daß mit dem positiven Nachweis des p53-Wildtypproteins durch den Antikörper PAb240 eine „Promotorfunktion“ des p53-Proteins identifiziert werden kann. Wenn die bisher gemachten Überlegungen richtig sind, das heißt, wenn die beiden Zellstämme ähnliche Mengen an funktionellem freien p53 besitzen, dann sollte man erwarten, daß beide Zellstämme vergleichbare Reaktionen nach einer Bestrahlung zeigen. Insbesondere sollten die Veränderungen in der Zellzyklusregulation nach Bestrahlung ähnlich sein. Die oben präsentierten Ergebnisse jedoch machen deutlich, daß die zwei Zellstämme sehr stark in ihren Proliferationsverhalten differieren. Für die Beobachtungen gibt es wenigstens drei Erklärungen: 1) Die Annahme, daß der Antikörper PAb240 nur freies p53-Protein erkennt, könnte falsch sein. Wenn zumindest ein Teil des komplexierten Proteins ebenfalls durch den Antiköper gebunden würde, wäre die Ähnlichkeit der Resultate für die beiden Zellstämme lediglich zufällig. Zieht man die „Western blot“ Analyse, die unter Konditionen stattfindet, bei denen der Komplex zerstört wird, als einen Weg zur Klärung der Frage heran, so kommt man leider aufgrund der geringeren Spezifität des Antikörpers PAb240 bei dieser Methode zu keiner eindeutigen Antwort. Die Erklärung scheint allerdings insgesamt weniger befriedigend für die beobachteten Ergebnisse zu sein, weil die Hinweise auf die spezifische Bindung des Antikörpers PAb240 sehr stark sind. 2) Die Voraussetzung, daß komplexiertes p53 immer funktionell inaktiv ist, könnte falsch sein. Dieses scheint unwahrscheinlich im Hinblick auf das bereits erwähnte Überlappen der Bindungsorte für die DNA und das große T-Antigen auf dem p53-Protein. Dabei sollte aber nicht eine Arbeit von Long et al. (1995) außer Acht gelassen werden, welche eine DNA-Bindungsfähigkeit des komplexierten p53Proteins dokumentiert (xxii). 3) Es könnten indirekte Effekte des komplexierten p53 sowohl auf die Funktion des freien Proteins als auch auf seine Induzierbarkeit nach Bestrahlung eine Rolle spielen. In diesem Zusammenhang ist eine Arbeit von Bedeutung, welche eine Induzierbarkeit des p53Proteins nach DNA-Schädigung in SV40-transformierten Zellen zum Inhalt hat (xxiii). In dieser Arbeit konnte zum einen gezeigt werden, daß p53 eine wildtyp-typische Akkumulation im Zellkern zeigt und das zum anderen neben der stabilen komplexierten Form (mit dem großen TAntigen) noch eine zweite nicht-komplexiert, ebenfalls stabilisierte, Form des p53-Proteins im Zellkern vorliegt. Die Frage, ob die nicht-komplexierte und oder die komplexierte Form des p53 nach DNA-Schädigung aktiviert wird, konnte auch in dieser Arbeit nicht geklärt werden. Immerhin ist interessant, daß das komplexierte p53-Protein noch DNA-Bindungsaktivität zeigt, also nicht nur freies p53 sondern auch das komplexierte p53-Protein biologisch aktiv sein kann. Zusätzlich könnte die Interaktion mit anderen Proteinen am amino- oder carboxyterminalen Ende des p53-Proteins, an Regionen außerhalb der große T-Antigen Bindungsstelle, von Belang sein. Auf diesem Wege wäre eine hohe Konzentration an komplexiertem p53-Protein von Bedeutung, welche über verschiedene Rückkopplungsmechanismen eingreifend einen Einfluß auf nachgeschaltete Effektorproteine des p53 ausüben könnte. Dabei kämen ebenso die posttranslationalen Modifikationen im Falle von DNA-Schäden in Betracht. Abschließend bleibt festzuhalten, daß möglicherweise eine parallele Funktionalität von komplexiertem und freiem p53-Protein in diesen SV40-transformierten Zellen vorliegt. Betrachtet man den Zusammenhang von p53-Protein mit dem G1-Block bei den zwei verschiedenen Wi38 VA13 Zellstämmen mit der Strahlensensitivität der beiden Zellstämme, so legen die oben dargestellten Ergebnisse einen direkten Einfluß nahe. Der Zellstamm Wi38 VA13E mit seiner geringen p53-Menge zeigt eine G1-Phase Verzögerung (Abb. 58) und ist weniger strahlensensitiv als der Zellstamm Wi38 VA13F (Abb. 57), welcher keine Verzögerung in der G1-Phase zeigt. Sehr wahrscheinlich ist der modifizierte Zellstamm Wi38 VA13E vergleichbar mit dem originalen nicht-transformierten Zellstamm Wi38, welcher normales Wildtypprotein besitzt und eine G1-Phase Blockierung zeigt (xxiv). Wi38 Zellen werden durch Serumhungerung in der G0-Phase arretiert und treten nach Serumstimulation wieder in den Zellzyklus ein (xxv). Die Wi38 VA13F Zellen arretieren nicht in der G0/G1-Phase nach Serumhungerung. Der Grad der Ruhestellung bei Wi38 VA13 Zellen ist ebenfalls sehr niedrig und vermutlich identisch zu dem hier verwendeten Zellstamm Wi38 VA13F (xxvi). Über den Zusammenhang zwischen G1-Phase Verzögerung und Strahlensensitivität besteht weit weniger Einigkeit in der Literatur, als man es aufgrund der Basis des „guardian of the genome“ Konzepts erwarten würde. Eine Arbeit von Bristow et al. (1996) beschreibt, daß von 36 Arbeiten lediglich 3 Arbeiten eine gesteigerte Strahlensensitivität in p53-mutierten Zellinien zeigen und diese Zellinien zudem nicht zur G1-Phaseblockierung fähig sind (Error! Bookmark not defined.). Ebenso dokumentieren Bristow et al. (1996), daß in 6 von 9 Arbeiten mit komplexiertem p53-Protein eine reduzierte Strahlensensitivität (keine Arbeit mit einem Anstieg) gefunden wird. Zwischen diesen Ergebnissen und den hier präsentierten Daten besteht keine Übereinstimmung. Andererseits konnte von Yamagishi et al. gezeigt werden, daß humane resistente Zellinien nach der Zugabe von großem T-Antigen strahlensensibler wurden (xxvii). Diese Arbeit wiederum unterstützt die Verbindung zwischen Strahlenresistenz und Zellzyklusblockierung in der G1-Phase auf die gleiche Art und Weise wie die hier vorgestellten Ergebnisse. Man kann zu dem Schluß kommen, daß nur aktives freies p53-Wildtypprotein mit dem Antikörper PAb240 in den beiden Zellstämmen nachweisbar ist, wohingegen auch komplexiertes Wildtypprotein mit dem Antikörper Do-1 im Zellstammn Wi38 VA13F erkannt werden kann. Das freie Wildtypprotein scheint verschiedene Funktionen in den zwei Zellstämmen auszuüben, indem es zu einem strahleninduzierten G1-Block und hoher Strahlenresistenz im Zellstamm Wi38 VA13E führt, nicht aber im Zellstamm Wi38 VA13F. i. Benchimol S., Pim D. und Crawford L. Radioimmunoassay of the cellular protein p53 in mouse and human cell lines. The EMBO Journal 1, 1055-1062, 1982 ii. 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