Biochemie: Kapitel 6: Erforschung der Gene

Biochemie, Kapitel 6
Isabelle Meyer
Biochemie: Kapitel 6: Erforschung der Gene
1.Fundament der Genforschung:
Restriktionsenzyme: Spalten lange DNA-Moleküle
DNA-Ligasen: verknüpfen Fragmente
2.Fundament:
Prinzip der Basenpaarung: Erkennung und Bindung komplementärer Sequenzen
Konstruktion neuer DNA-Kombinationen
Restriktionsenzymanalyse
Für: -Analyse der Chromosomenstruktur
-Sequenzierung langer DNA-Stücke
-Isolierung von Genen
-Erzeugung neuer DNA-Moleküle -> Klonierung
Restriktionsenzyme erkennen spezifische Sequenzen von 4-8 Basenpaaren; Spalten
Phosphodiesterbindung. Die Schnittstellen sind Palindrome (umgekehrte
Sequenzwiederholungen)
Bsp: 5’ C-C-G-C–G-G...
3’ G-G-C-G-C-C...
Trennen der Restriktionsfragmente
Mit Hilfe der Gelelektrophorese.
Sichtbar machen durch Southern-Blotting:
1) Fragmentgemisch wird mit Elektophorese aufgetrennt
2) Die Fragmente werden auf eine Nitrocellulosemembran überführt
3) Das gesuchte Fragment wird mit einer 32P-markierten Sonde hybridisiert
GAATTC gesucht
CTTAAG fluoreszierende Sonde (komplementär)
4) sichtbar machen im Autoradiogramm
(Nothern-Blotting: gleiche Methode, aber anstelle der DNA wird RNA verwendet)
6.1.3 Didesoxy-Methode
Herstellung von DNA-Fragmenten, deren Länge von der letzten Base in der Sequenz
anhängt (durch kontrollierten Abbruch der enzymatischen Replikation)
Sie wird an 4 Reaktionsgemischen gleichzeitig durchgeführt:
Bei allen 4 wird eine DNA-Polymerase zugesetzt:
-> synthetisiert die komplementäre Basenabfolge zu bestimmten Sequenzen
Das Inkubationsgemisch der 4 Reaktionsbehälter enthält:
-Die 4 Desoxyribonucleosidtriphosphate (A,T,G,C), die radioaktiv markiert sind
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-eine geringe Menge des 2’,3’-Didesoxyanalogs von einem Nucleosidtriphosphat (A
oder T oder G oder C); in jedem Ansatz ein anderes:
-> blockiert das weitere wachsen der Kette, da ein 3’-Hydroxylende fehlt, um
die nächste Phosphodiesterbindung zu knüpfen
Polymerase baut meistens das korrekte Nucleotid ein. Ab und zu wird ab und zu das
Analog eingebaut, was zum sofortigen Beenden der Reaktion führt.
Bsp: dATP (=verändertes A) überall wo im ursprünglichen Strang ein T steht, wird im
neu dazu synthetisierten Strang ein dATP eingesetzt und es kommt zum Abbruch.
Anschliessend werden die unterschiedlich langen Fragmente durch Gelelektrophorese
aufgetrennt.
Ziel:
Positionen von A,T,G,C können so in den bestimmten Sequenzen bestimmt werden.
6.1.4 Festphasensynthese (vgl Abb. 6.7)
Prinzip: automatisierte Synthese von DNA
Zur wachsenden Kette wird ein aktiviertes Monomer dazu gegeben.
Schutzgruppen: BCE, 5’-OH Gruppe des Monomers, DMT
1) Kopplung: 3’Phosphoratom wird unter Bildung eines Phosphodiesters an das
5’Sauerstoffatom der wachsenden Kette gebunden.
2) Oxidation durch I2, Phosphodiester (3 wertig) -> 5 wertig
3) Abspaltung der Schutzgruppen mit Dichloressigsäure
4) Reaktion kann wieder von vorne starten
- Peptidsynthese
6.1.5 Polymerasekettenreaktion (PCR) (vgl Abb. 6.8)
Für das vielfache Kopieren bestimmter Sequenzen
Zu einer Lösung mit der Zielsequenz werden zugegeben:
- Ein Primerpaar, dass mit den flankierenden Sequenzen hybridisiert
- A, T, G, C
- eine hitzestabile DNA-Polymerase
PCR-Zyklus:
1) Trennen der Stränge durch Erhitzen
2) Hybridisierung der Primer, durch schnelles Abkühlen der Lösung-> Primer
können mit jeweils einem Streng hybridisieren
3) DNA-Synthese: Erhitzen auf die optimale Temperatur der DNA-Polymerase
-> verlängert beide Primer Richtung Zielsequenz
4) Durch Erhitzen trennen sich die Stränge (die Vorlage und der neu dazu
synthetisierte Strang) wieder und die Reaktion kann von vorne beginnen
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6.1.6 PCR in der med.Diagnostik, Forensik und molekularen Evolution
Medizin: Mit spezifischen Primern lassen sich Bakterien und Viren nachweisen
- HIV bei Personen, bei denen noch keine Antikörper nachweisbar sind
- Bazillen der Art Myco-Bakterium in Gewebeproben
- Manche Arten von Krebs : Früherkennung
- Erfolg einer Chemotherapie kontrollieren
- Nachweis bestimmter Leukämien, die auf einer Umordnung
Chromosomen beruhen
Forensik/ Gerichtsmedizin: Das DNA-Profil eines Individuums
charakteristisch
- Organtransplantation
- Vaterschaftsfragen
- Kriminalistik (Blutflecken, Spermaproben, Haarwurzeln)
ist
der
sehr
Molekulare Evolution: DNA ist ein sehr stabiles Molekül (v.a. wenn sie vor Luft,
Licht und Wasser geschützt ist)
- PCR ist ein ideales Verfahren, um fossile DNA zu amplifizieren und
charakterisieren
- Mittels DNA aus Mikroorganismen können evolutionäre Beziehungen erstellt
werden
6.2.1 Restriktionsenzyme und DNA-Ligasen
Wie man neue DNA-Moleküle im Labor konstruiert:
Das interessierende DNA-Fragment wird kovalent an einen DNA-Vektor gebunden.
Dieser repliziert sich autonom im passenden Wirt.
Bsp: Plasmide (ringförmige DNA) und der Bakteriophag (Virus) sind die Vektoren
für die Klonierung von E.coli
1) Vektor wird an einer spezifischen Stelle mit einem Restriktionsenzym
aufgeschnitten. Es entstehen versetzte Schnittstellen mit komplementären
einsträngigen Enden (sog. Kohäsive Enden oder sticky Ends)
2) Das einzusetzende DNA-Fragment wird mit dem gleichen Restriktionsenzym
behandelt. Dadurch entstehen die gleichen kohäsiven Enden.
3) Plasmid und DNA-Fragment lagern sich aneinander -> DNA-Ligase verknüpft
die Basenpaare, in dem sie die Phosphodiester-Bindungen zwischen den zwei
DNA-Ketten katalysiert
Die Methode der DNA-Verknüpfung über kohäsive Enden ist mit Hilfe von DNALinkern („Verbindungsgliedern“) allgemein anwendbar: (vgl Abb. 6.12)
-
DNA-Linker wird mit den Enden eines Vektors oder eines DNA-Fragment
kovalent verknüpft -> Ligase stellt glatte Enden her
Angesetzte Enden werden mit Restriktionsenzym aufgeschnitten ->sticky
Ends
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6.2.2 Plasmide und einige Phagen
Plasmide:
- natürlich vorkommende, ringförmige doppelhelikale DNA-Moleküle
- 2 bis mehrere Hundert Kilobasen lang
- tragen Gene für Inaktivierung von Antibiotika, Produktion von Toxinen,
Abbau natürlicher Produkte
- sind zusätzliche Chromosomen und können unabhängig vom Wirtschromosom
replizieren
- sind entbehrlich
Plasmid pBR322: Gen für Resistenz gegen Tetracyclin und Ampicilin
Lambda(λ)-Phage:
1) λ-Phage schleust λ-DNA i Bakterium ein
2) Lytischer Zyklus:
- virale DNA und Proteine werden rasch produziert
- werden zu Viruspartikel verpackt -> Zerstörung der Wirtszelle und Freisetzug
ca. 100 neuer Viruspartikel
oder Lysogener Zyklus:
- Phagen-DNA fügt sich ins Genom der Wirtszelle ein
- Wird über viele Generationen hinweg repliziert
 ändert sich das Umfeld der Wirtszelle endet der lysogene Zyklus und geht
über in den lytischen Zyklus
Für wissenschaftliche Zwecke werden Phagen mutiert:
Ein Stück λ-DNA wird entfernt und durch ein gewünschtes Stück DNA ersetzt. Man
spricht von einem sog. Cosmid.
6.2.3 Genombibliothek / einzelne Gene spezifisch klonieren
Herstellung:
1) Eine Probe der gesamten Genom-DNA wird durch Restriktionsenzyme in
grosse Fragmente zerlegt
2) Durch Gelelektrophorese trennt man eine Gruppe von Fragmenten an die ca.
15 Kilobasen lang ist
3) Anbringen von Linkern, Erzeugen von kohäsive Enden durch
Restriktionsenzym
4) Anbauen an Vektoren (z.B: λ-Phagen)
5) Infizieren der E.coli Bakterien durch die Phagen
 Das resultierende Lysat enthält eine grosse Anzahl von Viruspartikeln, in
denen Fragmente der menschlichen DNA untergebracht sind. Sie stellen eine
Genombibliothek dar
Wie findet man ein bestimmtes Gen in der Genombibliothek?
1) Eine verdünnte Suspension der rekombinanten Phagen wird auf einem
Bakterienrasen gebracht -> 1 Phage infiziert je 1 Bakterium –> es entstehen je
eine Kolonie (=Plaque) aus identischen Phagen
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2) Durch Übertragen auf eine Nitrocellulosemembran fertigt an eine Kopie der
ursprünglichen Platte an
3) Die intakten Bakterien werden mit NaOH lysiert. NaOH denaturiert die DNA
4) Denaturierte DNA wird mit einer 32P-Sonde markiert (Je nachdem welches
Gen man sucht, werden andere Sonden verwendet)
5) Autoradiographie zeigt die Position des gesuchten Gens an
Wie kommt man zu den Sonden?
- Mit der entsprechenden mRNA aus solchen Zellen beginnen, die diese
reichlich enthält
- Man kann eine Gensonde herstellen, wenn ein Teil der Aminosäuresequenz
des Proteins bekannt ist, das von diesem Gen codiert wird.
Problem: Aminosäuren werden oft von mehreren Codons sequenziert
6.2.4 Chromosomenwanderung
Typische Genbibliothek in λ-Phagen-Vektoren bestehen aus DNA-Fragmenten, die ca.
15 kb lang sind. Viele Eukaryotengene sind aber deutlich länger (Bsp: DystrophinGen ca. 2000kb)
Wie kann man so lange DNA-Bereiche untersuchen?
- künstliche Bakterienchromosomen BAC
- künstliche Hefechromosomen YAC: (vgl Abb. 6.21)
enthalten:
- ein Centromer
- eine autonom replizierende Sequenz ARS(an der die Replikation beginnt)
- ein paar Telomere (normale Endstücke eukaryotischer Chromosomen)
- selektierbare Markergene
- Klonierungsstelle
Vorgehensweisen:
1) Genomische DNA wird mit Restriktionsenzym partiell verdaut
2) Trennen der Fragmente durch Elektrophorese -> grössere (ca. 450kb)
Fragmente werden eluiert und in YAC’s ligiert
3) Vermehren der YAC’s in Hefezellen
Chromosomenwanderung: (vgl Abb. 6.22)
Um lange DNA-Abschnitte abzusuchen, macht man sich die Fragmentüberlappung
innerhalb einer Bibliothek zu nutzen.
1) Fragment mit Region A wird durch Hybridisierung mit der komplementären
Sonde A’ selektiert. Das Fragment mit A könnte auch B enthalten.
2) Spaltung des Fragments, Klonierung der Region B ->Herstellung der Sonde B’
3) Bibliothek mit B’ durchsuchen -> Finden von Fragment mit der Region B
(und evt auch Region C)
 Erforschen langer unbekannter DNA-Abschnitte
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6.3.1 Herstellung komplementärer DNA (cDNA)
Wie lassen sich Säugertier-DNA’s in E.coli klonieren?
Problem:
Diese Gene enthalten Introns/ Extrons. Den Bakterien fehlt die Fähigkeit Introns aus
der Primärstruktur zu schneiden.
Lösung:
Man veranlasst Bakterien eine jeweils zur mRNA komplementäre rekombinante DNA
auszunehmen mit Hilfe reverser Transkriptasen
Methode: (vgl Abb. 6.24)
Retroviren verwenden reverse Transkriptasen um bei der Replikation RNA-DNAHybrid zu bilden.
- Enzym synthetisiert einen DNA-Strang komplementär zur RNA-Matrize
(sofern Primer vorhanden)
- Primer hybridisiert mit Poly(A)-Schwanz am 3’-Ende der Eukaryoten-mRNA
- Erhöhen des pH’s -> hydrolysieren des RNA-Stranges
- Synthese des komplementären Stranges der cDNA -> doppelsträngige cDNA
Herstellen einer cDNA-Bibliothek (vgl Abb. 6.24)
1) terminale Transferase (Enzym) fügt eine Reihe von dG-Nucleotiden an das
3’Ende einer DNA
2) Oligo (dC) bindet an Sequenz = Primer für Synthese
3) Anhängen synthetischer Linker zur Ligation in geeignetem Vektor
 Herstellen komplementärer DNA-Sequenzen zu allen mRNA-Arten; inserieren
in Vektoren; Einbringen in Bakterien (=cDNA-Bibliothek)
6.3.2 Vergleichen der Expressionslevel
Die meisten Gene sind in jeder Zelle in gleicher Menge vorhanden. In welchem
Ausmass das Gen jedoch exprimiert wird, ist von Zelltyp zu Zelltyp verschieden.
Die effizienteste Methode, dies zu untersuchen, basiert auf dem Prinzip der
Hybridisierung:
Hybridisierung:
Durch lichtgesteuerte chemische Synthesen (wie man sie in der Halbleiterindustrie
verwendet) oder durch Aufbringen winzigster Mengen cDNA oder Oligonucleotiden
auf einer festen Unterlage hergestellt. Die letzteren werden als DNA-Chips
bezeichnet. Durch die Hybridisierung dieser immobilisierten DNA mit
fluoreszenzmarkierter
cDNA kann man den Expressionslevel jedes einzelnen Gens über seine bekannte
Lokalisation auf dem Chip identifizieren. Die Intensität des fluoreszierenden Punkt
auf dem Chip ist ein Mass für die Häufigkeit der Transkription bestimmten Gens.
6.3.3 Exprimieren von Genen in Eukaryotenzellen
Bakterien führen keine posttranslationalen Modifikationen aus- wie z.B spezifische
Spaltung von Polypeptiden und das Anheften von Kohlehydrateinheiten- da ihnen die
dazu notwendigen Enzyme fehlen.
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 Viele eukaryotischen Gene können nur in eukaryotischen Zellen exprimiert
werden.
Verfahren:
1) Tierzellen nehmen mit Calcium-Phosphat gefällte fremde DNA-Moleküle auf.
Ein kleiner Teil dieser DNA wird stabil in die chromosomale DNA eingebaut.
Das Ausmass des Einbaus ist klein, doch die Methode ist sehr nützlich, da sie
sehr einfach ist.
2) Mit einer sehr feinen Mikroglaspipette wird die DNA in den Zellkern
mikroinjiziert (ca. 2% der so behandelten Zellen sind lebensfähig)
3) Neue Gene mittels Retroviren in die Zelle einschleusen (vgl. 5.3.2). Die DNAVersion des viralen Genoms (=provirale DNA) kann von der Wirtszelle
zusammen mit der normalen Zell-DNA exprimiert werden.
6.3.4 Beispiele für transgene Mäuse
6.3.5 Das Ausschalten von Genen
Durch Ausschalten eines Genes (Gen-Knockout) lassen sich Rückschlüsse auf die
Funktion ziehen. Die Methode es Gen-Knockout basiert auf der homologen
Rekombination: (vgl Abb. 6.31)
1) Zunächst wird eine mutierte Version des auszuschaltenden Gens geschaffen,
die über weite Bereiche dem normalen Gen homolog ist.
2) Wird das mutierte Fremd-Gen in eine embryonale Stammzelle eingeführt,
kommt es in den homologen Bereichen zur Rekombination. Das normale Gen
wird durch das Fremd-Gen ersetzt.
3) Die Zelle injiziert man in Embryonen und es entstehen z.B Mäuse, in denen
das Gen ausgeschaltet ist (hier: sog. Knockout-Mäuse)
6.3.6 Das Einschleusen von Fremd-DNA in Pflanzenzellen
Methoden:
- Ti-Plasmide (Tumorinduzierende Plasmide). Vergleichbar mit BakterienPlasmiden. Das Arbeiten mit Ti-Plasmiden ist aber nur bei Dicotyledonen
möglich.
- „Genkanonen“ zur Transformation durch Beschuss: Wolfram-Kügelchen
werden mit DNA beschichtet. Mit diesen Kügelchen werden die Zellen nun
mit hoher Geschwindigkeit beschossen. Diese Methode ist eine der
Effizientesten.
- Elektroporation (vgl. Abb. 6.35):
1) Verdauung der Zellwand durch Cellulase
2) Zufügen von Fremd-DNA; kurze elektrische Impulse -> Vorübergehende
Öffnungen: Ermöglichen Aufnahme der Fremd-DNA
3) Rückbildung der Zellwand
6.4.1 Gezielte Veränderungen der DNA
Deletionen:
Ein Plasmid wird mit einem Restriktionsenzym an 2 Stellen gespalten und unter
Bildung eines kleineren Ringes wieder geschlossen.
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 Entfernen eines grossen Stück DNA
Für kürzere Deletionen schneidet man das Plasmid nur an 1 Stelle auf. Die Enden
werden mit einer Exonuclease verdaut, welche Nucleotide von beiden Strängen
entfernt.
Substitutionen: (vgl Abb. 6.36)
Oligonucleotidghesteuerte Mutagenese
Bsp: Serin (TCT) soll durch Cystein (TGT) ersetzt werden (=Punktmutation)
Diese Mutation kann man erzeugen, wenn man
- ein Plasmid mit dem Gen oder der cDNA besitzt und
- die Basensequenz in der Umgebung kennt.
1) Man stellt einen Oligonucleotidprimer her, der bis auf den Ersatz des TCT
durch ein TGT zu jeder Region des Gens komplementär ist
2) Man trennt die 2 Stränge des Plasmids und hybridisiert den Primer (verändert)
mit dem komplementären Strang
3) Die DNA-Polymerase verlängert den Primer
4) Die DNA-Ligase schliesst den doppelsträngigen Ring
Insertionen: Kassettenmutatgenase (vgl Abb. 6.37)
1) DNA wird an 2 je 1-Mal vorhandenen Schnittstellen von 2 verschiedenen
Restriktionsendonucleasen gespalten
2) Ein synthetisches Oligonucleotid, dessen Enden komplementär zu diesen
Schnittstellen sind, wird dann mit der gechnittenen DNA ligiert.
6.4.2 Beispiele für die Verwendung
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