Protokoll - Goethe

Johann Wolfgang Goethe-Universität
Frankfurt am Main
Protokoll
Biochemie Praktikum – Teil 2
Sommersemester 2005
Leitung: Hammelmann, Soppa, Zaman
Proteincharakterisierung
Kai Scheiffele
Florian Schwarte
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG.............................................................................................................................................. 3
2
MATERIAL & METHODEN .................................................................................................................... 4
2.1
VERSUCH P1: PROTEINKRISTALLISATION ............................................................................................. 4
2.2
VERSUCH P2: ISOLIERUNG DER PURPURMEMBRAN (PM)...................................................................... 4
2.3
VERSUCH P3: MESSUNG DER ATP-BILDUNG DURCH VERSCHIEDENE ENERGIEWANDELNDE WEGE
(PHOSPHORYLIERUNG) ........................................................................................................................................ 5
3
2.4
VERSUCH P4: HETEROLOGE PRODUKTION UND REINIGUNG DES TATA-BOX-BINDEPROTEINS (TBP) . 6
2.5
VERSUCH P5: REGULATION DER BILDUNG DER NITRATREDUKTASE BEI E. COLI .................................. 7
ERGEBNISSE.............................................................................................................................................. 9
3.1
VERSUCH P1: PROTEINKRISTALLISATION ............................................................................................. 9
3.2
VERSUCH P2: ISOLIERUNG DER PURPURMEMBRAN (PM).................................................................... 15
3.3
VERSUCH P3: MESSUNG DER ATP-BILDUNG DURCH VERSCHIEDENE ENERGIEWANDELNDE WEGE
(PHOSPHORYLIERUNG) ...................................................................................................................................... 17
4
3.4
VERSUCH P4: HETEROLOGE PRODUKTION UND REINIGUNG DES TATA-BOX-BINDEPROTEINS (TBP) 19
3.5
VERSUCH P5: REGULATION DER BILDUNG DER NITRATREDUKTASE BEI E. COLI ................................ 20
DISKUSSION ............................................................................................................................................ 20
4.1
VERSUCH P1: PROTEINKRISTALLISATION ........................................................................................... 20
4.2
VERSUCH P2: ISOLIERUNG DER PURPURMEMBRAN (PM).................................................................... 21
4.3
VERSUCH P3: MESSUNG DER ATP-BILDUNG DURCH VERSCHIEDENE ENERGIEWANDELNDE WEGE
(PHOSPHORYLIERUNG) ...................................................................................................................................... 21
5
4.4
VERSUCH P4: HETEROLOGE PRODUKTION UND REINIGUNG DES TATA-BOX-BINDEPROTEINS (TBP) 22
4.5
VERSUCH P5: REGULATION DER BILDUNG DER NITRATREDUKTASE BEI E. COLI ................................ 23
QUELLEN ................................................................................................................................................. 23
-2-
1 Einleitung
In diesem Teil des Praktikums werden Versuche zur Charakterisierung von Proteinen
durchgeführt.
Im ersten Versuch wird mit verschiedenen Salz- und Proteinkonzentrationen getestet,
wie gut das Protein unter verschiedenen Bedingungen kristallisiert oder ausfällt.
Im zweiten Versuch wird die Purpurmembran isoliert und im dritten die Menge an
gebildetem ATP durch verschiedene energiewandelnde Wege gemessen. Diese
beiden Versuche erfolgen mit dem Mikroorganismus Halobacterium salinarum.
Versuch 4 befasst sich mit der heterologen Überproduktion von Fusionsproteinen
und deren Affinitätsreinigung. Im letzten Versuch wird ein Reportergen eingesetzt,
um die Regulation der Bildung von Nitratreduktase von drei verschiedenen E. coliStämmen unter verschiedenen Bedingungen zu testen.
Abbildung 1.
Lysozym [1]
-3-
2 Material & Methoden
2.1 Versuch P1: Proteinkristallisation
Wie im Skript beschrieben wird der Vorgang der Kristallisation bei unterschiedlichen
Salz- und Enzymverdünnungen von Lysozym über fünf Tage untersucht. Jeweils
werden 0%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% und 7% Endkonzentration pro Vertiefung in einer
Mikrotiterplatte angesetzt in allen möglichen Kombinationen (7*7 = 49) von NaCl- und
Lysozym-Verdünnungen (siehe auch Tabelle im Skript S. 9 oben). Dabei wird eine
Mikrotiterplatte bei Raumtemperatur, eine zweite bei 4°C belassen.
2.2 Versuch P2: Isolierung der Purpurmembran (PM)
Zellen von Halobacterium salinarum werden wie im Skript beschrieben zentrifugiert
und mittels Tris/HCl-Lösung und DNAseI resuspendiert, bis die Zellen vollständig
aufgeschlossen sind. 10 min wird bei Raumtemperatur inkubiert, damit DNAseI
genügend genomische DNA abbaut und somit die Viskosität der Lösung herabsetzt.
Während dessen wird die Zellzahl bestimmt. Dann werden die Membranen durch
Zentrifugation von den löslichen Proteinen getrennt. Das Pellet mit Membranen wird
in Tris/HCl resuspendiert und dann in Eppendorfgefäßen durch „Pottern“ weiter
zerkleinert und suspendiert.
Ein zuvor vorbereiteter Sukrosegradient in einem Zentrifugenröhrchen wird mit der
Membransuspension überschichtet und dann in einem Ausschwingrotor über 16 h
zentrifugiert. Die Lage, Farbe und Größe der dadurch aufgetrennten Fraktionen im
Zentrifugenröhrchen wird protokolliert. Anschließend werden von den einzelnen
Fraktionen, in denen Protein zu vermuten ist, Spektren von 250 nm bis 650 nm
Wellenlänge
aufgenommen.
Berechnet
werden
dann
sowohl
die
Bakteriorhodopsinkonzentration (BR) als auch die Gesamtkonzentration von
Proteinen nach Warburg und Christian. BR absorbiert bei 565 nm, so dass die hierbei
gemessene Extinktion Aufschluss über die Konzentration gibt. Entsprechend wird für
die Methode nach Warburg und Christian die Extinktion bei 260 nm und bei 280 nm
benötigt.
-4-
2.3 Versuch P3: Messung der ATP-Bildung durch verschiedene
energiewandelnde Wege (Phosphorylierung)
Bei diesem Versuch soll bestimmt werden, wie viel ATP Haloarchaea über
verschiedene energiewandelnde Wege produzieren kann. Diese verschiedenen
Wege werden über entsprechend gewählte Bedingungen induziert (siehe Skript S.
11/12).
Zunächst wird die Zellzahl bestimmt und dann 50 ml der Kultur abzentrifugiert und in
Basalsalz resuspendiert. In einem Messzylinder ist die Zellsuspension mit Stickstoff
überblasen und dann über etwa sechs Stunden bei 30°C inkubiert worden, damit die
Zellen aushungern.
Wie im Skript beschrieben werden in insgesamt vier Ansätzen jeweils 8 ml der
Suspension in eine 30°C thermostatische Küvette gegeben und mit Stickstoff
überblasen. Dann werden pro Ansatz über die Zeit verschiedene Bedingungen
geschaffen in An- oder Abwesenheit von Sauerstoff, des Protonophors CCCP und
Arginin (genaueres siehe Tabelle im Skript). Zu bestimmten Zeitpunkten werden
Proben entnommen und in eiskalten Phosphatpuffer gegeben. Dadurch werden die
Zellen lysiert und somit die Menge an bis dato produziertem ATP fixiert.
Die Auswertung der einzelnen entnommenen Proben erfolgt über den LuciferinLuciferase-Test. Eine Lösung namens „Firefly lantern extract“ (Extrakt vom
Leuchtkäfer) stellt dabei die benötigten Reagenzien zur Verfügung. Luciferin reagiert
in Gegenwart von Luciferase mit ATP und Sauerstoff, wobei Licht emittiert wird.
Dabei korreliert die Menge an emittiertem Licht linear mit der Menge an
vorhandenem ATP. Somit kann von der gemessenen Menge an Licht über einen
fixen Zeitraum von 30 sec Rückschluss auf die ATP-Konzentration gezogen werden.
Dazu dient das Erstellen einer Eichkurve mit definierten Mengen an ATP. Für das
genaue Vorgehen zur ATP-Bestimmung siehe Skript S. 13.
-5-
2.4 Versuch P4: Heterologe Produktion und Reinigung des TATABox-Bindeproteins (TBP)
Ausgehend von transformierten E. coli Bakterien soll eine Überproduktion des
Enzyms TBP bewirkt werden und dann das Protein gereinigt werden. Das
eingebrachte Plasmid enthält dabei sowohl das Gen für TBP wie auch Informationen
zur Ausbildung einer Ampicillinresistenz. Des Weiteren ist das Gen für TBP unter die
Kontrolle des induzierbaren lac-Promotors gestellt.
Zunächst wird ein Medium, bestehend aus SOB-Medium, Ampicillin und Kanamycin,
erstellt. Ampicillin dient dazu, Bakterien zu entfernen, die nicht den Vektor
aufgenommen haben und somit auch über keine entsprechende Ampicillinresistenz
verfügen. Das Medium wird mit einer Vorkultur inokuliert und dann bei 37°C auf
einem Schüttler inkubiert, bis eine optische Dichte von 0,498 erreicht worden ist.
Dann werden je eine 1 ml und eine 2 ml Probe entnommen (1 ml t0 und 2 ml t0).
Die Expression des TBP-Gens wird nun über IPTG induziert und dann nach 30 und
60 min jeweils eine 1 ml Probe entnommen (1 ml t 30 und 1 ml t60) und abschließend
nach 120 min wieder je eine 1 ml und eine 2 ml Probe (1 ml t120 und 2 ml t120). Diese
Proben werden jeweils abzentrifugiert und dann die Niederschläge auf Eis
aufbewahrt, um hinterher den Expressionsverlauf dokumentieren zu können.
Wie im Skript beschrieben, werden die Zellen der 1 ml Proben mit 1xSDSProbenpuffer versetzt und sieben Minuten auf 95°C erhitzt. Die Zelltrümmer und
Membranen der aufgeschlossenen Zellen werden über Zentrifugation entfernt. Die
Zellen der 2 ml Proben werden mittels Puffer B (Zusammensetzung siehe Skript S.
15 unten) lysiert und die aufgeschlossenen Proteine aufgrund einer hohen
Harnstoffkonzentration in Puffer B denaturiert. Wieder werden Zelltrümmer und
Membranen durch Zentrifugation entfernt und dann von jeder der beiden Proben ein
Aliquot genommen und mit 4xSDS-Probenpuffer versetzt.
Mit der restlichen Menge der beiden Proben wird jeweils, wie im Skript beschrieben,
eine Säulenchromatographie im Batchverfahren, mit Nickelchelatsepharose (NCS)
-6-
als Säulenmaterial, durchgeführt. Das am Säulenmaterial gebundene TBP wird mit
EDTA eluiert. Nach Zentrifugation wird jeweils der Überstand mit darin gelöstem TBP
mit 4x SDS Probenpuffer versetzt. Die entnommenen acht Proben werden 5 min bei
95°C belassen und dann auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel gegeben.
2.5 Versuch P5: Regulation der Bildung der Nitratreduktase bei E.
coli
E. coli kann neben Sauerstoff u.a. auch Nitrat als Elektronenakzeptor in der
Elektronentransportphosphorylierung
verwerten.
Untersucht
werden
soll
die
Expression der Nitratreduktasegene unter verschiedenen Bedingungen. Dazu
werden drei verschiedene Bakterienstämme verwendet, die über die nötigen Gene
verfügen. Der entsprechende narG-Promotor ist gekoppelt mit einem Reportergen,
dem lacZ-Gen von E. coli, welches für die β-Galaktosidase kodiert. Über die Zugabe
einer fixen Menge des zugehörigen Substrats o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid
(ONPG) können Rückschlüsse auf die Stärke der Expression des lacZ-Gens, und
somit auch auf die Nitratreduktase-Gene gezogen werden. Denn β-Galaktosidase
spaltet ONPG in Galaktose und o-Nitrophenol, dessen Absorption bei 420 nm
gemessen werden kann.
Folgende drei Stämme, mit entsprechenden Genen, werden für den Versuch
eingesetzt:
VJS950
narG’-’lacZ
IMW315
narG’-’lacZ,fnr::tetR
VJS957
narG’-’lacZ,narL215::Tn10(tetR)
Zunächst werden nach dem Pipettierschema von Tabelle 1 insgesamt zweimal zwölf
Ansätze für Vorkulturen vorbereitet, mit einem Volumen von jeweils 5 ml. Die
jeweiligen Lösungen für aerobe Bedingungen werden mit 25 µl des entsprechenden
Baktierienstamms angeimpft. Für die anaeroben Ansätze werden 125 µl Zellkultur
verwendet.
-7-
Tabelle 1.
Pipettierschema für Vor- und Hauptkulturen von drei Bakterienstämmen unter
verschiedenen Bedingungen .
Nr.
1
Stamm
VJS950
Substrate Bedingung Medium Glucose Tetracyclin
Glucose
2
[ml]
[µl]
[µl]
aerob
4,95
50
-
anaerob
4,875
125
(Stamm
3
Glucose +
aerob
4,7
50
nicht
4
NO3-
anaerob
4,625
125
resistent!)
Glucose
aerob
4,95
50
anaerob
4,875
125
5
IMW315
6
7
Glucose +
aerob
4,7
50
8
NO3-
anaerob
4,625
125
Glucose
aerob
4,95
50
anaerob
4,875
125
9
VJS957
10
11
Glucose +
aerob
4,7
50
12
NO3-
anaerob
4,625
125
NO3[µl]
-
250
5 µl
250
5 µl
250
Die anaeroben Ansätze werden, wie im Skript beschrieben, mit Stickstoff durchspült.
Alle Vorkulturen werden dann über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach demselben
Schema von Tabelle 1 werden am nächsten Tag Hauptkulturen vorbereitet, die dann
mit Vorkulturen mit den entsprechend gleichen Bedingungen angeimpft werden.
Auch hier wird jeder Ansatz zweimal erstellt. Dabei werden der aeroben
Hauptkulturen 2% (0,1 ml) des Endvolumens an Vorkultur hinzu gegeben und den
anaeroben Ansätzen 10% (0,5 ml).
Die Ansätze werden dann bei 37°C inkubiert, bis eine OD578 von 0.586 von Ansatz 3
erreicht worden ist. Da die Bakterien unter anaeroben Bedingungen zwar langsamer
wachsen als unter aeroben, aber bei den anaeroben Ansätzen dafür mehr Glukose
als Substrat und auch mehr Vorkultur verwendet wird, sollten alle Ansätze zum
entsprechenden Zeitpunkt erfahrungsgemäß ebenfalls eine OD von etwa 0,5
besitzen.
-8-
Dann wird direkt der Enzymtest mit ONPG durchgeführt (siehe Skript S. 20), wobei
die Mittelwerte der gemessenen OD-Werte und die Aktivität in Miller Units berechnet
werden. Das Stoppen der Enzymreaktion mittels Na2CO3 geschieht nach 27 min.
3 Ergebnisse
3.1 Versuch P1: Proteinkristallisation
In den für diesen Versuch folgenden Tabellen werden folgende Abkürzungen
benutzt:
A
Protein ist ausgefallen/ausgeflockt
K
Protein ist kristallisiert
A/K
Protein ist teilweise ausgefallen und teilweise kristallisiert
-9-
Tabelle 2.
Mikrotiterplatte mit Lysozym/NaCl-Gemisch in verschiedenen Verdünnungen,
1. Tag, Raumtemperatur
Lysoz.
0%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
0%
-
-
-
-
-
-
-
2%
-
-
-
-
-
-
-
3%
-
-
-
-
-
-
-
4%
-
-
-
-
A
A
A
5%
-
A
A
A
A
A
A
6%
-
A
A
A
A
A
A
7%
A
A
A
A
A
A
A
Tabelle 3.
Mikrotiterplatte mit Lysozym/NaCl-Gemisch in verschiedenen Verdünnungen,
NaCl
1. Tag, 4 °C
Lysoz.
0%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
0%
-
-
-
-
-
-
-
2%
-
-
-
-
-
-
-
3%
-
-
-
-
-
-
-
4%
-
-
-
-
A
A
A
5%
-
-
A
A
A
A
A
6%
-
-
A
A
A
A
A
7%
A
A
A
A
A
A
A
NaCl
- 10 -
Tabelle 4.
Mikrotiterplatte mit Lysozym/NaCl-Gemisch in verschiedenen Verdünnungen,
2. Tag, Raumtemperatur
Lysoz.
0%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
0%
-
-
-
-
-
-
-
2%
-
-
-
-
-
-
-
3%
-
-
-
-
-
-
-
4%
K
K
K
K
A
A
A
5%
A
A
A
A
A
A
A
6%
A
A
A
A
A
A
A
7%
A
A
A
A
A
A
A
Tabelle 5.
Mikrotiterplatte mit Lysozym/NaCl-Gemisch in verschiedenen Verdünnungen,
NaCl
2. Tag, 4 °C
Lysoz.
0%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
0%
-
-
-
-
-
-
-
2%
K
K
K
K
K
K
K
3%
K
K
K
K
A/K
A/K
A/K
4%
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A
5%
A
A
A
A
A
A
A
6%
A
A
A
A
A
A
A
7%
A
A
A
A
A
A
A
NaCl
- 11 -
Tabelle 6.
Mikrotiterplatte mit Lysozym/NaCl-Gemisch in verschiedenen Verdünnungen,
3. Tag, Raumtemperatur
Lysoz.
0%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
0%
-
-
-
-
-
-
-
2%
-
-
-
K
K
K
K
3%
-
K
K
K
K
K
K
4%
K
K
K
K
A
A/K
A/K
5%
A
A
A
A
A
A
A
6%
A
A
A
A
A
A
A
7%
A
A
A
A
A
A
A
Tabelle 7.
Mikrotiterplatte mit Lysozym/NaCl-Gemisch in verschiedenen Verdünnungen,
NaCl
3. Tag, 4°C
Lysoz.
0%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
0%
K
K
K
K
K
K
K
2%
K
K
K
K
K
K
K
3%
K
K
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
4%
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A
5%
A/K
A
A
A
A
A
A
6%
A
A
A
A
A
A
A
7%
A
A
A
A
A
A
A
NaCl
- 12 -
Tabelle 8.
Mikrotiterplatte mit Lysozym/NaCl-Gemisch in verschiedenen Verdünnungen,
4. Tag, Raumtemperatur
Lysoz.
0%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
0%
-
-
-
K
K
K
K
2%
-
K
K
K
K
K
K
3%
-
K
K
K
K
K
K
4%
K
K
K
K
A
A/K
A/K
5%
A/K
A
A
A
A
A
A
6%
A/K
A
A
A
A
A
A
7%
A
A
A
A
A
A
A
Tabelle 9.
Mikrotiterplatte mit Lysozym/NaCl-Gemisch in verschiedenen Verdünnungen,
NaCl
4. Tag, 4°C
Lysoz.
0%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
0%
K
K
K
K
K
K
K
2%
K
K
K
K
K
K
K
3%
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
4%
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A
5%
A/K
A
A
A
A
A
A
6%
A
A
A
A
A
A
A
7%
A
A
A
A
A
A
A
NaCl
- 13 -
Tabelle 10.
Mikrotiterplatte mit Lysozym/NaCl-Gemisch in verschiedenen Verdünnungen,
5. Tag, Raumtemperatur
Lysoz.
0%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
0%
K
K
K
K
K
K
K
2%
K
K
K
K
K
K
K
3%
K
K
K
K
K
K
K
4%
K
K
K
K
A
A/K
A/K
5%
A/K
A
A
A
A
A
A
6%
A/K
A
A
A
A
A
A
7%
A
A
A
A
A
A
A
Tabelle 11.
Mikrotiterplatte mit Lysozym/NaCl-Gemisch in verschiedenen Verdünnungen,
NaCl
5. Tag, 4°C
Lysoz.
0%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
0%
K
K
K
K
K
K
K
2%
K
K
K
K
K
K
K
3%
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
4%
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
A/K
5%
A/K
A
A
A
A
A
A
6%
A/K
A
A
A
A
A
A
7%
A
A
A
A
A
A
A
NaCl
- 14 -
3.2 Versuch P2: Isolierung der Purpurmembran (PM)
Die Zellzahl beträgt 1,25 * 109 Zellen pro ml. Tabelle 12 stellt die beobachteten
Fraktionen dar. Die lila Fraktionen bestehen größtenteils aus Bakteriorhodopsin und
werden deshalb mit Hilfe eines Durchfluss-Photometers untersucht (Ausnahme:
Fraktion 4, bzw. der Bodensatz). Die Ergebnisse hierzu sind in Tabelle 13
aufgetragen.
Tabelle 12.
Beobachtete Fraktionen nach der Dichtezentrifugation. Die Fraktionen sind von
0 bis 4 durchnummeriert und jeweils farblich qualifiziert.
0 Lila (hauch-dünn, an Oberfläche schwimmend)
Tabelle 13.
1
Gelb
2
Rosa
3
Lila
4
Lila Feststoff (am Boden)
Ergebnisse der photometrischen Untersuchung von Fraktion 0 und 3 (vgl.
Tabelle 12).
Fraktion
E260
E280
E565
Proteinkonz.
BR-Konz.
nmol BR
[mg/ml]
[nM]
je mg
Protein
0
3
2,248
0,436
1,040
6920,6
9,251
3
2,42
2,57
0,867
1,936
13761,9
14,640
Die BR-Konzentration errechnet sich nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz wie
folgt:
E 565 * 10 9
c [nM] 
 565 * d , wobei der Extinktionskoeffizient ε565 für Bakteriorhodopsin 63000
M-1 cm-1 beträgt und der Durchmesser d der gemessenen Flüssigkeit 1 cm.
- 15 -
Die Proteinkonzentration ist nach Warburg/Christian berechnet worden mit folgender
Formel:
c [mg/ml] = 1,45 * E280 – 0,74 * E260
Die BR-Konzentration in nmol je mg Protein berechnet sich wie folgt:
1. Proteinkonz.:
1
x [mg / ml]  [ml / mg]
x
2. BR-Konz.:
y [nmol / l] 
3. Menge an BR in 1 mg:
z [nmol / mg] 
y
[nmol / ml]
1000
y
1
[nmol / ml] * [ml / mg]
1000
x
Der erwartete Wert in nmol BR je mg Protein für reines BR berechnet sich wie folgt:
1. Molmasse BR:
27000 Da  27000 g / mol  27000 ng / nmol  0,027 mg / nmol
2. nmol /mg BR:
1
nmol / mg  37,037 nmol / mg
0,027
37,037 nmol BR sind also in einem mg reinem BR enthalten. Demnach besteht, unter
der Annahme, dass die nach Warburg/Christian berechnete Proteinkonzentration
korrekt ist, Fraktion 0 zu 25% aus BR und Fraktion 3 zu 40%.
Die Anzahl an BR-Molekülen pro Zelle berechnet man wie folgt:
1. BR-Konz.:
y [nmol / l] 
y
[nmol / ml]
1000
y
[nmol / ml]
1000
2. z [nmol BR / Zelle] =
1,25 * 10 9 [Zellen/ml ]
Unter der Annahme, dass sich die Gesamtmenge an BR aus den Zellen in Fraktion 0
und 3 befinden, beträgt die Anzahl an BR-Molekülen pro Zelle also 16,54 fmol.
- 16 -
3.3 Versuch P3: Messung der ATP-Bildung durch verschiedene
energiewandelnde Wege (Phosphorylierung)
ATP Eichkurve
80000
Lichtemission
70000
60000
50000
ATP
40000
Linear (ATP)
30000
20000
y = 662,36x + 9012,7
10000
0
0
50
100
150
ATP [pmol]
Abbildung 2.
ATP Eichgerade. Die verwendete Menge ATP wurde gegen die gemessene
Lichtemission im Luciferin-Luciferase-Test aufgetragen. Unter der Legende
rechts ist die Geradengleichung der interpolierten Trendgeraden zu sehen.
aerobe
Elektronentransportphosphorylierung
30
ATP [pmol]
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
t [min]
Abbildung 3.
Aerobe
Elektronentransportphosphorylierung.
Auftragung
der
ATP-Menge
(abgeleitet von der ATP-Eichgeraden aus Abbildung 2) im Luciferin-LuciferaseTest zu den jeweiligen Messzeitpunkten.
- 17 -
aerobe ETP + CCCP
30
ATP [pmol]
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
t [min]
Abbildung 4.
Aerobe Elektronentransportphosphorylierung + CCCP. Auftragung der ATPMenge (abgeleitet von der ATP-Eichgeraden aus Abbildung 2) im LuciferinLuciferase-Test zu den jeweiligen Messzeitpunkten.
Argininfermentation
30
ATP [pmol]
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
t[min]
Abbildung 5.
Argininfermentation. Auftragung der ATP-Menge (abgeleitet von der ATPEichgeraden aus Abbildung 2) im Luciferin-Luciferase-Test zu den jeweiligen
Messzeitpunkten.
- 18 -
Argininfermentation + CCCP
30
ATP [pmol]
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
t[min]
Abbildung 6.
Argininfermentation
+
CCCP.
Auftragung
der
ATP-Menge
(abgeleitet von der ATP-Eichgeraden aus Abbildung 2) im
Luciferin-Luciferase-Test zu den jeweiligen Messzeitpunkten.
3.4 Versuch P4: Heterologe Produktion und Reinigung des TATABox-Bindeproteins (TBP)
Abbildung 7.
PAGE, Coomassie-gefärbt; aufgetragene Proben: 1 ml t0 (Spur 1), 1 ml t30
(Spur 2), Protein-Standard (Spur 3), 1 ml t60 (Spur 4), 1 ml t120 (Spur 5), 2 ml t0
(Spur 6), 2 ml t120 (Spur 7), 2 ml t0 nach Elution (Spur 8), 2 ml t120 nach Elution
(Spur 9).
- 19 -
3.5 Versuch P5: Regulation der Bildung der Nitratreduktase bei E.
coli
Aktivität (Miller Units)
35
30
25
20
15
10
5
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Proben
Abbildung 8.
Aktivität (in Miller Units) der auf Regulation der Bildung der Nitratreduktase
getesteten Proben 1 bis 12.
4 Diskussion
4.1 Versuch P1: Proteinkristallisation
Die
Proteinkristallisation
ist
ein
notwendiger
Prozess
um
über
die
Röntgenstrukturanalyse Aussagen über die dreidimensionale Struktur eines Moleküls
(in unserem Fall eines Enzyms) treffen zu können. Dieser Prozess ist allerdings nicht
ohne weiteres von einem Molekül auf ein anderes übertragbar. Es ist daher nötig
empirisch die für das jeweilige Zielmolekül günstigsten Kristallisationsbedingungen
zu ermitteln. Die folgenden Aussagen können daher nicht verallgemeinert werden,
sondern sind nur aus dem Versuch resultierende Erfahrungswerte für Lysozym.
Am besten kristallisiert Lysozym offenbar bei niedrigen Temperaturen und geringen
Salzkonzentrationen. Die Proteinkonzentration hat offenbar keinen großen Einfluss.
Die besten Ergebnisse sind am 2. Tag bei 4°C und 2% Konzentration an NaCl
beobachtet worden. Erstaunlich jedoch ist, dass auch bei 0% Lysozym Kristalle
- 20 -
entstanden sind. Eventuell könnten diese Salzkristalle sein. Bei 0% NaCl jedoch
existiert keine plausible Bergündung dafür, dass auch hier Kristalle zu erkennen sind.
Vermutlich ist hier ein Fehler beim Pipettieren durch den Experimentator gemacht
worden.
4.2 Versuch P2: Isolierung der Purpurmembran (PM)
Das auffällig lila-farbene Bakteriorhodopsin ist offenbar in zwei bzw. drei Fraktionen
zu finden. Der Bodensatz der Probe ist nach näherer Betrachtung Feststoff. Also
werden dort auch Fragmente der Purpurmembran vorzufinden sein, die zu groß
gewesen sind, um in Lösung zu gehen und sich dementsprechend in einer Fraktion
weiter oben des Gradienten zu befinden. Die gelbe Fraktion ist höchstwahrscheinlich
Fett. Diese Fraktion besitzt ebenfalls bei näherem Hinsehen eine andere Brechung
wie die anderen Fraktionen. Die rosa Fraktion besteht wahrscheinlich aufgrund ihrer
Farbe und Lage aus verschiedenen Bestandteilen, inklusive einer geringen Menge
an BR. Fraktion 0 ist wahrscheinlich aus Fraktion 3 entstanden, indem eine geringe
Menge aus dieser Fraktion, vermutlich aufgrund eines fehlerhaft präparierten
Sukrose-Gradienten, an die Oberfläche der Flüssigkeit gelangt ist.
Alles in allem ist BR durch einfache Mittel aufgrund seiner auffälligen Farbe von
anderen Zellbestandteilen zutrenne gewesen. 40% (Fraktion 0) bzw. 25% (Fraktion
3) reines BR bedeuten jedoch, dass noch weitere Reinigungsschritte erforderlich
sind.
4.3 Versuch P3: Messung der ATP-Bildung durch verschiedene
energiewandelnde Wege (Phosphorylierung)
In Abbildung 3 ist zu sehen, dass nach Sauerstoffzugabe (nach 10 min) die ATPMenge in der Zelle ansteigt. Dies entspricht den Erwartungen, da Haloarchaea
Sauerstoff als Elektronenakzeptor verwerten kann. Allerdings hätte die ATP-Menge
nach 20 min wieder sinken müssen, da dort Sauerstoff als Elektronenakzeptor wieder
entzogen worden ist.
- 21 -
Nach Zugabe des Entkopplers CCCP (siehe Abbildung 4) hat sich die ATP-Menge
über die Zeit kaum verändert. Das ist dadurch zu erklären, dass CCCP den
Protonengradient abbaut und dadurch die ATP-Synthetaseaktivität hemmt, da die
ATP-Synthese mit einem lateralen Protonenfluss einhergeht, der vom Vorhandensein
eines Protonengradienten abhängt.
Nach Zugabe von Arginin (Probe nach 10:30 min) ist ein Anstieg der intrazellulären
ATP-Konzentration zu beobachten (siehe Abbildung 5). Dies beweist, dass
Haloarchaea ATP auch durch die Fermentation von Arginin produzieren kann. CCCP
sollte erwartungsgemäß keinen Einfluss auf diesen Metabolismus haben, da ein
Protonengradient keinen Einfluss auf die Fermentation haben, also auch dessen
Abbau keine Auswirkungen zeigen sollte. Tatsächlich ist kaum eine Veränderung der
ATP-Konzentration zu beobachten.
Für die von der Erwartung abweichende Messwerte konnten zwei mögliche
Fehlerquellen ermittelt werden: zum einen zeigte sich auch bei anderen Versuchen,
dass die verwendeten Haloarchaea scheinbar nicht mehr die erwünschte Fitness an
den Tag legten. Zum anderen sprechen Probleme bei der Erstellung der ATPEichgerade dafür, dass mit der verwendeten Luciferase etwas nicht stimmte.
4.4 Versuch P4: Heterologe Produktion und Reinigung des TATABox-Bindeproteins (TBP)
Abbildung 7 zeigt sehr deutlich den Verlauf der (durch IPTG induzierten)
Überproduktion des Zielproteins. So ist erwartungsgemäß in der Probe t 0 keine
signifikante Bande bei entsprechender Proteingröße zu identifizieren. Für die Proben
t30, t60 und t120 wird diese immer größer, was eine steigende Konzentration des
überproduzierten Proteins nachweist. Die sich der Überproduktion anschließende
Reinigung verlief zufrieden stellend. Wie zu erwarten, fehlt auch hier die
Proteinbande in der t0-Probe. Zwar wurde bei der Probe t120 auch ein großer Teil des
Zielproteins aus der Probe herausgereinigt (zu erkennen an der weiterhin dicken,
- 22 -
aber schwachen Bande), allerdings wurde die Probe auch von sämtlichen anderen
Proteinen gereinigt.
4.5 Versuch P5: Regulation der Bildung der Nitratreduktase bei E.
coli
Wie die Aktivität (Miller Units) in Abbildung 8 erkennen lässt, zeigt nur ein Stamm
(VJS950)
eine
signifikante
Aktivität
und
damit
der
Expression
des
Nitratreduktasegens. Wie zu erwarten ist eine hohe Aktivität nur in einem
nitrathaltigen Medium zu erzielen, da sonst das nötige Substrat für das Enzym fehlt.
Des Weiteren ist auch einzusehen, dass dieser Stamm mit NO3- im Medium unter
anaeroben Bedingungen eine mehr als doppelt so große Aktivität aufweist, da
Sauerstoff als Elektronenakzeptor nicht vorhanden ist und daher auf Nitrat
zurückgegriffen wird.
Die anderen zwei Stämme können den Ergebnissen zufolge kein Nitrat verwerten,
obwohl beide Stämme das notwendige Gen für Nitratreduktase besitzen (siehe Seite
7 unten). Mögliche Erklärungen dafür könnten sein, dass in den beiden Stämmen
IMW315 und VJS957 die synthetisierte β-Galaktosidase inhibiert oder gar denaturiert
wird. Auch Fehler beim Durchführen des Enzymtests von β-Galaktosidase mit dem
Substrat ONPG sind nicht auszuschliessen.
5 Quellen
[1] PDB-Sum,
Lysozym,
PDB-ID
srv/databases/pdbsum/, (lv 08.06.2005)
- 23 -
132I,
http://www.ebi.ac.uk/thornton-