Katalytische Strategien 9

9. Katalytische Strategien
9.0.1 Einige grundlegende katalytische Mechanismen sind vielen Enzymen
gemeinsam
Die enzymatische Katalyse beginnt mit der Substratbindung. Die Bindungsenergie,
die dabei als freie Enthalpie freigesetzt wird, bestimmt die Substratspezifität und
erhöht die katalytische Effizienz. Die Wechselwirkungen zwischen Enzym und
Substrat stabilisieren auch den Übergangszustand und verringern die
Aktivierungsenergie. Ausserdem kann die Bindungsenergie Strukturveränderungen
im Enzym oder Substrat unterstützen und so die Katalyse erleichtern, was man als
induced fit bezeichnet.
Mechanismen der Katalyse:
1. Kovalente Katalyse: Das aktive Zentrum einer reaktiven Gruppe enthält eine starke
nucleophile Gruppe, die temporär kovalent verändert wird. Bsp: Chymotropsin (9.1.2)
2. Allgemeine Säure-Base-Katalyse: Ein anderes Molekül als Wasser besitzt die
Funktion eines Protonendonors oder -akzeptors. Bsp: Histidinrest, der als basischer
Katalysator bei Chymotropsin, Nucleophilie eines Serinrestes verstärkt (9.1.2)
3. Metallionenkatalyse: Ein Metallion kann als elektrophiler Katlysator wirken, indem
es die negative Ladung eines Zwischenproduktes der Reaktion stabilisiert, oder eine
nucleophile Gruppe erzeugen, indem es die Acidität eines benachbarten Moleküls
erhöht. Bsp: Carboanhydrase (9.2.2)
Das Metallion kann an das Sustrat binden und dadurch die Bindungsenergie
erhöhen. Bsp: NMP-Kinase (9.4.3)
4. Katalyse durch Annäherung: Substrate binden ans Enzym und werden so
zusammengebracht. Bsp: NMP-Kinase (9.4.3)
9.1 Proteasen ermöglichen eine schwer durchführbare Reaktion
Proteasen spalten Proteine durch eine Hydrolysereaktion, die Addition eines
Wassermoleküls an eine Peptidbindung. Ohne Katalysator beträgt die Halbwertszeit
dafür zehn bis 1000 Jahre. Peptidbindungen müssen
aber bei einigen
biochemischen Reaktionen innerhalb von Millisekunden gespalten werden. Für die
kinetische Stabilität von Peptidbindungen ist ihre Resonanzstruktur verantwortlich.
Das Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe ist wegen dem Doppelbindungscharakter
zwischen dem Kohlenstoff- und Stickstoffatom weniger elektrophil. Ein Enzym, das
eine Spaltung bewirken soll, muss also einen nucleophilen Angriff auf eine
normalerweise nicht reaktive Carbonylgruppe ermöglichen.
9.1.1 Chymotrypsin besitzt einen hochreaktiven Serinrest
Ein Enzym, das am Abbau von Proteinen beteiligt ist, ist Chymotrypsin. Es spaltet
Peptidbindungen selektiv auf der carboxyterminalen Seite von grossen hydrophoben
Aminosäuren, z.B. Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin, Methionin. Eine stark
nucleophile Gruppe des Enzyms greift die Carbonylgruppe des Substrats an und wird
während der Katalyse kurzzeitig kovalent mit dem Substrat verknüpft –> Kovalente
Modifikation.
Beim katalytischen Mechanismus von Chymotrypsin spielt ein ungewöhnlich reaktiver
Serinrest (Serin 195) eine Rolle.
9.1.2 Die Chymotrypsinreaktion erfolgt in zwei Schritten, die über ein kovalent
gebundenes Zwischenprodukt miteinander verknüpft sind
Um die Kinetik der Enzymreaktion leicht messen zu können, lässt man das Enzym
mit einem Substratanaloga reagieren, das ein farbiges Produkt hervorbringt. Bei
Chymotrypsin ist ein solches chromogenes Substrat N-Acetyl-L-phenylalanin-pnitrophenylester und
eines der Produkte, die bei der Chymotrypsinspaltung
entstehen ist das gelbe p-Nitrophenolat.
Zu Beginn der Reaktion zeigt sich eine Phase des schnellen Anstiegs (burst). Sobald
das Gleichgewicht erreicht ist, entsteht das Produkt langsamer. Dies deutet darauf
hin, dass die Hydrolyse in zwei Schritten erfolgt, von denen der erste rascher erfolgt
als der zweite. Die Bildung von p-Nitrophenolat erfolgt also nach Zugabe des
Substrats mit grosser Geschwindigkeit, sobald das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt
entstanden ist, während das Enzym für ein “Zurücksetzen“ durch die Hydrolyse des
Acyl-Enzym-Zwischenproduktes länger braucht.
9.1.3 Serin ist Teil einer katalytischen Triade mit Histidin und Aspartat
Chymotrypsin ist etwa kugelförmig und besteht aus drei Polypeptidketten, die durch
Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Das aktive Zentrum welches Serin 195
enthält, liegt in einer Spalte an der Oberfläche des Enzyms. Die Seitenkette vom
Serin ist über eine Wasserstoffbrücke mit dem Imidazolring von Histidin 57
verbunden, dessen NH-Gruppe wiederum über eine Wasserstoffbrücke mit der
Carboxylatgruppe von Aspartat 102 verknüpft ist. Diese Anordnung bezeichnet man
als katalytische Triade. Der Histidinrest positioniert die Serinseitenkette und
polarisiert deren Hydroxylgruppe. Durch den Abzug des Protons von der
Hydroxylgruppe entsteht ein Alkoxidion, das stärker nucleophil ist als ein Alkohol. Der
Aspartatrest stützt die Orientierung des Histidins und macht es durch elektrostatische
Effekte zu einem besseren Protonenakzeptor.
Mechanismus für die Hydrolyse von Peptiden (Abb. 9.8): Nach der
Substratbindung erfolgt ein nucleophiler Angriff der Hydroxylgruppe von Serin 195
auf das Carbonylkohlenstoff des Substrats. Die Umgebung des Kohlenstoffatoms
verändert sich von einer trigonal planaren zu einer tetraedrischen Struktur. Dieses in
sich instabile tetraedrische Zwischenprodukt erhält formal eine negative Ladung am
Sauerstoffatom der Carbonylgruppe, die durch NH-Gruppen eines Proteinbereiches,
den man als Oxyaniontasche bezeichnet, stabilisiert wird. Das Zwischenprodukt
zerfällt anschliessend und es entsteht das Acyl-Enzym. Ein Proton wird vom positiv
geladenen Histidin auf die bei der Spaltung der Peptidbindung entstehende
Aminogruppe übertragen, welche sich so ungehindert vom Enzym lösen kann und
durch ein Wassermolekül ersetzt wird. Die nun folgende Hydrolyse der Estergruppe
des Acyl-Enzyms entspricht im Prinzip der vorangegangenen Reaktion. Der
Histidinrest wirkt nun als allgemeiner Säurekatalysator und bildet ein tetraedrisches
Zwischenprodukt, bei dessen Zerfall sich das Carbonsäureprodukt bildet. Schliesslich
ist das Enzym nach Freisetzung des Carbonsäureprodukts wieder bereit für einen
neuen Katalysezyklus.
Eine tiefe, verhältnismässig hydrophobe Tasche (S1-Tasche), in welche die langen,
ungeladenen Seitenketten von Aminosäureresten wie Phenylalnin und Tryptophan
hineinpassen, erklärt die Bevorzugung von Peptidbindungen direkt hinter solchen
Aminosäureresten. Die Bindung einer geeigneten Seitenkette in diese Tasche
positioniert die daran anschliessende Peptidbindung im aktiven Zentrum für die
Spaltung.
Andere Proteasen zeigen noch komplexere Spezifitätsmuster mit zusätzlichen
Taschen.
9.1.4 Katalytische Triaden kommen auch bei anderen hydrolytischen Enzymen
vor
Einige davon, wie beispielsweise Trypsin und Elastase, sind zu Chymotrypsin
homolg. Sie zeigen dieselben Reaktionsmechanismen, unterscheiden sich jedoch in
der Substratspezifität. Weitere Vertreter der Chymotrypsinfamilie sind eine Gruppe
von Proteinen, die bei der Blutgerinnung mitwirken und eine Reihe von Proteasen bei
Bakterien und Viren. Auch andere Enzyme, die nicht zu Chymotrypsin homolog sind,
enthalten sehr ähnlche aktive Zentren mit einer katalytischen Triade, z.B. Subtilisin,
eine Bakterienprotease, oder Carboxypeptidase II aus Weizen.
Dieselbe Strategie für die Hydrolyse von Peptid- und ähnlichen Bindungen ist also im
Lauf der Evolution mindestens dreimal entstanden und ist somit ein Beispiel für
konvergente Evolution.
9.1.5 Die katalytische Triade wurde mithilfe ortsspezifischer Mutagenese genau
untersucht
Mit ortsspezifischer Mutagenese konnte der jeweilige Beitrag der einzelnen
Aminosäuren zur katalytischen Leistungsfähigkeit des Enzyms bestimmt werden.
Der Austausch von Serin oder Histidin gegen Alanin verringerte den Wert für k kat auf
weniger als ein Millionstel des normalen Wertes. Die Umwandlung von Aspartat hatte
einen geringeren Effekt.
9.1.6 Cystein-, Aspartat- und Metalloproteasen sind weitere wichtige Klassen
von peptidspaltenden Enzymen
Die Strategie der Cysteinproteasen stimmt grösstenteils mit der von der
Chymotrypsinfamilie überein. Bei ihnen übernimmt ein Cysteinrest, der von einem
Histidinrest aktiviert wird, die Funktion der nucleophilen Gruppe, die ähnlich dem
Serinrest bei den Serinproteasen die Peptidbindung angreift. Bsp: Papain aus der
Papayafrucht; Cathepsine, im Immunsystem von Säugern; Caspasen, Enzyme bei
der Apoptose
Bei den Aspartatproteasen ist das wichtigste Merkmal des aktiven Zentrums ein
Paar von Asparaginsäureresten, die zusammen einem Wassermolekül ermöglichen
eine Peptidbindung anzugreifen. Der eine Asparaginsäurerest verschiebt in seiner
deprotonierten Form das Gleichgewicht des angreifenden Wassermoleküls zur
Deprotonierung und der andere polarisiert in seiner protonierten Form die
Peptidcarbonylgruppe und erhöht so deren Empfindlichkeit für einen Angriff. Zu
dieser Enzymklasse gehört Renin, das bei der Blutdruckregulierung beteiligt ist, und
das Verdauungsenzym Pepsin.
Das aktive Zentrum der Metalloproteasen enthält ein gebundenes Metallion. Dies ist
fast immer ein Zinkion, das ein Wassermolekül aktiviert, welches dann als
nucleophile Gruppe die Peptidcarbonylgruppe angreift. Bsp: Thermolysin, ein
bakterielles Enym; Carboxypeptidase, ein Verdauungsenzym.
Bei jeder dieser drei Strategien wird Wasser oder eine andere nucleophile Gruppe
aktiviert, die Peptidcarbonylgruppe polarisiert und die anschliessende Stabilisierung
eines tetraedrischen Zwischenprodukts ermöglicht.
9.1.7 Proteaseinhibitoren sind wichtige Medikamente
Chemische Verbindungen, welche die Aktivität von Proteasen blockieren oder
verändern, zeigen starke biologische Auswirkungen. Die meisten natürlichen
Proteaseinhibitoren besitzen ähnliche Strukturen wie die Peptidsubstrate der
Enzyme, die sie hemmen. Mehrere wichtige Medikamente sind Proteaseinhibitoren
z.B. Captopril, Inhibitor der Metalloprotease ACE für die Regulierung des Blutdrucks;
Crixivan, Inhibitor der HIV-Protease für die Behandlung von AIDS. Spezifität ist bei
diesen als Medikamente verwendeten Proteaseinhibitoren sehr wichtig.
9.2 Carboanhydrasen machen eine schnelle Reaktion noch schneller
Kohlendioxid ist eines der hauptsächlichen Endprodukte im aeroben Metabolismus.
Bei komplexen Organismen wird Kohlendioxid ins Blut freigesetzt und zum Ausatmen
in die Lungen transportiert. Im Blut reagiert Kohlendioxid mit Wasser, wobei sich
Kohlensäure bildet, die durch Dissoziation eines Protons zu einem
Hydrogencarbonation wird.
Diese Hydratisierung erfolgt auch ohne Katalysator bei mittlerer Geschwindigkeit. Die
Carboanhydrasen sind als Katalysatoren aber notwendig, da die CO2Hydratisierung und die Kohlensäure-Dehyratisierung häufig an schnelle Reaktionen
gekoppelt sind. Die aktivsten dieser Enzyme, z.B. die menschliche Carboanhydrase
II, hydratisieren CO2 mit einer Geschwindigkeit von bis zu kkat=10^6s^-1.
9.2.1 Carboanhydrasen enthalten ein gebundenes Zinkion, das für die
katalytische Aktivität essenziell ist
Ein Drittel aller bekannten Proteine enthalten entweder gebundene Metallionen oder
benötigen solche Ionen für ihre Aktivität. Die chemische Reaktivität von Metallionen
ist bedingt durch ihre positive Ladung, durch ihre Fähigkeit zur Bildung von relativ
starken, aber kinetisch instabilen Bindungen und manchmal noch durch
verschiedene stabile Oxidationszustände. Zink kommt in biologischen Systemen nur
in der Oxidationsstufe +2 vor. Bei der Carboanhydrase ist ein Zinkatom immer an
mindestens vier Liganden gebunden, an Imidazolringe von drei Histidinresten und an
ein Wassermolekül.
9.2.2 Bei der Katalyse kommt es zur Aktivierung eines Wassermoleküls durch
Zink
Die Bindung eines Wassermoleküls an ein positiv geladenes zinkhaltiges Zentrum
verringert den pKs-Wert des Wassermoleküls von 15,7 auf 7. Aufgrund des
erniedrigten pKs-Wertes bildet sich eine gewisse Menge an Hydroxidionen. Ein
zinkgebundenes Hydroxidion ist ausreichend nucleophil, sodass es Kohlendioxid viel
besser angreifen kann als Wasser.
Mechanismus der Kohlendioxidhydratisierung (Abb. 9.25): Zink ermöglicht die
Freisetzung eines Protons aus dem Wassermolekül, sodass ein Hydroxidion
entsteht. Das CO2-Substrat bindet an das aktive Zentrum des Enzyms und wird so
positioniert, dass es mit dem Hydroxidion reagiert. Das Hydroxidion wandelt das
Kohlendioxidmolekül in ein Hydrogencarbonation um. Dessen Freisetzung und die
Bindung eines neuen Wassermoleküls regeneriert das katalytische Zentrum. Die
Bindung eines Wassermoleküls an Zink begünstigt also die Bildung eines
Übergangszustandes.
9.2.3 Ein Protonen-Shuttle ermöglicht die schnelle Regeneration der aktiven
Enzymform
Am Ende einer Kohlendioxidhydratisierung muss das zinkgebundene Wassermolekül
ein Proton abgeben, damit wieder die aktive Form des Enzyms entsteht. Die
Geschwindigkeit der Rückreaktion, das heisst die Protonierung des zinkgebundenen
Hydroxidions, wird begrenzt durch die Geschwindigkeit der Protonendiffusion.
Protonen diffundieren sehr schnell mit Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung
von etwa10^11 M^-1s^-1 (k-1). Die Geschwindigkeitskonstante der Rückreaktion
muss also geringer sein als dieser Wert. Da die Gleichgewichtskonstante bei pKs=7
K=k1/k-1=10^-7 ist, muss k1 geringer oder gleich 10^4s^-1 sein. Wenn jedoch
Kohlendioxid mit einer Geschwindigkeit von 10^6s^-1 hydratisiert wird, muss dieser
Schritt des Mechanismus mindestens genauso schnell erfolgen.
Lösung: Für die höchsten Geschwindigkeiten der Kohlendioxidhdratisierung muss ein
Puffer vorhanden sein. Der Puffer kann Protonen binden oder freisetzen. Der Vorteil
besteht darin, dass die Konzentration von Protonen und Hydroxidionen bei neutralem
pH-Wert auf jeweils 10^-7 begrenzt ist, während die Konzentration von
Pufferkomponenten viel grösser sein kann. Die molekularen Komponenten
zahlreicher Puffer sind aber zu gross, um in das aktive Zentrum der Carboanhydrase
gelangen zu können. Bei den Carboanhydrasen gibt einen Protonen-Shuttle,
dessen Hauptkomponente, das Histidin 64, Protonen vom zinkgebundenen
Wassermolekül an die Proteinoberfläche und dann weiter in den Puffer überträgt.
9.2.4 Durch konvergente Evolution sind bei verschiedenen Carboanhydrasen
aktive Zentren auf der Basis von Zink entstanden
Carboanhydrasen, die zu menschlichen Enzymen homolog sind und die man als Carboanhydrasen bezeichnet, kommen bei Tieren, einigen Bakterien und Algen
häufig vor. -Carboanhydrasen sind bei höheren Pflanzen und zahlreichen
Bakterienspezies zu finden. Die dritte Familie, die -Carboanhydrasen, hat man
zuerst bei Methanosarcina thermophila von den Archaea entdeckt. Eine konvergente
Evolution hat also mindestens dreimal Carboanhydrasen hervorgebracht, die auf
koordinierten Zinkionen basieren und deren katalytische Aktivität mit den
zinkgebundenen Wassermolekülen verknüpft ist.
9.3 Restriktionsenzyme führen hochspezifische Spaltungsreaktionen an DNA
aus
Bakterien und Archaea haben Mechanismen entwickelt, um sich selbst vor viralen
Infektionen zu schützen. Restriktionsendonucleasen (Restriktionsenzyme)
erkennen in der viralen DNA bestimmte Basensequenzen (Erkennungssequenzen
oder –stellen) und spalten die DNA an definierten Positionen. Die Typ-IIRestriktionsenzyme schneiden die DNA innerhalb ihrer Erkennungssequenz, andere
Arten an etwas von den Erkennungssequenzen entfernten Positionen.
Restriktionsendonucleasen müssen hochspezifisch sein, um nur DNA-Moleküle zu
schneiden, die Erkennungssequenzen enthalten, und die Wirts-DNA überhaupt nicht
anzugreifen. Die Wirts-DNA wird durch andere Enzyme geschützt, die man als
Methylasen bezeichnet. Sie methylieren Adeninbasen in den Erkennungssequenzen
der Wirtszelle. Die Enzympaare, Restriktionsendonuclease und Methylase,
bezeichnet man als Restriktions-Modifikations-Systeme.
9.3.1 Die Spaltung erfolgt über eine in-line-Verdrängung des 3’Sauerstoffatoms am Phosphor durch magnesiumaktiviertes Wasser
Die
Restriktionsendonucleasen
katalysieren
die
Hydrolyse
des
Phosphodiesterrückgrats der DNA. Dabei wird spezifisch die Bindung zwischen dem
3’-Sauerstoffatom und dem Phosphoratom gespalten. Die Produkte dieser Reaktion
sind DNA-Stränge mit einer freien 3’-Hydroxylgruppe und einer 5’-Phosphorylgruppe.
Diese Reaktion erfolgt über einen nucleophilen Angriff am Phosphoratom. Zwei
Mechanismen bieten sich dafür an: Mechanismus 1 mithilfe einer starken
nucleophilen Gruppe (Nu) über ein kovalent gebundenes Zwischenprodukt oder
Mechanismus 2 in einer direkten Hydrolyse (Abb. S.270/p 246). Jeder Mechanismus
geht von einer anderen nucleophilen Gruppe aus, die das Phosphoratom angreift. In
beiden Fällen handelt es sich jedoch um eine in-line-Verdrängung. Die
ankommende nucleophile Gruppe greift das Phosphoratom an, sodass ein
fünffachkoordinierter Übergangszustand in Form einer zweifachen trigonalen
Bipyramide mit dem Phosphoratom in der Mitte, der ankommenden nucleophilen
Gruppe an einer der Pyramidenspitzen und die zu erstzende Gruppe an der anderen
Spitze entsteht.
Da beim ersten Mechanismus am Phosphor zwei Verdrängungsreaktionen
stattfinden, würde sich die stereochemische Konfiguration am Phophoratom zweimal
hintereinander umkehren, sodass dieselbe Konfiguration erhalten bliebe. Beim
zweiten Mechanismus würde sich die Konfiguration jedes Mal bei einer
Verdrängungsreaktion umkehren. Die Analyse zeigte, dass sich die stereochemische
Konfiguration am Phosphoratom bei der Spaltung nur einmal umkehrt, was für einen
direkten Angriff von Wasser spricht.
9.3.2 Restriktionsenzyme benötigen für die katalytische Aktivität Magnesium
Restriktionsendonucleasen erfordern für ihre Aktivität Magnesium oder ein anderes
bivalentes Kation. Das Magnesiumion ist von sechs Liganden gebunden: drei
Wassermolekülen, zwei Carboxylate der Aspartatreste des Enzyms und ein
Sauersroffatom an der Schnittstelle. Untersuchungen haben gezeigt, dass ein
zweites Magnesiumion an einer benachbarten Position vorhanden sein muss, damit
die Restriktionsenzyme die DNA schneiden können.
9.3.3 Der vollständige katalytische Apparat bildet sich nur mit Komplexen aus
passenden DNA-Molekülen und sichert so die Spezifität
Die Erkennungssequenzen der meisten Restriktionsendonucleasen sind
umgekehrte Wiederholungen (inverted repeats). Diese Anordnung gibt der
dreidimensionalen
Struktur
der
Erkennungsstelle
eine
zweizählige
Rotationssymmetrie. Die Restriktionsenzyme zeigen eine entsprechende
Symmetrie, um die Erkennung zu ermöglichen. Das Enzym umgibt die DNA in Form
einer festen Klammer.
Zwischen dem Enzym und einer passenden DNA-Sequenz kommt es zu
charakteristischen Wechselwirkungen. Innerhalb der 5’-GATATC-3’-Sequenz treten
die G- und die A-Base am 5’-Ende eines jeden Stranges zusammen mit ihren
Watson-Crick-Bindungspartnern über Wasserstoffbrücken zu Aminosäureestern, die
sich in zwei Protonenschleifen befinden, in direkten Kontakt mit dem Enzym. Dabei
ragt bei jeder Untereinheit des Enzyms eine der Schleifen aus der Oberfläche
heraus. Das Auffälligste an diesem Komplex ist jedoch die Verformung der DNA,
die in der Mitte deutlich geknickt wird. Die mittleren beiden TA-Basenpaare treten
nicht mit dem Enzym in Kontakt, sind aber offenbar für den Knick erforderlich, weil
sie sich leicht verformen lassen. Die Störung der DNA-Struktur an dieser Stelle wirkt
sich gravierend auf die Spezifität der enzymatischen Reaktion aus.
Bei der EcoRV-Endonuclease hat man festgestellt, dass sich das Enzym bei
Abwesenheit von Magnesium mit annähernd derselben Affinität an alle DNASequenzen bindet, passende oder nicht. Die nicht passende DNA wird aber kaum
verformt, was wichtige Auswirkungen auf die Katalyse hat. Keine Phosphorylgruppe
gelangt in ausreichende Nähe zu den Aspartatresten des aktiven Zentrums, sodass
sich die Magnesiumbindungsstelle nur unvollständig bildet. Die Verformung des
Substrats und die anschliessende Bindung des Magnseiumions verbessern die
katalytische Spezifität der EcoRV-Endonucleasen um den Faktor 1'000'000, trotz der
geringen Unterschiede in Bezug auf die Substratbindung.
Bei der Bindung an das Enzym wird die DNA so verformt, dass zusätzliche
Kontaktstellen zwischen dem Enzym und dem Substrat entstehen; das erhöht die
Bindungsenergie. Jedoch wird dieser Gewinn durch den Energieaufwand beim
Verformen der DNA aus der entspannten Konformation wieder ausgeglichen. Also
besteht kein grosser Unterschied zwischen den Bindungsaffinitäten zu spezifischer
und unspezifischer DNA. Allerdings erhalten durch die Verformung des spezifischen
Komplexes die Bindungsstellen für das Magnesiumion ihre vollständige Struktur.
Enzyme können also die verfügbare Bindungsenergie nutzen, um Substrate zu
verformen und für die chemische Umwandlung vorzubereiten. Wechselwirkungen
innerhalb des Komplexes mit einem verformten Substrat stabilisieren den
Übergangszustand, der zur Hydrolyse der DNA führt.
Wenn sich an der Aminogruppe des Adeninnucleotids am 5’-Ende der
Erkennungssequenz eine Methylgruppe befindet, verhindert diese die Bildung einer
Wasserstoffbrücke und in Folge sind andere Wechselwirkungen zwischen dem
Enzym und dem DNA-Substrat unterbrochen; die für die Spaltung erforderliche
Verformung findet nicht statt. Also lässt sich durch die DNA-Verformung erklären, wie
die Methylierung die Katalyse blockiert und die DNA der Wirtszelle schützt.
9.3.4
Typ-II-Restriktionsenzyme
besitzen
einen
übereinstimmenden
katalytischen Core-Bereich und sind wahrscheinlich durch horizontalen
Gentransfer miteinander verwandt
Typ-II-Restriktionsenzyme kommen vor allem bei Archaea und Eubakterien vor. Die
gemeinsame Core-Struktur umfasst -Stränge, die die Aspatatreste enthalten,
welche die Bindungsstellen für Magnesiumionen bilden. Bakterien haben
möglicherweise von anderen Spezies Gene, die solche Enzyme codieren, durch
horizontalen Gentransfer übernommen. Die Sequenzen von EcoRI und RsrI
stimmen beispielsweise in einem Bereich von 266 Aminosäuren zu 50% überein,
allerdings sind diese Bakterienspezies nicht eng miteinander verwandt, was darauf
hindeutet, dass die beiden Spezies das Gen für das Enzym nach ihrer Arttrennung
aus demselben Ursprung erhalten haben. Bei Restriktion-Modifikations-Systemen hat
offenbar der Schutz vor Virusinfektionen den horizontalen Gentransfer begünstigt.
9.4 Nucleosidmonophosphat-Kinasen katalysieren den Austausch von
Phosphorylgruppen ohne vorhergehende Hydrolyse
Nucleosidmonophosphat-Kinasen (NMP-Kinasen) katalysieren die Übertragung der
endständigen Phosphorylgruppe von einem Nucleosidtriphosphat (NTP),
normalerweise ATP, auf die Phosphorylgruppe eines Nucleosidmonophosphats.
Dabei müssen sie die Konkurrenzreaktion, Übertragung der Phosphorylgruppe auf
ein Wassermolekül verhindern, was mithilfe des induced fit-Mechanismus möglich ist.
Ein Metallion verstärkt zusätzlich die Wechselwirkungen zwischen Enzym und
Substrat, wobei das Metall hier mit dem Substrat einen Komplex bildet.
9.4.1 NMP-Kinasen sind eine Familie von Enzymen, die P-Schleifen-Strukturen
enthalten
NMP-Kinasen enthalten eine konservierte NTP-Bindungsdomäne, welche aus einem
zentralen -Faltblatt, das an beiden Seiten von -Helices umgeben ist, besteht.
Zwischen dem ersten -Strang und der ersten Helix befindet sich die sogenannte PSchleife (Gly-X-X-X-X-Gly-Lys), welche mit den Phosphorylgruppen des
gebundenen Nucleotids in Wechselwirkung tritt.
9.4.2 Komplexe von Nucleosidtriphosphaten mit Magnesium (oder Mangan)
sind die eigentlichen Substrate für grundsätzlich alle NTP-abhängigen Enzyme
NMP-Kinasen sind ohne bivalente Metallionen, wie beispielsweise Magnesium oder
Mangan, grundsätzlich inaktiv. Der Metallion-Nucleotid-Komplex ist das eigentliche
Substrat der Enzyme. Die Bindung des Metallions an das Nucleotid erhöht die
Bindungsenergie. Erstens neutralisiert das Magnesiumion einen Teil der negativen
Ladung der Polyphosphatkette und verringert so unspezifische ionische
Wechselwirkungen zwischen dem Enzym und der Polyphosphatgruppe des
Nucleotids. Zweitens halten die Wechselwirkungen zwischen Magnesiumion und
Sauerstoffatom der Phosphorylgruppe das Nucleotid in einer genau definierten
Konformation fest. Ein Magnesiumion ist normalerweise in einer oktaedrischen
Struktur von sechs Gruppen umgeben, zwei Sauerstoffatomen und
Wassermolekülen. Drittens liefert das Magnesiumion zusätzliche Kontaktstellen für
eine Wechselwirkung zwischen dem ATP-Magnesium-Komplex und dem Enzym.
Manchmal binden Seitenketten des Enzyms direkt an das Magnesiumion. In anderen
Fällen interagiert das Enzym über Wasserstoffbrücken der Wassermoleküle, die an
das Ion angelagert sind, indirekt mit dem Magnesioumion.
9.4.3 Die Bindung von ATP induziert starke Konformationsänderungen
Die Strukturveränderungen im Kinasemolekül bei der Substratbindung sind ein
klassisches Beispiel für einen induced fit (Abb. 9.51). Die P-Schleife schliesst sich
über dem oberen Ende der Polyphosphatkette. Diese Bewegung ermöglich eine
Abwärtsbewegung der obersten Domäne des Enzyms, sodass diese über dem
gebundenen Nucleotid eine Art Deckel bildet. Wenn das ATP-Molekül auf diese
Weise gebunden ist, positioniert sich seine -Phosphorylgruppe in der Nähe der
Bindungsstelle des zweiten Substrats NMP. Die Bindung des zweiten Substrats NMP
führt zu zusätzlichen Konformationsänderungen. Beide Veränderungen stellen
sicher, dass nur dann eine katalytisch aktive Konformation entsteht, wenn sowohl
Donor als auch Akzeptor gebunden sind, um die hier sinnlose Übertragung der
Phosphorylgruppe auf Wasser zu verhindern. Das Enzym bindet seine beiden
Substrate in grosser Nähe zueinander und in der korrekten Orientierung, sodass der
Übergangszustand stabilisiert wird, der schliesslich zur Übertragung führt ->
Katalyse durch Annäherung.
9.4.4 P-Schleife-NTPase-Domänen sind in zahlreichen wichtigen Proteinen
vorhanden
Ähnliche und fast immer homologe Domänen wie bei den NMP-Kinasen kommen bei
vielen biochemisch essenziellen Proteinen vor. Bsp: ATP-Synthase, molekulare
Motorproteine (Myosin), signalübertragende Proteine (Transducin), Proteine für die
Translation von mRNA in Proteine, DNA-und RNA-entwindende Helikasen. Die weite
Verbreitung von P-Schleife-NTPase-Domänen lässt sich wahrscheinlich am besten
dadurch erklären, dass sie durch Bindung grundlegende Konformationsänderungen
ausführen können.