Wissensmarkt zum Ende der Physikausbildung

3D-Bildgebung des lakuno-kanalikulären Netzwerks
in Knochen
Mentorierte Arbeit fachwissenschaftliche Vertiefung
Lehrdiplom für Maturitätsschulen in Physik
ETH Zürich
Betreut durch Dr. Christian Helm
Verfasst von Matias Meier
September 2011
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung............................................................................................................. 3
2.
Das lakuno-kanalikuläre Netzwerk ...................................................................... 5
3.
2.1.
Knochen – eine poröse Struktur ................................................................... 5
2.2.
Knochenzellen und Knochenumbau ............................................................. 9
2.3.
Knochenstabilität und Osteoporose............................................................ 11
Bildgebungsmethoden für das LCN ................................................................... 14
3.1.
Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) ........................................... 14
3.2.
Computertomographie (CT) ....................................................................... 16
3.3.
Focused Ion Beam und Scanning Electron Microscope (FIB/SEM) ........... 20
4.
Schlussfolgerung ............................................................................................... 25
5.
Literaturverzeichnis ........................................................................................... 27
6.
Referenzen aller Abbildungen ........................................................................... 29
Eidesstattliche Erklärung .......................................................................................... 30
Anhang: Weiterführende Links und Literatur ............................................................ 31
2/31
1. Einleitung
Diese Arbeit nimmt sich eines interdisziplinären Themas und gleichzeitig auch eines
aktuellen Forschungsgebiets an. Auf der einen Seite betrifft sie die Mikroskopie und
verschiedene Bildgebungsmethoden, die in der Lage sind, von einer Probe einen
dreidimensionalen (3D) Datensatz zu erzeugen, der anschliessend elektronisch
analysiert werden kann. Ohne Wissen in Physik und Informatik kann weder die
Bildgebung, noch die anschliessende Analyse erfolgreich verlaufen. Zum anderen
handelt diese Arbeit vom Aufbau unserer Knochen, was wohl in den Themenbereich
der Biologie gehört. Allerdings sind auch hier die Übergänge zurück zur Physik oder
den Ingenieurwissenschaften fliessend. Dann nämlich, wenn es um Fragen der
Knochenstruktur, Knochenstabilität und Knochengesundheit geht, die nicht nur mit
entsprechende
experimentellen
Methoden,
sondern
auch
mit
numerischen
Simulationen erforscht werden. Doch weshalb sollte ein interdisziplinäres Thema wie
die „3D-Bildgebung des lakuno-kanalikulären Netzwerks in Knochen“ von Bedeutung
sein?
Knochen ist naturgemäss ein Thema, das uns alle angeht. Das menschliche Skelett
wächst mit uns und ist ausserdem in der Lage, sich äusseren mechanischen
Einflüssen anzupassen. In der biologischen Grundlagenforschung ist man sich aber
nicht im Klaren, wie ein Knochen genau „weiss“ wo er aufgrund von erhöhter
mechanischer Belastung verstärkt werden muss und wo nicht. Sicher ist, dass das
lakuno-kanalikuläre Netzwerk im Knochen dabei eine zentrale Rolle spielt. Allerdings
ist es nicht ganz einfach, Informationen über dieses Netzwerk zu erhalten. Denn es
ist nicht nur mikroskopisch klein, sondern auch im Knocheninnern verborgen. Klar ist
ebenfalls, dass für einen gesunden Knochen ein intaktes und funktionierendes
lakuno-kanalikuläres Netzwerk Voraussetzung ist und dass Knochenkrankheiten wie
zum Beispiel Osteoporose mit einem gestörten Netzwerk in Verbindung gebracht
werden können.
Die Ziele dieser Arbeit sind die folgenden: Zuerst soll geklärt werden, um was es sich
beim lakuno-kanalikulären Netzwerk in Knochen überhaupt handelt. Dazu werden im
ersten Kapitel der Knochenaufbau und einige Grundlagen der Knochenbiologie
behandelt. Zudem wird kurz auf die Knochenkrankheit Osteoporose und auf die mit
ihr einhergehenden strukturellen Änderungen des Knochengewebes eingegangen.
Das zweite Kapitel präsentiert verschiedene Bildgebungsmethoden, mit denen
aktuell versucht wird, das lakuno-kanalikuläre Netzwerk in Knochen dreidimensional
3/31
abzubilden und quantitativ zu erfassen. In diesem Kapitel werden aktuelle
Forschungsresultate
präsentiert
und
die
ersten
auf
3D-Daten
basierenden
Visualisierungen und Quantifizierungen des LCN. Die Arbeit schliesst mit einer
Zusammenfassung der zentralen Punkte und Literaturhinweisen, so dass sich der
interessierte Leser über die verschiedenen hier diskutierten Themen weiter
informieren kann.
4/31
2. Das lakuno-kanalikuläre Netzwerk
In diesem Kapitel steht die folgende Frage im Zentrum: „Was ist das lakunokanalikuläre Netzwerk in Knochen?“ Um diese Frage zu beantworten, gibt der erste
Abschnitt einen hierarchisch gegliederten Überblick über den Aufbau von Knochen.
Ausgehend von den makroskopisch sichtbaren Strukturen werden Funktion, Aufbau
und Zusammensetzung von Knochen diskutiert, um schliesslich auf der zellulären
Ebene beim lakuno-kanalikulären Netzwerk anzukommen. Anschliessend werden die
drei wichtigsten Zelltypen in Knochen – Osteoblasten, Osteoklasten und Osteozyten
– und der mit ihnen eng verbundene Auf- und Umbau von Knochen diskutiert. Das
Kapitel schliesst mit einem Abschnitt, der die Knochenkrankheit Osteoporose und die
damit im Kochen einhergehenden Änderungen thematisiert. Dabei wird ein
besonderes Augenmerk auf die mit dieser Krankheit einher gehenden makro- und
mikroskopischen Veränderungen der Knochenstruktur gelegt. Die in diesem Kapitel
verwendeten Fakten stammen, falls nicht anders präzisiert, aus dem Buch „Bone
Mechanics Handbook“ von Stephen C. Cowin [1].
2.1. Knochen – eine poröse Struktur
Abbildung 1: Das menschliche
Skelett
5/31
Die gut 200 Knochen des menschlichen Skeletts geben dem menschlichen Körper
neben der bekannten, in Abbildung 1 gezeigten Form auch seine Stabilität. Die
Knochen ermöglichen im Zusammenspiel mit der Muskulatur die Fortbewegung und
bieten den inneren Organen Schutz. Darüber hinaus spielen unsere Knochen als
Kalziumspeicher eine wichtige Rolle im Kalziumstoffwechsel des menschlichen
Körpers und sie beherbergen das für die Blutbildung wichtige Knochenmark.
Phänomenologisch kann man zwischen langen (zum Beispiel Oberschenkel- und
Oberarmknochen), kurzen (zum Beispiel Hand- und Fusswurzelknochen), flachen
(zum Beispiel Schulterblatt und rippen) und unregelmässigen Knochen (zum Beispiel
Wirbel) unterscheiden [2]. Im Folgenden soll nicht weiter auf die Unterschiede
zwischen den verschiedenen Knochenformen eingegangen werden, sondern anhand
von langen Knochen, auch Röhrenknochen genannt, grundsätzlich Aufbau und
Struktur des Knochengewebes näher diskutiert werden. Wie in Abbildung 2 gezeigt
lassen sich makroskopisch zwei Knochenformen unterscheiden: Kortikaler Knochen
und
trabekulärer
Knochen.
Den
beiden
Knochenformen
gleich
ist
ihre
Zusammensetzung. Knochen besteht zu etwa 65 % aus Mineralen (unreiner
Trabekulärer Knochen
Kortikaler Knochen
Abbildung 2: Schematischer Querschnitt eines langen Knochens.
Makroskopisch lässt sich kortikaler (oder kompakter) Knochen
von trabekulärem (oder spangiösem) Knochen unterscheiden.
6/31
Hydroxylapatit
Ca10(PO4)6(OH)2
mit
eingebetteten
Salzen
oder
chemischen
Elementen wie Karbonat, Zitrat, Magnesium, Fluorid oder Strontium). Unterschiedlich
ist jedoch der Anteil an Knochengewebe (organisches und mineralisiertes Gewebe)
pro Volumeneinheit. Dieser Beträgt bei kortikalem Knochen etwa 90 %, bei
trabekulärem Knochen lediglich 5 % - 35 % [2]. Dieser grosse Unterschied zwischen
trabekulärem und kortikalem Knochen lässt sich rein visuell anhand von Abbildung 2
nachvollziehen: Während es sich bei trabekulärem Knochen um eine schwammartige
Struktur aus miteinander verbundenen (etwa 150 μm dicken [2]) stab- oder
plattenartigen Strukturelementen (Trabekel genannt) handelt, ist kortikaler Knochen
äusserst kompakt. So macht kortikaler Knochen, der vor allem eine stützende und
schützende Funktion inne hat, rund 80 % der menschlichen Knochenmasse aus.
Auch trabekulärer Knochen hat neben einer metabolischen (trabekulärer Knochen ist
stärker in den Kalzium-stoffwechsel eingebunden als kortikaler) eine stützende
Funktion, die sich vor allem in der Orientierung der Trabekel widerspiegelt, wie dies
in Abbildung 3 für einen menschlichen Oberschenkelknochen gezeigt ist. Dabei
unterscheiden sich Orientierung und Form der einzelnen Trabekel je nach
Abbildung 3: Querschnitt eines
menschlichen Oberschenkelknochens
anatomischer Position und Funktion des Knochens. Ausserdem unterscheiden sich
auch die Anteile an kortikalem und trabekulärem Knochen je nach anatomischer
Position stark: Während die Elle aus ungefähr 92 % kortikalem und 8 % trabekulärem
Knochen besteht, weist ein typischer Wirbel 62 % kortikaler und 38 % trabekulärer
Knochen auf.
Kortikaler und trabekulärer Knochen sind aber keinesfalls homogen, sondern weisen
Porositäten unterschiedlicher Grössenordnung auf. Eine nur in kortikalem Knochen
7/31
Abbildung 4: Knochen ist eine poröse Struktur. In kortikalem Knochen finden sich
20 – 40 μm dicke Kanäle (Havers-Kanäle) für die Blutversorgung sowie das noch
feinere lakuno-kanalikuläre Netzwerk (LCN). Die rechte Abbildung zeigt mittig
einen Querschnitt eines Havers-Kanals sowie Kanalikuli und Lakunen des LCN.
vorkommende Porosität ist in Abbildung 4 abgebildet. Es handelt sich dabei um die
20 – 40 μm dicken Havers-Kanäle, welche die zur Nährstoffversorgung des
Knochens nötigen Blutgefässe beherbergen. Diese Havers-Kanäle wiederholen sich
in Abständen von mehreren hundert Mikrometer und durchsetzten so den ganzen
kortikalen Knochen. Zwischen diesen Kanälen befindet sich ein weiteres System von
noch feineren Tunneln und Kavitäten, das ebenfalls in Abbildung 4 erkennbar ist.
Dieses System durchsetzt nicht nur kortikalen, sondern auch trabekulären Knochen
vollständig. Die kleinen, ellipsoidförmigen Kavitäten – Lakunen oder OsteozytLakunen genannt – haben eine etwa 10 μm lange Halbachse. Von jeder dieser
Lakunen gehen etwa 50 feine Tunnels – Kanalikuli genannt – aus, welche die
Lakunen nicht nur miteinander, sondern auch mit den Havers-Kanälen verbinden [3].
Die durchschnittlich etwa 100 nm bis 250 nm dicken Kanalikuli bilden zusammen mit
den Lakunen das lakuno-kanalikuläre Netzwerk (LCN), wie es in Abbildung 5 links
Abbildung 5: Schematische Darstellung des lakuno-kanalikulären Netzwerks
(LCN) in Knochen. Eingebettet in das LCN sind die Osteozyten mit ihren
langen, dünnen Zellfortsätzen.
8/31
schematisch dargestellt ist [3]. Eingebettet in die Lakunen befinden sich die
Zellkörper der Osteozyten. Osteozyten sind die am meisten vorkommende Zellenart
in Knochen und die einzige, die sich direkt im Knochengewebe befindet. Mit ihren
langen Zellfortsätzen, die sich in den Kanalikuli befinden, stehen sie nicht nur mit
benachbarten Osteozyten, sondern auch mit anderen Zelltypen in Kontakt. Bei der
mittleren Distanz zwischen den Lakunen kann von einem Wert von 25 – 30 μm
ausgegangen werden [3]. Auf diese Weise bilden Osteozyten, wie in Abbildung 5
gezeigt, ein immenses zelluläres Netzwerk im Knochen, dessen negativer Abdruck
das LCN ist [3]. Das zelluläre Osteozyten-Netzwerk ist im LCN von Flüssigkeit
umgeben, welche die Nährstoffversorgung der Zellen sicher stellt.
Osteozyten sind lediglich eine von drei Haupttypen von Knochenzellen, die im
folgenden Abschnitt besprochen werden. Dabei soll klar werden, dass die Fähigkeit
von Knochen, sich selbst zu regenerieren, aufs Engste mit diesen Zellen und deren
Funktion verknüpft ist.
2.2. Knochenzellen und Knochenumbau
Knochengewebe ist kein totes Material. Denn es wird nicht nur bei Wachstum oder
Knochenbrüchen neu gebildet; es passt sich auch wechselnden mechanischen
Belastungen an. Bereits im 19. Jahrhundert war bekannt, dass sich Knochen zum
einen bei stärkerer mechanischer Belastung aufbaut, zum anderen bei fehlender
Belastung abbaut. Dieser unter dem Namen „Wolffsches Gesetz“ bekannte
Sachverhalt bedingt die Existenz von Zellen, die Knochen aufbauen können und
Zellen, die Knochen abbauen können. Es sind dies die Osteoblasten, die
Knochengewebe bilden und die Osteoklasten, die Knochengewebe absorbieren
können. Diese beiden Zellarten kommen aber nicht nur bei wachsender oder
sinkender mechanischer Belastung zum Einsatz. In unseren Knochen findet ein
ständig ablaufender Umbauprozess statt. Man spricht von „bone remodeling“, das
unter normalen Umständen verhindert, dass sich Mikrofrakturen im Knochen
ansammeln können und es zu Ermüdungsbrüchen kommt [2]. Abbildung 6 zeigt
anhand eines Trabekels den Ablauf beim Knochenumbau: Nach der Resorption des
alten Knochengewebes durch Osteoklasten wird neues durch die Osteoblasten
gebildet. Unsere Knochen gleichen somit einer permanenten Baustelle, bei der
innerhalb von 10 Jahren das gesamte Knochenmaterial einmal ersetzt wird [2]. Bei
diesem Umbauprozess müssen Knochenaufbau und Knochenabbau fein aufeinander
abgestimmt sein: Kommt es doch bei einer negativen Bilanz des Knochenumsatzes
9/31
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Knochenumbaus
an einem Trabekel. Abbau des Knochens durch einen
Osteozyten (Resorption) und anschliessender Aufbau durch
Osteblasten (Formation).
zum Schwund von mineralisiertem Knochengewebe, was in Osteoporose münden
kann [2].
Doch woher wissen die Osteoklasten und Osteoblasten, wann und wo sie in unseren
Knochen gebraucht werden? Diese Frage ist noch nicht abschliessend geklärt. Man
vermutet aber, dass die bereits im letzten Abschnitt erwähnten Osteozyten und das
LCN in der Antwort zu dieser Frage eine entscheidende Rolle spielen. Osteozyten
sind in der Lage, mechanische Belastung zu spüren. Ausserdem geht man davon
aus, dass sie in der Lage sind, Mikrofrakturen zu erkennen und dies in
entsprechende biologische Signale umsetzen können [2]. Auf diese Weise würde die
Signalisationskette in Gang gesetzt, welche die Osteoklasten und Osteoblasten
schliesslich am entsprechenden Ort ihre Arbeit aufnehmen lässt. Mit ihrem
immensen 3D-Netzwerk im Knocheninnern und ihrer Vernetzung mit anderen
Knochenzellen wären die Osteozyten jedenfalls ideal für diese Aufgabe geeignet.
Der genaue Mechanismus, wie Osteozyten die mechanische Belastung registrieren
können, ist aber noch unklar. Neben direkter Knochenverformung scheinen auch
indirekte Mechanismen wie der Flüssigkeitsstrom in den Kanalikuli eine wichtige
Rolle zu spielen [2].
Da das LCN für direkte Messungen nur schwer zugänglich ist, werden diese
Mechanismen rechnerisch mit Hilfe der Finite-Elemente-Methode (FE) oder
numerischer Strömungsmechanik (CFD) untersucht [4, 5]. Diesen Modellen fehlen
aber genaue Information zur Morphologie des LCN, da diese bisher mit den zur
10/31
Verfügung stehenden Bildgebungsmethoden nur ungenügend erfasst werden konnte.
Eine ideale Bildgebungsmethode würde die Morphologie des LCN unverändert und
exakt wiedergeben, so dass aus diesen Daten die für die Modelle nötigen
morphologischen Parameter bestimmt werden könnten. Um diesen Anforderungen
gerecht zu werden, kommt nur eine Bildgebungsmethode in Frage, welche das LCN
in 3D erfassen und abbilden kann.
Es besteht folglich ein Bedürfnis, das LCN möglichst akkurat abbilden zu können.
Davon
verspricht
man
sich
nicht
nur
eine
Verfeinerung
der
erwähnten
Computermodelle, sondern auch ein grundlegend besseres Verständnis der
Knochenbiologie.
Unterscheidet
sich
doch
das
LCN
nicht
nur
zwischen
verschiedenen anatomischen Positionen, kortikalem und trabekulärem Knochen,
sondern auch nach Knochenalter und Knochenkrankheiten [3]. Die Veränderung des
LCN mit verschiedenen Knochenkrankheiten und die damit einhergehende
Veränderung der Knochenstruktur soll im folgenden Abschnitt näher diskutiert
werden, bevor dann im nächsten Kapitel verschiedene 3D-Bildgebungsmethoden
besprochen werden, die für eine 3D-Erfassung des LCN eignen könnten.
2.3. Knochenstabilität und Osteoporose
Osteoporose ist eine Knochenkrankheit, die sich durch sinkende Knochendichte und
verminderte Intaktheit des trabekulären Knochens auszeichnet [6]. Dies hat eine
verminderte Knochenqualität und ein erhöhtes Knochenbruchrisiko zur Folge. Die
Kosten der durch Osteoporose verursachten Knochenbrüche wurden für Europa und
das Jahr 2000 auf 36 Milliarden Euro geschätzt [7]. Aufgrund der demographischen
Entwicklung werden diese Kosten bis zum Jahre 2050 weiter ansteigen – auf
geschätzte 77 Milliarden Euro [7]. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) definiert
Osteoporose mit Hilfe des sogenannten T-Wertes: Ein Mensch leidet an
Osteoporose, wenn seine Knochendichte um mindestens 2.5 Standardabweichungen
(dies entspricht einem T-Wert von -2.5) unter dem durchschnittlichen Wert der
maximalen Knochendichte eines jungen Erwachsenen seiner Vergleichsgruppe liegt.
Dies ist in Abbildung 7 links exemplarisch für die Knochendichte der Hüfte einer
europäischen Frau in mg/cm2 gezeigt [6]. Da der Mensch seine maximale
Knochendichte etwa bei seinem dreissigsten Lebensjahr erreicht, gibt es zwei
Hauptgründe für Osteoporose: Der kontinuierliche Verlust von Knochen mit
zunehmendem Alter, wie dies Abbildung 7 rechts zeigt, und eine ungenügende
11/31
Abbildung 7: Normalverteilung der Knochendichte für die Hüfte einer europäischen Frau in
mg/cm2. Unterschreitet die Knochendichte den Mittelwert der maximalen Knochendichte einer
gesunden, jungen Erwachsenen um mehr als 2.5 Standardabweichungen, spricht man von
Osteoporose (links). Liegt der T-Wert zwischen -1 und -2.5 spricht man von Osteopenie. Da die
Knochenmasse mit zunehmendem Alter abnimmt, verschiebt sich die Normalverteilung mit
zunehmendem Alter zu kleineren Knochendichten. Damit steigt die Anzahl der Personen mit
Osteoporose mit zunehmendem Alter per Definition (rechts).
Knochenbildung im Jugendalter, was einen erniedrigten Wert der maximalen
Knochendichte zur Folge hat.
Wie bereits erwähnt zeigt sich Osteoporose nicht nur in einer Abnahme der
Knochendichte, sondern auch in einem Verfall der Struktur des trabekulären
Knochens. Dies ist in Abbildung 8 anhand von zwei tomographischen Aufnahmen
von Knochenbiopsien eines gesunden und eines osteoporotischen menschlichen
Lendenwirbels illustriert. Durch die verminderte Konnektivität und die verminderte
Anzahl der Trabekel kann das osteoporotische Knochengewebe nicht mehr dieselbe
stützende Funktion übernehmen wie das gesunde Knochengewebe. Knochenbrüche
können die Folge sein.
Abbildung 8: Trabeklärer Knochen eines menschlichen Lendenwirbels für
einen gesunden (links) und einen osteoporotischen Knochen (rechts).
12/31
Neben der Knochendichte und der Struktur des trabekulären Knochens wird auch die
Struktur des Osteozyten-Netzwerks und des LCN durch Osteoporose (und andere
Knochenkrankheiten) beeinflusst. Während sich gesunder Knochen durch eine
grosse Anzahl von Kanalikuli und einem hohen Grad an Konnektivität auszeichnet
(vergleiche Abbildung 4 rechts und Abbildung 9 links), zeigt das LCN von
osteoporotischem Knochengewebe verminderte Orientierung und Konnektivität, wie
in Abbildung 9 zu erkennen ist [3]. Ein funktionierendes Osteozyten-Netzwerk und
ein intaktes LCN sind also auf das Engste mit einem gesunden Knochengewebe
verbunden.
Aufgrund
mangelnder
3D-Bildgebungsmethoden
sind
die
Strukturänderungen des LCN mit verschiedenen Knochenkrankheiten bisher nur
ungenügend erforscht [3]. Eine vielversprechende Anwendung einer exakten
Bildgebung des LCN wäre nicht nur eine Erforschung der Struktur des LCN in einem
frühen Stadium von Knochenkrankheiten, sondern auch die Möglichkeit, eventuelle
Behandlungserfolge in klinischen Studien nachweisen zu können [8]. Abschliessend
kann festgehalten werden, dass eine akkurate Bildgebung und Quantifizierung der
Morphologie des LCN für ein besseres Verständnis der Knochenbiologie von grossen
Interesse
wäre
[3].
Das
folgende
Kapitel
widmet
sich
verschiedenen
Bildgebungsmethoden, mit welchen dieses Ziel gegenwärtig verfolgt wird.
Abbildung 9: 3D Rekonstruktion des Osteozyten-Netzwerks im kortikalen
Knochen eines menschlichen Oberschenkels. Der Unterschied in
Konnektivität zwischen gesundem (links) und osteoporotischem Knochen
(Mitte und rechts) ist klar ersichtlich. Die Aufnahmen wurden mit Hilfe eines
konfokalen Laser Scanning Mikroskop (CLSM) gemacht.
13/31
3. Bildgebungsmethoden für das LCN
Bis heute gibt es keine befriedigenden Daten zur Morphologie des LCN. Weder für
gesundes, noch für pathologisches Knochengewebe. Dies hat neben der
Unzugänglichkeit des LCN innerhalb der mineralisierten Knochenmatrix auch damit
zu tun, dass sich seine Strukturen von weniger als 100 nm bis 10 μm und damit über
drei Grössenordnungen erstrecken, es einen immensen Vernetzungsgrad aufweist
und sich durch den ganzen Knochen erstreckt. Eine ideale Bildgebungsmethode,
sollte eine Auflösung haben, die mindestens um den Faktor 2 kleiner ist, als die
kleinsten Kanalikulidurchmesser. Gleichzeitig müsste sie die Möglichkeit bieten,
einen relevanten Bereich des LCN abbilden zu können. Dies bedeutet einen Bereich,
der neben den Kanalikuli auch mehrere Lakunen beinhaltet, so dass die Morphologie
des LCN in verlässlicher Weise quantifizieren werden könnte [3]. Um ein exaktes
Abbild des LCN aufnehmen zu können, müsste es sich bei der idealen
Bildgebungsmethode um eine handeln, die 3D-Daten liefern könnte. Und dies am
besten, ohne das untersuchte Gewebe zu beschädigen.
Natürlich ist die ideale Bildgebungsmethode illusorisch. Deshalb werden in den
folgenden Abschnitten verschiedene Bildgebungsmethoden vorgestellt, welche
dieses Ideal annähernd erfüllen. Für jede Methode werden zudem die erzielten
Resultate bei der Visualisierung und Quantifizierung des LCN präsentiert. Das
Kapitel startet mit einem Abschnitt zum konfokalen Laser Scanning Mikroskop
(CLSM). Im zweiten Abschnitt steht die Computertomographie (CT) und im
Speziellen die ptychographische CT im Zentrum. Das Kapitel schliesst mit einer
Betrachtung des kombinierten Einsatzes von Focused Ion Beam (FIB) und eines
Scanning Electron Microscope (SEM).
3.1. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)
Da es sich bei einem CLSM um ein Lichtmikroskop handelt, ist seine Auflösung
beugungslimitiert. Dies bedeutet eine Auflösung innerhalb einer Fokusebene von
rund 200 nm (laterale Auflösung) und eine Auflösung zwischen den Fokusebenen
(axiale Auflösung) von rund 450 nm [9]. Obwohl dies nicht ausreichen kann, um ein
vollständiges Bild des LCN erhalten zu können, wird in diesem Abschnitt kurz auf
diese Technik eingegangen. Nicht nur, weil CLSM eindrückliche Bilder wie Abbildung
9 liefern kann, sondern auch weil an Möglichkeiten gearbeitet wird, das
14/31
Beugungslimit mit auf Interferenz oder auf nicht linearen Phänomenen beruhenden
Methoden zu umgehen [3, 9, 10].
Die grundsätzliche Funktionsweise eines konfokalen Mikroskops wie des CLSM ist in
Abbildung 10 gezeigt. Im Unterschied zu einem konventionellen Lichtmikroskop wird
bei einem konfokalen Mikroskop das zu untersuchende Objekt nur punktweise
Abbildung 10: Funktionsweise eines Konfokalmikroskops. Das zu untersuchende
Objekt wird punktweise abgerastert, wobei die Lochblende vor dem Detektor
störendes Streulicht von ausserhalb der Fokusebene ausblendet.
beleuchtet. Zusätzlich wird durch eine Lochblende verhindert, dass Licht von
ausserhalb der Fokalebene beim Detektor eintrifft. Dies erlaubt eine verbesserte
Auflösung in axialer Richtung und es werden kontrastreichere Bilder erreicht, als bei
der konventionellen Lichtmikroskopie [11]. Bei der CLSM benützt man einen Laser,
um das zu untersuchende Objekt punktweise abzurastern. So entsteht am Computer
Pixel für Pixel das gewünschte Bild. Durch das zusätzliche Variieren der Fokusebene
lässt sich ein Stapel von mehreren Bildern aufnehmen, die zusätzlich eine
Tiefeninformation liefern. Durch geeignete Software lässt sich dieser Stapel
anschliessend zu einem 3D-Bild zusammenfügen. Besonders eindrücklich ist die
Verwendung von CLSM im Fluoreszenzmodus. Durch den Einsatz geeigneter
Fluorophore, die an die gewünschten Strukturen des zu untersuchenden Objekts
binden, können diese besonders gut sichtbar gemacht werden .Das Laserlicht wird
dann dazu verwendet, die Fluorophore anzuregen. Die in Abbildung 9 gezeigten
Bilder sind auf diese Weise entstanden.
Obwohl CLSM in der Knochenbiologie einen festen Platz hat, eignet es sich nicht nur
wegen seiner limitierten Auflösung nur bedingt zur Bildgebung des LCN. Auch die
limitierte Eindringtiefe des Lichts von 100-150 μm in die Knochenstruktur
15/31
verunmöglicht die Untersuchung von grösseren Knochenvolumina ohne eine
mechanische Bearbeitung derselben [3, 12]. Wir verlassen deshalb den Bereich der
Lichtmikroskopie und wenden uns einer Technik zu, die 3D-Daten eines Objekts
liefern kann, ohne dass dieses mechanisch zerschnitten werden müsste: der CT.
3.2. Computertomographie (CT)
Nach
der
Einführung
der
CT
in
den
späten
1970er-Jahren
ist
diese
Bildgebungsmethode heute aus der Medizin nicht mehr wegzudenken. Die derzeit in
der medizinischen Diagnostik eingesetzten Geräte warten mit eindrücklichen Werten
auf: Eine Ganzkörpertomographie ist in weniger als 4 Sekunden möglich [13] und
Auflösungen von bis 200 μm sind Standard [14]. Für die Bildgebung des LCN sind
diese Geräte aber nicht geeignet, verfehlen sie doch die dafür nötige räumliche
Auflösung um über drei Grössenordnungen. Bessere Auflösungen liefern CTDesktopsysteme mit Auflösungen im Mikrometerbereich [15-17]. Mit diesen Geräten
kann die trabekuläre Struktur von Knochen, wie es in Abbildung 8 gezeigt ist,
zerstörungsfrei, dreidimensional und auch quantitativ erfasst werden. Dies ist zentral,
um eine Beziehung zwischen mikroskopischen Merkmalen, Knochenstabilität und
Knochenkrankheiten oder Therapieansätzen herstellen zu können [18]. Allerdings
reicht die Auflösung dieser Geräte nicht, um selbiges auch für das LCN leisten zu
können.
Um
der
dazu
nötigen
Auflösung
näher
zu
kommen,
wird
Synchrotronstrahlung-basierete Computertomographie (SR CT) verwendet. Das
Grundprinzip der SR CT und erste damit erzielte Resultate in der Visualisierung des
LCN sollen im folgenden Abschnitt diskutiert werden.
Der Hauptunterschied zwischen der klinischen CT und SR CT ist die Herkunft der
verwendeten Röntgenstrahlung. Während bei klinischen Geräten die für die CT
notwendige Röntgenstrahlung durch Röntgenröhren erzeugt wird, geschieht dies bei
einem Synchrotron durch Ablenken von geladenen Teilchen – Elektronen im Falle
der Lichtquelle Schweiz (SLS) – die sich in einem Speicherring befinden. Der grösste
Vorteil der Synchrotronröntgenstrahlung gegenüber der Röntgenstrahlung einer
Röntgenröhre ist ihre Brillanz (Anzahl Photonen pro Sekunde, Fläche, Raumwinkel
und spektraler Bandbreite [19]). Sie übersteigt diejenige einer gewöhnlichen
Röntgenröhre um 12 Grössenordnungen [19]. Eine hohe Brillanz ist nicht nur wichtig,
um eine hohe räumliche Auflösung zu erreichen – die Anzahl Photonen, die für eine
bestimmte Bildqualität notwendig ist, steigt mindestens mit w 4 , wobei w das
16/31
Längenmass der räumlichen Auflösung bezeichnet [20] – sondern auch um die
Belichtungszeiten der einzelnen Aufnahmen möglichst gering halten zu können.
Dies ist besonders wichtig im Falle der CT, da vom zu untersuchenden Objekt
mehrere
hundert
Aufnahmen
(Projektionen)
aus
verschiedenen
Winkeln
aufgenommen werden müssen. Die Grundidee der CT besteht nun darin, aus diesen
Projektionen auf die innere Struktur des untersuchten Objekts zu schliessen. Es gibt
verschiedene Methoden, um aus den Projektionen die 3D-Rekonstruktion des
untersuchten Objekts zu berechnen. Am Häufigsten (bei allen Anwendungen mit
paralleler Strahlgeometrie) wird die gefilterte Rückprojektion verwendet. Dabei
werden die aufgenommenen Projektionen gefiltert und zurück in den Raum projiziert.
Aus der Überlagerung der Rückprojektionen ergibt sich dann die gesuchte innere
Struktur des untersuchten Objekts. Die gefilterte Rückprojektion kann mathematisch
mit Hilfe der Fourier-Transformation durchgeführt werden: Aus den gemessenen
Projektionen lassen sich die zweidimensionalen Fourier-Transformierten der
Objektquerschnitte berechnen. Durch die Rücktransformation ergibt sich dann die
gesuchte innere Objektstruktur [21]. Auf die Grundlagen der CT und der gefilterten
Rückprojektion soll hier aber nicht weiter eingegangen werden. Der interessierte
Leser findet in den Quellen [21] und [20] eine gute Einführung in die mathematischen
Prinzipien der CT. Weitere Informationen zu den Grundlagen der CT und zur
Gerätetechnologie sind in Referenz [14] zu finden.
Wir werden uns hier auf die Frage beschränken, weshalb mit Hilfe von
Röntgenstrahlung überhaupt Bilder erzeugt werden können. Trifft Röntgenstrahlung
auf Gewebe, kann es absorbiert, reflektiert, abgelenkt werden und ausserdem eine
Phasenverschiebung erfahren [20]. CT, wie es in verschiedenen Anwendungen
mehrheitlich benützt wird, nützt den Kontrast, der aufgrund der je nach Gewebeart
unterschiedlichen
Absorption
der
Röntgenstrahlung
entsteht.
Dieser
Absorptionskontrast ändert sich ungefähr mit Z 4 , wobei Z die Ordnungszahl der
untersuchten Atome bezeichnet [20]. Dies erklärt die gute Sichtbarkeit von Knochen
in Röntgenbildern oder CT-Aufnahmen, aber auch die schlechte Sichtbarkeit von
Gewebe, das aus Elementen kleinerer Ordnungszahl besteht wie dies zum Beispiel
Muskulatur oder Fett tun. Objekte, die lediglich schwach absorbieren, sind also durch
absorptionsbasierte CT nur sehr schwer darstellbar. Abhilfe kann hier die Tatsache
schaffen, dass die Röntgenstrahlung auch in schwach absorbierenden Objekten eine
Phasenverschiebung erfährt. Diese ist (wie die Absorption) abhängig von der durch
den
Röntgenstrahl
durchquerten
Objektstruktur
17/31
und
kann
damit
einen
(Phasen)Kontrast liefern. Anstelle der Rekonstruktion der räumlichen Verteilung des
komplexen Teils des Brechungsindex (Absorption) wird bei der Phasenkontrast-CT
der Realteil des Brechungsindex zur Bildgebung verwendet. Verschiedene Methoden
wurden entwickelt, um den Phasenkontrast mit Synchrotron- oder konventionellen
Röntgenquellen nützen zu können [22].
Eine dieser Methoden ist die aus der Elektronenmikroskopie stammende
Ptychographie, mit welcher an der Coherent Small-Angle X-ray Scattering (cSAXS)
Beamline an der SLS erstmals eine Röntgentomographieaufnahme des LCN
gemacht werden konnte [8]. Abbildung 11 zeigt den dabei verwendeten Messaufbau.
Abbildung 11: Schematischer Aufbau der ptychographischen
CT einer Knochenprobe (S). Das Röntgenlicht (X) trifft durch
eine Lochblende (P) auf die Probe (S), wodurch ein
Beugungsbild (D) entsteht. Die Probe (S) wird durch den
Röntgenstrahl abgerastert, dann etwas gedreht und erneut
abgerastert, bis die für eine tomographische Rekonstrukion
nötigen Daten vorhanden sind.
Kohärente, monochromatische Röntgenstrahlung wird durch eine Lochblende auf
einen Durchmesser von etwa 2,3 μm beschränkt [8]. Dieser Strahl trifft auf das zu
untersuchende
Objekt,
in
diesem
Fall
auf
eine
zylinderförmige
kortikale
Knochenprobe eines Mäuseoberschenkels von ungefähr 35 μm Höhe und 25 μm
Durchmesser [8]. Gemessen wird nun aber nicht die Strahlintensität unmittelbar nach
der Probe, sondern das Beugungsbild im Fernfeld wie in Abbildung 11 gezeigt. Dies
wurde für 704 über die Probe verteilte Punkte im Abstand von 1,2 μm wiederholt [8],
wobei der dabei resultierende Überlapp für die Berechnung der gesuchten Phasen
für die Ptychographie charakteristisch und zentral ist. Die auf diese Weise
abgerasterte Probe wurde dann um 1° gedreht und erneut abgerastert und so weiter.
Für die ganze Datenaufnahme und Rotation der Probe um 180° war eine Strahlzeit
18/31
von 36 h notwendig [8]. Nach der Rekonstruktion der Phaseninformation für jede
Projektion, wurde für die tomographische Rekonstruktion eine standardmässige
gefilterte Rückprojektion durchgeführt, um die 3D-Brechungsindexverteilung der
Probe zu erhalten. So resultierte eine 3D-Abbildung der Knochenprobe und des LCN
mit einer isotropen Voxelgrösse1 von 65 nm, die in Abbildung 12 gezeigt ist. Schön
zu sehen sind die Teile von drei Osteozyt-Lakunen mit den dazugehörigen Kanalikuli,
die als verbundene Kanäle erkennbar sind. Trotzdem eigenen sich diese Daten nur
bedingt für eine weitere quantitative Untersuchung des LCN. Wenn wir von Kanalikuli
Abbildung
12:
3D
Visualisierung
der
untersuchten
Knochenprobe. Die Knochenmatrix ist in transparenter Farbe
wiedergegeben. Erkennbar sind Teile von drei OsteozytLakunen (L) und eine Vielzahl von Kanlikuli (K).
mit Dicken von 100 nm ausgehen, werden diese lediglich durch 1-2 Voxel dargestellt.
Verengungen oder dünnere Kanalikuli können mit dieser Auflösung eventuell gar
nicht mehr dargestellt werden, wodurch die Morphologie des LCN nicht mehr korrekt
wiedergegeben würde. Es sind also höhere Auflösungen notwendig, um eine
akkurate Darstellung des LCN und eine aussagekräftige quantitative Analyse
desselben zu erreichen [23]. Dies ist aber nach Wissen des Autors gegenwärtig mit
SR CT nicht realisierbar.
Eine alternative Bildgebungsmethode, mit der ebenfalls 3D-Bildgebung durchgeführt
werden
kann
–
aber
mit
deutlich
höheren
Auflösungen
–
ist
die
Elektronenmikroskopie. So ist in der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
Tomographie mit Nanometerauflösung möglich [24]. Allerdings sind die dabei
1
Ein Voxel bezeichnet einen 3D Pixel (Datenpunkt).
19/31
untersuchten Volumina derart gering, dass TEM Tomographie für die Visualisierung
des LCN nicht in Frage kommen kann. Anders verhält es sich da mit dem
kombinierten Einsatz eines Focused Ion Beam mit einem Scanning Electron
Microscope (FIB/SEM). Wie die Morphologie des LCN mit einem FIB/SEM in 3D
erfasst werden kann, wird im folgenden Abschnitt diskutiert.
3.3. Focused Ion Beam und Scanning Electron Microscope (FIB/SEM)
Wenn es um die Auflösung geht, dann ist ein Rasterelektronenmikroskop oder
Scanning Electron Microscope (SEM) mit Auflösungen von bis zu weniger als 1 nm
der Lichtmikroskopie oder der CT klar überlegen und übertrifft auch die
Anforderungen zur Bildgebung des LCN um eine Grössenordnung. Allerdings
handelt es sich bei SEM um eine zweidimensionale (2D) Bildgebungsmethode, die
nur in Kombination mit anderen Techniken 3D-Daten liefern kann, wie das für das
LCN wünschenswert ist. Eine Möglichkeit, die hier näher beleuchtet wird, ist der
kombinierte Einsatz eines SEM mit einem FIB. Ein FIB funktioniert prinzipiell wie ein
SEM, allerdings verwendet es anstelle eines Elektronen- einen Ionenstrahl. Dieser
kann neben der Bildgebung auch eingesetzt werden, um eine Probe zu bearbeiten:
Mit Hilfe des Ionenstrahls können zum Beispiel einzelne Schichten der Probe
abgetragen werden. Ein FIB/SEM erlaubt so das abwechselnde Abtragen der Probe
durch FIB und Abbilden durch SEM. Da Ionen- und Elektronenstrahl wie in Abbildung
13 einen Winkel zueinander einschliessen, muss die Probe während dem
Abbildung 13: Schematische Darstellung der schichtweisen Bildgebung mit Hilfe eines FIB/SEM. Der Ionenstrahl
(FIB) trägt die Probe Schicht für Schicht ab, während mit
dem Elektronenstrahl (SEM) die aufeinander folgenden
Schichten abgebildet werden.
20/31
konsekutiven Abtragen und Abbilden weder bewegt, noch gekippt werden, so dass
ein präzise Datenaufnahme möglich ist. Die Auflösung der Bilder innerhalb einer
Schicht ist durch das SEM bestimmt, während die Auflösung in Schichtrichtung durch
die Abtragungspräzision des FIB gegeben ist. Auflösungen von 10 nm in
Schichtrichtung sind heute Routine, wobei auch bessere Resultate erreicht werden
können
(nach
[23]).
Der
aufgenommene
Bilderstapel
kann
anschliessend
elektronisch zu einem 3D-Volumen zusammengefügt und weiter bearbeitet werden.
Im folgenden Abschnitt wird dieses Verfahren näher beschrieben und gezeigt, wie
FIB/SEM erfolgreich auf eine Knochenprobe und die Bildgebung des LCN angewandt
werden konnte (nach [23]).
Knochen ist ein nicht leitendes, poröses Material. Dies muss berücksichtigt werden,
wenn eine Knochenprobe mit Hilfe eines FIB/SEM abgebildet werden soll. Die beim
SEM zur Bildgebung benutzten Elektronen können die Oberfläche einer nicht
leitenden Probe aufladen, was Bildqualität und Kontrast negativ beeinflussen kann.
Dies kann vermieden werden, indem die Probe mit einem leitenden Material
beschichtet wird oder indem niedrige Beschleunigungsspannungen verwendet
werden (nach [3]). Für die Bildgebung des LCN mit FIB/SEM ist es ausserdem
vorteilhaft, den Knochen in ein Kunstharz einzubetten und die Porositäten zu
Abbildung 14: SEM-Bilder eines Querschnitts eines Oberschenkelknochens einer
Maus. Die für die FIB/SEM-Bildgebung ausgesuchte Region (ROI) ist mit immer
grösser werdender Auflösung dargestellt. In Bild D sind die Querschnitte zweier
Osteozyt-Lakunen erkennbar, die mit Hilfe von FIB/SEM abgebildet werden sollen.
21/31
infiltrieren. Auf diese Weise werden bessere Resultate beim Abtragen der
Probenschichten durch FIB erzielt und ein guter Bildkontrast bei den SEM-Bildern
erreicht (nach [23]). Bevor das FIB/SEM eingesetzt werden kann, muss eine
geeignete Stelle innerhalb des Knochens (ROI) für die Bildgebung ausgesucht
werden. Dazu wird eine Knochenprobe nach der Einbettung und Infiltration mit
Kunstharz aufgeschnitten, poliert und mit einem SEM betrachtet, wie dies ist in
Abbildung 14 dargestellt ist. in Abbildung 14D sind die Querschnitte zweier OsteozytLakunen zu erkennen, die mit Hilfe von FIB/SEM abgebildet werden sollen. Dazu
wird die Probe nun, wie in Abbildung 13 schematisch gezeigt, im FIB/SEM für die
Bildgebung vorbereitet, so dass die konsekutive Abfolge von Schichtaufnahme und –
abtragung beginnen kann. Für das hier gezeigte Beispiel wurden 390 Schichten in
einem Abstand von jeweils 29,5 nm (± 2 nm) aufgenommen. Dies resultierte in einem
Gesamtvolumen von 19,0 μm x 14,3 μm x 11,5 μm. Für die Aufnahme eines Bildes
wurden weniger als zwei Minuten benötigt, was in einer Gesamtaufnahmezeit von 15
h und 25 min für den ganzen Bildstapel resultierte (nach [23]). Abbildung 15 zeigt
exemplarisch einige der aufgenommenen Bilder im jeweiligen Abstand von rund 1,5
μm. Klar zu erkennen sind die beinahe vollständig mit Kunstharz gefüllten, auch in
Abbildung 14 gezeigten Osteozyt-Lakunen. Die weiteren in Abbildung 15 zu
erkennenden, ebenfalls mit Kunstharz gefüllten Porositäten sind Querschnitte der
Kanalikuli, welche die Lakunen miteinander verbinden. Die aufgenommenen Bilder
wurden anschliessend zusammengefügt und weiter bearbeitet
(Details zur
Bildbearbeitung findet der interessierte Leser in [23] oder [25]), womit schliesslich ein
3D-Datensatz der untersuchten Region erzeugt werden konnte. Eine Visualisierung
Abbildung 15: Mit FIB/SEM aufgenommene Schichtbilder der in Abbildung 14 gezeigten
ROI. Zwischen den einzelnen Aufnahmen liegen 50 Schichten oder rund 1,5 μm.
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des Datensatzes (Voxelgrösse 18.6 nm x 18.6 nm x 29.5 nm) ist in Abbildung 16
gezeigt. Klar zu erkennen sind die beiden angeschnittenen Osteozyt-Lakunen (gelb),
welche durch eine Vielzahl von Kanalikuli (grün) miteinander verbunden sind. Neben
der rauen Oberfläche der Kanalikuli ist auch erkennbar, dass sich Kanalikuli
verzweigen können. Mit Hilfe des 3D-Datensatzes kann nun die Morphologie des
LCN quantitativ untersucht werden. Dies wurde für den hier abgebildeten Teil des
LCN für verschiedene Parameter gemacht. So wurde zum Beispiel der am
Häufigsten vorkommende Kanalikulidurchmesser auf ungefähr 80 nm und die Anzahl
Kanalikuli pro Lakune auf ungefähr 78 bestimmt [23]. Allerdings ist die Untersuchung
von grösseren Volumina mit Hilfe von FIB/SEM ist nötig, um diese Werte zu
bestätigen. Schon eine Knochenprobe von etwa 40 μm x 40 μm x 40 μm sollte es
erlauben, zwei Osteozyt-Lakunen vollständig abzubilden und zu quantifizieren, was
noch aussagekräftigere Resultate ermöglichen würde. Ausserdem ist mit dieser
Methode nun die Grundlage geschaffen, um die Abhängigkeit der genannten Werte
(und allgemein der Morphologie des LCN) vom Ort, Alter und Gesundheitszustand
der betrachteten Knochenprobe untersuchen zu können (nach [23]).
Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass es mit Hilfe von FIB/SEM
1000 nm
Abbildung 16: 3D Visualisierung des LCN, wie es mit Hilfe von FIB/SEM aufgenommen
wurde. Die beiden Osteozyt-Lakunen (gelb) sind durch Kanalikuli (grün) miteinander
verbunden.
23/31
erstmals gelungen ist, das LCN mit ausreichender Auflösung zu untersuchen, so
dass die Morphologie des LCN nun zuverlässig dargestellt und auch quantifiziert
werden kann. Allerdings hat auch FIB/SEM seine Limitationen. So handelt es sich im
Gegensatz zur CT um eine destruktive Methode, bei welcher die abgebildete ROI
anschliessend nicht mehr für weitere Untersuchungen zur Verfügung steht. Die in
dieser Arbeit präsentierten Bildgebungsmethoden werden im nachfolgenden Kapitel
weiter verglichen und die zentralen Punkte der Arbeit werden zusammengefasst.
24/31
4. Schlussfolgerung
In dieser Arbeit wurden nach den biologischen Grundlagen des LCN verschiedene
Methoden zu dessen Bildgebung vorgestellt. Während CLSM und auf Absorption
beruhende CT nicht die nötige Auflösung zur Bildgebung des LCN verfügten,
konnten mit Hilfe von ptychographischer CT und von FIB/SEM Abbildungen des LCN
erzeugt werden. Beide Methoden liefern 3D-Daten, welche eine Analyse der
Morphologie des LCN erlauben. Allerdings ist ptychographische CT momentan nur
bedingt zur Analyse des LCN geeignet. Mit einer Auflösung von gegenwärtig etwa 65
nm werden Kanalikuli lediglich durch wenige oder nur durch ein bis zwei Voxel
dargestellt. Im schlimmsten Fall werden eigentlich verbundene Kanalikuli sogar als
getrennt dargestellt, wodurch die Morphologie des abgebildeten LCN nicht mehr mit
dem tatsächlich in der Probe vorhandenen übereinstimmen würde. Besser
präsentiert sich die Situation bei FIB/SEM, mit dessen Hilfe das LCN ohne
unterbrochene Kanalikuli dargestellt werden konnte. Da mit FIB/SEM nicht nur
Volumen relevanter Grösse abgebildet werden können, sondern auch Voxelgrössen
von 5-10 nm möglich sind (nach [23]), erfüllt FIB/SEM die Anforderungen, um das
LCN quantitativ und in 3D erfassen zu können. Interessant scheint auch eine
Kombination von SR CT und FIB/SEM, bei welcher zuerst die Morphologie des LCN
eines grösseren Gebiets bestmöglich erfasst würde, um dann einzelne Regionen
gezielt mit FIB/SEM zu untersuchen. Mit weiteren Fortschritten in der SR CT sollte
die Bildgebung des LCN aber auch mit dieser Technik in Griffnähe kommen.
Mit der hier präsentierten Methode zur Bildgebung des LCN mittels FIB/SEM ist die
Grundlage geschaffen, die Morphologie des LCN quantitativ beschreiben zu können.
Die Morphologie des LCN beeinflusst direkt die Art und Weise, wie mechanische
Belastung in unserem Knochen wahrgenommen und weiter geleitet wird. Mit
Kenntnis der Morphologie des LCN können diese Mechanismen besser verstanden
werden. Ausserdem können Zusammenhänge zwischen der Morphologie des LCN
und gesundem sowie pathologischem Knochengewebe hergestellt werden, um damit
mögliche Behandlungsansätze von Knochenkrankheiten besser beurteilen zu
können.
Die Bildgebung des LCN mittels FIB/SEM oder SR CT wird sich allerdings aufgrund
des grossen zeitlichen und finanziellen Aufwands – von der benötigten Infrastruktur
gar nicht zu sprechen – auf die Forschung beschränken. Der zur Bildgebung des
LCN notwendige Aufwand macht es ausserdem schwierig, dieses Thema direkt in
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den Unterricht einzubinden oder zu diesem Thema eine Maturaarbeit durchzuführen.
Trotzdem
gibt
verschiedene
es
für
den
Physik-,
Anknüpfungspunkte:
Mathematik-
Erzeugung
von
oder
Informatikunterricht
Röntgenstrahlung
mittels
Röntgenröhre oder Synchrotron, relativistische Effekte der Synchrotronstrahlung
(siehe z.B. [26]), CT als Anwendung der Fourier-Transformation, Filterung und
Bildbearbeitung (Image Processing). Der interessierte Leser findet im Anhang
weitere Links und Literatur zu den genannten Themen und zu den zentralen Inhalten
dieser Arbeit.
26/31
5. Literaturverzeichnis
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
Cowin, S.C., Bone mechanics handbook. 2nd ed. 2001, Boca Raton, Fla.:
CRC. 1 vol.
Zilles, K. and B. Tillmann, Anatomie, Heidelberg: Springer. 1022.
Schneider, P., et al., Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte
lacuno-canalicular network. Bone. 47(5): p. 848-58.
Deligianni, D.D. and C.A. Apostolopoulos, Multilevel finite element
modeling for the prediction of local cellular deformation in bone.
Biomech Model Mechanobiol, 2008. 7(2): p. 151-9.
Anderson, E.J. and M.L. Knothe Tate, Idealization of pericellular fluid
space geometry and dimension results in a profound underprediction of
nano-microscale stresses imparted by fluid drag on osteocytes. J
Biomech, 2008. 41(8): p. 1736-46.
Ott, S. Osteoporosis and bone physiology. Aufgerufen am 10.09.2011,
http://courses.washington.edu/bonephys/opop/opop.html.
Kanis, J.A. and O. Johnell, Requirements for DXA for the management of
osteoporosis in Europe. Osteoporos Int, 2005. 16(3): p. 229-38.
Dierolf, M., et al., Ptychographic X-ray computed tomography at the
nanoscale. Nature. 467(7314): p. 436-9.
Hell, S.W., Far-field optical nanoscopy. Science, 2007. 316(5828): p. 11538.
Heintzmann, R. and G. Ficz, Breaking the resolution limit in light
microscopy. Brief Funct Genomic Proteomic, 2006. 5(4): p. 289-301.
Pawley, J.B., Handbook of biological confocal microscopy. 3rd ed. 2006,
New York: Springer. 985.
Jones, C.W., et al., Confocal laser scanning microscopy in orthopaedic
research. Prog Histochem Cytochem, 2005. 40(1): p. 1-71.
Siemens. Split-Second Scanning. Aufgerufen am 17.9.2011,
www.siemens.com/somatom-definition-flash.
Kalender, W.A. Computertomographie Grundlagen, Gerätetechnologie,
Bildqualität, Anwendungen. 2006. 2., überarb. u. erweiterte Aufl.:[324].
Ruegsegger, P., B. Koller, and R. Muller, A microtomographic system for
the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcif Tissue Int,
1996. 58(1): p. 24-9.
Scanco Medical, MicroCT Systems and Solutions. Aufgerufen am
17.9.2011, http://www.scanco.ch.
Skyscan. MicroCT and NanoCT. Aufgerufen am 17.9.2011,
http://www.skyscan.be.
Muller, R., Hierarchical microimaging of bone structure and function. Nat
Rev Rheumatol, 2009. 5(7): p. 373-81.
PSI. Why SwissFEL? Aufgerufen am 20.9.2011,
http://www.psi.ch/swissfel/why-swissfel#.
Bonse, U. and F. Busch, X-ray computed microtomography (microCT)
using synchrotron radiation (SR). Prog Biophys Mol Biol, 1996. 65(1-2):
p. 133-69.
Kak, A.C. and M. Slaney, Principles of computerized tomographic
imaging. 2001, Philadelphia: Society for Industrial and Applied
Mathematics. 327.
Bonse, U., X-ray imaging: past and present. 2008, SPIE. p. 707802.
27/31
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
Schneider, P., et al., Serial FIB/SEM imaging for quantitative 3D
assessment of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 49(2): p.
304-11.
McIntosh, R., D. Nicastro, and D. Mastronarde, New views of cells in 3D:
an introduction to electron tomography. Trends Cell Biol, 2005. 15(1): p.
43-51.
Russ, J.C., The image processing handbook. Fifth ed. 2007, Boca Raton:
CRC Press. 817.
Margaritondo, G., Elements of synchrotron light for biology, chemistry,
and medical research. 2002, Oxford: Oxford University Press. 260.
Muller, R., Bone microarchitecture assessment: current and future
trends. Osteoporos Int, 2003. 14 Suppl 5: p. S89-95; discussion S95-9.
Knothe Tate, M.L., et al., The osteocyte. Int J Biochem Cell Biol, 2004.
36(1): p. 1-8.
Holzer, L., et al., Three-dimensional analysis of porous BaTiO3 ceramics
using FIB nanotomography. J Microsc, 2004. 216(Pt 1): p. 84-95.
Holzer, M.C.a.L., Review of FIB-tomography, in Nanofabrication using
focused ion and electron beams: Principles and applications, S.M.a.P.R.
Ivo Utke, Editor. 2011, Oxford University Press: New York.
28/31
6. Referenzen aller Abbildungen
Abbildung 1: http://de.wikipedia.org/wiki/Knochen
Abbildung 2: http://en.wikipedia.org/wiki/Bone (links), http://highered.mcgrawhill.com/sites/0072507470/student_view0/chapter6/multiple_choice_qui
z_1.html (rechts unten), [27] (rechts oben)
Abbildung 3: http://www.ilsb.tuwien.ac.at/~daxner/ictam-projekt/monatsprojekt.html
Abbildung 4: http://www.kgu.de/zmorph/histopatho/histo4/pub/data/km/de/001_f.html
Abbildung 5: Selbst gezeichnet ([3])
Abbildung 6 http://www.nature.com/pcan/journal/v7/n2/full/4500705a.html
Abbildung 7: [6]
Abbildung 8: Institut für Biomechanik, ETH Zürich, Vorlesungsnotizen Micro- and
Nano-Tomography of Biological Tissues, Prof. Ralph Müller
Abbildung 9 [28]
Abbildung 10 http://de.wikipedia.org/wiki/Konfokalmikroskop
Abbildung 11: [8]
Abbildung 12: [8]
Abbildung 13 : [29]
Abbildung 14: [23]
Abbildung 15: Institut für Biomechanik, ETH Zürich, Vorlesungsnotizen Micro- and
Nano-Tomography of Biological Tissues, Dr. Philipp Schneider
Abbildung 16: [23]
29/31
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit bestätige ich, die hier vorliegende Arbeit selbständig verfasst und alle von mir
verwendeten Quellen aufgeführt zu haben.
Matias Meier, Winterthur, 12.10.2011
30/31
Anhang: Weiterführende Links und Literatur
Knochenbiologie und Osteoporose

Ein guter Einstieg in die Knochenbiologie ist das „Bone Curriculum“ der
American Society of Bone and Mineral Research“
http://depts.washington.edu/bonebio/ASBMRed/ASBMRed.html

Eine sehr gute und auf dem neusten Stand gehaltene Seite zum Thema
Osteoporose ist „Osteoporosis and bone physiology“ der University of
Washington. http://courses.washington.edu/bonephys/index.html

Ein Standardwerk zur Knochenbiologie und den mechanischen Eigenschaften
von Knochen ist das „Bone Mechanics Handbook“ [1].
Bildgebungsmethoden

Ein Standardwerk zur CLSM ist das „Handbook of Biological Scanning
Microscopy“ von James B. Pawley [11].

“Principles of Computerized Tomographic Imaging” [21] bietet einen guten
Einblick in die mathematischen Grundlagen der CT.

„Computertomographie“ [14] bietet einen Einblick in die technischen und
physikalischen Grundlagen der CT und der Gerätetechnologie.

Zu FIB/SEM: „Review of FIB-Tomography” [30].
Bildgebung des LCN und CT von Knochen

Der aktuelle Stand (2010) der 3D-Bildgebung des LCN ist im Review „Towards
quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network“ [3]
zusammengefasst.

Bildgebung des LCN mit ptychographischer CT [8] und mit FIB/SEM [23].

Review zur Bildgebung von Knochen mit CT “hierarchical microimaging of
bone structure” von Prof. Ralph Müller, Institut für Biomechanik, ETH Zürich
[18].
Image Processing

Informationen zur Bildbearbeitung, wie sie für eine quantitative Analyse wichtig
ist finden sich im „The Image Processing Handbook“ [25].
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