5_Diskussion

4 Diskussion
Viele Connexine, so z.B. Cx30, 30.3, 31, 31.1, 40 und 45 sowie Cx36 und Cx57 werden
während des präimplantativen Stadiums in der Blastozyste exprimiert (Davies et al., 1996;
Dahl et al., 1996a; Srinivas et al., 1999; Manthey et al., 1999). Eine unterschiedliche
Expression in den verschiedenen Geweben („sorting out“), die zum einen der ICM und zum
anderen dem Trophektoderm entstammen, erfolgt dann während der Trophoblastinvasion in
das Endometrium des Uterus. Die Regulationsmechanismen, die diese Aussortierung und
Kompartmentisierung der Connexine, die sich sowohl experimentell durch
Farbstoffausbreitung als auch durch elektrische Kopplung nachweisen lassen, ermöglichen,
sind noch weitestgehend unbekannt (Kalimi und Lo, 1998). Es gibt verschiedene Ansätze, die
mögliche regulierende Faktoren aufzeigen. Zu nennen wären hier z.B. eine mögliche
Modulation von Cx26 und Cx43 durch Progesteron und Östrogen bei der Ratte, eine
Beeinflussung der Expression von Cx31 und Cx43 in F9 embryonalen Karzinomzellen durch
Retinsäure, einem Vitamin A-Derivat und auch eine Beeinflussung der Connexinexpression
durch Transkriptionsfaktoren (Grümmer et al., 1996 a und b).
Dieser Regulationsmechanismus wird schon seit längerer Zeit diskutiert, so wird
beispielsweise die Cx43-Expression während der Präimplantationsphase unter anderem durch
den Transkriptionsfaktor Octamer-4 (Oct-4) der POU-Familie reguliert (Schöler, 1991).
Postimplantativ zeigt Oct-4 wie Cx43 ein „sorting out“ in das embryonale Gewebe (Dahl et
al., 1996b).
Auch der Transkriptionsfaktor Mash-2, ein Helix-loop-helix (bHLH)-Transkriptionsfaktor
weist eine deutliche Übereinstimmung des Expressionsmusters mit dem des Cx31 auf.
Allerdings zeigten hier Untersuchungen mit cotransfizierten Rcho-1-Zellen der
Trophoblastzelllinie, dass eine Überexpression von Mash-2 keine Beeinflussung der
Promotor – bzw. der Intronregion von Cx31 nach sich zieht (Gabriel et al., 2001). Für Cx31
sind bei der Ratte weiterhin Bindungsstellen für GATA-3 in der putativen Promotorregion
bekannt, wobei eine Überexpression von GATA-3 keinen Effekt auf die Aktivität des
Intronkonstruktes in Rcho-1-Zellen ausübt (Gabriel et al., 2001).
Zur Eingrenzung weiterer Transkriptionsfaktoren, die möglicherweise an der Regulation der
Connexinexpression während der Entwicklung der Maus beteiligt sein könnten, wurden hier
vier Transkriptionsfaktoren in ihrem Expressionsmuster mit Hilfe der nichtradioaktiven ISH
während der Prä- und Postimplantationsphase untersucht. All diese Transkriptionsfaktoren
sollen maßgeblich an der Regulation von Differenzierungsprozessen beteiligt sein. Bei den
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untersuchten Transkriptionsfaktoren handelte es sich um die beiden
Zinkfingertranskriptionsfaktoren GATA-2 und GATA-3 und die beiden
Homeoboxtranskriptionsfaktoren Esx1 und Pem.
Mit der nichtradioaktiven ISH konnte in den hier vorliegenden Untersuchungen eine
Expression des Transkriptionsfaktors Pem in der ICM und dem Trophektoderm nachgewiesen
werden. Die Expression des Pem-Proteins in der Präimplantationsphase war teilweise schon
bekannt. Nach den veröffentlichten Analysen von Fan et al. (1999) beginnt sie im späten
Morulastadium und ist sowohl in der ICM als auch im Trophektoderm vertreten. Für die
Faktoren GATA-2 und GATA-3 sowie für den anderen untersuchten Homeoboxfaktoren Esx1
war bisher die mRNA-Expression im Präimplantationsstadium unbekannt.
Diese drei Faktoren wiesen eine Expression in der ICM und auch im Trophektoderm auf,
wobei die Expression für GATA-2 etwas schwächer ausfiel, als für die anderen untersuchten
Faktoren.
Während der Präimplantationsphase der Maus werden ebenfalls, wie im einleitenden Teil
dargestellt, die verschiedensten Connexine im Trophektoderm und in der ICM exprimiert. Um
ihre Bedeutung in Bezug auf ihre Funktionen und Aufgaben wie z.B. den interzellulären
Austausch von niedermolekularen Substanzen und die elektrische Kopplung zwischen den
einzelnen Zellen während der Entwicklung genauer zu verifizieren, wurden für einige
Connexine, so z.B. für Cx43, defiziente Mäuse generiert (Houghton et al., 2002). Houghton et
al., (2002) untersuchten an Cx43 defizienten Mäusen das Präimplantationsstadium in Hinblick
auf Apoptose und Glucosetransport und konnten keinen Unterschied zum Wildtyp Cx43
feststellen. Dieses Ergebnis und eine frühere Untersuchung von Vance and Wiley (1999), die
Mausembryonen im Präimplantationsstadium mit dem GJ-Kommunikationsinhibitor 18
alpha-glycerrhetinic acid (AGA), beginnend im 4-Zellstadium, behandelten und ebenfalls
keine Beeinträchtigung der Entwicklung in der Präimplantationsphase feststellen konnten,
suggerieren, dass die GJ-Kopplung für die Präimplantationsentwicklung der Maus entbehrlich
ist. Auch andere Connexine, die im Blastozystenstadium exprimiert werden, so z.B. Cx30, 31,
36, 40 und 45 wurden inaktiviert, was zu keinen offensichtlichen Defekten in der
präimplantativen Entwicklung führte (Kirchhof et al., 1998; Simon et al., 1998; Kumai et al.,
2000; Krüger et al, 2000, Plum et al., 2001).
Über die Bedeutung der hier untersuchten Transkriptionsfaktoren für die
Präimplantationsphase ist bisher nur wenig bekannt. Mäuse, die den
Homeoboxtranskriptionsfaktoren Pem nicht exprimieren können, zeigen keinerlei Defizite in
der Entwicklung des extraembryonalen Gewebes, in dem Pem vorzugsweise bei
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Wildtypmäusen exprimiert wird. Pitman et al., (1998) stellten hier die Vermutung auf, dass
das Fehlen von Pem durch andere Faktoren, z.B. Esx1, der ein überlappendes
Expressionsmuster zu Pem zeigt, kompensiert wird. Defekte bei der Esx1-defizienten Maus
treten erst mit Beginn der Plazentation auf, so scheint Esx1 also für die präimplantative
Entwicklung eine geringe Bedeutung zu haben (Li und Behringer, 1998).
Auch bei den zurzeit bekannten Connexin-defizienten Mäusen treten die Defekte erst zu
einem späteren Zeitpunkt der Entwicklung auf. So kommt es z.B. bei Cx31-defizienten
Mäusen erst zu einer sichtbaren Veränderung während der plazentalen Entwicklung und bei
Cx43-defizienten Mäusen wird der Defekt, - eine Obstruktion des rechten Ausflusstrakts des
rechten Herzens -, erst direkt nach der Geburt relevant (Plum et al., 2001; Reaume et al.,
1995). Diese Tatsache, dass sowohl bei den genannten Connexinen und dem
Transkriptionsfaktor Esx1 jeweils die Defekte zu einem späteren Zeitpunkt in der
Entwicklung ihr Ausmaß zeigen und dass Esx1 sowie Cx31 beide bevorzugt im
extraembryonalen Gewebe exprimiert werden, lässt Esx1 in die engere Auswahl der
Transkriptionsfaktoren rücken, die möglicherweise an der Regulation der Connexinexpression
beteiligt sein könnten.
Ein Fehlen des Transkriptionsfaktors Pem hat anscheinend keinen Einfluss auf die weitere
Entwicklung der Maus, so dass hier eventuell eine Bedeutung dieses Faktors kumulativ mit
anderen Transkriptionsfaktoren angenommen werden kann. Mit dem Hinweis auf eine
Kooperation mit anderen Faktoren oder einer Kompensation dieses Faktors durch einen
anderen, wie es für Esx1 angenommen wird, ist eine Steuerung der Expression z.B. von Cx31,
das ebenso wie Pem bevorzugt in extraembryonalen Geweben exprimiert wird, nicht ganz
auszuschließen. Zudem drängt sich die Frage auf, welche Bedeutung die Expression von Pem
dann noch für die extraembryonalen Gewebe während der Mausentwicklung und die
männlichen und weiblichen Gonaden, in denen Pem ebenfalls bei der Maus exprimiert wird,
hat. Fan et al., (1999) schlossen aus den Ergebnissen ihrer Versuche, in denen sie eine
verstärkte Expression von Pem in embryonalen Stammzellen von Mausembryonen
herbeiführten, dass verstärkt exprimiertes Pem eine blockierende Rolle für den Übergang
undifferenzierter in differenzierte Zelllinien einnimmt. Über eine zeitlich schnellere oder
überschießende Differenzierung während der Entwicklung bei Pem-defizienten Mäusen ist
bisher noch nichts bekannt.
Die Literaturrecherche bezüglich GATA-3 – defizienten Mäuse, die anscheinend an einem
Mangel an Noradrenalin im sympathischen Nervensystem an Tag 11pc sterben und dem
Zusammenhang zu der Connexinexpression ergab, dass auch zwischen Connexinen und dem
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sympathischem Nervensystem ein Zusammenhang besteht (Lim et al., 2000). So zeigte eine
Untersuchung des Glucosestoffwechsels an Rattenlebern, dass ein verminderter Effekt von
Noradrenalin auf den Glucosemetabolismus in einer regenierenden Rattenleber weder auf eine
geringere Produktion von Noradrenalin noch auf eine Depletion des Leberglycogens
zurückzuführen ist, sondern wahrscheinlich durch eine Reduktion von gap junction, die die
Signalübertragung von Nervenimpulsen in der Rattenleber assistieren, bedingt ist (Iwai et al.,
1991). Somit ist hier ein möglicher Berührungspunkt zwischen GATA-3 und Connexinen
gegeben, so dass eine Regulation der Connexine durch GATA-3 vorstellbar wäre. Bisher
liegen allerdings noch keine dahingehenden weiterführenden Ergebnisse vor, so dass es sich
um bisher nicht bewiesene Thesen handelt.
Im Gegensatz zu den anderen genannten Transkriptionsfaktoren, führt ein Fehlen des
Transkriptionsfaktors GATA-6, der ebenfalls in der ICM und dem Trophektoderm exprimiert
wird und nach der Implantation im parietalen Endoderm sowie im Mesoderm und im
Endoderm, die an der Entwicklung des Herzens und des Darms beteiligt sind, zu finden ist,
schon sehr viel früher zum Tod des Embryos. Der Tod tritt an Tag 5.5pc ein, also kurz nach
der Implantation der Blastozyste. Wahrscheinlich ist der frühe Tod des Embryos durch einen
Defekt im Epiblast, der einen Defekt im extraembryonalen Gewebe nach sich zieht, bedingt
(Koutsourakis et al., 1999). Bisher wurden mögliche Zusammenhänge zwischen dem
Zinkfingertranskriptionsfaktor GATA-6 und dem Cx43 noch nicht untersucht.
In der Postimplantationsphase kommt es bei der Connexinexpression sowohl der Maus, als
auch der Ratte zu einer Kompartmentisierung von Cx31, 43 und 45. Diese scheint für die
Abgrenzung der völlig verschiedenen Entwicklungsvorgänge des Embryos von denjenigen in
den extraembryonalen Geweben wichtig zu sein, denn sie konnte von Lo und Gilula (1979)
sowie von Kalimi und Lo (1989) auf der funktionellen Ebene nachgewiesen werden. Dabei
wird die Expression von Cx31 in den Zellen, die der ICM entstammen, eingestellt und
konzentriert sich auf die Gewebe, die dem Trophektoderm entstammen, sprich dem EPC und
dem extraembryonalen Ektoderm (Dahl et al., 1996 a). Die Expression von Cx43 und Cx45
gestaltet sich komplementär zu der von Cx31. Diese beiden Connexine sind nach der
Implantation nämlich nur noch im embryonalen Ektoderm und im viszeralen Endoderm
vorhanden (Houghton et al., 2002). Eine besondere Aufmerksamkeit soll hier, im Vergleich
zu den hier untersuchten Transkriptionsfaktoren, zunächst Cx31 und Cx43 gelten, da sie die
einzigen Connexingene sind, die in der weiteren Entwicklung der Maus und auch der Ratte
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exprimiert werden. Die anderen im Blastozystenstadium exprimierten Connexine werden
nach der Implantation entweder nur sehr kurz und schwach oder gar nicht mehr exprimiert.
Die Bildung der Plazenta beginnt bei der Maus an Tag 8.5pc. Als Vorbereitung für die
eigentliche Plazenta bildet sich die Chorionplatte durch die Verschmelzung von Allantois und
EPC aus. Ab Tag 10pc sind dann Plazentastrukturen erkennbar. Die Mausplazenta besteht aus
folgenden Anteilen, der Labyrinthschicht, dem Spongiotrophoblasten und zur Dezidua hin
abschließend einer Zone aus Trophoblastriesenzellen (GC).
Im postimplantativen Zeitraum der Mausentwicklung ergab die vorliegende Untersuchung des
zeitlichen und räumlichen Expressionsmusters der vier untersuchten Transkriptionsfaktoren
(GATA-2, GATA-3, PEM und Esx1) eher ein variables Bild. Ein „sorting out“, wie bei der
Connexinexpression war hier nicht eindeutig feststellbar. Die Expression der mRNA war so
in einigen extraembryonalen Zelllinien zunächst vorhanden, dann für einen gewissen
Zeitraum nicht mehr nachweisbar und schließlich zu einem späteren Zeitpunkt erneut
detektierbar. Im Folgenden werden die zu den einzelnen Transkriptionsfaktoren erzielten
Ergebnisse von Stadium 5.5 bis 10.5dpc kurz rekapituliert und den schon in der Literatur
bekannten Ergebnissen gegenübergestellt. Ebenso wird hier versucht die
Transkriptionsfaktorexpressionsmuster mit den Mustern der Connexinexpression in
Verbindung zu bringen oder eine mögliche Verbindung auszuschließen.
Bei den Transkriptionsfaktoren GATA-2 und GATA-3 gab es bisher keine veröffentlichten
Analysen zum Expressionsmuster an Tag 5.5pc und 6.5pc. GATA-2 zeigte hierbei eine
Expression in allen untersuchten Geweben, während GATA-3 nicht im embryonalen
Ektoderm, ansonsten in allen anderen untersuchten Geweben, vertreten war. Bei GATA-2 und
GATA-3 kam es im Stadium 6.5dpc zu einer Änderung des Expressionsmusters. Die mRNAExpression von GATA-2 war hier nicht mehr im embryonalen Ektoderm und im parietalen
Endoderm zu verzeichnen. GATA-3 wies nun eine Expression im embryonalen Ektoderm auf,
die Expression im parietalen und viszeralen Endoderm war allerdings nun nicht mehr
vorhanden. Zusätzlich zu den in der Literatur bekannten Expressionsmustern, gab es bei
GATA-2 und GATA-3, weitere Gewebe, die hier ein positives Signal mit der
nichtradioaktiven ISH zeigten. Zu den Ergebnissen von Ng et al. (1994), die mit der
radioaktiven ISH erzielt wurden, zeigten sich zusätzlich zu der schon bekannten Expression in
den GC, dem EPC, dem extraembryonalen Ektoderm und dem schwachen Signal in der
Dezidua deutliche Signale im extraembryonalen Mesoderm, im parietalen Endoderm und
außerdem eine starke Anfärbung in der Dezidua.
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An Tag 7.5 hingegen war kein Signal im extraembryonalen Mesoderm zu sehen und auch die
Expression im embryonalen Gewebe war in diesem Stadium nicht mehr vorhanden.
Die beiden Zinkfingertranskriptionsfaktoren wurden also sowohl in den Derivaten der ICM
als auch des Trophektoderms exprimiert, wie es auch schon in der Präimplantationsphase der
Fall war. Diese Tatsache weist darauf hin, dass eine Regulation von Cx31 und Cx43 durch die
Zinkfingertranskriptionsfaktoren, wenn man eine mögliche Korrelation auf der Ebene der
Expressionsmuster untersucht, eher unwahrscheinlich ist, da Cx31 und Cx43 im Gegensatz zu
GATA-2 und GATA-3 unmittelbar postimplantativ ein „sorting out zeigen“. Hierbei
konzentriert sich Cx31 auf die Derivate des Trophektoderm und Cx43 auf die der ICM. Da
die Transkriptionsfaktoren GATA-2 und GATA-3 neben anderen Geweben auch in denen
exprimiert werden, in denen auch Cx31 und Cx43 vertreten sind, lässt sich eine Beteiligung
der Transkriptionsfaktoren an der Regulation der Connexine allerdings nicht völlig
ausschließen.
Wie schon zuvor zeigte GATA-2 an Tag 8.5pc, eine Expression im EPC im parietalen und
weniger im viszeralen Anteil des Chorions. Die GC, sowie der parietale als auch der viszerale
Dottersack und das embryonale Gewebe zeigten ebenfalls mit der nichtradioaktiven ISH ein
deutliches Signal.
In Bezug auf das extraembryonale Gewebe war bisher nur eine Expression von mRNA mit
Hilfe des Northern blot in der sich entwickelnden Plazenta festgestellt worden, wobei die
mRNA offensichtlich aus der gesamten Plazenta isoliert wurde (Ng et al., 1994). Auch für
GATA-3 fanden Ng et al., (1994) nur eine geringe Expression bei langer Exposition mit dem
Northern blot. GATA-3 wies hier im Vergleich zum Vortag ein reduziertes, aber deutliches
Expressionsmuster auf. Hier war nun nur noch eine Expression im parietalen Anteil der
Chorionplatte zu erkennen. Der viszerale Anteil zeigte an einigen Stellen eine sehr geringe
und an anderen Stellen keine Expression. In den GC sowie in der Dezidua war, wie auch im
parietalen Anteil der Chorionplatte, ein mRNA-Signal zu sehen. Im Embryo selber zeigte sich
im Gegensatz zu GATA-2 keine Expression. Untersuchungen mit GATA-2-defizienten
Mäusen an 9.5 dpc und 10.5dpc zeigten, dass ein Verlust von GATA-2 zu Defekten in der
Neurogenese führte (Nardelli et al., 1999). Ab Tag 9.5pc zeigten sowohl GATA-2 und
GATA-3 eine Expression im Embryo, sowie im Dottersack, im Labyrinth, im
Spongiotrophoblast und in den GCs. Untersuchungen von Silver und Palis (1997) ergaben,
dass ab dem Stadium 8dpc die Hämatopoese im viszeralen Dottersack beginnt und GATA-2
neben 3 anderen Transkriptionsfaktoren an diesem Prozess beteiligt zu sein scheint. Andere
Untersuchungen bezüglich der Expression und die Rolle von GATA-2 in den sekundären GCs
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weisen auf eine Regulation von Trophoblastriesenzell-spezifischen Hormonen wie Prolaktinlike Protein A, plazentares Lactogen I und Proleferin hin (Ma und Linzer, 2000). Auch Cx43
wird wie GATA-2 im Spongiotrophoblasten, den GCs und dem Embryo exprimiert. Ebenso
wie GATA-2 weist Cx43 eine Beteiligung an der Gehirnentwicklung auf und zeigt dort
ebenfalls ein in einigen Punkten übereinstimmendes Expressionsmuster zu GATA-2
(Ruangvoravat and Lo, 1992). Wie auch schon oben beschrieben spielt Cx43 eine Rolle bei
der Hämatopoese wie Untersuchungen mit Cx43-defizienten Mäusen zeigten (MontecinoRodriguez et al., 2000). Alle diese Übereinstimmungen in Hinblick auf das ähnliche
Expressionsmuster und das ähnliche Aufgabengebiet von GATA-2 und Cx43 könnte eine
Regulation von Cx43 durch GATA-2 vermuten lassen.
GATA-3 zeigte an Tag 10.5pc eine fehlende Expression im viszeralen und parietalen
Dottersack. Für GATA-3 lässt sich wie an Tag 9.5pc sagen, dass es lediglich Untersuchungen
mit Northern Blot-Analysen gibt, die eine Expression in der Plazenta nachweisen, wobei nicht
näher bezeichnet wurde, aus welchem Teil der Plazenta die mRNA gewonnen wurde (Ng et
al.,1994). Einen Berührungspunkt zu Cx43 gibt es zum einen auf der Ebene der Expression
im Spongiotrophoblasten und in den GC, sowie in den embryonalen Anteilen und zum
anderen bei der Hämatopoese. Manaia et al. (2000) zeigten eine Beteiligung von GATA-3 an
der Spezifikation von intraembryonalen hämatopoetischen Vorläuferzellen. Untersuchungen
von Montecino-Rodriguez et al. (2000) zeigten eine entscheidende Rolle von Cx43 bei der
Hämatopoese auf. Sowohl Cx43 als auch GATA-3 sind demnach an der Blutbildung beteiligt,
so dass es die Vermutung zulässt, dass GATA-3 an der Regulation von Cx43 während der
Hämatopoese sowie an den Regulationsprozessen in den extraembryonalen Geweben beteiligt
sein könnte.
Bei dem Transkriptionsfaktor Pem, konzentrierte sich die Expression an Tag 5.5pc zunächst
auf die Zelllinien, die dem Trophektoderm entstammen. Die Unterschiede zwischen den hier
vorliegenden Ergebnissen, die mit der nichtradioaktiven ISH erzielt wurden, und den
immunhistochemischen Untersuchungen von Lin et al. (1994), tauchten schon kurz nach der
Implantation, in den Stadien 5.5pc und 6.5pc auf. Das Protein Pem, das laut Lin et al. (1994)
exklusiv im extraembryonalen Gewebe exprimiert wird, wurde hier an Tag 6.5pc als mRNA
auch im embryonalen Ektoderm und dem extraembryonalen Mesoderm exprimiert. Lin et al.
(1994) detektierten das Pemprotein auch im Stadien 5.5 und 6.5 dpc im viszeralen Endoderm,
hier zeigten die Untersuchungen auf mRNA ein negatives Ergebnis. An beiden Tagen war
hier in den GC eine deutliche Expression in Bezug auf die mRNA zu verzeichnen, während
sie keine Proteinexpression in den GC nachweisen konnte. Hierbei scheint es so zu sein, dass
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mRNA und Proteinexpression nicht am selben Tag aufeinander folgen, sondern um ein bis
zwei Tage versetzt stattfindet, denn Lin et al. (1994) detektierten an Tag 7.5pc Pem-Protein in
einzelnen GCs. Neben dem Signal in den GCs konnten sie auch eine Expression von mRNA
mit Hilfe der radioaktiven ISH im viszeralen Endoderm, dem Chorion und dem EPC
nachweisen. Die nichtradioaktive ISH erzeugte ein sehr starkes mRNA- Signal in der
Dezidua, wohingegen die Arbeitsgruppe Lin et al. (1994) weder ein mRNA-Signal mit der
ISH noch das Protein mit der Immunhistochemie in der Dezidua detektieren konnten. Die
Ergebnisse müssen also aufgrund der genannten Differenzen im Vergleich zwischen Proteinund mRNA-Expression, aber auch im Vergleich des mRNA-Signals in der radioaktiven bzw.
nichtradioaktiven ISH kritisch betrachtet werden.
Da es sich um verschiedene Methoden von mRNA-Detektion handelt, nämlich einmal die hier
verwendete nichtradioaktive ISH und die radioaktive ISH von der Arbeitsgruppe um Lin
(1994), könnten die unterschiedlichen Ergebnisse daher rühren. Hierbei scheint die
nichtradioaktive ISH sensitiver zu sein als die radioaktive, da mit dieser an Tag 7.5dpc
zusätzlich zu der Expression im EPC, den sekundären GC und dem viszeralen Endoderm,
eine Expression im extraembryonalen Ektoderm sowie Mesoderm detektiert werden konnte.
Kreuzreaktionen sind eher unwahrscheinlich, da die Kontrollen jeweils keine Signale
aufwiesen. Es ließ sich auch nicht eruieren, ob es sich auch hier um eine verzögerte
Proteinexpression im extraembryonalen Ektoderm und dem Mesoderm handeln könnte, da
keine Ergebnisse über die Proteinexpression in diesen beiden Geweben in der Literatur
bekannt gegeben sind.
Pem ist als regulierende Instanz für Cx43 auszuschließen, da hier direkt nach der Implantation
an Tag 5.5pc dieses in dem extraembryonalen Gewebe reprimiert wird. Das Muster von Pem
entspricht so eher dem postimplantativen Verhalten von Cx31, das sich ebenfalls auf die
extraembryonalen Gewebe beschränkt. Wie von Dahl et al., (1996 b) gezeigt, ist sowohl die
mRNA, als auch das Protein von Cx31 im EPC und im extraembryonalen Ektoderm
vorhanden. Mögliche Bindungsstellen für Pem im Cx31-Gen sind bisher weder im Cx31-Gen
der Maus noch der Ratte bekannt (Plum, persönliche Kommunikation; Gabriel et al., 2001).
Betrachtet man allerdings die Untersuchungen der Cx31- und Pem-defizienten Mäuse unter
dem Gesichtspunkt, dass eine Pem-defiziente Maus im Gegensatz zu Cx31-defizienten
Mäusen keine sichtbaren Defekte aufweist, wird eine Regulation des Cx31-Gens zumindest
alleine durch den Transkriptionsfaktor Pem unwahrscheinlich. Es ist jedoch eine
Kompensation des fehlenden Pems durch andere Transkriptionsfaktoren, wie sie z.B. für Esx1
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diskutiert wird, denkbar und lässt so keinen endgültigen Ausschluss von Pem als regulierende
Instanz von Connexinen während der Entwicklung der Maus zu.
In den Stadien 8.5 bis 10.5dpc zeigte Pem im Vergleich zu GATA-2 ein sehr ähnliches
Expressionsmuster. Lediglich die Expression im Embryo war bei Pem nicht vorhanden.
Allerdings ließen sich hier, wie auch schon in den vorherigen Entwicklungsstadien der Maus,
Unterschiede zu den aus der Literatur bekannten Ergebnissen aufzeigen. Es ließ sich hier im
viszeralen Dottersack eine deutliche Expression im mesodermalen Anteil und eine wesentlich
schwächere Expression im endodermalen Anteil erkennen. Der parietale Dottersack zeigte
ebenfalls ein Signal. Ebenso ließ sich im Amnion eine deutliche Reaktion erkennen, während
Lin et al. (1994) hier keine Expression nachweisen konnten. Lin et al. (1994) zeigten eine
mRNA-Expression im Chorion, im EPC, im distalen Anteil des viszeralen Dottersacks und in
den GC auf. Die Expression des Transkriptionsfaktors Pem veränderte sich an Tag 10.5pc im
Vergleich zum Vortag nicht. Die Expression war weiterhin im Spongiotrophoblasten, dem
Labyrinth und den GC, sowie der Chorionplatte zu verzeichnen. Pitman et al. (1998), die
dieses Stadium der Mausentwicklung mit der nichtradioaktiven ISH untersuchten, zeigten
ebenfalls eine Expression in der gesamten Plazenta und der Chorionplatte sowie dem
Endoderm des viszeralen Dottersacks, in dem in den hier vorliegenden Ergebnissen keine
Expression zu verzeichnen war. Eine Expression im Amnion, die hier gezeigt werden konnte,
konnte wiederum von Pitman et al. (1998) nicht nachgewiesen werden. In den Stadien der
Plazentaentwicklung wird Cx31 nur in den GC und dem Spongiotrophoblasten exprimiert.
Pem zeigte hier nicht ein solches Expressionsmuster, das zu dem von Cx31 identisch gewesen
wäre. Die Expression von Pem erstreckt sich über mehr Gewebe als die von Cx31. Eine
Regulation von Cx43 durch c-fos und c-jun, deren Expression auch nicht in allen Punkten mit
der von Cx43 übereinstimmt, ist von Mitchell und Lye (2001) nachgewiesen, so dass ein zu
hundert Prozent übereinstimmendes Expressionsmuster nicht zwingend ist, um eine
Regulation von Cx31 durch Pem annehmen zu können.
Esx1 zeigte an Tag 5.5dpc, als auch an Tag 6.5pc eine ubiquitäre Expression sowohl in den
embryonalen, als auch den extraembryonalen Geweben, d.h. im EPC, im extraembryonalen
Ektoderm, im extraembryonalen Mesoderm, in den GC, im parietalen Endoderm, im
viszeralen Endoderm, im embryonalen Ektoderm und auch in der Dezidua. Für diese beiden
Tage gab es, wie auch für das Blastozystenstadium noch keine Ergebnisse, die in der Literatur
veröffentlicht wurden. In den Stadien 7.5 und 8.5dpc konnte über Esx1 aufgrund einer
Kreuzreaktion keine Aussage gemacht werden. Yan et al. (2000) zeigten an Tag 7.5pc mit
Hilfe der nichtradioaktiven ISH an Kryoschnitten nur eine Expression im Ektoderm des
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Chorion, sonst in keinem anderen extraembryonalen Gewebe. An Tag 8.5pc fanden Yan et al.
(2000) eine Expression im EPC. Li et al. (1997) wiesen sowohl mit der nichtradioaktiven
ISH, als auch mit dem Northern Blot an Tag 8.5pc ebenfalls eine Expression im Ektoderm des
Chorion und in der proximalen Basis des EPCs nach. Im Stadium 9.5dpc ließ sich die
mRNA-Expression von Esx1 wieder beurteilen. Es zeigte sich mit der nichtradioaktiven ISH
eine mRNA-Expression sowohl im Labyrinth, als auch im Spongiotrophoblasten. Ebenfalls
wurde ein Signal in den GC sichtbar. Der viszerale und der parietale Dottersack zeigten eine
Färbung, wobei das Signal im parietalen Anteil stärker imponierte. Hier gab es im Vergleich
zu den in der Literatur geschilderten Expressionsmustern Differenzen. Zum Stadium 9.5dpc
wurde von Li et al. (1997) eine Expression im Labyrinth und den GC gefunden. Auch der
viszerale Dottersack wies ein Signal auf, wobei es sich auf den endodermalen Anteil des
Dottersacks beschränkte. Auch Yan et al. (2000) fanden eine Expression im Labyrinth. Da
hier eine Differenz besonders zu der in der Literatur erwähnten Expression in der Plazenta
bestand, müssen diese Ergebnisse kritisch betrachtet werden. Schon in den Stadien 7.5dpc
und 8.5dpc war eine Kreuzreaktion vorhanden, so dass es sich hier um eben eine solche
handeln könnte, obwohl die Kontrollen in diesen Stadien keine Signale aufwiesen. Für Esx1
lässt sich in Bezug zur Literatur keine Änderung zum Vortag erkennen. Die Expression im
Spongiotrophoblasten war nach wie vor nur in der hier gezeigten Untersuchung zu
verzeichnen.
Eine Übereinstimmung mit dem untersuchten Transkriptionsfaktor Esx1 zeigte im weitesten
Sinne Cx43, das nach Untersuchungen sowohl im embryonalen Ektoderm, als auch im
viszeralen Endoderm exprimiert wird (Dahl et al, 1996 b). Esx1 wird allerdings als ein
Marker für das extraembryonale Gewebe propagiert, was es eher unwahrscheinlich erscheinen
lässt, dass er für die Regulation des Cx43-Expressionsmusters verantwortlich ist.
Auch Cx31 war wie Esx1 im extraembryonalen Ektoderm und im EPC zu detektieren.
Allerdings beschränkte sich die Expression nicht wie bei Cx31 auf diese beiden
extraembryonalen Gewebe, sondern ist auch wie oben beschrieben in anderen Geweben
vorhanden. Gleiches trifft auch auf die Expression in der Plazenta zu. Dort findet man Cx31
in den GC und dem Spongiotrophoblasten, während Esx1 zusätzlich nach den hier
vorliegenden Ergebnissen im Labyrinth mit seiner mRNA vertreten war. Das
Expressionsmuster von Cx31 stimmt also nur in einigen Punkten mit dem Muster des
untersuchten Transkriptionsfaktoren Esx1 überein. Was allerdings nach der oben erwähnten
veröffentlichten Analyse von Mitchell und Lye (2001) nicht ausschließt, dass Cx31 durch
Esx1 reguliert werden könnte.
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Setzt man die Ergebnisse von Li und Yan voraus, so kann man eine Korrelation mit Cx26, das
zum Zeitpunkt der Plazentaentwicklung ausschließlich im Labyrinth exprimiert wird, sehen.
Die hier erzielten Ergebnisse weisen aber eher darauf hin, dass dies nicht der Fall ist.
Eine Aussage, ob die exprimierten Connexine von den ebenfalls in der Blastozyste und in der
postimplantativen Entwicklung exprimierten und hier untersuchten Transkriptionsfaktoren
beeinflusst oder sogar gesteuert werden, ist alleine mit der nichtradioaktiven ISH nicht
möglich. Somit wäre es beispielsweise interessant ein Augenmerk auf eine veränderte
Expression von Connexinen bei Transkriptionsfaktor-defizienten Mäusen zu legen und
umgekehrt auch noch eine Veränderung der Transkriptionsfaktorexpression in Connexin defizienten Mäusen, während der Prä- und Postimplantationsphase zu untersuchen, um eine
mögliche gegenseitige Beeinflussung der Connexinexpression und der Expression der
Transkriptionsfaktoren zu erkennen. Ebenso könnte eine Kotransfektion entsprechender
Expressionsvektoren ausgewählter Transkriptionsfaktoren und Connexinen in Zelllinien
hilfreich sein, eine engere Auswahl in Frage kommender Transkriptionsfaktoren zu treffen.
Ein weiterer Ansatzpunkt ist die Erzeugung von KO- sowie Doppel-KO-Mäusen, z.B.
Doppel-KO-Mäuse von einem Connexin und im günstigsten Fall mehrerer
Transkriptionsfaktoren. Durch all diese weiterführenden Untersuchungen könnte eventuell
eine weitere Eingrenzung oder sogar eine Entdeckung von Transkriptionsfaktoren, die
möglicherweise an der Regulation von Differenzierungsprozessen, die während der
Trophoblastentwicklung und der Plazentaentwicklung stattfinden, erreicht werden.
Die Regulation der Connexinexpression und auch die Regulation der Connexine zu verstehen,
ist Voraussetzung für das Verstehen des Auftretens und der Ausprägung von Erkrankungen
oder auch gestörter Entwicklungsabläufe, die aufgrund einer veränderten Connexinexpression
oder Funktion der Connexine postnatal letal enden oder zur Ausprägung einer
Organdysfunktion führen.
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