Tierärztliche Hochschule Hannover Molekulargenetische
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Tierärztliche Hochschule Hannover Molekulargenetische Untersuchungen caniner Mammatumoren und ihrer zirkulierenden Nukleinsäuren INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Silvia Hennecke Uslar Hannover 2015 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. F.-J. Kaup, Deutsches Primatenzentrum, Göttingen Univ.-Prof. Dr. Dr. B. Brenig, Tierärztliches Institut, Georg-August-Universität, Göttingen 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Franz-Josef Kaup 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. Ottmar Distl Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2015 Meinen Eltern und Marcel Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung .................................................................................................................... 1 2 Publikationen............................................................................................................... 5 2.1 Genome aberrations in canine mammary tumors and their detection in cell-free plasma DNA. ...................................................................................... 7 2.2 Prevalence of the Prefoldin Subunit 5 Gene deletion in canine mammary tumors. ............................................................................................... 23 3 Diskussion ................................................................................................................. 33 4 Zusammenfassung ..................................................................................................... 41 5 Summary ................................................................................................................... 43 6 Literaturverzeichnis ................................................................................................... 45 7 Danksagung ............................................................................................................... 58 Einleitung 1 Einleitung Tumore sind beim Hund eine der wichtigsten Erkrankungen und eine der Haupttodesursachen. Beim weiblichen Hund sind Mammatumore mit 40% die häufigste neoplastische Erkrankung. Die Inzidenz von Mammatumoren liegt bei ca. 200/100.000 Hunden pro Jahr und kann durch eine Kastration vor oder nach der ersten Läufigkeit signifikant gesenkt werden (DORN et al. 1968; DOBSON et al. 2002; SLEECKX et al. 2011). Am häufigsten tritt die Erkrankung im Alter von 8-10 Jahren auf. Beim Hund sind bestimmte Rassen, z.B. Pudel, Cocker Spaniel, Englischer Springer Spaniel, Deutscher Schäferhund und Dackel, prädispositioniert. Mammatumore sind in 50 % der Fälle maligne und treten häufig in mehreren Komplexen gleichzeitig auf. Nach dem klinischen Bild und durch eine zytologische Untersuchung sind diese nur sehr schwierig in ihrer Dignität zu unterschieden. Die genaue Diagnose erfolgt nach der Mastektomie und einer darauffolgenden histopatholgischen Klassifikation. Der überwiegende Anteil der Mammatumore ist epithelialen Ursprungs, wie einfache Adenome bzw. einfache Karzinome, diese entsprechen histologisch dem humanen Brustkrebs. In 20% der Fälle gibt es beim Hund zusätzlich eine myoepitheliale Komponente (komplexes Adenom oder Karzinom), die in der Humanmedizin nur sehr selten auftritt. Nur 5% der Tumore entwickeln sich aus dem mesenchymalen Gewebeanteil des Gesäuges wie z.B. Fibroadenome, Fibrosarkome, Osteosarkome und andere Sarkome. Häufig kommt zu dem mesenchymalen Anteil noch eine epitheliale Gewebekomponente hinzu, sodass benigne Mischtumore bzw. Karzinosarkome entstehen (SLEECKX et al. 2011). Hunde, denen bereits ein maligner Gesäugetumor oder eine Hyperplasie der Milchleiste chirurgisch entfernt wurde, weisen ein erhöhtes Risiko auf einen weiteren malignen Tumor zu entwickeln. Es wird vermutet, das gutartige Tumoren der Mamma als eine Krebsvorstufe angesehen werden können, die dann in eine bösartige Transformation übergehen (SORENMO et al. 2009). Zwischen Tumorerkrankungen bei Menschen und Hunden sind viele Übereinstimmungen beschrieben. Diese beinhalten das Ansprechen auf die Therapie, die Inzidenz verschiedener Tumorarten, sowie den gleichen Lebensraum und die persönlichen Risikofaktoren und eine vergleichbare medizinische Versorgung (PAOLONI u. KHANNA 2008; ROWELL et al. 2011). Dies gilt insbesondere für die Mammatumoren des Hundes, da sie hier wie auch beim 1 Einleitung Brustkrebs Menschen spontan auftreten und nicht wie bei Mäusen induziert werden. Auch die Inzidenz, die beim Menschen etwa bei 125/100.000 im Jahr liegt, ist vergleichbar. Ebenso teilen beide Spezies die gleichen Risikofaktoren wie z.B. das Alter, genetische Prädisposition, Übergewicht in jungen Jahren und hormonelle Einflüsse. Der Altersdurchschnitt liegt beim Menschen bei 50-58 Jahren und entspricht etwa dem des Hundes (8-10 Jahren). Auch sind bei beiden Spezies die gleichen Hormone und ihre Rezeptoren wie Östrogen, Progesteron und Wachstumshormone an der Bildung von Tumoren beteiligt. Beim Brustkrebs tragen Frauen, die eine Mutation des BRCA1 oder BRCA2 aufweisen, ein erhöhtes Risiko zu erkranken, auch beim Hund wird eine Beteiligung dieser Gene vermutet (QUEIROGA et al. 2011; SLEECKX et al. 2011). Das Hundegenom weist, im Gegensatz zum Mäusegenom, mehr Übereinstimmungen mit dem menschlichen Genom auf, z.B. sind die telomerischen Regionen und deren Biologie ähnlich denen des Menschen. Daher eignet sich der Hund besser, um die Tumorbiologie, die Entstehung von Tumoren und deren Therapie zu studieren. Durch eine kürzere Lebenserwartung und einen schnelleren Krankheitsverlauf sind Hunde gut geeignet, um neue Therapien zu entwickeln (NASIR et al. 2001; KHANNA et al. 2006; ROWELL et al. 2011). Besonders Gesäugetumoren des Hundes werden oft als Model für den Brustkrebs des Menschen heran gezogen. Das steigende Wissen über die molekularen Unterschiede und Übereinstimmungen unterstützen daher die Verwendung von Gesäugetumoren in der Brustkrebsforschung (KLOPFLEISCH et al. 2011; QUEIROGA et al. 2011; LIU et al. 2014). Ein genetisches Kennzeichen von Tumorerkrankungen ist das Auftreten von genomischen strukturellen Aberrationen der Chromsomen, die Veränderungen der Kopienanzahl, sog. copy-number imbalances (CNI), und Umlagerungen mit neutraler Kopienanzahl mit einschließen. In der Humanmedizin wurden wiederkehrende chromosomale Aberrationen identifiziert, die mit bestimmten Tumorarten, z.B. Lungen- und Speiseröhrenkrebs, assoziiert werden konnten (BEROUKHIM et al. 2010). Durch den komplexen caninen Karyotyp (76 Autosomen) sind zytogenetische Studien komplizierter, daher profitieren genomische Analysen caniner neoplastischer Erkrankungen von der Entwicklung der Array-basierten komparativen genomischen Hybridisierung, sog. microarray-based comparative genomic hybridization (aCGH) (THOMAS et al. 2007; MULLER et al. 2012). Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden Kopienanzahlunterschiede in der Keimbahn von unterschiedlichen Hunderassen entdeckt (NICHOLAS et al. 2011). Beispielsweise wurden in einer kürzlich 2 Einleitung erschienenen aCGH-Studie signifikante Überlappungen in Regionen mit CNIs zwischen caninem und humanem Darmkrebs beschrieben (TANG et al. 2010). Für die Untersuchung chromosomaler Instabilität in humanen Tumoren wird verstärkt die Hochdurchsatzsequenzierung (next generation sequencing, NGS) angewandt (SCHWEIGER et al. 2011). Durch die Analyse von sog. paired-end mapping (PEM) Signaturen, die man beim NGS erhält, ergibt sich die Möglichkeit alle Aberrationen, inklusive Kopienanzahl neutraler Umlagerungen, mit ihrer genauen Position zu bestimmen. In der Humanmedizin wurden bereits mehrere tausend Brustkrebsgenome sequenziert, während in der Tiermedizin Tumore nur sehr selten mit NGS untersucht wurden (NAYLOR et al. 2005; CURTIS et al. 2012; STEPHENS et al. 2012). Zellfreie Nukleinsäuren (cfNA) im Blutplasma des Menschen wurden erstmals 1948 von Mandel und Métais beschrieben (MANDEL u. MÈTAIS 1948). Sie werden u.a. durch Apoptose und Nekrose frei und können in allen Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden. Im Verlauf von Tumorerkrankungen geben die entarteten Zellen Nukleinsäuren ins Blut ab, wo diese frei zirkulieren. Im Jahre 1994 wurde eine Punktmutationen im Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) im Blut von Krebspatienten detektiert, die im Blut von gesunden Kontrollpersonen nicht gefunden wurde. Somit konnte man mit Hilfe der cfNA zwischen gesunden und kranken Individuen unterscheiden. Seitdem werden cfNA bezüglich der Erkennung und Überwachung von Krebserkrankungen umfassend untersucht (SORENSON et al. 1994; VASIOUKHIN et al. 1994; SCHWARZENBACH et al. 2011). In cfNAs wurden nahezu alle Erscheinungsformen, von tumorassoziierten genetischen und epigenetischen Variabilitäten, untersucht. Dies schließt alle Punktmutationen, Veränderungen von Mikrosatelliten, repetitiven Elementen und DNA-Methylierungen mit ein (SCHWARZENBACH et al. 2011). Es wurde gezeigt, dass sich tumorspezifische chromosomale Bruchpunkte, segmentale Kopienanzahlunterschiede und quantitative Unterschiede der repetitiven Elemente in den cfNAs der Patienten nachweisen lassen (BECK et al. 2010; LEARY et al. 2010; MCBRIDE et al. 2010). Zellfreie Nukleinsäuren bieten sich als flüssige Biopsie an, die es erlauben, anhand einer Blutprobe einen Tumor hinsichtlich seiner Malignität zu analysieren. Kürzlich veröffentlichte Studien zeigen, dass mit Hilfe von Hochdurchsatztechnologien (SNP-Microarrays und NGS) ein vergleichbares Bild des Tumorgenoms auch aus der cfDNA erhalten wird (CHAN et al. 2012; SHAW et al. 2012). 3 Einleitung In den letzten Jahren lag der Fokus bei der Erforschung von Gesäugetumoren des Hundes primär auf Genen, die auch in der Humanmedizin etabliert sind. Um ein besseres Verständnis über die molekularen Prozesse, die zu einer neoplastischen Transformation der Gesäugezellen führen, zu gewinnen, ist jedoch ein breiteres Spektrum an zu überprüfenden Genen erforderlich. Zu den potentiellen Kandidatengenen gehört u.v.a. das Predfoldin Subunit 5 Gene (PFDN5), das im proximalen Breich des caninen Chromosoms 27 (CFA27) liegt. PFDN5 liegt auf CFA27 liegt im Bereich von 1.906.133 bis 1.909.613bp (Broad CanFam 3.1). Das kodierte Protein ist Teil des Prefoldin Komplexes, das als Chaperon fungiert und in die posttranslationale Faltung von höherwertigen Proteinen, wie Aktin und Mikrotubuli, involviert ist. Darüber hinaus können Prefoldin und seine Untereinheiten im Nukleus lokalisiert werden und wirken dort als transkriptionale Regulatoren, indem sie an die DNA oder Transkriptionsfaktoren binden (MILLAN-ZAMBRANO u. CHAVEZ 2014). Insbesondere ist PFDN5 dafür bekannt, den Transkriptionsfaktor c-Myc zu unterdrücken (MORI et al. 1998). Dadurch besitzt PFDN5 das Potential, als Tumorsuppressorgen zu fungieren. Fujioka und Mitarbeiter fanden einen Aminosäureaustausch (A157R), der zum Verlust der c-Myc Transkriptionsunterdrückungsaktivität führt. Dieser ist beim Menschen in 50-60% der Leukämie- bzw. Lymphomzellen und in mehr als 75% bei Zungenkrebs zu finden (FUJIOKA et al. 2001). Zusätzlich wurde eine alternative tumorspezifische Spleißvariante bei Schilddrüsen- und Kopf-Hals-Tumoren entdeckt. Eine Spleißvariante wird durch eine Retention des zweiten Introns gebildet, die dann ein frühzeitiges Stopkodon erzeugt. Eine weitere Spleißisoform führt zu einer 101bp langen Insertion. Beide Varianten werden in Tumoren im Vergleich zu gesundem und gutartigem Gewebe stärker exprimiert (REIS et al. 2005; GUIMARAES et al. 2006). Beim humanem Brustkrebs ist PFDN5 eines von 102 Genen, die eine unterschiedliche Expression im Tumor im Vergleich zu gesundem Gewebe aufweisen, davon zeigen 69% der analysierten Tumoren eine reduzierte Expression von PFDN5 (SCHUMMER et al. 2010). Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es, einen breiten Überblick über die genomischen Aberrationen in caninen Mammakarzinomen zu erhalten und davon ausgehend mögliche Kandidatengene näher zu untersuchen. 4 Publikationen 2 Publikationen Die Ergebnisse zu den Untersuchungen caniner Mammatumoren und ihrer zirkulierenden Nukleinsäuren wurden in zwei bereits veröffentlichten Publikationen dargestellt. Die erste Arbeit mit dem Titel Beck J., Hennecke S., Bornemann-Kolatzki K., Urnovitz H.B., Neumann S., Ströbel P., Kaup F.-J., Brenig B., Schütz E.: Genome aberrations in canine mammary carcinomas and their detection in cell-Free plasma DNA. PLoS ONE. 2013; 8(9): e75485. doi:10.1371/journal.pone.0075485 wurde im Wesentlichen von der Erstautorin Julia Beck und Eckhard Schütz geplant, während die Durchführung der molekulargenetischen Untersuchungen und die Datenauswertungen durch Silvia Hennecke erfolgten. Die übrigen Koautoren unterstützten mit ihren jeweiligen Expertisen die wissenschaftlichen Auswertungen. In diesen Untersuchungen wurde die DNA von fünf malignen Tumoren, die zugehörige Leukozyten DNA und ihre zirkulierenden Nukleinsäuren ausgewertet. Dabei zeigte sich ein heterogenes Muster der genomischen Aberrationen wie chromosomale Aneuploidien (n=2), kleinere Deletionen (n=1) und interchromosomale Fusionen (n=1). Bei einem Tumor wurde keine der genannten Aberrationen festgestellt werden. Durch Sequenzierung konnte eine Deletion am proximalen Ende des Chromosoms 27 detektiert werden. In diesem Bereich liegt das Prefoldin-Untereinheit 5-Gen (PFDN5), das Ausgangspunkt weiterer Untersuchungen darstellte. Diese Ergebnisse wurden in der zweiten Arbeit Hennecke S., Beck J., Bornemann-Kolatzki K., Neumann S., Murua Escobar H., Nolte I., Hammer S. C., Hewicker-Trautwein M., Junginger J., Kaup F.-J., Brenig B., Schütz E.: Prevalence of the Prefoldin Subunit 5 Gene Deletion in canine mammary tumors. PLoS ONE. 2015; 10(7):e0131280. doi:101371/journal.pone.0131280 5 Publikationen veröffentlicht. Die (PFDN5) Deletion wurde bei 24% der malignen (n=102) und 9% der benignen (n=40) Mammatumoren festgestellt, während sie in nicht-malignen Geweben nicht nachweisbar war. Bei den Tieren mit malignen Tumoren wurde weiterhin ein erhöhter Ki-67 Wert als Zeichen einer verstärkten Proliferation ermittelt. Die zweite Arbeit zeigt, dass auf molekulargenetischer Ebene PFDN5 ein potentieller neuer Tumormarker ist. Beide Arbeiten sind im Folgenden als PDF Dokumente aufgeführt. 6 Publikationen 2.1 Genome Aberrations in canine mammary carcinomas and their detection in cell-free plasma DNA 7 Publikationen 8 Publikationen 9 Publikationen 10 Publikationen 11 Publikationen 12 Publikationen 13 Publikationen 14 Publikationen 15 Publikationen 16 Publikationen 17 Publikationen 18 Publikationen 19 Publikationen 20 Publikationen 21 Publikationen 22 2.2 Publikationen Prevalence of the prefoldin subunit 5 gene deletion in canine mammary tumors 23 Publikationen 24 Publikationen 25 Publikationen 26 Publikationen 27 Publikationen 28 Publikationen 29 Publikationen 30 Publikationen 31 Publikationen 32 Diskussion 3 Diskussion Die in beiden Publikationen dargestellten Ergebnisse bauen aufeinander auf. Während in der ersten Publikation mit der Sequenzierung von Mammakarzinomen und zirkulierenden Nukleinsäuren grundsätzlich genomsiche Aberrationen festgestellt wurden, konzentrierte sich die zweite Studie auf ein dabei ermitteltes Kandidatengen (PFDN5), das an einer größeren Fallzahl untersucht wurde. Die nachfolgende Diskussion baut daher dieser Chronologie auf. Sequenzierung von fünf Mammakarzinomen Die “mate-pair” Sequenzierung von fünf Karzinomen der caninen Gesäugeleiste zeigte ein heterogenes Muster der genomischen Aberrationen. Gerade die drei tubulopapillären Karzinome (T35, T47, T52) zeigten keine offensichtlichen Übereinstimmungen in den CNI Mustern. Als aktivierende Eigenschaft der Tumorentwicklung werden Mutationen und genomische Instabilität betrachtet (HANAHAN u. WEINBERG 2011). Diese manifestiert sich in unterschiedlichen strukturellen Formen, welche zuerst bei humanem Dickdarmkrebs und später auch in anderen Krebsarten beschrieben wurden (GEIGL et al. 2008; MARTIN et al. 2012). Das häufigste Erscheinungsbild ist die chromosomale Instabilität, die sich in eine Aneuploidie ganzer Chromosomen oder einzelner Chromosomenabschnitte unterteilen lässt. Diese resultieren in fehlerhafter Trennung der Chromosomen während der Mitose, während segmentale Aneuploidien, die auch strukturelle Rearrangements oder Aberrationen genannt werden, durch Strangbrüche entstehen (GEIGL et al. 2008). Zwei der analysierten Tumorgenome (T30 und T49) zeigten auf der subchromosomalen Ebene eine Vielzahl an strukturellen Aberrationen. Im Tumor T47 trat eine chromosomale Instabilität auf, die mehrere gesamte Chromosomen betraf (CFA2, 3, 5, 11, 18, 19, 21, 27, 29, 30, 33, 37, 38). Diese Hypoploidien sind sehr häufig bei Tumoren der Gesäugeleiste des Hundes. Im Gegensatz dazu treten diese bei humanem Brustkrebs sehr selten auf. Hier kommen eher Amplifikationen von HSA1q, 11q, 8q und 16p vor (HELLMEN et al. 1988; RUTTEMAN et al. 1988; HICKS et al. 2006; KWEI et al. 2010). Im Genom des Tumors T49 wurden hoch komplexe interchromosomale Neuanordnungen nachgewiesen, die nur auf wenige Chromosomen (CFA11, 16, 18, 20, 27, 29, 35) beschränkt waren. Diese deuten auf eine Chromothripsis hin, ein erst kürzlich entdecktes Phänomen, das 33 Diskussion ein einmaliges chromosomenzerstörendes Ereignis beschreibt und in 2-3% der Fälle bei humanen Krebsformen vorkommt (STEPHENS et al. 2011; LIU et al. 2012; MAHER u. WILSON 2012). Die betroffenen caninen Chromosomen CFA27 und CFA35 sind syntänisch zu den humanen Chromosomen HSA12 beziehungsweise HSA6. Während HSA6 häufig in komplexe Amplifikationsmuster bei Brustkrebs involviert zu sein scheint, kommen Aberrationen von HSA12 seltener vor (HICKS et al. 2006). Eine weitere Form von genomischen Aberrationen in Tumorgenomen sind Genfusionen. Die Verschmelzung von SOX5 und ANO2 (beide auf Chromosom CFA27 lokalisiert) in T49 war die einzige detektierte Fusion in unserer Studie. Allerdings wurde diese noch nicht bei humanen Tumorarten beschrieben und scheint keine funktionelle Relevanz aufzuweisen. Vielmehr ist diese Fusion, wie viele andere Genaberrationen im Krebsgenom, ein Zufallsprodukt, das durch die große genomische Instabilität auftritt. Im Gegensatz zu caninen Tumoren sind beim Menschen bereits Genfusionen in vielen Tumorarten bekannt, z.B. TMPRRS2-ERG Fusion bei Prostatakrebs und FGF Fusionen bei Prostata und Brustkrebs. Genfusionen können die Ursache für Tumoren sein und als diagnostisches, prognostisches und therapeutisches Hilfsmittel dienen (MITELMAN et al. 2007; WU et al. 2010; YU et al. 2010). Die höchste Anzahl von Rearrangements und Aneuploidien wurde im Genom von T30 erfasst. Dieses Muster von CIN war hinweisend für einen mutierten Phänotyp. Das heißt, dass die chromosomale Instabilität in Tumorzellen in einer Kaskade von Genmutationen entsteht, welche die genetische Stabilität einer Zelle aufrechterhalten (LOEB et al. 2003; LIU et al. 2012). Eine andere Theorie besagt, dass eine chromosomale Aneuploidie die Ursache für eine strukturelle Neuordnung ist. Entsprechend dieser Hypothese führt ein unausgeglichener Karyotyp zu einer unbeständigen Expression von mehreren Tausend Genen und beeinträchtigt auch die DNA Reparaturmechanismen, welche dann zu strukturellen Neuanordnungen und Mutationen führen (FABARIUS et al. 2003). Diese Mutationen in Genen, wie p53, oder die frühe Entstehung von Aneuploidien werden als primärer Grund für die Bildung von Tumoren diskutiert, aber wahrscheinlich ist keines dieser eng verbundenen Phänomene die alleinige Ursache für alle Krebsarten (BOERKAMP et al. 2012). 34 Diskussion Nach der Sequenzierung wurden im Tumorgewebe von T52 nur wenige chromosomale Bruchpunkte detektiert. Mit der „depth of coverage“ Analyse zeigte sich eine flache Amplitude von Amplifikationen und Deletionen. Der Anteil des bruchpunktspezifischen Amplikons betrug, in Bezug auf das Referenzamplikon, 21%. Diese Tatsache, zusammen mit der relativ niedrigen Anzahl von erzeugten Sequenzen in der Probe dieses Tieres, macht eine Analyse der chromosomalen Instabilität für diesen Tumor nicht möglich. Ebenso konnte für T35 keine eindeutige CNI detektiert werden. Beim Brustkrebs des Menschen wurde bei einigen Tumoren ebenfalls ein „flaches“ Profil beschrieben (HICKS et al. 2006). Jedoch kann dies auch durch eine hohe Prozentzahl an nicht-neoplastischen Zellen in der Probe resultieren. Das Muster der chromosomalen Instabilität, das in Gesäugetumoren des Hundes detektiert wurde, ist ähnlich den Arten von Neuanordnungen, die von Hicks und Kollegen bei humanem Brustkrebs beschrieben wurden (HICKS et al. 2006). Mit den hauptsächlich vollständige Chromosomen betreffenden Alterationen erinnert T47 an den „einfachen“ Typ. Während T30 dem komplexen Typ I oder „sawtooth“ Muster gleicht, bei dem viele schmale Segmente der Chromosomen von Duplikationen und Deletionen mit normaler Kopienanzahl betroffen sind. T49 entspricht dem komplexen Typ II oder „firestorm“ Muster, das ein gehäuftes Auftreten von schmalen Amplifikationen auf einem Chromosom zeigt. Es konnte keine Relation zwischen dem genomischen Muster und dem Tumorgrad nachgewiesen werden (HICKS et al. 2006). Weitere Untersuchungen sind notwendig, um zu zeigen, ob eine bestimmte Untergruppe von caninen Tumoren vorhanden ist, die weder eine große Amplifikation noch Deletion zeigen. Zusammenfassend sind die genomischen Aberrationen in den fünf Tumorgenomen heterogen und weisen sowohl Gemeinsamkeiten als auch Unterschiede zum Brustkrebs des Menschen auf. Basierend auf vorherigen Vergleichen zwischen caninen und humanen CNIs, kann eine absolute Übereinstimmung der betroffenen genomischen Regionen nicht angenommen werden. Einige wiederkehrende CNI sind speziesspezifisch, weil sie ihren Ursprung in evolutionären instabilen hypervariablen Regionen haben, wie sie z.B. auf dem menschlichen Chromosom 8p23.1 vorkommen (TANG et al. 2010). 35 Diskussion Untersuchung der zirkulierenden Nukleinsäuren Zusätzlich zur Analyse der Tumorgenome wurde die cfDNA der Tiere untersucht. Die cfDNA und die Tumorgenome von zwei Tieren (T49 und T47) wurde „paired-end“ sequenziert und die Unterschiede der Kopienanzahl in den Proben mit Hilfe der Z-Wert Analyse ausgewertet. Es wurde eine gute Übereinstimmung zwischen den Tumoren und der dazugehörigen cfDNA in Regionen mit hoher Amplifikation erzielt. Im Vergleich dazu war die Übereinstimmung bei Deletionen deutlich schlechter. Wie Chan und Kollegen für Krebspatienten in der Humanmedizin zeigen konnten, hängt die Nachweisbarkeit von tumorassoziierten CNIs in cfDNA vom Anteil der Tumor-DNA im Plasma und von der Sequenziertiefe ab (CHAN et al. 2012). Ebenso konnte hier gezeigt werden, dass die quantitativen Unterschiede der Kopienanzahl in der cfDNA ihren Ursprung in den gleichen Kopienanzahlunterschieden der Tumorzellen haben. Ein, für die Bruchpunkte spezifisches, PCR-Assay konnte nur bei vier Tumoren (T30, T47, T49, T52) entwickelt werden, da T35 keine geeigneten Bruchpunkte aufwies. Das Auftreten von tumorspezifischen chromosomalen Bruchpunkten im Plasma des Hundes wurde in dieser Studie somit erstmals quantitativ bestimmt. Der Anteil der cfDNA im Plasma variierte zwischen den Tieren und lag im Bereich zwischen 1% bis 24%. Die Amplifikation von Fusionspunkten aus cfDNA ist als leistungsfähiges Verfahren zur Überwachung von Tumorrezidiven bekannt (LEARY et al. 2010; MCBRIDE et al. 2010). In der vorliegenden Studie wurde bewiesen, dass man mit diesem Verfahren bisher nicht identifizierte Metastasen und Tumoren nachweisen kann. So konnte die Persistenz von Tumormarkern im Plasma einer Hündin noch Monate nach der Mastektomie nachgewiesen werden. Die cfDNA Analyse wies die tumorspezifischen Fusionspunkte nach, die zu diesem Zeitpunkt nach erfolgreicher Mastektomie nicht mehr detektierbar hätte sein dürfen. Eine im Anschluss durchgeführte computertomographische Untersuchung der Hündin ergab eine bisher nicht entdeckte Metastase in der Lunge, die verantwortlich für die Ergebnisse der molekulargenetischen Analyse war. Allerdings konnten für die anderen Tiere der Studie keine Blutproben nach der Mastektomie gewonnen werden. Dennoch bestätigt diese Studie die Eignung von cfDNA als Tumormarker. Die Amplifikation von chromosomalen Bruchpunkten ist somit eine hochspezifische Methode, da man davon ausgeht, dass diese Bruchpunkte nicht von gesunden Körperzellen 36 Diskussion amplifiziert werden, sodass der Nachweis einer Amplifikation direkt an die Anwesenheit von Tumorzellen gebunden ist. Leary und Kollegen konnten ähnliche Ergebnisse bei humanem Darmkrebs und Brustkrebs erzielen (LEARY et al. 2010). Die aufwändige und teure Untersuchung der individuellen chromosomalen Bruchpunkte und die erforderliche Sequenzierung des Tumorgenoms stellen erhebliche Nachteile dieser Methode dar. Ebenso kann das Auftreten von multiplen Tumoren, mit unterschiedlicher Dignität und verschiedenen Aberrationsmustern, die Nutzbarkeit beim Hund einschränken. Zudem wird ein Monitoring von Tumorrezidiven bei Hunden mit Gesäugetumoren normalerweise nicht durchgeführt. Die hier angewandte Technologie bietet eine Grundlage für weitere Untersuchungen der Eignung von cfDNA als Biomarker für das Ansprechen auf Medikamente, zur Diagnostik und Überwachung des Krankheitsverlaufs. Deletion des PFDN5 Gens Das Chromosom CFA27 war in zwei der sequenzierten Tumorgenome komplett und in zwei weiteren Tumoren teilweise deletiert. Eine wiederkehrende Deletion des proximalen Endes des Chromosoms 27 konnte mit Hilfe der ddPCR bestätigt und in 10 von 20 Tumoren nachgewiesen werden. Die Suche nach tumorassoziierten Genen ergab PFDN5 als Kandidatengen in dieser Region. PFDN5, oder auch als c-Myc Modulator MM1 bekannt, ist als Tumorsuppressorgen beschrieben, das die Expression des c-Myc Onkogenproduktes unterdrückt (HAGIO et al. 2006). Die Überprüfung von Genen, die bei Brustkrebs häufig von Amplifikationen oder Deletionen betroffen sind, ergab nur in einigen Tumoren eine Überstimmung (BECK et al. 2013). Daraufhin wurde die Deletion von PFDN5 an einer größeren Probenanzahl überprüft. PFDN5 ein neuer Tumormarker Der zweite Teil der vorliegenden Dissertation konnte bestätigten, das die somatische Deletion von PFDN5 in malignen Gesäugetumoren des Hundes vorkommt und einen neuen potentiellen Tumormarker darstellt (HENNECKE et al. 2015). Weiterhin unterstützt das Auftreten der Deletion in 24% der analysierten malignen Tumoren die Annahme, dass PFDN5 ein potentielles „Tumor Driver“ Gen darstellt. Das bedeutet, dass das Gen bei somatischer Veränderung zum Auftreten von Tumorerkrankungen führt (HABER u. 37 Diskussion SETTLEMAN 2007; STRATTON et al. 2009). Es wird angenommen, dass unterschiedliche Mutationen erforderlich sind, um zur Tumorentstehung zu führen. Die genaue Anzahl kann lediglich geschätzt werden, da sie in bestimmten Tumorarten unterschiedlich auftreten. Es wird allgemein angenommen, dass „Cancer Driver“ Gene ab einer bestimmten Entwicklungsstufe der Tumoren verändert sind (STRATTON et al. 2009). Zum Beispiel wurde eine Amplifikation des c-Myc Onkogens in 15,7% der Brustkrebsfälle nachgewiesen (XU et al. 2010). Da PFDN5 bei Menschen in unterschiedlichen Tumorarten detektiert wurde, ist es von Interesse, ob diese Deletion auch beim Hund in verschiedenen Tumoren nachweisbar oder spezifisch für Mammatumoren ist. Z.B. wurde die Deletion in einem Osteosarkom der Mamma gefunden und es wäre von Bedeutung, ob sie auch in primären Knochentumoren zu finden ist. In dieser Studie konnte die Deletion des caninen PFDN5 mit 67% am häufigsten in der Gruppe der soliden Karzinome festgestellt werden. In komplexen Karzinomen zeigte sich diese in 26% der Fälle und in 10% der analysierten einfachen Karzinome (HENNECKE et al. 2015). Eine aktuelle Studie postuliert, dass diese Unterschiede auf verschiedene kanzerogene Mechanismen hindeuten, die zu unterschiedlichen Karzinomtypen führen (LIU et al. 2014). In Tumoren mit hohem Anteil benigner Tumorzellen und geringem Anteil mit karzinomatösen/sarkomatösen Tumorzellen wurde die Deletion nur in einer sehr geringen Prozentzahl nachgewiesen. Dies ist am wahrscheinlichsten auf einen Verdünnungseffekt zurückzuführen, da sehr häufig eine niedrige Anzahl maligner Zellen gleichzeitig in einem größeren Areal mit benignen Anteilen vorkommt. In diesen Tumoren liegt der karzinomatöse Anteil als Zentrum von bösartig erscheinenden Zellen oder als deutliche Knötchen von bösartigen Zellen innerhalb eines ansonsten komplexen Adenoms vor (MISDORP et al. 1999). Der prozentuale Anteil maligner zu benignen Zellen lässt sich sehr schwer schätzen. Der Verdünnungseffekt der DNA bösartiger Zellen mit nicht tumorös veränderten Zellen wurde bestätigt, indem die Deletion in drei von sechs Fällen bei Stanzproben maligner Bereiche nachgewiesen werden konnte, obwohl sie zuvor in dem homogenisierten Gesamtmaterial (benigne und maligne Bereiche) nicht nachweisbar war. Um die Anwesenheit der Deletion noch genauer zu bestimmen, sind weitere Analysen, z.B. aus Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem Material, erforderlich. 38 Diskussion Interessanterweise wurde die Deletion auch in einigen gutartigen Gesäugetumoren gefunden, obwohl diese zum Zeitpunkt der Mastektomie keine histopathologischen Hinweise auf Malignität aufwiesen. Diese drei Fälle stammten von komplexen Adenomen und benignen Mischtumoren. In einer kürzlich erschienen Studie für die Humanmedizin wird bestätigt, dass eine histopathologische Klassifizierung sehr schwierig ist, da eine beträchtliche falschnegativ-Rate auftrat (ELMORE et al. 2015). Des Weiteren können fokale Unterschiede zwischen den für die histopathologischen und molekularbiologischen Untersuchungen genommen Bereichen nicht ganz ausgeschlossen werden. Auf der anderen Seite werden benigne Gesäugetumoren auch als präkanzeröse Läsionen angesehen und tragen ein erhöhtes Risiko sich zu bösartigen Läsionen zu entwickeln (SORENMO et al. 2009). In diesem Zusammenhang kann angenommen werden, dass eine Deletion des c-MYC Repressor Gens PFDN5 einen Risikofaktor für eine Präkanzerose darstellt. In Progestin-induzierten Hyperplasien der caninen Mamma wurde eine verringerte Expression dieses Gens gefunden (RAO et al. 2009), jedoch konnte die PFDN5 Deletion hier in keiner der Hyperplasien detektiert werden. Die PFDN5 Deletion konnte in der cfDNA der Tiere nicht nachgewiesen werden, da nur ein geringer Anteil der cfDNA aus Tumormaterial stammte. Ab einem gewissen Bereich kann die Deletion durch die Verdünnung mit Gewebe mit normaler Kopienanzahl nicht mehr detektiert werden (LO et al. 2001), obwohl mit der ddPCR ein präzise Methode zur Verfügung steht. Bei tumorspezifischen Assays kommt dieses Phänomen nicht zum Tragen, da hier Bruchpunkte detektiert werden, die in normalen Körperzellen nicht vorliegen und die somit in geringsten Konzentrationen nachzuweisen sind. Ein weiterer Hinweis für die Rolle von PFDN5 als Tumorsuppressorgen ist die in dieser Studie ermittelte Assoziation zwischen der Deletion auf CFA27 und einem erhöhten Ki-67 Wert (BECK et al. 2013). Ki-67 ist ein nicht-Histon-Protein, welches nur in proliferierenden Zellen exprimiert wird. So kann die Wachstumsfraktion einer Zellpopulation und auch die Zellproliferation in Mammatumoren des Menschen und des Hundes bestimmt werden (GERDES et al. 1991; QUEIROGA et al. 2011). In der Humanmedizin wird, im Gegensatz zur Veterinärmedizin, der Ki-67 Wert für Brustkrebs routinemäßig bestimmt. Seit für Ki-67 signifikante Unterschiede zwischen gutartigen und bösartigen Gesäugetumoren beschrieben 39 Diskussion wurden, dient eine erhöhte Zellproliferation als Indikator für Malignität. Weiterhin werden erhöhte Ki-67 Werte mit erhöhtem Tumorgrad, erhöhter Tumorgröße, Lymphknotenbeteiligung und Metastasierung assoziiert. Bei Hündinnen, die einen Tumor mit hohem Ki-67 Wert zeigen, ist die Überlebenszeit signifikant erniedrigt (KLOPFLEISCH et al. 2011). Obwohl ein signifikanter Unterschied der Ki-67 Werte zwischen gutartigen und bösartigen Tumoren in unserem Probenset festgestellt wurde, scheint durch die große Überlappung ein genereller Nutzen als prognostischer Marker beeinträchtigt. Ebenso sind die Ki-67 Werte in den bösartigen Tumoren, welche die Deletion aufweisen, signifikant höher im Vergleich zur Gruppe ohne Deletion, obwohl beide Gruppen stark überlappen (HENNECKE et al. 2015) Es gab keine Angaben zur Überlebenszeit oder zu Tumorrezidiven bei den Patienten. Daher kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob sich der Ki-67 Wert in Verbindung mit der Deletion oder die Deletion alleine als prognostischer Marker eignet. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass das häufige Auftreten der Deletion in Gesäugetumoren ausschließlich mit der Position von PFDN5 zusammenhängt, weil dieses in der Nähe des Zentromers lokalisiert ist. Zentrale Fusionen, die das Ergebnis von umgekehrten Translokationen sind, kommen in Tumorzellen häufiger vor. Es wird angenommen, dass sie zufällig und in größerer Häufigkeit zu einem späten Zeitpunkt der Tumorprogression auftreten (HAHN 2002). Umgekehrte Translokationen führen häufig zu großen Deletionen im Bereich der Bruchpunkte (HOWARTH et al. 2011). Daher kann es möglich sein, dass die wiederkehrende Deletion von PFDN5 in Gesäugetumoren des Hundes mehr ihrer Position und weniger ihrer Funktion während der Krebsentstehung zu zuschreiben ist. Dennoch macht der Umstand, dass eine derartige somatische telomerische Deletion nicht auf anderen Chromosomen gefunden wurde und dass die PFDN5 Deletion in wesentlicher Häufigkeit in malignen Mammatumoren auftrat, eine funktionelle Rolle dieses Gens sehr wahrscheinlich. Die funktionelle Rolle sollte jedoch durch Expressionsstudien oder Proteinanalysen noch untermauert werden. Diese Arbeit dient daher nur als Grundlage für weitere Untersuchungen. 40 Zusammenfassung 4 Zusammenfassung Silvia Hennecke (2015) Molekulargenetische Untersuchungen caniner Mammatumoren und ihrer zirkulierenden Nukleinsäuren Mammatumore sind die häufigsten Neoplasien beim weiblichen Hund. Im Rahmen dieser Dissertation sollten chromosomale Aberrationen sowohl im Tumorgenom als auch in den zirkulierenden Nukleinsäuren an Mammatumoren erkrankter Hunde nachgewiesen und miteinander verglichen werden. In der ersten Publikation (Beck J., Hennecke S., et al.: Genome aberrations in canine mammary carcinomas and their detection in cell-free plasma DNA. PLoS ONE. 2013; 8(9): e75485) wurde die DNA von fünf malignen Tumoren, die zugehörige Leukozyten-DNA und ihre zirkulierenden Nukleinsäuren isoliert und mit Hochdurchsatz-Sequenzierung untersucht. Die Sequenzierungsdaten der Tumoren zeigten ein sehr heterogenes Muster der genomischen Aberrationen. Zwei Tumore zeigten chromosomale Aneuploidien und ein Tumor zeigte kleinere Deletionen. In einem weiteren Tumor konnten interchromosomale Fusionen nachgewiesen werden, wohingegen ein Tumor keine der genannten Aberrationen aufwies. In den zirkulierenden Nukleinsäuren konnten diese unterschiedlichen Aberrationen der Tumor-DNA mittels Sequenzierung ebenfalls detektiert werden. Die Abweichungen zum Tumor sind jedoch deutlich geringer, da es zu einer Verdünnung der Nukleinsäuren der apoptotischen Tumorzellen durch normale Körperzellen im Blut kommt. Für vier der Tumoren wurde ein tumor- und aberrationsspezifisches digitales PCR-Assay entwickelt, womit der tumorspezifische Anteil in den zirkulierenden Nukleinsäuren nachgewiesen wurde. Zwischen den Tieren variierte dieser Anteil sowohl zwischen den Tumoren als auch den zirkulierenden Nukleinsäuren grundlegend. Bei einem Tier konnte die tumorspezifische Nukleinsäure noch 83 und 89 Wochen nach der Mastektomie detektiert werden. Daraufhin wurde mit Hilfe einer Computertomographie eine Lungenmetastase bei diesem Tier nachgewiesen. In vier von fünf Tumoren konnte durch Sequenzierung eine Deletion am proximalen Ende des Chromosoms 27 detektiert werden, wohingegen der überwiegende Anteil der Aberrationen 41 Zusammenfassung nur in zwei Tumoren auftrat. In diesem Bereich des Chromosoms 27 liegt das PrefoldinUntereinheit 5-Gen (PFDN5). Das kodierte Protein ist Teil des Prefoldin-Komplexes und beim Menschen ist insbesondere PFDN5 dafür bekannt, den c-Myc Transkriptionsfaktor zu unterdrücken. Dadurch besitzt es das Potential, als Tumor-suppressorgen zu fungieren und kann aufgrund dessen mit hoher Wahrscheinlichkeit als Kandidatengen angesehen werden. Die oben beschriebene Deletion wurde mittels Droplet Digitaler PCR in 10 von 20 malignen Mammatumoren bestätigt. Innerhalb dieser Gruppe wurde bei Tumoren mit der Deletion ein signifikant erhöhter Ki-67 Wert ermittelt. Darauf aufbauend wurde in der zweiten Publikation (Hennecke S., et al.: Prevalence of the Prefoldin Subunit 5 Gene Deletion in canine mammary tumors. PLoS ONE. 2015; 10(7):e0131280. doi:101371) die PFDN5 Deletion an einer größeren Probandenanzahl untersucht. Es wurden 102 maligne und 40 benigne Mammatumoren und 11 Mammageweben ohne histopathologischen Befund auf des Auftreten der Deletion getestet. Die PFDN5 Deletion wurde in 24% der malignen, aber nur in 9% der benignen Mammatumore detektiert. In den nicht-malignen Geweben war sie nicht nachweisbar. Innerhalb der malignen Tumore trat die Deletion in den verschiedenen Untergruppen unterschiedlich häufig auf. Zusätzlich zur Deletion konnten bei den malignen Mammatumoren erhöhte Ki-67 Werte als Zeichen einer erhöhten Proliferationsrate festgestellt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei den untersuchten malignen Mammatumoren strukturelle Genomaberrationen nachgewiesen wurden, so dass deren Korrelat im Plasma als Tumorbiomarker anwendbar erscheint. Dies gilt besonders für das Auftreten der Deletion des PFDN5 Gens, das einen potentiellen neuen Tumormarker auf molekulargenetischer Ebene darstellen könnte. 42 Summary 5 Summary Silvia Hennecke (2015) Molecular Analysis of canine mammary tumors and their circulating nuleic acids Mammary tumors represent the most frequent cancers in female dogs. As part of this thesis the chromosomal aberrations in the tumor genome and in the cell-free DNA from dogs with mammary tumors were detected and compared with each other. For the first publication (Beck J., Hennecke S., et al.: Genome aberrations in canine mammary carcinomas and their detection in cell-free plasma DNA. PLoS ONE. 2013; 8(9): e75485) the DNA of five malignant tumors, the corresponding white blood cell DNA and their cell-free DNA were extracted and massive parallel sequencing was performed. The sequencing data of the tumors revealed heterogeneous patterns of genomic aberrations. Chromosomal aneuploidies were found in two tumors and frequent smaller deletions were found in one tumor. Another tumor showed interchromosomal fusions, whereas one tumor was devoid of any of these anomalies. After sequencing these different aberrations of tumor DNA were also detected in cell-free DNA. However, the deviations are much lower compared to the tumor, because the cell-free DNA from apoptotic tumorcells was diluted by cell-free DNA from normal cells. A tumorand aberration-specific digital PCR assay was designed for four of these tumors, to detect the tumor-specific part of the cell-free DNA. Amongst the dogs the content of tumor-specific rearrangements differed between the tumors and the cell-free DNA. In one of the animals the tumor-specific cell-free DNA was detected 83 and 89 weeks after mastectomy, a subsequent tomographic examination of the animal revealed a metastatic lesion in the lung. In summary in malignant mammary tumors structural aberrations were detected and their correlation in cell-free DNA in the plasma supports the use as a cancer biomarker. In four out of five tumors the sequencing revealed a deletion of the proximal end of canine chromosome 27, whereas the majority of the aberrations occurred in one or two tumors. The proximal part of canine chromosome 27 harbors the prefoldin subunit 5 gene (PFDN5) encoding a protein that is a part of the so-called prefoldin complex. In particular PFDN5 in humans is known to repress the c-MYC transcription factor. Thus it is a potential candidate 43 Summary tumor suppressor gene. By using droplet digital PCR deletion of the PFDN5 was confirmed in 10 out of 20 malignant tumors. In these tumors the Ki-67 scores were significantly higher in the presence of the deletion. Based on these findings in the second publication (Hennecke S., et al.: Prevalence of the Prefoldin Subunit 5 Gene Deletion in canine mammary tumors. PLoS ONE. 2015; 10(7):e0131280. doi:101371) the PFDN5 deletion were validated in 102 malignant and 40 benign canine mammary tumors and in 11 mammary tissues without histopathological findings. The PFDN5 deletion was detected in 24% of the malignant and only in 9% of the benign tumors and was not detectable in normal mammary tissue. The occurrence of the deletion differed in the subgroups of the malignant tumors. Thus presence of the PFDN5 gene deletion in malignant mammary tumor was confirmed and potentially represents a new tumor biomarker. In tumors with the deletion the higher Ki-67 scores were confirmed as well. The association of a higher Ki-67 score and PFDN5 deletion is indicative for an increased proliferation rate, therefore a relation to tumor aggressiveness can be assumed. In conclusion in the investigated malignant mammary tumors structural genomic aberrations were detected, so that their correlate in the plasma appears applicable as a tumor biomarker. This is especially true for the occurrence of the PFDN5 deletion and it represent a potential new tumor marker on the molecular genetic level. 44 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis BECK, J., S. HENNECKE, K. BORNEMANN-KOLATZKI, H. B. URNOVITZ, S. NEUMANN, P. STROBEL, F. J. KAUP, B. BRENIG u. E. SCHUTZ (2013): Genome aberrations in canine mammary carcinomas and their detection in cell-free plasma DNA. PloS one 8, e75485 BECK, J., H. B. URNOVITZ, W. M. MITCHELL u. E. SCHUTZ (2010): Next generation sequencing of serum circulating nucleic acids from patients with invasive ductal breast cancer reveals differences to healthy and nonmalignant controls. Mol Cancer Res 8, 335-342 BEROUKHIM, R., C. H. MERMEL, D. PORTER, G. WEI, S. RAYCHAUDHURI, J. DONOVAN, J. BARRETINA, J. S. BOEHM, J. DOBSON, M. URASHIMA, K. T. MC HENRY, R. M. PINCHBACK, A. H. LIGON, Y. J. CHO, L. HAERY, H. GREULICH, M. REICH, W. WINCKLER, M. S. LAWRENCE, B. A. WEIR, K. E. TANAKA, D. Y. CHIANG, A. J. BASS, A. LOO, C. 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Ein besonders herzlicher Dank gilt Prof. Dr. Ekkehard Schütz und Dr. Julia Beck, die mich die ganzen Jahre unterstützt haben und ohne die dieses Projekt niemals möglich gewesen wäre. Danke für die hervorragende Betreuung, dafür dass ich mit euch zusammenarbeiten durfte und ihr mir so viel beigebracht habt. Natürlich auch ein Dankeschön dem restlichen Chronix-Team, insbesondere Sarah Bierau und Stefan Balzer, für ihre super Zusammenarbeit und die schönen Zeit im Labor. Vielen Dank auch an Kirsten Bornemann-Kolatzki für die hilfreichen Gespräche. Bei dem gesamten Team der Kleintierklinik Göttingen, Prof. Dr. Stefan Neumann, Dr. Andrea Gessler, Dr. Uta Brandenburg, Dr. Almuth Chilla, Dr. Meike Frenz, Dr. Melanie Haas und allen Mitarbeitern möchte ich mich für die Hilfe bei der Probenbeschaffung und ihr immer offenes Ohr bei Fragen auch an den Wochenenden bedanken. Natürlich danke ich auch Claudia Floren und Isabel Wiedemann für ihre unzähligen Hilfestellungen in jedem Stadium der Arbeit und den fortwährenden Zuspruch. Bedanken möchte ich mich auch bei allen Kollegen und Kolleginnen des Tierärztlichen Instituts, besonders bei Melanie Scharfenstein und Sabrina Pach, die stets hilfsbereit waren. Danke für die schöne Zeit! Vielen Dank an meine Eltern, die mich während meines gesamten Werdeganges unterstützt haben. Meiner Schwester Sonja ohne die ich das Studium nicht überstanden hätte. Und natürlich meinen Schatz Marcel, der nun seit dem Abi alles mit mir zusammen durchgestanden hat und immer an meiner Seite war. Ihr seid die Besten. 58
