Dissertation Iris Scharf 25.11.08
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Aus der Medizinischen Universitätsklinik, Abteilung Innere Medizin II, der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Molekulare und klinische Charakteristika neuroendokriner Karzinome des Kolon INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität zu Freiburg i. Br. vorgelegt 2008 von Iris Christine Scharf geboren in Berlin ii iii Dekan: Prof. Dr. Christoph Peters Erster Gutachter: PD Dr. Christian N. Arnold Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Oliver G. Opitz Jahr der Promotion: 2008 iv v Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG ......................................................................................................................................................... 1 1.1 DEFINITION DER GEP-NET ...................................................................................................................................... 1 1.2 GESCHICHTLICHER HINTERGRUND ........................................................................................................................... 1 1.3 KLASSIFIKATION UND TERMINOLOGIE ...................................................................................................................... 2 1.4 EPIDEMIOLOGIE ........................................................................................................................................................ 2 1.5 PROGNOSE ................................................................................................................................................................ 3 1.6 SPEKTRUM UND CHARAKTERISTIKA ......................................................................................................................... 3 1.6.1 Charakteristika von Hindgut-NET ................................................................................................................... 4 1.6.2 Charakteristika von niedrig differenzierten neuroendokrinen Karzinomen (PDEC) ....................................... 5 1.7 KOLOREKTALES KARZINOM (CRC) .......................................................................................................................... 5 1.8 KARZINOGENESE....................................................................................................................................................... 7 1.8.1 Two-hit modell nach Knudson.......................................................................................................................... 7 1.8.2 Genomische Instabilität.................................................................................................................................... 8 1.8.3 Chromosomale Instabilität (CIN)..................................................................................................................... 8 1.8.4 CIMP................................................................................................................................................................ 8 1.8.5 Mikrosatelliteninstabilität (MSI) ...................................................................................................................... 8 1.8.6 Epigenetik......................................................................................................................................................... 9 1.9 KI-67-MARKER ....................................................................................................................................................... 12 1.10 AKTUELLER STAND DER FORSCHUNG ................................................................................................................... 13 2 ZIELSETZUNG .................................................................................................................................................... 15 3 MATERIALIEN.................................................................................................................................................... 17 3.1 GERÄTE .................................................................................................................................................................. 17 3.2 CHEMIKALIEN UND ENZYME ................................................................................................................................... 18 3.3 ANTIKÖRPER ........................................................................................................................................................... 19 3.4 KITS ........................................................................................................................................................................ 19 3.5 VERBRAUCHSMATERIALIEN .................................................................................................................................... 19 3.6 PUFFER UND LÖSUNGEN: ........................................................................................................................................ 20 3.7 HERSTELLUNG EINER POSITIV–KONTROLLE: .......................................................................................................... 21 3.8 PATIENTEN .............................................................................................................................................................. 22 3.8.1 Kolon-NET ..................................................................................................................................................... 22 3.8.2 Fore-und Midgut-NET.................................................................................................................................... 22 3.8.3 CRC................................................................................................................................................................ 23 4 METHODEN ......................................................................................................................................................... 23 4.1 METHYLIERUNGSSPEZIFISCHE PCR (MSP)-METHODE ........................................................................................... 23 4.1.1 Prinzip der MSP ............................................................................................................................................. 23 4.1.2 Mikrodissektion:............................................................................................................................................. 24 4.1.3 DNA-Extraktion für MSP-Analyse: ................................................................................................................ 24 4.1.4 Bisulfitbehandlung ......................................................................................................................................... 24 4.1.5 PCR ................................................................................................................................................................ 25 4.1.6 Gelelektrophorese: ......................................................................................................................................... 28 4.2 MSI- UND LOH-ANALYSE ...................................................................................................................................... 29 4.2.1 DNA-Extraktion für die MSI- und LOH-Analyse: .......................................................................................... 29 4.2.2 Endlabeln eines Primers ................................................................................................................................ 29 4.2.3 Endlabeln des Elektrophoresemarkers........................................................................................................... 29 4.2.4 PCR ................................................................................................................................................................ 30 4.2.5 Polyacrylamid-Gelelektrophorese: ................................................................................................................ 33 4.3 KI-67 FÄRBUNG ...................................................................................................................................................... 33 4.4 STATISTISCHE METHODEN ...................................................................................................................................... 34 5 ERGEBNISSE ....................................................................................................................................................... 37 5.1 MSI-ANALYSE ........................................................................................................................................................ 37 5.2 LOH- ANALYSE ...................................................................................................................................................... 37 5.3 MSP-ANALYSE ....................................................................................................................................................... 39 5.4 CIMP...................................................................................................................................................................... 41 5.5 GENMETHYLIERUNG ............................................................................................................................................... 42 5.6 KI-67-ANALYSE...................................................................................................................................................... 42 vi 5.7 VERGLEICH DER TUMORGRUPPEN........................................................................................................................... 43 5.7.2 MSI ................................................................................................................................................................. 44 5.7.3 LOH................................................................................................................................................................ 44 5.7.4 CIMP.............................................................................................................................................................. 45 5.7.5 Genmethylierung ............................................................................................................................................ 47 5.7.6 Ki-67............................................................................................................................................................... 48 5.8 ÜBERLEBEN ............................................................................................................................................................ 48 5.8.1 Überleben nach Tumorgruppen ..................................................................................................................... 48 5.8.2 Überleben nach LOH-Status .......................................................................................................................... 49 5.8.3 Überleben nach CIMP-Status ........................................................................................................................ 50 5.8.4 Überleben nach Ki-67-Index .......................................................................................................................... 50 5.8.5 Prognose (multivariate Analyse).................................................................................................................... 52 5.9 KORRELATION CIMP-POSITIVER STATUS UND KI-67-INDEX BEI KOLON-NET UND FORE- UND MIDGUT-NET ..... 52 6 DISKUSSION ........................................................................................................................................................ 55 7 ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................................................................... 61 8 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................................. 63 9 ANHANG ............................................................................................................................................................... 77 10 PUBLIKATION .................................................................................................................................................. 112 11 DANKSAGUNG.................................................................................................................................................. 113 12 LEBENSLAUF .................................................................................................................................................... 115 vii Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung Aqua bidest. Aqua bidestillata Aqua dest. Aqua destillata CIMP CpG-Insel-Methylator-Phänotyp CIN Chromosomale Instabilität CRC Kolorektales Karzinom CpG Cytidine phosphate guanosine DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat GEP Gastroenteropankreatisch h Stunde HE Hämatoxylin-Eosin HNPCC Hereditäres-nicht-polypöses Kolonkarzinom IHC Immunhistochemie kb Kilobase LOH Loss of Heterozygosity M Molar (mol/l) min Minute MMR Mismatch Repair MSI Mikrosatelliteninstabilität MSI-H MSI-High MSI-L MSI-Low MSP Methylierungsspezifische PCR MSS Mikrosatelliten-stabil n Anzahl NCBI National Center for Biotechnical Information NET Neuroendokriner Tumor PCR Polymerasekettenreaktion PDEC Poorly differentiated endocrine carcinoma PET Pancreatic endocrine tumor RER Replication error Rpm Umdrehungen pro minute s Sekunde viii TSG Tumorsuppressorgen WDEC well differentiated endocrine carcinoma WDET well differentiated endocrine tumor WDHA- Syndrom watery diarrhea, hypokalemia, achlorhydriaSyndrom Gen-Abkürzungen APC Adenomatosis polyposis coli Tumorsuppressorgen HIC 1 Hypermethylated in cancer 1 Tumorsuppressorgen hMLH1 Human mutL homolog 1 MMR-System/DNA-Reparatur MEN 1 Multiple endocrine neoplasia type 1 Tumorsuppressorgen MGMT O-6-Methylguanine-DNA- DNA-Reparaturenzym Methyltransferase p16 Cyclin- dependent kinase inhibitor Cyclin-abhängiger Kinaseinhibitor, 2A, (CDKN2A) Zellzyklusregulation RASSF1A Ras Association domain Family 1A Zellzyklusregulation, Apoptose TIMP 3 Tumorsuppressorgen Tissue Inhibitor of Metalloproteinase Sonstige: BAX Bcl-2 associated X-Protein (19q13) Apoptose- Regulation Bcl2 B-cell lymphoma protein 2 Apoptose-Regulation BRAF B-raf proto- oncogene Braf transforming seron/threonine proteinkinase (p94); BRCA1 Breast Cancer 1 Onkogen c-myc Myelocytomatosis oncogene Proto-onkogen COX2 Cyclooxygenase 2 Prostaglandinsynthese-Enzym DAP- Death associated protein kinase Enzym Kinase DCC Deleted in colorectal carcinoma Kolorektales Tumorsuppressorgen (18q21) ER Östrogen-Rezeptor Zellwachstum hMSH3 Human mutS/homolog3 MMR/DNA-Reparatur ix hMSH6 Human mutS/homolog6 IGF2R Insulin-like growth factor 2 Wachstumsfaktor-Rezeptor Receptor k-ras Ki rat sarcoma viral oncogene Proto-oncogen homolog MBD Methyl binding domain Komplex nahe bei Promotorregionen MLH1 MutL homolog 1 MMR-System/DNA-Reparatur MINT1,2,31 Methylated in Tumor PTEN Methylierte CpG-Inseln in CRC phosphatase and tensin homolog Tumorsuppressorgen deleted on chromosome 10 RARβ Retinoic acid receptor β Embryonalentwicklung,ApoptoseInduktion, Sehfunktion Rb Retinoblastom-Gen Tumorsuppressorgen SMAD2 SMAD4 TGFβRII Kolorektales Tumorsuppressorgen Transforming growth factor β Hemmung von Zellwachstum Rezeptor II THBS1 Thrombospondin1 Angiogenese-Inhibitor TP53 Tumorprotein p53 Tumorsuppressorgen:ApoptoseRegulation x 1 1 Einleitung 1.1 Definition der GEP-NET Neuroendokrine Tumoren (NET) sind seltene Neoplasien des diffusen neuroendokrinen Zellsystems, die sich durch heterogenes biologisches Verhalten und ein breites Spektrum unterschiedlich differenzierter Tumoren auszeichnen [142]. NET können an allen Lokalisationen auftreten, an denen es endokrine Vorläuferzellen gibt [15]. Diese befinden sich am häufigsten verstreut in der Mukosa des Magen-Darm-Trakts (gastroenteropankreatisches System (GEP)) [93,101], aber auch in anderen Geweben, die sich aus dem embryonalen Darmkanal herleiten, wie der Lunge [142]. Darüber hinaus können sich neuroendokrine Merkmale auch erst während der Onkogenese entwickeln [171]. Die Begriffe Fore-, Mid-und Hindgut -NET werden heute nur zur Bestimmung der Lokalisation verwendet [142]: Foregut-NET (Vorderdarm) befinden sich im Respirationstrakt, Magen, Duodenum, proximalen Jejunum und Pankreas; Midgut-NET (Mitteldarm) schließen distales Jejunum, Ileum, Appendix und proximale 2/3 des Kolon ein; Hindgut-NET (Enddarm) liegen im distalen Kolon und Rektum [173]. Die meisten NET sind funktionell inaktiv [15,39]. Im Falle der Produktion von bioaktiven Substanzen, wie Peptidhormonen, biogenen Aminen, Wachstumsfaktoren und -rezeptoren [135], spiegeln sie das Verteilungsmuster endokriner Zelltypen im Normalgewebe wider, z.B. Gastrin in Duodenal-NET [142], s. auch Tab.1. Meist dominiert die Produktion einer Substanz [93,157]. Dies kann klinisch als Hypersekretionssyndrom bzw. als klassisches Karzinoidsyndrom, mit Flush, Diarrhoe und kardialen Symptomen, auffallen; entsprechend sind die NET dann bereits in die Leber metastasiert [115]. NET exprimieren in ihrer phänotypischen Verwandtschaft zu neuronalen Zellen molekulare Differenzierungsmarker wie Chromogranin A, Synaptophysin [91] und viele andere [142], die eine spezifische immunzytochemische Erkennung ermöglichen. Die meisten NET sind maligne [12]. 1.2 Geschichtlicher Hintergrund Als erste Beschreibung gastrointestinaler endokriner Tumoren gilt eine Veröffentlichung von Merling aus dem Jahre 1838 [94]. Langerhans beschrieb 1869 nestförmig gelagerte Zellen (Inselzellen) im Pankreas [142]. Lubarsch [104] (1888) und Ranson [134] (1890) beschrieben ähnliche Tumoren und auch deren klinische Manifestation mit Flush und Diarrhoe, waren sich aber noch nicht deren endokriner Eigenschaften bewusst. Oberndorfer bezeichnete 1907 [116] erstmals diese intestinalen Tumoren als „Karzinoide“, da sie sich durch ein indolenteres Verhalten als Adenokarzinome des Darms 2 auszeichneten, also nur „karzinomähnlich“ waren. Ihr endokriner Charakter wurde erstmals 1906 von Ciaccio [35] und von Gosset und Masson [65] 1914 vorgeschlagen, die sie auch wegen ihrer Anfärbbarkeit mit Silber „Argentaffinome“ nannten. Feyrter fasste die topographisch disseminierten Zellen 1938 als „diffuses neuroendokrines System“ zusammen [53]. Stout fand Hinweise auf eine Herkunft rektaler Karzinoide von neuroendokrinen Zellen des Rektums, sog. Erspamer-Zellen [52]. Pearse prägte 1964 den Begriff der APUD- Zellen („Amin precursor uptake and decarboxylation“) [120] und postulierte eine gemeinsame embryonale Herkunft der APUD–Zellen von der Neuralleiste, die aber durch Le Douarin und Teillet widerlegt wurde [1,97]. Jedoch konnte Pearse auf den gemeinsamen, neuroendokrinen Charakter der NET hinweisen, denn mittlerweile wird vermutet, dass endokrine Tumoren aus gemeinsamen „Stammzellen” entstehen [155] bzw. sich von endodermalen Zellen des Vorder-, Mittel- und Enddarms herleiten, die das APUD-Programm zusammen mit der Expression eines neuroendokrinen Phänotyps angenommen haben [5,171]. Im Jahr 2000 sorgte die WHO –Klassifikation für begriffliche Klarheit und übernahm den von Pearse eingeführten Begriff des „neuroendokrinen Tumors“ (NET) [149]. 1.3 Klassifikation und Terminologie 1980 brachte eine WHO-Klassifikation zum ersten Mal Licht in die uneinheitliche Terminologie der Karzinoide, APUDome, Endokrinen Tumoren und Karzinome [15]. Sie verwendete für die meisten NET den Begriff „Karzinoid“ [174]. Jedoch wurde sie der morphologischen und biologischen Heterogenität der NET nicht gerecht, so dass im Jahr 2000 eine weitere WHO-Klassifikation folgte, die auch klinisch und prognostisch nützlich war [15,149]. Ebenso wurde „NET“ als Oberbegriff festgelegt [27,149]. Der Terminus „Karzinoid“ sollte nur noch für hochdifferenzierte extrapankreatische GEP-NET verwendet werden [142]. Entsprechend werden NET in hoch differenzierte endokrine Tumoren (benignes Verhalten, sehr gute Prognose), hoch differenzierte endokrine Karzinome (malignes Verhalten, günstige Prognose) und niedrig differenzierte endokrine Karzinome (meist kleinzellig, hochmaligne mit schlechter Prognose) unterteilt. Weitere, selten verwendete, Kategorien sind gemischt exokrin-endokrine Neoplasien und tumorähnliche Läsionen [149]. Zudem wird heute auch intensiv die Möglichkeit einer molekularen Charakterisierung der GEP-NET erforscht [91]. 1.4 Epidemiologie NET sind sehr seltene Neoplasien mit einer Inzidenz von 1-2 /100.000 pro Jahr [91,152], die im höheren Lebensalter auftreten [93]. Männer und Frauen sind gleich häufig betroffen, wenn NET des Appendix nicht einbezogen werden [93,133]. Die meisten NET treten sporadisch auf und ihre 3 Ätiologie ist größtenteils unbekannt [91,142], während nur ca. 1% [152] der NET mit einer Erbkrankheit wie dem MEN1–Syndrom (Wermer-Syndrom), der von-Hippel-Lindau- Erkrankung (VHL) und der Neurofibromatose Typ 1 assoziiert sind [142]. 1.5 Prognose Grundlage einer prognostischen Einteilung ist die Klassifikation [142]. Hierbei werden vor allem folgende Kriterien berücksichtigt: Primärtumorlokalisation, Tumorgröße und histologische Differenzierung [15]. Eine präzisere Aussage ist durch Parameter wie funktionelle Aktivität, Angioinvasion, lokale Ausbreitung, Metastasenstatus und Ki-67-Index möglich [142]. Derzeit werden prognostische Marker wie Ki-67, p53, Onkogene, Tumorsuppressorgene und Adhäsionsmoleküle untersucht, ob sie bezüglich der Prognose von NET aussagekräftig sind. Davon hat sich bisher Ki-67 als prognostisch signifikant hervorgehoben [14]. Allgemein ist die Prognose von GEP-NET günstiger als die der Adenokarzinome des Gastrointestinaltrakts [15]. 1.6 Spektrum und Charakteristika NET befinden sich hauptsächlich im gastroenteropankreatischen System und in der Lunge [152,164], wobei GEP-NET am häufigsten im Dünndarm, Appendix und Rektum [164] vorkommen. NET können auch in Thymus, Nieren, Ovar, Prostata, Brust und Haut gefunden werden [15]. Patienten mit NET haben ein erhöhtes Risiko an synchronen und metachronen, nichtendokrinen Tumoren zu erkranken. Diese Sekundärtumoren entstehen dann vor allem in Kolon und Rektum [15,57,111,152,156]. GEP-NET wachsen langsam, verglichen mit Adenokarzinomen des Gastrointestinaltrakts [15], sind jedoch meistens maligne [12]. Die meisten NET sind funktionell inaktiv. Funktionelle NET, die gehäuft im Pankreas entstehen, äußern sich, je nach ursprünglicher hormoneller Differenzierung der Tumorzelle, durch spezifische Symptome (s. Tab.1) [15]. Allgemein gilt, dass Foregut-NET durch ein Hypersekretionssyndrom, Midgut-NET durch das Karzinoid-Syndrom klinisch auffallen. Hindgut-Tumoren sind generell funktionell inaktiv [15]. NET Sekretionsprodukt Insulinom Insulin Gastrinom Gastrin Syndrom/Symptome Hypoglykämie, Verwirrtheit Zollinger-Ellison-Syndrom: Ulcera, Diarrhoe, Refluxkrankheit Diarrhoe, VIPom Vasoaktives intestinales Polypeptid peptische Hypokaliämie, Hypo-oder Achlorhydrie (WDHA/Verner-Morrison –Syndrom) 4 NET Sekretionsprodukt Somatostatinom Somatostatin Syndrom/Symptome Diabetes, Steatorrhoe, Gallensteine Growth-hormone-releasing- GHRHom hormone ACTHom Adrenocorticotropes Hormon Karzinoide Glukagonom Serotonin, Tachykinine, Prostaglandine Akromegalie Cushing–Syndrom Flush, Diarrhoe, Bronchokonstriktion, Endokardfibrose im rechten Herz Erythema Glukagon necrolyticans migrans, Diabetes mellitus, Gewichtsverlust Tab.1 1.6.1 Charakteristika von Hindgut-NET Kolon- und Rektum-NET sind selten, sie unterscheiden sich deutlich, sowohl von anderen NET, als auch vom CRC in Symptomen, diagnostischem und therapeutischem Management und der Prognose [164]: Hindgut-NET sind immer nicht-funktionell [15] und zeigen Deletionen des Chromosom 18q (DCC-Gen) [135,160], wohingegen MEN1-Gen-Alterationen (Chromosom 11q) kaum vorkommen [135]. 1.6.1.1 NET des Kolon Kolon-NET sind seltene (8-12% der GEP-NET [110]), histologisch meist niedrig differenzierte neuroendokrine Karzinome und in 50-60% der Fälle bei Diagnosestellung bereits metastasiert mit entsprechend schlechter Prognose [68,93]. Häufig werden sie mit undifferenzierten Adenokarzinomen verwechselt [164]. Immunzytochemisch sind sie an ihrem Synaptophysingehalt zu erkennen und können verstreut serotonin-und somatostatinpositive Zellen enthalten [91], wobei die Expression von Chromogranin A in malignen NET herunterreguliert sein kann [142]. Häufige Lokalisation der Kolon-NET ist das proximale Kolon aufgrund der erhöhten Anzahl neuroendokriner Zellen in der Mukosa. Bei einem Durchschnittsalter der Patienten von 65 Jahren, das geringer ist als das der Patienten mit kolorektalem Karzinom (70 Jahre), sind Männer etwas häufiger betroffen. Da gut differenzierte NET des Kolon selten sind, ähneln sich die 5-Jahres-Überlebenszeiten von NET und Adenokarzinomen oder sind geringfügig schlechter für die malignen Kolon-NET [164]. Synchrone und metachrone Tumoren, z.B. Adenokarzinome, können auch bei Patienten mit KolonNET gefunden werden (13% der Fälle) [110]. 1.6.1.2 NET des Rektum Rektum-NET machen ungefähr 10-20% der GEP-NET aus [28,91,93,164], sind häufiger und haben eine bessere Prognose als Kolon-NET [91] und Adenokarzinome gleicher Lokalisation [164], wobei 5 die Tumorgröße der wichtigste Prognosefaktor ist. Rektum-NET, die größer als 2cm sind, neigen zu Metastasierung. Viele Rektum-NET sind jedoch klein und asymptomatisch und werden frühzeitig in der Endoskopie entdeckt. Außerdem sind im Rektum gering differenzierte neuroendokrine Karzinome die Ausnahme [91]. Hier ist das Durchschnittsalter der Erkrankung das 52. bis 60.Lebensjahr, folglich sind jüngere Patienten als bei Adenokarzinomen betroffen [164]. 1.6.1.3 Gemeinsamkeiten von Adenokarzinomen und NET des Kolorektums Es wurden neuroendokrine Tumorzellen beschrieben, die in Adenokarzinomen des Kolorektums vorkommen und mit einer schlechteren Prognose verbunden sind [83]. Ebenso gibt es auch Adenome in NET, sog. Kollisionstumore. Die Tumorkomponente mit dem jeweils höheren Grading bestimmt den Verlauf [164]. 1.6.2 Charakteristika von niedrig differenzierten neuroendokrinen Karzinomen (PDEC) Sogenannte PDEC finden sich vor allem im Magen, der Papilla Vateri und im Kolon [91,93]. Eine schlechte Prognose haben kolorektale PDEC vom kleinzelligen oder intermediären Typ [93]. Chromosomale Instabilität (CIN) ist eine typische Eigenschaft von PDEC, oft ist das p53-Gen involviert. Nur wenige Studien konzentrierten sich bisher auf PDEC [135], die in dieser Arbeit untersucht werden. 1.7 Kolorektales Karzinom (CRC) Das CRC ist die dritthäufigste krebsassoziierte Todesursache bei Männern und Frauen in Industrienationen. Die meisten CRC treten sporadisch auf, 3-4% gehen auf eine familiäres Syndrom zurück wie die FAP (Familiäre Adenomatöse Polyposis) und das Lynch-Syndrom (HNPCC= hereditary non polyposis colorectal cancer) [9]. Im Rahmen der Adenom-Karzinom-Sequenz lässt sich eine Akkumulation von Veränderungen verschiedener wachstumsregulierender Gene beobachten (s. Abb.1). Das Kolonkarzinom gehört zu den am besten erforschten Tumoren, an ihm zeigt sich am deutlichsten das Ineinandergreifen verschiedener Alterationen, die zu genomischer Instabilität beitragen und bei der Tumorentstehung beteiligt sind wie CIN, MSI und CIMP [8]. 6 Abb.1 Adenom-Karzinom-Sequenz CIN Hypomethylation Normales Kolonepithel Mittelschwere leichte Dysplasie APC, bcl-2, c-myc, COX2 SMAD2/ SMAD4/ DCC (18q) K-rasMutation Karzinom p53Mutation HyperMethylierung (von hMLH1) MSI- CRC: MSIAdenom Normales , Kolonepithel schwere Dysplasie Dysplasie MLH1, MSH2, MSH6, MSH3 BAX, MBD4, TGFβRII, IGFIIR CIMP-CRC: Hypermethylierung von hMLH1 MSIKarzinom und anderen Tumorsuppressorgenen: Rb, p16, MGMT, BRCA1,PTEN, DAP-Kinase, E-cadherin, APC,TIMP3, RASSF1A [8] * Quelle: Christian N. Arnold: Vorlesung Gastroenterologie 11.01.2007 APC, bcl-2, c-myc, COX2, MLH1, MSH2, MSH6, MSH3 Bax, MBD4, TGFβRII, IGFIIR u Rb, p16, MGMT, BRCA1,PTEN, DAP-Kinase, E-cadherin, APC,TIMP3, RASSF1A [8] SMAD2/ SMAD4/ DCC (18q) durch LOH oder Mutation inaktivierte Gene durch Insertion/Deletion veränderte Gene, ausgelöst durch hMLH1Mutation oder Methylierung Mutationen in Genen, ausgelöst durch Hypermethylierung von hMLH1 u.a. Hypermethylierte Gene, s.Abkürzungsverzeichnis 7 1.8 Karzinogenese Tumoren resultieren aus der Akkumulation von Veränderungen in den Genen, die direkt Zellentstehung und Zelltod kontrollieren [100]. Dominante Onkogene transformieren bei ihrer Aktivierung die Zelle zur Tumorzelle, eine Inaktivierung rezessiver Onkogene bzw. der Tumorsuppressorgene (TSG) geht der Tumorentstehung voraus [101]. Diese genomische Instabilität fördert durch den unkontrollierten Zellzyklus das Wachstum der Zelle und begünstigt ihre klonale Expansion zum Tumor [100]. 1.8.1 Two-hit modell nach Knudson Für Tumorsuppressorgene (TSG) entwickelte Knudson anhand des Retinoblastoms im Jahr 1971 die Hypothese, dass bereits zwei Mutationsereignisse („hits“) beider Allele ausreichen, um ein TSG auszuschalten und damit möglicherweise die Zelle in eine Tumorzelle zu transformieren [95]. Bei hereditären Tumoren findet ein solches Ereignis bereits in der Keimbahn statt, das notwendige zweite in einer somatischen Zelle. Bei sporadischen Tumoren erfolgt beides in einer somatischen Zelle. Manche Tumoren können aber auch drei bis sieben Mutationsereignisse aufweisen, bis der Tumor entsteht [16]. Abb.2 erläutert einen möglichen Ablauf: *Quelle: A. Sosnowski: Inaugural-Dissertation (2005): Die Bedeutung genetischer und epigenetischer Mechanismen für die Pathogenese neuroendokriner Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems Abb.2: Two- hit modell nach Knudson Der erste “hit” erfolgt sowohl bei sporadischen als auch bei hereditären Tumoren durch Mutation, bei sporadischen auch durch Stilllegung des Gens durch aberrante Promotorhypermethylierung [42,82,101]. Beim zweiten Allel ist sowohl Methylierung als auch ein Allelverlust (LOH) möglich [99,101]. Dass zwei Mutationen in einer Zelle zur Tumorentstehung führen, ist selten, jedoch kann eine Methylierung beider Allele durchaus vorkommen [42,82,74]. 8 1.8.2 Genomische Instabilität Unter dem Begriff „genomische Instabilität“ werden Instabilitäten auf Nukleotidebene, chromosomale Instabilitäten, z.B. LOH oder Translokationen, Mikrosatelliteninstabilitäten und der CpG-Insel-Methylatorphänotyp (CIMP) aus dem Bereich der Epigenetik zusammengefasst [100,161]. 1.8.3 Chromosomale Instabilität (CIN) Die meisten Tumore zeigen genomische Instabilitäten auf chromosomaler Ebene mit häufigen Verlusten und Gewinnen chromosomaler Abschnitte [108]. Diese erhöhte Rate nennt man CIN, die zur Aneuploidie oder Polyploidie der Zelle führt. Der Verlust eines Allels eines Gens wird als „loss of heterozygosity“(LOH) bezeichnet [100]. 1.8.4 CIMP CIMP beschreibt eine weitere molekulare Instabilität, die durch Methylierung und damit Inaktivierung von TSG Tumorentstehung und -wachstum fördert [162]. Diese Instabilität interagiert auch mit anderen Wegen der Tumorentstehung wie MSI [162]. Beim CRC gibt es zwei Arten der Methylierung, die mit der Tumorprogression einhergehen und auch für die NET des Hindgut wichtig sein könnten: Die Typ A-Methylierung, die altersassoziiert ist, und die Typ CMethylierung, die „carcinomspezifisch“ im Rahmen von CIMP vorkommt [162]. So ist der CpG-Insel-Methylator-Phänotyp (CIMP) durch die Methylierung multipler CpG-Inseln (s.1.8.6) charakterisiert [161] und wird durch eine bestimmte Anzahl von Methylierungen in verschiedenen Genen eines Tumors festgelegt [62]. 1.8.5 Mikrosatelliteninstabilität (MSI) Mikrosatelliten-DNA besteht aus 10-50 Kopien von Folgen aus 1-5 Basenpaaren, die mehrmals wiederholt werden, z.B. (A)13 [31], und überall im Genom verteilt sind. Sie findet sich in Introns sowie in Exons (z.B. in Coding region des BAX- Gens oder TGFßRII-Gens) [31]. Mikrosatelliten sind hochpolymorph, d.h. in der Bevölkerung bestehen große Unterschiede bezüglich der Anzahl der Wiederholungen [96]. Diese Unterschiede sind stabil und erblich und eignen sich daher gut als Marker für die Forensik (genetisches Fingerprinting), die Untersuchung von genetischen Deletionen (LOH) und das Auffinden von krankheitsverursachenden Genen durch „Linkage –Untersuchungen“ mit diesen Markern [31]. MSI liegt vor, wenn sich das ursprüngliche Keimbahn-Mikrosatellitenallel durch Insertion oder Deletion verändert hat. Daraus folgt eine somatische Änderung der Länge eines Gens, also eine 9 Leserastermutation, welches sich aber nur bei klonaler Expansion einer solchen Zelle zeigt [31]. Diese Zellen wurden als Mutator- oder Replikationsfehler-Phänotyp (englisch: RER-phenotype für „replication error“ [25]) bezeichnet und später in „mikrosatelliteninstabil“ umbenannt [31]. Im hereditären nicht-polypösen kolorektalen Karzinomsyndrom (HNPCC oder Lynch-Syndrom) wurden zahlreiche Mikrosatelliteninstabilitäten zuerst entdeckt. Dort liegt eine Keimbahnmutation der DNA-Mismatch-Repair-Gene (MMR) hMLH1 und hMSH2 vor [31,60]. Sie gehören zum Reparatursystem der DNA, das Fehlpaarungen nach der Replikation korrigiert, und begünstigen bei Schädigung ihrer Funktion auch weitere Mutationen in anderen Genen [31,100]. DNA-MMR-Defekte können auch durch Mutationen [54] oder Promotorhypermethylierung [76], z.B. bei sporadischen Tumoren, verursacht werden. So finden sich beim sporadischen CRC ca. 15% der Tumoren mit Alterationen im MMR-System. Hier führt eine Promotorhypermethylierung von hMLH1 zur Stilllegung der Transkription und damit zu einem Defekt im MMR-System [40]. Ähnliche Häufigkeiten für MSI finden sich in sporadischen Endometrium- und Magen-Karzinomen [44,128,148,151]. Karzinome mit MSI unterscheiden sich von stabilen Tumoren häufig in Klinik, pathologischen und molekularen Eigenschaften, z.B. haben sie oft eine bessere Prognose als Tumoren mit CIN [7]. 1.8.6 Epigenetik Epigenetik ist als erbliche Modifikation der genetischen Aktivität definiert, die nicht mit der Änderung der DNA-Sequenz einhergeht. Dies geschieht durch Methylierung von vor allem Cytosin in CpG-Dinukleotidreichen Regionen der DNA (CpG- Inseln) zu 5’Methylcytosin. CpG-Inseln sind ca.0.5-4kb große Abschnitte der DNA, die eine hohe Anzahl von CytosinGuanosin-Dinukleotiden enthalten (cytosine phosphate guanosine) und zumeist in transkriptionsregulierenden Promotorregionen der Hälfte der menschlichen Gene beobachtet werden [74]. Sie sind normalerweise vor Methylierung geschützt. Die meisten CpG-Dinukleotide außerhalb der CpG-Inseln sind methyliert [74]. Erfolgt eine Methylierung innerhalb einer CpG-Insel einer Promotorregion, so wird das Gen nicht transkribiert („transcriptional silencing“) [6,74]. Dies kommt sowohl in der normalen Zelle als auch der Tumorzelle vor. Im Normalfall hat die Stilllegung von Genen in menschlicher und Säugetier-DNA den Sinn, schädigende Anteile des Genoms, wie ‚repeat’ Elemente, Transposons und eingebaute Viren–Genome an deren Transkription zu hindern [22,23]. Auch ist dies ein wichtiger Regulationsmechanismus der differenzierten Inaktivierung von Genen während der Embryonalentwicklung, der X- chromosomalen Inaktivierung und des Imprintings, dem differenzierten Ausschalten eines elterlichen Allels während der Gametogenese [6,74]. Zudem steigt der Anteil methylierter DNA im Genom mit zunehmendem Alter an [3,165]. 10 In Tumorzellen wurde zuerst eine globale Hypomethylation des Genoms beobachtet [36]. Diese kann eine verminderte Repression stillgelegter Genabschnitte, z.B. Aktivierung eines VirusGenoms, zur Folge haben. Außerdem löst ein Wegfall von Repression eine Instabilität von Chromosomen aus [21,50,51,63]. Desweiteren fanden sich in Tumorzellen regionale Promotorhypermethylierungen von meist Tumorsuppressorgenen und damit eine Inaktivierung derselben [73,84,85]. Insgesamt wird vermutet, dass mehr Gene durch epigenetische Modifikationen ihre Funktion verlieren als durch genetische Defekte [21,72,74,107]. Auf Proteinebene sind die Folgen von Methylierung bzw. Mutation ähnlich [73,84,85]: Das Protein wird nicht translatiert. An epigenetischen Modifikationen sind viele Mechanismen beteiligt (s. Abb.3). Hauptsächlich sind hier die DNA-Methyltransferasen (DNMT1, 3a, 3b), die methylbindenden Proteine (MBP, MBD, MeCP2) und die Interaktion von Histondeacetylasen (HDAC), Histonacetylasen (HAT) und der Chromatinstruktur zu nennen [6,74]. Epigenetische Veränderungen treten früh während der Tumorgenese auf [21,49], in sogenannten Vorläuferläsionen (z.B. kolorektales Adenom), und können so Zellen auf bestimmte Signaltransduktionswege festlegen und den Weg zur definitiv malignen Zelle ebnen. Diese Festlegung lässt auch die Anreicherung genetischer Defekte zu. Das eröffnet der Zelle einen Selektionsvorteil und trägt somit zur klonalen Expansion bei [169]. Ganze Netzwerke von Genen können gleichzeitig von epigenetischer Modifikation betroffen sein [21], daher lässt sich mittlerweile auch ein Hypermethylator-Phänotyp oder auch CIMP (CpG-Insel- Methylierungsphänotyp) für einige Tumoren charakterisieren [81,161], wofür bereits 3 bis 4 methylierte Gene ausreichen [41]. Das Gebiet der Epigenetik ist derzeit intensiver Gegenstand der Forschung, da man sich ein besseres Verständnis der Karzinogenese und neue Möglichkeiten in Prävention, Diagnostik und Therapie erhofft: So sind epigenetische Modifikationen prinzipiell reversibel im Gegensatz zu genetischen Mutationen. Hier könnten DNMT-Inhibitoren, wie 5`Azacytidin, z. T. in Kombination mit Histondeacetylase-Inhibitoren zum Einsatz kommen [74,146]. Gene mit methylierten Promotoren sind einfacher durch sensitive Methoden wie die MSP, die mit geringen DNA-Mengen auskommt, zu erfassen und könnten präventiv und diagnostisch relevante Marker liefern [74]. Außerdem wird die DNA in Tumoren genomweit auf methylierte Abschnitte untersucht, um noch unbekannte Tumorsuppressorgene zu finden [21]. 11 DNMT DNMT HAT Polym III KA TF HD AC MBD Exon1 CR HD AC MBD Exon2 Exon3 Abb.3 Normale Zelle : In der normalen Zelle sind die CpG-Inseln des Promotorabschnitts um Exon1 nicht methyliert (leere Kreise): Transkriptionsfaktoren (TF), Histonacetylasen (HAT), die durch Acetylierung von Resten in Histon3 und Methylierung von Lysin4 in Histon3 die Chromatinstruktur für die RNAPolymerase III (PolymIII) offen halten, und Ko-Aktivatoren (KA) können binden: das Gen wird transkribiert (Pfeil). Die DNA-Methylierungsmaschinerie (DNMT=DNA-Methyltransferasen) hat keinen Zugang zu den nicht-methylierten kodierenden Abschnitten. Im Genom liegen vereinzelt methylierte CpG-Inseln vor (schwarze Kreise). An sie binden methylbindende Proteine (MBD), an die wiederum Histondeacetylasen (HDAC) binden. HDAC halten Histone in einem deacetylierten Zustand, der die DNA für den o.g. TranskriptionsAktivations-Komplex unzugänglich macht. Meist liegen diese CpG–Inseln in nicht-kodierenden Abschnitten und sind daher stark methyliert. Eine Aufhebung der Methylierung hätte in diesen Bereichen Non-sense-Transkriptionen und eine Instabilität des Chromosoms zur Folge [74]. HAT DNMT HD AC MBD TF HD AC KA Polym III MBD Exon1 Exon2 Exon3 Abb.4 Tumorzelle In der Krebszelle sind weite Teile des Genoms hypomethyliert (leere Kreise). In anderen Bereichen hat die DNA-Methylierungsmaschinerie in Form von DNA-Methyltransferasen (DNMT) durch einen noch nicht genau verstandenen Prozess Zugang zu den Promotor-Regionen kodierender Abschnitte erhalten und diese methyliert. Durch den Komplex aus MBD und HDAC wird dieser Zustand aufrechterhalten und der Transkriptionsaktivationskomplex (mit TF, KA und Polymerasen) an seiner Bindung an die Promotorregion gehindert, das Gen ist ausgeschaltet [74]. Aus beiden Abbildungen wird deutlich, dass DNA-Methylierung und Histondeacetylierung synergistisch arbeiten, eine reine DNA-Methylierung führt nicht zur Geninaktivierung [24,87]. 12 1.9 Ki-67-Marker Das Ki-67-Antigen ist ein nukleäres Protein, das durch seine Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper des Ki-67-Klons definiert wird (z.B. MIB-1). Während der Interphase wird das Ki-67Antigen ausschließlich im Kern gefunden, wohingegen der größte Teil des Proteins sich während der Mitose wieder auf den Chromosomen befindet. Das Ki-67-Antigen wird während der späten G1, S-, M- und G2–Phase des Zellzyklus in allen proliferierenden Zellen exprimiert. In ruhenden Zellen (G0-Phase) und nicht stimulierten normalen menschlichen Zellen wird das Ki-67-Antigen nicht gefunden [143]. Die Menge des Ki-67-Antigens in der Zelle wird durch präzise Synthese-und Degradationssysteme stark reguliert [26,143]. So ist der Ki-67-Antikörper ein spezifischer und sensitiver Marker für proliferierende Zellen. In vielen verschiedenen malignen Neoplasien, inklusive NET, konnte die immunhistochemische Ki67-Markierung mit dem klinischen Verlauf der Erkrankung in Zusammenhang gebracht werden, u.a. GEP-NET [123,136,143]. D.h. ein erhöhter Ki-67-Index zeigt einen schnell wachsenden, aggressiven Tumor mit einer folglich schlechten Prognose an [136]. Welche Funktion das Ki-67-Antigen jedoch genau hat, ist bis heute nicht vollständig geklärt. Bekannt ist, dass es ohne Ki-67-Antigen keine Zellproliferation jeglicher Art gibt [26]. Bisher sind nur wenige Studien veröffentlicht, die die Ki-67-Anfärbung in GEP-NET untersuchen und mit deren Prognose in Zusammenhang bringen [26,112]. 13 1.10 Aktueller Stand der Forschung Das sporadische CRC entsteht auf zwei voneinander unabhängigen Wegen, CIN (~50%), und CIMP (~35-40%) [20,61,85]. CIN ist durch eine ausgeprägte Aneuploidie gekennzeichnet, die u. a. aus sequenzieller Inaktivierung des APC-Gens 5q (in bis zu 50% der CRC [48]), des DCC/SMAD2/SMAD4 Genlokus, des K-ras-Onkogens und des p53-Gens resultiert [8,99]. CIMP ist in einem bestimmten Subtyp von sporadischen CRC repräsentiert, der in Abwesenheit von CIN auftritt und umgekehrt [62]. CRC, die durch CIMP entstehen, sind im proximalen Kolon lokalisiert, betreffen häufiger weibliche und ältere Patienten, sind schlecht differenziert, weisen Wildtyp-p53, mehr K-ras- und BRAF-Mutationen und häufig auch MSI auf [70,98,140,161,163]. CIMP ist ein frühes Ereignis während der Tumorgenese und hat das Potential mehrere Tumorsuppressorgene gleichzeitig zu inaktivieren. Das wiederum beschleunigt den neoplastischen Prozess [161]. Zudem spielt CIMP eine Rolle bei der Entstehung der in 15% der sporadischen CRC auftretenden MSI, die durch Promotorhypermethylierung von hMLH1 verursacht wird [62,76,86], mit daraus folgenden weiteren Mutationen in so genannten „target-Genen“ wie TGFβRII-Rezeptor [119], IGF2-Rezeptor, BAX und den MMR-Genen hMSH3 und hMSH6 [8,61]. CIMP und MSI finden sich beide häufig im proximalen Kolon [161]. Ebenso haben Kolonkarzinome mit MSI keine K-ras-und TP53-Mutationen und damit auch eine bessere Prognose [141]. Bei den bisher untersuchten GEP-NET, also vor allem Fore-und Midgut NET, stach besonders der Verlust der Tumorsuppressorgenfunktion durch Allelverlust oder somatische Mutation hervor [101,124]. Allelverluste sind häufig in NET [58,154,160] und variieren je nach Lokalisation des Tumors [101,160]. MSI scheint bei GEP-NET eine geringe Rolle zu spielen: In manchen Studien konnte kein MSI nachgewiesen werden [13,58,89], in anderen wurde MSI zu 10% in Pankreastumoren gefunden [79]. Die Promotorhypermethylierung weiterer tumorassoziierter Gene wurde in kleineren Studien an NET beschrieben [30,144,172] und auch für eine größere Anzahl NET des Fore-und Midgut gezeigt [13]. Letztere Studie ergab, dass CIMP eine wichtige Rolle bei der Entstehung von GEP-NET spielt. Zudem zeigte sich, dass die Methylierung von HIC1, RASSF1A und APC sehr häufig war (83.1%, 71.3 % und 54.1%) [13]. Obwohl die Rolle von HIC1 nicht vollkommen klar ist, ist bekannt, dass dieses Gen den Tumorsuppressor p53 heraufreguliert [33] und damit z.B. eine Apoptose einleitet, in Tumoren wird es hauptsächlich durch Promotorhypermethylierung inaktiviert [129]. Verschiedene Studien geben 14 Hinweise darauf, dass der Ras-Signalweg vor allem durch die Methylierung des RASSF1APromotors an der Pathogenese von gut differenzierten GEP-NET beteiligt ist [13,36,80,102]. APC ist als Teil des wnt-Signalweges in die Pathogenese von GEP-NET involviert [13,47], wie auch bei anderen gastrointestinalen Tumoren [11]. Weniger häufig hypermethyliert waren das DNA-Reparaturgen O6-MGMT und das mit dem MEN1Syndrom assoziierte MEN1-Gen (16.1%, 14.3%) [13]. Das MEN1-Gen wird in sporadischen GEPNET vor allem durch Mutation inaktiviert [64], wobei hier vor allem Tumoren des Foregut betroffen sind [135]. Promotorhypermethylierung scheint eine geringere Bedeutung zu haben. MGMT ist ein DNA-Reparaturgen, das vor allem bei Kolonkarzinomen, Lungen-und Hirntumoren methyliert vorgefunden wird. Bei GEP-NET scheint es geringere Bedeutung zu haben [13,43]. Keine Methylierung wiesen TIMP3, p16INK4a/CDKN2A und hMLH1 auf [13]. p16 scheint dennoch wichtig zu sein, da die p16-Proteinexpression auf 58% der Tumoren beschränkt war [13]. Außerdem wurden in anderen Studien Promotorhypermethylierungen [30,80,144,147] nachgewiesen, die ebenfalls mit einem Expressionsverlust assoziiert waren [30,105]. In weiteren Studien wurden auch Promotorhypermethylierungen bei folgenden Genen gezeigt: p19 [36], RARß bei endokrinen Pankreastumoren [80], p14, THBS1, COX 2, Östrogen-Rezeptor-Gen (ER) bei pankreatischen NET und NET mit Karzinoidsyndrom [30]. Diese Untersuchungen wurden aber nur an kleinen Fallzahlen vorgenommen. An anderen Tumoren häufig beteiligte Onkogene wie k-ras und Tumorsuppressorgene wie Rb und p53 haben bei gut differenzierten GEP-NET keine Bedeutung [19,34,114,168,175]. In schlecht differenzierten NET werden jedoch häufig Veränderungen von p53 und Rb beobachtet [131]. Zu schlecht differenzierten NET (PDEC) ist bisher wenig bekannt: sie weisen häufig LOH am APC, DCC, TP53–Lokus auf [56]. Laut einer Zusammenfassung von Rindi und Bordi [135] sei CIN eine typische Eigenschaft von PDEC, unabhängig von der Lokalisation des Tumors. Oft sei das p53-Gen involviert. Die Autoren legen aufgrund histologischer und molekularer Beobachtungen die Vermutung nahe, dass gemeinsame genetische Ereignisse der Tumorentstehung von PDEC des Hindgut und Adenokarzinomen zugrunde liegen [135]. Daher werden auch in dieser Arbeit PDEC des Hindgut und CRC auf Ähnlichkeiten untersucht. Nur der Proliferationsmarker Ki-67 und das Ausmaß des spontanen Tumorwachstums wurden bisher als bedeutsam für die Prognose gefunden [14]. In einer Studie konnte gezeigt werden, dass signifikant mehr Tumoren mit Ki-67–Index >10% CIMP-positiv waren als NET mit einem niedrigeren Ki-67–Index. Zudem zeigten CIMP-negative NET ein besseres durchschnittliches Überleben als CIMP-positive [13]. 15 2 Zielsetzung In der vorgelegten Arbeit wurden die sehr seltenen, schlecht differenzierten NET des Kolon und Rektum (kurz: Kolon-NET) hinsichtlich der Beteiligung genetischer und epigenetischer Prozesse an ihrer Pathogenese untersucht. Diese Tumorgruppe gehört zu den GEP-NET des Hindgut und nennt sich auch „neuroendokrine Karzinome“. Ziele dieser Arbeit waren die Analyse • des Methylierungsstatus der Promotorregionen acht verschiedener Tumorsuppressorgene (p16, APC, HIC1, RASSF1A, TIMP3, MGMT, MEN1, hMLH1) mittels MSP, und des CIMPStatus, • der genomischen Instabilität (MSI und LOH) der Tumoren mit Hilfe entsprechender Marker, • des Ki-67-Index zur Feststellung einer Korrelation von Proliferationsrate und Genmethylierung. Zusätzlich wurden folgende Fragestellungen bearbeitet: 1. wie unterscheiden sich NET in unterschiedlichen Loci ? 2. wie unterscheiden sich schlecht differenzierte NET vom sporadischen CRC ? Hierzu wurden Untersuchungsergebnisse aus sowohl der eigenen Arbeitsgruppe (gut differenzierte Fore-und Midgut-NET) als auch aus dem Labor von Prof. Boland, Dallas, USA (CRC) hinzugezogen, und folgende Vergleiche aufgestellt: • MSI-Status bei Kolon-NET, CRC und Fore-und Midgut-NET • LOH-Status bei Kolon-NET und Fore-und Midgut-NET • CIMP-Status bei Kolon-NET, CRC und Fore-und Midgut-NET • Methylierungsmarker von Kolon-NET und Fore-und Midgut NET • Überlebenszeiten bei Kolon-NET und Fore-und Midgut-NET Zusätzlich wurde • eine multivariate Analyse der Überlebenszeiten auf prognostische Faktoren (Ki-67-Index, CIMP-Status, LOH-Status, Tumorgruppe) und • eine Untersuchung der Korrelation von CIMP-Status und Ki-67-Index bei Kolon-NET und Fore-und Midgut-NET durchgeführt. 16 17 3 Materialien 3.1 Geräte Autostainer DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland Base Runner 200 inkl. Glasplatten, Spacer und Kamm International Biotechnologies Inc., New Haven, CT, USA Biofuge Fresco Heraeus, Osterode, Deutschland Elektrophoresekammern für Agarosegele inkl. Zubehör: Bio-Rad, München, Deutschland Wide Mini-Sub Cell GT System Eismaschine AF20 Scotsman, Bettolino di Pogliano, Mailand, Italien Filme BioMax MR(14650) Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA Filmentwicklungsmaschine CP 1000 AGFA, Gevaert N.V:, Köln, Deutschland Gel- Dokumentationssystem UVT-28 MP /ICU-1 Herolab, Wiesloch, Deutschland (Transilluminator) Gel Dryer Model 583 Bio-Rad, München, Deutschland Heizblock“ Blockthermostat BT 200 „ Kleinfeld Labortechnik GmbH, Gehrden, Deutschland Laboratory Vacuum Manifold( Vac-Man) Promega, Mannheim, Deutschland Lichtmikroskop Zeiss, Oberkochem, Deutschland Magnetrührer IKAMAG KMO-1 IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland Membranpumpe Vacuubrand, Wertheim, Deutschland Membranvakuumpumpe Vacuubrand, Wertheim, Deutschland Mikrowellenherd Siemens, München, Deutschland pH- Meter Knick, Berlin, Deutschland 2, 20, 100, 200, 1000 µl Pipetten ABIMED, Langenfeld, Gilson, Frankreich Pipettierhilfe Pipettboy acu INTEGRA Biosciences, Fernwald, Deutschland Plexiglaskammer “Clene Cab” Herolab, Wiesloch, Deutschland Röntgenkassette 8x10 Siemens, München, Deutschland Schutzschild aus Plexiglas ZITT-THOMA, Freiburg, Deutschland Stromversorgungsgeräte: Modell 3000 Xi (für Polyacrylamidgele) Bio-Rad München, Deutschland PS305 (für Agarosegele) Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland Thermocycler MultiCycler PTC 220 DYAD Biozym, Oldendorf, Deutschland Tischzentrifuge QUALITRON, Korea Ultrospec 3000 pro UV/Visible Spectrophotometer Pharmacia Biotech, Cambridge, England Vortex Genie 2 Scientific Industries, Bohemia, NY, USA Waagen: PM 460 Mettler, Giessen, Deutschland Präzisionswaage Sartorius, Göttingen, Deutschland Wasserbad JULABO SW U3 JULABO Labortechnik, Seelbach, Deutschland 18 3.2 Chemikalien und Enzyme 40% Acrylamid/ Bis Lösung ( 19:1) Bio-Rad, Hercules, CA, USA Agarose Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Ammoniumacetat Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Ammoniumpersulfat (APS) Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Ammoniumsulfat Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland 32 [γ- P] ATP (10mCi/ml) Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland β- Mercaptoethanol Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Borsäure Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Bromphenolblau/ Xylen Cyanol Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland CpG Methylase inkl. 10x NEBuffer und S- New England BioLabs Inc., Beverly, MA, USA Adenosylmethionin dNTPs 25 µM ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland DAKO K5005 Detektionssystem für Autostainer DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland EDTA Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Eisessig Merck, Darmstadt, Deutschland Elektrophorese- Marker Φ X 174 RF DNA/HAE III Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland Fragments Ethanol Merck, Darmstadt, Deutschland Ethidiumbromid Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Formamid 98% Promega, Mannheim, Deutschland GeneReleaser® BioVentures Inc., Murfreesboro, TN, USA Gene Ruler 100bp DNA Leiter equimolar Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Glycerol Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Glykogen Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland Harnstoff Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland HotStarTaq DNA-Polymerase (containing 15mM MgCl2) QIAGEN, Hilden, Deutschland inkl. 10x PCR-Puffer Hydrochinon Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Isopropanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Mineralöl Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland NaOH (1M) Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumbisulfit Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Orange G Dye Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Proteinase K QIAGEN, Hilden, Deutschland Salzsäure Merck, Darmstadt, Deutschland Sigmacote (zur Imprägnation der Deckplatte für Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Polyacrylamidgele) T4 Polynukleotid Kinase (10 U/µl) inkl. 5x Forward Reaction Puffer Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland 19 Taq DNA Polymerase(5U/µl) inkl. 10x PCR Puffer und 50 Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland mM MgCl2 TEMED Merck, Darmstadt, Deutschland Trizma Base Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland Xylen Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland 3.3 Antikörper Monoclonal Mouse Anti-HumanKi-67 Antigen DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland Clone MIB-1,Code-Nr. M 7240 3.4 Kits Wizard DNA Clean-Up System Promega, Madison, WI, USA QIAmp DNA Blood Mini Kit (50) QIAGEN, Hilden, Deutschland DakoREAL™DetectionSystem, Alkaline Phosphatase RED DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland Rabbit/Mouse Code K5005 3.5 Verbrauchsmaterialien KIMWIPES Lite 200 Laborwischtücher Kimberly-Clark, Forchheim, Deutschland Parafilm Pechiney Plastic Packaging, Menasha, WI, USA “96 well” PCR Plate Standard PEQLAB, Erlangen, Deutschland PCR- Platten Omniplate 96 mit Deckel Hybaid, Ashford, Middlesex, England Pipettenspitzen ohne Filter VWR International, Darmstadt, Deutschland MµlTIFlex Flat.4mm Tips( Pipettenspitzen zum Beladen Sorenson BioScience, Salt Lake City, UT, USA von Polyacrylamidgelen) Pipettenspitzen mit Filter: 10µl Nerbe plus, Winsen/Luhe, Deutschland Universalfit Filter Tips 30µl Corning Inc., Corning, NY, USA PEQGold SafeGuard Filter Tips (200µl) PEQLAB, Erlangen, Deutschland Aeroject Tips( 1000µl) Ratiolab, Dreieich- Buchschlag, Deutschland Reaktionsgefässe: CellStar 50 ml Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland 1,5 ml Reaktionsgefässe Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland 0,5 ml PCR Tubes ultradünn Biozym, Oldendorf, Deutschland Skalpelle Hammacher, Solingen, Deutschland Stericup Filtereinheit Millipore, Schwalbach, Deutschland Stripette 5ml Corning Inc., Corning, NY, USA Wägepapier MN 266 Macherey-Nagel, Düren, Deutschland Whatman Chromatografiepapier Whatman International, Maidstone, England 20 3.6 Puffer und Lösungen: 8% Acrylamidlösung 200ml 40 % Acrylamid/Bis Lösung (19:1) 450g Harnstoff (Endkonzentration 7.5M) 50ml 10x TBE-Puffer (Endkonzentrationen 45µM Trizma Base, 45µM Borsäure, 1mM EDTA) wurden mit Aqua bidest. auf ein Volumen von 1l aufgefüllt, durch Stericup Filtereinheit filtriert und bei Raumtemperatur lichtgeschützt aufbewahrt. 10% Ammoniumpersulfat (APS) 1g APS wurde in 10ml Aqua bidest. gelöst und als Aliquots zu 1ml bei -20°C aufbewahrt. 10mM dNTP je 10µl 100mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP wurden gemischt und mit je 60µl Aqua bidest. verdünnt. 0.5M EDTA, pH 8 93.05g EDTA wurden in etwa 400ml Aqua bidest. aufgelöst; Titrierung des pHs auf 8.0 mithilfe 1M NaOH-Lösung. Das Volumen wurde mit Aqua bidest auf 500ml aufgefüllt. 10mM Hydroquinone 55mg Hydroquinone (Sigma H9003) auf 50ml Aqua bidest., wurde jeweils neu hergestellt. Loading dye für MSI/ LOH–Analyse (Sigma, B-3269) 9,5ml Formamid 98% 200µl 0.5M EDTA pH 8.0 300µl 1% Bromphenolblau/ Xylen Cyanol (1g BPB mit 1g XC auf 10ml Aqua bidest.) Mischen Loading dye wurde als Aliquots zu 1ml bei -20°C aufbewahrt. Low TE Puffer, pH 7.4 5ml 1M Tris- HCl pH 7.4 100µl 0.5M EDTA pH 8.0 mit 400ml Aqua bidest. gemischt, Titrierung des pH auf 7.4, Auffüllung auf 500ml mit Aqua bidest., anschließend wurde die Reaktionsmischung durch Stericup Filtereinheit gesaugt. Low TE Puffer pH 7.4 /Proteinase K (24:1): Proteinase K(10mg/ml) wurde mit Low TE Puffer pH 7.4 im Verhältnis 1:24 verdünnt. 2M NaOH: 5.24ml NaOH (50 %) in 44.76ml Aqua bidest. verdünnt. 3M NaOH: 7.86ml NaOH (50%) in 42.214ml Aqua bidest. verdünnt. 10M NH4Ac: 38.54g in 50ml Aqua bidest. verdünnt. 21 Orange Dye: Für 25ml wurden benötigt: 12.5ml Glycerol 62.5mg Orange G Dye 12.5ml Aqua bidest. 3M Natrium Bisulfite: 1.88g Natrium-Bisulfit (Sigma S9000) pro 5ml Aqua bidest., auf pH 5.0 mit 1M NaOH titriert, jeweils neu herzustellen. 50x TAE –Puffer 242g Trizma Base, 57.1ml Eisessigsäure und 100ml 0.5 EDTA pH 8.0 wurden mit Aqua bidest. auf ein Volumen von 1l gebracht. 10x TBE –Puffer 109g Trizma Base (Endkonzentration 0.9M) 55.7g Borsäure (Endkonzentration 0.9M) 40ml 0.5M EDTA pH 8.0 (Endkonzentration 20 mM) Diese Reagenzien wurden mit Aqua bidest. auf 1l aufgefüllt. 1M Tris-HCl pH 7.4 60.55g Trizma Base wurden in 400ml Aqua bidest. aufgelöst und der pH-Wert mit konzentrierter HCl auf 7.4 titriert. Das Volumen wurde anschließend mit Aqua bidest auf insgesamt 500ml gebracht und durch eine Stericup Filtereinheit gesaugt. 3.7 Herstellung einer Positiv–Kontrolle: Zur Positivkontrolle wurde DNA aus venösem Blut extrahiert. Dies wurde mithilfe des QIAmp DNA Mini Kit(50) nach Angaben des Herstellers bewerkstelligt. Die Konzentration der extrahierten DNA wurde mit dem UV/Visible-Spektrophotometer bei 260nm OD bestimmt. Die Flüssigkeitsmenge, die demnach 2µg DNA enthielt, wurde nach folgender Formel berechnet und hergestellt: abs.260nm * ext.coeff.(= 50 for DNA * 50 for dil factor)= x in µg/ml ; x/1000= µg/µl; Beispiel: 260 O.D.= 0.018; DNA in µg/ml = 45; in µg/µl= 0.045; benötigte Fl.menge in µl: 2/ 0.045= 44.4µl Diese Menge wurde bis auf 50 µl mit Aqua. dest. aufgefüllt. 22 Methylierung der extrahierten DNA mit CpG-Methylase-Protokoll: Um eine Menge von 25µl methylierter DNA zu erhalten, wurden folgende Reagenzien hinzupipettiert: • 2µg genom. DNA • 4000U/ml Sss1 Methyltransferase 22.5 µl 1.0µl (4U Endaktivität) (CpG- Methylase) • 10x NEB Puffer 2.5µl (1x) • 200x SAM 0.125µl (160µM) Anschließend wurde die Lösung für 1h bei 37°C und für 20 min bei 65°C inkubiert. Die methylierte DNA konnte nun bis zu ihrer weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt werden. 3.8 Patienten 3.8.1 Kolon-NET Das Untersuchungsgut bestand aus 34 niedrig differenzierten, kleinzelligen neuroendokrinen Karzinomen des Hindgut, die 1984-2005 während der Operationen von 34 Patienten entnommen wurden. Die Tumoren waren entsprechend ihrer Lokalisation nicht-funktionelle NET. Die Tumoren wurden für die PCR in 10µm bzw. für die immunhistochemische Untersuchung in 4µm dicken Paraffinschnitten auf Objektträger fixiert. Zudem wurden, zur Unterscheidung von Tumor- und Normalgewebe bei der Mikrodissektion, noch HE-(Hämatoxlin/Eosin), ChromograninA- und Synaptophysin-Färbungen mitgeliefert (s. Tab.A und VII im Anhang). 3.8.2 Fore-und Midgut-NET Diese wurden bereits zuvor in der Arbeitsgruppe (AG Arnold, Universitätsklinikum Freiburg) molekularbiologisch analysiert und konnten so zum Vergleich herangezogen werden. Die Fore-und Midgut-NET waren alle gut differenziert und traten sporadisch auf, wie eine eingängige Prüfung der Familien- und Patientengeschichte, die familiäre Syndrome ausschloss, feststellte. Sie wurden auch aus Pankreas und Metastasen in der Leber, in Lymphknoten und in der Niere entnommen. Sie sind in Tab.B im Anhang mit Methylierungsprofil, LOH-und MSI-Analyse aufgelistet. 23 3.8.3 CRC Zum Vergleich mit den Kolon-NET wurden die molekularbiologischen Daten von 150 sporadischen CRC aus dem Labor von Prof. Boland (Dallas, USA) zur Verfügung gestellt. Diese waren aufgrund ihres MSI-Status ausgesucht worden und stellen somit eine nicht randomisierte Gruppe dar. Sie werden in Tab.C im Anhang mit CIMP-und MSI-Status aufgeführt. 4 Methoden 4.1 Methylierungsspezifische PCR (MSP)-Methode 4.1.1 Prinzip der MSP Die MSP ist eine spezifische PCR-Methode zur Detektion methylierter DNA. In den Promotorregionen methylierter Gene liegen methylierte Cytosingruppen der CpG-Inseln vor (s. Kap.1.8.6), die Promotorregionen unmethylierter Gene weisen Cytosine ohne Methylgruppe auf. Letztere werden durch die Bisulfitbehandlung mittels Sulfonierung und Desaminierung in Uracil umgewandelt. Methyliertes Cytosin wird durch eine Bisulfitbehandlung nicht verändert. Durch die Konstruktion unterschiedlicher Primer (s. Abb.5) für dasselbe Gen können somit in PCR und Gelelektrophorese methylierte Gene von unmethylierten spezifisch unterschieden werden. Probe 1: nicht methylierte DNA Probe 2: methylierte DNA CH3 CH3 CH3 l l l 5’-...CGAATACGACGT-...3’ 5’-...CGAATACGACGT-...3’ Bisulfitbehandlung 5’-...UGAATAUGAUGT-... 3’ PCR mit spezifischen Primern spezifisches PCR-Produkt ▼ ▼ CH3 CH3 CH3 l l l 5’-...CGAATACGACGT-...3’ PCR mit spezifischen Primern Abb.5: Prinzip der MSP *Quelle: A. Sosnowski: Inaugural-Dissertation (2005): Die Bedeutung genetischer und epigenetischer Mechanismen für die Pathogenese neuroendokriner Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems 24 4.1.2 Mikrodissektion: Das in Paraffin eingebettete Gewebe, aus dem die DNA extrahiert wurde, wurde mittels sterilem Skalpell unter dem Lichtmikroskop vom Objektträger mikrodisseziert. Hierzu wurden die 10µm Schnitte des Tumors verwendet. Zur Unterscheidung von Tumor-und Normalgewebe bediente man sich mitgelieferter HE-, ChromograninA- und Synaptophysin-gefärbter Schnitte. Das mikrodissezierte Gewebe wurde für 15min in je 150µl Xylen bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 350µl –20°C kaltes 100% Ethanol zu jeder Probe hinzugefügt und bei 4°C für 20min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und den Pellets erneut 50µl Xylen und 500µl -20°C kaltes 100% Ethanol hinzugefügt. Es folgte eine weitere Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen. Anschließend wurde der Überstand abgenommen und die Pellets bei Raumtemperatur oder im Heizblock bei 37°C getrocknet. Diese stehen nun zur Weiterverarbeitung, entweder für die MSP-Analyse oder die MSI-Analyse zur Verfügung. 4.1.3 DNA-Extraktion für MSP-Analyse: Zu den unter 4.1.2 genannten Pellets wurde je 30µl TE/Proteinase K (24:1) hinzugefügt, mit einer Mineralölschicht bedeckt und für 24 Stunden bei 55°C inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurden weitere 30µl TE/Proteinase K (24:1) hinzugefügt und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Im Anschluss daran wurde die Mineralölschicht abpipettiert und die DNA mithilfe des Wizard Clean Up System (Promega Extraction Kit) nach Angaben des Herstellers gereinigt und war nun für die Bisulfitbehandlung gebrauchsfertig. 4.1.4 Bisulfitbehandlung Für jede Behandlung mussten folgende Lösungen frisch zubereitet werden: • 10mM Hydroquinon • 3M Natriumbisulfitlösung, einzusehen im Abschnitt 3.6: „Puffer und Lösungen“. Um Einzelstrang-DNA zu erhalten, wurden zu jeder DNA-Probe 5,5µl 2M NaOH hinzugefügt und dies bei 37°C für 10min inkubiert. Anschließend wurden 30µl 10mM Hydroquinon und 520µl 3M Natriumbisulfit hinzugefügt, um zuerst Cytosin zu Cytosinbisulfit zu sulfonieren und es dann in Reaktion mit Wasser zu Uracilbisulfit zu desaminieren. Die Probe wurde mit Mineralöl bedeckt und für maximal 16-18 Stunden bei 50°C inkubiert. Darauf wurden die Proben mithilfe des DNAWizard Clean Up-Systems gereinigt, um danach die DNA (50µl) mit je 5,5µl 3M NaOH für 5min bei Raumtemperatur zu desulfonieren. Als Träger wurde 1µl Glykogen hinzugegeben. Zur Neutralisierung erfolgte eine Gabe von 33µl 10M Ammoniumacetat und zur DNA-Fällung eine Gabe von 300µl 100% Ethanol. 25 Die Präzipitation der DNA erfolgte entweder über Nacht bei -20°C oder für 1.5h bei -80°C. Daran schloss sich eine 30minütige Zentrifugation bei 4°C an mit Entfernung des Überstands. Wieder wurden 300µl 100% Ethanol zum Waschen hinzugefügt und für 30min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Pellets bei Raumtemperatur getrocknet. Es folgte eine Resuspension in, je nach DNA-Menge, 20-30µl 65°C heißem Aqua bidest. 4.1.5 PCR 4.1.5.1 MSP-PCR- Protokoll unter Verwendung von HotStarTaqPolymerase (Quiagen) Jede DNA-Probe wurde mit spezifischen Primern einmal für das methylierte und einmal für das unmethylierte Gen untersucht. Daher wurde ein zweifacher Mastermix angelegt, in folgender Zusammenstellung, wie für das Kit empfohlen: Mastermix: (unmethyliert/ methyliert) für eine Probe: 2.5µl 10x PCR-Puffer (15mM MgCl2) 0.8µl Forward-Primer (10pmol/µl) 0.8µl Backward-Primer (10pmol/µl) 0.5µl dNTPs (10mM) 19µl Aqua bidest 0.25µl HotStarTaqPolymerase (5U/µl) Je Well wurden 2.5µl DNA und 22.5µl Mastermix zusammenpipettiert und mit Mineralöl bedeckt. Die Leerprobe war reiner Mastermix. Anschließend wurde das entsprechende Programm durchlaufen, wie es die unten in Tabellen aufgeführten Bedingungen zeigen (Tab.2). 4.1.5.2 Primer Die meisten Primersequenzen (p16, HIC 1, APC, hMLH1, RASSF1A, TIMP3, MGMT) für die MSP waren bekannt oder wurden aus geeigneten Literaturstellen entnommen. Die MEN1-Primer (Men1Exon, Men1 Promotor) wurden bereits zuvor von der Arbeitsgruppe entworfen (s. 4.3). Die Primersequenzen für die MSI-und LOH-Marker sind in der NCBI-Datenbank erfasst („UniSTS“). Die Primer wurden von der Firma Hermann GbR, Freiburg, synthetisiert. 26 Tabelle 2: Gene, Primer und PCR-Bedingungen für die MSP- Analyse GEN APC Promotor 1A PRIMER [38] sense antisense Unmethyliert Methyliert 5'-AATTTGTTGGATGTGGATTAGGGT-3' 5'-CGTTGGATGCGGATTAGGGC-3' 5'-AACCTCATATCAATCACATACA-3' 5'-CCTCATATCGATCACGTACG-3' Größe 89 bp 84 bp PCR-Bedingungen Temperatur Initiale Denaturierung 95 °C 15 min 95 °C 15 min Denaturierung 92 °C 30 s 92 °C 30 s Annealing 56 °C 45 s 58 °C 45 s Elongation 72 °C 45 s 72 °C 45 s Anzahl der Zyklen Inkubationsdauer Temperatur 50 Abschließende Elongation 72 °C GEN Inkubationsdauer 50 10 min 72 °C 10 min p16 Unmethyliert methyliert 5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3' 5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3' 5'-CAACCCCAAACCACAACCATAA-3' 5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3' Größe 151 bp 150 bp PCR-Bedingungen Temperatur Initiale Denaturierung 95 °C Denaturierung 92 °C 30 s 92 °C 30 s Annealing 60 °C 30 s 62 °C 30 s Elongation 72 °C 30 s 72 °C 30 s PRIMER [75] sense antisense Anzahl der Zyklen Inkubationsdauer Temperatur 5 min 60 Abschließende Elongation 72 °C GEN RASSF1A [103] 72 °C 10 min methyliert sense 5'-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3' antisense 5 min 60 10 min Unmethyliert PRIMER Inkubationsdauer 95 °C 5'-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3' 5'-CAAACCCCACAAACTAAAAACAA-3' 5'-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3' Größe 105 bp 93 bp PCR-Bedingungen Temperatur Initiale Denaturierung 94 °C Denaturierung 94 °C 30 s wie unmethyliert Annealing 60 °C 30 s wie unmethyliert Elongation 72 °C 30 s wie unmethyliert Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation Inkubationsdauer Temperatur 5 min 60 72 °C Inkubationsdauer wie unmethyliert wie unmethyliert 10 min wie unmethyliert 27 GEN hMLH1 Region A PRIMER [10] sense Unmethyliert Methyliert 5'-TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT-3' 5'-ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC-3' 5'-ACCACCTCATCATAACTACCCACA-3' 5'-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3' Größe 124 bp 115 bp PCR-Bedingungen Temperatur Initiale Denaturierung 95 °C Denaturierung 95 °C 30 s 95 °C 30 s Annealing 58 °C 30 s 62 °C 30 s Elongation 72 °C 30 s 72 °C 30 s antisense Anzahl der Zyklen 5 min 70 Abschließende Elongation 72 °C GEN HIC-1 PRIMER [10] Inkubationsdauer Temperatur sense antisense Inkubationsdauer 95 °C 5 min 70 10 min 72 °C 10 min unmethyliert Methyliert 5'-TTGGGTTTGGTTTTTGTGTTTTG-3' 5'-TCGGTTTTCGCGTTTTGTTCGT-3' 5'-CACCCTAACACCACCCTAAC-3' 5'-AACCGAAAACTATCAACCCTCG-3' Größe 116 bp PCR-Bedingungen Temperatur Initiale Denaturierung 94 °C Denaturierung 94 °C 30 s wie unmethyliert Annealing 62 °C 30 s wie unmethyliert Elongation 72 °C Anzahl der Zyklen 72 °C GEN TIMP-3 sense antisense 15 min Inkubationsdauer wie unmethyliert 30 s wie unmethyliert 70 Abschließende Elongation PRIMER [17] 97 bp Inkubationsdauer Temperatur wie unmethyliert 10 min wie unmethyliert unmethyliert Methyliert 5'-TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT-3' 5'-CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC-3' 5'-CCCCCAAAAACCCCACCTCA-3' 5'-CCGAAAACCCCGCCTCG-3' Größe 122 bp PCR-Bedingungen Temperatur 116 bp Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer Initiale Denaturierung 95 °C 20 min wie unmethyliert Denaturierung 94 °C 45 s wie unmethyliert Annealing 59 °C 1 min Elongation 72 °C 1 min wie unmethyliert 10 min wie unmethyliert Anzahl der Zyklen 60 Abschließende Elongation 72 °C GEN MEN1 Exon 2 PRIMER sense antisense 58°C 45 s wie unmethyliert Unmethyliert Methyliert 5'-TTGGTTTGTTTTGTAGGTTGTTGT-3' 5'-GGTTTGTTTTGTAGGTCGTCGT-3' 5'-ACTCCTCTCAACCCAACTCAAC-3' 5'-ACTCCTCTCGACCCAACTCGAC-3' Größe 133 bp 131 bp PCR-Bedingungen Temperatur Initiale Denaturierung 95 °C 15 min wie unmethyliert Denaturierung 94 °C 45 s wie unmethyliert Annealing 62 °C 45 s wie unmethyliert Elongation 72 °C Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation Inkubationsdauer Temperatur 45 s 70 72 °C Inkubationsdauer wie unmethyliert wie unmethyliert 10 min wie unmethyliert 28 GEN MEN1 Promotor Unmethyliert Methyliert sense 5'-AGAAGTTTGGTGATTTTTTATTTTG-3' 5'-GTTCGGCGATTTTTTATTTCGA-3' antisense 5'-TAACCCTTCCCTTCAAACCAAC-3' 5'-TAACCCTTCCCTTCAAACCGAC-3' Größe 111 bp 107 bp PCR-Bedingungen Temperatur Initiale Denaturierung 94 °C 5 min wie unmehtyliert Denaturierung 94 °C 30 s wie unmehtyliert Annealing 60 °C 30 s wie unmehtyliert Elongation 72 °C 30 s wie unmehtyliert PRIMER Anzahl der Zyklen Inkubationsdauer Temperatur 70 Abschließende Elongation 72 °C GEN Inkubationsdauer wie unmehtyliert 10 min wie unmehtyliert MGMT unmethyliert Methyliert sense 5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3' 5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3' antisense 5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3' 5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3' Größe 93 bp 81 bp PCR-Bedingungen Temperatur PRIMER [43] Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer Initiale Denaturierung 94 °C 15 min Denaturierung 94 °C 45 s 94 °C 30s Annealing 57 °C 45 s 56 °C 30s Elongation 72 °C 45 s 72 °C 30s Anzahl der Zyklen 60 Abschließende Elongation 4.1.5.3 wie unmethyliert 72 °C wie unmethyliert 10 min wie unmethyliert MEN1 Primerdesign Die MEN1-Primer wurden bereits zuvor von der Arbeitsgruppe entworfen: Die Basensequenz von MEN1 wurde der NCBI GenBank (Zugangsnummer U93237) auf der Internetseite „www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=1945388“ entnommen. Die ersten 2.500 Basen wurden in ein Programm zum Entwerfen methylierungsspezifischer Primer eingegeben (www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi). Von den auf diese Weise ermittelten Primern wurde ein Set ausgewählt, das einen Abschnitt kurz vor Exon1 amplifiziert (1550 bis 1656), an dem der MEN1-Promotor vermutet wird [176]. Es wurde ein weiteres Set ausgesucht, das eine Sequenz in Exon2 (2250 bis 2381), das reich an CpG-Dinukleotiden ist, amplifiziert, da Exon1 nicht transkribiert wird. (www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Genes/MEN1ID148.html). 4.1.6 Gelelektrophorese: Zur Auftrennung der amplifizierten DNA wurde ein 2,5% Agarosegel, das mit dem unter UV-Licht fluoreszierenden Farbstoff Ethidiumbromid vermischt war, gegossen. Ethidiumbromid besitzt die Eigenschaft mit doppelsträngiger DNA zu interkalieren und kann unter UV-Transillumination sichtbar gemacht werden. 29 4.2 MSI- und LOH-Analyse 4.2.1 DNA-Extraktion für die MSI- und LOH-Analyse: Zu den unter 4.1.2 genannten Pellets wurden je 30µl GeneReleaser hinzugefügt, und unter folgendem Programm im Thermocycler inkubiert: Schritt Zeit Temperatur 1 30 s 65 ° C 2 30 s 8°C 3 90 s 65 ° C 4 3min 97 ° C 5 1min 6 3min 65 ° C 7 1min 97 ° C 8 1min 65 ° C 8°C Im Anschluss daran wurden je 25µl TE/ Proteinase K (24:1) hinzupipettiert, mit Mineralöl bedeckt und wie folgt inkubiert: Schritt Zeit Temperatur 1 54 h 55 ° C 2 15min 95 ° C Die DNA ist gebrauchsfertig und kann bis zu ihrer weiteren Verwendung bei -20°C gelagert werden. 4.2.2 Endlabeln eines Primers Anfänglich wurde jeweils ein Primer durch Phosphorylierung mit 32P radioaktiv markiert: 1µl 5x Forward Reaction Puffer 1µl Forward Primer (10pmol/µl) 1µl T4 Polynukleotid Kinase (10U/µl) Nach Vortexen und Herunterzentrifugieren wurden 2µl [γ-32P] ATP (10µCi/ml) hinzugefügt und die Mischung, nach Vortexen und Herunterzentrifugieren, für 1h bei 37°C inkubiert und anschließend für 15min bei 95°C denaturiert. 4.2.3 Endlabeln des Elektrophoresemarkers Als Elektrophoresemarker diente Φ X174 RF DNA/HAE III Fragments. Sein Endlabeling erfolgte folgendermaßen: 1µl Forward Reaction Puffer 3µl Marker (Φ X174) 1µl T4 Polynukleotid Kinase (10U/µl) 30 Nach Vortexen und Zentrifugieren wurden 1µl [γ- 32 P] ATP (10mCi/ml) hinzupipettiert, vermischt und für 1h bei 37°C inkubiert und für 15min bei 95°C denaturiert. Dann wurden 5µl Aqua bidest. sowie 10µl MSI- Loading dye hinzugegeben. 4.2.4 PCR Herstellung des Mastermixes (pro Marker) Volumina Konzentration in der PCR 12µl MgCl2 (50mM) 1.5µM 40µl 10x PCR Puffer 1x 8µl 10mM dNTPs 200µM 94µl Aqua bidest. Diese insgesamt 154µl sowie 1µl Backwardprimer (0.025µM) wurden zu dem bereits radioaktiv markierten Primer pipettiert. Nach abschließendem Vortexen und Zentrifugieren konnte der Mastermix bei -20°C ca. eine Woche gelagert werden. Für die PCR wurden pro 2µl DNA-Probe 2.4µl Mastermix und 0.06µl Taq DNA-Polymerase (5U/µl) geladen. 4.2.4.1 PCR-Bedingungen Es wurden folgende Marker verwendet: Marker Lokalisation im Bereich von BAT25 Intron von c-kit [Chr. 4q12] BAT26 Intron5 von hMSH2 [Chr. 2p16] D2S123 hMSH2 [Chr. 2p16] D5S346 APC D11S913 MEN1 D17S250 p53 [Chr. 17p13] RH94067 APC BAT25 und BAT26 sind Mononukleotidmarker, d.h. sie sind in der Regel monomorph. Sie setzen sich aus Poly(A)- Sequenzen zusammen, die nur geringen Längenvariationen unterliegen [77,90,178]. Alle anderen Marker sind polymorph, so dass pro Tumor auch immer die korrespondierende Normal-DNA zum Vergleich untersucht werden musste. D2S123 setzt sich aus einer Wiederholung der Basen (AC)13AT(AC)15 zusammen und D17S250 aus (AC)25. 31 Um den MSI-Status von Tumoren entsprechend der Richtlinien des National Cancer Institutes zu bestimmen, wurden folgende 5 Marker verwendet [25]: BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, D17S250. An allen Markern, außer BAT25 und BAT26, ließen sich zudem auch Allelverluste (LOH) untersuchen. Tab.3: MSI Marker Primer BAT 25[119] sense antisense Größe des PCR-Produktes PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung 5’- TCG CCT CCA AGA ATG TAA GT -3’ 5’- TCT GCA TTT TAA CTA TGG CTC- 3’ 90 bp Inkubationsdauer 3 min Temperatur 95 ° C Denaturierung 95 ° C 30 s 50 ° C 1 min 72 ° C 1 min Annealing Elongation Anzahl der Zyklen 35 * Abschließende Elongation 72 ° C Marker Primer 10 min BAT 26[119] sense antisense 5’ - TGA CTA CTT TTG ACT TCA GCC- 3’ 5’ - AAC CAT TCA ACA TTT TTA ACC C-3’ Größe des PCR-Produktes 86 – 100 bp PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Temperatur Inkubationsdauer wie BAT 25 Denaturierung wie BAT 25 Annealing wie BAT25 Elongation wie BAT 25 Anzahl der Zyklen wie BAT25* Abschließende Elongation wie BAT25 * am 9.11.06 wurde die Zyklenzahl auf 50 erhöht, dies betrifft nur Tumore 8cc, 20- 26cc Marker Primer Größe des PCR-Produktes PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung D2S123( UniSTS-Nr.888) sense antisense 5’ – AAACAGGATGCCTGCCTTTA- 3’ 5’- GGACTTTCCACCTATGGGAC-3’ 197- 227 bp Temperatur 94 ° C Inkubationsdauer 3 min Denaturierung 94 ° C 40 s Annealing 50 ° C 2 min Elongation 72 ° C 2 min Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation 40 72 ° C 10 min 32 Marker Primer D5S346(UniSTS-Nr.146926) sense antisense 5’ – ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG-3’ 5’ – AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT- 3’ Größe des PCR-Produktes 96 bp PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Temperatur 94 °C Inkubationsdauer 3 min Denaturierung 94 ° C 1 min Annealing 55 ° C 2 min Elongation 72 ° C 2 min Anzahl der Zyklen 35 Abschließende Elongation 72 ° C Marker D17S250[abgewandeltes Primerset] Primer sense antisense 10 min 5’ – AAGAGCTGAGACTCCATCTC- 3’ 5’ –ACAGCTCCTTTAATGGCAGG- 3’ Größe des PCR-Produktes 150 bp PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Temperatur 94 ° C Inkubationsdauer 3 min Denaturierung 94 ° C 30 s Annealing 50 ° C 1 min Elongation 72 ° C 1 min Anzahl der Zyklen 40 Abschließende Elongation 72 ° C 10 min Tab.4: LOH Marker Primer D11S913( UniSTS-Nr. 2112) sense antisense 5’- AAATGGAAGAAACAAAAGCC-3’ 5’- CCTGGTTAATCTCTCATTAATCC-3' Größe des PCR-Produktes 104 bp PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Temperatur 94 ° C Denaturierung 94 ° C 30s Annealing 50 ° C 30s Elongation 72 ° C 30s Anzahl der Zyklen Inkubationsdauer 3 min 50 Abschließende Elongation 72 ° C Marker RH94067(UniSTS-Nr.85831) Primer sense antisense 10 min 5’- ATGCATGTATCATCAGTCACCC-3’ 5’- GTCCCCTTATACAGTGGAGGG-3’ Größe des PCR-Produktes 135 bp PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Temperatur 94 ° C Denaturierung 95 ° C 45s Annealing 52 ° C 45s Elongation 72 ° C 45s Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation Inkubationsdauer 3 min 50 72 ° C 10 min 33 4.2.5 Polyacrylamid-Gelelektrophorese: Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte auf einem denaturierendem 8% Polyacrylamidgel, das aus 25ml 8% Acrylamidgellösung, 19µl TEMED zur Quervernetzung und 125µl APS zum Starten der Reaktion hergestellt wurde. Im Anschluss an die PCR wurden die DNA-Proben zur Spaltung der Doppelstränge mit jeweils 3µl LOH/MSI-Loading Dye für 10min bei 95°C erhitzt und dann auf Eis gekühlt, um die Denaturierung aufrechtzuerhalten. Es erfolgte die Auftragung von je 2µl PCRProdukt und 4µl des Elektrophoresemarkers Φ X174 RF DNA/HAE III Fragments als Größenleiter auf das Gel mithilfe der Spezialpipetten MµlTIFlex Flat.4mm Tips. Die Elektrophorese wurde bei 30W je Glasplatte bei maximaler Spannung von 1000V und maximaler Stromstärke von 100mA im BaseRunner200 durchgeführt. Je nach Größe der PCRProdukte wurde sie beendet. Nach der Trocknung wurde das Gel mit einem unbelichteten Film in einer Röntgenkassette für mehrere Stunden autoradiografiert. MSI wurde bestätigt, wenn sich eine Bandenverschiebung gegenüber der Normalgewebe- DNA zeigte. LOH wurde bestätigt, wenn die Intensität eines Tumorallels um 50% reduziert war im Vergleich zu Normalgewebe- DNA. 4.3 Ki-67 Färbung Zur Ermittlung des Proliferationsgrades der GEP-NET wurde der Proliferationsmarker Ki-67 mittels Immunhistochemie (IHC) bestimmt. Dazu wurde der monoklonale Antikörper MIB-1 zur Erkennung des im Nukleus lokalisierten Proteins Ki-67 verwendet (s. 1.9). Es wurde das DAKO M7240 Kit und das DAKO K5005 Detektionssystem für Autostainer angewandt: Die Paraffinschnitte wurden entsprechend Herstellerangaben für die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung (HIER) bei pH 6 im Dampfgarer vorbereitet. Durch die Demaskierung sollten die durch die Fixierung für den primären Antikörper unkenntlich gemachten Epitope offengelegt werden. Nun wurde der MIB-1-Antikörper in 2000facher Verdünnung dazugegeben. Es kam ein indirektes Streptavidin-Biotin-Verfahren zur Anwendung, bei dem der sekundäre Antikörper über Streptavidin mit zugegebener alkalischer Phosphatase in Verbindung tritt. Diese löst bei Anwesenheit von Chromogen RED eine rote Farbreaktion der betroffenen Zellkerne aus. Zur Gegenfärbung der normalen Zellkerne wurde eine HE-Färbung (Hämalaun nach Mayer) durchgeführt (blaues Endprodukt). Die Zahl der für Ki-67 angefärbten Zellkerne wurde unter dem Lichtmikroskop in mehreren Gesichtsfeldern mit 25facher Vergrößerung betrachtet und ausgewertet. 34 4.4 Statistische Methoden Wurden zwei Gruppen bezüglich eines Merkmals verglichen, kam der χ2-Vierfeldertest mit Stetigkeitskorrektur zur Anwendung. Wurden drei Gruppen bezüglich eines Merkmals verglichen, wurde der χ2-Test für Kontingenztafeln verwendet. Der Fisher`s Exact Test wurde zur Kontrolle der ermittelten p-Werte angewendet, wenn die Gesamtzahl der verglichenen Tumoren kleiner als 40 bzw. wenn die erwartete Häufigkeit innerhalb einer Vierfeldertafel kleiner als 5 war. Für die Berechnung des Zusammenhangs zwischen der Methylierung bestimmter Gene und dem Status des Tumors wurde der ‚Binary logit–Test’ und der ‚Cumulative logit-Test’ angewandt (s. 5.7.5.2). Der Mantel-Haenszel-Test diente der Berechnung von Signifikanzen bezüglich linearer Trends (s. 5.7.6). Bei allen Tests wurde ein p-Wert <0.05 als statistisch signifikant betrachtet. Als ‚Nachbeobachtungszeit’ war in dieser Studie die Zeit definiert, die zwischen Erstdiagnose des Tumors und Tod bzw. Ausscheiden des Patienten aus der Beobachtung verstrich. Als definitives Ende der Nachbeobachtung wurde bei den Kolon-NET der Zeitpunkt August 2006 gesetzt. Entsprechend wurde der Status der Patienten zu diesem Zeitpunkt in die Berechnungen aufgenommen (lebend oder verstorben). Als ‚Überlebenszeit’ wurde die Zeit definiert, die zwischen Erstdiagnose und Tod des Patienten verstrich. Zur Berechnung der Überlebenszeiten wurde die Kaplan-Meier-Methode angewandt. Der anschließende Logranktest verglich zwei oder mehr nach der Kaplan-Meier-Methode berechnete Überlebenskurven auf signifikante Unterschiede. Die berechneten Überlebenszeiten wurden durch untere und, wenn vorhanden, obere Grenzen des 95% Konfidenzintervalls (KI) umgeben. Manchmal konnte keine obere Grenze des 95% KI gebildet werden, da einige Patienten über den Beobachtungszeitraum hinaus überlebten. Auch konnte insgesamt keine mittlere Überlebenszeit gebildet werden, wenn mehr als 50% der Patienten über den Beobachtungszeitraum hinaus lebten. Nicht berechenbare oder nicht erhobene Daten werden nicht nochmals explizit als fehlend im Ergebnisteil erwähnt. Die mediane Überlebenszeit zeigt die Zeit auf, innerhalb der die Hälfte der Patienten (in absoluten Zahlen) verstorben ist. Diese Angabe ist natürlich nicht möglich bei Gruppen, deren Patienten zu mehr als die Hälfte über den Beobachtungszeitraum überleben. Die Überlebenszeit-Analysen waren univariat (Cox-Regression), wenn zwei Überlebenskurven bezüglich eines Merkmals, z.B. CIMP-Status, Tumorgruppe oder Ki-67-Index, im Logranktest verglichen wurden (z.B. 5.8.3). Eine multivariate Analyse wurde zur Feststellung eines prognostischen Faktors für das Überleben durchgeführt. Hierbei wurden alle vier möglichen Prädiktoren (Tumorgruppe, LOH-Status, CIMP-Status, Ki-67-Index) verglichen. Durch schrittweises Ausschließen (logistische-Regression) einzelner Faktoren konnte ein statistisch 35 signifikanter (p<0.05 likelihood ratio) prognostischer Faktor für das Überleben ermittelt werden (s. 5.8.5). Als Datenanalyseprogramm diente SAS 9.1. Alle statistischen Auswertungen dieser Studie wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Schulte-Mönting vom Institut für Biometrie und Medizinische Informatik, Freiburg, durchgeführt. 36 37 5 Ergebnisse 5.1 MSI-Analyse Von 34 Tumoren konnten 25 auf MSI untersucht werden. Es werden mikrosatellitenstabile (MSS), geringgradig mikrosatelliteninstabile (MSI-L) und hochgradig mikrosatelliteninstabile (MSI-H) Tumoren unterschieden. Tumoren mit einem instabilen Marker werden als MSI-L eingestuft, Tumoren mit zwei oder mehr instabilen Markern als MSI-H [25]. Bei den untersuchten Tumoren war einer MSI-H (4%, 1/25) und 5 MSI-L (20%, 5/25). MSS waren 76% der Tumoren (19/25). Eine Übersicht über MSI gibt Abb.6: MSI bei Kolon-NET 76% 100% Prozent 80% 60% 20% 40% 4% 20% 0% MSS MSI-L MSI-H Abb.6 Eine MSI war mindestens einmal an jedem der genannten fünf Marker des NCI vorhanden. 5.2 LOH- Analyse Von allen Kolon-NET ließen sich 27 auf Allelverluste untersuchen. Davon konnte bei 10 Tumoren LOH mindestens an einem Marker festgestellt werden (10/27, 37%). Ein Tumor (Nr.12cc) wies 3 Allelverluste an D2S123, PYGM und RH94067 auf. Ein weiterer Tumor (Nr.13cc) wies LOH an D17S250 und PYGM auf, ein anderer (14T) zeigte Allelverluste an D5S346 und D11S913. Die Häufigkeit der einzelnen Allelverluste ist in Tab.5 und 6 wiedergegeben. Marker LOH In Prozent D2S123 1/27 4% D5S346 1/27 4% D17S250 3/27 11% D11S913 5/27 19% PYGM 2/27 7% RH94067 2/27 7% Gen LOH In Prozent hMSH2 1/27 4% APC 3/27 11% p53 3/27 11% MEN1 7/27 26% 38 Am häufigsten wurden Allelverluste am oder in der Nähe des MEN-1-Lokus gefunden (26%, D11S913 und PYGM), gefolgt von p53 und APC (jeweils 11%) und hMSH2 (4%). Eine graphische Übersicht geben Abb.7 und Abb.8: Häufigkeit von LOH LOH 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% D2S123D5S346D17S250 D11S913PYGMRH94067 alle Marker Marker Abb.7 Allelverluste pro Marker Häufigkeit von LOH LOH 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 37% 26% 11% 11% 4% hMSH2 APC p53 MEN1 alle Marker Markerlokalisation Abb.8 Allelverluste je Genlokalisation N T 7cc D17S250 Abb.9 zeigt ein Beispiel eines LOH-Ergebnisses. Der Pfeil zeigt die fehlende Bande im Tumorgewebe (T) an und markiert damit den Allelverlust gegenüber dem Normalgewebe (N) am Marker D17S250. 39 5.3 MSP-Analyse Bei der MSP ließen sich alle 34 untersuchten Tumoren amplifizieren. Keines der 8 untersuchten Gene war ausschließlich unmethyliert. Am häufigsten waren die Promotoren von HIC1, MEN1 und APC mit 59% (16/27), 48% (15/31) und 46% (15/33) methyliert, wobei der MEN1-Promotor zu 50% (14/28), Exon2 des MEN1-Gens zu 7% (2/29) methyliert war. Die geringste Methylierungshäufigkeit fand sich bei TIMP3 mit 9% (3/32). Methylierungshäufigkeit aller 8 Gene auf: Gen Methyliert In Prozent TIMP3 3/32 9% hMLH1 4/32 13% p16 8/30 27% MGMT 13/31 42% RASSF1A 13/29 45% APC 15/33 46% MEN-1 15/31 48% HIC-1 16/27 59% Tab.7 Methylierungsprofil der Kolon-NET 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 3/32 4/32 TIMP3 hMLH1 8/30 13/31 13/29 15/33 15/31 16/27 p16 MGMTRASSF1A APC MEN 1 HIC 1 Häufigkeit der Genmethylierung Abb.10 zeigt die Methylierungshäufigkeit der verschiedenen Gene. Tab.7 weist die 40 U M U M 12 cc 13cc U 14cc M Abb.6.2 Positivkontrolle Nr.2 Abb.6.1 APC-Gen U M U M U M 6T 7T Abb.6.4 Positivkontrolle Nr.1 Abb.6.3 HIC1-Gen U M U M 8cc U 10cc U 7T U M 8T U Nr.1 Abb.6.5 hMLH1-Gen U M M Nr.2 Abb.6.6 Positivkontrolle s. Abb.6.7 Nr 1 Abb.6.7 MEN1 Exon2 und Positivkontrolle Nr.1 U M 5cc U 6cc Abb.6.9 MEN1 Promotor U M Nr.1 Abb.6.10 Positivkontrolle 41 U M 18cc U M M 19cc s.Abb.6.11 Nr.2 Abb.6.11 MGMT-Gen und Positivkontrolle Nr.2 U 9cc U M 10cc M Abb.6.14 Positivkontrolle Nr.1 Abb.6.13 p16 -Gen U U M 20cc U 1cc M 25cc Abb.6.15 RASSF1A-Gen U U M 2cc Abb.6.16 Positivkontrolle Nr.3 U M Abb.6.18 Positivkontrolle Nr.2 Abb.6.17 TIMP3-Gen Abb.11 zeigt Beispiele von PCR-Produkten der MSP-Analyse. Die Größen der PCR-Produkte sind in Kap.4, Tab.2 aufgelistet. Als Positivkontrolle diente nach dem Sss1-Protokoll methylierte DNA aus venösem Blut, als Negativprobe wurde H2O verwendet (Kap.3.7). 5.4 CIMP Da die Mindestzahl methylierter Gene für CIMP nicht einheitlich definiert ist, galt in dieser Untersuchung ein Tumor als CIMP-positiv, wenn ≥3 von 8 Genen methyliert waren. Beim CRC bestand CIMP, wenn 2 von 6 untersuchten Genen methyliert waren [62]. Diesen Phänotyp wiesen 65% (20/31) der Kolon-NET auf. Bei 3 von 34 untersuchten Tumoren gelang die Analyse des CIMP-Status nicht (s. Anhang Tab.A1: Tumoren 18T, 23cc, 24cc). 42 5.5 Genmethylierung Es zeigte sich, dass jeweils 29% (9/31) der Tumoren an 3 oder 4 Genen methyliert waren und in 2 Fällen (6.5%) eine aberrante Genmethylierung, bei der 6 oder mehr Gene betroffen waren, bestand. Bei 13% (4/31) bestand keine Methylierung. Zur Übersicht Tab. 8: Anzahl der methylierten n % 0 4/31 13% 1 4/31 13% 2 3/31 10% 3 9/31 29% 4 9/31 29% 5 0/31 0% 6 1/31 3% 7 1/31 3% Gene Tab.8 5.6 Ki-67-Analyse Nach Auswertung der Ki-67-Färbungen, konnten die Tumoren entsprechend der WHOKlassifikation von 2000 [93,144] den 3 Kategorien des Ki-67-Indexes zugeordnet werden: Tumoren mit Ki-67-Anfärbung der Zellkerne < 2%, 2-29% und >29%. Bei den Kolon-NET hatten 6% (2/34) der Tumoren einen Ki-67-Index von <2%, 9% (3/34) einen Ki-67-Index von 2-29% und 85% (29/34) waren zu >29% Ki-67-positiv (Tab.9): Ki-67-Index Ki-67 <2% Ki-67 2- 29 % Ki-67 <29% 6% (2/34) 9% (3/34) 85% (29/34) % der Kolon-NET Tab.9 Ki67-Proliferationsindex Häufigkeit der Ki67Kategorie 85% 100% 80% 60% 6% 9% 40% 20% 0% Ki67<2% Ki67>2-29% Ki67-Kategorie Abb.12 Ki-67-Index-Verteilung bei Kolon-NET Ki67> 29% 43 5.7 Vergleich der Tumorgruppen 5.7.1.1 Fore- und Midgut-NET Alle 38 Tumoren waren auswertbar. Sämtliche Fore-und Midgut-NET (34/38) waren MSS. 12.5% (3/24) der Tumoren zeigten LOH an denselben Markern wie bei den Kolon-NET. Es wurden dieselben Gene auf Methylierung wie bei den Kolon-NET untersucht: p16, hMLH1, APC, RASSF1A, MGMT, TIMP3, HIC1, MEN1 (Exon2 und Promotor). Es galten die gleichen Bedingungen zur Festlegung von CIMP wie bei den Kolon-NET (s.5.4). Es zeigte sich, dass 47% (18/38) CIMP-positiv waren. Die Ki-67-Analyse ergab folgende Verteilung: Ki-67- Index <2% 2-29% >29% % der Fore- und Midgut-NET 63.2% (24/38) 36.8% (14/38) 0% (0/38) Tab.10 Ki67-Index bei Fore- und Midgut NET Häufigkeit 0,80 63% 37% 0,60 0,40 0% 0,20 0,00 Ki67<2% Ki67 2-29% Ki67 > 29% Ki67-Index Abb.13 Ki-67-Index-Verteilung bei Fore- und Midgut-NET 5.7.1.2 Kolorektale Karzinome (CRC) Von den Tumoren waren 63% (94/150) MSS, 29% (43/150) MSI-L und 9% (13/150) MSI-H. Die CRC waren zuvor nach ihrem MSI-Status ausgewählt worden, insofern handelt es sich hier nicht um eine repräsentative Darstellung des MSI-Status. In dieser Gruppe wurden die Gene p14, p16, MLH1, MINT1, MINT2, MINT31 auf Methylierung untersucht. Hierbei galt ein Tumor als CIMPpositiv bei Methylierung von 2 von 6 Genen. Dies kam in 29% (44/150) der Fälle vor. 44 5.7.2 MSI Die Häufigkeiten des MSI-Status waren je nach Tumorlokalisation folgendermaßen verteilt: MSS/ MSI-L MSI- H Kolon- NET 96% (24/25) 4% (1/25) Fore- und Midgut-NET 100% 0% Tab.11 MSI Status nach Tumorlokalisation 100% Häufigkeit in % 96% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 4% 0% Kolon-NET Fore- und MidgutNET MSS/MSI-L MSI-H Tum orlokalisation Abb.14 Im Vergleich unterscheiden sich Fore-und Midgut-NET und Kolon-NET nicht signifikant bezüglich MSI (p=0.8317). Die CRC waren nicht repräsentativ, da es sich um eine Vorauswahl nach MSIStatus handelte. 5.7.3 LOH Bei den Kolon-NET fanden bei 37% (10/27) der Tumoren, bei Fore-und Midgut-NET bei 12.5% (3/24) Allelverluste statt. Dabei konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Tumorlokalisationen für die Häufigkeit von Allelverlusten festgestellt werden (p=0.1669). LOH-Status 0,37 Prozent 0,40 0,30 0,13 0,20 0,10 0,00 Kolon-NET Fore- und MidgutNET Tum orlokalisation Abb.15 LOH 45 5.7.4 CIMP Die Häufigkeiten des CIMP-Status waren in Bezug auf den MSI-Status in den verschiedenen Tumorlokalisationen folgendermaßen verteilt (mit Berücksichtigung der Grundgesamtheit): CIMP-positive CIMP- negative Tumoren Tumoren Kolon- NET/ MSS 52% (13/25) 16% (4*/25) Kolon- NET/ MSI-L 12% (3/25) 8% (2/25) Kolon- NET/ MSI-H 0% 4% (1/25) CRC/ MSS 16% (24/150) 47% (70/150) CRC/MSI-L 7% (10/150) 22% (33/150) CRC/MSI-H 7% (10/150) 2% (3/150) Fore- und Midgut-NET/ MSS 47% (18/38) 53% (20/38) Tab.12 * 2 Tumoren konnten bezüglich ihres CIMP-Status nicht gewertet werden (18T,23cc), wohl aber bzgl. der MSIAuswertung Zusammenhang CIMP und MSI-Status verschiedener Tumorlokalisationen Häufigkeit in % 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% Ko lo nNET/M SS Ko lo nNET/ M SI-L Ko lo nNET/ M SI-H CRC/ M SS CRC/ M SI-L CRC/ M SI-H Fo re-und M idgutNET/M SS CIMP pos CIMPneg Tumorlokalisation/MSI-Status Abb.16 Im direkten Vergleich zwischen CRC und Kolon-NET war die Häufigkeit des CIMP-positiven Status in Bezug auf den MSI-Status folgendermaßen verteilt: CIMP-positiv Kolon-NET CRC MSS 76% (13/17) 26% (24/94) MSI-L 60% (3/5) 23% (10/43) MSI-H 0% (0/1) 77% (10/13) Tab. 13 MSS und MSI-L Kolon-NET waren signifikant öfter CIMP-positiv als sporadische CRC (p=0.0272). Der einzige MSI-H-NET des Kolon war CIMP-negativ. 46 Die Häufigkeiten des CIMP-Status waren in den verschiedenen Tumorlokalisationen folgendermaßen verteilt: CIMP positiv CIMP negativ CRC 29% (44/150) 71% (106/150) Kolon- NET 64.5% (20/31) 35.5% (11/31) Fore- und Midgut- NET 47% (18/38) 53% (20/38) Häufigkeit in % Tab.14 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 71% 53% 47% 29% CRC CIMPneg 65% CIMP pos 35% KolonNET Fore und MidgutNET Tumorlokalisation Abb.17 Bei Betrachtung aller 3 Tumorentitäten war die Anzahl der CIMP-positiven Tumoren für KolonNET signifikant erhöht (p=0.0004). Im Einzelvergleich zwischen den Kolon-NET und den Fore-und Midgut-NET konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich des CIMP-Status gefunden werden (p=0.2376). Beim Einzelvergleich von Kolon-NET und CRC konnte jedoch ein für Kolon-NET signifikanter Unterschied bezüglich des CIMP-Status gefunden werden (p=0.0004). 47 5.7.5 Genmethylierung 5.7.5.1 Vergleich der Genmethylierung der verschiedenen NET Methylierungsprofil der Kolon-NET und Fore-und Midgut-NET Haüfigkeit in % 100% 80% 60% 40% 20% 0% HIC1 MEN1 APC RASSF1A MGMT p16 hMLH1 TIMP3 Gen Fore-und Midgut-NET Kolon-NET Abb.18 Für die Kolon-NET waren folgende Gene signifikant häufiger methyliert als für Fore-und MidgutNET: p16 (p=0.0090) und MEN1 (p=0.0430). Die Gene MGMT und TIMP3 waren zwar häufiger methyliert als bei Fore-und Midgut-NET, es bestand jedoch kein signifikanter Unterschied. HIC1, APC, hMLH1, RASSF1A waren in dieser Untersuchung häufiger bei den Fore-und MidgutNET methyliert, wobei sich nur für hMLH1 ein signifikanter Unterschied ergab (p=0.046). Methylierung Gene Fore und MidgutNET p-Werte Kolon-NET χ2-Vierfeldertest mit Stetigkeitskorrektur HIC1 21/25 84% 16/27 59.3% 0.0967 n.s./grenzwertig MEN1 7/33 21.2% 15/31 48.4% 0.0430 signifikant APC 23/36 63.9% 15/33 45.5% 0.1951 n.s. RASSF1A 20/30 66.6% 13/29 44.8% 0.1536 n.s. MGMT 8/30 26.7% 13/31 41.9% 0.3245 n.s.* p16 0/29 0% 8/30 26.7% 0.0090 signifikant hMLH1 17/36 47.2% 4/32 12.5% 0.0046 signifikant TIMP3 0/33 0% 3/32 9.4% 0.2264 n.s. Tab.15 5.7.5.2 Aussagekraft der Methylierung bestimmter Gene Die Methylierung der Gene APC und hMLH1 machte eine Voraussage der Tumorgruppe möglich. Sie waren vor allem bei Fore-und Midgut-NET methyliert (APC: p=0.0377; hMLH1: p=0.0014). Ebenso zeigte sich, dass die Methylierung von MEN1 (p=0.0056) und RASSF1A (p=0.0159) mit CIMP-positiven Tumoren korreliert war. Zuletzt ergab sich, dass bei Methylierung von hMLH1 ein signifikant niedrigerer Ki-67-Index bestand (p=0.0084). 48 5.7.6 Ki-67 Bei Kolon-NET gab es signifikant häufiger einen erhöhten Proliferationsindex (>29% bei n=29/34) im Gegensatz zu den Fore-und Midgut-NET (>29% bei n= 0/38) (p<0.0001) (s.Abb.12 und 13). Bei den Kolon-NET lag für das ordinale Merkmal Ki-67 (<2%, 2-29%,<29%) ein linearer Trend für die höheren Ki-67-Werte (>29%) vor (p<0.0001). Fore-und Midgut-NET wiesen eher niedrige Ki-67Werte auf. 5.8 Überleben Überlebenszeiten lagen für Fore-und Midgut-NET und Kolon-NET vor. 5.8.1 Überleben nach Tumorgruppen 5.8.1.1 Kolon-NET Kolon- NET Vorhandene Überlebensdaten 23 (34) Mediane Überlebenszeit 19 Monate Untere Grenze des 95% KI 8 Monate Mittlere Nachbeobachtungszeit 25 Monate Überlebende am Ende der Beobachtung 39.1% (9/23) Tab.16 Aus den Daten ging hervor, dass ca. 45% (11/23) der Patienten noch innerhalb eines 2-JahresZeitraums nach Diagnosestellung lebten. 5.8.1.2 Fore- und Midgut-NET Fore-und Midgut- NET Vorhandene Überlebensdaten 38 (38) Mediane Überlebenszeit Nicht bestimmbar (nb) Untere Grenze des 95% KI 36 Monate Mittlere Nachbeobachtungszeit 67 Monate Überlebende am Ende der Beobachtung 60.5% (23/38) Tab.17 5.8.1.3 Vergleich In der Kaplan-Meier Kurve (Abb.19) wurden die Überlebenszeiten von Kolon-NET und Fore-und Midgut-NET gegenübergestellt. Kolon-NET zeigten ein signifikant schlechteres Überleben (p=0.0061). 49 Abb.19 Kaplan-Meier-Kurve 5.8.2 Überleben nach LOH-Status Abb.20 Kaplan- Meier-Kurve Ein Patient verstarb nach 57 Monaten in der LOH-positiven Gruppe. LOH- positiv LOH- negativ 34 (43) 9 (34) 25 (34) Mediane Überlebenszeit 46 Monate nb 95% KI 19-57 Monate 13 Monate- x Mittlere Nachbeobachtungszeit 27 Monate 56 Monate Überlebende am Ende der Beobachtung 33.3% (3/9) 54.9% (~14/25) Tab.18 Es zeigte sich, dass das Überleben vom LOH-Status nicht abhängig ist (p=0.2773). 50 5.8.3 Überleben nach CIMP-Status Abb.21 Kaplan- Meier-Kurve CIMP-positiv CIMP- negativ 58 (72) 32 (58) 26 (58) Mediane Überlebenszeit 36 Monate nb 95% KI 14 Monate-x 36 Monate- x Mittlere Nachbeobachtungszeit 45 Monate 59 Monate Überlebende am Ende der Beobachtung 39.9% (~14/32) 60.9%(~16/26) Tab.19 Im Logranktest bestand kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen für das Überleben (univariate Analyse p=0.1839). 5.8.4 Überleben nach Ki-67-Index 5.8.4.1 Abb.22 Kaplan-Meier-Kurve: Überleben nach Ki-67-Status 51 Der Ki-67-Index wurde bei insgesamt 72 NET erhoben. Ki-67<2 % Ki-67 =2-29% Ki-67>29% 72 25 (26) 16 (17) 20 (29) Mediane Überlebenszeit nb 36 Monate 16.5 Monate 95% KI nb 12 Monate - x 8-57 Monate Mittl. Nachbeobachtungszeit 82 Monate 33 Monate 26.5 Monate Überlebende am Ende der Beobachtung 76% (19/25) 30 % (~6/16) 35 % (7/20) Tab.20 Im Logrank-Test (p=0.0024) konnte gezeigt werden, dass zwischen o.g. 3 Gruppen ein signifikanter Unterschied bezüglich des Überlebens bestand. Dies zeigte sich z.B. an unterschiedlich langen Nachbeobachtungszeiten. 5.8.4.2 Abb.23 Kaplan-Meier-Kurve Ki-67<2 % Ki-67> 2% 72 25 (26) 36 (46) Mediane Überlebenszeit nb 36 Monate 95% KI nb 13-57 Monate Mittl. Nachbeobachtungszeit 82 Monate 29 Monate Überlebende am Ende der Beobachtung 76% (19/25) 36% (13/36) Tab.21 Die Gruppen Ki-67=2-29% und Ki-67> 29% mit ähnlichen Nachbeobachtungszeiten wurden in einer Gruppe (36 Patienten) zusammengefasst und gegen die verbleibende Gruppe mit Ki-67 <2% (25 Patienten) verglichen. Im Logrank-Test konnte gezeigt werden, dass zwischen diesen beiden 52 Gruppen ein signifikanter Unterschied bestand (p=0.0008). Dies bedeutet ein signifikant schlechteres Überleben für Patienten mit Tumoren mit einem Ki-67-Index von > 2%. 5.8.4.3 Ob das schlechte Überleben von Patienten mit Kolon-NET mit ihrem erhöhten Ki-67-Index in Zusammenhang gebracht werden kann, ließ sich statistisch nicht bestätigen, da Kolon-NET hauptsächlich Tumoren in Gruppe 3 (Ki-67 >29%) aufwiesen (p=0.1500). 5.8.5 Prognose (multivariate Analyse) Die unter 5.8.1 bis 5.8.4 untersuchten Faktoren für das Überleben von Patienten mit NET wurden nun unter der Fragestellung verglichen, welcher von ihnen mit dem Überleben der Patienten signifikant korrelierte. Es zeigte sich, dass der Ki-67-Index am zuverlässigsten das Überleben bei NET voraussagen konnte (Cox- Regression, Likelihood ratio: p=0.0004). Die Hazard Ratio mit 2.3 für den Ki-67-Index zeigte zusätzlich, dass Patienten mit Tumoren aus der höheren Ki-67-IndexGruppe (>29%) nach 1 Jahr Überleben eine deutlich schlechtere Prognose haben. 5.9 Korrelation CIMP-positiver Status und Ki-67-Index bei Kolon-NET und Fore- und Midgut-NET Korrelation CIMP/Ki67 1,00 CIMP+ in Prozent 1,00 0,65 0,80 0,50 0,60 0,43 0,40 0,20 0,00 0,00 0,00 Ki67<2% 2%<Ki67< 29% Ki67> 29 % Ki67 Kategorie Kolon NET CIMP+ Fore/Midgut NET CIMP+ Abb.24 CIMP positiv bei: Ki-67<2% Ki-67=2-29% Ki-67>29% Kolon-NET 0% (0/2) 100% (3/3) 65% (17/26) F/MidgutNET 50% (12/24) 43% (6/14) 0% (0/0) Tab.22 Es zeigte sich, dass in der zusammengefassten Gruppe der NET keine signifikante Korrelation zwischen CIMP-und Ki-67-Status bestand (Mantel-Haenszel-Test p=0.1664 und Cochran-MantelHaenszel-Test p=0.6764). Einzeln betrachtet ergab sich weder für die Kolon-NET noch für die 53 Fore-und Midgut-NET eine Korrelation zwischen dem CIMP-Status und Ki-67-Index. Bei den Fore-und Midgut-NET bestand ein Trend dahingehend, dass bei niedrigerem Ki-67-Index vermehrt CIMP-positive Tumoren vorhanden waren (s.Tab.22). Dies konnte aber aufgrund des Fehlens von Fore-und Midgut-NET mit einem Ki-67-Index >29% nicht auf Signifikanz untersucht werden. Betrachtete man nur die Gruppe der CIMP-positiven Kolon-NET, so ließ sich ein Trend beschreiben, der vor allem CIMP-positive Tumoren bei Ki-67-Index >29% aufwies (85%, 17/20): CIMP-positiv Tab.23 Ki-67 <2% Ki-67=2-29% Ki-67>29% Gesamt 0% (0/20) 15% (3/20) 85% (17/20) 100%(20) 54 55 6 Diskussion In einer vorangegangenen Studie wurde an gut differenzierten Fore-und Midgut-NET die Beteiligung von genetischen und epigenetischen Veränderungen an der molekularen Pathogenese untersucht [13]. Dort wurde gezeigt, dass die Promotormethylierung ein häufiges Ereignis ist, und für GEP-NET wurde ein bestimmtes Methylierungsprofil beschrieben. Bemerkenswert war, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen den Methylierungsprofilen verschiedener Tumorsubgruppen gab. Neben genetischen Veränderungen schien CIMP eine wichtige Rolle in der Tumorpathogenese dieser Fore-und Midgut-NET zu spielen. Dies führte zu der Annahme, dass CIMP auch bei der Pathogenese der Kolon-NET beteiligt ist, so wie es bereits für sporadische CRC gezeigt wurde. In dieser Untersuchung wurden charakteristische molekulare Veränderungen von gut und schlecht differenzierten NET in unterschiedlicher anatomischer Lage direkt miteinander verglichen. Es konnten bezüglich der molekularen Veränderungen Unterschiede zwischen sporadischen CRC, gut differenzierten NET des Fore-und Midgut und schlecht differenzierten NET des Kolon gezeigt werden, die die Wachstumscharakteristika und Proliferationsraten in beiden Tumorarten (CRC und NET) beeinflussen könnten. Außerdem wurde der Einfluss von verschiedenen Prädiktoren auf das Überleben von gut und schlecht differenzierten Tumoren gezeigt. Das histologische Grading hat nur eine begrenzte Aussagekraft für das Metastasierungsverhalten eines Tumors und das Überleben der Patienten [112]. Der Ki-67-Index ist schon seit längerem bekannt dafür, dies als zuverlässiger Prädiktor für das Überleben bei verschiedenen malignen Neoplasien zu ergänzen [26,112,123,142,143], wobei er bei aggressiven, proliferierenden und metastasierenden Tumoren erhöht ist. Bisher sind nur wenige Überlebens-Studien für NET durchgeführt worden. Die meisten fanden den Ki-67-Proliferationsindex als den vorrangigen Prädiktor für das Überleben [4,14,137,145]. Verschiedene molekulare Ereignisse sind in NET beschrieben worden, dazu gehören die genetischen und epigenetischen Veränderungen von p53, BAX, p16INK4a/CDKN2A, BRAF, bcl-2, PTEN, DPC4/Smad4, p27 [4,13,67,69,105,112,124,144, 153,154,160,125-127,172], Allelverluste [56] oder die unterschiedliche Expression von Nuclear Survivin und anderen Proteinen [66,68]. Die meisten dieser Ereignisse standen nicht im Zusammenhang mit dem Überleben der Patienten oder der Aggressivität der Tumoren. Die Survival-Analyse dieser Studie ergab, dass Patienten mit NET mit einem Ki-67-Index > 2% ein signifikant schlechteres Überleben zeigten (p=0.0008). Bei den hier untersuchten Kolon-NET war ein eindeutiger Trend zu den höheren Ki-67-Werten (Ki-67>29%) zu verzeichnen, wobei umgekehrt die gut differenzierten Fore-und Midgut-NET eher niedrige Ki-67-Werte aufwiesen (Ki67<2%) (p<0.0001; 5.7.6). Abschließend zeigte sich in der multivariaten Analyse (5.8.5), dass sich 56 der Ki-67-Index als prognostischer Faktor für NET hervorheben konnte. Hingegen ließ sich das schlechte Überleben von Patienten mit Kolon-NET nicht direkt mit ihrem erhöhten Ki-67-Index in Zusammenhang bringen, aber die Anzahl schlecht differenzierter Hindgut-Tumoren mit einem niedrigen Ki-67-Index war gering. Dies müsste an einer größeren Anzahl von Kolon-NET nochmals überprüft werden. Eine aktuelle Studie belegte [Grabowski 2008, zur Publikation eingereicht], dass auch die Aufrechterhaltung einer p27-Expression ein Prädiktor für längeres Überleben bei manchen Patienten [78] war. Hier spielte der Verlust des Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitors p27 eine entscheidende Rolle für die Aggressivität von GEP-NET. Das wird dadurch erklärt, dass in diesen Tumoren durch den Mangel an Inhibition des Cyclin E eine erhöhte Progression des Zellzyklus und eine verstärkte Proliferation stattfindet. Patienten, bei denen weiterhin p27 exprimiert wurde, hatten ein signifikant besseres Überleben in dieser Studie. Weitere Prädiktoren für das Überleben sind die histologische Differenzierung und das Vorliegen von Malignität (Infiltration des Tumors in das umliegende Gewebe) [92]. Die Aggressivität der Kolon-NET könnte mit der schlechten Differenzierung der Tumoren aufgrund des Verlusts der p27-Expression und des häufigen Allelverlusts [137,124,56,78] zusammenhängen. Tumoren mit häufigen Allelverlusten weisen ein aggressiveres Wachstum auf, sind schlechter differenziert [56,100,160], korrelieren mit einem höheren Proliferationsindex und schlechterem Überleben [160,137,56,109]. LOH kommt oft bei GEP-NET vor [99,154,160]. Die im Vergleich recht häufigen (nicht signifikanten) Allelverluste bei Kolon-NET (37%, 10/27) gegenüber den gut differenzierten Fore-und Midgut-NET (12.5%, 3/24) deuten auf das instabile Genom und das aggressivere Verhalten dieser Tumorgruppe hin [56,150]. Jedoch wiesen die Kolon-NET keine hohen LOH-Raten wie andere Tumoren des Hindgut (CRC) auf (50% [99]), und LOH war kein Prädiktor für schlechteres Überleben trotz kürzerer Nachbeobachtungszeiten (27 Monate vs. 56 Monate) für Patienten mit LOH-positiven Tumoren. Bei Kolon-NET kamen vor allem hohe Allelverluste am MEN1-Gen vor. Die noch relativ häufigen Allelverluste am APC und p53-Lokus mit jeweils 11% (3/27) wiesen auf die Herkunft der Kolon-NET aus dem Hindgut hin, da diese Gene auch beim CRC durch Allelverlust ausgeschaltet sind [9]. Der Allelverlust von hMSH2 mit 4% (1/27) bestätigt den geringen Einfluss, den die MSI auf die Pathogenese von Kolon-NET hat. Auch war kein LOHTumor MSI-H. Die Bedeutung der Inaktivierung des MEN1-Gens ist ungeklärt. Früher wurden Alterationen an MEN1 vor allem im Foregut [124,135,136] und vorzugsweise durch Mutation beschrieben [64,158]. Bei den Kolon-NET wies der MEN1-Lokus die häufigsten Allelverluste auf (26%, 7/27) und war signifikant häufiger als in den Fore-und Midgut-NET methyliert (48%, 15/31 vs. 21%, 7/33; 57 p= 0.0430). Auch korrelierte eine MEN1-Methylierung mit CIMP-positiven NET (p=0.0056). In vorangegangenen Studien an gut differenzierten Fore-und Midgut-NET war eine MEN1Methylierung kaum [13] oder gar nicht [30] aufgefallen, zudem zeigte sich kein Zusammenhang zwischen Promotormethylierung und Expressionsverlust [13]. Das bedeutet zum einen, dass die Stilllegung des MEN1-Gens allgemein für die Pathogenese von GEP-NET wichtig ist, wie in [64] bereits berichtet, zum anderen, dass seine genaue Funktion in der Pathogenese von NET unterschiedlicher Lokalisation noch erforscht werden muss. Trotz unterschiedlicher Methylierungsraten der untersuchten Gene beeinflussten diese nicht das Überleben in den zugehörigen Tumorgruppen: Das Tumorsuppressorgen HIC1 ist dem Tumorsuppressor p53 direkt vorgeschaltet, der für die Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität der Zelle verantwortlich ist, und erhöht dessen Aktivität [33]. Entsprechend geht eine Inaktivierung von HIC1 mit maligner Progression eines Tumors [71] und einem schlechteren Überleben [33] einher. HIC1 wird in verschiedenen Tumoren häufig methyliert vorgefunden [129] wie auch in Fore-und Midgut-NET ([13] und in dieser Arbeit: 84%, 21/25) und den hier untersuchten Kolon-NET (59%, 16/27). Das methylierte HIC1-Gen scheint eine zentrale Rolle bei den schlecht differenzierten Kolon-NET einzunehmen. TIMP3, ein Tumorsuppressorgen, das im Rahmen von Tumorausbreitung und Metastasierung [2,18,29,172] methyliert vorliegt, war bei den bisher untersuchten gut differenzierten GEP-NET nicht inaktiviert ([13], hier untersuchte Fore-und Midgut-NET 0/33). Bei den Kolon-NET zeigte sich erstmals eine geringfügige Methylierung (9%, 3/32), die sich in das Bild der schlecht differenzierten Kolon-NET einfügt, die meist schon metastasiert sind. Der cyclinabhängige Kinase-Inhibitor p16 ist ein bedeutendes Tumorsuppressorgen in GEP-NET, von dem eine hohe Inaktivierung bekannt ist, sei es durch Methylierung in NET (30%[30], 52%[159], PET: 10%[30], 40%[80]), sei es durch Allelverlust [105,113,147]. Die hier gefundene Methylierung bei den Kolon-NET von 27% (8/30) wiederum zeugt von einer Ausschaltung von p16 gerade in schlechter differenzierten Tumoren [147], die gegenüber den hier untersuchten Fore-und Midgut-NET signifikant war (0%; p=0.0090). Zudem ist von der p16-Methylierung bekannt, dass sie mit schlechteren Patientenüberleben korreliert [80] und vor allem in CIMP-positiven CRC auftritt [161], ähnlich wie hier bei den Kolon-NET, so dass größere Studien nötig sind, um die Rolle von p16 in NET gründlich aufzuklären. Eine so häufige Methylierung des DNA-Reparaturgens MGMT, das mutagene oder zytotoxische Alkyl-Gruppen von der O6- Position des Guanins entfernt [121], wie bei den Kolon-NET (42%, 13/31) war bisher nicht in GEP-NET bekannt ([13], hier untersuchte Fore-und Midgut-NET: 27%), sondern schien eher bei Kolonkarzinomen, Lungen-und Hirntumoren von Bedeutung zu sein [13,43]. Dass es in Geweben mit MGMT-Methylierung häufig zu p53- und k-ras-Mutationen (G:C 58 zu A:T-Transitionen) [45,46,118,177] kommt und dass Tumoren mit MGMT-Methylierung eine schlechtere Prognose haben, da sie häufig Chemotherapeutika-resistent sind [106,122], passt zum malignen Verhalten der Kolon-NET. Dass das APC-Gen als dritthäufigstes in Kolon-NET methyliert war (46%, 15/33), bestätigt seine Rolle bei der Entstehung gastrointestinaler Tumoren [11,47] und GEP-NET [13,55]. Unter der Annahme, dass die Methylierung von APC gerade im Hindgut höher ausfallen müsste, bedingt durch eine zentrale Inaktivierung von APC wie bei den CRC [48,135], bleibt es unklar, warum die Methylierung des APC-Gens bei den Fore-und Midgut-NET häufiger auftrat (64%, 23/36), und müsste weiter erforscht werden. Das RASSF1A-Gen, das häufig in verschiedenen Neoplasien [37] wie auch in Fore-und MidgutNET [13,80,102,36] durch epigenetische Inaktivierung ausgeschaltet ist, zeigte eine relativ häufige Methylierung bei den Kolon-NET (45%, 13/29) und korrelierte mit einem CIMP-positiven Status des Tumors (p=0.0159). Bisher war das Vorkommen einer RASSF1A-Methylierung im Hindgut [130] fraglich. Da auch die Fore-und Midgut-NET dieser Arbeit (67%, 20/30, p=0.1536) eine hohe Methylierung aufwiesen, konnte die Bedeutung des Ras-Signalwegs in der Pathogenese von GEPNET wiederum gezeigt werden, MSI und hMLH1-Methylierung sind kaum in NET bekannt [13,89,58]. Dies bestätigten die geringen Funde von MSI (4% bzw. 0%) und hMLH1-Methylierung (12.5% bzw. 47%, p= 0.0046) sowohl bei den Kolon-NET als auch bei den Fore-und Midgut-NET. Die hohe hMLH1Methylierung bei Fore-und Midgut-NET scheint jedoch keine MSI zu verursachen. Patienten mit MSI–Tumoren weisen ein besseres Überleben auf, beide Eigenschaften treffen nicht für Kolon-NET zu [88,132,166,167,170]. Inwieweit die hohen Methylierungsraten von hMLH1 bei den gut differenzierten Fore-und Midgut-NET mit einer besseren Prognose zusammenhängen, wie in [79] und 5.7.5.2 gefunden, konnte nicht eindeutig geklärt werden, zumal die Fore-und Midgut-NET keine MSI aufwiesen. Die hMLH1-Methylierung ohne darauffolgende MSI bei Kolon-NET könnte im Zuge der höheren allgemeinen Methylierung bei schlechterer Differenzierung erklärt werden [117]. Es bleibt weiter zu erforschen, wie alle diese Gene das Tumorwachstum und/oder die Tumorprogression in sporadischen NET beeinflussen. Kürzlich wurde eine neue TNM-Klassifikation für GEP-NET vorgeschlagen [138,139]. Weitere Studien werden klären, ob diese Klassifikation einen neuen Überlebens-Prädiktor präsentiert, und werden die bekannten Prädiktoren ergänzen. Die hohe Anzahl CIMP-positiver Tumoren bei den Kolon-NET (64.5%, 20/31) zeigte, dass CIMP auch bei GEP-NET des Hindgut von Bedeutung für die Pathogenese ist, wie dies in einer vorangegangenen Studie für gut differenzierte GEP-NET des Fore-und Midgut gefunden wurde (73% [13]). Die hohe Anzahl CIMP-positiver Kolon-NET mag auch Ausdruck der schlechteren 59 Differenzierung sein, da mit Tumorprogression auch die Methylierung von Genen zunimmt (z.B. bei Magen-Karzinom)[117]. In der vorangegangenen Studie an gut differenzierten Fore-und Midgut hatten CIMP-negative Tumoren ein besseres Überleben als CIMP-positive Tumoren [13]. Es wurde dort kein anderer prognostischer Marker gefunden. In der aktuellen Untersuchung beeinflusste CIMP trotz längerer Nachbeobachtungszeiten für CIMP-negative Tumoren (59 Monate vs. 45 Monate) und mehr überlebenden Patienten am Ende der Nachbeobachtungszeit (61% vs. 40%) das Überleben weder in gut noch in schlecht differenzierten NET. Diese gegensätzlichen Aussagen müssen in Zukunft geklärt werden und könnten aufgrund der geringen Anzahl der untersuchten Tumoren zustande gekommen sein. Jedoch bestand der Trend CIMP-positiver Kolon-NET zu hohen Ki-67-Werten (>29%), aber es zeigte sich keine signifikante Korrelation zwischen CIMP-positiven NET und höheren Ki-67-Werten, wie in [13] (Ki-67>10%) festgestellt. Abgesehen von dem seltenen Vorkommen schlecht differenzierter Kolon-NET gegenüber sporadischen CRC, scheint die molekulare Pathogenese beider Tumorarten unterschiedlich zu sein, obwohl sie bezüglich ihres Wachstums einige Ähnlichkeiten zeigen. Anders als bei den CRC kommt MSI bei schlecht differenzierten Kolon-NET selten vor. MSI war auch ein seltenes Ereignis bei den NET unterschiedlicher Lokalisationen [13,59,89]. Kolon-NET, die MSS waren, waren am häufigsten CIMP-positiv (76%, 13/17) und unterschieden sich zusammen mit den MSI-L-Kolon-NET signifikant von den MSS-CRC (26%, 24/94) bezüglich des CIMP-Status (p=0.0272). Umgekehrt waren hochgradig mikrosatelliteninstabile CRC sehr stark CIMP-positiv (77%, 10/13). Schlecht differenzierte GEP-NET des Hindgut werden also,wenn überhaupt, nicht durch einen Methylierungsphänotyp mikrosatelliteninstabil, wie dies bei den CRC durch die Methylierung von hMLH1 bekannt ist [62,161,162]. CIMP kam häufig vor, sowohl bei sporadischen CRC als auch bei schlecht differenzierten KolonNET, aber entsprechend der unterschiedlichen molekularen Pathogenese sind entscheidende Gene unterschiedlich methyliert [13,30,61,62,81]. Diese Arbeit zeigte erstmals den Methylierungsstatus von tumorassoziierten Genen an einer relevanten Anzahl von schlecht differenzierten Kolon-NET. Sporadische CRC und schlecht differenzierte NET des Kolon und Rektum unterscheiden sich also in ihrer Tumorpathogenese trotz des Auftretens von CIMP bei beiden. Bis nicht weitere Studien durchgeführt werden, die direkt die Methylierungsmuster von Kolon-NET mit denen des sporadischen CRC vergleichen, bleibt es unsicher, ob CIMP ein erworbener Defekt mit primärer Ätiologie ist oder ob dieses abnormale Muster der Promotormethylierung ein zufälliger Prozess ist, nach dem Tumorzellen selektiert werden. MSI kommt normalerweise nur in sporadischen CRC vor und zeigte sich nicht in GEP-NET unterschiedlicher Lokalisation und Differenzierung. Entsprechend ihrer schlechten Differenzierung hatten Kolon-NET ein schlechteres Überleben als 60 gut differenzierte Fore-und Midgut-NET. Prädiktor eines schlechten Überlebens war in dieser Arbeit ein hoher Ki-67-Proliferationsindex. 61 7 Zusammenfassung Kolon-NET sind seltene und bisher wenig erforschte Neoplasien, die sich durch schnelles Tumorwachstum und schlechte Differenzierung auszeichnen. Hier wurden sie erstmals in einer relevanten Anzahl auf ihre genetischen und epigenetischen Charakteristika untersucht und mit vorliegenden Daten aus CRC und gut differenzierten Fore-und Midgut-NET verglichen. Zudem wurde eine Survival-Analyse für NET erstellt. MSI schien trotz der Lokalisation im Kolon und einer relativ häufigen hMLH1-Methylierung nur eine geringfügige Rolle in der Pathogenese von Kolon-NET zu spielen. Die LOH-Analyse an MEN1, APC, p53 und hMSH2 ergab, dass LOH in der Pathogenese von Kolon-NET von größerer Bedeutung ist als in Fore-und Midgut- NET, was entweder mit ihrer schlechten Differenzierung oder der Lokalisation im Hindgut zusammenhing. Vor allem das MEN1-Gen hob sich durch häufige Allelverluste hervor (26%). Alle mittels MSP untersuchten Gene waren methyliert und zeigten im Fall von MEN1 und p16 eine signifikant häufigere Methylierung bei Kolon-NET, so wie HIC1 und hMLH1 eine signifikant häufigere Methylierung bei Fore-und Midgut-NET aufwiesen. Insgesamt waren HIC1, MEN1 und APC am häufigsten bei Kolon-NET methyliert, bei Fore-und Midgut-NET waren es HIC1, RASSF1A und APC. Über die p16-Inaktivierung bestehen uneinheitliche Voruntersuchungen: das in Kolon-NET gehäufte Auftreten spiegelte sich in dem schlechten Überleben der Tumorgruppe wieder. Der häufige Ausfall des MEN1-Gens gerade im Hindgut, sowohl durch LOH als auch durch Methylierung, zeigte dessen allgemeine Bedeutung für die Pathogenese von GEP-NET. Zudem gab es eine Korrelation zwischen MEN1-Methylierung und CIMP. CIMP wurde insgesamt zu 65% bei Kolon-NET festgestellt und trat besonders bei den MSS-Kolon-NET (76%) auf, worin sie sich von den MSS-CRC (26%) signifikant unterschieden. MSI-CRC (77%) wiesen häufig CIMP auf, was den bereits bekannten Zusammenhang zwischen Methylierung von hMLH1 und MSI bestätigte. Diesen gab es anscheinend für Kolon-NET nicht in einer relevanten Größe. Letztlich konnte CIMP doch nicht als prognostischer Faktor für NET dienen, wie früher erwiesen. Diese Position nahm der hier ebenfalls untersuchte Proliferationsindex Ki-67 ein: ein Wert >2% korrelierte signifikant mit schlechterem Überleben in der Gesamtgruppe der NET, für Kolon-NET konnte aufgrund der geringen Tumorzahl nur ein Trend beschrieben werden, der bei Tumoren mit hohen Ki-67-Werten ein schlechteres Überleben vermuten ließ. Kolon-NET sind also durch schwerwiegende Pathomechanismen wie häufige LOH-Ereignisse und Methylierungen (CIMP), hohe Ki-67-Werte und eine schlechte Prognose charakterisiert. Sie unterscheiden sich deutlich von den CRC trotz des Auftretens von CIMP in beiden Entitäten. In Bezug auf die Fore-und Midgut-NET unterscheiden sie sich durch hohe Ki-67-Werte und unterschiedliche Methylierungsmuster. Letztere müssten in weiteren Studien für Kolon-NET untersucht werden, um systematische Veränderungen zu erkennen. 62 63 8 Literaturverzeichnis 1. 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A Kolon-NET A1 Nummer 1 cc 2 cc 3 cc 4 cc 5 cc 6 cc 7 cc 8 cc 9 cc 10 cc 11 cc 12 cc 13 cc 14 cc 15 cc 16 cc 18 cc 19 cc 20 cc 12T 13T 14T 15T 16T Jr.Nummer 1 2 3 4 5 6 7 SG 6954 K 130/05 K 13/05 K 8/05 K 47/04 K 46/04 K 135/03 K 121/03 K 19/02 K 168/85 K 135/84 03 16982 A-C 6079/88 6800/91 7012/85 10793/88 12596/94 p16 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 HIC 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 APC 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 hMLH1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 RASSF1A 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 MEN 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 TIMP3 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 MGMT 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 CIMP CIMP CIMP N low CIMP N N CIMP CIMP CIMP low CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP low CIMP low low CIMP CIMP CIMP CIMP No of Met.Loc 3 4 0 1 3 0 0 3 3 3 2 4 4 3 3 3 1 4 1 2 4 4 3 6 78 Nummer 17T 18T 19T 20T 21 cc 22 cc 23 cc 24 cc 25 cc 26 cc Jr.Nummer S 298/86 8000/95 11197/93 5389/96 undiff SG 10292/96 SG 1338/98 SG 28624/00 SG 18231/01 SG 23036/01 SG 29098/03 p16 1 0 1 1 1 0 0 0 0 HIC 1 1 1 0 1 1 0 Tab. A1: MSP-Analyse der Kolon-NET APC 0 1 0 0 1 0 0 1 0 hMLH1 1 0 0 0 0 0 1 1 RASSF1A 1 1 0 0 0 1 0 MEN 1 0 1 0 0 0 1 0 TIMP3 0 0 0 0 0 0 1 0 MGMT 0 0 0 1 0 0 1 1 CIMP CIMP na CIMP low CIMP N na na CIMP low No of Met.Loc 4 1 4 1 4 0 0 0 7 2 79 A2 Nummer 1 cc 2 cc 3 cc 4 cc 5 cc 6 cc 7 cc 8 cc 9 cc 10 cc 11 cc 12 cc 13 cc 14 cc 15 cc 16 cc 18 cc 19 cc 20 cc 12T 13T 14T 15T 16T 17T 18T 19T 20T Jr.Nummer 1 2 3 4 5 6 7 SG 6954 K 130/05 K 13/05 K 8/05 K 47/04 K 46/04 K 135/03 K 121/03 K 19/02 K 168/85 K 135/84 03 16982 A-C 6079/88 6800/91 7012/85 10793/88 12596/94 S 298/86 8000/95 11197/93 5389/96 undiff MSI low stable low stable low stable low low stable stable high stable stable stable stable stable stable stable stable stable stable stable LOH Ki-67 (%) follow-up (months) Gender Age Location 0 65 0 70 85 90 0 50 0 60 LOH 80 0 60 99 m 74 C.asc. LOH 50 m 71 0 50 15 m 67 0 40 18 w 77 LOH 5 27 w 54 50 8 LOH w 62 LOH 3 8 m 53 MSI 80 2 w 57 0 50 w 70 0 <2 m 70 LOH 20 0 50 40 w 60 LOH 90 8 w 81 0 50 13 m 69 LOH 90 57 m 49 LOH 30 19 m 32 0 50 13 m 29 0 60 0 w 63 0 50 7 m 57 0 50 14 m 32 0 <2 6 m 55 - Histologie schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert 80 Nummer 21 cc 22 cc 23 cc 24 cc 25 cc 26 cc Jr.Nummer SG 10292/96 SG 1338/98 SG 28624/00 SG 18231/01 SG 23036/01 SG 29098/03 MSI LOH Ki-67 (%) follow-up (months) Gender Age Location 75 2 m 64 Colon stable 75 1 w 92 Colon stable stable 85 68 w 58 Colon 45 62 m 54 Colon LOH 45 46 w 85 Colon 65 38 m 56 Rektumpolyp Histologie schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert schlecht differenziert Tab. A2: MSI- und LOH-Analyse, Ki67-Marker und Patientendaten Tab. B Fore- und Midgut-NET B1 Jr. Nummer 26/2001 9020/2000 7078/1998 7008/1998 6107/1997 6015/1997 5084/1996 7029/1998 1088/1992 348/1991 10132/1990 10079/1990 10072/1990 16939/88 2761/88 9056/95 3976/96 894/97 2899/98 7069/1998 Organ Pankreas Lebermetastase Magen Pankreas Niere Leber Papille LK, Lebermet. Pankreas Duodenum Dünndarm Pankreas Dünndarm Pankreas-schwanz Lig hepduod Pankreas Pankreas-schwanz Leber Pankreas LK diagnosis glucagonoma Vipoma gastrinoma non functional non functional gastrinoma non functional insulinoma non functional non functional non functional gastrinoma non functional insulinoma Gastrinom Met. insulinoma Vipoma gastrinoma insulinoma non functional CIMP + + + + + + + + + + behavior malignant malignant benign benign benign malignant malignant malignant malignant malignant malignant benign benign benign benign benign benign benign malignant malignant ki-67 >20 2-10 2-10 2-10 <2 <2 >20 <2 >10 <2 >20 2-10 <2 <2 <2 <2 10-20 <2 2-10 follow up (years) <1 >4 >4 >6 >7 <1 <1 1 1 1 1 3 3 16 16 >5 >8 >5 1 <10% 3 cause of death tu survived survived survived survived tu tu tu tu tu tu tu tu survived survived survived survived survived tu tu BAT25 BAT26 - - - - D2S123 D5S346 LOH - - - - na - - MSI - - - - - - - - - - LOH - - MSI na na - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 81 Jr. Nummer Organ 6128/1997 Ileum 6135/1997 LK 6109/1997 Ileum 5008/1996 Ileum 2105/1993 Duodenum 2047/1993 Duodenum 1153/1992 Appendix 348/1991 Duodenum 10132/1990 Dünndarm 10083/1990 Dünndarm 10082/1990 Dünndarm 10076/1990 Ileum 10075/1990 Ileum 10072/1990 Dünndarm 9988/1990 Lebermet. 9534/1990 Lebermet. 9525/1990 Lebermet. 9479/1990 Ileum diagnosis non functional non functional carcinoid syndrome carcinoid syndrome carcinoid syndrome non functional non functional non functional non functional non functional non functional carcinoid syndrome carcinoid syndrome non functional carcinoid syndrome carcinoid syndrome non functional carcinoid syndrome CIMP + + + + + + + + - behavior benign benign benign benign benign benign benign benign malignant malignant malignant benign benign benign benign benign benign benign ki-67 <2% follow up (years) 7 <2% 7 <2% <2% <2% <2% <2% <2% 2-30% 2-30% 2-30% <2% <2% <2% <2% <2% <2% <2% 7 6 6 7 10 8 3 3 2 10 10 9 3 5 8 12 Tab. B1: Fore-und Midgut-NET Überlebensdaten, Ki67-Marker, MSI-Marker cause of death survived survived survived survived survived survived survived survived tu tu tu survived survived survived tu survived survived survived BAT25 BAT26 D2S123 D5S346 - - - na - - - - - na - - - - - na - - - - MSI na - - - - na - na - - - - - - - - MSI - - - - - - - - 82 B2 Jr. Nummer 26/2001 9020/2000 7078/1998 7008/1998 6107/1997 6015/1997 5084/1996 7029/1998 1088/1992 348/1991 10132/1990 10079/1990 10072/1990 16939/88 2761/88 9056/95 3976/96 894/97 2899/98 Organ Pankreas Lebermetastase Magen Pankreas Niere Leber Papille LK, Lebermet. Pankreas Duodenum Dünndarm Pankreas Dünndarm Pankreasschwanz Lig hepduod Pankreas Pankreasschwanz Leber Pankreas 7069/1998 LK 6128/1997 Ileum 6135/1997 LK 6109/1997 Ileum 5008/1996 Ileum 2105/1993 Duodenum 2047/1993 Duodenum 1153/1992 Appendix 348/1991 Duodenum 10132/1990 Dünndarm 10083/1990 Dünndarm diagnosis glucagonoma Vipoma gastrinoma non functional non functional gastrinoma non functional insulinoma non functional non functional non functional gastrinoma non functional insulinoma Gastrinom Met. insulinoma Vipoma gastrinoma insulinoma non functional non functional non functional carcinoid syndrome carcinoid syndrome carcinoid syndrome non functional non functional non functional non functional non functional D17S250 - MSS MSI-L + + + + + MSI-H D11S956 D11S913 PYGM na N N na N N N N N na N N N N N N N N N na N N N N N N N na N N N N N N N na na na na na na na na na na N N N N N N N + - + + + + - LOH - + + + + + + + + + + + + + + + + + + na N + + 83 Jr. Nummer Organ 10082/1990 Dünndarm 10076/1990 Ileum 10075/1990 Ileum 10072/1990 Dünndarm 9988/1990 Lebermet. 9534/1990 Lebermet. 9525/1990 Lebermet. 9479/1990 Ileum diagnosis non functional carcinoid syndrome carcinoid syndrome non functional carcinoid syndrome carcinoid syndrome non functional carcinoid syndrome Tab.B2: Fore-und Midgut-NET MSI- und LOH-Marker D17S250 LOH - MSS MSI-L + + + MSI-H D11S956 D11S913 na na na PYGM N N N na na na N N N + _ + + + + na na 84 B3 Jr. Nummer 26/2001 9020/2000 7078/1998 7008/1998 6107/1997 6015/1997 5084/1996 7029/1998 1088/1992 348/1991 10132/1990 10079/1990 10072/1990 16939/88 2761/88 9056/95 3976/96 894/97 2899/98 Organ Pankreas Lebermetastase Magen Pankreas Niere Leber Papille LK,Lebermet. Pankreas Duodenum Dünndarm Pankreas Dünndarm Pankreas-schwanz Lig hepduod Pankreas Pankreas-schwanz Leber Pankreas 7069/1998 LK 6128/1997 Ileum 6135/1997 LK 6109/1997 Ileum 5008/1996 Ileum 2105/1993 Duodenum 2047/1993 Duodenum 1153/1992 Appendix 348/1991 Duodenum 10132/1990 Dünndarm 10083/1990 Dünndarm diagnosis glucagonoma Vipoma gastrinoma non functional non functional gastrinoma non functional insulinoma non functional non functional non functional gastrinoma non functional insulinoma Gastrinom Met. insulinoma Vipoma gastrinoma insulinoma non functional non functional non functional carcinoid syndrome carcinoid syndrome carcinoid syndrome non functional non functional non functional non functional non functional hMLH1 Region C u u u m u m p16 u m u m u m m u u m m na 2x m u u u u u u u u u u na 2x na 2x u na 2x na u u u na u u u u u u u u u u u u u u m m u u u u u na 2x APC MGMT m m m m m u m u u u m u m m na 2x m m u u m u u u u u na u m u u na u m na na m m na m m u u u m m m u m m m u m u m u u u u u na MEN1 Prom. MEN1 Exon2 u u u na u u na u u u na u m na na u u u u u u u u u u u u u u na na u na na u m na u u u u u m m u u u u u u u u u m u u na u u na HIC1 u/m na na m m m na na m m m na m na na u/m m na u m m u u m m u/m na m m m RASSF1a u/m na u u u/m m m m u/m u na m u/m u na u/m m na u/m m u/m u/m u u/m m na m u/m u na TIMP3 u u u u u u na u u u u u u u na u u na u u u u u u u u u u u u CIMP 3 1 1 3 3 3 2 3 2 2 2 2 6 1 0 5 6 0 3 4 2 4 1 4 2 2 3 4 2 2 85 Jr. Nummer Organ 10082/1990 Dünndarm 10076/1990 Ileum 10075/1990 Ileum 10072/1990 Dünndarm 9988/1990 Lebermet. 9534/1990 Lebermet. 9525/1990 Lebermet. 9479/1990 Ileum diagnosis non functional carcinoid syndrome carcinoid syndr non functional carcinoid syndrome carcinoid syndrome non functional carcinoid syndrome hMLH1 region C m m m m m m u na 2x p16 u u u u u na 2x na na APC MGMT m m u na u u u m u m m MEN1 Prom. u m u u na 2x Tab.B3: Fore- und Midgut-NET : MSP-Analyse und Häufigkeit der Methylierung (CIMP) u u u u m MEN1 Exon2 u m u u u u u u na m na HIC1 m u m na m na na na RASSF1a u u m na u/m u u na TIMP3 u u u u u u na na CIMP 3 3 3 1 6 1 2 1 86 Tab. C: CRC ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 3 0 1 1 1 1 1 4 1 1 0 1 1 1 5 1 1 0 1 1 1 6 0 1 1 1 0 1 7 0 1 1 1 1 0 8 0 1 1 0 1 1 9 1 1 0 0 1 1 10 0 1 0 1 1 1 11 0 0 1 1 1 1 12 0 1 0 1 1 1 13 0 0 1 1 1 0 14 0 0 1 1 0 1 15 0 1 0 1 1 0 16 0 1 0 1 1 0 17 0 1 0 0 1 1 18 0 1 0 0 1 1 19 0 0 1 1 1 0 20 0 1 0 1 1 0 21 0 0 0 1 1 1 22 1 0 1 0 1 0 23 0 1 0 1 1 0 24 0 0 1 0 1 0 25 0 1 0 0 1 0 26 0 0 1 0 1 0 27 0 0 0 0 1 1 28 0 1 0 1 0 0 29 0 0 0 0 1 1 CIMP or N CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP No of Met Loci 6 6 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 MSI Gender Age Location H F 76 P H . L F 67 P H . H . S M 35 L M 78 D L F 65 P H . L M 67 D S F 45 P H . S F 63 P H M 65 D L M 70 P S M 81 P S M 59 D S M 64 P L F 61 D S F 69 D S M 74 P H . S F 59 D L F 60 D S M 23 D S F 52 D S M 60 D S F 75 P S F 74 D Histology muc or poor Dukes Stage B wel B mod mod C A mod mod B A mod mod wel wel muc or poor mod mod mod wel C B A D C B C C B muc or poor wel mod mod mod muc or poor muc or poor D D B C B D D 87 ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 30 0 1 0 0 1 0 31 0 1 0 0 0 1 32 0 1 0 1 0 0 33 0 1 0 0 1 0 34 0 1 1 0 0 0 35 0 0 1 1 0 0 36 0 0 0 1 1 0 37 0 0 0 1 1 0 38 0 1 0 0 1 0 39 0 0 0 0 1 1 40 0 1 0 0 1 0 41 1 1 0 0 0 0 42 0 0 0 0 1 1 43 0 0 0 0 1 1 44 0 0 0 0 1 1 45 0 0 0 0 0 1 46 0 0 0 0 0 1 47 0 1 0 0 0 0 48 0 0 0 0 0 1 49 0 0 0 0 0 1 50 0 1 0 0 0 0 51 0 0 0 0 0 1 52 0 0 0 0 0 1 53 0 0 0 0 0 1 54 0 0 0 0 0 1 55 0 1 0 0 0 0 56 0 0 0 0 0 1 57 0 0 0 0 0 1 58 0 0 0 1 0 0 59 0 0 0 0 0 1 CIMP or N CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP CIMP N N N N N N N N N N N N N N N No of Met Loci 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MSI Gender Age Location S M 68 P S M 64 D S M 79 P L F 74 D S F 60 P L F 65 P S M 69 P L M 75 D S F 88 P S . S . H . S . S M 64 D H . S M 54 D S M 69 D S M 58 D S F 63 D S M 64 D S M 48 D L M 65 P L M 65 P L M 53 D L F 58 D S M 63 D S M 65 D L F 73 D S M 55 D L M 25 D Histology mod mod mod wel mod wel wel wel muc or poor Dukes Stage D D D C C A C C C wel C muc or poor mod mod mod mod mod mod mod mod mod mod mod mod mod mod D C D C C D B B C D B A B B B 88 ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 60 0 0 0 0 0 1 61 0 0 0 0 0 1 62 0 0 0 0 0 1 63 0 1 0 0 0 0 64 0 0 0 0 1 0 65 0 0 0 0 0 1 66 0 0 0 0 0 1 67 0 0 0 0 1 0 68 0 0 0 0 1 0 69 0 0 0 0 1 0 70 0 0 0 1 0 0 71 0 0 1 0 0 0 72 0 1 0 0 0 0 73 0 0 0 0 1 0 74 0 0 0 0 0 1 75 0 0 0 0 0 1 76 0 1 0 0 0 0 77 0 0 0 0 0 1 78 0 0 0 0 0 1 79 0 0 0 0 0 1 80 0 0 0 1 0 0 81 0 0 1 0 0 0 82 0 1 0 0 0 0 83 0 1 0 0 0 0 84 0 0 0 0 0 1 85 0 0 0 0 0 1 86 0 0 0 0 1 0 87 0 0 0 0 0 1 88 0 0 0 0 0 1 89 0 0 0 0 0 1 CIMP or N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N No of Met Loci 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MSI Gender Age Location S M 53 D S F 45 D H M 47 P S M 64 P S M 63 D S M 69 D S M 51 D S F 48 D L M 74 D S F 75 D L F 74 P S F 75 D S F 86 P S M 67 D S F 58 P S M 59 P S M 72 D S M 73 P S M 54 D S M 64 D L F 81 D L F 76 P S M 57 D S F 74 P L M 45 D S M 64 P S M 77 D L F 82 P H M 37 P H M 56 D Histology mod mod mod mod mod mod mod mod mod mod mod wel mod mod mod mod mod mod mod mod muc or poor mod mod mod mod mod wel wel mod mod Dukes Stage B D D C B C C D D C A A C B D D A A B C C C A C C B C A B A 89 ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 90 0 0 1 0 0 0 91 0 0 0 0 1 0 92 0 0 1 0 0 0 93 0 0 1 0 0 0 94 0 0 0 0 1 0 95 0 1 0 0 0 0 96 0 0 0 0 0 1 97 0 1 0 0 0 0 98 0 0 0 0 0 1 99 0 0 0 0 1 0 100 0 1 0 0 0 0 101 0 0 0 0 0 0 102 0 0 0 0 0 0 103 0 0 0 0 0 0 104 0 0 0 0 0 0 105 0 0 0 0 0 0 106 0 0 0 0 0 0 107 0 0 0 0 0 0 108 0 0 0 0 0 0 109 0 0 0 0 0 0 110 0 0 0 0 0 0 111 0 0 0 0 0 0 112 0 0 0 0 0 0 113 0 0 0 0 0 0 114 0 0 0 0 0 0 115 0 0 0 0 0 0 116 0 0 0 0 0 0 117 0 0 0 0 0 0 118 0 0 0 0 0 0 119 0 0 0 0 0 0 CIMP or N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N No of Met Loci 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MSI Gender Age Location L F 76 P S F 79 D S M 69 P L F 56 P S M 85 D S M 70 P L M 67 D S F 57 D L F 60 P L M 67 P S F 69 D L M 61 D S M 60 D L M 46 D L M 70 D L F 73 D L F 57 D L F 67 P S M 70 D S M 63 P S M 56 D S M 62 P S M 62 D S M 34 D S M 47 D L F 52 P S F 59 D S M 63 D S M 69 P L F 81 D Histology mod mod mod wel mod mod wel wel mod mod wel mod wel mod mod wel mod muc or poor mod mod mod mod mod wel mod mod mod mod mod mod Dukes Stage D B C A C B D C D A B D B B C A D D B C C A D A D B D B D A 90 ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 120 0 0 0 0 0 0 121 0 0 0 0 0 0 122 0 0 0 0 0 0 123 0 0 0 0 0 0 124 0 0 0 0 0 0 125 0 0 0 0 0 0 126 0 0 0 0 0 0 127 0 0 0 0 0 0 128 0 0 0 0 0 0 129 0 0 0 0 0 0 130 0 0 0 0 0 0 131 0 0 0 0 0 0 132 0 0 0 0 0 0 133 0 0 0 0 0 0 134 0 0 0 0 0 0 135 0 0 0 0 0 0 CIMP or N N N N N N N N N N N N N N N N N No of Met Loci 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MSI Gender Age Location S M 65 D S M 41 D L M 67 D S M 73 P S M 73 D S F 55 D S M 59 D S F 77 D S M 42 D L M 44 D L M 82 D S M 53 D S M 42 D L M 44 P S M 45 D S F 65 D Histology wel mod mod mod mod mod mod mod mod wel mod mod mod mod mod mod Tab. C: Kolorektale Karzinome: MSP-Analyse, CIMP-Status, MSI-Status, Patientendaten,Histologie und Dukes Stage Dukes Stage A D B D C B B B C A C D C C C A 91 ID No 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 MLH1 P16 P14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MINT1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MINT2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MINT31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 CIMP or N N N N N N N N N N N N N N N N No of Met Loci 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MSI S S L S S S L S S S S L L S S Gender M F F M M F M F F M M M F F M Age 62 56 60 68 71 70 66 61 85 43 72 55 54 63 73 Location D D D D D P D D D P D D P D D Histology mod mod mod mod mod mod wel mod mod muc or poor mod mod muc or poor mod mod Tab. C: Kolorektale Karzinome: MSP-Analyse, CIMP-Status, MSI-Status, Patientendaten,Histologie und Dukes Stage Dukes Stage D B C B C C A C C C B C C C B 92 Tab.I Kolon-NET Überlebensmonate % der Überlebenden % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (surv) (survival) (failure) 0.000 1.0000 0 0 0 23 0.000 0.9565 0.0435 0.0425 1 22 1.000 0.9130 0.0870 0.0588 2 21 2.000 * * * 3 20 2.000 0.8261 0.1739 0.0790 4 19 6.000 0.7826 0.2174 0.0860 5 18 7.000 0.7391 0.2609 0.0916 6 17 8.000 * * * 7 16 8.000 0.6522 0.3478 0.0993 8 15 8.000 * * * 8 14 13.000 * * * 9 13 13.000 0.5590 0.4410 0.1047 10 12 14.000 0.5124 0.4876 0.1058 11 11 15.000 * * * 11 10 18.000 * * * 11 9 19.000 0.4555 0.5445 0.1083 12 8 27.000 * * * 12 7 38.000 * * * 12 6 40.000 * * * 12 5 46.000 0.3644 0.6356 0.1189 13 4 57.000 0.2733 0.7267 0.1191 14 3 62.000 * * * 14 2 68.000 * * * 14 1 99.000 * * * 14 0 93 Fore- und Midgut-NET Überlebensmonate (surv) % der Überlebenden (survival) % der Verstorbenen (failure) Survival Standard Error Number failed Number left 0.000 1.000 0 0 0 38 12.000 * * * 1 37 12.000 * * * 2 36 12.000 * * * 3 35 12.000 * * * 4 34 12.000 * * * 5 33 12.000 * * * 6 32 12.000 * * * 7 31 12.000 0.7895 0.2105 0.0661 8 30 24.000 0.7632 0.2368 0.0690 9 29 36.000 * * * 10 28 36.000 * * * 11 27 36.000 * * * 12 26 36.000 * * * 13 25 36.000 * * * 14 24 36.000 0.6053 0.3947 0.0793 15 23 48.000 * * * 15 22 48.000 * * * 15 21 60.000 * * * 15 20 60.000 * * * 15 19 60.000 * * * 15 18 72.000 * * * 15 17 72.000 * * * 15 16 72.000 * * * 15 15 84.000 * * * 15 14 84.000 * * * 15 13 84.000 * * * 15 12 94 Überlebensmonate % der Überlebenden % der Verstorbenen Survival Standard Error Number failed Number left (surv) (survival) (failure) 84.000 * * * 15 11 84.000 * * * 15 10 96.000 * * * 15 9 96.000 * * * 15 8 96.000 * * * 15 7 108.000 * * * 15 6 120.000 * * * 15 5 120.000 * * * 15 4 120.000 * * * 15 3 144.000 * * * 15 2 192.000 * * * 15 1 192.000 * * * 15 0 Tab.I Fore- und Midgut-NET Tab.II LOH-negative Tumoren Überlebensmonate % der Überlebenden (survival) (surv) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (failure) 0.000 1.0000 0 0 0 25 0.000 0.9600 0.0400 0.0392 1 24 2.000 0.9200 0.0800 0.0543 2 23 6.000 0.8800 0.1200 0.0650 3 22 7.000 0.8400 0.1600 0.0733 4 21 12.000 * * * 5 20 12.000 0.7600 0.2400 0.0854 6 19 13.000 * * * 7 18 13.000 0.6800 0.3200 0.0933 8 17 95 Überlebensmonate % der Überlebenden (survival) (surv) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (failure) 14.000 0.6400 0.3600 0.0960 9 16 15.000 * * * 9 15 18.000 * * * 9 14 36.000 * * * 10 13 36.000 0.5486 0.4514 0.1018 11 12 40.000 * * * 11 11 48.000 * * * 11 10 60.000 * * * 11 9 60.000 * * * 11 8 84.000 * * * 11 7 96.000 * * * 11 6 96.000 * * * 11 5 99.000 * * * 11 4 120.000 * * * 11 3 120.000 * * * 11 2 192.000 * * * 11 1 192.000 * * * 11 0 Tab.II LOH-negative Tumoren 96 Tab.II LOH-positive Tumoren Überlebensmonate (surv) % der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number failed Number left 0.000 1.0000 0 0 0 9 8.000 * * * 1 8 8.000 0.7778 0.2222 0.1386 2 7 8.000 * * * 2 6 19.000 0.6481 0.3519 0.1653 3 5 24.000 0.5185 0.4815 0.1759 4 4 27.000 * * * 4 3 46.000 0.3457 0.6543 0.1835 5 2 48.000 * * * 5 1 57.000 0 1.0000 0 6 0 Tab. III CIMP- negative Tumoren Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number failed Number left (Failure) 0.000 1.0000 0 0 0 26 1.000 0.9615 0.0385 0.0377 1 25 6.000 0.9231 0.0769 0.0523 2 24 8.000 0.8846 0.1154 0.0627 3 23 12.000 * * * 4 22 12.000 * * * 5 21 12.000 * * * 6 20 12.000 0.7308 0.2692 0.0870 7 19 18.000 * * * 7 18 36.000 * * * 8 17 36.000 * * * 9 16 36.000 0.6090 0.3910 0.0968 10 15 97 Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number failed Number left (Failure) 38.000 * * * 10 14 40.000 * * * 10 13 48.000 * * * 10 12 48.000 * * * 10 11 60.000 * * * 10 10 60.000 * * * 10 9 72.000 * * * 10 8 84.000 * * * 10 7 84.000 * * * 10 6 84.000 * * * 10 5 96.000 * * * 10 4 108.000 * * * 10 3 144.000 * * * 10 2 192.000 * * * 10 1 192.000 * * * 10 0 CIMP-negative Tumoren Tab.III CIMP-positive Tumoren Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left 0.000 1.000 0 0 0 32 0.000 0.9688 0.0313 0.0308 1 31 2.000 * * * 2 30 2.000 0.9063 0.0938 0.0515 3 29 8.000 0.8750 0.1250 0.0585 4 28 8.000 * * * 4 27 12.000 * * * 5 26 12.000 * * * 6 25 98 Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (Failure) 12.000 * * * 7 24 12.000 0.7454 0.2546 0.0778 8 23 13.000 * * * 9 22 13.000 0.6806 0.3194 0.0835 10 21 14.000 0.6481 0.3519 0.0856 11 20 15.000 * * * 11 19 19.000 0.6140 0.3860 0.0876 12 18 24.000 0.5799 0.4201 0.0891 13 17 27.000 * * * 13 16 36.000 * * * 14 15 36.000 * * * 15 14 36.000 0.4712 0.5288 0.0919 16 13 46.000 0.4349 0.5651 0.0917 17 12 57.000 0.3987 0.6013 0.0909 18 11 60.000 * * * 18 10 72.000 * * * 18 9 72.000 * * * 18 8 84.000 * * * 18 7 84.000 * * * 18 6 96.000 * * * 18 5 96.000 * * * 18 4 99.000 * * * 18 3 120.000 * * * 18 2 120.000 * * * 18 1 120.000 * * * 18 0 Tab.III CIMP-positive Tumoren 99 Tab IV: Überleben nach Ki-67-Index (3 Gruppen) Ki-67<2% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left 0.000 1.0000 0 0 0 25 6.000 0.9600 0.0400 0.0392 1 24 12.000 * * * 2 23 12.000 * * * 3 22 12.000 0.8400 0.1600 0.0733 4 21 36.000 * * * 5 20 36.000 0.7600 0.2400 0.0854 6 19 60.000 * * * 6 18 60.000 * * * 6 17 60.000 * * * 6 16 72.000 * * * 6 15 72.000 * * * 6 14 84.000 * * * 6 13 84.000 * * * 6 12 84.000 * * * 6 11 84.000 * * * 6 10 84.000 * * * 6 9 96.000 * * * 6 8 96.000 * * * 6 7 108.000 * * * 6 6 120.000 * * * 6 5 120.000 * * * 6 4 120.000 * * * 6 3 144.000 * * * 6 2 192.000 * * * 6 1 192.000 * * * 6 0 100 Ki-67=2-29 % Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (Failure) 0.000 1.000 0 0 0 16 8.000 * * * 0 15 12.000 * * * 1 14 12.000 * * * 2 13 12.000 * * * 3 12 12.000 * * * 4 11 12.000 0.6667 0.3333 0.1217 5 10 24.000 0.6000 0.4000 0.1265 6 9 27.000 * * * 6 8 36.000 * * * 7 7 36.000 * * * 8 6 36.000 * * * 9 5 36.000 0.3000 0.7000 0.1235 10 4 48.000 * * * 10 3 48.000 * * * 10 2 72.000 * * * 10 1 96.000 * * * 10 0 101 Ki-67 >29% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (Failure) 0.000 1.000 0 0 0 20 0.000 0.9500 0.0500 0.0487 1 19 1.000 0.9000 0.1000 0.0671 2 18 2.000 * * * 3 17 2.000 0.8000 0.2000 0.0894 4 16 7.000 0.7500 0.2500 0.0968 5 15 8.000 * * * 6 14 8.000 0.6500 0.3500 0.1067 7 13 13.000 * * * 8 12 13.000 0.5500 0.4500 0.1112 9 11 14.000 0.5000 0.5000 0.1118 10 10 15.000 * * * 10 9 18.000 * * * 10 8 19.000 0.4375 0.5625 0.1140 11 7 38.000 * * * 11 6 40.000 * * * 11 5 46.000 0.3500 0.6500 0.1202 12 4 57.000 0.2625 0.7375 0.1177 13 3 62.000 * * * 13 2 68.000 * * * 13 1 99.000 * * * 13 0 102 Tab.V Überleben Kolon-NET und Ki-67<2% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (Failure) 0.000 1.000 0 0 0 1 6.000 0 1.0000 0 1 0 % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left Überleben Kolon-NET und Ki-67=2-29% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) (Failure) 0.000 1.000 0 0 0 2 8.000 * * * 0 1 27.000 * * * 0 0 % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left Überleben Kolon-NET und Ki-67>29% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) (Failure) 0.000 1.000 0 0 0 20 0.000 0.9500 0.0500 0.0487 1 19 1.000 0.9000 0.1000 0.0671 2 18 2.000 * * * 3 17 2.000 0.8000 0.2000 0.0894 4 16 7.000 0.7500 0.2500 0.0968 5 15 8.000 * * * 6 14 8.000 0.6500 0.3500 0.1067 7 13 13.000 * * * 8 12 13.000 0.5500 0.4500 0.1112 9 11 14.000 0.5000 0.5000 0.1118 10 10 15.000 * * * 10 9 18.000 * * * 10 8 103 Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (Failure) 19.000 0.4375 0.5625 0.1140 11 7 38.000 * * * 11 6 40.000 * * * 11 5 46.000 0.3500 0.6500 0.1202 12 4 57.000 0.2625 0.7375 0.1177 13 3 62.000 * * * 13 2 68.000 * * * 13 1 99.000 * * * 13 0 Überleben Kolon-NET und Ki-67>29% Überleben Fore-und Midgut-NET und Ki-67<2% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left 0.000 1.000 0 0 0 24 12.000 * * * 1 23 12.000 * * * 2 22 12.000 0.8750 0.1250 0.0675 3 21 36.000 * * * 4 20 36.000 0.7917 0.2083 0.0829 5 19 60.000 * * * 5 18 60.000 * * * 5 17 60.000 * * * 5 16 72.000 * * * 5 15 72.000 * * * 5 14 84.000 * * * 5 13 84.000 * * * 5 12 84.000 * * * 5 11 84.000 * * * 5 10 104 Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (Failure) 84.000 * * * 5 9 96.000 * * * 5 8 96.000 * * * 5 7 108.000 * * * 5 6 120.000 * * * 5 5 120.000 * * * 5 4 120.000 * * * 5 3 144.000 * * * 5 2 192.000 * * * 5 1 192.000 * * * 5 0 Überleben Fore-und Midgut-NET und Ki-67<2% 105 Überleben Fore-und Midgut-NET und Ki-67=2-29% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (Failure) 0.000 1.0000 0 0 0 14 12.000 * * * 1 13 12.000 * * * 2 12 12.000 * * * 3 11 12.000 * * * 4 10 12.000 0.6429 0.3571 0.1281 5 9 24.000 0.5714 0.4286 0.1323 6 8 36.000 * * * 7 7 36.000 * * * 8 6 36.000 * * * 9 5 36.000 0.2857 0.7143 0.1207 10 4 48.000 * * * 10 3 48.000 * * * 10 2 72.000 * * * 10 1 96.000 * * * 10 0 Es gab keine Fore-und Midgut-Tumoren mit Ki67-Index >29%. 106 Tab.VI: Überleben nach Ki-67-Index (2 Gruppen) Ki-67<2% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left 0.000 1.0000 0 0 0 25 6.000 0.9600 0.0400 0.0392 1 24 12.000 * * * 2 23 12.000 * * * 3 22 12.000 0.8400 0.1600 0.0733 4 21 36.000 * * * 5 20 36.000 0.7600 0.2400 0.0854 6 19 60.000 * * * 6 18 60.000 * * * 6 17 60.000 * * * 6 16 72.000 * * * 6 15 72.000 * * * 6 14 84.000 * * * 6 13 84.000 * * * 6 12 84.000 * * * 6 11 84.000 * * * 6 10 84.000 * * * 6 9 96.000 * * * 6 8 96.000 * * * 6 7 108.000 * * * 6 6 120.000 * * * 6 5 120.000 * * * 6 4 120.000 * * * 6 3 144.000 * * * 6 2 192.000 * * * 6 1 192.000 * * * 6 0 107 Ki-67>2% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left 0.000 1.000 0 0 0 36 0.000 0.9722 0.0278 0.0274 1 35 1.000 0.9444 0.0556 0.0382 2 34 2.000 * * * 3 33 2.000 0.8889 0.1111 0.0524 4 32 7.000 0.8611 0.1389 0.0576 5 31 8.000 * * * 6 30 8.000 0.8056 0.1944 0.0660 7 29 8.000 * * * 7 28 12.000 * * * 8 27 12.000 * * * 9 26 12.000 * * * 10 25 12.000 * * * 11 24 12.000 0.6617 0.3383 0.0796 12 23 13.000 * * * 13 22 13.000 0.6042 0.3958 0.0824 14 21 14.000 0.5754 0.4246 0.0834 15 20 15.000 * * * 15 19 18.000 * * * 15 18 19.000 0.5434 0.4566 0.0846 16 17 24.000 0.5115 0.4885 0.0855 17 16 27.000 * * * 17 15 36.000 * * * 18 14 36.000 * * * 19 13 36.000 * * * 20 12 36.000 0.3751 0.6249 0.0857 21 11 38.000 * * * 21 10 108 Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen Survival Standard Error Number Failed Number Left (Failure) Ki-67 >2% 40.000 * * * 21 9 46.000 0.3334 0.6666 0.0857 22 8 48.000 * * * 22 7 48.000 * * * 22 6 57.000 0.2778 0.7222 0.0876 23 5 62.000 * * * 23 4 68.000 * * * 23 3 72.000 * * * 23 2 96.000 * * * 23 1 99.000 * * * 23 0 109 Tab.VII: Klinische Daten der Hindgut- NET Lauf- Überlebens Todes- Sekretion/ Ki 67- Tumor- ursache Marker Index grading + - - 65% Schlecht diff. - + - - 70% Schlecht diff. - - - - - 85% Schlecht diff. kleinzellig - - - - - 90% Schlecht diff. Kolon kleinzellig - - + - - 50% Schlecht diff. - Kolon kleinzellig - - - - - 60% Schlecht diff. - - Kolon kleinzellig - - - - - 80% Schlecht diff. 74 99 lebt faustgroß + - Syn+ 60% Schlecht diff. -- - - - Kolon kleinzellig --- -- + -- -- 50% Schlecht diff. m 71 15 lebt Rektum kleinzellig -- 1.6cm + - Syn+,CG+ 50% Schlecht diff. 3cm - - Syn+, Sero+, 40% + - Geschlecht Alter 1cc - - - 2cc - - - 3cc - - - 4cc - - - 5cc - - 6cc - 7cc Status Tumor- Lokalisation Histologie Metastasen - Kolon kleinzellig - - - Kolon kleinzellig - Kolon kleinzellig - Kolon - - - - - - 8cc m 9cc 10cc nummer Zeit (m) Kolon ascendens kleinzellig Leber, größe LK retroperitoneal CIMP Knochen, Leber, 11cc m 67 18 lebt Sigmoid Jun06 Kolon kleinzellig Milz, Oberbauch, Schlecht diff., G2 axillär, iliacal, paraaortale LK 0.6x 12cc w 77 27 lebt Kolon kleinzellig --- 13cc w 54 8 tot Kolon kleinzellig Leber, LK --- + kleinzellig LK 1.3x0.8cm + 0.5cm Tumortoxischer Kollaps Kolon( 14cc w 62 8 lebt terminales -- Ileum) Syn+, CG+, Sero+ Syn+, CG+, CG+, Sero++ 2-5% >50% 3% Schlecht diff.; wdNEC Schlecht diff., G3 Schlecht diff. wdNEC,G1 Schlecht 15cc m 53 2 tot Kolon kleinzellig Leber -- + Tumor Syn+, 80% grade diff.,low anaplastic large cell NEC 110 Laufnummer 16cc 18cc Geschlecht Alter w 57 w 70 Überlebens Status Zeit (m) - - -- -- Lokalisation Kolon (Caecum) Kolon Histologie Metastasen kleinzellig LK kleinzellig -- Tumorgröße 1.2cm -- CIMP + - Todes- Sekretion/ Ki 67- Tumor- ursache Marker Index grading -- - Syn+, CG+,Sero+ NSE+, Glu+, PPfocal++ 50% Schlecht wdNEC Schlecht <2% diff.,trabecular growth pattern 19cc m 70 - -- Kolon kleinzellig - -- + -- NSE+, 20% Schlecht diff. 20cc w 60 40 lebt Kolon kleinzellig -- -- - -- -- 50% Schlecht diff. Legende: CIMP + = 3/ 8 Gene waren methyliert - = <3/8 Gene waren methyliert na: nicht (genügend) Tumoren für CIMP-StatusBestimmung amplifiziert Status: Stand August 2006 Sonstiges: - = keine Daten verfügbar Syn+= Tumor anfärbbar für Synaptophysin CG+ = Tumor anffärbbar für Chromogranin A PP+ = pankreatisches Polypeptid diff., Sero+= Serotonin NSE+= Neuronenspezifische Enolase Glu+ = Glukagon; 111 Lauf-nummer Geschlecht Alter Überlebens Status Zeit(m) Lokalisation Histologie Rektum Undifferen Metastasen Tumorgröße CIMP Todes- Sekretion/ ursache Marker Ki 67- Index Tumorgrading 12T w 81 8 Tot Leber -- - -- -- 90% Schlecht diff. 13T m 69 13 tot Kolon transversum Leber (solitär) -- + -- -- 50% Schlecht diff. 14T m 49 57 tot Sigma Leber (diffus) -- + -- -- 90% Schlecht diff. 15T m 32 19 tot Kolon ascendens 0 -- + -- -- 30% Schlecht diff. 16T m 29 13 tot Rektum Leber, Peritoneum -- + -- -- 50% Schlecht diff. 17T w 63 0 tot Lunge, Leber, -- + k.A. -- 60% Schlecht diff. 18T m 57 7 tot Rektum Leber (diffus) -- na -- -- 50% Schlecht diff. 19T m 32 14 tot Sigma Leber, Hirn -- + -- -- 50% Schlecht diff. 20T m 55 6 tot Rectum LK A. mesenterica inferior -- - -- -- <2% Schlecht diff. 21cc m 64 2 tot Kolon kleinzellig Leber, M an 11 meso-kolischenLK 6,5cm + Tumor Syn+ 75% Schlecht diff. 22cc w 92 1 tot Kolon kleinzellig - -- - Tumor -- 75% Schlecht diff. 23cc w 58 68 lebt Kolon kleinzellig Leber-M. -- na -- -- 85% Schlecht diff. 24cc m 54 62 lebt Kolon kleinzellig - -- na -- -- 45% Schlecht diff. 25cc w 85 46 tot Kolon kleinzellig - -- + k.A. -- 45% Schlecht diff. 26cc m 56 38 lebt Rektumpolyp kleinzellig - -- - -- -- 65% Schlecht diff. ziertes CA Undifferen ziertes CA Undifferen ziertes CA Undifferen ziertes CA Undifferen ziertes CA Kolonflexur Undifferen rechts ziertes CA Undifferen ziertes CA Undifferen ziertes CA Undifferen ziertes CA 112 10 Publikation Arnold CN, Nagasaka T, Goel A, Scharf I, Grabowski P, Sosnowski A, Schmitt-Gräff A, Boland CR, Arnold R, Blum HE (2008). Molecular characteristics and predictors of survival in patients with malignant neuroendocrine tumors. Int J Cancer 2008 Oct 1; 123 (7): 1556-64. 113 11 Danksagung Herrn Prof. Dr. Drs. h.c. H.E. Blum möchte ich sehr für die Möglichkeit danken, in seiner Abteilung meine Dissertation über dieses interessante Thema schreiben zu dürfen, sowie Frau Prof. Dr. Annette Schmitt-Gräff für ihr Interesse an dieser Arbeit und die Bereitstellung einiger Tumorpräparate. Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater und Betreuer PD Dr. med. Christian Arnold für die Überlassung des Themas, die sorgfältige Einarbeitung in die Methodik, sowie seine geduldige und kontinuierliche Unterstützung während der Durchführung und Niederschrift der Arbeit. Auch danke ich ihm für seine konstruktive Kritik und seinen Rat in schwierigen Phasen der Dissertation. Ebenso verdanke ich ihm die Möglichkeit, an einer Publikation beteiligt zu sein. Ohne ihn wäre diese Arbeit nicht zu Stande gekommen. Herrn Prof. Dr. Oliver Opitz danke ich herzlich für seine Bereitschaft das Zweitgutachten zu erstellen. Des weiteren möchte ich auch meiner Vorgängerin in derselben Arbeitsgruppe, Dr. med. Andrea Sosnowski gerne danken: zum einen für die Überlassung einiger Abbildungen im Einleitungsteil und Tabellen im Methodenteil, zum anderen auch für hilfreiche Tipps während der experimentellen Phase, sowie für ihre allgemeine Bereitschaft, mich zu unterstützen. Den Mitarbeitern des B5-Labors der Medizinischen Klinik Freiburg, insbesondere Wolfgang Mössner, Angela Queisser und Eva Egenter danke ich sehr für alle technische Unterstützung, die herzliche Arbeitsatmosphäre und die freundschaftliche Verbundenheit. Außerdem möchte ich mich auch bei allen Mitarbeitern der B-Labore bedanken, die mir gerne mit ihrer Erfahrung und Hilfsbereitschaft zur Seite gestanden sind. Ebenso danke ich den Mitarbeitern des Pathologischen Institutes, insbesondere Frau Bärbel Weinhold, für die Durchführung der Ki-67-Färbungen. Herrn Prof. Dr. Schulte-Mönting vom Institut für Biometrie und Medizinische Informatik Freiburg danke ich für die Beratung in statistischen Fragen und die Durchführung großer Teile der statistischen Auswertung. 114 Abschließend möchte ich mich bei all denen bedanken, die mich in den letzten Jahren auf diesem Weg begleitet und unterstützt haben. Da sind besonders Freunde von „Studenten für Christus“ Freiburg, Studienkollegen und vor allem meine Familie zu nennen, ohne deren Ermutigung ich sicherlich nicht so weit gekommen wäre. 115 12 Lebenslauf PERSÖNLICHE DATEN Name Iris Christine Scharf Geburtsdatum 06.06.1982 Geburtsort Berlin Familienstand ledig Staatsangehörigkeit deutsch Eltern Hanns-Peter Scharf, Doktorand der Theologie, verstorben 1987 Sabine Scharf, geb. Zimmer, Diplom-Theologin Geschwister Andreas (1984) SCHULBILDUNG 1988-1992 Grundschule Masseldorn, Mosbach 1992- 2001 Nikolaus- Kistner- Gymnasium, Mosbach 2001 Abitur HOCHSCHULBILDUNG Seit 10/2001 Medizinstudium an der Albert-LudwigsUniversität Freiburg 9/2003 Physikum Seit 10/2005 Dissertation bei PD Dr. med. Arnold und Prof. Dr. Drs. h. c. H.E.Blum FAMULATUREN 2/2004- 4/2004 Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe, Kreiskrankenhaus Mosbach 8/2004- 10/2004 Dawe Langano Rural Clinic, Äthiopien 9/2005– 10/2005 Abteilung Innere Medizin, Lorettokrankenhaus Freiburg PRAKTISCHES JAHR 02/2007- 12/2007 Ev. Diakonissenkrankenhaus Karlsruhe- Rüppurr STUDIENABSCHLUSS 5/2008- 12/2008 Kolloquium und Abschluss des Promotionsverfahrens 10/2008- 11/2008 Staatsexamen- 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 116
