Expression von MutLa im Zellzyklus

Aus dem Fachbereich Medizin
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
Frankfurt am Main
betreut am
Zentrum der Inneren Medizin
Medizinische Klinik I
Direktor: Prof. Dr. Stefan Zeuzem
Expression von MutLa im Zellzyklus
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
des Fachbereichs Medizin
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
Frankfurt am Main
vorgelegt von
Milena Opper
aus Mainz
Frankfurt am Main, 2016
INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS..................................................................................................................6
TABELLENVERZEICHNIS....................................................................
7
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS................................................................................................................ 8
1
EINLEITUNG...................................................................................................................................... 1 0
1.1
DAS LYNCH SYNDROM............................................................................................................................ 1 0
1.1.1
Epidemiologie und Charakteristika....................................................................................10
1.1.2
Geschichte............................................................................................................................... 12
1.1.3
Lynch Syndrom vs. HNPCC.................................................................................................. 13
1.1.4
Pathogenese............................................................................................................................14
1.2
MIKROSATELLITENINSTABLITÄT.................................................................................................... 15
1.3
DNA MISMATCH REPARATUR............................................................................................................. 1 7
1.3.1
1 .4
Aufgabe und Funktion von DNA Mismatch R eparatur P ro tein en ................................ 17
1.3.1.1
Hauptkomponenten.......................................................................................................... 19
1.3.1.2
Detektion von Fehlpaarungen.......................................................................................... 19
1.3.1.3
Beginn der DNA Mismatch Reparatur............................................................................... 22
1.3.1.4
Reparatur von Fehlpaarungen.......................................................................................... 22
DER ZELLZYKLUS......................................................................................................................................2 4
1.4.1
Ablauf.......................................................................................................................................24
1.4.2
Regulation...............................................................................................................................26
1.5 WEITERE FUNKTIONEN VON DNA MISMATCH REPARATUR PROTEINEN....................2 8
1.5.1
Beteiligung am Zellzyklus....................................................................................................29
1.5.2
A poptoseeinleitung.............................................................................................................. 30
1 .6 FRAGESTELLUNG......................................................................................................................................3 3
2
MATERIAL UND METHODEN..................................................................................................... 3 4
2 .1
MATERIAL................................................................................................................................................... 3 4
2.1.1
Chemikalien und V erbrauchsm aterial.............................................................................. 34
2.1.1.1
Allgemeine Chemikalien................................................................................................... 34
2.1.1.2
Verbrauchsmaterial.......................................................................................................... 36
2.1.1.3
Zellkulturreagenzien..........................................................................................................37
2.1.1.4
Zelllinien............................................................................................................................37
2.1.1.5
Antikörper.........................................................................................................................37
2.1.1.6
Zellzyklusblocker...............................................................................................................38
2.1.1.7
Kit Systeme........................................................................................................................ 38
2.1.1.8 TaqMan-Sonden.................................................................................................................. 38
2.1.1.9 Puffer und Lösungen........................................................................................................... 39
2.1.2
G eräte......................................................................................................................................41
2.1.3
Softw are................................................................................................................................. 42
2.2
METHODEN......................................................................................................................................
2.2.1
Zellkultur.......................................................................
2.2.1.1 Kultivieren von Zellen...........................................................................
...4 3
43
43
2.2.1.2 Passagieren von Zellen........................................................................................................43
2.2.1.3 Synchronisieren von Zellen................................................................................................43
2.2.2
2.2.1.3.1
Zugabe von Zellzyklusblockern................................................................................ 44
2.2.1.3.2
Serumentzug... .... ..................................................................................................... 46
2.2.1.3.3
Mitotic shake-off..........................................................................................................46
Durchflusszytometrie..........................................
2.2.2.1
Fixieren von Zellen......................................................
47
48
2.2.22 Propidiumiodid-Färbung....................................................................................................49
2.2.3
Molekularbiologische M ethoden........................................................................................49
2.2.3.1 Isolation von Gesamt-RNA.....................
2.2.3.2
49
Konzentrationsbestimmung der RNA...............................................................................50
2.2.3.3 Reverse Transkription..................................
51
2.2.3.4 Quantitative Echtzeit-PCR.................................................................................................. 52
2.2.4
Proteinchemische Methoden.......................................................................
54
2.2.4.1
Extraktion von Gesamt-Protein......................................................................................... 54
2.2.4.2
Extraktion von Kern-Zytoplasma Fraktion.......................................................................54
2.2.4.3 Bestimmung der Proteinkonzentration..............................................................................55
2.2.4.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese................................................................................55
2.2.4.5
2.2.5
Western Blot Analyse........................................................................................................ 57
In vitro Zellkulturm ethoden.........................................................
2.2.5.1 Zellkernanfärbung...............................................................................................
3
ERGEBNISSE....................................................
3 .1
58
58
60
ZELLZYKLUS-ABHÄNGIGE PROTEINEXPRESSION VON M L H 1........................................... 6 0
3.1.1
Synchronisation mit Zellzyklusarrest auslösenden Substanzen..................................60
3.1.1.1 Hydroxyurea....................................................................................................................... 60
3.1.1.2 Nocodazol..........................................................................
62
3.1.2
Synchronisation mittels Serumentzug............................................................
65
3.1.3
Synchronisation mittels Mitotic shake-off........................................................................ 68
3.1.3.1 HeLa-Zellen.........................................................................................................................68
3.1.3.2 SW480-Zellen......................................................................................................................73
3.1.4
3.2
Vergleich unterschiedlicher Verfahren zur Zellsynchronisation................................. 76
MLH1 mRNA LEVEL IM ZELLZYKLUS.............................................................................................. 7 8
3.3
4
SUBZELLULÄRE LOKALISATION VON MLH1 IM ZELLZYKLUS............................................ 8 0
DISKUSSION...................................................................................................................................... 8 4
4 .1
MLH1 WIRD ZELLZYKLUS-ABHÄNGIG EXPRIMIERT............................................................... 8 4
4.1.1
Regulation von MMR Proteinen..........................................................................................84
4.1.2
MLH1 w ird in der G2/M Phase am stärksten exp rin d e rt.............................................. 85
4.1.3
Synchronisationsm ethoden.................................................................................................87
4 .2
4.1.3.1
Vergleichbarkeit.................................................................................................................87
4.1.3.2
Behandlung mit Hydroxyurea...........................................................................................88
4.1.3.3
Behandlung mit Nocodazol................................................................................................88
4.1.3.4
Serumentzug...................................................................................................................... 89
4.1.3.5
Mitotic shake-off............................................................................................................... 89
DIE REGULATION DER MLH1 PROTEINMENGE IM ZELLZYKLUS ERFOLGT
TRANSKRIPTIONSUNABHÄNGIG...................................................................................................... 9 0
4.2.1
MLH1 w ird nicht Zellzyklus-abhängig tran sk rib iert...................................................... 90
4.2.2
Proteindegradation als möglicher Regulator der MLH1 Expression im Zellzyklus ..91
4 .3
DIE SUBZELLULÄRE LOKALISATION VON MLH1 VARIIERT IN DEN VERSCHIEDENEN
ZELLZYKLUSPHASEN.............................................................................................................................. 9 2
ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................................................... 9 6
ABSTRACT.................................................................................................................................................9 7
LITERATURVERZEICHNIS..................................................................................................................9 8
DANKSAGUNG.......................................................................................................................................1 0 5
SCHRIFTLICHE ERKLÄRUNG..........................................................................................................1 0 6
LEBENSLAUF..........................................................................................................................................1 0 7