Abhandlung vorgelegt von Kurt Vorburger Dipl - ETH E

Research Collection
Doctoral Thesis
Untersuchungen zur Struktur und Biogenese der Kernlamina
Author(s):
Vorburger, Kurt
Publication Date:
1989
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-000543840
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Diss. ETH Nr. 8891
UNTERSUCHUNGEN ZUR STRUKTUR
UND BIOGENESE DER KERNLAMINA
Abhandlung
zur
Erlangung
des Titels eines
Doktors der Naturwissenschaften
der
Eidgenössischen Technischen Hochschule
Zürich
vorgelegt
Vorburger
Kurt
Dipl. Natw.
geboren
am
von
von
ETH
17. Januar 1958
Buchs SG
Angenommen auf Antrag
Prof. Dr. H.M.
PD Dr. E.A.
von
Eppenberger, Referent
Nigg und Prof. Dr.
H. Hennecke, Korreferenten
1989
Y
Erof.Dr.H.M
Meiner Frau Nevin und
meiner Tochter Eva Katharina
Prof. Dr. H.M.
Eppenberger
Wohlwollen, das
PD Dr. E.A.
er
danke ich für sein Interesse
mir während meiner Dissertationszeit
an
meiner Arbeit und sein
entgegengebracht hat.
Nigg danke ich für seine kompetente Betreuung. Durch sein grosses
Wissen und seine vielen Ideen hat
meiner Arbeit immer wieder
er
gegeben. Seine Begeisterungsfähigkeit
wirkte
ansteckend
und
neue
hat
Impulse
mich stark
motiviert.
Prof. Dr. H. Hennecke danke ich für die Uebernahme des Korreferats.
gilt
Mein Dank
Zellkulturen
auch Vreni Kurer, die mir die
beigebracht
Den Mitarbeitern
von
Hybridoma-Herstellung
und die Arbeit mit
hat.
PD Dr. E.A.
Nigg
danke ich für die Hilfe bei der Suche nach
Lamin-kodierenden cDNS-Klonen.
Nebst allen andern Leuten, die mir in
vor
allem den Mitarbeitern der
die vielen wertvollen
irgendeiner Weise geholfen haben, möchte
Gruppen
Ratschläge
von
ich
Prof. M. Lezzi und Prof. J.-C. Perriard für
beim Erlernen der
molekularbiologischen
Techniken
danken.
Besonders dankbar bin ich meiner Mutter, die mich während meiner
bestmöglichst
Ausbildung
stets
unterstützt hat.
Schliesslich möchte ich meiner Frau Nevin für die Geduld und das mir entgegen¬
gebrachte
Vertrauen danken.
Zürich, im Mai 1989
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
5
Summary
8
I.
Einleitung
10
1.1. Aufbau der Kernhülle
10
1.1.1.
11
Kernporen
1.1.2. Kemlamina
13
1.2. Struktur der
15
Laminproteine
1.3. Mitoseverhalten der
Laminproteine
18
1.4.
Entwicklungsabhängige Expression
1.5.
Biogenese der Laminproteine
21
1.6.
Zielsetzung
22
Abkürzungen
24
II.
der
Laminproteine
20
III. Material und Methoden
25
II 1.1. Zellkulturen
25
111.1.1.
Lösungen, Seren
und Medien
25
111.1.2. Primärkulturen
26
111.1.3. Zellinien
27
111.1.4.
Passagieren,
111.1.5. Metabolische
III.2.
Präparation
Einfrieren und Auftauen
von
Zellen
Markierungen
und
Fraktionierung
27
28
von
Zellkernen
29
11.2.1. Puffer und
li.2.2. Zellkerne
29
Lösungen
30
Lebergewebe
aus
11.2.3.
Porenkomplex-Laminafraktion
11.2.4.
Fraktionierung
11.3.
Herstellung
11.3.1.
von
Immunisierung
11.3.2. Fusion
von
von
31
32
Antikörpern
32
33
Myelomazellen
Subklonierung
11.3.4. Produktion von
Hühnerembryofibroblasten
Mäusen
Milzzellen mit
11.3.3. Selektion und
11.3.5.
kultivierten
monoklonalen
von
31
von
Hybridomazellen
Hybridomakulturüberständen
33
34
34
Subklassenbestimmung
11.4.
Gelelektrophorese
35
11.5.
Immunoblotexperimente
36
11.6.
Immunpräzipitationsexperimente
37
11.7.
Immunfluoreszenzexperimente
39
11.7.1. Fixation
11.7.2. Indirekte
11.8. Isolation
von
Lamin-kodierenden cDNS-Klonen
40
Antikörper
40
11.8.2. Isolation
von
11.8.3. Isolation
von
11.10.
cDNS-Klonen mit Hilfe
cDNS-Klonen durch
DNS-Sequenzierung
RNS-Präparation
11.10.1. Total-und
11.10.2.
poly(A)+RNS
Synthetische RNS
11.11. RNS
39
Immunfluoreszenzfärbungen
11.8.1. cDNS-Genbanken und
11.9.
39
Kulturzellen
von
Blot-Hybridisierungen
11.12. /n v/fro-Translationen
von
Antikörpern
PIaque-Hybridisierung
40
41
42
42
42
43
44
44
111.13. Chemische
Spaltungen
der
Laminproteine
46
IV. Resultate
48
IV.1.
Herstellung
IV.2.
Charakterisierung
von
monoklonalen
Antikörpern gegen Kernhüllenproteine
Antikörpern
von
und
Antigenen
IV.2.1.
Molekulargewichte
IV:2.2.
Lokalisierung der Antigene
IV.2.3.
Einteilung der Lamin A-spezifischen Antikörper
IV.3.
Klonierung
der
50
Antigene
50
52
Hühnerlamin-kodierenden
von
48
nach
Epitopkiassen
cDNS-Sequenzen
54
55
IV.3.1. Isolation
von
Lamin A-kodierenden cDNS-Klonen
55
IV.3.2. Isolation
von
Lamin B-|- und
59
B2-kodierenden cDNS-Klonen
IV.3.3. Primär- und Sekundärstrukturen der
IV.3.4. Quantitativer
Vergleich mehrerer
Laminproteine A, Bi
A- und
B-typischer
und
B2
Vertebraten-
Laminproteine
66
IV.3.5. Gemeinsame und
spezifische
Domänen
von
A- und
B-typischen
Laminproteinen
IV.4.
Analyse
der
IV.7.
69
Hühnerlamin-Transkripte
IV.5. In w'fro-Translation
IV.6. In
61
von
w'iVo-Prozessierung
poly(A)+
von
72
RNS und
synthetischer RNS
Hühnerlamin B2
72
75
Biogenese der Laminproteine
78
IV.7.1. Posttranslationelle Modifikation
von
Lamin A
78
IV.7.2. Posttranslationelle Modifikation
von
Lamin B2
82
IV.8. In wfro-Modifikation der
IV.9.
Prozessierung
zellfreien
von
Lamin A und B2:
Charakterisierung
86
der Aktivitäten in
Systemen
IV.9.1. Zeitlicher Verlauf und
IV.9.2.
Laminproteine durch ein Mevalonsäurederivat
90
Temperaturabhängigkeit der
in vitro-Pro-
zessierung
von
Lamin A
90
Hemmung
der
Lamin-Prozessierung
92
IV.9.3. Subzelluläre Lokalisation der
IV.10.
Charakterisierung
IV.10.1.
des
Kernhüllenantigens
Lokalisierung des Antigens
IV. 10.2. Biochemische
Lamin-prozessierenden Aktivitäten
P1
99
P1
Eigenschaften
99
des
Antigens
P1
102
V. Diskussion
V.1.
Vergleich
96
106
von
Laminproteinen
und
zytoplasmatischen
Intermediär-
filamenten
106
V.2. Struktureller
Vergleich
V.3. Funktionelle
Betrachtungen
von
A- und
B-typischen Laminproteinen
107
108
V.3.1. Mitoseverhalten
108
V.3.2. Interaktion
109
von
Lamina und Chromatin
V.3.3. Membran-Assoziation der
V.4.
der
Biogenese
B-typischen Laminproteine
Laminproteine
111
V.4.1. Posttranslationelle Modifikationen der
V.4.1.1. Modifikation der
V.4.1.2.
Laminproteine
Laminproteine durch ein Mevalonsäurederivat
Proteolytische Prozessierung
der
112
113
posttranslationellen Modifikationen
114
Mögliche
V.4.3.
"Enzymologie" der Lamin-Prozessierung
V.5. Das neue
111
Lamin-Vorläuferproteine
V.4.2.
Funktionen der
110
Kemhüllenantigen
P1
116
118
Perspektiven
119
VI. Literaturverzeichnis
122
Publikationen
134
Lebenslauf
135
V.6.
Zusammenfassung
Die Kernlamina stellt ein fibrilläres Protein-Netzwerk dar, das sich direkt unter
der inneren Kernmembran befindet und als Teil des Kernskeletts betrachtet wird.
Es wird angenommen, dass diese Struktur die Kernhülle stabilisiert und die
räumliche und funktionelle
Die
Komponenten
Organisation
der Kernlamina, die
des
Interphasenchromatins mitbestimmt.
Laminproteine,
zytoplasmatischen Intermediärfilamentproteinen
verwandt und werden deshalb
als eine Familie dieser Proteinklasse betrachtet. Die
aufgrund
biochemischen
von
Unterfamilie
werden. Es
eingeteilt
Unterfamilien
zwei
für
Embryonalentwicklung
dieser Arbeit
die
gibt
Laminproteine können
A-
eine
und
eine
B-typische
Hinweise dafür, dass die Existenz
Spezialisierung
funktionelle
während
und während der Mitose verantwortlich ist. Zu
allerdings nicht klar,
war
in
Kriterien
sind strukturell mit den
ob diese
Unterfamilien
der
Beginn
auch
nach
strukturellen Kriterien unterschieden werden können. Zur
Untersuchung
molekularen Struktur der drei
als A, Bi
bezeichneten
Klone
gegenwärtig bekannten und
Hühnerlaminproteine
isoliert
und
sequenziert.
wurden
Durch
deshalb
den
von
und
der
B2
entsprechende cDNS-
Vergleich
der
drei
Hühner-
laminsequenzen untereinander und mit Laminsequenzen anderer Vertebraten
neben
konnten
strukturelle
einigen gemeinsamen charakteristischen Domänen
Motive
zur
identifiziert werden. Der
Klassifizierung.
Unterscheidung
Vergleich
in einer
Vertebraten-Spezies
beiden
Homologien bestätigte
zwei
von
war
und im Kern
in vivo ein
gefunden
und
B2)
bewiesen werden.
zum
reifen Protein
grösseren Molekulargewicht
prozessiert. Ueberraschenderweise
Allerdings
war
dabei unklar
geblieben,
B2-Variante bezeichnete Protein einen Vorläufer
von
ob dieses als Lamin
Lamin B2 darstellt. Im
vorliegenden Arbeit konnten durch Transkription
B2-kodierenden cDNS-Klonen
tischen
ursprüngliche
kurzlebiges, immunologisch mit Lamin B2 verwandtes Protein
worden.
Rahmen der
die
B-typischen Laminproteinen (Bi
Lamin A wird als Vorläufer mit einem scheinbar
synthetisiert
Lamin-Unterfamilien
herausgearbeiteten Unterscheidungsmerkmale
Anhand der
konnte erstmals die Existenz
von
der
auch
von
Lamin A- und
und anschliessender Translation der
synthe¬
Transkripte Proteine hergestellt werden, die exakt mit den
in vivo
synthetisierten
und als
mögliche
Vorläufer betrachteten Proteinen
Während der Lamin A-Vorläufer im
Retikulozytenlysat
primäre Translationsprodukt der Lamin B2-RNS
in der zweidimensionalen
Gelelektrophorese
komigrierten.
stabil war, wurde das
in ein Protein
umgewandelt,
das
exakt mit dem authentischen reifen
Lamin
B2 komigrierte. Diese Resultate zeigten, dass Lamin B2 ebenfalls als
Vorläufer
Der
synthetisiert
wird.
Carboxy-Terminus
Tetrapeptidmotiv (-CAAX)
der
Laminproteine (-CXXM) gleicht
dem C-terminalen
ras-verwandten Proteinen und Hefe-Sexfaktoren.
von
Die CAAX-Box ist der Ort verschiedener
posttranslationeller Modifikationen
wie
proteolytischer Spaltung, Isoprenylierung und Methylierung der C-terminalen
Carboxylgruppe.
Im Verlaufe der weiteren Arbeit wurde
Hühnerlaminproteine
A und
Peptid
CXXM-Motiv) abgespalten wird,
und
B2)
am
3 kDa
(und damit
C-Terminus
von
das
Lamin B2
DieTranslationsprodukte synthetischer
werden im
ein Mevalonsäurederivat modifiziert,
ungefähr
von
werden
höchstens drei Aminosäuren entfernt.
Lamin-Transkripte (A, Bi
dass die beiden
B2 in vivo proteolytisch gespalten werden. Während
im Falle von Lamin A ein C-terminales
ganze
gezeigt,
was
Retikulozytenlysat spezifisch
durch
bedeuten könnte, dass die Lamin¬
proteine isoprenyliert sind. Interessanterweise fehlt diese Modifikation bei
synthetischen
Lamin B2-Mutanten, die in der CXXM-Box anstelle des
Cysteins
ein Alanin aufweisen. Diese Resultate sind ein guter Hinweis dafür, dass der
bei den
Isoprenrest
gebunden
wird.
das C-terminale
Cystein
Prozessierung der Laminproteine
scheint
Laminproteinen
Die C-terminale
ebenfalls
an
aufgrund der vorliegenden Resultate ein mehrstufiger Prozess
der
Vergleich
mit neuesten
der ras-Proteine
Untersuchungen
zur
zu
sein, der, wie
posttranslationellen Modifikation
ergab, der C-terminalen Prozessierung dieser Onkogenpro-
dukte sehr ähnlich ist.
Die
Isoprenylierung
von
p21ras
am
Cystein
186 ist eine
wichtige Voraus¬
setzung für die Plasmamembran-Assoziation und die biologische Aktivität dieses
Proteins. Das
weise eine
Isoprenderivat
der
vergleichbare Funktion
B-typischen Laminproteine
und wäre demnach
Lamina in der inneren Kernmembran
Sowohl die
an
erfüllt
der
Prozessierung des Lamin
gehemmt
scheint
die
zytoplasmatisches Enzym
Mit Hilfe eines monoklonalen
ein bisher unbekanntes
A-Vorläufers als auch die
zu
Lamin
Prozessierung
von
divalenten
B2-prozessierende Aktivität ein
sein.
Antikörpers wurde
Antigen
im Verlauf dieser Dissertation
in der Kernhülle von Hühnerzellen identifiziert.
Dieses Protein, das kein Bestandteil des
eine den
der
werden. Während die Lamin A-Protease in der Kernfraktion
nachgewiesen wurde,
lösliches
Verankerung
beteiligt.
des Lamin B2-Vorläufers konnte in vitro durch Chelatoren
Kationen
möglicher¬
Porenkomplexes
zu
sein scheint, besitzt
Laminproteinen ähnliche Resistenz gegen Extraktionen mit Triton
X-
100 und Puffern mit hoher Salzkonzentration. Interessanterweise bindet dieses
Antigen
bereits in der frühen
zurück. Zu diesem
Anaphase
Zeitpunkt ist der grösste
ganze mitotische Zelle verteilt.
an
die Oberfläche des Chromatins
Teil der
Laminproteine
noch über die
8
Summary
The nuclear lamina is
nuclear membrane.
a
fibrillar
protein
meshwork
Organization
of the
components, the nuclear lamins, represent
A- and
proteins. According
features
a
interphase
special family of
distinguishing
the members of these subfamilies remain to be
lamins A, Bi and B2, cDNA clones
were
isolated and
of the chicken lamin sequences with each other
on
presently
alignments made it possible
distinguish B-type
lamins from
the first time that two
identify
to
B-type
A-type
lamin
a
fully
kown chicken
sequenced. Comparisons
hand and with those of
on one
the other hand allowed to establish structural features that
members of both subfamilies.
to
the intermediate
and differentiation but the structural
characterized. To compare the structure of the three
common
major
to biochemical criteria the lamins are classified into
specialization during cell division
other lamins
chromatin. Its
subfamilies. The existence of two subfamilies is believed to reflect
B-type
functional
the inner surface of the
By providing attachment points, the nuclear lamina is thought
to be involved in the functional
filament
lining
Conversely, multiple
are
sequence
number of structural motifs that
clearly
lamins. Thus it could be demonstrated for
proteins (Bi
and
B2)
exist in
a
vertebrate
species.
Lamin A is
mass
synthesized
which is
processed
as a
was
that
Polypeptides
phoresis,
transcripts
were
from the
in vivo. Prior to the
precursor of lamin B2. The
a
respectively.
processed
stable, the translation product of the lamin
reticulocyte lysate
lamin B2, and that two distinct activities
a
Polypeptide
are
a
bonafide precursor of
involved in
processing of newly
lamins A and B2.
carboxy-terminus of nuclear lamins (-CXXM) resembles
(the CAAX box)
of
fungal mating
to different
factors and ras-related
a
proteins.
C-terminal motif
The CAAX box
types of posttranslational modifications, including proteolytic
processing, isoprenylation
shown
into
with authentic mature lamin B2. These results indicate that the
transiently expressed variant of lamin B2 represents
suject
yielded
in vivo precursors of lamins A and B2,
in the
is
present
gel electro-
B2 transcript
The
a
two-dimensional
was
synthesized
molecular
derived from lamin A and B2 cDNAs
Whereas the Lamin A precursor
comigrating
represents
indistinguishable, by
putative
was
apparently higher
transiently expressed
unclear whether this variant
in vitro translation of
an
into mature lamin A within the nucleus. In addition
short- lived lamin B2 variant is
study it
precursor with
and
carboxyl methylation.
In the
by peptide mapping that both chicken lamins
present study it
A and B2 are
was
processed
proteolytically
(including
the -CXXM
amino acids
(14C)-mevalonic
modification.
encoding
FoUowing
no
i.e. the
approximately
of
MV is
incorporated
alanine instead of
proteins by
modification of lamin
isoprenylation
3 kDa
translation of cDNA-derived
precursor of
an
cysteine
isoprenoid
a
derivative
putitive isoprenoid
a
into lamin B2 translated from
a
in the C-terminal CXXM motif.
implicate this particular cysteine
These results
residue as the target for
MV derivative, and
they indicate
is amenable to studies in cell-free Systems. Moreover, these
suggest that C-terminal processing of newly synthesized nuclear lamins is
results
a
(MV),
acid
Remarkably,
mutant cDNA
that
peptide
is cleaved from Lamin A, at most three C-terminal
motif)
removed from lamin B2.
are
a
reticulocyte lysates, lamin proteins specifically incorporate
RNAs in
of
in vivo. However, whereas
multistep process highly reminiscent of the pathway elaborated recently for
related
ras-
proteins.
of
Isoprenylation
p21ras
at
cystein
membrane association and
plasma
have
isoprene moiety may
In the
biological activity.
case
of lamins the
comparable function and therefore may be required
a
for proper interaction of
186 was shown to be essential for both
newly synthesized lamins
with the inner nuclear
membrane.
Processing
of the precursors of lamins A and B2 could be inhibited
chelators of divalent cations, i.e.
metal-dependent
activity
enzymes
of the lamin
contrast,
the
are
A-protease
lamin
o-phenanthroline
and EDTA,
could be detected
B2-processing activity
only
seems
in
to
that
suggesting
involved in maturation of these
by
proteins. The
nuclear fraction. In
a
be
located
in
the
postmicrosomal supernatant.
A
new
protein
identified with
that this
same
protein
monoclonal
is not located at the nuclear pores. The P1
Interestingly
this
P1
antigen,
was
antibody. Preliminary local ization studies indicate
protein
anaphase, whereas the lamins
time.
envelope, called
resistance to extractions with nonionic
the lamins.
in
a
of the chicken nuclear
antigen shows
detergents and high salt buffers
binds back to the surface of chromatin
are
still distributed
over
the
as
early
the whole cell at this
10
I.
Einleitung
Die Zunahme der
Organismen
vor
genetischen Information während
die
Aufgabe gestellt, komplexere organisatorische
regulatorische Probleme
die
Bildung
Zellkernes
eines
während der
des
Anforderungen
dadurch die
Kerninnern. Durch die
(DuPraw
und
Entwicklung
wichtigsten evolutionären Prozesse,
Die
Organisation
des
von
Zellkernes
war
eines
der sich
den
Pro-
wird
den
vergrösserten Genoms in verschiedener Hinsicht gerecht:
Kernhülle trennt die
ermöglicht
für das Genom. Die
Abtrennung der eukaryontischen Organismen
hatte.
und
Folge dieser steigenden Ansprüche
eigenen Kompartiments
karyonten abgespielt
die
lösen. Die
zu
heute als einer der
gilt
der Evolution hatte die
DNA
Bildung
den
von
eines
zytoplasmatischen Prozessen
einzigartigen
und
biochemischen Milieus im
postulierte Interaktion mit dem Interphasenchromatin
1966, Comings und Okada 1970, Gerace et al. 1978, Hancock
et al.
Hughes 1982, Lebkowsky und Lämmli 1982,
Gerace et al. 1984, Burke und Gerace
1982,
würde die Kernhülle zudem
des Genoms nehmen. Es ist anzunehmen, dass diese
Einfluss auf die
Topologie
Eigenschaften
der Kernhülle
Replikation, Transkription
1986)
Lewis und Lämmli
wichtig
sind für den
geregelten
Ablauf
von
RNS-Prozessierung.
und
1.1. Aufbau der Kernhülle
Die Kernhülle der
ist im
Interphasenzelle
sichtbar. Durch die höhere
Auflösung
im
Lichtmikroskop
deutlich als "Hülle"
Elektronenmikroskop können
ultrastrukturell unterscheidbare Elemente beobachtet werden: die
membran, die
Porenkomplexe und die darunterliegende
Doppel¬
(Barton
Lamina
drei
et al.
1971, Franke 1974).
Die Kernhülle besteht
(siehe unten)
aus
zwei einzelnen
Lipidmembranen,
miteinander verbunden sind und den
einschliessen.
Immunzytochemische
die
(Senior
und Gerace
1988)
beiden Kernmembranen in ihrer
fehlt
jedoch gegenwärtig
Membranen
zu
trennen
ein
und
den Poren
periplasmatischen
Methoden führten
Raum
Identifikation
zur
Proteinen, die entweder spezifisch für die äussere (Matsuura
die innere
an
et al.
1981)
von
oder
Membran sind. Damit ist klar, dass sich die
Zusammensetzung eindeutig
unterscheiden. Es
überzeugendes Verfahren,
somit
das
Ausmass
der
um
die
beiden
Unterschiede
mit
11
biochemischen Methoden abzuklären. Funktionell sind die beiden Membranen
ebenfalls verschieden: während die innere Membran mit der Lamina assoziiert
ist, bildet die äussere Membran mit dem endoplasmatischen Retikulum ein
Kontinuum
wurden
(Franke 1974)
und ist ebenfalls mit
einige ER-spezifische Funktionen wie
translationelle Modifikation bestimmter Proteine
nachgewiesen (Puddington
Bis
kurzem
vor
(Gerace
et al.
waren
führte dann
zur
1988),
deren
Synthese
die
an
und die post-
der äusseren Kernmembran
1985).
wenige Kemmembran-assoziierte Proteine bekannt
1982, Berrios und Fisher 1986, Clawson et al. 1984). Die
monoklonale
et al.
etat.
erst
Möglichkeit,
(Brown
Polysomen besetzt. Ausserdem
Antikörper gegen zelluläre Fraktionen herzustellen,
Identifikation
weiteren Membran-assoziierten
von
Antigenen
1985, Lord et al. 1988, Frasch et al. 1988, Senior und Gerace
mögliche
Funktionen
zur
Zeit
Gegenstand
intensiver
Forschung
sind.
1.1.1.
Kernporen
Die Existenz einer Kernhülle führte schon früh
der
und nukleare Prozesse durch Austausch
zytoplasmatische
koordiniert werden müssen.
war
zu
Aufgrund
bereits im letzten Jahrhundert
von
Vorstellung,
dass
Makromolekülen
von
lichtmikroskopischen Untersuchungen
vorgeschlagen worden,
dass
spezielle
Poren
Kompartimente verbinden (Hartwig 1876). Die Entwicklung des
die beiden
Elektronenmikroskops ermöglichte erstmals die Darstellung der Poren(Callan
Ultrastruktur
Hilfe immer
Folge mit
und Randall 1949, Callan und Tomlin,
grösserer Auflösung analysiert wurde (Unwin
1982). Diese Resultate
führten
Ring,
Seiten
beiden
der
bestehend
umens
und
bilden
Durchmesser
von
dass sich die
Diffussion
von
(entsprechend
ungefähr
60
ca.100
Milligan
mit achtfacher
Symmetrie
globulären Untereinheiten,
befestigt.
Von
diesen
beiden
ist auf
über-
Diaphragma um ein zirkuläres Loch, das einen
A aufweist. Mikroinjektionsstudien mit Tracern zeigten,
Molekülen
einem
und
ragen acht Keile gegen das Zentrum des Poren-
Kernhülle wie ein
kDa)
Diffusionsrate
ein
acht
aus
Kernmembran
einandergelagerten Ringen
die in der
heute üblichen Modell, das die Poren als
zum
supramolekulare Proteinaggregate (ungefähr 10** Da)
darstellt. Je ein
1950),
mit
einem
globulären
erlaubt
normales Sieb verhält,
maximalen
Protein
umgekehrt proportional
Durchmesser
mit einem
(Bonner 1975, Paine 1975,
zum
das die
passive
von
100Ä
Molekulargewicht
Bonner
1978),
von
wobei die
Partikeldurchmesser ist.
Für
12
mit mehr als 60 kDa
Kernproteine
aktiver
Mit
Molekulargewicht
muss
andererseits ein
Transportmechanismus existieren (Feldherr etal. 1983).
biochemischen
(Dingwall
molekularbiologischen (Hall
et al.
1982,
Feldherr
et al.
1984)
und
etal. 1984, Lanford und Butel 1984, Kalderon etal.
1984a, Kalderon etal. 1984b) Verfahren ist eine Signalsequenz (Nuclear
Location
für die Aufnahme eines viral kodierten
Signal)
Kernproteins,
des
sogenannten SV 40 Large T Antigen, in den Zellkern, identifiziert worden. Das
Signal
setzt sich aus den sieben Aminosäuren PKKKRKV zusammen und besitzt
Sequenzen
damit einen basischen Charakter.
zum
Teil
völlig verschiedener Zusammensetzung sind
ebenfalls
Auch
mit derselben Funktion, aber mit
worden
gefunden
RNS
die
(in
Mit Hilfe
(Dingwall und Laskey 1986,
Form
Zytoplasma exportiert
zu
werden
an
(Zasloff 1983, Dworetzky
deren Oberfläche ein
Oozyten (Nukleoplasmin) adsorbiert worden
dass der
gewiesen,
Transport
mit zellfreien
Experimente
von
(Feldherr
ins
1988).
Xenopus-
eindeutig
wurde
und in wVo-Studien
1986).
aktiv
und Feldherr
durch die Poren stattfindet
Systemen
scheint
Kernprotein
war,
Kernproteinen
McKeon et al.
RNS-Protein-Komplexen)
von
Goldpartikeln,
von
in anderen
nach¬
et al.
1984).
ergaben Hinweise
dafür, dass der Transport durch die Kernhülle energieabhängig ist (Newmeyer et
1986b).
al. 1986a,
einige
Es sind
interessante Fälle bekannt, bei denen die Grösse und das
Vorhandensein einer
den
Signalsequenz
in den
Transport
Kern
Zusammenhang die Befunde,
(Fritz
et al.
1986) je
(Dingwall
1984)
nach
und
1986).
cAMP-abhängigen
einzigen
in
diesem
wonach in
Xenopus leavis die meisten
snRNPs
einige Antigene (Dreyer
et al.
Proteinkinase
zu
Typ
II
Zytoplasma lokalisiert sind
kataiytischen
in
den
kataiytischen
unterliegen, denn die Erhöhung
relativ
wenig
an
Protein
einer
zytoplasma¬
von
Wanderung
den
der
1985).
Zusammensetzung bekannt. Das
(gp 190)
immunzytochemischen
Als Mannose-enthaltendes
möglicherweise
etal.
der
kataytischen
anschliessende
(Nigg
scheint
der Struktur und Funktion der Poren ist bis heute
über deren molekulare
identifiziert und mit
es
die
Untereinheiten in den Zellkern
Porenkomplex-assoziierte
1982).
und
Untereinheiten
Trotz breitem Interesse
Untereinheiten der
Zellkern
tischen cAMP-Konzentration bewirkt die Dissoziation der
regulatorischen
sind
1981, Dingwall und Laskey
im Kern oder im
Auch die Aufnahme der
differentiellen Kontrolle
Faktoren sind, die für
wichtig sind. Bemerkenswert
Entwicklungsstadium
et al.
nicht die
die Poren in der
erste
wurde mit biochemischen Methoden
Verfahren lokalisiert
(Gerace
integrales Membran-Glykoprotein
Lipid-Doppelmembran.
Die
et al.
verankert
Häufigkeit
in den
13
(bis
Poren
Kopien pro Komplex) spricht ebenfalls für eine derartige Funktion
25
Glykoproteins (Gerace
dieses
(Davis
diese
die
Antikörpern
monoklonalen
Identifikation
und Blobel 1986, Snow etal.
Antigene
einer
zu
gebundene N-Acetylglucosaminreste
et al.
1987, Holt
1987).
et al.
Agglutinin (WGA)) bindet
al.
1987)
Xenopus
den
Import
von
spezifischen Antikörpers
Export
Glykoproteinen,
(Davis
(Dabauvalle
alle
O-glykosidisch-
und Blobel 1986, Snow
et al.
1988, Yoneda
gelang
et al.
es, in
(Finlay
et
1987)
den
Oozyten
von
mit Hilfe eines monoklonalen Poren¬
Nukleoplasmin
hemmen, wobei derselbe Antikörper
5S ribosomaler RNA und reifer tRNA hemmt
von
die
gehören
Weizenkeimagglutinin {Wheat Germ
den Kern. Kürzlich
zu
von
Porenantigenen
Interessanterweise
aufweisen
Das Lektin
Proteinen in
von
von
weiteren
von
mit Hilfe
die Zuckerreste und hemmt sowohl in vitro
an
als auch in vivo
Transport
1987).
Klasse
neuen
1982). Später gelang
et al.
auch den
(Featherstone
et al.
1988).
Das Bestreben, den Mechanismus des
aufzuklären, hat
Forbes
1988)
zwei Schritte
von
ersten
Erfolgen geführt. Sowohl
als auch in vivo
(Richardson
zerlegt werden,
nämlich in die
und Forbes
Newmeyer
Signalsequenz Voraussetzung
Zusammenfassend
experimentellen
(1988)
für die
erscheint
Bindung
mit
Systemen,
um
konnte der
den
Transport
und
Transport
in
die Kernhülle und die
an
Bindung
an
dass
heute,
die Poren.
die
Kombination
Ansätzen weitere Information über den
monoklonalen
(Newmeyer
ist das Vorhandensein einer intakten
Poren liefern wird: Identifikation und weitere
proteinen
in vitro
1988)
et al.
die Poren genauer
Translokation durch die Poren. Nach den
energieabhängige
anschliessende
Studien
zu
Transportes durch
Antikörpern
Transport
Charakterisierung
sowie der Einsatz
in Einzelschritte
zu
von
durch die
von
von
zwei
Poren¬
in vitro
-
gliedern.
1.1.2. Kernlamina
Unterhalb der inneren
fibrilläre
Schicht
Kernmembran
(20-200 nm)
beobachtet werden
kann
im
Elektronenmikroskop eine
als dritte strukturelle
Einheit der Kernhülle
(Fawcett 1966, Kalifat etal. 1967). Diese Struktur wurde als
Kernlamina bezeichnet. Sie konnte in verschiedenen
Organismen
wie Insekten,
Vögeln und Säugern nachgewiesen werden und scheint somit ein allgemeiner
Bestandteil
Benavente
der Kernhülle
1986).
Pachytän-Stadiums
von
somatischen
Zellen
zu
sein
(Krohne
und
Ueberraschenderweise konnten in den Keimzellen des
von
Xenopus
laevis
(Krohne und Benavente 1986)
und
von
14
(Stick
Hühnern
keine Lamina
Die
und Schwarz 1982, Stick und Schwarz 1983, Lehner etal.
gefunden
Lamina
werden.
wurde
Rattenleberzellkemen
ursprünglich
(Dwyer
isoliert
wurden.
prominenten
und
Der
unlösliche
Proteinen mit einem
bildet
morphologisch
biochemischen
und
Blobel
Rest
al.
1984)
Methoden konnte
1978),
der
an
(Gerace
und intranukleärer
1981)
1981,
Fisher
typische Lamine
B-typische
und
Dagenais
und Blobel
werden
Kalifat etal.
wurden
Lokalisierung
(Gerace
1967)
1980).
et
Mit
etal. 1978,
vorhanden sind. Ihr
geschätzt
1986a),
und in Invertebraten
wurden die
nachgewiesen.
Migration
Laminproteine
1980,
etal. 1978,
und Advalonic 1980, Risau et al.
1983)
1982, Fuchs et al.
et al.
Amphibien (Krohne
in
(Maul
biochemischem Verhalten
Vögeln (Shelton
in
später
Verwandtschaften und der
Gelelektrophorese
mit
1982).
at al.
immunologischer
das
der Lamina wurde auf mehr als 75%
Stick und Hausen 1980, Lehner etal.
Krohne etal.
zusammen
Netzwerk,
(Gerace
vergleichbaren Molekulargewichten,
Proteine mit
70 kDa
und Evans 1983,
nachgewiesen
(Fawcett 1966,
Zusammensetzung
und Blobel
von ca.
drei
aus
dass diese Proteine ausschliesslich in der schon früher
identifizierten Kernlamina
Anteil
Kerne
Säugerzellen gefunden (Gerace
und als Lamin A, B and C bezeichnet
Krohne et al.
aus
(Porenkomplex-Laminafraktion. PCL). Später
Lebkowsky und Lämmli 1984, Havre
immunologischen
wobei die
vorwiegend
supramolekulares
wurden die drei Proteine auch in anderen
Blobel 1980,
Methoden
1976),
sich
setzt
Molekulargewicht
ein
assoziiert ist
Porenkomplexen
mit
hohen Salzkonzentrationen und Triton X-100
nacheinander mit Nukleasen,
extrahiert
1987)
in der zweidimensionalen
in zwei Familien
unterteilt: A-
mit neutralem bis leicht basischem isoelektrischem
Lamine mit isoelektrischem Punkt im
Aufgrund
Bereich
sauren
Punkt und
(Gerace
et al.
1984, Burke und Gerace 1986). Interessanterweise wurden bei der Analyse der
Hühnerlamina mit Hilfe
ersten Mal zwei
etal.
(Lehner
von
monoklonalen
Antikörpern
neben Lamin A
zum
B-typische Lamine nachgewiesen und als Bi und B2 bezeichnet
1986a).
Während das in
geringerer Menge vorhandene Bi
immunologisch mit dem Säugerlamin B verwandt ist, ist eine Zuordnung
Lamin
B2
weniger eindeutig,
Hühnerlamin A
(Lehner
Mitteilung) verwandt.
einem in
etal.
geringer Menge vorhandenen,
etal.
1986a).
es
ist
immunologisch sowohl
mit
1986a) als auch mit Bi (S. Bailer, persönliche
Ausserdem weist
Lamin B-ähnlichen Protein der
(Lehner
denn
von
es
immunologische
und bisher
nur
Verwandtschaft mit
wenig charakterisierten
Porenkomplex-Laminafraktion
von
Säugern
auf
15
I.2. Struktur der
Laminproteine
Voraussetzung
sierung
für die
Abklärung
Sequenzen (McKeon
möglichen
strukturell
Laminproteine
Intermediärfilamentproteine
Fisher 1987, Steinen und
von
verwandt
sind
etal.
1988) zeigten,
und
dass die
zytoplasmatischen
als
deshalb
(Tabellel) (Osborn
Teil
dieser
und Weber 1986,
Roop 1988).
Intermediärfilamantproteinen
Anzahl
IFTyp
Höger
mit der Klasse der
Proteinklasse betrachtet werden können
Tabelle 1: Expression
Speziali¬
etal. 1986, Fisher etal. 1986, Krohne etal. 1987, Wolin et
al. 1987, Gruenbaum etal. 1988, Stick 1988,
nuklearen
funktionellen
ist die genaue Kenntnis ihrer Struktur. Erste cDNS-
Laminproteine
der
einer
Polypeptide
Keratine
in Zelten und Gewebena
Molekulargewicht(kDa) Zelltyp
19
40-68
1
54
Vimentin
Epithelzellen
mesenchymale Zellen
z.B. Fibroblasten
Chondrozyten
Endothelzellen
Desmin
1
53
myogene Zellen
GKal Hbrillary
Addic Protein
1
51
Astrozyten, Gliazellen
NF-L
63
Neuronen
NF-M
160
NF-H
200
(GFAP)
3
Neurofilamentp roteine
60-70
3-5
Lamine
alle somatischen
Zellen
a
(?)
Es sind nur die wichtigsten Zelltypen aufgelistet. Einige Zellen weisen eine charakteristische Koexpression von mehr als einem Intermediärfilamentprotein auf. Zum Beispiel exprimieren vas¬
kuläre glatte Muskelzellen Vimentin und Desmin, oder einige Gliazellen zeichnen sich durch den
Besitz von Vimentin und GFAP aus (aus Osborn und Weber 1986).
Die Intermediärfilamente sind Teil des
meisten
Zellen
eukaryontischen
vor.
Zytoskeletts
Den Namen erhielten diese Filamente
typischen Durchmessers
7-10 nm, denn damit
aufgrund
ihres
bezüglich
ihrer Dicke zwischen den Aktinfilamenten
(25nm).
Auch
nachgewiesen
wenn
bis
heute
werden konnte,
so
und kommen in den
von
experimentell
(4nm)
keine
liegen
sie
und den Mikrotubuli
Funktion
eindeutig
wird doch vermutet, dass diese Proteine
an
16
verschiedenen Funktionen wie der
Verankerung
der Zelle und der
Organellen beteiligt sind (Steinen
Die
1988).
Bewegung
von
Intermediärfilamente
werden
können in verschiedene Familien
des Zellkerns, der
spezifischen
Die
Analyse
und
eingeteilt
werden
(Tabelle 1).
von
cDNS- und
Proteinsequenzen ergab,
Intermediärfilamente eine zentrale,
Domäne besitzen, die
Die grosse
Beziehung
unterschiedlichen
bezüglich
ihrer
vorwiegend a-helikale
Länge (310 nm) gut
Molekulargewichten
Der a-helikale
Bereich
Sequenzmuster, aufgrund
von
dieser Proteine
besitzt
dessen
Helices umeinander winden
Länge
zu
dass die Proteine der
konserviert ist. Die
flankierenden, nicht-cc-helikalen Bereiche sind hypervariabel und führen
mit einer
und
Funktionen der differenzierten Zelle besitzen.
zytoplasmatischen
1986).
Roop
gewebespezifisch exprimiert
Variabilität könnte ein Indiz dafür sein, dass diese Proteine eine
den
Formgebung
charakteristisches
den
und Weber
repetitives
Eigenschaften sich zwei benachbarte
(Coiled Coil)
47 nm bilden
ein
(Osborn
zu
a-
und dabei eine zentrale Rod-Domäne
(Fig. 1,
genaue
Erklärung
im
Resultateteil).
Solche Dimeren bilden den Grundbaustein sämtlicher Intermediärfilamente
(Osborn
und Weber 1986, Steinen und
durch drei kurze, nicht-helikale
Roop 1988). Der
Sequenzstücke (Linker) unterbrochen, wodurch
die vier Unterdomänen 1a, 1b, 2a und 2b entstehen
Unterteilung
und Weber
der Unterdomäne 2
(Fig. 1). Allerdings
in vielen Fällen nicht ganz
ist die
eindeutig (Osborn
1986).
NCZZlal
1b
Head
Figur
a-helikale Bereich wird
1: Struktur-Modell der
]C
2b
Rod
Tail
Intermediärfilamentproteine
Die helikale Domäne (breiter rechteckiger Bereich) ist bezüglich ihrer Länge konserviert
(Ausnahme: Laminproteine von Vertebraten, siehe Resultateteil) und wird von hypervariablen
nicht-helikalen Enddomänen flankiert (N-terminale Head- und C-terminale fa/7-Domäne). Die
helikafen Elemente der flotf-Domäne (1a, 1b, 2a und 2b) sind durch nicht-helikale Linker (punktiert)
getrennt (Ausnahme: Laminproteine). Die Helices besitzen die Fähigkeit zur Bildung von Coiled
Co/7-Strukturen, wobei sich die Polypeptide parallel ineinander verdrehen. Die gestrichelten Linien
markieren die bei allen Intermediärfilamentproteinen konservierten Phasenwechsel in den
repetitiven Heptapeptiden.
17
Die Struktur der
Struktur der
der
Laminproteine
um
42 Aminosäuren
zwei
aus
Domänen
typische
1988).
nämlich
Bis
vor
dass
die
Dimere
diejenige
von
war
allerdings
vorliegenden
nur
Xenopus L\ (Krohne
B-typischen Sequenzmotiven
(Steinen
eine
etal.
sehr unsicher
war.
besitzt ebenfalls die Motive, die
B-typisch vorgeschlagen
A- und
Kenntnis der Primärstruktur
möglich sein.
Bildung
und
so
Etwa
der
aufgrund
wurden. Eine
weiteren,
10
nm-
Roop 1988).
A- und B-
dass die Existenz
gleichzeitig
{Höger
vor
allem
et al.
von
mit den
B-typische
1988).
Diese
der Primärstruktur
von
endgültige Bestätigung
B-typischen Sequenzmotiven
von
Inter¬
nicht verschobenen
Laminproteine
1987),
Sequenz
von
den
B-typische Sequenz bekannt,
eines höheren Vertebraten veröffentlicht
die Existenz
sämtlicher
Resultaten wurde mit Lamin B der Maus die erste
als
zu
etal. 1987, Wolin etal. 1987, Stick
Sequenz
Xenopus L\
zur
wurden für die
vorgeschlagen (Krohne
kurzem
ist der Coli 1b
Gegensatz
parallelen gegeneinander
Sequenzvergleichen
von
der
von
zwischen den Unterdomänen bei
Intermediärfilamente führt, nicht genau bekannt
Aufgrund
und im
besteht, ist der weitere Aufbau, der
Molekülen
Punkten
a-helikal.
Einigkeit darüber herrscht,
mediärfilamentproteine
länger,
Sequenzstücke
Laminproteinen möglicherweise
Während
einigen
zytoplasmatischen Intermediärfilamentproteine. So
Intermediärfilamenten sind die
den
unterscheidet sich in
Laminproteine
für
wird erst durch die
B-typischen Laminproteinen
18
I.3. Mitoseverhalten der
Laminproteine
Ein funktionelles Kriterium für die Klassifikation der
unterschiedliches Verhalten während der
gleichzeitig
mit der
Auflösung
Zellteilung.
der Kernhülle
Laminproteine
In der
ist ihr
Prophase, ungefähr
und der Kondensation
des
Chromatins, wird die Lamina depolymerisiert und die Laminproteine erscheinen
diffus über das ganze
1980).
Durch
Zytoplasma
Zellfraktionierung
verteilt
(Gerace
etal. 1978, Gerace und Blobel
Sedimentationsanalyse
und
wurde
Lamin A und C als lösliche Monomere existieren, und Lamin B
Vesikel
gebunden bleibt (Gerace
diese Befunde haben
zu
der
und Blobel 1980, Stick etal.
Modellvorstellung geführt,
der Chromatinseite und Lamin B auf der
(Gerace
und Blobel 1982, Gerace etal.
wie die Interaktion
von
und Gerace
1987) und
Domänen
von
Vor allem
dass Lamin A und C auf
1984). Allerdings
die dieses
Die
hydrophobe
ist bis heute
ungeklärt,
Lamina
Domäne mit der inneren
Blobel 1980, Gerace etal. 1984, Burke
cDNS-Sequenzen
Lamin B der Maus
würden.
stützen
In den
gefunden,
1988).
Lamin B mit den Membranvesikeln zustande kommt. Es
interagiert (Gerace und
1986).
mitotische
an
Membranseite der Kernlamina liegen
wurde vermutet, dass Lamin B durch eine
Kernmembran
gezeigt, dass
(Höger
von
et al.
Xenopus L| (Krohne
1988)
Konzept der Insertion
könnte
aber
auch
wurden
et al.
jedoch
keine
in die Kernmembran
aufgrund
einer
post-
translationellen Modifikation in der Kernmembran verankert sein
(Beck
etal.
1988, Wolda und Glomset 1988, siehe Kap.
ausserdem
Es
I.5.).
experimentelle Hinweise dafür, dass die Kernlamina
Membranprotein bindet,
Kernmembran
worden
(Senior
In den
gibt
an
ein
integrales
denn erst kürzlich sind zwei Proteine der inneren
beschrieben
und als
potentielle Membrananker bezeichnet
und Gerace 1988, Worman etal.
1988).
Metaphasechromosomen wurden keine Laminproteine gefunden
(Goderham und Jeppesen 1983, Lebkowsky und
Telophase,
etwa
Repolymerisation
gleichzeitig
der
mit der
Laminproteine
Bildung
Lämmli
1984).
der Kernmembran,
der
In
erfolgt die
auf der Oberfläche des sich dekonden¬
sierenden Chromatins.
Während der Mitose sind die
Laminproteine hyperphosphoryliert,
was
darauf
hindeutet, dass ihr Polymersationszustand durch Phosphorylierung reguliert wird
(Gerace
und Blobel 1980, Gerace etal.
Ottaviano und Gerace,
gelungen,
einzelne
Kirschner 1985,
1985).
In
Teilschritte
1984, Miake-Lye und Kirschner 1985,
neueren
des
Arbeiten mit in
Wfro-Systemen
Kernhüllenabbaues
Lohka und Maller 1985,
Suprynowicz
(Miake-Lye
und Gerace
ist
es
und
1986,
19
Newport
Spann 1987)
und
und des Kernhüllenaufbaues
(Lohka
und Masui
1983, Lohka und Masui 1984, Burke und Gerace 1986, Newmeyer etal. 1986a,
Newport 1987) während der
(Newport
und
Spann 1987),
Mitose
zu
dass die
analysieren. Es konnte gezeigt
Membranauflösung,
die
werden
Depolymerisation
der Lamina und die Kondensation der Chromosomen biochemisch
separierbare
Prozesse des Kernabbaues sind. Interessant scheinen in diesem Zusammen¬
hang
die
Befunde, wonach die Phosphorylierung der Lamine und die
anschliessende
Depolymerisation
der Lamina der
zeitlich
vorausgehen (Miake-Lye
1986).
Es wird angenommen, dass die
Voraussetzung
Auslöser dieses Prozesses wirkt
Laminproteine verantwortliche
Burke und Gerace
an
Homogenaten
(1986)
aus
und Kirschner 1985,
Auflösung
für die
entsprechenden
(Immunadsorption),
werden. Die
haben die
Laminproteine
Säugerzellen,
Laminproteine
So wurde
festgestellt,
Phosphorylierung der
Ausfällung
die in der
von
Metaphase blockiert
Lamin A und C oder
Antikörpern
Hinweise
im
worden
waren
geschlossenen Kernhülle gehemmt
ist offensichtlich eine
der Kernhülle
von
deren Oberfläche
beladen
(Burke
Voraussetzung
und Gerace
1986).
für den
Daneben
dafür, dass die Dephosphorylierung der
den Aufbau der Kernhülle kontrolliert.
einzelner
zwar
der Lamina beim Kernaufbau
Bedeutung
konnte der Aufbau einer
Autoren
die
Staphylococcus aureus-Bakterien,
Bildung der Lamina
die
lieferten
der Lamina
Kinase konnte bis heute nicht identifiziert werden.
monoklonalen
postmitotischen Aufbau
und Gerace
ist, aber nicht als direkter
(Fisher 1987). Die für
worden waren, untersucht. Durch die
mit
der Kernhülle
Suprynowicz
Depolymerisation
der Kernhülle
somatischen
Lamin B mit Hilfe fixierter
Auflösung
Homogenat ergab weitere
Die
Immunadsorption
interessante Resultate.
dass einerseits Lamin B nicht allein
an
die Oberfläche des
Chromatins zurückbinden kann, während sich andererseits die Lamine A und C
auch ohne die
Gegenwart
von
Lamin B
anlagern. Schliesslich lieferten Burke
an
und
der Oberfläche des Chromatins
Gerace
(1986)
Elektronenmikroskops den direkten Nachweis, dass Lamin
Vesikel
gebunden
ist. Diese Resultate stützten die
Hypothese,
B
mit
an
Hilfe
mitotische
wonach Lamin B
die Kernlamina in der Membran verankert, während die Lamine A und C
Bindung
Blobel
an
das Chromatin
1982).
beteiligt
sind
(Gerace
des
an
der
und Blobel 1980, Gerace und
20
1.4.
Entwicklungsabhängige Expression
Das Studium der
während der
der
Laminproteine
Laminazusammensetzung
Embryonalentwicklung
dieser Art wurden an
und Benavente 1986, Stick
Oozyten (ab Diplotän)
nur
Nach
1985).
und
und Hausen
einem
1987). Interessanterweise
und in den frühen
Lamin L||
von
1985),
et al.
Erythrozyten)
kürzlich
ein drittes
1981, Stick und Hausen
Lamin
von
des Krallenfrosches
L| (im Stadium der
(ab Gastrulation) verschwindet L|||
allmählich
aber interessanterweise erscheint dieses Protein
späteren Zeitpunkt
L|| wurde
meisten frühen
wurde in den reifenden
Embryonalstadien
der
Entwicklung
wieder in bestimmten
(Monozyten, Neuronen, Sertolizellen) (Benavente
und
in
allen
adulten
etal.
1985).
Zusätzlich
(mit
Ausnahme
Zelltypen
Laminprotein gefunden
und
1987).
diejenige
Die Lamina der
der
Oozyten,
(Benavente und
Arbeiten in
nur aus
Krohne
unserem
Spermatiden
einem
und
suchungen
grosse
Spermien besteht,
an
Labor
zeigten
am
Beispiel
immunzytochemischen
Lamin Bi
fällt die Abnahme
zusammen.
Lamin
ef
ähnlich wie
aus
Liv
1985).
konnten in den frühen
Mengen
L|
der
(Wolin
einzigen Laminprotein, nämlich
entwicklung drastisch verändert (Lehner
und
zu
aufgrund seiner struk¬
des Huhnes
zum ersten
dass sich der Lamin A-Gehalt in somatischen Zellen während der
chemischen
zu
Zelltypen
turellen Verwandtschaft mit menschlichem Lamin A als La bezeichnet
al.
und
Xenopus leavis vorgenommen (Krohne
Beginn der Synthese
dem
Midblastula)
(Stick
Laminproteinen. Die
Laminprotein (L|||) gefunden (Krohne
ein
Gametogenese
lieferte weitere Evidenz für funktionelle
Unterschiede zwischen den verschiedenen
Untersuchungen
während der
von
Methoden
Embryonal¬
Bei diesen mit bio¬
durchgeführten
Embryonalstadien kein
nachgewiesen
Lamin
1987).
et al.
Male,
Unter¬
Lamin A, aber relativ
werden. In den meisten Geweben
Bi zeitlich mit der Zunahme
von
Bi ist im allgemeinen in den adulten Geweben
nur
noch in
relativ
geringer Menge vorhanden, demgegenüber
allen
geprüften Entwicklungsstadien und Zelltypen ungefähr gleich gross
(Lehner
et al.
1987).
Beobachtungen
zur
In
späteren Arbeiten wurden
Gewebe- und
Laminproteine gemacht (Stewart
ist der Gehalt
Lamin A
in
an
Säugerembryonen
und Burke 1987, Lebel etal. 1987,
wenig differenzierten Zellen, allein eine funktionelle Kernlamina
Entwicklungsstudien
postulierten Funktionen
ähnliche
Entwicklungs-spezifischen Expression
1987, Röber etal. 1989). Es scheint, dass B-typische Laminproteine,
Diese
Lamin B2 in
erscheinen
der Lamina in der
vor
allem im
Interphase
Guilly
vor
der
etal.
allem in
bilden können.
Zusammenhang mit den
sehr interessant.
Aufgrund
21
der
dass die Lamina
postuliert,
und Blobel 1982,
(Gerace
wichtig
für die Struktur und Stabilität der Kernhülle ist
Miake-Lye und Kirschner 1985, Burke und Gerace,
als Anker für die
1986) und
wurde
Extraktionsbedingungen
Unlöslichkeit unter verschieden
typischen
dient
Kernporen
(Scheer
1976).
etal.
Wie
anfangs
Organisation
des Chromatins
beteiligt sein (Hancock 1982, Lebkowsky und Lämmli 1982,
Benavente und
erwähnt, könnte die Lamina
1986)
Krohne
Transkription
und die
der funktionellen
wichtige nukleare Prozesse wie die DNS-Replikation
(Hancock 1982, Cook
beeinflussen
Nigg 1988).
Blobel 1985,
der
und dadurch
an
Es ist eine attraktive
Vorstellung,
und
Laskey 1984,
dass die Modulation
Laminazusammensetzung während der Embryonalentwicklung wichtige
Differenzierungsschritte beeinflusst.
l.5.Biogenese
der
Laminproteine
A wird als Vorläufer mit einem
Säugerlamin
Molekulargewicht synthetisiert (Laliberte"
1985).
et al.
Dagenais
Kernlamina
Biogenese
et al.
des reifen Proteins führt,
Bildung
für dieses Protein kein Voriäufer
am
allerdings nicht
war
die diese
im
Zytoplasma
Funktion als
et al.
von
Beim Studium der in vivo-
die Art der Modifikation, die
zur
menschlichem Lamin A darstellt und da
gefunden
worden war, wurde vermutet, dass
(McKeon etal. 1986, Fisher
etal.
Vermutung bestätigen würden, sind
Signal
spekuliert,
dass
(Lehner
verhindern könnte
1986).
bis heute
er
eine
et al.
frühzeitige
1986b),
aber
für die Aufnahme in den Zellkern wurde diskutiert
1984, Gerace etal. 1984). Damit hätte der Vorläuferanteil eine
ähnliche Funktion wie die klassischen
anderen
1984).
bekannt. Ueber die Funktion des Vorläuferanteils von Lamin A ist
Oligomerisierung
(Laliberte
grösseren
nichts bekannt. Da menschliches Lamin C
ebenfalls nichts bekannt. Es wurde z.B.
auch eine
kDa
A wurde in unserem Labor ebenfalls ein
C-Terminus modifiziert wird
Experimentelle Daten,
3
1984, Gerace et al. 1984,
et al.
1986b). Ueber
eine C-terminal verkürzte Variante
Lamin A
et al.
Hühnerlaminprotein
gefunden (Lehner
Voriäufer
ca.
Der Vorläufer wird beim Einbau in die bestehende
prozessiert (Gerace
von
um
Signalpeptide,
die die Lokalisation in
Zellkompartimenten und Organellen bestimmen (Blobel 1983).
Ueberraschenderweise wurde mit Pu/se-Cnase-Experimenten in Hühner¬
embryofibroblasten
einem
ein
immunologisch
mit Lamin
B2 verwandtes Protein mit
geringfügig höheren Molekulargewicht gefunden (Lehner etal. 1986b).
Aufgrund
der extremen
Kurzlebigkeit (Halbwertszeit
von
drei
Minuten)
war
die
22
weitere
Charakterisierung
dieses Proteins
schwierig
und somit blieb unklar, ob
dieses als B2-Variante bezeichnete Protein einen Vorläufer
von
Lamin B2
darstellt.
Nach neuesten Erkenntnissen scheinen in
Voriäufer
Glomset
von
Lamin A
1988).
isoprenyliert
Säugerzellen
(Beck
werden
zu
Verankerung
der Lamina in der Kernmembran
Offensichtlich wird die Struktur der
der Funktion der Lamina zweifellos
I.6.
1988, Wolda und
zu
Isoprenanteil eine
Rolle bei
spielen könnte (vgl. Kap. I.3.)
nach ihrer
Laminproteine
verschiedenste Weise verändert. Es wird
Modifikationen
et al.
Ueber die genaue Struktur und die Funktion dieser Modifikation
ist nichts bekannt, es wird aber vermutet, dass der
der
Lamin B und der
Synthese
auf
für das Verständnis des Aufbaus und
wichtig sein,
diese
posttranslationellen
analysieren.
Zielsetzung
Die
Eigenschaften
biochemischen und
der
Laminproteine
immunologischen
sind in den verschiedensten
Spezies
mit
Methoden recht gut untersucht worden.
Dabei stellte sich heraus, dass diese Kernhüllenproteine in zwei Subfamilien
eingeteilt
werden können. Die
Frage
nach der Funktion der Kernlamina im
allgemeinen und der B-, beziehungsweise
speziellen,
blieb weiterhin
weitere Studium der
der
Eine wesentliche
ungeklärt.
Eigenschaften und Bedeutung
Kenntnis ihrer Primärstruktur. Das erste Ziel der
die Isolation und
Sequenzierung
laminproteine A,
Bi und B2
von
B-typische
kodieren.
Laminproteine auf
Voraussetzung
dieser
Die
es
aus
den
auch
strukturelle
war
deshalb
cDNS-Sequenzen
molekularer
Ebene
überprüfen,
zu
zu
in A-
identifizieren.
allgemein akzeptierten biochemischen Kriterien
Unterscheidung
A-
und
B-typischen
gibt vermehrte Hinweise dafür, dass die Laminproteine
wesentliche
Laminproteinen
Es
Merkmale
Arbeit
ist die
ermöglichen, die Einteilung
beziehungsweise Subfamilien-spezifische Sequenzmotive
Damit stünden neben den heute
für das
Kernproteine
vorliegenden
im
cDNS-Klonen, die für die drei Hühner-
abgeleiteten Aminosäuresequenzen sollten
und
A-typischen Laminproteine
Eigenschaften
zur
zur
von
Verfügung.
wie die
Verankerung
während der Mitose durch
in der Kernmembran oder die Löslichkeit
posttranslationelle Modifikationen
isolierten cDNS-Klone und die damit verbundene
Laminproteine herzustellen,
sollte
es
erwerben. Die
Möglichkeit, synthetische
erlauben, die Biogenese dieser Proteine
zu
23
studieren. Durch
Vergleich
von
Proteinen sollte insbesondere
synthetischem
Lamin B2 mit in vivo
abgeklärt werden,
ob die
hergestellten
kurzlebige
Lamin
B2-
Variante ein Vorläufer des reifen Proteins darstellt. Die Kenntnis der Amino¬
säuresequenz sollte weitere Charakterisierungen, wie Lage und Art der
posttranslationellen
durch
ermöglichen. Diese Fragen sollten
Vergleich genau definierter Spaltprodukte
authentischen
war
Modifikationen
Laminproteinen
versucht
werden,
prenylieren.
durch
von
Lamin B und Vorläufer
synthetischen und
von
Säugerzellen nachgewiesenen
Lamin A. Dazu sollte zunächst
synthetisch hergestellte Laminproteine
Mit einem solchen
System
würde sich die
in vitro
bestimmen. Aus dem Studium der
umfassende
gewonnen werden.
von
der
Biogenese
Die erzielten Resultate sollten
iso-
Aminosäure zu
posttranslationellen Modifikationen
Vorstellung
zu
Möglichkeit eröffnen,
Expression gezielt mutierter cDNS-Klone die isoprenylierte
einigermassen
allem
bearbeitet werden. Von besonderem Interesse
schliesslich das Studium der erst kürzlich in
Isoprenylierung
von
vor
der
sollte eine
Laminproteine
insbesondere
mögliche
Erklärungen für bestimmte Eigenschaften dieser Kernhüllenproteine liefern.
Im
Zusammenhang mit der Isolierung
war es von
Dabei wurde
von
Lamin
A-spezifischen cDNS-Klonen
Interesse, monoklonale Antikörper gegen Lamin A herzustellen.
gleichzeitig das
Kernhüllenantigene
zu
Ziel
isolieren.
verfolgt, Antikörper gegen bisher unbekannte
24
II.
Abkürzungen
ßME
ß-Mercaptoethanol
Bp
Basenpaar
BSA
Rinderserumalbumin
cDNS
DNS, komplementär
CMF
Hank's Balanced Salt Solution ohne Kalzium und
CS
Hühnerserum
DFP
Diisopropylfuorphosphat
DMEM
Dulbecco's Modified
DNase
Deoxyribonuklease
DNS
Deoxyribonukleinsäure
DTT
1,4-Dithiothreithol
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
FCS
Serum von fötalen Kälbern
Gin
L-Glutamin
IAA
Jodacetamid
IEF
Isoelektrische
Ig
Immunglobulin
IPTG
Isopropyl-ß-D-thio-galaktopyranosid
MEM
Minimum Essential Medium
mRNS
Boten
NCS
Serum
PBS
Salzlösung,
PEG
Polyethylenglykol
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
poly(A)+
RNS
(bovine
zu
serum
albumin)
mRNS
Magnesium
(chicken serum)
Eagle's Medium
Fokusierung
(messenger)-RNS
von
neugeborenen Kälbern
mit
Phosphat gepuffert (phosphate
polyadenylierte RNS
PS
Penicillin-Streptomycin
RIPA-Puffer
Radioimmunoprecipitationassay-Putfer
RNS
Ribonukleinsäure
rpm
Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
RPMI-Medium
Roswell Park Memorial Institute Medium
RT
Raumtemperatur
SDS
Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
SDS-PAGE
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
TPB
Tryptose Phosphate
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Broth
buffered
saline)
25
III. MATERIAL UND METHODEN
HU. Zellkulturen
111.1.1.
-
Lösungen.
Seren und Medien
Hank's Balanced Salt Solution ohne Kalzium und
Lösung
enthielt
Magnesium (CMF):
Ein Liter
8g NaCI, 0.4g KCl, 0.06g Na2HPO4-2H20, 0.06g KH2PO4,1g
Glucose, 10mg Phenolrot, 0.35g NaHC03.
Eine zehnfach konzentrierte
Stocklösung
siert und bei 4°C aufbewahrt.
Aliquote
wurde durch Sterilfiltration sterili¬
jeweils
wurden
in autoklaviertem
Wasser verdünnt.
-
Dulbecco's Modified
min
Eagle's Medium (DMEM),
Roswell Park Memorial Institute Medium 1640
-
Dulbecco's Modified
-
-
4.5g Glucose,
(RPMI),
(Gibco)
(Amimed)
Leibovitz L-15 Medium, ohne L-Glutamin
Tryptose Phosphate
Broth
(Gibco)
(TPB) (Gibco)
(FCS) (Nabi)
Serum
von
fötalen Kälbern
-
Serum
von
neugeborenen Kälbern (NCS) (Inotech)
-
Hühnerserum
-
L-Glutamin
-
ohne L-Glutamin
Eagle's Medium (DMEM), mit 4.5g Glucose, ohne L-Gluta¬
-
-
ohne L-Gluta¬
(Amimed)
-
min
mit
(CS) (Gibco)
(Gin), Stocklösung
200 mM
(Gibco)
Penicillin-Streptomycin (PS), Stocklösung
Trypsinlösung (2.5%)
in Kalzium- und
100 U/ml
(Gibco)
Magnesium-freiem PBS (Amimed)
26
Gelatinelösung, 0.1%
in
H2O, autoklaviert
Kulturmedium für
Hühnerembryofibroblasten:
94 ml DMEM, 1ml
NCS, 1ml CS, 2ml TPB, 1ml Gin, 1ml PS
Kulturmedium für
B6 Nierenzellen:
Xenopus
H2O, 59.5 ml Leibovitz L-15, 8 ml FCS, 5 ml TPB,
25.5 ml
1ml
Gin, 1ml PS
Hybridomazellen:
Kulturmedium für PAI- und
87 ml RPMI, 10 ml NCS, 1.25ml Gin, 1.25
NaPyruvat (100mM),
1ml PS
Markiermedium ohne Serum:
98 ml MEM ohne L-Methionin und ohne L-Glutamin
(Gibco),
1ml Gin
(Gibco),
4ml FCS, 1 ml
1ml PS
Markiermedium mit Serum:
94ml MEM ohne L-Methionin und ohne L-Glutamin
Gin,
1ml PS
Medium für die
für die
Herstellung
Amin Kit
sung
Markierung
von
35S-Cystein:
100ml Markiermedium wurden
(Gibco) folgende
(10X konzentriert),
(Ausnahme: Cystein),
mit
sterilen
75 ml
1ml
aus
Lösungen gemischt:
H2O, je 1ml
Vitamingemisch
von
dem MEM-Select
10 ml Earle Salzlö¬
jeder Aminosäurelösung
und 2.93ml
NaHC03 (7.5%).
pH wurde vorsichtig mit 1N HCl auf 7.3 eingestellt. Zu der einen Hälfte
diums wurden 2 ml FCS und 0.5 ml PS
zugegeben,
zu
Der
des Me¬
der anderen Hälfte
nur
0.5 ml PS.
111.1.2. Primärkulturen
-
Hühnerembryofibroblasten:
Hautstücke wurden
in
möglichst
von
10-1
kleine Stücke
während 30 Minuten im
Itägigen Embryonen abgezogen, mit der Pinzette
zeriegt
und in 10ml CMF mit 200 uJ
C02-lnkubator (5% CO2)
Trypsinlösung
in Einzelzellen disoziiert. Die
27
Zeilen wurden in einer
5ml Kulturmedium
zu
Tischzentrifuge sedimentiert (5Minuten, 200xg)
resuspendiert. Um
und in
weitere Einzelzellen aus den Hautstücken
lösen, wurde mit einer Pasteurpipette mehrere Male auf- und abpipettiert. Mit
einem sterilen
Gewebereste
Nylonfilter
von
mit 10um
den Fibroblasten
wurden
grössere
Die Zellen wurden in
geeigneter
Porendurchmesser
abgetrennt.
Verdünnung (ungefähr 1-3x105 Zellen/ml) ausplattiert und im C02-Inkubator
kultiviert, bis die ganze Kulturschale konfluent bewachsen
wurden dann mit
Trypsin
von
der Kulturschale
Kulturschalen vermehrt. Die Zellen
wurden wieder mit
Zellen wurden im
Trypsin
von
von
war.
Die Zellen
und auf mehreren
gelöst
neuen
wiederum konfluenten Kulturschalen
den Kulturschalen
flüssigen Stickstoff gelagert und
gelöst
eingefroren. Die
und
konnten bei Bedarf
aufgetaut
werden.
111.1.3. Zellinien
Die verschiedenen Zellinien wurden
-
-
von
folgenden
Personen erhalten:
Xenopus B6-Nierenzellen: G. Ryffel, Kernforschungszentrum
PAI-Zellen
(Maus-Myelomazellen):
Die Zellinien wurden in
und im
entsprechenden
Karlsruhe
V. Kurer, ETH Zürich
Aliquoten eingefroren.
Kulturmedium
Bei Bedarf wurden sie
(vergl. 111.1.1.) kultiviert.
Die
Nierenzellen wurden bei 26°C in verschlossenen Kulturflaschen
Zellen und etablierte
Hybridomazellinien
bei 37°C kultiviert. Die
beschrieben
111.1.4.
-
wurden im
aufgetaut
Xenopus B6-
gezüchtet.
PAI-
C02-Inkubator (5% CO2)
Herstellung der Hybridomazellinien
ist weiter unten
(III.3.1.-III.3.3.).
Passagieren, Einfrieren und Auftauen
von
Zeilen
Passagieren
Schwach adhärente Zellen
mit einer
Pasteurpipette
von
Medium verdünnt.
neuem
wenige
dem
der Kulturschale
(10cm Durchmesser) gegeben.
Minuten in den C02-Inkubator
vom
Substrat
Abspritzen
in
wurden zweimal mit CMF
wurden 2 ml CMF und 2
Mikroskop (Phasenkontrast)
Zellen
wurden durch
gelöst, kurz abzentrifugiert und
Hühnerembryofibroblasten
gewaschen. Anschliessend
Kulturschale
(PAI, Hybridomazellen)
Tropfen Trypsin in die
Die Kulturschalen wurden für
gestellt. Das Ablösen der Zellen wurde mit
überwacht. Sobald sich der
gelöst hatte, wurde
die Aktivität des
grösste Teil der
Trypsins durch Zugabe
28
von
2ml 10% FCS in CMF
gestoppt. Nach der Sedimentation (5 Minuten, 200xg)
wurden die Fibroblasten in frischem Medium
resuspendiert und
in
geeigneter
Verdünnung ausplattiert.
Xenopus B6-Nierenzellen wurden auf die gleiche Art und Weise passagiert
wie
Hühnerembryofibroblasten,
anstelle
von
CMF wurde
jedoch 70% CMF
in
H2O verwendet.
-
Einfrieren:
Zellen
wurden
von
den
Kulturschalen
sedimentiert
(5 Minuten, 200xg).
schutzmedium
resuspendiert und
Das
in ein
Gefrierschutzmedium wurde das
gelöst (vgl.
Sediment
Passagieren)
wurde
in
2ml-Gefriergefäss (Nunc)
1ml
und
Gefrier¬
transferiert. Als
jeweilige Kulturmedium verwendet, supple-
mentiert mit 10% DMSO und 20% NCS. Die Zellen wurden über Nacht in
geschlossenen Styroporbehältern bei -70°C langsam eingefroren
möglichst
-
schnell in
flüssigen
und dann
Stickstoff transferiert.
Auftauen:
Zellen wurden
so
schnell wie
möglich
in einem Wasserbad bei 37°C auf 2-
5°C getaut und sofort in 10ml kaltes Kulturmedium verdünnt. Nach der Zentri-
fugation (5 Minuten, 200xg) wurden die sedimentierten Zellen in frischem Kultur¬
medium in
geeigneter Verdünnung ausplattiert.
111.1.5. Metabolische
Markierungen
Die Zellen wurden zweimal mit dem Markiermedium ohne Serum
Um den im Zellinnem vorhandenen Vorrat
mit Markiermedium ohne Serum
an
(4ml pro
Methionin
10cm
zu
gewaschen.
senken, wurden sie
Kulturschale)
während 30
Minuten im C02-Inkubator inkubiert. Danach wurde das Medium durch Markier¬
medium mit Serum ersetzt. Für
Markierungen während
4 bis 6 Stunden wurden
50u,Ci/ml, für Pulsmarkierungen (5-10 Minuten) 200 u.Ci/ml 35S-Methionin
zugegeben.
Für
Markierungen über Nacht mit
35S-Cystein
markierte Aminosäure ebenfalls in einer "Konzentration"
von
wurde die radioaktiv
50u,Ci/ml
eigesetzt.
29
III.2.
Präparation
111.2.1. Puffer und
-
Fraktionierung
und
von
Zellkernen
Lösungen
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF),
100x
Stocklösung (0.1 M PMSF
in
Isopro-
panol)
0.174g PMSF
für 10ml:
-
-
Isopropanol
lösen
Trasylol, Stocklösung 20'000KIE/ml (Bayer)
ß-Mercaptoethanol (ßME),
ßME
(Fluka)
14.1M
und die Proteaseninhibitoren PMSF und
Gebrauch
-
in
zu
den Puffern
für 500ml:
jeweils
kurz vor
gegeben.
(0.5M Tris-HCI, pH 7.5,
TKM 10x
wurden
Trasylol
50 mM
MgCl2,
25mM
KCl)
30.27g Tris, 5.08g MgCl2.6H20. 0.932g KCl. mit HCl
auf
pH 7.5 (RT)
einstellen.
-
TKM
(50mM Tris-HCI, pH 7.5,
5mM
MgCl2, 2.5mM KCl,
1mM
PMSF, 1%
Trasylol, 3mM ßME)
kurz
-
Gebrauch: +PMSF,
für 500ml:
42.78g Saccharose, 50ml
vor
2.1/TKM
Gebrauch:
(2.1 M
2.3/TKM
kurz
vor
PMSF, 1% Trasylol, 3mM ßME
TKM 10x
+PMSF, +Trasylol, +ßME
Saccharose in
TKM)
359.4g Saccharose, 50ml TKM 10x
(2.3M
für 500 ml:
-
M Saccharose in TKM, 1mM
(0.25
für 500ml:
-
+Trasylol, +ßME
0.25/TKM
kurz
-
vor
Saccharose in TKM, 1mM PMSF, 1%
393.6g Saccharose, 50ml TKM
Gebrauch: +PMSF,
Verdauungspuffer
1mM PMSF, 1%
1
Trasylol, 3mM ßME)
10x
+Trasylol, +ßME
(10mM Tris-HCI, pH 8.5,
Trasylol, 3mM ßME)
0.1 mM
MgCl2,
10% Saccharose,
30
-
Verdauungspuffer
1mM
-
-
(10mM Tris-HCI, pH 7.5,
0.1 mM
10% Saccharose,
MgCl2,
PMSF, 1% Trasylol, 3mM ßME)
Hochsalzpuffer (100mM Tris-HCI, pH 7.5,
3mM
-
2
2M
NaCI, 1mM PMSF, 1% Trasylol,
ßME)
in
(Sigma D-5010): Stocklösung (1 mg/ml)
DNase I
Aliquoten
bei -20°C
RNase A
(Sigma R-5000): Stocklösung (1 mg/ml)
gelagert, aufgetaute Aliquote
Verdaungspuffer 2,
nur
in
in
einmal verwendet
Verdauungspuffer 2,
in
Aliquoten bei -20°C belagert, Aliquote zwei- bis dreimal verwendet
-
Phosphate buffered saline (PBS) (8mM Na2HP04,1.5mM KH2PO4,138mM
NaCI, 4mM KCl)
Hl.2.2. Zellkerne
Zellkerne
gesehen
aus
von
aus
Lebergewebe
Lebern
von
18
Tage
alten
Hühnerembryonen wurden,
kleineren Modifikationen, nach der Methode
Blobel und Potter
von
(1966) präpariert. Alle Präparationsschritte wurden auf Eis ausgeführt.
Lebern wurden nach der Entnahme in 0.25/TKM
von
0.25/TKM
Embryonen
einem
Nylonfilter (Maschenweite:
wurde durch
Die
Zugabe
von
110
um)
Die
1:1)
zehn
wurden die
Auf-
wurden durch drei
und
Lagen
filtriert. Die Konzentration der Saccharose
2.3/TKM erhöht
Mischung wurde auf ein Kissen
Homogenate
=
mit
Potter-Elvehjem-Homogenisator
Abwärtsbewegungen homogenisiert.
Die
gewaschen. Nach der Zugabe
(Volumen der Embryonen:Volumen 0.25/TKM
in
ab¬
von
(3
Teile 2.3/TKM
15 ml 2.1/TKM
1 Teil
zu
Homogenat).
geschichtet.
Die Kerne
wurden dann in einem Beckman SW 27 Rotor während 60 Minuten bei 25'000
rpm sedimentiert. Das Kernsediment wurde in TKM
1000xg).
Die
unversehrt
zwischen
gewaschen (10 Minuten,
Erythrocyten blieben dank der milden Homogenisation mehrheitlich
und
wurden
auf dem
Homogenat und 2.1/TKM
Stufengradienten
von
den Kernen
an
der
abgetrennt.
Phasengrenze
31
Hl.2.3.
Porenkomplex-Laminafraktion
Porenkomplex-Laminafraktionen
Variante
Zellkerne
Blobel
Dwyer und
von
(50mg Kernprotein)
Mit TKM
gewaschene
Hühnerleber wurden in 5ml
embryonaler
aus
modifizierten
leicht
einer
(1976) präpariert.
MgCl2 (0.1 mM) resuspendiert,
eiskaltem
nach
wurden
wobei die
Salzlösung
ständigem Rühren dazugegeben wurde. 25
tropfenweise
und unter
Stocklösung
und 25 ul
RNase
A-Stocklösung
am
Anfang
ul DNase I-
unverzüglich dazu-
wurden
pipettiert. Nach dem Mischen (Vortex) wurden 20ml Verdauungspuffer
dazugegeben.
durchgeführt. Die verdauten
5ml
Verdauungspuffer
Stocklösung
wurde bei
Verdauung
Die
2
Kerne wurden sedimentiert
15 Minuten
(10 Minuten, 2000xg),
resuspendiert und nach der Zugabe
und 25ul RNase
Raumtemperatur
Raumtemperatur während
von
1
in
25ul DNase I-
erneut während 15 Minuten bei
A-Stocklösung
verdaut. Die restlichen Strukturen, die sogenannten Kern¬
hüllen, wurden während 10 Minuten bei 10000xg sedimentiert und das Pellet in
Verdauungspuffer
4.5ml
100
(10%, w/v)
2
resuspendiert. Nach
der
Zugabe
von
0.5ml Triton X-
wurden die Kernhüllen während 10 Minuten auf Eis extrahiert
und die verbleibenden unlöslichen Kernstrukturen bei
sedimentiert
10000xg
(10
Minuten, 4°C). Nach der Resuspendierung in 2.5ml Verdauungspuffer 2 wurden
auf
Die Extraktion wurde während 10 Minuten
Hochsalzpuffer dazugegeben.
2.5ml
Eis
durchgeführt
und
die
unlöslichen
Reste,
Porenkomplex-
die
Laminafraktion, wurden bei 13000xg sedimentiert (10 Minuten, 40C), einmal in
destilliertem Wasser
PBS
gewaschen und schliesslich
in 300-500
jllI Wasser oder
resuspendiert.
Hl.2.4.
Fraktionierung
von
Für das Studium der in
verschiedene Fraktionen
wurden auf Eis
markierten
kultivierten
wfro-Prozessierung
von
durchgeführt.
Fibroblasten
Hühnerembryofibroblasten
Fibroblasten
von
Lamin A
hergestellt.
Die während kurzer Zeit
(approx. 107/Schale)
zweimal mit eiskaltem PBS und einmal mit
Alle
(Kap. IV.9.)
wurden
Präparationsschritte
(4-10 Minuten)
radioaktiv
wurden in der Kulturschale
Homogenisationspuffer (10
mM Tris-
HCI, pH 7.4, 140 mM KCl, 1.5mM MgC*2, 1mM PMSF, 5mM Jodacetamid und
200KIE
Trasylol/ml) gewaschen
und mit 750u,l
Homogenisationspuffer über¬
schichtet. Die Zellen wurden mit einem Gummischaber
abgelöst und
in
einem
Dounce
von
Homogenisator durch
der Kulturschale
20
Auf-
und
Ab-
32
wärtsbewegungen
aufgeschlossen.
Der Anteil
Phasenkontrastmikroskopie überprüft und
Zellen wurde durch
95%. Zur
B
Stöpsel
mit dem
Kern- und einer
Herstellung einer
an
lysierten
war
grösser als
Zytoplasma-Fraktion
wurde das
Homogenat bei niedriger Rotordrehzahl (8 Minuten, 1000xg) zentrifugiert.
Durch
während
Zentrifugation
eine
in
Homogenat
Ueberstand
Minuten
30
bei
in
partikuläre Fraktion und
aufgeteilt.
Dazu wurden kleine
wurde
100'000xg
einen
das
postmikrosomalen
Eppendorfröhrchen vollständig
mit
Homogenat (750u1) gefüllt. Die mit Parafilm abgedichteten Röhrchen wurden
dann in den Beckman SW
40-Zentrifugenbechem,
pH7.5, 5% Saccharose, gefüllt
waren, während 30 Minuten
(100'000xg) zentrifugiert (4°C).
Alle Zellfraktionen wurden
präzipitationsexperimenten (Kap. III.6.)
NaDeoxycholat
(w/v)
und 0.1%
die ganz mit 10mM Tris-HCI,
auf 1%
(w/v)
eingestellt. Dabei
SDS
bei 40'000 rpm
vor
den Immun-
Triton X-100, 1%
(v/N)
wurden 20x konzentrierte
Stocklösungen verwendet.
III.3.
Herstellung
111.3.1.
von
Immunisierung
monoklonalen
von
Mäusen
8-12 Wochen alte Mäuse
Laminafraktionen
komplettem
Freund'schem
Vier Wochen
(Balb/c)
Lebern
aus
von
18
intraperitoneal mit Porenkomplex-
Tage alten Hühnerembryonen
Protein
in
/Maus).
später wurde den Mäusen wieder dieselben Antigene in
Woche nach der zweiten
Schwanzvene
wurden
Adjuvans (Gibco) immunisiert (300ug
Freund'schem
inkomplettem
Antikörpern
einige
Zellkernproteinen
ul
Adjuvans (Gibco) intraperitoneal injiziert.
Injektion
Blut
wurden den Mäusen durch Anstechen der
entnommen.
wurde in einem
Eine
Die
Reaktivität der Seren
Immunfluoreszenzexperiment
an
mit
Fibroblasten
getestet. Drei Wochen später wurde denjenigen Mäusen, die eine starke
Immunantwort
wiederum
Antigens
den
das
Antigen
intraperitoneal injiziert.
in
inkomplettem
beiden
injiziert.
gezeigt hatten,
Drei
an
drei
aufeinanderfolgenden Tagen
Dabei wurden
Freund'schem
am
ersten
Adjuvans und 50u,g
Tag 50ug
in PBS
injiziert.
folgenden Tagen wurden jeweils 100ug des Antigens
Tage
nach der letzten
und deren Milzzellen mit
Antigeninjektion
Myelomazellen fusioniert.
des
wurden die Mäuse
in
An
PBS
getötet
33
111.3.2. Fusion
5-6
Myelomazellen
Tage nach der letzten Antigeninjektion wurden die Mäuse durch
Genickbruch
aus
Milzzellen mit
von
getötet und
in 70% Ethanol desinfiziert. Die Milz wurde
aseptisch
dem durch Sectio eröffneten Peritoneum entnommen und in 10 ml GKN
mM NaCI, 5.36 mM
KCl,
10mM
Na2HP04,
5mM
NaH2P04,
11.1mM
(137
Glucose,
10mg Phenolrot/I) mit einem Plastikspritzen-Stöpsel durch ein Stahlnetzchen
gepresst. Die Zellsuspension wurde in einem sterilen Falconröhrchen
Sedimentation
Die Zellen
von
zur
grösseren Gewebsfetzen drei Minuten lang stehen gelassen.
(normalerweise
1-2x108/Milz)
wurden in 10 ml GKN
resuspendiert
und in ein konisches 50ml Falconröhrchen transferiert. Zu den Milzzellen wurden
1-5x107
GKN
PAI-Zellen
(Maus-Myelomazellen) gegeben,
gewaschen worden
Nach
waren.
Minuten, 200xg) wurde der Ueberstand
Operationen
so
die vorher einmal mit 10 ml
Zentrifugation
der
Zellmischung (8
gut wie möglich entfernt. Die weiteren
wurden in einem Wasserbad bei 37°C mit auf 37°C
Lösungen ausgeführt.
Zum Zellsediment wurden 0.5ml PEG 4000
vorgewärmten
(Merck,
Kat.Nr.
9727, 50% (w/v) in GKN) tropfenweise während 30 Sekunden zugegeben. Das
Röhrchen wurde während der
PEG-Zugabe geschüttelt.
Zellsuspension
lang
90 Sekunden
ohne Schütteln
wurden dann 10ml GKN während 4-5 Minuten
Nachher wurde die
inkubiert.
zugegeben.
Inkubation ohne Schütteln wurden die Zellen einmal mit einer
und
abpipettiert
und während 8 Minuten bei
200xg
Tropfenweise
Nach 10 Minuten
10ml-Pipette
auf-
sedimentiert. Die Zellen
wurden in 80 ml HAT-Medium
ergänzt
(Hybridoma-Kulturmedium, vgl. Kap. 111.1.1.,
Hypoxanthin, 0.4uM Aminopterin und 1.6u,M Thymidin)
mit 0.1 mM
resuspendiert. Die Zellsuspension
verteilt, in denen
plattiert
worden
1OOuJ normalem
am
war
Tag
vor
wurde auf 8
der Fusion ein
(1-2x105
Milzzellen
von
Subklonierung
von
der
Fusion
mit
indirekter
nerembryofibroblasten getestet. Es
Milzzellen
aus-
nicht immunisierten Mäusen in
wurden
Hybridomaklone
gesammelt worden
wurden
Immunfluoreszenz
nur
Klone
Antikörper eine Kernfluoreszenz ergaben. Sobald
Kulturüberstand
von
Hybridomazellen
Die Kulturüberstände der aufwachsenden
nach
Feederlayer
Hybridoma-Kulturmedium/Loch).
III 3.3. Selektion und
Tage
Mikrotiterplatten (100uJ/Loch)
von
10-14
auf
Hüh¬
aufgezogen,
deren
einem
800ul
Klon
waren, wurde die Reaktivität der darin
34
Antikörper
enthaltenen
reaktive
Zellen
in einem
Immunoblotexperiment
untersucht. Klone, die
Antikörper produzierten, wurden zweimal subkloniert.
in
limitierender
zusammen
normalen
wurden
mit
am
Verdünnung (0.3,
Maus/Mikrotiterkultur) ausgesät.
aufgezogen,
nachdem
die
Zellen/Mikrotiterkultur)
3 und 30
Vortag angesetzten Feederzellen
Dazu wurden die
(1-2x105
Milzzellen einer
Jeweils drei verschiedene Subklone
Reaktivität
ihrer
in
Antikörper
einem
Immunfluoreszenztest
Aliquote
von
überprüft worden war. Von jedem Subklon wurden zwei
ungefähr 107 exponentiell wachsenden Zellen eingefroren und in
flüssigem Stickstoff gelagert.
Hl.3.4. Produktion
Gewinnung
Zur
Hybridomakulturüberständen
von
von
Hybridomakulturüberständen
stationären Phase kultiviert.
geerntet,
an
dem noch
wurden die Zellen bis
Die Ueberstände wurden
möglichst wenige
zu
einem
zur
Zeitpunkt
tote Zellen vorhanden waren. Die
Zelltrümmer wurden
abzentrifugiert (5 Minuten, 200xg) und die Ueberstände
wurden
NaAzid
mit
experimente
0.02%
wurden
bei
4°C
Ueberstände
von
gelagert.
Für
serumfreien
ImmunpräzipitationsHybridoma-Zellkulturen
verwendet. Zur
Gewinnung
Hybridomazellen
zunächst in normalem Kulturmedium bis kurz
der
der serumfreien
Kulturüberstände
logarithmischen Wachstumsphase kultiviert.
Das
wurden die
vor
dem Ende
serumhaltige
Medium
wurde dann durch serumfreies Wissler BM86 Medium ersetzt. Die Zellen wurden
dann wieder bis zum Ende der stationären Phase kultiviert
serumfreien Ueberstände wurden
und bei 4°C
Hl.3.5.
gelagert.
Subklassenbestimmung
Beyer (1984)
Antikörper
je
wurden mit der Dotblotmethode
bestimmt. Nitrocellulosestreifen wurden 10 Minuten in PBS
befeuchtet und anschliessend wieder
wurde
Die
gesammelt, zentrifugiert (5 Minuten, 200xg)
Die Subklassen der monoklonalen
nach
(2-3 Tage).
vollständig getrocknet.
Von
ein ul Kulturüberstand auf fünf verschiedene Sreifen
Nachdem die Proben
BSA 30 Minuten
Stunden mit
eingetrocknet
lang inkubiert.
jedem
Klon
aufgetragen.
waren, wurden die Streifen in PBS mit 3%
Die Streifen wurden dann während zwei
Kaninchenantikörpern inkubiert, die spezifisch
nur
mit bestimmten
35
Mausantikörpern reagieren (anti IgM,
Subklassen
von
lgG2b.
lgG3,
anti
anti
IgGA; Nordic,
anti
Kaninchenantikörper
experimenten (vgl. Kap. III.5)
anti
lgG2a>
1:300 verdünnt in PBS mit 3%
Kontrolle wurde ein Streifen in PBS mit 3% BSA ohne
gebundenen
IgGi.
dann
wurden
mit Peroxidase
anti
BSA).
Als
Antikörper inkubiert.
Die
wie
bei
Immunoblot-
Protein A nach¬
gekoppeltem
gewiesen.
III.4.
Gelelektrophorese
Eindimensionale
nach der Methode
wurden
von
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
von
Lämmli
(1970) durchgeführt.
Radioaktive Proteinmarker
Standardproteine
nicht-radioaktive
Amersham,
wurde
von
Bio
Rad
bezogen.
Für die zweidimensionale
Gelelektrophorese
wurden die in w'fro-Translationen
und die Pansorbin-Pellets mit Wasser auf 30ul verdünnt. Anschliessend wurde
den
Proben
4u1
ß-Mercaptoethanol
und
20u1
zugegeben. Nach einer Inkubation bei 37°C
Proben mit 5ul
Ampholyten (Pharmacia,
das Pansorbin durch
entfernt.
In
Zentrifugation
der ersten
Dimension
geringfügigen Aenderungen,
thode der isoelektrischen
durch die
dem Laden der Proben eine
jeder
Im Falle der
wurden
von
O
die
Probe
57mg
Immunpräzipitate
5
wurde
Minuten)
(1975) beschriebene
Als
Elektrodenpuffer
von
Me¬
wurden
verwendet. An die Gele wurde
Spannung angesetzt,
je
Harnstoff
Proteine, abgesehen
'Farrell
Aethylendiamin
erhöht wurde: 500V und 750V während
(10%, w/v)
3-10 und 4 Teile
Raumtemperatur (17'000xg,
Fokusierung aufgetrennt.
0.01 M Glutaminsäure und 0.01 M
vor
bei
Ampholyten pH
wurden in
sorgfältig gelöst (Endkonzentration: 9.5M).
P-40
während 10 Minuten, wurden die
1 Teil
Ampholyten pH 5-8) ergänzt. Schliesslich
Nonidet
wobei diese stufenweise
15 Minuten,
gefolgt
von
1000V
während 30 Minuten. Die Proteine wurden in der ersten Dimension während 12
Stunden
PAGE
bei 1000V im
(8%)
pH-Gradienten
fokusiert und anschliessend durch SDS-
in der zweiten Dimension weiter
aufgetrennt.
36
111.5.
-
-
-
-
-
-
-
Immunoblotexperimente
Puffer und
Lösungen:
Transferpuffer (25mM Tris-Glyzin, pH 8.9)
PBS-Blockierpuffer (PBS
TBS
(50
mM
mit 3%
BSA)
Tris-HCI, pH 7.8,150 mM NaCI)
TBS-Blockierpuffer (TBS
mit 3% BSA und 0.1% Triton
TBS-Waschpuffer (TBS
mit 1% BSA und 0.1% Triton
125|-waschpuffer (TBS
mit 0.1%
X-100)
X-100)
BSA, 0.1% Triton X-100 und zusätzlich 0.5M
NaCI)
-
4-Chlor-1-naphthol-Stocklösung (30mg 4-Chlor-1-naphthol (Merck)
in 10ml
Methanol)
-
Reaktionslösung (1ml 4-Chlor-1-naphthol-Stocklösung,
9ml PBS, 10uJ
H2O2,
30%)
-
mit Peroxidase
-
mit
gekoppelter Ziegenantikörper gegen Immunglobuline (Medac)
125l iodinierter Schafantikörper gegen Mausimmunglobuline (Amersham,
15uCi/ug)
Vorgehen:
Proteine, aufgetrennt durch SDS-PAGE, wurden elektrophoretisch während 2
Stunden
bei
50V
transferiert. Als
Zum Nachweis
auf
Nitrocellulosemembranen
Transferpuffer
von
Die noch freien
Proteinbindungsstellen
in
über
wurden
in
Aszitesflüssigkeit (verdünnt
anderen monoklonalen
Inkubation
bei
gewaschen.
gespült
und
sekundären
in
Nacht
während
Stunden
Die
Kulturüberständen
PBS-Blockierpuffer,
Antikörper: 1:2000) inkubiert.
wurden
zwei
4°C) abgesättigt.
bei
unverdünnten
Raumtemperatur
Reagentien:
der Nitrocellulosemembranen wurden
PBS-Blockierpuffer
Raumtemperatur (oder
cellulosestreifen
Schüll)
Antigenen wurden zwei Varianten angewendet:
Peroxidase-gekoppelten,
Inkubation
und
wurde SDS-PAGE-Puffer ohne SDS verwendet.
1. Nachweis mit
durch
(Schleicher
P1
Nitro-
oder
-Antigen: 1:1000;
Nach einer
bei
in
alle
2-4stündigen
überschüssige Antikörper weg¬
Dazu wurden die Nitrocellulosestreifen zweimal kurz mit PBS
anschliessend
auf einem
Raumtemperatur gewaschen.
Peroxidase-gekoppelten
Die
Schüttler dreimal
Inkubation
Ziegenantikörper
mit
dem
(1:2000
Minuten
bei
sekundären,
mit
10
verdünnt
in
PBS-
37
Blockierpuffer)
wurde während zwei Stunden bei
Raumtemperatur durchgeführt.
Nach den Inkubationen wurde wiederum, wie oben beschrieben,
Nach
der
Zugabe
oft
TBS-Blockierpuffer
Antikörpern)
gestoppt. Anstatt PBS-Blockierpuffer und PBS wurden
und
und TBS
TBS-Waschpuffer (für
spezifische Signal leicht
mit125l-iodinierten,
sekundären
Die Nitrocellulosemembranen wurden in
Antikörper wurden ebenfalls
zu
in
und der
unspezifische
einer Endkonzentration
von
0.1%
Antikörpern:
TBS-Blockierpuffer abgesättigt.
TBS-Blockierpuffer
wurde Triton
Hybridomakulturüberständen
bis
Reagentien)
sekundären
stark vermindert.
2. Nachweis
ersten
das Waschen nach den ersten
(für das Waschen nach den
verwendet. Dadurch wurde das
Hintergrund
durch Auswaschen
Reaktionslösung wurde die Farbreaktion
der Substrate mit Wasser
gewaschen.
verdünnt. Zu den
X-100-Stocklösung (10%
gegeben. Nach
Die
w/v in
H2O)
den Inkubationen
(2-4
Stunden, RT) wurde zweimal kurz mit TBS-Waschpuffer gespült und während
dreimal 10 Minuten
gewaschen. Die radioaktiv markierten Antikörper
verdünnt
TBS-Blockierpuffer
wurde zweimal kurz mit
Minuten
lang
im
(0.1uCi/ml).
Nach den Inkubationen
wurden in
(2 Stunden, RT)
TBS-Waschpuffer gespült. Nachher wurde dreimal
125I-Waschpuffer
gewaschen und einmal
zehn
kurz mit 10mM Tris-
HCI, pH 7.5 gespült. Die Nitrocellulosemembranen wurden getrocknet und
autoradiographiert.
III.6.
-
-
Immunpräzipitationsexperimente
Puffer und Lesungen
5x RIPA-Puffer
(0.1 M Tris-HCI, pH 7.4, 0.75M NaCI, 5% (wA/) Triton X-100, 5%
(w/v) NaDeoxycholat,
0.5%
(w/v) SDS)
-
RIPA-Puffer: 50ml 5x RIPA-Puffer und 200ml
-
Pansorbin
H2O
(Calbiochem), Bindungskapazität normalerweise 2.3mg
human
IgG/ml Suspension
-
Homogenisationspuffer (10mM Tris-HCI, pH 7.4, 140mM KCl, 1.5mM MgCl2,
1mM PMSF, 1%
zugegeben.
Trasylol)
PMSF und
Trasylol
wurden erst kurz vor Gebrauch
38
-
SQlubilisierung und Fraktionierung
von
Zellen:
Operationen wurden bei 4°C durchgeführt. Metabolisch mit 35S-
Alle
Methionin markierte Zellen wurden dreimal mit PBS
(107)
gewaschen. Die Zellen
wurden in 800ut RIPA-Puffer und in Anwesenheit der Proteaseninhibitoren
Trasylol (1%), PMSF (1mM)
und Jodoacetamid
(5mM)
solubilisiert. Pansorbin, das zweimal mit RIPA-Puffer
wurde
zugegeben (200ul/ml Solubilisat).
unlösliches und
während 10 Minuten
gewaschen
worden war,
Nach 10 Minuten Inkubation wurde
unspezifisch bindendes Material abzentrifugiert (10 Minuten,
17'000xg)
Nach den in
fraktionen
den
vor
NaDeoxycholat
-
Wfro-Prozessierungsexperimenten (Kap. IV.9.)
wurden die Zell¬
Immunpräzipitationen auf 1% (w/v) Triton X-100,
und 0.1% SDS
1%
(wA/)
(wA/) eingestellt.
Immunpräzipitationen
Aliquote der Solubilisate
kulturüberständen oder
(Lehner
etal.
Falle der
zu
wurden
zu
3ul Lamin
1986a) gegeben.
800ul
Immunpräzipitationen mit
serumfreien
A/B2-spezifischem
Nach der Inkubation
von
Hybridoma¬
Kaninchenserum
einer Stunde wurden im
dem Kaninchenserum 30uJ mit RIPA-Puffer
gewaschenes Pansorbin zugegeben.
klonalen
je
Bei
Immunpräzipitationen mit
mono¬
Antikörpern wurde das gewaschene Pansorbin vorher während einer
Stunde mit
affinitätsgereinigten Kaninchenantikörpern (in RIPA), die gegen
Mausimmunglobuline gerichtet
mit dem Pansorbin
(bzw.
waren, beschichtet. Nach
mit dem
wurden die Proben 2 Minuten bei
Pansorbin/Immunkomplexe
einstündiger Inkubation
Pansorbin/Kaninchenantikörper-Komplex)
17'000xg zentrifugiert.
Die sedimentierten
wurden 5x mit RIPA-Puffer und 1x mit 50mM Tris-
HCI, pH 7.5, gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden mit 3x SDS-PAGE-
Probenpuffer eluiert (2 Minuten, 100°C), durch SDS-PAGE aufgetrennt und
durch
Fluorographie nachgewiesen.
39
111.7.
Immunfluoreszenzexperimente
in.7.1. Fixation von Kulturellen
Die Zellen wurden in Kulturschalen auf
folgende
-
Fixationsmethoden
Deckgläschen gezüchtet. Es
wurden
angewendet:
Methanol/Aceton-Fixation:
Diese Methode wurde beim
Hybridomaklone angewendet.
Minuten in Methanol
getaucht.
Vor den
(-20°C)
Screening
von
Ueberständen
Die Zellen wurden kurz mit PBS
wachsender
gewaschen,
und nachher für 20 Sekunden in Aceton
Immunfluoreszenzfärbungen
wurden die
Präparate
an
für 5
(-20°C)
der Luft
getrocknet.
-
Paraformaldehyd/Triton-Fixation:
Die Zellen wurden mit einer
2% Saccharose in
Paraformaldehyd,
fixiert.
Paraformaldehyd-enthaltenden Lösung (3%
PBS)
fünf Minuten bei
Die fixierten Zellen wurden dreimal kurz mit PBS
Permeabilisierung
gewaschen.
Zur
wurden die Zellen 5 Minuten in eiskaltem PBS mit 0.5% Triton
X-100 inkubiert. Vor den
Immunfluoreszenzexperimenten
wieder dreimal kurz mit PBS
Hl.7.2. Indirekte
Raumtemperatur
wurden die Zellen
gewaschen.
Immunfluoreszenzfärbungen
Die kultivierten Zellen wurden nach Fixation und
Permeabilisierung
mit den
primären Antikörpern inkubiert. Hybridomakulturüberstände wurden unverdünnt
verwendet. Das
polyklonale
Antiseren gegen Lamin A/B2 wurde 1:300 in PBS
verdünnt. Nach 10 Minuten wurden die
PBS
gewaschen. Die Inkubationen
Präparate
mit sekundären
dreimal für
je
5 Minuten in
Antikörpern (mit
Rhodamin
gekoppelte Schafantikörper gegen Mausimmunglobuline, beziehungsweise
Fluorescein
beide
von
Minuten bei
gekoppelte Ziegenantikörper gegen Kaninchenimmunglobuline,
Cappel,
1:300 verdünnt in
PBS) wurden ebenfalls während
Raumtemperatur durchgeführt.
5 Minuten mit PBS
80%
mit
Glycerin
10
Anschliessend wurde wieder dreimal
gewaschen. Die Präparate wurden
in 0.1 M
montiert und durch ein Zeiss Standard Model
Tris-HCI, pH 9.0,
18-Mikroskop
mit
40
einem
Planapo Oelimmersionsobjektiv (x63) fotographiert.
111.8. Isolation
Mi-8.1.
Lamin-kodierenden cDNS-Klonen
von
cPNS-Genbanken und Antikörper
Isolation der cDNS-Klone wurden
Für die
drei X
folgende
gt11
cDNS-
Expressionsgenbanken verwendet:
-
Expressionsgenbank, hergestellt
RNS
aus
erytroiden Zellen
Moon etal.
Geschenk
-
mit
15
von
(nach
Tage
ihrer
alten
Grösse) fraktionierter poly(A)+
Hühnerembryonen (M-library,
1985).
von
Dr. R. T. Moon
(Univ.
Expressionsgenbank, hergestellt
of
Washington, Seattle, U.S.A.)
poly(A)+
mit
RNS
aus
10
Tage alten Hühner¬
embryonen (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA, U.S.A.).
-
Expressionsgenbank,
ebenfalls mit
embryonen hergestellt (Sap
ström
(EMBL, Heidelberg)
Für die Isolation
von
Lehner etal.
von
Lamin Bi
aus
10
Tage
1986), grosszügigerweise
etal.
zur
poly(A)+ RNS
alten Hühner¬
von
Dr. B. Venn-
Verfügung gestellt.
und B2-kodierenden cDNS-Klonen wurden die
-
(1986a) hergestellten monoklonalen Antikörper verwendet.
Für
die Suche von Lamin A-kodierenden cDNS-Klonen wurde neben den in dieser
Arbeit beschriebenen
P-Antikörpern der
von
C. F. Lehner
hergestellte Antikörper
01 verwendet.
III.8.2. Isolation
Das
von
cDNS-Klonen mit Hilfe
Imunoscreening wurde
entweder
spezifisch
nach der Methode
Mischungen
Antikörpern (Immunoscreening)
von
Antikörpern durchgeführt,
die
für Lamin A, Bi oder B2 sind. Dabei wurde im wesentlichen
Young und
von
wurden in E.coli Y1090
intaktem
mit
von
propagiert.
ß-Galaktosidasegen
Davis
(1983) vorgegangen.
Für den Nachweis
wurde
der
von
Die
Phagen
Transformanten mit
Bakteriensuspension
vor
dem
Ausplattieren der Farbindikator 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactosid (X-
Gal) zugegeben.
induziert.
Die
Die
Expression
des
ß-Galaktosidasegens
Nitrocellulosefilter mit der daran
wurden für 30 Minuten in
wurde mit IPTG
gebundenen Phagen-DNS
Blockierpuffer (entweder 3% BSA
in TBS
(Kap. III.5.)
41
oder 0.1% Gelatine in
den
TBS)
inkubiert. Die Filter wurden während 4 Stunden mit
primären Antikörpern (Aszites-Flüssigkeit, 1:2000 verdünnt
inkubiert und anschliessend 3x10 Minuten
Gelatine),
0.1% Triton X-100
gewaschen
(je
10
1:1000 verdünnt in
Minuten)
Bei dieser
und für 2 Stunden mit sekundären
von
0.03%
von
cDNS-Klonen durch
zuerst
Raumtemperatur
einer
Maus
IgG gerichtete Ziegen¬
gelegt,
das
4-Chlor-1-naphthol
0.3mg/ml (Stocklösung: 3mg/ml, gelöst
von
Screening-MeXhoäe
Phagen-DNS
0.1%
inkubiert. Nach vier Waschschritten in TBS
wurden die Filter in TBS
H2O2 in einer Konzentration
III.8.3. Isolation
(oder
wurde die Peroxidase-Aktivität durch eine Farbreaktion sichtbar
gemacht. Dazu
Konzentration
TBS)
Blockierpuffer)
1% BSA
mit TBS,
Antikörpern (Peroxidase-gekoppelte, gegen
antikörper,
in
0.5M
in
(Stocklösung: 30%)
in
in einer
Methanol)
und
enthielt.
PIaque-Hybridisierung
wurde die auf Nitrocellulose immobilisierte
NaOH, 1.5M NaCI während 5 Minuten bei
denaturiert. Die Filter wurden anschliessend für
Neutralisations-Lösung (0.5M Tris-HCI, pH 7.5,
gebadet. Nach dem Backen (2 Stunden bei 80°C,
1.5M
in
je
NaCI)
vacuo)
5 Minuten in
und in 2x SSC
wurden die Filter
während 2 Stunden in
Formamid,
4x
Hybridisations-Lösung (1x Denhardt's-Lösung, 40%
SSC, 0.02M Tris-HCI, pH 7.4, 100ug/ml Lachsspermien-DNS
(Boehringer)) blockiert. Für die Hybridisation (16-18 Stunden)
markierte cDNS-Proben zugegeben (approx. 106 cpm/ml).
menschlichen
Lamin
A-cDNS
wurde
Hühnerlamin cDNS-Proben bei 68°C
(Rigby
Mc/f-Translation
Vogelstein 1983)
etal.
1977)
bei
42°C,
hybridisiert.
Die
bei
markiert. Nach der
Hybridisation
60 Minuten in 2x SSC, 0.1%SDS bei
32P-
Im Falle der
Verwendung
Fragmente
oder durch Random
wurden
von
wurden durch
Priming (Feinberg
und
wurden die Filter dreimal 30-
Raumtemperatur gewaschen.
In
einigen
Fällen wurden die Filter zusätzlich für 45 Minuten in 3x SSC, 0.1% SDS bei
50°C gewaschen. Die getrockneten Filter wurden schliesslich für 3-16 Stunden
mit Verstärkerfolie
Die Isolation
exponiert (-70°C).
homogener Phagenklone
und die
Reinigung
der
Phagen
im
grösseren Massstab erfolgte nach Standardmethoden (Maniatis etal. 1982); die
Reinigung
von
kleineren
Mengen
wurde mit Lambdasorb
gemäss den Instruktionen des Herstellers durchgeführt.
(Promega Biotec)
42
III.9.
DNS-Sequenzierung
Die cDNS-/nserfs der
X-Phagen
Messing 1982, Messing 1983)
Biotec)
Dale et al.
von
cDNS-Klonen
Firma IBI
der
(1985)
hergestellt. Dabei
eines
eine Reihe
von
der
von
(Amersham)
verwendet.
Klenow
Sanger
oder T7
et al.
Firma
nach
wurde
der
(1984)
Polymerase (Sequenase,
(Biolabs)
oder
Klenow
United States
(Avian
AMV
cDNS-
unter der
Für
die
Dideoxy-Kettenabbruch-
entweder
Retrotranskriptase (Pharmacia) sequenziert (Chen
111.10.
überlappende
Henikoff
von
der
Sequenzierung
Promega Biotec verfahren.
DNS
(1977)
die
Doppelsträngige Plasmid-DNS wurde entweder mit
Enzym
überlappenden
wurde das Kit CYCLONE I BIOSYSTEM
Sequenzierung einzelsträngiger
Methode
verkürzten
DNS wurden ebenfalls verkürzte
Kits
und
in M13-Vektoren wurde nach der
hergestellt. Dabei wurde nach der Methode
Verwendung
(Vieira
pGEM-3Zf(-) (Promega
(International Biotechnologies, Inc.) verwendet. Für
doppelsträngigen
Klone
oder in das Plasmid
Sequenzierung
umkloniert. Für die
Methode
wurden entweder in M13-Vektoren
Polymerase
Biochemicals)
T7
Polymerase,
Myeloblastosis
und
Virus)
Seeburg 1985).
RNS-Präparation
¦11-10-1- Total- und
polyfAW
RNS
Lösungen:
-
GIT-Puffer
(5.5M Guanidin-isothiocyanat, 2,5mM EDTA,
0.5%
N-Lauroylsarco-
sin, 20mM Tris-HCI, pH 7.4), autoklaviert, ß-Mercaptoethanol wurde kurz
Gebrauch auf eine Konzentration
-
-
-
Cäsiumchlorid-Puffer
-
0.1 M
2.5mM
zugegeben.
NaOAc, pH 6.0), autoklaviert
TE, pH 7.4 (10mM Tris-HCI, pH 7.4,1mM EDTA, pH 8.0)
TE-gesättigtes Phenol (zur Analyse, Merck,
Wsetal.
-
(7.5M CsCI,
von
vor
Art.
206), Herstellung:
siehe Mania-
(1982)
Methylenchlorid (puriss., Fluka)
PBS(Kap.lll.2.1.)
Total-RNS
aus
Hühnerembryos,
einer
Reihe
Hirn und Leber
von
von
18
Geweben
Tage
(12
alten
Tage
alte
ganze
Hühnerembryonen
und
43
Hühnerembryofibroblasten) wurde, abgesehen
kultivierte
Aenderungen, nach der Methode
embryonales Gewebe
Davis
von
(1986) isoliert: 0.75g
et al.
wurde in 4ml GIT mit einem
geringfügigen
von
Polytron (Kinematica GmbH,
Kriens, No. PTA 7K) während viermal 15 Sekunden homogenisiert (Position 6,
Messer mittlerer
Grösse).
Die Fibroblasten wurden in 9cm-Schalen kultiviert. Die Zellen wurden kurz mit
eiskaltem PBS
pro Schale
abgespült
lysiert.
Die
und anschliessend durch die
Lysate
von
Zugabe
8 Schalen wurden
von
200ul GIT
und mit dem
vereinigt
Polytron homogenisiert (Stufe 4-5,15 Sekunden).
Zur
Entfernung
von
unlöslichem Material wurden die Proben 20 Minuten bei
20°C in einem SS34 Rotor
wurden anschliessend auf
(3000xg, Sorvall) zentrifugiert.
1.7ml-Aliquote
der
Polyallomer-Röhrchen, Kontron) geschichtet
Die Ueberstände
Cäsiumchloridlösung (in
und
über
Nacht
bei
4.4ml
Raum¬
temperatur in einem SW 60 Rotor (Beckman) bei 34'000 rpm sedimentiert. Die
RNS-Pellets wurden in 600ul
(Fibroblasten: 300ul)
TE
resuspendiert
Minuten auf Eis inkubiert. Die RNS wurde mit dem Vortex
mit
Phenol
und
Methylenchlorid extrahiert,
schliesslich in ultrareinem sterilem Wasser
mit
vollständig solubilisiert,
Ethanol
gelöst.
präzipitiert
Die Ausbeuten
betrugen ungefähr 2mg/g embryonales Gewebe und 7.5ug/Schale
Poly(A)+ RNS wurde nach Standard-Methoden (Maniatis
Selektion
an
oligo(dT)-Cellulose (Pharmacia) isoliert.
und für 30
an
und
RNS
Fibroblasten.
etal.
1982) durch
Die RNS wurde bei -70°C
gelagert.
IH.10.2.
Synthetische
RNS
Die cDHS-lnserts wurden in das Plasmid
kloniert und mit
I für cA-1 und
geeigneten Restriktionsenzymen linearisiert {Sal
cB-|-4).
Für die
linearisierten Plasmide mit T7
enthielten
Polymerase (Pharmacia)
10 mM DTT,
RNS das
0.5mM
I
40mM Tris-HCI,
100ug/ml BSA
Ansatz wurde für die
cap-Analog
zugegeben.
(Boehringer)
von
2ug Plasmid-DNS,
triphosphate (Boehringer),
I für
Herstellung der synthetischen RNS
40°C in einem totalen Volumen
Mischungen
pGEM-3Zf(-) (Promega Biotec)
20uJ
pH 7.6,
und 25U RNasin
von
jedem
6mM
am
7mG(5')pppG (Pharmacia)
Die
Reaktions-
der vier Nukleosid-
MgCl2,
(Boehringer).
Bildung der cap-Struktur
wurden die
während 60 Minuten bei
transkribiert.
0.5 mM
cB2-3, Pvu
2mM
Dem
Spermidin,
Transkriptions-
5'-Ende der
synthetischen
in einer Konzentration
Am Ende der Inkubation wurde die
Mischung
von
mit 25U DNase
und 23U RNasin versetzt und während 10 Minuten bei 37°C
44
inkubiert. Nach der
Zugabe einer die Polymerase abstoppenden Lösung (0.6M
NaCI, 10mM EDTA, pH 5.5, 1% SDS) und
die Proben mit Phenol:Chloroform
10ug Hefe-tRNS (BRL) wurden
extrahiert. Schliesslich wurde die RNS
(1ml Volumen) mit Wasser voräquilibrierte Sephadex G25-
durch eine kleine
Säule(Pharmacia) zentrifugiert.
ih.11. RNS
(1:1)
von
Die
synthetische RNS
wurde bei -70°C
gelagert.
B|Qt-Hybridisierungen
Northern Blots wurden nach einer leicht modifizierten Variante der Methode
von
Khandjian (1986) durchgeführt:
Total- oder
poly(A)+
Formaldehyd-enthaltenden Agarosegelen aufgetrennt
RNS wurde in
1%igen
und anschliessend auf
Biodyne A-Nylonmembranen (No. SD1104G, Pall Biosupport, NY, U.S.A.)
transferiert. Die RNS-enthaltende Seite wurde für 2 Minuten mit UV-Licht
bestrahlt
(Cross-Linking,
Stunden bei 42°C
in
Church und Gilbert,
1984).
Die RNS wurde während 5
3.3xSSC, 5xDenhardt's-Lösung, 50% entionisiertes
Formamid,
160ng/ml denaturierte DNS
Mannheim),
0.02% SDS, 50mM
aus
Heringspermien (Boehringer,
Natriumphosphat, pH 6.5, prähybridisiert.
auf der Membran immobilisierte RNS wurde anschliessend mit
Die
32P-markierten
cDNS-Fragmenten hybridisiert (1.5x106 cpm/ml Hybridisationslösung).
Die
cDNS-Fragmente
wurden nach der Random
und
Vogelstein 1983)
markiert. Die
Primi/jp-Methode (Feinberg
Hybridisation erfolgte
über Nacht bei 42°C in
3.3xSSC, 3xDenhardt's-Lösung, 50% entionisiertem Formamid, 100ng/ml
denaturisierter DNS
phosphat, pH
6.5.
aus
Heringspermien,
0.04% SDS und 40mM Natrium¬
Die Filter wurden 4x5 Minuten bei
Raumtemperatur
mit
2xSSC, 0.1% SDS, 2x30 Minuten bei Raumtemperatur mit 0.3xSSC, 0.1% SDS
und schliesslich 1x 30 Minuten bei 47°C mit
Als Standard wurden RNS-Marker
(0.24-9.5kB)
O.IxSSC, 0.1% SDS gewaschen.
von
BRL verwendet.
111.12. In y/frp-Translationen
Lösungen
-
-
und Puffer:
Retikulozytenlysat (Promega Biotec)
Aminosäurenmischung
enthält
ohne L-Methionin
jede Aminosäure
(Promega Biotec)
in einer Konzentration von 1 mM
45
-
Aminosäurenmischung
enthält
-
jede
Aminosäure in einer Konzentration
35S-Methionin,
-
35S-Cystein,
-
von
1 mM
RNasin, 40U/ul (Promega Biotec)
-
-
L-Cystein (Amersham)
ohne
1000Ci/mmol
600Ci/mmol
(Amersham,
(Amersham,
SJ.
SJ.
1015)
15232)
L-Methionin-Lösung, 6mg/ml
R-(2-14C)-Mevalonsäurelacton,
56.7mCi/mmol
Standard-Translationen wurden, abgesehen
nach den Instruktionen der Firma
35ul
(Amersham,
von
CFA.
660)
geringfügigen Aenderungen,
Promega Biotec durchgeführt:
Retikulozytenlysat
1uJ
Aminosäurenlösung (ohne L-Methionin oder
5uJ
35S-Methionin
1ul
RNasin
oder
ohne
L-Cystein)
35S-Cystein
fiuj RNS (400ng synthetische RNS oder 3-5ug poly(A)+ RNS in 8u,l H2O)
50uJ
Die Translationen wurden im
allgemeinen während
60 Minuten bei 30°C
durchgeführt.
Für die
Pü/se-C/7ase-Experimente
Minuten in der
Synthese
Gegenwart
unmarkierten
synthetische RNS
während
15
radioaktiv markiertem Methionin translatiert. Die
von
markierten
von
wurde
Proteinen
wurde
durch
Zugabe
Methioninlösung (Endkonzentration: 2mM)
(Boehringer, Mannheim) gestoppt
und die
und
Reaktionsmischung
von
2ul der
0.5u,g RNase A
wurde weiter bei
30°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquote entnommen und
durch SDS-PAGE
Für die
analysiert.
Markierung
der
Laminproteine
mit radioaktiver Mevalonsäure wurden
pro Translation 25u,l dieser radioaktiven
Aktivität
von
25uCi
pro
(Lösungsmittel: Benzol)
ml
Translationsansatz
wurde
vor
Mevalonsäure in einem offenen
Oberfläche
der
5
Minuten)
Das
eine
25ul-Aliquot
eingedampft. Dazu
Eppendorf-Röhrchen
mit
ergab
was
wurde die
bei 50°C inkubiert und die
Stickstoff
begast.
Nach
dem
wurde die radioaktive Mevalonsäure
H2O gelöst und anstelle der radioaktiven Aminosäure dem
Reaktionsansatz
der beiden
dem Gebrauch
Flüssigkeit gleichzeitig
vollständigen Eindampfen (ca.
in 5ul sterilem
Verbindung eingesetzt,
zugegeben.
Der Reaktionsansatz wurde zudem mit
Aminosäurenlösungen (ohne
L-Methionin und ohne
je 0.75uJ
L-Cystein)
46
ergänzt. Die Translationszeit betrug 90 Minuten (ergibt ein 1:1-Verhältnis
Vorläufer und reifem Lamin
Für die
von
B2).
Immunpräzipitationsexperimente (vgl. Kap. III.6.)
mit dem Lamin A/B2-
spezifischen Kaninchenserum (Lehner etal. 1986a) wurden die Reaktions¬
(Endvolumen: 200ul)
ansätze auf IxRIPA rekonstituiert
inhibitoren
Trasylol (1%), PMSF (1mM)
111.13. Chemische
Die
Laminproteine
ansätzen oder
PAGE
Spaltungen
aus
(Gel: 8%,
der
und mit den Proteasen¬
(5mM)
und Jodacetamid
versetzt.
Laminproteine
wurden durch
Immunpräzipitation
aus
in w'fro-Translations-
radioaktiv markierten Fibroblasten isoliert und durch SDS-
0.75mm) aufgetrennt.
Dicke:
10 Minuten in Wasser
Danach wurden die Gele während
und anschliessend
eingelegt
Die Lamin¬
getrocknet.
proteine wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht und
getrockneten Gel geschnitten.
im Gelstück
erfolgte
Die
Tryptophan-spezifische Spaltung
aus
der Proteine
im wesentlichen nach der von Draetta et al.
beschriebenen Methode: Die Gelstücke wurden während 5 Minuten in
tisierungspuffer (50% Essigsäure,
für die
Spaltung
(purum, Fluka)
Rehydratsierungspuffer
(1987)
Rehydra-
Harnstoff) gequollen und anschliessend
0.1%
während 20 Minuten in 50%
N-Chlorsuccinimid
dem
Essigsäure,
inkubiert. Nach
0.1% Harnstoff, 40mM
mehrmaligem Waschen
wurden die Gelstücke 20 Minuten in 0.5M Tris-HCI,
in
pH
6.8, 0.4% SDS, 0.02% Bromphenolblau gelegt und danach während 20-30
Minuten in
SDS-PAGE-Probenpuffer äquilibriert
SDS-Polyacrylamidgels gestossen.
der
elektrophoretischen Auftrennung
Für die
von
Die
Spaltung
von
Lamin A zwischen
der
Fluorographie sichtbar gemacht.
Aspartat
und Prolin wurde,
abgesehen
(1982) beschriebenen
Immunpräzipitation
isolierten radioaktiven
von
(synthetischer
Lamin A-Vorläufer, authentisches reifes Lamin
Spaltung
den Gelstücken eluiert. Dazu wurden die
aus
Gelstücke in 500u,l 50mM NH4HCO3, 0.1% SDS, 1%
angesetzt)
während 5 Minuten
zerkleinert und 5 Minuten
Stunden bei
rehydratisiert,
gekocht.
Raumtemperatur
Stunde mit 500ul
A)
wurden
getrockneten
ß-Mercaptoethanol (frisch
mit einem
abgerundeten Glasstab
Anschliessend wurden die Gelstücke 2
auf einem
Tischzentrifuge sedimentiert (17'000xg,
1
wurden nach
Shih etal.
einigen Modifikationen, nach dem
Proteine
vor
proteolytischen Fragmente
durch
Verfahren vorgegangen: Die durch
und in die Probentaschen eines
Eppendorfschüttler bewegt
5
Minuten).
und mit der
Das Pellet wurde nochmals
Ammoniumbicarbonatlösung eluiert und die beiden
47
Fraktionen wurden
Böhringer,
vereinigt.
Mannheim)
TCA
und
(Stocklösung: 50%), wurden
Proben
Zugabe
Nach
die
wurden
auf
eine
Proteine
während
Die
zentrifugiert.
Das Pellet wurde zuerst mit 10%
10uq RNase
A
Minuten
10
von
Minuten
bei
15%
auf
Eis
17'OOOxg (RT)
Trichloressigsäure
(v/v)
Ameisensäure
dazugegeben.
7 Stunden bei 50°C. Pro Ansatz wurde
ca.
Endkonzentration
90
{Carrier,
A
und dann mit
(1:1, v/v) gewaschen und schliesslich lyophilisiert.
Die Proteine in wurden in 500ul 70%
wurden nochmals
10ug RNase
während
präzipitiert.
einem Ethanol/Ether-Gemisch
von
Die
gereinigtes
gelöst
und und es
Spaltung erfolgte während
Protein mit einer Aktivität
von
30'000cpm eingesetzt. Nach der Inkubation wurde die Ameisensäure durch
Lyophilisation (ca.
2
Stunden)
Probenpuffer aufgenommen,
Fluorographie
sichtbar
entfernt.
Die
durch SDS-PAGE
gemacht.
Spaltprodukte wurden
(10-17%) aufgetrennt
in 25u,l
und durch
48
IV. RESULTATE
IV.1. Herstellung
Expressions-Genbanken eingesetzt
von
spätere Isolation
war
es
Lamin
die
Verfügung,
zur
worden
Die
Epitope
von
A,gt11-
aus
monoklonalen
herzustellen.
Für die
B-|- und B2-kodierenden cDNS-Klonen standen Antikörper
von
CF. Lehner
(Inst,
für
Zellbiologie,
ETH
Zürich) hergestellt
(unveröffentlichte Resultate).
waren
Laminproteine des Huhnes
Für die
Immunogene.
erwiesen
Immunisierung
verwendet, die einen hohen Gehalt
traktionen
werden. Im Hinblick auf die
vorteilhaft, eine Reihe
verschiedene
Antikörpern gegen möglichst
von
Sonden für die effiziente
Hühneriamin A-kodierenden cDNS-Klonen
von
Expressions-Genbanken,
Isolation
Antikörpern gegen Kernhüllenproteine
Antikörper können als spezifische
Monoklonale
Analyse
monoklonalen
von
von
Säugetieren
als
gute
Proteingemische
Lamin A aufwiesen,
nämlich Sub¬
achtzehntägiger Hühnerembryonen (Fig. 2). Die
Leberkernen
Subtraktionen wurden durch
Verdauung
sequenzieller
und anschliessender
in
Mäusen wurden
von
an
sich
der Leberkerne mit DNase l/RNase A
Extraktion der Kernhüllen mit Triton X-100
und Puffer mit hoher Salzkonzentration gewonnen. Die einzelnen Ueberstände
dieser Extraktionsschritte sind in
sich
1976), zeichnet
Blobel
aus
mengenmässig
noch dominierten
Nukleasenverdauung
zum
waren
schiedes Hessen sich die einzelnen
von
Bei der
Kernhüllen
noch
die in den Zellkernen
Spuren
von
der
Proteine
in diesem
Ausser den
12prozentigen Gel
Laminproteinen
enthielt die
40-60 kDa und über 70 kDa.
erfolgte
Verwendung
(partikuläre
dieser
In
geringen Molekulargewichtsunter¬
Myelomazellen mit den Milzzellen, die
Mäusen isoliert woren waren,
1986c).
des
der
noch eine ganze Reihe bisher nicht charakteri¬
sierter Proteine in den Bereichen
von
nur
Laminproteine
(Fig. 2, Spur 7).
Porenkomplex-Laminafraktion
Die Fusion
Anreicherung
wurden bereits bei der ersten
(Fig. 2, Spur 2),
(Fig. 2, Spur 7). Wegen
nicht unterscheiden
starke
eine
grössten Teil extrahiert (Fig.2, Spur 3).
Porenkomplex-Laminafraktion
al.
durch
(Fig. 2, Spur 7, Pfeil). Histone,
Laminproteine
vorhanden
Der unlösliche
Behandlungen, die Porenkomplex-Laminafraktion (Dwyer
Rückstand solcher
und
Fig. 2, Spuren 3-6, dargestellt.
von
aus
den immunisierten
nach vorhandenen Protokollen
Kernextrakten
Fraktionen
nach
(Fig.2, Spuren
(Lehner
4 und
5) oder
Nukleasenverdauungen)
komplexem Immunogen konnten nach der Fusion
nur
et
als
Hybridomaklone isoliert
werden, die Antikörper gegen bereits bekannte Kernantigene produzierten. So
49
V
12
Figur
2:
3
4
5
6
7
8
Immunogene
Zellkerne, isoliert
aus
Lebern von
I8tägigen Hühnerembryonen, wurden zweimal mit DNase
I und
RNase A verdaut und anschliessend mit Triton X-100 und Puffer mit hoher Salzkonzentration
extrahiert. Die Proteine der Zellkerne, die Proteine, die in den einzelnen Präparationsschritten aus
den Zellkernen extrahiert wurden und die Proteine der am Schluss zurückbleibenden
Porenkomplex-Laminafraktion wurden durch SDS-PAGE (12%) aufgetrennt und mit Serva Blau
gefärbt.
Spur 1: Molekulargewichtsmarker, von oben nach unten: Phosphorylase B (92 kDa), BSA (67 kDa),
Ovalbumin (45 kDa), Carboanhydrase (30 kDa), Trypsininhibitor aus Soyabohnen (21.5
kDa) Lysozym (14.4 kDa)
Spur 2: Zellkerne aus Lebern von I8tägigen Embryonen
Spur 3: Ueberstand nach der ersten Nukleasenverdauung
Spur 4: Ueberstand nach der zweiten Nukleasenverdauung
Spur 5: Ueberstand nach der Extraktion mit Triton X-100
Spur 6: Ueberstand nach der Extraktion mit hoher Salzkonzentration
Spur 7: Porenkomplex-Laminafraktion
Spur 8: Molekulargewichtsmarker (vgl. Spur 1)
50
erwiesen sich
vor
allem Lamin B2 und Proteine der
(ein hypothetisches nukleoplamatisches Gerüst,
immundominante
Laminafraktion
Fusion
Lehner etal.
(Fig.2, Spur 7)
als
wie im
einige, die,
reagierten. Daneben
Lamin A
Immunogengemisch
als ziemlich
Porenkomplex-
verwendet. Aus dieser
Lamin-spezifischer Antikörper,
folgenden gezeigt wird, ausschliesslich
wurden auch
Antikörper gegen
Komponenten des Immunogengemisches gefunden,
nukleoplasmatisches
1986c)
Im Falle der Fusion "P" wurde die
Antigene.
resultierte eine beträchtliche Anzahl
darunter auch
sogenannten "Substruktur"
Protein mit einer Grösse
so zum
von ca.
bisher unbekannte
Beispiel gegen
200 kDa
iv.2.
Charakterisierung
Die
von
ein
(nicht gezeigt)
und gegen ein bisher unbekanntes Protein der Kernhülle. Die Lamin
Nukleoplasma-spezifischen Antikörper wurden nicht
mit
B2- und
weiter bearbeitet.
Antikörpern und Antigenen
Ueberstände wachsender
Hybridomaklone wurden
zuerst
in
Immun¬
fluoreszenzexperimenten getestet. Klone, deren Antikörper die Kernhülle färbten,
wurden subkloniert und weiter untersucht. Die Resultate dieser
sind in den
IV.2.1.
Die
Kapiteln
IV.2.1 bis IV.2.3. und IV. 10.
Molekulargewichte
Molekulargewichte
bestimmt
(Fig. 3).
der
Antigene
auf
1986a)
Lamin B2 mit dem
markiert
Antigene
1986a) sichtbar gemacht.
In
Das
und
zum
Der
(Fig. 3) wurde zusätzlich
Antikörper E3 (Lehner ef al.
Spur
monoklonalen
1
Antikörper
die
P2-P7 und P10
(Fig.2,
gleiche gelelektrophoretische
Antikörper P1, der im Primärtest eine
Kernhüllenfärbung ergab, reagierte
Spur 10, Pfeil).
Lebern
einzigen damals verfügbaren Antikörper 01
Spuren 3-9) reagierten mit einem Protein, das
schwache
aus
auf Nitrocellulosefilter transferiert. Als
Die monoklonalen
Mobilität aufwies wie Lamin A.
Zellkernen, isoliert
von
(Fig. 3, Spur 2).
spezifischen
Immunoblotexperimenten
SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt
Referenz wurde Lamin A mit dem
et al.
wurden in
Dazu wurden die Proteine
anschliessenden Nachweis der
(Lehner
gezeigt.
Antigene
der
achtzehntägiger Embryonen,
Untersuchungen
mit einem 82 kDa-Protein
(Fig. 3,
Kontrollexperiment ohne primären Antikörper zeigte keine
unspezifische Markierung (Fig.3, Spur 11).
51
—
92
-69
—
1
Figur
3:
Molekulargewichte
der
234
5
67
8
45
9 10 11
Antigene
Zellkernproteine aus Lebern von I8tägigen Hühnerembryonen wurden durch SDS-PAGE (8%)
aufgetrennt und auf Nitrocellulose transferiert. Nitrocellulosestreifen wurden mit den monoklonalen
Antikörpern P2-P7 (Spuren 3-8), P10 (Spur 9), P1 (Spur 10) und zur Kontrolle ohne primären
Antikörper (Spur 10) inkubiert. Als Referenz wurden die monoklonalen Antikörper E3 (Lamin B2spezifisch, Spur 1) und 01 (Lamin A-spezifisch, Spur 2) verwendet. Gebundene Antikörper
wurden durch Inkubation mit Peroxydase-gekoppelten, sekundären Reagenzien durch eine
Pfeil
Der
sichtbar gemacht.
Farbreaktion
zeigt die Position des P1-Antigens.
Molekulargewichtsmarker: von oben nach unten: Phosphorylase B (92'000), BSA (66'000) und
Ovalbumin(45'000).
52
IV.2.2.
Lokalisierung
Nach der
Antigene
der
Subklonierung
der
Hybridomaklone wurden
die
Antikörper
erneut
mit indirekter Immunfluoreszenz in
Hühnerembryofibroblasten lokalisiert (Fig. 4).
Die
eine
Antikörper
P1 und P2
ergaben
die
Fokussierung durch
Kernmitte
Fluoreszenzmaximum erkennbar ist
P10
Färbung
deutlich
(Fig.
Während der
zeigten
sich zwischen
Antikörper
P1
ein
P1
Antikörper erzeugten
4
gibt
keine
P2. Bei der
Fokussierung
P2 deutliche
Unterschiede.
P2 eine wesentlich
Fotografieren eine
IgG
spezifische Färbung (Fig. 4E). Um
homogenere
allfällige feine
zu
als
kürzere
Belichtungszeit
primärem Antikörper ergab
zeigen,
dass das P1
ausschliesslich in der Kernhülle und nicht auch im Kerninneren
von
auf die
machen, wurde im Falle der viel stärkeren
zu
durch P2 beim
wurde dieses Protein
P3-P7 und
das Intensitätsverhältnis der mit Hilfe der beiden
als bei P1. Die Kontrolle mit Maus
gewählt
D). Die Antikörper
und
bei bei der
peripheres ringförmiges
Fluoreszenz nicht realistisch wieder. Um
Strukturen deutlicher sichtbar
Kernhüllenfärbung
was
granuläres Färbemuster erzeugte (Fig. 4A),
ergab der Lamin A-spezifische Antikörper
Färbung (Fig. 4C). Figur
als
4B und
ergaben die gleiche Kernfärbung wie
Kernoberfläche
der Kernhülle,
S.
Bailer im
Rahmen anderer
indirekter Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitten durch
Dabei wurde ausschliesslich eine
zu
-Antigen
finden ist,
Experimente
mit
Hirngewebe lokalisiert.
der
Kernperipherie festgestellt (nicht
den
Lokalisierungsstudien wurde
Färbung
gezeigt).
Aus
den
Molekulargewichten
geschlossen, dass
Antikörper
P1
und
P2-P7 und P10 Lamin
reagiert mit einem
späteren Experimenten
A-spezifische Antikörper
bisher unbekannten
weiter charakterisiert wurde
sind. Der
Kernhüllenantigen,
(Kap. IV.10.).
das in
53
^^>j*-
Figur
4:
Immunfluoreszenzlokalisierung
der
P-Antigene
in
Hühnerembryofibroblasten
Die Fibroblasten wurden mit Formaldehyd fixiert und mit Triton X-100 permeabilisiert. Nach der
Inkubation mit Kulturüberständen der Klone P1 (A, B) und P2 (C, D) wurden die gebundenen
Antikörper mit Rhodamin-gekoppelten sekundären Antikörpern sichtbar gemacht. In der Kontrolle
wurden Maus
IgG
als
primäre Antikörper
verwendet
(E).
54
TEIL A: STUDIE ZUR KERNLAMINA
IV.2.3.
Einteilung
Die Lamin
der Lamin
A-spezifischen Antikörper
A-spezifischen
monoklonalen
nach
Antikörper
Immunfluoreszenz auf ihre Reaktivität mit der Lamina
Epitopkiassen
wurden mit indirekter
von
Xenopt/s-Nieren-
epithelzellen untersucht. Die Reaktivität mit einem synthetischen
Teilprotein,
das mit Hilfe
von
lieferte ein zweites Kriterium
nach
vier
Monierter cDNS
zur
Epitopkiassen. Aufgrund
auf Lamin A drei
synthetischen Teilprotein
am
der Lamin
Einteilung
war
(Kap. IV.3.),
A-spezifischen Antikörper
dieser beiden Kriterien lassen sich theoretisch
Epitopkiassen bilden. Tabelle
Antikörpern
hergestellt worden
Lamin A-
II
zeigt, dass sich
Epitopkiassen
mit den vorhandenen
unterscheiden Hessen. Da dem
N-Terminus 170 Aminosäuren fehlten, Hessen sich
die
Epitopkiassen auch grob lokalisieren. Die Epitope der Klassen
der
Xenopus-Lamlna vorhanden)
und A.lll
liegen
A.l
(auch
demnach ziemlich nahe
am
in
N-
Terminus, während die Epitope der Klasse A.M in der Mitte oder in der Cterminalen
Region
zumindest
am
der
Proteinsequenz
N-Terminus strukturelle Aehnlichkeit mit einem
Xenopus-Lam'ma aufzuweisen.
Kernhülle
von
lokalisiert sind. Hühnerlamin A scheint
He/a-Zellen
Keiner der
Reaktivität mit
Reaktivität mit
Xenoous-Laminab
cDNS-Klon A9°
Subklasse3
Antigen
P1
"gGi
igGi
Kernhülle
Lamin A
+
IgGi
igGi
"gGi
igGi
igGi
igGi
Lamin A
P3
P4
P10
P5
P6
P7
P-Antikörper reagierte
mit der
(nicht gezeigt).
Hybridomaklon
P2
Protein der
—
n
Epitopklasse
—
-
A.I.
+
-
A.I.
Lamin A
+
-
A.I.
Lamin A
+
-
A.I.
Lamin A
-
Lamin A
-
Lamin A
-
+
A.II.
+
A.II.
-
A.lll.
a
bestimmt mit der Dotblotmethode nach
D
bestimmt mit indirekter Immunfluoreszenz
c
Reaktivität mit Fusionsprotein aus ß-Galaktosidase (E.coli) und Lamin A-Teilprotein (siehe Kap.
IV.3.1.), immobilisiert auf Nitrocellulose
n:
nicht bestimmt
Beyer (1984)
55
IV.3.
Klonierung
IV.3.1. Isolation
Bei der
Arbeit
Klonierung
fortgesetzt.
analysiert.
cDNS-Sequenzen
Lamin A-kodierenden cDNS-Klonen
von
von
Hühnerlamin A wurde die
Zuerst wurde eine X.
erythroiden
von
Hühneriamin-kodierenden
von
Zellen
von
CF. Lehner
gt11 cDNS-Genbank, hergestellt
15tägiger Hühnerembyonen (Moon
Als Probe diente ein 723
Ein
positiver Phagenklon (A2)
Sequenzhomologie
1986)
zu
menschlichem Lamin A
für die Suche nach
gereinigte
cDNS-Sequenzen
von
poly(A)+
RNS
et al.
1986).
(Tamkun
aus
(McKeon
et al.
zur
et al.
langes
Teilprotein
Insertion Klon A2 wurde als Probe
mit der gesamten strukturellen Information
dieser
terienplaques. Die Phagenklone
5'-
1986, Fisher etal.
analysiert,
Hühnerembryofibroblasten hergestellt
Aus
vom
sequenziert. Die extensive
für Hühnerlamin A verwendet. Zunächst wurde eine Genbank
Hilfe
1985),
(McKeon
Hess vermuten, dass die klonierte cDNS für ein C-terminales
Hühnerlamin A kodierte. Das
von
et al.
wurde isoliert und sein 1.3 kb
cDNS-/nserf wurde in M13-Vektoren subkloniert und
RNS
aus
Bp langes Eco RVHind Ill-Fragment
Ende eines cDNS-Klons, der für menschliches Lamin A kodiert
1986).
begonnene
Suche
resultierten
wurden durch
Homogenität gereinigt. Sieben Klone, die
eindeutig stärksten Signale ergaben,
13
die mit
worden
war
positive Bak¬
mehrmaliges Ausplattieren bis
bei der
PIaque-Hybridisierung die
wurden weiter
Inserts wurden in einem Partialverdau mit Eco Rl
analysiert.
Ihre cDNS-
herausgeschnitten.
Fünf Klone,
A8, A9, A11, A19 und A20 besassen ein cDNS-Fragment, das länger als 1000
Bp
Die Inserts der restlichen zwei Klone, A10 und A15
war.
und zählten nur
ungefähr 200 Bp.
Inserts der fünf
Für die weitere
waren
gleich lang
Charakterisierung
wurden die
grösseren Klone direkt im Phagenvektor X gt11
von
beiden
Seiten her teilweise sequenziert. Diese Klone wiesen, wie A2, eine extensive
Homologie
1986).
zu
menschlichem Lamin A auf
Da bei der
Sequenzierung
in A.
gt11
(McKeon
et al.
1986, Fisher
et al.
ungefähr 200 Basen gelesen
nur
werden konnten, wurden die cDHS-lnserts in M13-Vektoren umkloniert und
grössere Teile davon sequenziert. Die Sequenz der A19-cDNS wurde
Orientierung vollständig
der Methode
Subklonen
von
5
zeigt
1780
bestimmt. Zu diesem Zweck wurde im M13-Vektor nach
Dale et al.
(1985)
hergestellt. Sämtliche
und besassen eine
in einer
ausgeprägte
eine Serie
neu
von
bestimmten
überlappenden
Sequenzen
verkürzten
waren
kolinear
Verwandtschaft mit menschlichem Lamin A.
Fig.
eine Karte dieser Hühnerlamin A-kodierenden cDNS-Klone. A9 ist mit
Bp
der
längste
Klon. Durch
Vergleich
mit menschlichem Lamin A Hess sich
56
3'
5'
I
1
l
"—l
/\-H
l
hA
A2
*
M (A)
l
EcoRI
_
-Lh(A)55
A9
H
A11
U
H
H
A19
(a\
<Au
EboRI
H
500
A8
A20
1
Bp
i
Figur 5: Länge und relative Lage
zur
menschlichen Lamin A-cDNS
(hA)
von
einigen Hühnerlamin
A-
cDNS-Klonen
Für die Isolation von A8, A9, A11, A19 und A20 wurde A2 als Hybridisierungsprobe verwendet. Die
Polyadenylierungssignale der Klone A8, A9 und A19 sind mit einem Stern gekennzeichnet. (A)n
gibt die Längen der poly(A)-Ketten an. Die schrägen Linien bezeichnen die Deletion in der Cterminalen Region von A2 (siehe Text). Die menschliche Lamin A-cDNS besitzt eine Grösse von
3216 Bp (Fisher et al. 1986).Die kodierende Region dieser cDNS ist durch einen Balken
dargestellt.
abschätzen, dass
am
5'-Ende
von
A9
ungefähr
500
fehlen. Die cDNS-Klone A8, A9 und A19 weisen
weniger lange poly(A)-Ketten
ein
auf. Vierzehn
Bp der kodierenden Region
an
ihrem 3'-Ende mehr oder
Basenpaare
perfektes Polyadenylierungssignal (AATAAA).
davor
Der als
(upstream) liegt
Hybridisierungsprobe
verwendete Klon A2 besitzt bemerkenswerterweise eine Deletion
nahe
am
3'-Ende der kodierenden
Region (Fig. 5). Die Uebersetzung in
nosäuresequenz ergab für die cDNS, die für menschliches Lamin
für die
isolierten
Hühnerlamin A-Klone das charakteristische
Tetrapeptid-Motiv -CSIM,
ein
biologisch
von
das bei A2 fehlt.
Gegenwärtig
ist
es
176
Bp
die Ami¬
A kodiert und
C-terminale
unklar, ob A2 für
relevantes Protein kodiert, oder ob diese cDNS durch einen
Klonierungs-Artefakt entstanden ist.
Die
ß-Galaktosidase-Fusionsproteine
sämtlicher A-Klone wurden auf ihre Reaktivität mit verschiedenen Hühnerlamin
A-spezifischen
cDNS-Klon A9
monoklonalen
war
Antikörpern getestet (nicht gezeigt).
das Insert im
richtigen
Leseraster in das
Nur beim
ß-Galaktosidasegen
57
12
Figur
6:
Reaktivität
von
3456789 10
Hühnerlamin
A-spezifischen
monoklonalen
Galaktosidase/Hühnerlamin A-Fusionsprotein
Das Fusionsprotein des cDNS-Klones A9 wurde in E. co//'-Wirtsbakterien
Antikörpern
vom
mit
ß-
Stamm Y 1090
Bakterienplaques (auf der Agarpiatte) mit
Filterabzug
exprimiert.
verschiedenen Lamin A-spezifischen monoklonalen Antikörpern getestet.
Anschliessend wurde ein
Streifen 1-6
den
P2-P7
Streifen
7
P10
Streifen
8
01
Streifen
9
L3/4B4, freundlicherweise
Streifen 10
von
Kontrolle ohne
von R. Stick, Tübingen
primären Antikörper
,
zur
Verfügung gestellt
58
eingebaut worden,
einige der getesteten Lamin A-Epitope nach¬
dass
so
gewiesen werden konnten.(Fig.6).
immunologischen
Diese
bestätigten,
Daten
dass die isolierten cDNS-Klone für Hühnerlamin A kodieren. Die Reaktivität mit
A-Teilprotein wurde ausserdem für
dem A9-Lamin
Antikörper
klonalen
mono¬
Epitopkiassen verwendet (Kap. IV.2.3.).
in
mit der Isolation der beschriebenen Klone wurde durch Dr. G.
Gleichzeitig
Kitten und G. Maridor,
RNS
poly(A)+
der
Einteilung
die
(ISREC, Epalinges)
eine weitere Genbank,
10tägigen Hühnerembryonen (Sap
von
hergestellt
aus
1986), analysiert.
etal.
Diese Genbank wurde ebenfalls mit der cDNS A2 als Probe auf Hühnerlamin Akodierende Klone untersucht. Parallel dazu wurde die
Mischung
monoklonalen
von
Hühnerlamin
Genbank mit einer
gleiche
Epitope gerichtet sind (Kap. IV.2.3.), analysiert.
gegen verschiedene
Immunoscreenina bezeichnete Methode hat den Vorteil, dass das
der
gesuchten cDNS
direkt als
werden kann. Der Einsatz
Epitope erleichtert
Fusionsprotein
monoklonalen
von
im Primärscreen
Klonierung.
gegenüber
die im
richtigen
Leseraster und in der
gefunden werden
7A
Figur
jedoch
nicht
im
Galaktosidase
gezeigt).
von
Lamin A
richtigen Leseraster,
nicht
von
zwei
Klon cA-1, isoliert durch
die ganze strukturelle Information
mit
so
spezifischen
monoklonalen
Fusionsprotein
Lamin
am
gezeigt).
kodieren. Die cDNS
(Promega Biotec)
von
et al.
bestätigten,
positive
15
Klonen sind
(siehe Kap. IV.3.3.). Sein
dass das
liegt. Fünf
Antikörpern
dieses cDNS-Klones, das andererseits
Diese Resultate
Methode
PIaque-Hybridisierung,
werden
1986a)
enthält
Insert ist
Fusionsprotein
mit
konnte
ß-
(nicht
Antikörpern gefunden
monoklonalen
5'-Ende
A-spezifischen
spezifischen Antikörpern (Lehner
der
Restriktionsanalyse
wurde, ist kolinear mit Klon cA-1 und kodiert für mehr als 80%
A, wobei der fehlende Rest
Epitope
cDNS-Fragmente,
repräsentativen
Antikörpern nachgewiesen
Klon cA-2, der mit
diese
insgesamt
und deren cDNS-Inserts wurden durch
dargestellt.
der
richtigen Orientierung exprimiert wurden,
charakterisiert. Partielle Restriktionskarten
in
nur
können. Mit beiden Methoden wurden
Phagenklone isoliert
in einem
Mindestlänge
hat
den Nachteil, dass
PIaque-Hybridisierung
der
nachgewiesen
ungefähre Lage
Falls zudem die
ausgesagt werden. Andererseits
Klone
Genprodukt
positiver Klone
bekannt ist, kann in vielen Fällen auch bereits etwas über die
gefundenen
Diese als
Antikörpern gegen verschiedene
den Ausschluss fälschlicherweise
frühen Stadium der
die
A-spezifischen Antikörpern,
von
von
Hühnerlamin
sechs getesteten
reagierten
von
9 Lamin
mit
dem
Bi- oder B2-
nicht erkannt wurde
(nicht
dass cA-1 und cA-2 für Hühnerlamin A
Klon cA-1 wurde in M13-Vektoren und in
umkloniert und nach der Methode
von
Sanger
pGEM-3Zf(-)
etal.
(1977)
59
Die Identität der Hühnerlamin A-cDNS konnte durch
sequenziert.
mit Lamin A von anderen
vergleiche
Kap. V.3.5.). Die
der Fibroblasten-Genbank
aus
(Fig. 5)
cDNS-Klone
Spezies eindeutig
Vergleich geht hervor, dass
Aus diesem
(siehe
bestimmt werden
(Tamkun
1986)
etal.
überlappenden Sequenzen
sind in den
Sequenz¬
der cDNS cA-1 bis
isolierten
mit cA-2 identisch.
poly(A)-Kette
zur
47
Nukleotide fehlen.
IV.3.2. Isolation
Lamin Bi- und Bo-kodierenden cDNS-Klonen
von
Die ersten Lamin B-|- und Lamin B2-kodierenden Teilklone
Lehner isoliert worden. cDNS Klone mit der
für Lamin
Eine
Bi wurden
partielle
Klonen ist in
T. Peter
Restriktionskarte
Fig.
7B
Für die Isolation
eine
von
vier
repräsentativen
Lamin B2-kodierenden
von
worden
embryonen hergestellt
Lamin Bi -kodierenden
poly(A)+
aus
war
cDNS-Sequenzen
(Moon
RNS
1985),
et al.
mit monoklonalen Anti¬
Aus dieser Suche resultierte ein Klon,
einem cDHS-lnsert
von
Lamin
1.48 kb. Sein
mit Lamin A- und Bi
ligiert und nach
Aus dem
1 für ein
Laminprotein kodiert,
Klon cB2-1
hergestellt
wovon
dem
das
RNS
A und
von
von
Klon cB2-1 wurde in
Sanger
war
10
einer, cB2-2, ein cDHS-lnsert
vollständig
eine Reihe
Vergleich
1986, Fisher
die Information für
in beiden
verkürzten
mit der
et al.
(1977)
ersichtlich, dass cB2-
einer X
gt11
cDNS-Genbank
Tage alten Hühnerembryonen
von
2.0 kB enthielt
in
1986)
Sequenz
wurde
(Fig. 7C). Sein
M13-Vektoren
Orientierungen sequenziert.
der 5'-terminalen Hälfte nach der Methode
von
et al.
Bi verschieden ist. Das Insertvon
Analyse
von
erkannt.
(Clonetech). Mehrere positive Phagenklone wurden
war
Sequenzierung
zweiten aus
poly(A)+
Methode
cDNS-Sequenzen
von
vier der sechs
Antikörpern
Restriktionsfragmente davon (Fig. 7C) wurden
umkloniert und
(1985)
aus
worden
Insert und
für die
der
wurde als Probe für die
verwendet, die
isoliert,
Vergleich
der
von
-spezifischen monoklonalen Anti¬
Resultate. Das cDHS-lnsert
körpern ergaben negative
cB2-1 (Fig. 7C) mit
wurde
monoklonalen
B2-spezifischen
Kontrollexperimente
sequenziert.
Fusionsprotein
wurde zuerst
15tägigen Hühner¬
von
körpern analysiert.
M13-Vektoren
und charakterisiert.
dargestellt.
kgt11 cDNS-Genbank, die
getesteten
C. F.
gesamten strukturellen Information
(ISREC, Epalinges) isoliert
von
waren von
Dabei wurde
von
Dale et al.
überlappenden Subklonen hergestellt. Aus
von
menschlichem Lamin A
geschlossen, dass dem
Klon
(McKeon
cB2-2
am
N-terminale Aminosäuren fehlt. cB2-3 wurde
et al.
5'-Ende
aus
einer
Hühnerembryonen hergestellten Xgt11 cDNS-Genbank (Sap
ef al.
wenige
60
Chicken Lamin A
A
] c
N[
Chicken Lamin
B
*
¦
¦
,_
-I
cA-1
—\
CA-2
B1
] C
Eco FB
I
Xho\
I
¦
I
bp
Eco PS
Nar\
Eco PI
Marl
,
500
500
bp
Ahal
Xba\
Eco Rl
'
'—IX/701
'
'
•
'
»
¦
¦
¦
L__
^
I—"-
Chicken Lamin
C
B2
NC
500
Psfl SsflH/ndlßamHI
Pst I
Bgl
I
—i
_i_
1^
Figur
»-
7: Restriktionskarten
C^-1
06,-2
08,-3
ca,-4
i_i
1
JL
1
bp
cB2-1
cB2-2
cB2-3
einiger Hühnerlamin-kodierender cDNS-Klone
Die cDNS-Klone sind zusammen mit den Laminproteinen, für die sie kodieren, dargestellt. Die
punktierten Flächen bezeichnen die Positionen der zentralen a-helikalen ftod-Domänen.
61
1986)
Hybridisierungsprobe
isoliert. Als
Fragment (158 Bp)
B2/ß-Galaktosidase-Fusionsprotein
Lamin
B2-spezifischen
-spezifischen
(nicht gezeigt).
monoklonalen
Fragmente
fälschlicherweise
Transkripten
ligiert worden
als die
Rl-Fragmente
kodiert für ein Protein
von
bei der
Herstellung
in Northern-
der Genbank
Primärstruktur setzt sich
66'529
Da
aus
aus
(Fig. 8)
der Lamin
A. Bi und Bp
die daraus
Hühnerlaminproteine.
73'164 Da, die
von
ausfielen
cB2-3-cDNS (nicht gezeigt). Dies
Hühnerlaminproteine
657 Aminosäuren
aus
während Tests mit A-
sind.
der drei
Aminosäuresequenzen
Molekulargewicht
sämtlichen fünf getesteten
zeigen die Nukleotidsequenzen und
8-10
Molekulargewicht
von
Rl-Fragmente hybridisierten
IV.3.3. Primär- und Skundärstrukturen der
Figuren
wurde
Antikörpern durchwegs negativ
Die beiden anderen Eco
lässt vermuten, dass die drei Eco
abgeleitete
drei Eco Rl-
aus
dass eines dieser
Antikörpern erkannt,
monoklonalen
mit anderen
Experimenten
Die
II-
gesamte strukturelle Information für Hühnerlamin B2 enthält. Das
die
Lamin
und Bi
Bgl
cB2-1 und cB2-2 ist. Die Sequenzanalyse bestätigte, dass dieses
kolinear mit
Fragment
cB2-2 (Fig. 7C). Klon cB2-3 besteht
von
Restriktionsanalyse ergab,
Die
Fragmenten.
diente dabei das 5'-terminale
Die
abgeleiteten
Lamin
A-cDNS
mit einem errechneten
Bi-kodierenden cDNS
584 Aminosäuren mit einem totalen
zusammen.
Das
aus
600 Aminosäuren
zusammengesetzte Lamin B2 besitzt ein errechnetes Molekulargewicht
von
67'945 Da. Die theoretischen isoelektrischen Punkte für Lamin A, Bi und B2
betragen 6.5, 4.9 und 5.26. Alle diese Werte stimmen gut mit den Werten
überein, die
Lehner et al.
von
(1986a)
Gelelektrophorese ermittelt worden
Gemäss
drei
Voraussagen
Laminproteine
Organisation
auf
Domäne, die
aus
sind durch kurze
wird
Tail)
von
eine für
flankiert.
Sekundärstruktur
(Garnier etal. 1978)
Sie besitzen eine zentrale a-helikale Rod-
den drei Unterdomänen
(Coils) 1a,
Zwischensegmente (Linker)
1b und 2 besteht. Die Coils
verbunden. Die a-helikale Domäne
carboxyterminalen
a
Domänen
(Head
und
für die Formation der zentralen f?od-Domäne ist ein
das aus sieben Aminosäuren besteht
den Positionen
weisen alle
Intermediärfilamentproteine typische molekulare
(Figuren 8-10).
Grundlage
und zweidimensionaler
waren.
nicht-helikalen Amino- und
repetitives Motiv,
an
zur
mittels ein-
und d meistens eine
hydrophobe Aminosäure
Dadurch entsteht auf der Oberfläche der a-Helix ein
hydrophober "Saum", durch
den
jeweils
(Heptad Repeat), wobei
schraubenartig
zwei a-Helices
zu
finden ist.
verlaufender
parallel interagieren
und
62
sich dabei umeinander winden
(Coiled Coil) (Geisler
und Weber 1986, Franke 1987, Steinen und
1988).
Alle drei
Primärstrukturen
Roop 1988, Conway und Parry
Hühnerlaminproteine besitzen,
von
und Weber 1982, Osborn
wie alle anderen bekannten
Laminproteinen (Weber 1986, Parry
etal.
gegenüber den zytoplasmatischen Intermediärfilamentproteinen
um
sechs
Heptapeptid-Einheiten verlängerten Coil
Um die Primärstrukturen der drei
1986),
von
einen
Vertebraten
1b.
Hühnerlaminproteine
vergleichen, wurden
zu
ihre
Aminosäuresequenzen untereinandergeschrieben (Alignment, Fig. 11). Alle
drei
Laminproteine
strukturell mit dem
Figur 8: cDNS-Sequenz
besitzen eine basische Domäne
Signal
Lokalisierung
für die
und die daraus
(Fig. 11, unterstrichen), die
des SV large T Antigen im Zeil-
abgeleitete Aminosäuresequenz
von
Hühnerlamin A
Die Coils 1a, 1b und 2 bezeichnen a-helikale Domänen mit den typischen repetitiven
Heptapeptiden, die bewirken, dass zwei benachbarte Aminosäuren sich ineinander verdrehen
(Coiled Coils). Die
(McKeon
Coils der
Hühnerlaminproteine
wurden durch
Vergleich
mit Lamin A des
etal. 1986, Fisher etal. 1986) bestimmt. Die repetitiven Heptapeptide sind in
der ersten und vierten Position markiert: die ausgefüllten Kreise bezeichnen hydrophobe
ungeladene Aminosäurereste, die die Bildung der Coiled Coils begünstigen. Offene Symbole
Menschen
weniger günstige Aminosäuren: geladene Aminosäuren (offene Kreise) und kurze
aliphatische Hydroxyaminosäuren (offene Dreiecke). Mögliche Phasenwechsel in den
Heptapeptiden sind durch ein offenes Viereck gekennzeichnet. Ein mögliches Signal für die
Lokalisierung im Zellkern ist unterstrichen. Die vier konservierten Typtophanreste in der Ta/7-
bezeichnen
Domäne sind mit Sternen versehen.
Figur
9:
cDNS-Sequenz
und die daraus
abgeleitete Aminosäuresequenz
von
Hühnerlamin Bi
Die Coils 1a, 1b und 2 bezeichnen, wie in Figur 8, a-helikale Domänen mit den typischen
repetitiven Heptapeptiden, die die Bildung von Coiled Coils begünstigen. Die repetitiven
Heptapeptide sind in der ersten und vierten Position markiert: ausgefüllte Kreise zeigen
hydrophobe ungeladene Aminosäuren an, ausgefüllte Vierecke kennzeichnen Cysteine, offene
Kreise markieren geladene Aminosäuren und offene Dreiecke bezeichnen kurze aliphatische
Hydroxyaminosäuren. Mögliche Phasenwechsel im Heptapeptidmotiv kommen an konservierten
Stellen vor und sind durch ein offenes Viereck gekennzeichnet. Ein potentielles Signal für die
Lokalisierung im Zellkern ist unterstrichen und die vier carboxyterminalen Tryptophanreste in der
Ta/7-Domäne sind durch Sterne gekennzeichnet.
Figur 10: cDNS-Sequenz und die
daraus
abgeleitete Aminosäuresequenz
von
Hühnerlamin
B2
Die Coils 1a, 1b und 2 mit dem sich wiederholenden Heptapeptidmotiv wurden durch Vergleich mit
menschlichem Lamin A (McKeon etal. 1986, Fisher etal. 1986) identifiziert. Die erste und vierte
Aminosäure der repetitiven Heptapeptide sind entsprechend ihrer chemischen Eigenschaft mit
verschiedenen
Symbolen
versehen:
ausgefüllte
Kreise weisen auf
hydrophobe ungeladene
Aminosäurereste hin, die die Bildung von Coiled Coils fördern, offene Symbole bezeichnen
Aminosäuren, die die Bildung der Lamindimere weniger begünstigen, so zum Beispiel geladene
(offene Kreise) und kurze aliphatische Hydroxyaminosäuren (offene Dreiecke). Die
potentiellen Phasenwechsel im sich wiederholenden Sequenzmotiv liegen an konservierter Stelle
und sind durch offene Vierecke gekennzeichnet. Ein Motiv, das möglicherweise als Signal für die
Lokalisierung im Zellkern wichtig ist, ist unterstrichen. Die vier Tryptophanreste in der Ta/'ADomäne
sind durch Sterne gekennzeichnet.
Aminosäuren
63
CGTCCGCCGTCCGCCGCCCCCCGACGGCTCTTCTCCGCCCGCCOSGCGCCCCCGCAGCGTTCCCCGCCCGCCGCCCGCCGTCCCGGGGTa^ACXGCCGCCCCCCGCCCAGCCGCC
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460
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GTC
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CTC CGC AAC AAA TCC AAT GAG GAC CAG GCC CTG GGG AAC TGG CAG GTG AAG CGG CAG AAC GGG GAC GAC CCC CCC CTG
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64
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65
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450
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480
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TGA AGAMGAAAAAGAAAGAAACTATTACTTGCTATTITITCCATTTATTTCCTTTTATTTTTGCTATTTTTTTTTTCCTCCAGAG^
ATTTCTTTGATGGTTACTTCCTGGTACATTmATAAAAAAAAAAAGGAAAAGATGGAGGTTGAA
AACCCCAGITTCTTTTTGGGGGACTTGGATCGGCGCCAGGGGTOITTCCATTCGTCTGtXCTCrTTGACTGAGCTTCGGCC..
.
66
(Dingwall
kern
drei Proteinen vier konservierte
und eine Reihe
ist. Die Ta/V-Domäne enthält bei allen
Laskey 1986) verwandt
und
von
sauren
Tryptophanreste (Fig. 11, ausgefüllte Sterne)
Schliesslich
(Fig. 11, gestrichelt).
Aminosäuren
besitzen alle drei Proteine ein C-terminales
Tetrapeptid-Motiv mit der Sequenz
CXXM.
Vergleich ergab
Der
drei
aber auch
Hühnerlaminproteinen.
So besitzen
(Höger
in Lamin B der Maus
weist Lamin Bi noch zwei weitere
Positionen 70 und
alle
Cysteinreste
und
594).
283).
Im
Cysteine
1988)
Xenopus L| (Krohne
in der Co/7-Domäne auf
zu
Serinresten auf
Signals
so
Nr. 573, 591
fünf Histidinresten
und B2 fehlen. Lamin
(Fig. 11, ausgefüllte Kreise). Obwohl diese Domänen
besitzt doch
IV.3.4. Quantitativer
einzig B2 bis
Vergleich
B2
für die Lokalistion im Zellkern eine Reihe
Laminproteinen relativ reich
bei anderen
B-|),
Laminproteinen Bi
aus
(Fig. 11,
Hühnerlamin A
von
(Fig. 11,
finden
Lamin A besitzt in der Ta/7-Domäne eine Reihe
die bei den
et al.
konserviert ist. Daneben
dazu sind im Falle
Gegensatz
weist auf beiden Seiten des
Lamin
et al.
und B2 im
Laminproteine Bi
der auch in
in der Nähe des C-Terminus
(Fig. 11, Pfeilspitzen),
von
die
nur
Cysteinrest (Fig.11, Dreieck),
Coil 1b einen
1987) und
wesentliche Unterschiede zwischen den
einige
Hydroxyaminosäuren
an
auch
(z.B.
sind
sieben Serinreste in einer Reihe.
zu
mehrerer A-
und
B-typischer
Vertebraten-
Laminproteine
Um
Verwandtschaft
die
quantitativ
und
B-typischen Laminproteinen
erfassen, wurden vorhandene Laminsequenzen
zu
einer
Computeranalyse verglichen.
dem
Algorithmus
waren
A-
zwischen
von
drei A- und drei
Das dabei verwendete
Needleman und Wunsch
etal.
1987).
1986)
Die
gerechtfertigt,
mit den
(1970).
und die
Xenopt/s-Lamine
Berücksichtigung
von
dass dieses Protein eine
(Wolin
A
(McKeon
etal.
1987)
und B2 aufweisen
die Aehnlichkeit zwischen
und Hühnerdesmin
(Geisler
1982)
wiesen bei diesem
et al.
und L|
(Kap. V.3.5.).
Vergleich:
in der
nämlich die
1986,
(Krohne
ausgedehnte strukturelle Verwandtschaft
dass 70-90% aller Aminosäurereste in allen sechs
1987) liegt
Vergleich
L| in dieser Vergleichsstudie ist dadurch
ähnlich sind. Zum
al.
basiert auf
In diesem
B-typische Laminproteine eingeschlossen,
Hühnerlaminproteinen Bi
geht hervor,
Vertebraten in
Programm
drei Hühnerlamine A, Bi und B2, menschliches Lamin A
Fisher etal.
von
und Weber
Grössenordnung
von
quantitativen Vergleich
Aus Tabelle III
Laminproteinen
Hühnerlaminproteinen
oder Hühnervimentin
50%. A- und
(Zehner
B-typische
et
Lamine
eine ähnliche Verwandtschaft mit den
67
.Coil 1b
4-».Coil 1a
~—n
!-*.
HSGTPIRGTPGGTPLSPTRISRLqEKEELRQLNORLAVYIDRVRALELENDRLLVKISEKEEVTTREVSGIKNLYESELADARIWLDETAKERA
MAAAVAPLSPQPRGAAASAALSPTRISRLQEKEELRQLNDRLAVYIDKVRSLETENSALQRRVSEREQVCGREISGLKELFETELADARKTLDDTARERA
MSTPSQRRSGRGGGP.SGTPLSPTRITRLqEKEDLqELMORLAVYIDKVRSLELENAGLRLRITESEEVVSREVSGIKAAYEAELADARKTLDSVAKERA
.
..
B2
BI
1
1
A
1
T
B2
95
BI
101
700
A
RLqLELSKVREEHKELKARNAKKEADLLAAqARLKDLEALLNSKEAALSTALGEKRNLENEVRDLRAqVAKLEGALSEAKKqLqDEHLRRVDAENRLqTL
.
.
Coil
r*-
2
99
.
RLqiEIGKLRAELEEFNKSYKKKDADLSVAqGRIKDLEVLFHRSEAELNTVLNEKRSLEAEVADLRAqLAKAEOGHAVAKKqLEKETLMRVDLENRCqSL
KLQIELGKLRAEHEqVLSSYAKKDSDLNAAqVKLREFEAALNAKEAALATALGDKRSqEEELEDLRDqiAqLEVSLAAAKKELADETLqKVDLENRCqSL
—1
94
100
194
200
199
•
294
i95
20i
200
QEDLDFRKNVFEEEIRETRKRHEHRLVEVDTSRqqEYENKMAqALEDLRNQHDEqVKLYKMELEqTYqAKLENAILASOqNDKAAGAAREELKEARHRIE
lEDLEFRKNVYEEEIKETRRKHETRLVEVDSGRqiEYEYKLAqALKEIREQHDAqVKLYKEELEqTYSSKLENIRqSSEMHSCTANTVREELHESRHRIE
KEELEFQKNIYSEELRETKRRHETRLVEIDNGRQQEFESKLAEALQDLRRqHEOQIRHYRDELEKTYGAKLENAKQSAERNSSMAGAAHEELQQTHIRID
300
299
B2
295
BI
301
A
300
SLSHqLSGLqKqASATEDRIRELKETMAGEROKFRKMLDAKEREHTEHROqMqLqLTEYqELLDVKLALDHEISAYRKLLEGEEERLKLSPSPSSRVTVS
TLSSHIADiqKESRAWqORVHELEOTLSKERENYRKILAENEREVAEMRNqHqqqFSDYEqLLDVKLALDHEISAYRKLLESEEERLRLSPGPSSRVTVS
SLSAELSqLqKqLAAKEAKLREVEEALSREREGGRRLLAEKEREHAEHRARMqqqLDEYqELLDIKLALDMEINAYRKLLEGEEERLRLSPSPSSqRGAR
394
400
399
B2
A
395 RATSSSSSSSTSLVRSSRGKRRRIEAEELSGSGTSGIGTGSISGSSSSSSFQMSQQASATGSISIEEIDLEGKYVqLKNNSEKOQSLGNWRLKRQIGDGE 494
40J RASSSRS
VRTTRGKRKRIDVEE
SEASSSVSISHSASATGNISIEEIOVOGKFIRLKNTSEqDqPHGGHEMIRKIGDTS 478
400 SSGLqHS
GAGSAKKRRLEDGE
GREGREGRTSFSHHARTSGRVGVEEVDLEGRFVRLRNKSNEOqALGNWqVKRqNGDDP 478
B2
BI
495
479 A.
B2
BI
A
BI
EIAYKFTPKYVLRAGqTVTiwGADAGVSHSPPSVLVWKNqGSWGTGGNIRTYLVNSDGEEVAVR.TVTKSVVVRENEEEEDEADFGEEDLFNqqGDPRTT
593
A
SYRYTSRYVLKAGqTVTIWAANAGVTASPPTDLIWKNqNSWGTGEOVKVVLKNSqGEEVAqRSTVFKnVNEGEEEEEEGEEEILEDVIHqqGSPRKP 577
479 PLTYRFPPKFTLKAGQAVTIWASGAGATHSPPSDVVWKAQSSWGSGOSLRTALINSNGEEVAMRKLVRTVIINDDOEOEEDDEVSIHHRHHH..SGCSGS 576
B2
¦ft ä
594 SRGCLVM
h
BI
A
600
57fl ERSCVVM 584
-k *
577 ADPAEYNLRSRTVLCGTCGqPADKGSAAAASSASSASTVTVSRGYRSSGGGIGEGLLGRSYVLGGAGPRRqAPAPqGCSIH
Figur
.
11:
.
.
.
Vergleich der Aminosäuresequenzen
von
.
Lamin A,
111
¦
657
B-\ und B2
Die Coils 1a, 1b und 2 sind durch Pfeile angegeben. Alle drei gegenwärtig bekannten
Hühnerlaminproteine weisen folgende gemeinsame Merkmale auf: vier konservierte
Tryptophanreste (ausgefüllte Sterne) in der Ta/7-Domäne, ein potentielles Signal für die
Lokalisation im Zellkern (unterstrichen), eine saure Domäne (gestrichelte Linie) und ein
carboxyterminales Tetrapeptidmotiv mit der Sequenz CXXM (offene Sterne). Andererseits ist ein
Cystein im Coil 1b nur bei den beiden B-typischen Laminproteinen vorhanden (Pfeil), während
eine Reihe von Histidinresten in der Ta/Z-Region spezifisch für Lamin A ist (Pfeilspitzen). Man
beachte in der Sequenz von Lamin B2 die Reihen von Serinresten (ausgefüllte Kreise) auf beiden
Seiten des potentiellen Signals für die Lokalisierung im Zellkern.
68
zytoplasmatischen Intermediärfilamentproteinen
die Verwandtschaft unter
die Verwandtschaft
Befund
entsprechende
-
cBi
71
CB2
72
a
verschiedenen Unterfamilien. Dieser
Spezies-Zugehörigkeit
sind bei allen
der
verglichenen
A-typischen
Lamin¬
Proteine
beträgt
B-typischen
der Aminosäuren identisch, bei den
B-typischen
A-typischen
Proteinen
48%. 37% der Aminosäuren dieser Domäne
Laminproteinen
identisch.
Aehnlichkeit3 (%) der Aminosäuresequenz zwischen verschiedenen A- und Btypischen Laminproteinen von Vertebraten
cAb
CA
dass
signifikant grösser ist als
konserviert. In der ftod-Domäne sind bei den
entsprechende Wert
sind bei allen sechs
Tabelle III:
zeigt ferner,
Wert 46%. Andererseits sind 31% der Aminosäuren in allen
Laminproteinen 78%
der
aus
Aminosäuren identisch. Für die
Laminproteinen
beträgt
der
von
einer Unterfamilie
entsprechenden Positionen
proteinen 65% der
sechs
Proteinen
gilt unabhängig
Proteine. An den
der
von
Mitgliedern
auf. Tabelle III
cBi
cB2
HuA
XeA
XeL|
71
72
91
87
72
77
71
70
81
.
72
70
75
77
Die Aehnlichkeit wurde nach dem Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) bestimmt.
Dazu wurde ein Programm der Genetics Computer Group der Universität von Wisconsin verwen¬
det.
D
Abkürzungen und Herkunft der Daten: cA: Hüherlamin A; cBi: Hühnerlamin B-|; CB2: Hühnerla¬
min B2; HuA: menschliches Lamin A (Fisher etal., 1986); XeA: Xenopus-Lamin A (Wolin etal.,
1987); XeL|: Xenopus L| (Krohne et al., 1987).
Eine
quantitative Analyse
Domänen der
der strukturellen
ist in Tabelle IV
Laminproteine
gezeigt.
terminalen Domänen sind, wie dies bei den
filamentproteinen
der Fall ist
Conway und Parry 1988),
ftod-Domäne.
Es ist
zwischen den Coils
Diese
(Osborn
im
Konservierung
gleich gut
Intermediär¬
zytoplasmatischen
und Weber 1986, Steinert und
dass bei den
einzelnen
Die N-terminalen und C-
allgemeinen weniger konserviert
auffällig,
von
Roop 1988,
als die zentrale
Laminproteinen
die
Regionen
konserviert sind wie die Co/7-Domänen selbst.
Konservierung könnte strukturelle Eigenschaften der Zwischenregionen
wiederspiegeln. So
bleibt
nach den
Regeln
zur
Voraussage
von
Sekun-
69
(Garnier
därsrukturen
Zwischenregionen
et al.
erhalten
1978)
(Parry
die a-helikale
etal.
Struktur auch in diesen
1986).
Tabelle IV: Aehnlichkeit3
A- und
(%) in der Aminosäuresequenz zwischen vergleichbaren Segmenten
B-typischen Vertebraten-Laminproteinen
Segment
(Nr. der Aminosäuren)
cAb/cBi
CA/CB2
cA/HuA
cB-|/XeL|
cB-|/XeL|
Head
53
67
91
45
56
78
78
97
78
73
80
70
100
100
90
76
73
97
83
78
88
88
96
92
75
79
76
94
86
78
60
61
85
80
72
(28-35)
Coil 1a
(37)
Linker 1a-1b
Coil 1b
(138)
Linken b-2
Coil 2
(10)
(24)
(146)
Tai!*2 (194-269)
3
Die Aehnlichkeiten wurden
D
Erklärung der Abkürzungen
c
gleich bestimmt,
wie in der Fussnote zu Tab. III
von
angegeben
in der Fussnote von Tab. III
Die ganze Ta/ADomän der B-typischen
der A-typischen Lamine verglichen.
Laminproteine
wurden mit der
entsprechenden
Domä¬
ne
IV.3.5. Gemeinsame und
spezifische
Domänen
von
A- und
B-tvpischen
Lamin¬
proteinen
In einer weiteren Studie wurden die Primärstrukturen
und
zu
verschiedenen A-
von
B-typischen Vertebraten-Laminproteinen verglichen.
Um diesen
Vergleich
erleichtern, wurde eine Konsensussequenz für jede Unterfamilie erstellt.
Dabei
wurden
dieselben
Laminsequenzen
wie
bei
Vergleichen (Tabellen III und IV) berücksichtigt. Aus Figur
A-
und
B-typische Laminproteine
neben
einer
Organisation (vgl. Kap. IV.3.3.) Regionen
mit
terminalen
Ende
von
sämtlichen Klassen
und Weber 1982,
und
von
liegen
Coil 2.
am
hoher
gleichen
dass
strukturellen
Sequenzhomologie
von
Coil 1a und
am
C-
Bereiche sind auch zwischen
Hanukoglu und Fuchs 1983, Osborn und Weber 1986, Steinen
Roop 1988, Conway und Parry 1988). Vermutlich
1987).
geht hervor,
Intermediärfilamentproteinen stark konserviert (Geisler
Domänen für die axiale Interaktion von
etal.
quantitativen
Konservierung zwischen
N-terminalen Ende
Die
12
gemeinsamen
aufweisen. Die Domänen mit der besten strukturellen
den beiden Unterfamilien
den
Interessanterweise findet
parallelen
man
sind diese beiden
Laminmolekülen
wichtig (Parry
auch ausserhalb der Co/7-Domänen
70
stark konservierte Bereiche, nämlich die 13 Aminosäuren unmittelbar
Coil 1a oder die
Region, die dem Coil
1b
folgt (Fig. 12). Der
vor
dem
Tail enthält weitere
Motive, die zwischen den beiden Unterfamilien konserviert sind und die bereits
beim
sind
Vergleich
(für
Hühnerlaminproteine (Kap. IV.3.3.)
der drei
weitere
Erklärungen
siehe
Legende
zu
Fig. 12).
Neben den beschriebenen Gemeinsamkeiten
proteinen
wurden beim
Unterschiede
Aminosäuren)
Domäne
gibt
Serine und
es
A- und
von
Zunächst fällt die
C-terminale
A-typischen Laminproteine
einige konservierte Motive,
Glycine (Fig. 12).
auf.
so zum
ausgefülltes Dreieck). Dieses Cystein liegt
Unterfamilien stark konserviert ist.
In dieser
unterstrichen). Aufällig
sämtlicher
Cystein
beiden X im Falle der
aus
B-Sequenzen,
im Coil 1b
(Fig. 12,
wichtige
B-typischen Sequenzen
carboxyterminalen Region (Fig. 12,
Tetrapeptid-Motiv -CXXM
den Aminosäuren -CSIM besteht,
B-typischen
80
A-spezifischen
diese Domäne
Möglicherweise erfüllt
Histidinen in der
(ca.
in einer Domäne, die in beiden
ist auch, dass das C-terminale
A-Sequenzen
Seitenketten
Lamin¬
Beispiel einige Cysteine,
strukturelle Funktionen. Sämtliche A-, aber keine der
von
Extension
Andererseits besitzen alle Lamin
aber keines der Lamin A-Proteine, ein konserviertes
besitzen eine Reihe
B-typischen
Vergleich der beiden Unterfamilien auch einige auffällige
gefunden.
der
beschrieben worden
wohingegen die
Lamine Aminosäuren mit
hydrophoben
repräsentieren.
Figur 12: Vergleich der Laminproteine mehrerer Vertebraten-Spezies
Für den
Vergleich wurden die Konsensussequenzen von je drei A- und B-typischen LaminPrimärstrukturen erstellt. Dabei wurden dieselben Laminproteine wie in den Tabellen III und IV
berücksichtigt. Grosse Buchstaben bezeichnen Aminosäuren, die bei allen drei Proteinen einer
Unterfamilie konserviert sind. Kleine Buchstaben zeigen an, dass die entsprechende Aminosäure
in zwei
Spezies vorkommt und in der dritten Spezies ein konservativer Austausch stattgefunden
(z.B. D/E, R/K, Y/F, l/V/L/M/A). Alle anderen Substitutionen sind durch Punkte markiert.
Gestrichelte Linien bezeichnen Positionen, wo Lücken (Gaps) eingeführt wurden. Beachte, dass
die meisten Lücken in den Bereichen auf beiden Seiten des potentiellen Signals für die
Lokalisierung im Zellkern (unterbrochene Linie) vorkommen. Die Positionen der Co7/s 1a, 1b und 2
sind durch Pfeile bezeichnet. Ausgefüllte Sterne markieren die Positionen der vier
Tryptophanreste, während die offenen Sterne auf das konservierte C-terminale Tetrapeptidmotiv
hinweisen. Die saure Domäne ist durch ausgefüllte Kreise markiert. Die Lamin A-spezifische Reihe
von Histidinresten ist unterstrichen. Das Lamin B-typische Cystein im Coil 1b ist mit einem
ausgefüllten Dreieck gekennzeichnet.
hat
R
-^i
r-+-
Coil
1b
Sy.Kkd.dL...Q.r.re.Eall....A.L.Ta..e.rS...Ev.DLr..i..1....A.AKK.L..E.L..VDLENRCQS
2
a...REEL.E.RmRI
-*-|
KkRrLE..E
tV T*r
..r.C.vM
s!DP.EYNLRSRTvlC.tCG.PAdK..a
B
A
.
•
.-SS.SS.SsVTvtR.YRS.GG-.G
G...V---
PQ.CSIM
——
...HHHh-
^
r.
iSIEEiDvdGKyi .LKN.SE.D. .1G.W.1 .R. IGd.
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S. .SSS. .i.. .A.ATG.
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B ..-.ykfT.rYVLkA.QTVTIW.A.AGV. .SPPs.LiWKNQ.SWGTG. .vk. .L.NS.GEEVA.R-Tv.-t
A
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B SRAsSS..
A .r
A
B
lKEELeFQK.IY.EElRETKRRHETRLVEiDNGrQ.EFESkLAdAL.eLR.QHE.Qi..Yk.EL.KTY.AKLeNAkQSAERNS.lvG.A.EElQQs.IRI
Coil
A
r-^
L.EdL.FRKNvyEEEIkET.rrHE.RLVEVDs.RQ.eYE.Kl.QAL.e.R.Q.d.Qv.LYK.ELEQTY..KLENa...Se
-*-,
ARLQLELSKvREE.KELKARN.KKE.DLl.AQARLKDLEALLNSKeAALsTAL.EKR.LE.E..dLr..vAKLE..L.e.KKQLQDEMLRRVD.ENR.QT
ArLQiEl.Kl.aE
T
M.TP.QrR.tR.----s.TPLSPTRITRLQEKEDLQ.LNDRLAVYIDkVRSLE.ENA.LRLRITESEeVvSREVsGIK.AYE.EL.DARKTLDSVAKER
M. .A
1a
B
B
A
B
A
Coil
LSPTRIsRLQEK.eL. .LNDRLAvYID.VR.LE.EN. .L.. .vsErE.V. .REvSGiK.LyEtELADARr.LDdTArEr
r-*-
72
IV.4.
Mit Hilfe
Länge
aus
der
Analyse
der
Hühnerlamin-Transkripte
Blot-Hybridisierungen (Northern Blots)
RNS
von
wurde die volle
Hühnerlamin-Transkripte ermittelt. Total-RNS oder poly(A)+ RNS, die
Zellkulturen, ganzen Embryonen oder ausgewählten embryonalen Geweben
worden waren, wurden mit radioaktiver
hergestellt
Probe
analysiert.
Im
Ein
einziges,
dazu
hybridisierte
B).
mit zwei
Transkripten mit den Längen
Gegensatz
langes Transkript
7.7 kb
13A und
mit
eine Lamin
Lamin
gefunden (Fig.
wurde
B-|-spezifische Probe
3.8 kb und 3.2 kb
allerdings schwache Signale, wurden
nachgewiesen (nicht gezeigt).
cB2-3 cDNS (Fig. 7C) als
(Fig. 13C). Mehrere,
A-spezifischen
Proben
Bedeutung dieses Resultats ist
Die
noch
abzulären.
Ergebnisse dieser A/orf/iern-Hybridisierungen
Interessant erscheinen die
Zusammenhang mit früheren in wVo-Studien, bei denen eine
Lamin B2-Variante
der
gefunden worden
spezifisches Signal gefunden
durch
(Lehner
etal.
werden.
Allerdings
ist
1986b).
zu
kurzlebige
extrem
Bei der
in verschiedenen Geweben konnte aber
spezifischen Transkripte
sich zwei
war
Analyse
nur
ein
B2-
berücksichtigen, dass
Transkripte mit geringfügig unterschiedlichen Molekulargewichten
A/orf/?er/7-Hybridisierungen
IV.5. In wfro-Translation
In früheren
von
Experimenten
poly(A)+ RNS
kaum unterscheiden lassen.
poly(A)+
waren
RNS und
synthetischer
RNS
bei der in wfro-Translation
zwei Proteine identifiziert worden, die die
von
embryonaler
gleiche elektropho-
retische Mobilität wie reifes Lamin B2 und die B2-Variante besassen
al.
im
1986b).
Die
et
Frage, ob zwei Transkripte existieren, oder ob ein einziges
Translationsprodukt
allerdings
(Lehner
im
ungeklärt.
Retikulozytenlysat
Um
zwischen
modifiziert
diesen
worden
beiden
unterscheiden, wurden die Translationsprodukte
von
war,
blieb
Möglichkeiten
poly(A)+ RNS
zu
und
homogener synthetischer RNS verglichen (Fig. 14). Für die Herstellung der
synthetischen RNS wurde das cDNS-/nserf
von
Klon cB2-3 in einen
pGEM-
Expressionsvektor (Promega Biotec) subkloniert und transkribiert. Nach der
Translation
spezifischen
der
poly(A)+
Antikörpern
munpräzipitiert
(Fig.
Molekulargewichten
14,
von
RNS
(Fig. 14, Spur 1)
(Lehner
Spur 2).
67 und 66
et al.
1986a)
Dieselben
kDa wurden
wurden
zwei
zwei
mit Lamin
B2-
Polypeptide
im-
Proteine
mit
bei der Translation
den
der
73
-9.5
-7.5
-44
-2.4
-1.4
-0.24
1
Figur
13:
Vergleich
der
3
2
Transkripte
von
4
Lamin
5
6
Bi und B2 durch Northern-Anatyse
(4-lOug/Spur) wurde in einem Formaldehyd-enthaltenden 1% Agarosegel aufgetrennt und
entweder mit der 32P-markierten cDNS CB2-3 (Fig. 7c) oder mit einem 930 Bp langen Eco RlFragment von cB-)-3 (Fig. 7b) getestet. Teil A: Total-RNS von 12 Tage alten Hühnerembryonen
(Spur 1) und Hühnerembryofibroblasten (Spur 2) wurde mit der Lamin B2-Probe hybridisiert. Teil B:
RNS
Tage alter Hühnerembryonen
wurden mit der Lamin B2-spezifischen
poly (A)+ RNS aus Gehirn (Spur 5)
hybridisiert.
der Lamin Bi-spezifischen Probe
wurde
mit
oder Leber (Spur 6) 18 Tage alter Hühnerembryonen
hybridisiert.
poly(A)+
RNS
vom
Gehirn
(Spur 3)
oder
von
Probe
der Leber
(Spur 4)
Teil C:
18
74
-200
92
1
i^.^0
^_
69
Ä
-
m-
.
1
Figur
14:
2
3
4
5
6
46
30
M
Vergleich von in w'fro-translatierten Lamin B2 Proteinen mit authentischen,
nerembryofibroblasten immunpräzipitierten Lamin B2-Formen
In wfro-Translationen im
aus
Hüh¬
Retikulozytenlysat und Immunpräzipitationen mit einem Lamin A/B2-
spezifischen Kaninchenserum (Lehner et al. 1986a) wurden nach den in "Material und Methoden"
beschriebenen Anleitungen durchgeführt. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE (8%)
aufgetrennt und durch Fluorographie sichtbar gemacht.
Spur 1: Translationsprodukte der poly(A)+ RNS aus drei Tage alten Hühnerembryonen
Spur 2: Lamin B2-Proteine, immunpräzipitiert aus den in Spur 1 dargestellten Translations¬
produkten
Spur 3: Translationsprodukte der mit cDNS-Klon cB2-3 hergestellten synthetischen mRNS
Spur
Laminproteine, durch Immunpräzipitation aus mit 35S-Methionin während
Hühnerembryofibroblasten isoliert
Spur 4, die Fibroblasten wurden jedoch während 5 Stunden markiert
4: Authentische
vier Minuten markierten
Spur 5: gleich wie in
Spur 6: Kontroll-Translation ohne RNS
Pfeil: Lamin B2-Variante, Pfeilspitze: reifes
Lamin
B2, ausgefüllter Kreis: Lamin A-Vorläufer, offener
Kreis: reifes Lamin A
(kDA): schwere Kette
(69), Ovalbumin (46) und Carboanhydrase (30).
M: radioaktive Proteinmarker
von
Myosin (200), Phosphorylase
B
(92), BSA
75
homogenen synthetischen RNS erhalten (Fig. 14, Spur 3) und konnten mit Lamin
B2-spezifischen Antikörpern präzipitiert werden (nicht gezeigt). Ausserdem
Immunpräzipitation
worden
4 und
IV.6. In
wfro-Prozessierung
Die Resultate in
Kapitel IV.5. wurden
zeitliche Verlauf der in
Translationszeit
so
erklärt, dass die beiden Lamin B2-
primären Translationsproduktes
Um diese
entstanden sind.
wfro-Synthese
Interpretation
Polypeptiden (nicht gezeigt).
die
Experimenten wurde
Form demonstriert
Mit
der
Die durch
zur
Transkription
Translationsprodukte
oder nach
Ueberschusses
unmarkiertem Methionin
Pulse
längeren Chase-ZeWen
nur
beiden
cDNS-Klon cB2-3
Gegenwart
von
35S-
wurden entweder direkt
in
Gegenwart
eines
analysiert (Fig. 15, Spuren 2-7).
ein Protein nachweisbar war, wurde
allmählich die niedermolekulare Form
mit der Zunahme dieses Proteins
Proteins
von
fortgesetzter Translation
(Fig.15A, Spur 1)
Während nach dem
von
B2-Variante in die niedermolekulare
gewonnene RNS wurde während 15 Minuten in der
Methionin translatiert und die
Bildung
B2-Variante
durchgeführten Pulse-Chase-
in vitro
Umwandlung
(Fig. 15).
an
prüfen, wurde der
zu
15 Minuten wurde nur die höhermolekulare
von
im Retikulo¬
Lamin B2 studiert. Nach einer
von
nachgewiesen, längere Translationszeiten führten
zu
(Fig. 14,
Hühnerlamin Bo
von
Formen durch Modifikation des
Variante
waren
35S-
5).
Spuren
zytenlysat
metabolisch mit radioaktivem
aus
Hühnerembryofibroblasten isoliert
Methionin markierten
gleichen gelelektro-
und das reife Lamin B2,
kurzlebige B2-Variante
wie die
phoretischen Mobilitäten
die beide durch
zwei Proteine genau die
synthetisierten
hatten die in vitro
war
nach
gebildet. Parallel
eine Abnahme der höhermolekularen
beobachten. Nach 4-6 Stunden
abgeschlossen (Fig. 15A, Spur 7).
war
die
Bildung des kleineren
Diese Resultate deuten auf eine
Vorläufer/Produkt-Beziehung zwischen der B2-Variante und dem reifen Lamin
B2 hin. Diese Interpretation wurde durch zweidimensionale Gelelektrophorese
weiter erhärtet, denn die Produkte der in Wfro-Translation
kodierender mRNS besitzen genau dieselben
wie die beiden
metabolisch markierten
aus
Immunpräzipitation isolierten
Bei der Translation
durch
Transkription
Lamin
von
elektrophoretischen
Lamin
B2-
Mobilitäten
Hühnerembryofibroblasten
durch
B2-Formen (Fig. 16).
homogener synthetischer Hühnerlamin A-RNS, hergestellt
des cDNS-Klones cA-1, konnte
nur
ein
einziges
Produkt
76
1
3
2
5
4
6
7
B
3
r*i
200
92
-
-
12
Figur 15
A: In vitro
Prozessierung
Synthetische RNS, hergestellt
3
4
des Lamin
durch
5
69
46
6
B2-Vorläufers
Transkription
der cDNS
cB2-3 (Fig. 7c) wurde
im Retikulo¬
zytenlysat in der Gegenwart von 35s-Methionin während 15 Minuten translatiert (Pulse) und nach
Zugabe eines Ueberschusses an unmarkiertem Methionin weiter inkubiert (Chase).
1: Translationsprodukte nach 15 Minuten (Pulse)
Spur
Spuren 2-7: Translationsprodukte nach folgenden Cftase-Zeiten (Minuten): 8 (Spur 2), 16 (Spur
3), 32 (Spur 4), 64 (Spur 5), 4 Stunden (Spur 6) und 6 Stunden (Spur 7).
der
Figur 15B:
In
w/ro-Synthese
des Lamin A-Vorläufers
Transkription der Lamin A-kodierenden cDNS (cA-1, Fig. 7A)
Retikulozytenlysat für 15 Minuten translatiert (Spur 1) oder
zusätzlich während 60 Minuten in der Gegenwart eines Ueberschuss an unmarkiertem Methionin
inkubiert (Spur 2). Spur 3 zeigt, dass das Translationsprodukt durch Lamin A-spezifische
Antikörper präzipitiert werden kann. Die Spuren 4 und 5 zeigen die Laminproteine, die aus
metabolisch markierten Hühnerembryofibroblasten durch Immunpräzipitation mit einem Lamin
A/B2-spezifischen Kaninchenserum (Lehner et al. 1986a) isoliert wurden. In Spur 4 sind die
Proteine gezeigt, die nach einer Markierungszeit von 4 Minuten synthetisiert wurden, in Spur 5
diejenigen nach einer Markierungszeit von 5 Stunden. Ausgefüllter Kreis: Lamin A-Vorläufer,
offener Kreis: reifes Lamin A, Pfeil: Lamin B2-Vorläufer, Pfeilspitze: reifes Lamin B2.
Synthetische RNS wurde durch
hergestellt und anschliessend
die
in
77
EF1
T
o
t
T
!
Figur
16:
Komigration
von
synthetischen
und authentischen
Laminproteinen
B2-Proteine wurden entweder in vitro synthetisiert und prozessiert oder mit Hilfe des Lamin
A/B2-spezifischen Kaninchenserums (Lehner et al. 1986a) aus metabolisch markierten
Hühnerembryofibroblasten immunpräzipitiert. Die Proteine wurden durch zweidimensionale
Gelelektrophorese analysiert (O'Farell 1975). Der Lamin B2-Vorläufer ist durch eine Pfeilspitze und
reifes Lamin B2 durch einen Pfeil gekennzeichnet. Eine in geringer Menge vorhandene saure
Form von Lamin B2 ist durch ein offenes Dreieck markiert (Erklärung im Text).
Lamin
Teil A:
authentische Lamin B2-Proteine, isoliert
35s-Methionin
Teil B:
aus
Fibroblasten, die während vier Minuten mit
markiert wurden
Translationsprodukte synthetischer
Lamin
B2-spezifischer RNS (Transkription
von
cB2-3);
Translationszeit: 80 Minuten
Teil C:
Koelektrophorese
einer
1:1-Mischung
der in den Teilen A und B
gezeigten Proben
78
nachgewiesen werden (Fig. 15B, Spur 1), das im Unterschied
Vorläufer nach
(Fig. 15, Spur 2).
wurde
konnte mit Lamin
3).
Ein
Das
Vergleich mit
um
ca.3 kDa
und
Translationsprodukt
IV.7.
Neu
et al.
(Fig.15, Spur 4) komigrierte.
A-Vorläufer wurde schliesslich durch
Lamin
waren
während des
folgenden sind
die
von
(Lehner
et al.
von
Vorläufer und Produkt
1986a),
war
über die Art der
Prozessierungsschrittes nichts bekannt.
Resultate der
Untersuchungen
Laminproteinen dargestellt. Die
beteiligten enzymatischen
Hühnerlamine A und B2
zur
der
an
Im
postranslationellen
Prozessierung der
Aktivitäten wurden mit Hilfe
wfro-Systemen charakterisiert.
IV.7.1. Posttranslationelle Modifikation
Durch die Kenntnis der
Spaltungen möglich sein,
Lamin A
von
Aminosäuresequenz
sollte
präzipitation
aus
markiert worden
derselben
Zellkulturen, die
waren
Methode
metabolisch
es
mit Hilfe
von
nur
wenige
(Pulsmarkierung),
aus
Zellkulturen
markiert worden
Gelelektrophorese aufgetrennt.
waren.
Die
von
bei
Spaltprodukte
den
vier
Minuten mit
Die
35S-Methionin
die
während
Spaltprodukte
5
Stunden
Immunpräzipitate wurden durch
entsprechenden Banden
wurden
im
aus¬
Gelstück
Tryptophanresten gespalten.
wurden anschliessend mittels
17B werden die
loka¬
isoliert. Reifes Lamin A wurde nach
gereinigt,
konservierten
zu
Lamin A durch Immun¬
geschnitten und die radioaktiv markierten Antigene wurden
chemisch
geeigneten
die Modifikation in der Primärstruktur genauer
lisieren. Zu diesem Zweck wurde der Vorläufer
Figur
prozessiert
1984, Lehner et al. 1986b). Während der zeitliche Verlauf der
Modifikation(en)
in
Die Identität
Lamin A wird beim Einbau in die Kernlamina
genauer untersucht worden
von
dass das
grösser ist als reifes Lamin A (Fig. 15, Spur 5)
Prozessierung und die biochemischen Eigenschaften
Modifikation
(Fig. 15, Spur
Laminproteine
synthetisiertes
(Gerace
werden
Gelelektrophorese bestätigt (nicht gezeigt).
der
Biogenese
prozessiert
nicht
Laminproteinen ergab,
den authentischen
B2-
der Hühnerlamin A-mRNS
Translationsprodukt
aufwies und exakt mit dessen Vorläufer
zweidimensionale
Retikulozytenlysat
A-spezifischen Antikörpern präzipitiert
Translationsprodukt
von
im
fortgesetzter Inkubation
Lamin
zum
Die
Gelelektrophorese analysiert.
des Lamin A-Vorläufers
(Spur 1),
In
des reifen
79
Lamin
(Spur 2)
A
verglichen.
Die
Bei der
war.
Abbildung zeigt,
Spaltung
hervor
(Fig. 17A),
erwartungsgemäss
Tryptophanreste
dass
sich dabei
es
vier
der Proteine nicht
nahe beisammen
so
möglich
war.
um
N-terminale
vollständig
Fragmente,
wobei
liegen (Fig. 17A),
im verwendeten
Die kleinen C-terminalen
Fragmente handelt.
allerdings
dass eine
verglichen. Erwartungsgemäss
Tryptophan
nur
w'fro-Translation
Methionin
Fragmente wanderten
Radioaktivität
synthetischer
deshalb
hergestellt
ein
Auftrennung
in diesem Gel
Experiment
die C-terminalen Produkte der
durch das C-terminale Methionin markiert
von
wurde
waren
mRNS
Lamin
(Kap. IV.6)
in der
A-Vorläufer
und anschliessend
bei den
Figur 17: Lokalisation der posttranslationellen Modifikation
von
zwei
Gelsystem (8% Acrylamid)
mit der Front und wurden deshalb in einem zweiten, ähnlichen
bei
4)
unvollständiger Spaltung
entstanden bei
N-terminale
entsprechenden Spaltprodukte
nicht
Spaltung
und
des Vorläufers und des reifen Lamin A entstanden
Tryptophanreste
der vier
Aufgrund
der
dass die
3
Hauptfragmente (Fig. 17B). Aus der Analyse der Aminosäuresequenz
dieselben
ging
ungespaltenen Proteine (Spuren
sowie die
mit
(Fig. 17A).
Gegenwart
hoher
Spaltung
Durch in
von
35S-
spezifischer
Tryptophanresten gespal-
Lamin A
Der Lamin A-Vorläufer wurde durch Transkription der vom cDNS-Klon cA-1 (Fig. 7a) abgeleiteten
synthetischen RNS hergestellt. Für die Markierung des synthetischen Vorläufers wurde 35S-Me¬
thionin verwendet. Reifes Lamin A wurde metabolisch entweder mit 35S-Cystein (Teil C, Streifen
35S-Methionin (alle
anderen Streifen) markiert und mit dem Lamin A/B2-spezifischen
präzipitiert. Der Vorläufer und reifes Lamin A wurden nach der
elektrophoretischen Auftrennung durch Fluorographie sichtbar gemacht und aus dem Gel
ausgeschnitten. Die Spaltung der Proteine im Gelstück bei den Tryptophanresten erfolgte wie in
"Material und Methoden" beschrieben. Die Spaltprodukte wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt
und durch Fluorographie sichtbar gemacht. Radioaktive Molekulargewichtsmarker (in kDa, von
oben nach unten): schwere Kette von Myosin (200), Phosphorylase B (92), BSA (69), Ovalbumin
(46) und Carboanhydrase (30).
2)
oder mit
Kaninchenserum
Verteilung der Tryptophanreste, der Methioninreste (ausgefüllte Sterne) und der
in der Primärstruktur von Hühnerlamin A. Die Längen der möglichen
Produkte bei partieller Spaltung sind in kDa angegeben.
Teil A:
Cysteinreste (offene Sterne)
Teil B: Analyse der N-terminalen Spaltprodukte mittels SDS-PAGE (8%). die Länge der Fragmente
ist in kDa angegeben. Ungespaltene Proteine sind mit einem Kreis bezeichnet (Vorläufer: offener
Kreis; reifes Protein: ausgefüllter Kreis).
Lamin A-Vorläufer, gespalten
reifes Lamin A, gespalten
Lamin A-Vorläufer, ungespalten
reifes Lamin A, ungespalten
Spur 1:
Spur 2:
Spur 3:
Spur 4:
Teil C:
Analyse der C-terminalen Spaltprodukte mittels SDS-PAGE (15%). Die Länge der
Fragmente (Spur 2) sind nicht bestimmt, die entsprechenden Zahlen
modifizierten C-terminalen
wurden deshalb mit einem Stern versehen.
Spur 1: Lamin A-Vorläufer, gespalten
Spur 2: reifes Lamin A, gespalten
Spur 3: kürzere Exposition von Spur 1
80
*
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—
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i
-15-,
145
46
1
12
3
4
2
3
-14
81
Cysteinreste
ten. Da sich im Falle von Lamin A sämtliche
(Fig.17A),
befinden
wurde
Spaltexperiment
für das
35S-Cystein
Zellkulturen isoliert, die metabolisch mit
(Fig. 17C, Spur 2). Die Spaltprodukte
wurden anschliessend in einem
Aus
nahe
am
reifes
C-Terminus
Lamin
A
markiert worden
aus
waren
des Vorläufers und des reifen Lamin A
15prozentigen Polyacrylamidgel aufgetrennt.
Figur 17C geht hervor, dass die C-terminalen Fragmente des Vorläufers
(Fig. 17C, Spur 1) ein scheinbar grösseres Molekulargewicht besassen,
diejenigen
von
(Fig. 17C, Spur 2).
reifem Lamin A
dem Grössenunterschied, der zwischen den
ungefähr
wurde. Eine kürzere
gefunden
der
Exposition
erwartungsgemäss schwache Markierung
Die Differenz
entspricht
ungespaltenen
Proteinen
17C
zeigte die
1 in
Gelspur
als
Figur
Fragmente (Fig.
der C-terminalen
17C, Spur 3). Aus diesen Experimenten wurde der Schluss gezogen, dass der
Vorläufer
von
Lamin A im Bereich des C-Terminus
In einem weiteren
Experiment
prozessiert
wurde die Art der Modifikation untersucht. Zu
diesem Zweck wurden radioaktiv markierte Lamin A-Proteine
Form) gelelektrophoretisch aufgetrennt,
unter
Bedingungen inkubiert,
Aspartat
Lamin
und Prolin führten.
A-Sequenz. Die Spaltung
beiden Proteinen
terminals
Fragment (64)
C-Terminus
(vgl. Fig. 17)
an
der
beider
Polypeptide erfolgte
dem Gel eluiert und
zwischen
95%,
zu ca.
zu
beiden Proteinen ist ebenfalls ein
auf der
bei
was
Migrationsverhalten.
Nr. 1
grösseres C-
erkennen, das durch partielle Spaltung
besassen die C-terminalen
Spaltstelle
und reife
zeigt die Verteilung der Spaltstellen
gelegenen Spaltstelle (DP2)
unterschiedliches
aus
spezifischen Spaltung
einer
zu
18A
anschliessend
(Vorläufer
Bildung desselben C-terminalen Hauptfragmentes führte
zur
(Fig. 18B, Fragment 52). Bei
am
die
Fig.
wird.
(Fig. 18A)
entstanden ist.
Fragmente
an
der näher
Erwartungsgemäss
dieser beiden Proteine ein
erzeugte die Spaltung der Proteine
So
zwei deutlich verschiedene
Fragmente (Fig.
18B, vgl. die Fragmente 21 und 21*). Es fällt auf, dass das Fragment 21 im
Vergleich
zu
21* etwa
weist auf eine
doppelt
etwa
doppelt
so
proteolytische Abspaltung
analysierte C-terminale Fragment
Spaltung
beim Vorläufer
an
der
Spaltstelle
nachgewiesen
Nr. 2
Fragment
Degradationsprodukt
Das zwischen den
9
zu
des
Das C-terminale
(Fig. 18A)
worden
Charakter der C-terminalen Modifikation
terminalen
des C-Terminus
bestätigte.
erfahrungsgemäss
Nr.1
und 2
auf
Fragment 9,
das
entstanden war, konnte
(Fig. 18B),
beobachtende Bande
Spaltstellen
hin, denn das
verlöre bei einer solchen Modifikation das
endständige markierte Methionin (Fig 18A).
durch
stark markiert ist. Dieses Resultat
was
Die
den
proteolytischen
knapp
repräsentiert
nur
unter dem C-
wahrscheinlich ein
Proteolyse anfälligen
Lamin A.
(Fig. 18A) liegende Fragment
12
82
war
erwartungsgemäss bei beiden Proteinen gleich lang und gleich stark
zeigen eindeutig, dass
markiert. Diese Resultate
nach der Translation
proteolytisch abgespalten
IV.7.2. Posttranslationelle Modifikation
Im
von
wird.
Lamin Bo
IV.6 wurde die Existenz eines Lamin
Kapitel
Aus dieser für ein Lamin
vom
der C-Terminus von Lamin A
B2-Vorläufers nachgewiesen.
B-Typus einzigartigen Tatsache ergab
Frage nach
der Art der Modifikation des Vorläufers. Die
Modifikation
von
definierten
Spaltprodukten
Antigene
und
deren
Lamin A
untersucht. Die
von
synthetischem
prozessiertem synthetischen
Vorläufer
Proteinen
(Fig. 19B, Spur 2)
Lamin B2
(Fig. 19B).
identisch
des
als
Charakterisierung
der
10* und
von
9.5*),
dem Lamin
von
von
von
in vitro
authentischem
niederprozentigen
56 und 52
waren
die
waren
synthetischem
was
bei allen
C-terminalen
35S-Methionin hergestellt.
A/B2-spezifischen Antiserum
von
reifem
Lamin
und
B2
auf eine C-terminale Modifika-
posttranslationellen Modifikation
Der Lamin A-Vorläufer wurde durch Translation
von
und
Die in einem
Andererseits
diejenigen
(Fig.19C, Fragmente 16*. 12*.
Gegenwart
wie im Falle
synthetischem Vorläufers (Fig. 19C, Fragmente 16,12,10
9.5) deutlich grösser
18:
gleich
konservierten
(Fig. 19B, Spur 1),
analysierten N-terminalen Fragmente 58.5, 58,
Spaltprodukte
Figur
vier
In den ersten
(Fig. 19B, Spur 3) verglichen.
reifem Lamin B2
drei
genau
der radioaktiv markierten
den
bei
von
Experimenten (Fig. 19B und C)
Lamin B2-Proteine mit 35S-Methionin markiert. Zuerst wurden die
Spaltprodukte
Gel
Spaltung
chemische
(Kap. IV.7.1) durchgeführt.
wurden die
Reinigung
der C-terminalen Domäne wurde
Tryptophanresten
postranslationelle
B2 wurde wiederum durch die Analyse
Lamin
sich die
von
Lamin A
synthetischer mRNS (vgl. Fig. 17) in der
Immunpräzipitation mit
Reifes Lamin A wurde durch
aus
metabolisch mit
35S-Methionin
markierten
Fibroblasten isoliert. Nach der elektrophoretischen Auftrennng wurden die Laminproteine aus dem
Gel eluiert und chemisch zwischen Asp und Pro gespalten. Die Spaltprodukte wurden durch SDSPAGE
Teil A:
analysiert.
Verteilung
(Sterne) und der Spaltstellen (DP) in der Primärstruktur von
möglichen Spaltprodukte der partiellen Spaltung sind in kDa
der Methioninreste
Hühnerlamin A. Die
Längen
der
angegeben.
Analyse der Spaltprodukte mittels SDS-PAGE (10-17%). Die Längen der Fragmente (linker
Rand) sind in kDa angegeben. Am rechten Rand sind die Positionen der radioaktiven
Molekulargewichts-Marker angegeben: schwere Kette von Myosin (200*000), Phosphorylase B
(92*000), BSA (69'000), Ovalbumin (45*000) und Carboanhydrase (30*000).
Spur 1: Lamin A-Vorläufer, gespalten
Spur 2: reifes Lamin A, gespalten
Spur 3: Lamin A-Vorläufer, ungespalten
Spur 4: reifes Lamin A, ungespalten
Teil B:
83
•
**•*
*
*
"
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Nh
¦
'
DPI
*
DP2
i
i
i
•
HC
h
64
h
12
52
h
B
-200
64-
-
92
-
69
52-
46
-
30
-
14
21-
12-
9-
2
3
4
9
84
tion während der
terminalen
Prozessierung
des authentischen reifen Lamin B2 nicht markiert
Spaltprodukte
19C, Spur 3),
hinweist. Ueberraschenderweise waren die C-
darauf hinweist, dass das
was
des Motivs -CLVM
ob das
geprüft,
authentischen
Lamin
Cystein
Cystein
Figur 19D, Spur
C-terminalen
markiert
von
35S-Cystein
endständigen Tetrapeptid-Motiv
3
(Doppelstern)
Fragmente
Es
B2 noch vorhanden ist. Zu diesem Zweck wurde
markiert worden war,
Tryptophan gespalten. Die C-terminalen Fragmente, die
im
war.
des C-terminalen Motivs -CLVM im reifen
authentisches reifes Lamin B2, das mit
das
markierte Methionin
(Fig. 19A) posttranslationell abgespalten worden
wurde deshalb
wiederum bei
endständige
(Fig.
der
(Fig. 19D, Spuren
Mobilität aufwiesen als die
2). Es
durch
markiert sein können, sind in
Erwartungsgemäss
synthetischen B2-Lamine
1und
authentischem Lamin
deutlich sichtbar.
nur
ebenfalls mit
waren
die
35S-Cystein
fällt auf, dass die C-terminalen
Fragmente
B2 eine geringfügig andere gelelektrophoretische
entsprechenden Fragmente
von
synthetischem
Lamin
B2 (Fig. 19D, vgl. Spuren 2 und 3). Dies könnte bedeuten, dass durch die Cterminale
Figur
19:
Abspaltung
von
Charakterisierung
Der Lamin
der
maximal drei Aminosäuren das
Migrationsverhalten
posttranslationellen Modifikationen
Lamin
B2-Vorläufer wurde durch
hergestellt (jeweils Spur 1). Reifes
Translation
von
synthetischer RNS
B2
in
Retikulozytenlysat
Prozessierung des
synthetischen Vorläufers im Retikulozytenlysat (jeweils Spur 2) oder durch Immunpräzipitation aus
metabolisch markierten Fibroblasten (jeweils Spur 3) isoliert (vgl. Figuren 17 und 18). Die Proteine
wurden nach ihrer gelelektrophoretischen Auftrennung spezifisch bei Tryptophanresten
gespalten und die Fragmente wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die Positionen und die
Molekulargewichte der radioaktiven Proteinmarker sind jeweils am rechten Rand der Teilfiguren
angegeben: von oben nach unten: schwere Kette von Myosin (200'000), Phosphorylase B
(92'000), BSA (69'000), Ovalbumin (46*000) und Carboanhydrase (30'000).
von
Lamin B2 wurde entweder durch
Verteilung der Cysteinreste (leere Sterne), der Methioninreste (ausgefüllte Sterne) und der
Tryptophanreste in der Primärstruktur von Lamin B2. Die Längen der möglichen Spaltprodukte der
partiellen Spaltung sind in kDa angegeben.
Teil A:
Analyse der N-terminalen Spaltprodukte mittels SDS-PAGE (5.6%). Die Proteine wurden mit
markiert. Die Fragmente sind durch ihr Molekulargewicht gekennzeichnet. Der
Lamin B2-Vorläufer ist durch einen Pfeil markiert, reifes Lamin B2 durch eine Pfeilspitze.
Spur 1: synthetischer Lamin B2-Voriäufer
Spur 2: synthetisches reifes Lamin B2
Spur 3: authentisches reifes Lamin B2
Teil B:
35S-Methionin
Analyse der C-terminalen Spaltprodukte mittels SDS-PAGE (15%). Die Proteine
35S-Methionin (Teil C) oder mit ^S-Cystein (Teil D) markiert. Die Fragmente
sind durch ihr Molekulargewicht gekennzeichnet, wobei die modifizierten C-terminalen Fragmente
des synthetischen reifen Lamin B2 zusätzlich durch einen Stern markiert sind. Der Doppelstern
bezeichnet die in wVo-modifizierten Fragmente (Teil D, Spur 3). Die N-terminalen Fragmente sind
durch "N" gekennzeichnet.
Spur 1: synthetischer Lamin B2-Vorläufer
Spur 2: synthetisches reifes Lamin B2
Spur 3: authentisches reifes Lamin B2
Teile C und D:
wurden entweder mit
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86
der
Spaltprodukte geringfügig
Spur 3, zeigt eindeutig,
C-terminale
dass
unspezifischer Spaltungen
Modifikation
gibt
13 kDa
IV.8. In -//fro-Modifikation der
Gruppe
abgespalten
Laminproteine
des
In
-//Vo-Markierungen
Hessen vermuten, dass der Substituent eine
Struktur dieser Modifikation ist,
dass
es
von
unbekannt. Neueste
sich bei zwei dieser
Hintergrund
mit
C-
durch ein
etal. 1984,
Mevalonsäure,
war
(Schmidt
die
etal.
an
1984),
ist. Die genaue
wenigen Ausnahmen abgesehen (siehe
Untersuchungen ergaben
isoprenylierten Proteine
Hinweise dafür,
um
Lamin B
(Beck
et al.
von
Lamin A
(Beck
et al.
Mobilität
von
nicht-proteolytische
Lamin B2 verändert
Modifikation
(Kap. IV.7.),
wurde
ob dieses Protein in vitro durch ein Mevalonsäurederivat modifiziert
Vergleich
werden kann. Zum
wurden auch Lamin A und B-|
Modifikation untersucht. Zu diesem Zweck wurden die
Retikulozytenlysat
translatiert.
Bi
(Schmidt
Isoprenverbindung
der Tatsache, dass eine
gelelektrophoretische
geprüft,
in
am
handeln könnte.
Vor dem
die
Proteins führte.
posttranslationell
1988, Wolda und Glomset 1988) und den Vorläufer
1988)
reifen
zu
werden.
verschiedenen Positionen radioaktiv markiert worden
Diskussion),
dass in vivo und in
durch ein Mevalonsäurederivat
zellulärer Proteine wird
1986).
durch markierte
nur
C-Terminus des Vorläufers
Mevalonsäuremetabolismus modifiziert
et al.
Fig. 19C,
in vivo eine zusätzliche Modifikation, bei der
es
Terminus maximal drei Aminosäuren
Eine kleine
am
geringeren Molekulargewicht
Interessanterweise
Bruenger
von
mit
sind.
nicht-proteolytische
scheinbar
Produkt des
im Bereich
Experimenten wurde der Schluss gezogen,
Aus diesen
einem
Signale
Vergleich
entstanden sein können und demnach nicht Produkte
Spaltprodukte
vitro dieselbe
verändert worden ist. Der
Figur
20
zeigt,
(Teil B, Spur 2)
Translation wurde
in der
so
Gegenwart
auf eine solche
synthetischen Transkripte
R-(2-14C)-Mevalonsäurelacton
von
dass sowohl Lamin A
(Teil A, Spur
2
)
als auch Lamin
durch Mevalonsäure modifiziert wurden. Die Dauer der
gewählt,
und 50% als reifes Protein
dass im Falle
von
Lamin B2 50% als Vorläufer
vorlagen (Fig. 20C, Spur 1). Interessanterweise
konnte die Modifikation durch die Mevalonsäure nur beim reifen Lamin
nachgewiesen
werden
Expositionszeiten
gefunden.
wurde
In einem
(Fig.
im
20C,
Falle
Spur
des
Kontrollexperiment
2).
Auch
B2-Vorläufers
wurde
bei
keine
sehr
B2
langen
Modifikation
synthetische RNS,
die für die
87
C
B
12
Figur
12
20: In w'fro-Modifikation der
Synthetische
12
Hühnerlaminproteine
RNS wurde entweder in der
D
Gegenwart
12
durch ein Mevalonsäurederivat
von
35S-Methionin (jeweils Spur 1)
oder von
Retikulozytenlysat translatiert. Die mit 35S(8%) analysiert, die mit radioaktiver
Mevalonsäure modifizierten Proteine wurden zuerst durch Immunpräzipitation mit einem Lamin
A/B2-spezifischen Antiserum (Lehner et al. 1986a) angereichert.
R-(2-14C)-Mevalonsäurelacton
(jeweils Spur 2)
in
Methionin markierten Proteine wurden direkt durch SDS-PAGE
Teil A: Lamin A
Teil B: Lamin
Teil C: Lamin
Die
Bi
B2.
Pfeilspitze markiert den Lamin B2-Vorläufer, der Pfeil das reife Lamin B2. Man beachte,
dass
nur
reifes Lamin B2 durch ein Mevalonsäurederivat modifiziert wird.
Teil D: Kreatinkinase
(Typ B)
Verfügung gestellt).
des Huhnes
(RNS
wurde freundlicherweise
von
T.
Wirz, Zürich,
zur
88
Hühnerkreatinkinase
vom
Typ
(B-CK) kodiert,
B
tiver Mevalonsäure translatiert.
Gegenwart
in der
Figur 20D, Spur 2, zeigt,
von
radioak¬
dass dieses Protein
nicht durch ein Mevalonsäurederivat modifiziert wurde. Dieser Befund und die
Tatsache, dass der Lamin B2-Vorläufer ebenfalls nicht modifiziert wurde,
sprechen gegen
eine
unspezifische Modifikation
der
Laminproteine
durch ein
Mevalonsäurederivat.
Als nächstes wurde versucht, den Ort der Modifikation in der Primärstruktur
Lamin B2 genauer
lokalisieren. Die
cerevisiae hatte
Saccharomyces
kleinen
zu
Strukturaufklärung
ergeben,
dass das C-terminale
Peptides posttranslationell isoprenyliert
wird
Aufgrund
dieses Resultates wurde vermutet, dass
ebenfalls
Akzeptoren
B2-cDNS-Klone (Geschenk
von
von
synthetische mRNS
transkribiert und die
Gegenwart
(Anderegg
Cysteine
von
Cystein dieses
der
etal.
1988).
Laminproteine
für ein Mevalonsäurederivat sind. Um dies
wurden mutierte Lamin
Epalinges)
des a-Sexfaktors
von
zu
prüfen,
Dr. G. Kitten, ISREC,
anschliessend in
radioaktiv markierter Mevalonsäure translatiert
der
(Fig. 21, Spuren
2, 4, 6 und 8). Parallel dazu wurden mit 35S-Methionin markierte synthetische
Proteine
hergestellt
und damit der Einfluss der Mutationen auf die
des Vorläufers in die
Umwandlung
B2-Form mit dem scheinbar kleineren Molekulargewicht
getestet (Fig. 21, Spuren 1, 3, 5 und 7). Es zeigte sich, dass die Mutante mit
einem Alanin anstelle des
Cysteins
in Position 191
beiden oben erwähnten Kriterien in
Wildtyp-Lamin
B2 (Fig. 21, vgl. Spuren 3 und
(C-terminales CXXM-Motiv)
wandernde
Alanin
ein
8).
in
bezug
auf die
prozessiert wurde,
4 mit
Spuren
Cysteins
1
und
2).
wie
Im
in Position 597
aufwies, weder in die schneller
B2-Form umgewandelt, noch durch ein Mevalonsäurederivat
(Fig. 21, Spuren
5 und
6). Dasselbe Ergebnis
erzielt, bei der beide Cysteine durch ein Alanin
und
Weise
dazu wurde eine Mutante, die anstelle des
Gegensatz
modifiziert
gleicher
{Coil 1b)
wurde mit einer Mutante
ersetzt waren
(Fig. 21, Spuren
Aus diesen Resultaten wurde der Schluss gezogen, dass das
7
Cystein
des C-terminalen CXXM-Motivs für den Einbau des Mevalonsäurederivats und
für den
Prozessierungschritt,
Mobilität führte,
von
der
zur
entscheidender
Veränderung der gelelektrophoretischen
Bedeutung
ist.
89
WT
C-AC-AC-A
Met
MV
Met
191/597
597
191
MV
Met
MV
Met
MV
8
Figur
21: In
v/fro-Prozessierung
von
Lamin
B2-Mutanten
Synthetische RNS wurde durch Transkription von Wildtyp- oder mutierter Lamin B2-CDNS
hergestellt. Die Mutationen, bei denen jeweils ein Cystein-Codon durch ein Alanin-Codon ersetzt
wurde, betrafen die Aminosäurenpositionen 191 und 597, oder beide zusammen. Synthetische
RNS wurde entweder in der Gegenwart von 3^S-Methionin (Spuren 1, 3, 5 und 7) oder von R-(214C)-Mevalonsäurelacton (Spuren 2, 4, 6 und 8) translatiert. Die mit 35s-Methionin markierten
Proteine wurden direkt durch SDS-PAGE (8%) analysiert, die mit radioaktiv markierter
Mevalonsäure modifizierten Proteine wurden zuerst durch Immunpräzipitation mit einem Lamin
A/B2-spezifischen Antiserum (Lehner et al. 1986a) angereichert. Die radioaktiven Proteine wurden
durch Fluorographie sichtbar gemacht. Radioaktive Proteinmarker (Spur M, von oben nach unten):
Myosin (200'000), Phosphorylase B (92'500), BSA (69'000), Ovalbumin (46'000), Carboanhydrase
(30*000).
Spuren 1 und 2: Wildtyp-Lamin B2
Spuren 3 und 4: Lamin B2 mit (Cys * Ala)-Mutation an Position 191
Spuren 5 und 6: Lamin B2 mit (Cys +Ala)-Mutation an Position 597
Spuren 7 und 8: Lamin B2-Doppelmutante
90
IV.9.
Prozessierung
von
Lamin A und Bo:
Charakterisierung
der Aktivitäten in
zellfreien Systemen
vorangehenden Kapiteln
In den
wurde
allem die Art der posttrans¬
vor
lationellen Modifikationen beschrieben. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde
eine
Charakterisierung
enzymatischen
Aktivitäten
der
(3 Minuten)
Untersuchung
der
Prozessierung
der
Laminproteine beteiligten
angestrebt.
des Lamin A-Vorläufers wurde in
Hühnerembryofibroblasten
Halbwertszeit
zum
an
proteolytische Spaltung
Die
aus
der
Aufgrund der
untersucht.
(Lehner
des Lamin B2-Vorläufers
in diesem
Prozessierung
extrem
et al.
System schwierig.
Retikulozyten-System ausgewichen,
Teil auf das
Homogenaten
1986b)
ist die
Deshalb wurde
in dem die
des Vorläufers in das reife Protein mit einer Halbwertszeit
kurzen
von
Umwandlung
zwei Stunden
abläuft.
IV.9.1. Zeitlicher Verlauf und
von
Temperaturabhänoigkeit
der in
Wfro-Prozessierung
Lamin A
Hühnerembryofibroblasten,
markiert worden
Homogenat
waren,
die während
wurden
10
mit einem
wurde entweder bei 0°C
Minuten mit
Douncer
35S-Methionin
homogenisiert.
Das
oder bei 37°C
(Fig.
(Fig. 22, Spuren 6-9)
22, Spuren 2-5) inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben
entnommen,
aus
denen die
Laminproteine
Analyse immunpräzipitiert wurden.
Homogenat
unmittelbar nach der
reifes Protein
wurde
Nach einer Inkubation
nur
wurde die
lagert.
Prozessierung
noch
zum
von
der
gelelektrophoretischen
Figur 22, Spur 1,
umgewandelt worden ist. Nach
beträchtlicher Teil des Vorläufers
Spur 2).
Aus
vor
erst
ist ersichtlich, dass im
wenig
Lamin A-Vorläufer in
30 Minuten bei 37°C ist ein
reifen Protein
gespalten
worden
(Fig. 22,
1, 3 oder 12 Stunden (Fig. 22, Spuren 3-5)
wenig zusätzliches reifes Lamin A gebildet. Möglicherweise
Prozessierung durch zunehmende unspezifische Proteolyse über¬
Bei 0°C wurde während denselben Inkubationszeiten kein reifes Lamin A
gebildet (Fig. 22, Spuren 6-9).
In den
folgenden Experimenten
Homogenate jeweils ein bis drei Stunden inkubiert.
wurden die
91
¦iimm**
t
12
Figur
3
22: Zeitlicher Verlauf und
4
*
6
Temperaturabhängigkeit
7
9
8
der Lamin
10
A-Prozessierung
im zellfreien
System
Hühnerembryofibroblasten
wurden während 10 Minuten
(Spuren 1-9)
(Spur 10) mit 35S-Methionin inkubiert und anschliessend mit
aufgebrochen. Das Homogenat der kurz markierten Zellen wurde
oder während 16 Stunden
einem
Dounce
entweder direkt
Homogenisator
analysiert (Spur
37°C inkubiert (30 Minuten, 1, 3 oder 12 Stunden; Spuren 2-5). Parallel dazu
wurden auch Proben bei 0°C Proben inkubiert (Spuren 6-9). Mit dem Lamin A/B2-spezifischen
1) oder
zuerst bei
Immunpräzipitationen aus den verschiedenen Fraktionen durchgeführt und die
(8%) aufgetrennt. Der Lamin A-Vorläufer ist durch einen leeren
Kreis markiert, reifes Lamin A durch einen ausgefüllten Kreis. Reifes Lamin B2 ist durch eine
Pfeilspitze gekennzeichnet.
Antiserum wurden
Proteine wurden durch SDS-PAGE
92
IV.9.2.
Hemmung
der
Lamin-Prozessierung
Durch den Einsatz verschiedener Inhibitoren kann eine unbekannte Protease
klassifiziert werden
vitro in der
in
Figur
(Barrett 1979).
Gegenwart
23
von
Die Aktivität der Lamin A-Protease wurde in
verschiedenen Inhibitoren
zusammengestellt.
verfolgt.
Ohne Inhibitor wurden in drei Stunden
gespalten (Fig. 23A, vgl. Spuren
des Lamin A Vorläufers
1und
Serinproteasen-Inhibitoren Leupeptin, Trypsin-Inhibitor
der
Diisopropylfluorphosphat (DFP)
und
Demgegenüber
die
konnte
2).
Spaltung
von
Lamin
partiell gehemmt
von
Lamin A.
durch
A
werden
Pepstatin,
(Fig. 23A, Spur
10
).
(Fig. 23A, Spur 8),
Hemmung
Eine etwas schwächere
Hemmung
(Fig. 23A, Spur 9).
Lösungsmittel Isopropanol
verschiedene Inhibitoren verwendeten
A-Prozessierug nicht (Fig. 23A, Spuren
Resultat wurde durch die
Hemmstoffes TLCK beobachtet. In der
Zugabe des
zur
konnte auch mit EDTA allein beobachtet werden
interessantes
Zugabe
Sojabohnen,
aus
aber auch die Kombination der Chelatoren EDTA und DTT führte
beeinflussten die Lamin
Die
zeigte ebenfalls keinen Effekt (Fig. 23A, Spur 7).
Metallchelators o-Phenanthrolin
der Lamin A-Protease
50%
ca.
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (Fig.
23A, Spuren 3-6) hatte keinen Effekt auf die Proteolyse
ein Inhibitor saurer Proteasen,
Die Resultate sind
Die für
und DMSO
11 und
12).
Ein
Zugabe des Trypsin-spezifischen
Gegenwart
dieses Inhibitors besass der
grösste Teil des nach der Prozessierung gebildeten reifen Lamin A ein scheinbar
grösseres Molekulargewicht (Fig. 23A, Spur 13). Der gleiche Effekt wurde durch
Chymotrypsin-spezifischen Hemmstoff TPCK
den
erzielt
(nicht gezeigt). Es ist
denkbar, dass die Lamin A-Prozessierung in zwei Schritten abgelaufen
(oder TPCK) gehemmt
wobei der zweite Schritt durch TLCK
verhalten
von
Lamin A verändert haben. Um diese beiden
prüfen, wurde ein Homogenat
aus
Methionin markiert worden waren,
Zellkulturen, die mehrere
hergestellt
worden war.
gelelektrophoretische
Andererseits könnte auch eine Modifikation das
war,
Lauf¬
Möglichkeiten zu
Stunden mit 35S-
und mit TLCK inkubiert. Es
zeigte
sich, dass TLCK auf reifes Lamin A denselben Einfluss hatte (Fig. 23A, Spur 14).
Offensichtlich wurde reifes Lamin A, im
(oder TPCK) modifiziert
Hemmung
der Lamin
Gegensatz
und dadurch
A-Prozessierung
in
seiner
durch
zum
Vorläufer, durch TLCK
Migration
beinflusst.
Chelatoren wurde in
Die
einem
separaten Experiment bestätigt (Fig. 23B). Die Chelatoren o-Phenanthrolin (Spur
3),
DTT
(Spur 4)
des
(Spur 5),
EDTA
(Spur 6)
sowie eine Kombination
führten auch in diesem Versuch
Lamin
A-Vorläufers.
Aus
Spur
2
zu
einer
von
Hemmung
(Fig. 23B)
ist
EDTA und DTT
der
das
Prozessierung
Ausmass
der
93
Prozessierung
ohne Hemmstoffe ersichtlich, in
Laminproteine, die
Resultate
sind
vor
ein
der Inkubation im
deutlicher
Vorläufers
Hinweis
auf die
sind die
Beteiligung
eines
Diese
Metall¬
des Lamin A-Vorläufers.
Experimenten wurde geprüft,
energieabhängig
(Fig. 23B)
1
Homogenat vorlagen, dargestellt.
abhängigen Enzyms bei der Prozessierung
In weiteren
Spur
ist. Sowohl das
ob die
Spaltung
des Lamin A-
nicht-hydrolysierbare ATP-Analog
AMP-P-N-P als auch das ATP-verbrauchende
System Hexokinase/Glucose
hatten im Fibroblasten homogenat keinen Einfluss auf die
Lamin-A-Spaltung.
Andererseits konnte die Lamin A-Proteolyse auch nicht durch exogenes ATP
beeinflusst werden
Zum
Vergleich
(nicht gezeigt).
wurde die
der
Gegenwart
von
synthetischer mRNS
von
Prozessierung
von
Lamin B2 im
Retikulozytenlysat
in
verschiedenen Inhibitoren untersucht. Nach der Translation
während 15 Minuten wurde die
Bildung
von
radioaktiv
Figur 23: Charakterisierung der Lamin A-Protease durch Inhibitoren
Teil A:
Hühnerembryofibroblasten wurden während 10 Minuten (Spuren 1-13) oder während 16
(Spur 15) in 35S-Methionin-haltigem Medium inkubiert und anschliessend mit einem
Dounce Homogenisator aufgeschlossen. Das Homogenat der kurz markierten Zellen wurde
entweder direkt analysiert (Spur 1) oder zuerst während 3 Stunden bei 37°C inkubiert (Spur 2). Der
Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Spaltung des Lamin A-Vorläufers ist in den Spuren 3-13
Stunden
dargestellt. Die Inhibitoren wurden nach dem Zellaufschluss in Form einer 100x konzentrierten
Stocklösung zugegeben. Mit dem polyklonalen Antiserum gegen Lamin A und B2 wurden
Immunpräzipitationen aus den verschiedenen Fraktionen durchgeführt. Die immunpräzipitierten
Proteine wurden durch SDS-PAGE (8%) aufgetrennt. Nur die Regionen der Fluorographie mit den
Laminproteinen ist gezeigt.
Spur 3: Leupeptin, 150 ug/ml
Spur. 4: Trypsininhibitor aus Sojabohnen, 300 u.g/ml
Spur 5: Diisopropylfluorphosphat, 2mM
Spur 6: PMSF,1mM
Spur 7: Pepstatin A, 0.12mM
Spur 8: o-Phenanthrolin, 4mM
Spur 9: EDTA,5mM
Spur
Spur
10:
11:
(5mM) + DTT (2mM)
Isopropanol (1%), als Lösungsmittel
Spur
12:
DMSO
Spur
Spur
13:
TLCK, 0.4 mM
TLCK, 0.4 mM, das Homogenat wurde
14:
EDTA
(1%), als Lösungsmittel
Methionin inkubiert worden
Teil B: Das
Homogenat
aus kurz
für
für PMSF verwendet
Pepstatin A, o-Phenanthrolin und TLCK verwendet
aus
Zellen
hergestellt,
die 4 Stunden mit
35S-
waren.
markierten Zellen wurde entweder direkt
analysiert (Spur 1) oder
zuerst drei Stunden bei 37°C
Gegenwart von verschiedenen Chelatoren (Spuren 3-6)
inkubiert. Als Probe wurde Homogenat ohne Inhibitor inkubiert (Spur 2). Zum Vergleich wurden die
Laminproteine aus Zellkulturen immunpräzipitiert, die während 16 Stunden mit 35S-Methionin
inkubiert worden waren (Spur 7). Der Lamin A-Vorläufer ist durch einen leeren Kreis markiert, reifes
Lamin A durch einen ausgefüllten Kreis gekennzeichnet. Reifes Lamin B2 ist durch ein Dreieck
in der
markiert.
Spur
Spur
Spur
Spur
3: o-Phenanthrolin, 7mM
4: EDTA (3.5 mM)+DTT(2mM)
5: DTT,2mM
EDTA, 10mM
6:
94
11
in
Iflll
II
1
5
CO
II
III
III
1
CM
y—
1
O
II1
1*1
0)
.
11
03
II 1
1^
1t
r»-
III
(0
111
0
II1
IO
11
IO
II1
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CO
III
CM
1
1
0
<
11
J J
MI
11
^
o
CO
4
•<*
CO
CM
-
95
2
1
Figur
24:
3
4
Charakterisierung
5
6
der Lamin
7
8
9
10
11
12
13
14
B2-prozessierenden Aktivität durch Inhibitoren
Synthetische Lamin B2-kodierende RNS wurde während 15 Minuten in der Gegenwart von 35SMethionin translatiert (Pulse) und nach der Zugabe eines Ueberschusses an unmarkiertem
Methionin weiter während drei Stunden inkubiert (Chase). Gleichzeitig mit der Zugabe des
unmarkierten Methionins wurden dem Retikulozytenlysat verschiedene Inhibitoren beigefügt
(Spuren 1-13). Die Inhibitoren wurden in Form einer 100x konzentrierten Stocklösung zugegeben.
Die Translationsprodukte wurden durch SDS-PAGE (8%) analysiert. Nur die Region der
Fluorographie mit den Laminproteinen ist gezeigt. Der Vorläufer von Lamin B2 ist durch einen Pfeil
und reifes Lamin B2 durch eine Pfeilspitze markiert.
1
PMSF, 1mM
Spur
2
Aprotinin, 50u.g/ml
Spur
3
Leupeptin, 50u.g/ml
Spur
4
TPCK, 0.8 mM
Spur
5
TLCK, 0.8 mM
Spur
6
Jodacetamid, 5mM
Spur
7
Pepstatin A, 100u.g/ml
Spur
8
Dithiothreitol, 2mM
Spur
7mM
9
o-Phenanthrolin,
Spur
1 D:
EDTA, 1mM
Spur
1 1:
Isopropanol, 1%, Lösungsmittel für PMSF
Spur
1: 1:
DMSO, 1%, Lösungsmittel für Pepstatin A, o-Phenanthrolin, TPCK und TLCK
Spur
Methanol
1:
3:
(50%), 1%, Lösungsmittel für Leupeptin
Spur
1' l:
Kontrolle ohne Inhibitor
Spur
96
markiertem
B2-Vorläufer durch die Zugabe eines Ueberschuss
Lamin
unmarkiertem Methionin gestoppt. Für die weitere Inkubation wurden dem
verschiedene Hemmstoffe
(Spur 9)
Chelatoren o-Phenanthrolin
Hemmung
der Lamin
PMSF
(Fig. 24, Spur 8).
(Fig.24, Spur 1),
die Lamin
das
vor
Lysat
geht hervor, dass die
(Spur 10)
eine
Gegensatz
bewirkten. Im
Prozessierung
vollständige
zur
Spaltung
Lamin B2 nicht nicht mit DTT
von
Partielle Effekte wurden auch mit den Inhibitoren
(Fig. 24, Spur 4),
TPCK
Pepstatin (Fig. 24, Spur 7)
Hemmstoffe
24
Figur
und EDTA
B2-Prozessierung
des Lamin A-Vorläufers ist die
hemmbar
Aus der
zugegeben.
an
beobachtet.
Die
TLCK
(Fig. 24, Spur 5)
und
Serinproteasen-spezifischen
Trasylol (Fig. 24, Spur 2), Leupeptin (Fig. 24, Spur 3) beinflussten
B2-Prozessierung ebensowenig
SH-Proteasen
allem
hemmt.
(Fig. 24, Spur 6),
wie Jodacetamid
Die
verschiedene
für
Inhibitoren-
Stocklösungen verwendeten Lösungsmittel (Fig. 24, Spuren 11-13)
keinen Effekt auf die
Prozessierung.
In
Fig. 24, Spur 14,
hatten
ist ein Kontroll¬
experiment ohne Inhibitor dargestellt.
iv.9.3.
Sutaelluläre Lokalisation der Lamin-prozessierenden Aktivitäten
Anstelle des ganzen
Homogenats
wurden Fraktionen, die durch
unmittelbar nach dem Zellaufschluss
prozessierende Aktivitäten untersucht.
ganzen
Homogenats inkubiert.
In
worden
gebildet
sind
Lamin-
waren,
auf
jeweils
ein Teil des
Als Kontrolle wurde
Figur 25
Zentrifugation
die
Resultate
dieser
Untersuchungen zusammengefasst. Die Prozessierung im Kontroll-Homogenat
wird in den Teilen A-C
Experiment
in
Figur
jeweils
Spuren
in den
25A wurde das
an
Lamin A-Vorläufer
Zentrifugation
bei
In einem weiteren
der
partikulären
Fraktion
postmikrosomalen Ueberstand stabil
Experiment wurde
das
Homogenat durch
nachgewiesen
werden
Fraktionierungs-Experimenten
10 Minuten bereits der
Vorläufers in den Zellkern
in eine
In der Kernfraktion konnte die Aktivität der Lamin A-
(Fig. 25B, Spur 3),
blieb der lösliche Lamin A-Vorläufer stabil
von
in
1000xg in eine Kernfraktion (Crude Nuclei) und
Zytoplasmafraktion getrennt.
Protease
Für das
prozessiert wurde (Fig. 25A, Spur 3),
blieb der lösliche Anteil des Vorläufers im
(Fig. 25A, Spur 4).
gezeigt.
Zellhomogenat durch Zentrifugation bei
100'OOOxg fraktioniert. Während der bereits
vorliegende Anteil
und 2
1
in der
Zytoplasmafraktion
(Fig.25B, Spur 4).
Aus diesen beiden
ist ersichtlich, dass nach einer
grösste Teil des
transportiert worden
neu
Markierungszeit
synthetisierten Lamin
war.
Diese Resultate
zudem, dass die Lamin A-Protease mit dem Zellkern assoziiert ist.
A-
zeigen
97
B
12345
12
3
4
12345
5
Figur 25: Subzelluläre Lokalisation der Lamin
A- und
B2-prozessierenden
Aktivitäten
Hühnerembryofibroblasten wurden für 10 Minuten (Teile A und B, Spuren 1-4), für 7 Minuten (Teil
C, Spuren 1-4) oder für 16 Stunden (Teile A, B und C, Spur 5) in 35S-Methionin-haltigem Medium
inkubiert. Die Homogenate der kurz markierten Zellen wurden entweder direkt analysiert (Spur 1 in
A, B und C) oder zuerst für drei Stunden bei 37°C inkubiert (Spur 2 in A, B und C). Ein Teil der
Homogenate wurde vor der Inkubation bei 37°C entweder durch Zentrifugation während 30
Minuten bei 100'000xg in eine partikuläre Fraktion (Teil A, Spur 3) und in einen postmikrosomalen
Ueberstand (Teil A, Spur 4) aufgetrennt oder durch Zentrifugation während 8 Minuten bei 1000xg
in eine nukleare (Teil B, Spur 3) und eine zytoplasmatische (Teil B, Spur 4) Fraktion aufgeteilt. Die
postmikrosomale Fraktion der während 7 Minuten markierten Zellen wurde entweder direkt
analysiert (Teil C, Spur 3) oder ebenfalls drei Stunden bei 37°C inkubiert (Teil C, Spur 4).
Die Laminproteine wurden mit einem Lamin A/B2-spezifischen Kaninchenserum aus den
verschiedenen Fraktionen immunpräzipitiert und mittels SDS-PAGE (8%) analysiert. Es sind nur die
repräsentativen Teile der Fluorographie abgebildet. Offener Kreis: Lamin A-Vorläufer; ausgefüllter
Kreis: reifes Lamin A; Pfeil: Lamin B2-Vorläufer: Pfeilspitze: reifes Lamin B2.
98
(1986b)
Lehner et al.
postmikrosomalen
auch die Lamin
Lamin
hatten in früheren
Ueberstand
gefunden.
Homogenisation
Zentrifugation
nur
bei
Es wurde
zu
können, wurden die Fibroblasten
(Fig. 25C, Spur 3)
Spuren
4).
der
Anfang der Inkubationszeit konnte sowohl
Lamin
im
postmikrosomalen
Die
im
Ueberstand
B2-Vorläufer nachgewiesen werden. Nach dreissig
in beiden Fraktionen kein Vorläufer mehr
2 und
vor
100'OOOxg wurde der postmikrosomale Ueberstand während
Totalhomogenat (Fig. 25C, Spur 1) als auch
war
kurzlebigen
während 7 Minuten mit 35S-Methionin markiert. Nach der
30 Minuten bei 37°C inkubiert. Am
Minuten
im
geprüft, ob dieselbe Fraktion
Aktivität enthält. Um den sehr
B2-prozessierende
B2-Vorläufer nachweisen
Experimenten reifes Lamin B2
finden
(Fig. 24C,
partikuläre Fraktion enthielt erwartungsgemäss
kein Lamin
zu
B2-Vorläufer (nicht gezeigt). Aus Fibroblasten, die über Nacht markiert worden
waren, wurden nur die reifen
ist
eine
Laminproteine isoliert (Fig. 25C, Spur 5). Allerdings
unspezifische Degradation
mikrosomalen
Ueberstand
nicht
des
Lamin
B2-Vorläufers
im
ausgeschlossen. Diese Resultate
post¬
lassen
vermuten, dass der Lamin B2-Voriäufer durch ein lösliches zytoplasmatisches
Enzym
modifiziert wird.
99
TEIL B: STUDIE ZUM KERNHUELLENANTIGEN P1
IV. 10.
Charakterisierung
Bei der
Herstellung
Kemhüllenantigens
monoklonalen
von
(Kap. IV.1)
Laminafraktion
hüllenprotein
des
mit einem
wurde ein
Molekulargewicht
P1
Antikörpern gegen
Porenkomplex-
die
Antikörper gefunden,
von
der ein
82 kDa erkennt. In den
Experimenten wurden die Eigenschaften dieses
Antigens
neuen
folgenden
mit immun-
und biochemischen Methoden weiter untersucht. Aus diesen
zytochemischen
Studien lassen sich
möglicherweise Hypothesen über die Funktion
Antigens formulieren.
Ein
IV.10.1.
In
Vergleich dieses Polypeptides mit
Kernhüllenproteinen
bekannten
Lokalisierung
Kapitel
des
Antigens
IV.2.2. wurden
dieses Proteins
Verteilung
durchgeführt (Fig. 26).
Vorstellung
Dabei wurden
ermittelt
Antigens (Fig. 26, Spur 1).
wahrscheinlich
neu
radioaktiv markierte
Zentrifugation (1000xg)
(Fig.26).
Der
Die Kernfraktion enthielt
synthetisiertes Protein
dar.
die
Lamina
der Kernmembran
in
der
am
Immunfluoreszenzfärbungen
Antikörper
P1
(Fig.
Kaninchenserum
27A
)
(Fig. 27B)
-Antigen durch
90% des
ist eine
geringe
des
P1-Antigens
während
Laminproteine während
P1
-Antigen
mit
verschiedenen
(Doppelimmunfluoreszenz, Fig.27).
Ende der
von
stellt
Zu diesem Zweck wurde in derselben
das
und
Zelle
ganzen
Zytoplasma
ungefähr
Allerdings
Experiment wurde das Verhalten
Fluoreszenzfarbstoffen markiert
verteilt
vom
ausgeschlossen.
Zellzyklusstadien verglichen.
jeweils
die Zellkerne
zytoplasmatische Anteil (Fig. 26, Spur 2)
der Mitose untersucht und mit dem Verhalten der
Auflösung
Hühnerembryo¬
Homogenisator aufgeschlossen,
Kontamination mit Zellkernen nicht
In einem weiteren
des P1-
der subzellulären
von
und in beiden Fraktionen wurde der Gehalt an P1
Immunpräzipitation
Zelle
Lokalisierung
zur
erhalten, wurde ein Fraktionierungs-Experiment
zu
wurden anschliessend durch milde
denselben
wenigen bisher
P1
Fluoreszenzexperimente
fibroblasten mit einem Dounce
abgetrennt
den
des P1-
könnte ebenfalls aufschlussreich sein.
beschrieben. Um eine genauere
Antigens
Kern¬
Prophase
vergefunden,
wurden die
Antigene
wie
ist
Metaphasen-Zellen
und dem
polyklonalen
Nach der
dies
aus
diffus
den
mit dem monoklonalen
Lamin
A/B2-spezifischen
ersichtlich ist. Interessanterweise band ein grosser
100
—
—
-
1
Figur
26: Subzelluläre
200
92
69
2
Lokalisierung des P1-Antigens
Fibroblasten wurden während 16 Stunden mit
35S-Methionin
markiert und anschliessend mit
Homogenisator aufgeschlossen. Das Homogenat wurde durch Zentrifugation bei
1000xg während 8 Minuten in ein Kernpellet (Spur 1) und eine zytoplasmatische Fraktion (Spur 2)
aufgetrennt. Das P1 -Antigen (Pfeil) wurde durch Immunpräzipitation mit dem monoklonalen
Antikörper isoliert und durch SDS-PAGE (5.6%) analysiert. Radioaktive Proteinmarker (in kDa, von
oben nach unten): schwere Kette von Myosin, Phosphorylase B, Rinderserumalbumin.
einem Dounce
101
I» J
B
4
•
•
>
•
*
•
Figur
27:
Immunfluoreszenzlokalisierung
des
P1-Antigens während der Mitose
Hühnerembryofibroblasten wurden mit Formaldehyd fixiert und mit Triton X-100 permeabilisiert. Die
Zellen wurden gleichzeitig mit dem monoklonalen Antikörper P1 (A,D und G) und mit dem Lamin
A/B2-spezifischen Kaninchenserum (B, E und H) inkubiert (Doppelimmunfluoreszenz). Die
gebundenen Maus-Antikörper wurden mit einem Rhodamin-gekoppelten sekundären Antikörper
sichtbar gemacht. Für den Nachweis der gebundenen Kaninchen-Antikörper wurde ein mit
Fluorescein-isothiocyanat-gekoppelter sekundärer Antikörper verwendet. Die Bilder A, B und C
zeigen eine Zelle in der Metaphase, D, E und F in der Anaphase, G, H und I in der Telophase. C, F
und I zeigen die Phasenkontrastbilderder mitotischen Teilungsstadien.
102
-Antigens bereits kurz nach der Trennung des Chromatins (frühe
Teil des P1
Anaphase)
Zeitpunkt
die Oberfläche der Chromosomen zurück
an
konnte erst ein
geringer Anteil
In der
A und
B2 auf der
(Fig.
werden
nachgewiesen
E).
27
Telophase wurde schliesslich der grösste Teil beider Antigene wieder
den wachsenden Kernhüllen der
und
Zu diesem
Laminproteine
der
Oberfläche des kondensierten Genmaterials
(Fig. 27D).
in
27 G
späteren Tochterzellen vorgefunden (Fig.
H).
IV.10.2. Biochemische
Extraktion
Durch
Eigenschaften
von
des
Zellkernen
Antigens
P1
unter verschiedenen
denaturierenden
Bedingungen können die Laminproteine und einige andere,
im
Mengen vorhandene Komponenten des Zellkernes,
angereichert
werden
in
geringeren
Rückstand
und Blobel 1976, Gerace und Blobel
(Dwyer
Löslichkeit des P1 -Antigens wurde unter verschiedenen
stark
1980). Die
Extraktionsbedingungen
getestet und mit der Löslichkeit der Laminproteine verglichen. Zu diesem Zweck
wurden
Lebern
die
Nukleasen,
18tägigen
von
nicht-ionischem
Zentrifugation
partikulären und
monoklonalen
abgetrennt
Antikörper
P1
spezifischen
X-100)
jedem Schritt wurde
und
und
bei
wurden
Antikörper
hoher
sämtliche
Immunoblot-Experiment
analysiert (Fig. 28C). Diesselben
monoklonalen
mit
sequenziell
der unlösliche Rest
anschliessend
löslichen Fraktionen in einem
wurden mit einem
Lamin
(Triton
Detergens
Salzkonzentration extrahiert. Nach
durch
Hühnerembryonen
mit dem
Fraktionen
auch auf den Gehalt
an
B2 untersucht (Fig. 28B). Nach den beiden Verdauungen mit Nukleasen
(Fig. 28C, Spuren 2-5)
Spuren
6 und
vorhanden
7)
war
und nach der Extraktion mit Triton X-100
das
P1-Antigen ausschliesslich
(Fig. 28C, Spuren 2,
4 und
6).
in den
Sedimenten
Bei der Extraktion in Puffer mit hoher
Salzkonzentration wurde ein Teil des P1 -Antigens
meiste blieb aber im unlöslichen Rest, der
gelöst (Fig. 28C, Spur 9), das
Porenkomplex-Laminafraktion (Fig.
28C, Spur 8). Der Vergleich mit den Löslichkeits-Eigenschaften
(Fig. 28B) zeigte,
(Fig. 28C,
dass beide Proteine ähnliche biochemische
von
Lamin B2
Eigenschaften
besitzen, denn beide Proteine wurden in der Porenkomplex-Laminafraktion
angereichert (Fig. 28, Spur 8).
sehen ist
(Fig. 28C), scheint
Polypeptid
war
Die untere Bande, die im P1-lmmunoblot
ein
Degradationsprodukt
in der Kernfraktion nicht nachweisbar
früheren
Immunoblotexperimenten
(Fig. 3).
Bemerkenswerterweise besitzt dieses
war
zu
sein, denn dieses
(Fig. 28C, Spur 1).
dieses Protein nicht
Antigen
zu
gefunden
Auch in
worden
exakt dieselbe
gel-
103
B
92-
69
>
—.
—
<
45-
123
Figur
4567891
28: Nachweis des
P1-Antigens
234567
in der
891
234567
89
Porenkomplex-Laminafraktion
von 18tägigen Hühnerembryonen wurden sequenziell mit DNase l/RNase A, Triton X100 und mit hoher Salzkonzentration extrahiert. Die Proteine der Zellkerne, sowie die löslichen
und unlöslichen Fraktionen der einzelnen Präparationsschritte wurden durch SDS-PAGE (8%)
aufgetrennt und entweder mit Serva Blau angefärbt (Teil A) oder auf Nitrocellulose transferiert
Leberkerne
(Teile
B und
C).
Der Nitrocellulosefilter wurde zuerst mit dem monoklonalen
P1-Antikörper
gebundenen Antikörper wurden durch einen mit 125|-gekoppelten sekundären
Schaf-Antikörper markiert und durch Fluorographie sichtbar gemacht (Teil C). Derselbe Filter wurde
zum Nachweis von Lamin B2 mit dem monoklonalen Antikörper E3 (Lehner etal. 1986a) verwendet
(Teil B). Dabei wurden die gebundenen E3-Antikörper mit einem sekundären, Peroxydasegekoppelten Ziegen-Antikörper nachgewiesen. Als Molekulargewichtsmarker (linker Rand) wurden
folgende Proteine verwendet: Phosphorylase B (92'000), BSA (67'000) und Ovalbumin (45'000).
1
Zellkerne aus Lebern von 18tägigen Embryonen
Spur
2
Sediment nach der ersten Nukleasenverdauung
Spur
Ueberstand nach der ersten Nukleasenverdauung
3
Spur
4
Sediment nach der zweiten Nukleasenverdauung
Spur
Ueberstand nach der zweiten Nukleasenverdauung
5
Spur
Sediment
nach der Extraktion mit Triton X-100
6
Spur
7
Ueberstand nach der Extraktion mit Triton X-100
Spur
Sediment nach der Extraktion mit hoher Salzkonzentration
8
Spur
Porenkomplex-Laminafraktion
Ueberstand der Extraktion mit hoher Salzkonzentration
9:
Spur
inkubiert.
Die
104
Mobilität wie reifes Lamin A
elektrophoretische
Mit Ausnahme
(nicht gezeigt).
gp190 (Gerace etal. 1982) werden sämtliche bekannten
von
Porenkomplexproteine mit N-Acetylglucosamin modifiziert (Davis
und Blobel
1986, Snow etal. 1987, Holt etal. 1987), wobei die Zucker-Monomere durch
O-glykosidischen Bindungstyp
einen neuen,
1986).
und Hart,
(Holt
Glykosilierung
enthaltende
Mit
endoplasmatischen Retikulums,
Oligosaccharide N-glykosidisch
p62
von
korreliert die
geringfügigen Veränderung
und Blobel
der
werden
der
von
bei der Mannose-
Asparaginreste gebunden
an
posttranslationelle Glykosilierung mit
gelelektrophoretischen
(Davis
Mobilität
1986).
Pü/sö-Cftasö-Experimenten
wurde
geprüft,
ob das
translationell in einer ähnlichen Weise modifiziert wird wie
Hühnerembryofibroblasten
die
p62. Dabei
Laminproteine
wurden
anschliessend
isoliert und schliesslich durch SDS-PAGE
synthetisiertes und "älteres"
P1
zu
einer
Proteins. Um einen weiteren
der
Vergleich
Neu
in der SDS-PAGE dasselbe
-Antigen zeigten
Veränderung
durch
analysiert
Mig ratio ns-Verhalten (nicht gezeigt). Allerdings führt die Glykosilierung
jedem Fall
wurden
kurzfristigen Markierung (10 Min.) mit
bestimmte Zeiten in Medium ohne 35S-Methionin
markierten
Immunpräzipitation
P1-Antigen post-
nach einer
radioaktivem Methionin für
inkubiert,
angehängt
Damit unterscheidet sich diese Modifikation klar
im Lumen des
werden. Im Falle
einer
die Proteine
an
nicht in
gelektrophoretischen
Mobilität eines
mit
Porenkomplex-
p62 und
proteinen durchzuführen, wurde das P1-Antigen
anderen
mit Lektinen, die
spezifisch
an
bestimmte Zuckerreste binden, getestet. Für diesen Versuch wurde das P1-
Antigen durch die Herstellung einer Porenkomplex-Laminafraktion
aus
18tägiger
embryonaler Hühnerleber angereichert und auf Nitrocellulose transferiert. Die
immobilisierten
spezifischen
Proteine wurden
Lektin
einerseits
mit
Weizenkeimagglutinin (WGA)
dem
N-Acetylglucosamin-
und andererseits mit dem
Mannose-spezifischen Lektin Concanavalin A getestet. Beide Lektine
die
Meerrettich-Peroxidase
enzymatische
Reaktion
Concanavalin A banden
Antigen,
zumindest
an
was
Porenkomplexproteinen
gekoppelt
sichtbar
das
die
werden.
Glykosilierung anbetrifft,
somit
Weder
durch
eine
WGA
noch
ist das P1-
nicht mit den bekannten
verwandt. Einen direkteren Hinweis dafür, dass P1 kein
aus ersten
Lokalisierungs-Experimenten
mit
Elektronenmikroskop gewonnen (S. Bailer, persönliche Mitteilung).
Aufgrund dieser Untersuchung
zu
gemacht
konnten
P1-Antigen (nicht gezeigt). Offenbar
Bestandteil der Poren ist, wurde
dem
und
waren an
sein. Die genaue
scheint das P1
Lokalisierung
und die
-Antigen
eher ein
Eigenschaften
Membranprotein
dieses
Polypeptides
105
werden in unserem Labor weiter untersucht.
106
V. DISKUSSION
V.1.
Vergleich
Die
Laminproteine gehören,
Kategorie
einer
zu
von
zytoplasmatischen
Strukturen, die auch
zellulären
Kemgerüsts beteiligt
zu
sein. Die
Analyse
als Teil des
Laminproteine
die
scheinen
Entsprechend
betrachtet.
Sequenzen
um
Bemerkenswerterweise
Position,
sämtlicher
liegt das
beide Proteinklassen einen
(Osborn
ein
(siehe
Homologie
eine
Resultate).
Die
dass der Coil 1b
von
Heptad Repeats länger ist
von
42 Aminosäuren genau
Neurofilamentproteins (NF-L)
ein Intron aufweisen.
verschiedenen Autoren die
von
Spezies
Ausdruck, dass die Proteine
aufweisen
Insert
Intermediärfilamentproteine
Befundes wurde
gegenwärtig
als
zytoplasmatischen Intermediärfilamentproteine.
mit Ausnahme eines
wo
des
zytoplasmatischen
aber deutlichen
42 Aminosäuren oder sechs
Domäne der
entsprechende
zum
bestätigen ausserdem,
der drei Hühnerlamine
Laminproteinen
die
begrenzten,
Architektur
molekulare
gemeinsame
Dies kommt darin
neben einer
Gruppen
Aufbau
in anderen
beobachtete Verwandtschaft dieser Proteinfamilie mit den
beider
am
Zytoskeletts
der Primärstrukturen der
Hühnerlaminproteine bestätigte die bereits
Intermediärfilamentproteinen.
rigorosen
unter
Aufgrund dieser Eigenschaft
zytoplasmatischen Intermediärfilamente
wurden die
Intermediärfilamenten
zytoplasmatischen Intermediärfilamente,
wie die
extrahiert werden können.
Bedingungen nicht
bekannten
und
Laminproteinen
von
gemeinsamen
und Weber 1986, Steinen und
einer
an
die Gene
Aufgrund dieses
dass
Hypothese aufgestellt,
evolutionären Vorläufer besitzen
Roop 1988). Interessanterweise
konnte
längere flod-Domäne nicht ausschliesslich bei Laminproteinen gefunden
werden, sondern auch bei zytoplasmatischen
Invertebraten
Eukaryonten
(Weber
et al.
Intermediärfilamenten
von
1988). Es ist deshalb anzunehmen, dass die
schon sehr früh während der Evolution eine Kernlamina erworben
hatten und dass die
Expression der zytoplasmatischen Intermediärfilamente
ein
späteres Ereignis darstellt.
Bemerkenswerterweise sind die Linker der
Laminproteine
in Vertebraten in
Bezug auf ihre Länge und ihre Sequenz stark konserviert (Tab. IV) und enthalten
im
Gegensatz
zu
Aminosäuren, wie
den
zum
zytoplasmatischen
Beispiel Prolin,
die die oc-Helices
Wahrscheinlich sind die flod-Domänen der
a-helikal
(Steinen
und
Roop 1988),
was
Intermediärfilamenten
Laminproteine
möglicherweise
brechen
würden.
in ihrer ganzen
eine
keine
Länge
Voraussetzung für
107
den Aufbau der Kernlamina ist.
Die N-terminale Head-Domäne der
signifikante Homologie
keine
proteinen
keine
den
gemeinsames
auf. Als
Proteinklassen einen
Threonin)
zu
Laminproteine
zytoplasmatischen
relativ hohen Anteil
signifikante Homologie
zu
der
an
Tai! der
Laminproteine besitzt ebenfalls
entsprechenden
Hydroxyaminosäuren. Die mögliche Bedeutung
reichen Domänen wird in
B2
neben
einer
von
A- und
einen
gemeinsam sind,
von
Hydroxyaminosäuren
an
Hühnerlaminproteine A, Bi
strukturellen
Anhand dieses
auffälligen Domänen,
auch Motive
den A- oder den
der drei
eingehenden
anderer Vertebraten.
Reihe
der
die
Vergleich
mit
den
Vergleiches konnten
allen
Laminproteinen
gefunden werden, die jeweils ausschliesslich
B-typischen Laminproteinen vorkommen. Es
angenommen werden, dass diese Motive wichtige Merkmale
der beiden Lamin-Unterfamilien darstellen. Damit hat sich
biochemischen Kriterien vorgenommene
zur
Unterscheidung
gezeigt, dass die nach
gerechtfertigt
verglichenen Homologien rechtfertigten
die
bei
darf deshalb
Einteilung der Laminproteine
Unterfamilien auch nach strukturellen Kriterien
dieser Arbeit
an
B-typischen Laminproteinen
Aminosäuresequenzen
ermöglichte
Laminproteinen
Domäne der Intermediär¬
Kapitel V.3.1. diskutiert.
Vergleich
Die Kenntnis der
und
Hydroxyaminosäuren (Serin,
DieTa/V-Region der Laminproteine ist ebenfalls reich
filamentproteine.
V.2. Struktureller
Intermediärfilament-
Merkmal weist diese Domäne bei beiden
lange C-terminale
auf. Der
ist relativ kurz und weist
in zwei
ist. Auch die in
Einteilung
der Lamin¬
in die beiden Unterfamilien.
proteine
Lamin
B2
war
aufgrund seines isoelektrischen Punktes
im
sauren
Bereich
(Lehner etal. 1986a) und seiner Assoziation mit Membranvesikeln während der
Mitose
(Stick
et al.
immunologische
1986a)
führte
1988)
(Newport
typisches Laminprotein
Aus
al.
klassifiziert worden. Die
(Lehner
et al.
allerdings dazu, dass andere Autoren Lamin B2 als A-typisches
bestätigten eindeutig,
derselben
B-typisches Laminprotein
Verwandtschaft zwischen Lamin B2 und Lamin A
Protein betrachteten
Ebene
als
Spezies
und Forbes
Die
Vergleiche
auf molekularer
dass Lamin B2 neben Lamin Bi ein zweites B-
darstellt. Damit wurde hier erstmals bewiesen, dass in
mindestes 2
Untersuchungen
1987).
zur
B-typische Laminproteine vorkommen
immunologischen
Verwandtschaft
waren von
können.
Lehner et
(1986a) der Schluss gezogen worden, dass das Lamin Bi des Huhnes dem
108
Lamin B der
Säugetiere entspricht.
dass Lamin B2
Andererseits hatten diese Studien
immunologisch mit zwei bis drei
sauren, und in
geringen Mengen
vorhandenen, Komponenten der Porenkomplex-Laminafraktion
zellen verwandt ist. Wahrscheinlich
entsprechende cDNS-Klone
Säuger¬
von
gehören diese Antigene ebenfalls
B-typischen Laminproteine.
Unterfamilie der
gezeigt,
Es wird deshalb interessant sein,
analysieren.
zu
Obwohl während der frühen Embryonalentwicklung höherer Vertebraten
typische Laminproteine exprimiert
Burke
1987),
zur
konnten in allen
werden
(Lehner
nur
B-
etal. 1987, Stewart und
sorgfältig geprüften Zelltypen
von
Vögeln
und
Säugern mindestens zwei strukturell verschiedene Laminproteine gefunden
werden
(Lehner
1987, Stewart und Burke 1987). Die Coexpression
et al.
Laminproteinen
mehreren
könnte
Laminproteine vorzugsweise
mehreren Autoren in den
Xenopus laevis
nur
ein
ein
Hinweis
Heteropolymere
Oozyten
sein, dass diese
darauf
bilden.
Allerdings
und in den ersten
Laminprotein (L|||) nachgewiesen
1981, Benavente etal. 1985, Stick und Hausen 1985),
ist
von
Teilungsstadien
worden
was
von
(Krohne
gegen die
von
et al.
Hypothese
spricht, dass die Lamina notwendigerweise eine heteropolymere Struktur
aufweist. Es ist
Xenopus
von
jedoch
nicht auszuschliessen, dass diese
laevis
noch
Zusammenhang ist
weitere
interessant
es
Kriterien weder ein A- noch ein
V.3. Funktionelle
Der
der
von
erlaubte
analysieren und
folgenden
enthalten.
In
diesem
erwähnen, dass L||| nach strukturellen
B-typisches Laminprotein
ist
(Stick 1988).
Betrachtungen
Vergleich
proteinen
zu
Laminproteine
Entwicklungsstadien
verschiedenen A- und
es,
die
Laminproteine
Verwandtschaft der beiden
strukturelle Motive
wird diskutiert, ob
B-typischen Vertebratenlamin-
zu
ihrer
Unterfamillien
Unterscheidung
zu
finden.
zu
Im
gewisse Eigenschaften und mögliche Funktionen
auf bestimmte Motive zurückzuführen sein könnten.
V.3.1. Mitoseverhalten
Es
gibt Evidenz dafür,
reversiblen
Rolle
dass die
Phosphorylierung
Depolymerisation der Lamina während
der
Laminproteine
der Mitose eine
spielt (Gerace und Blobel 1980, Ottaviano und Gerace 1985,
Gerace
1986). Allerdings könnten
auch andere
bei der
wichtige
Burke und
posttranslationelle
Modifi-
109
kationen
et al.
der
an
(1987),
dass die
von
(1985) stellten fest,
verschiedenen Stellen
studierten die
aktivierter
der Lamina
Nettoladung
Demethylierung
reversible
Gerace
Depolymerisation
dass die
Xenopus-Em
menschlichem Lamin C in
und wiesen nach, dass der
Laminprotein
während der Mitose
sind. Ward und Kirschner
Phosphorylierungsstellen
wurde das exogene
in diesem
liegt
System
an
einer zusätzlichen Stelle
Kirschner
(1988)
Eiern
Xenopus
Bei
von
den
den
aus
von
den
Aminosäuren
an
wobei *S das
Laminsequenzen ist diese
zum
SRATSS
im Falle
Beispiel
zusammen.
Ward
von
und
lieferten Evidenz dafür, dass die erwähnte Domäne durch die in
laevis vorhandene S6 Kinase
phosphoryliert
wird.
zytoplasmatischen Intermediärfilamentproteinen
Phosphoakzeptor-Stellen
et al.
konnte
Sequenz GRAS'SH,
Serin darstellt. Bei allen bekannten
B2
von
stark erhöht wurde. Ausserdem
Domäne einigermassen konserviert, sie setzt sich
Hühnerlamin
Extrakten
in der stark konservierten Domäne, die
den Coil 2 anschliesst und besitzt die
phosphorylierte
an
(1988)
Phosphorylierungsgrad
phosphoryliert. Eine dieser konstitutiv phosphorylierten Stellen
Autoren bestimmt werden. Sie
Chelsky
erhöht wird. Ottaviano und
Laminproteine
hyperphosphoryliert
von
sein. So fanden
Lamin B während der Mitose durch
Carboxylgruppen
Phosphorylierung
vier konstitutiven
von
beteiligt
mehrere
in der Head- und in der Ta/V-Domäne bekannt
1987, Geisler und Weber 1988, Steinert 1988). Es ist
weitere
Phosphatakzeptoren
Bereich
liegen. Aufgrund
Hydroxyaminosäuren
sind
der
Laminproteine ebenfalls
ihrer starken
sind
vor
Konservierung
allem die
zu
(Geisler
vermuten, dass
im nicht-helikalen
und ihrem hohen Anteil
an
Bereiche, die die flod-Domäne
flankieren, potentielle Akzeptoren für Phosphorylierungen während der Zell¬
teilung. Geisler und Weber (1988) wiesen in vitro nach, dass
Domäne
von
Hühnerdesmin drei Motive mit der
eine Aminosäure mit kurzer
Seitenkette)
Konsensussequenz
durch die
cAMP-abhängigen Kinase phosphoryliert werden
Intermediärfilamente hemmen. Die
solche charakteristischen
RIS in Position 19
V.3.2. Interaktion
von
von
in der Head-
(X
ist
katalytische Untereinheit der
und dadurch den Aufbau der
Hühnerlaminproteine
Aminosäuretripletts auf,
RXS
weisen ebenfalls
so zum
Beispiel
die
einige
Sequenz
Lamin B2.
Lamina und Chromatin
Die Head- und die flod-Domäne
Intermediärfilamente eine
wichtige
spielen beim Aufbau der zytoplasmatischen
Rolle
(Traub
und
al. 1985, Osborn und Weber 1986, Steinert und
Vorgias 1983,
Roop 1988).
Kaufmann et
Es ist deshalb
110
naheliegend,
Kernlamina
isolierten
eine
Bedeutung
von
1988).
deshalb
sind. Die Resultate
Laminproteinen ergaben
Beteiligung
etal.
dass dieselben Domänen auch beim Aufbau der
postulieren,
zu
vor
in
aus
tatsächlich auch
wfro-Bindungsstudien
experimentelle
Hinweise für
der Head-Domäne beim Aufbau der Laminfilamente
Eine Proteindomäne, die mit dem Chromatin
allem im Bereich der
Ta/7-Region
mit
(Georgatos
interagiert, kann
vermutet
werden.
Vermutung wird gestützt durch die elektronenmikroskopische Abbildung
Diese
von
in
wrro-rekonstituierten Lamin A- und Lamin B-Dimeren, die auf einer Seite der
ftod-Domäne deutlich zwei
globuläre
ist leicht vorstellbar, dass diese
10nm-Filamente abheben
globulären Domänen
(Steinert
(Aebi
Domänen aufweisen
und
et al.
1986).
Es
der Oberfläche der
von
Roop 1988) und
mit dem Chromatin
interagieren.
Ein
möglicher
Kandidat für die
Bindung
typischen Laminproteinen vorhandene
C-Terminus. Aehnliche
das Chromatin ist das in A- und B-
an
Motiv
aus sauren
Aminosäuren nahe
Bereiche wurden in verschiedenen
saure
am
Kernproteinen
gefunden (Eamshaw 1987). Obwohl die Funktionen dieser Domänen nicht
eindeutig bestimmt werden konnte,
Domänen der
sein
zu
Histonproteine
scheint doch eine Interaktion mit basischen
durch elektrostatische
Wechselwirkungen möglich
(Earnshaw 1987).
Die Assoziation mit dem Chromatin könnte auch durch Lamin
Domänen zustande kommen,
oder durch die
am
von
Beispiel
durch die Histidin-Reihe im Ta/7
C-Terminus konzentrierten
Interaktion könnte die
Oberfläche
so zum
A-spezifische
Cysteinreste.
Eine
derartige
präferentielle Bindung A-typischer Laminproteine auf
Telophasechromosomen (Burke
V.3.3. Membran-Assoziation der
und Gerace
1986)
der
erklären.
B-typischen Laminproteine
B-typische Laminproteine bleiben während des ganzen Zellzyklus mit
Membranen assoziiert,
andererseits
liegen
während der Mitose als lösliche Monomere
und Gerace 1986, Stick et al.
einem
die
(Gerace und Blobel 1980, Burke
vor
1988). Aufgrund
von
lipophilen, photoaktivierbaren Reagens
ursprünglich
als
Markierungsversuchen
war
integrales Membranprotein bezeichnet
Raymond 1984). Diese Markierungsexperimente
interpretieren, denn auch
lipophile
A-typischen Laminproteine
Reagens
von
Lamin A
markiert
Hühnerlaminproteine Bi
waren
worden.
In
sind
das
substanzielle
der
und B2 wurden keine
Rattenlamin
worden
allerdings
mit
(Lebel
und
mit Vorsicht
Mengen durch
B
zu
das
Aminosäuresequenz der
genügend lange hydrophobe
111
Domänen
gefunden,
Verankerung
die auf eine direkte
Kernmembran schliessen lassen. Dasselbe Resultat
Analyse
(Höger
Blobel
von
Xenopus-Lamm L\ (Krohne
1988)
etal.
(6M)
in
und
Polypeptide
war
bei der genauen
von
Lamin B der Maus
bei der Extraktion von Kernhüllen mit NaOH
Lösung
Membranprotein (Singer
und verhält sich somit nicht wie ein
und
Nicolson
in der
geht Lamin B, wie Gerace
erhalten worden. Ausserdem
(1982) nachwiesen,
oder Harnstoff
1987)
et al.
der
1972).
Es
scheint
und
(0.02M)
intgrales
daher
scheinlicher, dass B-typische Laminproteine entweder durch die Bindung
wahr¬
an
ein
integrales Membranprotein oder aufgrund einer posttranslationellen Modifikation
in
der Kernmembran verankert sind
proteine weiter
zu
Biogenese
der
Kenntnis
Möglichkeit,
daher
Laminproteine
der
die
cDNS-Sequenzen
Laminproteine
in vitro
Laminproteine
und
zu
die
sich
daraus
ergebende
synthetisieren, ermöglichten
genaues Studium der Biogenese dieser Kernhüllenproteine. Wie die
liegenden Resultate zeigen,
1986b) auch Lamin B2
Während
verschieden.
wird neben dem Hühnerlamin A
als Vorläufer
ihrer C-terminalen Domäne
Säugerzellen
die
Existenz
et al.
typische
Laminprotein
nachgewiesen
1985), ist
wurde.
war
die Art der Modifikation ist
eines
(Gerace
das Hühnerlamin
in
das
Lamin
zur
Bildung
Allerdings
der beiden
wurden
die mit der
Synthese
von
durch einen
Isomeren Dmi.
Gruenbaum et al.
Umwandlung
von
an
allerdings
A-Vorläufers
ebenfalls
das
Laminprotein
von
einer der beiden Lamin-Unterfamilien
wird nach seiner
et al.
auch
in
etal. 1984, Laliberte etal. 1984,
gaster, das aber aufgrund seiner Primärstruktur
eindeutig
vor¬
B2 das bisher einzige bekannte Bfür
Vertebraten,
Einzig Dm0,
(Lehner
ein
synthetisiert. Beide Proteine werden
prozessiert,
demonstriert worden
Dagenais
nicht
von
charakterisieren und insbesondere den Ort der Modifikationen
V.4.1. Posttranslationelle Modifikationen der
Die
war
(siehe Kap. V.4.).
bestimmen
V.4.
Es
Interesse, die posttranslationellen Modifikationen der Lamin¬
besonderem
zu
(vgl. Kap. V.4.).
von
Vorläufer
Drosophila
melano-
Gruenbaum et al.
zugeordnet
mehrstufigen
ein
(1988)
werden konnte,
Prozess modifiziert,
und
Dm2 führt (Smith
(1988)
Hinweise dafür
et al.
was
1987).
gefunden,
dass
Dm0 in Dirn. und Dm2 verbundene Modifikation
wahrscheinlich den N-Terminus betrifft. Das
Gleichgewicht
zwischen den beiden
112
Isoformen Dmi und Dm2 kommt durch
lierungsreaktionen
keine
dass der
gezeigt,
1988).
etal.
und
Dephosphory-
Versuche mit alkalischer
Umwandlung desB2-Voriäufer
Phosphorylierungsreaktionen zugrunde liegen
sönliche
können
(C.
F.
in reifes
B2
Lehner, per¬
Mitteilung).
V.4.1.1. Modifikation der
Die
(Gruenbaum
zustande
hatten
Phosphatase
Phosphorylierungs-
Laminproteine
durch ein Mevalonsäurederivat
vorliegenden Untersuchungen ergaben,
proteine nach ihrer Synthese
im
dass alle drei
Retikulozytenlysat spezifisch
Hühnerlamin¬
durch ein Produkt
des Mevalonsäuremetabolismus modifiziert werden. Erst kürzlich wurden in
Säugerzellen
zwei
dimensionalen
Gelelektrophorese
1988)
isoprenylierte Proteine nachgewiesen, die
und mit Lamin B
(Beck
kleinen
Gruppe
exakt mit dem Lamin A-Vorläufer
etal. 1988, Wolda und Glomset
Es scheint somit ziemlich sicher
zu
zellulärer Proteine
Isoprenverbindung
in der zwei¬
(Schmidt
modifiziert werden
et al.
1988) komigrierten.
sein, dass die Laminproteine
gehören, die durch
(Beck
zu
jener
relativ
eine nicht näher bekannte
etal. 1984,
Bruenger and Rilling
1986).
(1988) präzipitierten
Beck et al.
weiteres
konnten.
isoprenyliertes Protein,
Aufgrund
seiner
dessen Identität sie
und
Gelelektrophorese
Es ist
könnte
Abgesehen
bestimmter
es
nicht bestimmen
Eigenschaften (Bestandteil
mit
sich dabei
Lamin
der
in der zwei¬
von
Lehner et al.
verwandte
Protein der
um
B2
das
ein
handeln.
gegenwärtig
Modifikation
jedoch
aufgrund seiner Migration
(1986a) gefundene, immunologisch
Säugerlamina
Lamin-spezifischen Antikörper
biochemischen
Porenkomplex-Laminafraktion)
dimensionalen
mit einem
exakt den
um
von
nicht klar, ob
es
sich bei der in vitro
gleichen Vorgang handelt,
diesen Vorbehalten könnte das in
wie
er
beobachteten
in vivo abläuft.
v/rro-System das Studium
enzymologischer und struktureller Aspekte der Isoprenylierung
erleichtern.
Durch
gezielte Mutagenese
mit Hilfe
von
synthetischen Oligonukleotiden
wurde der Nachweis erbracht, dass das Vorhandensein des
CXXM-Box eine unerlässliche
Voraussetzung
Lamin B2 ist. Höchstwahrscheinlich wird das
dabei selber derivatisiert. Die
durch chemische
Spaltung
markiertem Lamin B2
von
in der
für die in wYro-Modifikation
Cystein
Ergebnisse der Analyse
synthetischen,
Cysteins
des
von
Tetrapeptidmotivs
von
Fragmenten,
die
mit radioaktiver Mevalonsäure
hergestellt wurden (nicht gezeigt),
unterstützen diese
113
Interpretation. Die Translationsversuche mit
Transkripten demostrierten überdies
mutierten
Spezifität
erneut die
translationellen in -//fro-Modifikation. Es ist
den
zu
synthetischen
der beobachteten
post¬
vermuten, dass bei der in vitro-
Modifikation der Hühnerlamine A und Bi ebenfalls das
Cystein
der CXXM-Box
involviert ist.
Neben den Laminen sind
allem zwei
die Produkte der
ras-Onkogene.
C-Terminus aufweisen. Es
am
Cystein
Die
von
des a-Sexfaktors
translationell durch das
Thioätherverbindung
etal.
des
1989)
zur
in
Anderegg
hatte
mit Hilfe der
ergeben, dass das
Saccharomyces
von
von
auch bei diesen
cerevisiae post-
Prozessierung
Arbeit
zeigt,
ras-Proteinen
der
zeigte, dass das Cystein
wird.
Lamin-Vprläuferproteine
dass der C-Terminus
wird das C-terminale Methionin
(Hancock
Onkogen-Produkten isoprenyliert
Laminproteinen proteolytisch abgespalten
bleibt
(1988)
et al.
auch
Isoprenderivat Farnesol modifiziert wird, wobei eine
*//Vo-Prozessierung
Tetrapeptidmotivs
vorliegende
Gruppe gehören
entsteht. Eine erst kürzlich veröffentlichte Studie
V.4.1.2. Proteolytische
Die
und bestimmte Unter¬
Proteine. Zur zweiten
Massenspektrometrie durchgeführte Strukturaufklärung
C-terminale
Proteinen bekannt, die
von
gewisse Sexfaktoren verschiedener Hefen
einiger GTP-bindender
einheiten
Gruppen
Tetrapeptidmotiv (CAAX)
dasselbe konservierte
sind dies
vor
von
wird. Bei der
abgespalten,
das
A- und
Proteolyse
Cystein
B-typischen
von
Lamin B2
des CXXM-Motivs
jedoch erhalten. Gegenwärtig ist nicht bekannt, ob die zwei Aminosäuren
zwischen dem Methionin und dem
Modifikation, die der Spaltung
wiederum
bei
den
Onkogenprodukte
Hancock etal.
zeigten,
B2 ähnlich sein könnte, wurde
beschrieben.
Der
drei Aminosäuren verkürzt
von
C-Terminus
(Guiterrez
dieser
etal. 1989,
Anderegg etal. (1988)
werden die drei C-terminalen Aminosäuren des a-Sexfaktors
Cystein
durch einen
Proteinen
Lamin
1989). Wie die Strukturaufklärungen
Saccharomyces
terminale
um
ebenfalls entfernt werden. Eine
von
ras-Proteinen
wird
Cystein
cerevisiae ebenfalls
wird ausserdem anschliessend an seiner
Methylester
(Clarke
posttranslationell abgespalten.
modifiziert
(Anderegg
et al.
1988).
(Chelsky
nachgewiesen. Allerdings
ebenfalls das C-terminale
et al.
1987)
wurden
Das C-
Carboxylgruppe
Auch bei den
etal. 1988, Guiterrez etal. 1989, Hancock etal.
Lamin B der Maus
von
1989)
ras-
und bei
Carboxyl-Methylierungen
ist noch abzuklären, ob bei diesen Modifikationen
Cystein
betroffen ist.
114
Gegenwärtig
eindeutig geklärt, wieso die Prozessierung
ist nicht
sowohl in vitro, als auch in vivo die
verändert. Jedenfalls kommt die
Lamin
war nur
Lamin
die reife Form
von
Mobilität dieses Proteins
der Mobilität nicht
aufgrund
produzierte, schneller migrierende
ergab die Analyse
mutanten
von
von
Lamin
B2-Proteinen
C4C)-Mevalonsäure
und der
Form
Mevalonsäurederivat
geschwindigkeit. Allerdings
selber
durch
der
zu
Veränderung der Migrations¬
Einbau eines 14C-Mevalonsäure-
sollte dann der
derivats in Lamin Bi. und in Lamin A-Vorläufer auch
gelelektrophoretischen Mobilität dieser
eine
Aenderung
gelelektrophoretischen Mobilität. Möglicherweise führt die Modifikation
nicht
der
Lamin B2 durch ein Mevalonsäurederivat modifiziert.
Korrelation zwischen dem Einbau
das
B2
B2 besitzt immer noch das C-terminale Methionin. Interessanterweise
Ausserdem
der
Veränderung
denn die in vitro
Proteolyse zustande,
von
elektrophoretische
von
zu
einer
Veränderung der
Proteine führen. Es ist aber zumindest
ausgeschlossen, dass die gleiche Modifikation bei verschiedenen
Proteinen nicht
zu
gleichen Aenderung
Proteolyse
Während die
terminalen
der
Aminosäuren
proteolytischen Schritt
et al.
terminalen
Cystein
führt, wird
zur
Entfernung
A
Lamin
Peptides
maximal drei C-
von
durch
neu
synthetisierten
einen
zusätzlichen
Lamin A mit der Kernhülle statt
1984, Lehner et al. 1986b) und führt
vermutete
Spaltstelle
Lamin B2
modifiziert. Diese zusätzliche Modifikation findet kurz
nach der Assoziation des
(Gerace
von
ihrer Mobilitäten führt.
von
ungefähr
Entfernung eines C-
2-3 kDa. Damit würde die
Isoprenylierung abgespalten.
wird die direkte
zur
Sequenzierung
am
Zur genauen
des C-Terminus
C-terminalen
Bestimmung
von
der
reifem Lamin A
nötig sein.
V.4.2.
Die
Mögliche
Funktionen der
vorliegenden Resultate
peptidmotiv
von
neu
Modifikationen
lassen vermuten, dass das C-terminale Tetra¬
Lamin B2 auf die
entsprechende CAAX-Box
fikation
posttranslationellen
gleiche
Art und Weise modifiziert wird wie die
der ras-Proteine. Für die
synthetisierter Laminproteine
posttranslationelle
wird deshalb
Modi¬
folgendes Modell
vorgeschlagen: alle Laminproteine mit carboxyterminalem CXXM-Motiv werden
kurz nach ihrer
prenyliert.
Synthese
Wie die in
an
freien Ribosomen
(Lehner
et al.
1986b) iso-
Figur 19 dargestellten Ergebnisse zeigen, folgt der
Isoprenylierung
ein
proteolytischer Schritt,
(wahrscheinlich)
drei
C-terminalen
isoprenylierte Cystein wird,
in
der
Aminosäuren
Analogie
zu
zur
führt.
Abspaltung
Das
von
endständige
den ras-Proteinen und den Hefe-
115
(Clarke
Sexfaktoren
anschliessend
etal. 1988, Gutierrez etal. 1989, Hancock etal.
Carboxylgruppe methyliert.
seiner freien
an
erfolgt die weitere proteolytische Spaltung
in
den
(Gerace
Zellkern
Beobachtung).
et al.
Bei diesem
von
Wie bereits erwähnt,
Lamin A erst nach dessen
1984, Lehner et al.
1986b,
Prozessierungsschritt, der
Laminproteine betrifft, wird ein C-terminales Peptid
von
1989),
nur
persönliche
die
2-3 kDa
Import
A-typischen
und damit das
gesamte CXXM-Motiv abgespalten.
Einzelne Schritte dieses Modells müssen noch durch weitere
Experimente
überprüft werden. Abgesehen davon ist der vorgeschlagenenProzessierungsAblauf konsistent mit der
von
im Falle
der Vorläufer
von
Lamin A
nur
Beck et al.
isoprenyliert
dieses Modells erklärt werden, wieso
methyliert sind (Chelsky
So
kaum
völlig
(1988) gemachten Beobachtung,
dass
ist. Ausserdem kann anhand
B-typische Laminproteine carboxy-
nur
1987).
etal.
verschiedene Proteine wie ras, Hefe-Sexfaktoren und Lamine haben
zufällig einen homologen Carboxyterminus und, wie die vorliegenden
Resultate
wahrscheinlich ähnliche oder gar identische Modifikationen
zeigen,
diesem stark konservierten
stellung,
Tetrapeptidmotiv.
Funktion(en)
wie
der
modifizierte
Proteingruppen erfüllt.
Voraussetzung
Cysteinresten
und
Plasmamembran
für die
ist ihrerseits für die
biologische
der
ist
Palmitylierung
Assoziation
etal.
Laminproteine dieselbe(n)
Carboxyterminus
anschliessende
(Hancock
der
Falle der ras-Proteine
Im
für die
Es ist eine interessante Vor¬
Carboxyterminus
dass der modifizierte
dieser
1989). Die
an
beiden
die
von
anderen
Isoprenylierung
benachbarten
Onkogenprodukte
mit
der
Assoziation mit der Plasmamembran
Aktivität der ras-Proteine
wichtig (Willumsen
et al.
1984, Buss und Sefton 1986, Hancock etal. 1989). B-typische Laminproteine
besitzen keine
etal. 1987,
sind keine
Cysteinreste
Höger
in der Nähe des
etal. 1988, Peter etal.
1989, Vorburger etal. 1989). Zudem
experimentellen Hinweise für eine Palmitylierung der Laminproteine
bekannt. Es ist eine attraktive
wesentliche Faktor für die
Vorstellung, dass der Isoprenrest allein der
Verankerung
Kernhülle ist. Der Befund, dass die
am
isoprenyHerten C-Terminus (Krohne
C-Terminus
von
neu
synthetisierter Laminproteine
Abspaltung
eines 2-3 kDa grossen
in der
Peptides
Lamin A erst nach der Assoziation dieses Proteins mit der
Kernhülle stattfindet
(Gerace
et al.
1984, Lehner
et al.
1986b),
stützt diese
Interpretation.
B-typische Laminproteine
vorgeschlagen wurde,
(Worman
et al.
an
ein
könnten
auch,
integrales
wie
von
anderem
Gruppen
Protein der Kernmembran binden
1988, Senior und Gerace 1988). Es ist nicht ausgeschlossen,
116
dass sowohl der
Isoprenrest, als
auch
integrale Membranproteine
Interaktion der Lamina mit der Kernmembran
der
Kernmembran
bewirkt
anschliessende
Bindung
und
festgestellt (Hancock
Verankerung
integrales Membranprotein
1989),
et al.
allerdings nicht,
terminal-verkürzte Variante
wird.
von
Möglicherweise
CHO-Zellen
Laminproteine
wie menschliches Lamin C, das eine C-
Lamin A darstellt, korrekt in der Kernlamina
bilden Lamin A und C kurz nach ihrer
Vorläufer eine
transportiert. Die Transfektion
im
(1986b)
Gründen unwahrscheinlich
im
Zytoplasma verhindern. Eine
vor
vorzeitig oligomerisiert
dafür, dass
vor
und zweitens lieferten
allem
die
mit mutierten menschlichen Lamin A-Klonen
erwähnte Funktion der Lamin
"Envzmologie"
Der Lamin
der
zwei
N-terminale
Georgatos
Domäne
von
Experimenten
et al.
für die
Transfektionen
sprechen ebenfalls gegen die
stark
noch im Nukleus akkumulieren
1988).
Lamin-Prozessierung
B2-Vorläufer wird kurz (T1/2=3Min.) nach seiner Synthese noch im
Zytoplasma prozessiert (Lehner
Vorläufers in reifes Protein
et al.
etal.
1986b),
dagegen findet
die
Umwandlung
des Lamin A-
wahrscheinlich im Zellkern statt
1984, Lehner et al. 1986b). Die vorliegenden Ergebnisse der
Arbeiten mit dem
darüber
aus
A-Extension, denn selbst Proteine mit einem
verkürzten Tail konnten in diesen
und McKeon
allem
sein: erstens musste dann erklärt werden, wieso
zu
Polymerisation der Laminproteine wichtig ist. Die Ergebnisse
(Loewinger
Dimerisierung der
könnte das zusätzliche Element im Lamin A-
vorzeitige Oligomerisierung
Evidenz
von
Zytoplasma (Loewinger und McKeon 1988).
solche Funktion scheint aber für den Vorläufer-Anteil
Lamin C nicht
Synthese
(Chinese Hamster Ovary Cells) mit mutierten cDNS-Klonen
Nach Lehner ef al.
(Gerace
die
zustande kommt. Ein
menschlichem Lamin A lieferte tatsächlich Hinweise für eine
V.4.3.
durch
Palmitylrest erfolgt.
Heterodimere und werden als solche in den Kern
(1988)
erst
mit der
wobei in diesem Falle die zusätzliche
in der Plasmamembran durch einen
Dieses Modell erklärt
von
Laminproteinen
endgültige Verankerung
die
ein
an
von
mehrstufiger Bindungsprozess wurde bei einigen ras-Proteinen
ähnlicher
plaziert
beteiligt sind. Es ist denkbar, dass
einen ersten Schritt der Interaktion
Isoprenrest
der
an
hinaus
Fibroblastenhomogenat bestätigen diese Befunde und geben
Hinweise
auf
die
Lokalisierung
enzymatischen Aktivitäten. Die Lamin A-Protease
war
der
entsprechenden
bei diesen
ausschliesslich in der Kernfraktion nachweisbar, die Lamin
Experimenten
B2-Prozessierung
117
wurde
Die
nur
dagegen
zytoplasmatischen
in der
nur
Fraktion beobachtet.
Fibroblastenhomogenat
des Lamin A- Vorläufers konnte im
Prozessierung
durch Metallchelatoren
partiell gehemmt
Es ist bekannt, dass
werden.
gewisse Chelatoren wie o-Phenanthrolin unspezifische Effekte,
Destabilisierung
1979).
Die
Chelatoren
dass ein
Ein
Proteasen durch
von
(EDTA,
o-Phenanthrolin und
Metall-abhängiges Enzym
Verbindungen gehemmt
dass Dithiothreitol im
werden
Lamin
(Barret
aber sehr dafür,
beteiligt ist.
Prozessierung
des Lamin B2-
bemerkenswert, dass
ist
B2-Vorläufers nicht beeinflusst,
(Barret 1979).
Retikulozytenlysat
Enzyme
durch
Thiol-
Es ist nicht auszuschliessen,
unstabil ist oder dass
vorwiegend
es
an
Lysats bindet und dadurch nicht mehr als Chelator
des
Komponenten
Aenderung des Migrationsverhaltens
wirkt. Da die
offenbar nicht durch die
C-Terminus zustande kommt, kann angenommen werden, dass ein
Metall-abhängiges Enzym
ist.
der
an
Metall-abhängigen
viele
bekannterweise
am
dieser Modifikation
ist auch
Prozessierung des
Dithiothreitol die
Spaltung
an
Dithiothreitol) spricht
Retikulozytenlysat beteiligt. Es
im
Vorläufers
andere
aufweisen können
,
Hemmung der Spaltung des Lamin A-Vorläufers durch verschiedene
Metall-abhängiges Enzym
obwohl
Denaturierung
wie z.B. die
an
der kovalenten Modifikation
Es ist eine interessante
Hypothese,
Mevalonsäurederivat durch die
dass die
von
Lamin B2
beteiligt
Modifikation durch das
Komplexbildner gehemmt wird. Erwartungs¬
gemäss würden dann die Chelatoren auch die Modifikation des Lamin AVorläufers durch das Mevalonsäurederivat verhindern. Es ist denkbar, dass die
Isoprenylierung
ein
Modell
geschlagenes
säurebiosynthese
tatsächlich
gesehen
Folge
zu
Signal
Hemmung
TPCK
Hemmung
der
vor¬
Mevalon-
(1988) gezeigt hatten,
der Lamin A-Protease durch Chelatoren auch die
einzige Hühneriaminprotein,
und
TLCK
modifiziert
Proteindomäne erst nach der
für die Modifikation
zugänglich
entweder durch bestimmte
Hemmstoffe
Die
(vgl.
Isoprenylierung sein.
Reifes Lamin A ist das
Interaktion
V.4.4.).
Kap.
ist
einer dramatischen Akkumulation des Lamin A-Vorläufers. So
der verhinderten
entsprechende
nachfolgende Proteolyse
in Zellkulturen führte, wie Beck et al.
könnte die
Hemmstoffe
in
für die
Dies
spezifischen
bedeutet, dass die
Spaltung des
Lamin A-Voriäufers
wird. Offenbar wird die Konformation des Proteins
Prozessierungsschritte (Proteolyse?)
mit der bestehenden
vor
wird.
das durch die
Lamina stark verändert.
allem mit Histidinresten
interagieren,
oder durch die
Da die
beiden
wäre es interessant
zu
prüfen, ob die Modifikation in der für Lamin A-Proteine typischen Histidin-reichen
Domäne stattfindet. Falls dies zutrifft,
ergäbe
sich vielleicht eine
Möglichkeit, die
118
Funktion dieses Motivs
V.5. Das
neue
zu testen.
P1
Kernhüllenantigen
Mit Hilfe eines monoklonalen
Antikörpers
Kernantigen gefunden. Aufgrund
der in indirekten
Immunfluoreszenzexperi¬
grösste Teil dieses Antigens in der Kernhülle lokalisiert ist. Diese Annahme
konnte durch die
Immunfluoreszenzfärbung
Gewebe wurden
ca
10% des
gefunden. Dabei handelt
Vergleich
den
zu
zytoplasmatische
in der
Antigens
um neu
somatischem
Fraktion
et
al.
in den Zellkern
1986b)
neu
ist
der
synthetisierte
transportiert.
P1-Antikörper erzeugte auf der Kernoberfläche ein auffallend punktiertes
Färbemuster. Eine ähnliche
Färbung
Kernporen-spezifischen Antikörpern
Davis und
war
in
Immunfluoreszenzexperimenten mit
beobachtet worden
(Gerace
bereits bekannten
Snow et
a7.1987).
Porenkomplex-Antigene besitzen (Davis
Das P1
-Antigen unterscheidet sich
Porenkomplexproteinen dadurch,
reagiert.
In
Antigen
P1-Antigen,
Es
wird
biochemischen
nicht
allen bisher bekannten
mit
Weizenkeimagglutinin
Abklärung
Eigenschaften
Die
der
der
(S. Bailer,
hypothetischen Kerngerüsts
dieses Proteins genauer
Laminproteine und
der Funktion ebenfalls
von
anderer
Hilfe des
von
zu
sein.
untersuchen und mit
Kernhüllenantigene
Elekronenmikroskops
Bedeutung
zu
wird
sein. Erst kürzlich
Rattenleberzellen ein
vergleichbarem Molekulargewicht (75 kDa) gefunden (Senior
Antigen blieb selbst
sein
möglichen Funktionen wichtig sein, die
wurde in der inneren Kernmembran
Dieses
zu
werden.
seiner charakteristischen Unlöslichkeit könnte
präzise Lokalisierung mit
Aufklärung
mit Hilfe der
Kernporen nachgewiesen
wie die Kernlamina, Teil eines
Eigenschaftein
für die
es
und Blobel 1986,
von
scheint eher mit der Kernmembran asoziiert
für die
vergleichen.
dass
nicht in den
persönliche Mitteilung). Aufgrund
das
1982,
die auch die
vorläufigen Experimenten konnte das P1-Antigen
Immunelektronenmikroskopie
Dieses
et al.
1986, Snow et al. 1987). Das P1-Antigen wird in der
Blobel
Porenkomplex-Laminafraktion angereichert, eine Eigenschaft,
den
werden
synthetisiertes Protein.
relativ gross. Das
vergleichsweise langsam
von
zytoplasmatischen
(Lehner
Laminproteinen
P1-Antigens
Kryoschnitten bestätigt
Fraktionierung
sich wahrscheinlich
Anteil des
Protein wird offenbar
Der
es
von
Bei der
(S. Bailer, persönliche Mitteilung.)
Im
neues
Randfärbung der Zellkerne ist anzunehmen, dass
menten beobachteten starken
der
wurde in Hühnerzellen ein
Protein mit
und Gerace
1988).
nach der Extraktion mit Puffern, die sowohl Salz in
119
hoher Konzentration als auch Triton X-100 enthielten, in der unlöslichen Lamina-
potentieller Membrananker für die Kernlamina
Fraktion und ist deshalb als
bezeichnet worden Das
P1-Antigen ist
vorhanden als dieses 75 KDa-Protein,
was
gegen eine
Während der Mitose bindet das P1
kondensierte Chromatin zurück,
Laminproteine
vergleichbare Funktion
einem
Rolle.
Aufgrund der
wird
Zeitpunkt also,
Zytoplasma
wo
von
Newport (1987) mit
in »//rro-Versuchen
vor
spielt
wichtige
erzielten
Anlagerung
der
das
grösste Teil der
verteilt ist. Vielleicht
Chromatin
kondensierte
das
vorstellbar, dass ein Antigen wie P1
beteiligt
der
an
einer solchen
Modifikation des
ist.
Perspektiven
Die Primärstrukturen der drei
Hühnerlaminproteine A, B-|
die biochemischen Unterschiede zwischen A- und
Eigenschaften
Mutagenese
von
und
postulierten Funktionen
Entwicklung
während der
(Schatten
nun
B2 bestätigten
die
Laminproteine
der
bestimmten Motiven und Domänen
Die Zelle besitzt die
und
B-typischen Laminproteinen
auf molekularer Ebene. Die isolierten cDNS-Klone eröffnen
und
der
an
auf eine bisher unbekannte Weise modifiziert. Es ist durchaus
Laminproteine
Chromatins
Anaphase
bereits in der
beim Wiederaufbau der Kernhülle nach der Mitose eine
Antigen
Resultate
zu
-Antigen
noch über das ganze
dieses
die
geringerer Menge
Polypeptide spricht.
der beiden
V.6.
in der Zelle in viel
zu
Möglichkeit,
durch
gezielte
studieren.
Möglichkeit, die Zusammensetzung der Kernlamina
der Keimzellen und des
Embryo
stark
zu
modulieren
etal. 1985, Krohne und Benavente 1986, Lehner etal. 1987, Stewart
Burke
1987).
Die
Lamina besitzt das
Kornpaktierungs-Muster des Chromatins
und auf diese Weise die Genaktivität
zu
Potential, ein übergeordnetes
fixieren
(Newport
beeinflussen
zu
(Newport
und Forbes
1987)
und Forbes 1987,
Nigg 1988). Es wurde deshalb verschiedentlich die Hypothese formuliert, dass
die
Aenderung
der
Lamina-Zusammensetzung
während
der
Embryonal¬
entwicklung eine fundamentale Aenderung der Chromatin-Organisation
Folge
hat
und
differentiellen
damit
einen
Genexpression
1987).
Organisation
des Chromatins
Bindung
des Chromatins
leistet
zu
Beitrag
zur
(Blobel 1985, Cook
Wichtigkeit
Lehner et al.
Um die
wesentlichen
der
Entstehung
und
zur
der
Laskey 1984,
Laminazusammensetzung für die
bestätigen, wird
beteiligte(n) Domäne(n)
zu
es
nötig sein, die
an
der
kennen. Da die Zunahme
120
Aenderung der Lamina-Zusammen-
des Lamin A-Gehalts die markanteste
setzung während der Embryonalentwicklumg
und
von
von
Säugern (Stewart und Burke 1987, Röber
insbesonders interessant sein,
typische Laminproteine
scheiden. Um das Verhalten
1989) darstellt,
etal.
Eigenschaft, Chromatin
entwickelten in
vor
allem
Bindung
an
wrro-Systeme studiert
wfro-Systeme,
in
jene
zu
wird
es
binden, unter¬
gezielt mutierten Laminproteinen
von
studieren, bietet sich die Methode der Transfektion
Andererseits könnte die
1987)
et al.
untersuchen, ob und inwiefern sich A- und B-
zu
ihrer
in
Vögeln (Lehner
in vivo
Zellkulturen
von
zu
an.
das Chromatin auch mit Hilfe der neulich
werden. Wertvoll wären in dieser Hinsicht
bei
Schritte
einzelne
denen
des
Kern-
(Burke
und Gerace
Mit mutierten cDNS-Klonen Hesse sich eine weitere wesentliche
Eigenschaft
hüllenaufbaus
am
Ende der Mitose studiert werden können
1986, Newport 1987, Fisher 1987).
membran.
Aufgrund
Modifikation für die
der
Verankerung
nämlich die
der Kernlamina studieren,
in
der
Lipid-Doppel-
vorliegenden Resultate könnte eine posttranslationelle
Bindung
an
die Kernmembran verantwortlich sein. Mit Hilfe
der in wfro-Translation kann sowohl der Vorläufer
von
Lamin B2 als auch das
durch ein Produkt des Mevalonsäuremetabolismus modifizierte reife Protein
synthetisiert
werden. Damit eröffnet sich die
postulierte
Modifikation die
an
mitotische Vesikel
sich mit
zu
von
eine
testen, ob diese
untersuchen. In einem solchen in
spezifische
zum
modifiziertem und nicht-modifiziertem Lamin
gezielt mutierten Proteinen vielleicht
Laminproteine
zu
Funktion eines Membranankers besitzt. Es ist
Beispiel denkbar, die Bindung
B2
Möglichkeit,
auch abklären, ob
Domäne für die
Membranprotein besitzen. Die Bedeutung
des
wYro-System
Bindung
an
ein
Hesse
B-typische
integrales
isoprenyiierten Cysteins
für die
korrekte Interaktion der Lamina mit der inneren Kernmembran könnte aber auch
durch
Transfektion
von
Säugerzellen
mit
gezielt
mutierten
cDNS-Klonen
untersucht werden.
Der genaue Aufbau der nativen Struktur der Kernlamina ist bis heute nicht
bekannt. Es scheint
einzig Einigkeit
darüber
parallelen, umeinander gewundenen
Grundbaustein bilden
(Aebi
zu
bestehen, dass Dimere
von
(Coiled Coils)
den
Laminmolekülen
etal. 1986, Krohne et al. 1987,
Parry etal. 1987).
Ferner lassen in wYro-Studien vermuten, dass die Laminmoleküle
Heteropolymere bilden (Krohne
Studium des Verhaltens
von
möglich sein, Domänen
zu
wichtig
sind.
etal. 1987,
mutierten
päferentiell
Georgatos etal. 1988). Durch
Laminproteinen
das
in der Zelle, sollte
es
identifizieren, die für den Aufbau der Kernlamina
121
Bis heute ist relativ
bekannt. Den
bisher keine
neuen
wenigen
eindeutige
bisher identifizierten
Funktion
Antigenen
zugeschrieben
wie z.B. des
Kernhüllenantigenen,
klonalen
Zusammensetzung der Kernmembran
über die
wenig
mit Hilfe
von
wichtig sein,
die biochemischen
deren Verhalten in der Zelle genauer
zum
zu
Beispiel darin, P1-spezifische Antikörper
Wiederaufbau der Kerhülle
cDNS-Klonen
Eigenschaften
zu
liefern. Es
Antigene und
Polypeptides
in mitotische Zellen
auf den
zu
postmitotischen
studieren.
Antikörper könnten auch die Isolation
erleichtern.
solcher
zum
untersuchen. Ein interessanter Ansatz
und dadurch den Einfluss dieses
Monoklonale
Zellkompartiments
von
mono¬
Antikörpern wird mit Sicherheit einen wesentlichen Beitrag
wird daher
injizieren
werden. Die Identifikation
P1-Antigens,
Verständnis der Struktur und Funktionen dieses
bestünde
der Kernhülle konnte
Aus
der
von
Primärstruktur und
P1 -kodierenden
Voraussagen
zur
Sekundärstruktur Hessen sich dann unter Umständen Hinweise auf die Funktion
dieses
Antigens gewinnen.
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PgfrliKatignen
Vorburger, K., Lehner, C.F., Peter, M., Kitten, G.T., Eppenberger, H.M., Maridor, G.
and
Nigg,
E.A.
(1989)
Experientia 45, 36,
Structure and
processing of chicken
vitro
higher
processing
proteins
Abstract
Vorburger, K., Lehner, C.F., Kitten, G.T., Eppenberger,
A second
nuclear lamin
vertebrate
B-Type
of chicken lamin
H.M. and
Nigg, E.A. (1989)
lamin: cDNA sequence determination and in
B2. J. Mol. Biol.
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Peter, M., Kitten, G.T., Lehner, C.F., Vorburger, K., Bailer, S.M., Maridor, G. and
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E.A.
(1989) Cloning
lamins A and Bi and
and
sequencing
comparison of
the
of cDNA clones
primary
encoding
chicken
structures of vertebrate A- and B-
type lamins. J. Mol. Biol. 222, 393-404.
Vorburger, K., Kitten, G.T. and Nigg,
proteins by
requires
press).
the
a
E.A.
mevalonic acid derivative
cysteine residue of
the
(1989)
occurs
Modification of nuclear lamin
in
carboxy-terminal
reticulocyte lysates
and
CXXM motif. EMBO J.
(in
135
Lebenslauf
Geboren
1965-1971
Primarschule in Buchs
1971-1973
Sekundärschule in Buchs
1973-1977
Gymnasium Sargans,
1978-1980
Studium
an
der
Abteilung
1980-1984
Studium
an
der
Abteilung für Naturwissenschaften der
am
17. Januar in Buchs
(SG)
1958
Abschluss mit Matura
Typus C
für Landwirtschaft der ETH in Zürich
ETH in
Zürich, Teilrichtung Ac (Experimentelle Biologie)
1985-1989
Anstellung
als Asistent II
am
Institut für
Zürich, Dissertation unter der Leitung
berger
und PD Dr. E.A.
1987
Heirat mit Nevin Sadek
1989
Geburt einer Tochter
Nigg
(Eva Katharina)
Zellbiologie
von
der ETH
Prof. Dr. H.M.
Eppen¬