Taurolidin als Kombinationspartner für die Behandlung von
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Ruhr-Universität Bochum PD. Dr. med. Ansgar Michael Chromik Dienstort: Asklepios Klinikum Harburg, Hamburg Abteilung für Allgemein- und Viszeralchirurgie Taurolidin als Kombinationspartner für die Behandlung von humanen Pankreaskarzinomzellen mit Gemcitabin und rhTRAIL Inaugural-Dissertation Zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum Vorgelegt von Christina May aus Gelsenkirchen 2016 Dekan: Prof. Dr. med. Albrecht Bufe Referent: PD Dr. med. Ansgar Michael Chromik Korreferent: Prof. Dr. med. Roland Schroers Tag der mündlichen Prüfung: 20.06.2017 Für meine Eltern Inhaltsverzeichnis 1EinleitungundHintergrund.................................................................................................................8 1.1. Einleitung ...................................................................................................... 8 1.2. Hintergrund ................................................................................................... 8 1.2.1. Das Pankreaskarzinom .......................................................................... 8 1.2.2. rhTRAIL/Apo2-Ligand .......................................................................... 11 1.2.3. TRD ...................................................................................................... 13 1.2.4. Gemcitabin ........................................................................................... 13 2.Fragestellung..........................................................................................................................................15 3.MaterialundMethoden......................................................................................................................16 3.1. Material ....................................................................................................... 16 3.1.1. Zelllinien und Zellkulturmedium ............................................................ 16 3.1.2. Reagenzien .......................................................................................... 16 3.2. Methoden .................................................................................................... 16 3.2.1. Zellkultur ............................................................................................... 16 3.2.2. MTT Zellviabilitätstest .......................................................................... 18 3.2.3. BrdU Proliferationsassay ...................................................................... 19 3.2.4. Durchflusszytometrie ............................................................................ 20 3.2.5 Zellmorphologie ..................................................................................... 22 3.2.5. Statistische Analyse ............................................................................. 22 4.Ergebnisse................................................................................................................................................23 4.1. Experimente zur Dosisfindung für TRD als Einzelsubstanz ....................... 23 4.1.1. Detektion und Quantifizierung von Apoptose und Nekrose durch die Durchflusszytometrie ...................................................................................... 23 4.1.2. Fazit ..................................................................................................... 29 4.2. Experimente zur Dosisfindung für rhTRAIL als Einzelsubstanz ................. 29 4.2.1. Detektion und Quantifizierung von Apoptose und Nekrose durch die Durchflusszytometrie ...................................................................................... 30 4.2.2. Fazit ..................................................................................................... 35 4.3. Experimente zur Dosisfindung für Gemcitabin als Einzelsubstanz ............. 35 4.3.1. Detektion und Quantifizierung von Apoptose und Nekrose durch die Durchflusszytometrie ...................................................................................... 35 4.3.2 Fazit ...................................................................................................... 40 4.4. Experimente zum kombinierten Einsatz von TRD und rhTRAIL ................. 40 1 4.4.1. BxPC3-Zellreihe ................................................................................... 40 4.4.2. AsPC1-Zellreihe ................................................................................... 46 4.5. Experimente zum kombinierten Einsatz von TRD und Gemcitabin ............ 52 4.5.1. BxPC3-Zellreihe ................................................................................... 52 4.5.2. AsPC1-Zellreihe ................................................................................... 57 5.Diskussion................................................................................................................................................61 5.1. Studienaufbau ............................................................................................. 61 5.1.1. Auswahl der Zelllinien .......................................................................... 61 5.1.2. Auswahl der Substanzen ..................................................................... 62 5.1.3 Studien zum klinischen Einsatz von TRD ............................................. 63 5.1.4 Studien zum klinischen Einsatz von TRAIL ........................................... 65 5.2. Ergebnisse zur Dosisfindung für die Einzelsubstanzen .............................. 66 5.2.1. Auswahl der Methode .......................................................................... 66 5.2.2. Ergebnisse für TRD als Einzelsubstanz ............................................... 67 5.2.3. Ergebnisse für rhTRAIL als Einzelsubstanz ......................................... 67 5.2.4. Ergebnisse für Gemcitabin als Einzelsubstanz .................................... 68 5.3. Ergebnisse der Kombinationsexperimente ................................................. 69 5.3.1. Auswahl der Methoden ........................................................................ 69 5.3.2. Ergebnisse zur Substanzkombination TRD mit rhTRAIL ..................... 70 5.3.3. Ergebnisse zur Substanzkombination TRD mit Gemcitabin ................ 71 5.4. Ausblick ...................................................................................................... 71 6.Zusammenfassung................................................................................................................................72 7.Literaturverzeichnis............................................................................................................................73 8.Anhang.......................................................................................................................................................83 2 Abkürzungsverzeichnis 5FU 5-Fluoruracil Abb. ANOVA Apo2 Abbildung Analysis of variance Apoptosis-inducing ligand Bcl2 BrdU bzw. B-cell lymphoma 2 Bromdesoxyuridin beziehungsweise Ca. CA19-9 CDKN2A cm² CO2 CRM CT circa Carbohydrate-Antigen 19-9 DD DMSO DR dsDNA death domains Dimethylsulfoxid death receptor Doppelstrang Desoxyribonukleinsäure ERCP Endoskopisch retrograde CholangioPankreatikographie FACS FBS FITC Fluorescence activated cell sorting fetales Kälberserum Fluoresceinisothiocyanat g ggf. Gewichtskraft gegebenenfalls IPMN Intraduktal papillär muzinöse Neoplasie l Liter mm mM ml MRCP MRT MTT Millimeter Millimolar Milliliter Magnetresonanz-Cholangiopankreatikographie Magnetresonanztomographie 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazoliumbromid NF-kB ng nm Nuclear factor KappaB Nanogramm Nanometer cyclin-dependent kinase Inhibitor 2A Quadratzentimeter Kohlenstoffdioxid zirkumferentieller Resektionsrand Computertomographie 3 ns nicht signifikant PanIN PI POD PS Pankreatische intraepitheliale Neoplasie Propidium Iodid Peroxidase Phosphatidylserin rhTRAIL R RPMI rekombinantes humanes TRAIL Rezeptor Roswell Park Memorial Institute Tab. TNF TRAIL TRD Tabelle Tumornekrosefaktor Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand Taurolidin U Unit z.B. zum Beispiel µg µl µmol Mikrogramm Mikroliter Mikromol 4 Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Reduktion vitaler Zellen durch TRD (100, 250, 500, 750, 1000 µmol/l) .... 24 Abb. 2: Induktion von Apoptose durch TRD (100, 250, 500, 750, 1000 µmol/l) .... 25 Abb. 3: Induktion von Nekrose durch TRD (100, 250, 500, 750, 1000 µmol/l) ...... 26 Abb. 4: Reduktion vitaler Zellen durch TRD (10, 100, 250, 500, 1000 µmol/l) ...... 27 Abb. 5: Induktion von Apoptose durch TRD (10, 100, 250, 500, 1000 µmol/l) ...... 28 Abb. 6: Induktion von Nekrose durch TRD (10, 100, 250, 500, 1000 µmol/l) ........ 29 Abb. 7: Reduktion vitaler Zellen durch TRAIL (50, 100, 250, 500 ng/ml) .............. 31 Abb. 8: Induktion von Apoptose durch TRAIL (50, 100, 250, 500 ng/ml) .............. 32 Abb. 9: Induktion von Nekrose durch TRAIL (50, 100, 250, 500 ng/ml) ................ 33 Abb. 10: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRAIL (50, 100, 250, 500 ng/ml) .................................................................... 35 Abb. 11: Reduktion vitaler Zellen durch Gem (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 µM) ........... 36 Abb. 12: Induktion von Apoptose durch Gem (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 µM) ........... 37 Abb. 13: Induktion von Nekrose durch Gem (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 µM) ............. 38 Abb. 14: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch Gem (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 µM) ................................................................... 40 Abb. 15: Reduktion der Zellaktivität (MTT-Test nach 24 Stunden) durch TRD, TRAIL und Kombinationen ............................................................................. 42 Abb. 16: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, TRAIL und Kombinationen .................................................................... 44 Abb. 17: Proliferationshemmung durch TRD, TRAIL und Kombinationen ............ 46 Abb. 18: Reduktion der Zellaktivität (MTT-Test nach 24 Stunden) durch TRD, TRAIL und Kombinationen ............................................................................. 48 Abb. 19: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, TRAIL und Kombinationen .................................................................... 50 Abb. 20: Proliferationshemmung durch TRD, TRAIL und Kombinationen ............ 52 Abb. 21: Reduktion der Zellaktivität (MTT-Test nach 24 Stunden) durch TRD, Gem und Kombinationen ........................................................................................ 54 Abb. 22: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, Gem und Kombinationen ...................................................................... 55 Abb. 23: Proliferationshemmung durch TRD, Gem und Kombinationen ............... 57 Abb. 24: Reduktion der Zellaktivität (MTT-Test nach 24 Stunden) durch TRD, Gem und Kombinationen ........................................................................................ 59 5 Abb. 25: Proliferationshemmung durch TRD, Gem und Kombinationen ............... 60 6 Abbildungsverzeichnis Anhang Abb. A 1: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, TRAIL und Kombinationen (BxPC3-Zellreihe) ........................................ 84 Abb. A 2: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, TRAIL und Kombinationen (AsPC1-Zellreihe) ........................................ 86 Abb. A 3: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, Gem und Kombinationen (BxPC3-Zellreihe) .......................................... 86 7 1EinleitungundHintergrund 1.1.Einleitung Das Pankreaskarzinom gehört zu den aggressivsten Tumorerkrankungen mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 8-9 %. Der einzige kurative Therapieansatz ist die komplette chirurgische Resektion. Allerdings zeigen nur ca. 20 % der Patientin bei Diagnosestellung ein Stadium, in dem eine chirurgische Komplettresektion möglich erscheint. In den letzten 20 Jahren ist Gemcitabin (Gem) der Goldstandard in der Chemotherapie des duktalen Pankreaskarzinoms geworden, sowohl im palliativen als auch im adjuvantem Gebrauch. (Burris, Moore et al. 1997, Haller 2003, Oettle, Post et al. 2007, O'Reilly 2009) Da allerdings die Erfolgsraten und die 5-Jahres-Überlebensrate weiterhin gering bleiben wurden andere, in der Tumortherapie gängige Cytostatika wie 5FU, Cisplatin und Oxaliplatin, sowie zielgerichtete Therapeutika wie der selektive Tyrosinkinasehemmer Erlotinib als Kombinationspartner in der Therapie mit Gemcitabin versucht. (Kosuge, Kiuchi et al. 2006) Allerdings zeigen kombinierte Therapien mit Gemcitabin häufig eine hohe Toxizität mit ausgeprägten Nebenwirkungen. Dies kann zu notwendiger Dosisreduktion oder sogar zum Beenden der Therapie führen. Deswegen ist es erforderlich, dass andere Chemotherapeutika als Einzeltherapie oder als mögliche Kombinationspartner mit Gemcitabin gefunden werden. 1.2.Hintergrund 1.2.1.DasPankreaskarzinom 1.2.1.1.Epidemiologie,ÄtiologieundDiagnostik Die Inzidenz für das Pankreaskarzinom in Deutschland beträgt ca. 5-10/100000 Einwohner pro Jahr. Mit ca. 16000 Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland gehört das Pankreaskarzinom zu den häufigsten Karzinomerkrankungen in Deutschland (Parkin, Bray et al. 2005, Haberland, Bertz et al. 2010) wobei Männer 8 etwas häufiger als Frauen erkranken. Der Erkrankungsgipfel liegt zwischen dem 60. und 80. Lebensjahr. Mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von ca. 8-9 % gehört das Pankreaskarzinom zu den Krebserkrankungen mit einer sehr schlechten Prognose (Tannapfel 2010) und ist in Deutschland die vierthäufigste Krebstodesursache. Das mittlere Erkrankungsalter betrug im Jahr 2010 für Frauen 71 Jahre und für Männer 75 Jahre. (Jemal, Siegel et al. 2010) Die Ätiologie ist bisher nicht vollständig geklärt, wobei sich Hinweise darauf ergeben, dass das Pankreaskarzinom aus prämalignen Vorstufen, wie der intraepithelialen Neoplasie (PanIN) oder intraduktalen papillär-muzinösen Neoplasie (IPMN) entstehen kann. (Adler, Seufferlein et al. 2007, Hruban, Maitra et al. 2007) Als sichere Risikofaktoren für die Erkrankung eines Pankreaskarzinom gelten eine familiäre Belastung (Verwandte ersten Grades mit einem Pankreaskarzinom) (Tersmette, Petersen et al. 2001, Permuth-Wey and Egan 2009), Rauchen und erhöhter Alkoholkonsum, starkes Übergewicht sowie eine chronische Pankreatitis. (Durbec, Chevillotte et al. 1983, Whitcomb and Pogue-Geile 2002, Chang, Corey et al. 2015) Patienten mit einem Diabetes mellitus Typ 2 haben ebenfalls ein erhöhtes Erkrankungsrisiko. Auch für Patienten mit genetischen Syndromen, wie zum Beispiel dem Peutz-Jeghers-Syndrom ist das Risiko an einem Pankreaskarzinom zu erkranken erhöht. (Canto 2007) Derzeitige Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Mutationen in bestimmten Genen (z.B. Mutationen im K-RAS- oder CDKN2A-Gen) die Karzinogenese begünstigen. Ca. 95% der Pankreaskarzinome gehen aus Zellen des exokrinen Anteils hervor, wobei davon ca. 90% von den Duktuli ausgehen. Da das Pankreaskarzinom im frühen Stadium allenfalls unspezifische Symptome aufweist erfolgt die Diagnose oft erst im fortgeschrittenen Stadium. Die Symptomatik ist abhängig vom Sitz des Tumors. 60% der Pankreaskarzinome entstehen im Kopfbereich des Organs, ca. 30% im Körper- und Schwanzbereich. Pankreaskopfkarzinome können durch eine Kompression der extrahepatischen Gallenwege zu einer Gallenabflusstörung mit schmerzlosem Ikterus führen und werden so eventuell früher klinisch auffällig, was zu einer günstigeren Prognose führt. Unspezifische Symptome des Pankreaskarzinoms sind Appetitlosigkeit und Gewichtsverlust, (gürtelförmige) Oberbauchschmerzen und Rückenschmerzen. Kennzeichnend für das Pankreaskarzinom ist eine relativ frühe Metastasierung. Zur klinischen Diagnostik bei Verdacht auf ein Pankreaskarzinom zählen neben 9 Anamnese und allgemeiner körperlicher Untersuchung die Oberbauchsonographie, die CT-Untersuchung (Computertomographie), die MRT (Magnet-Resonanz-Tomographie), gegebenenfalls in Kombination mit der MRCP (Magnetresonanz-Cholangiopankreatikographie), die Endosonographie ggf. mit Feinnadelpunktion (endoskopische und bei retrograde ausgeprägter Cholestase auch Cholangiopankreatikographie) mit die ERCP Stenteinlage. (Ardengh, de Paulo et al. 2003, Adler, Seufferlein et al. 2007) Der für das Pankreaskarzinom infrage kommende Tumormarker CA19-9 ist für die primäre Diagnostik wenig hilfreich und wird eher in der Verlaufskontrolle eingesetzt. (Steinberg 1990, Goggins 2005, Buxbaum and Eloubeidi 2010, Duffy, Sturgeon et al. 2010) 1.2.1.2.Therapie Der einzige kurative Therapieansatz des Pankreaskarzinoms ist die komplette chirurgische Resektion Resektionsrand (CRM) (R0) – möglichst von > 1mm - mit einem einschließlich zirkumferentiellen des regionalen Lymphabflussgebietes, wobei sich das Ausmaß der Operation nach der Lokalisation des Tumors richtet. (Adler, Seufferlein et al. 2007) Insgesamt zeigen allerdings nur ca. 20 % der Patienten ein resektables Stadium. (David, Lepage et al. 2009) Aufgrund der hohen Rezidivrate und der geringen 5-JahresÜberlebensrate ist ein multimodales Therapiekonzept sinnvoll, welches auch im kurativen Therapieansatz eine adjuvante Chemotherapie beinhaltet. Die in den aktuell geltenden Leitlinien empfohlenen Therapieregime für die adjuvante Chemotherapie beinhalten als Standard Gemcitabin über sechs Monate. (Adler, Seufferlein et al. 2007, Oettle, Post et al. 2007) Auch in der additiven Situation (z. B. bei nicht kompletter R1-Resektion) ist Gemcitabin für 6 Monate empfohlen. Als Alternative für den adjuvanten Einsatz ist auch 5FU möglich. (Berlin, Catalano et al. 2002, Neoptolemos, Stocken et al. 2004) In der primär nicht-resektablen oder metastasierten Situation ist ein palliativer Therapieansatz notwendig, wobei neben der Lebensverlängerung vor allem die Linderung von tumorbedingten Symptomen und Erhöhung der Lebensqualität das Ziel ist. Patienten in adäquatem Allgemeinzustand sollte hierbei eine 10 Chemotherapie empfohlen werden. Gemcitabin ist hierbei wiederum der Goldstandard seit einer 1997 erschienen Studie. (Burris, Moore et al. 1997) Seitdem konnte in Metaanalysen ein Überlebensvorteil für Patienten nach Gemcitabin-Kombinationstherapie im Vergleich zur Gemcitabin-Monotherapie gezeigt werden (Sultana, Ghaneh et al. 2008), wobei hier als mögliche Kombinationspartner Oxaliplatin (Louvet, Labianca et al. 2005), Cisplatin (Heinemann, Quietzsch et al. 2006) oder Capecitabine (Herrmann, Bodoky et al. 2007) untersucht wurden. In der metastasierten Situation ist auch eine Kombination von Gemcitabin mit dem Tyrosinkinasehemmer Erlotinib möglich, nachdem eine Phase-III-Studie (Moore, Goldstein et al. 2007) 2005 eine geringe – jedoch signifikante - Verlängerung des Gesamtüberlebens zeigte. Seit 2014 ist auch der kombinierte Einsatz von Gemcitabin mit nab-Paclitaxel für die Therapie des metastasierten Pankreaskarzinoms zugelassen. Studien, die sich mit dem kombinierten Einsatz von Gemcitabin mit anderen alternativen und zielgerichteten Therapeutika wie Cetuximab (Philip, Benedetti et al. 2010) oder Bevacizumab (Ko, Youssoufian et al. 2012) beschäftigen, konnten bislang keinen Überlebensvorteil gegenüber der Monotherapie mit Gemcitabin zeigen. 1.2.1.3.Prognose Da die Diagnose oft erst im fortgeschrittenen oder metastasierten Stadium erfolgt und das Pankreaskarzinom typischerweise besonders frühzeitig metastasiert hat das Pankreaskarzinom eine sehr schlechte Prognose. Die 5-Jahres- Überlebensrate beträgt für alle Pankreaskarzinome etwa 8-9% (2014). Auch nach kurativer Resektion ist lediglich eine 5 Jahres-Überlebensrate von 15-20% zu erreichen. Das mediane Überleben in der inoperablen, palliativen Situation beträgt lediglich 4-9 Monate. 1.2.2.rhTRAIL/Apo2-Ligand Eine vielversprechende Substanz der gezielten Therapeutika ist TRAIL (TNFrelated apoptosis-inducing ligand), auch bekannt als Apo2-Ligand. TRAIL ist als Protein der TNF-Familie ein Cytokin, welches in der Tumortherapie Apoptoseinduzierend sein kann. (Wiley, Schooley et al. 1995, Pitti, Marsters et al. 1996) TRAIL wird einerseits als Transmembranprotein vor allem auf Zellen des 11 Immunsystems exprimiert und ist so an der physiologischen Immunantwort zum Beispiel auf virale und antitumoröse Prozesse beteiligt. TRAIL kann aber durch Proteolyse in eine lösliche Form abgespalten werden. (Mariani and Krammer 1998) Als lösliche Form bildet TRAIL stabile Trimere, die an transmembranäre Rezeptoren von Zellen binden können. (Bodmer, Meier et al. 2000) Bisher konnten 5 Rezeptoren identifiziert werden (TRAIL-R1 bis R5), wobei TRAIL-R1 und 2 auch als Todesrezeptoren (Death Receptors, DR) bezeichnet werden. TRAIL-R1 wird auch als DR4 und TRAIL-R2 wird auch DR5 bezeichnet. Nach Bindung an diese Todesrezeptoren kann ein pro-apoptotisches Signal über intrazelluläre Todesdomänen (death domains, DD) vermittelt werden, welches den extrinsischen Weg der Apoptose der Zielzellen auslösen (Kim, Kim et al. 2004, Varfolomeev, Maecker et al. 2005), aber auch den ‚intrinsischen‘, mitochondrialen Weg über Aktivation von bax (Mitglied der Bcl2-Familie) und folgender Cytochrom-CAusschüttung durch die Mitochondrien der Zielzellen in das Cytosol bewirken kann. (Ashkenazi, Pai et al. 1999, LeBlanc and Ashkenazi 2003, Bouralexis, Findlay et al. 2005, Naumann, Kappler et al. 2011) Die übrigen TRAIL-Rezeptoren haben eher Apoptose-inhibierende Auswirkungen. Diese entsteht unter anderem durch kompetitive Bindung des TRAIL, Komplexbildung mit TRAIL-R2 oder Aktivierung des Apoptose-inhibierenden Transkriptionsfaktors NF-kB. In einigen Experimenten mit menschlichen Krebszelllinien wie Kolonkarzinom (Chromik, Daigeler et al. 2007), Fibrosarkom (Daigeler, Brenzel et al. 2008) und Zervixkarzinom (Ryu, Chang et al. 2000) konnte bereits die Apoptoseinduzierende Wirkung von TRAIL gezeigt werden. Phase 2-Studien beschäftigten sich mit der Evaluation von rekombinantem TRAIL beziehungsweise mit spezifischen Antikörpern gegenüber TRAIL-Rezeptoren in der Therapie zum Beispiel des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms (von Pawel, Harvey et al. 2014) oder des fortgeschrittenen hepatozellulären Karzinoms. (Koehler, Urbanik et al. 2009) Ein synergistischer Effekt auf die Apoptose von Tumorzellen konnte bisher schon für einerseits bewährte Chemotherapeutika wie etwa Cisplatin (Shin, Seong et al. 2002) oder Doxorubicin (Komdeur, Meijer et al. 2004) in Kombination mit TRAIL gezeigt werden. Aber auch die Kombination von TRAIL mit Taurolidin (TRD) zeigte synergistische Effekte auf verschiedene Krebszelllinien, zum Beispiel des Kolonkarzinoms (Chromik, Daigeler et al. 2007), des Ösophaguskarzinoms (Daigeler, Chromik et al. 2008) oder des Fibrosarkoms. (Daigeler, Brenzel et al. 12 2008) 1.2.3.TRD Taurolidin (TRD), ein Derivat der Aminosulfonsäure Taurin, ist ursprünglich bekannt als antiseptisches Medikament mit sowohl antibakterieller als auch antimykotischer Wirksamkeit. Es ist bekannt als präventiv eingesetzte Substanz zur Verhinderung von bakterieller Infektion nach chirurgischen Eingriffen und wird als Therapeutikum bei Peritonitis oder Katheter-assoziierter Infektion des Blutkreislaufs verwendet. (Baker, Jones et al. 1994, Koldehoff and Zakrzewski 2004) TRD kann durch Hydrolyse zu Metaboliten mit aktiven Methylgruppen gepalten werden und so zum Beispiel Endo- und Exotoxine inhibieren oder auch durch Interkation mit Zellwänden zum Beispiel von Bakterien diese verändern und zum Tod der Bakterien führen. In verschiedenen Studien konnte auch schon eine anti-neoplastische Aktivität des TRD gezeigt werden. (Jacobi, Menenakos et al. 2005, Neary, Hallihan et al. 2010) Auch wenn die genauen Signalwege noch nicht bekannt sind, zeigt sich TRD effektiv in Bezug auf den programmierten Zelltod in Form der Apoptose. Sowohl die Aktivierung von Cytochrom-C-abhängigem Zelltod (Han, Ribbizi et al. 2002, Darnowski, Goulette et al. 2004) und death-receptorassoziierte Signalwege, (Chromik, Daigeler et al. 2007, Daigeler, Chromik et al. 2008) sowie Hemmung der Proteinsynthese, (Braumann, Henke et al. 2004) Ausbildung von reaktiven Sauerstoffspezies (Chromik, Daigeler et al. 2010) und Beeinflussung der Stressreaktion des endoplasmatischen Retikulums (Chromik, Hahn et al. 2010) konnte gezeigt werden. Im Gegensatz zu anderen antineoplastisch wirksamen Substanzen zeigt TRD sich nicht toxisch und als systemisch angewandte Substanz auch gut verträglich. (Gong, Greenberg et al. 2007, Stendel, Scheurer et al. 2007) Diese Eigenschaft und die Fähigkeit zur Apoptoseinduktion machen TRD zu einem interessanten Kandidaten für eine Kombinationstherapie mit Chemotherapeutika zum Beispiel bei der Behandlung des duktalen Pankreaskarzinoms. 1.2.4.Gemcitabin 13 Gemcitabin ist als Antimetabolit ein seit Jahren effektiv eingesetztes Chemotherapeutikum. (Noble and Goa 1997, Gesto, Cerqueira et al. 2012) Es ist zunächst ein Prodrug und wird im Körper durch Phosphorylierung zu der aktiven Form Gemcitabintriphosphat umgewandelt. Es kann dann als Analogon zu dem Nukleosid Cytidin in die DNA der Zelle eingebaut werden und so die weitere DNASynthese verhindern. Gemcitabin kommt heutzutage bei vielen Karzinomerkrankungen zum Einsatz. (Gesto, Cerqueira et al. 2012) Oft wird Gemcitabin in Kombination mit einem anderen klassischen Chemotherapeutikum eingesetzt. So findet Gemcitabin zum Beispiel in der Kombination mit Cisplatin beim nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom (Noble and Goa 1997, Heinemann, Quietzsch et al. 2006) oder mit Paclitaxel in der palliativen Therapie des Mammakarzinoms Verwendung. (Noble and Goa 1997) Wie bereits erwähnt ist Gemcitabin in der adjuvanten als auch palliativen Therapie Pankreaskarzinoms das Mittel der ersten Wahl. (Adler, Seufferlein et al. 2007) 14 des 2.Fragestellung Zuletzt wurde in einigen Studien gezeigt, dass der Einsatz von TRD und TRAIL als Kombination den apoptotischen Zelltod in einigen menschlichen Krebszelllinien auslösen kann, wie beim Ösophagus- oder Kolonkarzinom, Fibrosarkom und Mesotheliom. Deswegen ist die Zielsetzung dieser Arbeit, TRD als Monotherapeutikum sowie als Kombinationspartner für Gemcitabin und TRAIL in der Behandlung von zwei menschlichen Pankreaskarzinomzellreihen zu evaluieren. Im ersten Abschnitt der Arbeit wurden dazu zunächst Experimente zur Dosisfindung für alle drei Reagenzien durchgeführt. Der zweite Teil beschäftigt sich mit Kombinationen von TRD mit Gemcitabin bzw. TRD mit TRAIL. 15 3.MaterialundMethoden 3.1.Material 3.1.1.ZelllinienundZellkulturmedium Es wurden zwei verschiedene Pankreaskarzinomzelllinien verwendet: BxPC3 (ATCC-LGC Standards GmbH, Wesel, Deutschland) und AsPC1 (CLS Cell Lines Service, Eppelheim, Deutschland). Beide Zelllinien wurden routinemäßig mit RPMI 1640-Nährmedium (Biowest, Nuaille, Frankreich) kultiviert, wobei das Nähmedium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), Streptomycin (100 µg/ml), Penicillin (100 U/ml) und 2 mM L-Glutamine (Biowest, Nuaille, Frankreich) versetzt wurde. Bei den AsPC1-Zellen wurde zusätzlich 1 mM Podium Pyruvat hinzugefügt. 3.1.2.Reagenzien TRD (Taurolin®) ultrapure powder (Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Schweiz) wurde in einer 5% Povidon-Lösung (K16 Povidon, Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Schweiz) aufgelöst. Der pH wurde mit Hilfe von Natriumhydroxidlösung auf 7,4 eingestellt. Als Kontrollreagenz für die Behandlung mit TRD wurde eine 5%ige Povisonlösung in gleichem Umfang verwendet. Recombinat human TRAIL (rhTRAIL) (Bender MedSystems, Wien, Österreich) wurde in destilliertem Wasser nach Anleitung durch den Hersteller aufgelöst. Als Kontrollreagenz für rhTRAIL wurde destilliertes Wasser verwendet. Gemcitabin wurde als Lösung in 0,9% Natriumchloridlösung von der Zentralapotheke des St. Josef Hospitals in Bochum zur Verfügung gestellt. 3.2.Methoden 3.2.1.Zellkultur Die Zelllinien wurden in Brutschränken bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. 16 3.2.1.1.Mediumwechsel Ein Mediumwechsel erfolgte alle 2 Tage. Das alte Medium wurde vorsichtig abgesaugt und neues Medium wurde hinzugefügt. Für die Zellkulturflaschen mit 25 cm2 Oberfläche wurden 5 ml und für die Fläschchen mit 12,5 cm2 wurden 2 ml Zellkulturmedium verwendet. 3.2.1.2.Zellenauftauen Die Zellen wurden im Wasserbad bei 37°C aufgetaut, es wurde tröpfchenweise Zellkulturmedium hinzugefügt und dann bei 20°C für 4 Minuten bei 230g Zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellett in vorgewärmtes 1000 µl Zellkulturmedium resuspendiert und in ein Zellkulturfläschchen überführt. 3.2.1.3.Zelleneinfrieren Zum Einfrieren wurde zunächst das Medium abgesaugt. Dann wurde vorgewärmtes Trypsin 1% hinzugefügt. Für die Flaschen mit 25 cm2 wurde 1,5 ml Trypsin und für die Flaschen mit 12,5 cm2 wurde 1 ml Trypsin verwendet. Nach Inkubation für 3-5 Minuten im Wasserbad und leichtem Klopfen auf den Flaschenboden wurde vorgewärmtes Medium zu den gelösten Zellen gegeben. Das Gemisch wurde dann in ein Falcon überführt und bei 20°C 4 Minuten bei 230g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, das Zellpellett in 1000 µl vorgewärmtes Zellkulturmedium resuspendiert und in Cryo-Röhrchen überführt. Nach Zugabe von 10% DMSO wurden die Zellen mit Hilfe des Mr. Frosty bei 80°C eingefroren. 3.2.1.4.Zellensplitten Ein Splitten und Passagieren der Zellen erfolgte, wenn ein konfluentes Wachstum erreicht war. Die Schritte der Trypsinisierung und Zentrifugation entsprechen den oben genannten Schritten zum Einfrieren der Zellen. Nach Absaugen des 17 Überstandes nach der Zentrifugation wurde je nach Bedarf ein Anteil der Suspension in neue Zellkulturflaschen mit vorgelegtem Medium ausgesät. 3.2.1.5.Zellzahlbestimmung War die Arbeit mit einer bestimmten Zellzahl notwendig, zum Beispiel bei der Durchflusszytometrie, erfolgte eine Auszählung mit 200 µl Zellsuspension mit Hilfe des Sysmex Blutzellanalysesystems. Je nach Bedarf wurde dann mit Medium verdünnt oder erneut zentrifugiert und mit weniger Zellkulturmedium resuspendiert, bis die gewünschte Zellanzahl erreicht war. 3.2.2.MTTZellviabilitätstest 3.2.2.1.PrinzipdesMTT-Zellviabilitätstests Der Nachweis der Zellaktivität beruht auf dem Prinzip der Messung des metabolischen Umsatzes einer Zelle. Das gelbe, wasserlösliche MTT wird durch Reduktion in ein violettes, wasserunlösliches aber alkohollösliches Formazan umgewandelt. Diese Reduktion kann durch Enzyme der Zellen (mitochondriale Dehydrogenasen gesunder Mitochondrien) erfolgen. Die Konzentration an Formazan korreliert dabei mit dem Proliferationsverhalten der Zelle. Somit ist das Ausmaß der Reduktion ein Maß für die Lebensfähigkeit der Zellen. 3.2.2.2.ZellaufbereitungundDurchführung Die BxPC3- bzw. AsPC1-Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Wells in einer Dichte von 4 x 105 Zellen pro Well ausgesät und unter oben genannten Zellkulturbedingungen für 24 Stunden inkubiert. Die verschiedenen Reagenzien (TRD, rhTRAIL, Gem und die Kombinationen TRD/rhTRAIL beziehungsweise TRD/Gem) wurden dann zu den Zellen in die Wells gegeben und für 6 und 24 Stunden inkubiert. Zellkulturmedium Als ohne Kontrolle diente Testsubstanz. ein MTT Testansatz mit Zellen im (Methylthiazoltetrazoliumbromid) wurde dann hinzugegeben und weitere 4 Stunden inkubiert. Das Medium wurde 18 nach der Inkubationszeit abgesaugt und DMSO wurde hinzugefügt und dadurch die Formazankristalle aus den Zellen gelöst. Es wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Mithilfe des Sunrise Absorbance ReadersTM (Tecan Trading AG, Schweiz) wurde das Formazan dann photometrisch bei 620 nm bestimmt. Der Umsatz des MTT des Kontrollansatzes der Zellen ohne Testsubstanz wurde dann als 100% gesetzt und die Ergebnisse der jeweiligen Testsubstanzen und Konzentrationen als Prozentsatz der Extinktion der Kontrolle angegeben. 3.2.3.BrdUProliferationsassay 3.2.3.1.PrinzipdesBrdUProliferationsassay BrdU (Bromdesoxyuridin) ist ein chemisches Analogon des Nukleosids Thymidin. Es kann von den Zellen anstelle von Thymidin in neu synthetisierte DNA eingebaut werden. Nach Zugabe von anti-BrdU-POD, einem Peroxidasegekoppelten spezifischen Antikörper gegen BrdU kommt es zu einer Substratreaktion, deren Produkt dann mittels Sunrise Absorbance ReaderTM (Tecan Trading AG, Schweiz) gemessen werden kann. Da sich die Menge des entstehenden Substrates proportional zur Menge der neu synthetisierten DNA verhält lässt sich damit auf die Proliferation der Zellen schließen. 3.2.3.2.ZellaufbereitungundDurchführung Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Wells in einer Konzentration von 4,5 x 105 Zellen pro Well ausgesät und für 24 Stunden unter oben genannten Bedingungen kultiviert. Die verschiedenen Wirksubstanzen (TRD, rhTRAIL, Gem und die Kombinationen TRD/rhTRAIL beziehungsweise TRD/Gem) wurden hinzugefügt und die Zellen für weitere 8 Stunden kultiviert. Erneut fungierte der Ansatz ohne Testsubstanzen als Kontrolle. Es wurde der BrdU Cell Proliferation Essay ELISA (Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland) nach Angaben des Herstellers benutzt, um die Effekte der verschiedenen Substanzen auf die Zellproliferation zu messen. Nach Zugabe des BrdU wurde zwei Stunden inkubiert. 19 3.2.4.Durchflusszytometrie 3.2.4.1.PrinzipderDurchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie ist eine Methode einerseits zum Zählen von Partikeln (in diesem Fall Zellen) und andererseits zur Analyse von Eigenschaften, sowohl physikalische als auch molekulare. Dazu werden die Zellen in einem Flüssigkeitsstrom möglichst einzeln an gebündelten Laserstrahlen (im Falle des hier verwendeten FACSCalibur ein Argon-Laser bei 488 nm und Dioden-Laser bei 635 nm) vorbei geleitet. Je nach Streulichtverhalten der Zelle werden die Laserstrahlen gebrochen, wobei das Maß der Vorwärtsstreuung der Größe der Zelle entspricht. Je größer die Zelle, desto mehr Licht wird gestreut (forward scatter). Die Seitwärtsstreuung ist dabei ein Maß für die Granularität der Zellen (sideward scatter). Die Messergebnisse des Streulichtes werden in Dot-Plots (Punktewolken) angegeben, wobei die auf der x-Achse die Vorwärtsstreuung und auf der y-Achse die Seitwärtsstreuung angegeben wird. Zusätzlich können bestimmt extra- und intrazelluläre Eigenschaften der Zelle quantifiziert werden, wenn die Zellen vor der Messung mit spezifischen Antikörpern markiert werden, welche an Fluoreszenzfarbstoffe gebunden sind. Die jeweiligen Laser regen dabei die Fluorochrome in einer bestimmten Wellenlänge an und die Intensität des spezifischen Emmisionsspektrums des jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffes wird detektiert, wobei die ermittelte Fluoreszenz dabei proportional zur Menge des gebundenen Antikörpers ist. Im Falle des verwendeten FACSCalibur ist eine Detektion in bis zu vier Kanälen möglich. In unserem Fall wurde FITC (Fluoreszeinisothiozyanat) und PI (Propidiumiodid) verwendet um vitale von apoptotischen und nekrotischen Zellen zu differenzieren. Wenn sich eine Zelle in der frühen Phase der Apoptose befindet ändert sich die Plasmamembranstruktur. Das sich bei vitalen Zellen in der inneren Plasmamembranschicht befindende Phospholipid Phosphatidylserin (PS) wird in die äußere Membranschicht an die Zelloberfläche transloziert. An dieses kann dann Annexin V (ein Phospholipidbindendes Protein mit hoher Affinität zu PS) binden. Annexin V wird gekoppelt an den grün fluoreszierenden Farbstoff 20 FITC verwendet. Dieser hat ein Absorptionsmaximum von 492 nm und ein Emisionsmaximun von 520 bis 530 nm. Befindet sich eine Zelle in der Nekrose, so wird die Membran durchlässig für größere Moleküle. PS wird dann auch für Annexin V/FITC erreichbar, auch wenn es sich nicht an der Oberfläche der Zelle befindet. Nekrotische Zellen sind also auch Annexin V/FITC-positiv. Um nekrotische von apoptotischen Zellen zu unterscheiden ist der zweite verwendete Farbstoff, Propidiumiodid (PI), notwendig. Dieser bindet spezifisch an dsDNA. PI ist ein rot fluoreszierender Farbstoff und hat ein Absorptionsmaximum von 495 nm und ein Emisionsmaximum von 639 nm. PI kann in die Zelle diffundieren und an dsDNA binden, wenn die Membranstruktur durch Nekrose durchlässiger für größere Moleküle geworden ist. Somit lassen sich drei Zustände unterscheiden: - vital: Annexin V/FITC und PI negativ - apoptotisch: Annexin V/FITC positiv, aber PI negativ - nekrotisch: Annexin V/FITC und PI positiv 3.2.4.2.ZellaufbereitungundDurchführung Die Zellen wurden in 6-Well-Platten mit einer Konzentration von 5 x 106 Zellen pro Well ausgesät und unter oben genannten Bedingungen inkubiert. Die verschiedenen Wirkstoffe (TRD, rhTRAIL, Gem und die Kombinationen) wurden dann dazu gegeben. Nach der festgelegten Inkubationszeit (6 bis 36 Stunden) wurden die Zellen gesammelt, wobei die adhärenten Zellen zuvor mit Hilfe von Trypsin gelöst wurden. Es erfolgte eine Zentrifugation bei 230 g für 4 Minuten, gefolgt von Resuspensation mit 200 µl Binding Buffer (Bender MedSystems, Wien, Österreich). Die Zellen wurden mittels Sysmex XE2100 D gezählt und 2 x 106 Zellen wurden in die Röhrchen für die FACS-Analyse gegeben. Nach Inkubation von jeder Probe mit 10 µl Annexin V-FITC für 10 Minuten in Dunkelheit und 5 µl PI (nach Angaben des Herstellers) wurden 20000 Zellen unmittelbar mithilfe des FACS flow cytometers (FACS Calibur BD Bioscience) analysiert. Die Punktewolken und Histogramme wurden mittel CellQuest Pro software (BD Science) analysiert. Die FACS-Analyse wurde mit aufeinanderfolgenden Passagen der Zellkulturen durchgeführt. 21 insgesamt vier 3.2.5Zellmorphologie Die Morphologie der Zellen wurde nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von TRD und/oder rhTRAIL beziehungsweise TRD und/oder Gem mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops (Zeiss Axiovent, Karl Zeiss, Jena, Deutschland) mit einer Vergrößerung von 20 betrachtet und dokumentiert. 3.2.5.StatistischeAnalyse Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie, also die Prozentsätze an vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen, als auch die Ergebnisse des BrdUProliferationstests und des MTT-Zellvitalitäts-Tests wurden ausgedrückt als Mittelwerte von mindestens drei unabhängigen Experimenten mit aufeinanderfolgenden Zellpassagen. In den Experimenten zur Dosisfindung für TRD, TRAIL und Gemcitabin mittels FACS-Analyse wurde der Vergleich zwischen den unterschiedlichen Versuchsansätzen mittels ANOVA mit Messwiederholung (‚repeated measurement ANOVA’), für die Kombinationsexperimente wurde eine einfaktorielle ANOVA (‚one-way-ANOVA’) sowohl für die Ergebnisse der Durchflusszytometrie, als auch für die des BrdU-Assays und des MTT-Tests durchgeführt. Der Vergleich unter den Gruppen erfolgte mit dem Posthoc-Test nach Tukey. Als Signifikanzniveau wurde p £ 0,05 festgelegt. In den Abbildungen wurde dies wie folgt angegeben: *** p £ 0,001, ** p £ 0,01 und * p £ 0,05. 22 4.Ergebnisse 4.1.ExperimentezurDosisfindungfürTRDalsEinzelsubstanz 4.1.1.DetektionundQuantifizierungvonApoptoseundNekrosedurchdie Durchflusszytometrie 4.1.1.1.BxPC3-Zellreihe Die BxPC3-Zellen wurden unter oben genannten Bedingungen ausgesät und mit TRD in verschiedenen Konzentrationen (100, 250, 500, 750, 1000 µmol/l) inkubiert. Als Kontrolle diente eine 5%-Povidonlösung. Nach festgelegten Zeitpunkten (6, 12, 24, 36 Stunden) erfolgten die Messungen. Die Unterscheidung zwischen vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen erfolgte mit Hilfe der Farbstoffe Annexin V/FITC und Propidiumiodid (PI). Es erfolgte eine wiederholte Messung an vier aufeinanderfolgenden Passagen mit Angabe der Prozentangaben zu vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen für alle Konzentrationen und alle Messpunkte (6, 12, 24, 36 Stunden). 4.1.1.1.1.VitaleZellen Für die verwendeten TRD-Konzentrationen von 250 µmol/l und mehr konnte eine signifikante Reduktion von vitalen BxPC3-Zellen gezeigt werden im Vergleich zu dem Kontrollversuch mit Povidon (siehe Abb.1). Lediglich die TRD-Konzentration von 100 µmol/l zeigte zu keinem Zeitpunkt eine signifikante Reduktion vitaler Zellen. Die niedrigste Rate an vitalen Zellen wurde nach Inkubation mit TRD 1000 µmol/l über 36 Stunden gefunden (23,9%). 23 Abb.1:ReduktionvitalerZellendurchTRD(100,250,500,750,1000µmol/l) Signifikanzniveau angegeben im Vergleich zur Kontrolle (ns nicht signifikant, *** p£0,001,**p£0,01) 4.1.1.1.2.ApoptotischeZellen TRD führt zur Apoptose der BxPC3-Zellen. Ein signifikanter Anstieg apoptotischer Zellen im Vergleich zur Kontrolle mit Povidon konnte für Konzentrationen ab 250 µmol/l gezeigt werden. Für die Konzentration von 100 µmol/l ließ sich kein signifikanter Unterschied finden. Die höchste Rate an apoptotischen Zellen von 29,2% zeigte sich nach Inkubation mit TRD 250 µmol/l für 12 Stunden. Wie Abb. 2 zeigt, wurde die höchste Rate an apoptotischen Zellen vor allem nach 12 Stunden erreicht. Danach ließ sich, außer für die Konzentration von 750 µmol/l TRD kein weiterer Anstieg apoptotischer Zellen nachweisen. 24 Abb.2:InduktionvonApoptosedurchTRD(100,250,500,750,1000µmol/l) Signifikanzniveau angegeben im Vergleich zur Kontrolle (***p£0,001, **p£0,01, *p£0,1,nsnichtsignifikant) 4.1.1.1.3.NekrotischeZellen Nachdem zu den frühen Messwerten (6 und 12 Stunden) zunächst ein signifikanter Anstieg der apoptotischen Zellen für TRD-Konzentrationen ab 250 µmol/l gezeigt werden konnte, führte eine weitere Inkubation (24 und 36 Stunden) zur signifikanten Zunahme des nekrotischen Zelltods für die Konzentrationen von 250, 750 und 1000 µmol/l (siehe Abb. 3). 25 Abb.3:InduktionvonNekrosedurchTRD(100,250,500,750,1000µmol/l) Signifikanzniveau angegeben im Vergleich zur Kontrolle (***p£0,001, **p£0,01, *p£0,05,nsnichtsignifikant) 4.1.1.2.AsPC1-Zellreihe Analog zu dem Versuchsansatz der BxPC3-Zellen wurden die AsPC1-Zellen unter oben genannten Bedingungen ausgesät und mit TRD in verschiedenen Konzentrationen (10, 100, 250, 500, 1000 µmol/l) inkubiert. Als Kontrolle diente auch hier eine 5%-Povidonlösung. Nach festgelegten Zeitpunkten (6, 12, 24 Stunden) erfolgten die Messungen. Die Unterscheidung zwischen vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen erfolgte erneut mit Hilfe der Farbstoffe Annexin V/FITC und Propidiumiodid (PI). Es erfolgte auch hier eine Messung an vier aufeinanderfolgenden Passagen. 4.1.1.2.1.VitaleZellen Eine signifikante Reduktion von vitalen Zellen konnte für die Konzentrationen TRD 500 µmol/l und 1000 µmol/l gezeigt werden. Auch nach Inkubation für 24 Stunden konnte für die Konzentrationen von 10, 100 und 250 µmol/l keine signifikante Reduktion der vitalen Zellen nachgewiesen werden (siehe Abb. 4). 26 Abb.4:ReduktionvitalerZellendurchTRD(10,100,250,500,1000µmol/l) Signifikanzniveau angegeben im Vergleich zur Kontrolle (*** p£0,001, ** p£0,01, ns nichtsignifikant) 4.1.1.2.2.ApoptotischeZellen Ein Anstieg der apoptotischen Zellen konnte für die TRD-Konzentrationen von 250 (p £ 0,05) und 500 µmol/l (p £ 0,01) nachgewiesen werden. Die niedrigen Konzentrationen von 10 und 100 µmol/l, sowie die höchste verwendete TRDKonzentration (1000 µmol/l) führten hingegen nicht zu einem signifikant nachweisbaren apoptotischen Zelltod der AsPC1-Zellen (siehe Abb. 5). 27 Abb.5:InduktionvonApoptosedurchTRD(10,100,250,500,1000µmol/l) SignifikanzniveauangegebenimVergleichzurKontrolle(**p£0,01,*p£0,05,nsnicht signifikant) 4.1.1.2.3.NekrotischeZellen Wie Abb. 6 verdeutlicht, konnte ein Anstieg der nekrotischen Zellen lediglich für die höchste verwendete Konzentration von TRD (1000 µmol/l) (p £ 0,001) gezeigt werden. Auch nach 12 Stunden führte die Inkubation mit den anderen verwendeten TRD-Konzentrationen (10, 100, 250, 500 µmol/l) zu keinem signifikant nachweisbarem nekrotischen Zelltod. 28 Abb.6:InduktionvonNekrosedurchTRD(10,100,250,500,1000µmol/l) Signifikanzniveau angegeben im Vergleich zur Kontrolle (*** p£0,001, ns nicht signifikant) 4.1.2.Fazit Sowohl in den Experimenten mit der BxPC3-Zellreihe als auch in den Ergebnissen der AsPC1-Zellreihe ließ sich zeigen, dass die Zellen sensitiv gegenüber TRD sind. Eine Inkubation über 6 und 12 Stunden führte hierbei vor allem zu einem Anstieg der apoptotischen Zellen, wobei eine weitere Inkubation (24 und 36 Stunden) vor allem zu einem Anstieg des nekrotischen Zelltods führen. Für sowohl BxPC3- als auch AsPC1-Zellen zeigte sich die TRD-Konzentration von 250 µmol/l als die niedrigste effektive Dosis. Daher wurde diese Konzentration für die gemeinsame Behandlung mit rhTRAIL beziehungsweise Gemcitabin ausgewählt. 4.2.ExperimentezurDosisfindungfürrhTRAILalsEinzelsubstanz 29 4.2.1.DetektionundQuantifizierungvonApoptoseundNekrosedurchdie Durchflusszytometrie Die BxPc3- beziehungsweise AsPC1-Zellen wurden analog zu den Experimenten zur Dosisfindung mit TRD (siehe oben) unter oben genannten Bedingungen ausgesät und mit rhTRAIL in verschiedenen Konzentrationen (50, 100, 250, 500 ng/ml) inkubiert. Als Kontrolle diente destilliertes Wasser. Nach festgelegten Zeitpunkten erfolgten die Messungen. Die Unterscheidung zwischen vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen erfolgte analog zu den TRD-Versuchen mit Hilfe der Farbstoffe Annexin V/FITC und Propidiumiodid (PI). 4.2.1.1.BxPC3-Zellreihe Es erfolgte eine Messung an vier aufeinanderfolgenden Passagen mit Prozentangaben (Mittelwerten) der vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen für alle Konzentrationen und alle Messpunkte (6, 12, 24, 36 Stunden). 4.2.1.1.1.vitaleZellen TRAIL reduzierte in allen Versuchsansätzen (50, 100, 250, 500 ng/ml) signifikant die Anzahl der vitalen BxPC3-Zellen im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Dies ließ sich bereits nach 6 Stunden Inkubationszeit nachweisen, wobei sich eine Dosisabhängigkeit zeigte. Je höher die gewählte Konzentration an TRAIL war, desto geringer zeigte sich die Anzahl der gemessenen vitalen Zellen (siehe Abb. 7). 30 Abb.7:ReduktionvitalerZellendurchTRAIL(50,100,250,500ng/ml) SignifikanzniveauangegebenimVergleichzurKontrolle(***p£0,001,**p£0,01) 4.2.1.1.2.apoptotischeZellen Wie Abb. 8 verdeutlicht, zeigte die Applikation von TRAIL zu den BxPC3-Zellen einen apoptotischen Effekt. Dies ließ sich bereits zu den frühen Messzeiten von 6 und 12 Stunden signifikant nachweisen für die Konzentrationen 100, 250 und 500 ng/ml. Die Applikation von TRAIL 50 ng/ml führte zu keiner signifikanten Veränderung. Die höchste Rate an apoptotischen Zellen wurde dabei nach 12 Stunden für die Konzentration TRAIL 500 ng/ml gemessen (34,1%). Eine weitere Inkubation führte zu keinem weiteren Anstieg der apoptotischen Zellen. 31 Abb.8:InduktionvonApoptosedurchTRAIL(50,100,250,500ng/ml) Signifikanzniveau angegeben im Vergleich zur Kontrolle (*** p£0,001, ** p£0,01, ns nichtsignifikant) 4.2.1.1.3.nekrotischeZellen Führte eine Inkubation der BxPC3-Zellen für 6 und 12 Stunden zunächst zu einem Anstieg der apoptotischen Zellen für die Konzentrationen 100, 250 und 500 ng/ml, so zeigte sich bei einer weiteren Inkubation (24 bzw. 36 Stunden) ein deutlicher Anstieg der Rate an nekrotischen Zellen für diese applizierten TRAILKonzentrationen. Erneut konnte für die geringste verwendete Dosis von 50 ng/ml kein signifikanter Unterschied festgestellt werden im Vergleich zur Kontrollgruppe mit destilliertem Wasser (siehe Abb. 9). 32 Abb.9:InduktionvonNekrosedurchTRAIL(50,100,250,500ng/ml) Signifikanzniveau angegeben im Vergleich zur Kontrolle (*** p£0,001, ** p£0,01, ns nichtsignifikant) 4.2.1.2.AsPC1-Zellreihe Die AsPC1-Zellen zeigten in der Dosisfindung mit TRAIL ein komplett anderes Verhalten als die Pankreaskarzinomzellreihe BxPC3. Zwar ließ sich, wie in Abb. 10 gezeigt, eine Reduktion von vitalen AsPC1-Zellen und ein Anstieg der apoptotischen Zellen in den Versuchen vermuten, dies zeigte sich aber für alle Zeitpunkte und verwendete TRAIL-Konzentrationen nicht signifikant im Vergleich zu der unbehandelten Kontrollgruppe ohne appliziertes TRAIL. 33 34 Abb. 10: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRAIL (50,100,250,500ng/ml) SignifikanzniveauangegebenimVergleichzurKontrolle(nsnichtsignifikant) 4.2.2.Fazit Die FACS-Analyse zur Dosisfindung für rhTRAIL hat gezeigt, dass BxPC3-Zellen empfindlich gegenüber rhTRAIL sind, dies konnte in einer zeit- und dosisabhängigen Reduktion der vitalen BxPC3-Zellen demonstriert werden. Die Konzentrationen von 100, 250 und 500 ng/ml zeigten hierbei einen frühen apoptotischen Effekt nach 6 beziehungsweise 12 Stunden Inkubationszeit, wobei weitere Inkubation dann zu einem signifikanten Anstieg von nekrotischen Zellen führte. Die AsPC1-Zellen hingegen zeigten sich nahezu resistent gegenüber der Behandlung mit rhTRAIL. Für die Kombinationsversuche wurde die niedrigste TRAIL-Konzentration verwendet, die eine signifikante Reduktion der BxPC-3Zellen zeigte (50 ng/ml) sowie eine höhere Konzentration 250 ng/ml. 4.3.ExperimentezurDosisfindungfürGemcitabinalsEinzelsubstanz 4.3.1.DetektionundQuantifizierungvonApoptoseundNekrosedurchdie Durchflusszytometrie Die BxPC3- beziehungsweise AsPC1-Zellen wurden analog zu den Experimenten zur Dosisfindung mit TRD und rhTRAIL (siehe oben) unter oben genannten Bedingungen ausgesät und mit Gemcitabin in verschiedenen Konzentrationen (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 µM) inkubiert. Als Kontrolle diente 0,9% Natriumchloridlösung. Nach festgelegten Zeitpunkten erfolgten die Messungen. Die Unterscheidung zwischen vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen erfolgte analog zu den TRD-Versuchen mit Hilfe der Farbstoffe Annexin V/FITC und Propidiumiodid (PI). 4.3.1.1.BxPC3-Zellreihe Auch hier erfolgte eine Messung an vier aufeinanderfolgenden Passagen mit 35 Angaben der ermittelten Prozentwerte (Mittelwerte) an vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen für alle Konzentrationen und alle Messpunkte (6, 12, 24, 36 Stunden). 4.3.1.1.1.vitaleZellen Die FACS-Messung zu den vier Zeitpunkten 6, 12, 24, und 36 Stunden zeigten eine signifikante Reduktion der vitalen Zellen (p ≤ 0,05) für die drei höchsten Gemcitabin-Konzentrationen (0,1, 1, 10 µM). Wobei die niedrigste Rate an vitalen Zellen nach 36 Stunden Inkubation mit 10 µM Gemcitabin erreicht wurde (54,1%). Für Gemcitabin 0,1 µM zeigten sich nach 36 Stunden noch 64,0 % und für die Konzentration 1 µM konnten 59,2% vitale Zellen detektiert werden. Nach Inkubation mit den beiden niedrigen Konzentrationen 0,001 und 0,01 µM konnte auch nach 36 Stunden keine signifikante Reduktion von vitalen Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe nachgewiesen werden (siehe Abb. 11). Abb.11:ReduktionvitalerZellendurchGem(0,001,0,01,0,1,1,10µM) SignifikanzniveauangegebenimVergleichzurKontrolle(*p£0,05,nsnichtsignifikant) 36 4.3.1.1.2.apoptotischeZellen Es zeigte sich ein Anstieg der apoptotischen Zellen für die beiden höchsten Konzentrationen von 0,1 und 10 µM Gemcitabin. Die höchste Rate an apoptotischen Zellen konnte mit 23,9% nach 36 Stunden Inkubation bei der Konzentration von 10 µM detektiert werden. Eine Inkubation mit den Konzentrationen 0,001, 0,1 und 1 µM zeigte keinen signifikanten Anstieg der apoptotischen Zellen im Vergleich zur Inkubation mit 0,9% Natriumchloridlösung (siehe Abb. 12). Abb.12:InduktionvonApoptosedurchGem(0,001,0,01,0,1,1,10µM) Signifikanzniveau angegeben im Vergleich zur Kontrolle (**p£0,01, *p£0,05, ns nicht signifikant) 4.3.1.1.3.nekrotischeZellen Der höchste zu messende Anteil nekrotischer Zellen von 17,8% konnte nach Inkubation mit 10 µM Gemcitabin für 36 Stunden gemessen werde. Dieser zeigte sich allerdings, wie demonstriert in Abb. 13 nicht signifikant im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Ein signifikanter (p ≤ 0,05), jedoch geringerer Anstieg nekrotischer Zellen zeigte sich für die Konzentrationen 0,001 µM (11,8%) 37 und 1 µM (15,1%) nach 36 Stunden. Abb.13:InduktionvonNekrosedurchGem(0,001,0,01,0,1,1,10µM) SignifikanzniveauangegebenimVergleichzurKontrolle(*p£0,05,nsnichtsignifikant) 4.3.1.2.AsPC1-Zellen Die AsPC1-Zellen zeigten in der Dosisfindung mit Gemcitabin ein anderes Verhalten als die Pankreaskarzinomzellreihe BxPC3. Wie Abb. 14 verdeutlicht, ließ sich zwar eine schwache Reduktion von vitalen Zellen und eine vage apoptotische Reaktion erahnen, diese Veränderungen zeigten aber keine statistische Signifikanz über alle Zeiträume (6 bis 24 Stunden). Alle verwendeten Konzentrationen von Gemcitabin (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, µM) konnten auch nach Inkubation von 24 Stunden keine signifikante Reduktion von vitalen Zellen und keinen signifikanten Anstieg apoptotischer oder nekrotischer Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe mit 0,9% Natriumchloridlösung nachweisen. Die Prozentzahl von vitalen Zellen blieb auch nach Inkubation mit der höchsten Konzentration von 10 µM nach 24 Stunden noch auf 73,4 % (im Vergleich dazu 77,0 % für die unbehandelte Kontrollgruppe). 38 39 Abb. 14: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch Gem (0,001,0,01,0,1,1,10µM) SignifikanzniveauangegebenimVergleichzurKontrolle(nsnichtsignifikant) 4.3.2Fazit Obwohl die BxPC3- und AsPC1-Zellen ein unterschiedliches Verhalten bei den Experimenten zur Dosisfindung mit Gemcitabin zeigten, entschieden wir uns für die weiteren Kombinationsexperimente die gleichen Dosierungen von Gemcitabin für beide Zellreihen zu verwenden. Wir wählten einerseits mit 10 µM die höchste Konzentration die bei BxPC3-Zellen die deutlichsten Effekte in Bezug auf Reduktion vitaler und Anstieg apoptotischer und nekrotischer Zellen gezeigt hatte. Als zweite Konzentration wählten wir 0,1 µM Gemcitabin, da sich diese als die niedrigste Konzentration mit statistisch signifikant nachweisbarer Wirksamkeit bei der Dosisfindung der BxPC3-Experimente erwies. 4.4.ExperimentezumkombiniertenEinsatzvonTRDundrhTRAIL 4.4.1.BxPC3-Zellreihe 4.4.1.1.EffekteaufdieZellvitalitätgemessenmittelsMTT-Test Für die Versuche wurden die BxPC3-Zellen wie oben beschrieben in Mikrotiterplatten mit 96 Wells in einer Dichte von 4 x 105 Zellen pro Well ausgesät und unter oben genannten Zellkulturbedingungen für 24 Stunden inkubiert. Die Inkubation mit den Einzelsubstanzen TRD und rhTRAIL (TRD 250 µmol/l, rhTRAIL 50 mg/ml, rhTRAIL 250 mg/ml) und den entsprechenden Kombinationen (rhTRAIL 50 mg/dl + TRD 250 µmol/l und rhTRAIL 250 mg/ml + TRD 250 µmol/l) sowie dem Ansatz ohne Testsubstanz als Kontrolle erfolgte dann für 6 und 24 Stunden. Der Einfluss der Einzelsubstanzen und der Kombinationen auf die Zellvitalität der BxPC3 Zellen wurde dann bestimmt durch das Ausmaß der erfolgten Reduktion von MTT zu Formazan durch die mitochondriale Dehydrogenasen. Dabei erfolgte die Angabe der vitalen Zellen in %, wobei jeweils Mittelwerte aus 4 konsekutiven 40 Passagen angegeben wurden. Wie Abb. 15 zu entnehmen, führte der kombinierte Einsatz von TRD und rhTRAIL für 24 Stunden zu einer nahezu kompletten Auslöschung der Zellvitalität. Sie betrug nach Inkubation mit der Kombination TRD 250 µmol/l und rhTRAIL 50 ng/ml nach 24 Stunden lediglich 2,5 % und in der Kombination TRD 250 µmol/l mit rhTRAIL 250 ng/ml nur 1,9 % der Aktivität der unbehandelten Gruppe. Diese starke Reduktion der Zellvitalität zeigte sich auch signifikant im Vergleich zu den Versuchsansätzen für rhTRAIL 50 und 250 ng/ml und auch TRD 250 µmol/l als Einzelsubstanzen (p £ 0,001). 41 Abb. 15: Reduktion der Zellaktivität (MTT-Test nach 24 Stunden) durch TRD, TRAIL undKombinationen Signifikanzniveau über den Balken angegeben im Vergleich zur Kontrolle, Signifikanzniveau über den Klammern angegeben als Vergleich zwischen den jeweiligenGruppen(***p£0,001) 42 4.4.1.2.DetektionundQuantifizierungvonApoptoseundNekrosedurchdie Durchflusszytometrie Die BxPC3-Zellen wurden analog zu den Experimenten zur Dosisfindung unter oben genannten Bedingungen ausgesät und mit TRD und/oder rhTRAIL als Einzelsubstanzen (TRD 250 µmol/l, rhTRAIL 50 ng/ml und rhTRAIL 250 ng/ml) und in verschiedenen Kombinationen (rhTRAIL 50 ng/dl + TRD 250 µmol/l und rhTRAIL 250 ng/ml + TRD 250 µmol/l) inkubiert. Nach festgelegten Zeitpunkten (6, 12, 24, 36 Stunden) erfolgten die Messungen. Die Unterscheidung zwischen vitalen, apoptotischen Dosisfindungsversuchen und mit nekrotischen Hilfe der Zellen erfolgte Farbstoffe analog Annexin zu den V/FITC und Propidiumiodid (PI). Angegeben wurden die Mittelwerte aus Experimenten aus vier konsekutiven Passagen. Analog zu den Ergebnissen des MTT-Tests ließ sich bei der FACS-Analyse ein additiver Effekt von TRD und rhTRAIL nachweisen. Abbildung 16 zeigt die Messergebnisse nach 24 Stunden. Hier ließ sich eine signifikante Reduktion (p £ 0,001) von vitalen Zellen für die Kombinationen TRD 250 µmol/l mit rhTRAIL 50 ng/ml (17,1%) und TRD 250 µmol/l und rhTRAIL 250 ng/ml (17,1%) im Vergleich zur Therapie mit den Einzelsubstanzen TRD (46,1%), rhTRAIL 50 ng/ml (59,2%) oder rhTRAIL 250 ng/ml (17,1%) nachweisen. Auch der Anstieg an nekrotischen Zellen war signifikant größer (p £ 0,001) für die Kombinationen als für die jeweiligen Einzelsubstanzen, wobei hier die höchste Rate an nekrotischen Zellen für die Kombination TRD 250 µmol/l mit rhTRAIL 50 ng/ml gefunden wurde (57,5%). Vergleichbare Effekte (Reduktion vitaler Zellen und Anstieg nekrotischer Zellen) ließen sich auch nach 12 und 36 Stunden sehen (siehe Abb. A1 im Anhang). 43 Abb. 16: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, TRAILundKombinationen Signifikanzniveau angegeben als Vergleich zwischen den jeweiligen Gruppen (***p£0,001) 4.4.1.3.EinflussaufdieProliferationgemessenmittelsBrdU-Test Die BxPC3-Zellen wurden unter oben genannten Bedingungen in 96-well-Platten ausgesät und über 8 Stunden mit TRD, rhTRAIL und den entsprechenden Kombinationen inkubiert. Wie Abb. 17 zeigt, führte eine Inkubation mit TRD 250 µmol/l als Einzelsubstanz zu einer deutlichen, signifikanten (p ≥ 0,001) Reduktion der Zellproliferation. Eine Inkubation mit rhTRAIL alleine, sowohl in der niedrigen 44 Dosierung 50 ng/ml, als auch in der höheren Konzentration 250 ng/ml hatte keine signifikante Reduktion der Proliferation verglichen zur unbehandelten Kontrollgruppe zur Folge. Betrachtet man den kombinierten Einsatz der beiden Substanzen, so zeigte sich in der Kombination TRD mit TRAIL 250 ng/ml eine weitere Reduktion der Zellproliferation. Dies war signifikant sowohl im Vergleich zu TRAIL 250 ng/ml als Einzelsubstanz (p ≥ 0,001) als auch verglichen mit TRD alleine (p ≥ 0,5). Die niedrigste Rate an Proliferation im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde mit 8,18 % für die Kombination TRD mit TRAIL 250 ng/ml gefunden. Der kombinierte Einsatz von TRD mit TRAIL 50 ng/ml führte allerdings nicht zu einer weiteren Reduktion der Zellproliferation. 45 Abb.17:ProliferationshemmungdurchTRD,TRAILundKombinationen BrdU-Test nach 8 Stunden, Signifikanzniveau angegeben als Vergleich der jeweiligen Gruppen(***p£0,001,*p£0,05,nsnichtsignifikant) 4.4.2.AsPC1-Zellreihe 4.4.2.1.EffekteaufdieZellaktivitätgemessenmittelsMTT-Test Der Versuchsaufbau für die Pankreaskarzinomzellreihe AsPC1 erfolgte analog zu den bereits oben beschriebenen Versuchen mit BxPC3. Die Inkubationszeiten und die Konzentrationen der Wirkstoffe wurden gleich gewählt. TRD als Einzelsubstanz führte nach 24 Stunden Inkubation zu einer Reduktion der 46 Zellvitalität auf 57,3 % im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Dies war hoch signifikant (p £ 0,001) und war die deutlichste Reaktion der Einzelsubtanzen. Eine Inkubation mit TRAIL alleine zeigte nur für die höhere Konzentration von 250 ng/ml einen Effekt, der jedoch mit 88,9% Aktivität deutlich geringer ausfiel, als bei TRD alleine. TRAIL in der niedrigen Konzentration von 50 ng/ml führte nicht zu einer signifikanten cytotoxischen Reaktion der AsPC1-Zellen. Diese geringere Empfindlichkeit der AsPC1-Zellen gegenüber den Substanzen TRD und TRAIL im Vergleich zu den BxPC3-Zellen ließ sich bereits in den Versuchen zur Dosisfindung beschreiben. Interessanterweise zeigte eine Inkubation mit der Kombination TRD mit TRAIL 50 ng/ml als auch mit TRAIL 250 ng/ml eine signifikant höhere Reduktion der Zellaktivität im Vergleich zu den jeweiligen Einzelsubstanzen (p £ 0,001). Für die Kombination TRD mit TRAIL 50 ng/ml betrug die Aktivität nach 24 Stunden 26,1% und für die Kombination mit TRAIL 250 ng/ml sogar lediglich nur 13,6 % (siehe Abb. 18). 47 Abb. 18: Reduktion der Zellaktivität (MTT-Test nach 24 Stunden) durch TRD, TRAIL undKombinationen Signifikanzniveau über den Balken angegeben als Vergleich der jeweiligen Gruppen (***p£0,001,**p£0,01,nsnichtsignifikant) 4.4.2.2.DetektionundQuantifizierungvonApoptoseundNekrosedurchdie Durchflusszytometrie Der Versuchsaufbau wurde auch hier wieder analog zu den weiter oben beschriebenen Kombinationsversuchen mit BxPC3-Zellen gewählt. Wie auch in den Ergebnissen des MTT-Tests gezeigt, führte eine Inkubation mit der Kombination TRD mit der höheren Dosis TRAIL 250 ng/ml zu einem deutlicheren Effekt als der jeweilige Einsatz der Einzelsubstanzen. Nach 12 Stunden war sowohl der Abfall der vitalen Zellen als auch der Anstieg von nekrotischen Zellen 48 signifikant (p £ 0,001, siehe Abbildung 19). Die Kombination von TRD mit TRAIL 50 ng/ml konnte bei der FACS-Analyse jedoch keinen additiven Effekt der Substanzen nachweisen, anders als bei den Ergebnissen des MTT-Tests. Der kombinierte Einsatz von TRD mit TRAIL 50 ng/ml führte hier nicht zu einer signifikanten Änderung im Vergleich zur Behandlung mit TRD oder TRAIL 50 ng/ml alleine. Abbildung A2 im Anhang zeigt die Ergebnisse für alle Messzeiten. 49 Abb. 19: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, TRAILundKombinationen Signifikanzniveau angegeben als Vergleich zwischen den jeweiligen Gruppen (***p£0,001,nsnichtsignifikant) 4.4.2.3.EinflussaufdieProliferationgemessenmittelsBrdU-Test Die AsPC1-Zellen wurden unter oben genannten Bedingungen in 96-well-Platten ausgesät und über 8 Stunden mit TRD, rhTRAIL und den entsprechenden Kombinationen inkubiert. Eine Inkubation mit TRAIL alleine zeigte auch bei den AsPC1-Zellen keinerlei Auswirkung auf die Zellproliferation. Dies konnte in den 50 Versuchen mit BxPC3-Zellen ebenfalls gesehen werden. Der Prozentsatz der Proliferation der AsPC1-Zellen entsprach für TRAIL 50 ng/ml 100,5% und für TRAIL 250 ng/ml 99,1% im Vergleich zur Kontrollgruppe. TRD als Einzelsubstanz zeigte eine deutliche Hemmung der Zellproliferation der AsPC1-Zellen. Auch dies ließ sich für die BxPC3-Zellen zeigen. Anders als bei den BxPC3-Zellen führte allerdings die Kombination von TRD mit TRAIL nicht zu einer weiteren Reduktion der Zellproliferation. Ein additiver Effekt ließ sich für die AsPC1-Zellen auch in der Kombination mit der höheren TRAIL-Dosis (250 ng/ml) nicht nachweisen. Die Prozentsätze für die Kombinationen entsprachen mit 8,7% (TRD 250 µmol/l + TRAIL 50 ng/ml) und 8,3% (TRD 250 mmol/L + TRAIL 250 ng/ml) in etwa denen für TRD alleine (9,2%) (siehe Abb. 20). 51 Abb.20:ProliferationshemmungdurchTRD,TRAILundKombinationen BrdU-Test nach 8 Stunden, Signifikanzniveau angegeben als Vergleich der jeweiligen Gruppen(***p£0,001,nsnichtsignifikant) 4.5.ExperimentezumkombiniertenEinsatzvonTRDundGemcitabin 4.5.1.BxPC3-Zellreihe 4.5.1.1.EffekteaufdieZellaktivitätgemessenmittelsMTT-Test Für die Versuche wurden die BxPC3-Zellen wie oben beschrieben in Mikrotiterplatten mit 96 Wells in einer Dichte von 4 x 105 Zellen pro Well unter oben genannten Zellkulturbedingungen ausgesät. Für 6 und 24 Stunden wurde dann mit TRD, Gemcitabin und den entsprechenden Kombinationen (TRD 250 52 µmol/l, Gemcitabin 0,1 µM, Gemcitabin 10 µM, Gemcitabin 0,1 µM + TRD 250 µmol/l und Gemcitabin 10 µM + TRD 250 µmol/l) inkubiert. Die Ergebnisse des MTT-Tests für die BxPC3-Zellen nach 24 Stunden zeigten, dass der kombinierte Einsatz von TRD mit Gemcitabin in einer deutlichen Reduktion der Zellaktivität mündete (siehe Abb. 21). Vor allem die Kombination von TRD mit Gemcitabin 10 µM zeigte mit einer Restaktivität von 10,4% eine signifikant (p £ 0,001) niedrige Zellvitalität im Vergleich zu den jeweiligen Einzelsubstanzen TRD (16,1%) und Gemcitabin 10 µM (71,0%). Für die Kombination von TRD mit Gemcitabin 0,1 µM konnte eine Restaktivität von 11,5 % nach 24 Stunden ermittelt werden. Diese war signifikant niedriger zu der Applikation mit Gemcitabin 0,1 µM als Einzelsubstanz (81,0%), jedoch nicht signifikant geringer als TRD alleine (16,1%). 53 Abb.21:ReduktionderZellaktivität(MTT-Testnach24Stunden)durchTRD,Gemund Kombinationen Signifikanzniveau über den Balken angegeben als Vergleich der jeweiligen Gruppen (***p£0,001,*p£0,05,nsnichtsignifikant) 4.5.1.2.DetektionundQuantifizierungvonApoptoseundNekrosedurchdie Durchflusszytometrie Der Versuchsaufbau und die Durchführung entsprachen den vorher beschriebenen Versuchen zur FACS-Analyse. Die applizierten Konzentrationen von TRD und Gemcitabin und die jeweiligen Kombinationen entsprachen denen des MTT-Tests (TRD 250 µmol/l, Gemcitabin 0,1 µM Gemcitabin 10 µM, Gemcitabin 0,1 µM + TRD 250 µmol/l und Gemcitabin 10 µM + TRD 250 µmol/l). Abb. 22 gibt exemplarisch die Ergebnisse nach 24 Stunden Inkubation wieder. 54 Abb. 22: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, GemundKombinationen Signifikanzniveau angegeben als Vergleich zwischen den jeweiligen Gruppen (***p£0,001,**p£0,01,*p£0,05,nsnichtsignifikant) Es zeigte sich, dass die Kombination von TRD mit sowohl Gemcitabin 0,1 µM als auch 10 µM zu einer signifikanten Reduktion von vitalen Zellen und einem signifikanten Anstieg nekrotischer Zellen im Vergleich zu Gemcitabin alleine führte. Allerdings ließ sich keine signifikante Änderung im Vergleich zur alleinigen Applikation von TRD nachweisen. Dies ließ sich auch zu den anderen Messzeitpunkten nachweisen (siehe Abb. A3 im Anhang). Beispielsweise zeigte sich auch nach 36 Stunden in allen Versuchsansätzen mit TRD der gleiche Effekt: vitale Zellen wurden deutlich mehr reduziert und die gemessenen nekrotischen Zellen stiegen deutlich mehr an, wenn TRD appliziert wurde, verglichen mit Gemcitabin als Einzelsubstanz oder verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe. Allerdings zeigte sich keine signifikante Differenz zwischen TRD 55 als Einzelsubstanz und den Kombinationen von TRD mit Gemcitabin 0,1 oder 10 µM. Dies lässt darauf schließen, dass der Effekt von Reduktion vitaler Zellen und Anstieg nekrotischer Zellen überwiegend durch TRD verursacht wird. 4.5.1.3.EinflussaufdieProliferationgemessenmittelsBrdU-Test Auch für die Kombinationstherapien für TRD und Gemcitabin erfolgte der Proliferations-Assay. Eine Inkubation der BxPC3-Zellen unter bereits oben mehrfach genannten Bedingungen erfolgte für TRD, Gemcitabin 0,1 µM, Gemcitabin 10 µM und die jeweiligen Kombinationen. Wie in Abbildung 23 gezeigt, kam es zu einer Versuchsansätze im deutlichen Vergleich Reduktion zur der Zellproliferation Kontrollgruppe. Eine in Applikation allen von Gemcitabin alleine zeigte eine deutlichere Reaktion als TRD als Einzelsubstanz. Nach 8 Stunden wurde für Gemcitabin 0,1 µM ein Prozentsatz von 22,4% und für Gemcitabin 10 µM ein Prozentsatz von 27,4% erreicht. TRD reduziert in der gleichen Zeit die Proliferationsrate bis auf 39,8%. Die deutlichste Reduktion der Zellproliferation zeigte sich für die Kombination TRD mit Gemcitabin 10 µM (14,2%). Dieser additive Effekt war signifikant (p £ 0,001) im Vergleich zu beiden Einzelsubstanzen. Für die Kombination TRD mit der geringeren GemcitabinDosierung 0,1 µM ließ sich aber wie in Abb. 23 sichtbar auch ein additiver Effekt erahnen. Dieser erreichte allerdings nur im Vergleich zur TRD als Monotherapie eine Signifikanz und nicht im Vergleich zur alleinigen Applikation von Gemcitabin 0,1 µM. 56 Abb.23:ProliferationshemmungdurchTRD,GemundKombinationen BrdU-Test nach 8 Stunden, Signifikanzniveau angegeben als Vergleich der jeweiligen Gruppen(***p£0,001,nsnichtsignifikant) 4.5.2.AsPC1-Zellreihe 4.5.2.1.EffekteaufdieZellaktivitätgemessenmittelsMTT-Test Der Versuchsaufbau und die Wahl der Kombinationen von TRD und Gemcitabin erfolgten analog zu den bereits oben beschriebenen Versuchen mit BxPC3-Zellen. Bei den AsPC1-Zellen führte eine Applikation von TRD 250 µmol/l zu einer Reduktion der Zellvitalität auf 53,3% 57 im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (siehe Abb. 24). Auch die Applikation von Gemcitabin als Einzelsubstanz führte zu einer signifikanten Reduktion der Zellaktivität im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieser fiel jedoch deutlich geringer aus als für TRD alleine. Nach 24 Stunden ergab sich für Gemcitabin 0,1 µM eine Restaktivität von 81,3% und für Gemcitabin 10 µM ein Wert von 76,6%. Betrachtete man die Kombinationstherapien, so ließ sich sehen, dass der cytotoxische Effekt auf die AsPC1-Zellen für die Kombinationen von TRD mit Gemcitabin deutlicher war. Die Kombination von TRD 250 µmol/l mit Gemcitabin 0,1 µM führte zur einer Reduktion der Zellaktivität auf 49,2%. Dies war signifikant mehr als die Therapie mit Gemcitabin alleine. Für die Kombination TRD mit der höheren GemcitabinDosierung von 10 µM erreichte die Zellaktivität lediglich einen Wert von 45,3%. Dies war nicht nur signifikant im Vergleich zur Gemcitabin alleine sondern auch zur alleinigen Applikation von TRD. 58 Abb.24:ReduktionderZellaktivität(MTT-Testnach24Stunden)durchTRD,Gemund Kombinationen Signifikanzniveau über den Balken angegeben als Vergleich der jeweiligen Gruppen (***p£0,001,nsnichtsignifikant) 4.5.2.2.EinflussaufdieProliferationgemessenmittelsBrdU-Test Wie Abb. 25 zeigt, führte eine Inkubation mit TRD, Gemcitabin und den Kombinationen aus beidem in allen Versuchsansätzen zu einer nahezu vollständigen Proliferationshemmung der AsPC1-Zellen. Anders als bei den Versuchen mit der anderen Pankreaskarzinomzellreihe BxPC3 war diese Proliferationshemmung in allen Ansätzen so ausgeprägt, dass sich kein Unterschied mehr zwischen den Einzelsubstanzen und den Kombinationen ausmachen ließ. Der Prozentsatz im Vergleich zur Kontrollgruppe war für keinen 59 weiteren Ansatz höher als 9,2% (TRD 250 µmol/l). Abb.25:ProliferationshemmungdurchTRD,GemundKombinationen BrdU-Test nach 8 Stunden, Signifikanzniveau angegeben als Vergleich der jeweiligen Gruppen(***p£0,001,nsnichtsignifikant) 60 5.Diskussion In dieser Arbeit sollte in der Zellkultur untersucht werden, ob die anti-infektive Substanz TRD als möglicher Kombinationspartner einen Therapieansatz in der Behandlung des Pankreaskarzinoms darstellen kann. 5.1.Studienaufbau 5.1.1.AuswahlderZelllinien Das Pankreaskarzinom ist eine der aggressivsten Tumorerkrankungen des Menschen mit einem medianen Überleben von weniger als einem Jahr und einer geringen 5-Jahres-Überlebensrate. Es rangiert unter den fünfthäufigsten Krebstodesursachen in Deutschland. (Haberland, Bertz et al. 2010, Jemal, Siegel et al. 2010) In den letzten 20-30 Jahren konnte durch neue Medikamente keine größere Steigerung der Überlebensraten erreicht werden. Der einzige kurative Therapieansatz ist die chirurgische Resektion. Diese ist jedoch häufig nicht möglich, da das Pankreaskarzinom durch oft fehlende spezifische Frühsymptome erst in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird. Die Therapie mit einer Chemotherapie hat einen großen Stellenwert, sowohl in der adjuvanten postoperativen als auch in der palliativen und metastasierten Situation. (Adler, Seufferlein et al. 2007) Heutzutage basiert die onkologische Behandlung vor allem auf dem Antimetabolit Gemcitabin. Dieses wird sowohl als Einzelsubstanz, als auch in Kombination mit anderen Wirkstoffen eingesetzt. (Adler, Seufferlein et al. 2007, Oettle, Post et al. 2007) Allerdings ist die Therapie mit Gemcitabin oft durch massive Nebenwirkungen Knochenmarkschädigung, Nierenschädigung und Begleiterscheinungen, Schleimhautentzündungen, gekennzeichnet. Dies führt oft zu Lebereiner wie oder notwendigen Dosisreduktion oder sogar Beendigung der wichtigen Chemotherapie in der Therapie des Pankreaskarzinoms. Die Zellreihen BxPC3 und AsPC1 wurden erstmals 1982 (BxPC3) (Loor, Nowak et al. 1982) beziehungsweise 1981 (AsPC1) (Tan, Shimano et al. 1981) beschrieben. Sie wurden schon in zahlreichen Studien verwendet Für beide Zellreihen wurde 61 die experimentelle Kultivierung oft erprobt und etabliert. (Chen, Horoszewicz et al. 1982, Lan, Hollingsworth et al. 1990, Chambers and Harris 1993) Auch die Verwendung zur Testung apoptotischer Vorgänge erfolgte bereits. (Guzmán, Maher et al. 2013, Hamed, Straubinger et al. 2013, Jiang, Wu et al. 2015) 5.1.2.AuswahlderSubstanzen Während der letzten Jahre kam der anti-infektiven Substanz TRD (Olthof, Versleijen et al. 2014) eine große Aufmerksamkeit in der onkologischen Forschung zu. Bekannt ist TRD als eine antibakterielle Substanz die erfolgreich angewandt wird bei Patienten mit Peritonitis oder Sepsis. Es kann die Zellwand der Bakterien zerstören oder auch freie Exotoxine binden. (Jacobi, Menenakos et al. 2005) Die anti-neoplastische Wirkung auf unterschiedliche maligne Zellen (wie etwa Neuroblastom, Kolonkarzinom, Fibrosarkom) wurde bisher in einigen Studien untersucht. (Chromik, Daigeler et al. 2010, Chromik, Hahn et al. 2010, Eschenburg, Luckert et al. 2014, Luckert, Eschenburg et al. 2014) Dies geschah sowohl in vitro, als auch in Tiermodellen. Aber auch die Therapie am Menschen wurde in Pilotstudien bisher getestet. (Imhof, Goldinger et al. 2011) Es werden unterschiedliche Mechanismen für die Apoptoseinduktion durch TRD diskutiert. Einerseits kann es das Tumorwachstum den intrinsischen, mitochondrialen Cytochrom-C-abhängigen vermittelt es über Signalweg der Apoptose FAS-Liganden-Bindung den auslösen, Zelltod andererseits und kann die Proteinsynthese der Zellen hemmen. (Han, Ribbizi et al. 2002, Darnowski, Goulette et al. 2004, Jacobi, Menenakos et al. 2005, Braumann, Gutt et al. 2009) TRD ist charakterisiert durch eine vergleichsweise geringe toxische Wirkung und ist als systemisch angewendete Substanz gut tolerierbar. (McCartney and Browne 1988, Baker, Jones et al. 1994, Willatts, Radford et al. 1995, Betjes and van Agteren 2004, Gong, Greenberg et al. 2007) Aufgrund dieses positiven toxischen Profils und der anti-neoplastischen Wirkung ist TRD ein vielversprechender und interessanter Kandidat für kombinierte Therapieregime mit anderen konventionellen Chemotherapeutika, wie Gemcitabin, oder auch neueren Subtanzen, wie etwa TRAIL. Die Apoptose-induzierende Wirkung des Peptidabkömmlings TRAIL konnte 62 bislang in vielen Studien für verschieden maligne humane Zellen demonstriert werden. (Kim, Kim et al. 2004, Chromik, Daigeler et al. 2007, Daigeler, Chromik et al. 2008) Die Wirkweise der Apoptoseinduktion durch TRAIL wird hauptsächlich durch den ‚extrinsischen’ Weg über spezielle Todesrezeptoren (death receptors, DR) vermittelt. (Kim, Kim et al. 2004, Varfolomeev, Maecker et al. 2005) Als Teil der physiologischen Immunantwort zeichnet sich TRAIL durch das Fehlen systemischer Nebenwirkungen und fehlende toxische Wirkung auf Normalgewebe aus. (Ashkenazi, Pai et al. 1999, Nagane, Huang et al. 2001) Unsere Arbeitsgruppe konnte kürzlich zeigen, dass der kombinierte Einsatz von TRD mit TRAIL einen synergistischen Effekt in einigen malignen Zelllinien zeigt, wie etwa denen des Kolonkarzinoms, des Leiomyosarkoms, des Ösophaguskarzinoms oder des Fibrosarkoms. (Chromik, Daigeler et al. 2007, Daigeler, Brenzel et al. 2008, Daigeler, Chromik et al. 2008, Karlisch, Harati et al. 2013) Nach unserem Wissen wurden bislang keine Versuche mit TRD als Kombinationspartner an humanen Pankreaskarzinomzellen durchgeführt. Demnach wurden in dieser Studie mit BxPC3- und AsPC1-Zellen zwei verschiedene Pankreaskarzinomzellreihen gewählt, um TRD als Kombinationspartner zu evaluieren. Einerseits in Kombination mit dem aktuell wichtigsten Chemotherapeutikum in der Behandlung des Pankreaskarzinoms, Gemcitabin, und andererseits in Kombination mit dem Apoptose-induzierenden TRAIL. 5.1.3StudienzumklinischenEinsatzvonTRD Das als anti-infektive Substanz bekannte Taurolidin wurde im klinischen Einsatz bereits in den 1970er Jahren bei der Behandlung der Peritonitis als intraperitoneale Spüllösung verwendet und zeigte hier bei niedriger Toxizität eine anti-infektive Wirkung und eine Abschwächung des klinischen Verlaufs der Peritonitis.(Browne, MacKenzie et al. 1978, Knight, Skellern et al. 1981, Billing, Fröhlich et al. 1992) In klinischen Studien konnte zudem ein Fehlen toxischer Wirkung von Taurolidin gezeigt werden.(Moser and Marti 1978, Knight, Skellern et al. 1981) Auch bei der Therapie der Katheter-assoziierten Infektionen zeigte Taurolidin bei der intravenösen Verabreichung beim Menschen seine antibakterielle Wirkung.(Koldehoff and Zakrzewski 2004, Olthof, Versleijen et al. 63 2014) Phase IV-Studien beschäftigten sich mit dem Einsatz von TaurolidinLösungen zur Verhinderung Katheter-assoziierter Blutbahninfektionen, zum Beispiel bei parenteraler Ernährung.(Bisseling, Willems et al. 2010, Klek, Szczepanek et al. 2015) Die antitumoröse Wirksamkeit von Taurolidin wurde bisher in zahlreichen tierexperimentellen Studien evaluiert.(McCourt, Wang et al. 2000, Braumann, Stuhldreier et al. 2005, Nestler, Schulz et al. 2005) Hier konnte zum Beispiel eine Hemmung des Tumorwachstums intraperitoneal beziehungsweise subkutan injizierter Kolonkarzinomzellen gezeigt werden bei gleichzeitig fehlender toxischer Wirkung auf Leber- und Nierengewebe.(Braumann, Schoenbeck et al. 2005, Braumann, Stuhldreier et al. 2005) Auch bezüglich der Therapie des Pankreaskarzinoms konnte in tierexperimentellen Studien eine antineoplastische Wirkung gezeigt werden.(Wenger, Kilian et al. 2002) Der erste klinische Einsatz in der onkologischen Therapie beim Menschen wurde für die Verwendung von Taurolidin intravenös bei der Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenem Glioblastom beschrieben.(Stendel, Picht et al. 2004) Hierbei konnte eine partielle Remission der Tumoren gezeigt werden, sowie eine Verbesserung der Lebensqualität dargestellt werden. 2006 wurde eine Falldarstellung veröffentlicht, bei der ein Patient mit zweifachem Rezidiv eines Magenkarzinoms in der palliativen Situation mit Taurolidin intravenös behandelt wurde, nachdem sich unter Behandlung mit klassischen Therapeutika wie zum Beispiel 5-FU eine progressive Erkrankung zeigte. Unter der Therapie mit Taurolidin konnte mittels computertomographischer Untersuchung keine weitere Progression der Tumorlast in dem geschilderten Fall festgestellt werden. Auch hier zeigte Taurolidin keine toxischen Nebenwirkungen. Es zeigten sich zum Beispiel keine negative Auswirkungen auf die Leukopoese, welche sich unter Therapie mit klassischen zystostatischen Medikamenten in der onkologischen Therapie oft zeigen.(Braumann, Winkler et al. 2006) Eine multizentrische Phase III-Studie beschäftigte sich mit der perioperativen intraperitonealen Lavage mit Taurolidin bei der operativen Therapie von jeweils 20 Patienten mit Kolon-, Magen- oder Pankreaskarzinomerkrankung. Es konnte hier eine Reduktion von inflammatorischen Zytokinen gezeigt werden, die von den Autoren der Studie als Surrogat-Parameter für eine potentielle systemische Metastasierung angesehen werden. Bezüglich der lokalen Remissions- und Fernmetastasierungsrate konnten 64 keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden.(Braumann, Gutt et al. 2009) Bezüglich der lokalen bzw. intraperitonealen Applikation von TRD werden weitere Studien an größeren Patientenkollektiven erwartet. In dieser vorliegenden Arbeit sollte TRD als Kombinationspartner für ein klassisches Chemotherapeutikum (Gemcitabin) und ein Therapeutikum aus der Gruppe der „targeted therapeutics“ (TRAIL) evaluiert werden, welche sich nicht selten durch massive Nebenwirkungen auszeichnen und so oft zu einer Dosisreduktion führen. Ein günstiger Kombinationseffekt mit TRD als Kombinationspartner, in dem TRD durch eine Dosisreduktion der klassischen Therapien zur verbesserten Tolerierbarkeit ohne Verschlechterung der Wirkung führt, würde in einer klinischen Studie an 11 Patienten mit metastasierter Melanomerkrankung gezeigt. Hier wurde die konventionelle Therapie mit Interleukin IL-2 kombiniert mit Taurolidin.(O'Brien, Cahill et al. 2006) Weitere Studien an Patienten könnten hier folgen, um die mögliche Kombination von Taurolidin mit klassischen Chemotherapeutika in der Behandlung von Karzinomerkrankungen, wie zum Beispiel des Pankreaskarzinoms zu evaluieren. 5.1.4StudienzumklinischenEinsatzvonTRAIL Mitte der 90er Jahre wurde TRAIL als Mitglied der TNF Familie entdeckt.(Wiley, Schooley et al. 1995) In Arbeiten konnte eine Apoptose-induzierende Wirkung des TRAIL gegenüber menschlichen Krebszellen bei fehlender Toxizität gegenüber gesunden Zellen gezeigt werden.(Ashkenazi, Pai et al. 1999) Bis heute konnten viele rekombinante Modifikationen von TRAIL als antineoplastisch wirksame Substanzen identifiziert werden.(Stuckey and Shah 2013) Durch Modifikation des TRAIL, zum Beispiel durch Bindung an humanes Serumalbumin, konnte in Arbeiten eine Steigerung der Halbwertszeit von TRAIL gezeigt werden.(Müller, Schneider et al. 2010) Auch monoklonale Antikörper gegen TRAIL-Rezeptoren auf Zellen waren bereits in einigen präklinischen Arbeiten mit Tumorzellen von Interesse.(Hellwig and Rehm 2012) In einer tierexperimentellen Studien konnte die Arbeitsgruppe um Harati et al 2016 in einem Modell an der Maus eine Hemmung des Tumorwachstums von vorher injizierten Fibrosarkomzellen durch TRAIL und Taurolidin im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigen. In der Arbeit erfolgte zudem eine histologische Untersuchung von Nieren-, 65 Herz-, Lungen- und Herzgewebe, wobei keine toxische Wirkung auf das jeweilige Gewebe gefunden wurde. Erste Phase-I-Studien beschäftigten sich bereits mit der Wirkung von TRAIL und monoklonalen Antikörper gegen TRAIL-Rezeptoren bei Patienten mit fortgeschrittenen soliden Tumoren. Bei guter Verträglichkeit konnte der Einsatz von zum Beispiel rhTRAIL, Mapatumumab (ein monoklonaler Antikörper gegen TRAIL-R1) beziehungsweise Tigatuzumab (ein monoklonaler Antikörper gegen DR5) keine Remission der Erkrankungen zeigen.(Hotte, Hirte et al. 2008, Forero-Torres, Shah et al. 2010, Herbst, Eckhardt et al. 2010) Eine Phase-II-Studie an Patienten mit non-Hodgkin-Lymphomen konnte jedoch ein Ansprechen auf eine Therapie mit dem monoklonalen Antikörper Mapatumumab demonstrieren, bei zwei Patienten konnte hier sogar eine komplette Remission erreicht werden.(Younes, Vose et al. 2010) Weitere laufende Studien lassen sich finden (http://cliniclatrials.gov), jedoch bisher noch ohne publizierte Ergebnisse. Eine abgeschlossene Phase-Ib/II-Studie (NCT01088347) evaluiert den Einsatz des monoklonalen Antikörpers Mapatumumab in Kombination mit Cisplatin und einer Strahlentherapie bei Patienten mit fortgeschrittenem Zervixkarzinom in Bezug auf Sicherheit, Verträglichkeit und Wirksamkeit, nachdem vorher in präklinischen Studien eine Apoptose-induzierende Wirkung an Zervixkarzinomzellen demonstriert werden konnte. In der Phase-II-Studie NCT00092924 wurden Patienten mit Bronchialkarzinom mit TRM-1, einem monoklonalen Antikörper gegen TRAIL-R1 behandelt. In der angeschlossenen Phase-I/II-Studie NCT00625651 wurde der klinische Benefit einer Behandlung mit dem TRAIL-R2-Antikörper Angiogenesehemmer Conatumumab Bevacizumab bei in Kombination Patienten mit mit dem metastasiertem Kolonkarzinom getestet. Eine weitere, bisher nicht abgeschlossene Studie (NCT01327612) evaluiert die Therapie mit Conatumumab an unterschiedlichen Tumorentitäten (zum Beispiel Kolonkarzinom und Sarkom). 5.2.ErgebnissezurDosisfindungfürdieEinzelsubstanzen 5.2.1.AuswahlderMethode Die Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) hat sich bereits in zahlreichen Studien 66 als verlässliche und praktikable Methode zur Detektion und Quantifizierung von Apoptose und Nekrose in verschiedenen Zellreihen erwiesen. Auch unsere Arbeitsgruppe konnte dies bereits nach Einwirkung von z.B. TRD auf unterschiedliche maligne humane Zellen zeigen. (Chromik, Daigeler et al. 2010, Chromik, Hahn et al. 2010) Der Farbstoff Annexin V kann an das PS binden, wenn dieses an die Außenseite der Membran der Zelle transloziert wird. Dies geschieht in der frühen Phase der Apoptose. Die Unterscheidung zwischen Apoptose und Nekrose erfolgt durch die Kombination mit einem weiteren Farbstoff, PI. 5.2.2.ErgebnissefürTRDalsEinzelsubstanz Es konnte gezeigt werden, dass AsPC1- und BxPC3-Zellen empfindlich auf TRD als Einzelsubstanz sind, wie es bereits vorher schon gezeigt werden konnte. (Chromik, Daigeler et al. 2010) Diese antineoplastische Potenz konnte bisher auch schon für andere humane Karzinomzellreihen demonstriert werden, wobei die Inkubationszeit der Experimente variierten (1-96 Stunden). (Jacobi, Menenakos et al. 2005, Daigeler, Brenzel et al. 2008, Chromik, Daigeler et al. 2010, Karlisch, Harati et al. 2013) Auch die Dosierung schwankte in vorangegangenen Experimenten. In dieser Studie wurde für beide Zellreihen ein breites Spektrum an Dosierung von TRD zur Dosisfindung verwendet (von 100 bis 1000 µmol/l). Im ersten Teil dieser Studie konnte gezeigt werden, dass TRD Apoptose und Nekrose sowohl zeit- als auch dosisabhängig induziert. Dies gilt sowohl für die BxPC3- als auch für die AsPC1-Zellen, wobei die Dosierung von 250 µmol/l sich sowohl bei den BxPC3- als auch bei den AsPC1-Zellen als die niedrigste Dosis effektive Dosis herausstellte. Dabei zeigte sich in der frühen Phase (nach 6 bzw. 12 Stunden Inkubation) vor allem ein Anstieg der apoptotischen Zellen. Eine weitere Inkubation (24 bzw. auch 36 Stunden) und vor allem die Inkubation mit der höchsten Dosierung von 1000 µmol/l führten dann vor allem zur Nekrose der Zellen. 5.2.3.ErgebnissefürrhTRAILalsEinzelsubstanz Bei der Dosisfindung für TRAIL konnte 67 mittels FACS-Analyse ein unterschiedliches Verhalten der BxPC3-Zellen im Vergleich zu den AsPC1-Zellen gezeigt werden. Die BxPC3-Zellen zeigten sich sensibel für die Therapie mit TRAIL. Hierbei wurde erneut ein breites Spektrum an Dosierung (von 50 bis 500 ng/ml) verwendet. Es zeigte sich eine sowohl zeit- als auch dosisabhängige Reduktion der vitalen Zellen. Ähnlich zu den Ergebnissen der Dosisfindung für TRD ließ sich nach kürzerer Inkubation (6 und 12 Stunden) vor allem die Apoptose der BxPC3-Zellen feststellen und die weitere Inkubation führte vor allem zu einem signifikanten Anstieg nekrotischen Zellen. Dies konnte bereits in Experimenten gezeigt werden. (Wicker, Sahu et al. 2010, Sahu, Batra et al. 2011) Die Konzentration von TRAIL 50 ng/ml zeigte sich als die niedrigste Konzentration, welche die vitalen BxPC3-Zellen signifikant reduzierte. Deswegen wurde diese (mit der höheren Konzentration 250 ng/ml) für die Kombinationsversuche mit TRD verwendet. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der BxPC3-Zellen zeigten sich die AsPC1-Zellen in den Experimenten zur Dosisfindung resistent gegenüber der Inkubation mit TRAIL. Zu keinem Zeitpunkt ließ sich auch nach multiplen Ansätzen der FACS-Analyse eine signifikante Reduktion vitaler oder ein signifikanter Anstieg apoptotischer und nekrotischer Zellen nachweisen. Diese Resistenz gegenüber TRAIL wurde bereits in Studien beschrieben. (Guzmán, Johnson et al. 2011, Büneker, Yu et al. 2012) Um die Sensibilität der AsPC1-Zellen gegenüber TRAIL zur erhöhen, wurden bereits Strategien evaluiert. Da unseres Wissens bisher keine Kombinationstherapien mit TRAIL und TRD an humanen Pankreaskarzinomzellen durchgeführt wurden, erscheint dieses Experiment als eine weitere Möglichkeit nachzuweisen, dass es Strategien gibt, um die Sensibilität der Pankreaskarzinomzellen auf TRAIL zu erhöhen. 5.2.4.ErgebnissefürGemcitabinalsEinzelsubstanz Gemcitabin stellt als Antimetabolit die Substanz der ersten Wahl in vielen Therapieregimen zur Behandlung des Pankreaskarzinoms dar. Es wird in der adjuvanten Therapie des Pankreaskarzinoms für 6 Monate angewendet, ist aber auch Mittel der Wahl in der palliativen und metastasierten Situation, oft in Kombination mit anderen Substanzen. (Adler, Seufferlein et al. 2007) Da die Therapie mit Gemcitabin aber durch teilweise schwerwiegende Nebenwirkungen 68 gekennzeichnet ist, erscheint die Möglichkeit, durch Kombination mit einer anderen Substanz (z. B. TRD) die Sensitivität der Karzinomzellen zu erhöhen und so eventuell eine Dosisreduktion zu ermöglichen, reizvoll. Die Experimente zur Dosisfindung lieferten in dieser Studie ähnliche Ergebnisse wie die zur Dosisfindung für TRAIL: die BxPC3- und AsPC1-Zellen zeigten jeweils ein unterschiedliches Verhalten, gemessen mit der FACS-Analyse zur Quantifizierung von Apoptose und Nekrose. Die BxPC3-Zellen zeigten sich sensitiv auf eine Inkubation mit Gemcitabin in verschiedenen Konzentrationen (von 0,01 bis 10 µmol/l), dies konnte bereits nach 6 Stunden Inkubation nachgewiesen werden. Die Reduktion der vitalen Zellen zeigte dabei eine Dosisabhängigkeit für die Konzentrationen 0,1 bis 10 µmol/l. Die Auswahl der Konzentrationen für die Kombinationsexperimente erfolgte für Gemcitabin 0,1 µmol/l, da sich diese als die niedrigste Konzentration mit signifikant nachweisbarer Reduktion vitaler Zellen erwies und für Gemcitabin 10 µmol/l, da sich diese als die Konzentration mit der ausgeprägtesten Wirkung auf die BxPC3-Zellen zeigte. Die Experimente zur Dosisfindung für die AsPC1-Zellen ergaben (ähnlich denen für TRAIL), dass Gemcitabin keine signifikante Veränderung in der Quantität der vitalen, apoptotischen oder nekrotischen AsPC1-Zellen ergab. Auch die höchste Konzentration 10 µmol/l konnte auch nach Inkubation für 24 Stunden keine signifikante Wirksamkeit erweisen, gemessen mittels FACS-Analyse. 5.3.ErgebnissederKombinationsexperimente 5.3.1.AuswahlderMethoden Nach den Experimenten zur Dosisfindung für die verwendeten Substanzen TRD, TRAIL und Gemcitabin erfolgte im zweiten Teil der Studie eine Kombination der Substanzen TRAIL und Gemcitabin jeweils mit TRD für ausgewählte Substanzkonzentrationen. Erneute wurde die Durchflusszytometrie verwendet, um die Rate an vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen für die jeweiligen Substanzkombinationen zu quantifizieren. Als weitere Methode, die Zellvitalität zu verifizieren, wurde zusätzlich zur FACS-Analyse der MTT-Test verwendet. Dieser gibt über das Ausmaß der Umsetzung von dem Farbstoff Tetrazoliumbromid zu 69 Formazan die Zellaktivität im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe wieder, da diese Reaktion nur durch Enzyme gesunder Mitochondrien stattfinden kann. Da die Zellaktivität aber noch keine Aussage zur Proliferationsfähigkeit macht, wurde der BrdU-Assay bei den Versuchen mit den Substanzkombinationen verwendet, um mögliche hemmende Effekt auf die BxPC3- bzw. AsPC1-Zellen nachzuweisen. Das Ausmaß des Einbaus des Nukleotids Bromdesoxyuridin anstelle von Thymidin in neu synthetisierte DNA wurde für die jeweilige Substanz und die Kombinationen gemessen. 5.3.2.ErgebnissezurSubstanzkombinationTRDmitrhTRAIL In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kombination von TRD mit TRAIL die Zellvitalität signifikant mehr reduziert, als die jeweils verwendeten Einzelsubtanzen. Die Ergebnisse des MTT-Tests zeigten, dass die Kombination der Wirksubstanzen den zytotoxischen Effekt sowohl auf BxPC3-Zellen als auch die AsPC1-Zellen potenzierte. Dies galt für die Kombination mit der höheren TRAIL-Dosis (250 ng/ml), aber auch die Subtanzkombination von TRD mit TRAIL 50 ng/ml resultierte in einer signifikant niedrigen Zellaktivität im Vergleich zu den jeweiligen Einzelsubtanzen. Der Effekt war für die BxPC3-Zellen so massiv, dass sich lediglich eine Restaktivität von 2,5 % (Kombination TRD mit TRAIL 50 ng/ml) und 1,9 % (Kombination TRD mit TRAIL 250 ng/ml) ergab. Diese nahezu nicht mehr vorhandene Zellaktivität zeigte sich bei den AsPC1-Zellen zwar nicht, allerdings ließ sich deutlich sehen, dass die eigentliche Resistenz der AsPC1Zellen gegenüber TRAIL, wie sie in den Experimenten zur Dosisfindung gesehen wurde, überwunden wurde. Die Zellvitalität war für beide Substanzkombinationen signifikant niedriger, als für die Inkubation mit TRD alleine. Dies ließ sich auch mittels FACS-Analyse demonstrieren. Auch hier war der Effekt auf Reduktion vitaler Zellen für die Kombinationen deutlicher als für die Einzelsubstanzen, wobei dies, anders als in den Ergebnissen des MTT-Tests, für die Kombination TRD mit TRAIL 50 ng/ml keine Signifikanz bei den AsPC1-Zellen erreichte. Die Kombination mit TRAIL 250 ng/ml zeigte aber auch hier wieder ein überwinden der eigentlichen TRAIL-Resistenz der AsPC1-Zellen. 70 5.3.3.ErgebnissezurSubstanzkombinationTRDmitGemcitabin Es konnte gezeigt werden, dass der kombinierte Einsatz von TRD mit Gemcitabin zu einer signifikant größeren Reduktion der Zellvitalität führte im Vergleich zur Inkubation mit der Einzelsubstanz Gemcitabin. Bei beiden Kombinationen (TRD mit Gemcitabin 0,1 bzw. 10 µmol/l) zeigte sich der cytotoxische Effekt signifikant deutlicher als für die Therapie mit Gemcitabin alleine. Dies konnte für beide Zellreihen mittels MTT Test gezeigt werden. Im Vergleich zur Therapie mit TRD alleine zeigte sich nur die Kombination mit der höheren Gemcitabin-Konzentration 10 µmol/l signifikant wirksamer und konnte so einen additiven Effekt der beiden Substanzen demonstrieren. 5.4.Ausblick Es konnte gezeigt werden, dass TRD als Einzelsubstanz antineoplastische Wirkung auf die verwendeten Pankreaskarzinomzellreihen BxPC3 und AsPC1 hat. In Kombination mit den verwendeten Subtanzen TRAIL und Gemcitabin zeigte sich bei den BxPC3-Zellen eine synergistische Wirkung der Substanzen und bei den für die Behandlung mit TRAIL gegenüber unsensiblen AsPC1-Zellen ein überwinden der Resistenz. Dieses unterschiedliche Verhalten der beiden Zellreihen legt nahe, dass weitere Zellreihen getestet werden könnten, um in vitro weitere Daten zu gewinnen. Ein nächster Schritt könnte darüber hinaus die Entwicklung eines XenograftModells, zum Beispiel an der Maus sein um die Effektivität und die Auswirkung der Testsubstanzen und deren Kombination in vivo zu testen. Möglicherweise könnte TRD in Zukunft ein interessanter Kombinationspartner für bewährte (Gem) und neuere Chemotherapeutika (TRAIL) darstellen, der er ermöglicht die Empfindlichkeit zu erhöhen bzw. Resistenzen zu überwinden. Weitere zukünftige Versuche werden notwendig sein, um dies zu untersuchen. 71 6.Zusammenfassung Das Pankreaskarzinom gehört mit seiner niedrigen 5 Jahresüberlebensrate von 89% zu einer der Karzinomerkrankungen des Menschen mit sehr schlechter Prognose. Der einzige kurative Therapieansatz ist die Resektion in sano gefolgt von einer Chemotherapie, wobei hier Gemcitabin den Goldstandard darstellt. Auch in der palliativen Situation ist Gemcitabin der Grundpfeiler der Behandlung. Da sich diese Substanz jedoch durch ein ausgeprägtes Nebenwirkungsspektrum auszeichnet, war das Ziel dieser Arbeit, mögliche Alternativen oder geeignete Kombinationspartner für Gemcitabin zu evaluieren. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass der Aminosäureabkömmling TRD eine antineoplastische Apoptose-induzierende Wirkung auf die Pankreaskarzinomzellreihen BxPC3 und AsPC1 ausübt. Die Kombination von TRD mit dem Protein TRAIL beziehungsweise mit Gemcitabin ergab in dieser Arbeit einen günstigen Kombinationseffekt bezüglich der apoptose- und nekroseinduzierenden Wirkung bei den BxPC3-Zellen und ein Überwinden der Resistenz der AsPC1-Zellen zum Beispiel gegenüber TRAIL. Dazu wurden Pankreaskarzinomzellen in Kultur mit den jeweiligen Wirksubstanzen und Kombinationen inkubiert. Die Prozentsätze der vitalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen wurden mittels FACS-Analyse dargestellt. In den Kombinationsexperimenten wurde zusätzlich zur Messung der jeweiligen Proliferationshemmung der Substanzkombinationen der BrdU-Test sowie zur Messung der Zellaktivität der MTT-Test verwendet. Zusammenfassend konnte in der Arbeit gezeigt werden, dass TRD als Einzelsubtanz zu einer zeit- und dosisabhängigen Apoptose- und Nekroseinduktion führt. Für TRAIL und Gemcitabin zeigten sich lediglich die BxPC3-Zellen sensibel, Kombinationsexperimenten die AsPC1-Zellen konnte gezeigt jedoch werden, nicht. dass In den beide Subtanzkombinationen (TRD mit Gemcitabin beziehungsweise TRD mit TRAIL) in beiden Zellreihen eine additive synergistische Wirkung im Vergleich zu den Einzelsubtanzen ausübten. 72 7.Literaturverzeichnis Adler, G., T. Seufferlein, S. C. Bischoff, H. J. Brambs, S. Feuerbach, G. Grabenbauer, S. Hahn, V. Heinemann, W. Hohenberger, J. M. Langrehr, M. P. Lutz, O. Micke, H. Neuhaus, P. Neuhaus, H. Oettle, P. M. Schlag, R. Schmid, W. Schmiegel, K. Schlottmann, J. Werner, B. Wiedenmann and I. Kopp (2007). "[S3Guidelines "Exocrine pancreatic cancer" 2007]." Z Gastroenterol 45(6): 487-523. Ardengh, J. C., G. A. de Paulo and A. P. Ferrari (2003). 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A 2: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, TRAILundKombinationen(AsPC1-Zellreihe) Signifikanzniveau angegeben als Vergleich zwischen den jeweiligen Gruppen (***p£0,001,**p£0,01,*p£0,05,nsnichtsignifikant) Abb. A 3: Reduktion vitaler Zellen, Induktion von Apoptose und Nekrose durch TRD, GemundKombinationen(BxPC3-Zellreihe) Signifikanzniveau angegeben als Vergleich zwischen den jeweiligen Gruppen (***p£0,001,**p£0,01,*p£0,05,nsnichtsignifikant) 86 Danksagung Für die Möglichkeit der Promotion und die Unterstützung möchte ich mich zunächst bei Herrn Prof. Dr. Waldemar Uhl, Direktor der Chirurgischen Klinik am St. Josef Hospital in Bochum bedanken. Mein größter Dank gilt meinem Doktorvater Herrn PD Dr. med. Ansgar Michael Chromik für die Überlassung des Themas der Dissertation und die langandauernde, geduldige fachliche und persönliche Betreuung während der ganzen langen Zeit. Eine zuverlässigere Betreuung hätte ich mir nicht wünschen können. Vielen Dank für die Zuversicht und stetige Motivation diese Arbeit erfolgreich abzuschließen. Außerdem möchte ich mich bei Annegret Flier für ihre unschätzbare Hilfe bei der Arbeit im Labor bedanken. Herrn Dr. med. Daniel Bulut danke ich sehr für die Einführung und die Unterstützung im Arbeiten mit der Durchflusszytometrie. Auch Kirsten Mros, Marie Buchholz und den anderen MitarbeiterInnen des wissenschaftlichen Labors im St. Josef Hospital und der ganze Arbeitsgruppe gilt mein herzlichster Dank für die geduldige Unterstützung und die stetige Hilfsbereitschaft bei meiner Arbeit. Von ganzem Herzen danke ich meinen Eltern Andrea und Norbert May, die mich nicht nur bezüglich dieser Arbeit und des Studiums fortwährend unterstützt haben, sondern auch mein ganzes Leben mit Liebe und Vertrauen zur Seite stehen. Ein ganz besonderer Dank dafür, dass sie immer das Beste für mich und meinen Bruder Raphael May tun und alles Erdenkliche bereit sind für uns zu geben. Nicht zuletzt und nicht unerwähnt möchte ich meinen Bruder Raphael May und meine ganze große Familie lassen. Herzlichen Dank für jegliche Unterstützung und Beistand. Lebenslauf Persönliche Daten Name Christina May Geburtstag 24.05.1985 Geburtsort Gelsenkirchen Familienstand ledig Schulausbildung 1991-1995 Gemeinschaftsgrundschule Urbanusstraße, Gelsenkirchen 1995-2004 Leibniz-Gymnasium, Gelsenkirchen mit Abschluss Abitur Hochschulausbildung 2004-2010 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum 09/2006 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 2009/2010 Praktisches Jahr - Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe, Marien-Hospital Witten - Klinik für Innere Medizin, Spitalzentrum Oberwallis, Schweiz - Chirurgische Klinik des St. Josef Hospital, Bochum 01/2011 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung und Approbation Beruf seit 2011 Assistenzärztin für Luisenhospital Aachen Gynäkologie und Geburtshilfe,
