1 Einleitung - Universität Hamburg
Werbung
Mutp53 Interaktom in einem murinen Tumorzellmodell Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) am Department Chemie der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften an der Universität Hamburg vorgelegt von Dipl. Biochem. Annette März aus Bad Münstereifel Hamburg, Januar 2008 Diese Arbeit wurde am Heinrich-Pette-Institut für Experimentelle Virologie und Immunologie an der Universität Hamburg in der Arbeitsgruppe von Herrn Professor Dr. Deppert, Abteilung Tumorvirologie, durchgeführt und von Herrn Dr. Genrich V. Tolstonog betreut. 1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Deppert, Heinrich-Pette-Institut Hamburg 2. Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Hahn, Universität Hamburg “The more we study the major problems of our time, the more we come to realize that they cannot be understood in isolation. They are systemic problems, which means that they are interconnected and interdependent.” Fritjof Capra. Für meine Eltern Inhaltsverzeichnis I INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS .......................................................................................................................... I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................................. IV ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................................................... 1 SUMMARY .............................................................................................................................................. 3 1 EINLEITUNG ........................................................................................................................................ 5 1.1 GRUNDLAGEN DER TUMORGENESE ................................................................................................... 5 1.2 ONKOGENE UND TUMORSUPPRESSORGENE ...................................................................................... 7 1.3 DAS TUMORSUPPRESSORPROTEIN P53 ............................................................................................ 7 1.3.1 Historischer Rückblick ........................................................................................................... 7 1.3.2 Struktur von p53 .................................................................................................................... 8 1.3.3 Modifikationen von p53 .......................................................................................................... 9 1.3.4 Funktion von p53 ................................................................................................................. 11 1.4 MUTANTES P53: ZUGEWINN ONKOGENER EIGENSCHAFTEN ............................................................. 15 1.4.1 Art und Häufigkeit von Mutationen in p53............................................................................ 15 1.4.2 Hinweise auf einen gain-of-function bei bestimmten mutp53 Spezies ................................ 18 1.4.3 Mögliche Mechanismen des gain-of-function ...................................................................... 19 1.5 IN VIVO P53 MAUSMODELLE............................................................................................................ 21 1.6 DIE MAUS TUMOR-ZELLLINIE METHA .............................................................................................. 22 1.7 ZIELSETZUNG DER ARBEIT.............................................................................................................. 23 2 MATERIAL ......................................................................................................................................... 25 2.1 CHEMIKALIEN ................................................................................................................................ 25 2.2 LÖSUNGEN UND PUFFER ................................................................................................................ 25 2.3 ENZYME ........................................................................................................................................ 28 2.4 DNA- UND PROTEIN MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS .................................................................. 28 2.4.1 DNA Molekulargewichtsstandards ....................................................................................... 28 2.4.2 ProteinMolekuargewichtsstandards ..................................................................................... 28 2.5 PLASMIDE ..................................................................................................................................... 28 2.6 BAKTERIENSTÄMME ....................................................................................................................... 29 2.7 OLIGONUKLEOTIDE, PCR- UND SEQUENZIERPRIMER ....................................................................... 29 2.8 EUKARYOTISCHE ZELLLINIEN .......................................................................................................... 30 2.9 NÄHRMEDIEN UND ANTIBIOTIKA ...................................................................................................... 30 2.10 ANTIKÖRPER ............................................................................................................................... 31 2.10.1 Primärantikörper ................................................................................................................ 31 2.10.2 Sekundärantikörper ........................................................................................................... 31 2.11 KIT SYSTEME .............................................................................................................................. 31 2.12 VERBRAUCHSMATERIALIEN ........................................................................................................... 32 2.13 COMPUTER-SOFTWARE ............................................................................................................... 32 2.14 GERÄTE ...................................................................................................................................... 32 3 METHODEN ....................................................................................................................................... 34 3.1 ZELLKULTUR UND ZELLPASSAGE..................................................................................................... 34 3.2 CHROMATIN-IMMUNPRÄZIPITATION-SEQUENZIERUNG (CHIP-SEQ) ................................................... 34 3.2.1 Protein-DNA Isolierung ........................................................................................................ 34 3.2.2 Immunpräzipitation .............................................................................................................. 35 3.2.3 Klonieren der DNA Fragmente ............................................................................................ 35 3.3 RNA-IP (RNA-IMMUNPRÄZIPITATION) ............................................................................................ 37 3.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) .......................................................... 38 3.5 WESTERN-BLOT / IMMUNBLOT (SEMI-DRY VERFAHREN) ................................................................... 38 3.6 DETEKTION (ECL-METHODE) ......................................................................................................... 39 3.7 IMMUNPRÄZIPITATION IN GROßEM MAßSTAB .................................................................................... 39 3.8 2D-GELELEKTROPHORESE ............................................................................................................. 40 3.9 MALDI TOF MASSENSPEKTROMETRIE ............................................................................................ 40 3.10 IMMUNFLUORESZENZ ................................................................................................................... 41 3.11 KONFOKALE LASER SCANNING MIKROSKOPIE (CLSM) .................................................................. 41 Inhaltsverzeichnis II 3.12 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE................................................................................................. 42 3.13 PROTEIN-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG NACH BRADFORD ........................................................... 42 3.14 RNAI TECHNOLOGIE .................................................................................................................... 42 3.15 TRANSFEKTION VON METHA ZELLEN MIT AMAXA ........................................................................... 43 3.16 DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACS ANALYSE) ................................................................................ 44 3.17 LIVE CELL IMAGING MIKROSKOPIE ................................................................................................ 45 3.18 VIABILITÄTSMESSUNG .................................................................................................................. 45 3.19 INJEKTION VON METHA ZELLEN IN BALB/C MÄUSE UND AUFARBEITUNG DER PROBEN ..................... 46 3.19.1 Ascites ............................................................................................................................... 46 3.19.2 Solide Tumore ................................................................................................................... 46 3.20 MICROARRAY ANALYSE ................................................................................................................ 46 4 ERGEBNISSE .................................................................................................................................... 49 4.1 DIE MURINE METHA TUMORZELLLINIE ALS MODELLSYSTEM FÜR DIE FUNKTIONSANALYSE VON MUTP53 .......................................................................................................................................................... 49 4.1.1 MethA Zellen in vitro ............................................................................................................ 49 4.1.2 MethA Zellen in vivo ............................................................................................................ 50 4.2 ERNIEDRIGUNG DES EXPRESSIONSNIVEAUS VON METHA MUTP53 DURCH RNA INTERFERENZ ........... 51 4.3.1 Analyse von MethA Zellen nach Expression von dsRNA durch Live Cell Imaging Mikroskopie ................................................................................................................................... 54 4.3.2 Validierung und Quantifizierung des durch dsRNA induzierten Wachstumsarrests durch Viabilitätsmessung ........................................................................................................................ 59 4.4 ANALYSE DER FUNKTION VON MUTP53 AUF DER EBENE DES GENOMS .............................................. 62 4.4.1 Expressionsprofiluntersuchung durch die Microarray Technologie ..................................... 62 4.4.2 ChIP-Seq zur Analyse von in vivo DNA Bindungsstellen von MethA mutp53..................... 73 4.5 UNTERSUCHUNG DER MUTP53 FUNKTION AUF DER EBENE DES TRANSKRIPTOMS .............................. 78 4.5.1 Gesamt RNA-Immunpräzipitation (RNA IP) zur Analyse der in vivo Interaktion von mutp53 mit RNA ......................................................................................................................................... 78 4.6 GENOMISCHE VERTEILUNG DER MUTP53 BINDUNGSSTELLEN UND KODIERENDEN REGIONEN DER MUTP53-GEBUNDENEN TRANSKRIPTE ................................................................................................... 80 4.7 UNTERSUCHUNG DER MUTP53 FUNKTION AUF DER EBENE DES PROTEOMS ...................................... 82 4.7.1 Proteomanalyse zur Identifizierung potentieller Proteininteraktionspartner von mutp53 .... 82 4.7.2 Verifizierung der potentiellen Interaktionspartner von mutp53 mittels konfokaler Mikroskopie ................................................................................................................................... 86 4.7.3 Die Bedeutung der RNA in Interaktionen von mutp53 mit anderen Proteinen .................... 88 5 DISKUSSION ..................................................................................................................................... 90 5.1 DIE EXPRESSION VON KLEINEN DSRNAS HAT UNABHÄNGIG VON DEREN SEQUENZ EINE DEUTLICHE REDUKTION DES WACHSTUMS SOWIE DES ÜBERLEBENS ZUR FOLGE ...................................................... 90 5.2 DER KNOCKDOWN VON MUTP53 POTENZIERT DIE DURCH DSRNA-VERMITTELTEN EFFEKTE ............... 93 5.3 ÜBERGEORDNETE FUNKTION VON MUTP53 IN DER REGULATION DER GENEXPRESSION ..................... 94 5.3.1 Genomische Verteilung und Sequenzkomposition der mutp53-Bindungsorte .................... 95 5.3.2 Einfluss von mutp53 auf die Genexpression ....................................................................... 97 5.3.3 Bindung von mutp53 an regulatorische Transkripte ............................................................ 98 5.3.4 Die Integration der ChIP und RIP Daten deuten auf eine Beteiligung von mutp53 an der Ausbildung von transcription/processing factories hin............................................................... 100 5.3.5 RNA bindende Proteine bilden RNA-stabilisierte Komplexe mit mutp53 .......................... 101 5.4 MÖGLICHE BETEILIGUNG VON MUTP53 AM SPINDELKONTROLLPUNKT DER MITOSE .......................... 102 6 LITERATUR ..................................................................................................................................... 104 7 ANHANG .......................................................................................................................................... 121 7.1 LISTE DER DURCH CHIP-SEQ IDENTIFIZIERTEN DNA-FRAGMENTE .................................................. 121 7.2 LISTE DER DIFFERENTIELL REGULIERTEN GENE ZWISCHEN MIT PSUPSCR UND PSUPSHP53 TRANSFIZIERTEN METHA ZELLEN 24H NACH TRANSFEKTION ................................................................ 124 7.3 LISTE DER DURCH DIE RNA-IP IDENTIFIZIERTEN MUTP53 GEBUNDENEN TRANSKRIPTE .................... 125 7.4 LISTE DER IN MIT DSRNA EXPRESSIONSVEKTOREN TRANSFIZIERTEN IM VERGLEICH ZU ADHÄRENTEN METHA ZELLEN HOCHREGULIERTEN GENE ......................................................................................... 127 7.5 LISTE DER IN MIT DSRNA EXPRESSIONSVEKTOREN TRANSFIZIERTEN IM VERGLEICH ZU ADHÄRENTEN METHA ZELLEN HERUNTERREGULIERTEN GENE .................................................................................. 128 7.6 VEKTORKARTEN .......................................................................................................................... 129 7.6.1 pBluescript II sk (+) ............................................................................................................ 129 Inhaltsverzeichnis III 7.6.2 pENTR/H1/TO ................................................................................................................... 129 7.6.3 pSuperior.neo.GFP ............................................................................................................ 130 7.7 SICHERHEITSTECHNISCHE DATEN...................................................................................... 131 7.7.1 Gefahrenstoffe ................................................................................................................... 131 7.7.2 Verzeichnis der Gefahrensymbole .................................................................................... 133 7.7.3 Verzeichnis der R- und S- Sätze ....................................................................................... 133 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ................................................................................................... 135 DANKSAGUNG .................................................................................................................................. 136 Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A APC APS ARE ARF AS ATM ATP ATR BrdU BS BSA bp C °C CAK CBB cdk cDNA CTAB ChIP ChIP-Seq C-Terminus Cy Cys DAPI ddNTPs DEPC DHB DMEM DMSO DNA DNase dNTPs dsRNA DTE DTT dUTP E1A ECL EDTA FACS FCS G GFP Glu Gly GOF HAT HDAC HEPES hnRNA Adenosin Anaphase Promoting Komplex Ammoniumperoxodisulfat AU rich element alternative reading frame Aminosäure Ataxia telangiectasia mutated Adenosintriphosphat ATM-related Bromodesoxyuridin Bindungsstelle Bovines Serumalbumin Basenpaare Cytosin Grad Celsius CDK-aktivierende Kinase coomassie brilliant blue cyclin dependent kinase copy DNA N-cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid (Cetavlon) Chromatin Immunpräzipitation Chromatin Immunpräzipitation-Sequenzierung Carboxyl-Terminus Cyanin Cystein 4,6 Diamidino-2-phenylidol Didesoxynukleotide Diethylpyrocarbonat 2,5 Dihydroxybenzoesäure Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonuklease Desoxynukleotide doppelsträngige RNA Dithioerythritol Dithiothreitol Desoxyuridintriphosphat early region 1 A Enhanced Chemoluminescence Ethylendiamintetraessigsäure Fluorescence Activated Cell Sorting Fötales Kälberserum Guanosin Green Fluorescent Protein Glutamin Glycin gain-of-function, Zugewinn von Funktionen Histon-Acetylase Histon-Deacetylase (N-2-Hydroxyethyl)-piperazin-N’(2-ethansulfonsäure) heterogene nukleäre RNA IV Abkürzungsverzeichnis hnRNP HPV IAA IEF IgG Ile INK4 IPTG IRES kb kDa LB LINE LTR LOH M MALDI ToF MS MAR/SAR MCS Mdm2 Met mg min ml mRNA mut MW nt N-Terminus OD p.a. PAGE PBS PCR PGS Phe pI pRb PTGS Pu Py RACE RISC RIP/ RNA-IP RNA RNAi RNase RPMI rRNA RT RT-PCR SAC scr SDS SINE heterogenes nukleäres Ribonukleoprotein humanes Papillomvirus Iodoacetamid Isoelektrische Fokussierung Immunglobulin G Isoleucin Inhibitors of cdk4 Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid internal ribosome entry site Kilobasen Kilodalton Luria-Bertani long interspersed nucleotide element long terminal repeat loss of heterozygosity Molar matrix assisted laser desorption/ionisation time of flight mass spectrometry nuclear matrix attachment region/scaffold attached region multiple cloning site Murine double minute 2 Methionin Milligramm Minute Milliliter messenger RNA mutante(s) molecular weight, Molekulargewicht Nukleotide Amino-Terminus optische Dichte pro analysis Polyacrylamid Gelelektrophorese Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung Polymerase Kettenreaktion Protein G Sepharose Phenylalanin isoelektrischer Punkt Retinoblastomaprotein Posttranscriptional Gene Silencing Purin Pyrimidin rapid amplification of cDNA ends RNA-induced silencing complex RNA-Immunipräzipitation Ribonukleinsäure RNA interference Ribonuklease am Roswell Park Memorial Institute entwickeltes Zellkulturmedium ribosomale RNA Raumtemperatur reverse transcriptase PCR spindle assembly checkpoint scrambled Natriumdodecylsulfat short interspersed nucleotide element V Abkürzungsverzeichnis siRNA shRNA SOB SOC SV40 T TAE TBST TCA TE TEMED Tris TSS UTR UV WAP wt w/v v/v X-Gal small interfering RNA short hairpin RNA super optimal broth super optimal broth, catabolite repression Simian Virus 40 Thymidin Tris-Acetat-EDTA Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 Trichloressigsäure Tris-EDTA N,N,N’,N’ Tetramethyl ethylendiamin Trishydroxymethylaminomethan Transkriptionelle Startstelle untranslated region Ultraviolette Strahlung whey acidic protein wildtyp Gewicht pro Volumen Volumen pro Volumen 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid VI Zusammenfassung 1 ZUSAMMENFASSUNG Mutp53 Interaktom in einem murinen Tumorzellmodell Missense Mutationen im p53 kodierenden Gen treten nicht nur häufig in humanen Tumoren auf, sondern sind auch in spontan immortalisierten und chemisch transformierten murinen Tumorzellen anzutreffen. Ähnlich wie bei menschlichen Zellen, findet eine Selektion für bestimmte missense Trp53 Mutationen statt, die die Expression von mutantem p53 bedingen. Obwohl mutante p53 Proteine die Fähigkeit verloren haben, pro-apoptotische und Wachstumsarrest auslösende Gene zu transaktivieren, können sie dennoch spezifisch mit Nukleinsäuren und Proteinen interagieren und assoziieren mit Chromatin. Die Expression von mutantem p53 wurde mit Tumor-unterstützenden Effekten in Verbindung gebracht, was als sog. gain-of-function bekannt ist. Um die molekularen Wirkungsmechanismen von mutp53 in einem murinen Tumorzellmodell zu untersuchen, wurde die mutp53 exprimierende MethA Zelllinie verwendet, die aus einem Methylcholanthren induzierten Fibrosarkom einer BALB/c Maus etabliert wurde. Die Technik der RNA induzierten spezifischen Reduktion der Genexpression (RNAi) wurde verwendet, um die mutp53 Expression zu dämpfen und das Verhalten der Zellen unter mutp53 Defizit zu beobachten. Dazu wurden MethA Zellen mit einem Vektor transfiziert, der die Expression einer p53 mRNA spezifischen- oder Kontroll-shRNA ermöglicht. Obwohl der mutp53 Spiegel unmittelbar nach der Transfektion effektiv reduziert werden konnte, war eine Expansion stabiler, mutp53-defizienter Klone nicht möglich. Mittels live cell Imaging Mikroskopie konnte beobachtet werden, dass das Wachstum und Überleben von MethA Zellen bereits durch die Expression einer Kontroll-shRNA dramatisch reduziert wird. Durch die Reduktion von mutp53 wurde dieser Wachstumsarrest sogar noch potenziert. Die mit pSUPshRNA transfizierten MethA Zellen weisen im Vergleich zu untransfizierten Zellen eine stark erhöhte Expression zahlreicher Interferonantwort-assoziierter Gene wie Eif2ak2 (dsRNA abhängige Proteinkinase) und Oas2 (2‘-5‘ Oligonukleotidsynthetase 2) auf, deren Aktivität höchstwahrscheinlich für den beobachteten Wachstumsarrest verantwortlich sind. Die Grundvoraussetzung für eine detaillierte Analyse und Erklärung der Beobachtungen ist die Identifikation funktioneller in vivo Partner von mutp53 und die Charakterisierung dieser Interaktion. Für diesen Zweck wurden Techniken auf Genom-, Transkriptom- sowie Proteomebene verwendet. Durch die ChIP-Seq Methode, die die Identifizierung von mutp53 Bindungsstellen erlaubt, konnte festgestellt werden, dass mutp53 bevorzugt an repetitive DNA Sequenzen bindet, die entfernt von transkriptionellen Startstellen kodierender Gene liegen. Um den Einfluss von mutp53 auf die Transkription zu untersuchen, wurden die Genexpressionprofile der transfizierten Zellen verglichen. Obwohl der Vergleich zwischen den Effekten der Kontroll-shRNA und p53 shRNA wenig aufschlussreich war, da die Zusammenfassung 2 Nebeneffekte der exogenen dsRNA überwogen, lieferte er einige Hinweise auf einen positiven Einfluss von mutp53 auf den Fortgang der Mitose. Aufgrund vieler Indizien, die für eine funktionelle Verbindung zwischen mutp53 und zellulärer dsRNA sprechen, wurde eine RNA-Immunpräzipitation durchgeführt. Durch Sequenzanalyse der mutp53 assoziierten RNA konnte eine Anreicherung nicht-kodierender, regulatorischer RNAs, nämlich B2-SINE Transkripte und 3' UTR Transkripte identifiziert werden. Dies lieferte erste Hinweise auf eine Beteiligung von mutp53 an der posttranskriptionellen Regulation. Diese Ergebnisse wurden durch die Analyse der mutp53 assoziierten Proteine verstärkt. In mutp53 MultiproteinKomplexen wurden RNA bindende Proteine der hnRNP Familie, YB1 und Hsc70, die als Ribonukleoprotein-Komplexen in funktionelle Domänen im Nukleus organisiert sind, identifiziert. Zusammenfassend lässt sich erkennen, dass DNA/RNA bindendes mutp53 Protein eine strukturelle Komponente von Transkriptions- und Prozessierungseinheiten ist und durch die Assoziation mit regulatorischen RNAs sowie RNA bindenden Proteinen an der Zelltyp- und Kontextspezifischen Organisation des Chromatins beteiligt sein könnte. Diese Hypothese wird auch durch die Bindung von mutp53 an MAR/SAR Elemente und anderen repetitiven DNA-Elementen unterstützt. Summary 3 SUMMARY Mutp53 interactome in a mouse tumor cell model Missense mutations in the gene encoding p53 are not only frequent genetic alterations in human tumor tissue and cell lines, but also in spontaneously immortalized and chemically transformed mouse cells. Similar to human cells, allelic selection for missense Trp53 mutations leads to the expression of mutant p53 (mutp53) proteins. Although mutp53 proteins have lost the transcriptional activity towards pro-apoptotic and growth arrest genes, they can still undergo the specific interactions with nucleic acids and proteins characteristic for wild-type p53 and are targeted to chromatin. The expression of mutp53 has been connected to a gain-of-function by contributing to tumorigenesis. To study the molecular mechanisms of the tumor-promoting and -supporting effect of mutp53 in a mouse tumor cell culture model, we used the mutp53 expressing MethA tumor cell line, which was established from a methylcholanthrene-induced fibrosarcoma in BALB/c mice. As a tool for studying mutp53 activity we used vector-driven expression of shRNA. Although mutp53 down-regulation was efficient immediately after transfection, none of the cells with a reduced mutp53 level could be expanded into stable clones. With the live cell imaging microscopy technique it could be observed that the transfection with dsRNA has a dramatic effect on the growth and survival of MethA cells. The reduction of mutp53 even potentiates the growth arrest. In contrast to untransfected MethA cells the transfection with dsRNA results in a dramatic increase in expression of genes, which are functionally related to the interferon pathway, e.g. PKR and 2'-5' OAS2, which are very likely responsible for the observed arrest and death of MethA cells. The prerequisite for a detailed molecular analysis is the identification of functional in vivo binding partners of mutp53 and the characterization of these interactions. For this purpose we took advantage of three techniques: genome-wide ChIP-Seq, RNA co-IP (RIP), and protein co-IP. Applying the ChIP-Seq Technique we observed that most mutp53 binding sites are rich in repetitive DNA sequences, and are distantly localized from the transcriptional start sites of coding genes. To study the influence of mutp53 on transcription, the gene expression profiles of dsRNA transfected cells were compared. Although this comparison was not very informative due to the dramatic unspecific effects of dsRNA, there are some hints of an involvement of mutp53 in the progression of mitosis. As much evidence points to a functional connection between mutp53 and cellular dsRNA, an RIP was performed subsequently. It was observed that mutp53-bound transcripts are strongly enriched in non-coding regulatory RNA: B2-type SINEs and solitary 3’-UTR Summary 4 transcripts. This observation points to a posttranscriptional regulation by mutp53. This indication is further corroborated by the analysis of mutp53 bound proteins. In mutp53-containg protein complexes a large group of RNA interacting proteins were found by co-IP including members of the hnRNP family, YB1 and Hsc70, which are organized in the nucleus into functional domains and complexes stabilized via RNA. These observations provide a basis for a working model according to which the DNA/RNA binding mutp53 protein is a structural component of transcription/processing factories. Through the association with regulatory RNAs and with RNA binding proteins a function of mutp53 in the cell- and context specific 3D organization of chromatin can be postulated. This hypothesis is supported by the binding of mutp53 to MAR/SAR elements and repetitive DNA-elements. Einleitung 5 1 EINLEITUNG 1.1 Grundlagen der Tumorgenese Krebserkrankungen stellen mit jährlich mehr als 400.000 neu diagnostizierten Fällen allein in Deutschland nach den Herz-Kreislauferkrankungen die zweithäufigste Erkrankung in den westlichen Industrienationen dar. Die molekularen Ursachen und Mechanismen der Tumorentstehung sowie -progression zu verstehen, bildet die Grundlage jeder gezielten Therapie und beschäftigt tausende Forscher weltweit. Das Genom ist unentwegt endogenen Schäden wie spontaner Depurinierung, intrazellulären durch den Metabolismus entstehenden (Sauerstoff-) Radikale, Verkürzung der Telomere und Fehlerrate der Polymerase sowie exogenen schädigenden Einflüssen wie UV-Strahlung, Höhenstrahlung und chemisch-genotoxischen Agentien ausgesetzt. Demgegenüber steht einer Zelle das DNA Reparatursystem bzw. das Apoptoseprogramm bei irreparablen Schäden als Schutz gegen genomische Schäden zur Verfügung. Die Integrität der Zelle wird durch Zellteilung, Differenzierung und Wachstum einerseits und Zelltod andererseits erzeugt und aufrechterhalten. Trotz aller Schutzmechanismen können sich Mutationen mit einer Rate von ca. 1,4 x 10-10 Mutationen/Nukleotid/Generation (Loeb, 1991) bzw. 10-7/Zelle/Generation (Elmore, Kakunaga, and Barrett, 1983) manifestieren. Dies entspricht etwa drei Mutationen pro Zelle in ihrer Lebensspanne. Dagegen wird die Zahl von Mutationen, die zur Entstehung eines Tumors nötig ist, auf sechs bis neun Mutationen pro Zelle geschätzt (Sugimura et al., 1992; Vogelstein et al., 1988). β-Catenin Axin Normales Epithel Genomische Instabilität Aberrante Foci Frühes Adenom K-ras fortgeschrittenes Adenom Smad4 spätes Adenom p53 Weitere Veränderungen Karzinom Metastasen „Two Hits“ APC Abbildung 1 Genetisches Modell der Tumorprogression am Beispiel des Kolonkarzinoms nach Fearon und Vogelstein. Alle malignen Tumore weisen Störungen der Proliferations- und Zelltodkontrolle auf, die im Gegensatz zur Normalzelle ein unbegrenztes Wachstumspotential, Immortalität, Invasion in benachbarte Gewebe aufgrund fehlender Kontaktinhibition und Metastasierung in andere Organe bedingen. Diese Eigenschaften werden nach dem Mehrschritt-Karzinogenese-Modell am Beispiel des Kolonkarzinoms nach Fearon und Vogelstein (Abb. 1) (Fearon and Vogelstein, 1990) durch klonale Evolution und Selektion von Zellen erworben, die sukzessive Einleitung 6 wichtige Onkoproteine durch Mutationen aktivieren bzw. Tumorsuppressorproteine durch Deletion oder Mutation inhibieren und dadurch einen Wachstumsvorteil gegenüber benachbarten Zellen erhalten (Hernandez-Boussard, Montesano, and Hainaut, 1999). Dementsprechend basiert der Prozess der Tumorentstehung auf einem Komplex miteinander verknüpfter genetischer und epigenetischer Veränderungen. Ein weiterer Aspekt der Tumorgenese wird durch das Stammzell-Modell der Tumorgenese (Weissman, 2005) beschrieben. Diese Hypothese beruht auf der Ähnlichkeit der Eigenschaften von Tumorzellen und Stammzellen, wie der Kapazität zur Selbsterneuerung, der Bildung heterogener Populationen sowie der Fähigkeit zur Migration und Invasion in umgebendes Gewebe. Nach dieser Hypothese besitzt eine Subpopulation der Zellen eines Tumors Stammzell-Charakteristika. Nicht erfolgreiche Therapien bzw. Rückfälle beruhen demnach auf einer ineffektiven Behandlung dieser Zellen (Dean, Fojo, and Bates, 2005; Eckfeldt, Mendenhall, and Verfaillie, 2005). Charakteristisch für Malignome sind darüber hinaus Abweichungen vom Chromosomensatz, die als Aneuploidie bezeichnet werden. Die Aneuploidie könnte essentielle Grundvoraussetzung der akkumulierten genetischen Veränderungen sein und die Tumorinitiation bedingen (mutator phenotype) (Duesberg and Li, 2003) (s. Abb. 2). Abbildung 2 Chromosomales Modell der Tumorentstehung und -entwicklung durch Selektion von aneuploiden Zellen nach Duesberg. Dieser Theorie der Tumorentstehung zufolge verursachen Karzinogene unspezifische Veränderungen der normalen Chromosomenzusammensetzung und verändern dadurch die Genexpression. Allerdings reicht Aneuploidie alleine nicht aus, um die weitere Progression bis hin zu klinisch relevanten Tumoren zu beschreiben, da unkontrollierte Aneuploidie die Tumorprogression verhindern würde. Beispielsweise scheinen Zell-Zell-Fusionen nötig zu sein, um einer Tumorzelle die Eigenschaft der Metastasierung zu verleihen (Parris, 2006). Um Krebspatienten künftig gezielt und mit einer höheren Wahrscheinlichkeit erfolgreich Einleitung 7 therapieren zu können, scheint eine individuelle Analyse der genetischen Veränderungen notwendig zu sein. 1.2 Onkogene und Tumorsuppressorgene Die Produkte von Proto-Onkogenen (z.B. c-MYC, RAS) erfüllen in der Normalzelle wichtige Aufgaben bei der Wachstumsregulation als Wachstumsfaktoren, intrazelluläre Signalüberträger oder Transkriptionsfaktoren und sind evolutionär hoch konserviert. Durch Mutationen von Proto-Onkogenen zu Onkogenen können diese dominant aktiviert werden, was zu einer unkontrollierten Proliferation der Zelle führen und eine Tumorentstehung initiieren kann (Bishop, 1991; Fearon and Vogelstein, 1990; Weinberg, 1989). Im Gegensatz zu Proto-Onkogenprodukten üben die Produkte von Tumorsuppressorgenen (z.B. P53, pRB, APC) eine inhibitorische Wirkung auf die Zell-Proliferation aus. Tumorsuppressoren können je nach zellulärer Funktion in sogenannte Gatekeeper (direkte wachstumshemmende Proteine), Caretaker (indirekte wachstumsinhibierende Wirkung durch Induktion von DNA Reparatur geschädigter Zellen oder Prävention von genomischer Instabilität) und Landscaper (Modulation der Mikroumgebung von Tumoren) eingeteilt werden (Macleod, 2000). Nach der Two Hit Hypothese von Knudson (Knudson, 1986) müssen beide Allele inaktiviert werden, um eine Tumorprogression zu begünstigen, da diese rezessiv wirken (Loss of heterozygosity, LOH) (Levine, 1993). Zahlreiche familiäre Krebssyndrome gehen auf die Inaktivierung eines Allels von einem Tumorsuppressorgen in der Keimbahn zurück. Die Wahrscheinlichkeit einer Inaktivierung des zweiten Allels und damit die Tumorentstehung ist bei diesen Menschen um ein Vielfaches höher, weshalb diese Individuen zur Tumorbildung prädisponiert sind. 1.3 Das Tumorsuppressorprotein p53 1.3.1 Historischer Rückblick Das Tumorsuppressorprotein p53 ist in etwa 40% aller Karzinome mutiert und steht aufgrund seiner wichtigen Funktion als „Wächter des Genoms“ - mit fast 45.000 Publikationen weltweit - seit fast drei Jahrzehnten im Mittelpunkt der Krebsforschung. P53 wurde erstmals 1979 im Komplex mit dem viralen T-Antigen in SV-40 transformierten Zellen entdeckt (DeLeo et al., 1979; Kress et al., 1979; Lane and Crawford, 1979; Linzer, Maltzman, and Levine, 1979). Das humane p53-Protein besteht aus 393 Aminosäuren, die vom 20 kb p53-Gen, welches auf Chromosom 17p13.1 lokalisiert ist und aus 11 Exonen besteht, kodiert werden. Bei der Maus ist p53 auf dem Chromosom 11q21-q22 lokalisiert und kodiert für 390 Aminosäuren (Czosnek et al., 1984; Le Beau et al., 1985; Rotter et al., 1984). Seinen Namen verdankt p53 einem durch Anhäufung von helixbrechenden Prolin-Resten im N-Terminus verursachten aberranten Laufverhalten in der SDS-PAGE bei 53 kDa, obwohl es ein Molekulargewicht von 43,5 kDa besitzt (Oren, 1985). Da in frühen Studien gezeigt wurde, dass p53 embryonale Einleitung 8 Rattenzellen immortalisieren (Jenkins, Rudge, and Currie, 1984) und in Kooperation mit aktiviertem Ras-Onkogen Fibroblasten transformieren kann (Eliyahu et al., 1984), wurde p53 zunächst als Onkoprotein klassifiziert. 1989 entdeckte man jedoch, dass diese Versuche nicht mit Wildtyp-p53 (wtp53), sondern mit mutiertem p53 (mutp53) durchgeführt wurden (Finlay, Hinds, and Levine, 1989; Hinds, Finlay, and Levine, 1989). Wtp53 dagegen supprimiert die zelluläre Transformation, und die Tumorsuppressorfunktion von wtp53 ist in einem großen Teil humaner Tumoren ausgeschaltet. Dementsprechend wurden die Aussagen revidiert und p53 als Tumorsuppressorgen eingestuft. 1.3.2 Struktur von p53 Das p53-Protein besteht aus zwei aminoterminalen Transaktivierungsdomänen (AS 1-40 und 41-83), einer Prolin-reichen Sequenz (61-94) einer sequenzspezifischen DNA bindenden Domäne (102-292), einer Kernlokalisationssignale enthaltende Domäne (326-355), einer Oligomerisierungsdomäne (323-356) sowie einer carboxyterminalen sequenzunspezifischen DNA bindenden Domäne (363-393). Die aminoterminale Transaktivierungsdomäne ist durch Interaktion mit den elementaren Transkriptionsfaktoren TFIID und TBP charakterisiert (Lu and Levine, 1995; Thut et al., 1995). Für die Transaktivierung sind die zwei Aminosäuren Leuzin 22 und Tryptophan 23 entscheidend, da Mutationen beider Aminosäuren zusammen mit einer DNA Bindungsmutation in der Aminosäure 281 zum Verlust der Transaktivierungseigenschaft führt (Lin et al., 1994). Die aminoterminale Domäne zeichnet sich weiterhin durch das gehäufte Vorkommen saurer Aminosäuren und durch verschiedene Phosphorylierungsstellen aus, die eine wichtige Rolle bei der p53-Stabilisierung spielen (Fields and Jang, 1990; Raycroft, Wu, and Lozano, 1990). Hier befindet sich darüber hinaus die Bindungsstelle für die Interaktion mit dem negativen Regulator und Onkoprotein Mdm2 (mouse double minute chromosome 2; humanes Homolog: HDM2), welches für eine strikte Kontrolle des intrazellulären p53 Spiegels sorgt (Momand et al., 1992; Oliner et al., 1993). Mdm2 wird einerseits durch p53 transaktiviert und leitet andererseits die proteolytische Degradation von p53 durch den Ubiquitin-Proteasom Signalweg ein. p53 und Mdm2 sind demnach über einen negativen Rückkopplungsmechanismus verbunden (Haupt et al., 1997; Kubbutat, Jones, and Vousden, 1997; Perry et al., 1993; Wu et al., 1993). Mdm2 vermag auch seine eigene Degradation durch Autoubiquitinierung zu induzieren. P53 induziert ferner die Expression des Wip-1 Gens (Fiscella et al., 1997), ein weiterer negativer Regulator, welcher für eine Phosphatase kodiert, die die p53 aktivierende p38 MAP Kinase durch Dephosphorylierung inhibiert (Takekawa et al., 2000). Außerdem wird p53 durch das p53 Zielgen Zyklin G, welches mit der Phosphatase PP2A Mdm2 dephosphoryliert (Okamoto et al., 2002) und damit aktiviert, negativ reguliert. Es wurden außer Mdm2 weitere E3 Ubiquitinligasen Pirh2 und COP1 für p53 entdeckt, die ebenfalls transkriptionell von p53 aktiviert werden (Dornan et al., 2004; Leng et al., 2003). Andererseits kann p53 auch durch Einleitung 9 die Aktivität von HAUSP deubiquitiniert werden (Li et al., 2002). Die Funktion von p53 als sequenzspezifischer Transkriptionsaktivator wird durch die hydrophobe DNA Bindungsdomäne vermittelt, die innerhalb der Vertebraten hoch konserviert ist, was die Bedeutung dieser Domäne unterstreicht (el-Deiry et al., 1992; Friedman et al., 1993). Die Struktur der DNA Bindungsdomäne wird von zwei Schichten antiparalleler β-Faltblätter bestimmt, welche die Grundlage für mehrere Schleifen aus α-Helices bilden. Diese Schleifen binden die DNA in der großen und kleinen Furche. Das Motiv wird teilweise durch ein tetraedrisch koordiniertes Zinkatom stabilisiert (Cho et al., 1994). Onkoproteine kleiner DNA Tumorviren, wie SV40-, Adeno- und Papillomaviren binden ebenfalls an diese Domäne. Ein großer Teil der aktivierten Zielgene enthält im Promotorbereich eine Konsensussequenz, die von p53 gebunden wird. Diese besteht aus zwei Dekameren der Sequenz 5'- PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy-3', die bis zu 13 bp voneinander getrennt sein können (el-Deiry et al., 1992). Des Weiteren bildet die Sekundärstruktur der DNA ein wichtiges Kriterium für eine spezifische Bindung von p53 (Kim, Albrechtsen, and Deppert, 1997). Neben der sequenzspezifischen DNA-Bindung ist auch die 3‘-5‘ Exonukleaseaktivität in der Kerndomäne lokalisiert (Mummenbrauer et al., 1996). Die vorwiegend basische carboxyterminale Region von p53 beinhaltet die Oligomerisierungsdomäne von p53 Monomeren (Sturzbecher et al., 1992), die nicht sequenzspezifische oder strukturspezifische DNA Bindungsdomäne (Jeffrey, Gorina, and Pavletich, 1995), drei Kernlokalisationssignale (Shaulsky et al., 1991), eine Domäne zur Bindung an einzelsträngige DNA Enden (Bakalkin et al., 1995), sowie eine Bindungs-Plattform für Proteininteraktionen (Ahn and Prives, 2001). 1.3.3 Modifikationen von p53 In der Abbildung 3 sind zusätzlich zur Struktur zahlreiche potentielle posttranslationelle Modifikationen wie Phosphorylierung, Acetylierung und Sumoylierung an den N- und Cterminalen Enden des Proteins dargestellt, die die Situation komplexieren. Diese Modifikationen werden durch Stress-induzierte regulatorische Enzyme wie ATM, ATR, CHK2, HIPK2, p300, PCAF, SUMO1 und PIN1 übertragen und modulieren dadurch den p53 Signalweg. Beispielsweise phosphoryliert die ATM-Kinase nach DNA Schäden durch ionisierende Strahlung p53 an Serin 15, welches zur Akkumulation von p53 führt (Banin et al., 1998; Canman et al., 1998; Kastan et al., 1992). Wie die Modifikation von p53 an den bekannten Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsstellen und Acetylierungs-/De- acetylierungsstellen in vivo zur Antwort von p53 auf DNA Schäden beiträgt, bleibt eine offene Frage. Zunächst wurde vermutet, dass die sequenzspezifische DNA Bindung von p53 durch Signalwege nach DNA Schädigung verstärkt wird (Latenzmodell). Dies wurde durch Modifizierung der carboxyterminalen 30 Aminosäuren durch Deletion, Phosphorylierung durch Caseinkinase II, Proteinbindung durch hsp70 oder den Antikörper Pab421 belegt, die Einleitung 10 alle zu einer Aktivierung der sequenzspezifischen DNA Bindung führen (Hupp and Lane, 1995; Hupp et al., 1992; Hupp, Sparks, and Lane, 1995). Abbildung 3 Schematische Darstellung des Tumorsuppressors p53 (nach: Anderson und Appella, 2007) p53 wird vor allem am Amino- und am Carboxy-Terminus posttranslational durch Phosphorylierung, Acetylierung und Sumoylierung modifiziert. Die zentrale DNA Bindungsdomäne, die für die Transaktivierungsaktivität von p53 essentiell ist, weist die größte Sequenzkonservierung auf. p53 interagiert weiterhin mit einer Reihe von Proteinen. Die Aktivierung der DNA Bindung wird außerdem durch die Modifizierung der 30 carboxyterminalen AS z.B. Phosphorylierung durch Proteinkinase C (Takenaka et al., 1995), Dephosphorylierung von Ser376 und Bindung an 14-3-3 (Waterman et al., 1998), Acetylierung durch p300/CBP (Gu and Roeder, 1997), Bindung an Ref-1 (Jayaraman et al., 1997), Bindung an c-abl (Nie et al., 2000), Sumoylierung (Gostissa et al., 1999; Rodriguez et al., 1999), Bindung an S100β (Lin et al., 2001) oder Bindung an kurze Segmente einzelsträngiger DNA erreicht (Jayaraman and Prives, 1995; Okorokov, Ponchel, and Milner, 1997). Demnach scheint der C-terminus für die Modulation der sequenzspezifischen DNA Bindung verantwortlich zu sein und könnte die Latenz von p53 erklären, die erst durch aktivierende Signale aufgehoben wird. Auf der anderen Seite konnten weitere Arbeitsgruppen herausfinden, dass die Bindung von p53 an DNA unabhängig von p53 aktivierenden Signalwegen ist. Untersuchungen zeigten, dass p53 in vivo an genomische DNA bindet, obwohl keine aktivierenden Signale vorhanden sind (Espinosa and Emerson, Einleitung 11 2001; Kaeser and Iggo, 2002). Dies lässt vermuten, dass andere Faktoren/Koregulatoren, die mit p53 kooperieren, reguliert werden, um die Aktivität von p53 zu modulieren. 1.3.4 Funktion von p53 In normalen, ungestressten Zellen liegt p53 in geringen Mengen (1000-10.000 wtp53 Moleküle pro Zelle) mit einer Halbwertszeit von etwa 10-20 min in einem latenten Zustand vor (Oren, Maltzman, and Levine, 1981; Patschinsky and Deppert, 1990). Es sorgt für die Integrität des Genoms, indem es direkt an der Reparatur von DNA Schäden beteiligt ist und die fehlerhafte Replikation der DNA verhindert (Janus et al., 1999). P53 nimmt außerdem durch Protein-Protein Wechselwirkung und seine intrinsische 3‘-5‘ Exonukleaseaktivität Einfluss auf DNA Reparatur, Rekombination und Replikation (Akyuz et al., 2002; Albrechtsen et al., 1999; Janz and Wiesmuller, 2002; Susse et al., 2000; Zink et al., 2002). Die Konzentration von p53 wird auf verschiedenen Ebenen der Transkription, Translation, subzelluläre Lokalisation, Stabilität und Aktivität strikt kontrolliert. Für die biochemische Wirkung von p53 ist die Oligomerisierung (Tetramerisierung) eine Voraussetzung. Nach Zellschädigung durch diverse Stimuli wie DNA Schäden, onkogenen Stress, Hitzeschock (Ohnishi et al., 1996), Hypoxie (Graeber et al., 1994), Glukosemangel, Schäden am mitotischen Spindelapparat (Cross et al., 1995), Ribonukleotiddepletion (Linke et al., 1996), Stickoxidexposition (Forrester et al., 1996) und Defekten der DNA Methylierung (Soussi and Beroud, 2001) wird eine Erhöhung der wtp53 Konzentration durch verschiedene Mechanismen erreicht, wie z.B. das Ablösen von p53 von seiner autoregulatorisch inhibierten mRNA (Mosner et al., 1995) und durch posttranslationale Modifikationen stabilisiert (Maltzman and Czyzyk, 1984), die vermutlich die Interaktion von p53 mit Mdm2 unterbinden. Generell werden höhere p53 Konzentrationen durch reduzierte Degradation statt erhöhter Neusynthese erreicht (Levine, 1997). P53 kann einen temporären Zellzyklusarrest, der die Reparatur von DNA Schäden ermöglicht, einen irreversiblen Zellzyklusarrest, terminale Differenzierung, Seneszenz oder die Apoptose, den programmierten Zelltod veranlassen. Der Verlust von p53 geht mit einer erhöhten Mutationsrate und genomischen Instabilität einher. Die Aktivierung verschiedenster p53 Zielgene scheint abhängig zu sein von Stimulus, Ausmaß der Schäden, Vorhandensein von Wachstumsfaktoren, Zelltyp und zellulärem Kontext, da immer noch ungeklärt ist, warum manche Zellen durch Apoptose eliminiert werden und p53 bei anderen dagegen einen Zellzyklusarrest veranlasst. Hinzu kommt, dass p53 eine unterschiedliche Promotorselektivität für seine Zielgene besitzt und darüber hinaus die Expression mancher Gene reprimieren kann (Ho and Benchimol, 2003). Beispielsweise bewirkt onkogener Stress durch deregulierte Expression von c-myc, ras, E1A oder β Catenin (Bates et al., 1998; Stott et al., 1998) eine Aktivierung von ARF (alternative reading frame) (Prives and Hall, 1999; Sharpless and DePinho, 1999; Sherr, 1998), welches Mdm2 negativ reguliert und somit die Einleitung 12 Degradation von p53 verhindert. Dagegen werden durch DNA Schäden die Kinasen ATM (Ataxia telangiectasia mutated) und CHK2 (cell cycle checkpoint kinase) aktiviert (Bell et al., 1999), die Mdm2 sowie p53 phosphorylieren und dadurch eine verstärkte Interaktion von p53 mit dem Transkriptionskoaktivator p300 hervorrufen (Dornan et al., 2003). Abbildung 4 Stark vereinfachte Darstellung des p53 Signalwegs, in der durch diverse Stressfaktoren über Mediatoren und Effektoren p53 aktiviert wird und durch die Aktivierung von Transduktoren die Angiogenese, den Wachstumsarrest, DNA Reparatur oder Apoptose auslösen kann (http://p53.free.fr). P53 besitzt zudem die Eigenschaft, die Relaxation von Chromatin durch Rekrutierung von HATs (Histonacetylasen) zu induzieren (Espinosa and Emerson, 2001; Rubbi and Milner, 2003), was auf eine Beteiligung von p53 an der globalen Umstrukturierung des Chromatins (chromatin remodeling) und damit der Genregulation hindeutet. Darüber hinaus ist für p53 auch eine Rolle als RNA bindendes Protein bekannt (Samad and Carroll, 1991), z.B. die Bindung an 5,8S rRNA (Fontoura et al., 1992), einzelsträngige RNA (Oberosler et al., 1993), seine eigene mRNA (Mosner et al., 1995) und den 5´UTR von cdk4 (Miller et al., 2000). 1.3.4.1 G1 Arrest P53 ist Teil eines Kontrollmechanismus, der das Fortschreiten des Zellzyklus an die Integrität der DNA koppelt. Beim G1 Arrest steht die Transaktivierung des p21 Proteins, eines Inhibitors zyklinabhängiger Kinasen (cyclin dependent kinase; CDK), im Vordergrund (Brugarolas et al., 1995; Deng et al., 1995; Dulic et al., 1994; el-Deiry et al., 1993; Harper et al., 1993; Waldman, Kinzler, and Vogelstein, 1995; Xiong et al., 1993). Ein Fortschreiten des Zellzyklus von der G1 in die S Phase wird durch die Inhibition von Cyclin D-CDK 4/6 sowie Einleitung 13 Cyclin E-CDK 2 Komplexen verhindert, da das Retinoblastomprotein pRB nicht sukzessive durch die genannten Komplexe phosphoryliert werden kann. Die von hypophosphoryliertem pRB gebundenen Transkriptionsfaktoren E2F können dadurch nicht freigesetzt werden und Gene transaktivieren, deren Produkte zur Einleitung der S Phase benötigt werden (Dowdy et al., 1993; Ewen et al., 1993; Hinds et al., 1992). Die p53 Zielgene Btg2, Gadd45 und Mcg10 sind zusätzlich im p53 abhängigen G1 Arrest involviert (Guardavaccaro et al., 2000; Kastan et al., 1992; Lim et al., 1998; Rouault et al., 1996; Smith et al., 1994; Zhu and Chen, 2000). Durch die Aktivierung von p21 können im Verlauf des Zellzyklusarrests in der G1 Phase DNA Schäden behoben werden. 1.3.4.2 S Phase Arrest Ein intra-S Arrest wird durch Δp53 vermittelt, ein alternativ gespleisstes p53 Protein, dem die Exone 7 bis 9 fehlen und welches den intra-S Kontrollpunkt durch Induktion von p21 und 143-3s induziert (Rohaly et al., 2005). Die Signifikanz dieser Daten ist allerdings noch unklar (Bourdon, 2007). Die DNA Replikation wird durch die Bindung von p21, welches p53 abhängig aktiviert wird, an PCNA (proliferating cell nuclear antigen) gestoppt (Waga et al., 1994). Während der DNA Synthese kolokalisiert PCNA mit dem Replikationsfaktor C (RPC) an die DNA und rekrutiert die Polymerase δ zur Elongation (Melendy and Stillman, 1991). Durch p21 Bindung werden PCNA und die DNA Synthese inhibiert, während die Reparatur-DNA Synthese durch die Polymerasen δ oder ε auch in Anwesenheit von p21 erfolgen kann (Li et al., 1994). 1.3.4.3 G2 Arrest Im Vordergrund des p53 vermittelten G2 Arrests steht die transkriptionelle Aktivierung des Zielgens 14-3-3σ, welches den Zyklin B- CDK 1 Komplex bindet und ins Cytoplasma sequestriert (Hermeking et al., 1997). Dadurch wird das Fortschreiten zur Mitose unterbunden. Des Weiteren wirkt die Kinase Wee1 der Phosphorylierung des Zyklin B- CDK 1 Komplexes durch die Phosphatase Cdc25C entgegen (Chan et al., 1999; Peng et al., 1997). Am G2/M Arrest ist auch das p53 Zielgen Gadd45 beteiligt, dessen Produkt beispielsweise mit cdc2 und PCNA interagiert (Smith et al., 1994; Zhan et al., 1999). Zusätzlich assoziiert p21 in der späten G2 Phase des Zellzyklus mit den Zyklin A und B Komplexen (cdc2-cyclin B) und verhindert die Aktivierung durch die Kinase CAK (cyclin activating kinase) (Poon et al., 1996). An der Aufrechterhaltung des G2/M Arrest sind außerdem die p53 Zielgene Gadd45, BTG2, MCG10, REPRIMO, B99 und HZF beteiligt. 1.3.4.4 Apoptose Die Apoptose verursacht die Eliminierung einer Zelle nach irreparabler Schädigung und dient damit der Bewahrung der Integrität des Gewebeverbands (Clarke et al., 1993; Lowe et al., Einleitung 14 1993; Ryan et al., 1993; Shaw et al., 1992; Yonish-Rouach et al., 1991). Man unterscheidet zwischen dem intrinsischen und dem extrinsischen Signalweg. Der intrinsische Signalweg wird durch UV oder γ Strahlung verursachte DNA Schäden, toxische Agentien, oxidativen oder metabolischen Stress eingeleitet, während der extrinsische Signalweg über die Aktivierung von Todesrezeptoren (TNF death receptor) verläuft. Letztlich führen beide Signalwege zur Aktivierung von Caspasen, die die Kondensierung der Zelle und deren Fragmentierung verursachen. P53 aktiviert sowohl den intrinsischen als auch extrinsischen Apoptoseweg. Durch Aktivierung von Bax und Reprimierung der Transkription von Bcl2 wird das Verhältnis zwischen pro- und antiapoptotischen Bcl2 Proteinen zugunsten der proapoptotischen Proteine verschoben (Miyashita and Reed, 1995), welches zur Permeabilisierung der mitochondrialen Membran und Freisetzung von Cytochrom C (Schuler et al., 2000) und APAF-1 führt und die Caspasekaskade (Caspase 9, 6 und 3) auslöst (Jurgensmeier et al., 1998). Nukleäres p53 induziert außerdem die Expression der proapoptotischen Gene (Chao et al., 2000; Jimenez et al., 2000) PUMA (Jeffers et al., 2003; Nakano and Vousden, 2001; Villunger et al., 2003; Yu et al., 2001), NOXA (Oda et al., 2000a; Shibue et al., 2003; Villunger et al., 2003), BID, APAF-1, DR5, p53AIP1 (Oda et al., 2000b), Bax (Miyashita and Reed, 1995), PERP (Ihrie et al., 2003), Pidd/Lrdd (Lin, Ma, and Benchimol, 2000), p53DINP1 (Okamura et al., 2001), PAC1 (Yin et al., 2003), UNC5H2 (Tanikawa et al., 2003) und TSAP6 (Passer et al., 2003). Obwohl die meisten Funktionen von p53 als Transkriptionsfaktor vermittelt werden, gewinnen transkriptionsunabhängige Aktivitäten immer mehr an Bedeutung. Zum Beispiel weist zytoplasmatisches p53 eine transkriptionsunabhängige proapoptotische Aktivität auf, indem es direkt an Bcl-Xl in den Mitochondrien bindet (Chipuk and Green, 2006; Moll, Marchenko, and Zhang, 2006). Sowohl Bax, Noxa, PUMA und p53AIP1 sind in Mitochondrien lokalisiert und assoziieren mit Bcl2. Wtp53 transaktiviert außerdem die Expression des Todesrezeptors CD95/APO/Fas (OwenSchaub et al., 1995), während dieser Rezeptor von mutp53 reprimiert wird (Miyashita et al., 1994). 1.3.4.5 Differenzierung Aus verschiedenen Arbeiten geht hervor, dass p53 eine Rolle in der Differenzierung von Zellen spielt, welche zur Tumorsuppressoraktivität beiträgt und damit die Generation genetisch veränderter Zellen verhindert (Stiewe, 2007). Die genomische Integrität wird schließlich auch bewahrt, wenn Zellen aus dem proliferativen Pool von Zellen ausgeschlossen werden. So kann die Expression von wtp53 in undifferenzierten Zellen ihre Differenzierung auslösen (Li et al., 1998c; Lin et al., 2005). Dabei stellt die Seneszenz ebenfalls einen Aspekt der Differenzierung dar. Die p53 Familienmitglieder p63 und p73 sind evolutionäre Vorgänger von p53 und besitzen vor allem in der Embryonalentwicklung und der Kontrolle der Differenzierung eine wichtige Funktion. Die Rolle von p53 in der Einleitung 15 Differenzierung wurde bislang vernachlässigt, da p53 knockout Mäuse sich relativ normal entwickeln, was allerdings auch auf die kompensatorische Wirkung durch die anderen p53 Familienmitglieder p63 und p73 zurückzuführen sein könnte. In vielen menschlichen Tumoren kann zudem eine Korrelation zwischen der Expression von mutantem p53 und geringem Differenzierungsgrad beobachtet werden. 1.3.4.6 Seneszenz Die zelluläre Seneszenz stellt einen durch DNA Schäden oder Aktivierung von Onkogenen ausgelösten permanenten Zellzyklusarrest von metabolisch aktiven Zellen in vitro in der G1 Phase des Zellzyklus dar, deren replikatives Potential erschöpft ist (Schmitt et al., 2007). Diese Zellen sind durch eine veränderte Morphologie, Physiologie und Gen- expressionsmuster charakterisiert. P53 ist in Kooperation mit Rb2 an der Induktion von zellulärer Seneszenz durch die Repression der Zyklin E und A Promotoren beteiligt. Bei intaktem p53-Rb2 Signalweg kann in p16 negativen Zellen die Tumorprogression durch Induktion zellulärer Seneszenz unterbunden werden (Helmbold, Deppert, and Bohn, 2006; Kapic et al., 2006). Dieser Arrest kann durch die Inaktivierung dieser essentiellen Tumorsuppressoren p53 oder pRb aufgehoben werden (Counter et al., 1992). 1.4 Mutantes P53: Zugewinn onkogener Eigenschaften 1.4.1 Art und Häufigkeit von Mutationen in p53 Mutationen im p53 Gen (mutp53) werden in 20-40% aller humanen Malignome gefunden (Baker et al., 1990; Beroud and Soussi, 1998; Finlay, Hinds, and Levine, 1989; Olivier et al., 2002; Vogelstein, Lane, and Levine, 2000). In 30% der Sarkome sowie zum Teil auch in anderen Malignomen ist Mdm2 amplifiziert, welches ebenfalls die p53 Funktion eliminiert (Freedman, Wu, and Levine, 1999). In anderen wtp53 exprimierenden Tumoren wiederum sind dagegen Defekte in der Expression des Tumorsuppressors und Mdm2 Antagonisten p14ARF (Maushomolog: p19ARF; (Sherr, 2001) oder Mutationen in Kinasen, wie beispielsweise ATM oder Chk2 zu beobachten (Bartek, Falck, and Lukas, 2001; Dasika et al., 1999). Demnach ist die wtp53 Funktion in nahezu allen Tumoren direkt durch Mutationen oder indirekt durch Defekte in p53 regulierenden Signalwegen ausgeschaltet. Es findet in erster Linie eine Selektion statt, die einen Verlust der p53 Tumorsuppressorfunktion durch die Transaktivierungsaktivität sowie dominant negative Effekte bewirken. Als dominant negative Wirkung ist die Suppression der Wildtyp p53 Aktivität durch einige p53 Mutanten bekannt. Durch Hetero-Oligomerisierung von mutp53 mit wtp53 wird dieses in eine mutante Konformation überführt (Eliyahu, Michalovitz, and Oren, 1985; Hinds, Finlay, and Levine, 1989; Kaczmarek et al., 1986; Milner and Medcalf, 1991). Es gibt allerdings auch vielfach Hinweise dafür, dass bestimmte mutp53 Spezies im Gegensatz zum bloßen Verlust der Tumorsuppressorfunktion von wtp53 durch transaktivierungsabhängige und -unabhängige Einleitung 16 Wege zur Tumorprogression beitragen, was als so genannter gain-of-function (GOF; Zugewinn an Funktionen) bekannt ist (Kim and Deppert, 2007; Petitjean et al., 2007; Strano et al., 2007; Weisz, Oren, and Rotter, 2007). Ein immer wieder aufgeführtes Argument für einen solchen Effekt ist die Tatsache, dass es sich im Gegensatz zu anderen Tumorsuppressorgenen, die meist durch Deletionen, Trunkierungen oder Promotor-silencing inaktiviert werden, bei Mutationen im p53-Gen in 80% aller Fälle um MissensePunktmutationen handelt (Hollstein et al., 1991; Levine, Momand, and Finlay, 1991). Diese Punktmutationen liegen zu 80% in der zentralen Domäne des p53-Moleküls (Hainaut and Hollstein, 2000; Levine et al., 1995; Olivier et al., 2002) und führen zur Expression eines vollständigen p53-Proteins mit einem einzigen Aminosäure-Austausch (mutp53), welches durch einen Verlust der Wildtyp p53 Transaktivierungsaktivität gekennzeichnet ist (Bullock and Fersht, 2001; Ko and Prives, 1996). Das gehäufte Auftreten von missense Mutationen in p53 alleine ist jedoch kein Argument für einen GOF, da keine Selektion von missense gegenüber nonsense Mutationen in der DNA bindenden Domäne nachgewiesen werden konnte, wenn man die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von missense und nonsense Mutationen in dieser Domäne berücksichtigt (Yang, Ro, and Rannala, 2003). Die mit einer deutlich geringeren Wahrscheinlichkeit auftretenden nonsense Punktmutationen haben die Expression von trunkiertem p53 oder die Abwesenheit von p53 aufgrund der Generierung eines stop-codons zur Folge. Ausserdem wurden in einer Arbeit von Sjöblom und Kollegen, die 13.023 Gene in elf Mamma- sowie elf Kolonkarzinomen sequenziert haben, insgesamt 1672 Mutationen detektiert mit einem Mutationsspektrum, welches generelle Mechanismen der Mutagenese reflektiert und durch das Auftreten von 80% missense Mutationen, 7% nonsense Mutationen, 4% Spleissmutationen und 8% Insertionen sowie Deletionen charakterisiert ist (Sjoblom et al., 2006). Dies entspricht ziemlich genau dem Mutationsspektrum von p53 in humanen Tumoren und zeigt, dass missense Mutationen generell die am häufigsten auftretenden Veränderungen in humanen Tumoren darstellen (Soussi, 2007). Die Tatsache, dass p53 im Vergleich zu anderen Tumorsuppressoren vor allem durch missense Mutationen verändert ist, kann durch das Ausschalten der Transaktivierungsaktivität durch eben diese Mutationen in der DNA Bindungsdomäne erklärt werden, welche eine Selektion auf Deletionen wie bei anderen Tumorsuppressoren überflüssig macht. Obwohl es keine starke Selektion für missense p53 Mutationen in Tumoren gibt, treten einige p53 Mutanten mit einer höheren Frequenz auf als erwartet. Die Mutationen in den sechs Codons 175, 245, 248, 249, 273 und 282 bei 1150 möglichen missense Mutanten machen zusammen 35% der in menschlichen Krebsarten untersuchten Mutationen in p53 aus und werden daher als hotspots bezeichnet (Olivier et al., 2002). P53 enthält in seinem Promotorbereich zwar keine Anhäufung von CpG Dinukleotiden (CpG Inseln), jedoch 42 CpG Dinukleotide verstreut in der kodierenden Region, die meist methyliert sind und Einleitung 17 bevorzugte Ziele von Mutationen durch genotoxische Agentien sowie UV Strahlung sind bzw. durch Deamidierung mutieren. Insbesondere sind Argininreste betroffen, die durch das CGN Basentriplett kodiert werden. Diese Erkenntnisse unterstützen die Vorstellung, dass in Tumoren vor allem eine Selektion auf den Verlust der Tumorsuppressoraktivität stattfindet, indem die Transaktivierungsfunktion der DNA bindenden Domäne durch missense oder nonsense Mutationen ausgeschaltet wird und in einem Teil darüberhinaus eine Selektion für bestimmte missense Punktmutationen stattfindet. In Abbildung 5 sind die in p53 gefundenen Mutationen dargestellt, die statistischen Korrelationsanalysen von Tumor-Datenbanken (s. z.B. http://www.p53.iarc.fr, http://p53.free.fr/, http://p53.bii.a-star.edu.sg/index.php) entnommen sind. Abbildung 5 Schematische Darstellung der funktionellen Domänen von p53 mit Angabe der in Tumoren gefundenen Häufigkeit von Mutationen in der sequenzspezifischen DNA bindenden Domäne. Gezeigt sind die N-terminalen Aktivierungsdomänen (AD1, AD2), die Prolin-reiche Region (PXXP), die zentrale sequenzspezifische DNA bindende Domäne, die Tetramerisierungsdomäne (TETRA) und die C-terminale nicht sequenzspezifische DNA bindende Domäne (BASIC). Zum Beispiel beinhaltet die Datenbank der Internationalen Agentur für Krebsforschung (International Agency for Cancer Research (IARC)) 23.544 sequenzierte somatische und 376 Keimzellmutationen in p53 (R11, Oktober 2006). 75% der somatischen Mutationen sind Punktmutationen, während die restlichen 25% durch Insertionen, Deletionen oder komplexe Rearrangements zustande kommen. In der UMD Datenbank (Universal Mutation Database) sind 3.555 verschiedene p53 Mutanten aufgelistet, deren Frequenzen des Auftretens in Tumoren sehr heterogen sind. 3.233 Mutanten tauchen 1-10 mal auf, 298 Mutanten 10-100 mal und 24 Mutanten über 100 mal mit der höchsten Frequenz von 979 für die Mutante R175H (Soussi et al., 2006). Eine Untersuchung des Einflusses von 2500 unterschiedlichen p53 Mutanten auf die Transaktivierung ergab ein relativ heterogenes Bild. Die in humanen Tumoren auftretenden hotspot Mutanten waren durch einen kompletten Verlust der Transaktivierungsaktivität tumorsupprimierender Zielgene gekennzeichnet, während weniger häufig auftetende Mutanten partiell alle oder einen bestimmten Teil dieser Gene aktivieren konnten (Fujita et al., 2003). Einleitung 18 1.4.2 Hinweise auf einen gain-of-function bei bestimmten mutp53 Spezies Auf einen gain-of-function Effekt bestimmter Mutationen in p53 weisen ausser dem gehäuften Auftreten bestimmter Mutationen in p53 folgende Befunde hin: Mutationen im p53 Gen sind sowohl in vitro als auch in vivo mit einer Resistenz gegenüber diversen Chemotherapeutika assoziiert (Ferreira, Tolis, and Giaccone, 1999; Vogelstein, Lane, and Levine, 2000). Diese Beobachtung wird gestützt durch Experimente, in denen eine Rekonstruktion der p53 Aktivität in p53 negativen Zellen eine Chemosensitivität auslöst (Wallace-Brodeur and Lowe, 1999). Mutationen in p53 in soliden Tumoren sowie lymphoiden Malignomen korrelieren außerdem mit erhöhter Angiogenese und einer signifikant schlechteren Prognose im Vergleich zur Abwesenheit von p53 (Greenblatt et al., 1994; Nigro et al., 1989; Soussi and Beroud, 2001). Der Zugewinn onkogener Eigenschaften von mutp53 Spezies wurde in vitro als erhöhte Proliferation (Chen, Chen, and Lee, 1994; Muller, Paulsen, and Deppert, 1996), erhöhtes Wachstum in Agar (Dittmer et al., 1993; Kawamura et al., 1996), erhöhte Wachstumsdichte (Chen, Chen, and Lee, 1994), zerstörter SpindelKontrollpunkt sowie chromosomale Abnormalitäten (Agapova et al., 1996; Gualberto et al., 1998; Wang et al., 1998a), antiapoptotische Aktivität (Lassus et al., 1999; Li et al., 1998b), erhöhte Ras induzierte Transformation (Gloushankova et al., 1997) und erhöhte Therapieresistenz beschrieben (Blandino, Levine, and Oren, 1999). So wurde für die konstitutive Expression von mutantem p53 in 10-3 (Gualberto et al., 1998) p53-null Zellen eine erhöhte Tumorigenität nach subkutaner Injektion in Nacktmäuse gezeigt. Es konnte ferner gezeigt werden, dass p53 Mutanten mit Ras Onkogen in der Transformation primärer Rattenzellen kooperieren können (Hinds et al., 1990; Slingerland, Jenkins, and Benchimol, 1993) und die Onkogen-induzierte Transformation und Tumorgenese von Saos-2 Zellen in Nacktmäusen verstärken (Dittmer et al., 1993; Finlay, Hinds, and Levine, 1989; Preuss, Kreutzfeld, and Scheidtmann, 2000). Außerdem sind einige mutante p53 exprimierenden Krebszellen resistent gegenüber der wtp53 unabhängigen, durch zytotoxische Agentien ausgelösten Apoptose. Die Reduktion der Expression von mutantem p53 in SKBR3, HT29 sowie SW480 Zellen geht außerdem mit reduzierter Proliferation, in vitro und in vivo Tumorigenität und Resistenz gegen Antikrebsmittel einher (Di Agostino et al., 2006). In vivo wurde eine erhöhte Tumorigenität (Cardinali et al., 1997; Dittmer et al., 1993; Lanyi et al., 1998; Li et al., 1998a; Shaulsky, Goldfinger, and Rotter, 1991) sowie erhöhte Invasivität (Cardinali et al., 1997; Hsiao et al., 1994; Wang et al., 1998b) für mutantes p53 beschrieben. Der Zugewinn onkogener Eigenschaften scheint allerdings je nach Zelltyp und verwendetem Promotor kontextabhängig zu sein und ist möglicherweise auf Unterschiede in koregulatorischen Proteinen zurückzuführen. Desweiteren besteht eine Diskrepanz zwischen in vitro und in vivo Effekten von mutp53, die keine allgemeinen Aussagen über den gain-offunction Effekt ermöglichen. Jede Mutation in p53 kann unterschiedliche Konsequenzen in Einleitung 19 der Transaktivierung von Zielgenen und Interaktion mit Proteinen nach sich ziehen. Diese Heterogenität der Mutationen kompliziert die gain-of-function Hypothese erheblich, weshalb sie auch von der Mehrheit der an p53 forschenden Wissenschaftler noch nicht anerkannt ist, zumal auch Mechanismen noch nicht genügend geklärt sind. Unbestritten ist, dass die meisten Mutationen im p53 Gen vermutlich durch reduzierte Degradation zu einer deutlichen Erhöhung der Halbwertszeit des Proteins im Tumor führen. Dadurch akkumuliert mutp53 in der Zelle (Buschmann et al., 2000; Haupt et al., 1997; Midgley and Lane, 1997). Li-Fraumeni Syndrom Patienten weisen beispielsweise nur in Tumoren erhöhte Konzentrationen von p53 auf, während normale Zellen dieser Patienten kein p53 akkumulieren, was darauf schließen lässt, dass Tumor-spezifische Veränderungen in der Degradation zur Stabilisierung von mutp53 führen. Das Li-Fraumeni Syndrom ist durch eine Keimbahnmutation im p53 Gen charakterisiert, welches zu einem vielfach höheren Risiko einer Tumorbildung führt, vor allem Osteosarkome, Lymphome, Mammakarzinome, Sarkome, Hirntumore und Leukämien. LiFraumeni Patienten besitzen ein 50%iges Risiko einer Krebserkrankung im Alter von 30 Jahren (Malkin et al., 1990). Lediglich 57% der Tumore von Li-Fraumeni Individuen zeigen einen LOH, während der andere Teil, abweichend von der two hit Regel von Knudson, ein wtp53 Allel besitzt (Varley et al., 1997). Die meisten Mutationen in p53 resultieren in einer reduzierten thermodynamischen Stabilität und partieller Entfaltung des Proteins und einer dadurch verringerten DNA Bindungsaktivität (Bullock and Fersht, 2001). Selbst wtp53 besitzt bereits eine geringe intrinsische thermodynamische Stabilität der Kerndomäne, da dessen Schmelztemperatur mit 42-44°C nur knapp über der Körpertemperatur liegt (Bullock et al., 1997; Bullock, Henckel, and Fersht, 2000). Diese geringe Stabilität verleiht dem Protein vermutlich eine Flexibilität in der Transaktivierung von Zielgenen durch die Bindung an relativ variable (Konsensus-) Sequenzen in den Promotoren von Zielgenen mit unterschiedlicher Affinität (Inga et al., 2002). Dennoch behalten manche p53 Mutanten die Fähigkeit DNA zu binden, allerdings sind sie meistens in dieser Eigenschaft temperatursensitiv. Vermutlich findet die Bindung von mutp53 an DNA in Verbindung mit anderen stabilisierenden Proteinen oder Koregulatoren statt. 1.4.3 Mögliche Mechanismen des gain-of-function Die transkriptionelle Regulation von Überlebensgenen kann als ein möglicher Mechanismus des gain-of-function von mutp53 in Betracht gezogen werden. Für Klasse I Mutanten (z.B. 248), welche durch eine Mutation in der DNA bindenden Domäne und daraus resultierendem Verlust des Kontaktes mit DNA trotz Wildtyp Konformation gekennzeichnet sind, wurde eine Transaktivierung von überlebensfördernden Genen beschrieben, die nicht vom Wildtyp Protein transaktiviert werden, z. B. MDR-1 (multi drug resistance protein 1; Chen, Chen, and Lee, 1994; Chin et al., 1992; Dittmer et al., 1993; Frazier et al., 1998; Lanyi et al., 1998), cmyc (Frazier et al., 1998; Matas et al., 2001), PCNA (human proliferating cell nuclear Einleitung 20 antigen; Deb et al., 1992; Kawamura et al., 1996; Lanyi et al., 1998), IL-6 (human interleukin 6; Margulies and Sehgal, 1993), hsp70 (human heat shock protein 70; Tsutsumi-Ishii et al., 1995), IGF-I-R (Werner et al., 1996), EGRI (epidermal growth factor receptor 1), EGFR (Dittmer et al., 1993; Lanyi et al., 1998; Ludes-Meyers et al., 1996), IGFII (insulin growth factor II; Lee et al., 2000), MDM2 Isoformen (Gorgoulis et al., 1998), VEGF (vascular endothelial growth factor; Kieser et al., 1994), FGF2 (basic fibroblast growth factor; Ueba et al., 1994), HIV-LTR, CD95 (Zalcenstein et al., 2003), c-fos (Kawamura et al., 1996; Preuss, Kreutzfeld, and Scheidtmann, 2000), BAG-1 (Yang, Pater, and Tang, 1999), 15- lipoxygenase (Kelavkar and Badr, 1999) und NF-κB2 (Scian et al., 2005). Ein weiterer Hinweis auf einen GOF liefern Experimente, in denen bestimmte mutp53 Spezies präferentiell mit MAR/SAR DNA Elementen interagieren (Deppert, 1996; Muller, Paulsen, and Deppert, 1996; Weissker et al., 1992; Will et al., 1998a; Will et al., 1998b), die sich in der Regel an den Grenzen von Transkriptionseinheiten und regulatorischen Sequenzen befinden und die an funktioneller Chromatinreorganisation beteiligt sind (Bode et al., 1995; Bode et al., 1996; Boulikas, 1995). Dadurch beeinflusst mutp53 möglicherweise die Expressionskontrolle von tumorrelevanten Genen. Zudem könnte ein weiterer Mechanismus des Zugewinns onkogener Eigenschaften durch Interaktionen mit Proteinen, die nicht mit wtp53 interagieren, charakterisiert sein, z.B. die inhibitorische Interaktion von mutp53 mit p73, welche das Auslösen der p73 abhängigen Apoptose unterbindet (Di Como, Gaiddon, and Prives, 1999; Marin and Kaelin, 2000; Monti et al., 2003; Strano and Blandino, 2003; Strano et al., 2002). Alternativ ist eine Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren beschrieben worden, mit einer daraus resultierenden indirekten Beteiligung an der Transaktivierung überlebensfördernder Gene. Für mutp53 wurde beispielsweise eine Kooperation mit den Transaktivatoren tumorassoziierter Gene Sp1, Ets-1 und NF-Y gefunden, deren Aktivität durch wtp53 reprimiert wird (Chicas, Molina, and Bargonetti, 2000; Di Agostino et al., 2006; Gu et al., 2004; Gualberto and Baldwin, 1995; Imbriano et al., 2005; Kim et al., 2003; Pastorcic and Das, 2000; Sampath et al., 2001). Durch alle genannten Mechanismen würde das Tumorwachstum aktiv von mutp53 unterstützt. Für mutantes p53 ist kein Konsensus DNA Motiv bekannt; es wurde aber eine Präferenz der Bindung an repetitive DNA Sequenzen sowie DNA Sequenzen, die zur Bildung einer nicht-B DNA Konformation tendieren, gezeigt (Koga and Deppert, 2000; Muller, Paulsen, and Deppert, 1996; Walter et al., 2005; Weissker et al., 1992). Die Expression von Klasse II Mutanten oder auch Konformationsmutanten (z.B. R175H), die eine lokale oder globale Destabilisierung des Proteins verursachen und durch Bindung an hsp70 charakterisiert sind, wurde in verschiedenen Systemen mit größerem onkogenen Potential assoziiert. Verglichen mit der Expression von trunkiertem p53 Protein oder der Abwesenheit von p53, wurde bei der Einleitung 21 Expression von mutantem p53 eine signifikant höhere Tumorinzidenz sowie ein früheres Auftreten von Tumoren bei Li-Fraumeni Patienten festgestellt. 1.5 in vivo p53 Mausmodelle p53 knockout Mäuse sind überraschenderweise nicht letal, zeigen jedoch ein stark erhöhtes Tumorrisiko. Im Gegensatz zum Li-Fraumeni Syndrom beim Menschen wird bei heterozygoten p53-Mäusen ein beschränktes Tumorspektrum mit Sarkomen und Lymphomen beobachtet. Karzinome dagegen tauchen selten auf (Donehower et al., 1992; Jacks et al., 1994; Purdie et al., 1994). Die durchschnittliche Überlebenszeit beträgt für heterozygote p53 knockout Mäuse 15-16 Monate und für homozygote vier bis fünf Monate. P53+/- Mäuse zeigen ein ähnliches Tumorspektrum wie p53+/+ Mäuse, während p53-/Mäuse vor allem Lymphome entwickeln (Venkatachalam and Donehower, 1998; Venkatachalam et al., 2001). Die in vivo Relevanz der missense p53 Mutationen ist noch nicht vollständig geklärt (Lozano, 2007). Die erste Maus mit einer hotspot Mutation in p53R172H in einem gemischten C57BL/6-129/Sv Hintergrund exprimierte zwar geringe Level von mutp53 aufgrund einer zusätzlichen Mutation in einer Spleissstelle (p53R172HΔg), zeigte allerdings ein deutlich verändertes Tumorspektrum verglichen mit p53+/- Mäusen mit einem höheren Anteil an Karzinomen und einem leicht erhöhten Auftreten von Lymphomen (Liu et al., 2000). 69% der sich in diesen Mäusen entwickelnden Osteosarkome und 40% der Karzinome, metastasierten und lieferten so den ersten in vivo Hinweis eines gain-of-function, da Metastasierung selten in p53 heterozygoten Mäusen gefunden wird. Ausserdem zeigen p53R172H/+ knock-in Mäuse im Vergleich zu p53+/- Mäusen ein verändertes Tumorspektrum mit einem erhöhten Vorkommen von Karzinomen und Osteosarkomen. Ähnlich weisen p53R270H/+ Mäuse im Vergleich zu p53+/- Mäusen einen höheren Anteil an Karzinomen, insbesondere Adenokarzinome der Lunge auf. Daher repräsentieren Mäuse mit einer Mutation auf einem Allel (p53R270H/+ und p53R172H/+) eher das Li-Fraumeni Syndrom als p53+/Mäuse. Lang und Mitarbeiter fanden heraus, dass Mäuse mit p53R175H/+ des C57BL/6 Stammes zwar ähnliche Überlebenszeiten und Tumorspektren aufwiesen wie p53+/- Mäuse, sich allerdings durch erhöhte Metastasierung unterschieden (Lang et al., 2004). Diese Ergebnisse unterstützen die Theorie des Zugewinns onkogener Eigenschaften nach Mutation von p53. Außerdem unterscheiden sich die Tumorspektren von p53R270H/- und P53R172H/- Mäusen des 129S4/SVJae genetischen Hintergrunds von dem p53-/- Mäusen mit einem ebenfalls erhöhten Vorkommen an Metastasen (Olive et al., 2004). In unserer Arbeitsgruppe wurde eine Mauslinie etabliert, in der die p53 hotspot-Mutante R270H in WAPT transgenen Balb/c Mäusen koexprimiert wird. Die Expression von SV40 frühen Genen unter dem mammagewebsspezifischen WAP (whey acidic protein) Promotor initiiert die Bildung von Adenokarzinomen der Mammae. In bitransgenen WAP-T-p53R270H Tieren wurde eine erhöhte Transition von intraepithelialen Neoplasien zu invasiven Karzinomen Einleitung 22 beobachtet, die sich im erhöhten Vorkommen von invasiven Karzinomen und erhöhter Metastasierung der Lunge äußerte. Allerdings führte die Expression von p53R270H in diesem Modell nicht zu erhöhter genomischer Instabilität, welches diesen Mechanismus für den beobachteten gain-of-function Effekt ausschließt (Heinlein et al., 2007). 1.6 Die Maus Tumor-Zelllinie MethA Zur Untersuchung der Eigenschaften von mutantem p53 im Hinblick auf einen onkogenen Zugewinn wurde die MethA Fibrosarkom-Zelllinie (Old et al., 1962; DeLeo et al., 1979; DeLeo et al., 1977) als Modellsystem ausgewählt. Diese Zelllinie wurde aus einem Tumor etabliert, welcher infolge einer einmaligen, subkutanen Injektion des Karzinogens Methylcholanthren in eine weibliche Balb/c Maus entstand. Methylcholanthren gehört zur Gruppe der polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen mit karzinogener Wirkung. Die relativ selten auftretenden und klinisch heterogenen Sarkome beinhalten diverse maligne Tumore mesenchymalen Ursprungs, die in Bindegewebe wie Fett, Muskel, Fasergewebe, Knochen und Blutgefässen entstehen. Fibrosarkome sind durch unreife, proliferierende Fibroblasten oder undifferenzierte anaplastische Spindelzellen in Kollagenhintergrund gekennzeichnet. MethA Zellen sind aneuploid und exprimieren zwei verschiedene mutante p53 Spezies mit stark erhöhter Halbwertszeit. Ein mutantes p53 Protein enthält die Mutation Cys132Phe, während das vom zweiten Allel kodierte p53 Protein zwei Mutationen in Glu168Gly und Met234Ile enthält (Arai et al., 1986; Bienz et al., 1984; Eliyahu et al., 1988). Die Theorie des Zugewinns onkogener Eigenschaften besagt, dass die Mutationen in p53 selektioniert wurden, da sie im Gegensatz zum bloßen Verlust der Tumorsuppressoreigenschaft von p53 einen Vorteil in der Tumorprogression darstellt. Die dem humanen p53 Protein entsprechenden Mutationen in Codon 135 und 237 wurden relativ häufig, während die Mutation in Codon 171 weniger häufig in menschlichen Tumoren gefunden wurde (IARC Datenbank). Die Mutation im Codon 132 stellt eine Konformationsmutante dar, während die in Codon 168 zu den DNA Bindungsmutanten gezählt wird. MethA Zellen exprimieren zusätzlich eine alternativ gespleisste p53 mRNA, welche für ein kürzeres Protein mit einem veränderten C-Terminus kodiert (Arai et al., 1986). Das Verwenden von MethA Zellen als Modellsystem für die Forschung hat allerdings den Nachteil, dass es keine Diskriminierung der Effekte der einzelnen p53 Punktmutationen erlaubt. MethA mutp53 ist zum größten Teil im Nukleus lokalisiert, wo es stabil mit Chromatin, und Kernmatrixfraktion assoziiert ist (Deppert et al., 1990; Deppert and Haug, 1986; Deppert and Von Der Weth, 1990; Steinmeyer and Deppert, 1988; Zerrahn et al., 1992). Ein durch Isoleuzin-Depletion vermitteleter G1-Wachstumsarrest führt zum Verlust der Assoziation von MethA mutp53 mit nukleären Strukturen (Steinmeyer, Maacke, and Deppert, 1990). Im Gegensatz zu wtp53 inhibiert MethA mutp53 nicht die Translation seiner eigenen mRNA, Einleitung 23 obwohl es wie wtp53 an seine mRNA bindet (Mosner et al., 1995). MethA mutp53 ist stabil mit dem Hitzeschockprotein hsp70 assoziiert, welches als erster Interaktionspartner identifiziert wurde und vermutlich für die Stabilität von MethA mutp53 mitverantwortlich ist (Gronostajski, Goldberg, and Pardee, 1984; Pinhasi-Kimhi et al., 1986). MethA mutp53 bindet in vitro an doppelsträngige sowie einzelsträngige DNA in nicht sequenzspezifischer Weise. De Fromentel und Mitarbeiter beobachteten MethA mutp53 in Assoziation mit periund interchromatin Fibillen sowie mit hnRNP Strukturen (de Fromentel et al., 1986). MethA Zellen bilden nach intraperitonealer Injektion in syngene Mäuse Ascites. Nach subkutaner Injektion erfolgt eine Tumorbildung lediglich nach Vorbehandlung mit FreundAdjuvanz. Die Tumore sind durch tumorassoziierte Makrophagen und T Lymphozyten charakterisiert, welche vermutlich für die Tumorbildung essentiell sind. Dies lässt darauf schließen, dass MethA Zellen zur Manifestierung eines Tumors eine entzündliche Umgebung benötigen. Es ist zudem bekannt, dass die löslichen, für die Aktivierung von Makrophagen bzw. Endothelzellen benötigten Cytokine M-CSF sowie EMAP I und II von MethA Zellen sezerniert werden (Clarijs et al., 2003), was im Allgemeinen für die in vivo Tumorentstehung und progression von Entzündungs-assoziierten Tumoren von Bedeutung ist. Die Überexpression von Cytokinen, insbesondere M-CSF wurde in einer klinischen Studie mit Mutationen in p53 korreliert (Asschert et al., 1997). Zwei unabhängige Arbeitsgruppen konnten ferner zeigen, dass die Applikation der antisense Technik in MethA Zellen, welche die MethAp53 Mengen ungefähr halbierten, signifikant die Wachstumsrate verringert (Shohat et al., 1987; Yamauchi, Kobayashi, and Tanaka, 1996). Dies führte erstmals zur Hypothese, dass der hohe Spiegel an mutp53 in MethA Zellen für das schnelle und kontinuierliche Wachstum dieser Zellen verantwortlich ist. Nach dieser Hypothese ist mutp53 für das Wachstum und Überleben von MethA Zellen essentiell und an der transkriptionellen und posttranskriptionellen Regulation von Wachstumsfaktoren und Überlebensfaktoren beteiligt. 1.7 Zielsetzung der Arbeit Die Tumorgenese ist ein noch nicht komplett verstandener komplexer Prozess und jeder Tumor stellt einen im Bezug auf genetische, epigenetische oder chromosomale Veränderungen einzigartigen Zellverband dar, der durch dereguliertes Wachstum und Mechanismen zur Umgehung des Zelltods charakterisiert ist. So muss in entarteten Zellen eine Balance zwischen der Integrität und der Funktionalität des Genoms auf der einen Seite und der genetischen Instabilität auf der anderen Seite erreicht werden, um einen Fortbestand des Tumors zu ermöglichen. Einer der wichtigsten Tumormarker, das Tumorsuppressorprotein p53, ist in fast allen Tumoren dereguliert. Die physiologische Funktion von p53 ist entweder durch Deletionen oder nonsense Mutationen komplett ausgeschaltet, durch missense Mutationen funktionell verändert oder p53 liegt in der wt Form vor und wird durch Einleitung 24 andere Faktoren in seiner Funktion gehemmt. Für einige p53 missense Mutanten wurde ein Zugewinn onkogener Eigenschaften postuliert, der nicht nur auf den Verlust der tumorsupprimierenden Funktion von wtp53 beruht, sondern durch einen aktiven Beitrag von p53 missense Mutanten zur Tumorgenese charakterisiert ist. Um den Beitrag von mutantem p53 an der Tumorgenese und den zugrunde liegenden Mechanismus zu verstehen, sollte die murine Tumorzelllinie MethA, die hohe Mengen verschiedener mutp53 Spezies exprimiert, als Untersuchungsmodell für einen Zugewinn an onkogenen Eigenschaften von mutantem p53 dienen. Zunächst sollte die Bedeutung von mutp53 auf das Wachstum und Überleben von MethA Zellen durch die Folgen der Reduktion von mutp53 mittels RNA Interferenz untersucht werden. Da p53/mutp53 durch mehrere Rückkopplungsmechanismen, posttranslationale Modifikationen, Protein-Protein Interaktionen und Gewebsspezifität in seiner Aktivität reguliert wird, scheint es notwendig, dieses komplexe Netzwerk als Ganzes zu betrachten. Dazu sollte die Funktion von mutp53 systematisch durch ein Interaktomprojekt charakterisiert werden. Hierfür wurden mehrere komplementäre Methoden eingesetzt. Mittels der Chromatinimmunpräzipitationstechnik können in vivo DNA Bindungsstellen von mutp53 Protein in MethA Zellen untersucht werden. Durch die bioinformatische Analyse der in vivo Bindungsstellen sollen die Eigenschaften der spezifischen Bindung durch MethAp53 analysiert werden, um beurteilen zu können, ob diese Bindung sequenz- oder strukturspezifischer Natur ist. Durch einen anschließenden Vergleich der Expressionsprofile von MethA Zellen mit normalem bzw. durch RNA interference (RNAi) herunterreguliertem mutp53 Level mittels Microarray Technologie soll der Einfluss von mutp53 auf die Regulation der Genexpression untersucht werden. Des Weiteren soll mithilfe der Gesamt RNA Immunpräzipitationsmethode herausgefunden werden, ob mutp53 in vivo an RNA bindet und wenn ja, welche RNA Sequenzen durch mutp53 gebunden werden. Dies soll Aufschluss über die posttranskriptionelle Genregulation durch mutp53 geben. Um das Interaktomprojekt abzurunden, sollen außerdem Protein Interaktionspartner durch die MALDI ToF Massenspektrometrie nach Immunpräzipitation identifiziert werden. Die Ergebnisse der Techniken auf Genom, Transkriptom und Proteomebene sollen Rückschlüsse auf einen möglichen gain-of-function Mechanismus von mutp53 im Bezug auf das Fortschreiten der Tumorgenese insbesondere der Bedeutung von mutp53 auf das Wachstum in MethA Zellen geben. Material 25 2 MATERIAL 2.1 Chemikalien Es wurden handelsübliche Chemikalien in Analysequalität der Firma Fluka (St. Gallen), Merck (Darmstadt), Serva (Heidelberg) und Sigma (München) verwendet. Spezielle Chemikalien und Biochemikalien wurden von folgenden Herstellern bezogen: Acrylamid-Bis Fertiglsg. 40% (37,5:1) Cetavlon Coomassie Brilliant Blue (CBB) G250 Diammoniumcitrat 2, 5 Dihydroxybenzoesäure (DHB) Dithioerythritol (DTE) Freund-Adjuvanz Harnstoff/Thioharnstoff Iodoacetamid (IAA) IPG Puffer (20 % Biolyte Ampholyte) Protein G Sepharose Tetradecanoylamidopropyldimethylammoniobutansulfonat (ASB-14) Trypsin, proteomics grade Vanadylribonukleosidkomplex Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Fluka, St. Gallen, Schweiz Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Fluka, St. Gallen, Schweiz Calbiochem, San Diego, USA Merck, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Bio-Rad, Hercules, CA, USA Amersham, Piscataway, NJ, USA Calbiochem, San Diego, USA Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München New England Biolabs, Frankfurt a. M. 2.2 Lösungen und Puffer Zum Ansetzen von Puffern und Stammlösungen wurde stets bidestilliertes Wasser (18 MΩ) einer Reinstwasseranlage verwendet. Äquilibrierungspuffer (4 mg/ml DTE oder 20 mg/ml IAA) 50 mM Tris-HCl pH 8,8 6 M Harnstoff, deionisiert 30% Glycerin 3% SDS 0,002% Bromphenolblau Agarose Versiegelungslösung 25 mM Tris-HCl pH 7,0 192 mM Glycin 0,1% SDS 0,5% Agarose 0,002% Bromphenolblau colloidale Coomassie Färbelösung 10% Lösung A (4 g/l CBB G250 in EtOH) in Lösung B (200 g/l Ammoniumsulfat, 50 ml/l konz. H3PO4 mit Wasser) CSK I Puffer 0,5% Triton X-100 10 mM PIPES-KOH pH 6,8 50 mM KCl 125 mM Glycin 300 mM Sucrose 1 mM EGTA 10 mM β-Mercaptoethanol 3 mM MgCL2 Material 26 CSK IV Puffer CSKI Puffer ohne Triton X-100 DMEM + 5 % FCS 13,38 g/l DMEM-Pulver 3,7 g/l NaHCO3 in Wasser, pH 7,3 sterilfiltrieren 5% (v/v) FCS E1A + Lysepuffer 1ml Puffer für 1x107 Zellen 50 mM HEPES 150 mM NaCl 0,1% NP-40 pH Wert mit KOH auf 7,0 einstellen 1% Trasylol 1% Pepstatin 1% Pefabloc sc 0,1% Leupeptin Proteaseinhibitoren Fixierungslösung I Ethanol:Essigsäure:Wasser (30:10:60) 10 x Glycin Laufpuffer 292,8 g Glycin 121,1 g Tris ad 2 l mit Wasser 1x Puffer hat pH 8,3 Harnstoffprobenpuffer 7 M/2 M Harnstoff/Thioharnstoff, deionisiert 0,5% Dithioerythritol (DTE) 2% Tetradecanoylamidopropyldimethylammoniobutansulfonat (ASB-14) 1,25% IPG Puffer (20 % Biolyte Ampholyte) 0,002% Bromphenolblau KCl Puffer 200 mM KCl 10 mM Tris-HCl pH 7, 5 0,2 mM EDTA 1 mM β-Mercaptoethanol Laemmli Probenpuffer (2x) 3,55 ml Wasser 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 2,5 ml Glycerin 2 ml 10% SDS 0,2 ml 0,5% Bromphenolblau frisch 50 µl β-Mercaptoethanol zu 950 µl Probenpuffer zusetzen LB agar 10 g bacto-trypton 5 g bacto yeast extract 10 g NaCl 15 g agar mit NaOH ad pH 7,0 ad 1 l mit Wasser, autoklavieren Material 27 LB Medium 10 g bacto-trypton 5 g bacto yeast extract 10 g NaCl mit NaOH ad pH 7,0 ad 1 l mit Wasser, autoklavieren SOB Medium 20 g Bacto Trypton 5 g bacto yeast extrakt 0,5 g NaCl 2,5 ml 1M KCl mit NaOH pH ad 7,0 ad 990 ml mit Wasser, autoklavieren vor Gebrauch 10ml sterilfiltrierte 1 M MgCl2 Lösung zugeben SOC Medium siehe SOB Medium 20 ml sterilfiltrierte 1M Glucoselösung Matrix für MS 10 mg/ml DHB (2, 5 Dihydroxybenzoesäure) 5 mg/ml Diammoniumcitrat 50% Acetonitril 0,1% TFA 0,01% Phosphorsäure 10x PBS 1,37 M NaCl 0,027 M KCl 0,017 M KH2PO4 0,1 M Na2HPO4 pH 7,4 10x PBS (PIERCE) 1,4 M NaCl 0,08 M Na2PO4 0,02 M Kaliumphosphat 0,1 M KCl pH 7,4 RIPA Puffer 10 mM Tris-HCl pH 8,0 140 mM NaCl 0,5% Triton X-100 0,1% SDS 0,1% Natriumdeoxycholat Sammelgel 7 ml Wasser 0,75 ml 1,5 M Tris-HCl pH 6,8 1,25 ml Acrylamidlösung 100 µl 10% SDS 5 µl TEMED 25 µl 10% APS 1 ml Glycerin SDS Elektrophoresepuffer 25 mM Tris 192 mM Glycin 0,1% SDS Material 28 6x SDS Probenpuffer 300 mM Tris-HCl pH 7,0 12% SDS 0,6% Bromphenolblau 60% Glycerin 10% β-Mercaptoethanol 50 x TAE, pH 8,3 242,3 g Tris 37,3 g EDTA (Dinatriumsalz, Dihydrat) 57,1 ml Essigsäure ad 1 l mit Wasser Trenngel (12%) 34,7 ml Wasser 20 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 24 ml Acrylamidlösung 800 µl 10% SDS 50 µl TEMED 250 µl 10% APS TRIS/Glycin Puffer 25 mM TRIS 192 mM Glycin 0,2% SDS 10% Ethanol 2.3 Enzyme Calf Intestinal Phosphatase (CIP) DNase I EcoRV Proteinase K Reverse Transkriptase RNase A RNase H Taq DNA Polymerase T4 DNA Ligase T4 Polynukleotidkinase Trypsin (Proteomics grade) New England Biolabs, Frankfurt a. M. Qiagen, Hilden New England Biolabs, Frankfurt a. M. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Fermentas, St. Leon-Rot Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Fermentas, St. Leon-Rot Eppendorf, Hamburg New England Biolabs, Frankfurt a. M. Gibco, (Invitrogen GmbH), Karlsruhe Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München 2.4 DNA- und Protein Molekulargewichtsstandards 2.4.1 DNA Molekulargewichtsstandards Gene RulerTM 1kb DNA ladder Gene RulerTM 100bp DNA ladder Fermentas, St. Leon-Rot Fermentas, St. Leon-Rot 2.4.2 ProteinMolekuargewichtsstandards Roti®-Mark 10-150 Precision Plus ProteinTM All Blue Standards Carl Roth®, Karlsruhe Bio-Rad, Hercules, CA, USA 2.5 Plasmide pBluescript II SK+ (2961 bp) pENTRTM/H1/TO (3869 bp) pSUPERIOR.neo+GFP (5430 bp) Stratagene, La Jolla, CA, USA Invitrogen GmbH, Karlsruhe OligoEngine, Seattle, WA, USA Material 29 2.6 Bakterienstämme SURE® Electroporation competent cells Stratagene, La Jolla, CA, USA SURE strain Genotyp: e14– (McrA–) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F' proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]. XL1-Blue competent cells Stratagene, La Jolla, CA, USA XL1-Blue Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]. 2.7 Oligonukleotide, PCR- und Sequenzierprimer Oligonukleotid 5´- 3´ Sequenz CatchA Adaptor AATTCGGTCAAGTGAACACGAGCAG Catch Bp Adaptor CTGCTCGTGTTCACTTGACCGAATT CDS Primer AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT M13 forward (-20) Primer GTAAAACGACGGCCAG M13 reverse GTCATAGCTGTTTCCTG scrambled sense Oligo nukleotid GATCCCCCGAACTTTTGGACGCGCACTTCAAGAGAGTGCG CGTCCAAAAGTTCGTTTTTC scrambled antisense Oligonukleotid TCGAGAAAAACGAACTTTTGGACGCGCACTCTCTTGAAGG CGCGTCCAAAAGTTCGGGG sip53 sense Oligonukleotid GATCCCCGACTCCAGTGGGAACCTTCTTCAAGAGAGAAGG TTCCCACTGGAGTCTTTTTC sip53 antisense Oligonukleotid TCGAGAAAAAGACTCCAGTGGGAACCTTCTCTCTTGAAGA GGTTCCCACTGGAGTCGGG SK new Primer CGGCCGCTCTAGAACTAGTGGAT T7 Primer TAATACGACTCACTATAGGG P1 Cap Primer AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrG PCR CDS Primer AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT Poly T CDS Primer AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC (T)30N-1N Poly T MBO 20 Primer CTGCTCGAATTCAACTGACG(T)30N-1N Mbo-sip53.H TCGAATTCAACTGACGGACTCCACTCCGAACCT Material 30 qRT-PCR-primer 5´- 3´ Sequenz Myo1e-Q1 CACAGTGGTGTGGACGACAT Myo1e-Q2 GCTTGAATGGGTTGACAGAGATT mActb_Q1 GAAATCGTGCGTGACATCAAAG mActb_Q2 TGTAGTTTCATGGATGCCACAG Trp53_Q1 TGGAGAGTATTTCACCCTCAAGA Trp53_Q2 CTCCTCTGTAGCATGGGCATC Ccl4-Q1 TTCCTGCTGTTTCTCTTACACCT Ccl4-Q2 CTGTCTGCCTCTTTTGGTCAG Cxcl10-Q1 CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC Cxcl10-Q2 GGCTCGCAGGGATGATTTCAA Dync1h1-Q1 TTCCAGGCGATGGGACGTAT Dync1h1-Q2 ATGTCTGGGCTAACCTTGACT Galnt7-Q1 AGGGTTTGATTCAAGCTCGGA Galnt7-Q2 CTCCTCGGGCATACCCATCT Ctnnb1-Q1 ATGGAGCCGGACAGAAAAGC Ctnnb1-Q2 CTTGCCACTCAGGGAAGGA mOas2-Q1 AATGAAAGTGTCGAGTTCGATGT mOas2-Q2 GCTCAATGAGATCCTTGTAGGC mStat2-Q1 CCGAAGCAGTTGTGGAGAG mStat2-Q2 GACATCCTGTTCGTCCTTCAG mEif2ak2-Q3 TTCACACGTGCTTCACGGAGT mEif2ak2-Q4 CCATTCAGCCAAGGTCTTCAG 2.8 Eukaryotische Zelllinien MethA Fibroblasten isoliert aus einer mit Methylcholanthren transformierten Balb/c Maus, die hohe Mengen verschiedener mutanter p53 Spezies exprimieren (132, 168 und 234) (DeLeo et al., 1977). 10-1 Zellen sind Balb/c Mausembryofibroblasten mit Deletionen in beiden p53 Allelen (Harvey and Levine, 1991). 2.9 Nährmedien und Antibiotika DMEM RPMI FCS Trypsin Trypsin (1:250) 2,5 % (w/v) Penicillin/Streptomycin Kanamycin Gibco (Invitrogen GmbH), Karlsruhe Gibco (Invitrogen GmbH), Karlsruhe PAA Laboratories, Pasching, A Biochrom AG, Berlin Biochrom AG, Berlin PAA Laboratories, Pasching, A Biochrom AG, Berlin Material Gentamycin, Neomycin Zeocin 31 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Gibco (Invitrogen GmbH), Karlsruhe 2.10 Antikörper 2.10.1 Primärantikörper Maus-anti-p53 Pab 421 (Epitop: AS 371-380) Maus-anti-p53 Pab 248 (Epitop: AS 157-192) Maus-anti-p53 Pab 242 (Epitop: AS 18-27) Ziege-anti-p53 polyklonal (FL-393; sc-6243) Maus-anti hsc-70 (B-6; sc-7298) Maus-anti-hnRNP A2/B1 (DP3B3; sc-32316) Kaninchen-anti-YB1 polyklonal (ab12148) Kaninchen-anti-hnRNP D (Poly6084; 608402) Maus-anti-PKR (B-10; sc-6282) Kaninchen-anti-cleaved caspase (9691) Maus-anti-Tubulin (DM1A; CP06-100UG) Ratte-anti-Tubulin (YL1/2; sc-53029) Ziege-anti-Aktin (1-19; sc-1616) Ratte-anti-Cd11b (ITGAM; CBL1313) Ziege-anti-Vimentin polyklonal (C20; sc-7557) Hybridomüberstand Hybridomüberstand Hybridomüberstand Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA Biozol, Eching BioLegend San Diego, CA, USA Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA Cell Signaling, Danvers, MA, USA Oncogene Research, USA Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA Millipore (früher Chemicon), Schwalbach Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA 2.10.2 Sekundärantikörper 2.10.2.1 Meerrettich Peroxidase (HRP) gekoppelte Sekundärantikörper Ziege-anti-Maus IgG-HRP (sc-2005) Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA Esel-anti-Ziege IgG-HRP (705-035-147) dianova, Hamburg Esel-anti-Maus IgG-HRP (715-035-151) dianova, Hamburg Esel-anti-Kaninchen IgG-HRP (711-035-152) dianova, Hamburg 2.10.2.2 Fluorochrom konjugierte Sekundärantikörper Esel-anti-Ziege IgG-Alexa 488 (A-11055) Invitrogen Molecular Probes, NL Esel-anti-Ziege IgG-Alexa 568 (A-11057) Invitrogen Molecular Probes, NL Esel-anti-Maus IgG-Alexa 488 (A-21202) Invitrogen Molecular Probes, NL Esel-anti-Maus IgG-Alexa 555 (A-31570) Invitrogen Molecular Probes, NL Esel-anti-Kaninchen IgG-Alexa 488 (A-21206) Invitrogen Molecular Probes, NL Ziege-anti-Kaninchen IgG-Alexa 555 (A-21429) Invitrogen Molecular Probes, NL Ziege-anti-Maus IgG-Alexa 568 (A-11031) Invitrogen Molecular Probes, NL 2.11 Kit Systeme Cell line Nucleofector® kit V Cell Proliferation Reagent WST-1 Cyanine CTP 2-color dye pack low RNA Input linear Amp Kit Nucleobond AX Amaxa biosystems, Köln Roche, Basel, Schweiz Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA Agilent Technologies Macherey-Nagel, Düren Material 32 NucleoBond PC 100/500 PCR cleanup Gel extraction kit Power SYBR® Green PCR MasterMix Macherey-Nagel, Düren Macherey-Nagel, Düren Applied Biosystems, Foster City, CA, USA Qiagen, Hilden QIAshredder RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthese kit RNase free DNase set RNA Mini Elute Cleanup Kit RNA 6000 Nano LabChip® Kits RNA spike-in kit RNeasy® Mini kit Taq DNA Polymerase T-GelTM -Adsorbent 2.12 Verbrauchsmaterialien Centricon® Centrifugal Filter devices Dynabeads-Protein G Filterpapier Whatman 3MM ImmobilonTM-P Membran Lysing Matrix D beads S400 Micro Spin Säulen Pack of Backings (4 Arrays/slide) Protein Assay Reagenz ReadyStripRM IPG Streifen (18 cm, pI 4-7 oder 3-10) Quick Spin Columns (G50 Sephadex) SuperSignal® West Extended Duration Substrate Trizol® Vectashield® mounting medium Whole mouse genome microarray 4x44K ZipTip C18 Pipettenspitzen Fermentas, St. Leon-Rot Qiagen, Hilden Qiagen, Hilden Agilent Technologies Agilent Technologies Qiagen, Hilden Eppendorf, Hamburg Pierce, Rockford, IL, USA Millipore, Schwalbach Dynal, Oslo, Norwegen Schleicher & Schüll, Dassel Millipore, Schwalbach MP biomedicals, Solon, OH, USA Amersham, Piscataway, NJ USA Agilent Technologies Bio-Rad, Hercules, CA, USA Bio-Rad, Hercules, CA, USA Roche, Basel Pierce, Rockford, IL, USA Invitrogen GmbH, Karlsruhe Vector, Wettenberg Agilent Technologies Millipore, Schwalbach 2.13 Computer-Software Adobe Photoshop 7.0.1 BioStation IM version 1.01, build 60 Endnote Version X1 7500 Fast System Software (Applied Biosystems) Feature Extraction 9.5 (Agilent Technologies) GeneSpring GX (Agilent Technologies) Imaris 4.3.1 (Bitplane AG) Kratos software (Kompact V2.4.1) Leica Confocal Software LCS Lite Version 2.0 MASCOT software (http://www.matrixscience.com) Microsoft Word, Excel, Power Point Sci Ed Central Clone Manager 5 2.14 Geräte 2100 Bioanalyzer BioStation IM Brutschrank B6060 Brutschrank Hera Cell 150 Brutschrank Hera Cell Function line Elektrophoresesystem Hoefer® SemiPhorTM Elektroporationsgerät NucleofectorTM I Agilent Technologies Nikon GmbH, Düsseldorf Heraeus Instruments, Düsseldorf Heraeus Instruments, Düsseldorf Heraeus Instruments, Düsseldorf GE healthcare, Chalfont St. Giles, GB Amaxa biosystems, Köln Material Elisa Reader SUNRISE Entwicklermaschine Classic E.O.S. FACS Aria Feinwaage H54AR Fluoreszenzmikroskop DMRA Fluoreszenzikroskop DMI 6000 B Gefriertrockner Finn-Aqua® Lyovac GT 2E Geldokumentation BioDocAnalyze Heizblock Techne Dri-Block DB 2A Immobiline® DryStrip Reswelling Tray Isoelektrisches Fokussiersystem IPGphorTM Konfokales Fluoreszenzmikroskop LSM 510 Kühlfalle RT100A Massenspektrometer Kratos PC Axima CFR Membran-Vakuumpumpe MZ2C/1,7 Mikroskop Labovert Mikroskop Phase Contrast ULW CD0.30 Mikroskop IMT-2 Mikroskop CK40 PCR Maschine PTC-200 pH-Meter PHM82 Standard pH-Meter Seven Easy Real-Time PCR System 7500 Fast Reinstwassersystem Milli-Q® Academic Röntgenfilme Sterilbank HERA safe KS18 und KS12 Stromversorgungsgerät Power Pac 200 Stromversorgungsgerät Power Pac 3000 Stromversorgungsgerät 2303 Multidrive XL Spektrophotometer NanoDrop® ND-1000 Spektrophotometer DU® 800 Thermomixer Comfort Vakuumzentrifuge Speed Vac® SPD 101B Vortexer Vortex-Genie Vortexer REAX top Waage PE360 Waage PM460 Waage PB3001-S/FACT Zentrifuge Biofuge pico Zentrifuge RC50 Plus Zentrifuge 5810 R Zentrifuge 4 °C 5415 C Zentrifuge 4 °C 5415 D Zentrifuge Omnifuge 2.0RS Zentrifuge Rotana 96 Zentrifuge L-70 Ultracentrifuge Zentrifuge Sorvall® RC 5C Plus 33 TECAN AG, Mannedorf, Schweiz AGFA, Köln BD biosciences, Pharmingen, USA Mettler Toledo, Gießen Leica, Solms Leica, Solms Steris® Corporation, Mentor, OH, USA Whatman Biometra, Göttingen Thermo-Dux, Wertheim Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA Carl Zeiss AG, Oberkochen Savant Instruments, Farmingdale NY, USA Shimadzu, Kyoto, Japan Vakuubrand, Wertheim Leitz, Wetzlar Olympus, Hamburg Olympus, Hamburg Olympus, Hamburg MJ Research, Watertown MA, USA Radiometer, Kopenhagen, DK Mettler Toledo, Gießen Applied Biosystems, Foster City, CA, USA Millipore, Schwalbach CEA Deutschland GmbH, Hamburg Thermo Electron Corporation, Langenselbold BioRad, München BioRad, München Pharmacia, Erlangen Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA Eppendorf, Hamburg Savant Instruments, Farmingdale NY, USA Bender & Hobein AG, Zürich, CH Heidolph, Kelheim Mettler Toledo, Gießen Mettler Toledo, Gießen Mettler Toledo, Gießen Heraeus Instruments, Düsseldorf Sorvall, Bad Homburg Eppendorf, Hamburg Eppendorf, Hamburg Eppendorf, Hamburg Heraeus Instruments, Düsseldorf Hettrich Zentrifugen, Tuttlingen Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold Methoden 34 3 METHODEN 3.1 Zellkultur und Zellpassage MethA Zellen wurden adhärent in DMEM mit 5% FCS in beschichteten Zellkulturschalen Nunc Delta in einem Inkubator mit 37°C und 6% CO2 kultiviert. Alternativ lassen sich MethA Zellen in Suspension halten. Dazu wurde eine 1:1 Mischung aus DMEM und RPMI Medium mit 10% FCS verwendet und die Zellen in Spinnergefäßen bei 37°C inkubiert. Aufgrund der hohen Wachstumsrate wurden die adhärent wachsenden MethA Zellen zweimal wöchentlich durch Zugabe von Trypsin EDTA und Inkubation bei 37°C für etwa 3 min passagiert. 3.2 Chromatin-Immunpräzipitation-Sequenzierung (ChIP-Seq) Zur Charakterisierung von DNA Sequenzen, an die mutp53 in vivo bindet, wurde eine Chromatin-Immunpräzipitation durchgeführt. Durch Behandlung der MethA Zellen mit Formaldehyd wird eine kovalente Quervernetzung der Proteine an genomische DNA erreicht. Das Chromatin wird durch Sonifizieren zerkleinert und die Chromatinfragmente mit gebundenem mutp53 Protein danach durch Immunpräzipitation mit spezifischem Antikörper angereichert. Abbildung 6 Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs der Gesamtgenom- ChromatinImmunpräzipitation. MethA Zellen werden in vivo mit dem Vernetzungsreagenz Formaldehyd behandelt, die DNA in kleinere Teile durch Sonifizieren geschert, anschließend mit p53 Antikörper gekoppelt an Matrix immunpräzipitiert, die Proteine durch Proteinase K Inkubation abgebaut und die DNA Fragmente isoliert. Anschließend werden die DNA Fragmente durch PCR amplifiziert, nach Agarosegelauftrennung analysiert und zuletzt kloniert und sequenziert. 3.2.1 Protein-DNA Isolierung Zunächst wurden mit PBS gewaschene MethA Zellen in der Kulturschale für 8 min bei 37°C mit 0,25% Formaldehyd enthaltendem DMEM inkubiert, damit DNA-Protein Komplexe reversibel quervernetzt werden, um diese dann isolieren und analysieren zu können. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 125 mM Glycin in PBS gestoppt. Die Zellen wurden dann mit einem Gummiwischer von der Platte entfernt und in 3 ml CSK I Puffer supplementiert mit Proteaseinhibitoren aufgenommen. Nach einer Zentrifugation bei 3300 rpm für 5 min bei 4°C wurde das erhaltene Pellet zweimal mit 1 ml CSK IV Puffer inklusive Proteaseinhibitoren gewaschen. Das Pellet wurde nun in 900 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,5 und 150 mM NaCl gelöst und sonifiziert. Nach einer Inkubation von 10 min auf Eis wurden 100 µl Cetavlon zugefügt und wiederum bei 12000 g für 5 min bei RT zentrifugiert. Das Pellet wurde danach in 200 µl Methoden 35 10 mM Tris-HCl pH 7,5 und 1,5 M NaCl aufgenommen und erneut sonifiziert. Nach Zugabe von 1,7 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,5 sowie 100 µl Cetavlon, wurde der Ansatz 15 min auf Eis inkubiert und anschließend 5 min bei RT und 12000 g zentrifugiert. Durch Aufnahme des Pellets in 400 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,5; 1,5 M NaCl sowie 3 Volumen 100% Ethanol, wurde die DNA gefällt. Das Pellet wurde zweimal mit 70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 900 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,5 und 0,5% SDS sowie 100 µl 2,5 M KCl aufgenommen und erneut 5 min auf Eis inkubiert. Nach einer 3 minütigen Zentrifugation wurde das Pellet in 1 ml KCl Puffer gelöst und 3 min bei 60°C geschüttelt, anschließend 5 min auf Eis inkubiert und 3 min bei 4°C und 12000 g zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Abschließend wurde das Pellet in 400 µl 10 mM Tris-HCL pH 7,5 und 0,1% SDS durch schütteln für 3 min bei 50°C gelöst. 3.2.2 Immunpräzipitation Zunächst wurden die DNA-Protein Proben auf folgende Konzentrationen bei einem Gesamtvolumen von 500 µl abgeglichen: 0,5% Triton X-100, 0,1% Natriumdeoxycholat, 140 mM NaCl und 10 mM Tris-HCl pH 8. Anschließend wurden 30 µl Protein G Sepharose (PGS, 50% w/v), welche in RIPA Puffer äquilibriert wurde, als Matrix zugegeben und 1 h bei 4°C inkubiert. Um unspezifische Bindung an die Matrix zu vermeiden, wurden die PGS Partikel nach einer kurzen Zentrifugation verworfen. Daraufhin wurde dem Überstand der entsprechende Antikörper zugesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach wurden wiederum 50 µl PGS zugegeben und 4 h bei 4°C rotiert. Die Matrix wurde nun fünfmal für je 10 min mit RIPA Puffer und anschließend mit 10 mM Tris-HCl pH 8,0 und 150 mM NaCl für 3 min gewaschen. Die PGS gebundenen Immunokomplexe wurden durch Inkubation mit 100 µl 2% SDS; 20 mM Tris-HCl pH 8,0 bei 65°C für 10 min eluiert und nochmals mit 300 µl derselben Lösung gewaschen. Es folgte ein Proteinabbau durch Inkubation mit 0,5 mg/ml Proteinase K und 2 mM CaCl2 für 1 h bei 50°C. Damit restliche Methylenbrücken dissoziieren, wurden die Proben zusätzlich 4 h bei 65°C inkubiert. Nachdem die DNA Fragmente durch Phenol-Chloroform Zugabe extrahiert wurden, wurde die DNA durch Zusetzen von 2,5 Volumen 100% Ethanol, 1/ 10 V 3 M Natriumacetat pH 5,5 sowie 10 µg Glycogen für 2-12 h bei -20°C gefällt, zentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 20 µl Wasser aufgenommen. Um die Enden der DNA Fragmente zu polieren, wurden diese 30 min bei 72°C mit 2 Einheiten Pfu DNA Polymerase und 200 µM dNTPs in einem Reaktionsvolumen von 25 µl inkubiert und anschließend auf 4°C abgekühlt. Erneut wurde eine Phenol-Chloroform Extraktion mit anschließender DNA Fällung durchgeführt, um die Polymerase wieder zu entfernen. Die in 10 µl Wasser aufgenommenen DNA Fragmente wurden nun an so genannte Catch A/Bp Adaptoren ligiert, indem sie mit T4 Polynukleotid-Kinasepuffer, 100 µM dATP, 30 pmol Adaptoren und T4 DNA Ligase für 8 h bei 16°C in einem Reaktionsvolumen von 20 µl inkubiert wurden. Eine anschließend durchgeführte Zentrifugation durch S400 Mini Spin Säulen trennt nicht ligierte Adaptoren wieder ab. Durch PCR wurden die immunoselektierten DNA Fragmente nun amplifiziert und die entstandenen Produkte durch Agarose Gelelektrophorese analysiert. 3.2.3 Klonieren der DNA Fragmente Zur Klonierung und Identifizierung der DNA Fragmente phosphoryliert. x µl PCR Produkt 1 µl T4 PNK 1-1.5 µl T4 PNK Puffer 1 µl 1mM ATP y µl ddH2O wurden diese zunächst Σ 10-15 µl Dazu wurde der Phosphorylierungsansatz 30 min bei 37°C inkubiert und die Polynukleotidkinase (PNK) durch 10 minütiges Erhitzen auf 70°C inaktiviert. Danach wurde das PCR Produkt mithilfe des PCR cleanup kits aufgereinigt, die DNA durch Ethanol Methoden 36 präzipitiert und anschließend in 10 µl Wasser resuspendiert. Parallel musste der verwendete Vektor pBluescript II SK+ mit EcoRV linearisiert und anschließend dephosphoryliert werden. Dazu wurde folgender Ansatz pipettiert: 1 µg Vektor DNA 5 µl 10x Restriktionspuffer 0.5 µl 100x BSA 1 µl EcoRV x µl ddH2O Σ 50µl Der Ansatz wurde 1 h bei 37°C inkubiert und wiederum Phenol-Chloroform extrahiert und die DNA durch Ethanol präzipitiert. Zur Dephosphorylierung wurde folgender Ansatz 1 h bei 37°C, dann 15 min bei 65°C inkubiert und erneut eine Phenol-Chloroform Extraktion sowie Ethanol Präzipitation durchgeführt: linearisierter Vektor 10x Dephosphorylierungspuffer 1 µl CIP (1U/µl) ddH2O Σ 50µl Vor der Ligation wurden linearisierter und dephosphorylierter Vektor, sowie das aufgereinigte PCR Produkt auf einem Agarosegel überprüft. Nun konnten die aufgereinigten DNA Fragmente mit der vorbereiteten Vektor DNA ligiert und schließlich in chemisch kompetente Zellen transformiert werden. 10 ng Vektor DNA (linearisiert und dephosphoryliert) x µl insert DNA (molares Verhältnis 1:3 bis 1:5) 2 µl 10x Ligasepuffer 1 µl T4 DNA ligase (1U/µl) y µl ddH2O Σ 20µl Der sog. blunt-end Ligationsansatz wurde über Nacht bei 16°C ohne Schütteln inkubiert. Als negative Kontrolle diente Vektor DNA ohne PCR Insert DNA, um den Prozentsatz religierten Vektors abschätzen zu können. Zur Transformation wurden 200 µl chemisch kompetente Zellen (Inoue, Nojima, and Okayama, 1990) und 5 µl Ligationsprodukt 30 min auf Eis inkubiert, dann 30 s bei 42°C inkubiert (Hitzeschock), direkt 800 µl SOC Medium zugegeben und 1 h bei 37°C zur Ausbildung der Antibiotikaresistenz inkubiert. Ein Teil des Ansatzes wurde auf eine vorbereitete LB-Ampicillin (50 µg/ml) Platte ausgestrichen, die IPTG (100 µl 10 mM) sowie Xgal (100 µl 2%) enthielten, um eine blau-weiß Selektion zu ermöglichen. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C in einem Brutschrank inkubiert. Die über Nacht gewachsenen Bakterienkolonien wurden durch PCR auf die Aufnahme des Vektors mit spezifischen Primern überprüft. PCR Programm 0.1-0.2 µM primer (SKnew, T7, 10 µM) 2 µl 10x Taq pol Puffer 0.2 µl Taq Polymerase 0.4 µl dNTPs (10mM) 1.5 µl template DNA 15.7 µl ddH2O Σ 20µl 1 94°C 2 min 2 96°C 20 s 3 55°C/ 50°C 30 s 4 72°C 2 min 2-4 30 Zyklen 5 72°C 6 4°C 8 min Methoden 37 Dazu wurde ein Teil einer Kolonie in 20 µl Wasser aufgenommen, welches 100 µg/ml RNase enthält, 5 min bei 95°C inkubiert, nach Abkühlen zentrifugiert und 1,5 µl des Überstandes für die PCR eingesetzt. Nach Ablauf des Programms wurden die PCR Ansätze auf einem Agarosegel aufgetrennt und überprüft. Von den positiven Klonen wurde die DNA in kleinem Maßstab präpariert und dann sequenziert. Dazu wurden 2-5 ml LB-amp Flüssigkultur angesetzt, die 12-16 h bei 37°C und 200 rpm geschüttelt wurden. Mithilfe des MN kits zur Mini-Präparation von Plasmid DNA wurde dann die Plasmid DNA laut Herstellerprotokoll isoliert und deren Konzentration durch UV Messung bestimmt, sowie deren Qualität auf einem Agarosegel überprüft. Die Sequenzierung erfolgte kommerziell von der Firma MWG Biotech. 3.3 RNA-IP (RNA-Immunpräzipitation) Um zu untersuchen, ob ein Protein an RNA bindet und wenn ja, an welche RNA Sequenzen, wurde das in Abbildung 7 dargestellte Protokoll in unserem Labor von Lars Tögel entwickelt. Extraktion von 5x106 Zellen mit E1A Puffer spezifische Immunpräzipitation mit polyklonalen Antikörper gegen p53 (lösliche Fraktion) Aufreinigung der gebundenen RNA cDNA Synthese: 5‘ Cap A(n) 3‘ 3‘T(n) PolyT-CDS 5‘ MoMuL Virus RT terminale Desoxynukleotidtransferase Aktivität 5‘ Cap A(n) 3‘ T(n) 3‘CCC P1Cap-CDS 5‘ P1Cap-CDS GGG 3‘CCC GGG PolyT-CDS 5‘ template switch A(n) 3‘ T(n) PolyT-CDS 5‘ Rnase H Verdau 3‘ P1Cap-CDS CCC T(n) PolyT-CDS 5‘ Synthese des zweiten Stranges, Amplifikation via PCR Klonierung in pBuescript II sk (+) und Sequenzierung Abbildung 7 Schematischer Ablauf des RNA-IP Experimentes (nach Lars Tögel). Für die RNA-IP wurden MethA Zellen 5 min in E1A+ Puffer, dem 2 mM des RNase Inhibitors Vanadylribonukleosidkomplex zugesetzt war, lysiert. Danach wurden die Zelltrümmer nach einer Zentrifugation verworfen. Um eine unspezifische Bindung von RNA an die verwendete Matrix zu vermeiden, wurde dem Überstand zunächst an Dynabeads gekoppelte Protein G Methoden 38 als Matrix zugesetzt und 30 min inkubiert. Die Verwendung der magnetischen Dynabeads als Matrix ermöglicht die Trennung der beads vom Überstand durch einen Magneten ohne Zentrifugation. Danach folgte die eigentliche Immunpräzipitation von mutp53 durch Zugabe von 1 µg p53 Antikörper für 1 h. Es wurden dann wiederum die Dynabeads-Protein G zugegeben und eine weitere Stunde inkubiert. Die Matrix wurde nun viermal mit E1A+ Puffer gewaschen und das Präzipitat anschließend mit RLT Puffer (RNeasy Mini kit) und zugesetztem β-Mercaptoethanol eluiert. Die RNA wurde nun mithilfe des RNeasy Mini kit isoliert und mit DNase I behandelt. Durch Verwendung der Poly T CDS und P1cap Primer wurde die RNA mithilfe des RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthese kits von Fermentas in cDNA umgeschrieben, mit RNase H verdaut und durch eine PCR amplifiziert (Matz et al., 1999). Daraufhin wurden die RNA Fragmente auf einem Agarosegel aufgetrennt und für die Klonierung aufgereingt und phosphoryliert und in den mit EcoRV linearisierten und dephosphorylierten pBluescript II SK+ Vektor ligiert (vgl. ChIP 3.2.3). Die Transformation, Präparation und Sequenzierung erfolgte wie unter 3.2 beschrieben. 3.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Zur Analyse der Proteinexpression wurde die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDSPAGE) verwendet. SDS (sodium dodecyl sulfate) ist ein anionisches Detergenz, welches die Eigenladung von Proteinen so effektiv überdeckt, dass Micellen mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheit entstehen. Bei der Probenvorbereitung wurden die Ansätze mit einem Überschuss von SDS auf 95°C erhitzt und so die Tertiär- und Sekundärstrukturen der Moleküle weitgehend aufgelöst. Schwefelbrücken zwischen Cysteinen wurden durch die Zugabe einer reduzierenden Thiolverbindung, hier β-Mercaptoethanol, aufgespalten. Die mit SDS beladenen, gestreckten Aminosäureketten bilden so Ellipsoide, deren Migrationsverhalten nur noch von der Anzahl der Aminosäuren abhängig ist. Um eine hohe Auflösung der einzelnen Banden zu erhalten, wurde hier eine Elektrophorese mit diskontinuierlichem Tris-HCl/Tris-Glycin-Puffersystem durchgeführt (Laemmli, 1970). Dabei ist die Gelmatrix in zwei Bereiche eingeteilt: das engporige Trenngel und das weitporige Sammelgel. Beide sind darüber hinaus unterschiedlich gepuffert. Beim Anlegen des elektrischen Feldes entsteht im Sammelgel ein Feldstärkegradient, in dem die ProteinIonen während der Wanderung einen Stapel in der Reihenfolge ihrer Mobilitäten bilden. Beim Erreichen des Trenngels treten die Proteine in einen Bereich mit konstanter Feldstärke ein, wobei schließlich eine Auftrennung nach Molekülgröße erfolgt. Es wurden jeweils 12,5%ige Gele angefertigt, da alle zu detektierenden Proteine im Bereich um 50-70 kDa zu erwarten waren. 3.5 Western-Blot / Immunblot (semi-dry Verfahren) Mit dieser Methode lassen sich elektrophoretisch aufgetrennte Proteine mit spezifischen Bindungseigenschaften über Antikörper direkt auf der Membran nachweisen. Für den elektrophoretischen Transfer sind zwei unterschiedliche Verfahren im Laboreinsatz: das semi-dry-Blotting und das Tankblotting. Beim Vorgang des Elektroblottings werden die zu einer Bande fokussierten Proteine aus der Polyacrylamidmatrix über das angelegte elektrische Feld eluiert und auf die Membran transferiert. Nach dem Transfer auf eine Nitrocellulosemembran kann eine weitere unspezifische Adsorption durch Blocken der noch verbliebenen bindenden Stellen mithilfe von Magermilchpulver zurückgedrängt werden. Für die Zurückdrängung von unspezifischen Bindungen hat sich auch in einigen Fällen der Einsatz nichtionischer Detergenzien in den Waschlösungen bewährt, weshalb Tween® 20 in einigen Fällen dem Waschpuffer zugesetzt wurde. Die hier verwendeten Waschpuffer waren PBS und PBST (T = Tween® 20) und richteten sich nach dem verwendetem Antikörper. Für den elektrophoretischen Transfer wurde die Hoefer® SemiPhorTM Apparatur verwendet und das Gel auf eine ImmobilonTM-P Membran transferiert. Danach wurde die Membran durch Inkubation mit 5% Magermilchpulver in PBST blockiert und anschließend mit dem ersten Antikörper inkubiert. Nach gründlichem Waschen der Membran mit PBST erfolgte die Inkubation mit dem zweiten HRP gekoppelten Antikörper. Methoden 39 3.6 Detektion (ECL-Methode) Bei der Immundetektion wird eine spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion ausgenutzt, bei der die Membran zuerst mit einem Antikörper für das zu untersuchende Protein inkubiert wird. Dieser Antikörper ist gleichzeitig Antigen für den zweiten Antikörper, der einen Amplifikator (HRP; mit Lumineszenz-System) enthält. Proteinbanden oder -spots wurden durch das SuperSignal® West Extended Duration Substrate visualisiert. 3.7 Immunpräzipitation in großem Maßstab Zur Identifizierung potentieller mutp53 interagierender Proteine, wurde eine Immunpräzipitation mit p53 spezifischem Antikörper durchgeführt und das Immunpräzipitat durch 2D Gelelektrophorese aufgetrennt. Die nach Coomassiefärbung sichtbaren Proteinspots können anschließend durch massenspektrometrische Analyse identifiziert werden. Hierzu wurden in Suspension kultivierte MethA Zellen vor der Ernte zweimal mit PBS gewaschen, zentrifugiert und das Zellpellet bei -20°C aufbewahrt. Für den weiteren Gebrauch wurde das MethA Zellpellet in E1A+ Lysepuffer resuspendiert und 20 min auf Eis inkubiert, bevor die unlöslichen Zelltrümmer abzentrifugiert wurden. Abbildung 8 Ablauf des Proteomexperiments schematisch dargestellt. MethA Zellen werden in großem Maßstab mit p53 Antikörper an PGS gekoppelt, immunpräzipitiert und das Präzipitat danach zweidimensional nach isoelektrischen Punkt pI und Molekulargewicht aufgetrennt. Nach Coomassiefärbung des Gels werden interessierende Proteinspots ausgestochen und der massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Für eine Immunpräzipitation in großem Maßstab wurden 5x109 MethA Zellen in 100 ml E1A+ Lysepuffer aufgenommen. Für die anschließende Immunpräzipitation wurde der Überstand mit der Matrix, an die eine anti-p53 Antikörpermischung gekoppelt wurde, versetzt und über Nacht bei 4°C zur Inkubation rotiert (5 mg Antikörpermix an 2 ml PGS gekoppelt). Pro 100 µg Totalprotein wurde ungefähr 1 µg Antikörper verwendet. Für die Kopplung an die Matrix PGS wurde eine Mischung dreier monoklonaler Maus p53 Antikörper verwendet: Pab 242, 248 sowie 421, die in unserem Labor als Hybridomüberstände hergestellt und mittels T-Gel Adsorbent nach Herstellerprotokoll aufgereinigt wurden. Nach der Inkubation wurde die Matrix mehrmals mit E1A+ Lysepuffer sowie PBS gewaschen. Anschließend wurden die Antikörper-Protein Komplexe durch kurze Inkubation mit 0,1 M Glycin pH 2.5 oder 2x Lämmli Puffer ohne β-Mercaptoethanol eluiert. Im Falle der Elution mit Glycin wurde das Eluat direkt durch Zugabe von 1 M Tris-HCl pH 9,0 neutralisiert. Ein Aliquot des Eluats wurde nun zur Proteinbestimmung nach Bradford verwendet. Die Proteine des Eluates wurden durch Zugabe von 20% TCA und 20% Isopropanol bei 4°C gefällt und das Präzipitat anschließend zur Salzentfernung zweimal mit Diethylether gewaschen. Danach wurde das Präzipitat in 8 M Harnstoffpuffer aufgenommen und sofort für die Isoelektrische Fokussierung (IEF) benutzt. Durch Verwendung des Harnstoffpuffers liegen die meisten Proteine solubilisiert, reduziert, deaggregiert und denaturiert vor, welches für die 2D-Gelelektrophorese notwendig ist. Methoden 40 3.8 2D-Gelelektrophorese Zunächst wurde etwa 1 mg Präzipitat, welches in 350 µl Harnstoffpuffer resuspendiert wurde, über Nacht mit dem entsprechenden ReadyStripRM IPG Streifen (18 cm, pI 4-7 oder 3-10) bei RT in dem so genannten Reswelling Tray inkubiert, um das Gel des Streifens mit der Probe zu rehydrieren. Danach wurde das Präzipitat in der ersten Dimension durch Isoelektrische Fokussierung an einem Streifen mit immobilisierten pH Gradienten (Ampholyte) gemäß des isoelektrischen Punktes pI aufgetrennt. Proteine wandern bei Anlegen einer Spannung zu dem pH Wert, an dem ihre Nettoladung 0 ist, dem sog. pI Wert. Die IEF startete mit 100 V und steigerte sich bis 8000 V. Eine gute Auftrennung wurde erreicht, wenn die IEF über 100.000 Vh lief. Der Streifen wurde nach erfolgreicher IEF zur Reduktion von Thiolgruppen im Äquilibrierungspuffer, der DTE enthält, 15 min inkubiert. Anschließend wurde der Streifen zur Alkylierung in den Äquilibrierungspuffer mit IAA überführt und ebenfalls 15 min inkubiert. Die SDS PAGE stellt die zweite Dimension der Auftrennung nach Molekulargewicht der Proteine dar. Hierfür wurden 12%ige SDS Polyacrylamidgele im Tris-Glycin Puffer System nach Laemmli verwendet (Laemmli, 1970). Dazu wurde der Streifen mit Agarose Versiegelungslösung auf das Sammelgel aufgebracht. Nach der Elektrophorese wurden die Gele zunächst in Fixierungslösung I inkubiert und dann mit Colloidaler Coomassie Blau Lösung nach dem Protokoll von Neuhoff et al. (Neuhoff et al., 1990) oder mit Silber nach Heukeshoven et al. (Heukeshoven and Dernick, 1985) gefärbt. Alternativ wurden die Gele durch Westernblotting an einer Membran immobilisiert, um einen immunologischen Nachweis durchzuführen. 3.9 MALDI ToF Massenspektrometrie (matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) Die MALDI ToF MS erlaubt die Analyse von intakten Peptiden, Nukleotiden sowie Polymeren bis 500 kDa mit einer Sensitivität im pmol bis fmol Bereich. Ein Massenspektrometer besteht aus einer Ionenquelle, einem Massenanalysator, der die Ionen nach ihrem Masse/Ladungsverhältnis trennt und einem Detektor, der die Ionen detektiert. Abbildung 9 Schematische Darstellung des Ionisationsprinzips bei der MALDI ToF MS. Durch die sanfte Ionisationsmethode wird die Fragmentierung der Peptide stark reduziert. Für die Analyse von Massen >10 kDa wird der lineare Modus verwendet, während Massen <10 kDa im Reflektronmodus analysiert werden. Eine für die Massenspektrometrie geeignete Matrix muss ohne Präzipitation mit dem Analyten kokristallisieren, UV Licht absorbieren und den Protonentransfer ermöglichen. Durch einen UV Laserstrahl wird die UV absorbierende Methoden 41 mit dem Analyten kokristallisierte Matrix unter Hochvakuumbedingungen ionisiert, wobei die absorbierte Energie von der Matrix auf den Analyten transferiert wird, wodurch dieser ionisiert. Durch ein elektrostatisches Feld werden die Ionen nun beschleunigt, bevor sie im feldfreien Massenanalysator gemäß ihrem Masse/Ladungsverhältnis getrennt werden. Für die massenspektrometrische Analyse wurden interessierende Proteinspots aus dem Gel ausgeschnitten und mit Fixierungslösung I entfärbt, gewaschen und vakuumgetrocknet. Die Gelstücke wurden danach in einer 1:10 Trypsin enthaltenden 25 mM Ammoniumhydrogencarbonatlösung resuspendiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Serinprotease Trypsin hydrolysiert Proteine spezifisch am carboxyterminalen Ende von Lysin- und Argininresten. Nach dem Trypsinverdau der Proteine in die spezifischen Peptide, wurden diese durch sukzessive Inkubation mit zweimal Wasser bei 37°C und 20% Acetonitril in Wasser bei RT extrahiert und anschließend Vakuum getrocknet. Zum Entsalzen wurden sog. ZipTip C18 Pipettenspitzen nach Herstellerprotokoll benutzt. Die massenspektrometrische Analyse erfolgte mit dem Kratos PC Axima CFR Gerät, welches mit einem gepulsten Stickstofflaser (337 nm, Pulsweite 4 ns) ausgestattet ist und im Reflektron Modus bei einer Beschleunigungsspannung von 20kV im Hochvakuum operierte. Die extrahierten und entsalzten Peptidproben wurden in einer frisch präparierten Matrixlösung resuspendiert, auf eine Stahlträgerplatte aufgebracht, luftgetrocknet und anschließend im Massenspektrometer gemessen. Zur externen Kalibrierung wurde eine Mischung synthetisierter Peptide mit folgenden Massen verwendet: m/z 717.4, 963.55, 1102.47, 1448.64, 2018.03, 2287.22, 3084.59, 3512.62, 4479.27. Die Spektren wurden mit der Kratos Software (Kompact V2.4.1) aufgenommen und analysiert. Normalerweise wurden 100-500 individuelle Laserschüsse auf eine Probe abgegeben. Mittels MASCOT Software (http://www.matrixscience.com) wurden die experimentell erhaltenen Peptidmassen mit theoretischen verglichen und dem jeweiligen Protein zugeordnet. 3.10 Immunfluoreszenz Die zu untersuchenden MethA Zellen wurden einen Tag vor Durchführung der Immunfluoreszenz auf einem Deckglas ausplattiert. Zuerst wurden diese dreimal 5 min bei RT mit PBS gewaschen und anschließend in einer 4 prozentigen Paraformaldehydlösung für 10 min fixiert. Durch Zugabe von 1% Triton X-100 in PBS wurden die Zellen permeabilisiert, wodurch die zu verwendenden Antikörper Zugang zum Inneren des Zellkerns erhalten. Alternativ wurde die Extraktion durch Inkubation mit CSK I Puffer für 10 min bei 4°C durchgeführt und anschließend zweimal mit CSK IV Puffer gewaschen. Danach wurden die Deckgläser nochmals mit PBS gewaschen, bevor durch Inkubation mit 0,5% BSA in PBS unspezifische Bindungsstellen blockiert wurden. Nun konnte die Inkubation mit dem ersten Antikörper für 1 h erfolgen. Bevor mit dem zweiten Farbstoff gekoppelten Antikörper für eine weitere Stunde inkubiert wurde, wurde erneut mit PBST gewaschen. Nach erneutem Waschen mit PBST wurden die Deckgläser wieder mit 4% PFA fixiert. Die DNA wurde nun, nachdem mit PBS gewaschen wurde, mit DAPI angefärbt und das Deckgläschen anschließend mit Vectashield-Lösung auf einem Objektträger eingebettet. Die Objektträger wurden nach Trocknen des Einbettmediums mit dem Zeiss LSM 510 Konfokalen Fluoreszenzmikroskop, der mit Argon-, Helium- und Neon- Lasern ausgestattet ist, betrachtet. Alternativ wurden die Objektträger in einem Fluoreszenzmikroskop beurteilt. 3.11 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) Die Verwendung der Konfokalen Laser Scanning Mikroskopie bietet den besonderen Vorteil, optische Schnitte mit einem bestimmten Abstand durch ein entsprechendes Präparat zu legen. Dabei ermöglicht eine zur Fokusebene angeordnete Lochblende, dass Licht, welches nicht aus der Brennebene stammt, nicht vom Detektor erfasst wird und somit nicht zum Bild beiträgt. Durch das punkt- bzw. zeilenweise Abtasten der Fokusebene wird so ein hochaufgelöster optischer Schnitt innerhalb der Ebene erzeugt. Die minimale Schnittdicke wird durch ein Zusammenspiel aus der Numerischen Apertur und der verwendeten Wellenlänge bestimmt. Ein Verschieben der Fokusebene ermöglicht das spätere Zusammensetzen der einzelnen Ebenen zu einem dreidimensionalen Abbild der Probe (Z- Methoden 42 Stapel). Dabei wurde der Anfang und das Ende des Stapels vor Beginn des Scannings festgelegt. Mit Hilfe des sogenannten Multitracking, einem Scanverfahren zur Detektion von Mehrfachfluoreszenzen, bei dem die Überlagerung der Emissionen durch ein schnelles Umschalten der Anregung vermieden wird, ist es möglich, aus einem Punkt quasi eine simultane Fluoreszenz zweier Farbstoffe zu ermitteln. Durch eine spätere Überlagerung der Einzelfluoreszenzen lässt sich bei entsprechender Farbdarstellung eine Kolokalisation der Fluoreszenzfarbstoffe oder der mit ihnen markierten Proteine nachweisen. Zur Durchführung der CLSM wurde das LSM 510 META von Zeiss verwendet. Die digitalen Aufnahmen wurden mit Hilfe der LSM-Software, welche das Forschungsmikroskop Axiovert 200M und die Scan-Module steuert, ausgewertet. Um eine optimale Auflösung zu erreichen und Aufnahme unter Anwendung der Methode des Differentiellen Interferenzkontrasts (DIC) zu ermöglichen, wurde das Immersionsöl-Objektiv Plan-Neofluar Ph3 63x NA 1.4 verwendet. Das Mikroskop war mit folgenden Lasern ausgestattet: Ar-Laser (458 nm, 488 nm, 514 nm, 25 mW), HeNe-Laser (543 nm, 1 mW) HeNe-Laser (633 nm, 5 mW). Nach der Aufnahme der Bilder wurden die Rohdaten in die Huygens Essential Software (Version 2.7.2p0, Scientific Volume Imaging B.V., Hilversum, NL; http://www.svi.nl) exportiert, um Dekonvolution unter Anwendung des Maximum Likelihood Estimation (MLE) Algorithmus durchzuführen. Die dekonvolierten Daten wurden dann mit Hilfe des Imaris Software Pakets (Version 4.1.3, Bitplane AG, Switzerland; http://www.bitplane.com) bearbeitet (Tonwertkorrektur inkl. Schwellenwertanpassung und Gammakorrektur) und 3D-rekonstruiert. Die Kolokalisation wurde mit dem Imaris Coloc Modul analysiert, und für die Darstellung als separate Kanäle abgespeichert und in das 3D-Bild integriert. 3.12 Agarosegel-Elektrophorese Das Trennprinzip der Elektrophorese beruht auf unterschiedlicher Wanderungsgeschwindigkeit von DNA unterschiedlicher Ladung und Größe im elektrischen Feld, wobei die DNA diskrete Zonen im Gel ausbildet. Für die Analyse und Präparation von DNAFragmenten wurden 1-2%ige Agarosegele in TAE verwendet. 3.13 Protein-Konzentrationsbestimmung nach Bradford Die Gesamtprotein-Konzentrationsbestimmung wurde in Anlehnung an die Methode von M. M. Bradford (Bradford, 1976) durchgeführt, bei der die Bindung des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue an Proteine in saurer Lösung ausgenutzt wird, welche zu einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nm zu 595 nm führt. Dadurch verändert sich die braunrote Färbung, die Coomassie in saurer Lösung besitzt, in eine blaue Färbung. Die Absorptionsintensität bei 595 nm hängt somit von der Menge an gebundenem Protein ab und kann photometrisch verfolgt werden. 3.14 RNAi Technologie RNA interference (RNAi) oder auch Posttranscriptional Gene Silencing (PTGS) beschreibt einen evolutionär konservierten Mechanismus der posttranskriptionellen Degradation von Transkripten durch dsRNA, die dem Schutz des Organismus vor viraler RNA oder Transposons dient. DsRNA wird durch die RNase III Enzymfamilie (Dicer in Drosophila melanogaster) in 21–23 Nukleotide (nt) lange RNAs mit charakteristischen 2 Thymin 3' Überhängen geschnitten. Die Prozessierung von dsRNA in siRNA (small interfering RNA) ist ein ATP abhängiger Prozess. Aktive siRNAs besitzen eine 5' Phosphat- und eine 3' Hydroxylgruppe (Zamore et al., 2000). Es folgt die Integration der dsRNA in einen ~360 kDa Protein/RNA Komplex namens RNA Induced Silencing Complex (RISC) mit anschließendem ATP abhängigem Entwinden der siRNA durch die Helikaseaktivität. Abschließend leitet die siRNA den RISC zur komplementären mRNA und verursacht deren Degradation, wobei die mRNA in der Mitte der komplementären Region restringiert wird (Hammond et al., 2000). Die siRNAs werden als short hairpin RNAs (shRNAs) konstruiert und in einen Vektor mit Polymerase III Promotor exprimiert, damit die durch Faltung gebildete dsRNA die Restriktion durch Dicer, sowie Inkorporation in den RISC hervorruft. Außerdem dient das auf microRNA Methoden 43 basierende Loop Motiv dazu, dass die dsRNA in das Cytoplasma gelangt und prozessiert wird (Kawasaki and Taira, 2003). Abbildung 10 Vereinfachter schematischer Ablauf der RNA interference. Die dsRNAs mit mehr als 30bp induzieren eine potente antivirale Antwort durch die Aktivierung der IFN und dsRNA activated proteinkinase (PKR). Synthetisch hergestellte 21-23nt RNAs, auch siRNAs genannt, vermitteln als Intermediate des natürlichen Mechanismus die Degradation der komplementären mRNA. Die siRNAs können direkt in die Zellen transfiziert werden oder werden als short hairpin RNAs (shRNAs) konstruiert, damit die nach Expression in einem geeigneten Vektor durch Faltung gebildete dsRNA die Restriktion durch Dicer sowie Inkorporation in den RISC hervorruft. Außerdem dient das auf microRNA basierende Loop Motiv dazu, dass die dsRNA in das Cytoplasma gelangt und prozessiert wird. DsRNA generell wird in den RISC (RNA induced silencing complex) inkorporiert mit anschließendem ATP abhängigem Entwinden der siRNA durch die Helikaseaktivität. Abschließend leitet die siRNA den RISC zur komplementären mRNA und verursacht deren Degradation, wobei die mRNA in der Mitte der komplementären Region restringiert wird. Um das mutp53 Level mittels shRNA Technologie herunterzuregulieren, wurde eine von der shRNA gegen humanes p53 (Nukleotide 867-885) abgewandelte shRNA, welche komplementär zur murinen p53 Sequenz ist, kommerziell von MWG synthetisiert. Zunächst wurden sense und antisense Strang miteinander hybridisiert. Diese wurden daraufhin in den pSUPERIOR.neo-GFP Vektor einkloniert und mittels Amaxa Elektroporation in MethA Zellen transfiziert. Als Kontrolle diente eine sog. scrambled shRNA, bei der die Nukleotide vertauscht werden, so dass sie nicht komplementär zu einem exprimierten Gen sind und daher als Negativkontrolle dienen können. 3.15 Transfektion von MethA Zellen mit Amaxa Zur transienten Transfektion von MethA Zellen mit linearisierter oder zirkulärer DNA, wurden die Zellen zunächst trypsinisiert und in ein 15 ml Gefäß überführt, die Zellzahl mithilfe einer Neubauer-Zählkammer ermittelt und 1x106 Zellen pro Transfektionsansatz 10 min bei 200 g zentrifugiert. Methoden 44 Abbildung 11 Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs. Die 19 nt lange zu murinem p53 komplementäre Sequenz wird in Form einer shRNA in den pSUPERIOR Expressionsvektor kloniert und durch Amaxa Elektroporation in MethA Zellen transfiziert. 12 oder 24 h später werden die GFP exprimierenden Zellen durch FACS angereichert und durch Immunfluoreszenz analysiert. Zusätzlich wird aus diesen Zellen RNA isoliert. Anschließend wurde das Zellpellet in 100 µl nucleofector solution (Amaxa kit V) aufgenommen und mit 2 µg zu transfizierender DNA (pSUPscr/shp53) versetzt, in die vom Hersteller gelieferten Elektroporationsküvetten überführt und sofort im Amaxa Gerät elektroporiert. Hierfür wurde das für MethA Zellen optimierte Programm D30 verwendet. Die Zellen wurden sofort in 500 µl vorgewärmtes DMEM Medium aufgenommen und in eine Schale ausplattiert. Zur Beobachtung der Zellen in der BioStation wurden spezielle Schalen mit beschichtetem Glasboden zum Ausplattieren verwendet. Ein Mediumwechsel kann 5-6 h nach dem Ausplattieren durchgeführt werden. Bei stabiler Transfektion mit linearisierter DNA kann 24 h nach Transfektion mit der Antibiotikaselektion begonnen werden. 3.16 Durchflusszytometrie (FACS Analyse) Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS-Analyse) ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen, und ermöglicht eine schnelle und genaue Multiparameter-Bestimmung und Sortierung vieler einzelner Zellen in Suspension. Dafür werden die Zellen durch hydrodynamische Fokussierung in einem Flüssigkeitsstrom an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge tropfenweise vorbeigeführt. Zu einer der häufigsten Anwendungen auf Einzelzellebene zählt die Detektion von Fluoreszenz-Farbstoffen, die direkt von den Zellen produziert werden, wie z.B. EGFP. Die Zellen werden dazu in einer Kammer (flow chamber) durch eine feine Nadel als Probenstrom (core) in die Mitte eines breiten Mantelstroms (sheat) injiziert. Über eine sich verjüngende Düse (nozzle) verlassen die Zellen die Kammer, fliegen tropfenweise mit hoher Geschwindigkeit (ca. 10 m/s) am Beobachtungs- bzw. Abfragepunkt durch einen Laserstrahl hindurch und landen schließlich in einem Auffangbehälter. Während die Zellen den Abfragepunkt passieren, treten sie in Wechselwirkung mit dem Anregungslicht. Das daraufhin von den Zellen ausstrahlende Streu- und Fluoreszenzlicht wird durch Detektorsysteme erfasst und gibt Aufschluss über die verschiedenen physikalischen und chemischen Eigenschaften der Zellen. Durch voreingestellte Sortierungs-Parameter für einzelne Eigenschaften, z.B. dem Fluoreszenzsignal von EGFP-positiven Zellen, bekommen diese Zellen kurz nach dem Tropfenabriss von den distal seitlich angebrachten Deflektoren einen elektrischen Puls und werden dadurch in ihrer Flugbahn in verschiedene Richtungen abgelenkt (und können somit in verschiedene Auffangbehälter einsortiert werden). Für die Methoden 45 Vorbereitung einer FACS-Analyse bzw. Sortierung wurden die mit pSUP-EGFP transfizierten MethA Zellen 12 bzw. 24 h nach Transfektion in 1xPBS gewaschen, trypsiniert und in 500 – 700 µl 1xPBS/5% FCS suspendiert. Die Suspension wurde in ein 5 ml Reaktionsgefäß gegeben und möglichst schnell der FACS zugeführt. Die durchflusszytometrischen Arbeiten wurden mit einem FACS Aria™ Flow Cytometer der Firma BD Bioscience durchgeführt und dokumentiert. 3.17 Live Cell Imaging Mikroskopie Zur Beobachtung der transfizierten Zellen wurden diese 12 h nach Transfektion in der BioStation IM, einem integrierten Mikroskopsystem für Zell-Kultivierung und -Beobachtung, inkubiert und an mehreren definierten Punkten alle 3 min über 60 h aufgenommen. Zur Auswahl stehen Phasenkontrast sowie Mehrfach-Fluoreszenzaufnahmen mit den Vergrößerungen 20, 40 und 80-fach. 3.18 Viabilitätsmessung Als indirektes Maß für die Proliferation und Viabilität einer Zelle kann deren metabolische Aktivität verwendet werden. Dazu wurden ohne Vektor, mit pSUP Leervektor, pSUPscr oder pSUPshp53 Vektor transfizierte MethA oder 10-1 Zellen in 96 well Schalen in definierter Anzahl (1000, 1500 und 2000 Zellen pro well) ausplattiert und die Viabilität 48 bzw. 72 h nach Transfektion gemessen. Dafür wurde das kolorimetrische Tetrazoliumsalz WST-1 zugegeben, welches durch endogene mitochondriale Dehydrogenasen in ein rotes Formazanprodukt reduziert wird. Die mitochondrialen Dehydrogenasen, die WST-1 reduzieren, gehören vornehmlich dem Komplex I der Atmungskette in den Mitochondrien an und sind ausschließlich in lebenden Zellen aktiv. Die Bildung des Formazans kann in einem Spektrophotometer gemessen und quantifiziert werden. Die Absorption ist proportional zur metabolischen Aktivität der Zellen und somit zum Wachstum und Viabilität der Zellen. Abbildung 12 Spaltung des Tetrazoliumsalzes WST-1 (4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate) in Formazan. EC Electron koppelndes Reagenz; RS mitochondriales succinat-tetrazolium-Reduktase System). Es wurden 15 µl WST-1 Reagenz zu 200 µl Medium pro 96 well zugegeben und die Absorption bei 450 nm und 620 nm als Referenz 0,5 bis 4 h nach Zugabe gemessen. Für die Auswertung wurde eine Inkubationszeit von 1 bzw. 1,5 h verwendet um sicherzustellen, dass die Werte sich im linearen Bereich befinden. Aus 6 Replikaten wurden nach Subtraktion des Medium-Leerwertes (Medium und WST-1 Reagenz) jeweils der Mittelwert und die Standardabweichung bestimmt. Für jeden Versuch wurden außerdem drei unabhängige Messungen durchgeführt. Methoden 46 3.19 Injektion von MethA Zellen in Balb/c Mäuse und Aufarbeitung der Proben 3.19.1 Ascites Zur Produktion von Ascites wurden 106 exponentiell wachsende MethA Zellen in DMEM ohne FCS intraperitoneal in Balb/c Mäuse gespritzt und diese etwa 20 Tage später zur Entnahme der Zellen präpariert. Die Ascitesflüssigkeit wurde zunächst zentrifugiert, und die Erythrozyten durch Zugabe von 8 ml 0.17 M NH4Cl und 2 ml FCS und Inkubation für 6-7 min bei 4°C lysiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und mehrmals mit PBS gewaschen. Ein Teil wurde für die RNA Isolierung mittels Qiagen RNeasy mini kit verwendet. 3.19.2 Solide Tumore Zur Induktion von soliden Tumoren wurden Balb/c Mäuse zunächst eine Woche vor subkutaner Inkjektion von 106 MethA Zellen mit Freund-Adjuvanz gespritzt. Die Mäuse wurden nach 20 bis 30 Tagen zur Präparation der Tumore getötet. Ein Teil der Tumore wurde direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren, während der andere Teil in saurem Formalin fixiert wurde. Zur Isolierung von RNA aus Tumorstücken wurden diese zunächst in 1 ml Trizolreagenz und Lysing Matrix D beads 2-3 mal in einem Schüttler auf Stufe 4 für 15 s homogenisiert und anschließend 10 min bei RT inkubiert. Danach wurden 200 µl Chloroform zugegeben, die Lösung durch Vortexen gemischt, zentrifugiert und die wässrige obere Phase abgenommen und durch Zugabe von Ethanol gefällt. Bevor die RNA mithilfe des RNA Mini Elute Cleanup Kits nach Herstellerprotokoll aufgereinigt wurde, erfolgte eine Inkubation mit DNase I. 3.20 Microarray Analyse Die Microarray Technologie ermöglicht die massenhafte, simultane Durchführung von Hybridisierungsreaktionen an der Oberfläche einer Festphase (array) bei geringem Material-, Platz- und Zeitbedarf (Brown and Botstein, 1999). Sie beruht auf dem Prinzip der Hybridisierung von markierten RNA Molekülen an komplementäre genspezifische Sequenzen, die auf der Oberfläche der Festphase immobilisiert sind. Die globalen Genexpressionsstudien von MethA Zellen wurden unter Verwendung von whole genome mouse Microarrays der Firma Agilent Technologies durchgeführt, die durch Immobilisierung von 60mer Oligonukleotiden mehr als 41.000 Gene und Transkripte repräsentiert. Jeder Array beinhaltet zudem diverse Kontrollproben, z.B. RNAs prokaryotischer/viraler Gene als Hybridisierungskontrollen sowie positive und negative Kontrollen. Für diese Arbeit wurden insgesamt fünf zweifarbige-Microarrays durchgeführt, die in Tabelle 1 schematisch dargestellt sind. Array 1 2 3 4 5 Kontrolle/Cy3 scr 12 h Exp.1 scr 24 h Exp.1 scr 12 h Exp.2 scr 24 h Exp.2 MethA adhärent Test/Cy5 shp53 12 h Exp.1 shp53 24 h Exp.1 shp53 12 h Exp.2 shp53 24 h Exp.2 MethA suspension Tabelle 1 Zusammenfassung der 5 Microarray-Experimente, in der jeweils eine mit Cy3 markierte Kontroll RNA mit der entsprechenden mit Cy5 markierten Test RNA auf einem Microarray hybridisiert wurde. Die ersten vier Experimente wurden aus mit pSUPscr bzw. pSUPshp53 transfizierten und FACS sortierten Zellen an zwei verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion und zwei verschiedenen Tagen erhalten. Experiment 5 diente zum Vergleich von in Suspension und adhärent wachsenden MethA Zellen. Ein typisches Microarray-Experiment umfasst die Herstellung Fluoreszenz-markierter cRNA ausgehend von der Gesamt-RNA über cDNA als Zwischenstufe, die Hybridisierung mit den auf dem Microarray immobilisierten Oligonukleotidproben, das Waschen der Microarrays nach der Hybridisierung sowie die Laser-induzierte Detektion der Hybridisierungssignale. Methoden 47 Abbildung 13 Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs, in dem zunächst RNA aus Zellen, die entweder mit pSUPscr Kontroll- oder pSUPshp53 RNA transfiziert wurden, isoliert wird und durch RT/PCR in cRNA umgeschrieben und gleichzeitig mit den Fluoreszenzfarbstoffen Cy3 oder Cy5 markiert werden. Gleiche Mengen an markierter RNA werden anschließend mit einem kommerziellen Microarray hybridisiert. Zum Schluss wird der Microarray gescannt und die Daten analysiert. Nach Isolierung der Gesamt RNA aus den entsprechenden Zellen wurde zunächst die Konzentration der RNA durch Messung mit dem NanoDrop Spektrophotometer gemessen und die Integrität der RNA am Agilent 2100 Bioanalyzer bestimmt. Dabei erfolgte die Durchführung der Messung mithilfe des RNA 6000 Nano Assay Protokolls unter Verwendung der Komponenten des RNA 6000 Nano LabChip® Kits. Dieses Verfahren beruht auf dem Prinzip der Kapillarelektrophorese und der Detektion des in die RNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffes PicoGreen durch einen Laser. Etwa 200 ng RNA wurden anschließend mithilfe des low RNA Input linear amplification kits in cRNA transkribiert und mithilfe des Cyanine CTP 2-color dye pack kits markiert. So genannte spike-in RNAs dienen als Kontrolle der Hybridisierung. Alle Schritte wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Hybridisierung der RNA mit Whole mouse genome microarrays (44K), sowie das Waschen und Scannen der Microarrays wurde freundlicherweise von Hr. Dr. Andreas Polten der Firma Agilent Technologies, Waldbronn durchgeführt. Nach der Visualisierung des Microarrays durch Scannen werden die Hybridisierungssignale in numerische Daten umgewandelt. Die Qualitätskontrolle, Normalisierung der Daten und Hintergrundfilterung wurde mithilfe der Agilent Feature Extraction Software im default Modus mit einer zusätzlichen Hintergrundfilterung (average of all negative control features) automatisch durchgeführt. Die weitere Auswertung der Daten erfolgte mit Microsoft Excel. Zunächst wurde eine Hintergrundfilterung vorgenommen, wobei alle Gene, deren Signale in beiden Kanälen rot und grün nicht größer als 50 bzw. 100 waren, verworfen wurden. Außerdem wurden alle Daten herausgefiltert, deren Laserintensitäten im roten sowie grünen Kanal nicht über dem Hintergrundsignal lagen. Darüber hinaus wurden alle Gene mit einem p Wert >0,01 (0,05) sowie einer Änderung um <1,5-fach von der Auswertung ausgeschlossen. Duplikate wurden ebenfalls eliminiert. Für den Vergleich zwischen normalen und mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten MethA Zellen wurde außerdem eine Clusteranalyse von Hr. Benjamin Otto von der Arbeitsgruppe Klinische Chemie des UKE, Hamburg durchgeführt. Die sog. Clusteranalyse von Genen/Proben dient der Entdeckung von Gruppen oder Methoden 48 Strukturen in einem Datensatz. In der Clusteranalyse wird nach Gengruppen oder Subgruppen gesucht, die ähnliche Expressionsmuster zeigen (Eisen et al., 1998; Tamayo et al., 1999). Bei diesem Verfahren erfolgt eine Einteilung der Proben nach der Ähnlichkeit ihrer Expression in Gruppen, den so genannten Clustern. Das Ziel ist es, die Proben so zusammenzufassen, dass sie innerhalb einer Gruppe einen minimalen Abstand haben, also möglichst ähnlich sind, und zwischen den Gruppen einen großen Abstand aufweisen und demnach möglichst unähnlich sind (Brazma and Vilo, 2001; Quackenbush, 2001). Die Visualisierung der Microarray Daten wurde in Form von sog. heatmaps vorgenommen, um die hochdimensionalen Daten in zwei Ebenen darzustellen. Zur Validierung der differentiellen Regulation ausgewählter Gene wurde eine quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) mit spezifischen Primern durchgeführt. Dazu wurden 2 µl cDNA, 5 µl 2x Power SYBR® Green PCR Master Mix, 2 µl Wasser und 1 µl Primer mix (je 10 µM) pipettiert und die PCR im Real-Time PCR System 7500 Fast von Applied Biosystems durchgeführt und mit der entsprechenden Software ausgewertet. Ergebnisse 49 4 ERGEBNISSE 4.1 Die murine MethA Tumorzelllinie als Modellsystem für die Funktionsanalyse von mutp53 4.1.1 MethA Zellen in vitro Die für diese Arbeit als Modellsystem verwendeten MethA Fibrosarkomzellen entstanden durch eine einmalige Injektion von Methylcholanthren in Balb/c Mäuse (Old et al., 1962). MethA Zellen sind in der Lage sowohl Substrat-abhängig (adhärent) als auch Substratunabhängig (in Suspension) zu wachsen. Ihr Phänotyp ist durch folgende Merkmale charakterisiert: (i) runde (Abb. 14a) bis spindelförmige (Abbildung 14b) Morphologie der adhärent wachsenden Zellen; (ii) Expression von mutantem p53 Protein (Abbildung 14c), (iii) Expression des Intermediärfilamentproteins Vimentin als Marker mesenchymaler Zellen (Abbildung 14e) und (iv) spontane Fusion zu mehrkernigen Riesenzellen unter hoher Zelldichte (Abbildung 14d,e). In Abbildung 14c ist die Färbung von in MethA Zellen endogen exprimiertem mutantem p53 mit einem polyklonalen p53 Antikörper durch Immunfluoreszenzfärbung zu sehen. Während sich der Grossteil von mutp53 im Zellkern befindet, lokalisiert eine Fraktion von mutp53 zusätzlich im Zytoplasma. Es ist auffällig, dass die Nukleoli groß sind, von denen mutp53 ausgeschlossen ist. Die großen Nukleoli der MethA Zellen lassen auf einen schnellen Umsatz der ribosomalen RNA sowie hohe Proliferation schließen. Die nukleolare Hypertrophie wurde häufig in Tumorzellen beobachtet und kann in Zusammenhang mit dem Verlust der reprimierenden Wirkung von wtp53 auf die Transkription der ribosomalen RNA gebracht werden (White, 2005). a b d c e Abbildung 14 Phänotypische Charakterisierung von MethA Zellen: (a,b) Phasenkontrastaufnahmen von dünn (a) und dicht (b) ausgesäten MethA Zellen; Vergrößerung 60 und 40-fach. (c) Ergebnisse 50 Immunfluoreszenzfärbung von Paraformaldehydfixierten MethA Zellen mit polyklonalem p53spezifischen Antikörper; 60-fache Vergrößerung. (d,e) Immunfluoreszenzfärbung von Paraformaldehydfixierten über längere Zeit konfluent wachsenden MethA Zellen mit polyklonalem Vimentin-spezifischen Antikörper (e) und zugehörige DAPI- Kernfärbung (d); Vergrößerung 40-fach. 4.1.2 MethA Zellen in vivo Injiziert man 106 MethA Zellen subkutan in syngene Balb/c Mäuse, nachdem man sieben Tage zuvor Freund-Adjuvanz injiziert hat, erhält man nach drei bis vier Wochen solide Tumoren. In Abbildung 15 sind repräsentative Beispiele Formalin fixierter und Hämatoxilin und Eosin (H&E) gefärbter Schnitte von zwei soliden MethA Tumoren gezeigt. Die soliden MethA Tumore sind durch eine Stroma-Kapsel von umgebendem Gewebe abgegrenzt. Die Immunfluoreszenzfärbung eines Kryoschnittes des Tumors 7.3 (Abbildung 15c) zeigt eine Färbung von mutantem p53 (rot) in der Mehrheit der Zellen, die mit DAPI gefärbten Kernen (blau) überlappt (violett). Im grünen Kanal ist die Färbung von CD11b, einem Makrophagen spezifischen Integrin (ITGAM) dargestellt. Man erkennt eine Färbung der Zellmembran durch CD11b in Zellen, die negativ für p53 sind und deren Kern durch die DAPI Färbung blau dargestellt ist. MethA Zellen hingegen sind negativ für den Makrophagenmarker CD11b. Die soliden Tumoren enthalten demnach außer MethA Zellen auch Makrophagen, die vermutlich durch Stimulation mit Freund-Adjuvanz zum Tumor rekrutiert wurden und eine essentielle Rolle in der Etablierung des Tumors spielen. Es sind in diesen kleinen (0,5 – 2 cm Durchmesser) soliden Tumoren keine Blutgefäße erkennbar. a b c Abbildung 15 Phänotypische Charakterisierung von MethA Tumoren (a,b) H&E Färbung formalinfixierter Paraffin-eingebetteter Schnitte der soliden MethA Tumoren 12244 und 7.3. (c) Immunfluoreszenzfärbung eines Kryoschnittes des soliden MethA Tumors 7.3. Die mutp53 Färbung ist in rot und die CD11b Färbung in grün dargestellt und die DAPI Färbung ist in blau gezeigt. Der Maßstab entspricht 50 µm. Ergebnisse 51 4.2 Erniedrigung des Expressionsniveaus von MethA mutp53 durch RNA Interferenz Die Methode der RNA Interferenz (RNAi) oder RNA induzierten spezifischen Reduktion der Genexpression lässt sich ausnutzen, um spezifisch die Expression eines Proteins von Interesse herunterzuregulieren und den dadurch entstehenden Effekt auf die Zellen zu beobachten. Dabei wird die Nukleotidsequenz einer shRNA (short hairpin RNA), die perfekt komplementär zur Sequenz des Zielgens ist, in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert und die Synthese dieser shRNA durch den RNA Polymerase III abhängigen H1 Promotor nach Transfektion in einer Zielzelle initiiert (Vektorkarten s. Anhang). Um herauszufinden, welchen Einfluss mutp53 in MethA Zellen auf deren Proliferation hat, wurde die Technik der RNA induzierten spezifischen Reduktion der Genexpression von mutp53 angewendet. Zur Senkung der mutp53 Proteinspiegel in MethA Zellen wurde eine für murines p53 spezifische shRNA Sequenz im Vektor pENTRTM/H1/TO (abgekürzt mit pENTR) kloniert. Diese shRNA Sequenz wurde von der in der Literatur beschriebenen humanen p53 spezifischen shRNA Sequenz (Aminosäuren 867-885) abgeleitet (Brummelkamp, Bernards, and Agami, 2002) (s. 2.7 Oligonukleotide). Als Negativkontrolle diente eine Sequenz, in denen die Nukleotide der shRNA unter Verwendung einer Software (http://bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm) so vertauscht wurden, dass sie nicht komplementär zu einer Gensequenz ist (scr, scrambled). Nach Expression der shRNA in der Zelle, wird diese doppelsträngige RNA von zelleigenen Enzymen prozessiert, so dass letztlich eine 21-23 nt lange, zum Zieltranskript komplementäre Sequenz an die mRNA des Zielgens hybridisiert und zum Abbau des Zieltranskriptes führt. Dies hat je nach Wirkungsgrad der verwendeten shRNA eine deutliche Reduktion der Proteinmenge des Zielgens zur Folge. Die stabile Expressionshemmung von mutp53 in MethA Zellen durch Transkription von shp53 RNA vom Vektor pENTRshp53 mit anschließender Antibiotikaselektion von Klonen war erfolglos. Es konnten zwar Antibiotika-resistente Klone selektioniert werden, diese zeigten allerdings sowohl in der Immunfluoreszenz- als auch in Immunblot-Analysen keine verringerte mutp53 Proteinmenge, obwohl eine Integration der shRNA Expressionskassette in das MethA Genom durch PCR bestätigt werden konnte (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz zu den mit pENTRscr Vektor transfizierten Zellen wiesen die mit pENTRshp53 Vektor transfizierten Zellen ein verringertes Wachstum sowie erhöhte Sensitivität auf, weshalb aus diesen Zellen weniger Klone erhalten wurden als mit pENTRscr transfizierten Zellen. Zusammen mit Literaturdaten, in denen die Behandlung von MethA Zellen mit antisense p53 RNA ein stark reduziertes Wachstum zur Folge hatte (Shohat et al., 1987; Yamauchi, Kobayashi, and Tanaka, 1996), führten diese Ergebnisse zur Annahme, dass mutp53 für die Proliferation von MethA Zellen essentiell ist. Um diese Hypothese genauer zu untersuchen, wurde der Effekt der shRNA Expression in MethA Zellen über transiente Transfektionen analysiert. Der dafür verwendete pSUPERIOR.neo+GFP Expressionsvektor Ergebnisse 52 (abgekürzt mit pSUP) enthält neben der shRNA Expressionskassette mit H1 Promotor außerdem das Gen, das für EGFP (enhanced green fluorescent protein) kodiert. EGFP diente als Markerprotein für eine erfolgreiche Transfektion. Da MethA Zellen schlecht transfizierbar sind (abhängig von der Passagenanzahl sind ca. 10-20% der Zellen positiv für die Expression von EGFP nach Amaxa-Transfektion mit pSUP Vektor), lassen sich durch diese Technik mithilfe des Aria FACS-Gerätes (Fluorescence activated cell sorting) EGFP exprimierende Zellen anreichern. 106 MethA Zellen wurden dazu mit 2 µg pSUPscr oder pSUPshp53 DNA durch Elektroporation gemäß des Amaxa Herstellerprotokolls transfiziert und 12 bzw. 24 h danach mit einem FACS-Gerät auf EGFP Expression sortiert und anschließend auf Deckgläschen ausplattiert. Wiederum 24 h später erfolgte eine Immunfluoreszenzfärbung nach mutp53. Der Ablauf des Experimentes ist in Abbildung 11 im Methodenteil schematisch dargestellt. In den folgenden Abbildungen 16.1 bis 16.4 ist die DAPI Kernfärbung (jeweils Abbildung a), die mutp53 Färbung (jeweils Abbildung b) sowie die EGFP Expression (Abbildungen c) jeweils zweier repräsentativer Präparatsausschnitte gezeigt. Die mit dem Kontrollvektor pSUPscr transfizierten und angereicherten Zellen weisen ein starkes Signal für mutp53 auf (Abb. 16.1 und 16.2), während im Vergleich dazu eine deutliche Reduktion des mutp53 Spiegels in der Mehrzahl der mit pSUPshp53 transfizierten Zellen zu erkennen ist (Abb. 16.3 und 16.4). Da nicht alle mit pSUPshp53 Vektor transfizierten Zellen einen gleichermaßen reduzierten mutp53 Gehalt aufweisen, handelt es sich um eine vergleichsweise heterogene Population, deren mutp53 Expression gemittelt um ca. 50% verringert ist (s. Tabelle 4). Man kann außerdem erkennen, dass die EGFP Expression transfizierter Zellen unterschiedlich ist. Die Immunfluoreszenzbilder zeigen jedoch, dass die ausgewählte shRNA gegen mutp53 spezifisch den mutp53 Proteinspiegel herunterreguliert. Demnach wird die verwendete shRNA in den MethA Zellen exprimiert und prozessiert und kann daher für weitere Experimente verwendet werden. 1 scr 2 scr A DAPI B p53 C EGFP Ergebnisse 53 3 shp53 4 shp53 Abbildung 16.1 bis 4 (a,b,c) Immunfluoreszenzaufnahmen von transfizierten und 24 h später über FACS angereicherten MethA Zellen. In Abbildung 1 und 2 sind die mit dem Kontrollvektor pSUPscr transfizierten Zellen gezeigt, während die in 3 und 4 dargestellten Zellen mit pSUPshp53 transfiziert wurden. In Abbildung a ist jeweils die DAPI Färbung, während in den Abbildungen b und c die mutp53 Färbung bzw. EGFP Expression dargestellt ist. Die Vergrößerung beträgt 40-fach. Die nachfolgenden Abbildungen zeigen ein repräsentatives Beispiel der FACS-Analyse von MethA Zellen 24 h nach Transfektion mit pSUPshRNA Expressionsvektoren. Man kann erkennen, dass sich die EGFP Expressionswerte bei den definierten Gitterrastern zwischen pSUPscr und pSUPshp53 transfizierten Zellen kaum unterscheiden (21,8 und 18,6%), und dass auch die Anzahl toter oder fragmentierter Zellen ungefähr gleich ist (2,5 und 2,3%). Generell war jedoch zu beobachten, dass die EGFP Expressionseffizienz in pSUPshp53 Vektor transfizierten im Vergleich zu pSUPscr transfizierten MethA Zellen leicht niedriger war, und dass trotz exakt gleicher Behandlung auch die Gesamtzellzahl der shp53 transfizierten Zellen geringer war. Diese Befunde lassen darauf schließen, dass durch die Transfektion mit pSUPshp53 vermutlich schon einige EGFP exprimierende Zellen vor der durchflusszytometrischen Analyse abgestorben sind und experimentell nicht erfasst werden konnten. Ergebnisse 54 Population P1 (Blau+grün) P2 (grün) NOT(P2) (blau) violett scr 97,5 % 21,8 % 78,2 % 2,5 % shp53 97,7 % 19,6 % 80,4 % 2,3 % Abbildung 17 Durchflusszytometrische Analyse von MethA Zellen, die mit pSUPscr Kontroll- (oben) oder pSUPshp53 Vektoren (unten) transfiziert wurden und 24 h nach Transfektion auf ihre EGFP Expression untersucht wurden. Es ist repräsentativ das Beispiel für das Experiment 1 zum Zeitpunkt 24 h nach Transfektion gezeigt. Die Bilder a, b und c repräsentieren unterschiedliche Darstellungsweisen. Das verwendete FACS Gerät besitzt eine Sortierungseffizienz von > 95 %. FSCH (forward scatter) entspricht der Größe bzw. dem Volumen der Zellen und SSC-H (sideward scatter) deren Granularität. Die in violett dargestellten Zellen repräsentieren aufgrund ihres Verhältnisses von Größe und Granularität tote oder fragmentierte Zellen. Die Gitterraster wurden anhand von nichttransfizierten MethA Zellen definiert. Die in grün dargestellten Zellen exprimieren EGFP, während die in blau dargestellten Zellen kein EGFP exprimieren. Die EGFP Expression ist als relative Leuchtintensität dargestellt. Man beachte, dass es sich bei allen gezeigten physikalischen Größen um relative Einheiten handelt. In der zugehörigen Tabelle sind die Populationen mit dem jeweiligen prozentualen Anteil angegeben. 4.3 Analyse des Effekts der Reduktion von mutp53 auf das Wachstum von MethA Zellen 4.3.1 Analyse von MethA Zellen nach Expression von dsRNA durch Live Cell Imaging Mikroskopie Aufgrund der Hinweise aus der Literatur sowie der erfolglosen Versuche, MethA Klone mit reduziertem mutp53 Gehalt zu erhalten, sollte die Bedeutung von mutp53 für die Proliferation mit einer weiteren Methode untersucht werden. Dazu wurden 150.000 MethA Zellen transient mit pSUPscr bzw. pSUPshp53 über Elektroporation transfiziert und das Wachstum ohne EGFP-FACS-Sortierung direkt in der BioStation IM der Firma Nikon dokumentiert. Als Kontrollen wurden MethA Zellen ferner ohne Vektor nach AMAXA Protokoll behandelt sowie mit pSUP Leervektor transfiziert, um den Einfluss der Transfektionsmethode bzw. des Vektors oder der EGFP Expression auf das Wachstum zu untersuchen. Die nach AMAXA Protokoll behandelten MethA Zellen verdoppelten ihre Zahl schon 24 h nach Transfektion (Abb. 18). Teilweise gingen aus einer Zelle sogar drei neue Zellen hervor. Im Gegensatz zu den AMAXA behandelten Zellen wurde bei den Zellen, die mit pSUP Leervektor (Abb. 19) transfiziert wurden, ein reduziertes Wachstum und erhöhtes Absterben beobachtet. Ergebnisse 55 Abbildung 18.1 bis 5 Phasenkontrastaufnahmen 8 bis 56 h nach der Transfektion von MethA Zellen ohne Plasmid (Kontrolle). Es sind fünf repräsentative Ausschnitte einer Zellkulturschale ausgewählt und in der BioStation IM aufgenommen. Die Vergrößerung beträgt 40-fach. 1 2 3 Ergebnisse 56 Abbildung 19.1 bis 5 Phasenkontrastaufnahmen 8 bis 56 h nach der Transfektion von MethA Zellen mit pSUP Leervektor. Es sind fünf repräsentative Ausschnitte einer Zellkulturschale ausgewählt und in der BioStation IM aufgenommen. Die Vergrößerung beträgt 40-fach. Die Transfektion von MethA Zellen mit pSUPscr (Abb. 20) oder pSUPshp53 (Abb. 21) führte zu einer weiteren drastischen Reduktion des Wachstums und der Viabilität. Dies lässt darauf schließen, dass dsRNA <30 bp in MethA Zellen einen deutlichen Effekt auf das Zellwachstum sowie das Überleben der Zellen hat. Für die Nutzung der RNAi Technologie wurden die dsRNA so konzipiert, dass sie kleiner als 30 bp sind, um einer für dsRNA >30bp bekannten sequenz-unspezifischen Interferonantwort zu entgehen. In einigen wenigen Publikationen wird berichtet, dass schon die Transfektion von dsRNA kleiner 30 bp eine potente Interferon-ähnliche Reaktion auslöst (Sledz et al., 2003). Der Einfluss von dsRNA <30 bp auf MethA Zellen ist daher überraschend. Der Effekt der Transfektion mit dsRNA im Vektor pSUP auf das Wachstum und die Viabilität von MethA Zellen scheint von mutp53 abhängig zu sein, da durch die Reduktion von mutp53 mittels shp53 Expression dieser Effekt zusätzlich verstärkt wird. Dieses Ergebnis ist ein starkes Indiz für eine essentielle Funktion von mutp53 in MethA Zellen für deren Wachstum in Gegenwart von exogen exprimierter dsRNA. Der größte Teil der mit pSUPshp53 transfizierten Zellen verbleibt in einem Wachstumsarrest und teilt sich nicht weiter oder stirbt Ergebnisse 57 ab. Morphologisch ist zu beobachten, dass die sterbenden Zellen runder und größer werden und schließlich platzen. Diese Anzeichen lassen einen Arrest in der Mitose und einen Tod durch die mitotische Katastrophe (Castedo et al., 2004; Galluzzi et al., 2007), ein Sonderfall der Apoptose, vermuten. Abbildung 20.1 bis 5 Phasenkontrastaufnahmen 8 bis 56 h nach der Transfektion von MethA Zellen mit pSUPscr Kontrolle. Es sind wiederum fünf verschiedene Ausschnitte der Zellkulturschale gezeigt, die in der BioStation IM aufgenommen wurden. Ergebnisse 58 Abbildung 21.1 bis 5 Phasenkontrastaufnahmen 8 bis 56 h nach der Transfektion von MethA Zellen mit pSUPshp53. Es wurden fünf verschiedene Bereiche der Zellkulturschale zur Beobachtung in der BioStation IM ausgewählt. Um das Wachstum quantifizieren zu können, wurde die Zellanzahl in fünf aufgenommenen Ausschnitten einer Zellkulturschale zum Startpunkt 8 h nach Transfektion sowie 56 h nach Transfektion als Endpunkt bestimmt und der Quotient aus Zellanzahl zum Endpunkt und Zellanzahl zum Anfangspunkt gebildet. Aus diesen Zahlen wurde der Mittelwert gebildet und die Standardabweichung berechnet. Startpunkt 8 h Endpunkt 56 h Quotient Kontrolle 38 (0,5) 199 (5,5) 5,24 pSUP 45 (1,2) 65 (4,7) 1,4 pSUPscr 20 (1,7) 38 (1,1) 1,9 pSUPshp53 21 (1,3) 14 (0,8) 0,71 Tabelle 2 Bestimmung des Wachstumquotienten der live cell imaging Mikroskopieaufnahmen. den Startpunkt 8h und 56h nach der Transfektion von MethA Zellen ohne Vektor (Kontrolle), pSUP, pSUPscr oder pSUPshp53 wurde die Summe der Zellen aus den fünf Bereichen Zellkulturschalen ermittelt und der Quotient aus beiden Zeitpunkten bestimmt. Standardabweichung ist in Klammern angegeben. Für mit der Die Ergebnisse 59 Der Wachstumsquotient zeigt, dass MethA Zellen nach Transfektion mit pSUPscr ein im Vergleich zur Kontrolle reduziertes Wachstum aufweisen, im Versuchszeitraum aber immerhin noch ihre Zellzahl fast verdoppeln. Dagegen nimmt nach Transfektion mit pSUPshp53 die MethA Zellzahl ab. Die Standardabweichung ist in Klammern angegeben (Tabelle 2). Zusammenfassend können durch dieses Experiment zwei voneinander abhängige Effekte der exogenen dsRNA deutlich gemacht werden. Zum einen wird durch die pSUP Vektorvermittelte Expression von dsRNA eine starke Reduktion des Wachstums und der Viabilität von MethA Zellen erzeugt und zum anderen wird dieser Effekt durch Reduktion des mutp53 Gehaltes potenziert. Dies weist darauf hin, dass mutp53 dem wachstumshemmenden Effekt von exogen exprimierter dsRNA entgegenwirken kann, da im Vergleich zur Transfektion mit pSUPscr Kontrolle die Reduktion des mutp53 Spiegels ein reduziertes Wachstum und eine reduzierte Viabilität der MethA Zellen zur Folge hat. Die Beobachtungen, die durch die live cell imaging Mikroskopie gemacht wurden, sollen durch eine Viabilitätsmessung weitere unabhängige experimentelle Bestätigung finden und den Effekt quantifizieren. 4.3.2 Validierung und Quantifizierung des durch dsRNA induzierten Wachstumsarrests durch Viabilitätsmessung Der Einfluss der Transfektion von dsRNA auf das Wachstum und die Viabilität der MethA Zellen ist deutlich durch live cell imaging Mikroskopie zu erkennen. Der dsRNA-vermittelte Effekt scheint außerdem abhängig von mutp53 zu sein, da ein reduzierter mutp53 Gehalt die Sterblichkeit erhöht und das Wachstum der MethA Zellen zusätzlich verringert. Dies lässt vermuten, dass mutp53 der Reduktion des Wachstums nach Expression von dsRNA partiell entgegenwirkt. Um diese Effekte mit einer größeren und dadurch repräsentativen Menge an Zellen quantifizieren zu können, wurde die metabolische Aktivität als indirektes Maß für das Wachstum und die Viabilität von transfizierten MethA Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Dazu wurden kolorimetrische Messungen mit dem Substrat WST-1, einem Tetrazoliumsalz, durchgeführt. WST-1 wird durch lebende Zellen aufgenommen und durch mitochondriale Dehydrogenasen zu einem löslichen FormazanFarbstoff reduziert. Die Reduktion von WST-1, die mit der Aktivität der Atmungskette und dadurch mit der Proliferation bzw. Viabilität von transfizierten Zellen korreliert, kann durch Messung in einem Spektralphotometer quantifiziert werden. Es wurden dazu drei voneinander unabhängige Experimente durchgeführt mit je zwei Messungen zu den Zeitpunkten 48 und 72 h nach Transfektion mit pSUP Leervektor, pSUPscr, pSUPshp53, oder Behandlung nach Amaxa-Protokoll. Die Zellen wurden nach der Transfektion nicht über FACS nach EGFP Expression sortiert, da die Beobachtungen durch live cell imaging Mikroskopie ebenfalls ohne Anreicherung transfizierter Zellen gemacht wurden. Es wurden Ergebnisse 60 1000, 1500 und 2000 Zellen pro well in einer 96-well Schale ausplattiert und je 6 Replikate pro Transfektion, Zellzahl und Experiment angefertigt. Als Nullwert der Messung diente Zellkulturmedium ohne Zellen. Aus 6 Replikaten für jede Probe wurde der Mittelwert berechnet und die Standardabweichung ermittelt. Mit dieser Methode konnte der durch live cell imaging Mikroskopie beobachtete Trend bestätigt und quantifiziert werden. Es wird deutlich, dass die Viabilität von MethA Zellen sowohl 48 als auch 72 h nach Transfektion mit pSUP Leervektor, pSUPscr und pSUPshp53 im Vergleich zu Zellen, die ohne Vektor DNA (mock) transfiziert wurden, sukzessive abnimmt. In der Abbildung 22 sind die Ergebnisse der Viabilitätsmessungen repräsentativ 72 h nach Transfektion von MethA Zellen als Mittelwerte der drei unabhängigen Experimente dargestellt. Viabilität MethA 72h nach Transfektion 1.1 1.0 rel. Absorption 0.9 0.8 pSUP scr shp53 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 500 1000 1500 2000 2500 Zellzahl Abbildung 22 Graphische Darstellung der WST-1-basierenden Viabilitätsmessung von MethA Zellen 72 h nach der Transfektion mit pSUP Leervektor (blau), pSUPscr (pink) oder pSUPshp53 (gelb). Es wurden insgesamt drei unabhängige Experimente durchgeführt, aus denen der Mittelwert berechnet wurde. Auf der Ordinate ist die relative Absorption bei 450 nm und auf der Abszisse die Zahl der ausplattierten Zellen dargestellt. Die Standardabweichung ist ebenfalls in den Fehlerbalken angegeben. Die relative Absorption bei 450 nm ist auf der Ordinate und die Zellzahl (1000, 1500 und 2000 Zellen pro well) auf der Abszisse für die mit pSUP Leervektor (pSUP), pSUPscr (scr) oder pSUPshp53 (shp53) transfizierten MethA Zellen dargestellt. Die Messwerte für die mock transfizierten MethA Zellen sind nicht dargestellt, weil diese deutlich höher als die Messwerte für die Vektor-transfizierten Zellen lagen. Um herauszufinden, ob die Viabilität durch die Expression von dsRNA bzw. shp53 RNA abhängig von mutp53 sinkt, wurden die gleichen Messungen für murine 10-1 Zellen, die kein p53 exprimieren, wiederholt. Die Viabilität von 10-1 Zellen, die entweder mit pSUP Leervektor oder pSUPscr bzw. pSUPshp53 Ergebnisse 61 Vektor transfiziert wurden, ist nahezu identisch (Abb. 23). Dieses Ergebnis zeigt, dass die reduzierte Viabilität durch Transfektion mit pSUPscr oder pSUPshp53 wahrscheinlich abhängig von mutp53 ist. Zusätzlich wird deutlich, dass die Transfektion von 10-1 Zellen mit pSUP Leervektor im Gegensatz zu MethA Zellen keinen Einfluss auf deren Viabilität hat. Diese Ergebnisse wurden mit einer weiteren unabhängigen Methode, der Kristallviolettfärbung bestätigt (Daten nicht gezeigt). Viabilität 10-1 72h nach Transfektion 0.9 0.8 rel. Absorption 0.7 0.6 pSUP scr shp53 mock 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Zellzahl Abbildung 23 Graphische Darstellung der WST-1-basierenden Viabilitätsmessung von 10-1 Zellen 72 h nach der Transfektion mit pSUP Leervektor (blau), pSUPscr (pink) oder pSUPshp53 (gelb). Außerdem ist die Viabilität von 10-1 Zellen ohne Vektor (mock) in türkis gezeigt. Es wurde der Mittelwert aus insgesamt drei unabhängigen Experimenten verwendet. Auf der Ordinate ist die relative Absorption bei 450 nm und auf der Abszisse die Zahl der ausplattierten Zellen dargestellt. Die Standardabweichung ist ebenfalls in den Fehlerbalken angegeben. Die bisherigen Versuche zeigen, dass mutp53 in Gegenwart von exogen exprimierter dsRNA einen Einfluss auf das Wachstum sowie die Viabilität von MethA Zellen hat, da die durch Expression von exogener dsRNA verursachte Reduktion des Wachstums und der Viabilität von MethA Zellen durch Reduktion von mutp53 noch verstärkt wird. Dieser Zusammenhang liefert bereits mögliche Hinweise auf eine wichtige Funktion von mutp53 im RNA Metabolismus von MethA Zellen. Um nun die molekularen Mechanismen von mutp53 in MethA Zellen zu untersuchen, die den beobachteten Effekt erklären könnten, wurde ein systemischer Ansatz gewählt. Hierfür wurden Experimente auf Genom-, Transkriptom- und Proteinebene durchgeführt, um durch die Analyse der Interaktionen und Interaktionspartnern die physiologische Funktion von mutp53 in MethA Zellen zu entschlüsseln. Dies soll die Interpretation des Beitrags von mutp53 auf das Wachstum von MethA Zellen ermöglichen und damit Rückschlüsse auf den Einfluss von mutp53 zur Tumorgenese zulassen. Ergebnisse 62 4.4 Analyse der Funktion von mutp53 auf der Ebene des Genoms 4.4.1 Expressionsprofiluntersuchung durch die Microarray Technologie Um Hinweise über den molekularen Mechanismus des mutp53 abhängigen Wachstumsarrests nach Transfektion von dsRNA Expressionsvektoren in MethA Zellen auf der Ebene der Genexpression zu erhalten, wurde die Microarray Technologie verwendet. Dazu wurden zunächst die Genexpressionsprofile von pSUPscr und pSUPshp53 transfizierten MethA Zellen verglichen (s. 4.4.1.1). Danach erfolgte ein Vergleich der Expressionsprofile von untransfizierten MethA Zellen mit dem von dsRNA Expressionsvektoren transfizierten Zellen (s. 4.4.1.2). Die Genexpressionsprofile sollen Aufschluss auf den Einfluss des reduzierten mutp53 Spiegels bzw. der dsRNA im Allgemeinen auf die Genexpression in MethA Zellen geben. 4.4.1.1 Vergleich der Expressionsprofile zwischen pSUPscr und pSUPshp53 transfizierten MethA Zellen Zum Vergleich der Expressionsprofile zwischen pSUPscr und pSUPshp53 transfizierten MethA Zellen wurde die Gesamt-RNA aus mit pSUPscr bzw. pSUPshp53 transfizierten und mittels FACS-Analyse nach EGFP Expression angereicherten MethA Zellen isoliert und in einer Reversen Transkription und danach folgenden linearen T7-RNA Polymerasevermittelten Amplifikation in eine Cy3 bzw. Cy5-markierte cRNA umgeschrieben. Die fluoreszierenden cRNA Proben wurden auf einem Gesamtmausgenom-Microarray mit 44.000 Druckpunkten der Firma Agilent Technologies hybridisiert (s. Abbildung 13). Es wurden insgesamt vier Microarray-Experimente mit zwei biologischen Replikaten (Experiment 1 und 2) zu jeweils zwei verschiedenen Zeitpunkten (12 und 24 h nach Transfektion) für diesen Vergleich durchgeführt. Zunächst erfolgt eine Qualitätskontrolle und Normalisierung der Daten wie im Methodenteil beschrieben. Danach wurden die vier Experimente zunächst getrennt mit den beschriebenen Filterkriterien (Hintergrundsubtraktion der relativen Expressionswerte von 50; alle Werte mit einem p-Wert >0,01 wurden herausgefiltert) ausgewertet und anschließend die überlappenden Gene zwischen den Experimenten bestimmt. Wie erwartet, ist (mut)p53 in der Liste der differentiell regulierten Gene mit einer etwa 2-fachen Reduktion nach knockdown von mutp53 durch die Transfektion mit pSUPshp53 zu finden. Dies impliziert, dass eine hinsichtlich des mutp53 Spiegels heterogene Zellpopulation vorliegt (s. Abb. 16). Daher wurde für die Auswertung der Expressionsdaten ein weniger stringenter Grenzwert von einer 1,5-fachen Änderung gewählt. Die Heterogenität der FACS angereicherten Zellen spiegelt sich ebenfalls in der vergleichsweise geringen Überlappung von Genen der vier Experimente wider. Wichtig zu erwähnen ist außerdem, dass die MethA Zellen für das Experiment 1 zwei Tage zuvor frisch aufgetaut wurden, während die Zellen vom Experiment 2 neun Tage zuvor aufgetaut wurden. Ergebnisse 63 Dies hat möglicherweise einen Einfluss auf das Expressionsprofil der Zellen. In der nachfolgenden Tabelle 3 ist die Anzahl der differentiell regulierten Gene der vier Experimente und der überlappenden Gene verschiedener Experimente dargestellt nach Verwendung der Filterungskriterien. FACS Proben P<0,01; 1,5 fache Änderung; BG50 Differentiell regulierte Gene hochreguliert herrunterreguliert scr-shp53-12h-Experiment 1 673 342 (50,8%) 331 (49,2%) scr-shp53-24h-Experiment 1 209 123 (58,8%) 86 (41,2%) scr-shp53-12h-Experiment 2 132 95 (72%) 37 (28%) scr-shp53-24h- Experiment 2 439 206 (46,9%) 233 (63,1%) Überlappung 12h- Exp. 1 und 2 24 15 (62,5%) 9 (37,5%) Überlappung 24h-Exp. 1 und 2 59 38 (64,4%) 21 (35,6%) Überlappung 12h+24h-Exp. 1 31 18 (56,2%) 14 (43,8%) Überlappung 12h+24h- Exp. 2 30 16 (51,6%) 15 (48,4%) Überlappung alle Proben 8 6 (75%) 2 (25%) Tabelle 3 Auswertung der zweifarbigen Microarray Experimente für FACS angereicherte Zellen. Bei Anwendung der Filterungskriterien 1,5-fache Expressionsänderung, p <0,01 und Hintergrundsubtraktion von 50 (BG 50) erhält man zwischen 130 und 670 differentiell regulierte Gene. Bestimmt man überlappende differentiell regulierte Gene zwischen den Experimenten, verringert sich die Anzahl differentiell regulierter Gene deutlich. Der prozentuale Anteil hochregulierter Gene beträgt 50 -70%. 4.4.1.1.1 Differentiell regulierte Gene in allen vier Microarray Experimenten In allen vier Experimenten führte die Erniedrigung des mutp53 Spiegels zur einer verringerten Expression der Gene für die Chemokine Ccl4 und Cxcl10 sowie Galnt7 (UDP-Nacetyl-alpha-D-galaktosamine: polypeptide N-acetylgalaktosaminyltransferase 7). Ergebnisse 64 Gen Genbeschreibung Exp.1 12h Exp.1 24h Exp.2 12h Exp.2 24h Mittelwert Ccl4 chemokine (C-C motif) ligand 4 -1,53 -1,62 -1,51 -1,57 -1,56 Cxcl10 chemokine (C-X-C motif) ligand 10 -1,60 -1,69 -2,00 -1,61 -1,72 Dync1h 1 dynein cytoplasmic 1 heavy chain 1 1,69 -1,57 -1,54 -2,15 -1,33 Galnt7 UDP-N-acetyl-alpha-Dgalactosamine: polypeptide Nacetylgalactos-aminyltransferase 7 -1,63 -1,66 -1,63 -1,75 -1,67 Trp53 transformation related protein 53 -2,56 -2,36 -1,97 -1,97 -2,2 U59758 p53-variant -2,03 -2,51 -1,71 -1,88 -2,01 Ctnnb1 catenin beta 2,54 1,58 1,56 1,75 1,82 Myo1e myosin IE 1,51 1,70 2,00 1,74 1,73 Tabelle 4 Liste der in allen vier Micrarray-Experimenten überlappenden differentiell regulierten Gene bei Filterungskriterien von p< 0,01; 1,5-fachen Änderung der Expression sowie Hintergrundsubtraktion von 50. Die angegebenen Werte stellen die Änderung des Verhältnisses zwischen scr Kontrolle und shp53 dar. Dagegen wurden die Gene Ctnnb1 (Catenin beta) und Myo1e (Myosin 1E) hochreguliert (Tabelle 4). Es konnte keine differentielle Regulation klassischer Zellzyklusarrest-, Differenzierungs- oder Apoptose-induzierender Gene nach Reduktion von mutp53 durch die Expressionsanalyse festgestellt werden, die den beobachteten phänotypischen Effekt direkt erklären würden. Mutp53 ist in Experiment 1 stärker herunterreguliert als in Experiment 2. Dies ist vermutlich auf die höhere Transfektionseffizienz von frisch aufgetauten MethA Zellen verglichen mit Zellen, die länger kultiviert wurden, zurückzuführen. Man kann außerdem feststellen, dass zytoplasmatisches Dynein (Dync1h1) im Experiment 1-12h nach Verringern des mutp53 Spiegels hochreguliert, während es in den anderen drei Experimenten herunterreguliert ist. In der Tumorgenese spielen Chemokine (chemotaktische Cytokine) eine wichtige Rolle bei der Migration und Aktivierung von Leukozyten in Tumorerkrankungen, die durch eine entzündliche Umgebung charakterisiert sind. Viele Malignome produzieren Cytokine, die als Mediatoren der Infiltration von Makrophagen und Leukozyten in diesen Tumoren wirken. Beispielsweise benötigen MethA Zellen eine entzündliche Umgebung zur Bildung eines Tumors in syngenen Mäusen, weshalb eine vorherige Behandlung mit FreundAdjuvanz essentiell ist. Des Weiteren wurde festgestellt, dass die MethA-Tumore mit Makrophagen und Leukozyten assoziiert sind (siehe 4.1.2). Eine Erklärung des Einflusses von mutp53 auf die Proliferation und das Überleben von MethA Zellen ergibt sich aus diesem Vergleich allerdings nicht direkt. Daher wurden zusätzlich die Gene untersucht, die in zwei Ergebnisse 65 Experimenten 24 h nach Transfektion mit pSUPscr oder pSUPshp53 differentiell reguliert sind, und für die eine stärkere Expressionsänderung erwartet wurde. 4.4.1.1.2 Differentiell regulierte Gene in Microarray Experimenten 24 h nach der Transfektion Da für den Zeitpunkt 24 h nach Transfektion eine stärkere Änderung der Genexpression erwartet wurde, fokussierten wir uns auf Gene, die 24 h nach Transfektion differentiell reguliert waren (siehe Tabelle 10 im Anhang 7.2). Auffällig waren Gene, die funktionell dem APC Komplex (Anaphase promoting complex), der den Fortschritt von der Metaphase zur Anaphase in der Mitose einleitet, zugeordnet werden konnten, darunter: Cdc23, Dync1h1, Rap1gap, Csnk1δ und Ajuba. Eine andere Gruppe differentiell regulierter Gene kann dem Zellwachstum und der Migration zugeordnet werden, z.B. Akt, Fhl1, Prodocan, Fut8, Rpl41 und Rpl5. Die könnte darauf zurückgeführt werden, dass die Reduktion von mutp53 durch shRNA gemittelt lediglich 50% beträgt und diese Reduktion von mutp53 auf die Transkriptmenge in MethA Zellen offensichtlich nur einen geringen Einfluss hat. 4.4.1.1.3 Validierung der differentiell regulierten Gene mittels qRT-PCR Für die sechs Gene neben mutp53, die in allen vier FACS-Microarrays als differentiell reguliert gefunden wurden, wurden Primer zur Überprüfung der Regulation durch quantitative real-time PCR aus PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu//primerbank) verwendet. Zur Normalisierung der Daten wurde das Gapdh Gen ausgewählt. Der Expressionswert der Kontrolle scr (rot) wurde gleich 1 gesetzt und die Expression der Gene in Zellen, die mit pSUPshp53 transfiziert wurden (blau) ist relativ zur Kontrolle angegeben (Abb. 24-27). In dem Experiment 1-12h kann eine differentielle Regulation von allen Genen mit Ausnahme von Ccl4 und Cateninb bestätigt werden (Abb. 24). Zytoplasmatisches Dynein war für dieses Experiment im Microarray hochreguliert nach knockdown von MethAp53, ist in der qRT-PCR jedoch eindeutig herunterreguliert. Im Experiment 1-24h kann eine differentielle Regulation für alle Gene mit Ausnahme von Cateninb zwischen pSUPscr und pSUPshp53 transfizierten MethA Zellen beobachtet werden (Abb. 25). Auch die Änderung der Expression stimmt bis auf Cateninb zwischen Expressionsdaten und qRT-PCR überein. Ergebnisse 66 8 7 6.321 6 5 4 3 2 1 0.96 0.667 0.862 0.397 0.341 0.321 0 Ccl4 Cxcl10 Dync1h1 Galnt7 p53 myo1e Cateninb Abbildung 24 Relative Quantifizierung mittels qRT-PCR von RNA aus Zellen, die mit pSUPscr (rot) oder pSUPshp53 (blau) transfiziert wurden und 12 h (Exp. 1) danach angereichert wurden. 2.5 1.947 2 1.5 1.088 1 0.688 0.65 0.506 0.456 0.5 0.379 0 Ccl4 Cxcl10 Dync1h1 Galnt7 p53 myo1e Cateninb Abbildung 25 Relative Quantifizierung mittels qRT-PCR von RNA aus Zellen, die mit pSUPscr (rot) oder pSUPshp53 (blau) transfiziert wurden und 24 h (Exp. 1) danach angereichert wurden. Im Vergleich der Expression zwischen Kontrolle und mit shRNA herunterreguliertem mutp53 in MethA Zellen 12 h nach Transfektion des Experimentes 2 kann eine differentielle Expression für alle Gene beobachtet werden mit Ausnahme von Myo1E (Abb. 26). Die Änderungen für Ccl4 und Cateninb sind ebenfalls gering. Ergebnisse 67 3 2.5 2 1.5 1.071 1 0.855 0.842 0.48 0.5 1.16 0.455 0.522 0 Ccl4 Cxcl10 Dync1h1 Galnt7 p53 myo1e Cateninb Abbildung 26 Relative Quantifizierung mittels qRT-PCR von RNA aus Zellen, die mit pSUPscr (rot) oder pSUPshp53 (blau) transfiziert wurden und 12 h (Exp. 2) danach angereichert wurden. 1.6 1.4 1.153 1.2 1.1 1 0.816 0.8 0.72 0.6 0.457 0.465 0.399 0.4 0.2 0 Ccl4 Cxcl10 Dync1h1 Galnt7 p53 myo1e Cateninb Abbildung 27 Relative Quantifizierung mittels qRT-PCR von RNA aus Zellen, die mit scr (rot) oder shp53 RNA (blau) transfiziert wurden und 24 h (Exp. 2) danach angereichert wurden. Für das Experiment 2-24h (Abb. 27) ist für alle ausgewählten Gene eine differentielle Regulation in der qRT-PCR zu beobachten. Allerdings findet man für zytoplasmatisches Dynein im Vergleich zur Expressionsanalyse mittels Microarray in der qRT-PCR im Gegensatz zu allen anderen Zeitpunkten eine leichte Hochregulation nach knockdown von mutp53 (vgl. 4.4.1.1.1 Tabelle 4). Insgesamt kann man eine Korrelation der Expressionsdaten mit den zwei Methoden Microarray und qRT-PCR feststellen mit Ausnahme von Cateninb, für das in der qRT-PCR keine signifikante differentielle Regulation durch mutp53 sichtbar ist. Generell ist festzustellen, dass aufgrund der nur 50%igen Ergebnisse 68 Reduktion von mutp53 in den mit pSUPshp53 transfizierten MethA Zellen relativ geringe Expressionsänderungen der Gene auftraten. Dies kann zum einen daran liegen, dass mutp53 keinen großen Einfluss auf die Transkription von Genen hat oder dass die Expression von exogener dsRNA sich so gravierend auf die Genexpression von MethA Zellen auswirkt, dass die Effekte der 50%igen Reduktion von mutp53 in den Hintergrund treten. Diese Überlegungen machten einen Vergleich zwischen untransfizierten und mit dsRNA transfizierten Zellen im Bezug auf deren Expressionsprofile interessant, welcher im nächsten Kapitel beschrieben ist. 4.4.1.2 Vergleich der Expressionsprofile zwischen untransfizierten und mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten MethA Zellen Durch die live cell imaging Mikroskopie konnte ein überraschend starker mutp53 abhängiger Effekt der dsRNA auf das Wachstum und die Viabilität von MethA Zellen beobachtet werden. Dieser Effekt impliziert einen starken Einfluss auf die Genexpression von MethA Zellen durch die Expression von dsRNA. Die Beobachtung der Reduktion des Wachstums von MethA Zellen durch dsRNA macht einen Vergleich der Expressionsprofile von untransfizierten und mit dsRNA Expressionsvektoren (pSUPscr oder pSUPshp53) transfizierten MethA Zellen interessant. Dazu wurde RNA aus untransfizierten MethA Zellen in Cy5-markierte cRNA konvertiert und auf einem Gesamtmausgenomarray wie unter 4.4.1.1 beschrieben hybridisiert. Danach wurden die Expressionsprofile der Kontroll-Zellen mit transfizierten Zellen verglichen. Zum Vergleich zwischen Expressionsprofilen einzelner Proben wurden die Microarray-Messwerte mit Hilfe des Limma-package (version 2.10.0) im R-Programm mittels Quantile-Methode normalisiert. Diese Normalisierung ist innerhalb eines zweifarbigen Microarray Experimentes nicht notwendig, da die zwei Kanäle eines Microarrays, die normalerweise miteinander verglichen werden, bereits normiert sind. Anschließend wurden die Daten gefiltert. Dafür wurden alle Gene, deren Messwerte einen Wert von <100 hatten, als unspezifischer Hintergrund herausgefiltert sowie alle Gene, die einen Expressionsunterschied von weniger als 2-fach oder einen p-Wert <0,05 zwischen den zu vergleichenden Kanälen aufwiesen. So können die zwischen untransfizierten und mit dsRNA transfizierten MethA Zellen differentiell regulierten Gene für die zu vergleichenden Hybridisierungen identifiziert werden. Zur Visualisierung der Daten erfolgte, ausgehend von den differentiell exprimierten Genen, eine hierarchische Clusteranalyse, die Gene aufgrund von ähnlichen Transkriptionsprofilen in Gruppen einteilt. Diese Analyse wurde freundlicherweise von Hr. Benjamin Otto von der Arbeitsgruppe Klinische Chemie des UKE, Hamburg angefertigt. Die Visualisierung der Microarray Daten wurde in Form von sog. Heat Maps und Dendrogrammen in den Abbildungen 28 und 29 vorgenommen, um die hochdimensionalen Daten in zwei Ebenen darzustellen. Die Expressionsänderung ist farblich dargestellt. Auf der Ergebnisse 69 Ordinate sind die differentiell regulierten Gene dargestellt, während auf der Abszisse die Proben/Hybridisierungen aufgelistet werden. In Abb. 28 sind die in den mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten Zellen im Vergleich zu untransfizierten MethA Zellen scr-12-2 shp53-12-2 scr-24-1 shp53-24-1 shp53-12-1 scr-12-1 scr-24-2 shp53-24-2 adhärent hochregulierten, während in Abb. 29 die herunterregulierten Gene dargestellt sind. Abbildung 28 Hierarchisches Clustering (complete linkage- und euklidische-Distanz) der Genexpressionsprofile der mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten Zellen im Vergleich zu untransfizierten MethA Zellen und Darstellung als Heat Map. Die Heat Map gibt das Expressionsverhältnis der Gene nach Expression von dsRNA im Vergleich zu normalen Zellen farblich wieder. Es sind die im Vergleich zu normalen Zellen hochregulierten Gene gezeigt. Die Farbkodierung ist oberhalb der Heat Map dargestellt. Dabei nimmt die Expressionsstärke von gelb über grün bis blau zu. Jede Reihe der Heat Map repräsentiert ein Gen und jede Spalte eine einzelne Hybridisierung. Die Gennamen sind aufgrund der Vielzahl in dieser Darstellung nicht erkennbar (Liste unter 7.4). Ergebnisse adhärent shp53-24-2 scr-24-2 scr-12-1 shp53-12-1 shp53-24-1 scr-24-1 shp53-12-2 scr-12-2 70 Abbildung 29 Hierarchisches Clustering der Genexpressionsprofile der mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten MethA Zellen im Vergleich zu untransfizierten Zellen und Darstellung als Heat Map. Es sind die im Vergleich zu normalen Zellen herunterregulierten Gene in Form einer Heat Map gezeigt. Die Farbkodierung ist oberhalb der Heat Map dargestellt. Jede Reihe der Heat Map repräsentiert ein Gen und jede Spalte eine einzelne Hybridisierung. Die Liste der Gene ist in 7.5 im Anhang zusammengestellt. In den Heat Maps ist deutlich zu erkennen, dass die jeweiligen Experimente beispielsweise scr-12.1 und shp53-12.1 zusammen clustern und daher ähnlicher sind, als dieselbe Transfektion eines anderen Experimentes wie zum Beispiel scr-12.1 und scr-12.2. Zwischen scr und shp53 RNA exprimierenden Zellen sind ebenfalls leichte Unterschiede in der Expression bestimmter Gene zu sehen. Allerdings sind diese Unterschiede nicht groß genug, Ergebnisse 71 um eigene scr oder shp53 Cluster zu bedingen. Ein sehr wichtiges Ergebnis dieses Vergleichs der Genexpression zwischen untransfizierten und mit dsRNA transfizierten MethA Zellen ist die Tatsache, dass die Expression von dsRNA verglichen mit unbehandelten MethA Zellen zu einer massiven Hochregulation von Genen führt, die funktionell dem Interferonsignalweg (wie dsRNA abhängige PKR (Genname: Prkr oder Eif2ak2), Oas2, Tlr3 etc.) zugeordnet werden können und die die phänotypischen Veränderungen von MethA Zellen nach Expression von dsRNA erklären könnten (s. Listen 7.4 und 7.5 im Anhang). Mit dem GATHER web Programm (Gene Annotation Tool to Help Explain Relationships; http://gather.genome.duke.edu/ unter Verwendung der Annotation: Gene Ontology) findet man die Immunantwort als einer der überrepräsentierten Signalwege, aus dem die größte einem Signalweg zuzuordnende Zahl an Genen (35) mit dem höchsten Bayes Faktor der 376 hochregulierten Gene identifiziert wurden (9830147J24Rik, Ccl2, Ccl5, Ccl7, Cxcl1, Cxcl5, Elf1, Fyb, G1p2, Gadd45g, Gbp1, Gbp2, Gb p4, Ifi202b, Ifi203, Ifi204, Ifi35, Ifit1, Ifit2, Ifit3, Ifitm3, Irf1, Isgf3gm, Ly96, Nfkbiz, Oas1a, Oas 3, Oasl2, Prkr, Samhd1, Stat3, Tap1, Tapbp, Tlr2, Tlr3). Auch die mutp53 Expression ist in mit pSUPscr transfizierten Zellen im Vergleich zu unbehandelten MethA Zellen in dieser Analyse etwa 2-fach erhöht, während die p53 Expression in mit pSUPshp53 transfizierten Zellen verglichen mit unbehandelten Zellen fast gleich ist. OAS2 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 adh scr-12.1 scr-24.1 sh-12.1 sh-24.1 scr-12.2 scr-24.2 sh-12.2 sh-24.2 -0.5 Abbildung 30 Validierung der differentiellen Regulation von Oas2 zwischen untransfizierten und mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten MethA Zellen durch qRT-PCR mit Oas2 spezifischen Primern. Zur Bestätigung der Microarray Ergebnisse wurde eine qRT-PCR durchgeführt. Die Expression von mutp53, Prkr und Oas2 wurde zwischen untransfizierten MethA Zellen und mit dsRNA Expressionsvektoren (pSUPscr oder pSUPshp53) transfizierten Zellen verglichen. Die qRT-PCR mit p53 spezifischen Primern zeigte keine eindeutige differentielle Ergebnisse 72 Regulation von mutp53 im Vergleich zwischen normalen adhärenten MethA Zellen und dsRNA exprimierenden Zellen (Daten nicht gezeigt). Die Transkription des Oas2 Gens hingegen war in allen mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten MethA Zellen im Vergleich zu untransfizierten Zellen deutlich erhöht, und dies korreliert mit den Microarray Ergebnissen (Abb. 30). Auch die Transkription des Eif2ak2 Genes ist gemessen in der qRTPCR in pSUPscr transfizierten MethA Zellen höher als in untransfizierten Zellen. Durch knockdown von mutp53 mittels pSUPshp53 wird die Expression von PKR nochmals erhöht (Abbildung 31). PKR 35 30 25 20 15 10 5 0 adh scr shp53 Abbildung 31 Validierung der differentiellen Regulation von Eif2ak2 (PKR) zwischen untransfizierten und mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten MethA Zellen durch qRT-PCR mit PKR spezifischen Primern. Generell war zu beobachten, dass die Änderungen der Transkriptmenge durch Microarray und qRT-PCR in der Richtung, jedoch nicht in der Quantität übereinstimmen. Beispielsweise waren die Oas2 Transkriptmengen in mit dsRNA exprimierenden Zellen im Microarray Experiment 10-fach höher als in Kontrollzellen, jedoch war durch qRT-PCR lediglich eine 3fache Zunahme der Oas2 Transkription zu beobachten. mock scr shp53 Abbildung 32 Immunfluoreszenzfärbung von mutp53 (rot) und PKR (grün) von Kontrollzellen und mit pSUPscr oder pSUPshp53 transfizierten MethA Zellen nach Fixierung mit Paraformaldehyd. Ergebnisse 73 Die Immunfluoreszenzfärbung von MethA Zellen zeigt die nukleäre Lokalisation von mutp53 in rot und die überwiegend zytoplasmatische und nukleoläre Färbung von PKR. Es ist zudem eine geringe Kolokalisation beider Proteine im Nukleus erkennbar (Abb. 32). Durch Immunblotting kann eine höhere Menge an PKR Protein in mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten MethA Zellen im Vergleich zu untransfizierten oder mit pSUP Leervektor transfizierten MethA Zellen detektiert werden. Diese Beobachtung bestätigt, dass die PKR Menge durch Expression von dsRNA erhöht wird. ~65kDa αPKR ~53kDa αp53 ~50kDa αTubulin shp53 scr Leervektor pSUPshp53 pSUPscr pSUP MethA 12h 24h Abbildung 33 Immunblot von untransfizierten und mit pSUP Leervektor, pSUPscr oder pSUPshp53 transfizierten MethA Zellen. Die Zellen wurden 12h nach der Transfektion in Laemmli SDS Puffer aufgenommen und in einem 10%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Proteinnachweise erfolgten mit Tubulin-, p53- und PKR-spezifischen Antikörpern. Zusammenfassend führt dieses Ergebnis zur Hypothese, dass die Expression von dsRNA vermutlich die Aktivierung von Interferon stimulierten Genen durch die PKR zur Folge hat, die u.a. einen Translationsstop hervorruft und den beobachteten Wachstumsarrest erklären könnte. Die könnte auch erklären, warum in pSUPscr und pSUPshp53 transfizierten MethA Zellen zwar eine höhere mutp53 mRNA Konzentration gefunden wird, im Immunblot aber weniger mutp53 als in pSUP transfizierten Zellen. 4.4.2 ChIP-Seq zur Analyse von in vivo DNA Bindungsstellen von MethA mutp53 Die Bindung von mutp53 an genomische DNA soll Aufschluss über den Einfluss von MethA mutp53 auf die Regulation der Genexpression und dadurch wiederum eine mögliche Erklärung für den beobachteten Effekt von mutp53 auf die Proliferation und die Viabilität von MethA Zellen geben. Kombiniert mit den Expressionsdaten könnte die Bindungsstellenanalyse auf die von mutp53 regulierten Gene hinweisen. Dadurch könnte mit höherer Sicherheit eine Regulation von Genen durch mutp53 bestätigt werden. Um genomische DNA Bindungssequenzen von mutp53 in adhärent wachsenden MethA Zellen zu charakterisieren, wurde die ChIP-Seq Technologie eingesetzt. Diese Methode basiert auf Ergebnisse 74 der Eigenschaft von membranpermeablem Formaldehyd Reagenz, welches die direkten Protein-DNA-Kontakte durch Ausbildung von Methylenbrücken zwischen Aminogruppen der Proteine und heterozyklischen Stickstoffatomen der Nukleotid-Basen vernetzt. Die Verwendung von Formaldehyd hat den Vorteil, dass die Vernetzung vollständig reversibel ist. Die vernetzten Protein-DNA Komplexe wurden aufgereinigt, wie im Kapitel Methoden beschrieben, und anschließend wurde eine Immunpräzipitation mit polyklonalem anti-p53 Antikörper durchgeführt. Die angereicherten DNA Fragmente wurden über LM-PCR amplifiziert, kloniert und sequenziert. Das Prinzip der ChIP-Seq ist vereinfacht in Abbildung 6 im Kapitel Methoden dargestellt. Als Negativkontrollen wurden Proben ohne Antikörper inkubiert, um unspezifische Bindung von DNA Fragmenten an die Matrix verfolgen zu können. In Abbildung 34 sind die Ergebnisse dreier Immunpräzipitations-Versuche gezeigt. Das Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegel zeigt eine Auftrennung der immunpräzipitierten und amplifizierten DNA Fragmente, die sich aufgrund der Ultraschallbehandlung der Proben im Bereich zwischen 200 und 1000 bp konzentrieren. Abbildung 34 Elektrophoretische Auftrennung der immunpräzipitierten und amplifizierten DNA Fragmente im Agarosegel. Dazu wurden Formaldehyd-vernetzte Protein-DNA Komplexe mit einem polyklonalen p53 spezifischen Antikörper und PGS präzipitiert oder als Kontrolle ohne Antikörper inkubiert. Die DNA wurde anschließend aufgereinigt, mit doppelsträngigen Adaptermolekülen ligiert und durch LM-PCR amplifiziert. Die Größe der DNA Markerbanden ist angegeben. In den Versuchen 2 und 3, die mit polyklonalem anti-p53 Antikörper inkubiert wurden, ist im Vergleich zu den ohne Antikörper inkubierten Proben eine deutlich stärkere Amplifikation der DNA Fragmente zu sehen, was auf die Spezifität der Antikörper und Vernetzung von mutp53 an genomische DNA in MethA Zellen schließen lässt. Die DNA Fragmente der Ansätze 2 und 3 wurden daraufhin in einen Klonierungsvektor eingebaut, und insgesamt 164 Inserts Ergebnisse 75 sequenziert. Die sequenzierten DNA Fragmente repräsentieren potentielle genomische Bindungsstellen (BS) für mutp53 in MethA Zellen, weil eine unspezifische Präzipitation nicht vollständig vermieden werden kann (Abb. 34). Die darauf folgende bioinformatische Auswertung der Daten sollte die genomische Verteilung der potentiellen mutp53-BS sowie deren Sequenzinhalt entschlüsseln. Die Koordinaten von 154 DNA Fragmenten wurden mithilfe des Online-Programms Blat (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat; Kent, 2002) auf Chromosomen (Mouse Mar. 2005 (mm6) assembly) identifiziert, während die restlichen 10 DNA Fragmente aufgrund ihren Ursprungs aus mehrfach vorkommenden repetitiven Sequenzen, wie z.B. Zentromer-DNA, nicht positioniert werden konnten. In der Tabelle 9 im Anhang 7.1 sind die Koordinaten aller sequenzierten mutp53-kopräzipitierten DNA Fragmente aufgelistet. Die Untersuchung der genomischen Umgebung der potentiellen mutp53-BS ergab, dass ca. 55% in intergenischen Regionen lokalisiert sind und 45% (69 von 154) innerhalb von Genen (davon 10 hypothetische protein-kodierende Gene). Bei den ingenischen Sequenzen kann man eine Präferenz für das erste Intron (26%; 18 von 69) beobachten. Das erste Intron enthält häufig regulatorische Elemente der Transkription wie gewebsspezifische enhancer, alternative Promotoren, LCR (locus control region) oder MAR/SARs (Chernov et al., 2002; Glazko et al., 2003; Shabalina and Spiridonov, 2004). MAR/SARs befinden sich außerdem an den Grenzen von Transkriptionseinheiten und sind durch einen hohen Anteil an repetitiven DNA Sequenzen charakterisiert. In diesem Zusammenhang kommt der Anreicherung der repetitiven Sequenzen in potentiellen mutp53BS eine wichtige Bedeutung zu. 70% (114 von 164) der DNA-Fragmente beinhalten repetitive Sequenzen, hauptsächlich LINE (long interspersed nucleotide elements), SINE (short interspersed nucleotide elements) und LTR (long terminal repeats) Elemente. 30 25 percentage 20 15 10 5 0 LINE SINE LTR simple low compl DNA satellite Abbildung 35 Darstellung der prozentualen Häufigkeit des Auftretens von repetitiven DNA-Elementen in den durch ChIP-Seq identifizierten DNA-Fragmenten. Ergebnisse 76 Die prozentuale Verteilung der repetitiven Elemente ist in Abbildung 35 grafisch dargestellt. Im nächsten bioinformatischen Ansatz wurde der Abstand der potentiellen mutp53-BS zu den nächstmöglichen Transkriptionsstarts (TSS) untersucht. Diese Analyse, die freundlicherweise von Mark Koudritsky und Tal Shay vom Weizmann Institute, Israel in der Arbeitsgruppe von Eytan Domany durchgeführt wurde, ergab, dass lediglich 6 von 152 DNAFragmente sich in einem Abstand von 5 kb, also Promotor-nahe, von der nächsten TSS befinden. Insgesamt befanden sich 43 potentielle Bindungsstellen innerhalb von 100 kb von einer Transkriptionsstartseite (Tabelle 5). Distanz zu Transkriptionsstarts mutp53 DNA Fragmente 1 KB 1 5 KB 6 10 KB 11 100 KB 43 Tabelle 5 Zusammenfassung der Untersuchung des Abstandes der durch ChIP-Seq identifizierten potentiellen mutp53-BS zu den nächstmöglichen transkriptionellen Startpunkten. Die Positionen der DNA Fragmente wurden analysiert im Abstand von 1 bis 100 kb zu TSS. Aufgrund dieser Ergebnisse kann die Aussage getroffen werden, dass die Beteiligung von mutp53 an der Genregulation eher indirekt durch die Bindung an regulatorische repetitive DNA Sequenzen, die im gesamten Genom verteilt sind, stattfindet und daher die globale Chromatinorganisation beeinflusst wird. Eine Präferenz der Bindung in der Nähe der Transkriptionsstarts konnte nicht festgestellt werden, dagegen wurde eine bevorzugte Bindung an Sequenzen des ersten Introns beobachtet. Die Gene, in denen oder in deren Nähe eine potentielle mutp53-BS gefunden wurde, sind im Bezug auf ihre biologischen Funktionen heterogen, so dass sie ohne weitere Analysen keinen direkten Hinweis auf einen Wirkmechanismus von mutp53 in MethA Zellen liefern. Auffällig ist jedoch, dass ein mutp53kopräzipitiertes DNA-Fragment aus dem Eif2ak2 (PKR) Gen stammt, was auf mögliche Beteiligung von mutp53 an der Regulation der Transkription des Eif2ak2 Gens hindeutet. Die Annahme einer solchen Regulation als Antwort auf die Expression von dsRNA könnte den partiellen Schutz vor Arrest und Zelltod durch Repression der PKR Expression durch mutp53 erklären. 4.4.2.1 Einfluss von mutp53 DNA-Bindungsstellen auf die Genregulation Die Identifikation der mutp53 DNA-Bindungsstellen durch die ChIP-Seq reicht alleine nicht aus, um deren Funktionalität im Hinblick auf die Genregulation beurteilen zu können. Zur Evaluation der ChIP-Seq Daten sollte deshalb durch Vergleich der Expressionsprofile von Ergebnisse 77 MethA Zellen transfiziert mit pSUPscr oder pSUPshp53 der Einfluss von mutp53 auf die Expression von Genen untersucht werden. Zur Untersuchung des direkten oder indirekten Einflusses der mutp53 Bindung an genomische DNA auf die Expression benachbarter Gene, wurden die Expressionswerte aller Gene, die eine mutp53 Bindungsstelle beinhalten, genauer betrachtet. Wendet man die stringenten Filterungskriterien 1,5-fache Expressionsänderung und p-Wert <0,01 an, erhält man 3 Gene, die nach shRNA-vermittelter Reduktion der mutp53 Expression zwischen mit pSUPscr und pSUPshp53 transfizierten Zellen in mindestens einem der vier Experimente differentiell reguliert sind und für die außerdem eine DNA-Bindungsstelle durch die ChIP-Seq gefunden wurde (Tabelle 6). Das in blau dargestellte Gen wurde herunterreguliert, während die in gelb dargestellten Gene nach knockdown von MethAp53 hochreguliert wurden. ChIP-Seq Lokalisation der Bindungsstelle Gen Beschreibung WW domain-containing protein 2 SM2-39 chr8:106831030-106831354 Wwp2 XM2-28 chr4:143841892-143842147 Dhrs3 XM2-38 chr9:70411728-70411955 Myo1e dehydrogenase/reductase (SDR family) member 3 myosin IE Tabelle 6 Liste der Gene, in denen durch die ChIP-Seq eine Bindungsstelle von mutp53 gefunden und außerdem eine differentielle Regulation in der Genexpression in pSUPshp53 transfizierten Zellen verglichen mit pSUPscr transfizierten Zellen gemessen wurde. Die in blau dargestellten Gene sind in pSUPshp53 transfizierten Zellen herunterreguliert, während die in gelb dargestellten Gene hochreguliert sind. Die 779 zwischen untransfizierten und mit dsRNA transfizierten Zellen differentiell regulierten Gene wurden ebenfalls auf eine mutp53 Bindungsstelle überprüft. Für die Gene Eif2ak2, Mast4 und Zfand1 wurde durch die ChIP-Seq Methode eine mutp53 Bindungsstelle im Gen gefunden und außerdem eine differentielle Regulation zwischen untransfizierten und mit dsRNA transfizierten MethA Zellen. Aufgrund des nur geringen Einflusses von mutp53 auf die Genexpression in unseren Experimenten und des wenig informativen Vergleichs der Genexpressionsprofile von pSUPscr und pSUPshp53 transfizierten Zellen, stellte sich die Frage, ob die Funktion von mutp53 vielleicht auf posttranskriptionelle Regulation zurückzuführen ist. Um dies herauszufinden, wurde die Funktion von mutp53 auf der Ebene des Transkriptoms untersucht. Das Verhalten von MethA Zellen nach Transfektion mit dsRNA Expressionsvektoren deutet auf eine funktionelle Verbindung zwischen mutp53 und dsRNA hin. Ergebnisse 78 4.5 Untersuchung der mutp53 Funktion auf der Ebene des Transkriptoms 4.5.1 Gesamt RNA-Immunpräzipitation (RNA IP) zur Analyse der in vivo Interaktion von mutp53 mit RNA Der Befund der Reduktion des durch dsRNA und folgenden Aktivierung der PKR verursachten Wachstumsarrests durch mutp53 könnte im Zusammenhang mit der Interaktion von mutp53 mit RNA stehen. Diese These wird durch in vitro Daten unterstützt, die zeigen, dass p53 mit einer höheren Affinität mit RNA verglichen mit DNA interagiert (Oberosler et al., 1993). Um herauszufinden, ob mutp53 in MethA Zellen in vivo funktionell mit RNA interagiert, wurde eine RNA-Immunpräzipitation durchgeführt. Der experimentelle Ablauf ist in Abbildung 7 im Kapitel Methoden gezeigt. Ähnlich wie bei der Chromatin-Immunpräzipitation werden auch hier Nukleinsäuren indirekt über den gebundenen Protein-Interaktionspartner präzipitiert und nach Aufreinigung aus diesem Komplex kloniert und sequenziert. Allerdings findet bei der RNA IP keine Quervernetzung statt, so dass nur stabile Interaktionspartner erfasst werden. Auf dem Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel in der Abbildung 36 wurden die über PCR amplifizierte, doppelsträngigen cDNA Moleküle aufgetrennt, die als RNA mit spezifischem p53 Antikörper oder in einem Kontroll-Ansatz (mit Ziege IgG bzw. ohne Antikörper) präzipitiert wurden. Eine deutliche Anreicherung von amplifizierten DNA Molekülen in Versuchen mit anti-p53 Antikörper ist zu erkennen. Abbildung 36 Elektrophoretische Auftrennung der durch RNA IP angereicherten, in cDNA konvertierten und über PCR amplifizierten DNA Fragmente. Der lösliche Bestandteil von 5x 106 Zellen wurde durch Zugabe von E1A Puffer mit 0,1% NP-40 extrahiert. Die spezifische Präzipitation von p53Proteinen erfolgte mit Hilfe polyklonaler Antikörper und Protein G-gekoppelten Dynabeads. Die p53gebundenen Transkripte wurden extrahiert, in cDNA umgeschrieben und anschließend amplifiziert. Gezeigt ist die Auftrennung der PCR-Produkte in einem 1%igen Agarose-gel. Die Spezifität der Immunpräzipitation wurde durch Immunblot-Analyse der Überstände aus allen Ansätzen überprüft (Abb. 37). Ergebnisse 79 Abbildung 37 Immunblot-Analyse der Überstände nach der Immunpräzipitation und Nachweis des p53 Proteins. Als Kontrolle wurde die Immunpräzipitation ohne Antikörper bzw. mit Ziege IgG durchgeführt. Der Immunblot zeigt, dass mutp53 durch die Immunpräzipitation mit spezifischen Antikörpern vollständig aus den Proben entfernt wurde, während in den Überständen aus KontrollAnsätzen p53 detektierbar ist. 86 klonierte cDNA Moleküle, die die durch mutp53 direkt oder indirekt gebundenen Transkripte repräsentieren, wurden sequenziert. Eine Sequenz-Analyse der p53- gebundenen Transkripte ergab, dass keine der Transkripte aus MethA Zellen den in Sequenzdatenbanken gespeicherten vollständigen Transkripten entsprach. Ein Teil dieser verkürzten Transkripte ist methodisch bedingt. So wurde zur cDNA Synthese ein Oligonukleotid (P1CAP-CDS) eingesetzt, das an eine Folge aus drei Cytosinen hybridisiert. Diese Pyrimidinfolge wird durch die Reverse Transkriptase an die entstehende cDNA angehängt. Enthielt nun die mRNA intrinsische Cytosin-Folgen, könnte man sich vorstellen, dass der Primer an diese hybridisierte und es zur Synthese verkürzter cDNA kam. Weiterhin kann eine Verkürzung der RNAs durch Degradation während der Präparation nicht ausgeschlossen werden. Eine bioinformatische Analyse ergab, dass aus 74 Transkripten 29mal 3' UTR (Untranslated Regions) Transkripte, die vermutlich auf die Aktivität alternativer Promotoren oder alternatives Splicing zurückzuführen sind. Außerdem gehören weitere 29 mutp53 kopräzipitierte Transkripte zur B2/B1 SINE Familie der repititiven Elemente. Die Liste der Transkripte ist im Anhang in Tabelle 11 zusammengestellt. 3' UTRs sind – durch Kompetition mit Faktoren, die an den 3‘ UTR der entsprechenden mRNA binden – an der Regulation von RNA Prozessierung, Abbau, Lokalisation und Effizienz der Translation beteiligt (Kugel and Goodrich, 2000; Kugel and Goodrich, 2002; Mignone et al., 2002; Rastinejad and Blau, 1993; Rastinejad et al., 1993; Workman and Kingston, 1998), während für B2 SINE eine Bindung an RNA Polymerase II gezeigt wurde, die die Transkriptsynthese unterbindet (Espinoza et al., 2004). Unter den analysierten Transkripten sind 12, die am 3' oder 5' Ende trunkiert sind. Dies lässt darauf schließen, dass mutp53 in MethA Zellen präferentiell an nicht kodierende Transkripte bindet. Durch 5' RACE PCR konnte die Existenz ausgewählter 3' UTR Transkripte bestätigt werden (Bcas2, Hnrpc, Rab34, Anxa2, Arf6, Got1, Cnih; Daten nicht gezeigt). Für die 3' UTR Transkripte wird eine Regulation des Ergebnisse 80 Gesamtlängentranskriptes im Gegensatz zur Translation des verkürzten Transkriptes postuliert. Unter den von mutp53 gebundenen Transkripten befindet sich eine Gruppe von Transkripten, die für RNA bindende Proteine kodieren wie snRNP E, hnRNP C und ribosomale Proteine sowie Proteine, die funktionell der Mitose zugeordnet werden können, wie Anapc11, Mad2l1bp, Dynll1, Tpx2 und Nucks1. Wenn man die thermodynamisch stabilste Sekundärstruktur der gefundenen Transkripte mit der RNA fold 1.5 Software (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) berechnen läßt, kann man feststellen, dass alle Transkripte Strukturen wie Haarnadel (hairpin), Ausbuchtungen (bulges), interne Schleifen (interior loops) und mehrfache Schleifen (multiloop) enthalten. Dies lässt darauf schließen, dass die RNA Konformation eine wichtige Bedeutung für die direkte oder indirekte Interaktion mit mutp53 haben könnte und mutp53 strukturspezifisch und nicht sequenzspezifisch an RNA bindet. Abbildung 38 Sekundärstrukturen einiger ausgewählter Transkripte, die durch mutp53 ko-präzipitiert wurden und deren Struktur mittels RNA fold 1.5 Software bestimmt wurde. Es sind die Sekundärstrukturen mit der geringsten freien Enthalpie dargestellt. 4.6 Genomische Verteilung der mutp53 Bindungsstellen und kodierenden Regionen der mutp53-gebundenen Transkripte Die durch ChIP-Seq Analyse erhaltenen 154 mutp53 DNA Bindungsstellen sowie die Sequenzen der durch RNA-IP identifizierten 87 mutp53 gebundenen Transkripte wurden für die Analyse der genomischen Verteilung im murinen Genom lokalisiert und grafisch Ergebnisse 81 dargestellt, wie in Abb. 39 gezeigt. Vergleichbar mit den Ergebnissen aus den ChIP-Seq Experimenten waren auch die Loci der mutp53-gebundenen Transkripte über das gesamte Genom verteilt. Man kann jedoch deutlich Anreicherungen von mutp53 Bindungsstellen oder Transkripten in bestimmten Bereichen von Chromosomen erkennen. Interessant ist außerdem, dass in bestimmten chromosomalen Bereichen eine Anreicherung von Bindungsstellen sowie Genen der mutp53-kopräzipitierten Transkripte gefunden werden. Diese in einem Bereich von höchstens 1 Mb auseinander liegenden Sequenzen wurden als ChIP/RIP Cluster definiert und sind in der Abbildung 39 schwarz umrandet. Anhand dieser Parameter konnten für MethA Zellen 15 Cluster identifiziert werden. Abbildung 39 Integrative Darstellung der Positionen der durch die ChIP-Seq gefundenen mutp53 DNA-Bindungsstellen (oben) und der kodierenden Regionen der durch die RNA-IP Methodik identifizierten mutp53-kopräzipitierten Transkripte (unten) an den Chromosomen durch die SigmaPlot 10.0 software. Cluster von mutp53 DNA-Bindungsstellen und gebundenen Transkripten sind schwarz umrandet. Durch dieses Ergebnis wird die Beteiligung von mutp53 an so genannten transcription/processing factories, an denen die Transkription sowie posttranskriptionelle Prozesse simultan stattfinden, unterstützt (Cook, 2003). Nach diesem Modell sind die in die Transkription und RNA Prozessierung involvierten Proteine in großen Komplexen (transcription factories) konzentriert, um die Chromatin-Schleifen gewunden sind, was eine simultane Transkription sowie Prozessierung der Transkripte mehrerer Gene ermöglicht, da Ergebnisse 82 eine limitierte Menge an RNA Polymerasen im Vergleich zur Menge an transkribierten Genen präsent sind. 4.7 Untersuchung der mutp53 Funktion auf der Ebene des Proteoms 4.7.1 Proteomanalyse zur Identifizierung potentieller Proteininteraktionspartner von mutp53 Die Ergebnisse der ChIP-Seq und RIP Experimente haben bereits einige Einblicke in die Funktion von mutp53 gewährt und auf eine übergeordnete Funktion von mutp53 in MethA Zellen in der Regulation der Genexpression hingewiesen. Angenommen, dass mutp53 mit transcription/processing factories assoziiert ist, wird man erwarten, dass infolge der ZellFraktionierung und Immunpräzipitation mutp53 in Multiprotein-Komplexen detektierbar ist. Um die Komposition dieser Multiprotein-Komplexe mittels Immunpräzipitation aufzuklären, wurden in Suspension wachsende MethA Zellen mit NP40-haltigem E1A Puffer extrahiert. Es wurde festgestellt, dass unter diesen Bedingungen nur ein Teil des nukleären mutp53 extrahierbar ist (Abb. 40), was auf stabile Assoziation von mutp53 mit Chromatin hinweist und eine Limitierung des Versuches darstellt, weil man für die nachfolgenden Studien mehr Zellen im Experiment einsetzen muss. Eine Extraktion unter stringenteren Bedingungen (z.B. höherer pH-Wert, höhere Salzkonzentration, Nuklease-Behandlung) oder die UltraschallBehandlung wurde aus dem Grund nicht verwendet, weil es den Verlust einiger Interaktionen zur Folge haben kann. Das Zell-Extrakt wurde für eine IP mit einer Mischung monoklonaler Maus p53-spezifischer Antikörper (Pab242, -248, -421) eingesetzt, und die Immunkomplexe wurden anschließend mithilfe von Protein G-Sepharose präzipitiert. Extraktion Abbildung 40 Immunfluoreszenzfärbung von mutp53 in MethA Zellen vor und nach der Extraktion mit NP40-haltigem E1A Lysepuffer mit anti-p53 Antikörper. In einer Immunblot-Analyse wurden der Zell-Extrakt, der Überstand nach Immunpräzipitation, die Waschfraktionen sowie das Eluat auf p53 Gehalt untersucht (Abb. 41). Es ist eine deutliche Anreicherung von p53 im Eluat verglichen mit dem MethA Zell-Extrakt zu erkennen, während die Überstand- und Waschfraktionen kaum p53 aufweisen. Ergebnisse 83 Abbildung 41 Nachweis von p53 durch Immunblot-Analyse in MethA Zell-Extrakt, den Überständen nach erfolgter Immunpräzipitation, den Waschfraktionen und den Eluaten. Das Eluat wurde in der ersten Dimension, der isoelektrischen Fokussierung nach isoelektrischem Punkt pI und in der zweiten Dimension, der SDS PAGE nach Molekulargewicht aufgetrennt. Das resultierende 2D-Gel wurde daraufhin mit colloidaler Coomassie Blau Lösung gefärbt, gescannt und alle signifikanten Proteinspots ausgestochen und der Analyse durch MALDI ToF Massenspektrometrie unterzogen (Abb. 42). Um die Reproduzierbarkeit des IP-Versuches zu testen, wurde das Experiment dreimal wiederholt. In Abbildung 42 stellt das bei ca. 53 kDa und pI 3-4 mit Pfeil versehene „schwarze“ Signal das Ergebnis der Immunblot-basierenden Detektion von mutp53 dar, welches mit einem polyklonalen anti-p53 Antikörper spezifisch nachgewiesen wurde und mit dem colloidalen Coomassie Blau gefärbten Gel überlagert wurde. Warum in 2D Gelen mutp53 nur durch Immunblotting detektiert werden konnte, ist unklar. Die eingesetzten p53-spezischen monoklonalen Antikörper weisen keine unspezifische Reaktion mit anderen zellulären Proteinen auf, da in Kontroll-Versuchen mit p53-negativen Maus EAT Zellen keine Färbung beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt). Dies lässt vermuten, dass die Unterrepräsentation von mutp53 im Immunpräzipitat die stöchiometrischen Verhältnisse der Komponenten der mutp53-haltigen Komplexe widerspiegelt. Es könnte sein, dass in NP40-extrahierbaren Komplexen der Anteil des mutp53 im Vergleich zu anderen Komponenten deutlich geringer ist. Alternativ, kann man auch nicht ausschließen, dass eine Fraktion des präzipitierten mutp53 z.B. durch Aggregation während der isoelektrischen Fokussierung in der zweiten Dimension analytisch nicht erfasst werden konnte. Diese These findet eine indirekte Unterstützung in der Beobachtung, dass rekombinantes mutp53, das aus Insektenzellen isoliert wurde, schwer löslich ist und zur Ausbildung großer Aggregate tendiert (Daten nicht gezeigt). Ergebnisse 84 Abbildung 42 Repräsentatives 2D-SDS Polyacrylamidgel des Immunpräzipitats. Die Proteine wurden entlang der x-Achse nach isoelektrischem Punkt aufgetrennt. Es wurde ein pH Bereich von 3 bis 10 verwendet. Entlang der y Achse wurden die Proteine in der zweiten Dimension nach Molekulargewicht in der SDS PAGE aufgetrennt. In schwarz ist das Signal von p53 überlagert, welches durch Immunblot-Analyse detektiert wurde. Analysierte Proteinspots sind markiert und mit arabischen Ziffern gekennzeichnet. Das Molekulargewicht ist durch den verwendeten Protein Standard markiert. Die mittels Peptidmassen-Fingerabdruck Methode identifizierten Proteinspots aus drei unabhängigen Experimenten sind in der zugehörigen Tabelle 8 aufgelistet. Wie aus Tabelle 8 zu entnehmen ist, kann man die mutp53-kopräzipitierten Proteine in vier Gruppen einteilen. Die größte Gruppe besteht aus RNA-Bindeproteinen, zu denen Proteine der hnRNP Familie, die 3' nicht-translatierte Regionen der Transkripte beispielsweise via deren AU reichen Sequenzen (AU rich elements, ARE) binden und dadurch die Stabilität dieser Transkripte und somit die posttranskriptionelle Regulation beeinflussen, gehören. Diese (de-) stabilisierenden Elemente werden in ca. 8% aller humanen mRNAs gefunden, welche für strikt kontrollierte Gene wie Cytokine, Interleukine, Interferone, TNFα und einige Proto-Onkogene kodieren (Bakheet et al., 2001; Barreau et al., 2006). Ergebnisse 85 Spot Protein I. RNA bindende Proteine 1 2 8/9 10/11/29 12/13 14/15 16 -18/28 27/31 21 36 34 24 YB1 (nuclease sensitive element binding protein 1) Rbm3 (RNA binding motif 3) Taf15 (RNA binding protein 56) Hnrpa3*** Hnrnpa2b1*** Hnrpdl*** Hnrpab*** Hnrpd Rps5 (ribosomal protein S5)** Rps7 (ribosomal protein S7) Khsrp (KH type splicing regulatory protein) Tardbp (TAR DNA binding protein) II. Zytosolische Proteine 19/20/32 22 30 35 26 25 LOC68045 (new mitotic spindle associated protein)** Actg (gamma-actin)*** Tubb5 (tubulin beta, 5)*** Tpi1 (Triosephosphate-isomerase)** Akap95 (A kinase anchor protein 95) Psme1 (proteasome 28 subunit, alpha) III. Hitzeschockproteine 3 4 26 Hsp90aa1 (heat shock protein 1)*** Hspa1 (heat shock70 kDa protein)** Hspa9*** IV. Andere 6 Mcm9 (minichromosome maintenance 9) Tabelle 7 Liste der mutp53 ko-präzipitierten Proteine aus MethA Zellen, die durch Massenspektrometrie-basierender Peptidmassen-Fingerabdruck Methode identifiziert wurden. Die mit drei Sternen gekennzeichneten Proteine wurden in drei unabhängigen Experimenten identifiziert, während die mit zwei Sternen gekennzeichneten Proteine in zwei Experimenten gefunden wurden. Die Überexpression von hnRNP A2 und B1 wurde in vielen Tumoren entdeckt und mit der Zellproliferation korreliert (He et al., 2005). Es wurden auch Proteine identifiziert, für die eine Interaktion mit wtp53 bekannt ist, z.B. YB1 (Lasham et al., 2003; Zhang et al., 2003), Hspa1 (Hsp70) und Triosephosphat Isomerase (Rahman-Roblick et al., 2007). YB1 kann auch zur Gruppe RNA-bindender Proteine gezählt werden, weil es spezifisch an Spleiß- Erkennungsstellen bindet und die Auswahl alternativer Spleißstellen reguliert. Die Identifikation des RNA Polymerase II assoziierten Taf15 Proteins in Komplexen mit mutp53 unterstützt die postulierten Interaktionen von mutp53 mit Komponenten des transcription/processing factories. Die Detektion dreier Hitzeschockproteine bestätigt außerdem die Ergebnisse früherer Studien, in denen Hsp70 als erster Interaktionspartner von mutp53 identifiziert wurde und vermutlich für die Stabilität von mutp53 in MethA Zellen mitverantwortlich ist (Gronostajski, Goldberg, and Pardee, 1984; Pinhasi-Kimhi et al., 1986). Der reproduzierbare Nachweis der zytosolischen Proteine im mutp53-Kopräzipitat, zu denen Ergebnisse 86 vor allem gamma-Aktin und beta-Tubulin gehören, ist nicht überraschend, wenn man die kurze Generationszeit der MethA Zellen berücksichtigt, was zur Folge hat, dass sich zirka 30% der Zellen während der Zell-Extraktion in der Mitose befinden (Daten nicht gezeigt). Während der Zellteilung wird mutp53 nicht proteolytisch abgebaut, und ist im Zytoplasma diffus verteilt. Offensichtlich ist mutp53 in mitotischen Zellen mit zytoplasmatischen Strukturen, vor allem zytoskeletalen Filamenten, assoziiert. Eine interessante Verknüpfung zur möglichen Funktion von mutp53 in mitotischen Zellen, ist die Identifikation zweier Proteine in mutp53 Komplexen, Mcm9 (minichromosome maintenance 9) und LOC68045 (new mitotic spindle associated protein), die funktionell der Mitose zugeordnet werden können. 4.7.2 Verifizierung der potentiellen Interaktionspartner von mutp53 mittels konfokaler Mikroskopie Um die durch massenspektrometrische Analyse identifizierten potentiellen ProteinInteraktionspartner von mutp53 zu verifizieren, wurden Immunfluoreszenzfärbungen von MethA Zellen durchgeführt und diese anschließend mittels Konfokalmikroskopie ausgewertet. Die Konfokalmikroskopie ermöglicht die Beschreibung der räumlichen Anordnung der untersuchten Proteine und Berechnung deren Kolokalisation. Dabei ist die Kolokalisation durch die Präsenz zweier oder mehrerer Proteine an der gleichen physischen Lokalisation einer Probe definiert. Zur Kolokalisation verschiedener Fluoreszenzmarker wird das Fluoreszenzlicht in spektrale Bereiche zerlegt, die simultan mit verschiedenen Detektoren verarbeitet werden können. Die digitalisierten Fluoreszenzsignale von jedem Detektor werden als getrennte Kanäle gespeichert und können mittels speziellen Computerprogrammen (z.B. Imaris) überlagert werden. Abbildung 43 Konfokalmikroskopische Darstellung der Immunfluoreszenzfärbung von Triton X100 extrahierten MethA Zellen mit mutp53 (rot) und hspa1 (grün) spezifischen Antikörper. Die Aufnahmen wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning Mikroskop gemacht und anschließend digital bearbeitet. Der Kolokalisations-Kanal (gelb) wurde mit Hilfe des Imaris Coloc Moduls berechnet. Objektiv: PlanApochromat 63x / 1,4 Oil; Maßstab: 10 µm. Ergebnisse 87 Die Abbildung 43 zeigt die Kolokalisation von hspa1 Protein mit mutp53 im Zellkern nach Extraktion mit Triton X100. Die Extraktion hat zur Folge, dass das zytoplasmatische mutp53 fast vollständig entfernt wurde, während noch zytoplasmatisches hspa1 Signal zu sehen ist. Des Weiteren wurde die Kolokalisation zwischen mutp53 und YB1 (Y box binding protein 1), hnRNP A/B (heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein) sowie hnRNP D untersucht. Für mutp53 und hnRNP D Protein ist ebenfalls eine Kolokalisation von <5% in Abbildung 44a zu erkennen. Nach Extraktion mit Triton X100 geht die zytoplasmatische Färbung von hnRNP D zurück (Abb. 44b), die nukleäre Kolokalisation mit mutp53 bleibt jedoch erhalten. Demnach entgehen sowohl mutp53 als auch hnRNP D teilweise der Extraktion und verbleiben im Zellkern. Für hnRNP D ist zusätzlich eine leichte zytoplasmatische Färbung erkennbar. a b c Abbildung 44 Konfokalmikroskopische Darstellung der Immunfluoreszenzfärbung von MethA Zellen mit mutp53 (rot) und hnRNP D (grün) spezifischen Antikörper ohne (a) oder mit vorheriger Triton X100 Extraktion (b) oder mit Triton X-100 Extraktion und RNase A Behandlung (c). Die Aufnahmen wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning Mikroskop gemacht und anschließend digital bearbeitet. Der Kolokalisations-Kanal (gelb) wurde mit Hilfe des Imaris Coloc Moduls berechnet. Objektiv: PlanApochromat 40x oder 63x / 1,4 Oil; Maßstab: 10 µm. Um die Frage zu beantworten, ob die Interaktion zwischen mutp53 und hnRNP D indirekt über RNA stattfindet, wurde zusätzlich zur Extraktion eine Inkubation mit RNase A durchgeführt und anschließend die Immunfluoreszenzfärbung gemacht. In Abbildung 44c ist eine deutliche Reduktion des hnRNP D Signals nach RNase A Behandlung sichtbar, was die Schlussfolgerung zulässt, dass die Verankerung von hnRNP D im Kern sensitiv gegenüber der Behandlung mit RNase A ist und demnach durch RNA vermittelt wird. Die Analyse der intrazellulären Verteilung von hnRNP A/B und mutp53 ergab ebenfalls eine Kolokalisation, in Übereinstimmung mit den hnRNP D Daten (Daten nicht gezeigt). Ein ähnliches Bild ergibt sich nach Untersuchung der Kolokalisation zwischen mutp53 und YB1. YB1 wurde in der Literatur bereits als Interaktionspartner von wtp53 beschrieben (Lasham et al., 2003; Zhang et al., 2003). Die Abbildung 45a zeigt ein nukleäres wie zytoplasmatisches Signal für YB1, dargestellt in grün, während mutp53 vornehmlich im Nukleus anzutreffen ist. Im Kern ist eine deutliche in gelb dargestellte Kolokalisation zu sehen, was einen weiteren Hinweis auf eine physische Interaktion beider Proteine liefert. Nach Behandlung mit Triton X100 wird ein Großteil von YB1, vor allem der zytoplasmatische Teil, sowie ein Teil mutp53 Protein aus der Ergebnisse 88 Zelle extrahiert (Abb. 45b). Die Behandlung der Zellen mit RNase A hat einen dramatischen Rückgang des YB1 Signals zur Folge (Abb. 45c). Dies lässt darauf schließen, dass YB1 ähnlich wie hnRNP D durch RNA in der nukleären Matrix der Zelle verankert ist und deswegen nach RNase A Behandlung freigesetzt wird. a b c Abbildung 45 Konfokalmikroskopische Darstellung der Immunfluoreszenzfärbung von MethA Zellen mit mutp53 (rot) und YB1 (grün) spezifischen Antikörper ohne Extraktion (a) mit vorheriger Extraktion durch Triton X-100 (b) oder mit Triton X-100 und RNase A Behandlung (c). Die Aufnahmen wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning Mikroskop gemacht und anschließend digital bearbeitet. Der Kolokalisations-Kanal (gelb) wurde mit Hilfe des Imaris Coloc Moduls berechnet. Objektiv: PlanApochromat 63x / 1,4 Oil; Maßstab: 10 µm. 4.7.3 Die Bedeutung der RNA in Interaktionen von mutp53 mit anderen Proteinen Die Bedeutung der RNA in Protein-Protein Interaktionen, auf welche die konfokale Mikroskopie hinweist, wurde des Weiteren in Immunblot-Analysen verifiziert. MethA Zellen wurden hierfür mit Triton X100 extrahiert und entweder mit Benzonase, RNase A oder beiden Nukleasen bei 37°C inkubiert. Als Kontrolle dient ein unbehandeltes, bei 37°C inkubiertes MethA Zelllysat. Anschließend wurden die Proben in einem SDS Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf eine PVDF Membran transferiert und mit den entsprechenden Antikörpern inkubiert (Abb. 46). Die Nukleasebehandlung ruft einen kompletten Verlust des p53 Signals hervor, während die Signale der potentiellen Interaktionspartner YB1, hnRNP D und hnRNP A/B erst durch Nukleasebehandlung sichtbar werden. Dies zeigt deutlich, dass die Nukleasebehandlung eine Freisetzung von YB1, hnRNP D sowie hnRNP A/B aus dem Nukleus hervorruft, während mutp53 vermutlich irreversibel aggregiert und deswegen aus der Analyse ausgeschlossen wird. Des Weiteren lässt sich festhalten, dass sowohl YB1 als auch hnRNP D und hnRNP A/B durch RNA im Nukleus verankert sind. Daraus folgt, dass die mutp53-haltigen Multiprotein-Komplexe an DNA gebunden sind und RNA enthalten. In einem zusätzlichen Experiment, das in Abbildung 47 dargestellt ist, wird dieser Zusammenhang bekräftigt. Ergebnisse 89 Abbildung 46 Immunblot-Analyse von Triton X100 extrahierten MethA Zellen, die mit Benzonase (B), RNase A (R) oder beidem (B+R) behandelt wurden bzw. unbehandelt blieben (37°C). Es wurde eine analytische Immunpräzipitation von MethA Zelllysat und währenddessen eine Inkubation mit Benzonase, RNase A oder beidem bzw. keine Behandlung als Kontrolle durchgeführt und anschließend mittels Immunblot analysiert. Im MethA Zelllysat ist lediglich ein Signal für mutp53 und YB1 erkennbar, wohingegen die Proteinmengen an hnRNP D und A/B nicht ausreichend zu sein scheinen, um sie im Immunblot visualisieren zu können. Führt man nun eine Immunpräzipitation mit polyklonalem anti-p53 Antikörper durch, detektiert man in dem Eluat ebenfalls ein Signal für hnRNP D und A/B, welches in der Menge durch Nukleasebehandlung verstärkt wird. Im Gegensatz dazu verringert sich der Gehalt an p53 nach Nuklease-behandlung deutlich. Abbildung 47 Immunblot-Analyse von p53 immunpräzipitierten MethA Zellen, die mit Benzonase (B), RNase A (R) oder beidem (B+R) behandelt wurden bzw. unbehandelt blieben (-R/B). Als zusätzliche Kontrolle wurde unbehandeltes MethA Zelllysat (MethA asc) aufgetragen. Diskussion 90 5 DISKUSSION Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der Funktion von mutp53 in einem murinen Tumorzellmodell im Hinblick auf eine unterstützende Wirkung in der Tumorgenese. Um die Funktion von mutp53 in MethA Zellen zu untersuchen, wurde die Proteinkonzentration von mutp53 durch RNA induzierte spezifische Reduktion der Genexpression erniedrigt. Phänotypische Veränderungen der mutp53 Reduktion auf das Wachstum und die Viabilität von MethA Zellen konnten beobachtet werden und deuten darauf hin, dass zwischen mutp53 und dsRNA eine funktionelle Verbindung besteht. Durch einen systematischen Ansatz wurde das Interaktionsspektrum von mutp53 mittels ChIP-Seq, RNA- und Protein-Ko- Immunpräzipitation charakterisiert. Damit konnte ein Einblick der Funktion von mutp53 in diesem Tumorzellmodell erhalten werden, der auf eine wichtige Rolle von mutp53 für die kontrollierte Proliferation in einem Tumorzellverbund vor allem durch eine übergeordnete Rolle in der Regulation der Genexpression hindeutet. 5.1 Die Expression von kleinen dsRNAs hat unabhängig von deren Sequenz eine deutliche Reduktion des Wachstums sowie des Überlebens zur Folge Lässt man in MethA Zellen dsRNA <30 bp durch Transfektion mit einem geeigneten Vektor exprimieren, kann man mittels live cell imaging Mikroskopie eine überraschend drastische Reduktion des Wachstums und des Überlebens der Zellen unabhängig von der verwendeten RNA-Sequenz im Vergleich zu Kontrollzellen innerhalb von 50 h nach Transfektion beobachten. Dieses Ergebnis wird durch Messungen der Viabilität sowie Messungen der Zellanzahl durch Kristallviolettfärbung bestätigt (Daten nicht gezeigt). Grundsätzlich können dsRNAs unspezifische Effekte in der Zelle auslösen, z.B. sog. off-target Effekte durch die Degradation der mRNA anderer Gene und Bindung an zelluläre Proteine in sequenzspezifischer Weise und Beeinflussung deren Funktion durch den sog. Aptamer Effekt (Shi, Hoffman, and Lis, 1999). So konnte für antisense Oligonukleotide die Bindung an viele verschiedene Proteine nachgewiesen werden (Branch, 1998; Brukner and Tremblay, 2000; Lebedeva and Stein, 2001), welches signifikante nichtspezifische Effekte hervorrufen kann (Cho et al., 2001; Fisher et al., 2002; Stein, 1995). Außerdem kann dsRNA durch einen miRNA Effekt die Translation von bestimmten Genen regulieren (Silencing) (Doench, Petersen, and Sharp, 2003) oder die Induktion einer nichtspezifischen Interferonantwort hervorrufen. In Säugetierzellen können dsRNAs nicht-spezifische inhibitorische Effekte auslösen, die kollektiv als Interferonantwort bezeichnet werden. Diese Antwort ist ein konservierter Mechanismus der Zellen als Schutz vor viraler RNA. Das Zytokin Interferon induziert die Expression zahlreicher intrazellulärer Gene zur Prävention der viralen Invasion und Diskussion 91 ermöglicht die Auslösung der Apoptose infizierter Zellen. Beispielsweise wird durch Interferon die Expression der dsRNA abhängigen Serin-/Threoninkinase PKR induziert (Meurs et al., 1990). Die am besten beschriebene Funktion der PKR ist daher der Interferon vermittelte Schutz gegen virale Infektion. Die PKR wird allerdings nicht nur in Virus-infizierten sondern auch in uninfizierten, erkrankten Geweben (Tumore, neurodegenerative Erkrankungen) als intrazellulärer Stresssensor aktiviert (Sadler and Williams, 2007) und wurde auch mit Zellwachstum, Signaltransduktion, Induktion von Apoptose, Differenzierung und RNAi in Verbindung gebracht. Wie in Abbildung 47 schematisch dargestellt, führt die durch dsRNA hervorgerufene Aktivierung der 2'-5' Oligoadenylatsynthetase 2 zur Degradation der dsRNA, während die Aktivierung der PKR einen generellen Translationsstop zur Folge hat. dsRNA IFN TNFα Induktion PKR 2‘ 5‘ OAS aktive PKR (Autophosphorylierung und Dimersierung) NFκB Aktivierung Zytokin Produktion P eIF2α Translation 2‘ 5‘ Oligoadenylate RNase L Degradation der RNA Abbildung 48 Schematische und vereinfachte Darstellung der Aktivierung von PKR und 2'-5' Oligoadenylatsynthetase 2 durch dsRNA als Schutzmechanismus der Zelle vor viraler Replikation. (modifiziert nach H. Helmbold). Es konnte kürzlich in einer Arbeit gezeigt werden, dass Alu-SINE Transkripte, deren Expression durch Stress rapide steigt, die Translation stimulieren, indem sie als Antagonisten die Aktivität der PKR inhibieren (Chu et al., 1998). Auf der anderen Seite wurde berichtet, dass die 3' UTR Bereiche von cytoskeletalen Muskel mRNAs (Tropomyosin, Troponin und Herzmuskel-Aktin) die Translation durch direkte Bindung an die RNA bindenden Domänen der PKR inhibieren (Nussbaum, Gunnery, and Mathews, 2002). Die Expression einer katalytisch inaktiven PKR (z.B. die Mutante K296R oder K296P) in NIH-3T3 Zellen führt zu deren Transformation und Bildung von Tumoren in Nacktmäusen und erhöht das Wachstum von HeLa Zellen (Barber et al., 1995; Jagus, Joshi, and Barber, 1999; Diskussion 92 Koromilas et al., 1992; Meurs et al., 1993). Diese Befunde implizieren eine positive Wirkung auf die Zellproliferation durch das PKR- Protein, wenn die Kinasedomäne inaktiv ist. Die PKR ist in den meisten Zelltypen in geringen Mengen im Zytoplasma vorhanden (Hovanessian, 1987). Erst durch Bindung von dsRNA an die beiden RNA bindenden Domänen im N-Terminus wird die im C-Terminus befindliche Kinasedomäne durch Änderung der Konformation aktiviert. Dies hat eine Autophosphorylierung und Dimerisierung der PKR und dadurch eine Aktivierung zur Folge (PKR review: Sadler and Williams, 2007). Die durch dsRNA aktivierte PKR phosphoryliert u.a. die alpha Untereinheit des eukaryontischen Initiationsfaktors eIF-2 und inhibiert dadurch die Proteinsynthese (Williams, 1999). Zudem induziert die PKR die Expression von NFκB (Gil, Alcami, and Esteban, 1999). Matsumoto und Kollegen beschrieben, dass die durch dsRNA ausgelöste Apoptose über drei Signalwege verläuft: den klassischen PKR abhängigen Signalweg (FADD-caspase 8), einen JNK/SAPK vermittelten mitochondrialen Signalweg sowie ein ERK2 bezogener Signalweg (Matsumoto et al., 2005). In der Literatur wird die Interferonantwort allerdings für dsRNA größer als 30 bp beschrieben (Lengyel, 1987). Aus diesem Grund verwendet man zur Umgehung dieser Antworten für die RNAi Technologie zum spezifischen knockdown eines Zielgens dsRNA, die 21 bis 23 nt lang ist (Elbashir, Lendeckel, and Tuschl, 2001). Die PKR kann zwar bereits durch dsRNA von 11 bp Länge aktiviert werden, allerdings sind für die volle Aktivierung 30 bp nötig (Manche et al., 1992; Nanduri et al., 1998). Eine andere Arbeit zeigt, dass die Induktion einer Interferonantwort durch dsRNA vom Zelltyp und der Duplexlänge abhängig ist (Reynolds et al., 2006). Vergleicht man Genexpressionsprofile zwischen transfizierten und unbehandelten Zellen, ist eine drastische Hochregulation von Interferonantwort assoziierten Genen, zu denen die dsRNA abhängige PKR sowie 2'-5' Oligoadenylatsynthetase 2 gehören, als Antwort auf Expression der exogenen dsRNA zu beobachten. Diese Ergebnisse sprechen für die Aktivierung einer nichtspezifischen Interferonantwort durch die in dieser Arbeit verwendete dsRNA. Allerdings weisen einige Ergebnisse auf einen alternativen Signalweg im Gegensatz zum Translationsstop hin. Zum einen konnte mittels live cell Imaging Mikroskopie ein morphologischer Wachstumsarrest während der Mitose beobachtet werden und zum anderen konnte keine Phosphorylierung von eIF2α nachgewiesen werden (Helmbold, unpublizierte Daten). Durch die Resultate dieser Arbeit kann postuliert werden, dass in MethA Zellen die Expression der exogenen dsRNA von 21-23 bp Länge zur Induktion der dsRNA abhängigen PKR, der OAS2 sowie zahlreichen Interferonantwort assoziierten Genen führt und diese Aktivierung vermutlich einen Wachstumsarrest mit anschließendem Zelltod verursacht. Diese Daten werden durch die Arbeit von Sledz und Mitarbeitern unterstützt, die ebenfalls zeigen konnten, dass das Interferonsystem durch siRNAs in mutp53 Diskussion 93 exprimierenden T98G Glioblastomzellen aktiviert wird (Sledz et al., 2003). Weitere Gruppen konnten beobachten, dass siRNAs oder shRNAs eine Interferonantwort auslösen (Bridge et al., 2003; Jackson et al., 2003; Kariko et al., 2004; Persengiev, Zhu, and Green, 2004; Zhang et al., 2006). Semizarov und Mitarbeiter haben beschrieben, dass erst nach Optimierung des siRNA Designs und der Transfektion die Expressionssignaturen von verschiedenen siRNAs gegen ein Zielgen gleich waren und sich von den Signaturen von siRNAs gegen ein anderes Zielgen unterschieden (Semizarov et al., 2003). Es ist außerdem bekannt, dass sich viele Tumorzelllinien, die für shRNA Experimente verwendet werden, durch einen defekten Interferonsignalweg auszeichnen (Stojdl et al., 2000). Dies könnte ein Grund sein, warum in der Mehrheit der RNAi Experimente eine solche Interferonantwort nicht in der Literatur beschrieben wird. Durch weitere Versuche unserer Arbeitsgruppe konnte mittels TUNEL Test (TdT-mediated dUTP nick end labeling), welcher zur Detektion von fragmentierter DNA verwendet wird, und Nachweis der Prozessierung von Caspase 3 durch Immunblot, Zellabsterben durch Apoptose infolge der Transfektion mit in in vitro synthetisierten dsRNA transfizierten Zellen beobachtet werden (Helmbold, unpublizierte Daten). Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass nur dsRNA, welche z.B. durch die Expression von shRNA mittels Vektoren oder in vitro Transkription generiert werden, die Aktivierung der PKR auslöst, während chemisch synthetisierte und über PAGE aufgereinigte 21-23bp siRNAs diesen Effekt nicht zeigten (Helmbold, unpublizierte Daten). Dies impliziert, dass die Aktivierung der PKR nicht durch perfekte doppelsträngige RNA <30 bp stattfindet. Möglicherweise entstehen durch Transfektion mit shRNA Expressionsvektoren oder in vitro Transkription längere Intermediate der dsRNA, die nicht effizient genug prozessiert werden und zur Aktivierung der PKR führen können. Der Einfluss der dsRNA auf das Wachstum und das Überleben der MethA Zellen unterstreicht die essentielle Bedeutung der Kontroll dsRNA (scr shRNA) für den Versuch und die Interpretation der Daten. Es ist aufgrund dieser Ergebnisse ratsam, die Expression von klassischen Interferon induzierten Genen wie PKR und 2'-5' Oligoadenylatsynthetase 2 bei Verwendung der RNAi Technologie zu überprüfen. 5.2 Der knockdown von mutp53 potenziert die durch dsRNA-vermittelten Effekte Der knockdown von mutp53 in MethA Zellen potenziert die durch dsRNA induzierten Wachstumshemmenden Effekte. Bei einer transienten Transfektion von MethA Zellen mit shp53 konnte 12 und 24 h nach Transfektion noch ein reduzierter mutp53 Spiegel beobachtet werden. Dies bestätigt die Potenz der ausgewählten shp53 RNA und die erfolgreiche Expression und Prozessierung dieser RNA in MethA Zellen. Doch schon in einem Zeitraum von 20 bis 40 h nach der Transfektion von MethA Zellen mit pSUPshp53 kann man im Vergleich zu pSUPscr transfizierten Zellen ein verlangsamtes Wachstum erkennen, wie durch die live cell imaging Mikroskopie zu beobachten ist. Gleiche Ergebnisse wurden durch Messen der metabolischen Aktivität sowie der Zellanzahl mittels Diskussion 94 Kristallviolettfärbung von transfizierten MethA Zellen erhalten (Daten nicht gezeigt). Diese Beobachtung erklärt den erfolglosen Versuch einer stabilen Reduktion des mutp53 Spiegels mittels RNAi Technologie und wird zusätzlich durch publizierte Daten bestätigt (Shohat et al., 1987; Yamauchi, Kobayashi, and Tanaka, 1996). Die Transfektion mit dsRNA <30 bp ruft in MethA Zellen entgegen der vorherrschenden Meinung eine Erhöhung der Konzentration der PKR hervor, die zusammen mit den anderen induzierten Genen zu einer starken Wachstumsreduktion und zum Tod der Zellen führt. Wahrscheinlich ist der PKR abhängige Effekt auf das Wachstum und Überleben von MethA Zellen mutp53 abhängig, da die Transfektion mit den entsprechenden Expressionsvektoren von 10-1 Zellen, die p53 defizient sind, keinen Einfluss auf deren Wachstum haben. In der qRT-PCR ist eine höhere Aktivierung der PKR durch shp53 RNA im Vergleich zu pSUPscr transfizierten Zellen festzustellen. Sowohl mutp53 als auch PKR binden dsRNA und kompetitieren vermutlich in der Bindung. Ein höherer mutp53 Spiegel kann möglicherweise die Aktivierung der PKR durch dsRNA partiell kompensieren. Aufgrund der Ergebnisse der RNA- und Protein-KoImmunpräzipitation kann eine Involvierung von mutp53 in den RNA Metabolismus und Bindung an regulatorische RNAs postuliert werden. Demnach könnte der Effekt von mutp53 auf das Wachstum dadurch erklärt werden, dass mutp53 in MethA Zellen auf der RNA Ebene ein Gleichgewicht an regulatorischen RNAs hält, welches ein schnelles aber kontrolliertes Wachstum durch posttranskriptionelle Regulation der Genexpression bedingt. Das Gleichgewicht wird durch die Expression von exogener dsRNA, die ebenfalls von mutp53 gebunden wird, empfindlich gestört. In Tumorzellen muss generell das Wachstum der Zellen kontrolliert werden. Je weniger mutp53 in MethA Zellen vorhanden ist, desto weniger kann die durch die Expression von exogener dsRNA hervorgerufene Dysbalance kompensiert werden. Diese Ergebnisse sprechen für die Existenz von mutp53 Spezies, die die Tumorgenese nicht nur durch den Verlust der Tumorsuppressoraktivität von wtp53, sondern durch einen Zugewinn an Funktionen aktiv unterstützen. Im speziellen sind die in MethA Zellen exprimierten mutp53 Spezies für die Regulation des Wachstums der Zellen verantwortlich. Um den molekularen Mechanismus der Funktion von mutp53 zu entschlüsseln, wurden daher mehrere komplementäre Techniken im Rahmen dieser Arbeit angewendet. 5.3 Übergeordnete Funktion von mutp53 in der Regulation der Genexpression Transkriptionsfaktoren können zum einen durch direkte Bindung an Promotoren die Expression von Genen regulieren. Auf der anderen Seite können sie auch indirekt Einfluss auf die Genexpression nehmen, indem sie durch Änderungen der Chromatinstruktur die Voraussetzungen für die Transkription bestimmter Gene schaffen. Um Anhaltspunkte für den Wirkungsmechanismus von mutp53 zu erhalten, wurde die ChIP-Seq Technik verwendet, die eine Identifikation von potentiellen mutp53 Bindungsstellen ermöglicht. Diskussion 95 5.3.1 Genomische Verteilung und Sequenzkomposition der mutp53-Bindungsorte Die molekulare Basis für eine DNA Bindung durch mutp53 ist noch unzureichend geklärt und es konnte bislang kein Konsensussequenzmotiv für mutp53 identifiziert werden. Im Gegensatz zu wtp53 haben die meisten mutp53 Proteine die Kapazität, sequenzspezifisch an DNA zu binden, verloren, können jedoch die Transkription von einigen Genen aktivieren oder reprimieren. Unsere Gruppe konnte zeigen, dass verschiedene mutp53 Proteine spezifisch und selektiv nichtlineare DNA aufgrund deren Konformation und daher in strukturspezifischer Weise binden (Gohler et al., 2005; Kim and Deppert, 2004). Diese Strukturselektivität von mutp53 aus MethA Zellen bildet die Basis für die spezifische und hochaffine Interaktion mit MAR/SAR regulatorischen DNA Elementen. Diese können durch ihre AT reiche Sequenz und ihre Entwindungsmotive ähnlich zur Sequenz AATATATTT sehr flexible DNA-Strukturen ausbilden und können strukturelle Veränderungen von Chromatin, wie z.B. regionales Entpaaren von Basen auslösen (Berezney, 1991; Bode et al., 1992; Gasser and Laemmli, 1987; Herbomel, 1990; Jenuwein et al., 1997; Kohwi-Shigematsu and Kohwi, 1990; Mielke et al., 1990). MAR/SARs sind 400 bp bis einige kb groß und an den Grenzen von transkriptionellen Einheiten und in der Nähe von enhancer-ähnlichen Regionen lokalisiert. Durch ihre Eigenschaften sind diese Elemente an der übergeordneten Regulation der Transkription durch Ausbildung von Chromatin-Schleifen involviert (Bode et al., 2000; Heng et al., 2004). Die Genregulation durch MAR/SAR transkriptionsmodulierende Elemente ist durch den Einfluss auf die Expression von mehreren Genen charakterisiert (Alvarez et al., 2000; Dobreva, Dambacher, and Grosschedl, 2003). Durch die in vitro und in vivo Bindung von MethA mutp53 an MAR/SAR Elemente und die enge Assoziation mit der nukleären Matrix durch Protein-Protein Interaktionen wurde für mutp53 eine Funktion in der übergeordneten Modulation der Genexpression postuliert (Müller et al., 1996; Koga und Deppert, 2000; Steinmeyer et al., 1990; Weißker et al., 1992; Will et al., 1998; Will et al., 1998). Aus unserer Gruppe geht außerdem aus verschiedenen Experimenten hervor, dass durch die Bindung von mutp53 an bestimmte Genomloci die Expression von mehreren Genen in einem Gencluster reguliert wird. Durch diese Ergebnisse wird ein Modell unterstützt, in dem mutp53 an repetitive DNA-Bereiche mit struktureller Flexibilität bindet, welches zur Umstrukturierung von Chromatin führt, entweder durch diese Bindung oder das Rekrutieren von anderen Faktoren. Um die Daten der in vitro Bindungsstudien zu verifizieren bzw. die Bindungsorte von mutp53 im Genom der MethA Zellen zu identifizieren, wurde im Rahmen dieser Arbeit die ChIP-Seq Technik eingesetzt. Durch diese Technik wurden 164 potentielle mutp53 DNA Bindungsstellen sequenziert. Aufgrund der Tatsache, dass die Behandlung der Zellen mit Formaldehyd zur Vernetzung von mit DNA assoziierten Multiprotein-Komplexen führt, kann man nicht unterscheiden, ob mutp53 direkt oder indirekt durch ein anderes DNA-bindendes Protein an die DNA gebunden war. Wenn man jedoch Diskussion 96 davon ausgeht, dass die Mehrheit der sequenzierten DNA-Fragmente spezifisch über die IP isoliert wurde, was durch Kontroll-Versuch (IP ohne Antikörper) unterstützt wird, kann man annehmen, dass diese DNA Fragmente die Bindungsorte von mutp53-enthaltenden ProteinKomplexen repräsentieren. Obwohl 45% der mutp53-BS in Protein-kodierenden Genen lokalisiert sind, befanden sich nur 6 Bindungsorte innerhalb von 5 kb von der nächsten TSS eines kodierenden Gens. Auffällig ist es jedoch, dass sich 70% dieser Bindungsorte durch einen hohen Anteil an unterschiedlichen Typen von repetitiven Sequenzen auszeichnen. Eine höhere Frequenz (45%) der Bindungsorte in Genen (verglichen mit einer geschätzten 25%igen Genomabdeckung durch Exone und Introne in der Maus; Waterston et al., 2002) sowie Überrepräsentation (20%) der repetitiven SINE-Sequenzen (verglichen mit geschätzten 9% SINE im Mausgenom; (Waterston et al., 2002) weisen auf die Spezifität des ChIPExperimentes hin. Ein häufiges Vorkommen von repetitiven DNA Sequenzen in Bindungsorten scheint eine generelle Eigenschaft von mutp53 zu sein, weil auch mutp53 aus humanen Zelllinien überwiegend an repetitive DNA Orte bindet (Marie Brazdova, Lars Tögel, unpublizierte Daten). Repetitive Sequenzen machen insgesamt zirka 37,5% des Mausgenoms aus (Waterston et al., 2002) und bedingen eine größere strukturelle Flexibilität der DNA, was unter Transkriptions-bedingter superhelikaler Spannung zur Ausbildung einer nicht-B-DNA Konformation führt. Diese DNA-Strukturen stellen eine Basis für die Bindung bzw. die Rekrutierung von regulatorischen Proteinen dar. Aufgrund der Heterochromatisierung können nicht alle repetitiven Sequenzen an der Genregulation teilnehmen und außerdem könnte die Bindung von regulatorischen Proteinen an nicht-B-DNA abhängig vom Chromatin-Kontext sein. Mutp53 könnte demzufolge alleine oder in Kooperation mit anderen nicht-B-DNA Bindungsproteinen die verfügbaren DNA Orte besetzen und übt auf diese Weise die Regulation der Transkription durch Einflüsse auf die globale Chromatinorganisation aus. Dieser Wirkmechanismus könnte eine generelle Eigenschaft von p53 sein, weil auch für wtp53 eine strukturspezifische Bindung von DNA, vor allem an nichtB DNA Strukturen, gezeigt wurde. Außerdem sind die DNA Sequenzen, an die mutp53 bindet, in ihrer biologischen Funktion heterogen und zeichnen sich nicht durch eine Konsensussequenz aus. Des Weiteren zeigt eine Studie von Wei und Kollegen, dass die Verteilung der Bindungsstellen von wtp53 in HCT116 kolorektalen Krebszellen nach 6stündiger Induktion mit 5-FU nicht so promotornah ist, wie man für einen Transkriptionsfaktor erwarten würde (Wei et al., 2006). Unter Anwendung der ChIP-PET Methode wurden von 65.572 ChIP-PET DNA-Fragmenten 542 als wtp53 Bindungsstellen mit hoher Sicherheit identifiziert, da diese mehrfach (bezeichnet als PET-Cluster) gefunden wurden. 474 PETClustern befinden sich in der Nähe von 458 Genen, während 68 aus nicht-kodierenden Orten stammen. Über 73% der mehr als dreimal gefundenen Bindungsstellen enthalten das Diskussion 97 Konsensusmotiv für eine p53 Bindung. 90% der 474 PET-Cluster sind innerhalb von 60 kb der Gene lokalisiert, davon aber nur 156 in Promotorregionen. Korrespondierende Expressionsdaten von mit 5-FU behandelten Zellen mit wt bzw. mutantem p53 zeigten die differentielle Expression von 122 Genen, in deren Nähe eine wtp53 Bindungsstelle detektiert wurde, von denen 65 hoch- und 57 herunterreguliert waren (Kho et al., 2004). Insgesamt waren durch die Behandlung mit 5-FU ~1280 Gene 2-fach differentiell reguliert, während 10% davon eine Bindungsstelle in der Nähe des Gens aufwiesen. Dieses Ergebnis wird durch verschiedene Studien unterstützt, in denen zwar viele infolge transkriptioneller Aktivierung von p53 induzierte Gene identifiziert werden konnten, von denen allerdings nur wenige einen Hinweis auf eine direkte Bindung an Promotorregionen durch p53 liefern (Chen and Sadowski, 2005; el-Deiry et al., 1992; Yin et al., 2003; Yoon et al., 2002). Ob durch die Bindung von mutp53 z.B. an repetitive Sequenzen die Transkription von potentiellen Zielgenen beeinflusst wird, kann durch die ChIP-Seq Methode nicht beurteilt werden. Daher wurden die Genexpressionsprofile von mit pSUPscr und pSUPshp53 Vektoren transfizierten MethA Zellen verglichen. Dafür ist es notwendig, die Expression von mutp53 auszuschalten oder zumindest signifikant zu reduzieren, um die Folgen dieser Reduktion studieren zu können. 5.3.2 Einfluss von mutp53 auf die Genexpression Um den Einfluss von mutp53 auf die Genexpression in MethA Zellen zu untersuchen, wurden Microarray-Experimente durchgeführt, in denen die Genexpressionsprofile von Kontrollzellen bzw. Zellen transfiziert mit pSUPscr und pSUPshp53 Vektoren verglichen wurde. Durch Verwendung strikter Filterungskriterien in dem Vergleich der Genexpressionsprofile von transfizierten Zellen untereinander wurde eine differentielle Expression in einer geringen Anzahl der Gene beobachtet, unter denen nur 3 Gene mit einer mutp53-Bindungsstelle sind. Ein sehr wichtiges Ergebnis dieser Studie ist jedoch ein massiver Effekt der doppelsträngigen shRNA auf die Genexpression durch Induktion Interferonantwort-assoziierter Signalwege. Dies macht auf der einen Seite eine Aussage über den mutp53 vermittelten Effekt auf die Transkription durch die RNAi Technik zumindest in dieser Zelllinie unmöglich, aber auf der anderen Seite stellt sich die Frage über eine mögliche Beteiligung von mutp53 an den dsRNA-vermittelten Prozessen auf der Ebene der transkriptionellen Regulation. Diese Frage scheint berechtigt zu sein, weil in p53-defizienten Zellen (10-1 Zelllinie) kein toxischer Effekt der Transfektion mit pSUPscr und pSUPshp53 Vektoren beobachtet wurde. Eine weitere Komplikation des Versuches, über shRNA Expression mutp53 zu reduzieren, ist die nur 2-fache Reduktion von mutp53 Expression nach Transfektion mit pSUPshp53. Obwohl bei der Auswertung der Microarray-Daten nur geringfügige Unterschiede in der Diskussion 98 Transkriptmenge des Eif2ak2 (PKR) Gens zwischen transfizierten Zellen beobachtet wurde, zeigte dagegen die qPCR-Analyse wesentlich stärkere Eif2ak2 Expression in den Zellen, die mit pSUPshp53 transfiziert wurden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass das Eif2ak2 Gen durch mutp53 reprimiert wird und diese Repression durch mutp53 Reduktion aufgehoben wird. Eine starke Unterstützung dieser Hypothese liefert die ChIP-Seq Analyse. Eines der klonierten mutp53-kopräzipitierten DNA Fragmente (SM3-43; siehe Tabelle 7.1 und Abb. 49) stammt aus dem vierten Intron des Eif2ak2 Genes, und es lässt die Vermutung zu, dass mutp53 in der Tat an der transkriptionellen Regulation dieses Gens beteiligt ist. Es bleibt nun die Frage, warum sich die Ergebnisse der Microarray-Hybridisierung und qPCR unterscheiden. Zu beachten bei der Auswertung der Expressionsdaten ist nämlich die Auswahl der Sequenz der Oligonukleotide, die ein Gen auf einem Microarray repräsentieren. Im Falle des Eif2ak2 Gens liegt die Sequenz des Oligonukleotids am Ende des letzen Exon (siehe Abb. 49). Wie aus Abb. 49 ersichtlich, ist die Position des Transkriptionsendes variabel, und unter Umständen werden Transkripte unterschiedlicher Länge generiert, die nicht mit dem Array-Oligonukleotid erfasst werden. Die Sequenzen der qPCR- Oligonukleotide wurden dagegen aus Exonen 14 und 16 gewählt (siehe Abb. 49), um die Transkripte unabhängig von der Länge des 3’UTR detektieren zu können. Aus diesem Grund wäre es sinnvoller bei dem Design der Oligonukleotid-basierenden Microarrays alle Exonen abzudecken, damit ein vollständiges Profil der Transkription erstellt werden kann. Abbildung 49 Nukleotidspositionen der mutp53-BS (SM3-43), qPCR Oligonukleotide (mEif2ak2Q3/Q4) und Agilent Microarray Oligonukleotid A_52_P559919 im Eif2ak2 Gen 5.3.3 Bindung von mutp53 an regulatorische Transkripte Aufgrund unzureichender Beweise für eine direkte Beteiligung von mutp53 an der Regulation der Transkription im Sinne eines Transkriptionsfaktors, wurde eine RNA Immunpräzipitation mit anti-p53 Antikörper durchgeführt. Für die Möglichkeit, dass RNA in die Aktivität von mutp53 involviert sein kann, spricht auch die Tatsache, dass p53 mit einer höheren Affinität an RNA bindet als an DNA (Oberosler et al., 1993). Mithilfe der RNA Immunpräzipitation wurde die Sequenz von 86 mutp53 kopräzipitierten Transkripten ermittelt. Von diesen sind Diskussion 99 29 B2/B1 SINE Transkripte, die mit tRNA verwandt sind und von der RNA Polymerase III in der Zelle als kurze nichttranslatierte RNA generiert werden. SINEs sind im Genom weit verbreitet und kommen vor allem in Regionen hoher Gendichte vor, dabei findet man sie oft innerhalb von Intronen oder in flankierenden Regionen von Genen. Mehr als 95% aller Gene sind mit SINEs assoziiert. SINE B2 Elemente können in entgegengesetzte Richtungen durch Pol II und Pol III Promotoren transkribiert werden (Allen et al., 2004; Ferrigno et al., 2001). Laut neuesten Studien lassen sich SINEs als wichtige Regulatoren der Genexpression klassifizieren. Die Repression Pol II regulierter Gene wurde nach Hitzeschock mit der erhöhten Transkription der B2 SINEs korreliert (Allen et al., 2004), und es gelang Espinoza und Mitarbeitern zu zeigen, dass B2 SINE RNA direkt an RNA Pol II bindet und die Transkriptsynthese reprimiert (Espinoza et al., 2004). B2 SINE RNA bindet mit hoher Affinität, Spezifität und kinetischer Stabilität an den Pol II Kern und wird dadurch in den Präinitiationskomplex an Promotoren inkorporiert. Eine weitere Studie zeigte, dass die gewebsspezifische Transkription eines SINEs im murinen Wachstumshormon Locus (GH) für dessen Aktivierung benötigt wird und eine Restrukturierung des regulierten Lokus in nukleäre Kompartimente ermöglicht (Lunyak et al., 2007). SINE Kopien sind in größerer Anzahl in der Nähe von deregulierten Genen in Tumoren vorhanden und beeinflussen deren Expression (Lerat and Semon, 2007). Je mehr SINE Elemente in der Nähe eines Gens gefunden wurden, desto mehr waren diese Gene in ihrer Expression in Tumorgewebe dereguliert. Unter diesem Aspekt könnte man sich vorstellen, dass die Bindung von mutp53 an SINEreiche DNA Orte und die Interaktion mit SINE RNA entscheidend für die Proliferation der Tumorzellen sein könnte. Die bisherigen Ergebnisse deuten auf eine Rolle der durch SINE Elementen kodierten B2 RNA als transkriptionelle Repressoren, z.B. bei Hitzeschock oder anderen Stressbedingungen, oder Aktivatoren hin. Eine weitere überrepräsentierte Gruppe von mutp53 kopräzipitierter RNA waren 3' UTR Transkripte. Diese Transkripte scheinen kein Artefakt der Klonierungsmethode zu sein, sondern man geht davon aus, dass im Mausgenom für die Mehrheit der Gene zusätzlich zum Volllängen-Transkript auch ein 3' UTR Transkript bzw. ein alternativ gespleisstes Transkript existiert (Gustincich et al., 2006). Die Bedeutung der 3' UTR Transkripte ist noch nicht komplett geklärt; ihre Beteiligung an der Regulation von RNA Prozessierung, Abbau und Lokalisierung von RNA wird vermutet. Untranslatierte Regionen (UTR untranslated regions) spielen im Allgemeinen eine wichtige Rolle in der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression durch Einfluss auf die Effizienz der Translation, auf ihre subzelluläre Lokalisation und die mRNA Stabilität (Gray and Wickens, 1998; Mignone et al., 2002). Kürzlich konnte eine Gruppe zeigen, dass p53 spezifisch an den 3' UTR der Urokinase Rezeptor mRNA bindet und durch diese Bindung diese RNA destabilisiert (Shetty et al., 2007). Aufgrund der Anreicherung von Diskussion 100 nichtkodierenden Transkripten in Komplexen mit mutp53 kann postuliert werden, dass mutp53 vorwiegend durch posttranskriptionelle Regulation mittels strukturspezifischer Bindung an regulatorische RNAs Einfluss auf das Wachstum von MethA Zellen nimmt. 5.3.4 Die Integration der ChIP und RIP Daten deuten auf eine Beteiligung von mutp53 an der Ausbildung von transcription/processing factories hin Die genomische Verteilung der mutp53 Bindungsstellen und der kodierenden Regionen der mutp53 gebundenen Transkripte lässt deutlich eine Anreicherung an bestimmten genomischen Loci (Cluster) erkennen. Diese Entdeckung stützt das Modell der transcription/processing factories der Genexpression (Bartlett et al., 2006; Faro-Trindade and Cook, 2006). Mutp53 könnte demnach eine Komponente der Ausbildung von Transkriptionsund simultanen Prozessierungseinheiten (transcription/processing factories) darstellen. Nach diesem Modell der Organisation von Chromatin im Zellkern geprägt von Peter Cook sind euchromatische Chromatinschleifen (euchromatic loops) um eine solche Transkriptions- und Prozessierungseinheit mit Anhäufung von RNA Polymerasen gewunden, welches eine simultane Transkription mehrerer Gene sowie deren Prozessierung (5' Capping, Spleißen, Polyadenylierung und Korrekturlesen) ermöglicht (Abb. 50). Abbildung 50 Modell der Organisation von Chromatin im Nukleus und der Genexpression durch transcription/processing factories nach Peter Cook, Oxford University. Danach sind euchromatische Schleifen um Transkriptions- und simultane Prozessierungseinheiten (rosa Kugel) gewunden. Transkriptionsfaktoren sind in diesem Modell in rot dargestellt. Diskussion 101 Dieses Clustern oder Kompartimentieren von (Transkriptions-) faktoren und RNA Polymerasen in einer „Fabrik“ ermöglicht eine effiziente Interaktion durch hohe lokale Konzentrationen. Während der Interphase sind eukaryotische Chromosomen alle 5 bis 200 kb in topologisch abhängigen Schleifen, die von MAR/SAR Regionen organisiert werden, gewunden. Dieses Modell ist im Einklang mit der Beobachtung, dass eine größere Menge an Transkriptionsfaktoren die Expression eines Gens veranlassen, da mehrere Bindungsstellen in Kooperation durch den Transkriptionsfaktor gebunden sein müssen. Die Assoziation von mutp53 mit solchen Fabriken wird durch Analyse der mutp53 kopräzipitierten Proteine unterstützt. 5.3.5 RNA bindende Proteine bilden RNA-stabilisierte Komplexe mit mutp53 Die durch die Protein-co-IP identifizierten Komponenten von mutp53-haltigen Komplexen weisen auf eine Rolle in der posttranskriptionellen Regulation von RNA hin. Die in dieser Arbeit angewendete Methode zur Proteinidentifikation ist allerdings limitiert, da aufgrund der Sensitivität des Massenspektrometers lediglich in größeren Mengen vorhandene Proteine identifiziert werden konnten und außerdem nur Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 10 und 150 kDa sowie pI Wert von 3-10 analysiert wurden. Darüber hinaus müssen die identifizierbaren Proteine in den jeweils verwendeten Puffern löslich sein. Auch die Extraktion von Proteinen durch den verwendeten Lysepuffer ist eingeschränkt. Demnach sind die beschriebenen Ergebnisse unvollständig. Dennoch lieferten die Experimente erste Hinweise auf die Funktion von mutp53 in MethA Zellen vor allem durch Interaktion mit RNA bindenden Proteinen und tragen somit zum Verständnis der mutp53 Funktion bei. Die potentielle Interaktion von mutp53 mit hsc70 (hspa1), YB1, hnRNP A/B und hnRNP D konnte mit einer weiteren unabhängigen Methode, der Kolokalisationsanalyse bestätigt werden. Fibrogranuläre RNP Strukturen sind an intranukleäre, nicht-Chromatin Strukturen, der nukleären Matrix, angeheftet. Es ist bekannt, dass RNP Partikel erst durch Verdau mit Ribonukleasen freigesetzt werden, da sie Teil einer Struktur, der nukleären Matrix, sind und nicht durch die Permeabilisierung des Kernmembran oder leichte Homogenisierung freigesetzt werden. HnRNP Proteine sind in großen Mengen in der Zelle vorhandene Proteine mit vielfältigen Aufgaben mit zentraler Rolle im RNA Metabolismus. Sie sind in das Verpacken entstehender hnRNA, dem alternativen RNA Spleißen, dem mRNA Export vom Nukleus und dem Transfer im Zytoplasma, der Stabilität und Translation involviert (Dreyfuss, Kim, and Kataoka, 2002; Krecic and Swanson, 1999; Shyu and Wilkinson, 2000; Weighardt, Biamonti, and Riva, 1996). Sie spielen außerdem eine Rolle in der Aufrechterhaltung der Telomere und regulieren die Genexpression auf transkriptioneller und translationaler Ebene. Es sind mehr als 20 hnRNP Proteine bekannt, von denen viele RNA Erkennungsmotive (RRM RNA recognition motifs) enthalten. Die Immunpräzipitation sowie Kolokalisation lieferten beide Hinweise auf eine Interaktion der genannten Proteine. Eine Diskussion 102 Nukleasebehandlung zeigte außerdem, dass Multiprotein-Komplexe vorliegen, die RNA abhängig gebildet wurden. Zusammengefasst kann postuliert werden, dass mutp53 durch Interaktion mit RNA bindenden Proteinen und regulatorischen RNAs eine übergeordnete Funktion in der Regulation der Genexpression trägt und dadurch Einfluss auf das Wachstum von MethA Zellen nimmt. Durch Expression exogener dsRNA findet vermutlich eine Kompetition von exogenen und endogenen RNAs um die Bindung an mutp53 statt, die das Gleichgewicht stören. Die Bindung von endogener sowie exogener RNA an mutp53 findet höchstwahrscheinlich in strukturspezifischer Weise statt. 5.4 Mögliche Beteiligung von mutp53 am Spindelkontrollpunkt der Mitose In den letzten Kapiteln wurde eingehend diskutiert, dass aus den Ergebnissen der Untersuchung der mutp53 Funktion eine Beteiligung an einer globalen transkriptionellen und posttranskriptionellen Regulation der Genexpression hervorgeht. Doch wie wirkt sich diese übergeordnete Funktion in der Genexpression konkret auf das Verhalten der MethA Zellen aus? Aus mehreren unabhängigen Experimenten wurden Hinweise auf eine Beteiligung von mutp53 an einem Arrest in der Mitose gesammelt. Wichtigster Indikator für einen mutp53 abhängigen mitotischen Arrest nach Transfektion mit exogener dsRNA war die Beobachtung der Morphologie der MethA Zellen durch die live cell imaging Mikroskopie nach Transfektion mit verschiedenen DNA-Konstrukten. Differentiell reguliert und interessant im Hinblick auf einen gain-of-function Effekt, der eine erhöhte Wachstumsrate bedingt, ist das Dync1h1 Gen, welches für zytoplasmatisches Dynein kodiert. Das Gen für die schwere Kette des zytoplasmatischen Dyneinkomplexes ist in drei von vier angefertigten Genexpressionsanalysen nach Reduktion von mutp53 differentiell reguliert und wurde außerdem in verschiedenen Zelllinien nach Screening von RNAi Bibliotheken auf reduziertes Wachstum als eines der neun essentiellen Gene für das Zellwachstum identifiziert (Harborth et al., 2001). Die Reduktion von Dync1h1 durch die RNAi Technologie korrelierte mit einem aberranten mitotischen Arrest. Zytoplasmatisches Dynein ist in das Ausschalten des Kontrollpunktes der Spindelanordnung (Spindle Assembly Checkpoints; SAC) involviert, indem es die Kontrollpunktproteine Mad2 und den RZZ Komplex von ausgerichteten Kinetochoren entfernt und ein Fortschreiten von der Metaphase in die Anaphase einleitet (Dotiwala et al., 2007; Griffis, Stuurman, and Vale, 2007; Yang et al., 2007). Die differentielle Regulation von Dync1h1 konnte durch qRT-PCR bestätigt werden. Der Verlust des mitotischen Spindelkontrollpunktes ist mit chromosomaler Instabilität in frühen Stadien der Entwicklung von Fibrosarkomen assoziiert. Eine Störung des Spindelkontrollpunktes durch einige mutante p53 Proteine wurde bereits als gain-of-function Effekt beschrieben (Gualberto et al., 1998). Durch die ChIP-Seq Technologie wurde außerdem eine Bindungsstelle von mutp53 in der Nähe des Dynlt3 Gens, welches für eine leichte Kette des zytoplasmatischen Diskussion 103 Dyneinkomplexes kodiert, gefunden und dieses ebenfalls in mindestens einem der vier Microarray Experimente differentiell reguliert. Diese leichte Kette verbindet zytoplasmatisches Dynein mit dem Spindelkontrollprotein Bub3 (budding uninhibited by benzimidazoles 3) (Lo, Kogoy, and Pfister, 2007). Die leichte Kette von zytoplasmatischen Dynein hat zudem eine Rolle außerhalb des Dynein Komplexes. Nukleäres Dynlt3 bindet an den Transkriptionsfaktor Satb1 an Strukturen der nukleären Matrix. Durch diese Interaktion ist Dynlt3 in die durch Satb1 vermittelte Repression des proapoptotischen Gens Bcl2 involviert (Yeh, Chuang, and Sung, 2005). In beiden Genexpressionsanalysen 24 h nach Transfektion wurde zusätzlich die Untereinheit Cdc23 des APC Komplexes (Anaphase promoting complex) als herrunterreguliert nach knockdown von mutp53 gefunden. Der hochkonservierte APC Komplex stellt eine E3 Ubiquitinligase dar, die Cyclin B durch Katalyse der Bildung von Cyclin B-Ubiquitin Konjugaten zur Degradation markiert. Cdc23 ist außerdem notwendig für die Phosphorylierung von Mcm (Minichromosome maintenance) durch die Dfp1-HSK1 Kinase. Veränderungen in Cdc23 werden in Kolonkarzinomen gefunden. Weitere Hinweise auf eine Beteiligung von mutp53 am Spindelkontrollpunkt konnten durch die Entdeckung der 24h nach Transfektion differentiell regulierten Genen wie Rap1gap, Csnk1δ und Ajuba gefunden werden. Außerdem wurden unter den mutp53 gebundenen Transkripten das 3‘ UTR Transkript von Dynll1 durch die RNA-IP identifiziert, welches für eine leichte Untereinheit des zytoplasmatischen Dyneinkomplexes kodiert. Des Weiteren wurden die 3‘ UTR der Anapc11 und Mad2l1bp Transkripte durch die RNA-IP gefunden, welche ebenfalls in den Spindelkontrollpunkt der Mitose involviert sind. Dabei stellt Anapc11 eine essentielle Untereinheit des APC Komplexes dar, während das Mad2 Bindeprotein den Spindelkontrollpunkt durch Inaktivierung von Mad2 inaktiviert und ein Fortschreiten in die Mitose ermöglicht. Das Protein Tpx2, dessen 3‘ UTR Transkript ebenfalls durch die RNA-IP in Assoziation mit mutp53 gefunden wurde, wird strikt durch den APC Komplex kontrolliert und aktiviert die Aurora A Kinase, die in vielen Tumoren überexprimiert ist, da sie eine wichtige Rolle in der Mitose spielt. Durch die Protein-co-IP konnte ferner die potentielle Interaktion von mutp53 mit den Proteinen Mcm9 sowie LOC68045, einem neuen mitotischen Spindel assoziiertem Protein identifiziert werden. Zusammenfassend wurden aus verschiedenen unabhängigen Analysen erste Hinweise auf das mutp53-abhängige Ausschalten des Spindelkontrollpunktes durch mehrere Untereinheiten des zyto- plasmatisches Dyneinkomplexes sowie Proteine, die Untereinheiten des APC bilden während der Mitose gesammelt. Ob der positive Effekt von mutp53 in MethA Zellen tatsächlich auf ein Fortschreiten der Metaphase zur Anaphase während der Mitose zurückzuführen ist, muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Literatur 104 6 LITERATUR Agapova, L. S., Ilyinskaya, G. V., Turovets, N. A., Ivanov, A. V., Chumakov, P. M., and Kopnin, B. P. (1996). Chromosome changes caused by alterations of p53 expression. Mutat Res 354(1), 129-38. Ahn, J., and Prives, C. (2001). The C-terminus of p53: the more you learn the less you know. Nat Struct Biol 8(9), 730-2. Akyuz, N., Boehden, G. S., Susse, S., Rimek, A., Preuss, U., Scheidtmann, K. H., and Wiesmuller, L. (2002). DNA substrate dependence of p53-mediated regulation of double-strand break repair. Mol Cell Biol 22(17), 6306-17. Albrechtsen, N., Dornreiter, I., Grosse, F., Kim, E., Wiesmuller, L., and Deppert, W. (1999). Maintenance of genomic integrity by p53: complementary roles for activated and non-activated p53. Oncogene 18(53), 7706-17. Allen, T. A., Von Kaenel, S., Goodrich, J. A., and Kugel, J. F. (2004). The SINE-encoded mouse B2 RNA represses mRNA transcription in response to heat shock. Nat Struct Mol Biol 11(9), 81621. Alvarez, J. D., Yasui, D. H., Niida, H., Joh, T., Loh, D. Y., and Kohwi-Shigematsu, T. (2000). The MAR-binding protein SATB1 orchestrates temporal and spatial expression of multiple genes during T-cell development. Genes Dev 14(5), 521-35. Arai, N., Nomura, D., Yokota, K., Wolf, D., Brill, E., Shohat, O., and Rotter, V. (1986). Immunologically distinct p53 molecules generated by alternative splicing. Mol Cell Biol 6(9), 3232-9. Asschert, J. G., Vellenga, E., Hollema, H., van der Zee, A. G., and de Vries, E. G. (1997). Expression of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), interleukin-6, (IL-6), interleukin-1 beta (IL-1 beta), interleukin-11 (IL-11) and tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) in p53characterised human ovarian carcinomas. Eur J Cancer 33(13), 2246-51. Bakalkin, G., Selivanova, G., Yakovleva, T., Kiseleva, E., Kashuba, E., Magnusson, K. P., Szekely, L., Klein, G., Terenius, L., and Wiman, K. G. (1995). p53 binds single-stranded DNA ends through the C-terminal domain and internal DNA segments via the middle domain. Nucleic Acids Res 23(3), 362-9. Baker, S. J., Preisinger, A. C., Jessup, J. M., Paraskeva, C., Markowitz, S., Willson, J. K., Hamilton, S., and Vogelstein, B. (1990). p53 gene mutations occur in combination with 17p allelic deletions as late events in colorectal tumorigenesis. Cancer Res 50(23), 7717-22. Bakheet, T., Frevel, M., Williams, B. R., Greer, W., and Khabar, K. S. (2001). ARED: human AU-rich element-containing mRNA database reveals an unexpectedly diverse functional repertoire of encoded proteins. Nucleic Acids Res 29(1), 246-54. Banin, S., Moyal, L., Shieh, S., Taya, Y., Anderson, C. W., Chessa, L., Smorodinsky, N. I., Prives, C., Reiss, Y., Shiloh, Y., and Ziv, Y. (1998). Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science 281(5383), 1674-7. Barber, G. N., Jagus, R., Meurs, E. F., Hovanessian, A. G., and Katze, M. G. (1995). Molecular mechanisms responsible for malignant transformation by regulatory and catalytic domain variants of the interferon-induced enzyme RNA-dependent protein kinase. J Biol Chem 270(29), 17423-8. Barreau, C., Watrin, T., Beverley Osborne, H., and Paillard, L. (2006). Protein expression is increased by a class III AU-rich element and tethered CUG-BP1. Biochem Biophys Res Commun 347(3), 723-30. Bartek, J., Falck, J., and Lukas, J. (2001). CHK2 kinase--a busy messenger. Nat Rev Mol Cell Biol 2(12), 877-86. Bartlett, J., Blagojevic, J., Carter, D., Eskiw, C., Fromaget, M., Job, C., Shamsher, M., Trindade, I. F., Xu, M., and Cook, P. R. (2006). Specialized transcription factories. Biochem Soc Symp(73), 67-75. Bates, S., Phillips, A. C., Clark, P. A., Stott, F., Peters, G., Ludwig, R. L., and Vousden, K. H. (1998). p14ARF links the tumour suppressors RB and p53. Nature 395(6698), 124-5. Bell, D. W., Varley, J. M., Szydlo, T. E., Kang, D. H., Wahrer, D. C., Shannon, K. E., Lubratovich, M., Verselis, S. J., Isselbacher, K. J., Fraumeni, J. F., Birch, J. M., Li, F. P., Garber, J. E., and Haber, D. A. (1999). Heterozygous germ line hCHK2 mutations in Li-Fraumeni syndrome. Science 286(5449), 2528-31. Berezney, R. (1991). The nuclear matrix: a heuristic model for investigating genomic organization and function in the cell nucleus. J Cell Biochem 47(2), 109-23. Literatur 105 Beroud, C., and Soussi, T. (1998). p53 gene mutation: software and database. Nucleic Acids Res 26(1), 200-4. Bienz, B., Zakut-Houri, R., Givol, D., and Oren, M. (1984). Analysis of the gene coding for the murine cellular tumour antigen p53. Embo J 3(9), 2179-83. Bishop, J. M. (1991). Molecular themes in oncogenesis. Cell 64(2), 235-48. Blandino, G., Levine, A. J., and Oren, M. (1999). Mutant p53 gain of function: differential effects of different p53 mutants on resistance of cultured cells to chemotherapy. Oncogene 18(2), 47785. Bode, J., Benham, C., Knopp, A., and Mielke, C. (2000). Transcriptional augmentation: modulation of gene expression by scaffold/matrix-attached regions (S/MAR elements). Crit Rev Eukaryot Gene Expr 10(1), 73-90. Bode, J., Kohwi, Y., Dickinson, L., Joh, T., Klehr, D., Mielke, C., and Kohwi-Shigematsu, T. (1992). Biological significance of unwinding capability of nuclear matrix-associating DNAs. Science 255(5041), 195-7. Bode, J., Schlake, T., Rios-Ramirez, M., Mielke, C., Stengert, M., Kay, V., and Klehr-Wirth, D. (1995). Scaffold/matrix-attached regions: structural properties creating transcriptionally active loci. Int Rev Cytol 162A, 389-454. Bode, J., Stengert-Iber, M., Kay, V., Schlake, T., and Dietz-Pfeilstetter, A. (1996). Scaffold/matrixattached regions: topological switches with multiple regulatory functions. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 6(2-3), 115-38. Boulikas, T. (1995). Chromatin domains and prediction of MAR sequences. Int Rev Cytol 162A, 279388. Bourdon, J. C. (2007). p53 and its isoforms in cancer. Br J Cancer 97(3), 277-82. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72, 248-54. Branch, A. D. (1998). A good antisense molecule is hard to find. Trends Biochem Sci 23(2), 45-50. Brazma, A., and Vilo, J. (2001). Gene expression data analysis. Microbes Infect 3(10), 823-9. Bridge, A. J., Pebernard, S., Ducraux, A., Nicoulaz, A. L., and Iggo, R. (2003). Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat Genet 34(3), 263-4. Brown, P. O., and Botstein, D. (1999). Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nat Genet 21(1 Suppl), 33-7. Brugarolas, J., Chandrasekaran, C., Gordon, J. I., Beach, D., Jacks, T., and Hannon, G. J. (1995). Radiation-induced cell cycle arrest compromised by p21 deficiency. Nature 377(6549), 552-7. Brukner, I., and Tremblay, G. A. (2000). Cellular proteins prevent antisense phosphorothioate oligonucleotide (SdT18) to target sense RNA (rA18): development of a new in vitro assay. Biochemistry 39(37), 11463-6. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., and Agami, R. (2002). A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296(5567), 550-3. Bullock, A. N., and Fersht, A. R. (2001). Rescuing the function of mutant p53. Nat Rev Cancer 1(1), 68-76. Bullock, A. N., Henckel, J., DeDecker, B. S., Johnson, C. M., Nikolova, P. V., Proctor, M. R., Lane, D. P., and Fersht, A. R. (1997). Thermodynamic stability of wild-type and mutant p53 core domain. Proc Natl Acad Sci U S A 94(26), 14338-42. Bullock, A. N., Henckel, J., and Fersht, A. R. (2000). Quantitative analysis of residual folding and DNA binding in mutant p53 core domain: definition of mutant states for rescue in cancer therapy. Oncogene 19(10), 1245-56. Buschmann, T., Minamoto, T., Wagle, N., Fuchs, S. Y., Adler, V., Mai, M., and Ronai, Z. (2000). Analysis of JNK, Mdm2 and p14(ARF) contribution to the regulation of mutant p53 stability. J Mol Biol 295(4), 1009-21. Canman, C. E., Lim, D. S., Cimprich, K. A., Taya, Y., Tamai, K., Sakaguchi, K., Appella, E., Kastan, M. B., and Siliciano, J. D. (1998). Activation of the ATM kinase by ionizing radiation and phosphorylation of p53. Science 281(5383), 1677-9. Cardinali, M., Kratochvil, F. J., Ensley, J. F., Robbins, K. C., and Yeudall, W. A. (1997). Functional characterization in vivo of mutant p53 molecules derived from squamous cell carcinomas of the head and neck. Mol Carcinog 18(2), 78-88. Castedo, M., Perfettini, J. L., Roumier, T., Andreau, K., Medema, R., and Kroemer, G. (2004). Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition. Oncogene 23(16), 2825-37. Chan, T. A., Hermeking, H., Lengauer, C., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1999). 14-3-3Sigma is required to prevent mitotic catastrophe after DNA damage. Nature 401(6753), 616-20. Chao, C., Saito, S., Kang, J., Anderson, C. W., Appella, E., and Xu, Y. (2000). p53 transcriptional activity is essential for p53-dependent apoptosis following DNA damage. Embo J 19(18), 4967-75. Literatur 106 Chen, J., and Sadowski, I. (2005). Identification of the mismatch repair genes PMS2 and MLH1 as p53 target genes by using serial analysis of binding elements. Proc Natl Acad Sci U S A 102(13), 4813-8. Chen, Y., Chen, P. L., and Lee, W. H. (1994). Hot-spot p53 mutants interact specifically with two cellular proteins during progression of the cell cycle. Mol Cell Biol 14(10), 6764-72. Chernov, I. P., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., and Sverdlov, E. D. (2002). Identification and mapping of nuclear matrix-attachment regions in a one megabase locus of human chromosome 19q13.12: long-range correlation of S/MARs and gene positions. J Cell Biochem 84(3), 590600. Chicas, A., Molina, P., and Bargonetti, J. (2000). Mutant p53 forms a complex with Sp1 on HIV-LTR DNA. Biochem Biophys Res Commun 279(2), 383-90. Chipuk, J. E., and Green, D. R. (2006). Dissecting p53-dependent apoptosis. Cell Death Differ 13(6), 994-1002. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., and Pavletich, N. P. (1994). Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science 265(5170), 346-55. Cho, Y. S., Kim, M. K., Cheadle, C., Neary, C., Becker, K. G., and Cho-Chung, Y. S. (2001). Antisense DNAs as multisite genomic modulators identified by DNA microarray. Proc Natl Acad Sci U S A 98(17), 9819-23. Chu, W. M., Ballard, R., Carpick, B. W., Williams, B. R., and Schmid, C. W. (1998). Potential Alu function: regulation of the activity of double-stranded RNA-activated kinase PKR. Mol Cell Biol 18(1), 58-68. Clarijs, R., Schalkwijk, L., Ruiter, D. J., and de Waal, R. M. (2003). EMAP-II expression is associated with macrophage accumulation in primary uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 44(5), 1801-6. Clarke, A. R., Purdie, C. A., Harrison, D. J., Morris, R. G., Bird, C. C., Hooper, M. L., and Wyllie, A. H. (1993). Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways. Nature 362(6423), 849-52. Cook, P. R. (2003). Nongenic transcription, gene regulation and action at a distance. J Cell Sci 116(Pt 22), 4483-91. Counter, C. M., Avilion, A. A., LeFeuvre, C. E., Stewart, N. G., Greider, C. W., Harley, C. B., and Bacchetti, S. (1992). Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo J 11(5), 1921-9. Cross, S. M., Sanchez, C. A., Morgan, C. A., Schimke, M. K., Ramel, S., Idzerda, R. L., Raskind, W. H., and Reid, B. J. (1995). A p53-dependent mouse spindle checkpoint. Science 267(5202), 1353-6. Czosnek, H. H., Bienz, B., Givol, D., Zakut-Houri, R., Pravtcheva, D. D., Ruddle, F. H., and Oren, M. (1984). The gene and the pseudogene for mouse p53 cellular tumor antigen are located on different chromosomes. Mol Cell Biol 4(8), 1638-40. Dasika, G. K., Lin, S. C., Zhao, S., Sung, P., Tomkinson, A., and Lee, E. Y. (1999). DNA damageinduced cell cycle checkpoints and DNA strand break repair in development and tumorigenesis. Oncogene 18(55), 7883-99. de Fromentel, C. C., Viron, A., Puvion, E., and May, P. (1986). SV40 large T-antigen and transformation related protein p53 are associated in situ with nuclear RNP structures containing hnRNA of transformed cells. Exp Cell Res 164(1), 35-48. Dean, M., Fojo, T., and Bates, S. (2005). Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer 5(4), 275-84. Deb, S., Jackson, C. T., Subler, M. A., and Martin, D. W. (1992). Modulation of cellular and viral Promotors by mutant human p53 proteins found in tumor cells. J Virol 66(10), 6164-70. DeLeo, A. B., Jay, G., Appella, E., Dubois, G. C., Law, L. W., and Old, L. J. (1979). Detection of a transformation-related antigen in chemically induced sarcomas and other transformed cells of the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A 76(5), 2420-4. DeLeo, A. B., Shiku, H., Takahashi, T., John, M., and Old, L. J. (1977). Cell surface antigens of chemically induced sarcomas of the mouse. I. Murine leukemia virus-related antigens and alloantigens on cultured fibroblasts and sarcoma cells: description of a unique antigen on BALB/c Meth A sarcoma. J Exp Med 146(3), 720-34. Deng, C., Zhang, P., Harper, J. W., Elledge, S. J., and Leder, P. (1995). Mice lacking p21CIP1/WAF1 undergo normal development, but are defective in G1 checkpoint control. Cell 82(4), 675-84. Deppert, W. (1996). Binding of MAR-DNA elements by mutant p53: possible implications for its oncogenic functions. J Cell Biochem 62(2), 172-80. Deppert, W., Buschhausen-Denker, G., Patschinsky, T., and Steinmeyer, K. (1990). Cell cycle control of p53 in normal (3T3) and chemically transformed (Meth A) mouse cells. II. Requirement for cell cycle progression. Oncogene 5(11), 1701-6. Literatur 107 Deppert, W., and Haug, M. (1986). Evidence for free and metabolically stable p53 protein in nuclear subfractions of simian virus 40-transformed cells. Mol Cell Biol 6(6), 2233-40. Deppert, W., and Von Der Weth, A. (1990). Functional interaction of nuclear transport-defective simian virus 40 large T antigen with chromatin and nuclear matrix. J Virol 64(2), 838-46. Di Agostino, S., Strano, S., Emiliozzi, V., Zerbini, V., Mottolese, M., Sacchi, A., Blandino, G., and Piaggio, G. (2006). Gain of function of mutant p53: the mutant p53/NF-Y protein complex reveals an aberrant transcriptional mechanism of cell cycle regulation. Cancer Cell 10(3), 191202. Di Como, C. J., Gaiddon, C., and Prives, C. (1999). p73 function is inhibited by tumor-derived p53 mutants in mammalian cells. Mol Cell Biol 19(2), 1438-49. Dittmer, D., Pati, S., Zambetti, G., Chu, S., Teresky, A. K., Moore, M., Finlay, C., and Levine, A. J. (1993). Gain of function mutations in p53. Nat Genet 4(1), 42-6. Dobreva, G., Dambacher, J., and Grosschedl, R. (2003). SUMO modification of a novel MAR-binding protein, SATB2, modulates immunoglobulin mu gene expression. Genes Dev 17(24), 3048-61. Doench, J. G., Petersen, C. P., and Sharp, P. A. (2003). siRNAs can function as miRNAs. Genes Dev 17(4), 438-42. Donehower, L. A., Harvey, M., Slagle, B. L., McArthur, M. J., Montgomery, C. A., Jr., Butel, J. S., and Bradley, A. (1992). Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature 356(6366), 215-21. Dornan, D., Shimizu, H., Perkins, N. D., and Hupp, T. R. (2003). DNA-dependent acetylation of p53 by the transcription coactivator p300. J Biol Chem 278(15), 13431-41. Dornan, D., Wertz, I., Shimizu, H., Arnott, D., Frantz, G. D., Dowd, P., O'Rourke, K., Koeppen, H., and Dixit, V. M. (2004). The ubiquitin ligase COP1 is a critical negative regulator of p53. Nature 429(6987), 86-92. Dotiwala, F., Haase, J., Arbel-Eden, A., Bloom, K., and Haber, J. E. (2007). The yeast DNA damage checkpoint proteins control a cytoplasmic response to DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A 104(27), 11358-63. Dowdy, S. F., Hinds, P. W., Louie, K., Reed, S. I., Arnold, A., and Weinberg, R. A. (1993). Physical interaction of the retinoblastoma protein with human D cyclins. Cell 73(3), 499-511. Dreyfuss, G., Kim, V. N., and Kataoka, N. (2002). Messenger-RNA-binding proteins and the messages they carry. Nat Rev Mol Cell Biol 3(3), 195-205. Duesberg, P., and Li, R. (2003). Multistep carcinogenesis: a chain reaction of aneuploidizations. Cell Cycle 2(3), 202-10. Dulic, V., Kaufmann, W. K., Wilson, S. J., Tlsty, T. D., Lees, E., Harper, J. W., Elledge, S. J., and Reed, S. I. (1994). p53-dependent inhibition of cyclin-dependent kinase activities in human fibroblasts during radiation-induced G1 arrest. Cell 76(6), 1013-23. Eckfeldt, C. E., Mendenhall, E. M., and Verfaillie, C. M. (2005). The molecular repertoire of the 'almighty' stem cell. Nat Rev Mol Cell Biol 6(9), 726-37. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., and Botstein, D. (1998). Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A 95(25), 14863-8. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1992). Definition of a consensus binding site for p53. Nat Genet 1(1), 45-9. el-Deiry, W. S., Tokino, T., Velculescu, V. E., Levy, D. B., Parsons, R., Trent, J. M., Lin, D., Mercer, W. E., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1993). WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 75(4), 817-25. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001). RNA interference is mediated by 21- and 22nucleotide RNAs. Genes Dev 15(2), 188-200. Eliyahu, D., Goldfinger, N., Pinhasi-Kimhi, O., Shaulsky, G., Skurnik, Y., Arai, N., Rotter, V., and Oren, M. (1988). Meth A fibrosarcoma cells express two transforming mutant p53 species. Oncogene 3(3), 313-21. Eliyahu, D., Michalovitz, D., and Oren, M. (1985). Overproduction of p53 antigen makes established cells highly tumorigenic. Nature 316(6024), 158-60. Eliyahu, D., Raz, A., Gruss, P., Givol, D., and Oren, M. (1984). Participation of p53 cellular tumour antigen in transformation of normal embryonic cells. Nature 312(5995), 646-9. Elmore, E., Kakunaga, T., and Barrett, J. C. (1983). Comparison of spontaneous mutation rates of normal and chemically transformed human skin fibroblasts. Cancer Res 43(4), 1650-5. Espinosa, J. M., and Emerson, B. M. (2001). Transcriptional regulation by p53 through intrinsic DNA/chromatin binding and site-directed cofactor recruitment. Mol Cell 8(1), 57-69. Espinoza, C. A., Allen, T. A., Hieb, A. R., Kugel, J. F., and Goodrich, J. A. (2004). B2 RNA binds directly to RNA polymerase II to repress transcript synthesis. Nat Struct Mol Biol 11(9), 822-9. Literatur 108 Ewen, M. E., Sluss, H. K., Sherr, C. J., Matsushime, H., Kato, J., and Livingston, D. M. (1993). Functional interactions of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins. Cell 73(3), 487-97. Faro-Trindade, I., and Cook, P. R. (2006). Transcription factories: structures conserved during differentiation and evolution. Biochem Soc Trans 34(Pt 6), 1133-7. Fearon, E. R., and Vogelstein, B. (1990). A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61(5), 759-67. Ferreira, C. G., Tolis, C., and Giaccone, G. (1999). p53 and chemosensitivity. Ann Oncol 10(9), 101121. Ferrigno, O., Virolle, T., Djabari, Z., Ortonne, J. P., White, R. J., and Aberdam, D. (2001). Transposable B2 SINE elements can provide mobile RNA polymerase II Promotors. Nat Genet 28(1), 77-81. Fields, S., and Jang, S. K. (1990). Presence of a potent transcription activating sequence in the p53 protein. Science 249(4972), 1046-9. Finlay, C. A., Hinds, P. W., and Levine, A. J. (1989). The p53 proto-oncogene can act as a suppressor of transformation. Cell 57(7), 1083-93. Fiscella, M., Zhang, H., Fan, S., Sakaguchi, K., Shen, S., Mercer, W. E., Vande Woude, G. F., O'Connor, P. M., and Appella, E. (1997). Wip1, a novel human protein phosphatase that is induced in response to ionizing radiation in a p53-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A 94(12), 6048-53. Fisher, A. A., Ye, D., Sergueev, D. S., Fisher, M. H., Shaw, B. R., and Juliano, R. L. (2002). Evaluating the specificity of antisense oligonucleotide conjugates. A DNA array analysis. J Biol Chem 277(25), 22980-4. Fontoura, B. M., Sorokina, E. A., David, E., and Carroll, R. B. (1992). p53 is covalently linked to 5.8S rRNA. Mol Cell Biol 12(11), 5145-51. Forrester, K., Ambs, S., Lupold, S. E., Kapust, R. B., Spillare, E. A., Weinberg, W. C., Felley-Bosco, E., Wang, X. W., Geller, D. A., Tzeng, E., Billiar, T. R., and Harris, C. C. (1996). Nitric oxideinduced p53 accumulation and regulation of inducible nitric oxide synthase expression by wildtype p53. Proc Natl Acad Sci U S A 93(6), 2442-7. Frazier, M. W., He, X., Wang, J., Gu, Z., Cleveland, J. L., and Zambetti, G. P. (1998). Activation of cmyc gene expression by tumor-derived p53 mutants requires a discrete C-terminal domain. Mol Cell Biol 18(7), 3735-43. Freedman, D. A., Wu, L., and Levine, A. J. (1999). Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol Life Sci 55(1), 96-107. Friedman, P. N., Chen, X., Bargonetti, J., and Prives, C. (1993). The p53 protein is an unusually shaped tetramer that binds directly to DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 90(8), 3319-23. Fujita, F., Taniguchi, Y., Kato, T., Narita, Y., Furuya, A., Ogawa, T., Sakurai, H., Joh, T., Itoh, M., Delhase, M., Karin, M., and Nakanishi, M. (2003). Identification of NAP1, a regulatory subunit of IkappaB kinase-related kinases that potentiates NF-kappaB signaling. Mol Cell Biol 23(21), 7780-93. Galluzzi, L., Maiuri, M. C., Vitale, I., Zischka, H., Castedo, M., Zitvogel, L., and Kroemer, G. (2007). Cell death modalities: classification and pathophysiological implications. Cell Death Differ 14(7), 1237-43. Gasser, S. M., and Laemmli, U. K. (1987). Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res 173(1), 85-98. Gil, J., Alcami, J., and Esteban, M. (1999). Induction of apoptosis by double-stranded-RNA-dependent protein kinase (PKR) involves the alpha subunit of eukaryotic translation initiation factor 2 and NF-kappaB. Mol Cell Biol 19(7), 4653-63. Glazko, G. V., Koonin, E. V., Rogozin, I. B., and Shabalina, S. A. (2003). A significant fraction of conserved noncoding DNA in human and mouse consists of predicted matrix attachment regions. Trends Genet 19(3), 119-24. Gloushankova, N., Ossovskaya, V., Vasiliev, J., Chumakov, P., and Kopnin, B. (1997). Changes in p53 expression can modify cell shape of ras-transformed fibroblasts and epitheliocytes. Oncogene 15(24), 2985-9. Gohler, T., Jager, S., Warnecke, G., Yasuda, H., Kim, E., and Deppert, W. (2005). Mutant p53 proteins bind DNA in a DNA structure-selective mode. Nucleic Acids Res 33(3), 1087-100. Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P. V., Manolis, E., Ikonomopoulos, J. A., Damalas, A., Lamprinopoulos, C., Rassidakis, G. Z., Zoumpourlis, V., Kotsinas, A., Rassidakis, A. N., Halazonetis, T. D., and Kittas, C. (1998). Effects of p53 mutants derived from lung carcinomas on the p53-responsive element (p53RE) of the MDM2 gene. Br J Cancer 77(3), 374-84. Literatur 109 Gostissa, M., Hengstermann, A., Fogal, V., Sandy, P., Schwarz, S. E., Scheffner, M., and Del Sal, G. (1999). Activation of p53 by conjugation to the ubiquitin-like protein SUMO-1. Embo J 18(22), 6462-71. Graeber, T. G., Peterson, J. F., Tsai, M., Monica, K., Fornace, A. J., Jr., and Giaccia, A. J. (1994). Hypoxia induces accumulation of p53 protein, but activation of a G1-phase checkpoint by lowoxygen conditions is independent of p53 status. Mol Cell Biol 14(9), 6264-77. Gray, N. K., and Wickens, M. (1998). Control of translation initiation in animals. Annu Rev Cell Dev Biol 14, 399-458. Greenblatt, M. S., Bennett, W. P., Hollstein, M., and Harris, C. C. (1994). Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res 54(18), 4855-78. Griffis, E. R., Stuurman, N., and Vale, R. D. (2007). Spindly, a novel protein essential for silencing the spindle assembly checkpoint, recruits dynein to the kinetochore. J Cell Biol 177(6), 1005-15. Gronostajski, R. M., Goldberg, A. L., and Pardee, A. B. (1984). Energy requirement for degradation of tumor-associated protein p53. Mol Cell Biol 4(3), 442-8. Gu, L., Zhu, N., Findley, H. W., Woods, W. G., and Zhou, M. (2004). Identification and characterization of the IKKalpha Promotor: positive and negative regulation by ETS-1 and p53, respectively. J Biol Chem 279(50), 52141-9. Gu, W., and Roeder, R. G. (1997). Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell 90(4), 595-606. Gualberto, A., Aldape, K., Kozakiewicz, K., and Tlsty, T. D. (1998). An oncogenic form of p53 confers a dominant, gain-of-function phenotype that disrupts spindle checkpoint control. Proc Natl Acad Sci U S A 95(9), 5166-71. Gualberto, A., and Baldwin, A. S., Jr. (1995). p53 and Sp1 interact and cooperate in the tumor necrosis factor-induced transcriptional activation of the HIV-1 long terminal repeat. J Biol Chem 270(34), 19680-3. Guardavaccaro, D., Corrente, G., Covone, F., Micheli, L., D'Agnano, I., Starace, G., Caruso, M., and Tirone, F. (2000). Arrest of G(1)-S progression by the p53-inducible gene PC3 is Rb dependent and relies on the inhibition of cyclin D1 transcription. Mol Cell Biol 20(5), 1797-815. Gustincich, S., Sandelin, A., Plessy, C., Katayama, S., Simone, R., Lazarevic, D., Hayashizaki, Y., and Carninci, P. (2006). The complexity of the mammalian transcriptome. J Physiol 575(Pt 2), 32132. Hainaut, P., and Hollstein, M. (2000). p53 and human cancer: the first ten thousand mutations. Adv Cancer Res 77, 81-137. Hammond, S. M., Bernstein, E., Beach, D., and Hannon, G. J. (2000). An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404(6775), 293-6. Harborth, J., Elbashir, S. M., Bechert, K., Tuschl, T., and Weber, K. (2001). Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs. J Cell Sci 114(Pt 24), 455765. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., and Elledge, S. J. (1993). The p21 Cdkinteracting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell 75(4), 80516. Harvey, D. M., and Levine, A. J. (1991). p53 alteration is a common event in the spontaneous immortalization of primary BALB/c murine embryo fibroblasts. Genes Dev 5(12B), 2375-85. Haupt, Y., Maya, R., Kazaz, A., and Oren, M. (1997). Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature 387(6630), 296-9. He, Y., Brown, M. A., Rothnagel, J. A., Saunders, N. A., and Smith, R. (2005). Roles of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A and B in cell proliferation. J Cell Sci 118(Pt 14), 3173-83. Heinlein, C., Krepulat, F., Lohler, J., Speidel, D., Deppert, W., and Tolstonog, G. V. (2007). Mutant p53(R270H) gain of function phenotype in a mouse model for oncogene-induced mammary carcinogenesis. Int J Cancer. Helmbold, H., Deppert, W., and Bohn, W. (2006). Regulation of cellular senescence by Rb2/p130. Oncogene 25(38), 5257-62. Heng, H. H., Goetze, S., Ye, C. J., Liu, G., Stevens, J. B., Bremer, S. W., Wykes, S. M., Bode, J., and Krawetz, S. A. (2004). Chromatin loops are selectively anchored using scaffold/matrixattachment regions. J Cell Sci 117(Pt 7), 999-1008. Herbomel, P. (1990). From gene to chromosome: organization levels defined by the interplay of transcription and replication in vertebrates. New Biol 2(11), 937-45. Hermeking, H., Lengauer, C., Polyak, K., He, T. C., Zhang, L., Thiagalingam, S., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1997). 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression. Mol Cell 1(1), 3-11. Literatur 110 Hernandez-Boussard, T., Montesano, R., and Hainaut, P. (1999). Analysis of somatic mutations of the p53 gene in human cancers: a tool to generate hypotheses about the natural history of cancer. IARC Sci Publ(146), 43-53. Heukeshoven, J., and Dernick, R. (1985). Characterization of a solvent system for separation of waterinsoluble poliovirus proteins by reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr 326, 91-101. Hinds, P., Finlay, C., and Levine, A. J. (1989). Mutation is required to activate the p53 gene for cooperation with the ras oncogene and transformation. J Virol 63(2), 739-46. Hinds, P. W., Finlay, C. A., Quartin, R. S., Baker, S. J., Fearon, E. R., Vogelstein, B., and Levine, A. J. (1990). Mutant p53 DNA clones from human colon carcinomas cooperate with ras in transforming primary rat cells: a comparison of the "hot spot" mutant phenotypes. Cell Growth Differ 1(12), 571-80. Hinds, P. W., Mittnacht, S., Dulic, V., Arnold, A., Reed, S. I., and Weinberg, R. A. (1992). Regulation of retinoblastoma protein functions by ectopic expression of human cyclins. Cell 70(6), 9931006. Ho, J., and Benchimol, S. (2003). Transcriptional repression mediated by the p53 tumour suppressor. Cell Death Differ 10(4), 404-8. Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., and Harris, C. C. (1991). p53 mutations in human cancers. Science 253(5015), 49-53. Hsiao, M., Low, J., Dorn, E., Ku, D., Pattengale, P., Yeargin, J., and Haas, M. (1994). Gain-of-function mutations of the p53 gene induce lymphohematopoietic metastatic potential and tissue invasiveness. Am J Pathol 145(3), 702-14. Hupp, T. R., and Lane, D. P. (1995). Two distinct signaling pathways activate the latent DNA binding function of p53 in a casein kinase II-independent manner. J Biol Chem 270(30), 18165-74. Hupp, T. R., Meek, D. W., Midgley, C. A., and Lane, D. P. (1992). Regulation of the specific DNA binding function of p53. Cell 71(5), 875-86. Hupp, T. R., Sparks, A., and Lane, D. P. (1995). Small peptides activate the latent sequence-specific DNA binding function of p53. Cell 83(2), 237-45. Ihrie, R. A., Reczek, E., Horner, J. S., Khachatrian, L., Sage, J., Jacks, T., and Attardi, L. D. (2003). Perp is a mediator of p53-dependent apoptosis in diverse cell types. Curr Biol 13(22), 198590. Imbriano, C., Gurtner, A., Cocchiarella, F., Di Agostino, S., Basile, V., Gostissa, M., Dobbelstein, M., Del Sal, G., Piaggio, G., and Mantovani, R. (2005). Direct p53 transcriptional repression: in vivo analysis of CCAAT-containing G2/M Promotors. Mol Cell Biol 25(9), 3737-51. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., and Resnick, M. A. (2002). Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and Promotor target sequence. Mol Cell Biol 22(24), 8612-25. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96(1), 23-8. Jacks, T., Remington, L., Williams, B. O., Schmitt, E. M., Halachmi, S., Bronson, R. T., and Weinberg, R. A. (1994). Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol 4(1), 1-7. Jackson, A. L., Bartz, S. R., Schelter, J., Kobayashi, S. V., Burchard, J., Mao, M., Li, B., Cavet, G., and Linsley, P. S. (2003). Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol 21(6), 635-7. Jagus, R., Joshi, B., and Barber, G. N. (1999). PKR, apoptosis and cancer. Int J Biochem Cell Biol 31(1), 123-38. Janus, F., Albrechtsen, N., Knippschild, U., Wiesmuller, L., Grosse, F., and Deppert, W. (1999). Different regulation of the p53 core domain activities 3'-to-5' exonuclease and sequencespecific DNA binding. Mol Cell Biol 19(3), 2155-68. Janz, C., and Wiesmuller, L. (2002). Wild-type p53 inhibits replication-associated homologous recombination. Oncogene 21(38), 5929-33. Jayaraman, J., and Prives, C. (1995). Activation of p53 sequence-specific DNA binding by short single strands of DNA requires the p53 C-terminus. Cell 81(7), 1021-9. Jayaraman, L., Murthy, K. G., Zhu, C., Curran, T., Xanthoudakis, S., and Prives, C. (1997). Identification of redox/repair protein Ref-1 as a potent activator of p53. Genes Dev 11(5), 55870. Jeffers, J. R., Parganas, E., Lee, Y., Yang, C., Wang, J., Brennan, J., MacLean, K. H., Han, J., Chittenden, T., Ihle, J. N., McKinnon, P. J., Cleveland, J. L., and Zambetti, G. P. (2003). Puma is an essential mediator of p53-dependent and -independent apoptotic pathways. Cancer Cell 4(4), 321-8. Jeffrey, P. D., Gorina, S., and Pavletich, N. P. (1995). Crystal structure of the tetramerization domain of the p53 tumor suppressor at 1.7 angstroms. Science 267(5203), 1498-502. Literatur 111 Jenkins, J. R., Rudge, K., and Currie, G. A. (1984). Cellular immortalization by a cDNA clone encoding the transformation-associated phosphoprotein p53. Nature 312(5995), 651-4. Jenuwein, T., Forrester, W. C., Fernandez-Herrero, L. A., Laible, G., Dull, M., and Grosschedl, R. (1997). Extension of chromatin accessibility by nuclear matrix attachment regions. Nature 385(6613), 269-72. Jimenez, G. S., Nister, M., Stommel, J. M., Beeche, M., Barcarse, E. A., Zhang, X. Q., O'Gorman, S., and Wahl, G. M. (2000). A transactivation-deficient mouse model provides insights into Trp53 regulation and function. Nat Genet 26(1), 37-43. Jurgensmeier, J. M., Xie, Z., Deveraux, Q., Ellerby, L., Bredesen, D., and Reed, J. C. (1998). Bax directly induces release of cytochrome c from isolated mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A 95(9), 4997-5002. Kaczmarek, L., Miller, M. R., Hammond, R. A., and Mercer, W. E. (1986). A microinjected monoclonal antibody against human DNA polymerase-alpha inhibits DNA replication in human, hamster, and mouse cell lines. J Biol Chem 261(23), 10802-7. Kaeser, M. D., and Iggo, R. D. (2002). Chromatin immunoprecipitation analysis fails to support the latency model for regulation of p53 DNA binding activity in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 99(1), 95-100. Epub 2001 Dec 26. Kapic, A., Helmbold, H., Reimer, R., Klotzsche, O., Deppert, W., and Bohn, W. (2006). Cooperation between p53 and p130(Rb2) in induction of cellular senescence. Cell Death Differ 13(2), 32434. Kariko, K., Bhuyan, P., Capodici, J., and Weissman, D. (2004). Small interfering RNAs mediate sequence-independent gene suppression and induce immune activation by signaling through toll-like receptor 3. J Immunol 172(11), 6545-9. Kastan, M. B., Zhan, Q., el-Deiry, W. S., Carrier, F., Jacks, T., Walsh, W. V., Plunkett, B. S., Vogelstein, B., and Fornace, A. J., Jr. (1992). A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia. Cell 71(4), 587-97. Kawamura, M., Yamashita, T., Segawa, K., Kaneuchi, M., Shindoh, M., and Fujinaga, K. (1996). The 273rd codon mutants of p53 show growth modulation activities not correlated with p53-specific transactivation activity. Oncogene 12(11), 2361-7. Kawasaki, H., and Taira, K. (2003). Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) Promotor significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells. Nucleic Acids Res 31(2), 700-7. Kelavkar, U. P., and Badr, K. F. (1999). Effects of mutant p53 expression on human 15-lipoxygenasePromotor activity and murine 12/15-lipoxygenase gene expression: evidence that 15lipoxygenase is a mutator gene. Proc Natl Acad Sci U S A 96(8), 4378-83. Kho, P. S., Wang, Z., Zhuang, L., Li, Y., Chew, J. L., Ng, H. H., Liu, E. T., and Yu, Q. (2004). p53regulated transcriptional program associated with genotoxic stress-induced apoptosis. J Biol Chem 279(20), 21183-92. Kieser, A., Weich, H. A., Brandner, G., Marme, D., and Kolch, W. (1994). Mutant p53 potentiates protein kinase C induction of vascular endothelial growth factor expression. Oncogene 9(3), 963-9. Kim, E., Albrechtsen, N., and Deppert, W. (1997). DNA-conformation is an important determinant of sequence-specific DNA binding by tumor suppressor p53. Oncogene 15(7), 857-69. Kim, E., and Deppert, W. (2004). Transcriptional activities of mutant p53: when mutations are more than a loss. J Cell Biochem 93(5), 878-86. Kim, E., and Deppert, W. (2007). Interactions of mutant p53 with DNA: guilt by association. Oncogene 26(15), 2185-90. Kim, E., Gunther, W., Yoshizato, K., Meissner, H., Zapf, S., Nusing, R. M., Yamamoto, H., Van Meir, E. G., Deppert, W., and Giese, A. (2003). Tumor suppressor p53 inhibits transcriptional activation of invasion gene thromboxane synthase mediated by the proto-oncogenic factor ets1. Oncogene 22(49), 7716-27. Knudson, A. G., Jr. (1986). Genetics of human cancer. J Cell Physiol Suppl 4, 7-11. Ko, L. J., and Prives, C. (1996). p53: puzzle and paradigm. Genes Dev 10(9), 1054-72. Koga, H., and Deppert, W. (2000). Identification of genomic DNA sequences bound by mutant p53 protein (Gly245-->Ser) in vivo. Oncogene 19(36), 4178-83. Kohwi-Shigematsu, T., and Kohwi, Y. (1990). Torsional stress stabilizes extended base unpairing in suppressor sites flanking immunoglobulin heavy chain enhancer. Biochemistry 29(41), 955160. Koromilas, A. E., Roy, S., Barber, G. N., Katze, M. G., and Sonenberg, N. (1992). Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science 257(5077), 1685-9. Literatur 112 Krecic, A. M., and Swanson, M. S. (1999). hnRNP complexes: composition, structure, and function. Curr Opin Cell Biol 11(3), 363-71. Kress, M., May, E., Cassingena, R., and May, P. (1979). Simian virus 40-transformed cells express new species of proteins precipitable by anti-simian virus 40 tumor serum. J Virol 31(2), 47283. Kubbutat, M. H., Jones, S. N., and Vousden, K. H. (1997). Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature 387(6630), 299-303. Kugel, J. F., and Goodrich, J. A. (2000). A kinetic model for the early steps of RNA synthesis by human RNA polymerase II. J Biol Chem 275(51), 40483-91. Kugel, J. F., and Goodrich, J. A. (2002). Translocation after synthesis of a four-nucleotide RNA commits RNA polymerase II to Promotor escape. Mol Cell Biol 22(3), 762-73. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(5259), 680-5. Lane, D. P., and Crawford, L. V. (1979). T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells. Nature 278(5701), 261-3. Lang, G. A., Iwakuma, T., Suh, Y. A., Liu, G., Rao, V. A., Parant, J. M., Valentin-Vega, Y. A., Terzian, T., Caldwell, L. C., Strong, L. C., El-Naggar, A. K., and Lozano, G. (2004). Gain of function of a p53 hot spot mutation in a mouse model of Li-Fraumeni syndrome. Cell 119(6), 861-72. Lanyi, A., Deb, D., Seymour, R. C., Ludes-Meyers, J. H., Subler, M. A., and Deb, S. (1998). 'Gain of function' phenotype of tumor-derived mutant p53 requires the oligomerization/nonsequencespecific nucleic acid-binding domain. Oncogene 16(24), 3169-76. Lasham, A., Moloney, S., Hale, T., Homer, C., Zhang, Y. F., Murison, J. G., Braithwaite, A. W., and Watson, J. (2003). The Y-box-binding protein, YB1, is a potential negative regulator of the p53 tumor suppressor. J Biol Chem 278(37), 35516-23. Lassus, P., Bertrand, C., Zugasti, O., Chambon, J. P., Soussi, T., Mathieu-Mahul, D., and Hibner, U. (1999). Anti-apoptotic activity of p53 maps to the COOH-terminal domain and is retained in a highly oncogenic natural mutant. Oncogene 18(33), 4699-709. Le Beau, M. M., Westbrook, C. A., Diaz, M. O., Rowley, J. D., and Oren, M. (1985). Translocation of the p53 gene in t(15;17) in acute promyelocytic leukaemia. Nature 316(6031), 826-8. Lebedeva, I., and Stein, C. A. (2001). Antisense oligonucleotides: promise and reality. Annu Rev Pharmacol Toxicol 41, 403-19. Lee, Y. I., Lee, S., Das, G. C., Park, U. S., Park, S. M., and Lee, Y. I. (2000). Activation of the insulinlike growth factor II transcription by aflatoxin B1 induced p53 mutant 249 is caused by activation of transcription complexes; implications for a gain-of-function during the formation of hepatocellular carcinoma. Oncogene 19(33), 3717-26. Leng, R. P., Lin, Y., Ma, W., Wu, H., Lemmers, B., Chung, S., Parant, J. M., Lozano, G., Hakem, R., and Benchimol, S. (2003). Pirh2, a p53-induced ubiquitin-protein ligase, promotes p53 degradation. Cell 112(6), 779-91. Lengyel, P. (1987). Double-stranded RNA and interferon action. J Interferon Res 7(5), 511-9. Lerat, E., and Semon, M. (2007). Influence of the transposable element neighborhood on human gene expression in normal and tumor tissues. Gene 396(2), 303-11. Levine, A. J. (1993). The tumor suppressor genes. Annu Rev Biochem 62, 623-51. Levine, A. J. (1997). p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 88(3), 323-31. Levine, A. J., Momand, J., and Finlay, C. A. (1991). The p53 tumour suppressor gene. Nature 351(6326), 453-6. Levine, A. J., Wu, M. C., Chang, A., Silver, A., Attiyeh, E. F., Lin, J., and Epstein, C. B. (1995). The spectrum of mutations at the p53 locus. Evidence for tissue-specific mutagenesis, selection of mutant alleles, and a "gain of function" phenotype. Ann N Y Acad Sci 768, 111-28. Li, B., Murphy, K. L., Laucirica, R., Kittrell, F., Medina, D., and Rosen, J. M. (1998a). A transgenic mouse model for mammary carcinogenesis. Oncogene 16(8), 997-1007. Li, M., Chen, D., Shiloh, A., Luo, J., Nikolaev, A. Y., Qin, J., and Gu, W. (2002). Deubiquitination of p53 by HAUSP is an important pathway for p53 stabilization. Nature 416(6881), 648-53. Li, R., Sutphin, P. D., Schwartz, D., Matas, D., Almog, N., Wolkowicz, R., Goldfinger, N., Pei, H., Prokocimer, M., and Rotter, V. (1998b). Mutant p53 protein expression interferes with p53independent apoptotic pathways. Oncogene 16(25), 3269-77. Li, R., Waga, S., Hannon, G. J., Beach, D., and Stillman, B. (1994). Differential effects by the p21 CDK inhibitor on PCNA-dependent DNA replication and repair. Nature 371(6497), 534-7. Li, Z. R., Hromchak, R., Mudipalli, A., and Bloch, A. (1998c). Tumor suppressor proteins as regulators of cell differentiation. Cancer Res 58(19), 4282-7. Lim, I. K., Lee, M. S., Ryu, M. S., Park, T. J., Fujiki, H., Eguchi, H., and Paik, W. K. (1998). Induction of growth inhibition of 293 cells by downregulation of the cyclin E and cyclin-dependent kinase 4 proteins due to overexpression of TIS21. Mol Carcinog 23(1), 25-35. Literatur 113 Lin, J., Blake, M., Tang, C., Zimmer, D., Rustandi, R. R., Weber, D. J., and Carrier, F. (2001). Inhibition of p53 transcriptional activity by the S100B calcium-binding protein. J Biol Chem 276(37), 35037-41. Lin, J., Chen, J., Elenbaas, B., and Levine, A. J. (1994). Several hydrophobic amino acids in the p53 amino-terminal domain are required for transcriptional activation, binding to mdm-2 and the adenovirus 5 E1B 55-kD protein. Genes Dev 8(10), 1235-46. Lin, T., Chao, C., Saito, S., Mazur, S. J., Murphy, M. E., Appella, E., and Xu, Y. (2005). p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression. Nat Cell Biol 7(2), 165-71. Lin, Y., Ma, W., and Benchimol, S. (2000). Pidd, a new death-domain-containing protein, is induced by p53 and promotes apoptosis. Nat Genet 26(1), 122-7. Linke, S. P., Clarkin, K. C., Di Leonardo, A., Tsou, A., and Wahl, G. M. (1996). A reversible, p53dependent G0/G1 cell cycle arrest induced by ribonucleotide depletion in the absence of detectable DNA damage. Genes Dev 10(8), 934-47. Linzer, D. I., Maltzman, W., and Levine, A. J. (1979). The SV40 A gene product is required for the production of a 54,000 MW cellular tumor antigen. Virology 98(2), 308-18. Liu, G., McDonnell, T. J., Montes de Oca Luna, R., Kapoor, M., Mims, B., El-Naggar, A. K., and Lozano, G. (2000). High metastatic potential in mice inheriting a targeted p53 missense mutation. Proc Natl Acad Sci U S A 97(8), 4174-9. Lo, K. W., Kogoy, J. M., and Pfister, K. K. (2007). The DYNLT3 light chain directly links cytoplasmic dynein to a spindle checkpoint protein, Bub3. J Biol Chem 282(15), 11205-12. Loeb, L. A. (1991). Mutator phenotype may be required for multistage carcinogenesis. Cancer Res 51(12), 3075-9. Lowe, S. W., Schmitt, E. M., Smith, S. W., Osborne, B. A., and Jacks, T. (1993). p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature 362(6423), 847-9. Lozano, G. (2007). The oncogenic roles of p53 mutants in mouse models. Curr Opin Genet Dev 17(1), 66-70. Lu, H., and Levine, A. J. (1995). Human TAFII31 protein is a transcriptional coactivator of the p53 protein. Proc Natl Acad Sci U S A 92(11), 5154-8. Ludes-Meyers, J. H., Subler, M. A., Shivakumar, C. V., Munoz, R. M., Jiang, P., Bigger, J. E., Brown, D. R., Deb, S. P., and Deb, S. (1996). Transcriptional activation of the human epidermal growth factor receptor Promotor by human p53. Mol Cell Biol 16(11), 6009-19. Lunyak, V. V., Prefontaine, G. G., Nunez, E., Cramer, T., Ju, B. G., Ohgi, K. A., Hutt, K., Roy, R., Garcia-Diaz, A., Zhu, X., Yung, Y., Montoliu, L., Glass, C. K., and Rosenfeld, M. G. (2007). Developmentally regulated activation of a SINE B2 repeat as a domain boundary in organogenesis. Science 317(5835), 248-51. Macleod, K. (2000). Tumor suppressor genes. Curr Opin Genet Dev 10(1), 81-93. Malkin, D., Li, F. P., Strong, L. C., Fraumeni, J. F., Jr., Nelson, C. E., Kim, D. H., Kassel, J., Gryka, M. A., Bischoff, F. Z., Tainsky, M. A., and et al. (1990). Germ line p53 mutations in a familial syndrome of breast cancer, sarcomas, and other neoplasms. Science 250(4985), 1233-8. Maltzman, W., and Czyzyk, L. (1984). UV irradiation stimulates levels of p53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells. Mol Cell Biol 4(9), 1689-94. Manche, L., Green, S. R., Schmedt, C., and Mathews, M. B. (1992). Interactions between doublestranded RNA regulators and the protein kinase DAI. Mol Cell Biol 12(11), 5238-48. Margulies, L., and Sehgal, P. B. (1993). Modulation of the human interleukin-6 Promotor (IL-6) and transcription factor C/EBP beta (NF-IL6) activity by p53 species. J Biol Chem 268(20), 15096100. Marin, M. C., and Kaelin, W. G., Jr. (2000). p63 and p73: old members of a new family. Biochim Biophys Acta 1470(3), M93-M100. Matas, D., Sigal, A., Stambolsky, P., Milyavsky, M., Weisz, L., Schwartz, D., Goldfinger, N., and Rotter, V. (2001). Integrity of the N-terminal transcription domain of p53 is required for mutant p53 interference with drug-induced apoptosis. Embo J 20(15), 4163-72. Matsumoto, S., Miyagishi, M., Akashi, H., Nagai, R., and Taira, K. (2005). Analysis of double-stranded RNA-induced apoptosis pathways using interferon-response noninducible small interfering RNA expression vector library. J Biol Chem 280(27), 25687-96. Matz, M., Shagin, D., Bogdanova, E., Britanova, O., Lukyanov, S., Diatchenko, L., and Chenchik, A. (1999). Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR. Nucleic Acids Res 27(6), 1558-60. Melendy, T., and Stillman, B. (1991). Purification of DNA polymerase delta as an essential simian virus 40 DNA replication factor. J Biol Chem 266(3), 1942-9. Literatur 114 Meurs, E., Chong, K., Galabru, J., Thomas, N. S., Kerr, I. M., Williams, B. R., and Hovanessian, A. G. (1990). Molecular cloning and characterization of the human double-stranded RNA-activated protein kinase induced by interferon. Cell 62(2), 379-90. Meurs, E. F., Galabru, J., Barber, G. N., Katze, M. G., and Hovanessian, A. G. (1993). Tumor suppressor function of the interferon-induced double-stranded RNA-activated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 90(1), 232-6. Midgley, C. A., and Lane, D. P. (1997). p53 protein stability in tumour cells is not determined by mutation but is dependent on Mdm2 binding. Oncogene 15(10), 1179-89. Mielke, C., Kohwi, Y., Kohwi-Shigematsu, T., and Bode, J. (1990). Hierarchical binding of DNA fragments derived from scaffold-attached regions: correlation of properties in vitro and function in vivo. Biochemistry 29(32), 7475-85. Mignone, F., Gissi, C., Liuni, S., and Pesole, G. (2002). Untranslated regions of mRNAs. Genome Biol 3(3), REVIEWS0004. Miller, S. J., Suthiphongchai, T., Zambetti, G. P., and Ewen, M. E. (2000). p53 binds selectively to the 5' untranslated region of cdk4, an RNA element necessary and sufficient for transforming growth factor beta- and p53-mediated translational inhibition of cdk4. Mol Cell Biol 20(22), 8420-31. Milner, J., and Medcalf, E. A. (1991). Cotranslation of activated mutant p53 with wild type drives the wild-type p53 protein into the mutant conformation. Cell 65(5), 765-74. Miyashita, T., Krajewski, S., Krajewska, M., Wang, H. G., Lin, H. K., Liebermann, D. A., Hoffman, B., and Reed, J. C. (1994). Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo. Oncogene 9(6), 1799-805. Miyashita, T., and Reed, J. C. (1995). Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell 80(2), 293-9. Moll, U. M., Marchenko, N., and Zhang, X. K. (2006). p53 and Nur77/TR3 - transcription factors that directly target mitochondria for cell death induction. Oncogene 25(34), 4725-43. Momand, J., Zambetti, G. P., Olson, D. C., George, D., and Levine, A. J. (1992). The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell 69(7), 1237-45. Monti, P., Campomenosi, P., Ciribilli, Y., Iannone, R., Aprile, A., Inga, A., Tada, M., Menichini, P., Abbondandolo, A., and Fronza, G. (2003). Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene 22(34), 5252-60. Mosner, J., Mummenbrauer, T., Bauer, C., Sczakiel, G., Grosse, F., and Deppert, W. (1995). Negative feedback regulation of wild-type p53 biosynthesis. Embo J 14(18), 4442-9. Muller, B. F., Paulsen, D., and Deppert, W. (1996). Specific binding of MAR/SAR DNA-elements by mutant p53. Oncogene 12(9), 1941-52. Mummenbrauer, T., Janus, F., Muller, B., Wiesmuller, L., Deppert, W., and Grosse, F. (1996). p53 Protein exhibits 3'-to-5' exonuclease activity. Cell 85(7), 1089-99. Nakano, K., and Vousden, K. H. (2001). PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53. Mol Cell 7(3), 683-94. Nanduri, S., Carpick, B. W., Yang, Y., Williams, B. R., and Qin, J. (1998). Structure of the doublestranded RNA-binding domain of the protein kinase PKR reveals the molecular basis of its dsRNA-mediated activation. Embo J 17(18), 5458-65. Neuhoff, V., Stamm, R., Pardowitz, I., Arold, N., Ehrhardt, W., and Taube, D. (1990). Essential problems in quantification of proteins following colloidal staining with coomassie brilliant blue dyes in polyacrylamide gels, and their solution. Electrophoresis 11(2), 101-17. Nie, Y., Li, H. H., Bula, C. M., and Liu, X. (2000). Stimulation of p53 DNA binding by c-Abl requires the p53 C terminus and tetramerization. Mol Cell Biol 20(3), 741-8. Nigro, J. M., Baker, S. J., Preisinger, A. C., Jessup, J. M., Hostetter, R., Cleary, K., Bigner, S. H., Davidson, N., Baylin, S., Devilee, P., and et al. (1989). Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumour types. Nature 342(6250), 705-8. Nussbaum, J. M., Gunnery, S., and Mathews, M. B. (2002). The 3'-untranslated regions of cytoskeletal muscle mRNAs inhibit translation by activating the double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR. Nucleic Acids Res 30(5), 1205-12. Oberosler, P., Hloch, P., Ramsperger, U., and Stahl, H. (1993). p53-catalyzed annealing of complementary single-stranded nucleic acids. Embo J 12(6), 2389-96. Oda, E., Ohki, R., Murasawa, H., Nemoto, J., Shibue, T., Yamashita, T., Tokino, T., Taniguchi, T., and Tanaka, N. (2000a). Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis. Science 288(5468), 1053-8. Oda, K., Arakawa, H., Tanaka, T., Matsuda, K., Tanikawa, C., Mori, T., Nishimori, H., Tamai, K., Tokino, T., Nakamura, Y., and Taya, Y. (2000b). p53AIP1, a potential mediator of p53dependent apoptosis, and its regulation by Ser-46-phosphorylated p53. Cell 102(6), 849-62. Literatur 115 Ohnishi, T., Wang, X., Ohnishi, K., Matsumoto, H., and Takahashi, A. (1996). p53-dependent induction of WAF1 by heat treatment in human glioblastoma cells. J Biol Chem 271(24), 14510-3. Okamoto, K., Li, H., Jensen, M. R., Zhang, T., Taya, Y., Thorgeirsson, S. S., and Prives, C. (2002). Cyclin G recruits PP2A to dephosphorylate Mdm2. Mol Cell 9(4), 761-71. Okamura, S., Arakawa, H., Tanaka, T., Nakanishi, H., Ng, C. C., Taya, Y., Monden, M., and Nakamura, Y. (2001). p53DINP1, a p53-inducible gene, regulates p53-dependent apoptosis. Mol Cell 8(1), 85-94. Okorokov, A. L., Ponchel, F., and Milner, J. (1997). Induced N- and C-terminal cleavage of p53: a core fragment of p53, generated by interaction with damaged DNA, promotes cleavage of the Nterminus of full-length p53, whereas ssDNA induces C-terminal cleavage of p53. Embo J 16(19), 6008-17. Old, L. J., Boyse, E. A., Clarke, D. A. & Carswell, E. (1962) Immunologie Studies on Chemically Induced Tumors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 101, 80-106. Oliner, J. D., Pietenpol, J. A., Thiagalingam, S., Gyuris, J., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1993). Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumour suppressor p53. Nature 362(6423), 857-60. Olive, K. P., Tuveson, D. A., Ruhe, Z. C., Yin, B., Willis, N. A., Bronson, R. T., Crowley, D., and Jacks, T. (2004). Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell 119(6), 847-60. Olivier, M., Eeles, R., Hollstein, M., Khan, M. A., Harris, C. C., and Hainaut, P. (2002). The IARC TP53 database: new online mutation analysis and recommendations to users. Hum Mutat 19(6), 607-14. Oren, M. (1985). The p53 cellular tumor antigen: gene structure, expression and protein properties. Biochim Biophys Acta 823(1), 67-78. Oren, M., Maltzman, W., and Levine, A. J. (1981). Post-translational regulation of the 54K cellular tumor antigen in normal and transformed cells. Mol Cell Biol 1(2), 101-10. Owen-Schaub, L. B., Zhang, W., Cusack, J. C., Angelo, L. S., Santee, S. M., Fujiwara, T., Roth, J. A., Deisseroth, A. B., Zhang, W. W., Kruzel, E., and et al. (1995). Wild-type human p53 and a temperature-sensitive mutant induce Fas/APO-1 expression. Mol Cell Biol 15(6), 3032-40. Parris, G. E. (2006). The cell clone ecology hypothesis and the cell fusion model of cancer progression and metastasis: history and experimental support. Med Hypotheses 66(1), 76-83. Passer, B. J., Nancy-Portebois, V., Amzallag, N., Prieur, S., Cans, C., Roborel de Climens, A., Fiucci, G., Bouvard, V., Tuynder, M., Susini, L., Morchoisne, S., Crible, V., Lespagnol, A., Dausset, J., Oren, M., Amson, R., and Telerman, A. (2003). The p53-inducible TSAP6 gene product regulates apoptosis and the cell cycle and interacts with Nix and the Myt1 kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 100(5), 2284-9. Pastorcic, M., and Das, H. K. (2000). Regulation of transcription of the human presenilin-1 gene by ets transcription factors and the p53 protooncogene. J Biol Chem 275(45), 34938-45. Patschinsky, T., and Deppert, W. (1990). Phosphorylation of p53 in primary, immortalised and transformed Balb/c mouse cells. Oncogene 5(7), 1071-6. Peng, C. Y., Graves, P. R., Thoma, R. S., Wu, Z., Shaw, A. S., and Piwnica-Worms, H. (1997). Mitotic and G2 checkpoint control: regulation of 14-3-3 protein binding by phosphorylation of Cdc25C on serine-216. Science 277(5331), 1501-5. Perry, M. E., Piette, J., Zawadzki, J. A., Harvey, D., and Levine, A. J. (1993). The mdm-2 gene is induced in response to UV light in a p53-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A 90(24), 11623-7. Persengiev, S. P., Zhu, X., and Green, M. R. (2004). Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). Rna 10(1), 12-8. Petitjean, A., Achatz, M. I., Borresen-Dale, A. L., Hainaut, P., and Olivier, M. (2007). TP53 mutations in human cancers: functional selection and impact on cancer prognosis and outcomes. Oncogene 26(15), 2157-65. Pinhasi-Kimhi, O., Michalovitz, D., Ben-Zeev, A., and Oren, M. (1986). Specific interaction between the p53 cellular tumour antigen and major heat shock proteins. Nature 320(6058), 182-4. Poon, R. Y., Jiang, W., Toyoshima, H., and Hunter, T. (1996). Cyclin-dependent kinases are inactivated by a combination of p21 and Thr-14/Tyr-15 phosphorylation after UV-induced DNA damage. J Biol Chem 271(22), 13283-91. Preuss, U., Kreutzfeld, R., and Scheidtmann, K. H. (2000). Tumor-derived p53 mutant C174Y is a gain-of-function mutant which activates the fos Promotor and enhances colony formation. Int J Cancer 88(2), 162-71. Prives, C., and Hall, P. A. (1999). The p53 pathway. J Pathol 187(1), 112-26. Literatur 116 Purdie, C. A., Harrison, D. J., Peter, A., Dobbie, L., White, S., Howie, S. E., Salter, D. M., Bird, C. C., Wyllie, A. H., Hooper, M. L., and et al. (1994). Tumour incidence, spectrum and ploidy in mice with a large deletion in the p53 gene. Oncogene 9(2), 603-9. Quackenbush, J. (2001). Computational analysis of microarray data. Nat Rev Genet 2(6), 418-27. Rahman-Roblick, R., Roblick, U. J., Hellman, U., Conrotto, P., Liu, T., Becker, S., Hirschberg, D., Jornvall, H., Auer, G., and Wiman, K. G. (2007). p53 targets identified by protein expression profiling. Proc Natl Acad Sci U S A 104(13), 5401-6. Rastinejad, F., and Blau, H. M. (1993). Genetic complementation reveals a novel regulatory role for 3' untranslated regions in growth and differentiation. Cell 72(6), 903-17. Rastinejad, F., Conboy, M. J., Rando, T. A., and Blau, H. M. (1993). Tumor suppression by RNA from the 3' untranslated region of alpha-tropomyosin. Cell 75(6), 1107-17. Raycroft, L., Wu, H. Y., and Lozano, G. (1990). Transcriptional activation by wild-type but not transforming mutants of the p53 anti-oncogene. Science 249(4972), 1049-51. Reynolds, A., Anderson, E. M., Vermeulen, A., Fedorov, Y., Robinson, K., Leake, D., Karpilow, J., Marshall, W. S., and Khvorova, A. (2006). Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna 12(6), 988-93. Rodriguez, M. S., Desterro, J. M., Lain, S., Midgley, C. A., Lane, D. P., and Hay, R. T. (1999). SUMO1 modification activates the transcriptional response of p53. Embo J 18(22), 6455-61. Rohaly, G., Chemnitz, J., Dehde, S., Nunez, A. M., Heukeshoven, J., Deppert, W., and Dornreiter, I. (2005). A novel human p53 isoform is an essential element of the ATR-intra-S phase checkpoint. Cell 122(1), 21-32. Rotter, V., Wolf, D., Pravtcheva, D., and Ruddle, F. H. (1984). Chromosomal assignment of the murine gene encoding the transformation-related protein p53. Mol Cell Biol 4(2), 383-5. Rouault, J. P., Falette, N., Guehenneux, F., Guillot, C., Rimokh, R., Wang, Q., Berthet, C., MoyretLalle, C., Savatier, P., Pain, B., Shaw, P., Berger, R., Samarut, J., Magaud, J. P., Ozturk, M., Samarut, C., and Puisieux, A. (1996). Identification of BTG2, an antiproliferative p53dependent component of the DNA damage cellular response pathway. Nat Genet 14(4), 4826. Rubbi, C. P., and Milner, J. (2003). p53 is a chromatin accessibility factor for nucleotide excision repair of DNA damage. Embo J 22(4), 975-86. Ryan, J. J., Danish, R., Gottlieb, C. A., and Clarke, M. F. (1993). Cell cycle analysis of p53-induced cell death in murine erythroleukemia cells. Mol Cell Biol 13(1), 711-9. Sadler, A. J., and Williams, B. R. (2007). Structure and function of the protein kinase R. Curr Top Microbiol Immunol 316, 253-92. Samad, A., and Carroll, R. B. (1991). The tumor suppressor p53 is bound to RNA by a stable covalent linkage. Mol Cell Biol 11(3), 1598-606. Sampath, J., Sun, D., Kidd, V. J., Grenet, J., Gandhi, A., Shapiro, L. H., Wang, Q., Zambetti, G. P., and Schuetz, J. D. (2001). Mutant p53 cooperates with ETS and selectively up-regulates human MDR1 not MRP1. J Biol Chem 276(42), 39359-67. Epub 2001 Aug 1. Schmitt, E., Paquet, C., Beauchemin, M., and Bertrand, R. (2007). DNA-damage response network at the crossroads of cell-cycle checkpoints, cellular senescence and apoptosis. J Zhejiang Univ Sci B 8(6), 377-97. Schuler, M., Bossy-Wetzel, E., Goldstein, J. C., Fitzgerald, P., and Green, D. R. (2000). p53 induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. J Biol Chem 275(10), 7337-42. Scian, M. J., Stagliano, K. E., Anderson, M. A., Hassan, S., Bowman, M., Miles, M. F., Deb, S. P., and Deb, S. (2005). Tumor-derived p53 mutants induce NF-kappaB2 gene expression. Mol Cell Biol 25(22), 10097-110. Semizarov, D., Frost, L., Sarthy, A., Kroeger, P., Halbert, D. N., and Fesik, S. W. (2003). Specificity of short interfering RNA determined through gene expression signatures. Proc Natl Acad Sci U S A 100(11), 6347-52. Shabalina, S. A., and Spiridonov, N. A. (2004). The mammalian transcriptome and the function of noncoding DNA sequences. Genome Biol 5(4), 105. Sharpless, N. E., and DePinho, R. A. (1999). The INK4A/ARF locus and its two gene products. Curr Opin Genet Dev 9(1), 22-30. Shaulsky, G., Goldfinger, N., and Rotter, V. (1991). Alterations in tumor development in vivo mediated by expression of wild type or mutant p53 proteins. Cancer Res 51(19), 5232-7. Shaulsky, G., Goldfinger, N., Tosky, M. S., Levine, A. J., and Rotter, V. (1991). Nuclear localization is essential for the activity of p53 protein. Oncogene 6(11), 2055-65. Shaw, P., Bovey, R., Tardy, S., Sahli, R., Sordat, B., and Costa, J. (1992). Induction of apoptosis by wild-type p53 in a human colon tumor-derived cell line. Proc Natl Acad Sci U S A 89(10), 4495-9. Literatur 117 Sherr, C. J. (1998). Tumor surveillance via the ARF-p53 pathway. Genes Dev 12(19), 2984-91. Sherr, C. J. (2001). The INK4a/ARF network in tumour suppression. Nat Rev Mol Cell Biol 2(10), 7317. Shetty, S., Velusamy, T., Idell, S., Shetty, P., Mazar, A. P., Bhandary, Y. P., and Shetty, R. S. (2007). Regulation of urokinase receptor expression by p53: novel role in stabilization of uPAR mRNA. Mol Cell Biol 27(16), 5607-18. Shi, H., Hoffman, B. E., and Lis, J. T. (1999). RNA aptamers as effective protein antagonists in a multicellular organism. Proc Natl Acad Sci U S A 96(18), 10033-8. Shibue, T., Takeda, K., Oda, E., Tanaka, H., Murasawa, H., Takaoka, A., Morishita, Y., Akira, S., Taniguchi, T., and Tanaka, N. (2003). Integral role of Noxa in p53-mediated apoptotic response. Genes Dev 17(18), 2233-8. Shohat, O., Greenberg, M., Reisman, D., Oren, M., and Rotter, V. (1987). Inhibition of cell growth mediated by plasmids encoding p53 anti-sense. Oncogene 1(3), 277-83. Shyu, A. B., and Wilkinson, M. F. (2000). The double lives of shuttling mRNA binding proteins. Cell 102(2), 135-8. Sjoblom, T., Jones, S., Wood, L. D., Parsons, D. W., Lin, J., Barber, T. D., Mandelker, D., Leary, R. J., Ptak, J., Silliman, N., Szabo, S., Buckhaults, P., Farrell, C., Meeh, P., Markowitz, S. D., Willis, J., Dawson, D., Willson, J. K., Gazdar, A. F., Hartigan, J., Wu, L., Liu, C., Parmigiani, G., Park, B. H., Bachman, K. E., Papadopoulos, N., Vogelstein, B., Kinzler, K. W., and Velculescu, V. E. (2006). The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers. Science 314(5797), 268-74. Sledz, C. A., Holko, M., de Veer, M. J., Silverman, R. H., and Williams, B. R. (2003). Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat Cell Biol 5(9), 834-9. Slingerland, J. M., Jenkins, J. R., and Benchimol, S. (1993). The transforming and suppressor functions of p53 alleles: effects of mutations that disrupt phosphorylation, oligomerization and nuclear translocation. Embo J 12(3), 1029-37. Smith, M. L., Chen, I. T., Zhan, Q., Bae, I., Chen, C. Y., Gilmer, T. M., Kastan, M. B., O'Connor, P. M., and Fornace, A. J., Jr. (1994). Interaction of the p53-regulated protein Gadd45 with proliferating cell nuclear antigen. Science 266(5189), 1376-80. Soussi, T. (2007). p53 alterations in human cancer: more questions than answers. Oncogene 26(15), 2145-56. Soussi, T., and Beroud, C. (2001). Assessing TP53 status in human tumours to evaluate clinical outcome. Nat Rev Cancer 1(3), 233-40. Soussi, T., Ishioka, C., Claustres, M., and Beroud, C. (2006). Locus-specific mutation databases: pitfalls and good practice based on the p53 experience. Nat Rev Cancer 6(1), 83-90. Stein, C. A. (1995). Does antisense exist? Nat Med 1(11), 1119-21. Steinmeyer, K., and Deppert, W. (1988). DNA binding properties of murine p53. Oncogene 3(5), 5017. Steinmeyer, K., Maacke, H., and Deppert, W. (1990). Cell cycle control by p53 in normal (3T3) and chemically transformed (Meth A) mouse cells. I. Regulation of p53 expression. Oncogene 5(11), 1691-9. Stiewe, T. (2007). The p53 family in differentiation and tumorigenesis. Nat Rev Cancer 7(3), 165-8. Stojdl, D. F., Lichty, B., Knowles, S., Marius, R., Atkins, H., Sonenberg, N., and Bell, J. C. (2000). Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolytic virus. Nat Med 6(7), 821-5. Stott, F. J., Bates, S., James, M. C., McConnell, B. B., Starborg, M., Brookes, S., Palmero, I., Ryan, K., Hara, E., Vousden, K. H., and Peters, G. (1998). The alternative product from the human CDKN2A locus, p14(ARF), participates in a regulatory feedback loop with p53 and MDM2. Embo J 17(17), 5001-14. Strano, S., and Blandino, G. (2003). p73-mediated chemosensitivity: a preferential target of oncogenic mutant p53. Cell Cycle 2(4), 348-9. Strano, S., Dell'Orso, S., Di Agostino, S., Fontemaggi, G., Sacchi, A., and Blandino, G. (2007). Mutant p53: an oncogenic transcription factor. Oncogene 26(15), 2212-9. Strano, S., Fontemaggi, G., Costanzo, A., Rizzo, M. G., Monti, O., Baccarini, A., Del Sal, G., Levrero, M., Sacchi, A., Oren, M., and Blandino, G. (2002). Physical interaction with human tumorderived p53 mutants inhibits p63 activities. J Biol Chem 277(21), 18817-26. Sturzbecher, H. W., Brain, R., Addison, C., Rudge, K., Remm, M., Grimaldi, M., Keenan, E., and Jenkins, J. R. (1992). A C-terminal alpha-helix plus basic region motif is the major structural determinant of p53 tetramerization. Oncogene 7(8), 1513-23. Sugimura, T., Terada, M., Yokota, J., Hirohashi, S., and Wakabayashi, K. (1992). Multiple genetic alterations in human carcinogenesis. Environ Health Perspect 98, 5-12. Literatur 118 Susse, S., Janz, C., Janus, F., Deppert, W., and Wiesmuller, L. (2000). Role of heteroduplex joints in the functional interactions between human Rad51 and wild-type p53. Oncogene 19(39), 450012. Takekawa, M., Adachi, M., Nakahata, A., Nakayama, I., Itoh, F., Tsukuda, H., Taya, Y., and Imai, K. (2000). p53-inducible wip1 phosphatase mediates a negative feedback regulation of p38 MAPK-p53 signaling in response to UV radiation. Embo J 19(23), 6517-26. Takenaka, I., Morin, F., Seizinger, B. R., and Kley, N. (1995). Regulation of the sequence-specific DNA binding function of p53 by protein kinase C and protein phosphatases. J Biol Chem 270(10), 5405-11. Tamayo, P., Slonim, D., Mesirov, J., Zhu, Q., Kitareewan, S., Dmitrovsky, E., Lander, E. S., and Golub, T. R. (1999). Interpreting patterns of gene expression with self-organizing maps: methods and application to hematopoietic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 96(6), 2907-12. Tanikawa, C., Matsuda, K., Fukuda, S., Nakamura, Y., and Arakawa, H. (2003). p53RDL1 regulates p53-dependent apoptosis. Nat Cell Biol 5(3), 216-23. Thut, C. J., Chen, J. L., Klemm, R., and Tjian, R. (1995). p53 transcriptional activation mediated by coactivators TAFII40 and TAFII60. Science 267(5194), 100-4. Tsutsumi-Ishii, Y., Tadokoro, K., Hanaoka, F., and Tsuchida, N. (1995). Response of heat shock element within the human HSP70 Promotor to mutated p53 genes. Cell Growth Differ 6(1), 18. Ueba, T., Nosaka, T., Takahashi, J. A., Shibata, F., Florkiewicz, R. Z., Vogelstein, B., Oda, Y., Kikuchi, H., and Hatanaka, M. (1994). Transcriptional regulation of basic fibroblast growth factor gene by p53 in human glioblastoma and hepatocellular carcinoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A 91(19), 9009-13. Varley, J. M., McGown, G., Thorncroft, M., Santibanez-Koref, M. F., Kelsey, A. M., Tricker, K. J., Evans, D. G., and Birch, J. M. (1997). Germ-line mutations of TP53 in Li-Fraumeni families: an extended study of 39 families. Cancer Res 57(15), 3245-52. Venkatachalam, S., and Donehower, L. A. (1998). Murine tumor suppressor models. Mutat Res 400(12), 391-407. Venkatachalam, S., Tyner, S. D., Pickering, C. R., Boley, S., Recio, L., French, J. E., and Donehower, L. A. (2001). Is p53 haploinsufficient for tumor suppression? Implications for the p53+/- mouse model in carcinogenicity testing. Toxicol Pathol 29 Suppl, 147-54. Villunger, A., Michalak, E. M., Coultas, L., Mullauer, F., Bock, G., Ausserlechner, M. J., Adams, J. M., and Strasser, A. (2003). p53- and drug-induced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins puma and noxa. Science 302(5647), 1036-8. Vogelstein, B., Fearon, E. R., Hamilton, S. R., Kern, S. E., Preisinger, A. C., Leppert, M., Nakamura, Y., White, R., Smits, A. M., and Bos, J. L. (1988). Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med 319(9), 525-32. Vogelstein, B., Lane, D., and Levine, A. J. (2000). Surfing the p53 network. Nature 408(6810), 307-10. Waga, S., Hannon, G. J., Beach, D., and Stillman, B. (1994). The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA. Nature 369(6481), 574-8. Waldman, T., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1995). p21 is necessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancer cells. Cancer Res 55(22), 5187-90. Wallace-Brodeur, R. R., and Lowe, S. W. (1999). Clinical implications of p53 mutations. Cell Mol Life Sci 55(1), 64-75. Walter, K., Warnecke, G., Bowater, R., Deppert, W., and Kim, E. (2005). tumor suppressor p53 binds with high affinity to CTG.CAG trinucleotide repeats and induces topological alterations in mismatched duplexes. J Biol Chem 280(52), 42497-507. Wang, X. J., Greenhalgh, D. A., Jiang, A., He, D., Zhong, L., Brinkley, B. R., and Roop, D. R. (1998a). Analysis of centrosome abnormalities and angiogenesis in epidermal-targeted p53172H mutant and p53-knockout mice after chemical carcinogenesis: evidence for a gain of function. Mol Carcinog 23(3), 185-92. Wang, X. J., Greenhalgh, D. A., Jiang, A., He, D., Zhong, L., Medina, D., Brinkley, B. R., and Roop, D. R. (1998b). Expression of a p53 mutant in the epidermis of transgenic mice accelerates chemical carcinogenesis. Oncogene 17(1), 35-45. Waterman, M. J., Stavridi, E. S., Waterman, J. L., and Halazonetis, T. D. (1998). ATM-dependent activation of p53 involves dephosphorylation and association with 14-3-3 proteins. Nat Genet 19(2), 175-8. Waterston, R. H., Lindblad-Toh, K., Birney, E., Rogers, J., Abril, J. F., Agarwal, P., Agarwala, R., Ainscough, R., Alexandersson, M., An, P., Antonarakis, S. E., Attwood, J., Baertsch, R., et al. (2002). Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420(6915), 520-62. Literatur 119 Wei, C. L., Wu, Q., Vega, V. B., Chiu, K. P., Ng, P., Zhang, T., Shahab, A., Yong, H. C., Fu, Y., Weng, Z., Liu, J., Zhao, X. D., Chew, J. L., Lee, Y. L., Kuznetsov, V. A., Sung, W. K., Miller, L. D., Lim, B., Liu, E. T., Yu, Q., Ng, H. H., and Ruan, Y. (2006). A global map of p53 transcriptionfactor binding sites in the human genome. Cell 124(1), 207-19. Weighardt, F., Biamonti, G., and Riva, S. (1996). The roles of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNP) in RNA metabolism. Bioessays 18(9), 747-56. Weinberg, R. A. (1989). Oncogenes, antioncogenes, and the molecular bases of multistep carcinogenesis. Cancer Res 49(14), 3713-21. Weissker, S. N., Muller, B. F., Homfeld, A., and Deppert, W. (1992). Specific and complex interactions of murine p53 with DNA. Oncogene 7(10), 1921-32. Weissman, I. (2005). Stem cell research: paths to cancer therapies and regenerative medicine. Jama 294(11), 1359-66. Weisz, L., Oren, M., and Rotter, V. (2007). Transcription regulation by mutant p53. Oncogene 26(15), 2202-11. Werner, H., Karnieli, E., Rauscher, F. J., and LeRoith, D. (1996). Wild-type and mutant p53 differentially regulate transcription of the insulin-like growth factor I receptor gene. Proc Natl Acad Sci U S A 93(16), 8318-23. White, R. J. (2005). RNA polymerases I and III, growth control and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol 6(1), 69-78. Will, K., Warnecke, G., Albrechtsen, N., Boulikas, T., and Deppert, W. (1998a). High affinity MAR-DNA binding is a common property of murine and human mutant p53. J Cell Biochem 69(3), 26070. Will, K., Warnecke, G., Wiesmuller, L., and Deppert, W. (1998b). Specific interaction of mutant p53 with regions of matrix attachment region DNA elements (MARs) with a high potential for baseunpairing. Proc Natl Acad Sci U S A 95(23), 13681-6. Williams, B. R. (1999). PKR; a sentinel kinase for cellular stress. Oncogene 18(45), 6112-20. Workman, J. L., and Kingston, R. E. (1998). Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annu Rev Biochem 67, 545-79. Wu, X., Bayle, J. H., Olson, D., and Levine, A. J. (1993). The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop. Genes Dev 7(7A), 1126-32. Xiong, Y., Hannon, G. J., Zhang, H., Casso, D., Kobayashi, R., and Beach, D. (1993). p21 is a universal inhibitor of cyclin kinases. Nature 366(6456), 701-4. Yamauchi, Y., Kobayashi, M., and Tanaka, A. (1996). Application of a dicistronic mRNA expression vector to antisense RNA expression in mammalian cells. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6(4), 305-9. Yang, X., Pater, A., and Tang, S. C. (1999). Cloning and characterization of the human BAG-1 gene Promotor: upregulation by tumor-derived p53 mutants. Oncogene 18(32), 4546-53. Yang, Z., Ro, S., and Rannala, B. (2003). Likelihood models of somatic mutation and codon substitution in cancer genes. Genetics 165(2), 695-705. Yang, Z., Tulu, U. S., Wadsworth, P., and Rieder, C. L. (2007). Kinetochore dynein is required for chromosome motion and congression independent of the spindle checkpoint. Curr Biol 17(11), 973-80. Yeh, T. Y., Chuang, J. Z., and Sung, C. H. (2005). Dynein light chain rp3 acts as a nuclear matrixassociated transcriptional modulator in a dynein-independent pathway. J Cell Sci 118(Pt 15), 3431-43. Yin, Y., Liu, Y. X., Jin, Y. J., Hall, E. J., and Barrett, J. C. (2003). PAC1 phosphatase is a transcription target of p53 in signalling apoptosis and growth suppression. Nature 422(6931), 527-31. Yonish-Rouach, E., Resnitzky, D., Lotem, J., Sachs, L., Kimchi, A., and Oren, M. (1991). Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukin-6. Nature 352(6333), 345-7. Yoon, H., Liyanarachchi, S., Wright, F. A., Davuluri, R., Lockman, J. C., de la Chapelle, A., and Pellegata, N. S. (2002). Gene expression profiling of isogenic cells with different TP53 gene dosage reveals numerous genes that are affected by TP53 dosage and identifies CSPG2 as a direct target of p53. Proc Natl Acad Sci U S A 99(24), 15632-7. Yu, J., Zhang, L., Hwang, P. M., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (2001). PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells. Mol Cell 7(3), 673-82. Zalcenstein, A., Stambolsky, P., Weisz, L., Muller, M., Wallach, D., Goncharov, T. M., Krammer, P. H., Rotter, V., and Oren, M. (2003). Mutant p53 gain of function: repression of CD95(Fas/APO-1) gene expression by tumor-associated p53 mutants. Oncogene 22(36), 5667-76. Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A., and Bartel, D. P. (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101(1), 25-33. Literatur 120 Zerrahn, J., Deppert, W., Weidemann, D., Patschinsky, T., Richards, F., and Milner, J. (1992). Correlation between the conformational phenotype of p53 and its subcellular location. Oncogene 7(7), 1371-81. Zhan, Q., Antinore, M. J., Wang, X. W., Carrier, F., Smith, M. L., Harris, C. C., and Fornace, A. J., Jr. (1999). Association with Cdc2 and inhibition of Cdc2/Cyclin B1 kinase activity by the p53regulated protein Gadd45. Oncogene 18(18), 2892-900. Zhang, Y. F., Homer, C., Edwards, S. J., Hananeia, L., Lasham, A., Royds, J., Sheard, P., and Braithwaite, A. W. (2003). Nuclear localization of Y-box factor YB1 requires wild-type p53. Oncogene 22(18), 2782-94. Zhang, Z., Weinschenk, T., Guo, K., and Schluesener, H. J. (2006). siRNA binding proteins of microglial cells: PKR is an unanticipated ligand. J Cell Biochem 97(6), 1217-29. Zhu, J., and Chen, X. (2000). MCG10, a novel p53 target gene that encodes a KH domain RNAbinding protein, is capable of inducing apoptosis and cell cycle arrest in G(2)-M. Mol Cell Biol 20(15), 5602-18. Zink, D., Mayr, C., Janz, C., and Wiesmuller, L. (2002). Association of p53 and MSH2 with recombinative repair complexes during S phase. Oncogene 21(31), 4788-800. Anhang 121 7 Anhang 7.1 Liste der durch ChIP-Seq identifizierten DNA-Fragmente 154 DNA-Fragmente wurden mithilfe des Online-Programms Blat (http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgBlat) auf Chromosomen (Mouse March 2005 (mm6) assembly) lokalisiert. DNAFragment XM3-40 SM2-27 XM3-5 XM2-32 SM2-40 XM2-21 SM2-32A XM2-51 SM3-14 XM3-18 XM2-2B XM2-26 SM2-47 SM3-1 SM3-10 SM3-28 SM2-36 SM2-32B XM3-39 SM2-30 SM3-31 XM3-8 XM2-9 XM2-6 SM2-44 XM3-45 SM2-42 XM2-19 SM2-34 SM2-48 XM3-16 XM3-47 SM2-3A XM2-17 SM3-18 XM2-16 SM3-19 XM3-48 XM2-39 XM3-14 SM2-19 XM3-33 Genomlokalisation chr1:100922902-100923391 chr1:110872710-110873292 chr1:115904942-115905360 chr1:119281235-119281493 chr1:130301581-130302129 chr1:155072699-155072824 chr1:17263950-17264285 chr1:178802679-178803148 chr1:181243523-181243875 chr1:190421479-190421935 chr1:192831416-192831683 chr1:22107150-22107504 chr1:41822664-41822809 chr1:64950547-64950727 chr10:87923498-87924020 chr10:127283999-127284393 chr10:129672449-129672810 chr11:22916455-22916555 chr11:45404130-45404584 chr11:52949738-52950144 chr11:59090488-59090899 chr11:83968347-83968721 chr11:85870829-85871435 chr11:100270893-100271425 chr11:110063482-110063728 chr11:112419972-112420147 chr12:19071553-19071879 chr12:21006186-21006653 chr12:37063380-37063889 chr12:57831673-57831835 chr12:70088943-70089586 chr12:93111415-93112042 chr12:94692464-94692491 chr12:103669250-103669700 chr12:110370465-110504737 chr12:111777906-111778337 chr13:33235925-33236621 chr13:36574575-36574830 chr13:52461390-52461749 chr13:59882731-59883088 chr13:65841210-65841494 chr13:73935063-73935304 Genname Cntnap5a AK084486 Cd55 Stx6 Jph1 Kif26b Kcnq5 AK149593 Lrp1 4930430E16Rik Acaca Brip1 Klhl10 Abca6/off Dock4 Mnat1 Ccnk F13a1 1110033M05Rik Anhang 122 SM3-32 SM3-16 XM2-14 XM3-2 SM2-6 SM2-28A SM2-22 XM2-49A SM3-29 XM2-20 SM3-9 SM3-3 SM3-25 XM3-20 SM3-49 SM2-16 XM2-43 SM2-29 XM3-13 XM2-25 XM3-11 SM2-31A XM2-48 SM2-9 SM2-46 SM2-2 XM3-50 SM2-25 SM2-24 SM3-43 SM3-2 SM3-13 SM2-35 XM2-5 XM3-21 SM2-49 SM2-23 XM3-6 XM3-24B SM2-8 XM2-15 SM2-7 SM3-36 SM3-8 SM3-20 XM3-1A XM3-31 SM2-3B SM2-20 SM3-6 SM3-37 SM2-28B XM2-33 chr13:99183842-99184372 chr13:99484189-99484451 chr14:18556719-18556933 chr14:41304927-41305522 chr14:70561352-70561670 chr14:81718208-81718611 chr14:93962705-93962839 chr14:97675635-97675817 chr15:55441132-55441619 chr15:95390735-95390803 chr16:14463415-14463718 chr16:20413303-20413763 chr16:21469874-21470035 chr16:29976600-299771811 chr16:41150667-41151214 chr16:43334385-43335011 chr16:47684430-47684631 chr16:49885647-49886087 chr16:89994660-89995158 chr16:96292955-96293051 chr17:23095666-23095840 chr17:23433193-23433639 chr17:23659512-23659900 chr17:23807121-23807745 chr17:26075811-26076300 chr17:32716443-32716740 chr17:40705500-40705658 chr17:51339139-51339504 chr17:65681089-65681236 chr17:76695094-76695486 chr17:77262413-77262638 chr18:36310385-36310898 chr18:43432621-43432771 chr18:61103095-61103692 chr18:66793900-66794078 chr18:79504146-79504337 chr19:50487835-50488031 chr2:28684414-28684952 chr2:54269521-54269698 chr2:81848523-81848834 chr2:91343830-91344348 chr2:93593947-93594281 chr2:103798804-103799270 chr2:112761956-112762402 chr2:125011710-125011984 chr2:141552919-141553521 chr2:158349510-158349845 chr2:170097661-170097691 chr3:7935448-7935490 chr3:10351205-10351848 chr3:22572702-22572955 chr3:37335515-37335694 chr3:59020429-59020912 Mast4 Mast4 Phr1 Col14a1 Nell2 Prkdc Vps8 Centb2 Gap43 4931408A02Rik Dscam Tmem112 3230401M21Rik Rab11fip3 Ppard Vars2 Arhgap28 Eif2ak2 Stk32a 1190002A17Rik Zfp804a AK139637 Gm1967 Ryr3 Fbn1 Macrod2 4930470P17Rik Zfand1 Anhang 123 SM2-31B XM3-1B XM3-37 SM2-18 SM2-43 XM2-45 SM3-39 XM3-29 XM2-35 XM2-18 XM3-32 SM2-5 SM2-26A XM2-12 XM2-28 SM3-40 SM3-42 XM2-36 XM2-3 SM2-26B XM3-10 XM2-29 SM3-21 XM3-54 SM2-37 SM3-48 XM2-54 XM3-24A SM3-34 SM2-45 SM3-38 SM3-47 XM3-28 XM2-23 SM2-14 SM2-4 XM3-9 XM3-12 XM2-13 SM2-39 XM2-1 XM3-46 SM2-38 XM2-49B SM2-21 SM2-33 XM2-31 XM2-41 SM3-17 XM2-38 XM3-43 XM2-22 XM2-40 chr3:68271901-68271922 chr3:110583558-110583969 chr3:116413732-116414222 chr3:130223865-130224157 chr3:133771697-133771845 chr3:146712687-146712847 chr3:149259554-149259772 chr4:33862664-33863277 chr4:37388347-37388539 chr4:48846906-48847447 chr4:81028054-81028404 chr4:84085681-84085709 chr4:118183799-118183925 chr4:141748092-141748350 chr4:143841892-143842147 chr5:14855819-14856121 chr5:44255409-44255887 chr5:83079137-83079379 chr5:112085370-112085401 chr5:117081602-117081804 chr5:141404703-141404954 chr6:44119030-44119215 chr6:85870980-85871662 chr6:121125643-121126279 chr6:125571415-125571732 chr6:129424841-129425110 chr6:132649697-132650127 chr7:6787507-6787697 chr7:15100441-15100895 chr7:47651282-47651384 chr7:76453009-76453459 chr7:93414748-93415141 chr7:134422660-134423340 chr8:7933235-7933539 chr8:69229997-69230738 chr8:77357904-77358458 chr8:79619235-79619428 chr8:86567305-86567499 chr8:88871928-88872302 chr8:106831030-106831354 chr8:112873278-112873554 chr8:119800638-119800809 chr8:125047080-125047469 chr9:8156438-8156768 chr9:35751586-35752301 chr9:42103352-42103813 chr9:42714403-42714691 chr9:49945382-49945695 chr9:52670176-52670736 chr9:70411728-70411955 chr9:79800284-79800580 chr9:118302228-118302411 chrX:7643781-7644305 4833424O15Rik Cyp2u1 Tacr3 AK048554 AK036601 D530005L17Rik BC035522 AK018156 Dhrs3 Lap3 Adrbk2 Nos1 Ptms AK081635 Mtap6 Tubgcp2 Tm6sf2 Wwp2 Pcnxl2 AK020329 AK136151 Grik4 Myo1e Anhang 124 SM3-22 SM2-10 SM2-50 XM2-37 SM3-23 SM3-45 chrX:44941502-44941638 chrX:47610410-47610561 chrX:52976999-52977187 chrX:119652483-119652726 chrX:123160783-123161294 chrX:137591759-137592048 Tabelle 8 Lokalisation der 154 sequenzierten mutp53-kopräzipitierten DNA-Fragmente im Mausgenom. Nicht aufgeführt sind DNA Fragmente, die aufgrund ihrer repetitiven Sequenzen keinem Chromosom zugeordnet werden konnten. 7.2 Liste der differentiell regulierten Gene zwischen mit pSUPscr und pSUPshp53 transfizierten MethA Zellen 24h nach Transfektion Genname 1810073N04Rik 5830443L24Rik Akt1 Azi2 Bcl2l1 Ccl4 Cdc23 Cdc42bpa Chd3 Cxcl10 Dync1h1 Fut8 Galnt7 Ganab Gbp1 Gbp5 Gtpbp1 Jub Mgat1 Mtmr1 Mx1 Notch1 Oas2 Ogfr Parp3 Rsad2 Sec15l2 Stat6 Tes Tinagl Trp53 U2af2 U59758 Proteinname thymoma viral proto-oncogene 1 5-azacytidine induced gene 2 Bcl2-like 1 chemokine (C-C motif) ligand 4 cell division cycle 23, yeast, homolog Cdc42 binding protein kinase alpha, transcript variant 11 chromodomain helicase DNA binding protein 3 chemokine (C-X-C motif) ligand 10 dynein cytoplasmic 1 heavy chain 1 fucosyltransferase 8 UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine: polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 7 alpha glucosidase 2 alpha neutral subunit guanylate nucleotide binding protein 1 guanylate nucleotide binding protein 5 GTP binding protein 1 ajuba (Jub) mannoside acetylglucosaminyltransferase 1 myotubularin related protein 1 myxovirus (influenza virus) resistance 1 notch-1 2'-5' oligoadenylate synthetase 2 opioid growth factor receptor poly(ADP-ribose) polymerase 3 radical S-adenosyl methionine domain containing 2 SEC15-like 2 (S. cerevisiae) signal transducer and activator of transcription 6 testis derived transcript tubulointerstitial nephritis antigen-like transformation related protein 53 U2 small nuclear ribonucleoprotein auxiliary factor p53-variant 24-Exp.1 -1,63 -1,63 -1,95 -1,53 -1,58 -1,62 -1,51 24h-Exp.2 -1.85 -1,70 -1,91 -1,51 -1,68 -1,57 -1,63 Mittelwert -1,73 -1,66 -1,93 -1,52 -1,63 -1.60 -1,57 -1,56 -1,50 -1,69 -1,57 -1,51 -1,56 -1,60 -1,61 -2,15 -1,51 -1,56 -1,55 -1,65 -1,84 -1,51 -1,66 -2,17 -1,52 -1,63 -1,87 -1,55 -1,59 -1,77 -1,53 -1,55 -1,51 -1,71 -1,53 -1,75 -1,76 -1,68 -1,79 -1,98 -1,97 -1,62 -1.64 -1,61 -1,59 -1,74 -1,66 -1,97 -1,70 -1,97 -1,60 -1,71 -1,92 -1,75 -1,60 -1,70 -1,57 -1,57 -1,62 -1,68 -1,75 -1,58 -1,76 -2,13 -1,65 -1,96 -2,36 -1,71 -1,85 -2,21 -1,58 -1,75 -1,97 -1,64 -1,80 -2,17 -1,61 -1,86 -2,16 -1,54 -2,51 -1,80 -1,88 -1,67 -2,18 Anhang Ube1x Usp47 Zcchc11 Zfp180 Zfp445 1810026B05Rik 1810035L17Rik 2010109N14Rik 2810026P18Rik 4632404H12Rik 5832418A03Rik Csnk1d Ctnnb1 Cugbp2 Fhl1 Hmgcs1 Mitf Myo1e Olfr430 Rap1gap Rpl41 Rpl5 Rps13 Runx1t1 Vps53 Wasf2 125 ubiquitin-activating enzyme E1, Chr X ubiquitin specific peptidase 47 zinc finger, CCHC domain containing 11 zinc finger protein 180 zinc finger protein 445 -1,82 -1,66 -1,80 -1,60 -1,74 -1,71 -1,63 -1,55 -1,75 -1,51 -1,76 -1,64 -1,67 -1,67 -1,62 casein kinase 1, delta catenin beta CUG triplet repeat, RNA binding protein 2 four and a half LIM domains 1 hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (EC 4.1.3.5) microphthalmia-associated transcription factor myosin IE olfactory receptor 430 Rap1 GTPase-activating protein ribosomal protein L41 ribosomal protein L5 ribosomal protein S13 runt-related transcription factor 1(cyclin D-related) vacuolar protein sorting 53 WAS protein family, member 2 1,82 1,69 1,82 1,59 1,80 1,61 1,52 1,58 1,61 1,53 2,12 1,53 1,70 1,63 1,67 1,51 1,50 1,59 1,91 1,64 1,57 2,24 1,58 1,85 1,90 1,67 1,53 1,53 1,75 1,55 1,77 3,54 1,50 1,74 1,66 1,56 1,73 1,57 1,85 1,67 1,58 1,68 2,03 1,64 1,83 1,74 1,73 1,57 1,52 1,66 1,58 1,64 2,83 1,52 1,72 1,64 1,61 1,61 1,53 1,72 1,79 1,61 1,62 Tabelle 9 Liste der differentiell regulierten Gene. Für diese Analyse wurden Expressionsdaten aus 2 Experimenten 24 h nach Transfektion mit pSUPscr bzw pSUPshp53 Vektoren verwendet. Bei der Auswertung der Daten wurden p<0,01; 1,5-fache Expressionsänderung und Hintergrundsubtraktion von 50 als Filterkriterien verwendet. Die Expressionsänderung ist als Änderung des Ratios zwischen scr und shp53 angegeben. 7.3 Liste der durch die RNA-IP identifizierten mutp53 gebundenen Transkripte Lokalisation im Genom chr1:130,104,527-130,105,138 Genname Ubxd2 chr1:133,738,226-133,752,187 Nucks1 chr1:135,431,422-135,437,792 chr1:196,804,522-196,815,510 chr1:43,067,623-43,068,032 chr10:128,315,434-128,315,773 chr10:82,179,804-82,180,193 Snrpe Crry Fhl2 Cd63 Nfyb chr11:120,421,651-120,421,769 Anapc11 chr11:22,902,173-22,903,335 chr11:78,008,211-78,008,383 chr11:80,287,654-80,288,129 Cct4 Cox7c (pseudogene) Rab34 Psmd11 chr11:83,322,777-83,322,934 Taf15 chr11:75,415,828-75,416,241 Proteinname UBX domain containing 2 nuclear, casein kinase and cyclindependent small nuclear ribonucleoprotein E complement receptor related protein four and a half LIM domains 2 Cd63 antigen nuclear transcription factor-Y beta anaphase promoting complex subunit 11 homolog chaperonin subunit 4 (delta) Cytochrome c oxidase polypeptide VIIc, mitochondrial precursor RAB34, member of RAS oncogene family proteasome 26S non-ATPase subunit 11 TAF15 RNA polymerase II, TATA box binding Anhang 126 chr11:88,646,882-88,647,084 chr12:55,778,431-55,778,987 chr12:70,291,954-70,292,393 chr13:3,564,953-3,565,061 chr14:23,323,169-23,328,322 chr14:45,697,547-45,697,905 chr14:50,996,750-50,996,984 chr15:36,716,143-36,716,569 chr15:97,072,165-97,072,388 chr16:55,941,511-55,941,646 Akap1 Cfl2 Arf6 Gdi2 Rps24 Cnih Hnrpc Ywhaz Amigo2 Pcnp (pseudogene) chr16:91,814,080-91,820,421 Atp5o chr17:33,606,490-33,606,636 chr17:34,604,781-34,604,964 chr17:34,875,046-34,875,406 chr17:45,610,971-45,611,214 H2-K1 RLTR11A H2-D1 Mad2l1bp chr19:43,553,063-43,553,355 Got1 chr19:45,803,573-45,803,779 Mgea5 chr19:60,823,467-60,827,632 chr19:7,265,255-7,265,529 chr2:152,583,594-152,585,360 chr2:25,565,064-25,565,561 chr2:29,892,509-29,893,438 chr2:32,056,394-32,056,534 chr3:103,307,446-103,307,889 chr3:135,403,120-135,403,448 chr3:138,388,383-138,392,708 Eif3s10 Otub1 TPX2 RLTR10C Set (pseudogene) 5830434P21Rik Bcas2 Ube2d3 Adh5 chr3:34,268,979-34,270,827 chr3:94,969,730-94,970,382 chr4:3,761,619-3,762,149 chr5:115,559,465-115,561,565 chr5:121,469,416-121,469,584 chr5:38,519,161-38,522,326 chr7:121,872,836-121,873,748 chr7:126,813,282-126,813,863 chr7:28,023,654-28,023,893 chr8:125,989,320-125,991,325 chr8:126,128,451-126,128,520 chr9:37,398,853-37,399,030 chr9:69,290,658-69,290,950 chrX:102,405,615-102,406,407 chrX:105,364,977-105,365,192 chrX:162,551,198-162,551,304 Akap1 cofilin 2, muscle ADP-ribosylation factor 6 Rab GDP dissociation inhibitor beta ribosomal protein S24 isoform 3 cornichon homolog heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C 14-3-3 protein zeta/delta amphoterin induced gene 2 Pcnp ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 H-2 class I histocompatibility antigen D17H6S56E-5 H-2 class I histocompatibility antigen MAD2L1 binding protein glutamate oxaloacetate transaminase 1, soluble meningioma expressed antigen 5 (hyaluronidase) eukaryotic translation initiation factor 3 OTU domain, ubiquitin aldehyde binding 1 microtubule-associated protein homolog Phosphatase 2A inhibitor hypothetical protein LOC227723 breast carcinoma amplified sequence 2 ubiquitin-conjugating enzyme E2D 3 alcohol dehydrogenase 5 (class III), chi translocase of the inner mitochondrial Dnajc19 membrane Psmb4 proteasome beta 4 subunit Rps20 40S ribosomal protein S20 Dynll1 dynein, cytoplasmic, light peptide Rpl6 60S ribosomal protein L6 Lyar Ly1 antibody reactive clone D7Wsu128e ubiquitin-binding protein homolog Maz MYC-associated zinc finger protein Supt5h suppressor of Ty 5 homolog Rpl13 60S ribosomal protein L13 BC057621 Protein C16orf7 homolog transforming growth factor beta regulated Tbrg1 gene Anxa2 annexin A2 Pgk1 (pseudogene) phosphoglycerate kinase 1 SH3-binding domain glutamic acid-rich Sh3bgrl protein Tmsb4x thymosin, beta 4, X chromosome Tabelle 10 Liste der durch die RIP identifizierten an MethA mutp53 gebundenen Transkripte (55). In gelb sind die 3’ UTR Transkripte markiert. Nicht gezeigt sind 29 B2 und B1 SINE Sequenzen sowie 3 BC1 scRNA. Anhang 127 7.4 Liste der in mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten im Vergleich zu adhärenten MethA Zellen hochregulierten Gene (mit den Filterkriterien 2 fache Hochregulation, p< 0,05 und Signal > 100 (insgesamt 376 Gene)) 1110001D15Rik, 1110034B05Rik, 1700012H17Rik, 1700029F09Rik, 1810032O08Rik, 2010107E04Rik, 2010111I01Rik, 2010300C02Rik, 2310016F22Rik, 2410018M08Rik, 2410104I19Rik, 2610030H06Rik, 4921511I16Rik, 5730521K06Rik, 2610034N15Rik, 4930481A15Rik, 5730596K20Rik, 2610101N10Rik, 2810003C17Rik, 2810022L02Rik, 4930528F23Rik, 4933405A16Rik, 5430435G22Rik, 5830415L20Rik, 5830484A20Rik, 6330409N04Rik, 6330442E10Rik, 9230105E10Rik, 9330175B10Rik, 9630055N22Rik, 9830147J24Rik, Abhd2, Acsl4, Adar, Ahnak, AI132487, AI451617, AI481105, AI607873, AI839735, AK008871, AK032921, AK035950, AK038627, AK040334, AK053808, AK083076, AK162987, Ak3l1, Akap8, Alkbh1, Ammecr1, Ankrd27, Ankrd37, Arhgap10, Arih1, Ascc3, Ash1l, Atm, AV030849, Axud1, Bach1, Baz1a, BC003267, BC006779, BC013561, BC020489, BC050078, BC057170, Bcl2l11, Bst2, Bud31, Bxdc2, C79267, Casp1, Casp12, Casp4, Cav2, Ccdc84, Ccdc88, Ccdc93, Ccl2, Ccl5, Ccl5, Ccl7, Ccne2, Ccnt2, Cd274, Cebpz, Cflar, Chit1, Chmp4b, Clasp1, Col4a3bp, Col8a1, Commd2, Cpne3, Creb1, Cxcl1, Cxcl5, Cyr61, D11Ertd759e, D11Lgp2e, D14Ertd668e, D17H6S56E-5, D330037H05Rik, D630004A14Rik, Dbr1, Dcp2, Ddx21, Ddx23, Ddx24, Ddx46, Ddx58, Ddx6, Dicer1, Dnmt3a, Dusp4, E430034L04Rik, Ehd4, Eif2ak2, Eif2c2, Eif2s1, Eif4g1, Eif5, Elf1, ENSMUST00000073378, ENSMUST00000091560, Esco1, Esd, Etnk1, Ets1, F830028O17Rik, Fbxo33, Fbxo39, Fgfr1op, Fhl2, Frap1, Fubp1, Fyb, Gadd45g, Gbp1, Gbp2, Gbp4, Gdap10, Ggps1, Gjb3, Gls, Gnl3, Golga1, Gprk6, Gsta1, Gsta2, Gtf2f2, Herc5, Hist1h1d, Hnrpdl, Hspa1a, Hspa4l, Ier3, Ier5, Ifi202b, Ifi203, Ifi204, Ifi205, Ifi35, Ifi44, Ifi47, Ifih1, Ifit1, Ifit2, Ifit3, Ifitm3, Ifitm7, Igtp, Iigp1, Iigp2, Il18rap, Il1rl1, Impad1, Ireb2, Irf1, Irf7, Irgm, Isg15, Isg20, Isgf3g, Itgb4bp, Jarid2, Jmjd1a, Josd3, Kitl, Klhl25, Kpna6, Lamc2, Lars2, Lats2, Lcor, Lgals3bp, Lgals9, Lmo7, Lmtk2, LOC382161, LOC545342, LOC545471, LOC673334, LOC676640, Ly6e, Ly96, Mad2l1, Map3k10, Mapk8, Mast4, Mdn1, Med6, Mib1, Mier1, Mitd1, Mpeg1, Mphosph10, Mrpl1, Mrpl46, Mtf2, NAP000727-001, NAP007796-001, NAP112463-1, Narg1l, Ncoa6ip, Neo1, Nfkbiz, Ngfb, Nmb, Nmi, Nmnat1, Nmt2, Noc2l, Nup155, Nup50, Oas1a, Oas1c, Oas1f, Oas3, Oasl1, Oasl2, Ogfr, Orc1l, Orc4l, Pabpc1, Parp12, Parp14, Parp9, Pbef1, Pdcd10, Pdpn, Pfkfb1, Phf11, Phip, Pigt, Piwil4, Pkp3, Plaur, Plec1, Pnpla7, Pnpt1, Pomp, Pop1, Ppl, Prkce, Prkrip1, Prss22, Psma3, Psmb10, Psmd1, Psmd7, Ptar1, Ptgs2, Rab30, Ramp3, Ranbp3, Rasa2, Rbbp4, Rbm27, Rc3h1, Rnf4, Rpl11, Rpl27a, Rps12, Rsbn1, Rtp4, S100a3, S100pbp, Samd9l, Samhd1, Scotin, Senp5, Sf3b1, Sfpq, Sh3gl3, Slc25a37, Slc30a1, Slc6a6, Slfn10, Slfn2, Slfn3, Sltm, Smg7, Socs1, Sp100, Speer3, Speer6-ps1, Stat1, Stat2, Stat3, Stch, Stk4, Taf1a, Tap1, Tapbp, Tardbp, TC1410591, TC1410711, TC1419321, TC1485374, TC1486081, Tfrc, Tgtp, Thrap3, Tlr2, Tlr3, Tm4sf1, Tnfaip3, Tnfrsf26, Tnrc6b, Topors, Tor1aip1, Tor1aip2, Tor3a, Trafd1, Trex1, Trim21, Trim25, Trim30, Trim34, Trip11, Trnt1, Troap, Tsc1, Ttll4, Ube1l, Ube2l6, Ube2v2, Ube3a, Ugcg, Usp18, Usp19, Usp42, Wdfy1, Wdr43, Xpo4, Yars2, Zc3h12c, Zc3hav1, Zcchc2, Zcchc7, Zfand2a, Zfp106, Zfp207, Zfp26, Zfp297b, Zfp367, Zfp386, Zfp451, Zfp472, Zfp606, Zfp672, Zranb2 Anhang 128 7.5 Liste der in mit dsRNA Expressionsvektoren transfizierten im Vergleich zu adhärenten MethA Zellen herunterregulierten Gene (mit den Filterkriterien 2 fache Hochregulation, p< 0,05 und Signal > 100 (insgesamt 403 Gene)) 0610011I04Rik, 0610030E20Rik, 0710001D07Rik, 1110002H13Rik, 1110012J17Rik, 1110032A03Rik, 1110051M20Rik, 1110054M08Rik, 1190002C06Rik, 1190002F15Rik, 1500041N16Rik, 1700009P17Rik, 1700011J10Rik, 1700020I14Rik, 1700052K11Rik, 1700088E04Rik, 1810009M01Rik, 1810014B01Rik, 2010004M13Rik, 2010200O16Rik, 2210010N04Rik, 2310004I03Rik, 2310010J17Rik, 2310039H08Rik, 2310043N10Rik, 2310047A01Rik, 2310067B10Rik, 2410127E16Rik, 2510048L02Rik, 2600003E23Rik, 2700007P21Rik, 2700046G09Rik, 2810004A10Rik, 2810007J24Rik, 2810422J05Rik, 3110062M04Rik, 4631423F02Rik, 4733401H18Rik, 4833409A17Rik, 4921511K06Rik, 4922501C03Rik, 4930579G22Rik, 4930579K19Rik, 4933439F18Rik, 5330426P16Rik, 5430420C16Rik, 5430440L12Rik, 5530400B01Rik, 5730470L24Rik, 5730494N06Rik, 5830408C22Rik, 5830434P21Rik, 6030465E24Rik, 6330403L08Rik, 6330509M05Rik, 6330549H03Rik, 6430567E01Rik, 6530401C20Rik, 9330129D05Rik, 9530077C05Rik, A_51_P256798, A_51_P426986, A230083H22Rik, A730011L01Rik, A930034L06Rik, AA536743, Abca3, Abhd14b, Acad10, Acot2, Acss2, Acyp1, Adam15, Adam9, Adra1b, Adssl1, Aebp1, Agtpbp1, AI316807, AK038845, AK041861, AK076876, AK084660, AK087041, Aldh1l2, Aldh3b1, Aldh6a1, Alg9, Angptl6, Antxr1, Aox1, Ap3b2, Apob48r, Arhgef2, Arntl, Asahl, Atf3, Atf5, Atoh8, Atp6v0a1, Atp8a1, AU040320, Azi1, B230219D22Rik, Bbc3, BC003940, BC008155, BC010787, BC018371, BC027382, BC038156, BC046404, Bcl2, Bphl, Braf, Btbd2, C1s, Calm1, Camk2n2, Carkl, Cbr2, Cbx6, Ccbl1, Ccdc85b, Cdc42ep1, Cdc42ep1, Cds2, Cebpg, Cenpm, Cetn4, Ches1, Cic, Cit, Ckb, Clpb, Cmkor1, Cnih4, Col16a1, Col2a1, Col5a3, Crim1, Crocc, Cth, Cyb5r1, Cyp27a1, Cyp39a1, Cyp4f13, D10Ucla1, D11Ertd333e, D16Ertd472e, D8Ertd354e, D930010J01Rik, Dbp, Dcxr, Ddef2, Ddit3, Dgka, Dhrs7, Dip2c, Dnajc10, Dnalc4, Dscr1l2, Dync1li2, Dynlt1, E130307M08Rik, Egfl7, ENSMUST00000049389, ENSMUST00000055502, Entpd2, Ext2, F730047E07Rik, Fads1, Fads2, Fads3, Fah, Fancl, Fbxw4, Flot1, Flywch1, Fn1, Foxp1, Fts, Fyn, Gadd45a, Galc, Gamt, Glb1, Glce, Glipr2, Gosr1, Gphn, Gpr124, Gpt2, Gramd1b, Grcc10, Gsto2, Gstt2, Gstt3, Gtpbp2, Hcfc1r1, Hdac4, Hdac5, Hddc3, Hexa, Hexb, Hic1, Hip1, Hoxb9, Hs2st1, Ica1l, Ick, Id1, Id2, Id3, Ids, Ier5l, Ift122, Ift172, Ift80, Il4i1, Itgb5, Jund1, Jundm2, Kazald1, Kctd15, Khk, Kif21b, Klf4, Klhdc8a, Lamb2, Leprotl1, Lmo6, Lrrc61, Lrrcc1, Ltbp3, Ltbp4, Man2a2, Mapbpip, Mapk1, Mapk3, Mib2, Mical1, Mknk2, Mocs1, Mrgpre, Mst1, Mtap4, Mtmr11, Mxra8, Myh14, Nadsyn1, NAP030253-1, NAP098046-001, Nat9, Nedd4, Nexn, Nicn1, Nkiras2, Nnmt, NP064425, Nrbp2, Nrm, Nt5dc2, Nudt14, Nupr1, Nutf2, Odz4, Ogfod1, Olfr1221, Osgep, Otub2, Paox, Paqr4, Pcbd2, Pck2, Pcmtd1, Pctk3, Pex11c, Pld1, Pltp, Plxnb2, Polr3e, Polr3gl, Ppapdc2, Ppp2r5b, Ppp3cc, Praf2, Pros1, Prpf40b, Prss16, Psrc1, Ptprs, Ptrh2, Pycr1, R3hdm2, Rab23, Rab3d, Rab3gap2, Rag1ap1, Rb1, Rfxank, Rgma, Rhoj, Rnaset2, Rnf157, Rpl22, Rps6ka2, Rras, Rsrc1, Samd14, Scap2, Scd1, Scd2, Scly, Scpep1, Sdsl, Sec22c, Selenbp1, Selenbp2, Sepn1, Serpinf1, Sertad2, Sesn2, Sfi1, Sft2d2, Sgsh, Sirt5, Six1, Slc22a18, Slc2a8, Slc39a3, Slc41a3, Slc6a9, Slc7a5, Snai2, Snapap, Snrpa, Sox21, Spsb2, Srr, Ssr1, St3gal5, Stau2, Steap2, Tbc1d5, Tbpl1, TC1499901, Tcfcp2, Tcta, Tenc1, Terf2ip, Tgfb1, Tgfb1i1, Timp2, Tinagl, Tle2, Tle6, Tm7sf2, Anhang 129 Tmem151, Tmem53, Tnrc6b, Tpcn1, Trappc1, Trappc6a, Trib3, Trp53inp2, Trpm4, Tsc22d3, Tspan17, Tst, Ttc7, Twsg1, Ube2h, Ube3b, Ubl3, Ugt1a6b, Ulbp1, Usp11, Vamp5, Vegfa, Wars, Wasf1, Wdr5b, Wdr67, Wfs1, Whsc1l1, Wwp1, X83328, Xpr1, Yif1b, Yipf2, Zbtb4, Zdhhc24, Zfand1, Zfp580, Zfp704, Zfpn1a4, Zmat3, Zmym3, Zmym6, Zranb3 7.6 Vektorkarten 7.6.1 pBluescript II sk (+) 7.6.2 pENTR/H1/TO Anhang 7.6.3 pSuperior.neo.GFP 130 Anhang 131 7.7 SICHERHEITSTECHNISCHE DATEN 7.7.1 Gefahrenstoffe Die folgende Liste beinhaltet sämtliche Verbindungen und Lösungsmittel, mit denen während dieser Arbeit umgegangen wurde. Die Gefahrstoffe sind, soweit vorhanden, mit den jeweiligen Gefahrensymbolen, R- und S-Sätzen versehen worden. Substanzname Gefahrensymbol R-Sätze S-Sätze 2-Mercaptoethanol T, N R 22-24-34-51/53 S 26-36/37/39-4561 2-Propanol F, Xi R 11-36-67 S 7-16-24-26 3-Aminophthalhydrazid Xi R 36/37/38-20/21 S 24/25 22-40-50/53 4-Cumarsäure Xi R 36/37/38 S 24/25-22-2636/37/39 Aceton F, Xi R 11-36-66-67 S 9-16-26 Acetonitril Xn, F R 11-20/21/22-36 S 16-36/37 Acrylamid T R 45-46-20/21- S 53-45-24-36/37 25-36/38-43-48 23/24/25-62 Ammonium- O, Xn R 8-22-36/37/38 S 22-24-26-37 peroxodisulfat -42/43 Ampicillin R 42/43 S 23-26 Bisacrylamid Xn R 22-20/21/22 S 24/25-36/37 Cetavlon/CTAB Xn, N R 22-37/38-41-50 S 26-36-61 Chloroform Xn R 22-38-40-48 S 36/37 20/22 Diethylether F+, Xn R 12-19-22-66-67 S 9-16-29-33 Diethylpyrocarbonat Xn R 22-36/37/38 S 26-37/39 2, 5 Dihydroxy- Xn - S 24/25 Dimethylformamid T R 61-20/21-36 S 53-45 Dithiothreitol Xn R 22-36/38 S 24/25 Essigsäure 100 % C R 10-35 S 23.2-26-45 Ethanol F R 11 S 7-16 Ethidiumbromid T+ R 22-26-36/37 S 26-28.2-36/37 benzoesäure 38-68 Anhang Ethylendiamin- 132 Xi R 22-36/37/38 S 26-36 Formaldehyd T R 23/24/25 S 2-28 Iodoacetamid T R 25-42/43 S 22-36/37-45 Isoamylalkohol Xn R 10-20 S 24/25 Kanamycinsulfat T R 61 S 45-36/37/39 Methanol F, T R 11-23/24/25- S 7-16-36/37-45 tetraessigsäure 39/23-24/25 N,N,N’,N’-Tetramethyl- F, C R 11-20/22-34 ethylendiamin S 16-26-36/37/ 39- 45 Natriumazid T+, N R 28-32-50/53 S 28.1-45-60-61 Natriumdeoxycholat Xn, Xi R 22-37 S 22-36 Natriumdodecylsulfat Xn R 21/22-36/37/38 S 26-36/37 Natriumhydroxid C R 35 S 26-37/39-45 Neomycinsulfat T, Xi R 63-42/43-36 S 45-26-36/37/39 37/38 Nonidet P-40 Xi R 36/38 S 23 Phenol T R 24/25-34 S 28.6-45 Phosphorsäure C R 34 S 26 Proteinase K Xn, Xi R 36/37/38-42 S 22-24-26-36/37 Salzsäure 37 % C R 34-37 S 26-36/37/39-45 Trichloressigsäure C R 35 S 24/25-26 Xi R 36/38 S 24/25 Triton X-100 Xi R 36/37/38 S 26-36 Trypsin Xi R 36/37/38-42 S 22-24-26-36/37 Wasserstoffperoxid 30 % C R 34 S 3-26-36/37/39-45 Picogreen Tetradecanoylamidopropyldimethylammoniobutansulfonat (Asb-14) Amidosulfobetain Trishydroxymethylaminomethan Anhang 133 7.7.2 Verzeichnis der Gefahrensymbole O C E F F+ T T+ Xn Xi N Brandfördernd Ätzend Explosionsgefährlich Leichtentzündlich Hochentzündlich Giftig Sehr giftig Gesundheitsschädlich Reizend Umweltgefährlich 7.7.3 Verzeichnis der R- und S- Sätze Gefahrenhinweise (R-Sätze) R 8 Feuergefahr bei Berührung mit brennbaren Stoffen R 10 Entzündlich R 11 Leichtentzündlich R 12 Hoch entzündlich R 19 Kann explosionsfähige Peroxide bilden R 20 Gesundheitsschädlich beim Einatmen R 21 Gesundheitsschädlich bei Berührung mit der Haut R 22 Gesundheitsschädlich beim Verschlucken R 24 Giftig bei Berührung mit der Haut R 25 Giftig beim Verschlucken R 26 Sehr giftig beim Einatmen R 28 Sehr giftig beim Verschlucken R 32 Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase R 34 Verursacht Verätzungen R 35 Verursacht schwere Verätzungen R 36 Reizt die Augen R 37 Reizt die Atmungsorgane R 38 Reizt die Haut R 40 Verdacht auf krebserzeugende Wirkung R 41 Gefahr ernster Augenschäden R 42 Sensibilisierung durch Einatmen möglich R 43 Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich R 45 Kann Krebs erzeugen R 46 Kann vererbbare Schäden verursachen R 50 Sehr giftig für Wasserorganismen R 61 Kann das Kind im Mutterleib schädigen R 62 Kann möglicherweise die Fortpflanzungsfähigkeit beeinträchtigen R 63 Kann das Kind im Mutterleib möglicherweise schädigen R 66 Wiederholter Kontakt kann zu spröder oder rissiger Haut führen R 67 Dämpfe können Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen R 68 Irreversibler Schaden möglich Kombination der R-Sätze R 20/21 Gesundheitsschädlich beim Einatmen und bei Berührung mit der Haut R 20/22 Gesundheitsschädlich beim Einatmen und Verschlucken R 20/21/22 Gesundheitsschädlich beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut R 21/22 Gesundheitsschädlich bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken R 23/24/25 Giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut R 24/25 Giftig bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken R 36/38 Reizt die Augen und die Haut Anhang 134 R 36/37/38 Reizt die Augen, Atmungsorgane und die Haut R 39/23/24/25 Giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch Einatmen, Berührung mit der Haut und durch Verschlucken R 42/43 Sensibilisierung durch Einatmen und Hautkontakt möglich R 48/20/22 Gesundheitsschädlich: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch Einatmen und durch Verschlucken R 48/23/24/25 Giftig: Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei längerer Exposition durch Einatmen, Berührung mit der Haut und durch Verschlucken R 50/53 Sehr giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben R 51/53 Giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben Sicherheitsratschläge (S-Sätze) S 2 Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen S 3 Kühl aufbewahren S 7 Behälter dicht geschlossen halten S 9 Behälter an einem gut gelüfteten Ort aufbewahren S 16 Von Zündquellen fernhalten - nicht rauchen S 22 Staub nicht einatmen S 23 Gas/Rauch/Dampf/Aerosol nicht einatmen S 23.2 Dampf nicht einatmen S 24 Berührung mit der Haut vermeiden S 26 Bei Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren S 28 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel … S 28.1 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser S 28.2 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser und Seife S 28.6 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Polyethylenglycol 400 und anschließende Reinigung mit viel Wasser S 29 Nicht in die Kanalisation gelangen lassen S 33 Maßnahmen gegen elektrostatische Aufladung treffen S 36 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen S 37 Geeignete Schutzhandschuhe tragen S 45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen) S 53 Exposition vermeiden - vor Gebrauch bes. Anweisungen einholen S 60 Dieser Stoff und sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen S 61 Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Besondere Anweisungen einholen/Sicherheitsdatenblatt zu Rate ziehen Kombination der S-Sätze S 24/25 Berührung mit den Augen und der Haut vermeiden S 36/37 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen S 36/37/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen S 37/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen Anhang 135 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst und nur mit den angegebenen Methoden und Hilfsmitteln angefertigt habe. Wörtlich oder inhaltlich aus anderen Quellen entnommene Stellen sind als solche kenntlich gemacht, und die Inanspruchnahme fremder Hilfen ist namentlich aufgeführt. Hamburg, Januar 2008 (Annette März) Anhang 136 DANKSAGUNG An erster Stelle bedanke ich mich bei Hr. Prof. Dr. Wolfgang Deppert für die Möglichkeit in der Abteilung Tumorvirologie an diesem interessanten Thema forschen zu können und sein stetes Interesse an meiner Arbeit, seine Diskussionsbereitschaft sowie die Begutachtung der Arbeit. Besonders dankbar bin ich für die exzellente Betreuung durch Hr. Dr. Genrich V. Tolstonog, der immer Hilfs- und Diskussionsbereitschaft zeigte. Durch sein Wissen und seine Ideen konnte sich sowohl die Arbeit als auch ich mich stetig weiterentwickeln. Die Betreuung des proteinchemischen Teils der Arbeit durch Hr. Dr. Jochen Heukeshoven wird trotz seines Todes nicht in Vergessenheit geraten. Dafür möchte ich mich ganz herzlich bedanken. Herrn Prof. Dr. Ulrich Hahn möchte ich für seine Bereitschaft danken, das Dissertationsgutachten zu dieser Arbeit anzufertigen, Herrn Prof. Dr. Bernd Meyer und Dr. Patrick Ziegelmüller danke ich für die Begutachtung der Disputation. Mein herzlicher Dank geht an alle Mitarbeiter der Abteilung Tumorvirologie, die durch ihre liebevolle Unterstützung und Hilfsbereitschaft für ein angenehmes Arbeitsklima und sehr viel Spaß gesorgt haben. Besonders danke ich meinen Laborkollegen Gabriele Warnecke, Lars Tögel und Sathish Babu Hunsur Nayaran. Außerdem möchte ich mich bei Hr. Arne Düsedau für die Hilfe bei der FACS Analyse und Dr. Christina Heinlein für die Injektion der Mäuse bedanken. Bei der bioinformatischen Auswertung wurde ich durch Simon Hess und Benjamin Otto sowie von Tal Shay und Eytan Domany vom Weizmann Institute of Science, Israel unterstützt. Ganz besonders danke ich meinen Eltern Hildegard und Willi, meinen Geschwistern André und Angelika und meinen Freunden für deren liebevolle Unterstützung, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Für die finanzielle Förderung dieser Arbeit bedanke ich mich bei der Deutschen Krebshilfe e.V.
