Enzymbasierte Biosensoren - Universität des Saarlandes

Seminar Biotechnologie 2
Biosensors and Biofuel cells
with engineered proteins
Universität des Saarlandes
Verfasst von:
Lisa Marie Finkler
Matrikelnummer 2535995
[email protected]
Studiengang:
Biotechnologie Master
Semester:
WS 2012/13
Betreuer:
Prof. Dr. Kohring
1
Inhaltsverzeichnis
Einleitung .................................................................................................................................... 3
Definition und Schema einer Biokraftstoffzelle ..................................................................... 3
Definition und Prinzip eines Biosensors ................................................................................. 5
Detektionsprinzipien .............................................................................................................. 6
Piezoelektrische Sensoren.................................................................................................. 6
Optische Sensoren.............................................................................................................. 7
Kalorimetrische Sensoren .................................................................................................. 8
Elektrochemische Sensoren ............................................................................................... 9
Anwendungsbereiche........................................................................................................... 10
Erkennungsprinzipien von Biosensoren ................................................................................... 10
Enzymbasierte Biosensoren ................................................................................................. 11
Antikörperbasierte Biosensoren .......................................................................................... 11
Zellbasierte Biosensoren ...................................................................................................... 13
DNA-basierte Biosensoren ................................................................................................... 14
Rezeptorbasierte Biosensoren ............................................................................................. 14
Vergleich von Biosensoren und Biokraftstoffzellen in Bezug auf Selektivität, Sensitivität und
Stabilität ................................................................................................................................... 15
Verbesserungsansätze der Betriebsparameter von Biosensoren ........................................ 17
Verbesserungsansätze der Betriebsparameter von Biokraftstoffzellen .............................. 18
Quellenverzeichnis ................................................................................................................... 19
Abbildungsverzeichnis .............................................................................................................. 20
2
Einleitung
Im Rahmen dieses Seminares soll eine Übersicht gegeben werden über die verschiedenen
Arten von Biosensoren sowie Biokraftstoffzellen. Es werden die verschiedenen
Rezeptorsysteme sowie die verschiedenen Arten der Signalübertragung aufgezeigt.
Abschließend wird nochmals ein Vergleich zwischen Biosensoren und Biokraftstoffzellen
bezüglich Selektivität, Sensitivität sowie Stabilität und Verbesserungsmöglichkeiten
erläutert.
Definition und Schema einer Biokraftstoffzelle
Allgemein besteht eine Kraftstoffzelle aus einer Anode und einer Kathode, welche durch eine
semipermeable Membran voneinander getrennt sind. Bei einer Biokraftstoffzelle erfolgt die
chemische Umsetzung der Brennstoffe durch Mikroorganismen oder Enzymsysteme im
Kompartiment der Anode (siehe Abbildung 1). Dabei wird das Substrat, der Brennstoff, durch
die Mikroorganismen abgebaut und die freigesetzten Elektronen auf die Anode übertragen.
Über einen externen Kreislauf gelangen die Elektronen in das Kathodenkompartiment. Die
Protonen werden direkt über die semipermeable Membran zur Kathode übertragen. Die
chemische Reaktionsenergie wird mit Hilfe eines Oxidationsmittels in elektrische Energie
umgewandelt. Unter Verbrauch der Elektronen und Protonen sowie Sauerstoff entsteht als
Reaktionsprodukt Wasser [1,2].
3
Abbildung 1: Prinzip einer Biokraftstoffzelle
[8]
Man unterscheidet bei den Biokraftstoffzellen nochmals zwischen mediator-basierten
mikrobiellen Brennstoffzellen und mediatorlosen mikrobiellen Brennstoffzellen. Mediatoren
sind die Substanzen, welche die freiwerdenden Elektronen im Anodenkompartiment auf die
Anode übertragen und somit als Redoxsystem fungieren, da sie die Elektronen zunächst
aufnehmen und dann wieder abgeben.
Der Vorteil von enzymatischen Brennstoffzellen liegt in ihrer hohen Spezifizität der
katalytischen Aktivität der Enzyme, wodurch eine Trennung der beiden Kompartimente nicht
immer notwendig ist und somit eine Miniaturisierung solcher Brennstoffzellen möglich ist.
Nachteil solcher Systeme ist das limitierte Substratspektrum im Vergleich zu mikrobiellen
Brennstoffzellen. In mikrobiellen Brennstoffzellen liegen die Enzyme außerdem in ihrer
optimalen Umgebung vor, was eine positive Auswirkung auf ihre Aktivität mit sich bringt
[1,2].
4
Die ablaufenden Reaktionen sind im Folgenden zusammengefasst:
Reaktion Gleichung
Anode
2 H2 + 4 OH-  4 H2O + 4 e-
Kathode
O2 + 2 H2O + 4 e-  4 OH-
Gesamt
2 H2 + 4 OH-  4 H2O + 4 e-
Eine mögliche Anwendung des Prinzips von Biokraftstoffzellen sind Biosensoren.
Definition und Prinzip eines Biosensors
Allgemein versteht man unter einem Sensor einen Messwertfühler, welcher Verbindungen
selektiv erfasst und ein konzentrationsabhängiges Signal liefert. Ein Sensor besteht aus zwei
Grundbestandteilen, einem Rezeptor, dem Erkennungssystem für die nachzuweisenden
Stoffe oder Moleküle, sowie dem Transduktor, dem Messwertumwandler. Durch die
Reaktion der Probemoleküle mit dem Rezeptor erfolgt eine Änderung der physikalischen
oder chemischen Eigenschaften. Diese Änderung wird durch den Tranducer in ein
elektrisches Signal umgewandelt. Biosensoren enthalten als Rezeptor eine biologische
Komponente wie zum Beispiel Enzyme, Antikörper, Organellen oder Mikroorganismen. Das
Prinzip eines Sensors ist in Abbildung 2 dargestellt.
Im ersten Schritt erfolgt eine spezifische Erkennung des Probemoleküls durch den
biologischen Rezeptor des Biosensors. Anschließend findet eine Umwandlung der
chemischen oder physikalischen Veränderung in ein elektrisches Signal statt. Dieses wird
dann weiter verarbeitet und als Messwert ausgegeben [3,4].
5
Abbildung 2: Prinzip eines Biosensors
[12]
Detektionsprinzipien
Man unterscheidet bei Biosensoren nach den unterschiedlichen Detektionsprinzipien des
jeweiligen
Transducers.
Diese
werden
unterteilt
in
optische,
elektrochemische,
kalorimetrische sowie piezoelektrischen Sensoren.
Piezoelektrische Sensoren
Piezoelektrische Sensoren enthalten Quarzkristalle, deren Schwingungsfrequenz sich bei
Belegung durch Substanzen verändern. Die Schwingungsfrequenz ist umgekehrt proportional
zur Wurzel der Masse des Quarzes. Somit lässt sich ein Quarzkristall, welcher mit Enzymen,
Antikörpern oder anderen biologischen Rezeptoren besetzt ist, als Mikrowaage verwenden.
Die Methode ist besonders gut geeignet für die Detektion von Mikroorganismen, Pestiziden,
Kampfstoffen und Rauschgiften. Der Nachteil der Methode liegt darin, dass der beschichtete
Sensor nur einmal verwendet werden kann, da die Rezeptorschicht mit den zu
analysierenden Substanzen anschließend belegt ist.
Ein Spezialfall der piezolektrischen Sensoren sind die Oberflächenwellensensoren (SAW,
Surface Acoustic Waves). Durch Bindung einer Substanz an die Rezeptorschicht kommt es zu
einer Veränderung der an der Oberfläche des Sensors verlaufenden Welle, was wiederum
detektiert werden kann [5].
6
Optische Sensoren
Optische Sensoren werden meistens zur Messung des Sauerstoffgehaltes in Flüssigkeiten
verwendet. Optische Sensoren werden auch Optoden genannt, das Messverfahren liegt der
Fluoreszenzlöschung zu Grunde. Sie besitzen einen Indikator, welcher mit dem
Probematerial in Kontakt gebracht wird und entsprechend der Komplexbildung das
eingestrahlte Licht absorbiert, reflektiert, streut oder durch Fluoereszenz reemittiert.
Eine weitere Methode beruht auf dem Effekt der Evaneszenz. Evaneszenz tritt bei der
Totalreflexion am Übergang zwischen optisch dichterem Lichtleiter zu optisch dünnerem
Medium auf. Evaneszenz beschreibt die verhinderte Totalreflexion, da die Reflexion nicht
direkt an der Grenzfläche stattfindet, sondern ein Teil des Lichtes die Grenzfläche
durchdringt und dann erst wieder zurückfällt. Es dringt also ein Teil des Lichtes in das optisch
dünnere Medium ein und klingt dann exponentiell ab. Evaneszente Felder können zur
Detektion von Komplexbildung genutzt werden.
Ein Spezialfall dieses Prinzips findet bei der Oberflächenplasmonresonanz (SPR, Surface
Plasmon Resonance) statt (siehe Abbildung 3). Hierbei wird polares, monochromatisches
Licht auf eine dünne Edelstahlschicht (Gold oder Silber) gestrahlt. Diese Schicht befindet sich
auf einem Glasprisma. Es findet an der Schicht eine Totalreflexion statt. Kommt es nun zu
Wechselwirkungen in der Sensorschicht durch den Beladungsgrad an der Oberfläche, so
ändert sich der Winkel des reflektierten Lichtes [5].
7
Abbildung 3: Prinzip der Oberflächenplasmonresonanz
[13]
Kalorimetrische Sensoren
Kalorimetrische Sensoren messen die Enthalpieänderung in Form der Änderung der
Reaktionswärme, welche bei der Reaktion der Analyten mit dem Rezeptor auftritt. Die
Temperaturerhöhung ist dabei abhängig von der Stoffmenge der Reaktionspartner. In
Abbildung 4 ist das Beispiel anhand der Umsetzung von Glukose mittels Glukoseoxidase
dargestellt. Je mehr Glukose umgesetzt wird, desto mehr Wärme entsteht. Da die Änderung
der Temperatur nur sehr gering ist, muss die Reaktion in einem thermisch isolierten System
stattfinden [5].
8
Abbildung 4: Kalorimetrische Sensor
[14]
Elektrochemische Sensoren
Elektrochemische Sensoren werden nochmals unterteilt in amperometrische und
potentiometrische Sensoren. Durch die Bildung eines Analyt-Rezeptor-Komplexes ändern
sich die elektrischen Parameter wie Ladung, Strom oder Spannung
Bei amperometrischen Sensoren wird der Stromfluss in einer Messkammer an zwei
Elektroden bei konstanter Spannung gemessen. Dieses Verfahren ist besonders geeignet für
Substanzen welche leicht oxidiert bzw. reduziert werden.
Potentiometrische Sensoren werden eingesetzt, wenn ionische Reaktionsprodukte vorliegen.
Die quantitative Bestimmung der Ionen erfolgt aufgrund ihres elektrischen Potentials mit
Hilfe einer Messelektrode. Die Messelektrode ist mit dem entsprechenden Enzym
beschichtet. Als Referenzelektrode wird die gleiche Elektrode ohne Enzymbeschichtung
verwendet. Häufig werden ionenselektive Feldeffekttransistoren (ISFET) oder Metalloxidbeschichtete Säureelektroden (MOSFET) verwendet [5].
9
Anwendungsbereiche
Biosensoren finden ein breites Anwendungsgebiet im Bereich der Medizin, Umweltanalytik,
Sicherheitskontrolle oder auch im Bereich der Nahrungsmittelkontrolle. Im Bereich der
Medizin können Stoffwechselprodukte wie Blutzucker, Cholesterin oder Harnstoff mittels
Biosensoren nachgewiesen werden. Der Nachweis von Glukose war eines der ersten
Anwendungsgebiete von Biosensoren. Im Bereich der Umweltanalytik kann zum Beispiel der
Bakteriengehalt
von
Gewässern
bestimmt
werden,
indem
als
Rezeptoren
die
entsprechenden Antikörper verwendet werden. Desweiteren können im Trinkwasser oder
Abwasser toxische Verbindungen wie Pestizide oder Chemikalien nachgewiesen werden. Im
Bereich der Nahrungsmittelkontrolle können verschiedene Parameter untersucht werden
wie pH Wert, Toxine, Schimmel aber auf verschiedene Aromastoffe [6, 7, 9].
Erkennungsprinzipien von Biosensoren
In Abbildung 5 ist eine Übersicht der der verschiedenen Erkennungsprinzipien von
biologischen Sensoren dargestellt.
Abbildung 5: Übersicht von biologischen Sensortypen
[9]
10
Enzymbasierte Biosensoren
Enzymbasierte Biosensoren waren historisch die ersten Biosensoren besonders im Bereich
der Umweltanalytik. Sie bieten eine Vielzahl von Vorteilen. Durch genetische Veränderungen
können die Enzymaktivität oder die Substratspezifizität verändert werden, sodass das
Zielmolekül einfacher detektiert werden kann. Enzymbasierte Biosensoren bringen aber
auch Nachteile mit sich im Bereich der Umweltanalytik. Nur wenige Umweltschadstoffe
können mittels Enzymbasierten Biosensoren detektiert werden. Außerdem ist die
Wechselwirkung zischen Enzym und Substrat nicht immer optimal, da auch Inhibitoren die
Aktivität der Enzyme beeinflussen. Ein weiteres Problem ist, dass die Spezifizität der Enzyme
innerhalb einer Klasse von Schadstoffen nur gering ist, wie zum Beispiel bei
Nervenkampfstoffen oder Organophosphaten.
Weitere Innovationen im Bereich von enzymbasierten Biosensoren zeichneten sich im
Bereich der Immobilisierung aus. Es werden neue Materialien verwendet und RedoxMediatoren in das System eingebaut. Es werden Sol-Gele eingesetzt, welche anorganischen
oder hybridpolymeren Schichten sind und den Vorteil vor allem in der Umweltanalytik mit
sich bringen hitzestabil, pH-puffernd und unempfindlich zu sein. Desweiteren werden
Kombinationen aus kovalenter und nicht-kovalenter Enyzmimmobilisierung, aber auch
Nanopartikel verwendet, um die katalytische Aktivität zu verbessern.
Ein Problem stellt vor allem die Inhibition durch toxische Metalle wie Kupfer, Quecksilber,
Cadmium oder Zink dar. Somit kann die Detektion von Umweltschadstoffen nicht präzise
durchgeführt werden, da vor allem kontaminierte Umweltproben wie Wasser oder Boden
diese toxischen Metalle unter anderem enthalten. Aus diesem Grund werden enzymbasierte
Biosensoren vor allem zur Analyse von Oberflächengewässern oder Abwasser aus der
Industrie eingesetzt, wo zuvor bekannt ist, welche Verunreinigungen enthalten sein können
[9].
Antikörperbasierte Biosensoren
Antikörperbasierte Biosensoren oder auch Immunosensoren sind von Natur aus schon
vielseitigen einsetzbar als enzymbasierte Biosensoren. Sie können spezifischer an spezielle
Substanzen bzw. Gruppen binden.
11
Das Problem bei antikörperbasierten Biosensoren stellt jedoch die Limitation bei besonders
komplexen Proben wie im Bereich der Umweltanalytik dar.
Es kann gleichzeitig nur eine gewisse Anzahl an Substanzen innerhalb einer Probe bestimmt
werden. Um diesem Problem entgegenzuwirken, gibt es verschiedene Ansätze.
Die simultane Detektion von Toxinen konnte mit Hilfe eines Biosensors durchgeführt
werden, bei welchem nach dem Prinzip der planaren Wellenleitertechnologie die Detektion
stattfindet. Ein weiterer Ansatz ist der Nachweis mit Hilfe eines Mikrochips, auf welchem die
Antikörper mittels Hydrogel auf einem Glaschip immobilisiert sind. Die Detektion erfolgt mit
Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes. Ein weiteres Sensorsystem basiert auf der Methode der
Total Internal Reflectance Fluorescence (TIRF). Dieser Sensortyp RIANA (River Analyzer)
enthält eine Fließinjektion. Mit Hilfe von zuvor fluorophormarkierten Antikörpern als
biologisches Erkennungselement könnten bestimmte Analytike simultan detektiert werden.
Dieser Test wird auch als Bindungshemmtest bezeichnet. Die Probelösung wird mit der
Standardantikörperlösung inkubiert, die Lösung wird über den Transducer gepumpt, sodass
die freien Antikörper mit den entsprechend chemisch modifizierten Oberfläche des
Glastranducers binden können (siehe Abbildung 6). Im Rahmen der optischen Detektion
entstehen evaneszente Felder. Der Fluorophor wird oberflächennah in diesem Bereich zur
Fluoreszenz angeregt, sodass eine simultane Detektion der verschiedenen Analyte möglich
ist.
Ein weiteres System, welches zwischen 20 und 30 Analyte simultan detektieren kann, ist das
AWACSS (Automated Water Analyser Computer Supported) System. Das Prinzip beruht
ebenfalls auf der Evaneszenzfeldtechnik. Im Gegensatz zu RIANA ist hier der Laserstrahl nicht
frei in den Transducer eingekoppelt, sondern über eine integrierte Glasfaser[9,11].
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Bindungshemmtests
[15]
12
Zur Immobilisierung der Antikörper bzw. Immunorezeptoren werden verschiedene
Techniken durchgeführt wie mittels Mikropipetten, Drucktechnik oder Mikrofluidtechnik
aber auch mit Hilfe von elektrischen Feldern.
Eine weitere Methode ist die Immobilisierung mittels Peptid-Nukleinsäuren als
Bindungsstelle der Antikörper. Entsprechend der komplementären Oligonukleotide kann
eine spezifische Anlagerung auf einer gewünschten Stelle auf dem Array stattfinden. Ein
weiterer Vorteil liegt in der Wiederverwendbarkeit des Assays nach einer chemischen
Behandlungen.
Der Vorteil der hohen Affinität zwischen Antikörper und Antigen ist eben gleichzeitig
Nachteil, wenn es um die Wiederverwendbarkeit der Sensoren geht. Aus diesem Grund
werden auch Einwegsensoren oder wegwerf bare Materialen eingesetzt.
Im Rahmen der Umweltanalytik werden antikörperbasierte Biosensoren nicht nur zur
Detektion von Chemikalien eingesetzt sondern eben auch zunehmend zur Detektion von
umweltrelevanten Mikroorganismen [9].
Zellbasierte Biosensoren
Zellbasierte Biosensoren werden untergliedert je nach Zelltyp, wie zum Beispiel Bakterien,
Hefen, Algen oder Gebekulturzellen. Die häufigsten zellbasierten Biosensoren basieren
jedoch auf genetisch veränderte Bakterien (GEMs, genetically engineered bacteria). Durch
ein regulatorisches System, welches mit Reportergenen verknüpft ist, können Schadstoffe
detektiert werden. In Anwesenheit von Effektoren wird also eine Kaskade ausgelöst,
wodurch man ein messbares Signal erhält. Effektoren können zum Beispiel DNA-schädigende
Substanzen, Gammastrahlung, Hitzeschock, oxidativer Stress, toxische Metalle oder
organische Umweltgifte sein.
Mikroorganismen bieten einige Vorteile, sie produzieren ihre Enzyme, Kofaktoren und
Nukleinsäuren
kontinuierlich,
sind
also
relativ
robust
und
autonom.
Sie
sind
selbstreplizierend und können mit vielen verschiedenen Transducermechanismen verknüpft
werden. Allerdings reagieren sie auf Umwelteinflüsse und benötigen Nährstoffe, Sauerstoff
und einen eingestellten pH-Bereich. Außerdem können mehrer Stunden vergehen bis man
ein Signal erhält, da eventuell erst Proteine exprimiert werden. Der Bereich, in welchem
Organismen Analyte detektieren können, ist begrenzt.
13
Ist die Konzentration zu gering, kann diese nicht detektiert werden, ist sie zu hoch, kann der
Mikroorganismus nicht mehr existieren.
Als Beispiel können flüchtig organische Verbindungen (VOCs, volatile organic compounds)
mit Hilfe eines Benzen-sensitiven Promotors, welcher mit der Produktion von grün
fluoreszierendem Protein gekoppelt ist, detektiert werden.
Es können aber auch unmodifizierte Zellsysteme eingesetzt werden, indem dann die
Zellviabilität gemessen wird, nachdem die Zellen mit der Probe inkubiert werden.
Es gibt eine Vielzahl von zellbasierten Biosensoren, welche im Bereich der Grundwasser- und
Schmutzwasseranalyse sowie für biologische Frühwarnsysteme eingesetzt werden [9].
DNA-basierte Biosensoren
DNA-basierte Biosensoren spielen vor allem in der medizinischen Diagnostik eine Rolle, sie
können aber auch in Bereich der Umweltanalytik eingesetzt werden. Mit Hilfe dieser
Sensoren können DNA-schädigende Chemikalien detektiert werden. Es können zum Beispeil
toxische aromatische Amine, oxidatische Schädigung, bioaktive Benzopyrene mittels
fluoreszenzbasierten Biosensoren detektiert werden.
Mit Hilfe von DNA-Microarrays können eine Vielzahl von pathogenen Mikroorganismen oder
Umweltschadstoffen nachgewiesen werden. Aber auch in der Lebensmittelindustrie werden
diese Chips als Analysemethode eingesetzt, um krankmachende Organismen nachzuweisen
[9].
Rezeptorbasierte Biosensoren
Rezeptorbasierte Biosensoren bieten den Vorteil, dass sie jegliche schädliche Substanzen
detektieren können, welche in physiologisch relevanten Konzentrationen vorherrschen.
Vor allem aber die Detektion von endokrin wirksamen Substanzen, endokrine Disruptoren,
sollen mit Hilfe von rezeptorbasierten Biosensoren detektiert werden, da sie wie Hormone
wirken und das Hormonsystem des Organismus aus dem Gleichgewicht bringen. Diese
Substanzen können natürlich oder auch chemisch hergestellte Verbindungen sein, welche in
die Umwelt gelangen. Ein Beispiel ist der humane Östrogenrezeptor Alpha[9].
14
Vergleich von Biosensoren und Biokraftstoffzellen in Bezug auf
Selektivität, Sensitivität und Stabilität
Proteine können in Biokraftstoffzellen bzw. Biosensoren zwei verschiedene Funktionen
übernehmen, die spezifische Erkennung der Analytmoleküle sowie die Signalweiterleitung
bei erfolgter Bindung zur Erzeugung eines elektrochemischen Potentials.
Anhand des Glucoseoxidasesensors in Abbildung 7
können beide Aufgaben definiert
werden.
Abbildung 7: Prinzip eines Glucoseoxidasesensors
[10]
Glucoseoxidase übernimmt die Funktion der spezifischen Erkennung von Glucose und
generiert gleichzeitig ein elktrochemisches Signal, wobei Glucose oxidiert wird und
Wasserstoffperoxid entsteht. Der Mediator wird oxidiert, sodass ein messbarer Strom
erzeugt wird. Der Glucoseoxidasesensor ist besonders bedeutend, da beide Funktionen von
einem Enzym übernommen werden. Die gemessene Stromstärke ist dann proportional zur
Glukosekonzentration der in Kontakt gebrachten Lösung.
In Abbildung 8 ist das Prinzip einer Biokraftstoffzelle dargestellt. Sie besitzt zwei Electroden,
welche mit einer Enyzmschicht bedeckt sind. Die Anode dient als Elektronenquelle, hier wird
der Kraftstoff Glukose mit Hilfe des Enzyms Glucoseoxidase oxidiert. Die Kathode fungiert als
Elektronensenke, es wird mit Hilfe von Lactase das Oxidationsmittel Sauerstoff reduziert. Die
Verwendung zweier spezifischer Enzyme bietet den Vorteil, dass es zu keiner Kreuzreaktion
kommt und keine trennende Membran notwendig ist.
15
Abbildung 8: Prinzip einer Biokraftstoffzelle (Glucoseoxidase, Lactase als Enzymsysteme)
[10]
Biosensoren und Biokraftstoffzellen arbeiten prinzipiell nach den gleichen Prinzipien.
Bezüglich der Betriebsparametern Selektivität, Sensitivität und Stabilität gibt es jedoch
einige Unterschiede.
Biosensoren sind idealerweise hochspezifisch und detektieren nur ein ganz spezielles
Probemolekül, während Biokraftstoffzellen im Gegensatz dazu eine hohe Substrattolleranz
zeigen sollten, um möglich viele verschieden Substrate als Kraftstoff verwerten zu können.
Um die gewünschte Eigenschaft in Bezug auf Selektivität sowohl bei Biosensoren als auch bei
Biokraftstoffzellen zu verbessern, kann mittels „Protein Engineering“ die Wechselwirkungen
zwischen Rezeptor und Probemolekül optimiert werden.
16
Sensitivität beschreibt die Eigenschaft den Kraftstoff zu oxidieren und entsprechend daraus
einen elektrischen Strom zu generieren. Die Eigenschaft ist bei beiden Typen erwünscht,
wobei unterschiedliche Funktionen erfüllt werden müssen.
Biosensoren sollten im Optimalfall eine messabare lineare Antwort über den gewünschten
Konzentrationsbereich erzeugen, um die genaue Konzentration der Probemoleküle zu
quantifizieren. Bei Biokraftstoffzellen sollten die beteiligten Enzymsysteme mit höchster
Umsetzungsrate arbeiten, um die höchste Leistungsdichte zu erzeugen.
Prinzipiell kann der Oxidationsprozess in drei Schritte untergliedert werden, welche
entsprechend der gewünschten Eigenschaft verbessert werden kann. Der erste Schritt ist der
Massentransport des Kraftstoffes zu der Enzymschicht, welcher durch die Gestaltung bzw.
das Material der Elektrode beeinflusst werden kann. Der zweite Schritt ist die Reaktion des
Kraftstoffes mit dem aktiven Zentrum des Enzyms, was wiederum durch „Protein
Engineering“ verbessert werden kann. Der letzte Schritt ist der Elektronentransport hin zur
Anode, was durch Verwendung von Mediatoren optimiert werden kann.
Die letzte Eigenschaft, betriebliche Stabilität, eine konstante Leistung über die Zeit ist
ebenfalls bei beiden Methoden erwünscht. Aber auch hier geht es bei Biosensoren eher
darum, dass die Haltbarkeitszeit eher im Vordergrund steht. Auch nach längerer Lagerung
sollte die Enzymaktivität sich nicht verschlechtern. Bei Biokraftstoffzellen geht es darum,
dass die Enzymaktivität während der Zeit der Stromerzeugung nicht schlechter werden
sollte, sodass möglichst viel Energie erzeugt wird. Auch hier können Methoden des „Protein
Engineering“, Hilfestoffe um die Enzyme zu schützen oder das Elektrodenmaterial
entsprechend gewählt werden, um die Stabilität zu gewährleisten [10].
Verbesserungsansätze der Betriebsparameter von Biosensoren
Eine verbesserte Selektivität kann durch „Protein Engineering“ erreicht werden. Als Beispiel
wurde ein Biosensor, welcher mit Hilfe von Acetylcholinesterase Umweltgifte nachweisen
kann molekular modelliert und Aminosäuren substituiert. Als Ergebnis erhielt man eine
20000-fach niedrigere Nachweisgrenze von Dichlorvos, einem Insektizid, welches zur Gruppe
der Phosphorsäureester gehört und umweltgefährdend ist.
17
Acetylcholinesterase hydrolisiert Acetylcholin. Dichlorvos wirkt als Inhibitor und senkt
dadurch die katalytische Aktivität, wodurch über die Aktivitätsänderung die Konzentration
von Dichlorvos bestimmt werden kann.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin einen Biosensor zu verwenden, wobei zwei
unterschiedliche Enzyme die Aufgaben des Rezeptors und der Signalgenerierung
übernehmen. Durch die Aufteilung kann eine Anreicherung der Analyte auf der
Rezeptoroberfläche erfolgen und eine Signalerhöhung stattfinden.
Die letzte Methode um Biosensoren zu optimieren ist eine Verbesserung der Bindung des
Rezeptors an der Elektrodenoberfläche. Eine kovalente Immobilisierung wie zum Beispiel die
Bindung eines viralen Rezeptors über einen C-terminalen Hexahistidin tag auf einer
Goldoberfläche führt zu einer besseren Bindung der viralen Analyte und somit zu einer
besseren Signalerzeugung. Eine weitere Möglichkeit ist die Verknüpfung über einen langen
terminalen Peptidlinker, wodurch eine molekulare Flexibilität gewährleistet ist und
gleichzeitig die Denaturierung umgangen wird, welche bei einer direkten Verknüpfung
vorkommen kann [10].
Verbesserungsansätze der Betriebsparameter von Biokraftstoffzellen
Je nach Art einer Biokraftstoffzelle ist ein breites oder ein enges Substratspektrum
erwünscht. Bei einem biomedizinischen Sensor, welcher mittels Glukose aus dem Blut als
Kraftstoffquelle versorgt wird, ist nur ein enges Substratspektrum, eben Glukose erwünscht.
Hingegen bei gewöhnlichen Biokraftstoffzellen zur Energieerzeugung sollten möglichst viele
Kraftstoffe verwertet werden können. Die Oxidation von mehreren Kraftstoffen durch ein
Enzym ist jedoch nur schweer realisierbar. Durch „Protein Engineering“ kann die Spezifizität
der Enzyme verbreitert werden. Eine weitere Möglichkeit besteht jedoch in der Verwendung
von „nativen Multi-Enzym-Kaskaden“ wie zum Beispiel bei der Glycolyse, dem Citratzyklus
oder der Fettsäureoxidation. Als Beispiel wird eine Kaskade von Enzymen eingesetzt um
oligomere Lignocellulose abzubauen, wodurch die strukturelle Komplexität verringert wird
und diese Strukturen dann wiederum einfacher in einer Biokraftstoffzelle verwertet werden
können [10].
18
Quellenverzeichnis
[1]
http://www.aktuelle-wochenschau.de/2006/woche45b/woche45b.html (2.10.2012)
[2]
http://en.wikipedia.org/wiki/Microbial_fuel_cell (2.10.2012)
[3]
Instrumentelle Analytik und Bioanalytik, Manfred H. Gey; Springer (2008)
[4]
Bioanalytische Und Biochemische Labormethoden; Kurt E. Geckeler,Heiner Eckstein;
Vieweg
[5]
Sensoren in Wissenschaft und Technik: Funktionsweise und Einsatzgebiete, Ekbert
Hering,Gert Schönfelder; Vieweg + Teubnder (2012)
[6]
Biofuel Cells for Self-Powered Electrochemical Biosensing and Logic Biosensing: A
Review; Ming Zhou, Joseph Wang; Electroanalysis (2012), 24, No. 2, 197-209
[7]
Biosensor Applications in the Field of Antibiotic Research- A Review of Recent
Developments; Katrin Reder-Christ, Gerd Bendas; Sensors (2011), 11, 9450-9466
[8]
http://2007.igem.org/wiki/index.php/Image:Fuelcell.JPG
[9]
Recent advances in biosensor techniques for environmental monitoring; K.R.Rogers;
Analytica Chimica Acta 568 (2006) 222-231
[10]
Biosensors and biofuel cells with engineered proteins; Daren J. Caruana, Stefan
Howorka; Molecular BioSystems (2010), 6, 1548-1556
[11]
http://www.git-labor.de/news/aus-der-wissenschaft/biosensoren-fuer-quantitiveanalytik-lebensmittel-und-wasseranalytik-milch (12.10.2012)
[12]
http://www.aktuelle-wochenschau.de/2005/images/woche39/abb1.jpg
[13]
http://www.nature.com/nrd/journal/v1/n7/images/nrd838-f2.gif
[14]
http://www.diabeticus.de/infos/technik/img/Img00005.gif
[15]
http://www.git-labor.de/news/aus-der-wissenschaft/biosensoren-fuer-quantitiveanalytik-lebensmittel-und-wasseranalytik-milch
19
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Prinzip einer Biokraftstoffzelle ............................................................................. 4
Abbildung 2: Prinzip eines Biosensors........................................................................................ 6
Abbildung 3: Prinzip der Oberflächenplasmonresonanz ........................................................... 8
Abbildung 4: Kalorimetrische Sensor ......................................................................................... 9
Abbildung 5: Übersicht von biologischen Sensortypen ........................................................... 10
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Bindungshemmtests .......................................... 12
Abbildung 7: Prinzip eines Glucoseoxidasesensors ................................................................. 15
Abbildung 8: Prinzip einer Biokraftstoffzelle (Glucoseoxidase, Lactase als Enzymsysteme) ... 16
20