Enzymbasierte Biosensoren - Universität des Saarlandes
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Seminar Biotechnologie 2 Biosensors and Biofuel cells with engineered proteins Universität des Saarlandes Verfasst von: Lisa Marie Finkler Matrikelnummer 2535995 [email protected] Studiengang: Biotechnologie Master Semester: WS 2012/13 Betreuer: Prof. Dr. Kohring 1 Inhaltsverzeichnis Einleitung .................................................................................................................................... 3 Definition und Schema einer Biokraftstoffzelle ..................................................................... 3 Definition und Prinzip eines Biosensors ................................................................................. 5 Detektionsprinzipien .............................................................................................................. 6 Piezoelektrische Sensoren.................................................................................................. 6 Optische Sensoren.............................................................................................................. 7 Kalorimetrische Sensoren .................................................................................................. 8 Elektrochemische Sensoren ............................................................................................... 9 Anwendungsbereiche........................................................................................................... 10 Erkennungsprinzipien von Biosensoren ................................................................................... 10 Enzymbasierte Biosensoren ................................................................................................. 11 Antikörperbasierte Biosensoren .......................................................................................... 11 Zellbasierte Biosensoren ...................................................................................................... 13 DNA-basierte Biosensoren ................................................................................................... 14 Rezeptorbasierte Biosensoren ............................................................................................. 14 Vergleich von Biosensoren und Biokraftstoffzellen in Bezug auf Selektivität, Sensitivität und Stabilität ................................................................................................................................... 15 Verbesserungsansätze der Betriebsparameter von Biosensoren ........................................ 17 Verbesserungsansätze der Betriebsparameter von Biokraftstoffzellen .............................. 18 Quellenverzeichnis ................................................................................................................... 19 Abbildungsverzeichnis .............................................................................................................. 20 2 Einleitung Im Rahmen dieses Seminares soll eine Übersicht gegeben werden über die verschiedenen Arten von Biosensoren sowie Biokraftstoffzellen. Es werden die verschiedenen Rezeptorsysteme sowie die verschiedenen Arten der Signalübertragung aufgezeigt. Abschließend wird nochmals ein Vergleich zwischen Biosensoren und Biokraftstoffzellen bezüglich Selektivität, Sensitivität sowie Stabilität und Verbesserungsmöglichkeiten erläutert. Definition und Schema einer Biokraftstoffzelle Allgemein besteht eine Kraftstoffzelle aus einer Anode und einer Kathode, welche durch eine semipermeable Membran voneinander getrennt sind. Bei einer Biokraftstoffzelle erfolgt die chemische Umsetzung der Brennstoffe durch Mikroorganismen oder Enzymsysteme im Kompartiment der Anode (siehe Abbildung 1). Dabei wird das Substrat, der Brennstoff, durch die Mikroorganismen abgebaut und die freigesetzten Elektronen auf die Anode übertragen. Über einen externen Kreislauf gelangen die Elektronen in das Kathodenkompartiment. Die Protonen werden direkt über die semipermeable Membran zur Kathode übertragen. Die chemische Reaktionsenergie wird mit Hilfe eines Oxidationsmittels in elektrische Energie umgewandelt. Unter Verbrauch der Elektronen und Protonen sowie Sauerstoff entsteht als Reaktionsprodukt Wasser [1,2]. 3 Abbildung 1: Prinzip einer Biokraftstoffzelle [8] Man unterscheidet bei den Biokraftstoffzellen nochmals zwischen mediator-basierten mikrobiellen Brennstoffzellen und mediatorlosen mikrobiellen Brennstoffzellen. Mediatoren sind die Substanzen, welche die freiwerdenden Elektronen im Anodenkompartiment auf die Anode übertragen und somit als Redoxsystem fungieren, da sie die Elektronen zunächst aufnehmen und dann wieder abgeben. Der Vorteil von enzymatischen Brennstoffzellen liegt in ihrer hohen Spezifizität der katalytischen Aktivität der Enzyme, wodurch eine Trennung der beiden Kompartimente nicht immer notwendig ist und somit eine Miniaturisierung solcher Brennstoffzellen möglich ist. Nachteil solcher Systeme ist das limitierte Substratspektrum im Vergleich zu mikrobiellen Brennstoffzellen. In mikrobiellen Brennstoffzellen liegen die Enzyme außerdem in ihrer optimalen Umgebung vor, was eine positive Auswirkung auf ihre Aktivität mit sich bringt [1,2]. 4 Die ablaufenden Reaktionen sind im Folgenden zusammengefasst: Reaktion Gleichung Anode 2 H2 + 4 OH- 4 H2O + 4 e- Kathode O2 + 2 H2O + 4 e- 4 OH- Gesamt 2 H2 + 4 OH- 4 H2O + 4 e- Eine mögliche Anwendung des Prinzips von Biokraftstoffzellen sind Biosensoren. Definition und Prinzip eines Biosensors Allgemein versteht man unter einem Sensor einen Messwertfühler, welcher Verbindungen selektiv erfasst und ein konzentrationsabhängiges Signal liefert. Ein Sensor besteht aus zwei Grundbestandteilen, einem Rezeptor, dem Erkennungssystem für die nachzuweisenden Stoffe oder Moleküle, sowie dem Transduktor, dem Messwertumwandler. Durch die Reaktion der Probemoleküle mit dem Rezeptor erfolgt eine Änderung der physikalischen oder chemischen Eigenschaften. Diese Änderung wird durch den Tranducer in ein elektrisches Signal umgewandelt. Biosensoren enthalten als Rezeptor eine biologische Komponente wie zum Beispiel Enzyme, Antikörper, Organellen oder Mikroorganismen. Das Prinzip eines Sensors ist in Abbildung 2 dargestellt. Im ersten Schritt erfolgt eine spezifische Erkennung des Probemoleküls durch den biologischen Rezeptor des Biosensors. Anschließend findet eine Umwandlung der chemischen oder physikalischen Veränderung in ein elektrisches Signal statt. Dieses wird dann weiter verarbeitet und als Messwert ausgegeben [3,4]. 5 Abbildung 2: Prinzip eines Biosensors [12] Detektionsprinzipien Man unterscheidet bei Biosensoren nach den unterschiedlichen Detektionsprinzipien des jeweiligen Transducers. Diese werden unterteilt in optische, elektrochemische, kalorimetrische sowie piezoelektrischen Sensoren. Piezoelektrische Sensoren Piezoelektrische Sensoren enthalten Quarzkristalle, deren Schwingungsfrequenz sich bei Belegung durch Substanzen verändern. Die Schwingungsfrequenz ist umgekehrt proportional zur Wurzel der Masse des Quarzes. Somit lässt sich ein Quarzkristall, welcher mit Enzymen, Antikörpern oder anderen biologischen Rezeptoren besetzt ist, als Mikrowaage verwenden. Die Methode ist besonders gut geeignet für die Detektion von Mikroorganismen, Pestiziden, Kampfstoffen und Rauschgiften. Der Nachteil der Methode liegt darin, dass der beschichtete Sensor nur einmal verwendet werden kann, da die Rezeptorschicht mit den zu analysierenden Substanzen anschließend belegt ist. Ein Spezialfall der piezolektrischen Sensoren sind die Oberflächenwellensensoren (SAW, Surface Acoustic Waves). Durch Bindung einer Substanz an die Rezeptorschicht kommt es zu einer Veränderung der an der Oberfläche des Sensors verlaufenden Welle, was wiederum detektiert werden kann [5]. 6 Optische Sensoren Optische Sensoren werden meistens zur Messung des Sauerstoffgehaltes in Flüssigkeiten verwendet. Optische Sensoren werden auch Optoden genannt, das Messverfahren liegt der Fluoreszenzlöschung zu Grunde. Sie besitzen einen Indikator, welcher mit dem Probematerial in Kontakt gebracht wird und entsprechend der Komplexbildung das eingestrahlte Licht absorbiert, reflektiert, streut oder durch Fluoereszenz reemittiert. Eine weitere Methode beruht auf dem Effekt der Evaneszenz. Evaneszenz tritt bei der Totalreflexion am Übergang zwischen optisch dichterem Lichtleiter zu optisch dünnerem Medium auf. Evaneszenz beschreibt die verhinderte Totalreflexion, da die Reflexion nicht direkt an der Grenzfläche stattfindet, sondern ein Teil des Lichtes die Grenzfläche durchdringt und dann erst wieder zurückfällt. Es dringt also ein Teil des Lichtes in das optisch dünnere Medium ein und klingt dann exponentiell ab. Evaneszente Felder können zur Detektion von Komplexbildung genutzt werden. Ein Spezialfall dieses Prinzips findet bei der Oberflächenplasmonresonanz (SPR, Surface Plasmon Resonance) statt (siehe Abbildung 3). Hierbei wird polares, monochromatisches Licht auf eine dünne Edelstahlschicht (Gold oder Silber) gestrahlt. Diese Schicht befindet sich auf einem Glasprisma. Es findet an der Schicht eine Totalreflexion statt. Kommt es nun zu Wechselwirkungen in der Sensorschicht durch den Beladungsgrad an der Oberfläche, so ändert sich der Winkel des reflektierten Lichtes [5]. 7 Abbildung 3: Prinzip der Oberflächenplasmonresonanz [13] Kalorimetrische Sensoren Kalorimetrische Sensoren messen die Enthalpieänderung in Form der Änderung der Reaktionswärme, welche bei der Reaktion der Analyten mit dem Rezeptor auftritt. Die Temperaturerhöhung ist dabei abhängig von der Stoffmenge der Reaktionspartner. In Abbildung 4 ist das Beispiel anhand der Umsetzung von Glukose mittels Glukoseoxidase dargestellt. Je mehr Glukose umgesetzt wird, desto mehr Wärme entsteht. Da die Änderung der Temperatur nur sehr gering ist, muss die Reaktion in einem thermisch isolierten System stattfinden [5]. 8 Abbildung 4: Kalorimetrische Sensor [14] Elektrochemische Sensoren Elektrochemische Sensoren werden nochmals unterteilt in amperometrische und potentiometrische Sensoren. Durch die Bildung eines Analyt-Rezeptor-Komplexes ändern sich die elektrischen Parameter wie Ladung, Strom oder Spannung Bei amperometrischen Sensoren wird der Stromfluss in einer Messkammer an zwei Elektroden bei konstanter Spannung gemessen. Dieses Verfahren ist besonders geeignet für Substanzen welche leicht oxidiert bzw. reduziert werden. Potentiometrische Sensoren werden eingesetzt, wenn ionische Reaktionsprodukte vorliegen. Die quantitative Bestimmung der Ionen erfolgt aufgrund ihres elektrischen Potentials mit Hilfe einer Messelektrode. Die Messelektrode ist mit dem entsprechenden Enzym beschichtet. Als Referenzelektrode wird die gleiche Elektrode ohne Enzymbeschichtung verwendet. Häufig werden ionenselektive Feldeffekttransistoren (ISFET) oder Metalloxidbeschichtete Säureelektroden (MOSFET) verwendet [5]. 9 Anwendungsbereiche Biosensoren finden ein breites Anwendungsgebiet im Bereich der Medizin, Umweltanalytik, Sicherheitskontrolle oder auch im Bereich der Nahrungsmittelkontrolle. Im Bereich der Medizin können Stoffwechselprodukte wie Blutzucker, Cholesterin oder Harnstoff mittels Biosensoren nachgewiesen werden. Der Nachweis von Glukose war eines der ersten Anwendungsgebiete von Biosensoren. Im Bereich der Umweltanalytik kann zum Beispiel der Bakteriengehalt von Gewässern bestimmt werden, indem als Rezeptoren die entsprechenden Antikörper verwendet werden. Desweiteren können im Trinkwasser oder Abwasser toxische Verbindungen wie Pestizide oder Chemikalien nachgewiesen werden. Im Bereich der Nahrungsmittelkontrolle können verschiedene Parameter untersucht werden wie pH Wert, Toxine, Schimmel aber auf verschiedene Aromastoffe [6, 7, 9]. Erkennungsprinzipien von Biosensoren In Abbildung 5 ist eine Übersicht der der verschiedenen Erkennungsprinzipien von biologischen Sensoren dargestellt. Abbildung 5: Übersicht von biologischen Sensortypen [9] 10 Enzymbasierte Biosensoren Enzymbasierte Biosensoren waren historisch die ersten Biosensoren besonders im Bereich der Umweltanalytik. Sie bieten eine Vielzahl von Vorteilen. Durch genetische Veränderungen können die Enzymaktivität oder die Substratspezifizität verändert werden, sodass das Zielmolekül einfacher detektiert werden kann. Enzymbasierte Biosensoren bringen aber auch Nachteile mit sich im Bereich der Umweltanalytik. Nur wenige Umweltschadstoffe können mittels Enzymbasierten Biosensoren detektiert werden. Außerdem ist die Wechselwirkung zischen Enzym und Substrat nicht immer optimal, da auch Inhibitoren die Aktivität der Enzyme beeinflussen. Ein weiteres Problem ist, dass die Spezifizität der Enzyme innerhalb einer Klasse von Schadstoffen nur gering ist, wie zum Beispiel bei Nervenkampfstoffen oder Organophosphaten. Weitere Innovationen im Bereich von enzymbasierten Biosensoren zeichneten sich im Bereich der Immobilisierung aus. Es werden neue Materialien verwendet und RedoxMediatoren in das System eingebaut. Es werden Sol-Gele eingesetzt, welche anorganischen oder hybridpolymeren Schichten sind und den Vorteil vor allem in der Umweltanalytik mit sich bringen hitzestabil, pH-puffernd und unempfindlich zu sein. Desweiteren werden Kombinationen aus kovalenter und nicht-kovalenter Enyzmimmobilisierung, aber auch Nanopartikel verwendet, um die katalytische Aktivität zu verbessern. Ein Problem stellt vor allem die Inhibition durch toxische Metalle wie Kupfer, Quecksilber, Cadmium oder Zink dar. Somit kann die Detektion von Umweltschadstoffen nicht präzise durchgeführt werden, da vor allem kontaminierte Umweltproben wie Wasser oder Boden diese toxischen Metalle unter anderem enthalten. Aus diesem Grund werden enzymbasierte Biosensoren vor allem zur Analyse von Oberflächengewässern oder Abwasser aus der Industrie eingesetzt, wo zuvor bekannt ist, welche Verunreinigungen enthalten sein können [9]. Antikörperbasierte Biosensoren Antikörperbasierte Biosensoren oder auch Immunosensoren sind von Natur aus schon vielseitigen einsetzbar als enzymbasierte Biosensoren. Sie können spezifischer an spezielle Substanzen bzw. Gruppen binden. 11 Das Problem bei antikörperbasierten Biosensoren stellt jedoch die Limitation bei besonders komplexen Proben wie im Bereich der Umweltanalytik dar. Es kann gleichzeitig nur eine gewisse Anzahl an Substanzen innerhalb einer Probe bestimmt werden. Um diesem Problem entgegenzuwirken, gibt es verschiedene Ansätze. Die simultane Detektion von Toxinen konnte mit Hilfe eines Biosensors durchgeführt werden, bei welchem nach dem Prinzip der planaren Wellenleitertechnologie die Detektion stattfindet. Ein weiterer Ansatz ist der Nachweis mit Hilfe eines Mikrochips, auf welchem die Antikörper mittels Hydrogel auf einem Glaschip immobilisiert sind. Die Detektion erfolgt mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes. Ein weiteres Sensorsystem basiert auf der Methode der Total Internal Reflectance Fluorescence (TIRF). Dieser Sensortyp RIANA (River Analyzer) enthält eine Fließinjektion. Mit Hilfe von zuvor fluorophormarkierten Antikörpern als biologisches Erkennungselement könnten bestimmte Analytike simultan detektiert werden. Dieser Test wird auch als Bindungshemmtest bezeichnet. Die Probelösung wird mit der Standardantikörperlösung inkubiert, die Lösung wird über den Transducer gepumpt, sodass die freien Antikörper mit den entsprechend chemisch modifizierten Oberfläche des Glastranducers binden können (siehe Abbildung 6). Im Rahmen der optischen Detektion entstehen evaneszente Felder. Der Fluorophor wird oberflächennah in diesem Bereich zur Fluoreszenz angeregt, sodass eine simultane Detektion der verschiedenen Analyte möglich ist. Ein weiteres System, welches zwischen 20 und 30 Analyte simultan detektieren kann, ist das AWACSS (Automated Water Analyser Computer Supported) System. Das Prinzip beruht ebenfalls auf der Evaneszenzfeldtechnik. Im Gegensatz zu RIANA ist hier der Laserstrahl nicht frei in den Transducer eingekoppelt, sondern über eine integrierte Glasfaser[9,11]. Abbildung 6: Schematische Darstellung des Bindungshemmtests [15] 12 Zur Immobilisierung der Antikörper bzw. Immunorezeptoren werden verschiedene Techniken durchgeführt wie mittels Mikropipetten, Drucktechnik oder Mikrofluidtechnik aber auch mit Hilfe von elektrischen Feldern. Eine weitere Methode ist die Immobilisierung mittels Peptid-Nukleinsäuren als Bindungsstelle der Antikörper. Entsprechend der komplementären Oligonukleotide kann eine spezifische Anlagerung auf einer gewünschten Stelle auf dem Array stattfinden. Ein weiterer Vorteil liegt in der Wiederverwendbarkeit des Assays nach einer chemischen Behandlungen. Der Vorteil der hohen Affinität zwischen Antikörper und Antigen ist eben gleichzeitig Nachteil, wenn es um die Wiederverwendbarkeit der Sensoren geht. Aus diesem Grund werden auch Einwegsensoren oder wegwerf bare Materialen eingesetzt. Im Rahmen der Umweltanalytik werden antikörperbasierte Biosensoren nicht nur zur Detektion von Chemikalien eingesetzt sondern eben auch zunehmend zur Detektion von umweltrelevanten Mikroorganismen [9]. Zellbasierte Biosensoren Zellbasierte Biosensoren werden untergliedert je nach Zelltyp, wie zum Beispiel Bakterien, Hefen, Algen oder Gebekulturzellen. Die häufigsten zellbasierten Biosensoren basieren jedoch auf genetisch veränderte Bakterien (GEMs, genetically engineered bacteria). Durch ein regulatorisches System, welches mit Reportergenen verknüpft ist, können Schadstoffe detektiert werden. In Anwesenheit von Effektoren wird also eine Kaskade ausgelöst, wodurch man ein messbares Signal erhält. Effektoren können zum Beispiel DNA-schädigende Substanzen, Gammastrahlung, Hitzeschock, oxidativer Stress, toxische Metalle oder organische Umweltgifte sein. Mikroorganismen bieten einige Vorteile, sie produzieren ihre Enzyme, Kofaktoren und Nukleinsäuren kontinuierlich, sind also relativ robust und autonom. Sie sind selbstreplizierend und können mit vielen verschiedenen Transducermechanismen verknüpft werden. Allerdings reagieren sie auf Umwelteinflüsse und benötigen Nährstoffe, Sauerstoff und einen eingestellten pH-Bereich. Außerdem können mehrer Stunden vergehen bis man ein Signal erhält, da eventuell erst Proteine exprimiert werden. Der Bereich, in welchem Organismen Analyte detektieren können, ist begrenzt. 13 Ist die Konzentration zu gering, kann diese nicht detektiert werden, ist sie zu hoch, kann der Mikroorganismus nicht mehr existieren. Als Beispiel können flüchtig organische Verbindungen (VOCs, volatile organic compounds) mit Hilfe eines Benzen-sensitiven Promotors, welcher mit der Produktion von grün fluoreszierendem Protein gekoppelt ist, detektiert werden. Es können aber auch unmodifizierte Zellsysteme eingesetzt werden, indem dann die Zellviabilität gemessen wird, nachdem die Zellen mit der Probe inkubiert werden. Es gibt eine Vielzahl von zellbasierten Biosensoren, welche im Bereich der Grundwasser- und Schmutzwasseranalyse sowie für biologische Frühwarnsysteme eingesetzt werden [9]. DNA-basierte Biosensoren DNA-basierte Biosensoren spielen vor allem in der medizinischen Diagnostik eine Rolle, sie können aber auch in Bereich der Umweltanalytik eingesetzt werden. Mit Hilfe dieser Sensoren können DNA-schädigende Chemikalien detektiert werden. Es können zum Beispeil toxische aromatische Amine, oxidatische Schädigung, bioaktive Benzopyrene mittels fluoreszenzbasierten Biosensoren detektiert werden. Mit Hilfe von DNA-Microarrays können eine Vielzahl von pathogenen Mikroorganismen oder Umweltschadstoffen nachgewiesen werden. Aber auch in der Lebensmittelindustrie werden diese Chips als Analysemethode eingesetzt, um krankmachende Organismen nachzuweisen [9]. Rezeptorbasierte Biosensoren Rezeptorbasierte Biosensoren bieten den Vorteil, dass sie jegliche schädliche Substanzen detektieren können, welche in physiologisch relevanten Konzentrationen vorherrschen. Vor allem aber die Detektion von endokrin wirksamen Substanzen, endokrine Disruptoren, sollen mit Hilfe von rezeptorbasierten Biosensoren detektiert werden, da sie wie Hormone wirken und das Hormonsystem des Organismus aus dem Gleichgewicht bringen. Diese Substanzen können natürlich oder auch chemisch hergestellte Verbindungen sein, welche in die Umwelt gelangen. Ein Beispiel ist der humane Östrogenrezeptor Alpha[9]. 14 Vergleich von Biosensoren und Biokraftstoffzellen in Bezug auf Selektivität, Sensitivität und Stabilität Proteine können in Biokraftstoffzellen bzw. Biosensoren zwei verschiedene Funktionen übernehmen, die spezifische Erkennung der Analytmoleküle sowie die Signalweiterleitung bei erfolgter Bindung zur Erzeugung eines elektrochemischen Potentials. Anhand des Glucoseoxidasesensors in Abbildung 7 können beide Aufgaben definiert werden. Abbildung 7: Prinzip eines Glucoseoxidasesensors [10] Glucoseoxidase übernimmt die Funktion der spezifischen Erkennung von Glucose und generiert gleichzeitig ein elktrochemisches Signal, wobei Glucose oxidiert wird und Wasserstoffperoxid entsteht. Der Mediator wird oxidiert, sodass ein messbarer Strom erzeugt wird. Der Glucoseoxidasesensor ist besonders bedeutend, da beide Funktionen von einem Enzym übernommen werden. Die gemessene Stromstärke ist dann proportional zur Glukosekonzentration der in Kontakt gebrachten Lösung. In Abbildung 8 ist das Prinzip einer Biokraftstoffzelle dargestellt. Sie besitzt zwei Electroden, welche mit einer Enyzmschicht bedeckt sind. Die Anode dient als Elektronenquelle, hier wird der Kraftstoff Glukose mit Hilfe des Enzyms Glucoseoxidase oxidiert. Die Kathode fungiert als Elektronensenke, es wird mit Hilfe von Lactase das Oxidationsmittel Sauerstoff reduziert. Die Verwendung zweier spezifischer Enzyme bietet den Vorteil, dass es zu keiner Kreuzreaktion kommt und keine trennende Membran notwendig ist. 15 Abbildung 8: Prinzip einer Biokraftstoffzelle (Glucoseoxidase, Lactase als Enzymsysteme) [10] Biosensoren und Biokraftstoffzellen arbeiten prinzipiell nach den gleichen Prinzipien. Bezüglich der Betriebsparametern Selektivität, Sensitivität und Stabilität gibt es jedoch einige Unterschiede. Biosensoren sind idealerweise hochspezifisch und detektieren nur ein ganz spezielles Probemolekül, während Biokraftstoffzellen im Gegensatz dazu eine hohe Substrattolleranz zeigen sollten, um möglich viele verschieden Substrate als Kraftstoff verwerten zu können. Um die gewünschte Eigenschaft in Bezug auf Selektivität sowohl bei Biosensoren als auch bei Biokraftstoffzellen zu verbessern, kann mittels „Protein Engineering“ die Wechselwirkungen zwischen Rezeptor und Probemolekül optimiert werden. 16 Sensitivität beschreibt die Eigenschaft den Kraftstoff zu oxidieren und entsprechend daraus einen elektrischen Strom zu generieren. Die Eigenschaft ist bei beiden Typen erwünscht, wobei unterschiedliche Funktionen erfüllt werden müssen. Biosensoren sollten im Optimalfall eine messabare lineare Antwort über den gewünschten Konzentrationsbereich erzeugen, um die genaue Konzentration der Probemoleküle zu quantifizieren. Bei Biokraftstoffzellen sollten die beteiligten Enzymsysteme mit höchster Umsetzungsrate arbeiten, um die höchste Leistungsdichte zu erzeugen. Prinzipiell kann der Oxidationsprozess in drei Schritte untergliedert werden, welche entsprechend der gewünschten Eigenschaft verbessert werden kann. Der erste Schritt ist der Massentransport des Kraftstoffes zu der Enzymschicht, welcher durch die Gestaltung bzw. das Material der Elektrode beeinflusst werden kann. Der zweite Schritt ist die Reaktion des Kraftstoffes mit dem aktiven Zentrum des Enzyms, was wiederum durch „Protein Engineering“ verbessert werden kann. Der letzte Schritt ist der Elektronentransport hin zur Anode, was durch Verwendung von Mediatoren optimiert werden kann. Die letzte Eigenschaft, betriebliche Stabilität, eine konstante Leistung über die Zeit ist ebenfalls bei beiden Methoden erwünscht. Aber auch hier geht es bei Biosensoren eher darum, dass die Haltbarkeitszeit eher im Vordergrund steht. Auch nach längerer Lagerung sollte die Enzymaktivität sich nicht verschlechtern. Bei Biokraftstoffzellen geht es darum, dass die Enzymaktivität während der Zeit der Stromerzeugung nicht schlechter werden sollte, sodass möglichst viel Energie erzeugt wird. Auch hier können Methoden des „Protein Engineering“, Hilfestoffe um die Enzyme zu schützen oder das Elektrodenmaterial entsprechend gewählt werden, um die Stabilität zu gewährleisten [10]. Verbesserungsansätze der Betriebsparameter von Biosensoren Eine verbesserte Selektivität kann durch „Protein Engineering“ erreicht werden. Als Beispiel wurde ein Biosensor, welcher mit Hilfe von Acetylcholinesterase Umweltgifte nachweisen kann molekular modelliert und Aminosäuren substituiert. Als Ergebnis erhielt man eine 20000-fach niedrigere Nachweisgrenze von Dichlorvos, einem Insektizid, welches zur Gruppe der Phosphorsäureester gehört und umweltgefährdend ist. 17 Acetylcholinesterase hydrolisiert Acetylcholin. Dichlorvos wirkt als Inhibitor und senkt dadurch die katalytische Aktivität, wodurch über die Aktivitätsänderung die Konzentration von Dichlorvos bestimmt werden kann. Eine weitere Möglichkeit besteht darin einen Biosensor zu verwenden, wobei zwei unterschiedliche Enzyme die Aufgaben des Rezeptors und der Signalgenerierung übernehmen. Durch die Aufteilung kann eine Anreicherung der Analyte auf der Rezeptoroberfläche erfolgen und eine Signalerhöhung stattfinden. Die letzte Methode um Biosensoren zu optimieren ist eine Verbesserung der Bindung des Rezeptors an der Elektrodenoberfläche. Eine kovalente Immobilisierung wie zum Beispiel die Bindung eines viralen Rezeptors über einen C-terminalen Hexahistidin tag auf einer Goldoberfläche führt zu einer besseren Bindung der viralen Analyte und somit zu einer besseren Signalerzeugung. Eine weitere Möglichkeit ist die Verknüpfung über einen langen terminalen Peptidlinker, wodurch eine molekulare Flexibilität gewährleistet ist und gleichzeitig die Denaturierung umgangen wird, welche bei einer direkten Verknüpfung vorkommen kann [10]. Verbesserungsansätze der Betriebsparameter von Biokraftstoffzellen Je nach Art einer Biokraftstoffzelle ist ein breites oder ein enges Substratspektrum erwünscht. Bei einem biomedizinischen Sensor, welcher mittels Glukose aus dem Blut als Kraftstoffquelle versorgt wird, ist nur ein enges Substratspektrum, eben Glukose erwünscht. Hingegen bei gewöhnlichen Biokraftstoffzellen zur Energieerzeugung sollten möglichst viele Kraftstoffe verwertet werden können. Die Oxidation von mehreren Kraftstoffen durch ein Enzym ist jedoch nur schweer realisierbar. Durch „Protein Engineering“ kann die Spezifizität der Enzyme verbreitert werden. Eine weitere Möglichkeit besteht jedoch in der Verwendung von „nativen Multi-Enzym-Kaskaden“ wie zum Beispiel bei der Glycolyse, dem Citratzyklus oder der Fettsäureoxidation. Als Beispiel wird eine Kaskade von Enzymen eingesetzt um oligomere Lignocellulose abzubauen, wodurch die strukturelle Komplexität verringert wird und diese Strukturen dann wiederum einfacher in einer Biokraftstoffzelle verwertet werden können [10]. 18 Quellenverzeichnis [1] http://www.aktuelle-wochenschau.de/2006/woche45b/woche45b.html (2.10.2012) [2] http://en.wikipedia.org/wiki/Microbial_fuel_cell (2.10.2012) [3] Instrumentelle Analytik und Bioanalytik, Manfred H. Gey; Springer (2008) [4] Bioanalytische Und Biochemische Labormethoden; Kurt E. Geckeler,Heiner Eckstein; Vieweg [5] Sensoren in Wissenschaft und Technik: Funktionsweise und Einsatzgebiete, Ekbert Hering,Gert Schönfelder; Vieweg + Teubnder (2012) [6] Biofuel Cells for Self-Powered Electrochemical Biosensing and Logic Biosensing: A Review; Ming Zhou, Joseph Wang; Electroanalysis (2012), 24, No. 2, 197-209 [7] Biosensor Applications in the Field of Antibiotic Research- A Review of Recent Developments; Katrin Reder-Christ, Gerd Bendas; Sensors (2011), 11, 9450-9466 [8] http://2007.igem.org/wiki/index.php/Image:Fuelcell.JPG [9] Recent advances in biosensor techniques for environmental monitoring; K.R.Rogers; Analytica Chimica Acta 568 (2006) 222-231 [10] Biosensors and biofuel cells with engineered proteins; Daren J. Caruana, Stefan Howorka; Molecular BioSystems (2010), 6, 1548-1556 [11] http://www.git-labor.de/news/aus-der-wissenschaft/biosensoren-fuer-quantitiveanalytik-lebensmittel-und-wasseranalytik-milch (12.10.2012) [12] http://www.aktuelle-wochenschau.de/2005/images/woche39/abb1.jpg [13] http://www.nature.com/nrd/journal/v1/n7/images/nrd838-f2.gif [14] http://www.diabeticus.de/infos/technik/img/Img00005.gif [15] http://www.git-labor.de/news/aus-der-wissenschaft/biosensoren-fuer-quantitiveanalytik-lebensmittel-und-wasseranalytik-milch 19 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Prinzip einer Biokraftstoffzelle ............................................................................. 4 Abbildung 2: Prinzip eines Biosensors........................................................................................ 6 Abbildung 3: Prinzip der Oberflächenplasmonresonanz ........................................................... 8 Abbildung 4: Kalorimetrische Sensor ......................................................................................... 9 Abbildung 5: Übersicht von biologischen Sensortypen ........................................................... 10 Abbildung 6: Schematische Darstellung des Bindungshemmtests .......................................... 12 Abbildung 7: Prinzip eines Glucoseoxidasesensors ................................................................. 15 Abbildung 8: Prinzip einer Biokraftstoffzelle (Glucoseoxidase, Lactase als Enzymsysteme) ... 16 20
