MOL404BioteEF2015

Einführung in die Biotechnologie
Biotechnologie ist die Lehre von der auf
Basis von quantifizierenden Methoden
reproduzierbar gemachten Durchführung
von Bioprozessen in industriellen
Produktionsverfahren technischen
Maßstabes.
MOL.404 / CHE.723 SS 2015
IBB - Biotechnologie und Bioprozesstechnik
[email protected]
1
B
I
O
T
E
C
H
N
O
L
O
G
I
E
Molekulare Biotechnologie
Engineering von Biosystemen
Zell-Engineering
Stoffwechsel-Engineering
Protein-Engineering
Integrierte Vernetzung
Bioprozesstechnik
Engineering von Produktionsverfahren
IBB - Biotechnologie und Bioprozesstechnik
Prozessentwicklung
Reaktionstechnik
Aufarbeitungstechnik
Einführung in die Biotechnologie
 Biotechnologische Prozesse
– Substrate und deren Aufbereitung
– Bioreaktoren
Aufbau, Design und Betrieb
Kinetik
– Aufarbeitung
 Prozessbeispiele
 Enzymtechnologie
– Produktion
– Enzymatische Prozesse
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Biotechnologie traditionell

Gärungen (Bier und Wein; Sauermilchprodukte und Käse;
Wurstherstellung; Essig; fermentierte asiatische Produkte;
Kaffee, Tee und Kakao)

Enzyme (überlegen Sie welche)
Stärke und Milch

Traditionelle Mikroorganismen in der Biotechnologie
(überlegen Sie welche das sind und deren Klassifikation)
Hefen
Schimmelpilze (Pinsel- und Gießkannenschimmel)
Bakterien (Milchsäure, Buttersäure, Propionsäure, Aceton-Butanol, ...)

Forscher (A. van Leeuwenhoek 1632-1723; L. Pasteur 1822-1895; E.
Buchner 1860-1917)
Renneberg, R. 2006. Biotechnologie für Einsteiger, Elsevier
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Biotechnologie heute
Medizin
Pflanzen
IBB
Industrielle
Biotechnologie
Marine
Organismen
Grund- und Feinchemikalien, Wirkstoffe, Polymere, ...
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Biotechnologie in Österreich
Sandoz
Intercell
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> 100
Gentechnische Impfstoffe
Mikrotechnologien mit
hohem Durchsatz.
Chemie/Biologie im
Vordergrund (z.B. EnzymentProzesse im Laborwicklung)
maßstab.
Wechselwirkung von biochemischen Komponenten
und Prozesstechnik (z.B. Enzym
im Rührreaktor)
Prozess im Pilot oder
Industriemaßstab.
Prozesstechnik im
Vordergrund (z.B. Dimensionierung des Enzymreaktors)
IBB
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Abbildung. Schematische Darstellung der Arbeitsschritte in der Bioprozessentwicklung, vom Gen zum Produkt.
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 Stufen der Prozessentwicklung

Identifizierung eines neuen Produktkandidaten

Entscheidung die Prozessentwicklung zu beginnen

Parallele Entwicklung - Anlagentechnik und Maßstabsvergrösserung
sowie physiologische Tests, klinische Studien, Toxizitätsüberprüfung,
usw.

In Phase III von klinischen Tests wird bereits Material aus der
Produktionsanlage verwendet (Center for Biological Evaluation and
Research, FDA).
 Vorteile einer effizienten Prozessentwicklung

In allen Einzelheiten reproduzierbare Herstellung eines biologischen
Produktes von invarianter Qualität und Charakteristik

Reduktion der Anlagenkosten (durch z.B. Minimierung der Grösse des
Bioreaktors) als wesentlichem Teil der gesamten Prozesskosten

Reduktion der Zeitspanne zwischen Beginn der Prozessentwicklung
und Markteinführung des Produktes.
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Abbildung. Parallele Prozessentwicklung ist ein entscheidendes Kriterium
für die Implementierung von biotechnologischen Verfahren in der Industrie.
Dies gilt vor allem für neue Produkte mit medizinischer Anwendung, bei
denen die Markteinführung mehrere Jahre benötigt. Die prinzipielle
Brauchbarkeit des Verfahrens muss in den ersten 6 bis 12 Monaten bewiesen
werden.
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Grobes Ablaufschema
eines biotechnologischen
Prozesses.
Die völlig biospezifische
Komponente ist die
Bioreaktion
(“Fermentation”).
Substrataufbereitung,
Sterilisation, und
Aufarbeitung erfordern
teilweise spezielle Techniken,
die für Biosysteme entwickelt
und optimiert wurden.
Aufschluss von mikrobiellen
Zellen zur Enzymgewinnung
ist ein Beispiel.
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Abbildung. Optimierung eines industriellen Prozesses anhand identifizierter kostenbestimmender Faktoren.
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Substrataufbereitung - Upstream processing
 Reduktion der Substratkosten
– Reinchemikalien für Massenprodukte zu teuer
– ausgehend von erneuerbaren Rohstoffen
– Kohlenhydrate (Zellulose, Stärke, Saccharose)
– Proteine (aus Fisch, Sojabohnen)
 Eliminierung von Inhibitoren
– Schwermetalle (Mn2+; Zitronensäure)
– Azetat (Hefefermentation)
 Anforderungen für klinische Produkte
– Viren
– Proteine
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Viele “klassische”
Produkte der
Biotechnologie werden
im Multihunderttonnen
Maßstab jährlich
hergestellt, haben aber
einen Preis von unter 1
Euro pro Kilogramm.
Der Optimierung jedes
einzelnen Prozessschrittes kommt daher
Bedeutung zu.
Die Substratwahl ist
davon eine wesentliche
Komponente.
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Unter anaeroben Prozessbedingungen kommen den
Bilanzen an Redoxkofaktoren sowie für ATP
besondere Bedeutung zu.
Überlegen Sie warum das
so ist.
Ein technisches Problem ist
die Bildung von Glyzerin
während der Ethanolherstellung. Woher kommt das
Glyzerin und warum wird es
gebildet?
Abbildung: Hefebiomasse und Ethanol gehörten zu den ersten biotechnologischen Produkten und sind auch noch heute mengenmäßig enorm wichtig.
Prozessverbesserungen inkludieren vor allem die Verbesserung der
mikrobiellen Stoffwechselleistungen und das Upstream Processing.
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Stärke
• Lineares und verzweigtes
Homopolysaccharid, aufgebaut
aus einer Hauptkette mit a1,4glykosidisch verknüpften
Glukoseeinheiten
• Verzweigungen in a1,6Positionen
• Polymerisationsgrad und
Verzweigungsgrad abhängig
vom Rohstoff
• Depolymerisation (Hydrolyse)
für mikrobielle Verwertung nötig
• Säurehydrolyse führt zu
Nebenprodukten
Lignocellulose
Saccharose
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Der Abbau von Stärke ist das Beispiel
für den Einsatz von Enzymen im
großtechnischen Maßstab und wird
unter anderem für das Upstream
Processing eines natürlichen Rohstoffs
verwendet.
• Die Verflüssigung von Stärke findet mit
extrem thermostabilen Enzymen (aAmylasen) bei etwa 80°C statt. Die
Hauptkette wird gespalten und kürzere,
besser lösliche Einheiten enstehen.
• DE entspricht der Anzahl an
reduzierenden Enden, gewichtet an
100% Glukose.
• Weitere Enzyme spalten mit
unterschiedlichen Spezifitäten (a1,6;
a1,4 - Maltose oder Glukose-spaltend;
Glukoseisomerisierung; Dextrinsynthese).
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Abbildung: Einige Enzyme, die zur vollständigen Hydrolyse
von Stärke (Amylopektin) benötigt werden. Die Quelle für
diese und andere Amylasen sind Bakterien und Pilze.
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Vor- und Nachteile des Enzymeinsatzes
 Selektivität (Chemo, Regio, Stereo)
 Günstiger pH (2 - 12) und T-Bereich (10 - 110 °C)
 Keine oder wenig Nebenprodukte
 Nicht toxisch und leicht abbaubar
 Durch Immobilisierung wiederverwendbar
 Herstellung in unlimitierenden Mengen durch mikrobielle
Produktion möglich
 Feinabstimmung der Eigenschaften möglich
 geringe(re) Stabilität und Bedarf an Kofaktoren (Metalle)
 manchmal teuer (vor allem wegen Aufarbeitung)
Beispiel: Isomerisierung der D-Glukose in D-Fruktose
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Wirtschaftliche Gesichtspunkte des
Enzymeinsatzes
 Kostenreduktion
 Erhöhung der Ausbeute und verbesserte
Rohstoffnutzung
 Verminderung der Kosten für die Aufarbeitung (z.B.
Filtration in der Herstellung von Fruchtsäften)
 Qualitätsverbesserung
 Veränderte technische Eigenschaften von Proteinen und
Fetten; verbesserter Geschmack von Käse
 Verminderte Umweltbelastung
 Lösungsmittelbedarf in der Penicillinherstellung
 Molkeverwertung (Laktoseabbau)
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Im Gegensatz zur
Stärkeverzuckerung, die in
Rührtankreaktoren mit löslichen
Enzymen durchgeführt wird,
erfolgt die Glukoseisomerisierung in Reaktoren mit gebundenem (immobilisiertem) Enzym
(Festbettreaktoren).
Die Bindung der GlukoseIsomerase, als freies Enzym
oder innerhalb mikrobieller
Zellen, erfolgt über adsorptive
Kräfte an Ionentauscher oder
Silika mit oder ohne Quervernetzung.
Abbildung: Enzymatischer Prozess zur Herstellung von Fruktosereichem Sirup (42 % D-Fruktose), welcher hauptsächlich zur Süßung
von Getränken eingesetzt wird.
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Der Bioreaktor
 Rührkesselreaktor (10 mL bis 100 m3 Arbeitsvolumen)
 Reaktorgeometrie (H/D ≈ 1 - 3)
 andere Designs: Säulenreaktoren ohne mechanisches
Rührwerk (H/D > 3)
 Rührergeometrie (d/D ≈ 0.3 bis 0.5)
 Rührerbauweise und Leistungseintrag des Rühres (Pg ≈ d5)
hängen stark voneinander ab.
 Turbulenz (Reynolds Zahl; Re = Nid2r/m, laminar für Rei < 10;
turbulent für Re > 104) hängt vom Leistungseintrag ab.
Erhöhte Turbulenz verbessert das Mischverhalten im
Bioreaktor.
Rührerdrehzahl Ni [1/s]; Rührerdurchmesser d [m]; Fluiddichte r [kg/m3];
Fluidviskosität m [kg/(m s)]
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Schematischer Aufbau eines
Rührkesselbioreaktors
• Tank aus rostfreiem Stahl
• 1 oder mehrere Rührer
montiert am Rührerschaft
• Montage des Rührers erfolgt
von unten oder oben (Dichtung
und Sterilität !!)
• Leistungseintrag direkt von
der Anzahl der Rührer
abhängig.
• Sterile Belüftungsvorrichtung
(Zu- und Abluft)
• Temperaturkontrolle und
Kühlungsvorrichtung
(Leistungseintrag; mikrobielles
Wachstum)
• Sterile Inokulierung sowie
Probenahme
• Mess- und Regeltechnik
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The power input (Pg) in an aerated stirred vessel influences:
• the oxygen transfer rate by affecting the transfer coefficient kLa, and
• the quality of mixing, avoiding dead zones (where mixing is poor) and
local concentration gradients.
It is dependent on:
• stirrer speed Ni (to the power of 3)
• stirrer diameter d (to the power of 5)
• the fluid density r, and
• the power number of the stirrer (which in turn depends on fluid turbulence given by the Reynold’s number).
The value of kLa is influenced further by the (superficial;
volumetric) gas flow rate (Fg) and the medium viscosity (t).
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Abbildung: Schematischer Darstellung einiger Rührertypen. Die
Auswahl stellt immer einen Kompromiss zwischen Leistungseintrag
(hoch), Aufbringen von Scherkräften (niedrig) sowie Kompatibilität
mit viskosen Medien dar. Der Blattrührer (Rushton impeller) ist am
breitesten einsetzbar. Biotechnologische Medien sind teilweise hoch
viskos, einerseits auf Grund der gebildeten Biomasse oder wegen
polymerer extrazellulärer Produkte.
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Abbildung. Darstellung der Bauweise (a) und des Strömungsverhaltens
(b) in Reaktoren mit axialem (links) und radialem (rechts) Rührer.
Abbildung. Strombrecher im Reaktor sorgen für
erhöhte Turbulenz und damit verbesserte Mischung
des Reaktorvolumens.
Weitere Rührertypen
Abbildung. Zusammenstellung weiterer gebräuchlicher Rührertypen, klassifiziert
nach „axial“ und „radial“ sowie dem Einsatzbereich in Bezug auf die Zähigkeit
der zu mischenden Flüssigkeit. , Viskosität in Pa s.
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Scherkräfte

Scherrate im gerührten Tank (“Integrated Shear Factor” ISF)
 ISF = 2 p N d / (D - d) wobei N die Drehzahl des Rührers ist, d ist der Rührerdurchmesser
und D ist der Durchmesser des Reaktors

Labordaten zeigen, dass z.B. tierische Zellen bei ISF Werten über 20 s-1 kaum mehr
wachsen.
 Hohe Scherraten können für die Grenzflächen Flüssig-Fest erwartet werden. Es ist
daher manchmal nötig, dass zwischen mittlerer Scherrate und maximaler Scherrate
unterschieden wird.
 In Blasensäulen wird die Scherrate durch die Geschwindigkeit (ms-1) der Gasblasen
determiniert. Weiter Schereffekte werden durch Koaleszenz erzeugt.
 Inaktivierung von Zellen und pilzlichen Mycelen (siehe Abb.) durch Scherkräfte
fließt in das Design des Bioreaktors mit ein.
Abbildung: Das Wachstum von filamentösen Organismen unterscheidet sich stark vom Wachstum von
Bakterien oder Hefen. Sie zeigen apikale Verlängerung
und Verzweigung der Hyphen, gefolgt von
Pelletbildung. Prozessfaktoren beeinflussen dieses
Wachstum und auch die Produktbildung.
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Weitere Bioreaktortypen
Blasensäule
Zylindrischer Aufbau,
Verhältnis von Höhe zu
Breite etwa 3 bis 6
Es gibt keine mechanische
Durchmischung - die
Mischung erfolgt über die
mit den Gasblasen
aufsteigende Flüssigkeit
Begasung über Vorrichtung
am Boden (Sinterplatte,
Düse, o.ä.)
Vorteile sind die relativ
geringen Anlagenkosten,
das Fehlen beweglicher
Teile, und die geringe
Schaumbildung
Abbildung. Schematische Darstellungen eines Blasensäulereaktors (linkes Bild) und der
Durchmischung in diesem Reaktor unter heterogenen Flussbedingungen (siehe nächste Seite).
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Abbildung. Typische Konfigurationen von Airliftreaktoren. Die Separation in
Steig- und Fallrohr verbessert die Mischeigenschaften im Vergleich zur Blasensäule.
 Vergleichende Diskussion der Reaktortypen
 Mischungseffizienz und Massentransport sind in allen drei Typen
(STR, Blasensäule, Airlift) im Industriemaßstab ähnlich. Der
maximale Massentransport ist im STR am höchsten, weil der
Leistungseintrag über den Rührer am stärksten ist.
 Im Falle der BS und des AL bricht der Massentransport bei
Viskositäten über 0.1 N s m-2 zusammen.
 Mechanischer Probleme können im STR im Zusammenhang mit
dem Rührermotor auftreten.
 Daher gilt als Faustregel:




BS und AL sind für Bioreaktionen mit myzelbildenden Pilzen und in
der Herstellung von mikrobiellen Polysacchariden ungeeignet.
Flexibilität hinsichtlich Viskosität und Massentransport wird vor allem
durch den STR geliefert.
Die BS ist der billigste Reaktor und wird für Reaktionen im Bereich
niedriger Viskositäten und in Volumina von 50 bis 500 m3 verwendet.
Für Volumina von 200 bis 10 000 m3 wird der AL eingesetzt, vor
allem weil die Möglichkeit lokaler Zugabe von Substrat besteht. Der
STR ist in diesem Maßstab ungeeignet, da die Rührerleistung bis zu
1 MeW ansteigen kann.
Bioreaktionen in viskose Medien werden nicht im Maßstab > 500 m3
betrieben.
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Steriltechnik und Sterilisation
 Dichtungen für den Rührerschaft
(mit Sattdampf sterilisierbare
Gleitringdichtungen)
 Filtration (adsorptive Tiefenfilter;
Absolutfilter mit molekulare
Ausschlussgröße; 0.1 µm)
 Sterile Zudosierung und
Probennahme
 Sterilisation des Bioreaktors
 Sattdampf statt trockener Hitze
 Abtötungseffekt als Funktion der
Inkubationszeit und der Temperatur
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Sterilisation mit Sattdampf
 Aufheizen des flüssigen Mediums auf Sterilisationstemperatur
(etwa 120°C)
 Direkte Injektion von Sattdampf ins Medium
 Verdünnung (10-20%)
 Qualität des Dampfes (Kontamination durch Metallionen oder
organische Substanzen)
 Indirekter Wärmetransfer über Kühlsystem des Reaktors
 Sterilisation erfolgt in drei Phasen, die in einem TemperaturZeit-Profil dargestellt werden: Aufheizen, Haltezeit (thd) bei 120
°C, Abkühlen.
 Die Sterilisationführt zur Reduktion der Anzahl der lebenden
Zellen vor der Inaktivierung (N0).
 Unter der Annahme, dass die Zellen nur während thd inaktiviert
werden, ergibt sich die Frage, wie lange thd sein soll.
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Abbildung: Verschiedene konstruktionstechnische Lösungen,
um Wärmetransfer in Bioreaktoren effektiv zu bewerkstelligen.
Links: Ummantelung; Mitte: Kühlschlangen; Rechts:
Kühlschlangen, die auch als Prellwände fungieren.
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Abbildung: Zeit-Temperatur-Profil für
eine typische Dampfsterilisation (a) und
Abtötung der lebenden Zellen im
Bioreaktor als Funktion der Zeit (b).
Die Inaktivierung der Zellen kann häufig
als Reaktion 1.Ordnung beschrieben
werden. Das heißt, die Abnahme von N
über die Zeit erfolgt exponenziell.
In der thd gilt:
• ln (N1/N2) = kd thd
kd ist eine Inaktivierungskonstante (h-1), die
Organismen spezifisch ist und von der
Temperatur abhängt.
•kd = A exp (-Ed/RT)
wobei A ein Arrhenius Faktor, Ed die
Aktivierungsenergie für den Zelltod, R die
Gaskonstante und T die Temperatur in K ist.
• thd = ln (N1/N2) / kd
N1 ≥ 103; N2 ≤ 10-3
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 Vermeidung von Nebenreaktion (z.B. “Bräunung”) (Abb. 5.8)
 Kenntnis der Kinetik der Inaktivierung von hitzeresistenten Organismen
bzw. Sporen (z.B. Bacillus sp.). (Abb. 11E9.1)
 In Suspensionen, wenn z.B. das Substrat unlöslich ist, hängt
Wärmetransfer stark von der Partikelgröße ab ( 1µm - 1µs; 1cm -100 s).
 N ist direkt vom Maßstab abhängig. Sterilisation von größeren
Reaktoren schwieriger (thd länger; Energiekosten bedeutend).
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Bioprozesskinetik
Abbildung: Charakterisierung des mikrobiellen
Wachstums anhand einer Darstellung des
Zeitverlaufs (oben) sowie der spezifischen
Wachstumsraten in den einzelnen Phasen (unten).
Wie lässt sich das mikrobielle Wachstum und damit
verbunden, Substratverbrauch und Produktbildung
formalkinetisch beschreiben?
Was sind typische Werte für die maximale
Wachstumsrate von Hefen und Bakterien, und in
welchem Größenordnungsbereich liegen die Monod
Konstanten?
Wie lässt sich aus dem Wert der Wachstumsrate die
Verdopplungszeit eines Organismus berechnen?
Wie lässt sich die Zeitdauer des Batches berechnen,
wenn Sie die Anfangs- und Endkonzentration an
Biomasse vorgeben?
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System der Ertragskoeffizienten
Biomasse YXS = g Zellen produziert /
g Substrat verbraucht
Produkt YPS = g Produkt hergestellt /
g Substrat verbraucht
Elektronenbilanzen dienen zur
Berechnung der theoretischen Ausbeuten
wie
• Sauerstoffbedarf oder
• maximale Biomasseausbeute
Ausgegangen wird von den vorhandenen
Elektronen (4 in C, 1 in H, -2 in O etc.)
sowie dem Reduktionsgrad der beteiligten
Reaktanden (Summe aller Elektronen /
Anzahl der C Atome).
Thermodynamisch maximale YXS Werte:
n-Hexan (2,6); Glucose (0,8); Essigsäure
(0,8); Oxalsäure (0,1)
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Voraussetzungen für experimentelle Studien zur Kinetik als
physiologischer Eigenschaft von Mikroorganismen
• Identifizierung relevanter Zustandsvariablen aus den Kulturparametern
• Vereinfachung
• Eliminierung von physikalischen Effekten (Massentransport)
Abbildung:
Wechselwirkungen und
mögliche Beeinflussungen
zwischen dem
biotechnologischen
Produktionsystem
(Zellpopulation) und der
prozesstechnischen
Umgebung (Medium,
Bioreaktor). Eine typische
Frage betrifft die
Konzentration des
limitierenden Substrates
(C-Quelle, O2, etc.)
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Eliminierung von Massentransporteffekten
Abbildung: Darstellung von drei Rührtankbioreaktoren zur
Erklärung der Begriffe „Transportlimitierung“ und
„Pseudohomogenität“.
a) Fall einer homogenen Lösung ohne Grenzflächen (z.B.
flüssig/fest oder gasförmig/flüssig); Stofftransport (rTR)
erfolgt in der Regel durch molekulare Diffusion und ist
zumeist viel schneller als chemische Reaktionen (rRk).
Zur Ermittlung kinetischer Gesetzmäßigkeiten muss
gelten, dass rRk ≤ 0,1 rTR. Ein mögliches Beispiel wären
Transformationen mit löslichen Enzymen.
b) Pseudohomogener Fall, in dem zwar reale
Grenzflächen vorliegen (OTR, Sauerstofftransport von
der Gas- in die Flüssigphase; Versorgung von
suspendierten mikrobiellen Flocken mit Substrat),
jedoch das Kriterium rRk ≤ 0,1 rTR nach wie vor erfüllt
wird.
c) Fall eines heterogenen Systems, wobei rRk ≥ 0,1 rTR.
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Abbildung. Eliminierung von Massentransporteffekten (2) - Mischzeitkonzept
für Rührkesselrektoren. Experiment zur Charakterisierung des Mischverhaltens in
einem Bioreaktor. Ein Marker (Salzlösung, Farbstoff, ...) wird in den Reaktor injiziert
und die Misschung über Leitfähigkeit oder spektrophotometrische Detektion on-line
mit einer Elektrode gemessen. Das Bild zeigt einen typischen Verlauf, aus dem die
Zirkulationszeit (tc) und die Mischzeit (tm) ermittelt werden. tm wird durch die definierte
Mischgüte (z.B. 90% wie im Bild) festgelegt. tc ist eine Funktion des Macromixing und
wird durch stärkeres Rühren erniedrigt. Beachten Sie: tm ≤ 0,1 tRk. Ein idealer
Rührkessel ist vollständig (Mischgüte: 100%) und unendlich schnell vermischt.
Grundbegriffe der Monod Kinetik
Biologisches Wachstum in einer autokatalytischen Reaktion
rX = dx/dt = µ x
mit x der Konzentration an Zellen (g/L), X der Masse an Zellen (g), rX der
Wachstumsgeschwindigkeit (g/(L h)) sowie einem Proportionalitätsfaktor µ (1/h),
der als spezifische Wachstumsrate bezeichnet wird.
µ = rX/x
Für die Situation von nur einem limitierenden Substrat formulierte Monod:
µ = µmax s/(Ks + s)
mit µmax der maximalen spezifische Wachstumsrate (1/h), s der Substratkonzentration (g/L) sowie Ks der Sättigungskonstante für s.
Den Ertragskoeffizienten YXS kann man formulieren als:
YXS = rX/rS (oder vereinfacht: = x/s)
Typische Werte für µmax sind mit Glucose als C-Quelle (Saccharomyces: 0.47 1/h;
E. coli: 2 1/h); für Ks von Glucose (Saccharomyces: 25 mg/L; E. coli: 4 mg/L;
Aspergillus: 5 mg/L) und O2 (etwa 0,05 mg/L)
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Abbildung: Vergleich von zwei Monod-Kinetiken mit
unterschiedlichem Ks Wert (relativ niedrig: oben;
relativ hoch: unten).
Bezüglich der Substratkonzentration s wird unter
sättigenden Bedingungen (s ≈ 10 Ks) eine Reaktion
nullter Ordnung erreicht.
rx = dx/dt = (µmaxx) s0
wobei: s0 = 1
Liegt s deutlich unter Ks, werden Bedingungen einer
Reaktion erster Ordnung erreicht.
rx = dx/dt = (µmaxx/Ks) s1
wobei: s1 = s
Überlegungen zum Satzverfahren (Batch)
• Reaktor wird befüllt und inokuliert. Danach ändern sich mit fortschreitendem Wachstum die Konzentrationen (Ci) aller Nährstoffe, der Zellen und der Produkte mit der
Zeit.
• Aus der Massenilanz: (VCi)/t ≈ d(VCi)/dt = V ri
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Überlegungen zum Satzverfahren (Batch) (2)
• Aus der Konzentrationsbilanz: Ci/t ≈ dCi/dt = ri
• Unter Verwendung der Monod-Kinetik:
Biomasse: rX = dx/dt = µ x = µmax x s/(Ks + s)
Substrat: rs = ds/dt = qs x = - (µ/YXS) x = - x [µmax s/(Ks + s)]/YXS
• Oft gilt, da Ks einen kleinen Wert hat, dass s/(Ks + s) ≈ 1.
• Das heißt in weiterer Folge: rX = dx/dt ≈ µmax x.
• Nach Variablenseparation und Integration erhält man:
ln(x) - ln(x0) = ln (x/x0) = µmax (t - t0), oder
x = x0 e µmax (t - t0)
mit t der Zeit und dem Index 0 für t = 0.
• Wachstum (und Substratverbrauch) erfolgen exponenziell. Wenn s ≈ Ks stimmt die
Näherung von s/(Ks + s) ≈ 1 nicht mehr. Es folgt ein Übergang von exponenzieller
Phase in eine Verzögerungsphase.
• Minimale Verdopplungszeit td: 2 x0 = x0 e µmax (td - 0)
woraus folgt: td = ln(2)/µmax
• Minimale Dauer des Batches tB = [ln(x0 + x) - ln(x0)]/µmax
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Überlegungen zum Satzverfahren (Batch) (3)
• Minimale Dauer des Batches tB = [ln(x0 + x) - ln(x0)]/µmax
• Mit der Annahme, dass x0 sehr viel kleiner als x ist, und mit x = s0YXS erhält man:
tB = [ln(s0YXS) - ln(x0)]/µmax
• Sauerstoff kann als limitierendes Substrat auftreten
Sauerstoff ist in wässrigen Medien nur
schlecht löslich. Wie kann der
Mikroorganismus totzdem ausreichend
mit Sauerstoff versorgt werden, um das
Wachstum optimal zu unterstützen?
Begasung mit Luft oder reinem
Sauerstoff ist nötig.
YXO2 = rX / rO2
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 Sauerstofftransportrate OTR = kLa (O2* - O2)
kL ist der Massentransportkoeffizient der Flüssigphase (ms-1);
a ist die Gas-Flüssig Austauschfläche pro Volumseinheit (m2
m-3); O2* ist die Gleichgewichtskonzentration von Sauerstoff,
und O2 ist die aktuelle Konzentration.
 OTR kann verbessert werden durch:
 Erhöhung von O2* (Reinsauerstoff statt Luft; Druckerhöhung)
 Erhöhung des kLa Wertes (Bioreaktortechnologie; 0.02 - 0.2 s-1)

Größe und Verweilzeit der Gasblasen (Art der Begasungseinheit; Rührer
und Rührspitzengeschwindigkeit)

Leistungseintrag (Art und Geometrie des Rührers; Rührerdrehzahl bzw.
Rührspitzengeschwindigkeit)

Turbulenz (Rührer; Strombrecher)

Begasungsrate
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Wechselwirkung zwischen biologischen
und prozesstechnischen Faktoren
Einflussfaktoren
• des Mediums
pH, T, mehr als 1
limitierendes Substrat,
chemische Reaktionen,
rheologische Eigenschaften, Grenzflächen,
Inhomogenitäten)
• der Zellen
Operative Rahmenbedingungen für den
Betrieb eines Bioreaktors
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Mess- und Regeltechnik in Bioreaktoren
Abbildung. Messparameter in Bioreaktoren. Kontrolliert werden zumeist physikalische und
chemische Parameter. Biologische Parameter wie die Biomassekonzentration lassen sich im
Regelfall nur indirekt kontrollieren, wofür eine quantitative Korrelation zwischen
physikalischen / chemischen Parametern und der biologischen Größe hergestellt werden
muss. Es kann sich dabei um ein mathematisches Modell handeln (z.B. Monod Kinetik) oder
empirische Korrelationen.
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Aufarbeitung
 Sedimentation, Flockulierung, Flotation oder
Zentrifugation von Zellen (Abb. A1)
 Filtration von Zellen oder Enzymen (Abb. A2)
 Mechanischer Zellaufschluss (Abb. A3)
 Weitere Reinigungsverfahren (bis zu 90% der
Produktionskosten)
 hochentwickelte Methoden auf Basis von biologischer
Affinität verfügbar
 Kosten meist prohibitiv (klassische Chromatographie)
 Kontinuierliche Aufarbeitung im Prozessmaßstab
(Abb. A4)
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Zentrifugenbauarten
• Röhren (links)
• Teller (mitte)
• Mehrkammer (rechts)
Abbildung A1: Darstellung von 3 technologisch genutzten Typen
von Zentrifugen. Ein künstlich verstärktes Schwerefeld (≥ 5000 x g)
ist bei vielen Zellen nötig, um brauchbare Absetzgeschwindigkeiten
(im Vergleich zur Sedimentation) zu erzielen. Im Idealfall wird ein
pastöses Produkt erzeugt. Wesentlich ist neben der Dichte der
Zellen, deren Radius (bei Annahme von Kugelform).
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 Flockulation
 Bildung von Zellaggregaten durch Zusatz von
Flockulationsmitteln (geladene Polymere wie
Polyethylenimin oder Acrylamid / Acrylat,
mehrwertige Kationen, quarternäre
Ammoniumverbindungen, ...)
 Neutralisation der negativ geladenen Gruppen an
der Zelloberfläche von Mikroorganismen
 Gute Sedimentation der Flocken ist wichtig
 Flotation
 Anhaftung der Zellen an Gasblasen
 Zugabe von Oberflächen aktiven Substanzen
(“Schäumer”) wie kurzkettige Polyethylenglykole
oder langkettige Alkohole
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 Filtration von Zellen
 Abtrennung von festen Teilchen mit einem Filterhilfsmittel
 Kuchen- oder Oberflächenfiltration
 Sieb- oder Membranfiltration (Größenausschluss)
 Tiefen- oder Bettfiltration (adsorptive Wechselwirkungen)
Oberflächenfiltration
• Träger, der von Filtertuch bedeckt ist
• Während der Filtration bildet sich der
Filterkuchen allmählich, und der
Flusswiderstand steigt damit stetig.
• Bleibt der angelegte Druck konstant, sinkt die
Durchflussrate.
• Zellen stellen einen kompressiblen
Filterkuchen dar, und es muss ein Kompromiss
zwischen Durchlässigkeit (geringer Druck) und
Kuchenentwässerung gefunden werden (hoher
Druck).
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 Zellaufschluss
 Chemische Methoden (Alkalibehandlung; Detergenzien
wie SDS oder Cetyl (C16) Trimethylammoniumbromid;
Enzyme wie Lysozym; Lyse durch Phagen oder
Antibiotika wie Penicillin oder CephalosporinC)
 Osmotischer Schock (Einfrieren, Auftauen) und
Trocknung (Gefrier-, Sprüh-, Lösungsmittel)
 Mechanische Verfahren



Scherkräfte in Lösung (Ultraschall, Rotor-Stator-Mischer mechanische Rührung; Hochdruckhomogenisator - Druck;
1000 - 2000 bar)
Scherkräfte in Festsubstanz (Kugelmühle - Vermahlen;
Mörser und Pistill - Vermahlen; X-Press - Druck)
Für größeren Maßstab sind der Hochdruckhomogenisator
und die Kugelmühle gut geeignet.
 Kombinationen der Aufschlussmethoden sind möglich und
sinnvoll.
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 Zellaufschluss
Eine technische Version des
Hochdruckhomogenisators ist der
Manton-Gaulin Homogenisator. Die
Menge an freigesetztem intrazellulären
Produkt ist proportional
• dem angelegten Druck
• der Anzahl der Passagen durch den
Homogenisator
• und ist temperaturabhängig.
Kugelmühlen unterscheiden sich in
den Geometrien der Rührscheiben und
vor allem in den verwendeten
Mahlkugeln (meist aus Glas):
• für Hefe (0,75 - 1,0 mm)
• für Bacillus sp. (0,50 - 0,75 mm)
• für Brevibact. sp. (0,25 - 0,50 mm)
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Abbildung: Die Prokaryonten (Eubakterien, Archebakterien) unterscheiden
sich hinsichtlich des Aufbaus und der Stabilität ihrer Zellwände. a) Archaea;
b) Gram-positive und c) Gram-negative Eubakterien.
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Kontinuierliche Aufarbeitung
Weitere Aufarbeitungsschritte für technische Enzyme
beinhalten vor allem:
• Fällung und Membranfiltration
• Einfache chromatographische Verfahren
• Extraktion und eventuell Trocknung
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Allgemeines Schema für die Proteinaufarbeitung
Resolution increases
CAPTURE
precipitation
extraction
ionexchange, HIC
INTERMEDIATE
various chromatopraphic proc.
POLISHING
Affinity methods
High-resolution
chromatography
Capacity increases
Technische Enzyme
und Proteine
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Therapeutische Enzyme
und Proteine
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Technische Enzyme
 Einsatzbereiche in der
Technologie
 Hauptsächlich Hydrolasen
(Enzymklasse 3)

Spaltung von Kohlenhydraten,
Proteinen, Fetten
 einfache und technisch wichtige
Reaktionen
 keine Kofaktoren
 stabil
 “Other”: Analytik und Sensoren,
Medizin, Biokatalyse und
Feinchemikalien
 Keine “Reinproteine”
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Industrielles Beispiel
 Resolution von Aminosäureracematen (Gemisch der
D,L-Form nach chemischer Synthese) durch
Acylierung (der Aminogruppe) und anschließende
selektive enzymatische Deacylierung mit dem Enzym
L-Aminosäureacylase
 Anwendungen für Lebens- und Futtermittel bzw. für
medizinische und kosmetische Zwecke.
Abbildung: Konzept der enzymatischen Resolution.
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Industrielles Beispiel
Abbildung: Prozesstechnische Realisierung der Resolution von
racemischen Acylaminosäuren. Kernelement ist der immobilisierte
Enzymreaktor, im Design eines Festbettes.
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Industrielles Beispiel
Abbildung: Darstellung verschiedener Methoden der Enzymimmobilisierung
(Rückhaltung). Transport zum und vom Enzym kann durch Diffusion
(Konzentrationsgradient) oder Konvektion (Druckdifferenz) erfolgen.
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Industrielles Beispiel
Abbildung: Reaktorkonfigurationen für enzymkatalysierte Prozesse. Die
gezeichneten Membranen in Bild (b), (e) und (f) besitzen Poren, die für
Proteine impermeabel sind (Ultrafiltrationsmembranen). Bilder (c) und (d)
zeigen Festbett- und Wirbelschichtreaktoren.
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