Chemisch-Analytische Methoden in der Pflanzenpyhsiologie

Chemisch-Analytische Methoden
in der Pflanzenphysiologie
• Qualitative Analytik nennt man Nachweis
• Aufgabe der (Bio)Chemischen Analytik ist die
quantitative Bestimmung von Stoffen (Analyten)
• Spurenanalytik (Kleinstmengenanalyse)
• Test (halbquantitative Analyse)
Verfahren, Methode, Prinzip
UntersuchungsObjekt
Probennahme
VorAusMessung
bereitung
wertung
Prinzip
Analysemethode
Analyseverfahren
Analytische
Information
Chemische Analytik
Naßchemische
Methoden
Gravimetrie
z.B. Wägungen
Volumetrie
z.B. Titrationen
Instrumentelle
Methoden
Elektroanalytische
Methoden
Optische
Methoden
z.B. Spektroskopie
Trennmethoden
z.B. Chromatographie
Kriterien zur Beurteilung einer
Methode
• Spezifität (Selektivität)
• Empfindlichkeit (Nachweisgrenzen)
• Genauigkeit & Reproduzierbarkeit
(accuracy & precision)
Selektivität
• Selektivität hängt von möglichen Störungen
durch andere Probe-Inhaltsstoffe ab.
Abtrennung von störenden Stoffen
spezifischere Methoden
• Begriff: Matrix!
Empfindlichkeit
Fähigkeit der Methode zwischen kleinen Differenzen
in der Konzentration des Analyten zu unterscheiden
abhängig von der Steigung
der Kalibrationsgeraden
Nachweisgrenze:
N = SL + 3.StabL
Meß-Signal( S)
S = m.c + SL
)
c
(
n
e
t
y
l
a
n
A
s
e
d
n
o
i
t
a
r
t
n
e
z
n
o
K
Genauigkeit & Reproduzierbarkeit
• Genauigkeit (accuracy)
sagt aus, wie nahe ein Meßwert dem
tatsächlichen Wert kommt
• Reproduzierbarkeit (precision)
sagt aus wie übereinstimmend wiederholte
Messungen sind
Systematischer & Zufälliger Fehler
Zufälliger
Fehler
Systematischer
Fehler
Genauigkeit
optimal
gut
schlecht
Reproduzierbarkeit
optimal
schlecht
gut
Die Kalibration
Prozess, mit welchem man die Gerätewerte
mit den absoluten Mengen der zu bestimmenden
Substanz in Übereinstimmung bringt.
•
•
•
•
Leerwerte (blanks)
Standards (externe, interne)
Kalibrationsbereich
Kontrollen
Leerwerte
• Leerwert ist Matrix ohne Analyt
• Nullpunktbestimmung für jedes analytische
Gerät notwendig
• Man unterscheidet:
- Reagenzienleerwerte (z.B. Photometrie)
- Blindwerte (Grundwert, z.B. Enzymatik)
Standards
Proben bekannter Konzentration, die man zur
Kalibrierung einer Methode einsetzt, nennt man
Standards!
Standards sollten in Matrix hergestellt sein.
• Externe Standards: die zu bestimmende Substanz
wird chemisch rein eingesetzt
• Interne Standards: eine ähnliche Substanz, die man
zusetzt und die als Bezugsgröße verwendet wird
Kalibrationskurve
1
2
1
2
8
8
Instrument-Anzeig
1
6
Instrument-Anzeig
Kalibrationspunkte
1
6
4
Nichtlineare
Kalibrationskurve
4
Arbeitsbereich
0
0
0
4
8
1
2
K
o
n
z
e
n
t
r
a
t
i
o
n
d
e
s
A
n
a
l
y
t
e
n
(
c
)
1
6
0
4
8
1
2
K
o
n
z
e
n
t
r
a
t
i
o
n
d
e
s
A
n
a
l
y
t
e
n
(
c
)
1
6
Kalibration
1. Leerwert
M+R
Messung
InstrumentenAnzeige
Auf Null stellen
Messung
InstrumentenAnzeige
Kalibrationskurve
Messung
InstrumentenAnzeige
Werteberechnung
2. Standards
S1 + M + R
S2 + M + R
3. Proben
P1 + M + R
P2 + M + R
M, Matrix; R, Reagentien; S1, Standard 1; P1, Probe 1.
Kontrollen
• Um eine Methode zu überprüfen sollte
regelmäßig eine Probe bekannter
Konzentration gemessen werden.
• Biologische Referenzmaterialien
• Schwierig bei Methoden die keine poolGrößen messen, sondern Prozesse (etwa
Enzymaktivitäten)
Berechnungen 1: Konzentrationen
• Masse (kg)
c=m/v
(Konzentration = Masse / Volumen)
z.B.: mg L-1, µg cm-3, mg mL-1, etc
• Stoffmenge (Mol)
c=n/v
(molare Konzentration = Mol / Volumen)
z.B.: mol L-1 (M), mmol L-1 (mM), µmol mL-1 (mM),
µmol L-1 (µM)
Berechnungen 2: Verdünnungen
! das Produkt aus Konzentration mal Volumen vor der
Verdünnung entspricht dem Produkt nach der Verdünnung!
Cvor x Vvor = Cnach x Vnach
z.B.: Aus einer 1M KCl-Lösung soll 250 mL einer 20mM
Lösung hergestellt werden.
1M x X = 0.02M x 250 mL
X = (0.02 x 250) / 1 = 5 mL
Lösung: 5 mL einer 1M KCl sind notwendig um 250 mL einer
20 mM Lösung herzustellen
Berechnungen 3:
Verdünnungsfaktor
• Z.B.: 10-fache Verdünnung (1 zu 10, 1:10)
1 mL auf 10 mL bedeutet 1 mL + 9 mL oder
1 mL in einem Gesamtvolumen von 10 mL
• Mischt man also gleiche Volumina
miteinander hat man eine Verdünnung von
1:2 (nicht 1:1!).
Werteangaben (signifikante Stellen)
max
Differenz

Max. Fehler*
(in %)
3,5
4,4
0,9
11,25
4,4
4,35
4,44
0,09
1,02
4,44
4,435
4,444
0,009
0,101
4,444
4,4435
4,4444
0,0009
0,010
Resultat
(R)
Grenzwert
min
4
*) F=0.5(/R)*100
Beispiel:
Waage zeigt 0.0256 g an. Die letzte Stelle ist unsicher! Der
wahre Wert kann also zwischen 25.55 und 25.64 mg liegen.
Werteangaben 2
Beispiel:
Meßwerte — 11.44 mg Calcium, 2.11 g Pflanzenmaterial
11.44
11.435 - 11.444
2.11
2.105 - 2.114
5.4366
5.4092
Jeder Wert zwischen 5.409 und 5.437 ist möglich.
Der Wert kann also nicht als 5.42 angegeben werden
(Grenzwerte 5.415-5.424), sondern nur als 5.4 mg g-1
(Grenzwert 5.35 und 5.44).
Praktische Hinweise
• Chemikalien
• Wasserqualitäten
• Wägen
• Zentrifugation
• Volumsmessungen
Chemikalien
• Gefahrensymbole
Giftig
Mindergiftig
Reizend
Ätzend
Explosionsgefährlich
Brandfördernd
Hoch/Leicht
Entzündlich
• Qualitäten
p.a. (pro analysis), zur Synthese, ACS, OEAB, chemisch
rein, Suprapur, Biochimica select
• Beschriftungen von abgefüllten Chemikalien
Inhalt, Konzentration, Datum, Benutzer
Chemikalien
Wasserqualitäten
• Demineralisiertes Wasser
Geschirrspüler
(Reversosmose, Hausleitung)
• Deionisiertes Wasser
(Ionentaustauscherpatrone, allg. Labor)
• Destilliertes Wasser
Abwaschen,
anorg. Analytik
Enzymaktivitäten
(Quarzdestillationsanlage)
• Milli Q-Wasser
(Reinstwasser >18.2 MOhm cm-1)
Reinstwasser,
Chromatographie
WÄGEN
• Wägebereich der Waage beachten!
• Störungen: Offene Türen, Heizung, Erschütterungen
• Nivellieren (Libelle) und Kalibrieren (Auto)
•
•
•
•
•
•
Wägegefäß sollte möglich klein sein
Statische Aufladungen vermeiden (kein Kunststoff)
Mitte der Waagschale (Ecklasteffekt)
Waage vorbelasten (Erstwägeeffekt)
Indirekte Handhabung (Zange; T- und RH-Effekte)
Wägegut sollte Umgebungstemperatur haben
Einflüsse beim Wägen
Temperatur
T+
Wägegut
erscheint leichter
Luftfeuchte
TWägegut
erscheint schwerer
Verdunstung
erscheint leichter
Wasseraufnahme
erscheint schwerer
Zentrifugation
• Relative Beschleunigung
(x g) statt Drehzahl (rpm)
• Max. Drehzahl beachten
• Bremsen (je nach Anwendung)
• Austarieren der Gefäße
• Beladung:
- 2 x gegenüber (180°)
- 3 x im Winkel 120°
Volumsmessung
(auf Wägungen zurückführbar)
• Glaspipetten
(Ex, 20°, ± 1%)
Voll-, Meß-, Präszisionspipetten
•
•
•
•
•
Luftpolsterpipetten
Meßzylinder
Büretten
Dispensoren
Meßkolben (In!)
Enghals, Weithals