SW-V8-Prot

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V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung
Beispiele für Protein-Liganden Komplexe
Wo ist das aktive Zentrum?
(Docking wird hier nicht behandelt – siehe Spezialvorlesungen von A. Kämper und
A. Hildebrandt/D. Neumann im SS05)
Wie stark binden Liganden an Proteine?
Wie kann man die Affinität des Liganden verbessern?
Wie gelangen Liganden zum Protein (elektrostatische Anziehung)?
Wie gelangen sie ins Proteininnere bzw. wieder hinaus?
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
1
beta-Trypsin:Benzamidin (3ptb)
Enge, sehr polare Bindungstasche auf Proteinoberfläche.
Amidin-Gruppen
des Liganden
bilden 4 HBindungen mit
Carboxylgruppen
des Proteins
(Trypsin) aus.
Benzolring passt
optimal in hydrophobe Tasche.
www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
2
Cytochrome P450cam : Kampher (2cpp)
Weites, recht unpolares aktives Zentrum im Proteininneren.
Hämgruppe katalysiert Reaktion. Partielle Desolvatation.
Wie gelangt Substrat hinein?
www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock
Softwarewerkzeuge
8. Vorlesung WS 2004/05
3
Maus-Antikörper McPC-603:Phosphocholine (2mcp)
Bindungstasche auf Proteinoberfläche wird durch drei
hypervariable Loops geformt.
www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
4
Streptavidin:Biotin (1stp)
Sehr polare, tiefe Bindungstasche.
Außerordentlich starke Affinität.
www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
5
HIV-1 Protease:XK-263 Inhibitor (1hvr)
Inhibitor XK-263 stammt von Merck-Dupont. Er enthält eine 7-Ring
zyklische Urea-Einheit mit Phenyl- und Naphtyl-Ringen.
Die CO-Gruppe ahmt das ansonsten konservierte Wassermolekül 301 nach
und verdrängt es. Der tiefere Teil des zyklischen Urea-Rings enthält zwei
benachbarte Hydroxylgruppen, die H-Bindungen mit den katalytischen
Aspartat-Residuen bilden.
8. Vorlesung WS 2004/05
www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock 6
Softwarewerkzeuge
Identifikation von funktionellen Residuen
1 Funktionelle bzw. katalytische Residuen werden traditionell in (hoch)
konservierten Regionen von Multiple Sequence Alignments erwartet
evtl. Kopplung mit Information über 3D-Struktur
2: finde Residuen, die Proteinstruktur destabilisieren.
Grund: Funktionelle Residuen im Proteininneren sind oft energetisch ungünstig.
Funktionalität auf Kosten von Stabilität.
3: finde Löcher oder Einbuchtungen in Proteinstruktur.
Hier vorgestellt: integrierte Methode, die 1 -3 implementiert. Möglichkeit für
funktionelle Annotation von Proteinen mit unbekannter Funktion.
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
7
Wo ist das aktive Zentrum I?
Auswahl von 49 Enzymen. Kriterien:
- Auflösung  2.0 Å
- funktionelle Residuen sind bekannt (in Swissprot-Eintrag in ACT_SITE)
- enthalten nur eine Domäne (SCOP Datenbank)
- die SCOP-Einträge sind unterschiedlich
- es gibt  10 homologe Sequenzen mit Blast E-Wert < 10-10.
98 katalytische Residuen:
22 His
17 Asp, Glu
10 Cys
8 Ser
7 Arg, Lys
5 Tyr
3 Asn
2 Thr
8. Vorlesung WS 2004/05
Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)
Softwarewerkzeuge
8
Repräsentative Enzyme
PDB
Protein
Länge Auflösung
EC
SCOP
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
Zahl
Seq.
Zahl und Namen der
katalytischen Residuen
9
Repräsentative Enzyme
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
10
Fitness-Funktion
- Bewertung der Seitenketten-Konformation entsprechend Rotamer-Bibliothek
- Seitenketten-Packung (wissensbasiert)
- Hydratation (wissensbasiert)
- Analyse der Proteinoberfläche (MSP-Programm): Zuordnung zu den einzelnen
Residuen
- elektrostatische Energie: AMBER-Partialladungen  elektrostatisches Potential
(aus Poisson-Boltzmann-Rechnung)
Jeder Score(S), Rang (R) und Position (L) werden gegen den Mittelwert und die
Standardabweichung für jeden Aminosäuretyp normalisiert.
Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
11
Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen
Beispiel: 3D-Profil für Lysozym aus Hühnereiweiss. D52 ist katal. Residue.
native
Residue
Hydratations- lokale
klasse
Struktur
D52 hat sehr schlechten Rang. D.h.
es wäre günstig D52 zu ersetzen.
Katalytische Residuen sind stets unstabiler als nicht-katalytische.
Score Rang
Score
native native
beste
Residue
Residue Residue
8. Vorlesung
WS 2004/05
Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)
Softwarewerkzeuge
12
Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen
Flussdiagramm der Vorhersagemethode.
- Links oben Analyse der Konservierung.
- Rechts oben Analyse der Position in
3D-Struktur bzw. Stabilität der
Mutantenproteine
- untere Hälfte trifft für verschiedene
Aminosäuretypen (1-Letter-code)
die Entscheidung, ob katalytische
Residuen vorliegen.
Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
13
Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen
Proteinstrukturen mit unbekannter Funktion. Die vorgeschlagenen
katalytischen Residuen sind markiert.
Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
14
Wo ist das aktive Zentrum II
Analyse mit elektrostatischen
Kontinuumsrechnungen
 
 A 

pH  pK a  log 
 HA 
Die Titrationszustände der meisten
Aminosäuren folgen der
Henderson-Hasselbalch-Gleichung.
Berechne Titrationskurven für 3
Enzyme mit UHBD.
TIM und AR haben eine sehr ähnliche
Strukturen, katalysieren aber ganz
unterschiedliche Reaktionen.
Ondrechen, Clifton, Ringe,
PNAS 98, 12473 (2001)
AR und PMI haben sehr verschiedene
Strukturen, katalysieren aber ähnliche
Reaktionen.
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
15
Theoretische Titrationskurven
Titrationskurven aller His-Residuen
in TIM
Triosephosphat Isomerase (TIM) katalysiert die Isomerierung von D-Glyceraldehyd3-Phosphat zu Dihydroxyaceton-Phosphat.
Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven:
His95, Glu165, Lys112, Tyr164.
Ondrechen, Clifton, Ringe,
Davon liegen H95, E165 und Y164 eng beieinander.
PNAS 98, 12473 (2001)
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
16
Theoretische Titrationskurven
Titrationskurven aller Tyr-Residuen
in AR
Ondrechen, Clifton, Ringe,
PNAS 98, 12473 (2001)
Aldose-Reduktase (AR) katalysiert die Reduktion einer Aldehydgruppe von
Aldose zu einem Alkohol.
Man findet 7 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven:
Tyr48, Cys298, Glu185, Lys21, Lys77, Tyr107, Tyr209.
Tyr48, His110 und Cys298 bilden das aktive Zentrum. Die anderen Residuen
liegen in der Nähe.
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
17
Theoretische Titrationskurven
Titrationskurven aller Lys-Residuen
in PMI
Ondrechen, Clifton, Ringe,
PNAS 98, 12473 (2001)
PMI katalysiert die Interkonversion von Mannose-6-Phosphat und Fructose-6Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven:
His135, Lys100, Lys136, Tyr287.
Alle liegen eng beieinander, die ersten 3 wohl im aktiven Zentrum und His135
nahe bei Lys136.
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
18
Weitere Beispiele
PDB ID
Name
1AMQ
Aspartat
aminotransferase* Transamination
Subtilisin
Peptidhydrolyse
Carlsberg
(Serin-Protease)
Acetylcholinesterase Ester Hydrolyse
1CSE
1EA5
1HKA
1OPY
1PIP
1PSO
1WBA
Chemie
Residuen mit auffälligen Titrationskurven
[H189, Y225, K258, R266, C191, C192],
[Y256], [Y295], [H301]
[D32, H64]
[Y130, E199, E327, H440, D392],
[Y148], [H398], [H425]
[D97, H115]
6-Hydroxymethyl-* Kinase
7,8-dihydropterin pyrophosphate kinase
3-Keto-5-Steroid Isomerase
isomerase
Papain
Peptidhydrolyse
(Cys Protease)
Pepsin
Peptidhydrolyse
(Säure-Protease)
Winged bean
Speicherung - keine
albumin
Enzymfunktion
Ondrechen, Clifton, Ringe,
PNAS 98, 12473 (2001)
8. Vorlesung WS 2004/05
[Y16, Y32, Y57], [C81]
[C25, H159],
[K17, K174, Y186], [R59], [R96]
[D32, D215, D303], [D11]
keine
Residue im
aktiven Zentrum
Softwarewerkzeuge
Residue im
zweiter Schale.
19
Fazit
Mittels elektrostatischer Kontinuumsrechnungen für bekannte Kristallstrukturen
von Proteinen wurde für verschiedene externe pH-Werte die energetisch
optimale Gesamtladung der Proteine berechnet.
Aktive Zentren von Enzymen enthalten oft mehrere polare bzw. geladene
Seitenketten um die chemische Umwandlung zu katalysieren.
Deren Titrationszustände sind eng aneinander gekoppelt und zeigen im
Vergleich zu isolierten Seitenketten sehr ungewöhnliche Titrationskurven.
Diese Methode erlaubt also die Position von aktiven Zentren allein aufgrund
der Proteinstruktur zu erkennen.
Ondrechen, Clifton, Ringe,
PNAS 98, 12473 (2001)
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
20
Wie stark binden Liganden an Proteine?
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
21
exp. Affinitäten von Protein:Liganden Komplexen
# Atome Ligand
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
4
4
4
5
5
5
6
6
6
7
7
7
8
8
8
9
9
9
9
Ca2+
Hg2+
Mn2+
Fe3+
Ag+
FS2Xe
NH3
CO
O2
Cyanide
Hydroxylamine
Azide
Ethylamine
Thioacetamide
NO3Vanadate
Thiosemicarbazide
SO42Iodoacetamide
Putrescine
Aminooxyacetic acid
Oxalat
-Aminobutyid acid
L-Cysteine
Aminomethiozolidine
Muscimol
Bromopyrimidone
Phosphonoacetic acid
Acetopyruvate
Methyl iodotyrosine
Nitrooxazolidinone
Benzamidine
Target
Typ
Amino-transferase
IM
Uroporphy-synthase
IM
Inositol-phosphatase
IM
Hydroxylase
IM
Arylformamidase
IM
Phosphotransferase
IA
Peroxidase
IA
Myoglobin
L
Meamine glutamate transferase I
Myoglobin
L
Myoglobin
L
Methane oxygenase
IA
Glycerol oxidase
IC
Glycerol oxidase
IA
Protease I
I
Methan monooxygenase
I
Carbonate deydratase
IA
Phytase
IA
Methane monooxygen.
I
Creatine kinase
IA
Methyl transferase
IC
Spermine synthase
I
Aminotransferase
I
Lactate dehydrogenase
IA
Neuromanidase transmitter
L
Serine acetyl transferase
I
Methyl transferase
I
-aminobutylicacid agonist
L
Cytosine deaminase
I
DNA polymerase
I
Acetoacetate decarboxylase
I
Tyrosine monooxygenase
I
Aldehyde dehydrogenase
I
Trypsin
I
8. Vorlesung WS 2004/05
-log K1
6.70
6.00
5.70
5.30
5.00
4.55
4.28
2.30
1.79
7.52
6.18
6.00
5.92
5.70
3.00
5.00
4.70
4.55
6.00
5.22
5.00
8.77
7.19
5.80
8.00
6.22
5.40
8.73
6.24
6.00
7.00
6.30
5.46
4.77
Softwarewerkzeuge
IM: Metallionischer Inhibitor
IA: kleiner anionischer Inhibitor
L: Ligand (Agonist oder Antagonist)
I: Inhibitor
IC: potentiell kovalente Wechselwirkung
22
experimentelle Protein-Liganden Affinitäten
# Atome Ligand
10
10
10
11
11
11
12
12
12
13
13
13
14
14
14
15
15
15
16
16
16
17
17
17
18
18
18
19
19
19
20
20
20
21
21
21
21
Target
Typ
-log K1
Allopurinol
Xanthine oxidase
I
9.17
Acetylcholine
Cholinergic receptor
L
8.14
Cabachol
Cholinergic receptor
L
7.85
Mercapto oxoglutaric
Isocitrate dehydrogenase
I
8.30
Diethyl pyrocarbonate
Ca2+ transmitter
L
8.80
Dopamine ,
, -androgen receptor
L
8.65
Norepinephrine
Adrenergic agonist
L
8.88
Nicotine
Nicotinic receptor
L
8.22
Hydroxybenzyl-Me3NR4 Acetycholiesterase I
I
7.68
Tiamenidine
-Adrenergic agonist
L
8.66
Serotonin
5-Hydroxy tryptamine receptor L
8.30
Benzyl mercaptopropionate Carboxypeptidase
I
7.96
Guanabenz
-Adrenergic receptor
L
9.02
Methylenpenicillanic
-Lactamase
I
8.85
Captopril
Carboxypeptidase
I
8.70
Aminoclonidine
L
9.32
Guanfacine
-Adrenergic agonist
L
8.73
Isatin derivative
Rhino protease
I
7.30
Acetophenone derivative ACEsterase
IC
14.89
Biotin
Streptavidin
L
13.43
Naphazoline
Adrenergic
L
8.73
Melatonin
Melatonin receptor
L
8.96
Guanine derivative
Purine nucleoside phosphorylase I
7.96
piperoxan
antihyper. receptor
L
7.85
Iodomelatonin
Melanin receptor
L
10.68
Alprenolol
-adrenergic receptor
L
9.47
Phosphoramidon
Metalloproteinase
I
7.55
Vesamicol
Vesamicol receptor
L
9.47
Propranolol
-adrenergic receptor
L
9.39
Trimethopri der
Dihydrofolate reductase
I
8.53
Estradiol
Steroid receptor
L
9.69
Melatonin derivative
Melatonin receptor
L
9.68
Vesamicol derivative
Vesamicol receptor
L
9.20
2-Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I
12.72
4-Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I
10.55
Triprolidine
Histamine antagonist
L
9.98
Trimethoprim
8. Vorlesung WS 2004/05
dihydrofolate reductase
I Softwarewerkzeuge
8.44
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman,
PNAS 96, 9997 (1999)
23
experimentelle Protein-Liganden Affinitäten
# Atome Ligand
22
22
22
22
23
23
23
23
24
24
24
25
25
25
26
26
26
26
27
27
27
28
28
28
29
29
29
30
30
30
Target
Amitriptylinoxide
Antidepressant
Mazindol derivative
Dopamine transporter
Indolyl ethyl amines
5-Hydroxy tryptamine receptor
Isatin derivative
Rhino protease
Vesamicol der.
VR
Neuraminic acid der.
Sialidase
Melatonin der.
melamin receptor
Vesamicol der.
VR
Vesamicol der.
VR
Isatin der.
Rhino protease
Methadone
Narcotic
Melatonin der.
Melamin receptor
Corticosterone
Steroid receptor
Isatin der.
Rhino protease
Aldosterone
Steroid receptor
Haloperidol
Antipsychotic
Yohimbine
-2 adrenergic receptor
Isatin der.
Rhino protease
Vesamicol der.
VR
Dexetimide
Anticholinergic
Dehydrosinefungin mRNA Me trans.
Vesamicol der.
VR
Indoyl ethyl amines
5-Hydroxy tryptamine receptor
Prazosin
1-adrenergic agonist
Spiperone
Ketanserin
Serotonin antagonist
Dextromoramide
Analgesic
Peptide phosphonates
Carboxy peptidase
Domperidone
Dopamine antagonist
Etorphine
Narcotic
Typ
L
L
L
I
L
I
L
L
L
I
L
L
L
I
L
L
L
I
L
L
I
L
L
L
L
L
L
IM
L
L
-log K1
9.02
8.82
8.49
8.00
11.05
10.52
10.24
10.17
11.19
8.70
8.66
9.62
8.51
8.40
9.32
9.02
8.73
8.40
9.74
8.80
8.74
9.82
9.70
9.62
10.27
9.39
9.02
12.00
10.13
9.91
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
24
experimentelle Protein-Liganden Affinitäten
# Atome Ligand
31
31
31
31
32
32
32
33
34
34
34
34
35
35
35
36
36
36
37
37
37
38
38
38
39
39
40
40
Target
Carboxamide derivative 5-Hydroxy tryptamine receptor
Benzodiazepine derivative Integrin antagonist
Budesonide
Glucocorticoid receptor
Flavin mononucleotide
Cytochrome b reductase
Serotonin dimer
5-Hydroxy tryptamine receptor
Cyclic urea
HIV protease
Hoechst 33258
DNA
Methotrexate
Dihydrofolate reductase
Cyclic-aza isostere
HIV protease
Buprenorphine
narcotic
Pimozide
antipsychotic
Hoechst 33342
DNA
Peptide phosphonates Carboxypeptidase
Argatroban
Thrombin
Peptide derivative
Thermolysin
Cyclic-aza isostere
HIV protease
Benzodiazepines
Integrin
Cyclic urea
HIV protease
Peptide phosphonates Carboxypeptidase
Cyclic-aza isostere
HIV protease
Benzodiazepines
Integrin
Hydroxypyrone
HIV protease
Cyclic urea
HIV protease
Benzodiazepines
Integrin
Cyclic sulfone
HIV protease
Benzodiazepines
Integrin
Cyclic-aza isostere
HIV protease
Hydroxy pyrone
HIV protease
Typ
L
L
L
I
L
I
L
I
I
L
L
L
IM
I
I
I
L
I
IM
I
L
I
I
L
I
L
I
I
-log K1
9.54
8.60
8.54
8.10
9.34
8.85
7.41
9.70
10.21
9.83
9.39
7.44
11.52
7.72
7.29
10.15
8.55
8.37
11.40
9.31
8.80
10.22
9.92
8.40
9.52
7.05
11.30
11.16
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
25
experimentelle Protein-Liganden Affinitäten
# Atome Ligand
41
41
41
42
42
43
43
43
44
45
46
46
47
48
50
50
51
51
52
54
54
55
56
56
58
60
62
64
64
67
68
Target
Typ
Peptide phosphonates Carboxypeptidase
IM
Cyclic urea
HIV protease
I
Cyclic sulfone
HIV protease
I
Hydroxypyrone
HIV protease
I
Cyclic urea
HIV protease
I
Peptide phosphonates Carboxypeptidase
IM
Cyclic urea
HIV protease
I
Cyclic sulfone
HIV protease
I
Cyclic urea
HIV protease
I
Serotonin dimer
5-Hydroxy tryptamine receptor L
Cyclic urea
HIV protease
I
Cyclic urea
HIV protease
I
Zaragozic acid A
Squalene synthase
I
Cyclic urea
HIV protease
I
Cyclic urea
HIV protease
I
Hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D
I
Zaragozic acid B
Squalene synthase
I
Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I
Cyclic urea
HIV protease
I
Cyclic urea
HIV protease
I
Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I
Peptide-based
Thrombin receptor
L
Cyclic urea
HIV protease
I
Peptide-based
Thrombin receptor
L
Cyclic urea
HIV protease
I
Cyclic urea
HIV protease
I
Cyclic urea
HIV protease
I
Cyclic urea
HIV protease
I
Acetyl-CoA
Acetyl-CoA carboxylase
I
Peptide-based
Thrombin receptor
L
Stearyl-CoA
Acetyl-CoA carboxylase
I
log K1
12.00
9.48
9.22
11.10
9.85
13.96
9.48
9.00
10.41
10.05
10.75
9.51
10.11
10.35
10.20
7.85
10.54
8.05
9.37
10.57
7.23
7.40
10.37
7.92
10.96
10.80
10.62
10.07
8.00
8.10
8.89
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
26
Bindungsaffinität
 Metallionen oder Metalloenzyme
 kleine Anionen
 natürliche Liganden
Enzyminhibitoren
linearer Anstieg der freien
Bindungsenthalpie zu Beginn
bis ca. 15 Nicht-H-Atome
Gbinding = - 60 kJ mol-1 maximal.
Dann wird Sättigung beobachtet.
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
8. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge
27
Interpretation
Metallionen und Anionen binden
am stärksten.
-G pro Atom
Nanomolekulare Liganden können
bereits mit 7-10 Atomen erreicht werden.
Grössere Liganden
- besitzen üblicherweise nur eine
kleine Zahl polarer Atome pro Molekül
- die elektrostatischen Gruppen der
Bindungsstelle werden zunehmend
im Inneren begraben
- sind oft elektrisch neutral
- besitzen mehr entropische
Freiheitsgrade
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
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Wie kann man die Bindungsaffinität verbessern?
Es gibt 2 Strategien zum Design von stark bindenden Inhibitoren:
(a) kombinatorische Strategien
(b) rationale Strategien.
Beide Strategien erlauben es in der Praxis
effizient Lead-Moleküle mit geringer Affinität zu finden;
beide sind ineffizient und unzuverlässig, Liganden mit hoher Affinität zu finden (nM).
Anwendung der kombinierten Strategie CombiSMoG um Ligand für menschliche
Carbonic Anhydrase II (HCA) zu finden.
Resultat: Es wurde der stärkste bisher bekannte Ligand für HCA gefunden
( Kd = 30 pM).
Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)
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CombiSMoG
Analyse von 1000 Protein-Liganden Komplexe in PDB
 entwickle statistisches Potential zwischen Atomen des Liganden und des
Proteins
Kontakt ja, wenn Distanz < 5 Å
Vorteile gegenüber Molekülmechanik-Kraftfeldern:
(1) sehr schnell auszuwerten
(2) Potentialwerte beinhalten implizit die Entropie für Wasserdesolvatation,
entsprechen freien Bindungsenthalpien
(3) Potential ist typisch für Protein-Liganden-Wechselwirkungen
Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)
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CombiSMoG-Algorithmus
Dunkelgrünes Fragment wird in
Bindungstasche positioniert.
Methode kann 50.000 Strukturen
pro Tag generieren.
Weiteres Fragment aus einer Bibliothek
mit 100 organischen Substanzen (blau)
wird angefügt. Winkel wird in 60° Schritten
optimiert.
Fragment wird akzeptiert, wenn neuer
Gesamt-Score besser als der alte ist
bzw. entsprechend einer Monte-CarloZufallsentscheidung.
Die Suche nach weiteren Fragmenten
wird fortgesetzt bis Abbruchbedinung
erreicht wird (z.B. maximale Anzahl
an Nicht-H-Atomen erreicht, z.B. 30).
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kombinatorisches Liganden-Design
Strukturen der 5 Liganden mit
den besten Scores.
In Klammer die Bewertung nach
Optimierung mit dem CHARMMKraftfeld.
Die lila und hellblauen Moleküle
wurden synthetisiert und ihre
Kristallstruktur mit HCA
bestimmt.
Geeignetes Startfragment
mit KD = 120 nM um WW
mit Zink-Ion zu vermeiden.
(H2NO2S-Gruppe hat
Kontakt mit Zn2+).
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Spektakulärer Erfolg für theoretisches Liganden-Design
Vorhergesagte Orientierung
der R- und S-Stereoisomere
In gelb ist jeweils die
Kristallstruktur gezeigt.
Oben und unten in B sind
zwei verschiedene
Ansichten gezeigt.
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Korrelation von CombiSMoG Scores mit exp. Daten
Korrelation für Inhibitoren von HCA,
für die Kristallstrukturen vorliegen
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80 Liganden für
asp: Aspartic Protease
met: Metalloproteine
misc:
ser: Serin-Proteasen
sug: Zucker-bindende Proteine
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Welche Aminosäuren bestimmen Substratspezifität?
Phosphorylierung ist zentraler Bestandteil vieler Signaltransduktionsketten.
Proteinkinasen katalysieren Phosphoryltransfer.
- ca. 2% von eukaryotischen Genomen kodieren für Proteinkinasen.
- Im Mensch gibt es wohl 518 verschiedene Proteinkinasen.
Wie kann hohe Substratspezifität erreicht werden?
(a) Lokalisation in unterschiedlichen Zellkompartments,
(b) selektive Aktivierung durch Kofaktoren (z.B. CDK)
(c) Spezifität des aktiven Zentrums bzw. von Substratbindungspositionen für
Bindung bestimmter Liganden
Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)
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prokaryotisches Zweikomponentensystem
rot und cyan: 2 katalytische
Proteinkinase-Untereinheiten
Dimerisierung via Helices
PO4 –Gruppe wird zunächst von
ATP auf konserviertes His in
Dimerisierungs-Domäne übertragen
blau und magenta: Regulatorprotein.
Transfer der PO4 –Gruppe auf
Asp
Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)
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Spezifizität bestimmende Residuen
MSA : Gruppierung nach Proteinfamilien HK1, HK2, HK3, die jeweils die
gleichen Substrate besitzen.
Welche Residuen machen die Unterschiede aus?
Das konservierte Arg (lila) ist keine spezifitätbestimmende Residue,
die roten und blauen Spalten sind dagegen gute Kandidaten.
Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)
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Eukaryotische Proteinkinase
gelbes Substratpeptid
liegt zwischen den
beiden Domänen (rot
und blau) der Proteinkinase.
Phospho-Thr197
In (b) – (d) sind
die möglichen
spezifitätsbestimmenden
Residuen als
raumfüllende
Modelle gezeigt.
Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)
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Numerische Analyse
Definiere
Pi x, y 
I i   Pi x, y  log
Pi x P y 
x 1 y 1
20
i
x
y
Ii
Y
I
Position im Alignment
Aminosäuretyp
Nummer der Familie in
einem Alignment
Pi(x,y) ist Wahrscheinlichkeit,
Aminosäure vom Typ x an Position i in
der Familie y zu finden.
Pi(x) ist die gleiche W’kt, wobei der Typ der
Famile egal ist
P(y) ist der Anteil aller Proteine, der zu
Familie y gehört.
Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)
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Wie gelangen Liganden zum bzw. ins Protein?
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Elektrostatische Ausrichtung
Manche Proteine müssen
Liganden mit starker Nettoladung bzw. Dipolmoment
anziehen.
 Sie erzeugen (durch geladene
Aminosäuren auf ihrer Oberfläche) ein starkes anziehendes
elektrostatisches Potential.
Dann wird die kinetische
Zeitkonstante kon sehr schnell
und das Enzym arbeitet oft
am diffusions-limitierten
Optimum.
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Electrostatic Steering
TIM
Superoxid Dismutase
beta-Lactamase
el. Potential
Isopotentialflächen
Ähnlichkeit des
elektrostatischen
Potentials bei
verschiedenen
Mitgliedern der
Proteinfamilie
bei hinreichender Sequenzidentität ist das
erzeugte elektrostatische Potential oft sehr
ähnlich.
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Wade et al. PNAS 95, 5942 (1998)
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Transport zwischen 2 Bindungstaschen
Multiproteinkomplexe ermöglichen “substrate channeling” zwischen
mehreren aktiven Zentren. Ligand diffundiert auf Proteinoberfläche.
Dieser Transportmechanismus
ist besonders effizient, da
ungerichtete, freie Diffusion
vermieden wird.
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Wie gelangen Liganden ins Proteininnere
bzw. wieder heraus?
Die Bindung von Liganden im Proteininneren hat die Effekte,
- eine Umgebung mit unterschiedlicher (kleinerer) Dielektrizitätskonstante
zu schaffen, in der die Elektrostatik eine grössere Rolle spielt,
- den Liganden in ein polarisiertes Umfeld zu bringen, das den Übergangszustand einer chemischen Reaktion stabilisiert (A. Warshel)
- die Reaktion von eventuell störenden Wassermolekülen zu separieren, die zu
chemischen Nebenreaktionen führen könnten.
Deshalb erfordern manche Proteine (Tryptophan Synthase,
Acetylcholinesterase, Cytochrom P450), dass die Liganden durch transient
offene Kanäle ins Proteininnere transportiert werden.
Zur Betrachtung der Ligandenaffinität gehört demnach auch die Analyse der
Pfade ins bzw. aus dem Protein heraus.
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AchE: Konformationelle Kontrolle des Eintrittskanals
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AchE: Konformationelle Kontrolle des Eintrittskanals
dynamische Kontrolle der
Grösse des Eintrittskanals
in Acetylcholinesterase
durch zwei aromatische
Residuen (lila)
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Cytochrom P450: mögliche Austrittspfade der Liganden
Cytochrom P450cam
Substrat Kampher:
kompakt, hydrophob
BM-3
negativ geladene
Fettsäuren
eryF
6-deoxyerythronolide B
Moleküldynamiksimulationen wurden von gebundenem Zustand gestartet,
zufällige „Kicks“ wirken auf den Liganden, damit der Austritt aus dem Protein
beschleunigt wird.
Winn et al. PNAS 99, 5361 (2002)
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Cytochrom P450: mögliche Austrittspfade der Liganden
Kristallstrukturen
Konformation nach Ligandenaustritt (Simulation)
Ligandenaustritt erfordert
kleine Änderungen des
Rückgrats, Rotation von
aromatischen Seitenketten
grössere transiente
Änderungen des
Proteinrückgrats
dynamische Kontrolle
der Kanalöffnung
durch Arg185
 Mechanismus der Protein-Öffnung ist an physikochemische Eigenschaften des
jeweiligen Substrats angepasst.
Winn et al. PNAS 99, 5361 (2002)
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Zusammenfassung
Die Protein:Liganden Wechselwirkung ist heutzutage relativ gut verstanden.
Wir haben Tools kennengelernt, mit denen man
- die Position des aktiven Zentrums lokalisieren kann
- Bindungsaffinitäten abschätzen bzw. verbessern kann
- die Assoziation bzw. Dissoziation des Liganden simulieren kann.
Für die Zukunft bleibt:
(1) korrelierte Analysen aus der umgekehrten Richtung: finde einen Liganden,
der selektiv an ein bestimmtes Protein bindet, jedoch nicht an andere
(2) Automatisierung + Verknüpfung der obigen Schritte
(3) Einbeziehung zusätzlicher Gesichtspunkte (ADMET)
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