Na + - Universität des Saarlandes
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Seminar 1 Nachweis des Proteins NHE-7 in roten Blutzellen Claudia Hahn 25.04.2012 1 Inhalt Na+/K+-Transport Leak-Transport NHE Familie Versuchsabläufe Referenzen 2 Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ Na+ K+ Na+ Na+ Na+ http://3imgsrv.fotofinder.com/archive/thumbnail/EE/EE375CF1C176A17E.jpg 3 Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ K+ K+ H+ H+ K+ K+ Na+ K+ H+ H+ K+ K+ K+ Na+ H+ Na+ Na+ NHE Familie Na+ http://3imgsrv.fotofinder.com/archive/thumbnail/EE/EE375CF1C176A17E.jpg 4 Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ K+ K+ Na+ Na+-K+-Transport K+ K+ Na+ Na+ K+ Na+ H+ K+ Na+ Na+ K+ H+ Na+ H+ NHE Familie Na+ http://3imgsrv.fotofinder.com/archive/thumbnail/EE/EE375CF1C176A17E.jpg 5 Leak-Transport Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+, K+ K+ K+ K+ Na+ K+ K+ Na+ K+ Na+-K+-Transport K+ K+ K+ K+ Na+ K+ Na+ K+ K+ Na+ NHE Familie Na+ K+ Na+ Na+ http://3imgsrv.fotofinder.com/archive/thumbnail/EE/EE375CF1C176A17E.jpg 6 Na+/K+-Transport Natrium-Kalium-Pumpe 3 Natrium raus 2 Kalium rein unter ATP Verbrauch (gegen Konzentrationsgefälle) http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Scheme_sodium-potassium_pump-de.svg&filetimestamp=20100611205409 7 Leak-Transport Definition: Unidirektionaler K+ und Na+ Einfluss und Ausfluss während alle bekannten Transportwege (Pumpen, Kanäle, Carrier) inhibiert sind durch Ouabain + Bumetanide + EGTA Na+/K+ Pumpe, der Na+/K+/2Cl- Kotransport und der Ca2+-aktivierte K+ Kanal sind inhibiert Der "leak" Na+ Fluss ist komplizierter als der "leak" K+ Fluss Größere Anzahl von spezifischen Transportsystemen Der "leak" K+ und Na+ Transport kann nicht über Elektrodiffusion erklärt werden 8 NHE Transmembrane Antiporter (Na+/H+ Austauscher) Regulieren den pH-Wert und die Ionenhomöostase Wird durch verschiedene Signalwege reguliert Hoch konserviert bei den Säugetieren Neun Isoformen NHE1 bis NHE9 9 Zwölf transmembrane Segmentantiporter Im neutralen pH sind die NHEs inaktiv; Aktivierung erfolgt bei Ansäuerung Struktur des Na+/H+ Austauschers Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007 10 NHE-Familie NHE 1 in nahezu allen Geweben, Zelltypen und Spezies Konstanthaltung von pH und Zellvolumen Reguliert die Proliferation Aktivierung des Na+/H--Austauschs durch intrazelluläre Säurebelastung NHE 2 vor allem im Gastrointestinaltrakt (Magen und Darm) ähnliche Aufgaben wie NHE1 11 NHE 3 Beim Menschen in Niere und Dünndarm, aber auch in vielen anderen Geweben zu finden Volumenregulation NHE 4 beim Kaninchen im Magen exprimiert, mittelstark im Dünndarm und Kolon und schwach in Niere, Gehirn, Herz, Uterus, Skelettmuskel und Leber Könnte an der Volumenregulation beteiligt sein 12 NHE 5 im Gehirn hoch exprimiert NHE 6 nur in den Mitochondrien, Herz, Gehirn, und Skelettmuskel pH-, Volumen- und Elektrolytregulation 13 NHE-7 kommt im Golgi-Netzwerk, Endosomen und Plasmamembran vor reguliert die Ionenhomöostase Durch intrazelluläre Akkumulation von Ca-Ionen und die Bindung von Calmodulin (CaM) aktiviert (Bindung an IL2) 14 Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007 15 Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007 16 NHE-8 Am proximalen Tubulus der Niere entdeckt im ER (endoplasmatisches Retikulum) und bis zum trans Golgi nachweisbar Elektrolyttransport NHE9 Im späten Endosom 17 Versuchsablauf Gewinnung von Blut Isolierung der Membranproteine Trennung der Proteine nach Größe mittels SDS-Page Anfärben über Coomassie-blau Western Blot Detektion mit Antikörpern 18 http://o.elobot.de/s/bot6/01307.jpg 19 http://o.elobot.de/s/bot6/01307.jpg 20 http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/gifs/sds_page1.gif 21 Proteine roter Blutkörperchen nach der SDS-Gelektrophorese und Coomassie-Färbung Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes 22 http://www.medizin.uni-greifswald.de/physiol/images/blot.jpg 23 http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/WesternBlotFinal.gif 24 Western Blot zum Nachweis des NHE 7 mit Antikörpern Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes 25 Ausblick Weitere Nachweise mittels verschiedener Methoden: MALDI-ToF Kapillarelektrophorese Flüssigchromatographie Polymerase-Kettenreaktion 26 Referenzen Attaphitaya S, Park K and Melvin JE. 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