4. Insertion eines Teiles der T-DNA
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CH2 CH3 CH3 Ethylmethansulfonat (EMS) + recessive mutants by ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenesis Punktmutation EMS G C Et-G C wildtype replication Et-G T G replication Et-G T A C wildtype T mutation Fixed mutation can be isolated by gene mapping 1. Chemische Mutagenese Zur chemischen Mutagenese werden oft Samen mit EMS behandelt. Das Ti-Plasmid und die Integration in die chromosomale DNA Das Ti-Plasmid und die Integration in die chromosomale DNA Schnelle Zellteilung Opinsynthese Auxin Ungewöhnliche Aminosäuren Cytokinin Phytohormone 1. Bindung an Verwundungsstelle 2. Verwendung der Phenole zur Erkennung durch Sensorproteine VIR A und VIR G 3. Aktivierung der Gene der VIR-Region: VIR B, C, D und E 4. Diese VIR-Proteine stellen eine freie Kopie der T-DNA her und 5. Verpacken die T-DNA zu einem T-Transportkomplex und leiten In Zelle 6. Signalsequenzen in VIR E2 und VIR D2 dirigieren durch nukleären Porenkomplex (NPC) in den Zellkern 7. T-DNA wird in Chromosom integriert und der Komplementärstrang wird durch ein Reparatursystem synthetisiert. 4. Mutation durch Transposons 4. Mutation durch Transposons Nachweis der Mutation Siehe PCR A Die Erzeugung und Analyse von Mutanten ist ein wichtiges Werkzeug der Entwicklungsphysiologie 1. Chemische Punktmutation 2. Energiereiche Strahlung B 3. Das Agrobakterium-System 4. Insertion von Transposons Identifizierung mutierter Gene: Was kann man über die Wahrscheinlichkeit von crossing over sagen? 2. Ansatz: Molekulare Marker Respriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus Erfolgreicher Gentransfer durch Agarobacterium tumefaciens Nutzpflanzen Magnolisopsida ? Rosopsida („Eudicots“) Tabak Tomate Kartoffel Raps Blumenkohl Salat Sonnenblume Apfel Rübe Liliospsida („Monocots“ Asparagus Yamwurzel Da gibt es noch ein Problem ! WT ca. 200 kb! Zwei-Vektor-Verfahren Da gibt es noch ein Problem ! Cointegration Agrobakterium Transformation Selektion von der transformierten Zellen Transgene Pflanze Komplikationen beim Einsatz des Agrobacterium-Systems 1. Insertion von T-DNA in wesentliche Gene oder in Kontrollelemente 2. Insertion der T-DNA an verschiedenen Loci des Genoms 3. Insertion von Concatameren in einen Locus 4. Insertion eines Teiles der T-DNA 5. Insertion des Plasmidgerüstes des einfachen oder binären Vektors 6. Nicht erfolgreiche Insertion von T-DNA 7. Insertion zufälliger DNA-Fragmente von E. coli oder Agrobacterium 8. Aktivierung von Transposons 1. Insertion von T-DNA in wesentliche Gene oder in Kontrollelemente - T-DNA von Agrobacterium insertiert bevorzugt an Stellen transkriptional hoher Aktivität. Gilt auch für „nackte“ DNA. - Ursache: solche Stellen sind partiell denaturiert (Strangaufspaltung) für Transkription. Offensichtlich lassen solche Stellen Rekombination leichter zu. - Solche Stellen sind meist Gene (oder sehr nahe daran), so dass mit hoher Wahrscheinlichkeit Insertion in Gene erfolgt – das damit „knocked out“ ist. - Nahezu alle transformierten Pflanzen enthalten auch ein oder sogar mehrere ausgeschaltete Gene. Wegen Redundanz muss das nicht unbedingt einen Einfluss auf den Phänotyp habe. - Mit Agrobacterium werden gezielt T-DNA-Mutanten erzeugt. 2. Insertion der T-DNA an verschiedenen Loci des Genoms - Mehrfache Insertion ist nicht selten, aber nicht vorhersehbar. Die Häufigkeit hängt vom Protokoll ab, sogar von AgrobacteriumStamm und stark von der Pflanze. - Wenn einmal der Widerstand gegen eine Insertion in das Pflanzengenom überwunden ist, dann gibt es meist auch multiple Insertionen. Eine Einzelinsertion ist möglich, muss aber nachgewiesen werden. - Concatamere T-DNA-Insertion nennt man, wenn Kopf-Schwanz-Insertionen an derselben Stelle erfolgen. (3. Insertion von Concatameren in einen Locus) - Dass „nackte“ DNA leichter mehrfach insertiert werden als mittels Agrobacterium ist ein widerlegtes Gerücht. Beide Komplikationen sind häufig. - Die Anzahl der Insertionen sollte ermittelt werden. 4. Insertion eines Teiles der T-DNA - Der Nachweis von T-DNA-Stücken kann schwieriger sein als die Insertion der vollständigen Sequenz. Die Wirkung beim „knock out“ kann aber dieselbe sein. - RNAi (Gene silencing) tritt oft auf, wenn multiple identische Gene zur selben Zeit transkribiert werden. Dazu sind nicht vollständige Sequenzen erforderlich, Teilsequenzen können sogar effektiver sein – ein ernstes Problem. Der Mechanismus ist nicht genau bekannt: Insertion kleiner Teilstücke oder Ablesefehler bei der Transkription. - Das historisch erste Agrobacterium-Plasmid pBIN19 hatte den Selektionsmarker (gegen Kanamycin) an der rechten T-DNA-Grenze. Da in Agrobacterium der Transfer von der rechten zur linken Grenze erfolgt (der Einbau allerdings von links nach rechts) konnte der Selektionsmarker ohne Gen von Interesse transferiert werden. Viele moderne Vektoren sind von pBIN19 abgeleitet. 5. Insertion des Plasmidgerüstes des einfachen oder binären Vektors - Linke und rechte Grenzen sind nahezu Palindrome, d.h. Spiegelbilder. - Die linke Grenze wird daher mitunter als rechte Grenze missverstanden. Folglich wird ein Teil oder das ganze Plasmidskelett transferiert. Das geschieht auch mit binären Vektoren. - Nach Initiation des Gentransfers kopieren die VIR-Proteine die T-DNA von der linken zur rechten Grenze. - Nur wenn danach speziell gesucht wird kann ein solcher Fehler auch gefunden werden. Effekte auf den Phänotyp können auf „knock out“ beruhen und als Einführung eines speziellen Gens fehlinterpretiert werden. 6. Nicht erfolgreiche Insertion von T-DNA - VIRD2-Proteine von Agrobacterium schützen die Enden der T-DNA (Verhinderung der Degradation in Wirtszelle) und unterstützen die Integration durch (1.) Initiation der DNA-Öffnung und (2.) der Rekombination. - Die kovalente Bindung erfolgt jedoch nicht immer an der Stelle der Öffnung. Der überhängende Teil der Wirts-DNA wird eliminiert. Das kann auf beiden Seiten der Insertion erfolgen. - Da die DNA-Integration initiiert werden kann ohne erfolgreich sein zu müssen kommt es so zu einer DNA-Deletion, die nicht durch eingefügte DNA markiert ist. - Das Ausmaß dieses Effektes lässt sich nur schwer abschätzen, ist aber an Beispielen nachgewiesen worden. - E. coli-DNA ist in transformierten Genomen nachgewiesen worden, die mit reiner DNA transformiert wurden – wahrscheinlich einfach von verunreinigenden Plasmidextrakten. (7. Insertion zufälliger DNA-Fragmente von E. coli oder Agrobacterium) 8. Aktivierung von Transposons - Genome höherer Organismen sind von Transposon-ähnlichen Sequenzen dominiert und kann mehr als 10 % der Gesamtsequenz ausmachen. Unterschiede im Ausmaß können für unterschiedliche Genomgrößen mitverantwortlich sein. - Es gibt Mechanismen, die diese Transposons inaktiv halten. - Insbesondere unter Stress (dazu gehört Transformation oder Selektionsdruck, manchmal auch in vitro-Kultivierung) sind diese Inaktivierungsmechanismen durchbrochen. - In Tabak ist gezeigt worden, dass Tto1 bei einem Transformationsexperiment 30 – 100 Bewegungen vornehmen kann. In einigen Fällen nimmt man durchaus 1000 Bewegungen von Transposons bei einem Transformationsereignis an. 1. PEG-vermittelte Aufnahme von DNA 1. PEG-vermittelte Aufnahme von DNA Effektivität der Transformation liegt bei 1 : 100.000 1. PEG-vermittelte Aufnahme von DNA (Protoplastenfusion) 2. Electroporation (Aufnahme von DNA oder Protoplastenfusion) 4. Biolistic Vermutlich zweitwichtigste Methode nach Agrobakterium. Biolistic chloroplast transformation HELIUM HELIUM Rupture disk Flying disk DNA-coated gold particles Stopping screen Evacuated chamber Sterile leaf Plant regeneration medium 4. Biolistic Segregation of chloroplast genomes (Plastom) accelerated gold particle coated with transforming DNA ~50-100 plastids / cell ~10-20 nucleoids / plastid ~5-10 pt genomes / nucleoid ~10,000 pt genomes /cell Integration of foreign genes into the chloroplast genome B A pt DNA pt DNA gene A gene B intergenic spacer gene B gene X aadA gene C gene D gene C transformation vector gene A gene B gene B gene X aadA gene C gene D gene C transformation vector
