Seminar Biotechnologie 1 Lipid rafts und ihre Funktion in
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Lipid rafts und ihre Funktion in biologischen Membranen Seminar Biotechnologie 1 Lisa Marie Finkler SS 2012 Betreuer: Prof. Dr. I. Bernhardt 1 Gliederung Biologische Membranen Lipid Rafts Aufbau Membranlipide Membranproteine Funktionen einer biologischen Membran Fluid Mosaic Modell Funktionen von Lipid Rafts Ergebnisdarstellung „Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts“ “Ca++-dependent viscle release from erythrocytes involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin” 2 Biologische Membranen Grenze zwischen 2 Kompartimenten Intrazellulär (innerhalb einer Zelle) Interzellulär (Inneren einer Zelle zu Zellaußenraum) Selektiv permeabel Bestehen hauptsächlich aus: Lipiden Anteil ist je nach Membrantyp Proteinen unterschiedlich 3 Aufbau einer biologischen Membran [1] 4 Aufbau einer biologischen Membran Membranlipide bilden die Grundstruktur (Doppelschicht) Amphiphatisch Hydrophiler Kopf Lipophiler Kohlenwasserstoffrest Permeabilitätsschranke Phospholipide Sphingolipide Cholesterin Mizelle Lipiddoppelschicht Liposom [2] 5 Aufbau einer biologischen Membran Phospholipide Phosphatidylcholin (siehe Abbildung) Phosphatidylserin Phosphatidylethanolamin Phosphatidylinositol häufigste Membranlipide [3] 6 Aufbau einer biologischen Membran Sphingolipide „Signalübertragung, Interaktion zwischen einzelnen Zellen, Zellwachstum, Zelldifferenzierung, Zelltod“ [6] [4] 7 Aufbau einer biologischen Membran Cholesterin Steroid-Grundgerüst Hydrophiler Anteil (OH-Gruppe) Membranoberfläche Hydrophober Rest Innerhalb der Membran Gehalt an Cholesterin beeinflusst die Fluidität der Membran [5] 8 Aufbau einer biologischen Membran Membranproteine Integrale Membranproteine (1-3) Periphere Membranproteine (4) Lipidverankerte Proteine (5) [6] 9 Aufbau einer biologischen Membran Integrale Membranproteine Amphiphatisch Hydrophober Anteil innerhalb der Membran Verankerung durch Wechselwirkung mit Fettsäureketten Hydrophiler Anteil außerhalb der Membran Wechselwirkungen mit der Umgebung Periphere Membranproteine Nichtkovalente Bindungen an Membran bzw. Proteine Lipidverankerte Proteine Kovalente Bindung an ein Lipid (z.B.: GPI-Verankerung) 10 Funktionen einer biologischen Membran Kompartimierung Selektive Permeabilität Transportvorgänge Signalaufnahme, Weiterleitung, Abgabe Ort der Energie- sowie Stoffumwandlung (Träger von Enzymen) 11 Fluid Mosaic Modell 1972 S.J. Singer und G.L. Nicolson [7] Modell zum Aufbau der biologischen Membran Flüssig-kristalline Lipiddoppelschicht (Hydrophile „Köpfe“ der Membranlipide außen, Hydrophobe „Fettsäureschwänze“ innen) Membranproteine inselartig eingelagert, lateral frei beweglich dynamische Struktur 12 Fluid Mosaic Modell Membranfluidität Lipidzusammensetzung Cholesterinanteil (hoher Anteil erhöhte Viskosität) Temperatur [8] Stabilität durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Fettsäureketten Wärmezufuhr: Übergang von kristallinem zu flüssigkristallinem Zustand 13 „Lipid Rafts“- Lipidflöße [9] 14 „Lipid Rafts“- Lipidflöße Unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung von anderen Membranbereichen Sphingolipide Cholesterin Glycolipide GPI-verankerte Proteine Stärker geordnet und dichter gepackt Caveolae Ausbuchtungen der Membran Caveolin als wichtigste Strukturelement hochdynamische Strukturen Zusammenlagerung Auflösung 15 Funktionen von Lipid Rafts [8] 16 Funktionen von Lipid Rafts [9] 17 Ergebnisdarstellung „Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts“ von Ulrich Salzer, Rainer Prohaska; blood (2001 97:1141-1143) Erkenntnisse über die Zusammensetzung von Lipid Rafts Verwendete Methoden Isolation der Lipid Rafts aus Erythrozyten durch Extraktion Gelektrophorese, Silberfärbung Membranmarker: Acetylcholinesterase (AChE) Western Blot 18 Ergebnisdarstellung A: diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation (Spur 1: Pellet, Spur 2: hohe Dichte, Spur 3: mittlere Dichte, Spur 4: Lipid Rafts) B: Extraktion in alkalische Lösung (Na2CO3) (Spur T: Suspension vor Extraktion, Spur S: Überstand, Spur P: Pellet) Stomatin, Flotillin-1 und -2 Integrale lipid raft assoziierte Membranproteine Protein 4.1 und 4.2, Spectrin, Actin Periphere Membranproteine Methode A Methode B 19 Ergebnisdarstellung Immunblot der isolierten Lipid Rafts Oligomere Komplexbildung von Flotillin-1 und -2 sowie Stomatin Spur 1 und 2: Erythrozytenmembran eines OHSt krankem Patienten; Spur N: gesunde Person Stomatin ist nicht in Spur 1 und 2 nachweisbar (OHSt) OHSt: Overhydrated Hereditary Stomatocytosis 20 Ergebnisdarstellung “Ca++-dependent vesicle release from erythrocytes involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin” von Ulrich Salzer, Peter Hinterdorfer, Ursula Hunger, Cordula Borken, Rainer Prohaska; blood (2002 99: 2569-2577) Erkenntnisse über die Bestandteile von Lipid Rafts sowie über die calciumabhängige Vesikulation Verwendete Methoden Rasterkraftmikroskopie Calciumabhängie Vesikulation Trennung der Mikro- und Nanovesikel durch Zentrifugation Gelektrophorese, Silberfärbung Western Blot 21 Ergebnisdarstellung Methode A und B unterscheiden sich Zentrifugationsmethoden A) B) Spur 1: Erythrozytenmembran Spur 2: Mikrovesikel Spur 3: Nanovesikel Spur 1: Erythrozytenmembran Spur 2 und 3: Mikrovesikel Spur 4: Nanovesikel Stomatin in Mikrovesikel Synexin und Sorcin in Nanovesikel Carboanhydrase ( CA) und Hämoglobin (Hb) in beiden nachweisbar 22 Ergebnisdarstellung A sowie B: Auswirkung von Ca2+ bzw. EDTA-Zugabe S: Überstand; P: Pellet nach Zentrifugation aq: aquatisch; dt: detergent nach Phasenseperation Synexin und Sorcin nach Ca2+ Zugabe im Pellet, nach EDTA Zugabe im Überstand Stomatin: keine Auswirkungen Stomatin nach Phasenseperation durch Triton X-114 nur noch in der detergenten Phase 23 Ergebnisdarstellung Periphere Membranproteine Integrales Membranprotein, Cytoskelettanker beteiligt am Kationentransport (Na+/K+) Abwesenheit: Overhydrated Hereditary Stomatocytosis Durch hydrophobe Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrückenbindungen an Membran gebunden Ablösen durch Veränderung des pH-Wertes, des Puffers, der Salzkonzentration (EDTA) Synexin Peripheres, calciumbindendes Protein Exozytoseprozesse, Membranfusion Integrale Membranproteine Stomatin Ablösen durch Detergenz (Triton X-114) Sorcin Peripheres, calciumbindendes Membranprotein Signaltransduktion 24 Abbildungsverzeichnis [1] http://www.biokurs.de/skripten/bilder/membr3.jpg [2] Biochemie: Eine Einführung mit 40 Lerneinheiten von Philipp Christen,Rolf Jaussi, Springer (2005) [3] www.chemgapedia.de [4] http://www.bioc.uzh.ch/blexon/s:sphingomyelin [5] http://www.guidobauersachs.de/oc/lipide.html [6] Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan Koolman,Georg Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. Auflage (2005) [7] http://www.rauhfasler.de/wp-content/uploads/2010/04/Fluid-mosaic-diagram-Singerand-Nicholson-resized-150x150.jpg [8] http://www.uni-marburg.de/fb20/cyto/lehre/Jacob/membranen.pdf [9] Taschenlehrbuch Biochemie von Gerd P. Püschel,Hartmut Kühn,Thomas Kietzmann,Wolfgang Höhne, Thieme (2011) [10]http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.html [11]http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.html 25 Quellen [1] Biochemie der Ernährungvon Gertrud Rehner,Hannelore Daniel, Spektrum, 3. Auflage (2010) [2] Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan Koolman,Georg Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. Auflage (2005) [3]http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/transport/membranentrans port.vlu/Page/vsc/de/ch/8/bc/transport/membran_aufbau_funktion.vscml.html [4] http://de.wikipedia.org/wiki/Lipide#Membranbildende_Lipide [5] www.lipidsignalling.de/lipidimfocus/sphingolipide.php [6] Biochemie von H. Robert Horton,Laurence A. Moran,K. Gray Scrimgeour,J. David Rawn,Marc D. Perry, Pearson Studium, 4. Auflage (2008) [7] Biochemie Zellbiologie von Katharina Munk, Thieme (2008) [8] Kurzlehrbuch Histologie von Norbert Ulfig, 3. Auflage, Thieme (2003) [9] Molekulare Zellbiologie von Gerald Karp,Sebastian Vogel,Susanne Kuhlmann-Krieg, Springer, 4. Auflage (2005) [10]www.deutscher-apotheker-verlag.de/.../tx.../9783804721074_p.pdf [11]http://www.wissenschaft-online.de/abo/lexikon/biok/4304 [12]Taschenlehrbuch Biochemie von Gerd P. Püschel,Hartmut Kühn,Thomas Kietzmann,Wolfgang Höhne, Thieme (2011) [13]http://cshperspectives.cshlp.org/content/3/10/a004697.full [14]http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.html [15]http://www.fwf.ac.at/de/abstracts/abstract.asp?L=D&PROJ=P15486 [16]http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.html [17]http://www.fwf.ac.at/de/finals/final.asp?L=D&PROJ=P12907 26 [18]http://www.uniprot.org/uniprot/P20073
