Genotypisierung
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Nicht-invasive pränatale RHD-Bestimmung RHD-Genotypisierung zellfreier fetaler DNA 32. Informationsgespräch der Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Gliederung Nicht-invasive fetale RHD-Genotypisierung 1 Hintergrund Prävention der Anti-D Bildung in der Schwangerschaft, Management von Antikörperträgerinnen in der Schwangerschaft 2 Standard-Prozedere und fetale Genotypisierung im Vergleich 3 Grundlagen der nicht-invasiven fetalen Gen-Diagnostik 4 Zuverlässigkeit der Methode: Sensitivität und Spezifität Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Nutzen fetaler RHD-Bestimmung Wann interessiert der kindliche RhD-Faktor? 1 Bei RhD-negativen Schwangeren: Prävention der Anti-D-Immunisierung Bei Antikörperträgerinnen: Nachweis des fetalen RHD-Genotyps Kein Immunisierungsrisiko bei RHD-negativen Feten HDFN-Risiko nur bei RHD-positiven Feten Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Prävention der Anti-D-Immunisierung Standards bei Schwangerschaften RhD-negativer Frauen1 1 - 28. SSW: Anti-D Immunglobulin - Bei RhD-positiven Neugeborenen: Anti-D Immunglobulin < 72 h p. partum 1 KAV-Richtlinien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Anti-D-immunisierte Schwangere Voraussage für die Entwicklung einer HDFN 1 nicht invasive Diagnostik (Mutter): Anti-D-Titerbestimmung Ultraschall fetales RHD-Screening (RHD-NIPD) Invasive fetale Diagnostik: Amniozentese Choriozentese Cordozentese Diagnostik beim Kindesvater (?) RhD und RHD-Zygotiebestimmung (PCR) Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Pränatale Ultraschall – Diagnostik Nachweis von Ödembildung 1 Prof. J. Deutinger Universitätsklinik für Frauenheilkunde Medizinische Universität Wien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Pränatale Ultraschall – Diagnostik Nachweis von Ödembildung 1 Prof. J. Deutinger Universitätsklinik für Frauenheilkunde Medizinische Universität Wien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Hydrops fetalis, 11. – 14. SSW 1 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Doppler Ultraschalldiagnostik A. cerebri media flow (MCA-PSV) Flow velocity waveform in the fetal middle cerebral artery in a severely anemic fetus at 22 weeks (left) and in a normal fetus (right). In fetal anemia, blood velocity is increased Bei einer schweren fetalen Anämie (Hb <6g/dl) ist die Flussgeschwindigkeit in der A. cerebri media signifikant erhöht. Scheier M, Prediction of severe fetal anemia in red blood cell alloimmunization after previous intrauterine transfusions. Am J Obstet Gynecol. 2006 Dec;195(6):1550-6. Epub 2006 Jun 21 Collins CY, Evaluating suspected fetal anemia with Doppler ultrasound. J Reprod Med. 2005 Jun;50(6):379-82 Anti-D-immunisierte Schwangere Voraussage für die Entwicklung einer HDFN 1 Nicht-invasive Diagnostik (Mutter): Anti-D-Titerbestimmung Ultraschall fetales RHD-Screening (RHD-NIPD) Invasive fetale Diagnostik: Amniozentese Choriozentese Cordozentese Diagnostik beim Kindesvater (?) RhD und ggf. RHD-Zygotiebestimmung (PCR) Nutzen fetaler RHD-Bestimmung (Wann) ist die Genotypisierung sinnvoll? 2 Prävention der Anti-D-Immunisierung bei Schwangerschaft RhD-negativer Frauen Bei Antikörperträgerinnen: Nachweis des fetalen RHD-Genotyps Vermeidung von: passiver Immunprophylaxe (humanes Plasmapräparat) Frühzeitige Klarheit Unabhängigkeit von der Verfügbarkeit von humanem Anti-D Kosteneffizienz? Vermeidung von: invasiver Diagnostik und assoziierter Risiken Entwicklung der RHD-NIPD Internationale Arbeitsgruppen SAFE NoE - Gruppe 2 Special Non-Invasive Advances in Fetal and Neonatal Evaluation Network of Excellence Sixth EC Framework Program Gemeinsame Protokolle Multizentrische Evaluierung Standardisierung der Prozesse Grundlage der Genotypisierung RHD- und RHCE-Gen 3 Daniels G. Human Blood Groups RHD negativ RHD positiv (heterozygot) RHD positiv (homozygot) Fetale Genotypisierung aus maternalem Plasma Lo et al. weisen DNA männlicher Feten in maternalem Plasma nach LO, Y.M.D. et al. 1997. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 350: 485–487. 3 FINDINGS: Fetus-derived Y sequences were detected in 24 (80%) of the 30 maternal plasma samples, [...] None of the 13 women bearing female fetuses, and none of the ten non-pregnant control women, had positive results for plasma, serum or nucleated blood cells. INTERPRETATION: Our finding of circulating fetal DNA in maternal plasma may have implications for non-invasive prenatal diagnosis, and for improving our understanding of the fetomaternal relationship. Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Zellfreie fetale DNA Synzytiothrophoblast als Ursprung der fetalen DNA 3 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Kumpel et al. Transfusion 2008 Anteil fetaler DNA an der zellfreien mütterlichen DNA Die cffDNA-Menge ist abhängig vom Gestationsalter des Feten Die DNA-Menge liegt zum Zeitpunkt der Untersuchung teilweise nahe dem stochastischen Bereich der rqPCR. 3 DNA-Qualität: die cffDNA ist stark fragmentiert Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Konzentration der cffDNA Konzentrationsunterschiede bei gleichem Gestationsalter 3 C. Ellen van der Schoot Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Studien zur RHD-NIPD Review 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Studien zur RHD NIPD Ergebnisse von Sanquin, NL 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Kontrolle für die Amplifikation fetaler DNA Beispiele Y-chromosomale Marker Lo et al. Chin and Lo Rijnders et al. Avent and Chitty 1998 2003 2004 2006 SYR SYR SYR SYR 2002 2002 2003 2005 HLA-DQ RHCE, C, E, c insertion/deletion insertion/deletion 2006 RAASF1A Genetische Polymorphismen Lee et al. Legler et al. Van der Schoot et al. Brojer et al. Epigenetik 4 Chan et al. Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Kontrolle für die Amplifikation fetaler DNA Sensitivität der Methoden Zuverlässigkeit der Methode ist abhängig von: - geeignete Amplifikationskontrollen für fetale DNA - geeignetes Entscheidungsschema 4 Das Verfahren muss ausreichend sensitiv sein, jeden RHD-positiven Feten richtig zu typisieren. Falls zu wenig fetale DNA vorhanden ist, muss das erkannt werden. Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Amplifikation fetaler DNA Spezifität der Methoden Falsch positive Ergebnisse sind nicht kritisch: Bei vermeintlich RHD-positiven Feten würde der Schwangeren eine nicht indizierte Anti-D-Prophylaxe verabreicht werden. 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Fetale DNA-Methylierung Universaler fetaler DNA-Marker für nicht-invasive Diagnostik K.C. Allen Chan et al. Hypermethylated RASSF1A in Maternal Plasma: A Universal Fetal DNA Marker that Improves the Reliability of Noninvasive Prenatal Diagnosis Clinical Chemistry 2006;52(12):2211-2218 4 BstU I methylation-sensitive restriction enzyme CG’CG, GC’GC Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland DNA-Methylierung in vivo-Bedeutung der DNA-Methylierung Eukaryonten Epigenetik - Genexpression Hypermethylierung führt zur Suppression der GenExp. Prokaryonten Schutz vor DNA anderer Organismen Methylierung blockiert Enzym-Schnittstelle eigener DNA - fremde (Bakteriophagen-) DNA wird zerstört 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland DNA-Methylierung in vitro-Bedeutung für die fetale Diagnostik Enzymatische Verdauung der mütterlichen Plasma-DNA fetale Methylierung blockiert die Restriktionsschnittstelle die methylierte fetale Gensequenz bleibt erhalten die maternale Sequenz wird zerstört Die Menge der fetalen DNA kann gemessen werden 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Amplifikationskontrolle für fetale DNA methyliertes fetales RAASF1A Abb.1: Komplette Verdauung der maternalen DNA Abb.2: Inkomplette Verdauung der maternalen DNA Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland RHD-NIPD SAFE-Protokoll Abb.3: RHD negativer männlicher Fetus Abb.4: RHD positiver männlicher Fetus Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland RHD-NIPD SAFE-Protokoll Abb.5: RHD positiver weiblicher Fetus Abb.4: RHD positiver männlicher Fetus Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Amplifikationskontrolle für fetale DNA methyliertes fetales RAASF1A Abb.1: Komplette Verdauung der maternalen DNA Abb.2: Inkomplette Verdauung der maternalen DNA Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Entscheidungsbaum bei Verwendung von RASSF1A und ACTB für das Pränatale RHD-Screening nach Chan et al. Clinical Chemistry 2006;52(12):2211-2218 4 Zusammenfassung Nicht-ivasive pränatale RHD-Diagnostik bei Antikörperträgerinnen Frühzeitiger Ausschluss RHD-negativer Feten Vermeidung invasiver Diagnostik Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Zusammenfassung NIPD: Kriterium zur Indikationsstellung der Anti-D-Prophylaxe Hohe Sicherheit gegenüber falsch positiven Ergebnissen Vermeidung unnötiger Anwendung von humanem Anti-D Unabhängigkeit von der Verfügbarkeit von Anti-D 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland RHD-NIPD Arbeitsgruppe Elisabeth Schwartz-Jungl1 Claudia Hobel2 Josef Deutinger3 Dieter Schwartz1 Christof Jungbauer2 Peter W. Husslein3 W. R. Mayr1,2 1 Universitätsklinik für Blutgruppenserologie und Transfusionsmedizin, Medizinische Universität Wien Österreichisches Rotes Kreuz, Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland 3 Universitätsklinik für Frauenheilkunde, Medizinische Universität Wien 2 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland www.blut.at www.roteskreuz.at Österreichisches Rotes Kreuz Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland www.blut.at www.roteskreuz.at Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
