Zellsimulationen - Chair of Computational Biology

V11 Zellsimulationen
Nerven-Verbindung (synaptischer Spalt).
Nach seiner Auschüttung bindet der
Neurotransmitter Acetylcholin (hellblaue
Kugeln) an die Acetylcholinrezeptoren
(tassenförmige Objekte) und an
Acetylcholinesterase. Doppelt besetzte
Rezeptoren (gelb) leiten Strom, der eine
Kaskade von Vorgängen einleitet, die zur
Kontraktion des Muskelstrangs führen.
Diese und nächste Stunde werden 3 Simulationspakete behandelt, E-cell, Virtual
Cell, Mcell, die 3 verschiedene Paradigmen für Zellsimulationen verkörpern
- ODE = gewöhnliche Differentialgleichungen, enthalten ∂/∂t
grösseres
- PDE = partielle Differentialgleichungen, enthalten ∂/∂t und ∂/∂r
Detail
- explizite Simulation der Brownschen Bewegungen einzelner
Moleküle
- Projekte unserer Arbeitsgruppe
11. Vorlesung WS 2006/07
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1
Differentialgleichungen
Eine gewöhnliche Differential- bzw. Differenzialgleichung (oft abgekürzt mit
ODE für engl. ordinary differential equation) ist eine Differentialgleichung, die nur
Ableitungen nach einer reellen Variablen enthält.
Ihre Lösung ist somit eine Funktion, die von einer Variablen abhängt.
Differentialgleichungen werden oft benötigt, um Vorgänge in der Natur zu
beschreiben, bei denen sich Größen in Abhängigkeit von sich selbst verändern.
Das Zerfallsgesetz in der Physik etwa besagt, dass die
Anzahl dN der pro Zeiteinheit dt zerfallenden Atome einer
Menge instabiler Atome proportional zur aktuell
vorhandenen Anzahl N an Atomen ist.
Durch Berechnen der Funktion N(t) aus dieser
Differentialgleichung kann die Anzahl der Atome zu
jedem Zeitpunkt bestimmt werden.
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dN t   N t dt
dN t 
 dt
N t 
ln N t   t  c
N t   e t  c
 N t   N 0 e t
2
Partielle Differentialgleichungen
Eine Partielle Differentialgleichung (Abkürzung PDE für partial differential
equation) ist eine Differentialgleichung, die partielle Ableitungen enthält.
Etwas genauer gesagt ist eine PDE eine Gleichung für eine oder mehrere
unbekannte Funktionen, die folgende Kriterien erfüllt:
- die unbekannte Funktion hängt von mindestens 2 Variablen ab
- in der PDE kommen partielle Ableitungen nach mindestens 2 Variablen vor
- in der Gleichung kommen nur die Funktion, sowie deren partielle Ableitungen,
jeweils am gleichen Punkt ausgewertet vor.
Die implizite Form einer partiellen Differentialgleichung für eine Funktion u, die von
zwei Variablen x und y abhängt, lautet

ux, y  ux, y   2ux, y  
F  x, y, ux, y ,
,
,
,...  0
x
y
xy


wobei F eine beliebige Funktion ist.
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3
Beispiele für partielle Differentialgleichungen
Viele physikalische Prozesse hängen sowohl vom Ort als auch von der Zeit ab.
Zum Beispiel hängen die Wellen, die durch einen Wassertropfen der auf eine
Wasseroberfläche fällt entstehen, sowohl von der Zeitableitung (Geschwindigkeit der Welle)
also auch von der Raumableitung (Profil der Welle) ab.
Da Ableitungen nach mehreren Variablen auftauchen, ist also eine partielle
Differentialgleichung zur Beschreibung des Vorgangs notwendig.
Das einfachste mögliche Beispiel einer partiellen Differentialgleichung ist folgendes:
Eine Funktion u(x,t) möge von 2 Variablen abhängen (z. B. von Ort x und Zeit t).
Die partielle Ableitung
analog gibt
u  x, t 
gibt an, wie stark sich die Funktion in der Zeit ändert,
t
u  x, t  die Änderung der Funktionswerte in der Ortsvariablen an.
x
Falls diese beiden Änderungen gleich sind, ergibt sich folgende Differentialgleichung
u  x, t  u  x, t 

t
x
Eine Lösung dieser Gleichung wäre u(x,t) = f(x + t) mit einer beliebigen Funktion f.
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4
Virtual Cell: Software-Umgebung für
computerunterstützte Zellbiologie
Prof. Leslie Loew, University of Conneticut Health Center
National Resource for Cell Analysis and Modeling
Virtual Cell
- wurde für die Zellbiologie-Community entwickelt
- ermöglicht die Konstruktion räumlicher Modelle
- Verbindung zur quantiativen Lichtmikroskopie an lebenden Zellen
- Kann man auf der Basis des komplexen räumlichen und zeitlichen Zusammenspiels der Zellkomponenten ein quantitatives Verständnis des gesamten zellulären
Verhaltens entwickeln?
- Sind die identifizierten Komponenten notwendig und hinreichend?
- Wie sensitiv reagiert der Gesamtprozess auf Veränderungen einer Komponente?
(Zellen sind „robust“).
- Die Simulationen werden über das Internet auf einem 16-Prozessor cluster mit
Alpha-Prozessoren durchgeführt.
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5
Design einer Virtuellen Zelle
Die `Physiologie' beinhaltet die
topologische Anordnung von
Kompartments und Membranen, die mit
ihnen assoziierten Moleküle, und die
Reaktionen zwischen den Molekülen.
Die getrennt definierte `Geometrie‘ ist
eine räumliche Beschreibung der
Kompartments in 0-3 Dimensionen.
Sie kann aus analytischen Ausdrücken
bestehen oder aus einem
experimentellen Bild abgeleitet werden,
das z.B. von einem Mikroskop stammt.
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Das eigentliche Modell besteht aus
der Verbindung der Topologie der
physiologischen Beschreibung mit
einer geeigneten räumlichen
Geometrie.
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6
Virtual cell: graphische Benutzerschnittstelle (GUI)
Das GUI von Virtual Cell ist als JAVA
applet innerhalb eines Webbrowsers
entwickelt.
Hier sieht man, wie eine Zelltopologie
einer bestimmten experimentellen
Geometrie zugeordnet wird.
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7
Einzelschritte bei Erstellung von BioModellen
Structure Mapping – definiert die Beziehung zwischen der Physiologie
(zelluläre Strukturen) und der Geometrie des Modells. Bestimme das Verhältnis
von Oberfläche zu Volumen für die Modelle der Kompartments oder für nicht
aufgelöste räumliche Strukturen. Bilde die zellulären Strukturen auf geometrische
Objekte ab.
Wähle zwischen unterschiedlichen Randbedingungen (Wert bzw. Ableitung am
Rand = Dirichlet bzw. Neumann) für die Strukturen.
Anfangsbedingungen – Konzentrationen und Diffusionsraten können räumlich
variable definiert werden. Wähle Anfangsbedingungen für Diffusion ≠ 0.
Reaction Mapping – erlaube oder verbiete Reaktionen bzw. Flüsse.
Math Viewer – prüfe die mathematische Beschreibung, die vom Programm
automatisch für die Abbildung des physiologischen Modells auf ein
Kompartment-Modell oder auf ein räumliches Modell erstellt wird.
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8
Abstraktion experimenteller Geometrien
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9
Zuordnung von Physiologie und Geometrie
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10
Definition des Flusses durch Membranen
Zwischen verschiedenen Kompartments
erzeugt das Programm automatisch
Membranen.
Flüsse beziehen sich auf eine
bestimmte Membran und beschreiben
den Fluss eines bestimmten Moleküls
durch diese Membran.
Das Molekül muss auf beiden Seiten
der Membran existieren.
Flüsse werden in (mM*mm*s-1) gemessen und sind beliebige Funktionen der
Transporter- bzw.
Kanalkonzentrationen.
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11
Definition der mathematischen Formeln
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12
zeitabhängige Darstellung der Ergebnisse
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13
räumliche Darstellung der Ergebnisse
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BK-induzierte Calcium-Wellen
Fink, Slepchenko, Moraru, Watras, Schaff, Loew
Biophysical Journal, 79, 163 (2000)
“An Image-Based Model of Calcium Waves in Differentiated Neuroblastoma Cells”
Die intrazelluläre Calcium-Dynamik ist ein besonders geeignetes Modellsystem.
Es existieren viele experimentelle Techniken um die molekularen Komponenten
zu visualisieren, die die Calcium-Ausschüttung bestimmen, und um die CalciumKonzentration selbst mit Fluoreszenz-Farbstoffen zu visualisieren.
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15
Pathway für die Bradykinin-induzierte Ausschüttung von
Calcium in differentiereten Neuroblastoma-Zellen
Sobald Bradykinin (BK) an seinen Rezeptor in der
BK
Plasmamembran bindet (BKR), setzt dies eine G-
Protein Kaskade in Gang (gezeigt als αGq, βγ), die
Phospholipase C (PLC) aktiviert. PLC hydrolysiert
wiederum Glycerinphosphat, das in
Phosphatidylinositolbisphosphat (PIP2) gebunden ist.
Das Produkt dieser Hydrolyse setzt IP3 von der
Membran frei. IP3 kann frei im Zytosol diffundieren,
IP3
dabei von Phosphatasen und Kinasen abgebaut
werden, oder an seinen Rezeptor IP3R in der ERMembran binden. IP3R ist ein Calcium-Kanal, der sich
nach Bindung von IP3 und Ca2+ öffnet. Das so aus
dem ER freigesetzte Ca2+ bindet an Ca2+ Buffer (B) im
Zytosol. Schliesslich wird Ca2+ durch die SERCA Ca2+Pumpe ins ER zurückgepumpt, bzw. durch andere
Calcium-pumpen und –austauscher aus der Zelle
hinaus (Caext.).
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16
Experiment: BK-induzierte Calcium-Welle
BK (500 nM) wurde extern zum Medium einer
N1E-115 Nb Zelle zugegeben, die mit dem
Farbstoff fura-2 gesättigt war.
Die Fluoreszenz einer 380-nm Anregung
wurde mit einer CCD Kamera gemessen, in
die [Ca2+] Konzentration umgewandelt, und in
einer Falschfarbendarstellung gezeigt.
Relative zeitliche Änderung von [Ca2+] in zwei
interessanten Regionen im Zellsoma und in
dem Neuron (im obersten Bild durch
Rechtecke gezeigt):
Welle kommt etwas später im Soma an,
besitzt überall gleiche Amplitude.
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17
Calcium-Welle (exp)
QuickTime™ and a
YUV420 codec decompressor
are needed to see this picture.
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18
Es gibt mehr ER im soma als in neuronaler Fortsetzung
(a) Electronmikroskopische
Aufnahme des ERs im Soma und
im Neurite von N1E-115
Neuroblastoma-Zellen.
(b) Das ER einer lebenden Zelle
wird einige Minuten nach Injektion
durch einen fluorezenten,
lipophilen Farbstoff sichtbar
gemacht.
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19
Verteilung von InsP3R, BKR und SERCA in ER- Membran
(a) Visualisierung intrazellulärer Verteilungen mit 3D Immunofluoreszenz. Hier
wurde N1E-115 Nb-Zelle fixiert und mit einem Antikörper für SERCA2
markiert.
(b) Intrazelluläre Verteilung von BKR und ER/InsP3-R/SERCA2.
Die relative Konzentration von BKR in der Plasmamembran (äussere Schicht)
wird gemittelt für sechs verschiedene Regionen der Zelle angegeben.
Die mittlere Verteilung des ER
ist identisch mit der von InsP3R
and SERCA und wird innerhalb
der Zelle durch Graustufen
angegeben (siehe Skala rechts).
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Simulationsdetails
instantaner Anstieg
nach BK-Reizung
InsP3-Produktion
InsP3-Diffusion und -Abbau
Calcium-Dynamik
Kinetik der
InsP3-Kanäle
Kinetik der SERCA-Pumpe
und: Calcium-Speicherung (nicht
gezeigt)
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21
Simulation von BK-induzierter Calcium-Welle
In den Spalten von links nach rechts
zeigen die pseudokolorierten Bilder die
Simulationsergebnisse für [Ca2+]cyt,
[InsP3]cyt, und PO (die W’kt dass der
IP3-Rezeptor offen ist).
Unten sieht man den zeitlichen Verlauf
in Soma und Neurite (deren Positionen
sind als gelbe und grüne Punkte im Bild
links oben gezeigt).
Experimentelle Werte
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Calcium wave (simulation)
Ca2+ – ist exp.
messbar
QuickTime™ and a
YUV420 codec decompressor
are needed to see this picture.
Text
InsP3 – nicht
exp. messbar
Simulation in 2D dauert etwa 15 Minuten auf PC. Δt = 0.01 s.
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unterschiedliche Zellgeometrien
Experimentelle und simulierte BKinduzierte Calcium-Ausschüttung in
N1E-115 Nb Zellen
unterschiedlicher Morphologie.
(a) Modellierung wie zuvor, aber mit
2 Neuriten anstelle von einem.
(b) Es wurden konstante
Verteilungen von BKR und ER in
der Zelle angenommen.
Skalierung (a) 50 µM und (b) 20
µM.
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24
Virtual cell: Ausblick
aktuelle Version:
- ermöglicht Simulation von Reaktions-Diffusionsprozessen in beliebigen
Geometrien. Anpassung notwendig für Probleme, die Änderungen der Geometrie
erfordern (Zellwanderung, Zellteilung).
-behandelt nur bestimmte Sorten von stochastischen Prozessen:
Brownsche Bewegung, gerichtete Teilchenbewegung entlang von Mikrotubuli,
Reaktion einzelner Teilchen mit kontinuierlich verteilten Molekülen.
- wenn die Anzahl an wechselwirkenden Molekülen zu klein wird, braucht man
statt der stochastischen Beschreibung Reaktionen zwischen diskreten Molekülen.
- Behandlung diskreter Zustände ist auch erforderlich zur Modellierung der Ströme
von einzelnen Ionenkanälen und deren räumlicher Verteilung.
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25
Virtual cell: Ausblick II
Es wird erforderlich (und möglich) sein, Simulationsmodelle zwischen
verschiedenen Softwareplattformen auszutauschen und eventuell gleichzeitig
auszuführen.
z.B. benutze GEPASI bzw. E-Cell um ein Modell auf der Ebene von ODEs zu
optimieren und reduzieren bevor man mit Virtual Cell die räumlichen Verteilungen
mittels PDEs simuliert.
Zwei Ansätze hierfür:
CellML – markup language von Physiome Sciences Inc. & Univ. of Auckland
SBML – Caltech & ERATO-Kitano Symbiotic Systems Project
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M-cell: Allgemeine Monte–Carlo Simulation von
zellulären Mikrophysiologien
Thomas M. Bartol Jr.
Joel R. Stiles
Computational Neurobiology Laboratory
Biomedical Applications
(T. Sejnowski), Salk Institute, San Diego
Pittsburgh Supercomputing Center
Ziel: quantitatives, molekulares Verständnis der Nervenfortleitung,
Funktion von Nervengasen, Modulatoren, oder Autoimmunerkrankungen.
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MCell: Idee + Motivation
MCell ermöglicht 3-D Monte–Carlo Simulationen für Ligandendiffusion und
chemische Signalprozesse.
Biologische Strukturen wie Neuronen zeigen auf der subzellulären Ebene eine
enorme Komplexität und Diversität. Die inter- und intrazelluläre Kommunikation
geschieht mittels verschiedener chemischer Signalpfade.
Am Prozess der synaptischen Transmission sind z.B. Neurotransmitter und
Neuromodulatoren beteiligt. Ebenfalls beteiligt sind Proteine, die die Auffüllung
und Entleerung der synaptischen Vesikel mit Neurotransmitter-Molekülen
beeinflussen, Rezeptorproteine, Transportproteine, sowie oxidierende und
hydrolytische Enzyme.
Mit Mcell kann man alle diese Parameter in beliebig komplexen räumlichen
Darstellungen der beteiligten zellulären Strukturen darstellen und variieren.
Anfangsbedingung: Eine Monte–Carlo Simulation beginnt damit, dass die
Zellumgebung mit einzelnen Liganden und Liganden-bindenden Molekülen
angefüllt wird.
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Warum soll man Monte Carlo Algorithmen benutzen?
1. löse PDEs zwischen Voxels
Die Diffusion von Ligandenmolekülen in Lösung basiert auf Brownscher
Bewegung.
Der mittlere Netto-Fluss aus einer Region des Raums in eine andere hängt von
der Mobilität der Moleküle und dem räumlichen Konzentrationsunterschied der
beiden Regionen ab.
Eine Methode, den räumlichen Gradienten zu berechnen, ist, den Raum in kleine,
üblicherweise kubische Volumenelemente (Voxels) aufzuteilen, innerhalb derer
man gute Mischung annimmt, und dann mittels eindimensionaler partieller
Differentialgleichungen den mittleren Fluss durch die Verbindungsfläche zwischen
angrenzenden Voxeln zu berechnen.
Sofern die Granularität der räumlichen und zeitlichen Unterteilung fein genug ist,
wird eine numerische Simulation das korrekte mittlere Verhalten des Systems
erzeugen.
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löse PDEs innerhalb von Voxels
Man kann weitere PDEs hinzufügen um die mittlere Raten chemischer Raten
Reaktionen innerhalb jedes Voxels zu beschreiben. Man erhält damit eine
Simulation des räumlichen und zeitlichen Diffusionsverhaltens und der
chemischen Reaktionen.
Für einfache räumliche Anordnungen kann diese Methode sehr effizient sein.
Für komplexe (d.h. realistische) Structuren werden die räumlichen Unterteilungen
immer komplexer und eine grosse Anzahl an Voxeln ist erforderlich.
Auf jeden Fall liefert die Simulation keine direkten Informationen über die
stochastischen Schwankungen, die auf der endlichen Anzahl an beteiligten
Molekülen beruhen. Diese sind in biologischen Systemen jedoch oft von grossem
Interesse.
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2. völlig andere Methode: Random walk
Direkte Beschreibung der Brownschen Bewegung der einzelnen
Ligandenmoleküle. Durch Verwendung von Zufallszahlen werden bei jedem
Zeitschritt beliebige erlaubte Richtungen und Verschiebungen ausgewählt.
Indem die Zeitschritte und Verschiebungen deutlich kleiner als die Teilchengröße
gehalten werden, erreicht man eine hohe numerische Genauigkeit.
Kollisionen mit beliebigen Oberflächen werden entdeckt und gemäss von
Regeln behandelt (Bindung, Transport, Reflexion etc.). Voxel sind unnötig.
Gleichsam werden Kollisionen mit möglichen Bindungsstellen entdeckt und
behandelt. Für die Ausbildung von Bindungen werden Bindungswahrscheinlichkeiten festgelegt. Die momentane Entscheidung wird durch eine Zufallszahl
bestimmt.
Alle möglichen Vorgänge werden auf einer Molekül-für-Molekül Basis betrachtet.
Dadurch enthält die Simulation realistische stochastische Schwankungen in
Abhängigkeit von der räumlichen Verteilung und der Anzahl an Molekülen.
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Rechenaufwand: sehr hoch
konkrete Anwendung, Effekt eines Nervengases
15,680 Simulationen für jeden Zustand.
Jede Simulation entspricht 40 Millisekunden in Realzeit und dauert je nach
Parametern zwischen 10 Sekunden bis zu 6 Stunden, im Mittel etwa 1 Stunde.
gesammelte Daten: 60 Gigabyte
Die Rechnungen wurden parallel auf bis zu 1,024 Prozessoren von Blue Horizon
(SDSC) durchgeführt.
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Typische Vorgänge während einer MCell-Simulation
-
Freisetzung von Ligandenmolekülen aus einer
Struktur (z.B. einem Vesikel)
-
Erzeugung oder Vernichtung von Ligandenmolekülen
(z.B. Synthese, Hydrolyse, oder Redox-Reaktionen)
-
Diffusion der Liganden innerhalb des Raums
zwischen beliebigen Oberflächen
(z.B. prä- und postsynaptische Membranen)
-
chemische Reaktionen von Ligandenmolekülen
mit “Effektor”molekülen
(z.B. Rezeptoren oder Enzyme)
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33
MCell: biologische Skala
Der Level an Detail von MCell Simulationen liegt
zwischen denen von atomistischen
Moleküldynamik-Simulationen und der
Simulationen gesamter Zellen (Virtual Cell, E-cell).
Die Diffusion einzelner Ligandenmoleküle wird als
Brownsche Bewegung mit einem Random–Walk–
Algorithmus simuliert.
Mittlere Ratenkonstanten werden in Monte–
Carlo–Wahrscheinlichkeiten für Reaktionen
einzelner Moleküle pro Zeitschritt umgeformt.
Damit können die Ligandenmoleküle stochastisch
reagieren sobald sie an Rezeptoren, Enzyme oder
Transporter gebunden sind.
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34
Tutorial: nichtgebundene Diffusion
In diesem einfachen Beispiel
werden Liganden an zwei Punkten
freigesetzt (rot und blau markiert).
Durch die Verwendung unterschiedlicher Diffusionskonstanten
wird unterschiedliches Verhalten
erzeugt.
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35
Tutorial: nichtgebundene Diffusion
file run_parameters
dt = 1.0e-6
/* run_parameters */
/* Simulationszeitschritt*/
iterations = 300
viz_output_file = "viz_data“
/* ligand_parameters */
red_ligand_diffusion_constant = 6.0e-6
blue_ligand_diffusion_constant = red_ligand_diffusion_constant/2.0
number_of_ligand_molecules = 5.0e3
release_site_diameter = 0.03
red_location = [0.0, 0.0, 0.0]
blue_location = [-1.0, -1.0, 0.0]
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36
zeitlicher Verlauf
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37
Tutorial 2: Sampling der Liganden
Hier werden die gleichen Punkte
zur Ausschüttung der Liganden
verwendet wie zuvor.
Zur Analyse werden Reaktionsbehälter definiert um die Ligandenmoleküle zu zählen, die sich in
bestimmten Gebieten befinden und
diese Information in eine Datei
REACTION_DATA_OUTPUT zu
schreiben.
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38
Tutorial 2: Sampling der Liganden
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39
Tutorial 4: einzelne Bindungsprozesse
Hier wird die Simulation von
Reaktionszentren wie Effektoren
eingeführt.
In der Box führen Ligandenmoleküle
Brownsche Bewegung aus.
Am Boden der Box befindet sich ein
Gitter von Effektormolekülen.
Die rot markierten Zylinder haben ein
Ligandenmolekül gebunden.
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40
Tutorial 6: Antiporter
Hier werden Antiporter-Moleküle in der Membran modelliert, die den gleichzeitigen
entgegengesetzen Transport zweier Liganden L und M durch die Membran
bewirken.
Blaue Antiporter haben keine Bindungsstelle besetzt, rote und grüne Antiporter
haben nur einen roten bzw. grünen Liganden gebunden.
Gelbe Antiporter sind doppelt besetzt. Nun ist Transport möglich.
Iteration 1000
Iteration 5000
•Iteration 0
Iteration 15000
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41
Tutorial 9: einfache Pore
Hier wird die Grösse einer Vesikelpore während der Simulation skaliert.
Iteration 0
Iteration 250
Iteration 750
Iteration 1000
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42
räumliche Rekonstruktion aus exp. Abbildungen einer
neuromuskulären Verbindung in Maus–Sternomastoid
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43
Simulation der in den Spalten erzeugten Ströme
Ausschnitt aus Bild
auf vorheriger Seite.
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44
Diffusion von Neurotransmittern in Synapsen
Neurotransmitter-Moleküle (Acetylcholin)
diffundieren und aktivieren Rezeptoren in
den Synapsen zwischen verschiedenen
Zellen.
Die wie Tassen aussehenden Objekte sind
Acetylcholin-Rezeptoren:
blaue sind frei;
rote haben 1 Ach;
grüne haben 2 Ach gebunden,
sind jedoch geschlossen;
gelbe haben 2 Ach gebunden,
sind offen.
Die Anzahl an Ionen, die durch die gelben
Rezeptoren fliesst, ergibt den elektrischen
Strom an der Synapse.
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Ausschnitt aus Bild
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45
zeitliche Entwicklung der Rezeptorzustände
22 μs nachdem sich die Pore öffnet
90 μs
Stiles et al., 1996, PNAS 93:5747-5752.
160 μs
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46
Zusammenfassung
Zellsimulationen sind im Kommen!
Detaillierte, dreidimensionale Modelle sind notwendig,
sobald Lokalisation z.B. an Membran stattfindet, und
sobald wichtige Moleküle in kleinen Zahlen vorliegen.
Schlagwort: Systems Biology.
Messung von kinetischen Konstanten im Allgemeinen mühsam.
Daher zunächst Konzentration auf Modellsysteme.
Molekulare Simulationen können sehr aufwendig sein.
Ein Volumen von 100 nm3 enthält ca. 1000 Proteine.
1 μm3 enthält dagegen bereits ca. 106 Proteine.
Bei Beschränkung auf Molekül-Konzentrationen kann
dagegen fast in real time simuliert werden.
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