Fangen von Bakterien mit Licht

 Betreuerin: Nora Sauter Physikalische Chemie, Universität Basel 9. – 13. März 2015 Fangen von Bakterien mit Licht Fixierung von Caulobacter Crescentus mit Laser Rahel Schmidt – Gymnasium Oberwil – Therwil, 15.2.15 Marie-­‐Claire Graf – Gymnasium Liestal – Gelterkinden, 15.2.15 1 1.
Abstract Einerseits wurden die Testbakterien Caulobacter Crescentus in einem spezifischen Nährmedium kultiviert. Andererseits wurden mithilfe von Photo-­‐ und Soft-­‐lithographie und Plasma Bonding PDMS Mikrostrukturen (Devices) hergestellt. Schlussendlich wurden die Bakterien mithilfe von Laser unter dem Mikroskop in den Mikrostrukturen gefangen. Ermittelt wurde die Zeit, bei der ein Bakterium im Laser gefangen werden kann, ohne sich auf einer Oberfläche festzusetzen. Zudem wurde die maximale Fangkraft des Lasers errechnet. 2.
Einführung Was genau sind die ersten Schritte, die zur Bildung eines Biofilms führen? Dies ist die Frage der laufenden Grundlagenforschung für das Verständnis der Bildung von Biofilmen. Biofilme sind in der Medizin, wie auch in der Nahrungsmittelindustrie unerwünscht. Bei einem Aspekt der aktuellen Forschung geht es darum, die genauen Abläufe im Bakterium bei der Festsetzung eines Bakteriums auf einer Oberfläche zu verstehen. Mit diesem Wissen wird im weiteren Verlauf ein Weg gesucht werden, um die Bildung eben solcher Biofilme zu verhindern. Die Untersuchungen stützen sich auf die Annahme, dass die Geissel (Flagellum) einen entscheidenden Einfluss hat auf die Festsetzung von Bakterien auf Oberflächen und somit auf die Entstehung von Biofilmen. Ein weiterer Gegenstand der Forschung ist die Frage, ob der Laser phototoxische Wirkungen auf das Bakterium zeigt. 3.
Material & Methoden 3.1 Kultivierung vom Modellbakterium Caulobacter Crescentus Aus einer bestehenden Zellkultur werden drei Abstriche auf Agarplatten gemacht, sowie eine weitere Kultur in flüssiges Nährmedium gefüllt. Die Zellkulturen werden bei 30 °C gelagert. Von der Agarplatte wird jeweils eine Kolonie weiter in einem flüssigem Nährmedium gezüchtet, welche auf dem Shaker geschüttelt wird. 3.2 Photolithographie Um in einem späteren Schritt Bakterien mit dem Laser gezielt zu fangen, werden Mikrokanäle und Mikrokammern (microfluidic devices) hergestellt. Dabei wird zuerst ein negativer Master für 8 m hohe Kammern folgendermassen bearbeitet: Beim Spinning mit 4000 rpm während 30 sec verteilt sich der Fotolack SU-­‐8 3005 gleichmässig dünn auf dem Master. Anschliessend wird der Photolack für 3 min bei 95 °C gehärtet (Soft Baking). Während 5.8 sec wird der Master durch eine bestehende Maske mit UV-­‐Licht belichtet (Exposure). Der Photolack der beleuchteten Strukturen härtet sich auch und so entsteht die gewünschte Struktur. Beim Post Exposure wird die Struktur fixiert (2 min bei 95 °C). In einer Entwicklerflüssigkeit wird der Master 2 min lang vom nicht ausgehärteten Photolack befreit (Development), und anschliessend während 20 min bei 200 °C gebacken (Hard Baking). Nun ist der negative Master mit der gewünschten Struktur fertig und kann im nächsten Schritt weiterverwendet werden. 2 3.3 Soft Lithographie 3.4 PDMS Mikrostrukturen (Devices) 3.5 Fangkraft der optischen Falle für Polystyrolpartikel berechnen Das PDMS wird aus einer Mischung von zwei Polymeren (Base und Curing-­‐Agent) im Verhältnis 10:1 angemischt. Anschliessend wird das PDMS über den negativen Master gegossen und über Nacht bei 80 °C gehärtet. Ein Ausschnitt der ausgehärteten PDMS Strukturen wird nun ausgeschnitten (Cut Out) und es werden die Löcher für die Ein-­‐ und Ausgänge gestanzt. Die PDMS Struktur wird mit Plasma behandelt (Plasma Treatment) und auf eine ebenfalls mit Plasma behandelte Glasscheibe gelegt. Durch die Aktivierung durch die Plasmabehandlung verbinden sich das PDMS und die Glasscheibe. In die vorgestanzten Löcher werden nun kleine Schläuche eingeführt. 
Nach Einrichtung des Lichtmikroskops, des Infrarotlasers (830 nm) und der Suspension mit fluoreszierenden Polystyrolpartikeln wird das Device unter das Lichtmikroskop mit eingebauter Kamera gelegt. Mithilfe von verschiedenen Softwares kann die Fliessgeschwindigkeit der Suspension, die Beleuchtungsstärke, die Belichtungszeit und die Fluoreszenzbeleuchtung geregelt werden. Die Probe kann mit Hilfe eines beweglichen Objektträgers positioniert werden. Mit folgender Formel wird die maximale Fangkraft des Lasers berechnet: FTrap,max  6Rv Zuerst wird die Geschwindigkeit v des der Falle entweichenden Partikels anhand von Videoanalysen ermittelt. Abbildung 1: Ein Partikel wird im Laser festgehalten. Die Fliessgeschwindigkeit wird erhöht, bis der Partikel aus der Falle gespült wird. Die Belichtungs-­‐
zeit beträgt 0.01 s. Die zurückgelegte Strecke des Partikels während der Belichtungszeit wird gemessen. Als Referenzlänge diente die bekannte Breite des Kanals mit 40 µμm. 3 Die Auswertung der Videos ergab einen durchschnittlichen Weg von 30.2 µμm während 0.01 s Belichtungszeit. v = 30.2 µμm / 0.01 s = 3020 µμm/s = 0.00302 m/s. Die Viskosität n von Wasser bei 20 °C beträgt 1 mPa*s = 0.001 Pa*s. Der Radius R der kugelförmigen Polystyrolpartikel beträgt 1 µμm = 0.000001m. 3.6 Kritische Zeit im Laser 3.7 Geschwindigkeit der schwimmenden Bakterien Caulobacter Crescentus werden analog zu den Polystyrolpartikel in die Devices eingeführt und unter dem Lichtmikroskop beobachtet. Mit dem Laser werden die Bakterien unterschiedlich lange festgehalten und danach wieder entlassen. Die exakte Zeit der Bakterien in der Falle wurde später anhand der Videoanalysen berechnet. Nun wird mithilfe der Videos geschaut, wie beweglich die Bakterien nach der Zeit im Laser sind (festgesetzt / nicht festgesetzt). Die Daten werden in einem Diagramm eingetragen. Der Suspension der Testbakterien wird 1 l GFP-­‐gebundenes Lectin (green fluorescent protein) zugefügt. Lectin bindet an den Holdfast (Teil, mit welchem das Bakterium sich mit der Oberfläche verbindet) und bei Bestrahlung mit blauem oder ultraviolettem Licht fluoresziert GFP. So können nicht schwimmende (sondern nur im Strom treibende) Bakterien von den schwimmenden unterschieden werden. 4.
Resultate 4.1 Fangkraft für Polystyrolpartikel 4.2 Kritische Zeit im Laser Das Resultat für die maximale Kraft der Falle ist: FTrap,max  5.7 *10 11 N  57 pN Nach ungefähr 6 s fangen die ersten Bakterien an sich anzuheften. 
Abbildung 2: Zeit welche Caulobacter Crescentus im Laser festgehalten wurde und die Beweglichkeit danach (nicht festgesetzt (not fixed) oder festgesetzt (fixed)). 4 4.3 Geschwindigkeit der Bakterien 5.
Diskussion Es ist kein Resultat vorhanden. 5.1 Fangkraft für Polystyrolpartikel 5.2 Kritische Zeit im Laser 5.3 Geschwindigkeit der Bakterien Verglichen mit einer früheren Messung von Nora Sauter ist das berechnete Resultat von 57 pN sinnvoll. Abweichungen können entstehen bei der Bild-­‐ und Videoanalyse. Nur ein Bruchteil des Videomaterials ist aussagekräftig, doch ist ein deutlicher Übergang bei 6 s ersichtlich. Werden die Bakterien unter 6 s im Laser gehalten schwimmen sie davon, nach einer Zeit über 6 s setzten sie sich an der Oberfläche fest. Für grössere Aussagekraft müssten mehr Daten vorhanden sein. Dieses Resultat (sowohl auch jenes von 4.1) ist insofern von Bedeutung, als dass man bei weiterführenden Experimenten mit Bakterien und verschiedenen Kunststoffpartikeln die Laserapparatur automatisiert einrichten kann, um die Arbeit zu erleichtern. Leider ist kein Resultat vorhanden. Beim ersten Versuch schien die ganze Suspension zu fluoreszieren, beim zweiten Versuch fluoreszierten alle Bakterien. In einem weiteren Schritt soll nun zuerst die Wirkungsweise von Lectin-­‐gebundenem GFP besser untersucht werden, bevor es wieder eingesetzt wird. 6.
Danksagung Ganz herzlich danken wir unserer Betreuerin Nora Sauter. Sie führte uns in die wissenschaftliche Laborwelt ein, erklärte uns ihre Doktorarbeit und liess uns selber Hand anlegen. So hatten wir eine spannende Woche am Institut für physikalische Chemie an der Universität Basel. Weiteren Dank geht an Prof. Dr. Thomas Pfohl, in dessen Laboratorien wir unsere Experimente durchführen durften. Einen grossen Dank möchten wir Schweizer Jugend forscht und der Universität Basel aussprechen, welche uns diese unglaubliche Chance ermöglicht haben! 7.
Literatur-­‐ & Quellenverzeichnis Fotos: Rahel Schmidt, Marie-­‐Claire Graf Grafik (Titelseite): Nora Sauter Mobility and Surface Adsorption of Caulobacter Crescentus –Benjamin Banusch – Uni Basel – Project work Nanosciences supervised by Prof. Th. Pfohl and Prof. U. Jenal Weitere Hintergrundinformationen: Nora Sauter 5 8.
8.1 Anhang Fangkraft für Polystyrolpartikel berechnen Zurückgelegte Strecke der Polystyrolpartikel während 0.001 s. Referenzlänge: Breite des Kanals: 40 m LÄNGE [ m]
MOVIE NR.
MITTELWERT
21
31
21
20.3
22
23.2
22
30.8
23
53.2
23
22.4
24
-
25
-
26
-
27
25.5
28
26
29
26.9
30
-
31
-
32
-
33
-
34
-
35
-
36
-
37
-
38
-
39
-
40
-
41
-
42
-
43
-
44
-
45
-
46
-
47
30.7
48
32.6
48
40
49
-
50
30.2
6 Überprüfung der gelieferten technischen Daten (12 frames/s) mithilfe einer einfachen Rückrechnung gibt ein akzeptables Resultat: MOVIE
NR.
T
GEMESSEN
PICS/S
STOP
SEQUENZ
2
8.3
11.928
262
99
3
10
11.5
472
115
4
10.66
12.57
348
134
5
10.23
11.926
241
122
6
10.25
11.707
361
120
7
10.28
11.576
335
119
8
10.06
11.829
401
119
9
9.9
11.616
306
115
10
10.25
MITTELWERT 11.707
11.818 414
120
8.2 Kritische Zeit im Laser A B E F G H -­‐ -­‐ -­‐ 330 -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ 490 160 13.3 -­‐ x 347 392 45 3.8 3 342 418 76 6.3 4 x 449 506 57 4.8 4 x 306 373 67 5.6 3 x 196 274 78 6.5 4 x 160 224 64 5.3 4 11 x 328 379 51 4.3 3.5 12 x 125 235 110 9.2 6 13 x 244 292 48 4 3 x 592-­‐628 0-­‐9 45 3.8 4 x 172 221 49 4.1 3 x 87 117 30 2.5 3.5 1 2 x 3 x 4 x 5 6 7 8 9 10 14 15 16 17 18 19 20 AA BB CC DD EE FF GG III C D -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ x 73 124 51 4.3 2 x 224 275 51 4.3 3 x 392 450 58 4.8 3 Movie-­‐ Nr. festgesetzt (fixed) nicht festgesetzt ! weggeschwommen (not fixed) Bildnummer Laser-­‐Start Bildnummer Laser-­‐Stop Anzahl Bilder von Bakterium im Laser Zeit im Laser berechnet (Camara: 12 frames/s) Zeit im Laser gemessen mit Stoppuhr 7