Struktur-Funktions-Beziehung der HCMV-kodierten ˜Fcγ

Humboldt-Universität zu Berlin
Dissertation
Struktur-Funktions-Beziehung der HCMV-kodierten
Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68
zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat)
im Fach Biologie
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
von
Henrike Christiane Reinhard
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter:
1. Prof. Dr. Hartmut Hengel
2. Prof. Dr. Richard Lucius
3. PD Dr. Thorsten Wolff
eingereicht: 12. Dezember 2008
Datum der Promotion: 20. Mai 2009
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯INHALTSVERZEICHNIS⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
I
IV
ZUSAMMENFASSUNG
1
SUMMARY
3
1
EINLEITUNG
5
1.1
Herpesviren
5
1.2
Das humane Cytomegalovirus (HCMV)
1.2.1 Medizinische Bedeutung und Epidemiologie
1.2.2 Virionstruktur und Genomorganisation
1.3
Immunglobuline und ihre Rezeptoren
1.3.1 Immunglobuline
1.3.2 Fc-Rezeptoren
1.3.3 Fcγ-Rezeptoren
10
11
12
13
1.4
Antikörper-vermittelte Kontrolle von Virusinfektionen
1.4.1 Virusneutralisation und Komplement-vermittelte Virolyse
17
18
1.5
Immunevasion durch Herpesviren
6
7
9
21
1.6
Virale Fcγ-Rezeptoren (vFcγR)
1.6.1 CMV-kodierte Fcγ-Rezeptoren
1.6.2 Funktion HCMV-kodierter Fcγ-Rezeptoren
1.6.3 HSV-1-kodierte Fcγ-Rezeptoren
22
22
24
24
1.7
FcγR/Antikörperinteraktion
1.7.1 Zelluläre Fcγ-Rezeptoren
1.7.2 Bakteriell kodierte Fcγ-Rezeptoren
1.7.3 Herpesviral kodierte Fcγ-Rezeptoren
26
26
28
28
2
2.1
2.2
ERGEBNISSE
30
Biochemische Charakterisierung der HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68
2.1.1 Strukturelle Anforderungen an den Liganden Fc bei der Interaktion mit gp34 und gp68
2.1.2 Teilen sich HSV-1 gE und die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren dieselbe
Ligandenbindungsstelle?
2.1.3 Definition der minimalen Bindedomäne von gp68
2.1.4 Definition der minimalen Bindedomäne von gp34
2.1.5 gp34 formt kovalente Homooligomere
2.1.6 Ist die Bildung von kovalenten gp34 Homodimeren Voraussetzung für Fc-Bindung?
2.1.7 Besitzt gp34 eine Ig-artige Ektodomänenstruktur?
30
30
Nachweis der viralen Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 als Komponenten des HCMV Virions
2.2.1 Generierung einer rekombinanten gp34HA Epitop-markierten HCMV-Mutante
2.2.2 gp34 und gp68 sind Oberflächenproteine des HCMV Partikels
2.2.3 Quantifizierung der Neutralisierungskapazität verschiedener HyperimmunglobulinPräparationen gegenüber HCMV und HSV-1
2.2.4 Die cytomegaloviralen Fcγ-Rezeptor-defizienten Mutanten wachsen wildtypartig in vitro
2.2.5 gp34 und gp68 interferieren nicht mit HCMV-spezifischen neutralisierenden Antikörpern
55
55
59
33
39
42
46
51
53
62
64
65
I
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯INHALTSVERZEICHNIS⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
2.2.6 Definierte IgG Subklassen entscheiden nicht über die Hemmung neutralisierender IgGAntikörper durch gp34 und gp68
2.2.7 gp34 und gp68 interferieren nicht mit der Virustransmission über Muttermilch
2.2.8 gp34 und gp68 unterscheiden sich gegenüber gE in ihrem Einfluss auf die Fc-abhängige
Komplement-vermittelte Virolyse
72
74
76
3
DISKUSSION
80
3.1
Übersicht über die Ziele dieser Arbeit
80
3.2
“Finemapping“ und Vergleich der Bindungsstelle von gp34 und gp68 an Fc
3.2.1 gp34 und gp68 unterscheiden sich in ihrem Ligandeninteraktionsmodus
3.2.2 Modelle der gp34/Fc-Interaktion
3.2.3 Interaktion der zellulären Fcγ-Rezeptoren CD32A und CD64 mit Fc
81
82
84
87
3.3
Charakterisierung der HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren als Bestandteil des Virions
3.3.1 gp34 und gp68 sind Bestandteil der äußeren Virushülle, ohne dabei neutralisierende
Antikörper zu hemmen
3.3.2 gp34 und gp68 interferieren nicht mit der Komplement-vermittelten Virolyse
3.3.3 Identifizierung eines dritten HCMV-kodierten Proteins mit Fc-bindenden Eigenschaften
3.3.4 Antikörper-unabhängige immunevasive Funktionen viraler Fcγ-Rezeptoren
88
4
MATERIAL UND METHODEN
88
92
93
94
98
4.1
Material
4.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
4.1.2 Kits
4.1.3 Bakterienstämme
4.1.4 Plasmide/BACmide
4.1.5 Oligonukleotide
4.1.6 Zelllinien
4.1.7 Viren
4.1.8 Primäre Antikörper/IVIGs/sekundäre Antikörper
4.1.9 Geräte
98
98
101
102
102
103
104
104
107
107
4.2
Zellbiologische Methoden
4.2.1 Kultivierung adhärenter Zellen
4.2.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen
4.2.3 Kultivierung von Hybridomazellen
4.2.4 Transfektion
109
109
110
110
111
4.3
Virologische Methoden
4.3.1 Herstellung gereinigter Virus-Stocks
4.3.2 Herstellung ungereinigter Virus-Stocks
4.3.3 Virustitration
4.3.4 Immunfärbung HCMV infizierter Zellen
4.3.5 HCMV Wachstumskurven
4.3.6 Neutralisationstest
4.3.7 Komplement-vermittelte Virolyse
4.3.8 UV-Inaktivierung
4.3.9 Herstellung rekombinanter Vaccinia Viren (rVACV)
4.3.10 Isolierung der rVACV DNA zur Analyse
4.3.11 Sequenzierung der rVACV DNA zur Analyse
112
112
114
115
116
118
118
121
121
122
124
124
4.4
Molekularbiologische Methoden
4.4.1 Klonierungen
4.4.2 Zielgerichtete Mutagenese
125
125
132
II
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯INHALTSVERZEICHNIS⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4.5
4.4.3 Southern Blot Analyse
4.4.4 Luziferase-Reportergenassay
132
135
Proteinchemische Methoden
4.5.1 Immunpräzipitation von [35S]-Methionin/Cystein metabolisch markierten Proteinen
4.5.2 Immunpräzipitation
4.5.3 Gesamtzell-Proteinlysate
4.5.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
4.5.5 Western Blot
4.5.6 Aufreinigung monoklonaler Antikörper mittels Affinitätschromatographie
4.5.7 Kovalente Kopplung von Antikörpern an Cyanbromid-aktivierte Sepharose (CNBrSepharose)
4.5.8 Deglykosylierung von Proteinen mittels Endoglykosidase H (Endo H) und Peptid NGlykosydase F (PNGase F)
4.5.9 Inhibierung der Glykosylierung von Proteinen mittels Tunicamycin
4.5.10 IgG
Depletion
aus
humanem
Serum
als
Komplementquelle
mittels
Affinitätschromatographie
4.5.11 Herstellung von Fab2-Fragmenten aus IgG durch Pepsinspaltung
4.5.12 Pufferaustausch durch Dialyse
4.5.13 Konzentration von Antikörpern
4.5.14 Proteinase K protection assay
4.5.15 Proteinquantifizierung
4.5.16 Silberfärbung von Proteingelen
135
135
139
139
140
141
142
143
144
145
145
146
147
147
148
148
149
LITERATURVERZEICHNIS
150
ANHANG
165
LEBENSLAUF
167
DANKSAGUNG
168
ERKLÄRUNG
170
III
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb.
Abbildung
ADCC
Antikörper-abhängige Zytolyse
AIDS
acquired immunodeficiency syndrome
Amp
Ampicillin
APS
Ammoniumperoxodisulfat
BAC
bacterial artificial chromosome
BSA
bovines Serumalbumin
bp
Basenpaare
C1q
Komplementkomponente 1q
ca.
zirka
CD
cluster of differentiation
CIP
calf intestine alkaline phosphatase, alkalische Phosphatase
CPE
zytopathischer Effekt
C-terminal
carboxyterminal
D-MEM
Dulbecco’s modified eagle medium
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DC
Dendritische Zelle
pH
potentia hydrogenii
EBOV
Ebola Virus
EBV
Ebstein-Barr-Virus
E. coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
Endo H
Endoglykosidase H
ER
Endoplasmatisches Retikulum
Fab
Antigen-bindendes Fragment
FACS
fluorescent activated cell sorting
Fc
kristallisierbares Fragment
FcR
Fc-Rezeptor
IV
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
FcRn
neonataler Fc-Rezeptor
FCS
fötales Kälberserum
g
Gramm
gp
Glykoprotein
gB
HCMV Glykoprotein B
gE
HSV Glykoprotein E
gH
HCMV Glykoprotein H
gI
HSV Glykoprotein I
gL
HCMV Glykoprotein L
gO
HCMV Glykoprotein O
gp34
HCMV Glykoprotein 34
gp68
HCMV Glykoprotein 68
GPI
Glykosylphosphatidylinositol
h
Stunde
H60
minor histocompatibility antigen 60
HA
Hämagglutinin
HCMV
humanes Cytomegalovirus
HHV
humanes Herpesvirus
HIV
human immunodeficiency virus
HSV
Herpes simplex Virus
HUVEC
humane Nabelschnurendothelzellen
ICOS
induzierbarer Co-Stimulator
IE
immediate early (sehr frühe Phase der Genexpression)
IgA
Immunglobulin A
IgD
Immunglobulin D
IgE
Immunglobulin E
IgG
Immunglobulin G
IgM
Immunglobulin M
IgSF
Immunglobulin-Superfamilie
IP
Immunpräzipitation
V
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
IRL
internal repeat long
IRS
internal repeat short
ITAM
immunoreceptor tyrosine-based activation motif
ITIM
immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif
Kana
Kanamycin
kbp
Kilobasenpaare
kDa
Kilodalton
KSHV
Karposi Sarkoma Herpes Virus
l
Liter
μ
mikro
M
molar
MCMV
murines Cytomegalovirus
mg
Milligramm
MHC
major histocompatibility complex
min
Minute
ml
Milliliter
MOI
multiplicity of infection
MRC-5
humane, embryonale Lungenfibroblasten
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
MULT-1
murine UL16-binding protein like transcript 1
nAk
neutralisierender Antikörper
NK
Natürliche Killerzellen
NKG2D
natural-killer group 2, member D
nm
Nanometer
NT
Neutralisationstest
N-terminal
aminoterminal
OD
optische Dichte
ORF
open reading frame; offener Leserahmen
PAS
Protein-A Sepharose
PBS
phosphate buffered saline
VI
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
PCR
Polymerasekettenreaktion
pfu
plaque forming units
PGS
Protein-G Sepharose
p.i.
post infection; nach Infektion
PNGaseF
Peptid-N-Glykosidase F
PMN
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
RAE-1
Retinoic acid early inducible 1
RPMI
Zellkulturmedium (entw. im Roswell Park Memorial Institute)
RT
Raumtemperatur
rVACV
rekombinantes Vacciniavirus
SDS
Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
sec
Sekunde
SHIV
chimärer Simian-human immunodeficiency virus
sIgA
sekretorisches IgA
SIV
Simian immunodeficiency virus
TBE
Tris Borat EDTA
TBST
tris buffered saline with tween
TEMED
N,N,N’,N’’-Tetramethylendiamin
TK
Tymidinkinase
TRIM21
tripartite motif-containing 21
Tris
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
TRL
terminal repeat long
TRS
terminal repeat short
U
Unit
UL
unique long
US
unique short
ÜN
über Nacht
V
Volt
vFcR
viraler Fc-Rezeptor
VII
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
v/v
Volumen pro Volumen
VZV
Varicella zoster Virus
WHO
World Health Organization, Weltgesundheitsorganisation
wt
Wildtyp
w/v
Gewicht pro Volumen
Aminosäuren
A (Ala)
Alanin
C (Cys)
Cystein
D (Asp)
Asparaginsäure
E (Glu)
Glutaminsäure
F (Phe)
Phenylalanin
G (Gly)
Glycin
H (His)
Histidin
I (Ile)
Isoleucin
K (Lys)
Lysin
L (Leu)
Leucin
M (Met)
Methionin
N (Asp)
Asparagin
P (Pro)
Prolin
Q (Glu)
Glutamin
R (Arg)
Arginin
S (Ser)
Serin
T (Thr)
Threonin
V (Val)
Valin
W (Trp)
Tryptophan
Y (Tyr)
Tyrosin
VIII
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ZUSAMMENFASSUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
ZUSAMMENFASSUNG
Neutralisierende IgG-Antikörper übernehmen eine Schlüsselrolle in der Eindämmung der
Virusinfektion, indem sie Glykoproteine des Virions binden und dadurch den Eintritt in
die Wirtszelle hemmen. Zusätzlich wirkt die Aktivierung der Komplementkaskade durch
bereits an Viruspartikel gebundenes IgG als verstärkender antiviraler Mechanismus und
führt zur Virolyse. Eine Familie distinkter Oberflächenrezeptoren spezifisch für die FcDomäne von IgG (FcγR) (CD16, CD32 und CD64) stellt eine Klasse wirtseigener
Rezeptoren dar, die für die Kommunikation von humoraler und zellulärer Immunantwort
verantwortlich
sind.
Interessanterweise
kodieren
Mitglieder
der
Familie
der
Herpesviridae für Fc-bindende Proteine, die Kandidaten für immunevasive Funktionen
darstellen könnten.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen die HCMV-kodierten IgG-Fc-bindenden Proteine
gp34 und gp68, die eindeutig als Bestandteil der äußeren Virushülle nachgewiesen
werden konnten. Damit erfüllen sie die Anforderungen potentieller Inhibitoren der
antiviralen IgG-Antikörperantwort gegen freie Virionen, wie neutralisierende IgGAntikörper und Komplement-vermittelte Virolyse. Prototyp eines solchen Inhibitors ist
der HSV-1-kodierte FcγR gE, der mittels eines sogenannten antibody bipolar bridgingMechanismus agiert. Entgegen der Ausgangshypothesen wurde weder für gp34 noch für
gp68 in vitro ein hemmender proviraler Effekt auf IgG-abhängige Neutralisation und
Virolyse beobachtet. Diese Befunde sind unabhängig von den verwendeten HCMVStämmen und von Antikörperpräparationen bzw. der Antikörperkonzentration. In
unserem Labor wurde jedoch gezeigt, dass sowohl gp34 als auch gp68 selektiv die IgGAntikörper-abhängige Aktivierung zellulärer Fcγ-Rezeptoren inhibieren.
Um die Frage zu beantworten, wie die vFcγ-Rezeptoren die zellulären Fcγ-Rezeptoren
beeinflussen wurden vergleichende Studien durchgeführt. Der Befund biochemischer
Analysen, dass die hoch affine IgG-Fc-Bindung von gp34 und gp68 unabhängig von der
N-Glykosylierung des Liganden ist war ein erster Hinweis auf sich unterscheidende
Interaktionsmechanismen zwischen den zellulären und den viralen Fcγ-Rezeptoren.
Mithilfe eines mutierten Fc-Fragmentes innerhalb der CH2-CH3-Domäne konnte für gp68
1
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ZUSAMMENFASSUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
eindeutig eine mit HSV-1 gE überlappende Bindestelle in dieser Region identifiziert
werden. Die Herstellung von Verkürzungsmutanten der HCMV-kodierten FcγRezeptoren erlaubte die detaillierte Analyse der für die Fc-Bindung essentiellen
Molekülbereiche. Die für die Ligandenbindung erforderlichen Aminosäuren 71-292 von
gp68
binden
Fc
in
einer
2:1
Stöchiometrie,
wobei
die
intrinsischen
N-
Glykosylierungsstellen, nicht aber die intensive O-Glykosylierung des vFcγR essentiell
sind. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass gp34 sowohl auf infizierten
Zellen als auch als Bestandteil des Viruspartikels kovalente Homooligomere formt. Die
systematische Konstruktion von gp34-Cysteinpunktmutanten auf Basis der für die
Bindung notwendigen Aminosäuren 24-140 lässt vermuten, dass die Oligomerisierung
Voraussetzung für die Fc-Bindung ist. Im Gegensatz zu gp68 scheint der Mechanismus der
Fc-Bindung von gp34 einzigartig unter den bekannten Fcγ-Rezeptoren zu sein. Diese
Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass trotz redundanter Expression HCMVkodierter Fcγ-Rezeptoren der Bindungs- und Wirkungsmechanismus selektiv ist.
2
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯SUMMARY⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
SUMMARY
Neutralizing IgGs play a key role in diminishing virus infectivity by binding glycoproteins
on the virion and thereby inhibiting the entry into host cells. Additionally, IgG-bound
virus particles may be inactivated by virolysis through the activation of the complement
cascade. Surface receptors specific for the Fc domain of IgG, i.e. CD16, CD32 and CD64,
represent a family of host receptors, connecting humoral and cellular immune responses.
It has been found that also members of the virus family herpesviridae code for proteins
with Fc binding properties, implying functions that could intervene with antibodydependent effector functions.
The HCMV-encoded Fc-binding proteins gp34 and gp68 comprise the main focus of this
thesis. The presence of HCMV-encoded FcγRs gp34 and gp68 on the virion membrane
raised the question whether they are able to inhibit virus specific neutralising IgG and
complement-mediated virolysis. The prototypic HSV-1-encoded FcγR gE was described to
affect HSV-1 neutralisation and virolysis by a mechanism referred to as „antibody bipolar
bridging“. Despite extensive analysis, there were no implications found that gp34 or gp68
interfere with neutralising IgG or virolysis in vitro, independent of the antibody
preparation or concentration and the HCMV strains that were used. However, our lab
could demonstrate that both viral FcγRs expressed on infected cells selectively inhibit the
IgG-dependent activation of the different host Fcγ receptors.
To elucidate how the vFcγRs inhibit their host counterparts, comparative binding studies
were performed. Biochemical analysis showed that in contrast to CD16, CD32 and CD64,
IgG-Fc recognition by gp34 and gp68 occurs independently of N-linked glycosylation of
IgG, which points to a different binding mechanism among host and viral Fcγ receptors.
Furthermore, by taking advantage of an Fc fragment mutated within the CH2-CH3
interface, overlapping binding regions of the HSV-1 gE and gp68 were identified. To gain
further insight into the interaction with Fc, truncation mutants of gp34 and gp68 were
constructed and analysed for their Fc binding capability. For gp68 the amino acids 71-292
including the N-glycosylation sites are strictly required for Fc binding in a 2:1
stoichiometry. Interestingly, gp34 forms covalently linked homo-oligomers in infected
3
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯SUMMARY⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
cells and on the virion surface. Based on the minimal binding domain comprising the
amino acids 24-140 of gp34, the analysis of targeted cysteine exchange mutants revealed
that oligomer formation by gp34 is absolutely required for Fc binding. In contrast to gp68,
the Fc binding characteristics of gp34 appears to be unique among the known FcγRs.
These findings allow us to postulate that even if the HCMV-encoded FcγRs are
redundantly expressed the mechanistic details and binding properties are selective.
4
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
1
EINLEITUNG
Viren sind hoch spezialisierte obligat intrazelluläre Parasiten, die für die eigene
Vermehrung die zelluläre Maschinerie ihres Wirtes benötigen. Verfolgt man dabei den
Infektionsverlauf verschiedener Viren, lassen sich zwei prototypische Strategien
differenzieren. Auf der einen Seite existieren Viren, die nach einer so genannten hit and
run-Strategie ihren Wirt epidemisch infizieren und ihn dabei stark schädigen oder töten.
Es handelt sich hierbei oft um Viren, die sich noch nicht perfekt an ihren Wirt adaptiert
haben, stark zytopathisch sind und demzufolge während der Infektion zu Zell- und
Gewebsschäden führen. Ursächlich hierfür kann unter anderem das erst kürzliche
Überwinden einer Speziesgrenze sein, wie zum Beispiel der Artensprung des Ebola Virus
(EBOV) von der Fledermaus auf den Menschen, wobei hier der Affe wahrscheinlich als
zusätzlicher Zwischenwirt auftreten kann (Zampieri et al., 2007). Ein weiterer Grund
kann die Entstehung neuer Virusvarianten durch die Veränderung antigener
Eigenschaften bestimmter Oberflächenproteine (antigenic shift) sein, wie es zum Beispiel
bei Influenza Viren vorkommt. Auf der anderen Seite findet man Viren, die sich über
Jahrmillionen der Koevolution nahezu perfekt an ihren Wirt angepasst haben und in
diesem lebenslang persistieren, ohne ihn akut oder dauerhaft stärker zu beeinträchtigen.
Das prominenteste Beispiel dieser ausbalancierten so genannten infect and persistStrategie ist die Familie der Herpesviren.
1.1
Herpesviren
Die Bezeichnung Herpes (gr. herpein, kriechen) erlangte die Virusfamilie aufgrund der
kriechenden Ausbreitung der durch Herpes simplex verursachten Hautläsionen.
Herpesviren zeichnen sich durch ihre strikte Wirtsspezifität aus und sind in der Lage,
lebenslang in ihrem Wirt - vorwiegend im Zustand der Latenz - zu persistieren
(Chatterjee & Harrison, 2001). Alle Herpesviren besitzen eine vergleichbare Morphologie
mit einem ungewöhnlich großen doppelsträngigen DNA Genom und konnten bei den
verschiedensten Wirbeltieren nachgewiesen werden. Bis heute sind acht Vertreter
humaner Herpesviren beschrieben, die sich in die folgenden drei Unterfamilien gliedern:
Alpha-, Beta- und Gammaherpesvirinae (α-, β- und γ-Herpesviren) (Chatterjee &
5
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Harrison, 2001, Whitley, 2001). Die Taxonomie dieser Viren beruht auf Unterschieden in
Pathogenität, Zelltropismus und Virusgenetik. Das Herpes simplex Virus Typ 1 und Typ 2
(HSV-1, HSV-2 bzw. Humanes Herpesvirus 1 und 2, HHV-1, HHV-2) und das Varicella
zoster Virus (VZV, HHV-3) gehören zu den α-Herpesviren, bei denen ein breites
Spektrum der Wirtszellen in vitro, eine vergleichsweise kurze Replikationszeit und eine
latente Infektion in sensorischen Ganglien typisch ist (Cook et al., 1991). Das humane
Cytomegalovirus (HCMV, HHV-5) und die humanen Herpesviren 6 und 7 (HHV-6,
HHV-7) sind Vertreter der β-Herpesviren, bei denen ein langer Replikationszyklus und
eine strikte Wirtsspezifität charakteristisch sind. Zu den lymphotropen γ-Herpesviren
gehören das Epstein-Bar-Virus (EBV, HHV-4) und das Kaposi Sarcom assoziierte
Herpesvirus (KSHV, HHV-8).
1.2
Das humane Cytomegalovirus (HCMV)
Cytomegaloviren sind die prototypischen Vertreter der β-Herpesviren. Für das Genus
namensgebend sind vergrößerte Zellen mit riesenhaftem Zellkern, der für die Infektion
typische intranukleäre Einschlüsse aufweist. Nach ihrem histologischen Erscheinungsbild
werden HCMV-infizierte Zellen auch als Eulenaugenzellen bezeichnet (Abb. 1.1).
Abb. 1.1: HCMV-infizierte Eulenaugenzellen. Hämatoxylin/Eosin-gefärbte Fibroblastenzellen einer HCMV
infizierten Lunge (D. Wiedbrauk, Michigan, USA)
Aufgrund des für Herpesviren typischen Tropismus wurde HCMV ursprünglich als
salivary gland virus (Speicheldrüsenvirus) bezeichnet (Chatterjee & Harrison, 2001).
Cytomegaloviren sind stark an ihren Wirt adaptiert (Ho, 1990) und führen bei gesunden
Personen zu milden Infektionsverläufen, wohingegen es bei immuninkompetenten
6
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Personen zu fatalen Krankheitsverläufen kommen kann. Charakteristisch für HCMV ist
seine lebenslange Persistenz im Wirtsorganismus, wobei während der langen Phasen der
Latenz das virale Genom als extrachromosomales Episom mit minimalster Genexpression
in CD34+ hämatopoetischen Stammzellen vorliegt (Maciejewski et al., 1992, Minton et al.,
1994). Virale Partikel sind erst nach Reaktivierung der produktiven Infektion
nachweisbar (Roizman & Knipe, 2001).
1.2.1 Medizinische Bedeutung und Epidemiologie
Die weltweite Prävalenz von HCMV-spezifischen Antikörpern schwankt zwischen 40
und 100%, je nach geografischer Lage und dem sozioökonomischen Status der
untersuchten Bevölkerung (Britt & Alford, 1996). So findet man in der erwachsenen
Bevölkerung Deutschlands einen Anteil von ca. 50% HCMV-Infizierten, während in
Ländern der Dritten Welt die Infektionsrate bei bis zu 100% liegt. HCMV ist für pränatale
(diaplazentar; über die Gebärmutter) und perinatale (während der Geburt) Infektionen
über die Mutter bekannt, was zu starken Schädigungen des Embryos bzw. Neugeborenen
führen kann (Weller & Hanshaw, 1962). Die Transmissionsrate auf das Kind liegt im
Rahmen einer Primärinfektion der Schwangeren zwischen 30-50%. In Abhängigkeit von
der Bevölkerungsgruppe erleiden bis zu 0,1% der Neugeborenen durch kongenitale
HCMV-Infektionen bedingte Schädigungen. Sie gehen einher mit einem komplexen
Krankheitsbild (Cytomegalovirus inclusion disease), das Missbildungen des zentralen
Nervensystems (Microcephalie, Chorioretinitis), Hepatosplenomegalie und Hörschäden
einschließt. Spätschäden wie Schwerhörigkeit und Sprachstörungen findet man bei 1015% der infizierten Neugeborenen (Trincado & Rawlinson, 2001). Der meist
asymptomatische Verlauf der HCMV-Infektion bei immunkompetenten Personen steht in
einem deutlichen Gegensatz zum schwerwiegenden bis tödlichen Krankheitsverlauf bei
immunsupprimierten Personen (Transplantatempfänger, AIDS-Patienten, Krebspatienten
unter Strahlen- oder Chemotherapie) durch Hepatitis, Meningitis, Myokarditis,
Chorioretinitis, Colonulcerationen und Arthritis. Interstitielle HCMV-Pneumonien
stellen besonders bei Knochenmarktransplantatempfängern die häufigste Todesursache
dar (Enright et al., 1993). HCMV kann durch Speichel, Zervixsekret, Muttermilch,
7
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Samenflüssigkeit und Blut, aber auch durch Transplantate übertragen werden (Chatterjee
& Harrison, 2001).
Im Zuge der Primärinfektion repliziert das Virus zuerst in Epithelzellen des
Gastrointestinal- oder Genitaltraktes, breitet sich von dort hämatogen und auch
zellgebunden über das Gefäßendothel aus und gelangt schließlich vor allem in Niere,
Nebenniere, Lunge und Leber. Virale DNA ist außerdem in Myokard, Milz und
Knochenmark nachweisbar. Nachdem das Immunsystem die Primärinfektion im
immunkompetenten Wirt kontrolliert, tritt eine lebenslange virale Latenz ein. Es kann
dann sporadisch zur Reaktivierung der Virusvermehrung und Ausscheidung freier
Virionen mit der potentiellen Übertragung auf andere Personen kommen. Eine sterile
Immunität wird bei HCMV folglich nicht erreicht. Obwohl schon seit vielen Jahren
angestrebt, existiert bis heute keine sichere und effektive Impfung gegen HCMV. Dabei
wurden verschiedene Vakzinationsstrategien verfolgt, wie die Gabe attenuierter HCMVStämme, rekombinanter HCMV-Proteine oder Plasmid-DNA, die für virale Antigene
kodiert (Gonczol & Plotkin, 2001). Bei der Behandlung immunsupprimierter Patienten
werden heutzutage vier verschiedene Virostatika eingesetzt: Ganciclovir, Foscarnet,
Valganciclovir und Cidofovir, die aber sowohl toxische Nebenwirkungen besitzen als
auch die Entstehung resistenter HCMV-Stämme nach sich ziehen können (Legendre,
2000).
Im Maustiermodel konnte gezeigt werden, dass Antikörper, die gegen das murine
Cytomegalovirus (MCMV) gerichtet sind einen protektiven Effekt während der
Reaktivierung, nicht aber während der Primärinfektion haben (Jonjic et al., 1994). Die
Gabe von hochdosierten und aufgereinigten IgG-Präparationen mehrerer tausend Spender
(IVIG; intravenous immunoglobulin) zur antiviralen Therapie zeigte einen starken
prophylaktischen Effekt bei kongenitaler HCMV-Infektion, sowie einen moderaten
Schutz bei Organtransplantationspatienten (Boeckh et al., 2004, Sulowicz et al., 1998).
Durch die Applikation von IVIG konnte die Übertragung von HCMV nach
Primärinfektion während der Schwangerschaft von 50% auf 3% der Neugeborenen
reduziert werden (Nigro et al., 2005).
8
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
1.2.2 Virionstruktur und Genomorganisation
Alle Herpesviren zeigen eine vergleichbare Morphologie. Infektiöse HCMV-Partikel sind
membranumhüllt und besitzen einen Durchmesser von 150 bis 200 nm. Sie weisen ein
ungewöhnlich großes doppelsträngiges lineares DNA Genom (135-235 kbp) auf, das sich
innerhalb eines ca. 100 nm umfassenden ikosaedrischen Kapsids befindet (Abb. 1.2).
Abb. 1.2: Aufbau eines Herpesvirus. Elektronenmikroskopische Aufnahme eines HSV-1 Partikels (von
Lynda M. Stannard, Department of Medical Microbiology, Cape Town University, Cape Town, South
Africa)
Das Kapsid umgebende Tegument ist eine elektronenmikroskopisch amorph erscheinende
Phosphoproteinmatrix (Chatterjee & Harrison, 2001, Mocarski & Courcelle, 2001,
Whitley, 2001), umschlossen von der Hüllmembran, in die virale Glykoproteine
eingelagert sind. Die Hüllmembran selber leitet sich von Membranen der Wirtzelle ab. Bis
jetzt sind acht virale Glykoproteine identifiziert worden, die in die äußere Virushülle
eingelagert sind und so den Eintritt in die permissive Wirtszelle vermitteln: gB (UL55),
gM (UL100), gH (UL75), gL (UL115), gO (UL74), gN (UL73), gp48 (UL4) und UL33
(Mocarski & Courcelle, 2001).
Cytomegaloviren besitzen aufgrund ihres großen Genoms eine hohe Kodierungskapazität.
Mit etwa 200 offenen Leserahmen (open reading frames, ORFs) stellt die DNA des
humanen Cytomegalovirus (HCMV) das größte Virus bei Säugern dar (Chee et al., 1990,
Davison et al., 2003). Das Genom der Cytomegaloviren setzt sich aus einmalig
vorkommenden (unique long, UL- Region und unique short, US-Region) und sich
9
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
wiederholenden Sequenzabschnitten zusammen. Nach ihrer Lage im linearen HCMVGenom bezeichnet man Letztere entweder als terminal repeat (TR) oder als internal
repeat
(IR).
Je
nachdem,
welche
der
beiden
unique-Regionen
von
den
Sequenzwiederholungen flankiert werden, unterteilt man sie in TRL und IRL bzw. TRS
und IRS. Da es sich hierbei um inverted repeats handelt, besteht die Möglichkeit der
intramolekularen Rekombination des Genoms, so dass vier isomere Stränge mit gleicher
Häufigkeit entstehen können. Klinische HCMV Isolate haben im Gegensatz zu extensiv
passagierten Laborstämmen zusätzliche 21 ORFs (UL133-154) anstelle einer Duplikation
der RL- bzw. der RS-Regionen in Letztgenannten (Cha et al., 1996). Aus der
beschriebenen Struktur leitet sich auch die genetische Nomenklatur ab: Gene in der ULRegion werden beispielsweise sequentiell mit der Abkürzung UL bezeichnet.
1.3
Immunglobuline und ihre Rezeptoren
Eukaryotische Zellen sind in der Lage, Pathogene wie zum Beispiel Viren zu erkennen
und Abwehrmechanismen zu aktivieren, die die Infektion durch eine rasche Reaktion im
Organismus lokal eingrenzen und nicht infizierte Zellen vor einer Infektion schützen. Die
Reaktion des Immunsystems auf den Eintritt von Pathogenen ist kaskadenartig
organisiert. Die ersten Abwehrschritte erfolgen schnell und sind relativ unspezifisch; sie
stellen die unmittelbare Antwort des Immunsystems dar. Das angeborene Immunsystem
spielt dabei die entscheidende Rolle, denn durch konstitutiv exprimierte sowohl intra- als
auch extrazelluläre Rezeptoren, die als Sensoren fungieren, werden konservierte
pathogene Strukturen erkannt (Akira, 2001). Die Spezifität der Immunantwort höherer
Vertebraten (Wirbeltiere) nimmt mit Verlauf der Infektion zu, wenn es vermittelt durch
antigenpräsentierende Zellen zur pathogenspezifischen Antikörperproduktion durch BLymphozyten des Wirtes und zur Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses
kommt (adaptives bzw. erworbenes Immunsystem). Zirkulierende Antikörper können
direkt oder mithilfe von Rezeptor- und Komplementinteraktionen ihre antivirale
Wirkung entfalten und die Infektion zum Erliegen bringen (Woof & Burton, 2004).
10
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
1.3.1 Immunglobuline
Als Antwort auf eine Virusinfektion werden von B-Lymphozyten des Immunsystems
Antikörper produziert, die virale Proteine als fremd erkennen. Beim Menschen existieren
fünf verschiedene Antikörperklassen, Immunglobulin A (IgA), D (IgD), E (IgE), G (IgG)
und M (IgM), die sich hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität, ihres Wirkungsortes,
ihrer Struktur und des Zeitpunktes ihrer Produktion nach erfolgter Infektion
unterscheiden. Allen gemeinsam ist eine Y-förmige Grundstruktur, bestehend aus zwei
identischen schweren und leichten Ketten (Abb. 1.3), wobei dieses strukturelle Modul im
IgM als Pentamer und im IgA als Dimer kovalent gekoppelt auftritt. Die spezifische
Antigenerkennung erfolgt bivalent über die beiden variablen Bereiche (V-Regionen) in
der so genannten Fab-Region (fragment antigen binding, Antigen-bindendes Fragment).
Der Fc-Teil (fragment crystallizable, kristallisierbares Fragment) eines Antikörpers
hingegen ist in seiner Aminosäuresequenz innerhalb einer Klasse hoch konserviert (CRegionen). Beide Domänen verbindet eine flexible und in ihrer Länge variierende so
genannte hinge (Gelenk)-Region. Die globulären Subdomänen (CH, CL, VH und VL) des
Antikörpers machen ihn zu einem Mitglied der IgSF (immunoglobulin superfamily)Familie. Ihre Immunglobulinstruktur aus gestapelten β-Strängen wurde durch
Röntgenstrukturanalysen bestimmt (Abb. 1.3). Herausragendes Domänenmerkmal ist ein
in der Position konserviertes Cysteinpaar, das die strukturgebende intramolekulare
Disulfidbrücke formt. Innerhalb der CH2-Domäne des Fc-Teils existiert eine NGlykosylierungsstelle am Asparagin297 (Abb. 1.3), die zu einer so genannten geöffneten
Konformation des Moleküls beiträgt und Voraussetzung für Rezeptorinteraktionen ist
(Krapp et al., 2003, Shields et al., 2001).
11
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Antigen-Bindestelle
VH
Fab
CH1
VL
CL
hinge
CH 2
Fc
Glykosylierung
interdomain hinge
CH 3
Abb. 1.3: Aufbau eines IgG-Moleküls. In dunkelgrau: leichte Kette (light chain), in hellgrau: schwere Kette
(heavy chain), in rot: N- Glykosylierung, Fab: Fab-Region, Fc: Fc-Region, C: konstant, V: variabel,
H: schwer (heavy), L: leicht (light) (Struktur nach Koordinatensatz 1HZH.pdb mit MacPyMol von Sander
Smits, Biochemie, HHU, Düsseldorf)
Als erstes Immunglobulin nach Infektion wird der nieder affine, aber als Pentamer hoch
avide (Avidität: Kraft der multivalenten Bindung zwischen Antigen und Antikörper) IgMAntikörper produziert, gefolgt von hoch affinem IgG und IgA, wobei Letzteres als
sekretorischer IgA-Antikörper (sIgA) in Speichel und Muttermilch zu finden ist. Im
Serum
stellen
zirkulierende
IgG-Moleküle
mit
ca.
75%
die
dominierende
Immunglobulinklasse dar. Sie lassen sich in die vier Subklassen IgG1-4 unterteilen, die
unterschiedliche biologische Eigenschaften und Halbwertszeiten haben.
1.3.2 Fc-Rezeptoren
Die Schnittstelle zwischen der humoralen Antikörperantwort und der zellulären
Immunantwort wird durch die Interaktion von Immunglobulinen mit spezifischen
zellständigen Rezeptoren gebildet. Alle fünf Antikörperklassen besitzen spezifische
Rezeptoren, die jeweils an der Fc-Domäne binden und dadurch verschiedene
Effektorfunktionen auslösen können, wie z.B. die Antikörper-abhängige Zytolyse
(Ravetch & Kinet, 1991). Sie werden auf der Oberfläche verschiedener Leukozyten
exprimiert: FcαR (CD89) bindet IgA und sIgA (Monteiro et al., 1990); der FcεR (CD23)
auf Mastzellen bindet hoch affin IgE und spielt eine bedeutende Rolle in der Freisetzung
von Immunmediatoren (Gould & Sutton, 2008). Über den IgM-bindenden FcμR und den
12
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
IgD-bindenden FcδR ist bis jetzt nur wenig bekannt. Sie werden mit einer Regulation der
Antikörperproduktion und der Unterstützung bei B-Zell-Aktivierung in Zusammenhang
gebracht.
1.3.3 Fcγ-Rezeptoren
Die IgG-spezifischen Rezeptoren (FcγR) des Menschen lassen sich in drei Klassen
unterteilen, die wiederum teilweise aus mehreren Isoformen bestehen (Abb. 1.4).
FcγRΙ (CD64) bindet mit hoher Affinität (KD: 108-9 M-1) (Miller et al., 1996)
subklassenspezifisch monomeres IgG (IgG1=IgG3>IgG4>>IgG2) (Canfield & Morrison,
1991, Hulett & Hogarth, 1994) und wird hauptsächlich auf Monozyten und Makrophagen,
in geringen Mengen auch auf eosinophilen Zellen exprimiert. Die hohe Affinität zu
monomerem IgG resultiert unter physiologischen Bedingungen im Serum in der
Absättigung der IgG-Bindungskapazität von CD64 (Ravetch, 1997). Obwohl die Funktion
des CD64 noch nicht in seiner Gänze verstanden ist, konnte gezeigt werden, dass dieser
Rezeptor eine aktivierende Rolle in der Antikörper-abhängigen Zytolyse (ADCC,
antibody-dependent cellular cytolysis), Phagozytose und Cytokinproduktion ausübt (van
Vugt et al., 1998).
FcγRΙΙ (CD32) bindet mit mikromolarer Affinität monomeres IgG (IgG3>IgG1), besitzt
aber hohe Avidität für Immunkomplexe bestehend aus IgG und Antigen (Hulett &
Hogarth, 1994). Die Bindung an monomeres IgG2 ist abhängig vom CD32 Genotyp und
bedarf eines Histidins an Position 131. CD32 wird auf den meisten Leukozyten exprimiert
und stellt neben den aktivierenden Isoformen CD32A und CD32C mit CD32B den
einzigen beschriebenen inhibitorischen Rezeptor dar, der unter den Fcγ-Rezeptoren ein
mit Ausnahme von Natürliche Killerzellen (NK) und T-Zellen extrem breites
Expressionsspektrum hat (Nimmerjahn & Ravetch, 2008). Die Stimulation der
aktivatorischen Isoformen führt zu Phagozytose, Cytokin- und Superoxidproduktion und
zu ADCC. CD32B spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Aktivität von B-Zellen
und der Antikörperproduktion von B-Plasmazellen (Ono et al., 1996, Xiang et al., 2007),
bei der Regulierung der DC-Reifung (Dhodapkar & Dhodapkar, 2005) und der
Makrophagenfunktion (Bruhns et al., 2003).
13
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
FcγRΙΙΙ (CD16) verhält sich hinsichtlich der Bindungsaffinität ähnlich CD32, da beide nur
hoch affin Immunaggregate binden (Ghirlando et al., 1995). Die Isoform CD16A wird
hauptsächlich auf NK-Zellen und Makrophagen exprimiert und bindet mit mittlerer
Affinität IgG1 und IgG3 und als Allotyp mit einem Valin an Position 158 auch IgG4 (van
der Pol & van de Winkel, 1998). CD16B hat generell eine schwache Affinität zu IgG und
kommt auf PMN (Polymorphonuclear leukocytes, polymorphkernige Leukozyten) vor.
Die CD16 Isoformen haben ein breites Spektrum an Funktionen wie die Vermittlung von
Superoxidproduktion, Phagozytose, Degranulierung und ADCC (van Vugt & van den
Winkel, 2001).
humane Fcγ-Rezeptoren
aktivierend
inhibierend
Struktur:
Name:
FcγRI
(CD64)
FcγRIIA
(CD32A)
Affinität:
hoch
schwach schwach
bis mittel bis mittel
FcγRIIC
(CD32C)
FcγRIIIA
(CD16A)
FcγRIIIB
(CD16B)
FcγRIIB
(CD32B)
schwach
bis mittel
schwach
bis mittel
schwach
bis mittel
Abb. 1.4: Zelluläre Fcγ-Rezeptoren. Bild verändert nach (Nimmerjahn & Ravetch, 2008)
Die
Struktur
der
zellulären
Fcγ-Rezeptoren
ist
durch
Kristallisations-
und
Mutationsanalysen gut charakterisiert (Maxwell et al., 1999, Radaev et al., 2001,
Sondermann et al., 1999, Sondermann et al., 2000) und ähnelt sich stark in ihrem Aufbau.
Mit Ausnahme des GPI (Glycosylphosphatidylinositol)-verankerten CD16B sind alle
Rezeptoren Typ Ι Transmembranproteine (Typ I: eine einzelne Transmembrandomäne,
N-Terminus extrazellulär gelegen) und besitzen eine in ihrer Sequenz konservierte,
glykosylierte extrazelluläre Ligandenbindungsregion. Diese besteht bei den nieder affinen
14
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Rezeptoren CD32 und CD16 aus jeweils zwei IgSF-Domänen. Im Gegensatz dazu besitzt
der hoch affine Rezeptor CD64 eine zusätzliche dritte Ig-artige Domäne, die
biochemischen Daten zufolge ursächlich für die nanomolare Ligandenaffinität ist (Allen &
Seed, 1989).
Hinsichtlich ihrer intrazellulären Domäne variieren die drei Rezeptorklassen stark. CD16
und CD64 existieren auf den Leukozyten als heterodimerer Rezeptorkomplex aus einer
Liganden bindenden α-Kette in Assoziation mit so genannten akzessorischen
Untereinheiten, wie γ-, ζ- und β-Ketten, die für die Signalweiterleitung durch
Phosphorylierungskaskaden
nach
Rezeptorquervernetzung
verantwortlich
sind
(Abb. 1.4). CD32 ist als einziger Fcγ-Rezeptor in der Lage, extrazelluläre Stimuli als Folge
der Ligandenbindung direkt mit intrazellulären Signalwegen zu verknüpfen, da er in der
zytoplasmatischen Domäne der α-Kette entweder aktivierende oder inhibitorische
Signalmotive besitzt. Die generelle Signalweiterleitung nach Rezeptorstimulation erfolgt
bei aktivierenden Rezeptoren, mit Ausnahme von CD16B, über die TyrosinPhosphorylierung so genannter intrazellulärer ITAM (immunoreceptor tyrosine-based
activation motif)-Sequenzen, wohingegen die Transduktion inhibitorischer Signale über
die Phosphorylierung intrazellulärer ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition
motif)-Motive realisiert wird (Cambier, 1995, Reth, 1989). Die Signalweiterleitung des
GPI-verankerten CD16B erfolgt wahrscheinlich über die laterale Interaktion mit weiteren
membranständigen Rezeptoren (Fernandes et al., 2006).
Die Initiierung inflammatorischer Prozesse durch Rezeptoren des Immunsystems muss
fein abgestimmt sein. Eine zusätzliche Regulierung der Rezeptoraktivität durch die
selektive Bindung von IgG in Abhängigkeit von der Art der N-Glykosylierung des
Antikörpers wurde von Kaneko Y., Nimmerjahn F. und Mitarbeitern beschrieben
(Kaneko et al., 2006). Im humanen Serum existieren über dreißig verschiedene
Glykosylierungsvarianten des IgG (Nimmerjahn & Ravetch, 2008). Es konnte gezeigt
werden, dass die vollständig prozessierte Form von IgG mit einer endständigen
Neuraminsäure fünf bis zehnmal schwächer von den zellulären Fcγ-Rezeptoren gebunden
werden kann. Eine daraus resultierende anti-inflammatorische Immunantwort wurde im
Mausmodell mit deglykosyliertem IgG im Vergleich zu Glykosyliertem bestätigt. Des
15
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Weiteren
induziert
inhibitorischen
die
zellulären
Anwesenheit
der
Fcγ-Rezeptors
Neuraminidase
CD32B
und
die
damit
Expression
des
gleichzeitig
die
Unterdrückung inflammatorischer Prozesse (Bruhns et al., 2003). Im Serum findet man ca.
5% des vollständig prozessierten IgG (Routier et al., 1998). Im Umkehrschluss wirken die
Glykosylierungsformen des IgG ohne terminale Neuraminsäure Rezeptor-stimulierend
und damit pro-inflammatorisch.
Die Rezeptorstimulation bewirkt ein breites Spektrum von sowohl aktivierenden als auch
inhibitorischen biologischen Prozessen, abhängig vom Rezeptor und der Rezeptortragenden Zelle. Normalerweise kommt es zur simultanen Stimulierung von
inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren. Dadurch muss erst ein bestimmter
Schwellenwert für die Weiterleitung aktivierender Signale erreicht werden. Die Stärke
der ausgelösten Antwort wird auf diese Weise kontrolliert (Nimmerjahn & Ravetch, 2005,
Ravetch & Bolland, 2001).
Der neonatale Fc-Rezeptor (FcRn) stellt unter den zellulären Fcγ-Rezeptoren sowohl
funktionell als auch strukturell eine Ausnahme dar. Er bildet ein heterodimeres Typ I
Transmembranprotein und besitzt eine MHC (major histocompatibility complex)-artige
Domänenstruktur, bestehend aus β2-Mikroglobulin (leichte Kette, light chain) und einer
schweren Kette (heavy chain) (Gastinel et al., 1992, Simister & Mostov, 1989). Der FcRn
unterstützt lediglich das Immunsystem, indem er IgG „wiederverwertet“ und dadurch
dessen Halbwertszeit verlängert (Roopenian & Akilesh, 2007). In FcRn knock out-Mäusen
konnte gezeigt werden, dass die IgG-Menge im Serum auf 20-30% im Vergleich zu
Wildtypmäusen sinkt und sich die IgG-Halbwertszeit von 6-8 Tagen auf 1 Tag verringert
(Roopenian et al., 2003). Die zweite maßgebliche Funktion des FcRn ist namensgebend.
Er ist verantwortlich für den aktiven Transfer von maternalem IgG zum Fetus (Roopenian
& Akilesh, 2007). Die Funktion des IgG-Shuttling durch den FcRn wird durch eine pHsensitive Interaktion des Rezeptors mit den Antikörpern realisiert. Er bindet dabei hoch
affin IgG im sauren Milieu des Darms (pH 6,0), transportiert es nach Endozytose von der
apikalen Membran durch die Endothelzellschicht (Mostov & Simister, 1985) und entlässt
es unter den physiologischen pH-Bedingungen des Blutstroms auf ihrer basolateralen
16
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Seite (pH 7,4) (Raghavan et al., 1993, Rodewald & Kraehenbuhl, 1984). Der FcRn hat
keine Subklassenspezifität und bindet mit vergleichbarer Affinität IgG1-IgG4.
Das Molekül TRIM21 (tripartite motif-containing 21) wurde erst kürzlich als neues
zelluläres Fc-bindendes Protein beschrieben (Rhodes & Trowsdale, 2007). TRIM21 ist im
Gegensatz zu den bereits bekannten Rezeptoren kein membranständiges Molekül,
sondern kommt ausschließlich zytoplasmatisch vor und ist teilweise an das
Endoplasmatische Retikulum (ER) assoziiert (Takahata et al., 2008). Es bindet mit
vergleichbaren nanomolaren Bindungsaffinitäten die Subklassen IgG1, IgG2 und IgG4.
Die biologische Relevanz dieses Rezeptors ist noch nicht bekannt. TRIM21 besitzt
zusätzlich zur Fc-Bindungseigenschaft eine E3-Ubiquitinligase-Aktivität für die schwere
Kette der IgG1 Subklasse (Takahata et al., 2008). Eine hypothetische Funktion ist die
Qualitätskontrolle für IgG in B-Zellen oder Plasmazellen, indem es ungefaltetes IgG nach
dessen retrograden Transport aus dem ER in das Zytoplasma bindet und seinen Ubiquitinabhängigen proteasomalen Abbau via des ER-assoziierten Degradierungsweges (ERAD)
initiiert. Eine ERAD-abhängige Degradierung ist bereits für die schwere Kette des IgM
des B-Zellrezeptors während der B-Zelldifferenzierung beschrieben worden (Drake et al.,
2006).
1.4
Antikörper-vermittelte Kontrolle von Virusinfektionen
Eine Virusinfektion löst ein breites Spektrum an Antikörper-vermittelten antiviralen
Immunantworten aus. Dabei spielen Antikörper produzierende B-Zellen eine zentrale
Rolle. Sie produzieren als eine erste humorale Antwort schützende, nicht Antigenspezifische, so genannte „natürliche“ Antikörper (IgM), die die Virusausbreitung durch
die direkte Bindung von Virionen, die Aktivierung des Komplementsystems und die
Aktivierung der adaptiven Immunantwort eindämmen (Dorner & Radbruch, 2007,
Hangartner et al., 2006). In einem zweiten Schritt erfolgt die Sekretion von
antigenspezifischen hoch affinen Antikörpern (IgG) durch langlebige Plasmazellen
(humorales Gedächtnis). Die dritte Stufe der antiviralen Antikörperantwort ist die
Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses durch reaktive memory (Gedächtnis)
17
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
B-Zellen, die einen raschen und antigenspezifischen Schutz nach einer Reinfektion
ermöglichen, indem sie rasch zu IgG-produzierenden Plasmazellen differenzieren.
Nach spezifischer Antigenerkennung über den variablen Teil werden antipathogene
Effektorfunktionen
durch
die
konservierte
Fc-Domäne
der
verschiedenen
Antikörperklassen vermittelt. Sie können in zwei große Gruppen unterteilt werden
(Parren & Burton, 2001). Zunächst kann das Virus direkt als freies Virion durch eine
Reihe von Mechanismen an der Infektion von Zielzellen gehindert werden:
1. Neutralisation: die Antikörperbindung an virale Oberflächenproteine, die mit
zellulären Eintritts-vermittelnden Rezeptoren interagieren, verhindert die Infektion
von Zielzellen.
2. Komplement-vermittelte Virolyse: die Initiierung des klassischen Komplementweges
führt direkt zur Zerstörung des Viruspartikels durch dessen Lyse.
3. Virusaggregation: die Vernetzung der Viruspartikel blockiert die Interaktion des Virus
mit Zelleintrittsrezeptoren bzw. das Entpacken des viralen Kapsids, es wird also
indirekt durch Aggregation neutralisiert.
4. Fc-vermittelte Phagozytose von Immunkomplexen: die Interaktion von Antikörpern
mit dem Viruspartikel führt zur Rekrutierung Fc-Rezeptor-tragender Immunzellen
(Opsonisierung), die daraufhin solche Immunkomplexe phagozytieren, prozessieren
und die darin enthaltenen Antigene präsentieren.
Darüber hinaus werden Antikörper-vermittelt infizierte Zellen an der Virusvermehrung
und Virusausbreitung gehindert durch:
1. Komplement-vermittelte
Zytolyse:
die
Aktivierung
der
klassischen
Komplementkaskade führt zur Lyse der infizierten Zelle.
2. Antikörper-abhängige Zytolyse (ADCC): durch die Aktivierung Fc-Rezeptortragender Immunzellen kommt es zur Lyse infizierter Zellen.
1.4.1 Virusneutralisation und Komplement-vermittelte Virolyse
Die Mehrheit der im Verlauf einer Virusinfektion produzierten Antikörper gehört nicht
zur Gruppe neutralisierender Antikörper und hat keine direkte antivirale Wirkung
18
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
(Hangartner et al., 2006). Letztere erkennen und neutralisieren für den Viruseintritt in die
Zelle essentielle Strukturen auf der Oberfläche freier Virionen und können diese dadurch
ohne Zuhilfenahme weiterer Komponenten an der erfolgreichen Infektion permissiver
Zellen in vitro hindern (Burton, 2002). Zu den potentiell neutralisierenden
Antikörperklassen gehören IgG, IgM und IgA. Sowohl die extrazellulären (Interaktion mit
der permissiven Zelle) als auch die intrazellulären (post-Eintrittsereignisse) Mechanismen
der Antikörper-vermittelten Virusneutralisation werden kontrovers diskutiert (Burton,
2002, Reading & Dimmock, 2007). Unumstritten ist das erstmals durch Burnet
beschriebene, so genannte occupancy (Besetzungs)-Model, bei dem durch Interaktion
neutralisierender Antikörper mit einer ausreichenden Menge kritischer, am Eintritt
beteiligter viraler Oberflächenstrukturen die Virusanhaftung an die Wirtszelle oder der
Prozess des Zelleintritts (viral entry) in die Zelle gestört wird (Burnet et al., 1937).
Darüber hinaus wurden eine Reihe weiterer Mechanismen postuliert, wie Antikörper ihre
neutralisierende Wirkung entfalten können (Klasse & Sattentau, 2002, Reading &
Dimmock, 2007).
1. Die Aggregation von Viruspartikeln durch neutralisierende Antikörper vermindert
proportional zur Anzahl der aggregierten Viruspartikel die Infektiösität. Die bivalente
Bindungskapazität des Fab-Teils der Antikörper ermöglicht die Vernetzung von zwei
Virionen pro IgG-Molekül; aggregierte und dadurch neutralisierte Partikel werden
zudem aufgrund ihrer Größe leichter phagozytiert und degradiert.
2. Die Inhibition von post-Eintrittsmechanismen durch Veränderung der Eintrittsroute
durch Aufnahme der Antikörper-dekorierten Virionen mittels Fc-Rezeptoren oder das
Blockieren des intrazellulären Entpackens von Viruspartikeln.
Die verschiedenen Mechanismen der Neutralisation variieren in Abhängigkeit von Virus
und Zelltyp. An die Oberfläche von Virionen können aber sowohl neutralisierende als
auch nicht neutralisierende Antikörper binden und antivirale Eigenschaften haben (Abb.
1.5) (Burton et al., 2001).
19
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Virus
nAk
Neutralisation
Schutz der Zelle
vor Virusinfektion
nonnAk
Komplement-vermittelte
Virolyse und Phagozytose
Abb. 1.5: Mechanismen der direkten und indirekten Neutralisation freier Virionen. Neutralisierende (nAk)
und nicht neutralisierende Antikörper (non-nAk) erkennen verschiedene Epitope auf der Virusoberfläche
und führen durch Neutralisation bzw. Komplement-vermittelte Virolyse und Phagozytose zum Schutz der
permissiven Zelle vor Infektion. Bild verändert nach (Burton, 2002)
Die
schützende
Eigenschaft
neutralisierender
Antikörper
vor
Infektionen
ist
unumstritten, ihre Kapazität in vivo variiert allerdings stark in Abhängigkeit des
jeweiligen viralen Erregers. In Tierversuchsmodellen mit einem chimären SIV (simian
immunodeficiency virus) konnte gezeigt werden, dass ein hoher Neutralisationstiter
(Antikörperverdünnung, die zu 50% Virusneutralisation in vitro führt) von 1:400 in
einem 90%igen und ein Neutralisationstiter von 1:38 sogar in einem 99%igen Schutz der
Tiere vor Infektion resultiert (Nishimura et al., 2002, Parren et al., 2001). In einer anderen
Studie mit EBOV infizierten Meerschweinchen führten dagegen selbst höchste Titer an
neutralisierenden Antikörpern zu keiner sterilen Immunität, schützten die Tiere aber vor
Erkrankung (Parren et al., 2002). Schlesinger und Chapman konnten zeigen, dass das nach
Entfernung
der
Fc-Domäne
eines
stark
neutralisierenden
Antikörpers
gegen
Gelbfiebervirus verbleibende F(ab)2-Fragment dieselbe Neutralisationskapazität in vitro
besitzt, aber in vivo keinen effektiven Schutz liefert (Schlesinger & Chapman, 1995). Es
liegt nahe, dass in diesen Fällen erst die Zuhilfenahme zusätzlicher Fc-vermittelter
antiviraler Effektormechanismen einen vollständigen Schutz bewirkt (Burton, 2002).
Diese Annahme wird durch Untersuchungen von Hessel et al. an Affen mit einem
chimären
Affen/human
immunodeficiency virus (SHIV) und neutralisierenden
Antikörpern gestützt. Hier konnte gezeigt werden, dass bei einem stark neutralisierenden
Antikörper in vitro und in vivo durch eingefügte Mutationen im Fc-Teil, die die Bindung
20
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
von Komplement oder von zellulären Fcγ-Rezeptoren beinträchtigen, die antivirale
Kapazität von 100% auf 55% sinkt (Hessell et al., 2007).
1.5
Immunevasion durch Herpesviren
Herpesviren erreichen eine lebenslange Persistenz im Wirtsorganismus ohne Elimination
durch das Immunsystem. Dazu steht den zahlreichen antiviralen Mechanismen von
Wirtszelle und Wirtsorganismus eine nicht minder große Zahl viraler Strategien
gegenüber, die der Unterwanderung der zellulären Abwehr dienen. Dabei kämpfen
Herpesviren erfolgreich an allen Fronten der Immunantwort; sie nutzen oft die Strategie
der „molekularen Piraterie und des molekularen Mimikry“, indem sie wirtseigene
Mechanismen imitieren und proviral zweckentfremden (Hengel et al., 1998). Es können
dabei sowohl die antiviralen Mechanismen der angeborenen als auch der adaptiven
Immunantwort des infizierten Organismus gehemmt werden (Mocarski, 2002). Von der
Effektivität dieser Strategien hängt eine optimale virale Replikation im Einzelorganismus
als Voraussetzung für die erfolgreiche Zirkulation innerhalb der Wirtspopulation ab. Bis
heute ist eine Vielzahl von immunevasionsrelevanten Genen identifiziert worden, die die
Frühphase der Immunantwort wie z.B. die Induktion von Typ I Interferonen und die
Wirkung von Typ II Interferonen hemmen und das Erkennen und die Destruktion
infizierter Zellen durch Natürliche Killerzellen blockieren (Le et al., 2008, Stern-Ginossar
et al., 2007, Zimmermann et al., 2005). Im weiteren Verlauf der Infektion werden
Dendritische Zellen (DC), B- und T-Zellen in ihrer antiviralen Funktion gehemmt sowie
Komplementaktivierung, Apoptose und die antivirale Chemokinantwort inhibiert
(Favoreel et al., 2003, Raftery et al., 2001). Außerdem wird mit der Antigenpräsentation
durch MHC-Moleküle der Klasse I und II interferiert (Momburg & Hengel, 2002).
Antikörper werden zwar nach Herpesvirusinfektion gebildet, sind aber nur eingeschränkt
wirksam im Gegensatz zu ihrer antiviralen Potenz gegenüber anderen Viren wie Polio
(Hovi, 2001) oder Masern (Cutts et al., 1991), wo sie eine Neuinfektion verhindern
können (Budt et al., 2004).
21
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
1.6
Virale Fcγ-Rezeptoren (vFcγR)
Schon vor vielen Jahren konnte gezeigt werden, dass einige Viren, Protozoen und
Bakterien
Moleküle
mit
IgG-bindenden
Eigenschaften
bilden.
Die
Bakterien
Staphylococcus aureus und Streptococcus spec. exprimieren die Fcγ-Rezeptoren Protein A
(Langone, 1982) bzw. Protein G (Christensen et al., 1976). Unter den Protozoen ist für die
Schistosomen ein Fc-bindendes Protein beschrieben worden (Torpier et al., 1979). Beim
Hepatitis C Virus (HCV) wurde das core-Protein als Fc-bindendes Molekül identifiziert
(Maillard et al., 2004) und murine Coronaviren weisen Proteine mit Fc-bindenden
Fähigkeiten auf (Oleszak & Leibowitz, 1990). Die größte Gruppe von Pathogenen mit Fcbindenden Proteinen sind die Herpesviren. Sowohl alle humanen α-Herpesviren (HSV-1,
HSV-2 und das Varicella zoster virus), als auch Vertreter der humanen (HCMV) und
murinen (MCMV) β-Herpesviren exprimieren Moleküle mit Antikörper-bindenden
Eigenschaften auf infizierten Zellen.
1.6.1 CMV-kodierte Fcγ-Rezeptoren
Schon Ende der siebziger Jahre wurde eine Fc-bindende Aktivität auf HCMV-infizierten
Zellen beobachtet (Keller et al., 1976, Sakuma et al., 1977). Die zwei glykosylierten Typ I
Transmembranproteine gp34 und gp68 wurden als die Fc-bindenden, viruskodierten FcγRezeptoren identifiziert (Atalay et al., 2002, Lilley et al., 2001). Durch ein Spleißprodukt
der mRNA UL119-118 wird das FcγR Glykoprotein 68 (gp68; 68 kDa) kodiert, durch die
sequenzhomologen ORFs IRL11/TRL11 wird das Glykoprotein 34 (gp34; 34 kDa)
exprimiert. Alle drei Gene sind für die Virusreplikation in vitro nicht essentiell und
werden unabhängig voneinander mit einer early-late-Kinetik exprimiert. Bereits 24 h
nach Infektion (h p.i.; hours post infection) sind gp34 und gp68 in infizierten Zellen
nachweisbar und erreichen ihr maximales Expressionsniveau 72 h p.i., eigene
Beobachtungen). Das Vorkommen der vFcγ-Rezeptoren wurde nicht nur an der
Oberfläche infizierter Zellen beschrieben (Atalay et al., 2002), sondern auch intrazellulär
ist eine starke Fc-Bindung von infizierten Zellen mittels FACS-Analyse nachweisbar
(Eugenia Corrales-Aguilar, Henrike Reinhard, unveröffentlichte Beobachtung). Weiterhin
22
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
wurde beschrieben, dass Fc-bindende Proteine Bestandteil des Virion-Teguments sind
(Stannard & Hardie, 1991).
Die extrazelluläre Fc-bindende Domäne der vFcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 weist im
Vergleich zu den zellulären Fcγ-Rezeptoren CD64 bzw. CD32 lediglich eine geringe
Sequenzhomologie auf. Dennoch wurde aufgrund konservierter Aminosäurepositionen
für beide Proteine eine IgSF-artige Struktur ähnlich der zellulären FcγRs vorausgesagt
(Atalay et al., 2002). Beide Rezeptoren werden N-glykosyliert, wobei gp68 zwölf und gp34
drei potentielle Glykosylierungsstellen aufweist. Für gp68 existieren außerdem im
Bereich
der
Aminosäuren
26-66
der
Ektodomäne
zahlreiche
vermutete
O-
Glykosylierungsstellen (Sprague et al., 2008). Die vFcγ-Rezeptoren binden die Fc-Domäne
humaner, monomerer IgG-Moleküle aller vier Subklassen mit vergleichbarer Affinität.
Zusätzlich interagiert gp34 ähnlich stark mit Kaninchen IgG und sehr schwach mit
Ratten- und Maus-IgG (Atalay et al., 2002), eigene Beobachtung).
Auf der Oberfläche MCMV-infizierter Zellen wurde das Genprodukt des ORF m138 als
Rezeptor mit Fc-bindenden Eigenschaften identifiziert (Lenac et al., 2006). Der MCMVkodierte vFcγR m138/fcr-1 (im weiteren Verlauf als m138 bezeichnet) ist ein hoch
glykosyliertes Typ I Transmembranprotein und kommt in infizierten Fibroblasten early-
late in einer niederglykosylierten (86-88 kDa) und einer hoch glykosylierten (105 kDa)
Form vor (Thale et al., 1994). Vergleichende Sequenzanalysen mit den zellulären FcγRezeptoren der Maus weisen auf ein Molekül, bestehend aus drei IgSF-artigen Domänen
hin (Lenac et al., 2006). Der vFcγR m138 bindet neben murinem IgG auch humanes IgG
und Ratten-IgG, wobei er strikt Subklassen-spezifisch ausschließlich mit murinem IgG2a
und IgG2b, nicht aber mit murinem IgG1 und IgG3 interagiert (Matthias Budt,
unveröffentlichte Daten). Die beiden ersteren Subklassen sind die dominierenden
zytotoxischen Antikörper in der Maus. Überraschenderweise zeigen MCMV-infizierte
Mäuse während der Primärinfektion einen B-Zell-unabhängigen Infektionsverlauf; die
An- oder Abwesenheit von Antikörpern hat keinen Einfluss auf den Verlauf der
Primärinfektion mit MCMV (Jonjic et al., 1994). Im Gegensatz dazu spielen Antikörper
während der Phase der MCMV-Reaktivierung eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle
der Replikation (Polic et al., 1998).
23
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Zusätzlich wurde beobachtet, dass eine m138-defiziente Virusmutante Antikörperunabhängig in Mäusen im Vergleich zum Wildtypvirus stark attenuiert war (CrnkovicMertens et al., 1998). Es wurde gezeigt, dass m138-Expression eine massive Reduktion der
Liganden des NK-Zell-Rezeptors NKG2D MULT-1 (murine UL16-binding protein like
transcript 1) und H60 auf der Oberfläche transfizierter und infizierter Zellen bewirkt
(Lenac et al., 2006). Die Deletion von m138 aus dem viralen Genom resultiert in einer
Attenuierung des Virus infolge der NK-Zell-vermittelten Immunantwort in vivo.
Außerdem interferiert m138 mit der Aktivierung von CD8+-T-Zellen, indem es den
lysosomalen Abbau des ko-stimulatorischen Moleküls B7-1 (CD80) auf Dendritischen
Zellen (DC) fördert (Mintern et al., 2006).
1.6.2 Funktion HCMV-kodierter Fcγ-Rezeptoren
Über die Funktion der viralen Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 auf der Oberfläche
infizierter Zellen in der IgG-vermittelten Immunantwort wurde bis vor kurzem nur
spekuliert. In einem neuen Aktivierungsassay für zelluläre Fcγ-Rezeptoren konnte sowohl
für gp34 als auch für gp68 eine IgG-vermittelte selektive Inhibierung von CD16A, CD32A
und CD64 gezeigt werden. Dabei ist der hemmende Effekt auf CD16 am größten; er
konnte außerdem durch eine unabhängige Aktivierungsmessung CD16-tragender NKZellen bestätigt werden (Eugenia Corrales-Aguilar, unveröffentlichte Daten).
Bei der Antikörper-abhängigen Komplement-vermittelten Zytolyse spielen die viralen
Fcγ-Rezeptoren keine nachweisbare Rolle, da es als Folge der Infektion zur
Hochregulierung der Komplement-regulatorischen Proteine CD46 und CD55 auf der
Zelloberfläche kommt. Dadurch wird die Aktivierung der Komplementkaskade
verhindert (Spiller et al., 1996).
1.6.3 HSV-1-kodierte Fcγ-Rezeptoren
Bei HSV-1 wurde bereits 1979 Glykoprotein gE identifiziert (Baucke & Spear, 1979), das
zusammen mit dem Glykoprotein gI (Johnson & Feenstra, 1987) als heterodimerer
Komplex (Johnson et al., 1988) sowohl monomeres als auch aggregiertes IgG an der FcDomäne binden kann. Beides sind glykosylierte Typ I Transmembranproteine, die sowohl
24
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
nach Infektion auf der Zelloberfläche exprimiert werden als auch Bestandteil der äußeren
Hülle des Viruspartikels sind. Der vFcγ-Rezeptor gE/gI bindet strikt subklassenspezifisch
nur humanes IgG1, IgG2 und IgG4 (Wiger & Michaelsen, 1985), aber auch Kaninchen
IgG. Der Hauptakteur des HSV-kodierten Fcγ-Rezeptors ist gE, denn gI vermittelt nur
eine Verstärkung der Bindung an aggregiertes IgG, die gE alleine nieder affin realisiert. gI
selbst kann weder mit monomeren noch mit aggregierten IgG interagieren (Dubin et al.,
1990).
Für den FcγR von HSV wurden verschiedene immunevasive Funktionen beschrieben.
Zum einen wurde gezeigt, dass er als Bestandteil des Virions dieses schwach vor
Antikörper-vermittelter Neutralisation und stark vor Komplement-vermittelter Virolyse
schützt (Frank & Friedman, 1989). Auf der Oberfläche infizierter Zellen schützt das
Heterodimer die Zellen vor Antikörper-abhängiger Zytolyse (ADCC) (Dubin et al., 1991).
Der die Abschwächung von immunem IgG durch den HSV-1 FcγR beschreibende
Mechanismus wird antibody bipolar bridging genannt (Abb. 1.6). Dieses Model basiert auf
der simultanen Bindung virusspezifischer IgG-Moleküle (sowohl auf dem Viruspartikel als
auch auf der infizierten Zelloberfläche), die mittels der Fab-Region das Antigen binden
und gleichzeitig am Fc-Teil durch den vFcγR komplexiert werden. Der Mechanismus des
antibody bipolar bridging ist durch die Flexibilität der hinge-Region des Antikörpers
möglich und wurde bereits bei der Aktivierung von Mastzellen und Neutrophilen
beschrieben (Benichou & Voisin, 1987, Daeron & Voisin, 1978, Leung-Tack et al., 1982).
Auf Basis der Kristallstruktur des gE/gI Komplexes wurde durch Björkman und
Mitarbeiter die mögliche Formierung eines ternären Antigen-Antikörper-RezeptorKomplexes postuliert (Sprague et al., 2006): infolge der doppelten Bindung eines
Antikörpers durch Antigen und Fc-Rezeptor ist dieser nicht mehr in der Lage, Fcspezifische Effektormechanismen auszulösen, wie beispielsweise die Bindung der
Komplementkomponente C1q als initialen Schritt der klassischen Komplementkaskadenaktivierung (Lubinski et al., 1998). Desweiteren konnte im Kaninchen experimentell
gezeigt werden, dass die Aktivierung von Antikörper-abhängigen Effektorfunktionen
FcγR-tragender Wirtszellen durch den HSV-kodierten Fcγ-Rezeptor gehemmt wird
(Nagashunmugam et al., 1998).
25
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
virusspezifisches
IgG
gI
gE
virales
Antigen
HSV-1
Abb. 1.6: Model des antibody bipolar bridging durch den HSV-1 FcγR gE/gI. Antigen-gebundenes immunes
IgG wird durch den viralen Fcγ-Rezeptor simultan an dessen Fc-Domäne komplexiert. Modell nach (Frank
& Friedman, 1989)
Auch für HSV-1 gE/gI sind Antikörper-unabhängige Funktionen beschrieben: das
Heterodimer ist in vitro bei der Zell-zu-Zell-Ausbreitung von HSV-1, insbesondere in
Epithel- und neuronalem Gewebe von Bedeutung (Dingwell et al., 1995, Polcicova et al.,
2005). Sowohl gE als auch gI sind außerdem am axonalen Transport von HSV Kapsiden
beteiligt (Snyder et al., 2008).
1.7
FcγR/Antikörperinteraktion
1.7.1 Zelluläre Fcγ-Rezeptoren
Die Interaktion zwischen dem Fc-Liganden und den zellulären Fcγ-Rezeptoren wurde
sowohl durch Mutationsanalysen als auch durch die Vermessung der Raumstruktur nach
erfolgreicher Kristallisierung im Detail studiert. Peter Sondermann und Co-Autoren
lösten die Struktur des CD16A im Komplex mit monomerem IgG1/Fc-Fragment
(Sondermann et al., 2000). In diesem Komplex bindet lösliches CD16 lediglich mithilfe
seiner zweiten proximal zur Membran gelegenen Domäne und zwei Aminosäureresten
des Zwischenstücks von Domäne 1 und 2 den Antikörper in einer 1:1 Stöchiometrie
(Abb. 1.7A). Die Interaktionsstelle am Fc-Fragment beschränkt sich dabei fast
26
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
ausschließlich auf den unteren, der Fc-Domäne zugewandten Teil der hinge-Region
(lower-hinge) und dem oberen Teil der sich anschließenden CH2-Subdomäne. Als Folge
der Rezeptor/Liganden-Interaktion öffnet sich die Struktur CH2-Subdomäne um einen
Winkel von 7° (Sondermann et al., 2000). Vergleicht man die Struktur der extrazellulären
Domänen der bereits kristallisierten Fcγ-Rezeptoren CD16A, CD32A und CD32B, so
ähneln sich diese untereinander sehr stark (siehe Übersicht in (Woof & Burton, 2004). Für
die Rezeptoren CD32 und CD64 wurde aus der bereits beschriebenen CD16/FcInteraktion daher auf einen prinzipiell ähnlichen Interaktionsmodus geschlossen.
A
B
CD16
hFC
gE
gE
hFC
Abb. 1.7: Die zwei Arten der hFc/Fcγ-Rezeptorinteraktion. (A) Der zelluläre Fcγ-Rezeptor CD16 (in grün)
interagiert mit einer 1:1 Stöchiometrie innerhalb der hinge-Region mit humanem Fc-Fragment (rot/blau)
aus (Sondermann et al., 2000). (B) Je ein Molekül des HSV-1 kodierten Fcγ-Rezeptors gE (blau) interagiert
mit je einer CH2-CH3-Oberfläche im Molekül hFc (grün) aus (Sprague et al., 2006). hFc: humanes FcFragment
Der FcRn variiert stark in seiner Art der Interaktion mit dem Liganden von den oben
genannten zellulären Fcγ-Rezeptoren. Er bindet in der so genannten interdomain hingeRegion zwischen der CH2 und der CH3-Subdomäne in einer 2:1 Stöchiometrie
(vergleichbar
mit
Abb.
1.7B),
indem
zwei
Rezeptormoleküle
mit
einem
Antikörpermolekül interagieren (Burmeister et al., 1994, Huber et al., 1993, James et al.,
2007, Sanchez et al., 1999). Die drastische pH-Abhängigkeit in der FcRn27
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Ligandenbindung ist ungewöhnlich für Protein-Protein-Interaktionen (Raghavan &
Bjorkman,
1996).
Ein
molekularer
Erklärungsansatz
für
solche
pH-abhängige
Affinitätsänderungen sind an der Bindung beteiligte Histidinreste, da ihr Imidazolring der
Seitenkette zur Deprotonierung im schwach neutralen Bereich (pH 6-7) neigt.
Mutagenesestudien (Kim et al., 1994) und Strukturaufklärungen (Burmeister et al., 1994)
bestätigen die Interaktion des neonatalen FcR mit konservierten Histidinen an den
Positionen 310 und 433 der CH2-CH3-Domäne im Fc.
Die Bindungsstellen von TRIM21 und FcRn an das Fc-Fragment sind im Wesentlichen
überlappend, wobei die Aminosäuren 433, 434 und 435 der CH2-CH3-Oberfläche dabei
essentiell sind (James et al., 2007). TRM21 interagiert ebenfalls mit einer 2:1
Stöchiometrie innerhalb der CH2-CH3-Oberfläche von Fc von zwei Molekülen Rezeptor
zu einem Molekül Antikörper (James et al., 2007). Eine pH-Abhängigkeit der
Ligandenbindung ist nicht vorhanden (Keeble et al., 2008).
1.7.2 Bakteriell kodierte Fcγ-Rezeptoren
Der
Interaktionsmodus
Pathogen-exprimierter
Fcγ-Rezeptoren
konnte
durch
Röntgenstrukturanalysen teilweise aufgeklärt werden (Deisenhofer, 1981). Für die
bakteriellen Rezeptoren Protein A aus Staphylococcus aureus und Protein B aus
Streptococcus spec. wurde außerdem gezeigt, dass sie mit nanomolaren Affinitäten die
CH2-CH3-Oberfläche von Fc binden (Karlsson et al., 1995, Walker et al., 1995). Durch
Kompetitionsexperimente konnte nachgewiesen werden, dass sie dabei teilweise mit
TRIM21 und FcRn überlappende Bindungsstellen am Fc-Teil nutzen (James et al., 2007,
Raghavan et al., 1994).
1.7.3 Herpesviral kodierte Fcγ-Rezeptoren
Kürzlich wurde die Ultrastruktur des HSV-1 kodierten Fc-Rezeptors gE/gI in Interaktion
mit seinem Liganden IgG-Fc gelöst (Abb. 1.7B) (Sprague et al., 2006). Aus ihr wird
deutlich, dass auch gE die CH2-CH3-Oberfläche bindet, einem hot spot vieler Fc-ProteinInteraktionen (Burton, 1985, DeLano et al., 2000). Interaktionspartner sind dabei im
Wesentlichen die Aminosäuren 252–258, 307, 309–311, 314–315, 382, 428 und 433–436
28
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯EINLEITUNG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
des Fc-Fragments (Sprague et al., 2006). Auch beim HSV-1 kodierten Fcγ-Rezeptor ist die
Bindungsstöchiometrie 2:1 von gE zu IgG. Wie auch beim neonatalen Fc−Rezeptor ist die
Interaktion mit Fc strikt pH-abhängig. In Plasmonresonanzanalysen ist eine Bindung im
sauren Milieu nicht mehr detektierbar, was wahrscheinlich die Folge der pH-abhängigen
Protonierung der Histidine 310 und 435 des Fc-Fragmentes ist (Sprague et al., 2006).
Betrachtet man den generellen Modus der Antikörper/Fcγ-Rezeptorinteraktion, werden
zwei distinkte Bindungsmodi deutlich. Eine Rezeptorgruppe realisiert die Interaktion
über die hinge-Region und den oberen Teil der CH2-Subdomäne des Antikörpers in einer
1:1 Stöchiometrie, wohingegen ein ebenso prominenter Anteil der Rezeptoren den
Liganden die CH2-CH3-Oberfläche mit einer 2:1 Stöchiometrie bindet. Warum diese
beiden Interaktionsmodi favorisiert werden, ist noch nicht verstanden.
29
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
2
ERGEBNISSE
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68
sowohl funktionell als auch biochemisch untersucht. Der erste Teil der Ergebnisse stellt
die Struktur und die spezifischen Bindungseigenschaften von gp34 und gp68 an die IgGFc-Domäne im Vergleich zu den humanen (CD16, CD32 und CD64), herpesviralen (gE)
bzw. mikrobiellen (Protein A und Protein G) Fcγ-Rezeptoren dar. Hierbei wurden
umfangreiche Mutations- und Bindungsstudien durchgeführt, da zahlreiche Versuche
zum Lösen der Proteinkristallstruktur von gp34 und gp68 in Interaktion mit dem
Liganden gescheitert waren (in Zusammenarbeit mit Pamela Björkman und Peter
Sondermann).
Im
zweiten
Teil
wurde
das
Augenmerk
auf
die
funktionelle
Charakterisierung der Rezeptoren als Bestandteil des Virions und deren mögliche
Interferenz mit antiviralem IgG des Immunsystems gelegt.
2.1
Biochemische Charakterisierung der HCMV-kodierten FcγRezeptoren gp34 und gp68
Sowohl gp34 (IRL11/TRL11) als auch gp68 (UL119-118) sind HCMV-kodierte Typ 1
Transmembranproteine, bestehend aus aminoterminaler Signalsequenz, Ektodomäne mit
mehreren N-Glykosylierungsstellen, Transmembrandomäne und einem C-terminalen
zytoplasmatischem Rest. Beide viralen Fcγ-Rezeptoren zeichnen sich durch eine hoch
affine Bindung an den Fc-Teil aller vier humanen IgG Subklassen aus (Atalay et al., 2002).
2.1.1 Strukturelle Anforderungen an den Liganden Fc bei der Interaktion mit gp34 und
gp68
Der Fc-Teil eines IgG Moleküls ist ein kovalentes Homodimer mit jeweils einer NGlykosylierung (Asn297), das durch intermolekulare Disulfidbrücken in der so genannten
N-terminalen hinge-Region miteinander verbunden ist. Jede einzelne Kette besteht aus
einer CH2-und CH3-Domäne, wobei die CH2-Domänen über die N-glykosidischen
Oligosaccharide an Position Asn297 interagieren. Die CH3-Domänen hingegen interagieren
über Protein-Protein-Wechselwirkungen. Für die zellulären Fcγ-Rezeptoren konnte
gezeigt werden, dass die Ligandenbindung über die Interaktion mit der CH1-CH2-hinge30
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
und der CH2-Region des IgG-Moleküls erfolgt (Sondermann et al., 2000). Dabei ist die
Glykosylierung des Liganden Fc sowohl für die Bindung als auch für die nachfolgende
Aktivierung der Rezeptoren essentiell (Jefferis & Lund, 2002). Demzufolge resultiert der
Verlust der N-Glykane des Fc in einer starken Beeinträchtigung (CD64, CD32B) bis hin
zum vollständigem Verlust (CD16A, CD32A) der Bindungskapazität (Shields et al., 2001,
Walker et al., 1989), obwohl es wahrscheinlich zu keiner direkten Interaktion von
Zuckerresten und zellulären Fcγ-Rezeptoren kommt (Radaev & Sun, 2002, Sondermann et
al., 2000). Im Gegensatz dazu bleibt die Interaktionsfähigkeit des bakteriellen FcγRezeptors Protein A von Staphylococcus aureus, der im Übergang von der CH2 zur CH3Domäne bindet, von der Deglykosylierung des Fc-Fragments unbeeinflusst (Nose &
Wigzell, 1983). Um die Frage zu beantworten, ob die Ligandeninteraktion der HCMVkodierten Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 glykosylierungsabhängig ist, wurde die
Bindungskapazität der viralen Fcγ-Rezeptoren an enzymatisch deglykosyliertes humanes
Fc (hFc) im Vergleich zu Glykosyliertem in einer Präzipitationsreaktion (IP) radioaktiv
markierter Proteine untersucht. Als Erfolgskontrolle des Endoglykosidase H (Endo H) und
Peptid-N-Glykosidase F (PNGase F) behandelten Fc-Fragmentes diente die Silberfärbung
eines SDS-Gels unter nicht-reduzierenden Bedingungen, in der die Größenveränderung
des Fc bedingt durch An- oder Abwesenheit des N-Glykans sichtbar wurde (Abb. 2.1B).
Anschließend wurde mittels rekombinanter Vaccinia Viren (rVACV)-exprimiertes gp34
und gp68 mit CD64 verglichen. Hier ist bereits publiziert, dass die Interaktion von CD64
mit deglykosyliertem Fc sehr stark abgeschwächt ist (Shields et al., 2001). Zur Kontrolle
wurden Lysate von VACV-wt infizierten Zellen untersucht (Abb. 2.1B, Spur 1-5).
Konditionen mit unbehandeltem Fc bei gp34, gp68 und CD64 (Abb. 2.1A, Spur 1, 6, 11
und 21) bzw. mit dem CD64-spezifischen Antikörper (Abb. 2.1A, Spur 16) dienten als
Kontrollen für eine intakte Fc-Bindung bzw. spezifische Präzipitation von CD64. Wie
erwartet führte die Deglykosylierung des Fc-Fragments zu einer stark verminderten
Bindungskapazität durch CD64 (Abb. 2.1A, Spur 17 und 18). Im Gegensatz dazu ist die
hoch affine Bindung von gp34 als auch gp68 an das Fc-Fragment unbeeinflusst von dessen
Glykosylierungsstatus (Abb. 2.1A, Spur 7-10, 12-15). Diese Ergebnisse schließen eine
direkte Bindung der viralen Fcγ-Rezeptoren an die Asn297-geknüpften Glykane aus.
31
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Vielmehr lassen sie auf glykosylierungsabhängige Konformationsänderungen des Fc-Teils
schließen, dessen so genannte vorhergesagte offene Konformation (Krapp et al., 2003)
Voraussetzung für die Bindung der zellulären Fcγ-Rezeptoren, aber nicht für die
Erkennung von gp34 und gp68 ist (siehe Schema in Abb. 2.1A).
A
„geschlossen“
= deglykosyliert
„geöffnet“
= glykosyliert
glykosylierungsabhängige
Fc- Konformation
wt
gp34
gp68
CD64
hFc
hFc
α-CD64
-- F H cF cH -- F H cF cH --
F H cF cH
66
**
F
H
:Deglykosylierg.
cF cH -- hFc
gp68 66
CD64
45
45
kDa
gp34
*
*
30
1
2
3
B
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13 14 15
30
kDa
16
17 18
19
20 21
hFc
--
F
H
cF
cH
: Deglykosylierg.
hFc
Abb. 2.1: gp34 und gp68 binden im Gegensatz zu dem zellulärem FcγR CD64 deglykosyliertes hFc. (A) CV-1
Zellen wurden mit rVACV oder VACV-wt für 14 h infiziert (MOI = 5). [35S]-Methionin/Cystein markierte
Zellen wurden lysiert und mit enzymatisch deglykosyliertem hFc (F, PNGase F behandelt; H, Endo H
behandelt), mit mock-behandeltem hFc (cF, cH, gleiche Bedingungen ohne Enzymzugabe), mit
unbehandeltem hFc oder mit CD64 spezifischen Antikörpern gefolgt von PAS, bzw. PGS präzipitiert. Die
Proteinkomplexe wurden auf einem 10-13%igen Gradienten-SDS-PAGE separiert. Unvollständig
glykosylierte Formen von gp34 und gp68 sind mit einem Stern gekennzeichnet. (B) 1 mg/ml hFc-Fragment
wurde ÜN enzymatisch mittels Endo H (H) bzw. PNGase F (F) deglykosyliert oder in dem jeweiligen Puffer
mock-behandelt (cH, cF). Im Vergleich zu 1 μg unbehandeltem hFc wurde die Deglykosylierung der
entsprechenden Menge der enzymatischen Reaktion mittels 10%iger SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden
Bedingungen der Größe nach aufgetrennt und durch anschließende Silberfärbung visualisiert.
32
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Die glykosylierungsunabhängige Art und Weise der Interaktion mit Fc haben gp34 und
gp68 gemein mit HSV gE, Staphylococcus aureus Protein A und dem neonatalen FcRezeptor (Armour et al., 2002, Deisenhofer, 1981, Shields et al., 2001) eigene
Beobachtung).
ZUSAMMENFASSUNG
•
gp34 und gp68 binden Fc unabhängig von dessen Glykosylierung
•
gp34
und
gp68
unterscheiden
sich
hinsichtlich
ihrer
konformationellen
Anforderungen an den Liganden Fc von den zellulären Fcγ-Rezeptoren
2.1.2 Teilen sich HSV-1 gE und die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren dieselbe
Ligandenbindungsstelle?
In Kristallisationsstudien des zellulären Fcγ-Rezeptors CD16A im Komplex mit dem
monomeren Liganden hFc von IgG1 konnte die Interaktionsstelle beider Proteine
definiert werden. CD16A bindet IgG mit Hilfe seiner beiden Ig-artigen Ektodomänen D1
und D2 in der so genannten hinge-Region des Antikörpers zwischen dem Fab- und dem
Fc-Teil und mit einer zusätzlichen Kontaktstelle in der CH2-Domäne. Diese Interaktion
resultiert in einer 1:1 Stöchiometrie von Rezeptor und Ligand (Radaev et al., 2001,
Sondermann et al., 2000). Die drei zellulären Fcγ-Rezeptoren CD16, CD32 und CD64
nutzen neben dem gemeinsamen Repertoire an Aminosäureresten, die an der Bindung an
hFc beteiligt sind, auch zusätzliche, individuelle Kontaktstellen (Shields et al., 2001). Im
Gegensatz zu dem beschriebenen Bindemodus des zellulären Fcγ-Rezeptors CD16
bestätigen Strukturanlysen des HSV-1-kodierten Fcγ-Rezeptors gE eine Interaktion
innerhalb des CH2-CH3-Domänenüberganges mit einer 2:1 Stöchiometrie von zwei
Molekülen gE pro Fc (Sprague et al., 2004, Sprague et al., 2006), vergleichbar mit der des
neonatalen Fcγ-Rezeptors (FcRn) (Burmeister et al., 1994) oder Protein A. Detaillierte
biochemische und kristallographische Analysen zeigen, dass sowohl gE, Protein A,
33
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Protein G, als auch die zellulären Moleküle FcRn und TRIM 21 mit überlappenden
Aminosäuren innerhalb des CH2-CH3-Domänenübergangs interagieren (Tab. 2.1).
Tab. 2.1: Liste der Aminosäuren der CH2-CH3-Region von Fc, die durch Fcγ-Rezeptoren gebunden werden.
(Burmeister et al., 1994, Deisenhofer, 1981, James et al., 2007, Sauer-Eriksson et al., 1995, Sprague et al.,
2006)
Fcγ-Rezeptor
gebundene Fc-Aminosäurereste
Fc-CH2-Domäne
gE
252 - 258
Protein A
252 - 254
Protein G
252 - 254
FcRn
252 - 254
309 - 311
TRIM21
252 - 253
311 314 315
Fc-CH3-Domäne
307, 309 - 311, 314 - 315 382 428, 433 - 436
310, 314
429, 433, 435 - 436
433, 435 - 436
433 - 436
428, 430 - 440
Es wird deutlich, dass Aminosäurereste dreier so genannter hot spots der CH2-CH3Domäne (Abb. 2.1, umrandete Boxen) bei der Interaktion verschiedener FcγR erkannt
werden (Burmeister et al., 1994, James et al., 2007, Sprague et al., 2006).
Mit Hilfe eines mutierten Fc-Fragments, abgeleitet von humanem IgG1, welches von
unserer Kooperationspartnerin Prof. Pamela Bjorkman (Caltech, La Jolla, Kalifornien) zur
Verfügung gestellt wurde (Sprague et al., 2004), sollte die genaue Kontaktstelle der viralen
Fcγ-Rezeptoren an den Fc-Teil untersucht werden. Dabei wurden sechs Aminosäurereste
in der hot spot-Region innerhalb der CH2-CH3-Domäne beider Ketten wie folgt verändert
(Met252 zu Gly, Ile253 zu Gly, His310 zu Glu, His433 zu Glu, His435 zu Glu und Tyr436 zu Ala).
Für den neonatalen Fc-Rezeptor und gE konnte mit Hilfe des mutierten, so genannten
nonbinding-Fc (nbFc) in Gelfiltrationsanalysen gezeigt werden, dass im Gegensatz zu
rekombinantem wtFc diese Mutationen zu einem Verlust der Ligandenbindung führen
(Martin & Bjorkman, 1999, Sprague et al., 2004).
34
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
In einer vergleichenden Präzipitationsreaktion mit wtFc und nbFc sieht man
erwartungsgemäß einen Verlust der Bindungskapazität bei gE, was mit den
Kristallisationsstudien
des
gE/gI-Fc-Komplexes
übereinstimmt
(Abb.
2.2).
Überraschenderweise binden die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren unterschiedlich hFc.
Eine Interaktion von gp68 mit nbFc ist nicht nachweisbar und lässt auf überlappende
Bindungsstellen mit gE bzw. FcRn schließen (Sprague et al., 2008). Im Gegensatz dazu
bleibt die Bindung von gp34 an nbFc im Vergleich zu wtFc unverändert. Die Interaktion
des Fcγ-Rezeptors CD64 mit nbFc ist nicht beeinflusst, wohingegen CD32A eine
nachweisbare, aber stark beeinträchtigte Bindung zu nbFc aufweist.
Ò
wtFc
Ò
nbFc
human
CD64
HSV-1
viral
HCMV
CD32A
gp68
gp34
gE
gI
Abb. 2.2: Die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 unterscheiden sich in ihrer Bindungsstelle
an das hFc-Fragment. gp68 und gE binden in der CH2-CH3-hinge-Region des hFc-Teils. CV-1 Zellen wurden
mit FcγR-exprimierenden rVACVs (CD64, CD32A, gp34 und gp68) oder mit dem HSV-1 Stamm F für 14 h
mit einer MOI von 4 infiziert, bevor sie metabolisch markiert wurden. Die Präzipitation hFc-bindener
Proteine aus dem Lysat erfolgte entweder mit an CNBr-Sepharose gekoppeltem Wildtyp-Fc-Fragment
(wtFc) oder mit mutiertem nonbinding-Fc-Fragment (nbFc). Der Bereich der Aminosäuremutationen in der
CH2-CH3-Region im Fc-Teil ist mit einem Ò markiert.
35
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Dieses Ergebnis unterstützt die CD16/Fc-Strukturdaten, wonach alle drei zellulären
Rezeptoren die gleiche Bindungsstelle am Antikörper nutzen. Die schwache Bindung von
CD32A an nbFc macht allerdings deutlich, dass zusätzlich zur hinge-Region weitere
wichtige Aminosäurereste an der Interaktion beteiligt sind (Shields et al., 2001). Eine
generelle Konformationsänderung des nbFc durch das Einbringen der Punktmutationen
konnte mit Hilfe von Kristallisationsstudien an äquivalent verändertem, stark homologem
Ratten-nbFc ausgeschlossen werden (Martin et al., 2001).
Im vorangegangenen Experiment wurden sowohl wtFc als auch nbFc an Cyanbromidaktivierte (CNBr)-Sepharose gekoppelt, um den Einfluss der Sepharose-gekoppelten
bakteriellen Fcγ-Rezeptoren (Protein A-Sepharose, PAS; Protein G-Sepharose, PGS) auf
einen Funktionsverlust der Bindungskapazität auszuschließen.
Aus der Abbildung 2.2 wird deutlich, dass sich gp68 und gE ein und dieselbe Binderegion
im Fc-Teil des IgGs teilen. Dabei handelt es sich um die bereits für Protein A und Protein
G ermittelte Interaktionsstelle am Fc.
Für gE wurde beschrieben, dass es mit Protein A um die Bindung an den Antikörper
kompetitiert und sich eine simultane Bindung beider Fcγ-Rezeptoren an Fc gegenseitig
ausschließt (Johansson et al., 1989). Hierbei wurde zuerst Protein A mit Fc inkubiert,
bevor dieser Komplex zu HSV-1-infizierten Zellen gegeben wurde („Vorinkubation“).
Vergleicht man allerdings diese Methode mit der herkömmlichen Präzipitationsreaktion,
wo zuerst der Ligand (Fc-Fragment) mit dem Rezeptor (gE, gp34, gp68) und danach mit
Protein
A-
oder
G-Sepharose
inkubiert
wird
(„klassisch“),
ist
deutlich
das
Zustandekommen eines ternären Komplexes, bestehend aus viralem Fc-Rezeptor, Fc und
Protein A oder Protein G durch den Erfolg der Präzipitation nachweisbar (Abb. 2.3, Spur
4 und 5). Da die gebundenen Aminosäurereste von Fc durch Protein A und Protein G im
Vergleich zu gE überlappend sind, kann der Verlust der Bindungskapazität von gE nach
Vorinkubation
mit
den
bakteriellen
Fcγ-Rezeptoren
nur
durch
strukturelle
Umlagerungen innerhalb des CH2-CH3-Domänenübergangs erklärt werden. Bereits in
Abb. 2.2 konnte gezeigt werden, dass auch gp68 dieselbe Ligandenbindungsstelle wie gE,
Protein A und Protein G nutzt, obwohl es unter den Bedingungen der Vorinkubation
36
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
(Spur 6 und 7) lediglich zu einer abgeschwächten Fc-Bindung an gp68 kommt.
Vermutlich ist der Bindemodus von gE und gp68 ähnlich, aber nicht identisch. Ob gE und
gp68 direkt um die Bindung an den Liganden kompetitieren können, ist bis jetzt nicht
gezeigt.
hFc
klassisch
Vorinkub.
wt
ΔFcγR
CNBr
PAS
CNBr PAS
PGS PAS
PGS : Sepharose
gp68
HCMV
66
45
gp34
HSV-1
30
gE
66
gI
kDa
1
2
3
4
5
6
7
Abb. 2.3: Im Gegensatz zu HSV-1 gE kompetitiert HCMV gp34 nicht mit dem bakteriellen Fcγ-Rezeptoren
Protein A und Protein G um die Bindung an hFc. 5x 105 MRC-5 Zellen wurden mit HCMV HB5 (wt) oder
mit der komplett Fcγ-Rezeptor-defizienten Mutante (ΔFcγR; ΔUL119-118/ΔIRL/ΔTRL11) (MOI = 2)
infiziert. 72 h p.i. wurden die Zellen für 1 h metabolisch markiert und anschließend lysiert. 5x 105 CV-1
Zellen wurden über Nacht mit dem HSV-1 Stamm F (wt) bzw. der HSV-1 FcγR-defizienten Mutante ΔgE
(ΔFcγR) infiziert (MOI = 2) und wie oben beschrieben markiert und lysiert. Die Präzipitation der vFcγRezeptoren erfolgte entweder mit 1 μg hFc, das direkt für 1 h mit dem Lysat inkubiert (klassisch; Spur 2, 4
und 5) und nachfolgend mit Protein A- (klassisch; Spur 2 und 4) oder Protein G (klassisch; Spur 5)Sepharose präzipitiert wurde. Alternativ wurde 1 μg hFc zusammen mit Protein A- (Vorinkub.; Spur 6) oder
Protein G-Sepharose (Vorinkub.; Spur 7) für 1 h vorinkubiert, die Komplexe 1x in IP-Waschpuffer B
gewaschen und anschließend für 1 h mit den Gesamtzelllysaten inkubiert. Als Kontrolle wurden die vFcγRezeptoren durch kovalent gekoppeltes hFc an CNBr-aktivierte Sepharose präzipitiert (klassisch; Spur 1 und
3). Die Immunkomplexe wurden auf einem 10%igem SDS-Gel aufgetrennt. PAS: Protein A-Sepharose; PGS:
Protein G-Sepharose; CNBr: Cyanbromid-aktivierte Sepharose
37
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Da im Gegensatz dazu die Fc-Bindung des HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptors gp34 von der
Reihenfolge der Ausbildung des ternären Komplexes unbeeinflusst hoch affin ist, bestätigt
dies den bereits in Abb. 2.2 dokumentierten einzigartigen Bindemodus von gp34 unter
den viral und bakteriell exprimierten Fcγ-Rezeptoren.
Als Kontrolle diente die Infektion mit der entsprechenden Fcγ-Rezeptor defizienten
Mutante (Abb. 2.3, Spur 1 und 2). Für die Protein A bzw. Protein G-unabhängige
Präzipitation Fc-bindender Proteine wurde CNBr-gekoppeltes Fc-Fragment eingesetzt,
das allerdings deutlich schwächer konzentriert war (Abb. 2.3, Spur 3).
ZUSAMMENFASSUNG
•
gp68 bindet im Gegensatz zu gp34 Fc innerhalb der CH2-CH3-Domäne
•
die Bindungstelle von gp34 an Fc ist einzigartig unter den bekannten mikrobiellen
Fcγ-Rezeptoren
Mit Hilfe des hdFc, einem Heterodimer bestehend aus einer mutierten und einer
wildtypartigen Kette, im Vergleich zum wtFc bzw. nbFc konnte in Kooperation mit
Pamela Bjorkman durch Gelfiltrationsanalysen eindeutig gezeigt werden, dass gp68 mit
einer 2:1 Stöchiometrie von zwei Molekülen gp68 an ein Molekül Fc innerhalb der CH2CH3-Domäne bindet (Sprague et al., 2008). Dieselbe Bindungsstöchiometrie konnte durch
Ko-Kristallisationsstudien auch für HSV gE, FcRn und TRIM21 nachgewiesen werden
(Burmeister et al., 1994, James et al., 2007, Sprague et al., 2006). Komplexe höherer
Ordnung (...-gp68-Fc-gp68-Fc-gp68-...), wie sie für den FcRn gezeigt wurden, konnten für
gp68 nicht detektiert werden. Des Weiteren konnte in Oberflächen-Plasmon-ResonanzAnalysen die Bindungsaffinität von gp68 („Analyt“) an wtFc („Ligand“) ermittelt werden,
die im nanomolaren Bereich liegt. Die Affinitätskonstante ist im Gegensatz zu gE pHunabhängig im Bereich zwischen pH 5,6-8,1 und beträgt bei den löslichen Varianten
gp68(26-289) KD= 300 nM und bei gp68(68-289) KD= 85 nM (Sprague et al., 2008).
38
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
ZUSAMMENFASSUNG
•
gp68 bindet mit einer 2:1 Stöchiometrie pH-unabhängig die CH2-CH3-Domäne mit
nanomolaren Affinitäten
2.1.3 Definition der minimalen Bindedomäne von gp68
Für gp68 werden N-terminal eine hydrophobe Signalsequenz (aa 1-25) und ein Bereich
mit 25 putativer O-Glykosylierungsstellen (aa 26-66) vorhergesagt. Sequenzvergleiche auf
Aminosäureebene der Fc-Bindedomänen humaner Fcγ-Rezeptoren lassen bei gp68 auf
eine Ig-artige Domäne (aa 91-190) des variablen V-Typs schließen, die auch die in ihrer
Position konservierten Cysteine 116 und 169 beinhaltet (Atalay et al., 2002). C-terminal
schließt sich eine Transmembrandomäne (aa 293-314) und eine zytoplasmatische Domäne
(aa
315-345)
an.
Über
die
gesamte
Ektodomäne
verteilt
existieren
12
N-
Glykosylierungsstellen (Abb. 2.4A).
39
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Abb. 2.4: Schematische Darstellung der gp68 Verkürzungsmutanten und deren hFc-Bindungskapazitäten.
(A) Das FLAG-Epitop-markierte gp68 Wildtypprotein (gp68FL) besteht aus einer vorhergesagten
25 Aminosäuren umfassenden N-terminalen Signalsequenz (weiße Box) gefolgt von einer 268 Aminosäuren
langen Ektodomäne (aa 26-293), einer 21 Aminosäure-umfassenden Transmembrandomäne (aa 294-314)
und einer 31 Aminosäuren langen zytoplasmatischen Domäne (aa 315-345). Alle generierten gp68 basierten
Mutanten sind lösliche Proteine ohne Transmembran- und zytoplasmatische Domäne mit C-terminalem
FLAG oder V5/6xHIS Markierung. Das ermittelte Molekulargewicht der glykosylierten und
deglykosylierten Formen befindet sich am Bildrand rechts neben der entsprechenden Mutante. TM:
Transmembrandomäne; Signal: Signalpeptid; Ig-lartige Domäne: Immunglobulin-artige Domäne. (B) Die
gp68 Verkürzungsvarianten wurden mittels rekombinanter VACV für 14 h in CV-1 Zellen exprimiert. Die
Präzipitation der Lysate erfolgte entweder mit hFc und Protein A-Sepharose, mit anti-FLAG-gekoppelter
Agarose oder mit anti-V5-Antikörpern gefolgt von Protein G-Sepharose. Vor der Auftrennung der Proteine
mittels 8-14%iger SDS-PAGE wurde ein Aliquot des Präzipitats durch Endo H deglykosyliert. Nach dem
Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulosemembran wurden die Proteine mit Hilfe von anti-FLAG M2
oder anti-V5-Antikörpern detektiert. Banden als Folge von unspezifischen Reaktionen des sekundären
Antikörpers sind mit einem Stern gekennzeichnet. WB: Western Blot Analyse
40
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Um die Frage zu beantworten, ob die vorhergesagte Ig-artige Domäne Voraussetzung für
die Fc-Bindung ist und um den minimalen funktionellen Bereich von gp68 zu definieren,
wurden lösliche C-terminale Verkürzungsmutanten hergestellt, denen sowohl die
Transmembrandomäne als auch der zytoplasmatische Teil fehlt. Diese wurden ektop
durch rekombinante Vaccinia Viren überexprimiert. Die Benennung der gp68 Varianten
erfolgte nach den verbleibenden Aminosäuren im Molekül (Abb. 2.4A). Die Mutante
gp68(71-292)FL,
der
zwei
N-Glykosylierungsstellen
und
der
potentielle
O-
Glykosylierungsbereich fehlt, wurde durch Fusion der Signalsequenz an Position 71 durch
Verwendung einer NheI-Schnittstelle und dem Einschub eines zusätzlichen Serins an
Position 70 generiert. Alle gp68 Verkürzungsvarianten wurden für den Nachweis
zusätzlich am C-Terminus mit einem FLAG- oder V5/6xHIS-Epitop versehen (Abb. 2.4A).
Eine Präzipitation aus rVACV infizierten Zelllysaten mit anti-FLAG-gekoppelter Agarose
bzw. V5-spezifischen Antikörpern zeigt, dass alle Proteine in ähnlicher Menge exprimiert
wurden (Abb. 2.4B, linkes Bild). Im Vergleich dazu kann man mit hFc-Fragment lediglich
die
funktionellen
Verkürzungsmutanten
gp68(26-292)FL
und
gp68(71-292)V5
präzipitieren (Abb. 2.4B, linkes Bild). Als Kontrolle dienten mock-infizierte und VACVwt infizierte Zelllysate. Die korrekte Größe und erfolgreiche Expression der
verschiedenen
gp68-Mutanten
wurde
mittels
Epitop-spezifischer
Antikörper
in
Immunpräzipitationen mit anschließender Deglykosylierung der Immunkomplexe durch
Endoglykosidase H (Endo H) bestätigt (Abb. 2.4B, rechtes Bild).
Die Aminosäuren 71-292 sind essentiell für die Funktionalität von gp68 und stellen die
minimale Fc-Bindedomäne dar. Weder der Bereich der O-Glykosylierung noch die
Transmembrandomäne und der zytoplasmatische Teil sind wichtig für die Bindung an hFc
und bestätigen die unabhängigen Ergebnisse der Oberflächen-Plasmon-ResonanzAnalyse, bei der die vergleichbaren gp68 Verkürzungsmutanten mit nanomolaren
Affinitäten binden (siehe 2.1.2).
Die bisherigen Ergebnisse der gp68-Verkürzungsmutanten unterstützen die Annahme
einer bindungsrelevanten Ig-artigen Domäne im gp68 Molekül, wobei sich die an die
putative IgSF-Domäne anschließenden C-terminalen 102 Aminosäuren inklusive der
41
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
sechs N-Glykosylierungsstellen als zusätzliche Voraussetzung für die Funktionalität
herausstellten. Ein unabhängiger Versuch mit Tunicamycin, einem Inhibitor der NGlykosylierung, bestätigt den Verlust der Bindungskapazität des deglykosylierten gp68 an
hFc (Abb. 2.5).
gp68FL
hFc
--
α-FLAG
+
--
hFc
+
DMSO
Tunicamycin
--
gp68FL
66
30
kDa
p33FL
Abb. 2.5: Verlust der Bindungskapazität von deglykosyliertem gp68 an hFc. CV-1 Zellen wurden mit
gp68FL exprimierenden rVACV 14 h infiziert. Ein Teil der Proben wurde 1 h vor und während der
metabolischen Markierung mit 5 μg Tunicamycin in DMSO inkubiert. Als Kontrolle diente die Zugabe des
gleichen Volumens an DMSO. Die Präzipitation erfolgte entweder mit hFc gefolgt von Protein A-Sepharose
oder mit α-FLAG-gekoppelter Agarose. Die Proteinkomplexe wurde auf einem 10-13%igen Gradientengel
aufgetrennt.
ZUSAMMENFASSUNG
•
die Aminosäuren 71-292 stellen die minimale Fc-Bindedomäne von gp68 dar
•
die O-Glykosylierung von gp68 ist im Gegensatz zur N-Glykosylierung für die FcBindung nicht essentiell
2.1.4 Definition der minimalen Bindedomäne von gp34
Für gp34 war N-terminal eine 23 Aminosäuren umfassende Signalsequenz mit
anschließender 159 aa großer Ektodomäne, ein Transmembranteil (aa 183-204) und eine
zytoplasmatische Domäne (aa 205-234) am C-Terminus vorhergesagt worden (Atalay et
42
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
al., 2002). Vergleichende Sequenzanalysen mit den bekannten Ig-artigen Domänen der
zellulären Fcγ-Rezeptoren ließen auf eine Ig-artige Domäne (aa 24-122) vom C-Typ
schließen, obwohl die maximale Homologie mit 12% Aminosäureidentität zu CD16 sehr
gering war (Atalay et al., 2002).
Um die funktionelle Domäne von gp34 zu bestimmen, wurden carboxyterminale
Verkürzungsmutanten wahlweise mit Signalsequenz hergestellt (Abb. 2.6A).
A
gp34
Signal
45
Y
101
YY
TM
Ig-artige Domäne
234
gp34(24-180)
156
gp34(ΔS-156)
156
gp34(24-124)
B
30
21kDa
180
gp34(24-156)
Cystein
21kDa / 31kDa
180
gp34(ΔS-180)
124
Y
18kDa / 28kDa
18kDa
14kDa / 24kDa
N-Glykosylierungsstelle
hFc
24kDa / 34kDa
putative Disulfidbrücke
C
gp34
gp34
gp34
gp34
gp34
(24-124) (24-156) (24-180) (ΔS-156) (ΔS-180)
-- + -- +
-- +
-- + -- + Endo H
hFc
gp34
--
gp34
gp34
gp34
gp34
gp34
(24-124) (24-156) (24-180) (ΔS-156) (ΔS-180)
-- + -- +
-- + -- + Endo H
+ -- +
30
14
kDa
14
kDa
Abb. 2.6: Schematische Darstellung der gp34 Verkürzungsmutanten und ihre hFc-Bindungseigenschaften.
(A) Die vorhergesagte Struktur des gp34 umfasst eine N-terminale Signalsequenz von 23 aa (weiße Box;
Signal; aa 1-23), eine sich anschließende Ig-artige-Domäne (aa 24-122) mit 3 N-Glykosylierungsstellen (Y)
und der putativen intramolekularen Disulfidbrücke (gestrichelte Klammer), einer 22 Aminosäuren langen
Transmembrandomäne (TM; aa 183-204) und einem C-terminalen zytoplasmatischem Ende von 30 aa Länge
(aa 205-234). Alle C-terminalen Verkürzungsmutanten von gp34 sind lösliche Proteine, ihre berechnete
molekulare deglykosylierte bzw. glykosylierte Masse ist am Bildrand rechts in kDa angegeben. Die
Verkürzungsmutanten wurden durch rVACV für 14 h in CV-1 Zellen exprimiert. An die einstündige
metabolische Markierung schloss sich eine Präzipitation mit Fc aus den Zelllysaten (B) oder aus dem
Überstand (C) an. Die Hälfte des Präzipitats wurde mit Endo H über Nacht deglykosyliert. Die Auftrennung
der Proteine erfolgte mittels 10-13% Gradienten-SDS-PAGE.
43
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Die kürzeste glykosylierte Mutante gp34(24-124) endete direkt nach der vorhergesagten
Ig-artigen Domäne. Wie in Abb. 2.6B zu sehen ist, führt der Verlust von 110 Cterminalen Aminosäuren gp34(24-124) zum Verlust der Fc-Bindungskapazität von gp34.
Ursächlich hierfür könnte die nicht mehr korrekte Faltung der Ig-artigen Domäne sein.
Eine C-terminale FLAG-markierte Variante gp34(24-124)FL bestätigte die Expression
durch Epitop-spezifische Immunpräzipitation und deren Funktionsverlust (Daten nicht
gezeigt). Erst durch eine Verlängerung des Moleküls auf 156 aa kann die Fc-Bindung
wieder hergestellt werden. Der Verlust der N-Glykosylierung von gp34 in den Varianten
ohne Signalsequenz (ΔS) schwächt lediglich die Affinität der Fc-Bindung, vergleicht man
die glykosylierte Mutanten gp34(24-156) und gp34(24-180) mit der entsprechenden Form
ohne Signalsequenz gp34(ΔS-156) bzw. gp34(ΔS-180) (Abb. 2.6B), hebt sie aber nicht
vollständig auf.
Eine Präzipitation der Verkürzungsmutanten aus dem Zellüberstand macht deutlich, dass
im Gegensatz zum Wildtypprotein gp34 mit Transmembrandomäne die löslichen
funktionellen Mutanten gp34(24-156) und gp34(24-180) sekretiert werden. Das
Durchlaufen der löslichen Proteine vom Endoplasmatischen Retikulum (ER) und Golgi
Apparat führt zur vollständigen Reife der Proteine, was mit einer verzweigten Nglykosidischen Verzuckerung einhergeht, die durch die Resistenz gegenüber Endo H
sichtbar wird (Abb. 2.6C). Den Mutanten ohne Signalsequenz fehlt die Voraussetzung für
den Eintritt ins ER, sie sind daher nicht in der Lage, die Zelle mittels des sekretorischen
Weges zu verlassen.
In einem unabhängigen zweiten Experiment konnte durch den Gebrauch des Inhibitors
Tunicamycin, der den ersten Schritt der N-Glykosylierung blockiert, bestätigt werden,
dass deglykosyliertes gp34 im Gegensatz zu gp68 prinzipiell noch funktionsfähig ist und
mit hoher Affinität hFc bindet (Abb. 2.7).
44
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
gp34FL
hFc
--
hFc
α-FLAG
--
+
DMSO
-- Tunicamycin
+
gp34FL
30
p24FL
kDa
Abb. 2.7: Bindung von gp34 an deglykosyliertes hFc. Nach Infektion von CV-1 Zellen mit rVACV gp34FL
wurde ein Teil der Proben für 1 h vor und während der metabolischen Markierung (1 h) mit 5 μg
Tunicamycin in DMSO inkubiert. Als Kontrolle diente die Zugabe des gleichen Volumens an DMSO. Die
Präzipitation erfolgte entweder mit hFc/PAS oder mit α-FLAG-gekoppelter Agarose. Die Proteinkomplexe
wurden auf einem 10-13%igen Gradientengel aufgetrennt.
Um die relevanten Aminosäuren für die Fc-Bindung an gp34 weiter einzugrenzen wurde
eine zusätzliche, C-terminal FLAG-markierte Verkürzung gp34(24-140)FL generiert
(Abb. 2.8A), die in der Präzipitation mit hFc noch funktionell ist (Abb. 2.8B).
A
B
gp34FL
Signal
45
Y
gp34(24-140)FL
Cysteine der Ektodomäne
putative Disulfidbrücke
82 101 142 150
YY
140
hFc
TM
234
25 / 35kDa
--
17/27kDa
Y N-Glykosylierungsstelle
gp34FL
+
gp34
(24-140)FL
--
+
Endo H
gp34FL
30
FLAG Epitop
20
kDa
*
*
*
p24FL
gp34
(24-140)FL
p34
(24-140)FL
Abb. 2.8: Die Aminosäuren 24-140 stellen die minimale Bindedomäne von gp34 dar. (A) Repräsentative
Darstellung der C-terminalen, löslichen Verkürzungsvariante gp34(24-140)FL mit entsprechendem
deglykosyliertem bzw. glykosyliertem Molekulargewicht. (B) Wildtyp gp34FL und die Verkürzungsmutante
gp34(24-140)FL wurden mittels rVACV exprimiert. Nach metabolischer Markierung für 1 h wurden
Antikörper bindende Proteine im Lysat mit hFc und Protein A-Sepharose präzipitiert. Die Hälfte des
Präzipitats wurde über Nacht mit Hilfe von Endo H deglykosyliert. Anschließend wurden die Proteine in
einer 10-13%igen Gradienten-SDS-PAGE separiert. Die verschiedenen Glykosylierungsstufen von gp34(24140)FL sind mit einem * markiert.
45
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Die Aminosäuren 24-140 stellen die minimale Bindedomäne dar und unterstützen die
Beteiligung der vorhergesagten Ig-artigen Domäne an der Fc-Bindung.
Um sicher zu stellen, dass die löslichen Verkürzungsvarianten von gp34 ähnliche
Bindungsaffinitäten
wie
das
Wildtypprotein
aufweisen,
wurde
in
einer
Präzipitationsreaktion die Menge an Fc-Fragment durch sequentielle Verdünnung
limitiert. Aus Abb. 2.9 wird deutlich, dass sowohl gp34 als auch gp34(1-156) mit
vergleichbarer Affinität humanes Fc-Fragment binden.
mock
2
VACV
2
1
0,25
0,1
µg hFc
gp34
gp34(24-156)
Abb. 2.9: gp34(1-156) bindet mit vergleichbarer Affinität hFc wie das Volllängenprotein gp34. CV-1 Zellen
wurden mit gp34 bzw. gp34(24-156) exprimierenden rVACV 14 h infiziert, metabolisch markiert, lysiert
und die gp34-Varianten mit unterschiedlichen Konzentrationen von hFc präzipitiert. Die Auftrennung der
Proteinkomplexe erfolgte mittels 10-13% Gradienten-SDS-PAGE.
ZUSAMMENFASSUNG
•
die Aminosäuren 24-140 von gp34 sind essentiell für die Bindung an Fc
•
die Bindungsaffinität der löslichen gp34 Mutanten ist vergleichbar mit dem
Wildtypprotein
•
Deglykosylierung von gp34 schwächt lediglich dessen Fc-Bindungskapazität
2.1.5 gp34 formt kovalente Homooligomere
Aufreinigungsversuche
des
löslichen
gp34
zeigten
in
einer
Größenausschluss-
Chromatografie das Vorkommen von ca. 90% Homodimeren im Vergleich zu 10% der
monomeren Form. Unter reduzierenden Bedingungen konnten dagegen nur noch
46
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Monomere nachgewiesen werden (Sprague et al., 2008). Unterschiedliche Bedingungen
der Lysate beim Aufkochen und die Detektion durch Western Blot Analysen mit ektop
exprimierten vFcγ-Rezeptoren zeigen eine kovalente Dimerisierung von gp34 unter
nicht-reduzierenden Bedingungen (vergleiche Abb. 2.10A und B). Als Kontrolle dienten
VACV-wt und gp68FL-Lysate, wo in keiner der untersuchten Bedingungen Oligomere
nachweisbar waren. Die gp68 Doppelbande ergibt sich aus den verschiedenen
Glykosylierungsformen, die in unterschiedlicher Menge im Gesamtzelllysat nachweisbar
sind. Im Gegensatz zu gp34 bildet gp68 keine kovalenten Homodimere aus.
A
wt
90
40
30
kDa
B
reduzierend
nicht-reduzierend
95
65
95
5
10
5
65
10
95 65 °C
5
gp34FL
wt
gp34FL gp68FL
10 min
gp68
130
90
gp34
40
30
kDa
gp68FL
95
65
95
65
95
65
°C
5 10
10
5 10
10
5 10
10
min
gp34 Tetramer
gp68
gp34 Dimer
gp34 Monomer
Abb. 2.10: gp34 formt kovalente Homooligomere. CV-1 Zellen wurden mit FcγR-exprimierenden rVACV
(gp34FL, gp68FL) im Vergleich zum VACV-wt für 14 h infiziert (MOI = 4). Die Gesamtzelllysate wurden
entweder mit reduzierendem (A) oder mit nicht-reduzierendem (B) Probenpuffer versetzt und für die
angegebenen Zeitenräume (min) bei entsprechender Temperatur (°C) inkubiert. Die Größenauftrennung
der Proteine erfolgte mittels 10% SDS-PAGE und deren Detektion mit einem FLAG-spezifischen
Antikörper.
Homodimere von gp34 sind nicht nur unter ektoper Überexpression detektierbar, sondern
auch in den Lysaten HCMV-infizierter Zellen. In einer Präzipitation mit polyklonalem
Kaninchen Serum sind unter nicht-reduzierenden Bedingungen fast ausschließlich gp34
Dimere entsprechender Größe von 68 kDa bei den beiden Laborstämmen HB5 und
Towne sichtbar (Abb. 2.11, rechtes Bild). Die starken Unterschiede im Expressionsniveau
von gp34 zwischen den Laborstämmen HB5 und Towne resultieren vermutlich nicht aus
Sequenzunterschieden des vFcγ-Rezeptors, da gp34 mit 97% Aminosäuresequenzidentität
hoch homolog ist. Unter reduzierenden Bedingungen fallen die kovalenten gp34 Dimere
47
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
komplett auf ihre monomere Form von 34 kDa zurück (Abb. 2.11, linkes Bild). Um eine
artifizielle Neubildung von gp34 Oligomeren während der Präzipitationsreaktion
auszuschließen, wurden während der Zelllyse die alkylierenden Reagenzien Jodacetamid
(IAA) oder N-Ethylmalemid (NEM) zugegeben. Bei den detektierten Dimeren unter
nicht-reduzierenden Bedingungen handelt es sich nicht um gp68, da gp68 im Gegensatz
zu gp34 kaum Kaninchen IgG bindet (Daten nicht gezeigt).
hFc
reduzierend
mock
IAA
HB5
NEM IAA
nicht-reduzierend
Towne
NEM IAA
mock
NEM
IAA
HB5
NEM IAA
Towne
NEM IAA
NEM : im Lysispuffer
gp34 Dimer
66
66
gp34 Monomer
30
30
kDa
kDa
Abb. 2.11: HCMV exprimiertes gp34 bildet hFc-bindende Homodimere. 5x 105 MRC-5 Zellen wurden mit
den HCMV Stämmen HB5 und Towne infiziert. 72 h nach Infektion wurden die Proteine für 1 h
metabolisch markiert und entweder mit 20 mM Jodacetamid (IAA) oder 10 mM N-Ethylmalemid (NEM)
enthaltendem Lysepuffer lysiert und mit polyklonalem Kaninchenserum und Protein A-Sepharose
präzipitiert. Die Präzipitate wurden unter reduzierenden (+ 40 mM Dithiothreitol, DTT) oder nichtreduzierenden (- 40 mM DTT) Bedingungen der Größe nach auf einem 10-13%iger Gradienten-SDS-PAGE
aufgetrennt.
Eine kovalente Dimerisierung wird über intermolekulare Disulfidbrücken unter
Beteiligung der schwefelhaltigen Aminosäure Cystein realisiert. gp34 hat 7 Cysteine an
den Positionen 45, 82, 101, 142, 150, 185 und 201, von denen Cys185 und Cys201 innerhalb
der vorhergesagten Transmembrandomäne liegen und Cys45 und Cys101 als konservierte,
intramolekulare Disulfidbrücken bildende Aminosäuren der Ig-artigen Domäne
vorhergesagt wurden (siehe Abb. 2.6) (Atalay et al., 2002). Bei gp68 kann trotz des
48
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Vorkommens
von
6
Cysteinen
innerhalb
der
Ektodomäne
keine
kovalente
Homodimerisierung beobachtet werden (siehe Abb. 2.10B). Um die Frage zu klären,
welche der 7 Cysteine von gp34 an der Homodimerisierung beteiligt sind, wurden die
löslichen Verkürzungsmutanten unter nicht-reduzierenden Bedingungen hinsichtlich
ihrer Dimerisierungskapazität verglichen. Die Variante gp34(24-156)FL besitzt im
Gegensatz zum Wildtyp nur noch 5 Cysteine in ihrer Ektodomäne, wohingegen gp34(24140)FL und gp34(24-124)FL lediglich noch 3 Cysteine aufweisen (Abb. 2.12).
Überaschenderweise wird unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Abb. 2.12A, linkes
Bild) deutlich, dass alle der genannten Verkürzungsmutanten noch die Fähigkeit besitzen,
mit sich selbst über Disulfidbrücken zu interagieren und Homodimere zu bilden.
Demzufolge wird die intermolekulare Disulfidbrücke von einem der 3 Cysteine an
Position 45, 82 oder 101 ausgebildet, da diese alle Mutanten gemein haben.
Um zu untersuchen, welches der Cysteine für die Homodimerisierung von gp34
verantwortlich ist, wurden die Aminosäuren Cys45, Cys82 und Cys101 auf Basis der
Minimalmutante gp34(24-140)FL durch strukturell und biochemisch ähnliche Serine
mittels zielgerichteter Mutagenese ausgetauscht (Abb. 2.12B). Diese Basismutante wurde
gewählt, da es sich um die minimal funktionierende Bindungseinheit von gp34 mit
lediglich 3 Cysteinen handelt (siehe Abb. 2.8). Die entstandenen Punktmutanten wurden
durch rekombinante Vaccinia Viren überexprimiert. In der anschließenden IP mit antiFLAG-Agarose sieht man, dass unter nicht-reduzierenden Bedingungen lediglich der
Komplettaustausch
aller
drei
Cysteine
gegen
Serine
zum
Verlust
der
Homodimerisierungskapazität führt (Abb. 2.12B). Sowohl die Einzelaustauschmutationen
als auch deren Kombinationen zeigen deutlich, dass beim Wegfall eines Cysteins
alternativ ein anderes die Bildung der intermolekularen Disulfidbrücke übernehmen kann
(Abb. 2.12B). Wichtig für die Ausbildung von Disulfidbrücken ist der Abstand der
Cysteinreste im Molekül. Da alle drei Einzelmutanten dimerisieren können, müssen die
Cysteine 45, 82 und 101 in kritischer räumlicher Nähe zueinander liegen, um miteinander
zu interagieren. Die monomere Form der Cystein-freien Mutante gp34(24-140)FL45/82/101 ist sehr instabil und dadurch im Western Blot nicht detektierbar, was auf den
Wegfall von strukturstabilisierenden Wechselwirkungen hindeutet.
49
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
A
YY
142 150
234
gp34(24-156)FL
gp34(24-124)FL
124
Cysteine der Ektodomäne
85
25kDa
Y N-Glykosylierungsstelle
putative Disulfidbrücke
B
35kDa
27kDa
140
40
kDa
FLAG Epitop
IP:
α-FLAG
29kDa
154
gp34(24-140)FL
IP:
TM
gp34
(24-156)FL
gp34
(24-140)FL
gp34
(24-124)FL
Y
82 101
gp34FL
gp34FL
45
wt
Signal
α-FLAG
wt
gp34(24-140)FL
45
82
45/
45/ 82/ 82/
101 101 101 101 : Position mutierter Cysteine
Trimer
Dimer
40
Expressionskontrolle
*
45
82 101
14
kDa
Monomer
Abb. 2.12: Die Dimerisierung von gp34 erfolgt durch kovalente Disulfidbrückenbildung der Cysteine
innerhalb der Region 24-124. (A) 1x 106 CV-1 Zellen wurden mit rVACV, die gp34FL und die C-terminalen
Verkürzungsvarianten gp34(24-124)FL, gp34(24-140)FL und gp34(24-156)FL exprimieren, für 14 h infiziert.
Anschließend wurden die Zellen lysiert, gefolgt von einer Immunpräzipitation mit anti-FLAG-gekoppelter
Agarose. Die Präzipitate wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen mittels 11%iger SDS-PAGE der
Größe nach aufgetrennt. (B) Cystein-Serin-Austauschmutanten innerhalb der potentiellen Ig-artigenDomäne wurden im Vergleich zu gp34(1-140)FL (siehe Schema) durch rVACV für 14 h in CV-1 Zellen
exprimiert. Die Immunpräzipitation aus den Lysaten erfolgte mit anti-FLAG-gekoppelter Agarose und die
Auftrennung der Proteine unter nicht-reduzierenden Bedingungen durch 11% SDS-PAGE. Als
Expressionskontrolle wurde ein Aliquot des Lysates unter reduzierenden Bedingungen mittels 11%iger SDSPAGE aufgetrennt. Die Detektion erfolgte mittels FLAG-spezifischem Antikörper. *: unspezifische Bande
50
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Die Mutationen der Aminosäuren Cys82 und Cys101 führen außerdem zur verstärkten
Bildung von Trimeren der entsprechenden Größe, die im Wildtypprotein gp34(24-140)FL
nur sehr schwach detektierbar sind. Ursächlich hierfür könnte aufgrund des Wegfalls von
Disulfidbrücken die Stabilisierung von metastabilen Molekülstrukturen sein.
ZUSAMMENFASSUNG
•
gp34 bildet kovalente Homodimere über intermolekulare Disulfidbrücken
•
die Aminosäuren Cys142 und Cys150 sind nicht für die Dimerisierung erforderlich
•
gp34 besitzt vermutlich keine klassische Ig-artige Domäne
2.1.6 Ist die Bildung von kovalenten gp34 Homodimeren Voraussetzung für FcBindung?
Im Abschnitt 2.1.2 wurde beschrieben, dass gp68 als Monomer mit einer 2:1
Stöchiometrie an Fc bindet. Im Gegensatz dazu dimerisiert gp34 mit sich selbst über
intermolekulare
Schwefelbrücken.
Um
die
Frage
zu
beantworten,
ob
die
Homodimerisierung Vorraussetzung für die hoch affine Ligandenbindung ist, waren die
generierten Cysteinaustauschmutationen auf Basis des gp34(24-140)FL Ausgangspunkt für
Fc-Bindungsanalysen mittels IP. Die Punktmutanten wurden ektop mit Hilfe
rekombinanter Vaccinia Viren überexprimiert und die Proteine metabolisch radioaktiv
markiert. Als Expressionskontrolle diente die Präzipitation mit anti-FLAG-gekoppelter
Agarose (Abb. 2.13). Erwartungsgemäß resultiert die Einzel- und Kombinationsmutation
des Cysteins an Position 101 im Vergleich zum Wildtypprotein zum Verlust der FcBindungskapazität von gp34(24-140)FL (Abb. 2.13), da es sich zusammen mit Cys45 um die
vorhergesagten, positionell konservierten und daher strukturgebenden Aminosäuren
innerhalb der proklamierten Ig-artigen Domäne handelt (Atalay et al., 2002).
Überraschenderweise führt im Gegensatz dazu die Veränderung von Cys45 zu Serin nicht
zu der erwarteten Beeinträchtigung der Bindungseigenschaften von gp34, sondern eine
51
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Mutation von Cys82, des dritten Cysteins der vorhergesagten Ig-artigen Domäne
(Abb. 2.13).
Unabhängig davon wurde ein zweiter Datensatz generiert, bei dem die einzelnen
Punktmutationen Cys45 und Cys101 in das Volllängenprotein gp34 eingefügt wurden.
Übereinstimmend wurde die Cys45-unabhängige hFc-Bindung bestätigt (Daten nicht
gezeigt). Da die funktionelle Mutante gp34(24-140)FL-45 noch in der Lage ist,
Homodimere auszubilden liegt die Schlussfolgerung nahe, dass Homodimerisierung
Voraussetzung für eine affine Ligandenbindung ist.
gp34(24-140)FL
45
82
101
45/
101
45/
82/
101 : Position mutierter Cysteine
hFc
20
Expressionskontrolle
α-FLAG
20
45
82 101
kDa
Abb. 2.13: Die Cysteine an Position 82 und 101 von gp34 sind essentiell für die Ligandenbindung. CysteinSerin-Austauschmutanten innerhalb der potentiellen Ig-artigen Domäne von gp34(24-140)FL wurden im
Vergleich zur gp34(24-140)FL Wildtypsequenz (siehe Schema) durch rVACV für 14 h in CV-1 Zellen
exprimiert. Nach metabolischer Markierung erfolgte die Präzipitation aus den Lysaten mit hFc und PAS.
Die Proteine wurden mittels 12% SDS-PAGE aufgetrennt. Als Expressionskontrolle diente die Präzipitation
mit α-FLAG-gekoppelter Agarose.
52
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Nur der Verlust aller der drei Cysteine Cys45, Cys82 und Cys101 der vorhergesagten Igartigen Domäne von gp34 führt zum Verlust der Ligandenbindung. Da alle anderen nichtFc-bindenden Punktmutanten noch in der Lage sind zu dimerisieren, ist die
Homodimerisierung von gp34 eine notwendige, aber nicht hinreichende Voraussetzung
für die Fc-Bindung.
In Abb. 2.12 konnte gezeigt werden, dass die Cysteine an den Positionen 45 und 82 der
Ektodomäne von gp34 im Prinzip in der Lage sind, intermolekulare Disulfidbrücken
auszubilden und dadurch Homooligomere zu formen. Dies schließt auch ein Cystein
(Cys45) ein, das potentiell an der intramolekularen Disulfidbrücke der vorhergesagten Igartigen Domäne (aa 24-122) beteiligt sein sollte (Atalay et al., 2002).
ZUSAMMENFASSUNG
•
die Cysteine Cys82 und Cys101 sind Voraussetzung für die Fc-Bindung von gp34
2.1.7 Besitzt gp34 eine Ig-artige Ektodomänenstruktur?
Die für gp34 von Atalay et al. vorgeschlagene Ig-artige Domäne basiert auf einem
Aminosäuresequenzvergleich mit den extrazellulären Fc-bindenden Domänen der
zellulären Fcγ-Rezeptoren CD16, CD32 und CD64. Ein grundlegendes Domänenmerkmal
ist die Ausbildung einer intramolekularen Disulfidbrücke durch zwei positionell
konservierte Cysteine, die bei gp34 an Position 45 und 101 zu finden sind (Atalay et al.,
2002). Als Folge der Mutation eines der beiden Cysteine sollte demnach die Bildung der
Ig-artigen Domäne durch den Wegfall der intramolekularen Disulfidbrücke nicht mehr
möglich sein und einen Funktionsverlust nach sich ziehen. Die Ergebnisse der
Cysteinpunktmutanten aus Abb. 2.11 weisen darauf hin, dass sowohl Cys45 als auch Cys101
an der Ausbildung von kovalenten Homodimeren durch eine intermolekulare
Disulfibrücke beteiligt sein können. Des Weiteren hat lediglich die Veränderung von
Cys101 einen Einfluss auf die Funktionalität von gp34 (siehe Abb. 2.13), was eine Ig-artige
Domäne in Frage stellt.
53
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Von Davison und Koautoren wurde im Gegensatz dazu eine Homologie der Ektodomäne
von gp34 mit einer so genannten CR1 (conserved region 1, konservierte Region 1)Domäne postuliert (Davison et al., 2003), die ursprünglich in einigen adenoviral
exprimierten Proteinen vorgefunden wurde und ein zentrales, positionell konserviertes
Tryptophan (Trp) besitzt (Deryckere & Burgert, 1996). Die zielgerichtete Mutagenese des
Trp65 auf Basis der Mutante gp34(24-140)FL zeigt, dass ein Aminosäureaustausch von
Tryptophan zu Phenylalanin an dieser Position zu einem vollständigen Verlust der FcBindungskapazität führt (Abb. 2.14).
VACV
wt
gp34(24-140)FL
trp65
hFc
Expressionskontrolle
α-FLAG
20
kDa
Abb. 2.14: Das Tryptophan an Position 65 von gp34 ist essentiell für die Ligandenbindung. Die TryptophanPhenylalanin-Austauschmutante an Position 65 der gp34-Ektodomäne wurde im Vergleich zur gp34(24140)FL Wildtypsequenz (durch rVACV für 14 h in CV-1 Zellen exprimiert. Nach metabolischer Markierung
erfolgte die Präzipitation aus den Lysaten mit hFc und PAS. Die Proteine wurden mittels 12% SDS-PAGE
aufgetrennt. Als Expressionskontrolle diente die Präzipitation mit α-FLAG-gekoppelter Agarose.
Dies könnte zum einen auf eine Beteiligung des Trp65 an der Bindung des Liganden Fc
durch hydrophobe Interaktionen hinweisen, wie sie bereits für CD16 beschrieben wurden
(Radaev et al., 2001). Andererseits bestätigt das in Abb. 2.14 gezeigte Resultat eine
zentrale Rolle des Trp65 bei der Fc-Bindung von gp34 und könnte ein Hinweis auf eine
alternative CR1-Domänenstruktur sein.
54
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
ZUSAMMENFASSUNG
•
das Tryptophan an Position 65 der Ektodomäne ist essentiell für die Fc-Bindung von
gp34
2.2
Nachweis der viralen Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 als Komponenten
des HCMV Virions
2.2.1 Generierung einer rekombinanten gp34HA Epitop-markierten HCMV-Mutante
In Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass sowohl gp34 als auch gp68 mit einer
early-late Kinetik in HCMV-infizierten Zellen synthetisiert werden. 24 h nach Infektion
sind beide Proteine detektierbar, die Expression erreicht das höchste Niveau 72 h p.i.
zeitgleich mit Beendigung eines vollständigen HCMV Replikationszyklus (Atalay et al.,
2002), Henrike Reinhard). Beide vFcγ-Rezeptoren sind Bestandteil der Oberfläche
infizierter Zellen, wobei FACS-Analysen zeigen, dass ein Großteil der Proteine
intrazellulär
lokalisiert
sind
(Henrike
Reinhard,
Eugenia
Corrales-Aguilar,
unveröffentlichte Beobachtung).
Das Vorkommen Fc-bindender Poteine als Teil des HCMV-Virions wird in der Literatur
kontrovers diskutiert. Mit Hilfe von Fc-markierten Goldpartikeln wurde eine Fcbindende Aktivität als Bestandteil des Virion Teguments elektronenmikroskopisch
beschrieben (Stannard & Hardie, 1991). In einer späteren Studie, in der mittels Tandem
Massenspektrometrie hochreiner HCMV-Partikel versucht wurde, die Gesamtheit aller
Proteine des HCMV-Virions nachzuweisen, konnten lediglich gp68, aber keine gp34
Peptide gefunden werden (Varnum et al., 2004). Da es sich sowohl bei gp34 als auch bei
gp68 um nicht-essentielle HCMV-Glykoproteine handelt, war deren Einbau im Virion
fraglich, da der Großteil der in der Virushülle vorkommenden Proteine für eine
erfolgreiche Infektion benötigt wird.
Um die Frage zu beantworten, ob gp34 und gp68 tatsächlich Bestandteil des HCMVVirions sind und in dieser Form antivirale Antikörperantworten abschwächen können,
wurden C-terminal HA-Epitop-markierte Rezeptorvarianten durch zielgerichtete BAC
55
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
(bacterial artificial chromosome)-Mutagenese hergestellt. Eine rekombinante gp68HA
Epitop-markierte (UL118-HA) HCMV-Mutante war bereits vorhanden (Atalay et al.,
2002). Die Methode der BACmid Mutagenese stützt sich auf die schnelle Vermehrung des
HCMV Genoms in E. coli und dessen zielgerichtete Veränderung mit Mitteln der
bakteriellen Genetik, z.B. homologe Rekombination (Borst et al., 1999) und ist in
Abb. 2.15 dargestellt.
PCR-Produkt
HA
RecA+ durch pKD46 bei
30°C / Cam+
Kana
pHB5
RecA+ durch pKD46
bei 30°C / Cam+
Transformation
Homologe Rekombination und KanamycinSelektion
pTRL11HA-Kana
RecA- bei 37°C /
Cam+ Kana+
pKD46
Virus DNA
Transformation
pBAC
Flp-Rekombinase+
durch pCP20 bei
30°C / Cam+ Kana+
pTRL11HA
Flp-Rekombinase– bei
43°C / Cam+ Kana–
MRC-5
Rekonstitution
Ausschneiden der
Kanamycin-Kassette
pCP20
rekombinantes HCMV
Abb. 2.15: Schema der BACmid-Mutagenese von linearen PCR-Fragmenten. Rekombinase inkompetente E.
colis (Stamm DH10B, RecA-) wurden zuerst mit der die BAC-Sequenz enthaltenden Virus DNA und mit
dem temperatursensitiven Plasmid pKD46 transformiert, bevor dessen durch Arabinose stimulierbares
Rekombinase A-Operon induziert wurde (RecA+). Die zur homologen Rekombination befähigten Bakterien
wurden mit dem PCR-Produkt, bestehend aus Selektionsmarker (Kanamycin; Kana), HA-Epitop und den
flankierenden homologen Bereichen entsprechend der Zielsequenz, transformiert. Die positiven Klone
waren nach erfolgreicher Rekombination Kanamycin resistent und wurden erneut bei 30°C mit dem
temperatursensitiven Plasmid pCP20 transformiert. Die Plasmid-kodierte FLP-Rekombinase entfernt Kana
via Resistenz-flankierender frt-Erkennungssequenzen. Nach Negativselektion auf Kanamycin und
Positivselektion auf Chloramphenicol (Cam) wurden die mutierten BACs in permissive Zellen (MRC-5)
transfiziert und rekombinantes HCMV rekonstituiert.
Ausgangspunkt zur Herstellung des rekombinanten Virus gp34HA war das HCMV
Wildtyp BACmid pHB5. gp34 wird im pHB5 von den zwei identischen Genkopien TRL11
und IRL11 kodiert, von denen mindestens eine durch eine HA-Epitop-markierte Variante
des gp34 ersetzt werden sollte (Abb. 2.15, siehe Schema).
56
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
pHB5
TRL11
TRL12
855 bp
pTRL11HA/Kana
TRL11
XbaI
XbaI
TRL12
Kana
HA
frt
frt
pTRL11HA
XbaI
TRL11
1018 bp
A
B
TRL12
HA
frt
pHB5 pTRL11HA
pHB5 pTRL11HA
+
+
--
Kana
C
Sonde: TRL11
--
pHB5 pTRL11HA
Kana
43.167 bp
+
--
Kana
1018 bp
855 bp
10
8
6
5
4
3
lange
Belichtung
2.5
2
1.5
1629 bp
1557 bp
1557 bp
Sonde: Kanamycin
1629 bp
Abb. 2.16: Überprüfung der BAC-Mutagenese zur Generierung des pTRL11HA. Die aus E. coli isolierte
BAC-DNA wurde auf die Insertion des HA-Epitops am C-Terminus des ORFs TRL11 (gp34) überprüft. (A)
5 μg DNA pHB5 und der pTRL11HA Mutante wurden ÜN mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut und
die Fragmente auf einem 0,5%igem Agarosegel verglichen. Die prominentesten Bandenveränderungen im
Schnittmuster als Folge der Insertion und anschließenden Entfernung der Kanamycinresistenz (Kana) sind
markiert (1629 bp Fragment, 1557 bp Fragment). Durch Blotten des Agarosegels wurde die DNA auf eine
Nylonmembran transferiert und mit spezifischen DIG-markierten DNA-Sonden gegen TRL11 und Kana
hybridisiert. (C) Die durch Entfernung der Kanamycinresistenz über frt-Rekombination zurückbleibenden
zusätzlichen 163 bp im HCMV Genom (siehe Schema) wurden durch PCR nachgewiesen. XbaI:
Restriktionsschnittstelle; frt: FLP Rekombinase Erkennungssequenz
57
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Der Austausch beider Kopien (TRL11 und IRL11) durch die HA-Epitop-markierte gp34Variante mittels homologer Rekombination innerhalb eines BACs ist unwahrscheinlich.
Die Herstellung des gp34HA Virus ist in Abbildung 2.16 dargestellt.
Als Zwischenstufe wurden Bakterienkolonien isoliert, die sowohl Chloramphenicol (Cam)
(BAC-DNA),
als
auch
Kanamycin
(Kana)
resistent
waren
(TRL11HA+).
Die
Kanamycinresistenz wurde im letzten Schritt wieder entfernt, das daraus resultierende
BACmid wurde nach Transfektion in permissive MRC-5 Zellen als infektiöse HCMVMutante rekonstituiert. Der durchgeführte Verdau der BAC-DNA nach Isolierung aus den
Bakterien mit dem Restriktionsenzym XbaI diente der Kontrolle der Insertion der
Kanamycinresistenz in die Zielsequenz und des Entfernen dieser im zweiten Schritt
(Abb. 2.16A). Das dabei entstandene Bandenmuster zeigt im Vergleich zur Wildtyp pHB5,
dass die HA-markierte gp34 Sequenz in den TRL11 Lokus inseriert wurde, was durch die
zwei distinkten Banden mit der berechneten Größe 1629 bp und 1557 bp sichtbar wird
(Abb. 2.16B). Die anschließende Entfernung der Resistenz resultiert im Verlust des
1629 bp großen Fragmentes. Eine Southern-Blot-Analyse desselben Agarosegels,
detektiert mit einer Kana-spezifischen DNA-Sonde, zeigt die Insertion bzw. die
Entfernung der Resistenzkassette (Abb. 2.15B). Die erneute Hybridisierung derselben
Membran mit einer IRL11/TRL11-DNA Sonde bestätigt die Spezifität der 1557 bp bzw.
43.167 bp großen Banden. Nach dem Entfernen der Kanamycinresistenz aus dem HCMV
Genom durch frt-Rekombination bleibt eine Fremdsequenz von 163 bp zurück, die durch
PCR nachgewiesen werden konnte (Abb. 2.16C). Das ausgewählte Primerpaar bindet im
TRL11 ORF und im HCMV Genom 3’ von der inserierten Sequenz. Das Amplifikat der
Wildtypsequenz hatte eine Länge von 855 bp, wohingegen das des rekombinanten
TRL11HA Virus 1018 bp groß war (Abb. 2.16C). Das Auftreten der Doppelbande in
Spur 3 erklärt sich durch die Rekombination des TRL11HA lediglich in den TRL11 Lokus,
nicht aber in den mitamplifizierten identischen Lokus IRL11. Die Elongationszeit der
PCR wurde so gewählt, dass es nicht zu einer Amplifikation der inserierten
Kanamycinresistenz kam (2646 bp).
Das generierte rekombinante HCMV TRL11HA wird in der weiteren Arbeit nach dem
markierten Protein als gp34HA bezeichnet.
58
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
2.2.2 gp34 und gp68 sind Oberflächenproteine des HCMV Partikels
Für beide HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 sollte in einem Proteinase KSchutzexperiment ermittelt werden, ob sie Bestandteil der Virushülle sind. Die auf der
Virionoberfläche vorkommenden Proteine sind prinzipiell sensitiv gegenüber der
Behandlung mit Proteinase K (Prot K) und werden auf diese Weise enzymatisch
gespalten, was in einer Größenreduktion oder einem völligen Abbau resultiert. Proteine
hingegen, die sich im Inneren des Partikels befinden, werden erst durch die Zugabe des
Detergens SDS für Prot K zugänglich und dadurch proteolytisch abgebaut. Hierfür
wurden hoch gereinigte, zellfreie Präparationen der Viren gp68HA und gp34HA
hergestellt. 1-2x 106 infektiöse Partikel wurden entweder mit SDS (Abb. 2.17, Spur 5), mit
Proteinase K (Spur 6) oder mit Proteinase K in Kombination mit SDS (Spur 7) inkubiert.
Als Kontrolle diente die gleiche Menge an Viruspartikeln unter Zugabe von PBS (Spur 4)
und ein Zelllysat, welches 72 h nach Infektion genommen wurde (Zeitpunkt maximaler
Abundanz von gp34 und gp68) (Spur 3). Mit einem HA-spezifischen Antikörper kann
man deutlich gp68HA bzw. gp34HA in präparierten HCMV-Virionen detektieren (Abb.
2.17, linkes bzw. rechtes Bild).
59
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
A
L
V
L
V
---
+
--
L
-+
V
+
+
-+
-+
+
--
SDS
Prot K
PNGase F
Endo H
+
--
132
85
*
*
gp68HA
41
*
*
32
*
kDa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
*
*
gB
pp65
pp86
pp72
β-Aktin
B
L
V
L
V
---
+
--
L
-+
V
+
+
-+
-+
+
--
SDS
Prot K
PNGase F
Endo H
+
--
132
85
gp34HA
41
32
kDa
1
2
3
4
5
6
7
8
*
*
*
9
10
*
11
*
gB
pp65
pp86
pp72
β-Aktin
Abb. 2.17: gp34 und gp68 sind Bestandteil der äußeren Virushülle. 1x 106 pfu/ml gereinigte Virionen der
(A) gp68HA und (B) gp34HA-Insertionsmutanten wurden für 15 min bei 56°C mit 0,01% SDS, 1 μg
Proteinase K oder Prot K in Kombination mit SDS behandelt (Spur 5, 6 und 7). Gestoppt wurde die
enzymatische Reaktion durch Zugabe von 2 mM PMSF für 10 min bei 90°C. Als Kontrolle dienten
Gesamtzelllysate 72 h p.i. (Spur 3) und mock-behandelte Proben (Spur 4). Die Deglykosylierung erfolgte für
2 h bei 37°C mittels Endo H oder PNGase F. Die Proben wurden entweder unter nicht-reduzierenden
(Spur 1 und 2) oder unter reduzierenden Bedingungen (Spur 3-11) mittels 10%iger SDS-PAGE aufgetrennt.
Die Detektion im Western Blot erfolgte mit einem HA-spezifischen Antikörper, gefolgt von anti-gB, antipp65, anti-pp72 und anti-β-Aktin spezifischen Antikörpern. Deglykosylierte Proteine sind mit einem *
markiert, gp34 Monomere und Oligomere mit einem Pfei, L: Lysat, V: Virusstock
60
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Die Spaltung des Rezeptors durch das proteolytische Enzym Proteinase K ohne Detergenz
in Spur 6 zeigt, dass beide Rezeptoren Bestandteil der äußeren Virushülle sind. Vergleicht
man die unbehandelten Rezeptorformen von Lysat und Viruspartikel (Spur 3 und 4) fällt
auf, dass sowohl gp68 als auch gp34 nur als hochglykosylierte, d.h. vollständig maturierte
Moleküle im Viruspartikel vorhanden sind. Bestätigt wird diese Annahme durch die
Behandlung von Lysat und Virusstock mit deglykosylierenden Enzymen. Vergleicht man
bei gp68HA die unbehandelte Lysatprobe (Spur 3) mit den deglykosylierten Proteinen
nach Endo H (Spur 8) und PNGase F (Spur 9) Behandlung wird deutlich, dass die
schneller migrierende Glykoproteinform von ca. 68 kDa im Lysat der Endo H sensitiven
Form entspricht, die im Viruspartikel (Spur 10) nicht vorhanden ist. Nach
Deglykosylierung fällt gp68 auf seine ursprüngliche Proteingröße von 33 kDa zurück
(Atalay et al., 2002). Das hochglykosylierte gp68 Molekül ist Endo H resistent. Erst durch
die Behandlung mit PNGase F werden alle N-glykosidischen Zuckerverbindungen
entfernt, was sich in einer 33 kDa großen Form widerspiegeln sollte. Das unerwartete
zusätzliche Auftreten einer ca. 60 kDa großen Bande im Lysat (Spur 9) und der
Viruspräparation (Spur 11) bestätigt offenbar die Anwesenheit zusätzlicher OGlykosylierungen von gp68, die nicht durch Endo H oder PNGase F entfernt werden
können. Die Detektion einer weiteren gp68 Form nach vollständiger Deglykosylierung
(Spur 11) mit einer Größe von ca. 23 kDa ist überraschend, da unmodifizierte gp68
Moleküle anhand der Aminosäuresequenz 33 kDa groß sind. (Spur 8 und 9). Es könnte
sich dabei um eine gespleißte gp68 Variante handeln, die sowohl den N-Terminus für den
Eintritt ins Endoplasmatische Retikulum (ER) als auch den HA-Epitop markierten CTerminus des Wildtypproteins beinhaltet. Alternativ könnte es sich um eine vermutlich
nicht mehr funktionelle, proteolytisch prozessierte Form des gp68 handeln. Die Identität
dieser gp68 Form muss noch geklärt werden.
Die nicht-reduzierenden Bedingungen in Spur 1 und 2 bestätigen für gp34HA im
Gegensatz zu gp68HA das Vorkommen von kovalenten Oligomeren (siehe 2.1.5) im Lysat
und im Viruspartikel. gp34 Monomere sind im Virion nicht detektierbar. Auch bei
gp34HA wird deutlich, dass nur vollständig maturierte, d.h. Endo H resistente
Glykoproteinformen (Spur 10) in das Viruspartikel eingebaut werden, die erst nach
61
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Behandlung mit PNGase F auf die Größe von 24 kDa ihres unmodifizierten
Proteinrückrates fallen (Spur 11).
Abundante Proteine der Virionhülle (gB) und des Teguments (pp65) dienten als
Kontrollen und zeigten die erwartete Lokalisation im Virion. Die Reinheit der
Virionpräparation wurde durch die Abwesenheit der HCMV exprimierten Proteine pp72
(IE1) und pp86 (IE2) kontrolliert. Beide Proteine sind nicht Bestandteil des Virions
werden aber abundant und frühzeitig nach Infektion exprimiert. Die geringe Menge des
zellulären Proteins β-Aktin in den Viruspräparationen im Vergleich zu den
Gesamtzelllysaten weist dessen Vorhandensein im HCMV-Virion (Varnum et al., 2004)
nach, allerdings in viel geringerer Konzentration als im Lysat infizierter Zellen.
ZUSAMMENFASSUNG
•
zwei distinkte Glykoproteinformen von gp68 sind Bestandteil der Virionhülle
•
gp34 ist als Homodimer und Tetramer in die Virionhülle inkorporiert
2.2.3 Quantifizierung der Neutralisierungskapazität verschiedener
Hyperimmunglobulin-Präparationen gegenüber HCMV und HSV-1
Neutralisierende Antikörper (nAk) haben direkte antivirale Eigenschaften. Sie binden für
die Infektion kritische virale Oberflächenantigene und verhindern dadurch die VirusZielzellinteraktion oder den Eintritt des Virus in die Zielzelle (Klasse & Sattentau, 2002).
Sie werden gegen Oberflächenproteine des freien Virus gebildet und gehören
hauptsächlich den Antikörperklassen IgG und IgA an. Neutralisierende Antikörper
erreichen erst zu späteren Zeitpunkten der HCMV Infektion ihren Maximalwert
(Alberola et al., 2000). Um ein möglichst repräsentatives Spektrum an neutralisierendem
IgG
zu
untersuchen,
wurden
kommerzielle
Hyperimmunglobulin-Präparationen
(intravenöses Immunglobulin; IVIG) verwendet. IVIG wird zur Prophylaxe von HCMVErkrankungen eingesetzt (Valantine et al., 2001) und besteht aus stark aufkonzentriertem,
gereinigten IgG vieler HCMV positiver Spender. Es enthält aufgrund der hohen
62
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Seroprävalenz außerdem hohe Konzentrationen von Masern, EBV oder HSV-1
spezifischen Antikörpern (Henrike Reinhard und Eugenia Corrales-Aguilar). Um die
Neutralisationskapazität verschiedener IVIGs gegenüber HCMV (Stamm HB5) und HSV-1
(Stamm
F)
zu
ermitteln,
wurden
Viruspräparationen
mit
einer
einheitlichen
Konzentration an IVIG inkubiert und die Virusneutralisation als Titerreduktion im
Vergleich zu Medium inkubierten Viruspräparationen bestimmt. In Abb. 2.18 kann man
eindeutig erkennen, dass 2 mg/ml des Präparates Cytotect® (Biotest, Dreieich,
Deutschland) zu einer 100fachen HCMV Neutralisation im Vergleich zur mockbehandelten Kontrolle führen. Gammagard® S/D und Kiovig™ der Firma Baxter
(Unterschleißheim, Deutschland) resultieren lediglich in einer 4,5fachen bzw. 3fachen
HCMV Titerreduktion. Beim HSV-1 Wildtypstamm F hingegen führen vergleichsweise
geringe Konzentrationen von 0,1 mg/ml IVIG zur 23fachen (Kiovig™) bzw. 13fachen
(Cytotect®) Titerreduktion, wobei hier Gammagard® S/D mit lediglich 3,5facher
Reduktion
am
schlechtesten
neutralisiert
(Abb. 2.18).
Vervierfacht
man
die
Konzentration der Präparate, sind keine infektiösen HSV-1 Viruspartikel bei Inkubation
mit Cytotect® und Kiovig™ nachweisbar, bei Gammagard® S/D erreicht man lediglich eine
225fache Reduktion des Virustiters (Daten nicht gezeigt).
Diese
Resultate
lassen
die
Schlussfolgerung
zu,
dass
vergleichsweise
hohe
Konzentrationen neutralisierender IgG-Antikörper in allen getesteten IVIGs gegenüber
HSV-1 im Gegensatz zu HCMV vorhanden sind. Vermutlich besteht ein ähnliches
Verhältnis bei den Serum-IgG-Konzentrationen der Mehrzahl der Serumdonoren. Für alle
weiteren Experimente wurde aufgrund der guten Neutralisierungskapazität gegenüber
HCMV und HSV-1 nur noch das IVIG Cytotect® Präparat verwendet.
63
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
6
5
4
6
HCMV HB5
pfu/ml (log10)
pfu/ml (log10)
7
Medium Cytotect Gammagard Kiovig
HSV-1 F
5
4
3
Medium Cytotect Gammagard Kiovig
Abb. 2.18: Neutralisierungskapazität verschiedener IVIG-Präparate gegenüber HCMV und HSV-1. 5x 1051x 106 pfu des HSV-1 Stamm F und HCMV Stamm HB5 wurden mit 0,1 mg/ml bzw. 2 mg/ml IVIG für 1,5 h
bei 37°C inkubiert, bevor das Virus/IVIG-Gemisch auf MRC-5 Zellen (HCMV) oder Vero Zellen (HSV-1)
gegeben wurde. Als Kontrolle diente die Inkubation der Viren mit Medium. Zwei Tage nach Infektion
wurden bei HSV-1 mikroskopisch Plaques gezählt. Bei HCMV wurden die infizierten Zellen nach 3 Tagen
durch Immunfärbung nachgewiesen. Jeder Balken ist der Mittelwert ± SD aus einer Dreifachbestimmung.
2.2.4 Die cytomegaloviralen Fcγ-Rezeptor-defizienten Mutanten wachsen wildtypartig
in vitro
Um auszuschließen, dass die Deletion der viralen Fcγ-Rezeptoren im HCMV der
verwendeten Mutanten Δgp68, (ΔUL118), Δgp34 (ΔIRL/ΔTRL11) und Δgp68/Δgp34,
(ΔUL118/ΔIRL/ΔTRL11) einen generellen Effekt auf das Wachstum der Viren und dessen
Infektiösität in vitro hat, wurden Wachstumsanalysen auf Fibroblasten durchgeführt.
Dabei war im Vorfeld schon bekannt, dass sowohl gp34 als auch gp68 für das Virus nicht
essentiell sind und die HCMV-Deletionsmutanten Δgp68 (ΔUL118) und Δgp34
(ΔIRL/ΔTRL10-14) keine Replikationsnachteile in Fibroblasten aufwiesen (Atalay et al.,
2002). Hierbei wurde das Wachstum des HCMV Wildtyps mit den Fcγ-Rezeptor
defizienten Mutanten Δgp68, Δgp34 und Δgp68/Δgp34 über einen Zeitraum von acht
Tagen verglichen. Wie in Abb. 2.19 zu erkennen ist, gibt es keine signifikanten
Wachstumsunterschiede des Wildtyps HB5 (in schwarz) und den vFcγ-Rezeptor
Mutanten in vitro. Bereits nach sechs Tagen haben alle Viren einen Titer von ca.
1x 106 pfu/ml erreicht.
64
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
7
HB5
Δgp68
Δgp34
Δgp68/
Δgp34
pfu/ml (log10)
6
5
4
3
2
0
2
4
d p.i.
6
8
Abb. 2.19: Die vFcγR-Mutanten haben kein Wachstumsdefizit in vitro. Vergleichende Replikationsanalysen
der HCMV-kodierten FcγR wurden auf MRC-5 Zellen über acht Tage mit einer Infektion von
0,05 MOI/Loch in Duplikaten durchgeführt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Proben auf -80°C
eingefroren, wobei d0 p.i. der eingesetzten Virusmenge entspricht. Der Titer wurde aus allen Überständen
zum gleichen Zeitpunkt in einer Doppelbestimmung durch Immunfärbung ermittelt.
ZUSAMMENFASSUNG
•
gp34 und gp68 sind nicht essentiell für das Wachstum von HCMV auf Fibroblasten in
vitro
2.2.5 gp34 und gp68 interferieren nicht mit HCMV-spezifischen neutralisierenden
Antikörpern
In vorangegangenen Arbeiten wurde gezeigt, dass der heterodimere HSV-1 kodierte FcγR
gE/gI
die
Funktion
neutralisierender
IgG-Antikörper
und
Fc-vermittelte
Effektoreigenschaften von Antikörpern inhibiert. Dabei bindet der Fcγ-Rezeptor den FcTeil des Antikörpers, der bereits über seine F(ab)2-Domäne spezifisch ein virales Antigen
erkannt hat (Dubin et al., 1991, Frank & Friedman, 1989). Dieser so genannte antibody
bipolar bridging-Mechanismus wird als Ursache für die Beeinträchtigung der antiviralen
Kapazität von Antikörpern bei HSV-1 diskutiert (Frank & Friedman, 1989,
Nagashunmugam et al., 1998). Für die HCMV-kodierten partikelständigen Fcγ65
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Rezeptoren gp34 und gp68 sollte in Neutralisationstests (NT) geklärt werden, ob sie
ebenso die humorale Immunantwort umgehen können, indem sie neutralisierende
Antikörper am Fc-Teil fixieren. Hierfür wurden HCMV wt HB5 mit den Fcγ-Rezeptor
defizienten Mutanten Δgp68, Δgp34 und Δgp68/Δgp34 in Anwesenheit von seriell
verdünntem IVIG (Cytotect®) verglichen. Der Einfluss der vFcγR würde durch eine
unterschiedliche Sensitivität der Mutanten gegenüber neutralisierenden Antikörpern
sichtbar werden. Verglichen wurde der HSV-1 wt bzw. die Virusrevertante gE-Rev mit
ΔgE, für die bereits die Beeinträchtigung der neutralisierenden Antikörper durch den
herpesviralen Fcγ-Rezeptor publiziert wurde (Frank & Friedman, 1989). Zuerst wurden
geringe Mengen an Viruspartikeln (ca. 50 pfu/Ansatz) mit steigenden Konzentrationen an
IVIG inkubiert. Wie in Abb. 2.20A zu erkennen ist, führt IVIG zu einer dosisabhängigen
Virusneutralisation, dargestellt als Prozent der eingesetzten mock-inkubierten (Medium)
Virusmenge.
Berechnet
man
die
IVIG-Verdünnung,
die
für
eine
50%ige
Virusneutralisation erforderlich ist, zeigen sich keine signifikanten Unterschiede der
Mittelwerte aller Mutanten im Vergleich zum Wildtyp HB5 (siehe überlappende
Standardabweichungen). Das heißt, die Anwesenheit der vFcγ-Rezeptoren beeinflusst
nicht die antivirale Wirkung der neutralisierenden Antikörper des IVIGs. Führt man
einen vergleichbaren Versuch mit einem 2000fachen höheren Virusinokulum durch und
drei verschiedenen Antikörperverdünnungsstufen, beobachtet man lediglich bei der 1:80
Verdünnung des IVIGs, was einer ungefähren Konzentration von 0,63 mg/ml entspricht,
einen geringen Effekt auf die Virusneutralisation der Mutanten Δgp34 und Δgp68/Δgp34
gegenüber HB5 und Δgp68 (Abb. 2.20B). Die Menge an infektiösen und nicht-infektiösen
Partikeln kann innerhalb der verschiedenen Virusstockpräparationen schwanken. Die
Ausstattung der Antigene auf der Virushülle der unterschiedlichen Partikel ist
vergleichbar. Es besteht die Möglichkeit, dass bei geringen Serumkonzentrationen die
neutralisierenden Antikörper limitierend sind, da sie auch nicht-infektiöse Virionen
erkennen.
66
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
B
A
75
wt
Δgp68
Δgp34
Δgp68/
Δgp34
6
pfu/ml (log10)
Virus Neutralisation (%)
100
IVIG
50
Medium
1:20
1:40
5
4
3
2
25
1
0
256
8192
wt
16384
Δgp68
Δgp34
Δgp68/
Δgp34
IVIG Verdünnung (1/x)
C
D
IVIG
6
Medium
1:25
IVIG
6
5
Medium
1:125
1:300
1:500
5
pfu/ml (log10)
pfu/ml (log10)
1:80
4
3
2
1
4
3
2
1
TB40-wt
Δgp68
Δgp34
wt
ΔgE
gE-Rev
Abb. 2.20: HCMV und HSV-1 kodierte Fcγ-Rezeptoren interferieren nicht mit den neutralisierenden
Antikörpern der IVIG-Präparation. (A) 50 pfu HCMV wt und Fcγ-Rezeptordeletionsmutanten wurden mit
den angegebenen Verdünnungen an IVIG für 1,5 h bei 37°C inkubiert, bevor sie auf MRC-5 Zellen gegeben
wurden. Nach 3 Tagen wurden die Zellen fixiert, mit einem Antikörper gegen das frühe HCMV-Antigen
p52 gefärbt und gezählt. Jeder Messpunkt entspricht dem Mittelwert aus drei Messungen. (B) HCMV wt and
FcγR-Deletionsmutanten (105 pfu) wurden mit verschiedenen Konzentrationen an IVIG inkubiert und
gezählt wie oben angegeben. Jede Säule entspricht dem Mittelwert ± SD einer Vierfachbestimmung. (C) Der
endotheliotrope HCMV BAC TB40-wt und die entsprechenden FcγR-Mutanten wurden mit 2 mg/ml IVIG
wie beschrieben inkubiert. Gezeigt ist der Mittelwert einer Vierfachbestimmung ± SD. (D) Nach Inkubation
von 5x 105 pfu HSV-1 mit zwei Verdünnungsstufen an IVIG für 1,5 h bei 37°C wurde der
Virus/Antikörpermix auf Vero Zellen gegeben. 36 h nach Infektion wurden die Virusplaques gezählt. Jede
Säule entspricht dem Mittelwert ± SD einer Vierfachbestimmung.
67
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Vergleicht man klinische HCMV Isolate mit Laborstämmen sieht man Unterschiede der
Viren in ihrer Sensitivität gegenüber neutralisierenden Antikörpern der IVIG Präparation
Cytotect® (Henrike Reinhard, unveröffentlichte Daten). Um zu untersuchen, ob eine
mögliche provirale Wirkung der vFcγ-Rezeptoren in Anwesenheit neutralisierender IgGAntikörper eventuell nur bei weniger in vitro passagierten HCMV Stämmen nachweisbar
ist, wurde ein weiterer HCMV-Stamm mit den entsprechenden Fcγ-Rezeptor defizienten
Mutanten im Neutralisationstest untersucht. Hierbei wurde das wt BACmid TB40
endotheliotropen Stamms TB40/E genutzt (Sinzger et al., 2008). Bei diesem Stamm ist die
Aminosäuresequenz im Bereich UL128-131 korrekt erhalten, weshalb er noch die
Fähigkeit besitzt, Zielzellen der HCMV Infektion in vivo, wie Endothelzellen, Monozyten
und Makrophagen effizient zu infizieren (Wang & Shenk, 2005a). Wie in Abb. 2.20C
deutlich wird, hat auch hier die Anwesenheit der vFcγ-Rezeptoren im Virion keine
proviralen Effekte in Gegenwart von neutralisierendem IgG. Die Inkubation der Viren
mit 2 mg/ml IVIG führt sowohl beim Wildtyp als auch bei den Mutanten zu einer 58fachen Titerreduktion im Vergleich zur Kontrollinkubation mit mock-Medium.
Als Vergleichsexperiment wurde HSV-1 wt mit der herpesviralen Fcγ-Rezeptormutante
ΔgE und der entsprechenden Revertante gE-Rev unter den gleichen Bedingungen wie in
(B) und (C) analysiert (Abb. 2.20D). Bei HSV wird deutlich, dass alle Viren bei einer
IVIG-Konzentration von 0,1-0,17 mg/ml ähnlich stark neutralisiert werden, unabhängig
von der Anwesenheit des viralen Fcγ-Rezeptors. Eine vergleichsweise geringe
Konzentration von 0,4 mg/ml führt einheitlich zur kompletten Neutralisation von HSV-1.
Transfiziert man HCMV-permissive MRC-5 Zellen mit dem Kontrollplasmid pTAControl, wird nach HCMV-Infektion und Genexpression durch Transaktivierung
Luziferase aktiv induziert (Henrike Reinhard und Mirko Trilling, unpublizierte
Beobachtung). Dieser unabhängige zweite Neutralisationstest bestätigt, dass sowohl der
HCMV wt als auch die Fcγ-Rezeptordeletionsmutanten in Gegenwart von IVIG
vergleichbar dosisabhängig neutralisiert werden (Abb. 2.21). Als Kontrolle der LuziferaseTransaktivierung durch virale Genexpression diente UV-inaktiviertes Virus, das keine
Luziferase-Expression auslösen konnte. Die spezifische Neutralisation in Anwesenheit von
IVIG wurde durch die Inkubation der Viren mit dem Serum eines HCMV negativen
68
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Spenders überprüft. Ein Teil des Luziferase-Lysates wurde mittels SDS-PAGE aufgetrennt
und die Menge des viralen Phosphoproteins pp72 (immediate early Transkipt 1, IE1) im
Western Blot detektiert. Die etwas geringeren pp72 Mengen der Mutanten im Vergleich
zum Wildtyp HB5 ist auf eine etwas geringere Infektionsdosis zurückzuführen. Als
Kontrolle der gleichmäßigen Gelbeladung diente die Detektion des zellulären Proteins βAktin.
80
60
40
HB5
Δgp68
Δgp34
1:100
1:50
negativ
IVIG
UV
Medium
1:100
1:50
negativ
IVIG
UV
Medium
1:100
1:50
negativ
IVIG
UV
Medium
negativ
UV
Medium
0
1:100
20
1:50
% der unbehandelten
Kontrolle
100
IVIG
Δgp68/ Δgp34
pp72
β-Aktin
Abb. 2.21: Ein Reportergen-basierter Neutralisationstest zeigt keine Unterschiede in der Sensitivität der
HCMV-FcγR-Mutanten gegenüber IVIG im Vergleich zum wt. MRC-5 Zellen wurden transient mit 2 μg
des Plasmids pTA-Control über Nacht transfiziert. 5x 104 pfu des HCMV wt HB5 und der vFcγ-Rezeptor
defizienten Mutanten wurden für 1,5 h bei 37°C mit den angegebenen Verdünnungen IVIG, Medium oder
mit 1:50 verdünntem HCMV-negativen Humanserum inkubiert. UV-inaktiviertes Virus diente als Kontrolle
und wurde für die angegebene Zeit in Medium inkubiert. Die transfizierten Zellen wurden mit 4 MOI
Virus/Antikörpermix für 24 h infiziert. Nach der Zelllyse folgte die Luziferasemessung. Jeder Wert ist der
Mittelwert einer Dreifachbestimmung und wird als x-faches der in Medium inkubierten Viruskontrolle
angegeben. Ein Aliquot desselben Lysats wurde mittels SDS-PAGE separiert und mit IE1-pp72 und β-Aktin
gleichzeitig detektiert. UV: UV-inaktiviertes HCMV, negativ: HCMV-negatives Humanserum
Im Neutralisationstest betrachtet man nur die Phase der initialen Infektion nach
Inkubation der Viren mit verschiedenen Konzentrationen an antiviralen Antikörpern. In
einem weiterführenden Experiment wurde die Auswirkung neutralisierender Antikörper
69
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
auf den Verlauf der Infektion in An- bzw. Abwesenheit der vFcγ-Rezeptoren über
mehrere Tage dokumentiert. Hierbei wurde, wie bereits in Abb. 2.20 beschrieben, der
HCMV wt HB5 im Vergleich zur Fcγ-Rezeptor defizienten Mutante Δgp68/Δgp34 mit
Cytotect® inkubiert, bevor MRC-5 Zellen mit dem Virus/Antikörpermix infiziert wurden
(„Präinkubation“). Der Einfluss der viralen Fcγ-Rezeptoren freiwerdender Virionen auf
die Infektion neuer Zellen nach einem Replikationszyklus wurde durch Inkubation der
Viren mit Antikörpern nach der initialen Infektion untersucht. Der Zellrasen wurde zwei
Stunden nach Infektion gewaschen und über den Zeitraum der Kinetik mit Antikörper
enthaltendem Medium überschichtet („Postinkubation“). Die IVIG Konzentration wurde
entsprechend so gewählt, dass sie zur Titerreduktion, aber nicht zur vollständigen
Neutralisation der eingesetzten Viren führte und betrug ca. 0,1 mg/ml. Zur Kontrolle
wurden die Viren in Medium oder in HCMV negativem Serum vergleichbarer
Konzentration inkubiert.
Der erste Zeitpunkt (d0) der Titermessung in Abb. 2.22A spiegelt das Szenario eines
Standard-NT wider. Die Titerabnahme am Tag d0 resultiert aus der Inkubation der Viren
mit neutralisierenden Antikörpern (rote Kurve, IVIG). Die Reduktion variiert zwischen
wt und Mutante, da der Partikelinput sich um eine halbe log10-Stufe unterscheidet und bei
gleicher Antikörperkonzentration weniger Viren effektiver neutralisiert werden. Der
Titer fällt bei beiden Viren unter die Nachweisgrenze am Tag 2 als Folge der Inkubation
mit neutralisierenden Antikörpern zum Zeitpunkt der Infektion. Beide Titer steigen
parallel zu den Kontrollinkubationen mit Medium und Negativserum stetig an, wobei
durch die geringere Virusmenge der wt verspätet die Nachweisgrenze (NG) überschreitet.
Überschichtet man die bereits infizierten Zellen mit IVIG-haltigem Medium, so wird ein
Großteil der Viren nach der ersten Replikationsrunde am Tag 3 neutralisiert und kann
dadurch keine neuen Zellen infizieren (Abb. 2.22B). Weil über die ganze Zeit der
Replikationsanalyse Antikörper im Überstand sind, erreicht die FcγR-defiziente Mutante
nicht ganz den Wildtyptiter. Der wt zeigt wiederum im Gegensatz zur Mutante einen
verspäteten Titeranstieg, der Unterschied zu den Kontrollkurven ist allerdings spätesten
am Tag 6 vergleichbar mit der Mutante.
70
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
HB5
7
7
5
5
4
4
3
2
2
1
1
2
4
d p.i.
B
6
8
0
pfu/ml (log10)
7
6
5
4
3
4
3
1
Medium
8
6
5
1
6
4
d p.i.
6
2
4
d p.i.
2
7
2
2
NG
Postinkubation
3
0
Präinkubation
6
6
0
pfu/ml (log10)
Δgp68/Δgp34
pfu/ml (log10)
pfu/ml (log10)
A
0
8
IVIG
NG
2
4
d p.i.
6
8
neg. Serum
Abb. 2.22: Die vFcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 haben keinen Einfluss auf die Infektiösität von HCMV in
Anwesenheit neutralisierender Antikörper. In Anwesenheit von IVIG oder HCMV-negativem Serum
wurden vergleichende Replikationsanalysen der FcγR-defizienten Mutante (Δgp68/Δgp34) und des HCMV
wt HB5 auf MRC-5 Zellen in Duplikaten durchgeführt. (A) 0,1 mg/ml Antikörper wurde für 1 h bei 37°C
mit 1x 104 pfu/ml HCMV inkubiert (Präinkubation), bevor der Mix auf MRC-5 Zellen gegeben wurde. (B)
Vergleichend wurden MRC-5 Zellen mit 1x 104 pfu/ml Virus infiziert, 2 h p.i. mit PBS gewaschen und in
0,1 mg/ml Antikörper für den gesamten Zeitraum inkubiert (Postinkubation). Zu den angegebenen
Zeitpunkten wurde der Virustiter als Doppelbestimmung ermittelt, wobei d0 p.i. der eingesetzten
Virusmenge entspricht. NG: Nachweisgrenze: 40 pfu/ml
ZUSAMMENFASSUNG
•
weder gp34 noch gp68 interferieren HCMV-Stamm unabhängig mit der antiviralen
Wirkung neutralisierender IgG-Antikörper
•
der
HSV-1
kodierte
Fcγ-Rezeptor
gE
beinträchtigt
nicht
die
Wirkung
neutralisierender IgG-Antikörper
71
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
2.2.6 Definierte IgG Subklassen entscheiden nicht über die Hemmung neutralisierender
IgG-Antikörper durch gp34 und gp68
Die Anwesenheit von sowohl cytomegaloviralen als auch herpesviralen Fcγ-Rezeptoren
als Bestandteil der äußeren Virushülle macht sie zu potentiellen Antigenen. Für gp68 und
gE konnte die Existenz spezifischer Antikörper im Serum nachgewiesen werden, die
antivirale Effektormechanismen vermitteln (Eugenia Corrales-Aguilar, unveröffentlichte
Daten). Um zu verhindern, dass vFcγR-spezifische Antikörper die eventuelle hemmende
Wirkung von gp34 und gp68 auf neutralisierende IgG-Antikörper verhindern, wurden
HCMV-spezifische
monoklonale
Antikörper
mit
definierter
Antigenerkennung
verwendet.
Ein Hauptantigen neutralisierender Antikörper gegenüber HCMV ist das Glykoprotein B
(Alberola et al., 2000, Marshall et al., 1992). Es ist eines der dominanten
Oberflächenglykoproteine des HCMV Partikels mit verschiedenen Epitopen für
neutralisierende Antikörper und spielt eine bedeutende Rolle beim Zelleintritt von
HCMV in Fibroblasten. Unter diesen findet man die am besten charakterisierten
immundominanten antigenen Domänen 1 und 2 (AD-1 und AD-2) (Meyer et al., 1992,
Utz et al., 1989, Wagner et al., 1992). Der humanisierte monoklonale Antikörper ITC88
erkennt das N-terminale Fragment innerhalb der AD-2-Domäne (Epitop) von gB und
entwickelt seine neutralisierende Kapazität durch die Inhibierung der Virus-Zell-Fusion
in vitro (Gicklhorn et al., 2003, Ohlin et al., 1993). Es wurde berichtet, dass die Subklassen
IgG1 und IgG3 die Mehrheit HCMV-spezifischer neutralisierender Antikörper nach
Infektion darstellen, wobei IgG3 ungefähr zehnmal effektiver neutralisiert (Gilljam &
Wahren, 1989, Gupta et al., 1996). Allerdings ist die Verteilung der IgG-Subklassen im
Serum nicht gleichmäßig. IgG1 und IgG2 sind mit jeweils 60% und 30% am stärksten
vertreten wohingegen IgG3 und IgG4 nur jeweils 5% der Gesamtantikörpermenge
darstellen. Sowohl gp34 als auch gp68 binden mit starker Affinität den Fc-Teil
monomerer Antikörper aller 4 Subklassen. Um auszuschließen, dass die unterschiedliche
Abundanz von IgG1-4 die Hemmung neutralisierender Antikörper unterrepräsentierter
Subklassen durch gp34 oder gp68 im Neutralisationstest verdeckt, wurden monoklonale
Antikörper definierter Subklassen verwendet. Die Neutralisationstests wurden in
72
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Anwesenheit aufgereinigter ITCC88 Antikörper der Subklassen IgG1 und IgG3, die ein
definiertes Epitop erkennen, durchgeführt. Die HCMV Fcγ-Rezeptor-defizienten
Mutanten wurden im Vergleich zum wt entweder mit 15 μg ITC88-IgG1 (Abb. 2.23A)
oder mit 8 μg ITC88-IgG3 (Abb. 2.23B) inkubiert. Beide Konzentrationen wurden im
Vorfeld getestet und so gewählt, dass sie zu einer Titerreduktion des wt um 1-1,5 log10Stufen im Neutralisationstest führen.
A
B
Medium
6
ITC88-IgG1
5
pfu/ml (log10)
pfu/ml (log10)
6
4
3
4
3
2
1
1
Δgp68
Δgp34
Δgp68/
Δgp34
ITC88-IgG3
5
2
wt
Medium
wt
Δgp68
Δgp34
Δgp68/
Δgp34
Abb. 2.23: gp34 und gp68 hemmen nicht die neutralisierende Wirkung gB AD-2-spezifischer Antikörper
definierter Subklassen. 15 μg des humanisierten monoklonalen anti-gB Antikörpers (ITC88) der Subklasse
IgG1 (A) und 8 μg des ITC88-IgG3 Antikörpers (B) wurden mit dem HCMV wt und den vFcγ-Rezeptor
Mutanten wie in Abb. 2.16 beschrieben inkubiert. Jeder Messpunkt entspricht dem Mittelwert ± SD einer
Vierfachbestimmung.
Entgegen der Erwartungen sind die viralen Fcγ-Rezeptor Mutanten weniger sensitiv in
Anwesenheit gB AD-2-spezifischer Antikörper im Vergleich zum HCMV Wildtyp,
unabhängig der verwendeten Subklasse der neutralisierenden Antikörper. Weder gp34
noch gp68 schützen signifikant das HCMV Virion vor Neutralisation. Warum die vFcγRezeptor-Einzelmutanten schwächer als das komplett Rezeptor-defiziente Virus
(Δgp68/Δgp34) neutralisiert wurden, muss noch weiter untersucht werden. Die
Wegnahme von Oberflächenrezeptoren wie den viralen Fcγ-Rezeptoren als Bestandteil
73
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
der äußeren Virushülle könnte sich auf die Antigenverteilung (gB-Abundanz) oder
Erkennung durch neutralisierende Antikörper auswirken.
ZUSAMMENFASSUNG
•
gp34 und gp68 stören nicht die neutralisierende Kapazität gB AD-2-spezifischer
Antikörper der Subklassen 1 und 3
2.2.7 gp34 und gp68 interferieren nicht mit der Virustransmission über Muttermilch
Im Zuge der Reaktivierung treten zellfreie Viruspartikel auf, die über verschiedene
Körperflüssigkeiten, wie Speichel und Muttermilch transmittiert werden. Dort findet man
drastische
Unterschiede
in
der
Verteilung
der
Antikörperklassen
und
deren
Konzentrationen im Vergleich zum Serum. In der Muttermilch ist sekretorisches IgA der
am häufigsten vorkommende Antikörper, gefolgt von 150mal weniger IgG, im Gegensatz
zu Serum, in dem IgG die dominante Antikörperklasse darstellt. Eine weitere
Besonderheit der Muttermilch ist das verstärkte Vorkommen der Subklasse IgG1, die rund
ein Drittel mal höher konzentriert ist als im Serum (Mehta et al., 1989). Um zu
überprüfen, ob die variierte Antikörperzusammensetzung bzw. deren unterschiedliche
Konzentration entscheidend für die Wirkung der viralen Fcγ-Rezeptoren auf
neutralisierende Antikörper sind, wurden NTs mit Muttermilch einer HCMV-positiven
Spenderin durchgeführt. Die Probe wurde zuvor zur Inaktivierung von Komplement für
30 min bei 56°C inkubiert. Die Inkubation des HCMV wt und der Fcγ-Rezeptor Mutanten
mit 1:2 vorverdünnter Muttermilch führt zur Titerreduktion aller verwendeten Viren um
1-1,5 log10-Stufen (Abb. 2.24A).
74
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
A
B
6
Medium
Muttermilch
IgG-depletierte
Muttermilch
Muttermilch
--
pfu/ml (log10)
5
+
IgG-Depl.
IgG
4
3
2
1
wt
Δgp68
Δgp34
Δgp68/
Δgp34
Abb. 2.24: Die Anwesenheit vFcγ-Rezeptoren erleichtert nicht die HCMV Transmission durch
Muttermilch. (A) Muttermilch einer HCMV-positiven Spenderin wurde 1:2 in Medium vorverdünnt. Die
Hälfte der Probe wurde durch Inkubation mit Protein G-Sepharose (PGS) für 2 h bei 4°C IgG-depletiert.
HCMV wt und FcγR-Mutanten wurden mit dem Überstand des PGS-Pellets, der unbehandelten
Muttermilch oder mit Medium wie unter Abb. 2.16 inkubiert. Die Mittelwerte ± SD entstammen einer
Vierfachbestimmung. (B) 10 μl einer 1:2 Vorverdünnung von unbehandelter oder IgG-depletierter
Muttermilch wurden auf die Anwesenheit von IgG im Western Blot mittels eines anti-human-IgG
überprüft. Die Proteine wurden in einer 10% SDS-PAGE aufgetrennt.
Da nicht nur IgG, sondern auch IgA neutralisierende Kapazitäten hat, wurde zwischen
der Wirkung beider auf HCMV durch die Depletion von IgG unterschieden. Dafür wurde
die Muttermilch mit Protein G-Sepharose inkubiert. Kontrolliert wurde die Depletion
durch Detektion mit einem IgG-spezifischen Antikörper im Western Blot (Abb. 2.24B).
Die Titerunterschiede zwischen den schwarzen und grauen Balken in Abb. 2.24A sind die
Folge der antiviralen Wirkung neutralisierender IgG Moleküle. Sowohl der Titer des
HCMV wt, als auch der Mutanten wird durch die Anwesenheit von IgG um den Faktor 10
reduziert (Abb. 2.24A). Die Unterschiede zwischen Inkubation mit Medium und mit
Muttermilch resultieren offenbar aus der Anwesenheit weiterer antiviraler Faktoren in
der
Muttermilch,
im
Wesentlichen
aber
vermutlich
durch
neutralisierendes
sekretorisches IgA, das nicht von gp34 oder gp68 gebunden werden kann (Atalay et al.,
2002). Überraschenderweise zeigen die Daten, dass die neutralisierende Kapazität der
Muttermilch gegenüber HCMV zur Hälfte durch IgG gewährleistet wird, erkennbar
durch den Virustiteranstieg nach IgG-Depletion. Nach gängigen Vorstellungen sollte
75
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
primär sekretorisches IgA die neutralisierende Antikörperklasse der Muttermilch sein.
Weder gp34 noch gp68 vermindern die neutralisierende Wirkung der Muttermilch. Die
Anwesenheit der vFcγ-Rezeptoren auf der Oberfläche des Viruspartikels erleichtert nicht
die Transmission von HCMV durch Muttermilch.
ZUSAMMENFASSUNG
•
gp34 und gp68 beeinflussen nicht die Transmission von HCMV Partikeln über die
Muttermilch
•
IgG der Muttermilch ist die dominante Klasse neutralisierender Antikörper gegenüber
HCMV
2.2.8 gp34 und gp68 unterscheiden sich gegenüber gE in ihrem Einfluss auf die Fcabhängige Komplement-vermittelte Virolyse
Erkennt ein Antikörper mittels seiner Fab-Region ein spezifisches Antigen, führt diese
Antigen-Antikörper-Interaktion großer Wahrscheinlichkeit nach zu konformationellen
Änderungen im IgG-Fc-Teil des Antikörpers (Woof & Burton, 2004). Infolge dessen kann
C1q, die erste Komponente der klassischen Komplementkaskade, innerhalb der CH2Subdomäne der Fc-Region binden und so den initialen Schritt der kaskadenartigen
Komplementaktivierung einleiten. Ist der so genannte membranangreifende Komplex
(membrane attack complex (MAC) formiert, kommt es zur Virolyse oder Zelllyse.
Lediglich
drei
der
vier
IgG-Subklassen
können
Komplement
aktivieren
(IgG3>IgG1>IgG2), das heißt C1q binden, was in der unterschiedlichen Flexibilität der
hinge-Region der Antikörper begründet liegt (Oi et al., 1984). Per Definition sind
neutralisierende Antikörper antiviral aus sich heraus und bedürfen die Zuhilfenahme
weiterer Faktoren nicht (siehe 1.4.1). Demnach können Komplement-bindende
Antikörper Viruspartikel erkennen und zerstören, das gebundene Epitop allerdings gehört
nicht notwendigerweise zu denen, die durch neutralisierende Antikörper erkannt
werden.
76
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Für den herpesviralen Fcγ-Rezeptor gE konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von
gE auf der Oberfläche des Virions HSV-1 vor Komplement-vermittelter Virolyse schützt
(Nagashunmugam et al., 1998). Ob dabei der vFcγR und die erste Komponente der
Komplementkaskade C1q direkt um die Bindungsstelle an den Fc-Teil kompetitieren oder
es zu strukturellen Umlagerungen innerhalb der Domäne nach Bindung an den Liganden
kommt, ist bis jetzt nicht bekannt. Um die Frage zu beantworten, ob gp34 und gp68 mit
der Bindung von Komplement an den IgG-Fc-Teil interferieren können, wurde der
Virustiter in Anwesenheit von HCMV-spezifischen Antikörpern mit und ohne
Komplement bestimmt. Frisches Serum HCMV und HSV-1 negativer Spender wurde
mittels Protein G-Sepharose IgG-depletiert und diente als Komplementquelle.
Es wurde berichtet, dass die Zugabe von Komplement in Anwesenheit von immunem IgG
zu einer 2-3fachen Titerreduktion bei HCMV führt (Spiller et al., 1997). In Abb. 2.25A
resultiert die Anwesenheit von 15% Humanserum als Komplementquelle in einer 35fachen Verstärkung der antiviralen Wirkung des IVIG. Komplement in Abwesenheit
von Antikörpern hat keine hemmende Wirkung auf HCMV (vergleiche Abb. 2.25A
weiße und hellgraue Balken). Vergleicht man den HCMV wt mit den Fcγ-Rezeptor
Mutanten, findet man keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Titerreduktion als
Einfluss des Komplements (Abb. 2.25A). gp34 und gp68 sind demzufolge nicht in der
Lage, die Fc-abhängige, Komplement-vermittelte Virolyse zu hemmen. Für HSV-1 wurde
berichtet, dass der vFcγ-Rezeptor gE mit der Komplement-vermittelten Virolyse durch
IgG interferiert (Frank & Friedman, 1989). Bei dem zum Vergleich untersuchten HSV-1
wt im Vergleich zur gE-defizienten Mutante mit entsprechender Revertante erkennt man
in der Tat eine deutliche Titerreduktion als Folge der Zugabe von Komplement zur IVIGPräparation (Abb. 2.25A, rechtes Diagramm). Die Komplement-vermittelte Virolyse
hemmt die Infektiösität des wt und der Revertante um den Faktor zehn, wohingegen das
gE-defiziente Virus um den Faktor 50 sensitiver ist. Eine Dosistitration des IVIG bei
konstanter Virusmenge und gleicher Konzentration an Komplement bestätigt die
Interferenz von gE mit Komplement im Gegensatz zu gp34 und gp68 (Daten nicht
gezeigt).
77
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
A
6
Medium
IVIG
IVIG + C‘
C‘
6
pfu/ml (log10)
pfu/ml (log10)
4
3
4
3
2
2
1
1
wt
6
IVIG + C‘
C‘
5
5
B
Medium
IVIG
Δgp68
Medium
IVIG-F(ab) 2
Δgp34
wt
Δgp68/
Δgp34
IVIG-F(ab) 2 + C‘
C‘
6
Medium
IVIG-F(ab )2
ΔgE
gE-Rev
IVIG-F(ab) 2 + C‘
C‘
5
pfu/ml (log10)
pfu/ml (log10)
5
4
3
4
3
2
2
1
1
wt
Δgp68
Δgp34
Δgp68/
Δgp34
wt
ΔgE
gE-Rev
Abb. 2.25: Die HCMV-exprimierten Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 hemmen im Gegensatz zu HSV-1 gE
nicht die Komplement-vermittelte Virolyse. (A) 3 mg/ml IVIG wurde zusammen mit 1x 105 pfu/ml HCMV
in An- oder Abwesenheit (linkes Diagramm) von 15% IgG-depletiertem human Komplement für 1,5 h bei
37°C inkubiert, bevor der Mix auf MRC-5 Zellen gegeben wurden. Als Kontrollen dienten Inkubationen
von HCMV mit Medium oder mit 15% IgG-depletierten Komplement ohne IVIG. HCMV infizierte Zellen
wurden wie in Abb. 2.16 beschrieben gefärbt und gezählt. 1x 105 pfu/ml HSV-1 wurde mit 0,1 mg/ml IVIG
und Komplement wie oben beschrieben inkubiert (rechtes Diagramm), auf Vero Zellen gegeben und nach
36 h durch Zählen der HSV-1 Plaques ausgewertet. (B) F(ab)2-Fragmente wurden durch Spaltung von IVIG
mit Pepsin generiert. HCMV (linkes Diagramm) wurde mit 3 mg/ml und HSV-1 (rechtes Diagramm) mit
0,8 mg/ml F(ab)2-Fragmenten wie unter (A) beschrieben inkubiert. Jede Säule repräsentiert den Mittelwert
± SD einer Vierfachbestimmung.
Um zu verdeutlichen, dass es sich bei der beschriebenen Komplementaktivierung um
einen Fc-abhängigen Effekt handelt, wurde IVIG mit Hilfe der Protease Pepsin in F(ab)2Fragmente und Fc-Peptide bei pH 4 gespalten. Die IVIG Vergleichspräparation wurde
78
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ERGEBNISSE⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
unter denselben Bedingungen mock-behandelt, aber ohne Zusatz des Enzyms (Abb.
2.25A). Die enzymatische Spaltung wurde in einer nicht-reduzierenden SDS-PAGE nach
Silberfärbung
durch
eine
Größenveränderung
nachgewiesen.
Die
fehlende
Komplementaktivierung der F(ab)2-Fragmente bei HCMV und HSV-1 bestätigt den
proviralen Einfluss des vFcγR gE auf die strikt Fc-abhängige, Komplement-vermittelte
Virolyse (Abb. 2.25B, linkes Diagramm). Als Folge der Prozedur der Antikörperspaltung
sinkt die neutralisierende Kapazität des IVIG gegenüber HCMV und HSV-1. Aus diesem
Grund wurden in (B) höhere Antikörperkonzentrationen als unter vergleichbaren
Experimentalbedingungen benötigt (vergleiche dazu Abb. 2.25A und B).
ZUSAMMENFASSUNG
•
gp34 und gp68 hemmen nicht die Antikörper-abhängige Komplement-vermittelte
Virolyse
Die im ersten und im zweiten Teil vorgestellten Daten charakterisieren gp34 und gp68 als
hoch affine HCMV kodierte Fcγ-Rezeptoren, die mit einem anderen Modus als die bisher
beschriebenen humanen und pathogenen Fc-bindenden Proteine mit ihrem Liganden
interagieren ohne sich dabei gegenseitig zu hemmen. Entgegen der ursprünglichen
Annahme ist die Funktionalität der herpesviral exprimierten Fcγ-Rezeptoren nicht
konserviert, da gp34 und gp68 im Gegensatz zu HSV-1 gE weder die Kapazität
neutralisierender Antikörper noch die Antikörper-abhängige, Komplement-vermittelte
Virolyse inhibieren können, obwohl sie Teil der äußeren Virionhülle sind. Ein Teil der
Ergebnisse ist in (Sprague et al., 2008) publiziert.
79
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯DISKUSSION⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
3
DISKUSSION
3.1
Übersicht über die Ziele dieser Arbeit
In der vorliegenden Arbeit bilden die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68
zwei Themenschwerpunkte. Für die bakteriellen (Protein A und Protein G) und die
zellulären Fcγ-Rezeptoren (CD16, FcRn, TRIM21) war zu Beginn dieser Arbeit durch KoKristallisationsstudien die Art und Weise der Interaktion mit Fc bekannt. Die 2002
identifizierten cytomegaloviralen Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 waren nicht näher
untersucht, weshalb über den Interaktionsmodus mit der Fc-Domäne von IgG nur
spekuliert werden konnte. Der Versuch der Kristallisierung beider Proteine war nicht
erfolgreich, woraufhin alternative Ansätze notwendig waren. Ziel des ersten Teils dieser
Arbeit sollte eine experimentelle Bestimmung der Fc-bindenden Domänen von gp34 bzw.
gp68
sein,
um
dann
die
löslichen
Minimalmutanten
für
weitergehende
Ligandeninteraktionsstudien zu nutzen und den Modus der Pathogen-exprimierten
Rezeptoren mit dem der Zellulären zu vergleichen.
Das humane Cytomegalovirus ist als langsames Virus mit einem infektiösen
Replikationszyklus von drei oder mehr Tagen und der hohen Anzahl exprimierter
Antigene auf erfolgreiche Immunevasionsstrategien angewiesen. Durch die Etablierung
einer lebenslangen Persistenz im Wirt ist HCMV vor allem mit der adaptiven
Immunantwort konfrontiert, deren Hauptakteure unter anderem IgG-Antikörper sind.
Die Hemmung virusreaktiver Immunglobuline steht dabei an prominenter Stelle, da
neutralisierende Antikörper und IgG-vermittelte Effektormechanismen die erfolgreiche
Zirkulation der Viren innerhalb der Wirtspopulation empfindlich stören können. Im
zweiten Teil dieser Arbeit stand daher die Frage im Mittelpunkt, ob die neu
identifizierten Fc-bindenden Rezeptoren Teil des Viruspartikels sind und dort die
Fähigkeit besitzen, die Wirkung antiviraler Antikörper zu kompromittieren. Der Anstoß
für diese Hypothese stellte die Beschreibung entsprechender Funktionen des HSV-1
kodierten Fcγ-Rezeptors gE dar (Frank & Friedman, 1989, Sprague et al., 2006). gp34 und
gp68 zeigten sowohl bei dem Fibroblasten-adaptierten Laborstamm HB5 als auch im
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endotheliotropen Stamm TB40 keine Interferenz mit neutralisierenden Antikörpern und
Komplement-vermittelter Virolyse, obwohl beide vFcγ-Rezeptoren Teil des Virions sind.
Ein neu etablierter Neutralisationstest auf Basis einer Reportergenanalyse bestätigte
diesen Befund. Zwar werden Fc-bindende Proteine von verschiedenen Vertretern der
Herpesvirusfamilie exprimiert, ihre Funktionen sind allerdings nicht vollständig
konserviert.
3.2
“Finemapping“ und Vergleich der Bindungsstelle von gp34 und gp68
an Fc
Alle drei humanen Fcγ-Rezeptoren (CD16, CD32 und CD64) gehören strukturell zur
IgSF (immunoglobulin superfamily)-Familie aufgrund ihrer Ig-artigen Ektodomänen und
entsprechend konservierter Aminosäuren (Sondermann & Oosthuizen, 2002). Die
Sequenzvergleiche mit den bereits beschriebenen Fcγ-Rezeptoren sind allein nicht
ausreichend, um die Fc-bindende Domäne der viralen Rezeptoren zu definieren, da trotz
des identischen Liganden die Sequenzgemeinsamkeiten nur moderat sind (Atalay et al.,
2002). Bei näherer Betrachtung von gE ist lediglich ein Sequenzabschnitt von 38
Aminosäureresten der Ektodomäne zu 46% identisch mit den Aminosäuren 109-154 des
humanen CD32A, aus denen eine Ig-artige Domänenstruktur geschlussfolgert wurde
(Dubin et al., 1994). Erst das kristallisierte gE zeigte, dass die besagten Aminosäuren keine
typische Ig-Domänenfaltung annehmen (Sprague et al., 2006). Auch für gp34 und gp68
wurde anhand von Sequenzvergleichen mit den zellulären Fcγ-Rezeptoren eine Ig-artige
Ektodomäne vorausgesagt, die für die Fc-Bindung verantwortlich sein könte (Atalay et al.,
2002). Durch das zielgerichtete C-terminale Verkürzen beider Moleküle konnte der
minimale Fc-Bindebereich der extrazellulären Domäne experimentell definiert werden,
der bei gp34 die N-terminalen 140 Aminosäuren inklusive der vorhergesagten Ig-artigen
Domäne einschließt. Interessanterweise schwächt die Abwesenheit der drei N-Glykane
von gp34 lediglich minimal die Ligandenaffinität. Die Fc-Bindung von gp68 hingegen
bedarf fast der kompletten glykosylierten Ektodomäne ausgenommen des vorhergesagten
Bereichs der O-Glykosylierung. Für die Familie der transmembranen Synaptotagmine
konnte gezeigt werden, das die O-Glykosylierung wichtig für die Internalisierung und die
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intrazelluläre „Transportroute“ eines Proteins sind (Atiya-Nasagi et al., 2005). Ob es sich
dabei um eine für gp68 relevante Beobachtung handelt, könnte in weiterführenden
Experimenten mit ektopisch exprimierten, membranverankerten gp68 Mutanten mit und
ohne O-Glykosylierungsbereich getestet werden.
3.2.1 gp34 und gp68 unterscheiden sich in ihrem Ligandeninteraktionsmodus
Betrachtet man die in der Vergangenheit beschriebenen mikrobiell-kodierten FcγRezeptoren, so fällt auf, dass pro Virus bzw. Bakterium lediglich ein Fc-bindendes
Molekül beschrieben wurde. Selbst beim heterodimeren Rezeptorkomplex gE/gI von
HSV-1 wirkt gI nur bindungsverstärkend, kann aber ohne die Hilfe von gE nicht mit Fc
interagieren (Dubin et al., 1990). Die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68
sind somit einzigartig, denn beide Moleküle werden mit vergleichbarer Kinetik auf
infizierten Zellen ko-exprimiert und sind beide in der Lage, hoch affin alle vier humanen
IgG Subklassen zu binden (Atalay et al., 2002). Da es sich bei HCMV gp34 und gp68 um
zwei effiziente, vermutlich nicht miteinander kompetitierende Rezeptoren handelt,
müssen Unterschiede hinsichtlich i) der Interaktionsstelle am Fc-Teil existieren oder ii)
des Interaktionsmilieus. Durch intensive Studien ist bei den zellulären Fcγ-Rezeptoren
CD16, CD32 und CD64 gezeigt worden, dass sie hoch effizient die glykosylierte Form des
Fc, aber kaum nachweisbar deglykosylierte Fc-Fragmente erkennen. Da sie nicht direkt
mit den Zuckerresten interagieren (Sondermann et al., 2000), ist die durch
Deglykosylierung maßgeblich veränderte Grundstruktur der CH2-Subdomäne des Fc, eine
der essentiellen Interaktionsstellen der zellulären Fcγ-Rezeptoren, ursächlich (Krapp et
al., 2003, Shields et al., 2001). gp34 und gp68 reihen sich in dieser Hinsicht in den
Bindemodus der Pathogen-exprimierten Fcγ-Rezeptoren Protein A, Protein G und gE ein,
da sie unbeeinflusst von der durch die Deglykosylierung bewirkten Strukturänderung an
die CH2-Subdomäne hoch affin binden können. Auf der Basis dieses Resultats kann
postuliert werden, dass gp34 und gp68 unempfindlich auf Strukturänderungen in der CH2Subdomäne reagieren, was auf eine sich von den zellulären Fcγ-Rezeptoren
unterscheidende Ligandeninteraktionsstelle hinweist. Da auch für HSV-1 gE gezeigt
werden konnte, dass dieser Rezeptor deglykosyliertes Fc binden kann (Henrike Reinhard,
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unveröffentlichte Beobachtungen), lag die Vermutung nahe, dass gp34 und gp68 mit dem
zweiten Bindungs-hot spot am Fc, dem CH2-CH3-Interface, interagieren. Versuche von
Kooperationspartnern, die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren im Komplex mit ihrem
Liganden zu kristallisieren, waren ohne Erfolg (Pamela Björkman, Caltech, La Jolla und
Peter Sondermann, MPI für Biochemie, jetzt Glycart, Zürich, persönliche Mitteilung).
Daher bedienten wir uns eines mutierten Fc-Fragments (nbFc, nonbinding Fc), bei dem
sechs Austausche von Schlüsselaminosäuren der CH2-CH3-Domäne vorgenommen wurden
(Abb. 3.1). Damit wurden bereits erfolgreich Interaktionsstudien mit FcRn und gE
durchgeführt und deren Bindestellen und Bindungsstöchiometrie definiert (Martin &
Bjorkman, 1999, Sprague et al., 2004). Bei beiden Molekülen handelt es sich um
Rezeptoren, die trotz erheblicher struktureller Unterschiede überlappende Bindestellen
am Fc-Fragment innerhalb der CH2-CH3-Domäne besitzen (Sprague et al., 2006). Ein
möglicher Grund für die Bevorzugung dieser Domäne bei der Wechselwirkung mit
verschiedenartigsten Molekülen sind die von DeLano und Kollegen vorgeschlagenen
intrinsischen physiko-chemischen Voraussetzungen des gering polaren Interface der CH2CH3-Region, wie zum Beispiel eine Reihe hydrophober Interaktionen in der Mitte der
Bindungstasche (DeLano et al., 2000).
nbFc
wtFc
nbFc
Abb. 3.1: Bereich der Aminosäuremutationen im nonbinding-Fc (nbFc). (A) Fc-Fragment als Ribbon-Model
(B) Detailansicht aus (A); rot: Zuckerreste, grün: die im nbFc-Fragment mutierten Aminosäuren Methionin
252, Isoleucin 253, Histidin 310, Histidin 433, Histidin 435 und Tyrosin 436 (Modell des Fc-Teils aus
Koordinatensatz 1HZH.pdb, mit MacPyMol von Jan Stindt, Biochemie, HHU, Düsseldorf)
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Durch den Verlust der Ligandenbindung von gp68 aufgrund der Mutationen im nbFc
(Sprague et al., 2008) kann geschlussfolgert werden, dass es mit gE, FcRn, Protein A und
Protein G (aus Ko-Kristallisationsexperimenten) überlappende Bindungsstellen nutzt.
gp34 hingegen erweist sich als Ausnahme: dieser Rezeptor nutzt weder den
beschriebenen Bindemodus der zellulären noch den der bekannten Pathogenexprimierten Fcγ-Rezeptoren. Damit ist sichergestellt, dass sich gp34 und gp68 nicht
gegenseitig in der Bindung an Fc hemmen, wenn sie auf derselben Zelloberfläche oder
Virionhüllmembran ko-exprimiert werden. HCMV infiziert in vivo ein breites Spektrum
an unterschiedlichen Zellen, darunter auch FcγR-tragende Dendritische Zellen,
Monozyten und Makrophagen (Hahn et al., 1998, Sinzger & Jahn, 1996, Stoddart et al.,
1994). Für CD64 und CD16A-tragende Zellen wurde gezeigt, dass sie in vivo mit
monomerem Serum-IgG dekoriert sind (Ioan-Facsinay et al., 2002, Mota et al., 2004).
Beide HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren als Bestandteil des Viruspartikels könnten auf
diese Weise an der zielgerichteten Infektion FcγR-positiver Zellen, vermittelt durch IgG,
beteiligt sein. Durch die Transfektion von CD16 und CD64 in nicht-permissive Zielzellen
von HCMV, deren Inkubation mit IgG und nachfolgender Infektion mit HCMV könnte
experimentellen Aufschluss über diese Hypothese geben.
3.2.2 Modelle der gp34/Fc-Interaktion
Bei der Betrachtung des HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptors gp34 als Bestandteil der
Virionhülle und infizierter Zellen wird deutlich, dass dieser als kovalentes Oligomer
vorliegt (Abb. 2.17). Auch isoliert exprimierte (Abb. 2.10) oder aufgereinigte gp34
Moleküle zeigen ohne die Beteiligung weiterer viraler oder zellulärer Kofaktoren unter
nicht-reduzierenden Bedingungen eine spontane Oligomerisierung (Sprague et al., 2008).
Alle klassischen zellulären und mikrobiellen Fc-bindenden Proteine interagieren affin als
monomere Rezeptoren mit ihrem Liganden. Lediglich für den neonatalen Fc-Rezeptor
wurde gezeigt, dass er auf einer Membran immobilisiert asymmetrische Homodimere
bilden kann. Ein Dimer ist hier in der Lage mit einer einzelnen CH2-CH3-Domäne der
IgG-heavy chain zu interagieren, was allerdings keine Bindungsvoraussetzung darstellt
(Praetor et al., 2002). Bringt man gp34 durch zielgerichtete Cysteinaustauschmutationen
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in der extrazellulären Domäne zum Verlust seiner Homodimerisierungskapazität, so wird
das Protein deutlich instabiler und ist nicht länger Fc-bindungskompetent (Abb. 2.12 und
Abb. 2.13). Die für die Ligandenbindung essentiellen Aminosäuren 24-140 sind außerdem
relevant für die Ausbildung des kovalenten gp34-Dimers. Mutationsanalysen der drei
Cysteine Cys45, Cys82 und Cys101 innerhalb der gp34-Ektodomäne zeigen, dass das
Vorhandensein eines der Cysteine in der Ektodomäne der Minimalmutante zur variablen
Ausbildung eines gp34-Homodimers führen kann; lediglich der Komplettaustausch aller
Cysteine gegen Serine führt zum Verlust der Dimerisierungsfähigkeit. Um eindeutige
Schlussfolgerungen über die Beteiligung der einzelnen Cysteine an Disulfidbrücken zu
ziehen, könnten freie Thiolgruppen der verschiedenen gp34 Cysteinpunktmutanten
durch
pegylierte
Alkylierungsreagenzien
abgesättigt
werden,
was
in
einer
Größenverschiebung im Western Blot resultieren würde (Schelhaas et al., 2007).
Wie die Fc-Bindung durch das gp34-Dimer realisiert werden könnte, ist in Abb. 3.2
schematisch
dargestellt.
Unter
Berücksichtigung
dreier
bereits
beschriebener
Interaktionsmodelle von Fcγ-Rezeptoren mit ihrem Ligand können mehrere Hypothesen
über mögliche Stöchiometrien der gp34/IgG-Interaktion aufgestellt werden.
1
gp34
2
gp34
3
gp34
gp34
gp34
gp34
Abb. 3.2: Modelle der IgG/gp34-Interaktion. Das Bild illustriert schematisch drei mögliche Modelle der
Interaktion von kovalenten gp34-Oligomeren (in lila) mit dem Liganden IgG (in grau) auf der
Virionoberfläche oder auf infizierten Zellen. (1) Rezptor-IgG-Interaktion in einer 1:1 Stöchiometrie (2)
zwei Rezeptormoleküle interagieren mit einem Molekül IgG (3) Vernetzung mehrerer Rezeptoren durch
gleichzeitige Bindung von 2 Molekülen IgG.
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Die erste Variante spiegelt die Bindung von CD16 an Fc mit einer 1:1 Stöchiometrie
wieder, in der zweiten Variante interagieren zwei Rezeptormoleküle mit einem Molekül
Fc, wie dies beispielsweise bei HSV-1 gE der Fall ist. Die dritte Variante basiert auf der in
Kristallisationsversuchen des FcRn mit Fc beobachteten Multimerformation, wobei
allerdings nicht eindeutig geklärt werden konnte, ob es sich dabei um ein
Kristallisationsartefakt oder um eine physiologisch relevante Struktur handelt (Raghavan
& Bjorkman, 1996). Denkbar wäre bei dieser Variante außerdem die gezielte Erhöhung
der
Rezeptorendichte
in
einem
distinkten
Bereich
der
Membran
durch
Ligandeninteraktion, was beschriebener maßen zur Signalinduktion führen kann (DeLisi,
1981). Aus den Ergebnissen in Abschnitt 2.2.2 wird deutlich, dass gp34 sowohl als
Bestandteil des Viruspartikels als auch in infizierten Zellen nicht nur in dimerer, sondern
auch in oligomerer Form auftritt. Variante drei der in Abb. 3.2 dargestellten gp34-IgG-FcInteraktionsmodelle stimmt am besten mit den erhobenen Daten dieser Arbeit überein.
Die
Dimerisierung
bzw.
Oligomerisierung
von
Rezeptormolekülen
hat
häufig
Implikationen auf Ebene der Signaltransduktion und Aktivierung intrazellulärer
Signalkaskaden. Über die Natur dieser Signale entscheiden die Signalmotive der
zytoplasmatischen Domänen der Rezeptoren oder an Letztere assoziierte akzessorische
Ketten. Die Formierung von Dimeren erzeugt eine Signalkonzentration an bestimmten
Bereichen der Plasmamembran. Die dadurch erreichte Amplifikation des Signals sorgt für
die Überwindung eines Schwellenwertes und zur Weiterleitung des empfangenen Signals
in nachgeschalteten Kaskaden. Für gp34 wurde in der zytoplasmatischen Domäne durch
das Vorhandensein der konservierten Aminosäuresequenz (fett hervorgehoben) DTEPLL
ein putatives Internalisierungssignal vorausgesagt (Atalay et al., 2002). Es handelt sich um
ein Dileucin-Konsensusmotiv DXXXLL (wobei X jede beliebige Aminosäure darstellen
kann), das bereits als verantwortlich für die Bestimmung der intrazellulären Route eines
Transmembranproteins
in
den
endolysosomalen
Abbauweg
beschrieben
wurde
(Gabilondo et al., 1997, Letourneur & Klausner, 1992). Dabei agieren Dileucinmotive als
Bindungsstellen für Adapterproteine, die für die Bestimmung der Route innerhalb der
Zelle verantwortlich sind.
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Des Weiteren gibt die Bildung einer intermolekularen Disulfidbrücke Auskunft über die
Struktur des gp34 Moleküls. Für die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren wurde bereits eine
Ig-artige
Domänenstruktur
des
extrazellulären
Bereiches
anhand
von
Aminosäurevergleichen mit CD16, CD32 und CD64 postuliert (Atalay et al., 2002).
Obwohl
die
hier
erhaltenen
experimentellen
Befunde
die
Ausbildung
einer
intramolekularen Disulfidbrücke und damit einer Ig-artigen Grundstruktur nicht
befürworten, kann die Existenz einer nicht-klassischen Ig-artigen Domäne ohne
konservierte Cysteine nicht endgültig ausgeschlossen werden.
3.2.3 Interaktion der zellulären Fcγ-Rezeptoren CD32A und CD64 mit Fc
Seit der publizierten Struktur von CD16 im Komplex mit dem Liganden Fc wird aufgrund
des ähnlichen Aufbaus aller drei zellulären Fcγ-Rezeptoren ein einheitlicher Bindemodus
für diese postuliert (Sondermann & Oosthuizen, 2002). Aus den Bindungsstudien des nbFc
an CD64 und CD32 wird deutlich, dass aus dem kristallisierten CD16/Fc-Komplex kein
generelles Interaktionsprinzip abgeleitet werden kann. CD64 verhält sich unbeeinflusst
durch die Mutationen in dem CH2-CH3-Interface des nbFc CD16-artig, wohingegen CD32
eine deutliche Reduktion seiner Ligandenbindung zeigt. Für die Interaktion von CD32 an
seinen Liganden existieren kontroverse Modelle. Auf der einen Seite wurde nach
Kristallisation des CD32B folgende Struktur des Komplexes mit Fc vorgeschlagen: zwei
Moleküle FcγR binden jeweils innerhalb des CH2-CH3-Domänenübergangs insgesamt
einen Fc-Teil (Sondermann et al., 1999). Kelly Maxwell und Kollegen hingegen
postulierten nach dem Lösen der CD32A-Struktur, dass CD32A homodimerisiert und als
Dimer IgG im hinge-nahen Bereich der CH2-Domäne bindet (Maxwell et al., 1999). Da
beide Isoformen des zellulären Fcγ-Rezeptors in ihrer Aminosäuresequenz der Ligandenbindenden Ektodomäne zu 97% identisch sind, erwartet man bei beiden CD32-Isoformen
den gleichen Interaktionsmodus. Die in dieser Arbeit erhobenen Daten mit CD32A
stützen eher die Annahme des ersten Modells, bei dem CD32A, wie auch gp68 und gE in
dem CH2-CH3-Interface bindet (Abb. 2.2). Ein unabhängiger funktioneller Test zeigt, dass
gp34 im Gegensatz zu gp68 und gE sehr schwach mit der IgG-abhängigen Aktivierung
von CD32A interferieren kann und stützt die eigenen im Rahmen dieser Arbeit
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generierten
biochemischen
Interaktionsdaten
(Eugenia
Corrales-Aguilar,
unveröffentlichte Daten).
3.3
Charakterisierung der HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren als
Bestandteil des Virions
Im Laufe der Evolution hat sich bei den Vertebraten das adaptive Immunsystem
entwickelt, dessen Hauptakteure im Wesentlichen T-Zellen, B-Zellen und Antikörper
sind. Im Zug einer HCMV-Infektion werden virusspezifische Antikörper gebildet, die
ihre antivirale Wirksamkeit erst während der Reaktivierung der Infektion entfalten
(Jonjic et al., 1994). Trotz der HCMV-spezifischen IgG-Antikörper wird das Virus nicht
eliminiert. Bei HSV-1, einem weiteren Vertreter der Herpesviren, konnte gezeigt werden,
dass durch die Funktion des HSV-kodierten IgG-bindenden Fcγ-Rezeptors gE die
virusspezifische Antikörperwirkung gezielt antagonisiert wird (Frank & Friedman, 1989).
Ein derartiger Mechanismus war für HCMV zu Beginn dieser Arbeit nicht gezeigt.
3.3.1 gp34 und gp68 sind Bestandteil der äußeren Virushülle, ohne dabei
neutralisierende Antikörper zu hemmen
Die Anwesenheit und die exakte Lokalisation der HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren im
Viruspartikel wurde immer wieder kontrovers diskutiert (Stannard & Hardie, 1991,
Varnum et al., 2004). Ein ausreichend spezifisches Antiserum (ohne Fc-Aktivität) zum
Nachweis von gp34 bzw. gp68 im Virion ist nicht existent. Durch die Herstellung HAEpitop-markierter vFcγ-Rezeptoren im HCMV-Kontext konnte mittels Western Blot
Analyse in hochreinen Virionpräparationen sowohl gp34 als auch gp68 in der äußeren
Virushülle detektiert werden. Dies steht in klarem Gegensatz zu dem Bericht, dass eine
Fc-bindende Aktivität in der Tegumentschicht des viralen Partikels lokalisiert ist
(Stannard & Hardie, 1991), bzw. dass lediglich gp68 Bestandteil des Virions ist (Varnum et
al., 2004).
Beim Nachweis der viralen Fcγ-Rezeptoren als Bestandteil des Virions wurde deutlich,
dass nur vollständig maturierte, das heißt hoch glykosylierte Formen von gp34 und gp68
in die Virushülle eingebaut werden (siehe Abb. 2.15). Extensive N- und O-Glykosylierung
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von membranständigen Molekülen kann einen Mechanismus der Immunevasion
darstellen. Das HIV-exprimierte Hüllprotein gp120 beispielsweise hat eine entscheidende
Rolle bei der Infektion von permissiven Zellen durch die Bindung an den CD4-Rezeptor.
Aufgrund dessen stellt gp120 ein prominentes Ziel für neutralisierende Antikörper dar
(Steimer et al., 1991). Durch die intensive Glykosylierung bestimmter funktional
wichtiger Rezeptorinteraktionsbereiche von gp120 werden neutralisierende Epitope
geschützt (Wyatt et al., 1998). Epitope, an die lediglich nicht neutralisierende Antikörper
binden können, bleiben unglykosyliert und damit frei zugänglich. Die Ausbildung eines
so genannten „Glykosylierungs-Schildes“ kritischer Epitope auf der Virushülle ist ein
Grund für die erfolgreiche Persistenz des HIV trotz der antiviralen IgG-Immunantwort
des Wirtes (Wei et al., 2003).
Aus Lysaten von ektopisch exprimiertem gp68 konnten in einem zellbasierten
Reportertest im Serum HCMV-positiver Spender CD16-aktivierende IgG-Antikörper
gegen gp68, nicht aber gegen gp34 nachgewiesen werden (Eugenia Corrales-Aguilar,
unveröffentlichte Daten). Im Umkehrschluss wäre gp68 durch die Bindung spezifischer
Antikörper in seiner Fähigkeit als viraler Fcγ-Rezeptor blockiert. Dies könnte erklären,
warum HCMV die Wirkung neutralisierender IgG-Antikörper nicht hemmen kann (siehe
Abb. 2.20). Im Gegensatz zu den im Virus inkorporierten gp68-Formen dominiert in der
infizierten Zelle unvollständig maturiertes gp68. Ob hoch glykosylierte Moleküle vor der
potentiellen Erkennung neutralisierender Antikörper geschützt sind, kann an dieser Stelle
noch nicht beantwortet werden und bedarf weiterer Experimente. Die O-Glykosylierung
von gp68 hat im Gegensatz zur N-Glykosylierung per se keinen Einfluss auf die
Ligandenbindung (siehe Abschnitt 3.2).
Trotz einer massiven Antikörperantwort des Wirtes auf die Infektion mit Herpesviren
wird diese lediglich kontrolliert, ohne dass es zu einer sterilen Immunität kommt. Als
mitverantwortlich dafür wurde bei HSV der virale Fcγ-Rezeptor gE beschrieben, durch
dessen Anwesenheit im Virion neutralisierende Antikörper bei Erkennung des Antigens
simultan am Fc-Teil gebunden werden. Voraussetzung für die so genannte antibody
bipolar bridging-Hypothese ist die Möglichkeit der Dislokation der IgG-Fc-Region, da
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ansonsten eine Interaktion aus sterischen Gründen nicht möglich ist. Die dafür benötigte
Flexibilität der hinge-Region des Antikörpers ist vorhanden (Burton, 1990).
Die Orientierung der Einzelmoleküle innerhalb des gE/Fc-Komplexes unterstützte die
Vermutungen über die Beteiligung von gE am antibody bipolar bridging, obwohl es
experimentell nicht gezeigt wurde (Sprague et al., 2006). Für die HCMV-exprimierten
Fcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 konnte in einem Ko-Immunpräzipitationsexperiment
gezeigt werden, dass es zur Ausbildung eines ternären Komplexes bestehend aus Antigen,
spezifischen Antikörper und dem mit dem Fc-Teil des Antikörpers simultan
interagierenden gp34 bzw. gp68 (antibody bipolar bridging) kommen kann (Eva MercéMaldonado, unveröffentlichte Beobachtung). Die Doppelbindung über Fab und Fc durch
gp34 und gp68 ist prinzipiell möglich, eine Hemmung neutralisierender Antikörper wird
dadurch allerdings nicht erreicht.
Obwohl für gE eine gewisse antagonisierende Rolle gegenüber neutralisierenden
Antikörpern beschrieben wurde (Frank & Friedman, 1989), konnte dies im Rahmen dieser
Arbeit nicht bestätigt werden. Die gleiche Schlussfolgerung kann auch für HCMV
getroffen werden, wo die Anwesenheit von gp34 und gp68 im Virion keinen proviralen
Einfluss auf neutralisierende Antikörper hat (Abb. 2.20). Um individuelle Schwankungen
von Immunseren auszuschließen, wurden die Neutralisationstests in Anwesenheit einer
Hyperimmunglobulin-Präparation (IVIG) durchgeführt, die in der HCMV Therapie
verwendet wird und aus mehreren tausend Einzelseren hochtitriger Spender
zusammengesetzt ist. Herkömmliche Neutralisationstests wurden standardmäßig auf
embryonalen Lungenfibroblasten durchgeführt. In vivo ist HCMV in der Lage, viele
verschiedene Zelltypen zu infizieren (Plachter et al., 1996). Seit einiger Zeit ist außerdem
bekannt, dass HCMV zelltypabhängig unterschiedliche Infektionswege nutzt: so
fusioniert es direkt mit der Plasmamembran von Fibroblasten, infiziert Epithel- und
Endothelzellen dagegen durch Endozytose, gefolgt von einer Fusion der viralen Hüll- mit
der zellulären Endosomenmembran (Bodaghi et al., 1999, Compton et al., 1992, Ryckman
et al., 2006). Alternative Arten der Infektion erfordern ein unterschiedliches Repertoire
an viralen Oberflächen-Glykoproteinen, die mit Komponenten der permissiven Zelle
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interagieren. Essentiell für eine erfolgreiche Infektion von sowohl Endothel- als auch
Epithelzellen ist der Hüllglykoproteinkomplex bestehend aus gH-gL-pUL131A-pUL130pUL128, wohingegen gH-gL-gO für die Fibroblasteninfektion notwendig sind (Hahn et
al., 2004, Wang & Shenk, 2005a).
Kürzlich konnte in vitro gezeigt werden, dass ein in Endothelzellen propagiertes HCMV
Isolat je nach verwendeter permissiver Zelllinie drastisch unterschiedliche Sensitivität
gegenüber neutralisierenden Antikörpern zeigt. Die Antikörper weisen dabei eine mehr
als 128fache Steigerung ihrer Neutralisierungskapazität in Endothel- und Epithelzellen im
Gegensatz zu humanen Fibroblasten auf (Gerna et al., 2008). Der Einsatz monoklonaler
Antikörper gegen die Hüllglykoproteine pUL131A, pUL130 und pUL128 bestätigt die
Annahme,
dass
sich
Virusneutralisierbarkeit
die
auf
den
beobachteten
Unterschiede
Hüllglykoproteinkomplex
hinsichtlich
zurückführen
der
lassen.
Dementsprechend sind Antikörper, die entweder direkt die Proteine pUL131A, pUL130
bzw. pUL128 binden oder durch deren Bindung die Interaktion anderer wichtiger
Glykoproteine der Virushülle an ihrer Funktion beim Eintritt hemmen, essentiell für die
Neutralisation. In einem System wie den Fibroblasten, bei denen der gH-gL-pUL131ApUL130-pUL128-Komplex irrelevant für den Eintritt des Virus in die Zelle ist, sind die
beschrieben neutralisierenden Antikörper nicht effektiv (Gerna et al., 2008).
Für die Genprodukte UL131A-128 konnte erstmals gezeigt werden, dass sie
konformationelle Veränderungen des gB Proteins begünstigen, dem Hauptmediator des
initialen Infektionsvorgangs. Dadurch wird die Interaktion von gB und gH während des
Eintrittsprozesses von HCMV in Nabelschnurvenenendothelzellen (human umbilical
vene endothelia cells, HUVECs) gefördert (Patrone et al., 2007). Kommt es zur Initiierung
des viralen Zelleintrittprozesses, führt die gB-gH-Interaktion zu einem transienten
Fusionskomplexes, bei dem die Genprodukte UL131A-128 als Fusionsaktivatoren und
mögliche Liganden für Eintrittsrezeptoren fungieren.
Die Existenz der viralen Fcγ-Rezeptoren als Bestandteil der äußeren Virushülle hat
keinen proviralen Einfluss in Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern im
Fibroblasten-Zellsystem in vitro. Unter Berücksichtigung der Zelltyp-spezifischen
91
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯DISKUSSION⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
unterschiedlichen
Eintrittsmechanismen
könnte
eine
simultane
Bindung
von
neutralisierenden Antikörpern an den pUL131A-128-Komplex eine Hinderung des
initialen Zelleintritts in Endothel- und Epithelzellen sein. Diese Hypothese ist unter
Zuhilfenahme des endotheliotropen Wildtypvirus TB40 im Vergleich zu den
entsprechenden Fcγ-Rezeptor-defizienten Mutanten überprüfbar. Außerdem konnten
Wang et al. vor einem Jahr erstmals zeigen, dass der infizierte Zelltyp über den Weg der
Infektion des freigesetzten Viruspartikels entscheidet (Wang & Shenk, 2005b). Dabei
wurde die Infektion von retinalen Pigmentepithelzellen durch in Fibroblasten-generierte
Viren mit Epithelzell-generierten Viren verglichen und geschlussfolgert, dass beide
Präparationen auf verschiedene Arten denselben Zielzelltyp infizieren, wobei der genaue
molekulare Unterschied noch nicht verstanden ist. Dieses Modell lässt die Hypothese zu,
dass in Fibroblasten generierte Viren zum Eintritt in die permissive Zelle ein anderes
Arsenal an Glykoproteinkomplexen nutzen, gegen die in vivo nur ein geringer Anteil
spezifischer neutralisierender Antikörper produziert wird.
3.3.2 gp34 und gp68 interferieren nicht mit der Komplement-vermittelten Virolyse
Der Prozess der Komplement-vermittelten Virolyse freier Virionen ist ein weiterer Fcvermittelter
Effektormechanismus
von
Antikörpern,
der
zur
Initiierung
der
Komplementkaskade führt, die mit der Zerstörung des viralen Partikels endet. Als
Antagonist dieses Prozesses wurde der herpesvirale FcγR gE beschrieben, der vermutlich
durch antibody bipolar bridging die Bindung von C1q, der ersten Komponente der
klassischen Komplementkaskade, an den Fc-Teil reaktiver Antikörper verhindert
(Lubinski et al., 1998). Die Interaktionsstelle von C1q bzw. von HSV-1 gE mit der IgG-FcDomäne ist durch Röntgenstrukturanalysen bekannt (Idusogie et al., 2000, Sprague et al.,
2006). Aus diesen Ergebnissen wird klar, dass die identifizierten Bindestellen beider FcLiganden nicht überlappen und daher über den Modus der gezeigten Interferenz nur
spekuliert werden kann. Eine Erklärung hierfür könnte die sterische Hinderung der
Komplementbindung an Fc eines bereits simultan über Fab-und Fc-Domäne gebundenen
Antikörpers sein, da die am antibody bipolar bridging-Komplex beteiligten Proteine in
starker räumlicher Nähe zueinander stehen müssen (Sprague et al., 2006).
92
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯DISKUSSION⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren sind im Gegensatz zu gE nicht in der Lage, die
Aktivierung der Komplement-vermittelten Virolyse zu unterbinden. Für gp68 konnte
gezeigt werden, dass dieser Rezeptor teilweise mit gE überlappende Bindestellen an Fc
hat, aber im Gegensatz zu diesem keine proviralen Eigenschaften in Anwesenheit von
Komplement entfaltet (Sprague et al., 2008). Inwieweit auf der alleinigen Grundlage von
Interaktionsstudien
allerdings
Aussagen
über
Mechanismen
der
Komplementantagonisierung getroffen werden können, bleibt zu diskutieren. Vielmehr
deuten die erhaltenen Ergebnisse der Neutralisationstests in An- und Abwesenheit von
Komplement (Abb. 2.25) darauf hin, dass es aufgrund der Rezeptor-Liganden-Interaktion
zu konformationellen Umlagerungen innerhalb des Antikörpers kommt, die wiederum
die Bindung weiterer Komponenten beeinflussen. Anders ist die antagonisierende
Wirkung von gE auf Komplement im Gegensatz zu gp68 bei der Nutzung stark
überlappender Bindestellen am Fc schwer zu erklären.
Die Aktivierung der wirtseigenen Komplementkaskade wird unter anderem durch so
genannte Komplementkontrollproteine (CD45, CD55, und CD59) reguliert. Sowohl für
HCMV (Spiller et al., 1997) als auch für HIV (Saifuddin et al., 1995) konne gezeigt
werden, dass der Einbau von CD55 und CD59 in das Viruspartikel zur Resistenz
gegenüber Komplement führt. Dadurch könnte der Effekt von gp34 und gp68 auf die
Antikörper-vermittelte Virolyse, initiiert durch die Bindung von C1q, überdeckt werden.
Bei HSV-1 konnte außerdem als Strukturkomponente das partikuläre Glykoprotein gC
identifiziert werden, das als weiterer Komplementantagonist fungiert, indem es den
zentralen Faktor C3 der Komplementkaskade bindet und dadurch diese hemmt. gE/gCdefiziente HSV-Mutanten sind in vitro und in vivo stark attenuiert in Anwesenheit von
spezifischen Antikörpern und Komplement (Lubinski et al., 2002). Für HCMV ist kein
vergleichbares Molekül bekannt.
3.3.3 Identifizierung eines dritten HCMV-kodierten Proteins mit Fc-bindenden
Eigenschaften
In Fc-Präzipitationsanalysen HCMV-infizierter Fibroblasten konnte ein weiteres Fcbindendes Protein mit einer Größe von ca. 95 kDa detektiert werden. Bei der Analyse
93
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯DISKUSSION⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
verschiedener Virusstämme zeigte sich, dass dieses Protein wie auch die bereits
bekannten vFcγ-Rezeptoren gp34 und gp68 von allen untersuchten Laborstämmen und
klinischen Isolaten mit einer early-late-Kinetik mit einer maximalen Abundanz 72 h p.i.
exprimiert wird. Wie auch gp34 und gp68 interagiert das neu identifizierte Protein hoch
affin mit monomerem Fc-Fragment von IgG-Antikörpern. Aufgrund der Existenz des
dritten HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptors als Bestandteil der Virusmembran (Eva MercéMaldonado, unveröffentlichte Beobachtung) stellt dieser einen weiteren potentiellen
Inhibitor neutralisierender Antikörper bzw. der Antikörper-abhängigen Komplementvermittelten
Virolyse
dar.
Vergleichende
Fc-Präzipitationsanalysen
der
bereits
vorhandenen HCMV-FcγR-Deletionsmutanten im HB5-Stammhintergrund zeigten
allerdings, dass die Deletion der Genregion ΔIRL/ΔTRL11, wie sie bei den Virusmutanten
Δgp34 und der Δgp68/Δgp34 vorliegt, zum Verlust der Expression des dritten FcγRezeptors führt. Durch die entsprechende FcγR-Mutante Δgp34 (ΔTRL11) im TB40Stammhintergrund wird der dritte Fcγ-Rezeptor noch exprimiert. Der dritte vFcγRezeptor könnte der inhibierende Rezeptor neutralisierender Antikörper bzw. der
Antikörper-abhängigen Komplement-vermittelten Virolyse im TB40 Stamm sein und
müsste durch eine zielgerichtete HCMV-Mutante in entsprechenden Zielzellen, wie
Endothelzellen untersucht werden.
Aufgrund der vorhandenen Resultate kann keine eindeutige Schlussfolgerung getroffen
werden, welche Genregion für den dritten viralen Fcγ-Rezeptor kodiert. Der Unterschied
in der Expression zwischen den Fcγ-Rezeptordeletionsmutanten der zwei verschiedenen
HCMV-Stämme könnte in der Zerstörung des kodierenden Lokus durch unterschiedlich
verwendete Konstruktionsstrategien
bei
der
Herstellung
der
Mutanten liegen.
Unwahrscheinlicher wäre eine nicht identische Genregion der zwei verwendeten HCMVStämme, die für den dritten Fcγ-Rezeptor kodiert, da sie untereinander stark homolog
sind.
3.3.4 Antikörper-unabhängige immunevasive Funktionen viraler Fcγ-Rezeptoren
Erste Hinweise für weitere Funktionen der CMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren neben
Immunglobulinen wurden aus in vivo Studien an Mäusen erhalten, in denen MCMV
94
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯DISKUSSION⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Wildtyp mit der FcγR-defizienten Virusmutante (Δm138) verglichen wurde. Dabei wurde
deutlich, dass auch in Antikörper-defizienten Mäusen die Deletionsmutante einen stark
attenuierten Phänotyp aufwies (Crnkovic-Mertens et al., 1998, Jonjic et al., 1994). Des
Weiteren wurde mittels Neutralisationstests gezeigt, dass m138 keine inhibierende
Wirkung
auf
neutralisierende
IgG-Antikörpern
ausübt
(Henrike
Reinhard,
unveröffentlichte Beobachtung). Ursächlich für die in vivo Beobachtungen kann die
Antikörper-unabhängige, dominante inhibitorische Wirkung von m138 auf die Liganden
H60 und MULT-1 (Lenac et al., 2006) sein. Es handelt sich dabei um NK-Zell-Liganden
des aktivierenden NKG2D-Rezeptors, die unter viraler Infektion und durch Zellstress
induziert werden und NK-Zell-stimulatorisch wirken. Außerdem wurde eine massive
Herunterregulation des ko-stimulatorischen Moleküls B7-1 (CD80) von der Oberfläche
Dendritischer Zellen durch m138 beschrieben (Mintern et al., 2006). Hinzukommen
weitere Beobachtungen, dass m138 den ICOS-Ligand von T-Zellen moduliert (HansWerner Mages, Matthias Budt, unveröffentlichte Beobachtungen). Es ist wahrscheinlich,
das die Hemmung der verschiedenartigen Liganden durch m138 das Resultat einer
Blockade eines gemeinsam genutzten Mechanismus ist denn eine spezifische, direkte
Interaktion des viralen Fcγ Rezeptors mit den jeweiligen Liganden.
Für die HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren sind bis heute keine IgG-unabhängigen
Funktionen bekannt. Exprimiert man allerdings ektopisch gp34 oder gp68 in Kombination
mit CD32A, so kann man eine Antikörper-unabhängige Interaktion von viralem mit
zellulärem Fcγ-Rezeptor in Ko-Immunpräzipitationsexperimenten nachweisen (Abb. 3.3).
95
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯DISKUSSION⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
α-CD32
α-FLAG
CD32A
--
66
gp34FL
gp68FL
ctrl-FL
--
--
--
+
+
+
0,3 μg hFc
ctrl-FL
gp68FL
45
CD32A
gp34FL
kDa
Abb. 3.3: gp34 und gp68 interagieren hFc-unabhängig mit CD32A. CD32A wurde entweder allein oder mit
FLAG-markiertem gp34 und gp68, bzw. einem Kontrollprotein in CV-1 Zellen durch rVACV koexprimiert. Nach metabolischer Markierung wurde ein Teil der Lysate mit 0,3 μg hFc für 1 h inkubiert. Die
Präzipitation erfolgte mit Hilfe von α-FLAG-gekoppelter Agarose oder mit CD32-spezifischem Antikörper
gefolgt von Inkubation mit PGS (Spur 1). Die Immunkomplexe wurden auf einem 10-13%igen GradientenSDS-Gel aufgetrennt.
Bis jetzt wurde kein weiterer Interaktionspartner außer IgG für CD32 beschrieben. Über
eine biologische Relevanz der direkten Bindung von gp34 und gp68 an CD32 kann nur
spekuliert werden. Ob es sich bei der Interaktion der vFcγ-Rezeptoren an C32A um eine
Kompetition mit Fc um dessen Bindestelle an CD32 bzw. eine generelle sterische
Hinderung handelt, könnte durch Titrationsexperimente mit unterschiedlichen FcKonzentrationen ermittelt werden. Durch die extrem hohe Sequenzhomologie (96%
Identität) innerhalb der extrazellulären Domäne von CD32A und CD32B (Brooks et al.,
1989) ist auch eine Interaktion mit dem inhibitorischen Rezeptor CD32B wahrscheinlich.
Ein weiterer maßgeblicher Aspekt könnte die Beeinträchtigung der Signaltransduktion
von CD32 durch Interaktion mit den viralen Fcγ-Rezeptoren sein, denn betrachtet man
die intrazelluläre Signalkette des CD32, so ist sie einzigartig unter den zellulären FcγRezeptoren, da sie keiner weiteren akkzessorischen Elemente bedarf. Die Intensität und
Dauer einer Pathogen-spezifischen Immunantwort von B-Zellen wird durch CD32B
bestimmt (Xiang et al., 2007). In myeloiden Zellen fungiert CD32B als Gegenspieler
96
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯DISKUSSION⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
aktivierender Signale. Die Beeinflussung dieser Signalwege durch die gezeigte RezeptorRezeptor-Interaktion könnte einen weiteren Antikörper-unabhängigen immunevasiven
Mechanismus von HCMV darstellen.
CD32 ist der am breitesten exprimierte zelluläre FcγR. Seine direkte Interaktion mit den
vFcγR des HCMV-Virions ohne Beteiligung des IgG-Fc-Teils würde die Infektion
relevanter Zielzellen über die Antikörper-unabhängige Rezeptor-vermittelte Endozytose
ermöglichen. Bei systemischer Lupus erythematodes (SLE), der zweithäufigsten
Autoimmunkrankheit, konnte gezeigt werden, dass die SLE-Immunkomplexe, bestehend
aus Autoantikörpern gegen Kernproteine und DNA, durch den auf Dendritischen Zellen
exprimierten FcγR CD32A gebunden und internalisiert werden (Means et al., 2005).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal die unterschiedlichen Interaktionsmodi
der HCMV-kodierten Fcγ-Rezeptoren an humanes Fc-Fragment charakterisiert. Sie
unterscheiden sich sowohl von den bereits bekannten Bindemechanismen der zellulären
als auch der Pathogen-exprimierten Fcγ-Rezeptoren anderer Pathogene. Möglicherweise
verfolgen Cytomegaloviren mit den viralen Fcγ-Rezeptoren die Strategie, mit einem
Rezeptor mehrere Liganden und damit verschiedene Wege der antiviralen Immunantwort
zu hemmen.
97
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4
MATERIAL UND METHODEN
4.1
Material
4.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
Acrylamid/Bisacrylamidlösung (30%)
Roth
AEC (3-Amino-9-Ethylcarbazol)
Sigma-Aldrich
Agarose SeaKem LE
BioWhittaker
Amicon® Ultra-4 Zentrifugen-Filtereinheit
Millipore
Amicon® Ultra-15 Zentrifugen-Filtereinheit
Millipore
Ammoniumpersulfat (APS)
Roth
Ampicillin
Roth
Bacitracin
Sigma-Aldrich
Bacto-Agar
Sigma-Aldrich
ß-Mercaptoethanol
Roth
Bromphenolblau
Merck
BrdU (Bromdesoxyuridin)
Sigma-Aldrich
Calciumchlorid
Roth
CIP (alkalische Phosphatase aus dem Kälberdarm)
New England Biolabs
Ciprofloxacin Hydrochlorid
ICN Biochemicals
Cyanbromid-activated Sepharose™ 6MB
GE Healthcare
[14C]-markierter Proteingrößenstandard
GE Healthcare
Dialysierschlauch (NMGG 6-8 kDa)
Spectra/Por
Dig-11-dUTP
Roche
DIG-Blocking-Reagenz
Roche
DIG-Easy Hyb
Roche
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
Invitrogen
DMSO (Dimethylsulfoxid)
Roth
DNA-Längenstandard Hyperladder I
Bioline
Dounce tissue grinder
Wheaton
98
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
dNTP
Roche
DTT (Dithiothreitol)
Merck
EDTA (Ethylendinitrilotetraessigsäure)
Merck
Endoglykosidase H (Endo H)
Roche
Essigsäure
Roth
Ethanol
Merck
Ethidiumbromid
Roth
FCS (fötales Kälberserum)
Invitrogen
Formaldehyd (37%)
Merck
Glycerol
Roth
Glycin
Roth
Hefeextrakt
Invitrogen
IAA (Jodacetamid)
Calbiochem
Isopropanol
Merck
Kaliumchlorid
Roth
Kaliumhydrogenphosphat
Roth
Leupeptin
Sigma-Aldrich
LipofectAMINE™ 2000CD
Invitrogen
Magermilchpulver
Sucofin
Magnesiumchlorid
Roth
Maleinsäure
Roth
MEM (Minimal Essential Medium)
Invitrogen
Methanol
Merck
Methylzellulose (Methocel MC)
Fluka
N’N’-Dimethylformamid
Fluka
Natriumacatat
Roth
Natriumcarbonat
Roth
Natriumchlorid
Roth
Natriumhydrogenphosphat
Roth
Natriumhydrogencarbonat
Merck
99
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Natriumhydroxid
Merck
Natriumpyruvat (100 mM)
Invitrogen
Natriumthiosulfat-Pentahydrat
Merck
NEM (N-Ethylmaleimid)
Sigma-Aldrich
Nitrocellulose Transfer-Membran (Protran)
Schleicher & Schuell
NP-40 (Nonidet P-40)
Sigma-Aldrich
Nylonmembran (Hybond NX)
GE Healthcare
OptiMEM
Invitrogen
Penicillin (10.000 U/ml)/Streptomycin (10 mg/ml)
Invitrogen
Pepsin
Sigma-Aldrich
Pepstatin A
Sigma-Aldrich
Peptid-N-Glykosidase F (PNGase F)
Roche
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol
Roth
PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid)
Roth
Ponceau S
Sigma-Aldrich
Protein A-Sepharose CL-4B
GE Healthcare
Protein G-Sepharose 4 Fast Flow
GE Healthcare
Protein G-Sepharosesäule (5 ml)
GE Healthcare
Proteinase K
Roche
Protein-Molekulargewichtsstandard (Kaleidoskop)
BioRad
Redivue ProMix L-[35S]Methionin/Cystein
GE Healthcare
Restriktionsendonukleasen
New England Biolabs
RNase A 100 mg/ml
Qiagen
RPMI 1640 Glutamax
Invitrogen
RPMI 1640 ohne L-Cystein, L-Methionin
Cambrex
Saccharose
Roth
Salzsäure
Roth
SDS (Natriumdodecylsulfat)
Roth
Silbernitrat
Merck
Sorbitol
Roth
100
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Spritzenfilter 0,45 μm
Schleicher & Schuell
Superfect Transfektions Reagenz
Qiagen
T4-Ligase
Fermentas
Taq-Polymerase
Invitek
TEMED
Roth
Tris Base
Roth
Trypan Blau (0,4 %)
Invitrogen
Trypsin (2,5%)
Invitrogen
Trypton
Roth
Tunicamycin
Sigma-Aldrich
Tween-20
Sigma-Aldrich
Wasserstoffperoxid (30%)
Roth
4.1.2 Kits
Expand High Fidelity PCR System
Roche
QIAqick Gel Extraction Kit
Qiagen
QIAprep Spin Miniprep Kit
Qiagen
MinElute Gel Extraction Kit
Qiagen
Plasmid Midi Kit
Qiagen
Nucleobond AX100
Macherey-Nagel
DIG High Prime
Roche
ECL Plus Western Blotting Detection System
GE Healthcare
Luciferase Reporter Gene Assay, high sensitivity
Roche
BCA™ Protein Assay Kit
Pierce
Cell Line Nucleofector Kit R und V
Amaxa
101
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4.1.3 Bakterienstämme
Escherichia coli, Stamm XL1-Blue
F´::Tn10 proA B lacI Δ(lacZ)M15/recA1 endA1
gyrA96 (Nal) thi hsdR17 (rKmK) glnV44 relA1 lac
(Stratagen)
Escherichia coli, Stamm DH10B
F– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)
80dlacZΔM15ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139
Δ(ara, leu)7697 galU galKλ– rpsL nupG (Reasearch
Genetics)
4.1.4 Plasmide/BACmide
Für die Herstellung der HCMV Mutanten wurden folgende BACmide und Plasmide
verwendet:
HCMV-BAC HB5 (Borst et al., 1999)
pKD46 (Datsenko & Wanner, 2000)
pACYC177 (New England Biolabs)
pFRT2-Kana (Albert Zimmermann, HHU, Düsseldorf)
pCP20 (Cherepanov & Wackernagel, 1995)
Rekombinante Vaccinia Viren wurden mit Hilfe der folgenden Plasmide generiert:
p7.5k131A
p7.5k131A-FLAG
Für den Luziferase-basierten Neutralisationstest wurde folgendes Plasmid verwendet:
pTA-Control (Clontech)
102
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4.1.5 Oligonukleotide
Die in Tabelle 4.1 aufgelisteten Oligonukleotide wurden für die Generierung, Analyse und
Sequenzierung der Verkürzungs- und Punktmutanten von gp34 und gp68 verwendet.
Desweiteren sind die Oligonukleotide zur Herstellung und Analyse der HCMV Mutante
gp34-HA aufgeführt.
Tab. 4.1: Oligonukleotide. unterstrichen: Restriktionsschnittstellen; rot: mutiertes Kodon; kursiv und
unterstrichen: Kanamycin-Kassette; fett: HA-Epitop.
Sequenz (5‘→ 3‘)
Anwendung
Name
AACGATAATAGATACGGAACGGGA
VACV PCR
tk11
CACACAGCAGTTAGTTTTACCACCA
VACV PCR
tk12
GCACGGTAAGGAAGTAGAAT
VACV Sequenz.
Seq1
TTTTACCACCATTTCAGAT
VACV Sequenz.
Seq2
CACACAGAATTCCATGGGAAGTTCATCGAACGCCGTC
gp34(ΔS)-Mutanten
TRL11-K1
CACACAGAATTCTCAATCCTGCAGGAGGTAGACTCC
gp34(x-124)
TRL11-K2
CACACAGAATTCTCACCGGATAAAAGCATCGACGCG
gp34(x-154)
TRL11-K4
CACACAGAATTCTCAGGACCACTGGCGTTTTAAATC
gp34(x-180)
TRL11-K6
TAGTCACTAGTATCCTGCAGGAGGTAGACT
gp34(x-124)FL
K2L-Spe-FL
GGAATTCAACTAGTGCTACGTGGGTGGATGATG
gp34(24-140)FL
K3L-rev
TAGTCACTAGTCAGAATTCTCACCGGATAAAAG
gp34(x-154)FL
K4L-Spe-FL
CCAACTACCGTGCCACCTCCGAGGACCGTACACGCAC
gp34(24-140)FL-45
mcys1-f
GTGCGTGTACGGTCCTCGGAGGTGGCACGGTAGTTGG
gp34(24-140)FL-45
mcys1-r2
TCGTATGCCGCCACTTTCCATCATTACAGACGCC
gp34(24-140)FL-82
mcys3-new-f
AGGCGTCTGTAATGATGGAAAGTGGCGGCATACGA
gp34(24-140)FL-82
mcys3-new-r
GCGGTGCGGCGTTCGCGTCCACGCGCCAAAATCTGAC
gp34(24-140)FL-101
mcys2-f1
GTCAGATTTTGGCGCGTGGACGCGAACGCCGCACCGC
gp34(24-140)FL-101
mcys2-r
GCCATCACAGCGTAGTCTTCCAGCGTTATGATATCTA
gp34(24-140)FL-101
mtrp-f1
TAGATATCATAACGCTGGAAGACTACGCTGTGATGGC
gp34(24-140)FL-101
mtrp-r2
GAAACTAGTCACGCGGACCCGCATCGTG
gp68(26-206)FL
gp68-C1Spe
GAAACTAGTCCGTTGTCCGTTATACGTCACG
gp68(26-251)FL
gp68-C2Spe
GAAACTAGTGTCCTCGAACAGCGGGTCGTCC
gp68(26-292)FL
gp68-C3Spe
GCGGCTAGCACGACGCAGAAAGAGGGG
gp68(71-292)V5/6xHIS nhe-f1
CGCGCTAGCGCTTGTGGTGCTACTTTTC
gp68(71-292)V5/6xHIS nhe-r2
CTGCGGACGGACCTAGATACGGAACCTTTGTTGTTGAC
GGTGGACGGGGATTTACAGGCCTACCCATACGATGTT
CCAGATTACGCTTAACCAGTGAATTCGAGCTCGGTAC
HCMV-gp34HA
TRL11-HA-1
CGCCGTATGCCTGTACGTGAGATGGTGAGGTCTTCGGC HCMV-gp34HA
AGGCGACACGCATCTTGACCATGATTACGCCAAGCTCC
TRL11-HA-2
GGTAGAAGCAGTGTTGGGTGAT
c-gp34HA-rev
HCMV-gp34HA PCR
103
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4.1.6 Zelllinien
MRC-5
humane Lungenfibroblasten (ATCC CCL-171)
Vero
Nierenepithelzelllinie einer grünen Meerkatze (ATCC CCL-81)
CV-1
Nierenfibroblastenzelllinie einer grünen Meerkatze (ATCC CCL-70)
HU 143 tk-
humane Osteosarkomazelllinie (Tk negativ) (ATCC CRL-8303)
MEF
murine embryonale Fibroblasten, Mausstamm Balb/c
4.1.7 Viren
HCMV
Towne
Fibroblasten-adaptierter Laborstamm (ATCC VR-977)
AD169
Fibroblasten-adaptierter Laborstamm (Chee et al., 1990)
HB5
BAC-Sequenz tragender wt des AD169 (Borst et al., 1999)
gp68HA
HA-Epitopmarkierung am Carboxyterminus des gp68 im HB5-Kontext
(Atalay et al., 2002)
gp34HA
HA-Markierung des ORF TRL11 auf HB5-Basis, Generierung von Cterminal HA-markiertem gp34 (Henrike Reinhard)
Δgp68
gp68-defiziente Mutante auf HB5-Basis (ΔUL118) (Atalay et al., 2002)
Δgp34
gp34-defiziente Mutante auf HB5-Basis (ΔIRL/TRL11) (Henrike
Reinhard)
Δgp68/Δgp34
gp34
und
gp68-defiziente
Mutante
auf
HB5-Basis
(ΔUL118/ΔIRL/ΔTRL11) (Henrike Reinhard)
TB40-wt
wt-BAC (TB40-BAC4) des endotheliotropen Stammes TB40/E (Sinzger
et al., 2008)
TB40-Δgp68
gp68-defiziente Mutante auf Basis des TB40-BAC (ΔUL118) (Philipp
Lacher)
TB40-Δgp34
gp34-defiziente Mutante auf Basis des TB40-BAC (ΔTRL11) (Philipp
Lacher)
104
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
MCMV
C3X
BAC-abgeleitetes rekombinantes wt-MCMV von MW97.01 (Wagner et
al., 1999)
FSH
m138-defizientes
rekombinantes
Virus
mit
einer
Leserasterverschiebung im ORF m138 auf C3X-Basis (Lenac et al.,
2006)
HSV-1
F
HSV-1 wt-Stamm (Dingwell et al., 1994)
ΔgE
gE-defiziente Mutante durch Insertion des green fluorescent protein
(gfp) in den US8-Genlokus (David C. Johnson, Portland)
gE-Rev
Revertante des gE-defizienten Virus (David C. Johnson, Portland)
VACV
wt
Wildtypvirus, Stamm Western Reserve (WR)
Die Gesamtheit der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten und generierten
rekombinanten VACV ist in Tabelle 4.2 aufgeführt. Als Basis für die Generierung wurde
das Western Reserve Wildtypvirus benutzt.
105
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Tab. 4.2: Rekombinante Vaccinia Viren. HR: die Herstellung der rVACV ist in dieser Arbeit beschrieben; *:
die Klonierung und Generierung ist an genannter Stelle beschrieben aber im Zuge dieser Arbeit geplant
bzw. durchgeführt worden; #: die V5/6xHIS-markierte Verkürzungsmutante wurde durch Umklonierung
der unmarkierten Variante durch Manuela Fiedler hergestellt.
rVACV
Referenz
rVACV
Referenz
gp34FL
(Atalay et al., 2002)
gp34(24-140)FL-101
HR
gp34
(Sprague et al., 2008)* gp34(24-140)FL-45/101
HR
gp34(24-180)
HR
gp34(24-140)FL-82/101
HR
gp34(ΔS-180)
HR
gp34(24-140)FL-45/82/101 HR
gp34(24-154)
HR
gp34(24-140)FL-trp65
HR
gp34(ΔS-154)
HR
gp68FL
(Atalay et al., 2002)
gp34(24-124)
HR
gp68
(Sprague et al., 2008)*
gp34(ΔS-124)
HR
gp68(26-292)FL
(Sprague et al., 2008)*
gp34(24-154)FL
HR
gp68(26-251)FL
(Sprague et al., 2008)*
gp34(24-140)FL
HR
gp68(26-206)FL
(Sprague et al., 2008)*
gp34(24-124)FL
HR
gp68(71-292)V5/6xHIS
(Sprague et al., 2008)#
gp34(24-140)FL-45 HR
CD64
(Sprague et al., 2008)*
gp34(24-140)FL-82 HR
CD32A
(Sprague et al., 2008)*
106
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4.1.8 Primäre Antikörper/IVIGs/sekundäre Antikörper
Tab. 4.3: Primäre Antikörper/IVIGs/sekundäre Antikörper
Bezeichnung/
Antigen
Hersteller/
Referenz
Spezies/
Eigenschaft
Anwendung/
Konzentration
α-FLAG (M2)
Sigma-Aldrich
Maus
WB: 1:3.000
α-FLAG-Agarose
Bethyl
Ziege, kovalent an
Agarose gekoppelt
IP: 4 µg
α-HA
Sigma-Aldrich
Kaninchen
WB: 1:4.000
α-V5
Invitrogen
Maus
WB: 1:10.000
ITC88
(IgG1 und IgG3)
(Ohlin M. et al., 1993)
humanisierter
monoklonaler Mausantikörper
NT
α-pp72 MsX CMV
Chemicon
Maus
WB: 1:15.000
α-pp65 (HCMV) [3A12]
Chemicon
Maus
WB: 1:20.000
α-beta-Aktin
Sigma-Aldrich
Maus
WB: 1:20.000
α-CD64 [10.1]
Ancell Corp.
Maus
IP: 2 µg
α-CD32 [AT10]
Santa Cruz
Maus
IP: 1,5 µg
α-p52 (HCMV) CCH2
Dako
Maus
Immunfärbung
α-gB (HCMV)
(W. Britt, Alabama)
Maus
WB: Überstand
Fc-Fragment
Rockland
human
IP: 1 µg
Cytotect® CP Biotest
Biotest
human
NT
Gammagard® SD
Baxter
human
NT
Kiovig™
Baxter
human
NT
α-Maus POD
Dianova
Ziege
WB: 1:3.000
α-Kaninchen POD
Sigma-Aldrich
Ziege
WB: 1:4.000
4.1.9 Geräte
Brutschränke
BBD 6220, Heraeus
Elektrophorese-Zubehör
Biometra/Roth
ELISA Reader
Rainbow ELISA Reader, Tecan
FPLC ÄKTA™ Systems
ÄKTAbasic, GE Healthcare
107
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Geltrockner
Gel Dryer 583, BioRad
Hybridisierungsofen
OV5, Biometra
Luminometer
MicroLumat LB96P, EG&G Berthold
Mikroskop
TS100, Nikon
Axiovert 40 CFL, Zeiss
Elektroporator
Nucleofector II, Amaxa AG
Gene Pulser, BioRad
Photometer
GeneQuant II, GE Helthcare
Power Supplies
Power Pac 300, BioRad
EPS 301, GE Healthcare
Semidry Blotting Apparatur
Fastblot B64, BioRad
Sterilbank
Hera Safe, Heraeus
Thermoblock
ThermoStat Plus, Eppendorf
Thermomixer Comfort, Eppendorf
Thermocycler
T1 und T3000, Biometra
Überkopfschüttler
REAX2, Heidolph
Ultraschall-Desintegrator
Sonifier 450, Branson
Ultrazentrifuge
Optima L-70K (Rotor SW 32), Beckman
UV-Crosslinker
CL-1000, UVP
UV-Transilluminator
Lumi-Imager F1, Roche
UV-Spektrometer
Mini 1240, Shimadzu
Vortexer
VV3, VWR
108
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Wiegeschüttler
3011, GFL
Zentrifuge
J2-21 (Rotoren JA-14 und JLA-16.250), Beckman
3K30, Sigma Sartorius
5810R, Eppendorf
5415D, Eppendorf
5417R, Eppendorf
4.2
Zellbiologische Methoden
4.2.1 Kultivierung adhärenter Zellen
Alle in dieser Arbeit verwendeten eukaryotischen Zellen wurden entweder in DMEM
(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) oder in RPMI-1640 kultiviert, versetzt mit 10%
hitzeinaktiviertem (30 min bei 56°C) FCS (Foetal Calf Serum), 100 Einheiten/ml
Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin und in einem Inkubator bei 37°C
und 5% CO2 inkubiert. Das RPMI-1640 Medium wurde zusätzlich mit 1 mM
Natriumpyruvat versetzt. Die Passagierung der Zellen erfolgte durch einmaliges Waschen
mit PBS und kurzzeitiger Inkubation in Trypsin. Die Trypsinkonzentration variierte
zwischen den verschiedenen Zelllinien von 0,5 bis 2,5% (verdünnt in PBS), für das
Ablösen von CV-1 Zellen wurde 2,5%iges Trypsin mit 2 mM EDTA verwendet. Die
enzymatisch
vom
Boden
der
Zellkulturgefäße
abgelösten
Zellen
wurden
in
Komplettmedium (DMEM bzw. RPMI-1640 mit oben genannten Zusätzen) resuspendiert
und auf entsprechende Zellkulturformate umgesetzt.
1x PBS (pH 7,4)
155 mM NaCl
1,1 mM KH2PO4
3 mM Na2HPO4-7H2O
109
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4.2.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Die Lagerung eukaryotischer Zellen erfolgte in flüssigem Stickstoff. Zellen sollten sich
zum Einfrierzeitpunkt in der Wachstumsphase befinden, also nur zwischen 70-85%
konfluent sein. Nach dem Trypsinieren wurden die Zellen in Komplettmedium
aufgenommen und für 5 min bei 300 g abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in speziellem
Einfriermedium resuspendiert und in 1 ml Aliquots in Cryoröhrchen überführt, wobei die
benötigte FCS-Konzentration je nach Sensitivität der Zelllinie zunimmt. Das DMSO
verhindert beim Einfrierprozess die Kristallbildung im wässrigen Medium und die damit
einhergehende
Zellschädigung.
Durch
Verwendung
von
Isopropanol
gefüllten
Einfriergefäßen wurde eine kontinuierliche Temperaturabsenkung der Zellen um
1°C/min gewährleistet. Die Zellen wurden für mindestens 24 h bei -80°C gelagert, bevor
sie zur langfristigen Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt wurden.
Einfriermedium
50 % (v/v) DMEM
40 % (v/v) FCS
10 % (v/v) DMSO
4.2.3 Kultivierung von Hybridomazellen
Hybridomazellen (Hybridomas) sind stabil fusionierte Zellhybride aus B-Zellen einer
immunisierten Maus und immortalisierten Myelomzellen. Sie werden klonal vereinzelt
und sezernieren große Mengen an Antikörpern einer Subklasse mit definierter
Epitoperkennung, so genannte monoklonale Antikörper. Die in dieser Arbeit
verwendeten Hybridomas wurden in RPMI-1640 (10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin)
in liegenden oder stehenden Zellkulturflaschen expandiert. Hybridomazellen sind
teilweise semiadhärent und müssen während der Passagierung durch Pipettieren vom
Zellkulturgefäßboden abgelöst werden. Zur Antikörperproduktion wurden 3-4x 107
Zellen pro T175cm2-Zellkulturflasche in RPMI-1640 ohne Zusatz von FCS eingesät und
für 7 Tage kultiviert, bis ein Großteil der Hybridomazellen abgestorben war. Die Zellen
110
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
und Zellreste wurden für 10 min bei 800 g abzentrifugiert. Der Antikörper enthaltende
Überstand wurde bei 4°C aufbewahrt bzw. für Langzeitlagerung bei -20°C eingefroren.
4.2.4 Transfektion
Die Transfektion eukaryotischer Zellen erfolgte durch den Einsatz kationischer Lipide
mittels LipofectAMINETM 2000 CD (LF2000 CD) und SuperFect® Transfection Reagent
(SuperFect) oder durch Transfektion der DNA in den Zellkern mittels Nucleofector®
Technology von Amaxa. Die zu transfizierenden Zellen wurden am Tag zuvor umgesetzt,
sodass die Zellen am Tag der Transfektion eine Konfluenz von 50% hatten.
SuperFect
Für die Transfektion mittels SuperFect von 4-5x 105 Zellen wurden 2,5 μg DNA (Plasmid
DNA) bis 3 μg (BACmid DNA) verwendet und auf 100 μl mit Antibiotika- und Serumfreien Medium aufgefüllt und leicht gemischt (abgeschnittene Spitzen bei BACmid DNA).
Zu diesem Reaktionsansatz wurden 15 μl Superfect gegeben, durchmischt und für 510 min bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit wurden die Zellen einmal mit 4 ml
PBS gewaschen und mit 1 ml Komplettmedium versehen. Der Transfektionsmix wurde
dann auf den Zellrasen getropft und die Platte für 2-3 h bei 37°C inkubiert. Abschließend
wurden die Zellen mit 4 ml PBS gewaschen und in 2 ml Komplettmedium bei 37°C
inkubiert.
LF2000 CD
Für die Transfektion von 4-5x 105 Zellen wurden 3 μl LF2000 CD mit 125 μl OptiMEM
(Invitrogen) gut vermischt und für 5 min bei RT inkubiert. 1,5 μg der zu transfizierenden
Plasmid DNA wurde mit OptiMEM auf 25 μl aufgefüllt, mit dem LF2000 CD-Mix
vereinigt, gemischt und für 25 min bei RT inkubiert. In der Zwischenzeit wurden die
Zellen
gewaschen,
enzymatisch
vom
Zellkulturgefäßboden
abgelöst
und
in
Transfektionsmedium (DMEM ohne Antibiotika) aufgenommen. Nach Zentrifugation der
Zellen bei 800 g für 5 min wurde der Überstand verworfen, das Zellpellet in
Transfektionsmedium resuspendiert und in der gewünschten Dichte (50-70% Konfluenz)
ausgesät. Das Endvolumen pro Loch sollte 500 μl betragen. Der LF200 CD-DNA-Mix
111
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
wurde am Ende tropfenweise dazu pipettiert und die Zellkulturplatte leicht geschwenkt.
Das Transfektionsmedium wurde nach 4-5 h Inkubation der Zellen bei 37°C durch
Komplettmedium ersetzt.
Amaxa Nucleofector®
1x 106 Zellen wurden in 100 μl der entsprechenden Nukleofektionslösung (V oder R)
resuspendiert, mit 2 μg Plasmid DNA versetzt und in eine Elektroporationsküvette
überführt. Nach dem Puls wurden die Zellen in Komplettmedium aufgenommen und auf
insgesamt 24 cm2 einer 24-Loch-Zellkulturplatte ausgesät. Für die Zelllinien Vero, CV-1,
293, RPE und Jurkat wurde das Nukleofektions-Kit V verwendet, MRC-5 Zellen wurden
mit dem Kit R transfiziert. Für die Transfektion wurden die Programme X-001 (MRC-5,
Jurkat und RPE), V-001 (Vero), Q-001 (293) und A-033 (CV-1) genutzt.
4.3
Virologische Methoden
4.3.1 Herstellung gereinigter Virus-Stocks
HCMV
20-30 Zellkulturflaschen (175 cm2) mit 90% konfluenten MRC-5 Zellen wurden mit einer
MOI (multiplicity of infection; Infektionsdosis) von 0,05-0,1 infiziert. Wenn alle Zellen
nach ca. 7-9 Tagen einen deutlichen cytopathischen Effekt (CPE) zeigten, wurde der
Überstand abgenommen und Zellreste bei 5.000 g für 10 min bei 10°C in 500 ml
Zentrifugenbechern pelletiert. Die Viren im zellfreien Überstand wurden 3 h bei 20.000 g
bei 10°C in 250 ml Zentrifugenbechern abzentrifugiert, in insgesamt 10 ml PBS
resuspendiert, vereinigt und mit einem Dounce tissue grinder (Wheaton) homogenisiert.
25 ml eines Sorbitol-Kissens (4°C) wurden vorsichtig mit der Virussuspension
überschichtet und bei 10°C und 100.000 g für 1 h im SW-32-Rotor ultrazentrifugiert. Das
Viruspellet wurde 30 min auf Eis in 1-2 ml PBS gelöst, resuspendiert, anschließend im
Dounce tissue grinder homogenisiert und in 10-50 μl Aliquots bei -80°C eingefroren.
112
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Sorbitol-Kissen
20% (w/v) Sorbitol
50 mM Tris/HCl (pH 7,4)
1 mM MgCl2
0,1 mg/ml Bacitracin
Der Puffer wurde mittels eines 0,45 μm Porenfilters sterilfiltriert.
MCMV
Für die Herstellung eines gereinigten MCMV-Stock wurden 20-30 175 cm2
Zellkulturflaschen murine embryonale Fibroblasten (MEF) in der 3. Passage mit einer
MOI zwischen 0,01 und 0,5 infiziert. Bei einem sichtbaren CPE nach 6-9 Tagen wurden
das Medium und die infizierten Zellen wie oben beschrieben abzentrifugiert, die Viren
pelletiert und nach Verwerfen des Überstandes über Nacht in 10 ml PBS auf Eis inkubiert.
Die Virussuspension wurde im Dounce tissue grinder homogenisiert, vorsichtig auf 25 ml
15%iges Saccharose-Kissen geschichtet und Viruspartikel bei 10°C und 100.000 g für 1 h
im SW-32-Rotor abzentrifugiert. Das Viruspellet wurde anschließend über Nacht auf Eis
in 2-3 ml PBS gelöst, im Dounce tissue grinder homogenisiert und in 10-50 μl Aliquots bei
-80°C eingefroren.
Saccharose-Kissen
15 % (w/v) Saccharose
50 mM Tris /HCl (pH 7,8)
10 mM KCl
5 mM EDTA
Der Puffer wurde mittels eines 0,45 μm Porenfilters sterilfiltriert.
113
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
HSV
Fünf 175 cm2 Zellkulturflaschen Vero Zellen wurden mit 0,01-0,5 MOI infiziert. Nach 2-3
Tagen, wenn ein deutlicher CPE sichtbar war, wurden Zellen und Überstand bei 5.000 g
für 10 min bei 10°C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde verworfen und der HSV-1-Stock
wurde wie für HCMV beschrieben präpariert.
4.3.2 Herstellung ungereinigter Virus-Stocks
HSV
Eine Zellkulturflasche (75 cm2) mit annähernd 100% konfluenten VERO Zellen wurde
mit einer MOI von 0,01-0,5 für 2-3 Tage infiziert, bis sich ein deutlicher CPE durch
Ablösen der Zellen von der Flasche zeigte. Die Viren wurden durch 2 Zyklen Einfrieren
bei -80°C und Auftauen bei 37°C aus den infizierten Zellen freigesetzt. Die Zellreste
wurden bei 4°C für 10 min bei 3.200 g abzentrifugiert und der Virusüberstand wurde in
500 μl Aliquots bei -80°C eingefroren.
Vaccinia Virus (VACV)
Eine 100% konfluente Zellkulturflasche (175 cm2) mit CV-1 Zellen wurde mit einer MOI
von 0,5 für 2-3 Tage infiziert, bis sich die Zellen durch den starken CPE von der Flasche
ablösten. Die infizierten Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4°C für 10 min bei
1.000 g geerntet. Der Überstand wurde verworfen. Das Zellpellet wurde in 750 μl kaltem
PBS resuspendiert, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und für 3x 10 sec bei einer
Abgabeleistung von ca. 30 W ultrabeschallt, um das zellständige VACV in den Überstand
zu überführen. Das Virus selbst ist durch eine stabile Virionhülle vor der Zerstörung
durch Ultraschallwellen geschützt. Die Zellreste wurden bei 4°C und 1.000 g für 7 min
abzentrifugiert und der virushaltige Überstand 1 (ÜS 1) wurde in ein neues 2 ml
Reaktionsgefäß überführt. Das Pellet wurde erneut in 500 μl kaltem PBS resuspendiert,
wie oben beschrieben ultrabeschallt, zentrifugiert und der ÜS 2 wurde abgenommen und
mit dem ÜS 1 vereinigt. Der VACV-Stock wurde bei 4°C gelagert. Ein Aliquot des Stocks
wurde zur Langzeitaufbewahrung bei -80°C eingefroren.
114
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4.3.3 Virustitration
HCMV
Die Bestimmung des Titers eines HCMV-Stocks erfolgte auf MRC-5 Zellen, die auf einer
96-Loch-Zellkulturplatte mit einer Konfluenz von 80% ausgesät wurden. HCMV wurde
durch serielle 1:10 Verdünnungen (20 μl Virusverdünnung auf 180 μl Medium/Loch) des
1:100 in DMEM vorverdünnten Virusstocks und anschließender Zentrifugation der Viren
auf die Zellen für 2x 15 min bei 800 g titriert. Die Zentrifugation erhöht die Infektionsrate
und war Bestandteil jeder HCMV Infektion. Nach dreitägiger Inkubation bei 37°C wurde
der Überstand abgesaugt, die Zellen durch Zugabe von 100 μl/Loch Methanol für
mindestens 2 Stunden bei -20°C fixiert und permeabilisiert. Nach Trocknung der
Zellkulturplatten wurden diese anschließend wie unter 4.3.4 beschrieben immungefärbt.
Der Virustiter in pfu (plaque forming units; Plaque-bildende Einheiten)/ml wurde unter
Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors und des Volumens des Inokulums wie folgt
berechnet:
Virustiter [pfu/ml ] =
Mittelwert der Anzahl gefärbter Zellen [pfu ]
Verdünnungsfaktor × Vol. des Inokulums [ml ]
MCMV
Für die Titration von MCMV wurden MEF in der Zellkulturpassage 3 mit 80%iger
Konfluenz in 48-Loch-Zellkulturplatten ausgesät. Der 1:100 vorverdünnte MCMV-Stock
wurde in 1:10 Stufen auf der Platte verdünnt und anschließend wie für HCMV
beschrieben auf die Zellen zentrifugiert. Nach zweistündiger Inkubation bei 37°C wurde
das Medium abgesaugt und durch ein semi-solides Methylzellulosemedium ersetzt. Durch
das viskose Medium wird die Plaqueformation lediglich durch Zell-zu-Zell-vermittelte
Virusausbreitung ermöglicht. Eine Ausbreitung über das Medium und die daraus
resultierende Bildung sekundärer Plaques findet nicht statt. Nach vier Tagen konnten die
MCMV
Plaques
mikroskopisch
gezählt
und
unter
Berücksichtigung
des
Verdünnungsfaktors und Inokulumvolumens der Virustiter wie folgt berechnet werden:
Virustiter [pfu/ml ] =
Mittelwert der Anzahl der Virusplaques [pfu ]
Verdünnungsfaktor × Vol. des Inokulums [ml ]
115
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Methylzellulose:
2,5% (w/v) Methylzellulose in H2O
(wird mit Rührfisch autoklaviert)
bei 4°C über Nacht rühren lassen
Methylzellulosemedium
vor Gebrauch zufügen:
8,8% (v/v) 10x MEM
4,4% (v/v) FCS
1,1% (v/v) Penicillin/Streptomycin
1,1% (v/v) L-Glutamin
30 mM NaHCO3
HSV-1
HSV-1 wurde auf 70% konfluenten Vero Zellen in einer 48-Loch-Zellkulturplatte titriert.
Hierbei wurde der Virusstock wie bei MCMV auf der Platte in log10-Schritten verdünnt
und die Plaques nach 36–48 h p.i. im Mikroskop ausgezählt. Durch Einberechnen des
Verdünnungsfaktors und des Volumens wurde der Virustiter (pfu/ml) bestimmt.
VACV
Zur Bestimmung des Vaccinia Virus-Titers wurden CV-1 Zellen mit einer Konfluenz von
70% in einer 48-Loch-Zellkulturplatte ausgesät. Der VACV-Stock wurde wie bei MCMV
und HSV-1 beschrieben in 1:10 Schritten verdünnt. Die VACV-Plaques wurden
mikroskopisch nach 36 h p.i. gezählt und der Virustiter wurde anhand der Verdünnung
und des Inokulums berechnet.
4.3.4 Immunfärbung HCMV infizierter Zellen
Die Bildung von Plaques aus HCMV infizierten Zellen ist langwierig und dauert ca. sechs
Tage. Bei rekombinanten HCMV ist die Plaqueformation zudem oft nicht eindeutig
116
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
bestimmbar. Ein alternativer Test zur Visualisierung HCMV infizierter Zellen ist deren
Immunfärbung mittels eines monoklonalen Antikörpers, der das frühe HCMV Antigen
p52 erkennt.
Nach dreitägiger Infektion der Zellen wurde das Medium durch jeweils 100 μl eiskaltes
Methanol ersetzt und die Platte für mindestens 2 h bei -20°C inkubiert. Die so fixierten
Zellen sind permeabilisiert und Antikörper können intrazelluläre Proteine binden. Nach
Entfernen des Methanols wurden die Platten kurz unter der Sterilbank getrocknet, bis alle
Methanolreste verdampft waren. Nach einmaligem Waschen der Zellen mit 100 μl PBS
wurden sie in 50 μl/Loch 1:200 vorverdünntem (1% (w/v) Milchpulver/PBS)
Primärantikörper (Klon CCH2; Dako) für 30 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde
2x mit 100 μl PBS/Loch gewaschen und der zweite, Peroxidase-gekoppelte anti-Maus
Antikörper in gleicher Menge und Verdünnung für 30 min bei RT zugegeben. Die
Peroxidase-Aktivität wurde mittels des Substrates 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC; Sigma)
unter Erhalt eines rotbraunen Farbniederschlags sichtbar gemacht. Nach zweimaligem
Waschen mit PBS wurden die Zellen in 50 μl Substratlösung für 15-30 min im Dunkeln
inkubiert. Das Waschen in PBS beendet die Reaktion und verhindert die Kristallbildung
des Substrates. Zum Zählen unter dem Lichtmikroskop wurden 100 μl PBS/Loch gegeben.
Der Virustiter wurde in Plaque-bildenden Einheiten/ml (pfu/ml) bestimmt.
Substratpuffer
0,1 M Na-Acetat (pH 5,5)
Substratlösung
1 AEC-Tablette
4 ml N,N-Dimethylformamid
Vor Gebrauch wurde 1 ml der Substratlösung mit 4 ml Substratpuffer und 10 μl 30% (v/v)
H2O2 (0,075% Endkonzentration) versetzt.
117
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4.3.5 HCMV Wachstumskurven
Um einen möglichen Einfluss von mutierten oder deletierten Genen auf das Wachstum
rekombinanter HCMV zu untersuchen, wurde die Virusvermehrung über mehrere Tage
bzw. mehrere Replikationsrunden gemessen. MRC-5 Zellen wurden in 12-LochZellkulturplatten mit einer Konfluenz von 60% ausgesät. Als Meßzeitpunkte wurden 0, 2,
4, 5, 6 und 8 Tage nach Infektion gewählt. Pro Zeitpunkt wurde eine 12-LochZellkulturplatte angelegt. Die Zellen wurden mit 0,07 MOI/Loch in 2 ml Medium/Loch
wie in 4.3.3 beschrieben infiziert. Die Platte des Zeitpunktes 0 wurde direkt nach
Infektion bei -80°C eingefroren, alle anderen Platten an den jeweiligen Tagen. Wenn das
Medium der Zeitpunkte 6 und 8 als zu stark verstoffwechselt beurteilt wurde, wurde 1 ml
frischen Mediums hinzu gegeben. Die Platten wurden gemeinsam aufgetaut, der Inhalt
eines jeden Lochs gemischt und davon je 20 μl in die unter 4.3.3 beschriebene HCMV
Titration in einer Doppelbestimmung eingesetzt.
4.3.6 Neutralisationstest
Die Anwesenheit neutralisierender Antikörper (nAk) vermindert die Infektiösität des
Virus, indem die Interaktion mit spezifischen Zelleintrittsrezeptoren, die Fusion mit der
Zelle oder das Entpacken des Virions selbst beeinträchtigt wird. Den Einfluss der viralen
Fcγ-Rezeptoren (vFcγR) auf die antivirale Kapazität der nAk wurde in Neutralisationstests
(NT)
ermittelt,
indem
die
verschiedenen
vFcγ-Rezeptor-Mutanten
mit
dem
entsprechenden Wildtypvirus in Anwesenheit neutralisierender Antikörper verglichen
wurden. Pro Virus wurden Dreifach- oder Vierfachbestimmungen angesetzt.
In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Varianten des Neutralisationstests (NT)
verwendet. In der ersten Methode (NT 1) wird eine konstant geringe Anzahl von
infektiösen Partikeln (25-60 pfu) in Anwesenheit serieller Antikörperverdünnungsstufen
dosisabhängig neutralisiert (Gonczol et al., 1986). Die zweite Methode (NT 2)
unterscheidet sich hinsichtlich der eingesetzten hohen Viruskonzentration (1x 1051x 106 pfu), die in Anwesenheit einer konstanten Antikörperkonzentration neutralisiert
wird (Frank & Friedman, 1989). Bei beiden Methoden handelt es sich um publizierte
Varianten des NT. Die dritte Methode (NT 3) basiert auf der Transfektion eines
118
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Herpesvirus
responsiven
Herpesviren
induzieren
Luziferaseexpression,
die
Luziferasereporter-Plasmides.
nach
mittels
Eintritt
des
in
die
beschriebenen
Replikationskompetente
transfizierten
Zellen
eine
Luziferase-Reportergenassays
gemessen werden kann. Die hierbei verwendete Viruskonzentration lag, wenn nicht
anders angegeben, bei ca. 2x 105 pfu.
NT 1
HCMV
MRC-5 Zellen wurden mit einer Konfluenz von 75% in 96-Loch-Zellkulturplatten
ausgesät. Die Hyperimmunglobulin-Präparation (intravenöses IgG, IVIG) oder der
monoklonale Antikörper wurden auf einer leeren 96-Loch-Platte in Komplettmedium in
log2-Schritten seriell vor verdünnt (50 μl/Loch), wobei die höchste Konzentration zu einer
kompletten Virusneutralisation und die Niedrigste zu 0-15% Neutralisation führen sollte.
Der Virusstock wurde mit 50 pfu/ml in 50 μl/Loch eingesetzt und zu dem verdünnten
Antikörper gegeben. Als Kontrolle diente die Inkubation des Virus mit Komplettmedium
ohne Antikörperzugabe. Das Virus-Antikörpergemisch wurde 90 min bei 37°C inkubiert,
bevor es auf die MRC-5 Zellen gegeben wurde. Nach Zentrifugation für 2x 15 min bei
800 g und RT wurden die Platten für 3 Tage bei 37°C inkubiert, bevor die infizierten
Zellen wie in 4.3.4 beschrieben immungefärbt wurden. Der Neutralisationstiter eines
Serums ist definiert als der reziproke Wert der Serumverdünnung (1/x), die zu einer
50%igen Virusneutralisation führt.
NT 2
HCMV
MRC-5 Zellen wurden in einer 96-Loch-Zellkulturplatte mit einer Konfluenz von 75%
ausgesät. Eine bestimmte Antikörperverdünnung wurde mit 1x 105-1x 106 pfu HCMV für
90 min bei 37°C inkubiert; als Kontrolle wurde die gleiche Virusmenge ohne Antikörper
gleich behandelt. Die inkubierten Ansätze wurden anschließend auf den MRC-5 Zellen in
log10 -Schritten verdünnt, wie oben beschrieben zentrifugiert und für 3 Tage bei 37°C
119
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
inkubiert, bevor die Virenanzahl über die Immunfärbung wie in 4.3.4 beschrieben
bestimmt wurde.
HSV-1
Vero Zellen wurden auf 48-Loch-Zellkulturplatten mit einer Konfluenz von 70%
ausgesät. 1-5x 105 pfu wurden mit einer entsprechenden Antikörperverdünnung oder als
Kontrolle ohne Antikörper für 90 min bei 37°C inkubiert. Das Medium der Vero Zellen
wurde abgesaugt und durch 500 μl frisches Komplettmedium ersetzt. Das VirusAntikörpergemisch wurde auf den Zellen in log10-Schritten verdünnt und die
Zellkulturplatte für 36 h bei 37°C inkubiert. Die Anzahl der Viren in den verschiedenen
Konditionen wurde durch Zählen der Plaques im Lichtmikroskop bestimmt.
MCMV
Murine embryonale Fibroblasten (MEF, Mausstamm Balb/c) wurden in der Passage 3 mit
einer 75%igen Konfluenz auf 48-Loch-Zellkulturplatten ausgesät. 1-5x 105 Viren wurden
mit einer entsprechenden Antikörperkonzentration bzw. als antikörperfreie Kontrolle für
90 min bei 37°C inkubiert. Das Medium auf den Zellen wurde durch 500 μl frisches
Komplettmedium ersetzt, die präinkubierten Viren darin in log10-Schritten verdünnt und
für 2x 15 min bei 800 g zentrifugiert. Nach zweistündiger Inkubation bei 37°C wurde das
Medium abgesaugt und durch semi-solides Methylcellulosemedium ersetzt. Nach 3-4
Tagen wurden die Plaques im Lichtmikroskop gezählt.
NT 3
HCMV
Eine 10 cm Zellkulturschale wurde wie beschrieben mittels LF2000 CD mit 7,5 μg der
Plasmid DNA pTA-Luc über Nacht transfiziert. Am darauf folgenden Tag wurden die
Zellen durch Trypsininkubation abgelöst und auf eine 24-Loch-Zellkulturplatte
umgesetzt. Nach ca. 8 h sind 80% der ausgesäten Zellen wieder adhärent. Nach der
Zellzahlbestimmung/Loch
wurden
verschiedene
Antikörperkonzentrationen
mit
2x 105 pfu (entspricht rund 5 MOI) HCMV für 90 min bei 37°C inkubiert. Als Kontrollen
120
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
dienten hierbei die höchste eingesetzte Antikörperkonzentration ohne Zugabe von
HCMV, die Inkubation des Virus mit nichtimmunem Serum in entsprechender
Konzentration oder die Verwendung von UV-inaktiviertem Virus (siehe 4.3.8). Nach
Absaugen des Mediums in der Zellkulturplatte und Zugabe der präinkubierten Viren oder
Kontrollen wurde die Kulturplatte 2x 15 min bei 800 g bei RT zentrifugiert und die
Luziferaseexpression 24 h p.i., wie unter 4.4.4 beschrieben, gemessen.
4.3.7 Komplement-vermittelte Virolyse
Die Zugabe von Komplementkomponenten in Anwesenheit von virusspezifischen
Antikörpern verstärkt die Wirkung der Antikörper. Sie leiten eine Kaskade ein, die durch
Porenbildung innerhalb der Virushülle zur Lyse und damit zur Zerstörung des viralen
Partikels führt (Favoreel et al., 2003). Als Komplementquelle wurde IgG-depletiertes
frisches Humanserum HSV-1 und HCMV negativer Spender verwendet. Die
einzusetzende Konzentration musste durch Titration des Komplements ermittelt werden.
Hierbei wurde die Virusreduktion unter Zugabe verschiedener Konzentrationen an
Komplement bestimmt und die Menge ausgewählt, die zu einer 2,5-10fachen Verstärkung
der antiviralen Kapazität der Antikörper durch Komplement führte. Im NT 1 wurden ca.
2,5-5% Komplement eingesetzt, im NT 2 lag die Konzentration aufgrund der höheren
Quantität an eingesetzten Viren und Antikörpern bei 15-20%. Als Kontrollen dienten
jeweils die entsprechende Antikörpermenge ohne Komplementzugabe, bzw. Komplement
ohne Anwesenheit von Antikörpern. Die Messung der Komplement-vermittelten Virolyse
erfolgte in allen drei Varianten des NT wie oben beschrieben.
4.3.8 UV-Inaktivierung
Durch die Behandlung mit UV-Licht wird das virale Genom irreversibel geschädigt,
wodurch das Virus die Fähigkeit zur produktiven Infektion verliert. Das Virus wurde in
1 ml Komplettmedium verdünnt und in eine 6 cm Zellkulturschale gegeben und
anschließend für 20 min mit einem Abstand von 10 cm zur UV-Quelle (254 nm)
bestrahlt. Für nachfolgende Infektionen wurde das behandelte Virus auf das
entsprechende Volumen verdünnt.
121
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4.3.9 Herstellung rekombinanter Vaccinia Viren (rVACV)
Zur ektopen Überexpression von sowohl viralen als auch zellulären Proteinen wurden
rekombinante Vaccinia Viren (rVACV) verwendet. Hier wird das Zielgen unter der
Kontrolle des starken VACV p7.5k-Promotors überexprimiert. Weitere Vorteile sind der
relativ kurze VACV Replikationszyklus von ca. 20 h und der früh nach der Infektion
(8 h p.i.) einsetzende, substanzielle viral host cell shutoff. Die zu exprimierenden Gene
wurden in den Rekombinationsvektor p7.5k131a gebracht, wo sie flankiert von der
Sequenz der viralen Thymidinkinase (tk) vorlagen. Durch die homologe Rekombination
dieser Sequenzen mit dem Vaccinia Virus Genom wird das VACV Thymidinkinasegen
(tk) zerstört und rekombinante Viren können in Anwesenheit von Bromodesoxyuridin
(BrdU) auf tk negativen Zellen selektiert werden (Staib et al., 2004). BrdU fungiert als
Thymidinanalogon und führt nach Einbau in das virale Genom durch eine funktionelle
Thymidinkinase zum Abbruch der Replikation.
Infektion
Im 6-Loch-Zellkulturplattenformat wurden CV-1 Zellen mit einer Konfluenz von 40-50%
ausgesät. In einem Volumen von 0,5 ml/Loch wurden die Zellen für 30 min mit Wildtyp
VACV mit einer MOI von 0,01-0,05 bei Raumtemperatur unter gelegentlichem
Schwenken infiziert. Das Komplettmedium wurde auf 2 ml/Loch aufgefüllt und die
Zellkulturplatte für eine weitere Stunde auf 37°C inkubiert.
Transfektion
Nach 90minütiger wt Infektion wurde die Transfektion mit Hilfe des „Superfect
Transfection Reagent“ der Firma Qiagen und 2,5 μg Rekombinationsvektor wie unter
4.2.4 beschrieben durchgeführt. Nach abschließendem Waschen der Zellen und der
Zugabe von 2 ml Komplettmedium erfolgte eine Inkubation bei 37°C für 2 Tage. Die
Zellkulturplatte wurde anschließend bei -20°C eingefroren und wieder aufgetaut. Die
Medium-Zell-Suspension wurde in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und bei 4°C
gelagert. Um die rVACV vollständig aus den infizierten Zellen freizusetzen, wurde die
Suspension für 3x 10 sec bei einer Abgabeleistung von ca. 30 W ultrabeschallt.
122
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
BrdU-Selektion
HU143 tk- Zellen wurden auf 6-Loch-Zellkulturplatten ausgesät und mit einer Konfluenz
von 60-70% verwendet. Pro Rekombinationsansatz wurde eine 6-Loch-Platte verwendet,
in drei Löchern wurde 0,5 ml Komplettmedium mit 100 μg BrdU/ml vorgelegt, zu den
restlichen drei Löchern der Platte wurde als Kontrolle 0,5 ml Komplettmedium ohne
Selektionsmarker gegeben. Die ultrabeschallte Medium-Zell-Suspension wurde von Loch
zu Loch in log10-Schritten (55 μl in 500 μl) sowohl auf der Hälfte mit Selektionsmarker, als
auch in den restlichen 3 Kontrolllöchern verdünnt. Die Platte wurde für 30 min bei RT
unter mehrmaligem Schwenken inkubiert, auf 2 ml/Loch mit dem entsprechenden
Medium aufgefüllt und für zwei Tage bei 37°C inkubiert, bis Plaques zu sehen waren.
Wenn im Vergleich mit den Kontrolllöchern ohne Selektion eine deutlich verringerte
Anzahl an Plaques unter BrdU-Selektions sichtbar war, wurde das Medium abgenommen
und 3-4 Plaques pro Rekombinationsansatz mittels 50 μl PBS gepickt. Hierfür wurde die
Pipettenspitze direkt auf den Plaque gesetzt, etwas PBS ausgelassen und sofort wieder
eingesogen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Der Plaque wurde 3x 3 sec mit ca.
30 W ultrabeschallt und bei 4°C gelagert. Eine zweite BrdU-Selektion wurde wie oben
beschrieben durchgeführt. Dazu wurden die 50 μl Plaquesuspension komplett in den
ersten 1:10 Verdünnungsschritt eingesetzt, und die Kontrolllöcher ohne BrdU wurden
weggelassen. Nach Plaquebildung in der zweiten Selektionsrunde wurden diese gepickt
und ultrabeschallt wie zuvor beschrieben.
rVACV Mini-Stocks
Nach der Zweifachselektion wurden Mini-Stocks aus den Plaques hergestellt. CV-1 Zellen
wurden mit einer Konfluenz von 70-80% im 6-Loch-Zellkulturplattenformat ausgesät, die
ultrabeschallte Plaquesuspension wurde in 2 ml Komplettmedium auf die Zellen gegeben
und bei 37°C inkubiert. Sobald alle Zellen einen deutlichen CPE zeigten, wurde die
geerntete Medium-Zellsuspension in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt, 3x 10 sec bei ca.
30 W ultrabeschallt und bei 4°C gelagert. Der Titer eines rVACV Mini-Stocks beträgt im
Durchschnitt etwa 5x 107 pfu/ml. Die Identität der Klone wurde über PCR und/oder WB
123
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
bestimmt. Für weitere Analysen wurden VACV Stocks wie unter 4.3.2 beschrieben
angelegt.
4.3.10 Isolierung der rVACV DNA zur Analyse
Die VACV DNA wurde durch den Verdau mit Proteinase K aus den Viruspartikeln
freigesetzt. Dafür wurden zu 100 μl VACV Mini-Stock 100 μl 4x Proteinase K Puffer,
180 μl H2O und 20 μl Proteinase K gegeben und über Nacht bei 56°C inkubiert. Die
Proteine wurden durch Zugabe von 800 μl Phenol/Chloroform, Mischen mit Vortexer
und einem anschließenden 4minütigem Zentrifugationsschritt bei 16.000 g extrahiert.
Zur wässrigen Phase wurden 0,7 Volumen Isopropanol gegeben, die DNA durch
Zentrifugation für 30 min bei 16.000 g und 4°C gefällt, der Überstand verworfen und das
Nukleinsäurepellet mit 70% eiskaltem EtOH gewaschen und erneut für 10 min bei
16.000 g und 4°C abzentrifugiert. Die DNA wurde bei 37°C getrocknet und in 30 μl H2O
gelöst. Für eine analytische PCR wurden 5 μl der gefällten DNA verwendet.
4x Proteinase K Puffer
50 mM Tris/HCl (pH 8,0)
20 mM EDTA
2% (w/v) SDS
4.3.11 Sequenzierung der rVACV DNA zur Analyse
Zur Bestätigung der korrekten Insertion des gewünschten Gens in den tk-Lokus des
VACV Genoms wurde zuerst das Gen mittels des Primerpaares tk11 und tk12 amplifiziert.
Die beiden Primer binden in der angrenzenden tk-Region und ergeben ein PCR Produkt
von 270 bp Länge bei nicht erfolgreicher Insertion des Gens, also bei VACV wt DNA.
Wenn allerdings durch homologe Rekombination das Zielgen in der tk Region inseriert
ist, vergrößert sich das amplifizierte Produkt um die jeweilige Genlänge (270 bp + x bp),
was in einem 1%igen Agarosegel gut aufgelöst werden kann. Um Punktmutationen
auszuschließen, wurde das Amplifikat mit Hilfe des Primerpaares Seq1 und Seq2
124
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
sequenziert. Dazu wurde das PCR Produkt zuvor aus dem Agarosegel wie unter 4.4.1
beschrieben aufgereinigt.
4.4
Molekularbiologische Methoden
4.4.1 Klonierungen
Die
Erzeugung
Standardmethoden
der
Expressionskonstrukte
unter
Zuhilfenahme
erfolgte
mit
molekularbiologischen
entsprechender Kits. Alle verwendeten
Restriktionsenzyme stammen von den Firmen NEB (New England Biolabs) und
Fermentas. Alle Nährmedien für Bakterien wurden vor Verwendung autoklaviert.
Klonierung der FLAG-markierten gp34 und gp68 Verkürzungsmutanten
Für die Generierung carboxyterminal FLAG-markierter Expressionskonstrukte als
Ausgangspunkt zur Herstellung rekombinanter Vaccinia Viren wurde ein neuer
Rekombinationsvektor auf der Basis von p7.5k131a konstruiert, der ein FLAG-Epitop
nach einer SpeI-Restriktionsschnittstelle besitzt (p7.5k131a-FLAG). Alle Konstrukte
wurden 5’ in die multiple cloning site (MCS) und 3’ über SpeI in den Vektor p7.5k131aFLAG kloniert, so dass das FLAG-Epitop im korrekten Leseraster vorlag (Abb. 4.1). Alle
wie beschrieben klonierten Konstrukte haben durch die Verwendung der SpeISchnittstelle einen zusätzlichen Einschub der zwei Aminosäuren Serin und Threonin am
3’-Ende direkt vor dem Epitop (Abb. 4.1).
MCS
SpeΙ
FLAG-Epitop
5‘– ACTAGTGACTACAAGGACGACGACGACAAG
Ser
Thr
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
TGA– 3‘
*
Stop
Abb. 4.1: Sequenzausschnitt des Rekombinationsvektors p7.5k131a-FLAG. MCS: multiple cloning site,
SpeI: SpeI-Restriktionsschnittstelle, Ser: Serin, Thr: Threonin, Asp: Asparagin, Tyr: Tyrosin, Lys: Lysin
125
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Klonierung der gp34 und gp68 Verkürzungsmutanten
Alle Konstrukte wurden über geeignete Restriktionsschnittstellen in die MCS von
p7.5k131a oder p7.5k131a-FLAG eingesetzt.
Agarose-Gelelektrophorese
Die elektrophoretische Auftrennung nach der Größe der DNA zur Analyse
restriktionsverdauter Plasmid-DNA, zur Kontrolle einer PCR bzw. zur präparativen
Gewinnung definierter Fragmente nach einem Restriktionsverdau oder einer PCR
erfolgte auf einem 1%igen (w/v) Agarosegel in 1x TBE. Alle DNA Proben wurden mit 6x
TBE-Probenpuffer versetzt und aufgetragen. Als Größenstandard wurden 2,5 μl einer 1 kb
DNA-Leiter
(HyperLadder
I)
verwendet.
Durch
Zugabe
von
Ethidiumbromid
(Endkonzentration 0,2 μg/ml) kurz vor Gießen des Gels wurde die DNA unter UV-Licht
sichtbar gemacht. Die Trennung erfolgte für 30 min bei 120 Volt.
Die Auftrennung von BACmid-DNA nach Restriktion erfolgte auf 0,5%igen (w/v)
Agarosegelen mit langer Trennstrecke in 0,5% TBE bei 60 Volt für 13 h.
10x TBE
6x TBE-Probenpuffer
0,5x TBE
900 mM Tris Base
6x TBE
45 mM Tris Base
900 mM Borsäure
10% (v/v) Glycerol
45 mM Borsäure
20 mM EDTA (pH 8,0)
Bromphenolblau
1 mM EDTA (pH 8,0)
DNA-Extraktion aus Agarosegelen
Die DNA-Banden wurden mit einem Skalpell aus dem Agarosegel auf dem UV-Tisch
ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA-Fragmente erfolgte mit Hilfe des „QIAquick
Gel Extraction Kit“ der Firma Qiagen nach Herstellerangaben. Die gereinigte DNA wurde
in 50 μl H2O aufgenommen. Die Extraktion von PCR-Fragmenten oder von Fragmenten,
die kleiner als 100 bp waren, erfolgte ausschließlich mit dem „MinElute Gel Extraction
126
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Kit“ der Firma Qiagen nach Herstellerangaben. Die gereinigte DNA wurde hier in 10 μl
H2O aufgenommen.
Ligation von DNA Fragmenten
Als Voraussetzung für die Ligation von DNA-Fragmenten mussten diese vollständig durch
Restriktionsenzyme geschnitten vorliegen. Der Zielvektor und das Fragment wurden in
einem Reaktionsvolumen von 10-20 μl ligiert, wobei das Fragment in einem 5fachen
Konzentrationsüberschuss im Vergleich zum Vektor (50-100 ng) eingesetzt und dessen
Menge wie folgt berechnet wird. ([ng] Insert = 5 x [kb] Insert x [ng] Vektor / [kb] Vektor)
Die Ligationsreaktion wurde mit Hilfe der T4 DNA Ligase nach Angaben des Herstellers
für 1 h bei RT oder über Nacht bei 16°C durchgeführt.
Dephosphorylierung des Vektors
Bei
ungerichteter
Ligation
von
Fragment
und
Vektor,
wenn
also
nur
ein
Restriktionsenzym verwendet wurde, muss der Vektor nach dem Verdau an seinen 5’Enden dephosphoryliert werden, da es ansonsten mit großer Häufigkeit zur Religation des
Vektors kommt. Die Dephosphorylierung wurde mit Hilfe der Alkalischen Phosphatase
aus Kälberdarm (CIAP, Calf intestinal alkaline phosphatase) nach Herstellerangaben
durchgeführt, der dephosphorylierte Vektor mittels des „QIAquick PCR purification“ Kits
gereinigt und in die Ligationsreaktion eingesetzt.
Analytische PCR
Zur Überprüfung eines Plasmids auf die Insertions eines DNA-Fragments wurde eine
analytische PCR in einem Reaktionsansatz von jeweils 25 μl durchgeführt. Verwendet
wurde die Taq-Polymerase der Firma Invitek. Die Elongationszeiten ergaben sich aus der
Länge des Konstruktes (0,5 min/500 bp). Die Denaturierung der DNA erfolgte anfänglich
für 5 min, im jeweiligen Zyklus für 30 sec. Die Primerbindung an die denaturierte DNA
erfolgte zwischen 30-45 sec. Die Amplifikation erfolgte in 30 Zyklen. Der Reaktionsansatz
für eine analytische PCR wurde wie folgt gewählt:
127
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
10-50 ng DNA
0,75 μl dNTPs (10 μM)
0,75 μl sense-Primer (10 μM)
0,75 μl antisense-Primer (10 μM)
2,5 μl 10x Reaktionspuffer (+ MgCl2)
1 U Taq-Polymerase
Präparative PCR
Zum Klonieren von PCR-Fragmenten wurden diese mittels des „Expand High Fidelity
PCR System“ (Roche) in einem 50 μl Reaktionsansatz amplifiziert. Hierfür wurde die
gleiche Konzentration der DNA wie für eine analytische PCR eingesetzt, aber die
doppelte Menge der oben aufgeführten Reagenzien verwendet. Die Elongationszeiten
ermittelten sich in gleicher Weise wie oben erwähnt, die Amplifikationsdauer lag bei 30
Zyklen.
Das für die homologe Rekombination benötigte PCR-Produkt zur BACmid-Mutagenese
wurde mittels touch down-PCR amplifiziert. Die Primer haben eine Länge von rund
80 bp, bestehend zum einen aus einer 20 bp langen Sequenz, die an die zu amplifizierende
DNA bindet. Der restliche, rund 60 bp lange Abschnitt findet im initialen
Amplifikationsschritt keine Zielsequenz, ist aber Voraussetzung für die folgende
zielgerichtete, homologe Rekombination ins BACmid. Aus diesem Grund kann keine
optimale Bindungstemperatur der Primer an die DNA ermittelt werden. Daher begann die
touch down-PCR mit einer hohen Bindetemperatur, die in jedem Zyklus um 1°C gesenkt
wurde, so dass die Primer erst ab einem bestimmten Zyklus binden konnten. Folgendes
PCR-Programm wurde verwendet:
128
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
95°C
5 min
40°C
1 min
94°C
1 min 20 sec
"
62°C
2 min
x20 Zyklen
72°C
0,5 min/500 bp
94°C
1 min
"
43°C
2 min
x15 Zyklen
72°C
2 min 30 sec
72°C
10 min
4°C
∞
-1°C/Zyklus
Isolierung von Plasmid-DNA
Für die DNA-Isolierung wurde, entsprechend der Menge der Bakterienkultur, das
„Miniprep Kit“ oder das „Midiprep Kit“ der Firma Qiagen nach Herstellerangaben
verwendet.
Isolierung von BACmid-DNA
Eine 10 ml LB-Übernachtkultur (16-18 h) wurde bei 3.200 g bei 4°C abzentrifugiert und
der Überstand dekantiert. Die folgenden Puffer P1, P2, N3 und EB wurden aus dem
„Miniprep Kit“ der Firma Qiagen verwendet. Das Bakterienpellet wurde in 200 μl P1
resuspendiert und in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde die
Bakterienlyse durch Zugabe von 300 μl P2 und Mischung durch mehrmaliges Invertieren
gestartet. Nach 5 min Inkubation bei RT wurde die Lyse durch Neutralisation mit 300 μl
N3 gestoppt. Das Lysat wurde für 10 min bei 16.000 g zentrifugiert und der klare
Überstand
in
ein
neues
Reaktionsgefäß
überführt.
Nach
Zugabe
von
1 ml
Phenol/Chloroform wurde alles durch ca. 80x Schwenken gut durchmischt. Nach
zweiminütiger Zentrifugation bei 16.000 g lagen die extrahierten Proteine in der
organischen Phase vor. Die wasserlöslichen Nukleinsäuren wurden durch Abnahme der
129
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
wässrigen Phase (abgeschnittene Pipettenspitzen) in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
Durch Zugabe von 650 μl 100%igem Isopropanol und anschließende Zentrifugation für
20 min bei 4°C und 16.000 g wurde die DNA ausgefällt. Das Präzipitat wurde in 1 ml 70%
eiskaltem Ethanol gewaschen und für 10 min bei 4°C und 16.000 g zentrifugiert. Das
Ethanol wurde vollständig entfernt, das Pellet für 10 min bei 37°C getrocknet und in 50 μl
EB-Puffer (10 μg/ml RNAse A) unter Schütteln bei 37°C für 10 min resuspendiert. Große
Mengen an BACmid-DNA wurden aus 200 ml Übernachtkultur mittels „Nucleobond
PC500 Kit“ (Macherey-Nagel) nach Herstellerangaben isoliert und anschließend über
Nacht in 100 μl EB-Puffer gelöst.
LB-Medium
1% (w/v) Bacto-Trypton
0,5% (w/v) Bacto-Hefeextrakt
1% (w/v) NaCl
Restriktionsverdau von DNA
Für den analytischen Restriktionsverdau wurde 0,25 μg und für den präparativen 1 μg
Plasmid-DNA verwendet und für 60 min nach Herstellerangaben geschnitten. Zur
analytischen und präparativen Restriktion von BACmid-DNA wurden 2,5-5 μg durch
entsprechende Restriktionsendonukleasen (hier XbaI) über Nacht nach Herstellerangaben
verdaut.
Herstellung chemokompetenter Bakterien
2 ml einer 5 ml LB-Übernachtkultur wurden als Inokolum für eine 200 ml LBFlüssigkultur verwendet, die bei einer Dichte (OD600) von 0,5 geerntet wurde. Die
Bakteriensuspension wurde auf Eis abgekühlt, bei 3.200 g für 10 min bei 4°C
abzentrifugiert und in einem Viertel des Bakterienkulturvolumens eiskaltem 0,1 M MgCl2
resuspendiert und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde im selben Volumen eiskaltem
0,1 M CaCl2 resuspendiert, für 20 min auf Eis inkubiert und wie beschrieben zentrifugiert.
130
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Das Bakterienpellet wurde in einem Hundertstel des Kulturvolumens eiskaltem 12% (v/v)
Glycerols in 0,1 M CaCl2 resuspendiert, in 50 μl Aliquots in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei -80°C gelagert. Die Effizienz der kompetenten Bakterien wurde
durch Transformation (siehe Transformation von Bakterien) von 50 ng Plasmid-DNA
bestimmt.
Herstellung elektrokompetenter Bakterien für die induzierte BACmid-Mutagenese
Die BACmid-Mutagenese durch homologe Rekombination wird über das Plasmid pKD46
gesteuert, das einen temperatursensitiven Replikationsursprung (funktional bei 30°C) und
eine durch Arabinose induzierbare Expression der Phagenrekombinase besitzt.
Zum Animpfen der 100 ml LB-Flüssigkultur wurden 1,5 ml einer bei 30°C gewachsenen
10 ml Übernachtkultur (Stamm DH10B, transformiert mit HCMV BACmid DNA und
pKD46) verwendet und auf 30°C bis zu einer optischen Dichte (OD600) von 0,1-0,15 weiter
inkubiert. Die Induktion der Rekombinase erfolgte durch Zugabe von 1 ml frisch
angesetzter 10%iger (w/v) Arabinose in H2O, bis eine OD600 von 0,25-0,3 binnen maximal
45 min erreicht wurde. Anschließend wurde die Bakterienkultur bei 3.200 g, 4°C für
10 min abzentrifugiert, in 100 ml eiskaltem 10% Glycerol resuspendiert und erneut wie
beschrieben zentrifugiert. Die Pellets wurden vereinigt und in 50 ml 10% Glycerol
resuspendiert. Nach abschließender Zentrifugation wurde das Pellet in 0,5-1 ml
10% Glycerol aufgenommen, in 50 μl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und
bei -80°C gelagert.
Transformation von Bakterien
Zur Transformation chemokompetenter Bakterien wurde ein Aliquot der Bakterien auf
Eis aufgetaut und nach Zugabe der DNA (ca. 50 ng) für 20 min auf Eis inkubiert. Nach
einem Hitzeschock für 90 sec bei 42°C wurden die Bakterien für 2 min auf Eis abgekühlt,
mit 1 ml auf 37°C vorgewärmten LB versetzt, für 30-60 min schüttelnd bei 37°C inkubiert
und auf einer LB-Agarplatte unter entsprechender Antibiotikaselektion ausplattiert und
über Nacht bei 37°C inkubiert.
131
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Für die Transformation elektrokompetenter Zellen bei der BACmid Mutagenese wurden
die Bakterien auf Eis mit 1-3 μl DNA versetzt und in eine Elektroporationsküvette
gegeben. Die Elektroporation erfolgte mit einem Puls von 5 ms bei 2.500 Volt, 25 μF und
200 Ω. Sofort nach der Transformation wurde die Bakteriensuspension in 1 ml
vorgewärmten LB (30°C oder 37°C) verdünnt und für 1 h bei 30°C (Plasmide mit
temperatursensitivem Replikationsursprung) oder 37°C inkubiert, danach auf LBAgarplatten in Anwesenheit des jeweiligen Selektionsmarkers ausplattiert und bei der
entsprechenden Temperatur über Nacht inkubiert.
LB-Agar
1,5% (w/v) Bacto-Agar in LB-Medium
Bakteriendauerkultur
Zur dauerhaften Lagerung wurden 0,5 ml einer Übernacht-Flüssigkultur 1:1 mit Glycerol
versetzt und nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff bei -80°C gelagert.
4.4.2 Zielgerichtete Mutagenese
Ein gewünschter Aminosäureaustausch durch die zielgerichtete Mutation von
Nukleotiden (nt) innerhalb des entsprechenden Codons wurde mittels des „QickChange II
XL
Site-Directed
Mutagenesis
Kit”
der
Firma
Stratagene
durchgeführt.
Die
Oligonukleotidlänge betrug 36 bp, wobei die Mutation von 1-2 nt in der Mitte lag. Die
Punktmutanten wurden nach Angaben des Herstellers generiert.
4.4.3 Southern Blot Analyse
Die DNA Analyse rekombinanter HCMV BACmide wurde mittels Southern Blot
Verfahren durchgeführt, bei der das restriktionsverdaute und nach Fragmentgröße
aufgetrennte Genom mit einer Sonde gegen das deletierte Gen bzw. gegen die inserierte
Antibiotikaresistenzkassette im Vergleich zum HCMV wt hybridisiert wurde. Als
Ausgangsmaterial diente durch einen Proteinase K Verdau extrahierte, aufgereinigte
132
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Virus DNA. 2-3 μg der DNA wurden mit einem entsprechenden Restriktionsenzym (XbaI
bzw. AseI) über Nacht geschnitten und auf einem 0,5%igen (w/v) Agarosegel (siehe 4.4.1,
Agarose-Gelelektrophorese) in 0,5x TBE-Laufpuffer der Größe nach bei 60 Volt über
Nacht aufgetrennt. Als Größenstandard diente ein 1 kb DNA Leiter der Firma Bioline.
Das Gel wurde auf dem Wiegeschüttler für 10-15 min in 250 mM HCl inkubiert (teilweise
Fragmentierung der DNA durch Depurinierung), die DNA für 2x 15 min denaturiert
(Trennung der DNA-Doppelhelix; Denaturierungslösung) und anschließend für 2x 15 min
neutralisiert (Neutralisierungslösung). Zwischen den einzelnen Schritten wurde das Gel
jeweils kurz mit H2O gewaschen. Der Transfer der DNA auf eine positiv geladene
Nylonmembran im Kapillartransferverfahren in 20x SSC Puffer erfolgte für mindestens
4 h nach Präequilibrierung der Membran für 1-2 min in H2O und 10-15 min in 20x SSC in
einer Turbo-Blot-Apparatur (Schleicher & Schuell) nach Angaben des Herstellers. Die
DNA wurde nach abgeschlossenem Transfer mit Hilfe eines UV-Crosslinkers bei
120.000 μJ kovalent an die Membran gebunden. Die Prähybridisierung der Membran
erfolgte mind. 1 h bei 42°C in der „Dig Easy Hyb“-Lösung der Firma Roche in
Hybridisierungsröhren.
Die Herstellung der DNA-Sonde erfolgte nach Herstellerangaben der Firma Roche durch
PCR
des
gewünschten
(Desoxyuraciltriphosphat)
Gens
im
mittels
Vergleich
Digoxigenin
zur
PCR
(DIG)-markierter
mit
unmarkierten
dUTPs
dNTPs
(Desoxyribonukleosidtriphosphat), was durch einen Größenunterschied aufgrund der
DIG-Markierung im Agarosegel sichtbar wurde. Die Sonde wurde aus dem Gel
aufgereinigt, mit 500 μl frischer Hybridisierungslösung versetzt, für 10 min bei 95°C
inkubiert und sofort auf Eis abgekühlt. Die Blot Membran wurde mit der DIG-markierten
Sonde in insgesamt 25 ml frisch angesetzter Hybridisierungslösung über Nacht bei 42°C
Blot hybridisiert.
Vor der Detektion wurde die Membran für 2x 5 min in Waschlösung I bei RT gespült und
anschließend 2x 15 min bei 68°C im Hybridisierungsofen mit Waschlösung II gewaschen,
bevor sie bei RT auf dem Wiegeschüttler kurz in Maleinsäurepuffer equilibriert wurde.
Unspezifische Bindungen wurden für 30 min bei RT auf dem Wiegeschüttler in BlockingPuffer (Blocking Reagenz, Roche) minimiert, bevor die Membran mit dem AP (alkalische
133
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Phosphatase)-gekoppelten anti-DIG-Antikörper in einer 1:20.000 Verdünnung in
Blocking-Puffer für 30 min bei RT auf dem Wiegeschüttler inkubiert wurde. Um
unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen, wurde die Membran dreimal für 10 min
bei RT mit Maleinsäurepuffer gewaschen dann 5 min in Substratverdünnungspuffer
equilibriert und schließlich für 5 min im Dunkeln in der Substratlösung (CDP-Star,
Roche) inkubiert. Das Signal der zwischen 2 Whatman®-Filterpapieren getrockneten
Membran wurde für 1 min bis über Nacht mittels eines Röntgenfilms detektiert.
Die Southern Blot Membran kann mehrmals nacheinander mit unterschiedlichen Sonden
hybridisiert werden. Dies erfordert allerdings zuerst das Entfernen der alten Sonde.
Hierfür wurde die Membran für 2x 15 min bei 42°C im Hybridisierungsofen in der
Stripping-Lösung inkubiert und anschließend 2x 15 min bei 42°C in 2x SSC equilibriert,
bevor sie erneut wie beschrieben prähybridisiert und mit der neuen Sonde hybridisiert
wurde.
Denaturierungslösung
Neutralisierungslösung
20x SSC
0,5 M NaOH
0,5 M Tris/HCl pH 7,5
3 M NaCl
1,5 M NaCl
3 M NaCl
0,3 M NaCitrat
Maleinsäurepuffer
Waschlösung I
Waschlösung II
1 M Maleinsäure pH 7,5
2x SSC
0,2x SSC
1,5 M NaCl
0,1% (w/v) SDS
0,1% (w/v) SDS
Waschlösung III
Blocking-Puffer
Substratlösung
0,3% (v/v) TWEEN 20 in 1% (w/v) Blocking Reagenz CDP-Star
Maleinsäurepuffer
in Maleinsäurepuffer
1:100
in
SubstratVerdünnungspuffer
134
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Substratverdünnungspuffer
Stripping-Lösung
0,1 M Tris/HCl pH 9,5
0,2 M NaOH
0,1 M NaCl
0,1% (w/v) SDS
4.4.4 Luziferase-Reportergenassay
Die Reportergenexperimente wurden unter Zuhilfenahme des „Luciferase Reporter Gene
Assay, high sensitivity” Kits der Firma Roche durchgeführt. Die Transfektion wurde wie
unter 4.2.4 beschrieben durchgeführt. Das Luziferase-Reportergenassay wurde auf 24Loch-Zellkulturplatten durchgeführt, wodurch die mittels LF2000 CD-transfizierten
Zellen von einer 10 cm2 Zellkulturschale auf eine 24-Lochplatte umgesetzt werden
mussten. Nach Absetzen und Adhärieren der Zellen auf der Zellkulturplatte, frühestens
aber nach 6 h, wurden die Zellen infiziert oder entsprechend kontrollbehandelt. Die
Luziferaseproduktion wurde nach 14-20 h gestoppt, indem die Zellen einmal vorsichtig
mit PBS gewaschen und anschließend 100 μl/Loch Luziferaselysepuffer zugegeben wurde.
Die Platten wurden sofort bei -70°C für nicht länger als 2 Wochen eingefroren. Zum
Messen der Luziferaseaktivität wurden die Zellkulturplatten zügig aufgetaut, 10 min unter
ständigem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert, die Zellen im Lysepuffer
resuspendiert, in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und bei 16.000 g für 3 min bei 4°C
zentrifugiert. 50 μl des geklärten Überstandes wurden in die Luziferasemessung
eingesetzt. Das Luminometer wurde so programmiert, dass zunächst 50 μl des
Luziferasesubstrates injiziert und nach einer Verzögerung von 1,6 sec die Lumineszenz
über eine Zeitspanne von 10 sec gemessen wurde. Jedes Experiment wurde in
Dreifachansätzen durchgeführt, aus denen die Standardabweichung berechnet wurde.
4.5
Proteinchemische Methoden
4.5.1 Immunpräzipitation von [35S]-Methionin/Cystein metabolisch markierten
Proteinen
Die Immunpräzipitation (IP) metabolisch markierter endogener oder überexprimierter
Proteine ermöglicht Studien zur Modifikation, Reifung und Halbwertszeitbestimmung
135
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
und außerdem zur Identifizierung potentieller Interaktionspartner. Die radioaktiv
markierten Proteine werden über Autoradiografie detektiert.
Pro Ansatz wurden im 6-Loch-Zellkulturplattenformat 1x 106 Zellen zweimal mit
warmen PBS/3% (v/v) FCS gewaschen und für 15 min in 1 ml Hungermedium (RPMI,
Methionin und Cystein frei, 5% (v/v) FCS) inkubiert. Nach Wechsel auf 0,7 ml
Hungermedium mit 150 μCi [35S]-Methionin/Cystein (Promix, GE Healthcare) erfolgte die
metabolische Proteinmarkierung 45-60 min bei 37°C, wenn nicht anders angegeben.
Anschließend wurden die Zellkulturplatten auf Eis gestellt, zweimal vorsichtig mit
eiskaltem PBS gewaschen und in 1 ml IP-Lysepuffer pro Loch für 20-30 min lysiert. Um
die Neubildung von Oligomeren durch den Einsatz alkylierender Reagenzien zu
verhindern, wurde der Lysepuffer wenn angegeben entweder mit 20 mM Jodacetamid
(IAA) oder 10 mM N-Ethylmaleimid (NEM) versetzt. Die Zellen wurden anschließend
resuspendiert, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und Zellreste bei 16.000 g, für
30 min bei 4 °C abzentrifugiert. Der geklärte Überstand wurde in ein neues
Reaktionsgefäß überführt und nach Zugabe von 0,5-2 μg Antikörper für 1 h bei 4°C
rotierend inkubiert. Protein A- oder G-Sepharose (PAS, PGS) wurde einmal in
Waschpuffer B gewaschen und 1:2 in diesem verdünnt. Entsprechend ihrer
unterschiedlichen
Bindeeigenschaften
wurde
für
humane
Antikörper
und
Kaninchenantikörper PAS, für Mausantikörper PGS verwendet (siehe Tab. 4.4).
Tab. 4.4: Relative Bindungsstärke von Protein A und Protein G. (-: keine Bindung; ++++: starke Bindung)
Spezies
Subklasse
Protein A
Protein G
Human
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
Maus
IgG1
IgG2a
IgG2b
IgG3
+
++++
+++
++
++++
++++
+++
+++
Kaninchen
IgG
++++
+++
Ziege
-
++
Rind
++
++++
136
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Jeweils
30-40 μl
des
Puffer-Sepharose-Gemisches
wurden
mit
abgeschnittenen
Pipettenspitzen in das Reaktionsgefäß gegeben und für weitere 45-60 min bei 4°C
rotierend inkubiert. Die Immunkomplexe wurden dreimal mit Waschpuffer B, zweimal
mit Waschpuffer C und einmal mit Waschpuffer D gewaschen, dazu wurden sie jeweils
durch Vortexen gemischt, für 20 sec bei 16.000 g und 4°C abzentrifugiert und der
Überstand abgesaugt. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde das Sepharosepellet
vollständig trocken gesaugt, in 40 μl 1x IP-Probenpuffer aufgenommen, kurz durch
Vortexen gemischt, 5 min bei 95°C inkubiert und anschließend kurz auf Eis abgekühlt,
bevor 8 μl 0,5 M IAA zugegeben wurden. Unter nicht-reduzierenden Konditionen wurde
der
IP-Probenpuffer
ohne
Zusatz
des
Reduktionsmittels
DTT
und
der
Alkylierungsreagenz IAA verwendet. Zum Schluss wurden die Proben für 5 min bei
16.000 g und 4°C zentrifugiert und der komplette Überstand wurde auf ein SDSPolyacrylamidgel oder einem Gradienten-SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. In dieser
Arbeit wurde der lineare Gelgradient zwischen 10-13% bzw. zwischen 11,5-15% gewählt
und mit Hilfe eines Gradientengelmischers hergestellt. Das höherprozentige Trenngel
wurde dafür mit 15% (w/v) Saccharose versetzt. Als Größenstandard diente ein [14C]markierter Proteinmarker (GE Healthcare).
4x IP-Probenpuffer
IP-Lysepuffer
250 mM Tris/HCl (pH 6,8)
140 mM NaCl
20 mM EDTA
5 mM MgCl2
8% (w/v) SDS
20 mM Tris/HCl (pH 7,6)
60% (w/v) Saccharose
1% (v/v) Nonidet P-40
Bromphenolblau
Vor Gebrauch wurde 1 ml IP-Probenpuffer Vor
mit
200 μl
20%
(w/v)
Gebrauch
wurden
die
SDS Proteaseinhibitoren (1 mM PMSF, 10 μM
(Endkonzentration 11,2%) und 50 μl 2 M Leupeptin, 1 μM Pepstatin A) frisch
DTT (Endkonzentration 80 mM) versetzt.
zugegeben.
137
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Waschpuffer B
Waschpuffer C
150 mM NaCl
500 mM NaCl
10 mM Tris/HCl (pH 7,6)
10 mM Tris/HCl (pH 7,6)
2 mM EDTA
2 mM EDTA
0,2% (v/v) Nonidet P-40
0,2% (v/v) Nonidet P-40
Waschpuffer D
1x IP-Probenpuffer
10 mM Tris/HCl (pH 8,0)
80 mM Tris/HCl (pH 6,8)
5 mM EDTA
34% (w/v) Saccharose
Bromphenolblau
Gradienten-Trenngel
Gradienten-Sammelgel
10-15% Acrylamid/Bisacrylamid
5% Acrylamid/Bisacrylamid
420 mM Tris/HCl pH 8,8
67 mM Tris/HCl pH 6,5
(15% (w/v) Saccharose)
14% (w/v) Saccharose
0,1% (w/v) SDS
0,1% (w/v) SDS
0,05% TEMED
0,045% TEMED
3% (w/v) APS
6% (w/v) APS
5x IP-Gellaufpuffer
IP-Gel-Fixierungslösung
250 mM Tris Base
40% (v/v) Methanol
2 M Glycin
10% (v/v) Essigsäure (96%)
20% (w/v) SDS wurde zum 1x IPLaufpuffer mit einer Endkonzentration von
0,1% hinzugefügt.
138
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
4.5.2 Immunpräzipitation
Die optimale Menge an eingesetzten Zellen ist abhängig von der Expressionsstärke des
jeweiligen Proteins und muss für unterschiedliche Experimentalansätze jedes Mal neu
ermittelt werden. Für die in dieser Arbeit durchgeführten IPs mit rVACV infizierten
Zellen wurden 1-2x 106 Zellen pro Ansatz verwendet. Die Zellen wurden mechanisch
abgelöst und zweimal in eiskaltem PBS gewaschen, in 600 μl IP-Lysepuffer resuspendiert
und 30 min auf Eis in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß lysiert. Nach 30 minütiger
Zentrifugation bei 16.000 g bei 4°C wurden die geklärten Überstände 2 h oder über Nacht
mit 0,5-2 μg spezifischen Antikörpern unter Rotieren bei 4°C inkubiert. Zur Kontrolle der
Proteinexpression wurde 1/10 des geklärten Lysates vor Antikörperzugabe abgenommen,
mit 5x Probenpuffer versetzt und bei -20°C eingefroren. Anschließend wurden die
Immunkomplexe präzipitiert und gewaschen, wie unter 4.5.1 beschrieben. Nach Zugabe
von 20 μl 2x WB-Probenpuffer (siehe 4.5.3) zu den Sepharosepellets wurden diese 5 min
bei 95°C inkubiert und 1 min bei 16.000 g zentrifugiert. Unter nicht-reduzierenden
Bedingungen wurde Probenpuffer ohne das Reduktionsmittel β-Mercaptoethanol
verwendet. Präzipitierte Proteine wurden über Western Blot nachgewiesen.
4.5.3 Gesamtzell-Proteinlysate
Für Western Blot Analysen wurden 1x 106 Zellen mechanisch abgelöst, in ein 1,5 ml
Reaktionsgefäß überführt und zweimal in eiskaltem PBS unter Zentrifugation bei 800 g
für 3 min bei 4°C gewaschen. Das Zellpellet wurde in 75 μl IP-Lysepuffer resuspendiert
und nach 30 minütiger Zelllyse auf Eis und mehrmaligem Schwenken des
Reaktionsgefäßes für 30 min bei 16.000 g und 4°C zentrifugiert, um Zellreste
abzutrennen. Der geklärte Überstand wurde mit 5x WB-Probenpuffer versetzt und bei 20°C gelagert, oder für 5 min bei 95°C inkubiert, auf Eis abgekühlt und über SDS-PAGE
aufgetrennt.
139
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
5x WB-Probenpuffer
0,5 M Tris/HCl (pH 6,8)
25% (v/v) Glycerol
2% (w/v) SDS
2% (v/v) β-Mercaptoethanol
Bromphenolblau
4.5.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die diskontinuierliche Proteinauftrennung bezüglich ihrer Größe erfolgte entsprechend
der Methode von Lämmli (Laemmli, 1970). Je nach gewünschter Separationsstrecke
wurden Minigel-Twin-System Apparaturen der Firma Biometra und Maxigel Apparaturen
der Firma Roth verwendet. Entsprechend der jeweiligen Fragestellung wurden die
Proteine in Gelen unterschiedlicher Acrylamidprozentigkeit aufgetrennt (Tab. 4.5). Bei
Verwendung der Maxigel Apparatur wurden die anzusetzenden Volumina pro Trenngel
verdreifacht und pro Sammelgel verdoppelt. Die Elektrophorese erfolgte bei 20 mA pro
Minigel für 1,5 h und bei 35 mA pro Maxigel für 4-5 h oder bei 10 mA und 4°C über
Nacht. Die Proben wurden vor dem Auftragen auf das Gel 5 min bei 95°C in Probenpuffer
inkubiert. Als Größenstandard wurde ein „Kaleidoscope” Molekulargewichtstandard der
Firma BioRad verwendet.
Tab. 4.5: Zusammensetzung der SDS-Gele
Lösungen
30 % Acrylamid/Bis
8%
3,2 ml
2 M Tris/HCl pH 8,8
Trenngel
10 %
4,0 ml
12 %
4,8 ml
Sammelgel
5%
1,5 ml
2,5 ml
0,5 M Tris/HCl pH 6,8
1,2 ml
60 % Saccharose
2,1 ml
20 % SDS
H 2O
45 µl
60 µl
6,1 ml
5,3 ml
4,5 ml
4,2 ml
TEMED
24 µl
12 µl
10 % APS
144 µl
120 µl
140
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
10x Gellaufpuffer (Laemmli)
252 mM Tris Base
1,92 M Glycin
1% (w/v) SDS
4.5.5 Western Blot
Der
Transfer
der
nach
ihrer
Größe
aufgetrennten
Proteine
auf
eine
Nitrozellulosemembran erfolgte mittels Semidry Blotverfahren. Die dafür verwendete
Membran und die Whatman®-Filterpapiere wurden auf Gelgröße zurechtgeschnitten
und in Semidry-Blotting Puffer equilibriert, bis sie gänzlich mit Puffer vollgesogen waren.
Die Semidry Transferapparatur wurde von Anode nach Katode folgendermaßen
aufgebaut: 3 Whatman®-Filterpapiere, Nitrozellulosemembran, SDS-Gel, 3 Whatman®Filterpapiere. Etwaige Luftblasen zwischen den Schichten und überschüssiger SemidryBlotting Puffer wurden von der Apparatur entfernt. Der Proteintransfer erfolgte je nach
Gelgröße bei 14-16 Volt für 1 – 1,5 h. Durch anschließende reversible Ponceau S Färbung
für 10-60 sec der Proteine auf der Membran wurde der gleichmäßige Transfer überprüft.
Danach wurde die Membran durch Spülen in H2O und 1x TBST wieder entfärbt und freie
Proteinbindestellen durch Inkubation für 1 h bei RT in 5% (w/v) Magermilchpuler in 1x
TBST abgesättigt. Die Inkubation des primären Antikörpers in 0,5 % (w/v)
Magermilchpulver in 1x TBST erfolgte für 1 h bei RT oder über Nacht bei 4°C unter
ständigem Schwenken. Nach zweimaligem kurzen Spülen in H2O wurde die Membran für
eine Stunde mit dem sekundären speziesspezifischen Meerrettichperoxidase (POD)
gekoppelten Antikörper in 1x TBST bei RT inkubiert. Anschließend wurde die Membran
zweimal kurz mit H2O gespült, zweimal 5 min in 1x TBST inkubiert und abschließend
fünfmal kurz mit H2O gespült. Nach Trocknen der Membran zwischen zwei Whatman®Filterpapieren wurde diese unter Verwendung des „ECL Plus Western Blotting Detection
Systems“ für 5 min inkubiert und die entstehende Chemilumineszenz durch Auflegen
eines lichtsensitiven Films detektiert.
141
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
10x Semidry-Blotpuffer
10x TBST
480 mM Tris Base
0,1 M Tris/HCl (pH 8,0)
280 mM Glycin
1,5 M NaCl
20% (v/v) Methanol
5% (v/v) Tween 20
4.5.6 Aufreinigung monoklonaler Antikörper mittels Affinitätschromatographie
Die Aufreinigung von humanen und murinen Antikörpern erfolgte mittels Fast Protein
Liquid Chromatography (FPLC) an einem Äkta™ Basic System über eine spezifische und
reversible Rezeptor-Liganden-Interaktion. Der Antikörper (Ligand) wird über seinen FcTeil an das Säulenmatrixgekoppelte Fc-bindende Protein (Rezeptor) von Streptococcus
spec. (Protein G) gebunden (Protein G-Sepharose-Säule, 5 ml Säulenvolumen). Ein Vorteil
dieses konstant gekühlten Systems ist eine Echtzeitmessung der Proteinkonzentration
über die Lichtabsorbtion bei 280 nm während des gesamten Laufes, da alle aromatischen
Aminosäuren hier ihr Absorptionsmaximum besitzen. Die verwendeten Lösungen und
Puffer
wurden
vor
Benutzung
sterilfiltriert
(Filterporengröße
0,45
μm)
und
gegebenenfalls abzentrifugiert, um eventuell ungelöste Bestandteile zu entfernen. Der
Überstand Antikörper-produzierender Hybridomazellen wurde für 30 min bei 3.200 g
und 4°C zentrifugiert, um Zellreste und Präzipitate abzutrennen. Daran anschließend
erfolgte eine Filtration durch einen mit PBS equilibrierten 0,45 μm Filter. Präzipitate
humaner Seren wurden durch Zentrifugation für 30 min bei 16.000 g und 4°C entfernt.
Die Antikörperaufreinigung wurde wie in Tab. 4.6 beschrieben durchgeführt. Die
Verbindungsschläuche der FPLC und die PGS-Säule wurden zuerst mit H2O und
anschließend mit dem Bindepuffer PBS gespült und equilibriert. Die Antikörperlösung
wurde in eine 10 ml oder 50 ml Ladeschlaufe (superloop) eingefüllt und mit dem
Bindepuffer unter konstantem Druck (≤ 0,31 MPa) und einer Flussrate von 1-2 ml/min
durch die PGS-Säule geführt. Die Bindung des IgG-Fc Teils durch Protein G ist säurelabil.
Der komplexierte Antikörper wurde mittels Elutionspuffer eluiert, sofort 1:2 mit PBS
verdünnt und durch tropfenweise Zugabe des Neutralisationspuffers auf einen neutralen
pH-Wert umgepuffert, der durch pH-Indikatorstreifen bestimmt wurde. Die PGS-
142
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Säulenregeneration erfolgte durch Equilibrierung in H2O und anschließender Lagerung in
20% Ethanol bei 4°C.
Tab. 4.6: FPLC-Reinigungsprofil von Antikörpern durch Protein G-Sepharose
Regeneration
Elution
Adsorption
Waschen
Programm
Puffer
pump wash basic
Schläuche (5 ml/min)
PGS-Säule (1-2 ml/min)
Probeninjektion
1 x H2O bidest.
1 x PBS
PBS
Spülen (5 Säulenvolumen)
pump wash basic
0,1 M Glycin
Elution (5-7 Säulenvolumen)
(pH 2,7)
pump wash basic
1 x H2O bidest.
Spülen (5-7 Säulenvolumen)
1 x 20% Ethanol
Elutionspuffer
Neutralisationspuffer
0,1 M Glycin (pH 2,7)
1 M Tris/HCl (pH 9,0)
4.5.7 Kovalente Kopplung von Antikörpern an Cyanbromid-aktivierte Sepharose (CNBrSepharose)
Um die Verwendung von bakteriellen Fcγ-Rezeptoren für Immunpräzipitationen zu
vermeiden, wurden Antikörper direkt an eine Cyanbromid-aktivierte Sepharosematrix
der Firma GE Healthcare fixiert. Diese Art der Kopplung ist unspezifisch und erfolgt
kovalent über die NH2-Gruppen der Aminosäuren eines Proteins. Um einen möglichst
hohen Anteil an funktional gekoppelten Antikörpern zu erhalten, wurde mindestens 1 mg
143
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Antikörper pro ml Sepharose eingesetzt. Die Kopplung erfolgte nach Herstellerangaben.
Die in Immunpräzipitationen einzusetzende Menge an Antikörper-CNBr-Sepharose
musste nach der Kopplung experimentell ermittelt werden.
4.5.8 Deglykosylierung von Proteinen mittels Endoglykosidase H (Endo H) und Peptid
N-Glykosydase F (PNGase F)
Die Glykosylierung von Proteinen ist ein stufenweiser Prozess, der mit dem Eintritt der
Proteine im Endoplasmatischen Retikulum (ER) beginnt und im trans-Golgi-Netzwerk
endet. Man unterscheidet zwischen N- und O-Glykosylierung, wobei N-glykosidische
Bindungen am Asparagin bereits im ER beginnen und durch die Enzyme Endoglykosidase
H (Endo H) und Peptid-N-Glykosydase F (PNGase F) entfernt werden können. Endo H
spaltet keine komplexen Oligosaccharidstrukturen, sondern spezifisch zwischen NAcetylglukosaminresten der Diacetylchitobiose. Demnach sind nur Glykoproteine Endo
H sensitiv, wenn sie das ER passiert haben, sich aber noch im cis-Golgi-Netzwerk
befinden. Mit dem Eintritt der Proteine in das trans-Golgi-Netzwerk und ihrer vollen
Reifung wird die Glykosylierung durch komplexe Zuckerreste vervollständigt. Die
Glykoproteine sind jetzt Endo H resistent, bleiben aber PNGase F sensitiv, denn dieses
Enzym spaltet direkt am Peptid-gebundenen Asparagin. Die Endo H Sensitivität kann als
Reifungsindikator von Glykoproteinen verwendet werden.
Zur Deglykosylierung von Immunkomplexen wurde das trockene Sepharosepellet mit
30 μl 1x Endo H Puffer oder 1x PNGase F Puffer versetzt, kurz durch Vortexen gemischt
und für 5 min bei 95°C inkubiert. Nach kurzem Abkühlen auf Eis wurden 6 μl 1 M βMercaptoethanol und 5 mU Endo H oder PNGase F hinzu gegeben. Die enzymatische
Abspaltung von Zuckerresten wurde für mindestens 4 h oder über Nacht bei 37°C
durchgeführt. Danach wurden die Proben mit 14 μl 4x IP-Probenpuffer versetzt, 5 min
bei 95°C inkubiert, auf Eis abgekühlt, mit 8 μl 0,5 M IAA versetzt und für 5 min bei
16.000 g und 4°C zentrifugiert, bevor sie auf ein SDS-Gel geladen wurden.
Um 20 μg humanes Fc-Fragment (1 mg/ml) mittels Endo H oder PNGase F zu
deglykosylieren, wurden pro Ansatz 25 mU Enzym und 25 μl des jeweiligen Puffers
verwendet und wie oben beschrieben behandelt. Der Reaktionsansatz wurde über Nacht
144
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
bei 37°C inkubiert. Als Kontrolle diente derselbe Ansatz ohne Zugabe von Enzym. Zum
Schluss wurden die Proben über Nacht gegen PBS dialysiert und in einer
Endkonzentration von 1 μg in der IP eingesetzt.
5x Endo H-Puffer
5x PNGase F Puffer
250 mM Na-Phosphat (pH 5,0)
250 mM Na-Phosphat (pH 6,5)
100 mM EDTA
50 mM EDTA
0,1% (w/v) SDS
1% (w/v) SDS
1% (v/v) Nonidet P-40
Nach der Inkubation der Proben bei 95°C wurde 0,2% (v/v) β-Mercaptoethanol
zugegeben.
4.5.9 Inhibierung der Glykosylierung von Proteinen mittels Tunicamycin
Der erste Schritt der N-Glykosylierung von Proteinen kann durch Inkubation der Zellen
mit Tunicamycin gehemmt werden. Tunicamycin ist ein Nukleosid-Antibiotikum und
blockt die initiale Transferase in der Glykosylierungskette und damit die Anheftung des
ersten Zuckerrestes an das Protein. Um die Funktionalität deglykosylierter Proteine zu
untersuchen, wurde die Verzuckerung während der metabolischen Markierung gehemmt.
Hierfür wurden die Zellen im Zuge der Immunpräzipitation sowohl im Hungermedium,
als auch während der Markierung jeweils mit 5 μg Tunicamycin (in DMSO gelöst)
inkubiert. Als Kontrolle diente das gleiche Volumen DMSO ohne Enzym. Die Proteine
wurden schließlich wie unter 4.5.1 beschrieben immunpräzipitiert.
4.5.10 IgG Depletion aus humanem Serum als Komplementquelle mittels
Affinitätschromatographie
Komplementbestandteile
sind
lösliche
Serumkomponenten
des
Blutes,
die
in
Zusammenwirkung eine Kaskade initiieren, die in Anwesenheit von Antikörpern zur
Lyse einer Zelle oder eines Virus führen können. Als Komplementquelle für
Neutralisationsanalysen wurde humanes Serum IgG depletiert.
145
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Serum aus frischem, humanem, HCMV und HSV-1 negativem Vollblut wurde nach
zweistündiger Inkubation bei 4°C durch Zentrifugation für 10 min bei 3.200 g auf 4°C in
Serumröhrchen der Firma BD gewonnen. Das Serum wurde in 1,5 ml Reaktionsgefäße
überführt und für 30 min bei 16.000 g, 4°C zentrifugiert, um weitere Präzipitate zu
entfernen. Die IgG-Depletion erfolgte mittels 5 ml PGS-Säule von GE Healthcare an
einem FPLC-System (siehe 4.5.6). Die Berechnung des eingesetzten Serumvolumens
erfolgte anhand der IgG Bindungskapazität der Säule, die mit 25 mg humanem IgG/ml
Säulenmedium beschrieben ist. Bei etwa 13,5 mg/ml IgG im Humanserum wurden nie
mehr als 8 ml Serum über die Säule gegeben. Als Bindepuffer diente PBS. Der
Säulendurchfluss wurde aufgefangen, aliquotiert, sofort bei -80°C eingefroren und bis zu 6
Monate gelagert. Die Säulenregeneration nach saurer IgG-Elution erfolgte wie in 4.5.6
beschrieben.
4.5.11 Herstellung von Fab2-Fragmenten aus IgG durch Pepsinspaltung
Pepsin ist eine Peptidase, die IgG spezifisch in Fab2-Fragmente mit intakter
Antigenbindeaktivität spaltet, wohingegen der IgG-Fc-Teil in kleine Polypeptide
gespalten wird. Das pH-Optimum des Enzyms liegt im extrem sauren Bereich (pH 1-2), da
es sich um ein Verdauungsenzym von Wirbeltieren handelt. Um den Antikörper bei der
Reaktion nicht dauerhaft durch den niedrigen pH-Wert zu schädigen, wurde die Reaktion
bei pH 4,0 durchgeführt. Zuerst musste die Antikörperpräparation gegen den
Reaktionspuffer bei 4°C mindestens 4 h wie beschrieben dialysiert werden. Die
Antikörperkonzentration wurde mit Reaktionspuffer auf 2 mg/ml eingestellt und im
Verhältnis von 1:1 mit 0,1 mg/ml Pepsin in Reaktionspuffer über Nacht bei 37°C
inkubiert. Das Enzym wurde durch Zugabe von 1M Tris/HCl (pH 9,0) zu einer
Endkonzentration von 166 mM inhibiert. Als Kontrolle diente derselbe Ansatz ohne
Enzym. Der Ansatz wurde über Nacht bei 4°C gegen PBS dialysiert und über Amicon
Größenausschlussfilter (Größenausschluss von 10 kDa) auf das gewünschte Volumen
reduziert (siehe 4.5.13). Die Effizienz und Güte der Proteolyse wurde nach Auftrennung
in einer 8%igen SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen durch Silberfärbung
146
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
(siehe 4.5.16) überprüft. Ungespaltenes IgG hat ein Molekulargewicht von ca. 150 kDa,
wohingegen Fab2-Fragmente eine Größe von 100 kDa haben.
Pepsin-Reaktionspuffer
0,2 M Na-Phosphat (pH 4,5)
4.5.12 Pufferaustausch durch Dialyse
Die durch Affinitätschromatographie aufgereinigten Antikörper wurden mittels Dialyse
umgepuffert. Ein Dialysierschlauch mit einem Größenausschluss von 6-8 kDa wurde vor
Gebrauch in H2O gewässert, in 1 mM EDTA für 10 min gekocht, abgekühlt und in H2O
auf 4°C gelagert. Der Schlauch wird dadurch weich und eventuell vorkommende
Proteasen werden zerstört. Die Probe wurde in einem mindestens 100fachen
Volumenüberschuss an Dialysepuffer, unter ständigem Rühren bei 4°C dialysiert. Für
einen vollständigen Ionenaustausch muss der Dialysepuffer mindestens einmal gewechselt
werden, frühestens aber 2-3 h nach Beginn der Dialyse.
4.5.13 Konzentration von Antikörpern
Affinitätschromatographisch aufgereinigte Antikörper wurden mittels eines Amicon
Größenausschlussfilters konzentriert. Die Porengröße des Filters muss fünfmal kleiner
sein als das aufzukonzentrierende Protein. Antikörper haben ein Molekulargewicht von
ca. 150 kDa, daher wurden Filter mit einem Größenausschluss von 30 kDa verwendet.
Zuerst wurde der Filter mit PBS equilibriert und gewaschen, um eine direkte Bindung der
Antikörper an die Filtermembran zu minimieren. Das Dialysepuffer-Antikörpergemisch
wurde auf den Filter gegeben und bei 4°C und 3.200 g in einem Ausschwingrotor
zentrifugiert. Die Flüssigkeit darf nicht vollständig durch die Filtermembran zentrifugiert
werden, da sonst die Antikörper nur sehr schwer wieder vom Filter zu lösen sind. Das
Gemisch wird so auf das gewünschte Volumen verringert und die Konzentration
anschließend bei 280 nm vermessen, wobei 1 OD bei einer Wellenlänge von 280 nm einer
IgG-Konzentration von ca. 0,7 mg/ml entspricht (Harlow & Lane, 1988). Als
147
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Referenzlösung diente PBS. Wenn der Antikörper in steriler Form benötigt wurde,
erfolgte anschließend eine UV-Bestrahlung bei 254 nm für 20 min.
4.5.14 Proteinase K protection assay
Die Anwesenheit viraler Proteine als Bestandteil des Virions wurde in einem so
genannten proteinase K protection assay identifiziert. Grundvoraussetzung ist die
Herstellung eines gereinigten Virusstocks, der keine zellulären Proteine mehr enthält. Das
Assay beruht auf der Inkubation von Virionen mit dem Enzym Proteinase K. Als Folge
werden nur die viralen Proteine, die Bestandteil der Virushülle und somit der Proteinase
K in Teilen zugänglich sind, enzymatisch gespalten. Durch Zugabe des Detergenz SDS
zum Enzym wird die Virionhülle zerstört und alle viralen Proteine, die Bestandteil des
Virions sind, werden gespalten. Der resultierende Größenverlust kann mittels spezifischer
Antikörper im Western Blot nachgewiesen werden. Es wurden 1x 106 pfu/ml gereinigte
Virionen entweder mit 0,1 mg/ml Proteinase K allein (Proteine der Virionhülle) oder in
Kombination mit 1% (w/v) SDS in PBS (Gesamtheit der Virusproteine) für 15 min auf
56°C inkubiert. Zur Kontrolle der spezifischen Proteinase K-Aktivität wurden die Viren
in 1% (w/v) SDS oder komplett ohne Detergenz und Enzym für die gleiche Zeit
behandelt. Die enzymatische Reaktion wurde durch die Zugabe von 2 mM
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, in Isopropanol gelöst) für 10 min bei 90°C gestoppt.
Die Proben wurden nach Zugabe von WB-Probenpuffer (Endkonzentration 1x) bei -20°C
gelagert. Als Kontrolle zellulär und viral exprimierter Proteine wurden Gesamtzelllysate
von MRC-5 Zellen, die für 72 h mit einer MOI von 2 infiziert wurden, nach
Standardprotokoll hergestellt.
4.5.15 Proteinquantifizierung
Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des „BCA Protein Assay“ Kits (Pierce) nach
Herstellerangaben durchgeführt. Zur Erstellung einer Eichkurve wurden 2 mg/ml bovines
Serumalbumin (BSA; Pierce) in PBS verdünnt und Konzentrationen von 100, 20, 10, 2, 1,
0,2 μg/ml in BCA-Reagenz vermessen. Als Referenz diente reines BCA-Reagenz. Das zu
quantifizierende Protein wurde vor der Messung 1:10 in PBS verdünnt und mit den
148
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯MATERIAL UND METHODEN⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
verschiedenen BSA-Konzentrationen der Eichkurve und der Referenz bei 60°C für 30 min
inkubiert. Anschließend wurde sofort die optische Dichte (OD) bei 562 nm gemessen.
4.5.16 Silberfärbung von Proteingelen
Geringe Mengen an Proteinen (≥50 ng) können nach der SDS-PAGE durch eine
Silberfärbung des Gels nachgewiesen werden.
Als Stammlösungen wurden 37% Formaldehyd, 2% (w/v) Na2S2O3 und 50% (v/v) Ethanol
verwendet. Alle anderen Komponenten wurden jeweils frisch angesetzt. Zuerst wurde das
Gel für 20 min in 25 ml Fixierer/12,5 μl Formaldehyd fixiert und anschließend für dreimal
5-10 min in 50% Ethanol gewaschen, bevor es für 1 min in Lösung A inkubiert wurde.
Nach dreimaligem kurzen Waschen in H2O (jeweils ca. 20 sec) wurde das Gel für 1015 min in Lösung B inkubiert und dann zweimal kurz in H2O gewaschen. Die
Silberfärbung der Proteinbanden im Gel wurde in Lösung C nach Sicht entwickelt. Bei
gewünschter Färbungsintensität wurde die Reaktion durch zweimaliges kurzes Waschen
in H2O und durch Inkubation im Fixierer gestoppt.
Fixierlösung
Lösung A
50% (v/v) Methanol
25 ml H2O
12% (v/v) Essigsäure (96%)
25 μl Na2S2O3 (2%)
Lösung B
Lösung C
25 ml H2O
25 ml H2O
18 μl Formaldehyd (37%)
10 μl Formaldehyd (37%)
40 mg AgNO3
6,25 μl Na2S2O3 (2%)
1 g Na2CO3
Während der gesamten Färbeprozedur wurde das Gel auf einem Wiegeschüttler
vorsichtig geschwenkt. Bei der Verwendung von SDS-Midi- oder Maxigelen wurden die
jeweiligen Inkubationszeiten verdoppelt bzw. verdreifacht.
149
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⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ANHANG⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
ANHANG
Beiträge und Konferenzen
Reinhard
H.,
Human
Atalay
R.,
cytomegalovirus
Zimmermann
(HCMV)
A.,
Fc-receptors
Messerle
interfere
M.
with
&
Hengel
neutralizing
H.
antibodies
Society for Virology, Study group „Immunobiology of Viral Infections“, 2. Workshop 2003, Schloss
Zeilitzheim
Reinhard H., Lee, M.-H., Corrales-Aguilar E., Atalay R. Budt M., Zimmermann A. & Hengel H.
Structure – function relationship of cytomegaloviral FcγRs: A single Ig-like domain is sufficient for
IgG-binding
Society for Virology, Study group „Immunobiology of Viral Infections“, 4. Workshop 2004, Schloss
Zeilitzheim
Reinhard
H.,
Novel
Zimmermann
structural
A.,
Corrales-Aguilar
features
of
the
E.,
Atalay
R.
HCMV-encoded
&
Hengel
Fcγ-receptor
H.
gp34
Society for Virology, Study group „Immunobiology of Viral Infections“, 5. Workshop 2005, Schloss
Zeilitzheim
Reinhard H., Zimmermann A., Corrales-Aguilar E., Atalay R., Ohlin M., Johnson D.C. & Hengel H.
Probing
herpesviral
Fcγ-receptors
for
interference
with
neutralizing
antibodies
Society for Virology, Study group „Immunobiology of Viral Infections“, 6. Workshop 2006, Schloss
Zeilitzheim
Reinhard H., Zimmermann A., Corrales-Aguilar E., Atalay R., Ohlin M., Johnson D.C. & Hengel H.
Probing
herpesviral
Fcγ-receptors
for
interference
with
neutralizing
antibodies
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, 2006, München
Reinhard H., Zimmermann A., Corrales-Aguilar E., Atalay R., Ohlin M., Johnson D.C. & Hengel H.
Probing
herpesviral
Fcγ-receptors
for
interference
with
neutralizing
antibodies
31st Annual International Herpesvirus Workshop, 2006, Seattle
Reinhard
H.,
Sprague
Unravelling
the
E.R.,
structure
Zimmermann
fubction
A.,
relationship
Bjorkman
of
the
P.J.
&
HCMV-encoded
Hengel
H.
Fcγ-receptors
Third European Congress of Virology, 2007, Nürnberg
Publikationen
Sprague E.R., Reinhard H., Cheung E.J., Farley A.H., Trujillo R.D., Hengel H. & Bjorkman P.J. (2008). The
human cytomegalovirus Fc receptor gp68 binds the Fc CH2-CH3 interface of IgG. J Virol 82, 349099.
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Halenius A., Momburg F., Reinhard H., Bauer D. Lobigs M. & Hengel H. (2006). Physical and functional
interactions of the cytomegalovirus US6 glycoprotein with the transporter associated with antigen
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Budt M., Reinhard H., Bigl A. & Hengel H. (2004). Herpesviral Fcgamma receptors: culprits attenuating
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Reinhard H., Trilling M., Le V.T.L.K. & Hengel H. (2009). A simple luciferase based assay allows
quantitative assessment of herpesvirus entry and neutralization in adherent and non-adherent cells.
Manuskript in Vorbereitung zum Einreichen im Journal of Virological Methods.
Reinhard H., Corrales-Aguilar E., Zimmermann A., Ohlin M., Johnson D.C. & Hengel H. (2009). Probing
herpesviral Fcg Receptors for interference with neutralizing antibodies. Manuskript in
Vorbereitung zum Einreichen im Journal of Virology.
166
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LEBENSLAUF
Der Lebenslauf wird im Internet nicht mitveröffentlicht.
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DANKSAGUNG
Mein ganz besonderes Dankeschön geht an
Prof. Richard Lucius für die Bereitschaft und die unkomplizierte Art in der Betreuung
meiner Doktorarbeit von Seiten der Humboldt-Universität Berlin.
Prof. Hartmut Hengel für das Überlassen meines liebsten Forschungsthemas – Antikörper
und Fcγ-Rezeptoren – und das Vertrauen in mich, genau dort richtig aufgehoben zu sein!
Deine
tägliche
Begeisterungsfähigkeit
und
Diskussionsfreude
für
Wissenschaft,
Spekulationen und offene Fragen zu jedweder Tageszeit hat mich immer wieder
vorangetrieben. Dein anderer Blick auf die verschiedensten Dinge des Lebens war
mindestens immer Anstoß zum Nachdenken.
Albert – für die gemeinsamen Jahre des Klonierens, Diskutierens und des gegenseitigen
Anstachelns.
Anne! Für Deine Freundschaft, das Großwerden-lassen im Labor, die Chaos-Geschichten
und die gemeinsamen, vertrauten Seilschaften am Ende eines Labortages, die
schlussendlich immer in einem gemütlichen Bierchen endeten.
Eugi! Den aufrichtigsten kleinen Fc-Rezeptor vom anderen Ende der Welt, mit dem ich 6
Jahre durch Dick und Dünn gegangen bin. Mit Dir würde ich immer wieder benches,
Betten, Bierchens, Bäder und BW-Assays teilen! Du bist meine Basis westlich des
Meridians!
Manuel – für einen gemeinsamen Weg bis fast zum Schluss, die gemeinsam entdeckte
Liebe zum Klettern, dass gemeinsame Umziehen, Grübeln, Probleme wälzen,
Formatieren, Helfen und für einander Dasein – einfach für eine lange Freundschaft!
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Die „technische Abteilung“ – also Stef, Alex und Anja – die das Leben in Labor (und
außerhalb!!) extrem angenehm machten und erleichtert haben und vor allem in
schwachen Momenten die Situation mit `nem guten Käffchen oder einer glasklaren
Intuition gerettet haben!
Alle restlichen Labormäuse/riche – für unendlich langes Diskutieren, Lachen, Ärgern,
Feiern, Umziehen, Trösten, Helfen, Beraten, Essen und Trinken gehen – einfach für
extrem viel gemeinsam verbrachte Tage, Abende und Nächte in den letzten Jahren auf
beiden Seiten der Elbe!
Meinen Eltern! und Schwestern Katha! und Nik! für den Glauben, dass auch eine
Doktorarbeit irgendwann einmal endet... und vor allem für die Unterstützung in seelisch
schwierigen – scheinbar unlösbaren – Situationen.
Jan
169
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ERKLÄRUNG
Hiermit erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und nur die angegebenen
Hilfmittel benutzt habe. Die Arbeit wurde bisher noch nicht anderweitig als Dissertation
eingereicht oder veröffentlicht.
Düsseldorf, den 12.12.2008
Henrike Reinhard
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