Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der
Werbung
Aus dem Institut für Tierzucht (Mariensee) der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) Braunschweig Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der Entwicklungsfähigkeit geklonter Schweineembryonen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Dagmar Theda Sage aus Wilhelmshaven Hannover 2005 Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. med. vet. H. Niemann 1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. H. Niemann 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. K.-H. Waldmann Tag der mündlichen Prüfung: 01.06.2005 Meinen Eltern, meinem Bruder Ansgar und Tobias Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung _____________________________________________________1 2. Schrifttum _____________________________________________________4 2.1. Physiologische Grundlagen.............................................................................4 2.1.1. Oogenese beim Säugetier ..................................................................................4 2.1.2. Vorgänge bei der Befruchtung ............................................................................6 2.1.3. Embryonale Entwicklung des Schweins..............................................................8 2.1.4. Physiologische Beschaffenheit von Eileiter und Uterus beim Schwein .............11 2.2. Biotechnologische Grundlagen.....................................................................14 2.2.1. In-vitro-Reifung porziner Oozyten .....................................................................14 2.2.2. In-vitro-Entwicklung von Schweineembryonen .................................................16 2.2.2.1. Einfluss der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Kultur .....................18 2.2.2.2. Berücksichtigung des Energiestoffwechsels frühembryonaler Stadien während der In-vitro-Kultur ..............................................................................................20 2.2.3. Erstellung porziner parthenogenetischer Embryonen und deren Entwicklungspotential in vitro ............................................................................25 2.3. Somatisches Klonen beim Schwein..............................................................29 2.3.1. Effizienz des Kerntransfers bei unterschiedlichen Spezies...............................29 2.3.2. Einflussfaktoren auf die Effizienz des Kerntransfers und die anschließende Entwicklung des Embryos .................................................................................31 2.3.2.1. Zyklusstand der Oozyte und Art der Spenderzelle............................................31 2.3.2.2. Kerntransferverfahren .......................................................................................32 2.3.2.3. Rolle des sogenannten „Nuclear Reprogramming“ in der frühen Embryonalentwicklung ......................................................................................36 2.3.2.4. Qualität und Entwicklungspotential der erstellten Oozyten-SpenderzellKomplexe..........................................................................................................37 2.3.3. In-vitro-und In-vivo-Potential porziner Kerntransferembryonen.........................38 3. Material und Methoden _________________________________________45 Inhaltsverzeichnis 3.1. Arbeitsmaterialien...........................................................................................46 3.1.1. Pipetten.............................................................................................................46 3.1.2. Medien ..............................................................................................................47 3.2. Spenderzellen für den Kerntransfer ..............................................................47 3.2.1. Gewinnung der Spenderzellen..........................................................................47 3.2.2. Kultivierung und Wachstum ..............................................................................48 3.2.3. Präparation für den Kerntransfer.......................................................................48 3.3. Eizellen als Empfängerzellen für den Kerntransfer .....................................49 3.3.1. Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen ................................................49 3.3.2. In-vitro-Reifung .................................................................................................50 3.3.3. Präparation für den Kerntransfer/Parthenogenese ...........................................50 3.4. Kerntransfer ....................................................................................................51 3.4.1. Entkernen .........................................................................................................51 3.4.2. Transfer einer Kernspenderzelle.......................................................................52 3.4.3. Fusion der Oozyten-Spenderzell-Komplexe .....................................................52 3.4.4. Elektrische und chemische Aktivierung.............................................................56 3.5. Erstellung parthenogenetischer Embryonen ...............................................57 3.6. In-vitro-Fertilisation mit aufgetautem Nebenhodenschwanzsperma .........57 3.6.1. Vorbereitung der Oozyten.................................................................................57 3.6.2. Aufbereitung und Präparation der Spermien.....................................................57 3.6.3. In-vitro-Fertilisation ...........................................................................................58 3.7. In-vitro-Kultivierung........................................................................................59 3.7.1. Allgemeine Kulturbedingungen .........................................................................59 3.7.2. Versuch 1: Veränderungen der umgebenden Kulturatmosphäre (Vergleich 20% vs. 5% Sauerstoff) ...................................................................59 Inhaltsverzeichnis 3.7.3. Versuch 2: Modifizierung des Kulturmediums...................................................60 3.8. Beurteilung der In-vitro-Entwicklung ............................................................61 3.8.1. Blastozystenrate ...............................................................................................61 3.8.2. Qualität der Blastozysten ..................................................................................61 3.8.2.1. Auszählung der Kerne mittels Hoechstfärbung.................................................61 3.8.2.2. Bestimmung von Inner-Cell-Mass und Trophectoderm mittels Differentialfärbung.............................................................................................62 3.9. Beurteilung der In-vivo-Entwicklung.............................................................63 3.9.1. Möglichkeiten des Embryotransferzeitpunktes..................................................63 3.9.1.1. Zygotenstadium ................................................................................................63 3.9.1.2. 4- bis 8-Zellstadium...........................................................................................63 3.9.1.3. Blastozystenstadium .........................................................................................64 3.9.2. Synchronisation der Empfängertiere.................................................................64 3.9.3. Embryotransfer von Kerntransferembryonen ....................................................64 3.9.4. Aufrechterhaltung der Trächtigkeit ....................................................................66 3.10. Statistische Auswertung ................................................................................66 4. Ergebnisse ___________________________________________________68 4.1. Vorversuch: Entwicklung parthenogenetisch erstellter Embryonen unter verminderter Sauerstoffspannung ......................................................68 4.1.1. Blastozystenraten .............................................................................................69 4.1.2. Durchschnittliche Kernzahlen ...........................................................................69 4.2. Versuch 1: Veränderung der Sauerstoff-Konzentration während der In-vitro-Kultivierung........................................................................................71 4.2.1. Entwicklung rekonstruierter Kerntransferkomplexe...........................................71 4.2.2. Entwicklung der IVF-Embryonen.......................................................................72 4.2.3. Entwicklung parthenogenetischer Embryonen..................................................73 Inhaltsverzeichnis 4.2.4. Verhältnis von Inner-Cell-Mass und Trophectoderm-Zellen..............................75 4.3. Versuch 2: Modifikation des Kulturmediums in vitro unter Berücksichtigung des Glucosestoffwechsels frühembryonaler Stadien ..77 4.3.1. Entwicklung rekonstruierter Kerntransembryonen ............................................77 4.3.2. Entwicklung der IVF-Embryonen.......................................................................78 4.3.3. Entwicklung parthenogenetischer Embryonen..................................................78 4.3.4. Verhältnis von Inner-Cell-Mass- und Trophectoderm-Zellen.............................80 4.4. In-vivo-Potential von Kerntransferembryonen nach Embryotransfer ........81 5. Diskussion ___________________________________________________83 5.1. Veränderte Sauerstoffatmosphäre während der In-vitro-Kultur von Kerntransfer-, IVF- und parthenogenetischen Embryonen .........................83 5.2. Veränderung des Kulturmediums hinsichtlich des Energiestoffwechsels porziner Embryonen .................................................86 5.3. In-vivo-Potential auf Empfängertiere transferierter Embryonen nach zuvor erfolgter In-vitro-Kultivierung..............................................................90 6. Zusammenfassung ____________________________________________92 7. Summary ____________________________________________________96 8. Literaturverzeichnis___________________________________________100 9. Anhang: Zusammensetzung der Medien __________________________122 10. Abkürzungsverzeichnis________________________________________125 11. Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen________________________128 Einleitung 1. 1 Einleitung Seit der Geburt des weltweit ersten, aus adulten Zellen geklonten Schafes „Dolly“ (WILMUT et al. 1997), hat es auch bei anderen Spezies Bemühungen gegeben, das somatische Klonen zu etablieren und Anwendungsmodelle zu entwickeln. Bisher wurden bei Schaf (WILMUT et al. 1997), Rind (CIBELLI et al. 1998), Ziege (BAGUISI et al. 1999), Maus (WAKAYAMA et al. 1998), Schwein (POLEJAEVA et al. 2000; ONISHI et al. 2000; BETTHAUSER et al. 2000), Kaninchen (CHESNE et al. 2002), Katze (SHIN et al. 2003), Maultier (WOODS et al. 2003), Pferd (GALLI et al. 2003) und bei der Ratte (ZHOU et al. 2003) lebende geklonte Nachkommen geboren. Während bei den meisten der genannten Spezies die Entwicklungsraten geklonter Embryonen sehr gering sind (unter 3%), können beim Rind zwar Erfolgsraten von 15- 20% erreicht werden, jedoch kommt es besonders bei dieser Spezies häufig zu Geburten von abnormal großen Kälbern (sogenanntes Large Offspring Syndrome) (YOUNG et al. 1998). Beim Schwein sind die Geburtsraten geklonter Ferkel trotz etablierter Kerntransferprotokolle nach wie vor besonders gering (<1%) (NIEMANN u. RATH 2001; ONISHI 2002; BREM u. KUHHOLZER 2002). Dies liegt hauptsächlich an Besonderheiten in der Reproduktionsphysiologie und frühembryonalen Entwicklung geklonter Embryonen („Nuclear Reprogramming“) (HAN et al. 2003). Zur Etablierung einer Trächtigkeit beim Schwein ist die Implantation von mindestens vier Embryonen notwendig (POLGE et al. 1966), was eine entsprechend hohe Anzahl (>100 Embryonen/Empfängertier) an entwicklungskompetenten Kerntransfer-Embryonen voraussetzt. Beim Schwein stellt zudem die Überwindung des 4-Zellblocks in der In-vitro-Kultur eine schwierig zu überwindende Barriere dar (BAVISTER 1988; BAVISTER 1995; YOUNG et al. 1998). Das Schwein ist eine interessante Spezies für das Klonen durch somatischen Kerntransfer. Hierbei geht es nicht primär um die Erstellung genetisch identischer Individuen zur Verbreitung wertvoller Vererbungsmerkmale aus züchterischem Interesse, sondern aktuell besonders um die Erstellung transgener „Knockout“Schweine für die Xenotransplantationsforschung (NIEMANN u. KUES 2003). Mittlerweile liegen genetisch modifizierte (α-1,3-Gal-Knockout) Spenderzellen vor, die bereits erfolgreich zur Erstellung von Knockout-Ferkeln durch Kerntransfer eingesetzt Einleitung 2 worden sind (DAI et al. 2002; LAI et al. 2002a; RAMSOONDAR et al. 2003; PHELPS et al. 2003). Am Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Mariensee wurde ein Kerntransferprotokoll zur Erstellung geklonter Schweine etabliert (HÖLKER 2003), mit dem die Produktion geklonter und transgener Schweine gelungen ist (HÖLKER 2003; PETERSEN 2004). Mit der vorliegenden Arbeit sollten vor allem die geringen Entwicklungsraten verbessert werden, um die Effizienz des somatischen Klonens beim Schwein zu erhöhen, den Kerntransferprozess im Labor von der Übertragung auf die Empfängertiere zu entkoppeln und durch Selektion in der In-vitro-Kultur die Anzahl der zu übertragenden Embryonen zu reduzieren. Beim somatischen Kerntransfer wird in vitro gereiften Schweineoozyten, die sich in der Metaphase II befinden, die DNA entfernt (Enukleation). Im nächsten Schritt wird die Spenderzelle zwischen Oozytenmembran und Zona pellucida abgesetzt (Kerntransfer) und Oozyte und Spenderzelle werden durch einen elektrischen Impuls miteinander fusioniert; dadurch erhält die Oozyte eine neue diploide DNA. Die fusionierten Oozyten-Spenderzell-Komplexe werden danach elektrisch und chemisch aktiviert und entweder zu Untersuchungen des Entwicklungspotentials in vitro kultiviert oder unmittelbar als rekonstruierte Komplexe auf Empfängersauen übertragen. Da die Arbeitsschritte der Enukleation, des Kerntransfers, der Fusion und Aktivierung im Labor in Mariensee bereits etabliert waren (HÖLKER 2003), lag der Schwerpunkt dieser Arbeit vor allem auf der Verbesserung der In-vitro-Kulturbedingungen. Nach der In-vitroKultur sollte eine Selektion entwicklungskompetenter Klonembryonen möglich werden, die im Anschluss an die Kultivierung auf Empfängertiere übertragen werden sollten, um so deren In-vivo-Potential zu überprüfen. Da die Erstellung von KerntransferEmbryonen sehr zeit- und arbeitsaufwändig ist, wurden zunächst als Modell mit parthenogenetischen und IVF- Embryonen verschiedene Versuchsansätze auf ihre Durchführbarkeit überprüft. Dies war aber nur in den Fällen möglich, wo sich der Versuchsaufbau nicht auf den speziellen Stoffwechsel geklonter Schweineembryonen bezog. Die darauffolgenden Versuche zur vergleichenden Untersuchung des Einleitung Entwicklungspotentials Kulturbedingungen von wurden Schweineembryonen mit Kerntransferembryonen, 3 unter verschiedenen IVF-Embryonen und parthenogenetischen Embryonen durchgeführt, wobei IVF- und parthenogenetische Embryonen zur Kontrolle der Qualität der eingesetzten Oozyten dienten. Die Auswirkungen der veränderten Kulturbedingungen sollten anhand der Parameter Blastozystenrate und -qualität beurteilt werden. Die Blastozystenrate wurde anhand morphologischer Kriterien unter dem Lichtmikroskop sowie anhand von Kernzahlen nach Hoechstfärbung untersucht. Die Qualität der Blastozysten wurde zum Einen anhand der Gesamtzellzahl und zum Anderen anhand des Verhältnisses von Inner-CellMass (ICM)-Zellen zur Gesamtzellzahl nach Differentialfärbung beurteilt. Im letzten Versuchsschritt wurde die In-vivo-Kompetenz der erstellten Klonembryonen untersucht. Hierzu fanden Embryotransfers verschiedener Entwicklungsstadien auf synchronisierte Empfängersauen statt. Schrifttum 4 2. Schrifttum 2.1. Physiologische Grundlagen 2.1.1. Oogenese beim Säugetier Die Gametogenese ist Voraussetzung für die weitere Fortpflanzungsfähigkeit des sich entwickelnden Individuums. Hierzu muss der Chromosomensatz der zukünftigen Keimzellen auf die Hälfte des von normalen somatischen Zellen reduziert werden, da sonst die Verschmelzung von Eizelle und Spermium zu einer Verdopplung der Chromosomenzahl bei jeder neuen Generation führen würde. Dies geschieht durch die Meiose (Reifeteilung), einer besonderen Form der Zellteilung. Die Entwicklung weiblicher Keimzellen beginnt bereits in der frühen Gravidität. Die Primordialkeimzellen sind die Stammzellen der Geschlechtszellen, die von der Dottersackwand des Embryos über den Dottersackstiel in die Keimleiste einwandern, was hier zur Differenzierung in die Gonadenanlage führt und beim Schwein ungefähr am 18. Tag geschieht (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Die Primordialkeimzellen vermehren sich während dieser Wanderung und separieren sich nach der Teilung, wobei jede Tochterzelle von somatischen Begleitzellen umgeben ist, die sich später zu Follikelzellen differenzieren. Nach einer kurzen Vermehrungsperiode trennen sich die Keimzellen nach der Teilung nicht mehr vollständig, sondern bleiben über Interzellularbrücken miteinander verbunden und bilden so den sogenannten Keimballen. Von diesem Stadium an, das beim Schwein um den 28. Tag erreicht wird, spricht man von Oogonien (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Die Mitosen der Oogonien sind zahlenmäßig begrenzt und laufen aufgrund der Verbindungen untereinander synchron ab (SCHNORR 1996). Nach Abschluss der Teilungen treten die Keimzellen in die Prophase I der ersten Reifteteilung (Meiose I) ein und werden nun als primäre Oozyten bezeichnet. Beim Schwein erfolgt dies zwischen dem 40. und 48. Trächtigkeitstag (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Zu dem Zeitpunkt liegt ein Chromosomensatz vor, dessen DNA aufgrund der vorangegangenen DNA- Synthese verdoppelt ist, also tetraploid (4n) (WEHNER u. Schrifttum 5 GEHRING 1995). In den verschiedenen Stadien der Prophase I (Leptotän, Zygotän, Pachytän, Diplotän) kondensieren die Chromosomen und werden als zwei miteinander verbundene (Doppel-) Chromatiden sichtbar (ALBERTS et al. 1995). Die jeweils homologen Chromosomen der mütterlichen und väterlichen Kopie lagern sich aneinander und tauschen bei dieser Paarung Abschnitte untereinander aus („Crossing over“), was zur genetischen Neukombination führt (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Nach diesem letzten Stadium der Prophase I lösen sich die Interzellularbrücken und die Meiose der primären Oozyten wird in diesem Stadium des Diplotän arretiert (FULKA et al. 1972). Während der weiteren Embryonalentwicklung erfolgt also zwar die Entwicklung der Eizelle und der Follikel, die meiotischen Teilungen im Kern beginnen jedoch erst kurz vor der ersten Ovulation des Tieres. Die Zahl der somatischen Zellen neben den Oozyten ist zunächst begrenzt. Sie vermehren sich aber nachdem die Oozyten die Prophase I beendet haben und umschließen diese dann, was zur Bildung von Primordialfollikeln führt, die durch Bindegewebszellen separiert werden (64. Tag beim Schwein) (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Durch das Wachstum des Ovars und die Entstehung der Primordialfollikel wird so die Rinde des Ovars gestaltet, in der die Eizellen als primäre Oozyten über die gesamte fertile Lebenszeit gespeichert werden. Beim Eintritt in die Pubertät des Tieres kommt es kurz vor der Ovulation unter Einfluss des LH-Peaks zur Wiederaufnahme der ersten Reifeteilung (HUNTER 1966). Der Kern der Eizelle tritt von der Prophase I in die Metaphase I ein, und die Chromosomen ordnen sich als Homologenpaare in der Äquatorialebene an. In der Anaphase I werden die homologen Chromosomen voneinander getrennt. Dadurch erhalten die Tochterzellen jeweils einen zufällig verteilten, haploiden Chromosomensatz, dessen Chromosomen aus zwei Chromatiden bestehen, die DNA liegt also verdoppelt vor (2n). Als Tochterzellen entstehen einmal die Eizelle als sekundäre Oozyte und der viel kleinere Polkörper (SCHNORR 1996). Jetzt treten die Zellen in die zweite Reifeteilung (Meiose II) ein. In der Prophase II löst sich die Kernmembran auf und eine Spindel entsteht. In dieser Phase verharrt die sekundäre Oozyte, bis es zur Befruchtung durch 6 Schrifttum ein Spermium kommt. Nach dem Eindringen des Spermiums in die Eizelle erfolgt die Trennung der Chromatiden in der Anaphase II. Dadurch entsteht ein weiterer Polkörper und die Eizelle enthält jetzt (wie auch die Polkörper) einen haploiden Chromosomensatz (1n), der nun den weiblichen Vorkern bildet (RÜSSE u. SINOWATZ 1998) (zum Überblick über die Vorgänge bei der Meiose, siehe Abbildung 1). Abbildung 1: Schematische Darstellung der Reifeteilung weiblicher Keimzellen (RÜSSE u. SINOWATZ 1998) 2.1.2. Vorgänge bei der Befruchtung Circa 30-45 Minuten nach der Ovulation erreichen die Eizellen den Übergang von der Eileiterampulle zum Isthmus, wo die Befruchtung stattfindet. Auf dem Weg zur Eizelle kommt es im weiblichen Genitaltrakt zu biochemischen Veränderungen am Spermium, Schrifttum 7 die als Kapazitation bezeichnet werden und bei denen sich unter anderem die Struktur der Plasmamembran ändert, was eine wichtige Voraussetzung für die anschließende Akrosomreaktion ist. Diese wird durch den Kontakt des Spermiums mit der Zona pellucida ausgelöst und bewirkt eine Freisetzung akrosomaler Enzyme, die ein Eindringen in die Zona ermöglichen. Nach dem Durchdringen der Zona pellucida lagert sich das Spermium mit der Längsfläche seines Kopfes parallel zur Eizellmembran an, wobei zunächst nur der postakrosomale Teil des Spermienkopfes in Kontakt mit den Mikrovilli der Eizelle tritt (SINOWATZ 1999). Man geht davon aus, dass das Spermium dabei an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor bindet. Dadurch aktiviert dieser Rezeptor die an ihn gebundene Phospholipase C (PLC), die wiederum Phosphatidylinositolbiphosphat aktiviert (SAUNDERS et al. 2002). Dadurch werden Mechanismen in Gang gesetzt, die zum Einstrom von extrazellulärem Calcium in die Eizelle führen. Auch wird Calcium aus den intrazellulären Speichern des Endoplasmatischen Retikulums freigesetzt (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998). Dieser enorme Anstieg der Ca++-Ionenkonzentration im Zytoplasma läuft in Oszillationen ab, die bis zu 70 Minuten nach dem ersten Kontakt des Spermiums mit der Oozyte anhalten können (PARRINGTON et al. 1996) (Abbildung 2). 2+ Abbildung 2: Intrazelluläre Ca -Oszillationen in befruchteten Oozyten bei der Ratte (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998) Auf diese Weise wird unter anderem durch Ausschüttung der kortikalen Granula der Polyspermieblock ausgelöst (SINOWATZ 1999). Weiterhin wird über calciumabhängige Enzyme und Protein-Tyrosin-Phosphatasen der Zellzyklus aktiviert, was dann die Fortsetzung der zweiten meiotischen Reifeteilung ermöglicht (zum Überblick über die Schrifttum 8 Vorgänge bei der Befruchtung siehe Abbildung 3). In der Eizelle entstehen dann sowohl ein männlicher als auch ein weiblicher haploider Vorkern. Abbildung 3: Überblick über den Mechanismus der Spermien-induzierten Aktivierung bei der Säugetier-Oozyte (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998) Beide Vorkerne bewegen sich anschließend aufeinander zu und verschmelzen miteinander. Da die DNA beider Vorkerne schon während der Dekondensation verdoppelt wurde, können sich die mütterlichen und väterlichen Chromosomen sogleich in der Äquatorialebene der Teilungsspindel anordnen und in die Prophase der ersten mitotischen Teilung übergehen (SINOWATZ 1999). 2.1.3. Embryonale Entwicklung des Schweins Die ersten Furchungsteilungen der Zygote beginnen 14-16 h nach der Befruchtung und erfolgen im Eileiter. Wenn der Embryo nach ca. 46 h in den Uterus eintritt, hat er das 4- Schrifttum 9 bis 8-Zell-Stadium erreicht (HUNTER 1974). Von der Uterushornspitze werden die Embryonen nun durch den gesamten Uterus bis in das gegenüberliegende Horn transportiert. Bereits ab dem Ende des 3. Tages, spätestens jedoch bis zum 5. Tag ist das Stadium der Morula erreicht, wobei sich der Embryo immer noch innerhalb der Zona pellucida befindet. Ab dem 6. Tag bildet sich die Blastozyste, indem sich die Zellen zu Trophectoderm (TE)-Zellen und Zellen der inneren Zellmasse (sog. „InnerCell-Mass“= ICM) differenzieren und im Inneren des Embryos das Blastocoel entsteht (Abbildung 4). Der Anteil der Trophectoderm-Zellen ist immer deutlich höher als der der ICM-Zellen (PAPAIOANNOU u. EBERT 1988). Aus den Zellen des Trophectoderm bilden sich später die Fruchthüllen (Amnion- und Chorionepithel), während der Schweinefetus aus den Zellen der ICM hervorgeht; daher werden diese Anteile der Blastozyste auch als Trophoblast und Embryoblast bezeichnet. Abbildung 4: Überblick zu den Furchungsteilungen beim Säuger (SCHNORR 1996) Schrifttum 10 Am 7. (6.-8.) Tag schlüpft die Blastozyste aus der Zona pellucida und nimmt an Größe zu, wobei die kugelige Form zunächst beibehalten wird. Um den 9. Tag der Gravidität beginnt die Gastrulation und erst an Tag 12 entsteht durch die Elongation ein länglicher Embryo; um diesen Zeitpunkt herum erfolgt auch die Erkennung der Trächtigkeit durch das Muttertier. Die Blastozysten sind noch maximal bis zum 15. Tag im Uterus frei beweglich und verteilen sich gleichmäßig in beiden Uterushörnern, erst danach ist der Embryo in seiner Lage fixiert und hat ausgeprägten Kontakt zum Uterusepithel (DZIUK 1985). Beim Schwein ist das Vorhandensein einer ausreichend großen Zahl vitaler Embryonen in beiden Hörnern Voraussetzung für die Aufrechterhaltung einer Gravidität (POLGE et al. 1966). Ein wesentlicher Grund hierfür liegt in der für die Erhaltung der Trächtigkeit benötigten Konzentration an Östradiol-17β, das in ausreichender Menge nur von mindestens vier lebensfähigen Embryonen produziert werden kann. Unter dem Einfluss des Östrogens wird die PGF2α-Ausschüttung des Endometriums nicht an das Ovar weitergeleitet, wo es bei einer nicht vorhandenen Trächtigkeit am Tag 14 eine Luteolyse der Gelbkörper herbeiführen würde. Durch die Rückbildung der Gelbkörper wird kein Progesteron mehr produziert, das die Trächtigkeit aufrechterhalten kann, und das Muttertier „rauscht um“, d.h. ein neuer Zyklus beginnt. Die Produktion von Östradiol-17β findet in der Blastozyste vom 10.-16. Tag statt. Innerhalb dieses Zeitraumes beginnt an Tag 12 auch die Implantation des Schweineembryos im Bereich der Uterushörner, bei der sich das Endometrium und der anliegende Trophoblast stark einfalten und auf diese Weise der Trophoblast in das Lumen ragende Endometriumspfropfen kappenartig umhüllt (RÜSSE 1999). Diese sogenannte „enge Apposition“ wird ab dem 14. Tag wieder flacher, die Verbindung zwischen Embryo und Endometrium bleibt jedoch bestehen und verstärkt sich beiderseits durch Ausbildung von Mikrovilli. Noch während der Implantation bilden sich die Amnionfalten um den Embryo und schließen ihn schließlich ein. Weiterhin wächst zur gleichen Zeit die Allantois als kleines Divertikel aus dem Endarm aus und füllt bis zum 25. Tag mit Ausnahme des dorsalen Bereiches fast das gesamte extraembryonale Coelom aus. Um den 12. Tag ist die Keimscheibe der ovoiden Blastozyste von Mesoderm unterlagert, das sich am 14. Tag in ein viszerales und ein parietales Blatt spaltet und dabei das intra- und extraembryonale Coelom entstehen lässt (RÜSSE 1999). Am 16. Tag ist die Schrifttum 11 Proliferation des Mesoderms bereits weit fortgeschritten, und es hat sich das erste Somitenpaar (als Anlage für die Urwirbel) und das Neuralrohr gebildet. Die weitere Entwicklung des Schweinefetus in der 3. Woche verläuft sehr rasch, die Länge nimmt von 4 mm am 17. Tag auf 16 mm am 24. Tag zu. In diesem Stadium sind die meisten Organsysteme bereits angelegt, so dass von einem frühen Schweinefetus gesprochen werden kann (RÜSSE 1999). Die Gesamtdauer der Gravidität beträgt beim Schwein 114 Tage; die durchschnittliche Wurfgröße liegt bei 8-12 Ferkeln, wobei zu beachten ist, dass die pränatale Sterblichkeit zwischen 35 und 40% liegt und der höchste Anteil davon noch vor der Implantation beobachtet wird (POPE et al. 1972). 2.1.4. Physiologische Beschaffenheit von Eileiter und Uterus beim Schwein Der Eileiter ist ein enger, häutig- muskulöser Schlauch, der die Aufgabe hat, die ovulierten Eizellen aufzunehmen und sie dem Uterus zuzuleiten (VOLLMERHAUS u. SCHUMMER 1995). Am Eileiter unterscheidet man sein eierstockseitiges, trichterförmig erweitertes Ende, das Infundibulum tubae uterinae, welches mit seinen Fimbrien innerhalb der Bursa ovarica liegt, und dem Ovar seine Öffnung zuwendet (VOLLMERHAUS u. SCHUMMER 1995). Die Bursa ovarica ist eine Art „Tasche“, die aus dem Mesovarium und Mesosalpinx (Aufhängeapparat von Eierstock und Eileiter) gebildet wird, und das Ovar kapuzenartig umhüllt; die weite Öffnung liegt ventral. Das Infundibulum führt in den erweiterten Anfangsteil, die Ampulle; der anschließende engere Isthmus ist viel länger, als es dem Abstand zwischen Eierstock und der Spitze des Uterushorns entspricht. Dieser Teil des Eileiters beschreibt auf dem Weg zahlreiche Windungen, bevor er in das Uterushorn einmündet. Eileiterampulle und Isthmus tubae uterinae weisen zusammen eine Länge von 19-22 cm auf (VOLLMERHAUS u. SCHUMMER 1995). Aufgrund der vielen unterschiedlichen Funktionen des Eileiters (Transport und Endreifung sowohl männlicher als auch weiblicher Eizellen, Ernährung und Transport der frühembryonalen Stadien) erfolgen zyklusabhängige Umbauvorgänge, um so optimale Stoffwechselbedingungen für die Embryonen zu schaffen (LIEBICH 1999). Schrifttum 12 Histologisch besteht die Wand des Eileiters aus Tunica mucosa mit Epithel und Lamina propria, Tunica muscularis, der Tela subserosa und der Tunica serosa (LIEBICH 1999). Die Schleimhaut übernimmt für die Funktionen des Eileiters eine wichtige Rolle und bildet ein einschichtiges, meist hochprismatisches Epithel, das stellenweise mehrstufig sein kann. Das Epithel besteht aus Flimmerzellen, die zum Teil mit Kinozilien ausgestattet sind, sowie Drüsenzellen, die außer einem schwach sauren Schleim auch Proteine, Elektrolyte, Enzyme, Albumine, Zucker und Aminosäuren sezernieren (LIEBICH 1999). Beide Zellformen unterliegen deutlichen zyklischen Veränderungen, wobei die Drüsenzellen zur Zeit der Brunst die stärksten Sekretionserscheinungen zeigen (IRITANI et al. 1974). Weiterhin haben Untersuchungen ergeben, dass sowohl Oozyten-Eileiter- als auch Eileiter-Oozyten-Interaktionen auftreten und z.B. die DeNovo-Synthese verschiedener Proteine durch die Oviduktzellen veranlassen (BUHI et al. 1997). Da Keimzellen, Zygoten und frühe Teilungsstadien auf die Unterstützung durch Makromoleküle aus dem Eileitersekret angewiesen sind, zeigt das Eileiterepithel in Abhängigkeit vom Zyklusstand zeitlich und räumlich begrenzte, spezifische Gen- und Proteinexpressionsmuster (BUHI et al. 1997). Wenn auch der Mechanismus noch nicht restlos geklärt ist, so haben doch Beobachtungen gezeigt, dass sich das Infundibulum aktiv am Auffangen der ovulierten Eizelle beteiligt. Gelangen die Eizellen in die entsprechend ausgestaltete, seröse Flüssigkeit enthaltende Bursa ovarica, werden sie durch den Eileitertrichter aufgesaugt; der Weitertransport zum Uterus hin wird durch peristaltische Kontraktionen der Eileitermuskulatur, unterstützt vom Flimmerstrom des Epithels bewerkstelligt (VOLLMERHAUS u. SCHUMMER 1995). Der Uterus besteht beim Schwein hauptsächlich aus den dünndarmschlingenähnlich gewundenen, dickwandigen, sehr langen Uterushörnern; der Uteruskörper selbst misst nur etwa 5 cm und nimmt keine Embryonen auf. Das Lumen wird von der Uterusschleimhaut, dem Endometrium, ausgekleidet, das ein unterschiedlich hohes, zur Sekretion befähigtes, einschichtiges und stellenweise auch mehrschichtiges Epithel trägt. Auch hier finden sich Flimmerzellen mit Kinozilien und sezernierende Zellen mit Mikrovilli (LIEBICH 1999). Die Lamina propria enthält zahlreiche verästelte tubulöse Einzeldrüsen, die im Schrifttum 13 Anschluss an die Brunst gesteigerte Aktivität zeigen und während der Trächtigkeit die sogenannte „Uterinmilch“ ausscheiden (VOLLMERHAUS u. SCHUMMER 1995). Über das „innere Milieu“ (pH-Werte, Osmolarität der Sekrete) von Eileiter und Uterus beim Schwein ist nur wenig bekannt. Besonders problematisch ist hierbei, dass invasive und nicht-invasive Messverfahren das Milieu nicht physiologisch wiedergeben. Der pHWert innerhalb des Eileiters liegt beim Säugetier zwischen 7,2 (Affe) (MAAS et al. 1977) und 8,0 (Ratte) (BEN-YOSEF et al. 1996). Die Sauerstoffkonzentrationen im Genitaltrakt der Sau sind nicht bekannt, jedoch ist anzunehmen, dass hier ähnlich geringe Sauerstoffspannungen (1,5-8,7% O2) herrschen wie bei anderen Säugetieren, wie z.B. Rhesusaffe, Hamster und Kaninchen (FISCHER u. BAVISTER 1993). Untersuchungen beim Schwein ergaben unterschiedliche Zusammensetzungen von Uterin- und Oviduktflüssigkeiten (IRITANI et al. 1974) (Tabelle 1), was auch die Tatsache erklärt, dass nur in den Uterus weitertransportierte Schweineembryonen das Potential zur Blastozystenentwicklung aufweisen, da hier im Gegensatz zum Ovidukt das entsprechende Milieu vorhanden ist (MURRAY, JR. et al. 1971). Schweineembryonen sind zwar generell von ähnlichen Verhältnissen im Eileiter umgeben wie andere Säugetierembryonen, jedoch scheinen sie zu bestimmten Stadien jeweils spezielle Bedürfnisse zu haben, die unter In-vitro-Bedingungen schwierig nachzuvollziehen sind (PETTERS u. WELLS 1993). So wurde zum Beispiel festgestellt, dass die Glucosekonzentration im Eileiter mit ca. 0,59 mmol fast neunfach geringer als die Glucosekonzentration im Blutplasma ist, während die Lactatkonzentration im Eileiter mit ca. 5,71 mmol mehr als doppelt so hoch ist wie die Lactatkonzentration im Blut; Unterschiede zwischen dem Bereich der Ampulle und dem Isthmus konnten nicht festgestellt werden (NICHOL et al. 1992). Weiterhin enthält Eileiterflüssigkeit neben anderen Wachstumsfaktoren insbesondere Insulin-like Growth Factor (IGF)-I und -II, die je nach Zyklusstand und Umweltbedingungen in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen (WISEMAN et al. 1992) und unter anderem auch von Theca interna- und Granulosa-Zellen sezerniert werden (KOLODZIEJCZYK et al. 2003). Schrifttum 14 Tabelle 1: Physiologische Zuammensetzung von porziner Eileiter-/Uterinflüssigkeit nach IRITANI et al. (1974) (*) und NICHOL et al. (1992) (**) Eileiter Uterus [mg/100 ml]* Östrus Diöstrus Östrus Diöstrus Natrium* 314,80 - 255,10 - Chlorid* 381,40 - 417,80 - Calcium* 10,60 - 12,10 - Kalium* 48,60 - 61,60 - Magnesium* 0,60 - 0,70 - 0 0,14 0,21 0,39 Lactat* 26,30 29,80 32,30 38,30 Glucose* 15,80 12,50 27,50 18,40 Lactat** 5,71 - - - Glucose** 0,59 - - - Glutamin* [µmol/ml] [mmol/l]** 2.2. Biotechnologische Grundlagen 2.2.1. In-vitro-Reifung porziner Oozyten Für die In-vitro-Reifung werden häufig primäre Oozyten aus Ovarien geschlachteter präpubertaler Sauen verwendet, die sich in der arretierten Phase (Diplotän) der Meiose I befinden. Zwar besitzen die Oozyten postpubertaler Sauen eine höhere Entwicklungskompetenz als die präpubertaler Tiere (MARCHAL et al. 2001; HYUN et al. 2003b), jedoch stehen letztere aufgrund des Alters von Schlachtschweinen in ungleich größeren Mengen zur Verfügung. Hierzu werden die 2-8 mm großen Follikel mit einer Nadel punktiert, und dabei die Oozyten mit den sie umgebenden Kumuluszellen (= Kumulus-Oozyten-Komplexe, KOK) und der Follikelflüssigkeit aspiriert (YOON et al. 2000). Oozyten aus kleineren Follikeln sind zur In-vitro-Reifung ungeeignet, da sie geringere Reifungsraten, Vorkernbildungsraten und Blastozytenraten aufweisen als Schrifttum 15 Oozyten aus großen Follikeln (Ø >3 mm) (YOON et al. 2000). Nach Selektion der geeigneten KOK (homogenes Zytoplasma der Eizelle, mindestens 2-3 intakte Lagen Kumuluszellen) erfolgt die Inkubation der KOK (meistens ~120) bei 38,5°C und 5% CO2 in Luft (HÖLKER 2003). Als Reifungsmedium hat sich North Carolina State University (NCSU) 37-Medium bewährt (PETTERS u. WELLS 1993; FUNAHASHI et al. 1997; HÖLKER 2003), dem zunächst hCG, PMSG und zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) zugesetzt wird. Nach 22 Stunden erfolgt ein Mediumwechsel in NCSU 37Medium ohne die o.g. Zusätze für weitere 18 Stunden (HÖLKER 2003); durch die Zugabe von hCG, PMSG und cAMP in den ersten 22 Stunden der Reifung wird eine Synchronisation der Kern- und der zytoplasmatischen Reifung begünstigt (FUNAHASHI u. DAY 1993; FUNAHASHI et al. 1997; FAN et al. 2002). Der Zusatz von cAMP soll dabei die meiotische Arretierung in der Prophase aufrechterhalten; der Transport erfolgt über die Gap junctions zwischen Kumulus- und Eizelle (KUMAR u. GILULA 1996). Durch einen optimalen cAMP-Spiegel in der Eizelle kann also ihre zytoplasmatische Reifung gewährleistet werden und durch den Entzug von cAMP während der letzten 18 Stunden der Reifung wird bei allen inkubierten Eizellen die meiotische Arretierung aufgehoben, sodass die Metaphase erreicht werden kann (FUNAHASHI et al. 1997; FAN et al. 2002; SOMFAI et al. 2003). Die Hormonzugabe während der ersten 20 Stunden verbessert die Kumulusexpansion sowie die Bildung eines männlichen Vorkerns nach IVF (FUNAHASHI u. DAY 1993). Dem Reifungsmedium wird häufig außerdem Follikelflüssigkeit vom Schwein zugesetzt, was als Proteinquelle dient und durch seine antioxidative Rolle eine weitere Verbesserung der Reifung von Schweineoozyten bewirken kann (FUNAHASHI et al. 1997; ABEYDEERA et al. 1998; TATEMOTO et al. 2004). Mithilfe o.g. Maßnahmen konnten Reifungsraten von 90% erreicht werden. Gereifte Oozyten werden morphologisch anhand des ausgeschleusten Polkörpers sowie der nahegelegenen Metaphase II-Platte bewertet. Die Qualität der in vitro gereiften Schweineeizellen reicht dennoch zwar nicht an die der in vivo gereiften heran, jedoch sind Ferkel nach IVF und anschließendem Embryotransfer (MATTIOLI et al. 1989; KIKUCHI et al. 1999; YOSHIOKA et al. 2002), sowie mittlerweile von mehreren Arbeitsgruppen geklonte Schweine aus in vitro gereiften Oozyten erzeugt Schrifttum 16 worden (POLEJAEVA et al. 2000; BETTHAUSER et al. 2000; PARK et al. 2001a; WALKER et al. 2002; HÖLKER 2003). 2.2.2. In-vitro-Entwicklung von Schweineembryonen Generell zeigen in vitro kultivierte Schweineembryonen nach Embryotransfer ein geringeres Entwicklungspotential als Embryonen, die zuvor aus dem Genitaltrakt gespült wurden, also in vivo produziert wurden (HYTTEL u. NIEMANN 1990). Obwohl nach In-vitro-Fertilisation (IVF) und anschließender Embryokultur bereits Blastozystenraten von bis zu 50% erreicht werden konnten (WANG u. DAY 2002), weisen in vitro entwickelte Embryonen eine schlechtere Qualität auf. Dies zeigt sich häufig sowohl in den geringeren Gesamtkernzahlen sowie im aberranten Verhältnis von ICM- zu TE-Zellen (MACHATY et al. 1998; YOSHIOKA et al. 2002; KOO et al. 2004). So liegen die Gesamtzellzahlen in vivo produzierter Schweineblastozysten von Tag 6 z.B. bei ca. 280 Zellen, während bei in vitro produzierten Blastozysten durchschnittlich nur ca. 40-50 Zellen erreicht werden (PAPAIOANNOU u. EBERT 1988; KOO et al. 2004). Als Basismedien für die In-vitro-Kultivierung porziner Embryonen wurden vor allem Whitten´s Medium (WM) (WHITTEN u. BIGGERS 1968), Beltsville Embryo Culture Medium (BECM-3) (DOBRINSKY et al. 1996), NCSU 23-Medium (PETTERS u. REED 1991) und Porcine Zygote Medium (PZM) (YOSHIOKA et al. 2002) eingesetzt, wobei nur letzteres ein definiertes Medium ist, d.h. anstelle von BSA wurde Polyvinylalkohol (PVA) eingesetzt; BSA erlaubt aufgrund seiner biologischen Herkunft keine vollständige Standardisierung des Mediums (KANE 1983; BAVISTER 1995). Durch die Bestandteile Glucose und Glutamin als Energiequelle wird den Schweineembryonen eine In-vitroEntwicklung bis zum Blastozystenstadium ermöglicht (PETTERS et al. 1990) (zum Überblick über die Kulturmedien siehe Tabelle 2). Schrifttum Tabelle 2: 17 Vergleich der Zusammensetzung porziner Kulturmedien WM, BECM-3, NCSU 23, PZM-3 und PZM-4 WM NCSU-23 BECM-3 PZM-3 PZM-4 [mmol/l] (1968) (1991) (1996) (2002) (2002) NaCl 68,49 108,73 94,59 108,00 108,00 KCl 4,78 4,78 6,00 10,00 10,00 - 1,70 1,70 - - KH2PO4 1,19 1,19 - 0,35 0,35 MgSO4 x 7 H2O 1,19 1,19 1,19 0,40 0,40 NaHCO3 25,07 25,07 25,07 25,07 25,07 Glucose 5,56 5,55 5,56 - - Glutamin - 1,00 1,00 1,00 1,00 Taurin - 7,00 - - - Hypotaurin - 5,00 - 5,00 5,00 Na- Lactat 25,20 - 23,00 - - Na- Pyruvat 0,33 - 0,33 0,20 0,20 CaCl2 Calcium(Lactat)2 - BME - - 20,00 20,00 20,00 MEM - - 10,00 10,00 10,00 BSA [mg/ml] 4,00 4,00 12,00 3,00 - PVA [mg/ml] - - - - 3,00 [mOsm] - ~297 ~290 ~288 ~288 Vom Vierzellstadium beginnt beim Schwein die Synthese embryonaler RNA, was bedeutet, dass das embryonale Genom aktiviert wird (MADDOX-HYTTEL et al. 2001). Dieser tiefgreifende Prozess scheint unter In-vitro-Bedingungen häufig unzureichend abzulaufen, was den sogenannten „Vierzellblock“, einen Entwicklungsstop in vitro kultivierter Schweineembryonen (BAVISTER 1988; BAVISTER 1995) im Vierzellstadium zur Folge hat. Dies kann durch Zugabe der Aminosäuren Taurin und Hypotaurin zum Kulturmedium überwunden werden (PETTERS u. REED 1991), sodass heute durchschnittliche Blastozystenraten von 25-40% erzielt werden können. Schrifttum 18 2.2.2.1. Einfluss der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Kultur Neben dem Medium sind jedoch auch andere Komponenten der Kulturbedingungen für die Embryonalentwicklung entscheidend, insbesondere die umgebende Atmosphäre der Kultur. Bisher wurden unterschiedliche Ergebnisse mit verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen erreicht; man unterscheidet dabei hauptsächlich die Kultivierung unter 5% CO2 in Luft, d.h. ~20% O2, von der Kultivierung in reduzierter Sauerstoffatmosphäre in 5% CO2, 5% O2 und 90% N2. Einige Gruppen berichten von einer verbesserten Entwicklung porziner Embryonen unter verringerter Sauerstoffkonzentration, und zwar sowohl hinsichtlich der Blastozystenrate als auch bezüglich der Kernzahlen (MACHATY et al. 2001; YOSHIOKA et al. 2002; KITAGAWA et al. 2004), andere Autoren fanden nur eine verbesserte Blastozystenqualität (KIKUCHI et al. 2002; IM et al. 2004). Der Sauerstoffgehalt in der In-vitro-Kultur wurde aufgrund der Erkenntnis, dass im Genitaltrakt der Sau die Sauerstoffspannung niedriger als in der Luft ist, reduziert. Die Sauerstoffkonzentration im Uterus ist noch geringer als im Eileiter (FISCHER u. BAVISTER 1993). Vermutlich ist diese geringe Sauerstoffkonzentration dafür verantwortlich, dass beim porzinen Embryo, der den Uterus kurz vor dem Stadium der kompaktierten Morula erreicht, eine Umstellung der ATP-Produktion von der oxidativen Phosphorylierung zur Glykolyse erfolgt (KRISHER et al. 2000). Dies wird in der In-vitroKultur unter der verminderten Sauerstoffspannung nachvollzogen und unterstützt (MACHATY et al. 2001; IM et al. 2004). Außerdem ist bekannt, dass unphysiologisch hohe Sauerstoffkonzentrationen die Bildung von Sauerstoffradikalen (sogenannte „reactive oxygen species“, ROS) zur Folge haben, welche wiederum die DNA fragmentieren, sowie Lipide und Proteine oxidativ schädigen können (KITAGAWA et al. 2004). Weiterhin wird angenommen, dass das Redox-Potential früher Entwicklungsstadien beim Schweineembryo hauptsächlich vom NAD+/NADH-Verhältnis abhängt und der geringere Sauerstoffgehalt den embryonalen Metabolismus und dessen Redox-Potential positiv beeinflusst, sodass diese leichter im Gleichgewicht gehalten werden können (MACHATY et al. 1998; YOSHIOKA et al. 2002). Schrifttum 19 KIKUCHI et al. (2002) erreichten mit der höheren Sauerstoffkonzentration (20% O2) verbesserte Blastozystenraten; bei anderen Arbeitsgruppen waren hingegen keine signifikanten Unterschiede zwischen 5% und 20% Sauerstoffgehalt in der Kulturatmosphäre erkennbar (MACHATY et al. 1998; BING et al. 2003). Diese Differenzen in den Ergebnissen werden entweder auf die inhomogenen Oozytenquellen zurückgeführt oder mit der individuellen Kompetenz der Embryonen, Sauerstoffradikale zu tolerieren, erklärt. Die In-vitro-Kulturbedingungen können auch die Genexpression bei Embryonen vom Schwein und anderen Spezies beeinflussen. So untersuchten WRENZYCKI et al. (2001) die Expression entwicklungsspezifischer Gene bei Rinderembryonen und stellten Unterschiede zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen fest. Allerdings waren diese Unterschiede bei den in vitro produzierten Embryonen, die in „Synthetic Oviduct Fluid“ (SOF) unter 5% Sauerstoff kultiviert wurden, deutlich weniger ausgeprägt, wie die Unterschiede zwischen In-vivo-Embryonen und solchen, die in vitro in „Tissue Culture Medium“ (TCM) unter 20% Sauerstoff kultiviert worden waren. Eine weitere Arbeitsgruppe untersuchte die Länge des vierten Zellzyklus (Übergang vom 8zum 16-Zeller und den Übertritt von der maternalen zur embryonalen Expression) bei in vitro produzierten Rinderembryonen (LEQUARRE et al. 2003) und stellte fest, dass die Blastozystenrate bei Embryonen mit längerem (~43,5 Stunden) Zellzyklus deutlich niedriger war, als die der Embryonen mit relativ kurzem vierten Zellzyklus (~8,9 Stunden). Ein Anstieg der Sauerstoffkonzentration von 5% auf 20% erhöhte den Anteil der Embryonen mit verlängertem Zellzyklus. Es wird daher vermutet, dass die Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Kultur die Dauer der Umstellung von maternaler zu embryonaler Genexpression beeinflussen kann. Beim Kaninchenembryo wurde unter 5% Sauerstoff in der Kulturatmosphäre eine erhöhte Transkription von „rabCyP18“-mRNA festgestellt, einem Protein, das vermutlich gegen oxidativen Stress wirkt (SANTOS et al. 2000). Bei in vitro produzierten Schweineembryonen wurde unter 20% Sauerstoffgehalt im Vergleich zu 5% Sauerstoff eine erhöhte Expression von HSC70 festgestellt (BERNARDINI et al. 2004). Dieses Protein gehört einer Stress- Schrifttum 20 Protein-Familie an, die an den Reaktionen des Embryos gegen oxidativen Stress beteiligt sind. Eine zusammenfassende Übersicht über vergleichende Untersuchungen zum Entwicklungspotential porziner Embryonen bei 5% und 20% Sauerstoffgehalt in der Kulturatmosphäre zeigt Tabelle 4. 2.2.2.2. Berücksichtigung des Energiestoffwechsels frühembryonaler Stadien während der In-vitro-Kultur Aufgrund der unterschiedlich langen Passagedauer durch den weiblichen Genitaltrakt und den zu den jeweiligen Zeitpunkten vorhandenen fortgeschrittenen Teilungsstadien sind hinsichtlich des Energiestoffwechsels tierartspezifische Unterschiede zu beachten (zum Überblick siehe Tabelle 3). Einen generellen Überblick über die Lokalisation der jeweiligen Stadien beim Säugetier gibt Abbildung 5. Tabelle 3: Spezies Rind Schaf/ Chronologischer Ablauf der frühen Embryonalentwicklung bei landwirtschaftlichen Nutztieren (nach NIEMANN u. MEINECKE 1993) Erste Teilg. Zweite Teilg. [Std.] [Std.] Eintritt in den Uterus Zeitpkt. Stadium 20-24 32-36 72- 8-16- 84 Zeller 66- 8-16- 72 Zeller 46- 16-18 28-30 Ziege Schwein 14-16 20-24 Morula Blasto Verlust Implant. -zyste der Zona -beginn pell. [Tag] [Tag] [Tag] [Tag] 5/6 7/8 9-11 22 4/5 5/6 7-8 15 4-Zeller 3/4 5 6 13 140- Blasto- 6 8 8 37 144 zyste 48 Pferd 24 30-36 Schrifttum Tabelle 4: 21 Entwicklungspotential porziner Embryonen unterschiedlicher Herkunft nach vergleichender In-vitro-Kultur unter 5% bzw. 20% Sauerstoff. Autor MACHATY et al. (1998) MACHATY et al. (2001) YOSHIOKA et Kultur- Kultur- Embryonen dauer medium Konzentr. In vivo 4 Tage NCSU 23 (Zygoten, 2-Zeller) IVF 6 Tage NCSU 23 (Morulastadien) In vivo 6 Tage NCSU 23 (Zygoten) PZM-3 BING et al. Parthenogenese 7 Tage NCSU 37 (2003) IM et al. (2004) Parthenogenese Kerntransfer 6 Tage 6 Tage NCSU 23 NCSU 23 PZM-3 Sauerstoff- Teilungs- Blastozysten- Ø-Kernzahl der rate rate Blastozysten 5% 97,4% 50,0% 20,0 20% 97,4% 55,3% 24,1 5% - 75,8% 45,7 20% - 63,4% 37,9 5% 76,1% 52,2% 52,1 20% 76,6% 59,6% 54,9 5% 68,1% 65,9% 92,4 20% 74,5% 61,7% 77,9 5% 89,4% 49,6% 44,1 20% 88,2% 45,9% 39,2 5% 77,5% 13,5% 36,7 20% 72,8% 12,9% 23,2 5% 71,5% 12,3% 19,4 20% 70,9% 7,2% 12,2 5% 70,9% 17,8% 21,9 20% 75,1% 18,8% 20,9 Schrittum al. (2002) Herkunft der 21 Schrifttum 22 22 Fortsetzung von Tabelle 4: Autor KITAGAWA et Entwicklungspotential porziner Embryonen unterschiedlicher Herkunft nach vergleichender In-vitro-Kultur unter 5% bzw. 20% Sauerstoff. Herkunft der Kultur- Kultur- Embryonen dauer medium Konzentr. IVF 7 Tage NCSU 23 al. (2004) KARJA et al. IVF 6 Tage NCSU 37 (2004) BERNARDINI et (2-/4-Zeller) 6 Tage BECM-3 Blastozysten- Ø-Kernzahl der rate rate Blastozysten 5% 70,6% 36,3% 42,1 20% 65,6% 22,5% 37,6 8-10% 66,5% 20,0% 43,9 20% 61,7% 15,3% 36,4 5% - 84,0% - 20% - 73,0% - Schrittum al. (2004) In vivo Sauerstoff- Teilungs- Schrifttum 23 Beim Schweineembryo steigt die Verstoffwechselung von Glucose vom Zygoten- zum Blastozystenstadium stetig an, wobei der Metabolismus bis zum 8-Zellstadium auf einem niedrigen Level stattfindet, im Stadium der kompaktierten Morula aber stark (um das 300fache) erhöht ist (FLOOD u. WIEBOLD 1988). Dies ist mit einem stark erhöhten Energiebedarf zu erklären, der damit einher geht, dass sich ab dem 8-Zellstadium sogenannte „tight junctions“ zwischen den Zellen bilden, was die Differenzierung in ICM- und TE-Zellen beginnen lässt. Auch für die Bildung und Expansion des Blastocoels sind große Energiemengen erforderlich (FLOOD u. WIEBOLD 1988). Hierbei ist zu beachten, dass bis zum Vierzellstadium der Pentosephosphatweg noch mehr als 5% des Glucosemetabolismus einnimmt, während vom 8-Zell- bis zum Blastozystenstadium nur noch ~1% der Glucose über diesen Weg umgewandelt wird, der größte Anteil der Metabolisierung also über die Glycolyse stattfindet (FLOOD u. WIEBOLD 1988). Mehrere Arbeitsgruppen haben gezeigt, dass der Ersatz von Glucose durch Lactat und Pyruvat bei der In-vitro-Kultur von IVF- (FLOOD u. WIEBOLD 1988; KIKUCHI et al. 2002; YOSHIOKA et al. 2002) und NT-Embryonen (LEE et al. 2003b) einen positiven Effekt auf das Entwicklungspotential haben kann. Es wird vermutet, dass Glucose, die zwar ein wichtiger Energielieferant während der Blastozystenbildung ist, in der ganz frühembryonalen Phase mit einer Retardierung der Entwicklung verbunden ist (LEE et al. 2003b). Weiterhin wird beim Glucoseabbau, als Nebenprodukt der Glykolyse, Methylglyoxal freigesetzt (ANKRAH u. PPIAH-OPONG 1999), was die Inaktivierung der intrazellulären Glutathion-Peroxidase und daraufhin eine steigende Konzentration freier Sauerstoffradikale zur Folge hat (PARK et al. 2003). Auf diese indirekte Weise kann die Glucosezugabe in sehr frühen Entwicklungsstadien eine oxidative Belastung für die Genomaktivierung (Beginn im späten Vierzellstadium (MADDOX-HYTTEL et al. 2001) bedeuten, was letztlich zum Vierzellblock führen kann (MEDVEDEV et al. 2004). Die Umwandlung von Methylglyoxal erfolgt durch Glyoxalase I (INOUE et al. 1998), die in so frühen Stadien jedoch erst minimal aktiv ist (MEDVEDEV et al. 2004). Als Begründung für die Verwendung von Pyruvat und Lactat als „Ersatz“- Schrifttum 24 Energiesubstrate werden die antioxidativen Fähigkeiten von Pyruvat und seine Funktion in der mitochondrialen Atmung, sowie die embryotrophe Rolle von Lactat durch die Erhöhung der Pyruvataufnahme und -verstoffwechselung genannt (LANE u. GARDNER 2000). Abbildung 5: Schematische Darstellung der Ovulation, Befruchtung und Furchung beim Säuger (SCHNORR 1996) In Anlehnung an Milieuveränderungen, die der Embryo bei Übertritt vom Eileiter in den Uterus erfährt (s.o.), wurden zweiphasige Kultursysteme entwickelt. Dabei wird nach 48 bzw. 72 Stunden ein Mediumwechsel durchgeführt. Untersuchungen der Stoffwechselaktivität (Glucose-, Pyruvat-, Lactat-Aufnahme etc.) haben ergeben, dass die Zusammensetzung des In-vitro-Kulturmediums sowohl die Intensität der Substrataufnahme, als auch die Wahl der metabolischen Reaktionswege beeinflussen kann (SWAIN et al. 2001; GANDHI et al. 2001). Der Austausch von Pyruvat und Lactat Schrifttum 25 gegen Glucose während der ersten 2-3 Tage der In-vitro-Kultur, gefolgt von weiteren 4 Tagen mit Glucose kann die präimplantative Entwicklung porziner IVF-Embryonen verbessern (KIM et al. 2004; MEDVEDEV et al. 2004) und nach Embryotransfer konnten Ferkel produziert werden (KIKUCHI et al. 2002). 2.2.3. Erstellung porziner parthenogenetischer Embryonen und deren Entwicklungspotential in vitro Parthenogenese ist definiert als Reproduktion ohne genetische Beteiligung einer Spermienzelle. Im Gegensatz zu einigen Amphibien und Fischen kommt die parthenogenetische Entwicklung bei Säugern nicht vor (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Untersuchungen haben ergeben, dass nicht nur ein diploider Chromosomensatz, sondern sowohl ein maternales als auch ein paternales Genom für den ungestörten Ablauf einer Embryonalentwicklung erforderlich ist; diese Erkenntnisse haben zur Entwicklung der sogenannten Imprinting-Theorie geführt (SURANI et al. 1984; BARTON et al. 1984; MONK 1987; NIEMANN u. MEINECKE 1993). Um eine parthenogenetische Entwicklung artifiziell auszulösen, ist die Aktivierung der Oozyte erforderlich, die normalerweise durch das Spermium induziert wird (s.o.). Bei Säugeroozyten kann eine parthenogenetische Entwicklung durch eine Vielzahl physiologischer und chemischer Stimuli, wie Calciumionophor, elektrischen Impuls, osmotischer Schock, Ethanol oder abrupte Temperaturveränderung sowie auch durch Fusion zweier Eizellen induziert werden (PRATHER et al. 1991; NUSSBAUM u. PRATHER 1995; WANG et al. 1998; GRUPEN et al. 1999). Hierbei sollte die Abfolge der physiologischen Vorgänge simuliert und eingehalten werden. In der Regel werden hierzu gereifte Oozyten entkumuliert, durch einen elektrischen Impuls aktiviert, dem anschließend noch eine chemische Aktivierung folgen kann (JILEK et al. 2001; GRUPEN et al. 2002; BING et al. 2003). Weiterhin muss die Ausschleusung des zweiten Polkörpers verhindert werden, damit die Eizelle ihren diploiden Chromosomensatz behält (KAUFMAN u. SACHS 1976). Dies kann durch chemische Substanzen, die die Struktur der Spindel stören, sodass es zwar zur Entstehung von zwei Chromosomensätzen kommt, nicht aber zur Zellteilung (z.B. Cytochalasin B, 6- Schrifttum 26 Dimethylaminopurin), gewährleistet werden. Auf diese Weise kann auch beim Schwein eine parthenogenetische Entwicklung herbeigeführt werden (JOLLIFF u. PRATHER 1997; KURE-BAYASHI et al. 2000). Derartige Embryonen können sich nach Embryotransfer auf synchronisierte Empfängertiere bis zum 30. Trächtigkeitstag entwickeln, zeigen aber ein deutlich reduziertes Körpergewicht (ZHU et al. 2003) oder schwere Missbildungen und Abnormalitäten und die Trächtigkeit wird abgebrochen (KURE-BAYASHI et al. 2000). Die Erstellung parthenogenetischer Schweineembryonen kann in Kernstransferversuchen eine wichtige Rolle haben, da auch die durch Kerntransfer erstellten Spenderzell-Oozyten-Komplexe aktiviert werden müssen, um eine geregelte Entwicklung durchlaufen zu können (KOO et al. 2000). Parthenogenetische Embryonen lassen sich mit geringem Arbeits- und Zeitaufwand in großer Anzahl erzeugen, und werden deshalb bei Kerntransferversuchen oft als Kontrollgruppen zur Bewertung Qualität der Oozyten, Kultur- und Aktivierungskonditionen eingesetzt (BETTHAUSER et al. 2000). Daher haben sich in den letzten Jahren viele Arbeitsgruppen mit unterschiedlichen Möglichkeiten zur Optimierung der parthenogenetischen Entwicklung beschäftigt. Da physiologisch bei der Befruchtung die intrazytoplasmatischen Ca2+Oszillationen eine zentrale Rolle einnehmen (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998), führen die meisten Aktivierungsprotokolle zur einer intrazytoplasmatischen Ca2+-Erhöhung, die die Befruchtung durch ein Spermium simulieren soll (zum Überblick über die Entwicklungsraten parthenogenetischer Schweineembryonen siehe HÖLKER (2003)). Als physikalischer Reiz wirkt ein elektrischer Gleichstrom-Impuls auf die Eizelle, der eine Öffnung von Membranporen in der Eizelle induziert (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982; PRATHER et al. 1989). In Medien mit hohen Ca2+-Konzentrationen ermöglichen diese Poren einen Ca2+-Influx, der die Aktivierung von Oozyten verschiedener Spezies bewirkt (TARKOWSKI et al. 1970; PRATHER et al. 1989). Des weiteren vermutet man, dass durch den elektrischen Impuls aus den intrazellulären Speichern Calcium freigesetzt wird, was zu einer Erhöhung des Calciumspiegels in Schweineoozyten führt (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982; MACHATY et al. 1999). Eine Hitzebehandlung Schrifttum 27 (KOMAR 1973) kann ebenso wie ein Kälteschock (CHANG 1954; LONGO 1975) artifiziell eine Eizelle aktivieren, nach der eine Entwicklung bis zum Blastozystenstadium möglich ist. Als Erklärung werden im Falle der Temperaturerhöhung Strukturveränderungen der Zellmembran vermutet (WHITTINGHAM 1980), während beim Kälteschock eine Umorganisation der Meiosespindel zur Aggregation der Chromosomen führt, die sich anschließend in einem neuen Kern reorganisieren (LONGO 1974). Unter chemischen Reizen versteht man den Einsatz von Ca2+-Ionophor A23187, Ethanol oder Thimerosal, die über unterschiedliche Mechanismen eine Aktivierung ermöglichen. A23187 transportiert intrazellulär Ca2+-Ionen über Membrankompartimente in das Zytoplasma und löst so die Ausschleusung kortikaler Granula und des zweiten Polkörpers sowie eine weitere Entwicklung aus (KLINE u. KLINE 1992; WANG et al. 1998; WANG et al. 1999). Thimerosal mobilisiert die Ausschüttung von intrazellulärem Calcium, indem es an Rezeptoren Sulfhydrylgruppen oxidiert (SWANN 1991). Jedoch kann hierbei die meiotische Spindel zerstört werden, wenn die Wirkung von Thimerosal nicht nach ~10 Minuten von seinem Antagonisten Dithiolthreitol wieder aufgehoben wird (MACHATY et al. 1997; TAO et al. 2000). Ethanol stimuliert als zeitlich begrenzter Medienzusatz die Bildung von Inositol-3-phosphat (IP3), was ebenfalls durch Ca+-Freisetzung aus den Speichern zu einer präimplantativen Entwicklung führt (CUTHBERTSON 1983; NAGAI 1987). Für biochemische Reize werden Enzyme oder andere Triggersubstanzen verwendet, die über die Aktivierung von Reaktionskaskaden entsprechende Mechanismen in Gang setzen. So stimuliert z.B. die Injektion von Guanosintriphospat (GTP) in Schweineoozyten intrazelluläre G-Proteine, in deren Folge die Phospholipase C (PLC) stimuliert wird, die Synthese von IP3 zu katalysieren (MACHATY et al. 1995). MACHATY et al. (2000) und SAUNDERS et al. (2002) konnten aus Eberejakulaten den sogenannten „Cytosolic Sperm Factor” (CSF) isolieren. Eine Injektion von CSF in Schweineoozyten führte zu ähnlichen Verhältnissen wie bei einer physiologischen Aktivierung mit einer Induktion der Ca2+-Freisetzung, wiederholten Ca2+-Oszillationen, 28 Schrifttum Exozytose kortikaler Granula, Wiederaufnahme der Meiose und Bildung von Vorkernen. Nicht alle biochemischen Substanzen zielen bei der artifiziellen Aktivierung direkt auf die Freisetzung von Calcium ab. Es besteht auch die Möglichkeit, über die Steuerung des Zellzyklus eine Aktivierung zu stimulieren. Die Steuerung des Zellzyklus der Oozyte erfolgt über den „Maturation Promoting Factor“ (MPF), der aus einer Cyclin-abhängigen Kinase (CdK) und dem regulatorischen Cyclin besteht. Nur bei einer kontinuierlichen Produktion von Cyclin ist ein hoher Plasmaspiegel an aktivem MPF gewährleistet. Dieser erlaubt den Übergang aus der G2-Phase in die mitotische M-Phase; dabei sinkt die MPF-Konzentration, und die Eizelle gelangt in die Interphase (ALBERTS et al. 1995). Proteinsyntheseinhibitoren wie Cycloheximide und Puromycin hemmen die Synthese von Cyclin und führen so zu einem Abfall des MPF-Spiegels. Die Cycloheximide und Puromycin aktivieren zwar Eizellen von Mensch und Maus (SIRACUSA et al. 1978), nicht jedoch solche von Rind und Schwein (NUSSBAUM u. PRATHER 1995). Ein zusätzlicher elektrischer (NUSSBAUM u. PRATHER 1995; TANAKA u. KANAGAWA 1997; MARTINEZ DIAZ et al. 2002) oder chemischer (PRESICCE u. YANG 1994) Stimulus zur Erhöhung der intrazytoplasmatischen Ca2+Konzentration ist jedoch wirksamer als die Aktivierung durch biochemische Reize allein. Wird die sogenannte „Mitogen-activated-protein“-Kinase (MAPK), die die Fortsetzung der zweiten Reifeteilung steuert (KUBELKA et al. 2002; LE BEUX et al. 2003), gehemmt, werden die Oozyten aktiviert (ITO et al. 2003). Eine Substanz zur Hemmung allgemeiner Proteinkinasen ist z.B. 6-Dimethylaminopurin (6-DMAP) (FULKA, JR. et al. 1991; JILEK et al. 2001). Außerdem gibt es noch spezielle Inhibitoren der CdK, wie Roscovitine und Butyrolactone, die durch die spezifische Hemmung ebenfalls eine Aktivierung hervorrufen (LE BEUX et al. 2003; BING et al. 2003). Auch hier ergab eine Kombination aus Ca2+-Ionophor und 6-DMAP (ROH u. HWANG 2002; BOQUEST et al. 2002) bzw. Elektrostimulation (GRUPEN et al. 2002; HÖLKER 2003) und 6-DMAP bessere Ergebnisse als die chemische oder elektrische Stimulation allein. Es ist allerdings anzumerken, dass die Ergebnisse unterschiedlicher Arbeitsgruppen nur bedingt miteinander vergleichbar sind, da diese auch durch die Quelle und Qualität der Schrifttum Eizellen, der gewählten Aktivierungsmethode 29 und dem In-vitro-Kulturmedium beeinflusst werden. Durch die stetige Verbesserung der Kulturbedingungen können mittlerweile hohe parthenogenetische Blastozystenraten (z.B. 49,6% (Tag 6); 46,0% und 68,0% (Tag 7)) erreicht werden (NGUYEN et al. 2003; ZHU et al. 2003; BING et al. 2003). Während die Teilungsraten parthenogenetischer Embryonen mit denen von Kerntransfer-Embryonen durchaus vergleichbar sind (~70-90%), liegen die Blastozystenraten parthenogenetischer Embryonen mit ~20-45% deutlich über dem von geklonten Embryonen (KOO et al. 2000; PARK et al. 2001b; ZHU et al. 2002; GRUPEN et al. 2002). Verglichen mit Embryonen, die mittels IVF erstellt wurden, ist die durchschnittliche Kernzahl der Blastozysten bei parthenogenetischen Embryonen geringer (WANG et al. 1998; KOO et al. 2000). Dieser Unterschied beruht vermutlich u.a. auf dem Fehlen des paternalen Genoms (Imprinting-Theorie, s.o.) oder auch dem möglicherweise haploid gebliebenen Chromosomensatz. Daher können parthenogenetische Embryonen zwar in Versuchen eingesetzt, die gewonnenen Erkenntnisse lassen sich jedoch nur in beschränktem Maße auf Kerntransferembryonen bzw. -versuche übertragen. 2.3. Somatisches Klonen beim Schwein 2.3.1. Effizienz des Kerntransfers bei unterschiedlichen Spezies Bis heute ist das Klonen durch somatischen Kerntransfer bei zehn Säugetierspezies gelungen (WILMUT et al. 1997; WAKAYAMA et al. 1998; CIBELLI et al. 1998; BAGUISI et al. 1999; BETTHAUSER et al. 2000; ONISHI et al. 2000; POLEJAEVA et al. 2000; CHESNE et al. 2002; SHIN et al. 2003; ZHOU et al. 2003; WOODS et al. 2003; GALLI et al. 2003). Allerdings wird mit 15-20% lebensfähigen Nachkommen pro übertragenem Embryo nur beim Rind eine höhere Entwicklungsrate erreicht. Bei allen anderen Spezies liegt die Geburtenrate zwischen <1-8% (zur Übersicht: Tabelle 5). Die vergleichsweise hohen Erfolgsraten beim Rind werden unter anderem darauf zurückgeführt, dass die In-vitro-Verfahren und -Protokolle intensiver erforscht und damit ausgereifter sind (DINNYES et al. 2002). Schrifttum 30 Tabelle 5: Spezies Erfolgsraten bisher geklonter Spezies (KUES u. NIEMANN 2004) Anzahl der Nachkommen/ Anzahl übertragener Embryonen Kaninchen <1% Weltweit geschätze Anzahl lebender Klontiere (circa) 6 Erstes gelungenes Experiment Katze <1% 1 SHIN et al. (2003) Maultier ~1% 1 WOODS et al. (2003) Maus <2% ~300 Pferd ~1% 1 GALLI et al. (2003) Ratte ~2% 4 ZHOU et al. (2003) Rind 15-20% ~3000 CIBELLI et al. (1998) Schaf 5-8% ~400 CAMPBELL et al. (1996) Schwein <1% ~250 BETTHAUSER et al. (2000); CHESNE et al. (2002) WAKAYAMA et al. (1998) ONISHI et al. (2000); POLEJAEVA et al. (2000) Ziege 3% ~400 BAGUISI et al. (1999) Im Gegensatz dazu liegen die Entwicklungsraten beim Klonen von Schweinen mit <1% sehr niedrig. Dies liegt unter anderem an der besonderen Reproduktionsbiologie des Schweins, da zum Zeitpunkt der Erkennung der Gravidität durch das Muttertier (Tag 1014) mindestens vier lebensfähige Embryonen vorhanden sein müssen (s. Kap. 2.1.3.). Während nach Übertragung von durch somatischen Kerntransfer erstellten Embryonen auf Empfängertiere beim Schaf bereits erstmals 1997 die Geburt geklonter Nachkommen berichtet wurde (WILMUT et al. 1997), wurde die Geburt der ersten geklonten Ferkel erst im Jahre 2000 publiziert (POLEJAEVA et al. 2000; BETTHAUSER et al. 2000; ONISHI et al. 2000). Seither wurden die Klon- und Kulturtechniken beim Schwein verbessert, und von verschiedenen Arbeitsgruppen sind wiederholt geklonte, teilweise sogar mehrfach transgene Schweine nach Kerntransfer produziert worden (PARK et al. 2001a; LAI et al. 2002a; HÖLKER 2003; RAMSOONDAR et al. 2003; Schrifttum 31 PHELPS et al. 2003; PETERSEN 2004). Auch von kommerzieller Seite (InfigenINC) gibt es Bemühungen, die Effizienz des Klonens beim Schwein zu erhöhen. In Abhängigkeit von der Art der Kernspenderzellen ergaben sich folgende initiale Trächtigkeits- und Abferkelraten: Single-Allel-k.o. Miniaturschwein: 14% und 7%, Doppel-Allel-k.o. Miniaturschwein: 17% und 7%, adulte Zellen Hausschwein: 67% und 60% sowie fetale Zellen Hausschwein: 20% und 20% (FORSBERG 2005). 2.3.2. Einflussfaktoren auf die Effizienz des Kerntransfers und die anschließende Entwicklung des Embryos 2.3.2.1. Das Zyklusstand der Oozyte und Art der Spenderzelle Zytoplasma der Empfängeroozyte ist entscheidend für das „Nuclear Reprogramming“ (hierzu siehe auch Kap. 2.3.2.3.) des übertragenen Zellkerns, wobei der Zellzyklus von Empfänger- und Spenderzelle soweit synchronisiert sein sollten, dass DNA-Schäden vermieden werden (HU et al. 2003). Um Zytofragmentationen durch Chromosomenabnormalitäten oder Polyploidien nach Kerntransfer zu vermeiden, ist außerdem die vollständige Entfernung der gesamten Oozyten-DNA erforderlich (LIU et al. 2002). Dies erfolgt nach Erreichen des Metaphase II-Stadiums, in welchem die Oozyte bereits einen Polkörper ausgeschleust hat, und die Metaphasenplatte in dieser Phase solange verharrt, bis ein Spermium die Fortsetzung der zweiten Reifteteilung induziert (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). In diesem Stadium ist das Zytoplasma der Oozyte in der Lage, diploide Spenderzellkerne in der G1/G0-Phase noch vor der ersten Furchungsteilung zur DNA-Replikation anzuregen (CAMPBELL et al. 1993). Wird bei der Aktivierung des Komplexes eine Ausschleusung der vermeintlich diploiden DNA als Polkörper verhindert, kann eine Normoploidie bei Kerntransferkomplexen aufrechterhalten werden. Als Spenderzellen können unterschiedliche Zelltypen fungieren, wobei zwischen embryonalen (Blastomeren, ICM-Zellen) und fetalen/adulten somatischen Zellen (z.B. Kumuluszellen) unterschieden werden muss (MIYOSHI et al. 2000; UHM et al. 2000). Beim Klonen mit somatischen Zellen werden an den Ablauf des „Nuclear Reprogramming“ erhöhte Anforderungen gestellt. Aufgrund ihrer einfachen Gewinnung Schrifttum 32 und Verfügbarkeit und der Möglichkeit der Kryokonservierung werden besonders adulte und fetale Fibroblasten im Kerntransfer eingesetzt, wobei letztere meist mit einer höheren embryonalen Entwicklungsrate verbunden sind (WILMUT et al. 1997; KATO et al. 2000; LUCAS-HAHN et al. 2002; LEE et al. 2003a). Um beim Kerntransfer einen Oozyten-Fibroblasten-Komplex zu erhalten, der einen diploiden Chromosomensatz enthält, muss sich die Spenderzelle im G0-/G1-Stadium befinden. Zum Überblick über die unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus siehe (HÖLKER 2003). Der Zellzyklus kann mittels Kontaktinhibition, Serumreduktion oder chemische Substanzen (z.B. Mimosin) synchronisiert werden (KUES et al. 2002; VACKOVA et al. 2003). Untersuchungen haben ergeben, dass kleinere Fibroblasten zu einem höheren Anteil in der G1-/G0-Phase sind als die größeren Fibroblasten (BOQUEST et al. 1999; TAO et al. 1999). 2.3.2.2. Kerntransferverfahren Wenn der somatische Kerntransfer nach der „klassischen“ Methode, d.h. mit Einsatz von Mikromanipulatoren durchgeführt wird, werden der gereiften Oozyte mittels einer spitzen Enukleationspipette sowohl der erste Polkörper als auch die DNA in Form der Metaphase II-Platte entfernt (zum Überblick: PRATHER et al. (1999)). Hierbei kommt es immer auch zu einem unterschiedlich großen Verlust von Ooplasma, der nach Möglichkeit so gering wie möglich sein sollte. Neben maternaler mRNA, die während der Oozytenreifung gebildet und gespeichert worden ist (MADDOX-HYTTEL et al. 2005), enthält das Zytoplasma der Eizelle außerdem noch maternale Proteine, die während der initialen Zellteilungen die Spindel bilden; eine Entfernung dieser Bausteine bei der Enukleation könnte mit ein Grund für die Ineffizienz des Kerntransfers sein (GURDON et al. 2003). Während der Enukleation kann es zur Schädigung der Oozyte durch UV-Licht kommen, wenn die Oozyte dieser Strahlung nach Hoechstfärbung zur Enukleationskontrolle kurzfristig ausgesetzt werden. Weitere Belastungen für die Oozyte entstehen durch die Injektion des Karyoplasten in den perivitellinen Raum, den ersten elektrischen Impuls zur Fusion und letztendlich durch den zweiten Impuls zur Aktivierung der fusionierten Komplexe (Abbildung 6). Schrifttum Abbildung 6: 33 Schematische Darstellung der Arbeitsschritte beim „klassischen“ Klonen Andere Methoden zur Erstellung geklonter (Schweine-) Embryonen sind das sogenannte „Hand-Made-Cloning“ (HMC) (VAJTA et al. 2001) und die intrazytoplasmatische Injektion des Karyoplasten (ONISHI et al. 2000). Bei der letzteren Methode wird eine gesamte Spenderzelle mittig im Ooplasma der zuvor entkernten Eizelle abgesetzt. Dadurch entfällt bei dieser Methode die Fusion. Problematisch ist, dass man nach wie vor nicht sicher ist, ob es tatsächlich in allen Fällen zu einer Inkorporation des neuen Zellkerns kommt, obwohl nach Embryotransfer bereits 34 Schrifttum insgesamt fünf Ferkel produziert werden konnten (ONISHI et al. 2000; LEE et al. 2003c). Beim HMC handelt es sich um eine zonafreie und verhältnismäßig schnell durchführbare Methode (KRAGH et al. 2004), die bisher allerdings routinemäßig erst beim Rind etabliert ist (VAJTA et al. 2001; OBACK et al. 2003). Hier wird die Oozyte vor Beginn der Manipulation in Demecolcin inkubiert, einer Substanz, die durch die Erweichung des Zytoskeletts der Oozyte eine „Vorwölbung“ der Metaphase II am Rande der Oozyte bewirkt (YIN et al. 2002; KAWAKAMI et al. 2003). Nach Entfernung der Zona pellucida durch Pronase erfolgt eine manuelle Teilung der Oozyte in Karyo- und Zytoplast. Hierzu ist kein Mikromanipulator nötig, das feine Skalpell kann vorsichtig mit der Hand geführt werden (VAJTA et al. 2001). Die Lysisrate bei dieser Art der Enukleation liegt bei Schweineoozyten bei 10% bis 30% (VAJTA et al. 2005). Anschließend werden zwei Zytoplasten, die durch Inkubation in Phytohämagglutinin „klebrig“ gemacht wurden, sowie ein Fibroblast miteinander fusioniert und aktiviert. Auch hierzu sind keine Mikromanipulatoren nötig; die Fusion erfolgt mittels zweier paralleler Drähte in einer Fusionskammer, zwischen denen die Komplexe durch Anlegen einer geringen Wechselstromspannung zunächst ausgerichtet werden, bevor ein Gleichstrom-Fusionsimpuls gegeben wird (PEURA et al. 1998). (Abbildung 7). Nach der Aktivierung werden die Embryonen bis Tag 7 kultiviert, da erst zu diesem Zeitpunkt die Blastozysten physiologischerweise aus der Zona pelludia schlüpfen. Ein Embryotransfer kommt bei der HMC-Technik nur im Blastozystenstadium in Frage, da es bei früheren Stadien zur Fusion oder auch Trennung der Blastomeren im Eileiter oder Uterus kommen kann (VAJTA et al. 2005). Beim Rind hat sich daher für die Kultur der empfindlichen Rekonstrukte das sogenannte „Well of the Well“-System (WOW) bewährt (VAJTA et al. 2000). Die Anwendung dieser vereinfachten Klontechnik beim Schwein ist jedoch nicht so effizient wie die ursprüngliche Methode. So liegen die Invitro-Entwicklungsraten (Blastozysten an Tag 7) nach HMC beim Schwein bei 4,8% bis 6% (BOOTH et al. 2001; KRAGH et al. 2004). Diese Ergebnisse erlauben bisher keine Übertragung geeigneter porziner Blastozystenstadien auf Empfängertiere, was die Schrifttum weitere Verbesserung des In-vitro-Entwicklungspotentials 35 für Schweineembryonen erforderlich macht. Abbildung 7: Schematische Darstellung der Arbeitschritte beim „Hand-Made-Cloning“ geklonte Schrifttum 36 2.3.2.3. Rolle des sogenannten „Nuclear Reprogramming“ in der frühen Embryonalentwicklung Nach Transfer eines Kerns in eine enukleierte Oozyte beginnen im Kern eine Reihe von Umstrukturierungen, die zur Umprogrammierung des genetischen Programms des übertragenen Kerns in einen frühembryonalen Status führen. Als sichtbare Veränderung werden eine Schwellung des Kerns und das Verschwinden der Nucleoli beschrieben, was allerdings nur nach Transfer in eine gereifte, entkernte Oozyte geschieht; jedoch bei nicht entkernten Zygoten, Zweizellstadien oder entkernten unreifen Oozyten nicht beobachtet wird (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Dies legt die Vermutung nahe, dass nur im Metaphase II-Stadium die entsprechenden regulatorischen Proteine im Zytoplasma vorhanden sind, die der Kern im Austausch mit den eigenen Proteinen aufnimmt (NIEMANN u. MEINECKE 1993; UHM et al. 2000). Parallel zur Kernschwellung und Proteinaustausch erfolgt eine Neuregulation der DNA- und RNASynthese. Da der neue Zellkern aus einer bereits differenzierten Zelle stammt, besitzt er die für das Gewebe typischen morphologischen und funktionellen Eigenschaften. Gleichzeitig jedoch trägt er die gesamte genetische Information des Organismus, aus dem er stammt, wobei die jeweils für das differenzierte Gewebe „wichtigen“ Gene über genetische und epigenetische Mechanismen kontrolliert werden. Das erfolgreiche Klonen von Säugetieren zeigt, dass diese Kontrollmechanismen reversibel sind und die Totipotenz einer Zelle wiederhergestellt werden kann. Dazu muss der Nukleus des durch Klonen rekonstituierten Embryos auf den Genexpressionsstand einer Zygote zurückprogrammiert werden, was als sogenanntes „Nuclear Reprogramming“ bezeichnet wird (SHI et al. 2003). Diese vollständige Rückprogrammierung ist für einen erfolgreichen Kerntransfer von entscheidender Bedeutung. Niedrige Entwicklungsraten und Anomalien bei geklonten Tieren wurden auf eine unvollständige bzw. fehlerhafte Rückprogrammierung zurückgeführt (SHI et al. 2003; PIEDRAHITA et al. 2004). Eine entscheidende Rolle im „Nuclear Reprogramming“ übernehmen epigenetische Mechanismen. Epigenetische Vorgänge beziehen sich nicht auf die Gensequenzen selbst, sondern bezeichnen bestimmte Strukturveränderungen und Reaktionen an Schrifttum 37 bestimmten Genen, sodass deren Genexpression verändert wird (zum Überblick: SHI et al. (2003)). Es liegen allerdings nur wenige Arbeiten zu epigenetischen Mechanismen bei geklonten Schweinen vor (KANG et al. 2001; ARCHER et al. 2003); beim Rind hingegen ist dieses Themengebiet bereits intensiver untersucht worden (DEAN et al. 2001; KANG et al. 2001; MANN u. BARTOLOMEI 2002; SHI et al. 2003). So beobachteten HAN et al. (2003) Abweichungen in Methylierungs-Profilen bei geklonten Rinderembryonen in diversen genomischen Regionen; diese unterschieden sich deutlich vom Methylierungsstatus normaler In-vitro- oder In-vivo-Embryonen. Dies bedeutet, dass geklonte Tiere mit Anomalien, die durch Fehler in der Rückprogrammierung entstanden sind, damit nicht zwingend Fehler im Erbgut, d.h. an den Genen selbst aufweisen müssen. Hier können auch fehlerhafte epigenetische Mechanismen vorliegen und die Nachkommen solcher Tiere wären dann gesund, da hier der Schritt der Rückprogrammierung des Kerns durch das Klonen wegfallen würde. 2.3.2.4. Qualität und Entwicklungspotential der erstellten Oozyten-SpenderzellKomplexe Generell kann man sagen, dass die Qualität der rekonstruierten Komplexe bei der Verwendung in vivo gereifter Oozyten besser ist, weil diese nach wie vor unter besseren Reifungsbedingungen die Metaphase II erreichen als unter In-vitroBedingungen (MOOR et al. 1990). Jedoch führten in den letzten Jahren deutliche Verbesserungen bei der In-vitro-Maturation zu einer weitgehend konstant brauchbaren Ausgangsqualität der Oozyten, wobei die Dauer der Reifung offensichtlich eine wichtige Rolle spielen kann. Unter den Bedingungen im Labor in Mariensee hat sich eine Maturationsdauer von 40 Stunden als besonders geeignet erwiesen (HÖLKER 2003). Diese Qualität ist mitentscheidend für die Weiterentwicklung, sodass die In-vitroKultivierung aktivierter Oozyten parallel zu einem Embryotransfer aktivierter Komplexe bereits einen Anhaltspunkt auf das Entwicklungspotential der jeweiligen „Charge“ geben kann. Oozyten mit unvollständiger zytoplasmatischer Reifung oder Komplexe mit hohen Lysisraten bei Fusion und/oder Aktivierung gehen erfahrungsgemäß mit einer verminderten Entwicklungsfähigkeit einher. Schrifttum 38 Die Bewertung der Qualität der Embryonen erfolgt durch unterschiedliche Methoden. So können Teilungsrate Entwicklungspotential Blastozysten kann und aller durch Blastozystenrate kultivierten einen Embryonen morphologische Anhaltspunkt sein. Beurteilung Die für Bewertung erfolgen das der („expandiert“, „schlüpfend“, „kollabiert“, „deutliches Blastocoel“, „deutliche ICM“ etc.); diese Kriterien sind jedoch relativ subjektiv. Objektivere Parameter sind der sogenannte TUNEL- Assay in Verbindung mit einer Differentialfärbung, was Blastozystenkerne mit fragmentierter DNA und deren Verhältnis zur Gesamtkernzahl darstellt (KARJA et al. 2004). Erst kürzlich etabliert wurde eine weitere Methode, die den Sauerstoff- Verbrauch einzelner Embryonen während der Kultur misst, um daraus Rückschlüsse auf deren Qualität ziehen zu können (LOPES et al. 2005). Untersuchungen von BRISON et al. (2004) ergaben, dass auch der Umsatz von Aminosäuren in Beziehung zur Blastozystenqualität steht; deren Messung während der In-vitro-Kultur könnte so eine Selektion entwicklungsfähiger Embryonen ermöglichen. 2.3.3. In-vitro- und In-vivo-Potential porziner Kerntransferembryonen Die Bewertung des In-vitro-Potentials erfolgt meistens durch die Blastozystenrate, da bei Erreichen dieses Stadiums bereits eine erste sichtbare Differenzierung in ICM und TE stattgefunden hat. Hierzu müssen zuvor die Prozesse innerhalb des Morulastadiums (Kompaktierung, Orientierung der ICM-Zellen) erfolgreich abgeschlossen worden sein (zum Überblick über bisherige Arbeiten siehe Tabelle 6). Bei der In-vivo-Entwicklung zählen Trächtigkeitsrate, Abferkelrate und Wurfgröße zu den wichtigsten Parametern, an denen der Klonerfolg gemessen wird. Tabelle 7 zeigt die bisher erfolgreiche Produktion von Klonferkeln. Schrifttum Tabelle 6: 39 Entwicklungspotential geklonter Schweineembryonen nach In-vitro-Kultur unter Berücksichtigung von Spenderzelltyp, Kulturmedium und Sauerstoffkonzentration AH: adulte Herzzellen, BL-I: Butyrolactone-I, BM: Blastomeren, CC: Kumulus-Zellen, Cyto B: Cytochalasin B, ODC: Ovidukt-Zellen, PAF: porzine adulte Fibroblasten, PFF: porzine fetale Fibroblasten, 6-DMAP: 6-Dimethylaminopurin Autor Reifg. Karyo -plast TAO et al. (1999) In vitro PFF TAO et al. (2000) In vitro PFF VERMA et al. (2000) Aktivierung Fusions -rate Kulturmedium O2Konz. 20% Dauer Teilgs.der rate Kultur 6 Tage 46,3% Blastozystenrate 5,3% Mikroinjektion Thimerosal + (Kern) Dithiothreitol 29,7% (erfolgr. Injekt.) - NCSU 23 NCSU 23 20% 6 Tage 58,8% 10,0% Ionomycin + 6-DMAP - NCSU 23 20% 6 Tage 48,8% 2,5% Impuls - NCSU 23 20% 6 Tage 52,4% 9,4% Impuls + CB Impuls - 20% 20% 6 Tage 6 Tage Ethanol + Cyto B (5h) Mikroinjektion Ethanol + Cyto B (5h) Fusion Simultan mit Fusion - NCSU 23 NCSU 23 (Drops) NCSU 23 20% 7 Tage 59,476,5% 58% 12,3% 6,6%11,6% 15,6% - NCSU 23 20% 7 Tage 40% 5,5% 81,1% NCSU 23 (Drops) 5% 5 Tage - 2,9% Fusion In vitro PFF Fusion In vitro PFF Fusion In vitro CC In vivo PFF Thimerosal + Diethiothreitol Schrifttum KOO et al. (2000) UHM et al. (2000) Technik 39 Schrifttum 40 Entwicklungspotential geklonter Schweineembryonen nach In-vitro-Kultur unter Berücksichtigung von Spenderzelltyp, Kulturmedium und Sauerstoffkonzentration Autor Reifg. Karyo -plast DE SOUSA et al. (2002) In vivo HYUN et al. (2003a) HYUN et al. (2003b) Aktivierung Fusions -rate Kulturmedium O2Konz. PFF Fusion Simultan mit Fusion + Cyto B 56% NCSU 23 20% In vivo PFF Fusion Impuls + Cyto B 73% NCSU 23 20% In vitro PFF; AH Chem. assistierte Enukleation Impuls Impuls + 6-DMAP Impuls + BL-I Impuls + Cycloheximide Ionomycin + 6-DMAP Simultan mit Fusion Impuls + Ionomycin Impuls + Ionomycin + 6-DMAP Simultan mit Fusion - - - In vitro In vitro PFFgfp PFF Fusion Fusion Blastozystenrate 1% 20% 20% Dauer Teilgs.der rate Kultur 4 Tage 16% in vivo >2 Tage in vitro 4 Tage 33% in vivo >2 Tage in vitro 6 Tage 6 Tage - - 20% 20% 6 Tage 6 Tage - 6-10% 6% - - 20% 6 Tage - 7-8% 74-76% NCSU 23 (Drops) NCSU 23 (Drops) NCSU 23 (Drops) 7% 7 Tage 58-69% 18-26% 7% 7 Tage 57-69% 17-23% 7% 7 Tage 59-68% 12-16% NCSU 23 (Drops) 7% 7 Tage 57-69% 13,824,0% 73-74% 74-76% 68-75% 7% 7-9% 7-11% Schrifttum YIN et al. (2002) Technik 40 Fortsetzung von Tabelle 6: Schrifttum Fortsetzung von Tabelle 6: Entwicklungspotential geklonter Schweineembryonen nach In-vitro-Kultur unter Berücksichtigung von Spenderzelltyp, Kulturmedium und Sauerstoffkonzentration Autor Reifg. Karyo -plast LEE et al. (2003a) In vitro Technik Aktivierung Fusions -rate Kulturmedium O2Konz. PFF Fusion 77,5% PAF Fusion 7% 7 Tage 88,1% 7,9% In vitro CC Fusion 7% 7 Tage 94,2% 5,8% In vitro ODC Fusion 7% 7 Tage 85,7% 3,1% In vitro PFF Fusion 7% 7 Tage 87,6% 19,3% In vivo PFF Fusion 7% 7 Tage 85,4% 21,4% In vitro PFF Fusion 7% 7 Tage 47,4% 10,9% 7% 7 Tage 64,2% 21,2% 20% 7 Tage 46% 19% - NCSU 23 (Drops) NCSU 23 (Drops) NCSU 23 (Drops) NCSU 23 (Drops) NCSU 23 (Drops) NCSU 23 (Drops) NCSU 23 + Glucose (Drops) NCSU 23 + Pyr/Lac (Drops) NCSU 23 (Drops) NCSU 23 7% In vitro Simultan mit Fusion Simultan mit Fusion Simultan mit Fusion Simultan mit Fusion Simultan mit Fusion Simultan mit Fusion Simultan mit Fusion Dauer Teilgs.der rate Kultur 7 Tage 87,9% 20% 7 Tage 81,1% 14,8% - NCSU 23 20% 6 Tage 42,7% 11,1% 64,5% NCSU 23 (Drops) 20% 7 Tage 32-60% 73,2% 72,9% 74,2% 81,3% 75,2% 70,0% 76,4% PFF PFF PFFgfp PFF Mikroinjektion (Zelle) Fusion Impuls + Cyto B Impuls + 6-DMAP Fusion Simultan mit Fusion Mikroinjektion Impuls vor (Kern) Kerninjektion; CB - 5,4-7,6% 41 In vitro LEE et al. (2003c) In vitro HÖLKER (2003) In vitro HAO et al. (2003) In KUROME et vivo/ al. (2003) In vitro Blastozystenrate 15,9% Schrifttum LEE et al. (2003b) 41 Schrifttum 42 Autor Entwicklungspotential geklonter Schweineembryonen nach In-vitro-Kultur unter Berücksichtigung von Spenderzelltyp, Kulturmedium und Sauerstoffkonzentration Reifg. Karyo -plast Aktivierung Fusions -rate Kulturmedium O2Konz. Impuls 81-86% NCSU 37 20% Ca2+Ionophor + 6-DMAP Simultan mit Fusion 93% NCSU 23 5% 7 Tage 93% 6% 77,6% NCSU 23 20% 6 Tage 70,9% 7,2% 79,3% 78,5% 79,7% - NCSU 23 PZM-3 PZM-3 NCSU 23 (Drops) NCSU 23 (Drops) 5% 20% 5% 5% 6 Tage 71,5% 12,3% 6 Tage 75,1% 18,8% 6 Tage 70,9% 17,8% 7 Tage 49-53% 9,5-26,4% 20% 6 Tage KAWAKAMI In vitro et al. (2003) PFF KRAGH et al. (2004) In vitro PFF Chem. assistierte Enukleation; Fusion HMC IM et al. (2004) In vitro PFF Fusion LEE et al. (2004) KOO et al. (2004) In vitro PFF Fusion In vitro PFF Fusion Simultan mit Fusion Impuls - Dauer Teilgs.- Blastoder rate zystenKultur rate 7 Tage 59-67% 6,0-7,0% 70,3% 9,8% Schrifttum Technik 42 Fortsetzung von Tabelle 6: Schrifttum Tabelle 7: 43 In-vivo-Entwicklungspotential geklonter Schweineembryonen nach somatischem Kerntransfer AH: adulte Herzzellen, AK: adulte Nierenzellen, Cyto B: Cytochalasin B, FSC: fetale somatische Zellen; GC: Granulosazellen, KT: Kerntransfer, PFF: porzine fetale Fibroblasten, PFF-gfp: porzine fetale Fibroblasten mit dem „green fluorescent protein“, 6-DMAP: 6Dimethylaminopurin Karyoplast Technik Aktivierung POLEJAEVA et al. (2000) In vivo Fusion Impuls ONISHI et al. (2000) In vivo Vorkern aus KT mit GC PFF Impuls + Cyto B 10 20-40 Std. Nach Akt. ~27 10% 1 1 BETTHAUSER et al. (2000) BONDIOLI et al. (2001) PARK et al. (2001a) PARK et al. (2002) LAI et al. (2002a) LAI et al. (2002b) BOQUEST et al. (2002) DE SOUSA et al. (2002) In vitro PFF Mikroinjektion (Kern) Fusion 23 30,4% 2 4 PAF Fusion 44 40,0% 1 2 In vitro PFF Fusion Impuls ? 102 ? 1 5 In vitro PFF Fusion Impuls 5 91 20,0% 1 4 In vitro PFF Fusion Impuls 4 50 25,0% 1 1 In vitro PFF Fusion Impuls 28 113 10,7% 3 7 In vivo PFF Fusion 10 80 50,0% 2 2 In vivo/ In vitro PFF Fusion 44-79 30,3% 1 1 In vitro PFF Fusion Ionomycin + 6-DMAP CB (+ Demecolcin) Impuls 8-76 Std. Nach Akt. ~12 Std. nach Akt. Direkt nach Akt. 3-24 Std. nach Akt. Direkt nach Akt. Direkt nach Akt. 3 Tage nach Akt. Direkt nach Akt. ~129 In vivo Ionomycin + 6-DMAP Impuls ~102 100% 4 28 WALKER et al. (2002) Anzahl Empfg.tiere 10 5 9 6 ÜberEmbryos/ tragene Tier Stadien Direkt ~59 nach Akt. (22-100) Direkt nach Akt. Initiale Trächtigkeit 20% Würfe Geb. insg. Ferkel insg. 1 5 43 Reifg. Schrifttum Autor Schrifttum 44 44 Fortsetzung Tabelle 7: In-vivo-Entwicklungspotential geklonter Schweineembryonen nach somatischem Kerntransfer Reifg. Karyo -plast Technik Aktivierung DAI et al. (2002) YIN et al. (2002) In vitro PFF Fusion Impuls Anzahl Empfg.tiere 39 In vitro AH s. Tab. 5 3 LEE et al. (2003c) HYUN et al. (2003a) In vitro PFF PFF In vitro PFFgfp PFF Impuls + Cyto B Simultan mit Fusion Simultan mit Fusion Impuls 9 In vitro Chemisch assistierte Enukl. Mikroinjektion Fusion RAMSOONDAR et al. (2003) KAWAKAMI et al. (2003) In vivo/ In vitro In vitro PHELPS et al. (2003) HÖLKER (2003) ARCHER et al. (2003a) WATANABE et al. (2004) In vitro AK Fusion Fusion 15 13 20 Impuls + Cyto B 10 PFF Chemisch assistierte Enukl. Fusion Impuls 16 In vitro PFF Fusion 4 In vitro PFF Fusion Impuls + 6-DMAP Impuls In vivo FSC Impuls 11 In vivo FSCgfp Mikroinj. (Kern) Mikroinj. (Kern) Impuls 14 ? ÜberEmbryos/ tragene Tier Stadien 1-4 Std. 163 nach Akt. 12-36 Std. ~234 nach Akt. 20-24 Std. nach Akt. Direkt nach Akt. Direkt nach Akt. 0-24 Std. nach Akt. 24-48 Std. nach Akt. 1- 4 Std. nach Akt. Direkt nach Akt. Direkt nach Akt. 48 Std. nach Akt. 48 Std. nach Akt. Initiale Trächtigkeit 43,6% Würfe Geb. insg. Ferkel insg. 3 6 66,7% 2 11 ~76 67% 3 4 - 66,6% 1 3 - 69,2% 1 2 ~146 35% 3 12 ~267 70% 2 7 ? 62,5% 2 5 ~150 50% 1 4 ? ? 2 9 ~20 - ? 9 (8†) ~120 - ? 4 (1†) Schrifttum Autor Material und Methoden 45 3. Material und Methoden Ziel dieser Arbeit war es, die Effektivität der Embryonalentwicklung nach somatischem Kerntransfer beim Schwein zu verbessern. Da Versuche zur In-vivo-Entwicklung sehr aufwendig sind, wurde zunächst die Verbesserung der In-vitro-Entwicklung angestrebt, um Blastozystenrate und -qualität zu erhöhen. Weiterhin sollte durch eine vorgeschaltete In-vitro-Kultur der Embryonen eine Entkoppelung des Produktionsprozesses vom Embryotransfer erreicht werden, was eine personelle Entlastung bedeuten würde. Neben den Kerntransferembryonen wurden auch parthenogenetische und durch IVF produzierte Embryonen eingesetzt, zum Einen als Standard für eine möglichst gute Invitro-Entwicklung und zusätzlich als Kontrolle der Oozytenqualität. Als Vorversuch galt das Erlernen der Klontechnik, die als etabliert galt, wenn sich geklonte Embryonen reproduzierbar bis zum Blastozystenstadium entwickelten. Als weiterer Vorversuch wurden zunächst einige Durchgänge der In-vitro-Kultur unter verminderter Sauerstoffkonzentration ausschließlich mit parthenogenetisch erstellten Embryonen durchgeführt. Somit konnte anhand der relativ einfacher, schnell und in großen Mengen verfügbaren Embryonen evaluiert werden, ob eine Sauerstoffkonzentration von 5% tendenziell zur Verbesserung der Kulturbedingungen geeignet ist und ob der Aufwand eines Kerntransferversuches gerechtfertigt ist. Im ersten Experiment wurden Kerntransfer-, IVF- und parthenogenetische Embryonen erstellt, die unter variablen Sauerstoffkonzentrationen kultiviert wurden. Als Kontrolle galt hierbei die In-vitro-Kultur bei einer Sauerstoffkonzentration von 20%, die Versuchsgruppen wurden bei ansonsten gleichen Konditionen einer Sauerstoffkonzentration von 5% ausgesetzt. Beim zweiten Experiment wurde auf einen vorgeschalteten Versuchsschritt verzichtet, da vermutet wurde, dass durch Kerntransfer erstellte Embryonen sich in ihrem Stoffwechsel von dem parthenogenetischer und von IVF-Embryonen unterscheiden. Damit wäre der „Test“einsatz parthenogenetischer Embryonen nicht sinnvoll gewesen. Material und Methoden 46 Hierbei wurde die Zusammensetzung des Kulturmediums modifiziert, während die „Kontrollgruppen“ im bisherigen Standardkulturmedium inkubiert wurden. Transfers von Embryonen auf synchronisierte Empfängertiere wurden erst nach erfolgreicher Verbesserung der Embryonenqualität nach In-vitro-Kultur durchgeführt. 3.1. Arbeitsmaterialien 3.1.1. Pipetten Für die Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe wurde eine Pasteurpipette (#747720, Fa. Brand, Wertheim) verwendet, die zuvor über einer Flamme im 130°-Winkel dünn ausgezogen wurde; der Durchmesser der Öffnung betrug ca. 220 µm. Transport und Selektion der gereiften, entkumulierten Oozyten erfolgten mittels Transportpipetten, die aus Schmelzpunktbestimmungsröhrchen (10 x 1,5 mm, #2005, Fa. Assistent) über einer Flamme gerade ausgezogen und in einer Mikroschmiede (Typ de Fronbrune, Fa. Bachhofer, Reutlingen) so gekürzt wurden, dass der Innendurchmesser der Öffnung 180 µm betrug. Für die Mikromanipulation an der Eizelle waren eine Haltepipette sowie Enukleationsund Kerntransferpipetten notwendig. Zur Herstellung der Haltepipetten wurden Schmelzpunktbestimmungsröhrchen (10 x 1,5 mm, #2005, Fa. Assistent) über einer Flamme dünn ausgezogen und an der Mikroschmiede auf einen Innendurchmesser von 125-150 µm gekürzt. Weiterhin wurde dann die scharfkantige Öffnung mit Hilfe eines glühenden Glastropfens bis auf eine kleine Öffnung von ca. 50 µm Innendurchmesser eingeschmolzen und abgerundet. Die Enukleationspipetten, die gleichzeitig auch dem Kerntransfer dienten, wurden aus Glaskapillarröhrchen (Schmelzpunkt- bestimmungsröhrchen, 100 x 1 mm, #9208100, Fa. Omnilab) hergestellt. Dazu wurden diese mit einem automatischen Kapillar-Puller (Micropipette Puller P-87, Fa. Sutter Instrument Co., USA) fein ausgezogen und in der Mikroschmiede so gekürzt, dass der Außendurchmesser bei ca. 25 µm lag. Die Spitze wurde daraufhin in einem 45°-Winkel angeschliffen, anschließend mit Aqua bidest. und 100%igem Ethanol gespült und an Material und Methoden 47 der Mikroschmiede durch einen glühenden Glastropfen mit einer ca. 50 µm langen Spitze (sogenannter „Spike“) versehen. 3.1.2. Medien Der Einsatz der jeweiligen Medien wird im Methodenteil genauer erklärt. Die genaue Zusammensetzung aller Reifungs-, Arbeits-, IVF- und Kulturmedien ist dem Anhang „Zusammensetzung der Medien“ zu entnehmen. 3.2. Spenderzellen für den Kerntransfer 3.2.1. Gewinnung der Spenderzellen Zur Gewinnung porziner Feten wurde eine Sau am Tag 25 der Trächtigkeit geschlachtet. Unmittelbar im Anschluss wurden die Feten aus dem Uterus entnommen, zweimal in PBS gewaschen und in eine mit PBS gefüllte Petrischale (Ø 90 mm, Fa. Greiner Labortechnik, Frickenhausen) überführt. Nach Dekapitation, Evisceration sowie Amputation der Extremitäten wurde der verbleibende Corpus mittels zweier Kanülen der Stärke 18 Gauge (Microlance 3, Fa. Becton Dickinson, Drogheda, Irland) in 1-2 mm große Stücke zerteilt. Parallel dazu wurden in Zellkulturflaschen (T25-Zellkulturschale, Tissue Culture Flask, #9025, Fa. TPP/Schweiz) jeweils 12 recalcifizierte Plasmatropfen (4/5 FBS, Fetal Bovine Serum, #10270-106, GIBCO™, Fa. Invitrogen Corporation, South America, sowie 1 /5 CaCl2) mithilfe einer Pasteurpipette aufgebracht. In diese Plasmatropfen wurden einzelne Gewebestückchen übertragen. Danach verblieben die Zellkulturflaschen zur Agglutination für 20 min. in einem 38°C-warmen Brutschrank (Hera Cell, Typ BB16, Fa. Heraeus Instruments, Hanau). Anschließend wurde den Zellkulturflaschen Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) + 10% FBS hinzugegeben; der Medienwechsel erfolgte alle 2-3 Tage. Wenn die auswachsenden Fibroblasten einen Hof von zwei Zentimetern erreicht hatten, wurden sie subkultiviert und die entsprechenden Aliquots wurden später in Eppendorf-Cups (Micro Test Tubes, Safe Lock 1,5 ml, Fa. Eppendorf, Hamburg) eingefroren, wobei dem Medium 10% Dimethylsulfoxid (DMSO, #D2605, Fa. Sigma, St. Louis, USA) als Kryoprotektivum zugesetzt wurde. Das Einfrieren erfolgte zunächst durch eine 24stündige Zwischenlagerung bei -80°C, erst danach wurden die Aliquots in flüssigen Stickstoff 48 Material und Methoden (-196°C) überführt. Die für die folgenden Versuche verwendeten Fibroblasten stammten alle von einem Fetus und waren drei- bis viermal passagiert worden. 3.2.2. Kultivierung und Wachstum Um Spenderzellen für den Kerntransfer zu erhalten, wurden die Eppendorf-Cups mit den aliquotierten fetalen Fibroblasten 5-6 Tage vor dem Kerntransfer im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und durch mehrmaliges Waschen von DMSO befreit. Anschließend wurden die Zellen auf einer Zellkulturschale (Tissue Culture Test Plates 6, #92406, Fa, TPP/Schweiz) in DMEM + 10% FBS ausgesät. 48 Stunden vor dem Kerntransfer wurde zusätzlich zur teilweise bereits erfolgten Kontaktinhibition eine Serumreduktion induziert. Hierzu wurde die Zellen in einem Medium kultiviert, das nur 0,5% Serum enthielt. 3.2.3. Präparation für den Kerntransfer Am Transfertag wurde das Medium der Zellkultur abgesaugt und am Boden anhaftende Fibroblasten zweimal mit jeweils 2-3 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden die Fibroblasten zur Ablösung für 10-20 Minuten mit 0,5 ml einer 10%igen EDTA/TrypsinLösung (#T-4174, Fa. Sigma, St. Louis, USA) in PBS inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden in 3 ml TL-Hepes 296 Ca2+-frei und 100 µl FCS aufgenommen und nach einigem Auf- und Abpipettieren in einem Zentrifugenröhrchen (10 ml PP Tubes, Cellstar®, #188261, Fa. Greiner bioone, Frickenhausen) bei 1000 rpm und Raumtemperatur drei Minuten zentrifugiert (Megafuge 1.0, Fa. Heraeus Instruments, Hanau). Nach Absaugen des Überstandes und Auflockerung des Pellets durch „scratching“ des Zentrifugenröhrchens, wurde dieser Prozeß nochmals wiederholt, allerdings nur in TL-Hepes 296 Ca2+-frei, ohne Zusatz von FCS. Anschließend wurde das so entstandene gewaschene Pellet mit 1 ml TL-Hepes 296 Ca2+-frei resuspendiert und in ein Eppendorf-Cup überführt, welches in einem Brutschrank (Brutschrank Inkubat Typ 80/85, MELAG Jürgens oHG, Berlin) warmgehalten wurde. Material und Methoden 3.3. Eizellen als Empfängerzellen für den Kerntransfer 3.3.1. Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen 49 Zur Gewinnung großer Mengen von Oozyten präpubertaler Jungsauen wurden Ovarien kommerziell geschlachteter Tiere (unbekannte Herkunft, wechselnde Betriebe) unmittelbar nach dem Ausweiden aus der Körperhöhle entnommen und in ein auf 39°C vorgewärmtes Thermogefäß überführt. Der Transport vom Schlachthof Lübbecke zum Institut (Entfernung ca. 80 km) erfolgte auf schnellstmöglichem Wege und dauerte ca. eine Stunde. Bei Ankunft der Ovarien wurde die Temperatur registriert (~32°C) und die Ovarien mit 38°C-warmer physiologischer Kochsalzlösung mit antibiotischem Zusatz abgespült. Die Follikelflüssigkeit mit den darin enthaltenen KOK und Follikelwandzellen wurde mit Hilfe einer 18-Gauge-starken Nadel (Microlance 3, Fa. Becton Dickinson, Drogheda, Irland) aus 2-8 mm großen Follikeln aspiriert. Die aspirierte Flüssigkeit wurde mit Hilfe einer Vakuumpumpe (VM AR-5100, Fa. Cook, Queensland 4113, Australien) in sterile Auffangbehälter (50 ml Zentrifugenröhrchen, Fa. Greiner Labortechnik, Frickhausen, Deutschland) geleitet. Im Anschluss an die Aspiration wurde das gesammelte Punktat (bestehend aus Follikelflüssigkeit, Kumulus-OozytenKomplexen, Zellen) mit PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Salt Solution, #D-6650, Fa. St. Louis, MO, USA) + 1% NBCS (New Born Calf Serum) aufgefüllt und 10 Minuten zum Absedimentieren der KOK stehen gelassen. Nach dem Abgießen des Überstandes wurde das entstandene Sediment nochmals mit PBS + 1% NBCS gewaschen und das dann entstandene Pellet in kleinen Tropfen in eine Petrischale (Ø 90 mm, Fa. Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Deutschland) gegeben und dort jeweils mit ca. 10 ml steriler PBS + 1% NBCS aufgefüllt. Bei ca. 40facher Vergrößerung konnten so KOK guter Qualität (mindestens 2-3 Kumuluszelllagen und Oozyten mit homogenem Zytoplasma) mithilfe einer ausgezogenen Pasteurpipette (s.o.) für die Reifung selektiert werden, die mehrmals in sterilem PBS + 1% NBCS gewaschen wurden. Alle Arbeitsschritte mit KOK oder Oozyten (auch bei folgend aufgeführten Arbeitsschritten) unter dem Stereomikroskop fanden auf beheizten Arbeitsplatten (Microscope Stage HAT200, Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) statt, die auf eine Temperatur von 39°C eingestellt waren. Material und Methoden 50 3.3.2. In-vitro-Reifung Für die In-vitro-Reifung wurden 2 ml steriles North Carolina State University (NCSU) 37Medium verwendet, das sich zur Reifung porziner Oozyten bewährt hat (HÖLKER 2003). Diesem Medium wurden porzine Follikelflüssigkeit, Cystein, Glutamin, Mercaptoethanol und Epidermal Growth Factor (EGF) zugesetzt. Außerdem wurde während der ersten 22 Stunden der Reifung mit EGF, cAMP und hCG/eCG supplementiert. Das Gesamtvolumen wurde jeweils zu 500 µl in die Wells einer 4-WellZellkulturschale (Nunclon™, #176740, Fa. Brand Products, Dänemark) pipettiert. Nach einmaligem Waschen in ca. 2 ml NCSU 37-Medium wurden ca. 110-120 KOK mittig in ein Well überführt und bei 38,5°C, 5% CO2 in Luft und 95% relativer Feuchte inkubiert (Function Line Typ BB 16, Heraeus Instruments, Hanau). Nach 22 Stunden erfolgte ein Medienwechsel in NCSU 37-Medium mit EGF-Zusatz, jedoch ohne cAMP und hCG/eCG, in dem die KOK weitere 18 Stunden inkubiert wurden, sodass die Gesamtreifungsdauer 40 Stunden betrug. 3.3.3. Präparation für den Kerntransfer/Parthenogenese 40 Stunden nach Beginn der Reifung wurden die KOK in eine vorbereitete Petrischale (Ø 35 mm, Fa. Greiner Labortechnik, Frickenhausen) mit 2 ml TL-Hepes 296-Medium + Ca2+ und 0,1% Hyaluronidase (#H-3506, Fa. Sigma, St. Louis, USA) überführt und darin fünf Minuten im Brutschrank belassen. Danach erfolgte eine mechanische Entkumulierung der aufgelockerten KOK, indem diese wiederholt auf- und abpipettiert wurden. Nach Ablösung aller Kumuluszellen wurden die Oozyten zügig in ein weiteres Schälchen TL-Hepes 296 + Ca2+ überführt; dieser Waschvorgang wurde zweimal wiederholt. Zur Erstellung parthenogenetischer Embryonen wurden Oozyten mit feingranuliertem, homogenen Zytoplasma in 300 µl TL-Hepes 296 + Ca2+ unter Öl (Silicone fluid DC200, #35135, Fa. Serva Biochemica, Heidelberg) übertragen und bis zur Aktivierung im CO2begasten Brutschrank aufbewahrt. Weiterhin wurden für die Erstellung von Kerntransfer-Embryonen Eizellen mit homogenem Zytoplasma und einem gut Material und Methoden 51 sichtbaren Polkörper im perivitellinen Raum selektiert, die ebenfalls in TL-Hepes 296 + Ca2+ unter Öl verbracht wurden. 3.4. Kerntransfer 3.4.1. Entkernen Hauptarbeitsmedium war das TL-Hepes-Medium 296 + Ca2+, in dem das Entkumulieren vorgenommen wurde (s.o.), die Oozyten bzw. Komplexe gewaschen und jeweils nach den entsprechenden Arbeitsschritten aufbewahrt wurden. Bei allen invasiven Vorgängen an den Oozyten wurden Ca2+-freie Medien verwendet (TL-Hepes-Medium 296 Ca2+-frei bzw. TL-Hepes-Medium 271 Ca2+-frei). Hierzu wurden ca. 12 Oozyten zunächst für 10 Minuten in TL-Hepes 296 Ca2+-frei mit 7,5 µg/mlCytochalasin B (#C-6762, Fa. Sigma, St. Louis, USA) und 5 µg/ml Hoechstfarbstoff 33342 inkubiert. Der Farbstoff lagert sich an die DNA an und macht sie so unter UV-Strahlung blau fluoreszierend sichtbar. Unter dem Mikroskop (Axiovert 135, Fa. Zeiss, Göttingen) des Mikromanipulators wurde ein Objektträger vorbereitet, auf dem 75 µl-Tropfen TL-Hepes 296 + Ca2+ mit 7,5 µg/ml Cytochalasin B unter Öl fixiert wurden. In diese wurden die Oozyten anschließend verbracht. Die Mikromanipulationseinheit bestand auf der linken Seite aus einem Manipulator (#11520138, Fa. Leitz, Wetzlar) zur Führung der Haltepipette, sowie auf der rechten Seite aus einer elektronischen Einheit (LN-MINI 25 XYZ motorisch, Fa. Luigs & Neumann, Ratingen), mit der die Enukleationspipette gesteuert wurde. Nun wurden die Oozyten einzeln jeweils von der Haltepipette mittels Unterdruck fixiert und so ausgerichtet, dass der Polkörper zwischen „4 und 5 Uhr“ aufzufinden war. Durch kurzzeitiges Abdunkeln des Hellfeldes und gleichzeitige Bestrahlung mit UV-Licht konnte die Position von Polkörper- und Metaphase II-DNA im Zytoplasma überprüft werden. Danach erfolgte die Entfernung des Polkörpers und der Metaphasen II-Platte durch Absaugen des angrenzenden Zytoplasmas mit der Enukleationspipette; eine anschließende ebenfalls kurzmöglichste UV-Bestrahlung diente der Kontrolle, ob das gesamte DNA-Material aus der Eizelle entfernt worden war. Erfolgreich entkernte Oozyten wurden innerhalb des Tropfens so platziert, dass keine Verwechslung mit noch nicht entkernten Oozyten möglich war. Nach der Enukleation wurden die Oozyten Material und Methoden 52 einmalig in TL-Hepes 296 + Ca2+ gewaschen, in einen TL-Hepes 296 + Ca2+-Tropfen unter Öl verbracht und im Brutschrank aufbewahrt. Einen Überblick über das Vorgehen bei der Enukleation zeigen die Abbildungen 8-12. 3.4.2. Transfer einer Kernspenderzelle Nachdem genügend entkernte Oozyten produziert worden waren (pro Versuchstag ca. 70-75 Stück), wurden diese in Gruppen zu je 10 Oozyten für 10 Minuten in TL-Hepes 296 Ca2+-frei mit 7,5 µg/ml Cytochalasin B unter Öl eingesetzt und daraufhin in 75 µlTropfen TL-Hepes 296 Ca2+-frei mit 7,5 µg/ml Cytochalasin B auf den Objektträger pipettiert. Auf dem Objektträger befand sich auch ein Tropfen mit der zuvor erstellten TL-Hepes 296 Ca2+-frei-Fibroblasten-Suspension, sodass hier zunächst 1-5 Zellen in die Transferpipette aufgenommen werden konnten; bei der Auswahl der Fibroblasten wurde auf kleine Zellen mit glatter, abgerundeter Oberfläche und einem homogenen Zytoplasma geachtet. Nach der Fixierung der jeweiligen Oozyte an der Haltepipette konnte ein einzelner Fibroblast in den perivitellinen Raum zwischen Oozytenmembran und Zona pellucida abgesetzt werden, wobei nach Möglichkeit die Öffnung zur Injektion genutzt wurde, die zuvor schon durch die Perforation der Zona pellucida während der Enukleation entstanden war. Des weiteren sollte so wenig umgebendes Medium wie möglich in den perivitellinen Raum gelangen. Nach erfolgtem Transfer der Spenderzellen wurden diese nach einmaligem Waschen in 300 µl-Tropfen TL-Hepes 271 Ca2+-frei unter Öl verbracht und ungefähr 5-30 Minuten nach der Fibroblasteninjektion in 20er Gruppen zur Fusion entnommen. Die Abbildungen 13-15 zeigen das Vorgehen bei der Injektion des Fibroblasten in den perivitellinen Raum. 3.4.3. Fusion der Oozyten-Spenderzell-Komplexe Die Fusionseinheit bestand aus zwei mit den Enden einander zugewandten Elektroden, die an ein Fusionsgerät (CFA 400, Elektro Zellfusion, Fa. Krüss, Hamburg) angeschlossen waren. Diese Elektroden waren durch zwei manuelle Mikromanipulatoren rechts und links vom Mikroskop steuerbar. Die Fusionskammer bestand aus einem mit Öl überschichteten 1000 µl-Tropfen SOR2-Medium Ca2+-frei, der auf einer Petrischale (Ø 90 mm, Fa. Greiner Labortechnik, Frickenhausen) Material und Methoden 53 Abbildung 8: Lage des Polkörpers auf „5 Uhr“ (Pfeil) nach Ausrichtung der entkumulierten Oozyte Abbildung 9: Unter UV-Licht deutlich fluoreszierender Polkörper (unten) und Metaphase II (oben) im benachbarten Zytoplasma Abbildung 10: Entfernung von Polkörper und Teilen des Zytoplasmas inkl. Metaphase II aus der Metaphase II-Oozyte 54 Material und Methoden Abbildung 11: Entfernung von Zytoplasma und Polkörper aus der Enukleationspipette Abbildung 12: Kontrolle auf vollständige Entfernung aller DNA-Bestandteile aus der Oozyte unter UV-Licht (außerhalb der Oozyte erkennbar) Abbildung 13: Positionierung des Fibroblasten direkt an der Pipettenspitze (Pfeil), um die Übertragung von Medium weitestgehend zu verhindern Material und Methoden 55 Abbildung 14: Absetzen des Fibroblasten (Pfeil) im perivitellinen Raum Abbildung 15: Oozyte nach erfolgreichem Transfer der Spenderzelle; Zustand vor der Fusion aufgetragen wurde. In diesen Tropfen ragten die beiden Elektrodenenden hinein; ihr durchschnittlicher Abstand betrug ca. 200 µm (bei beidseitigem Kontakt zur Oozyte). Die Fibroblasten-Oozyten-Komplexe wurden zunächst (meist auch in Gruppen zu 10 Komplexen) in 2 ml SOR2 Ca2+-frei pipettiert und darin ca. eine Minute bis zum Absinken auf den Boden der Petrischale belassen. Danach erfolgte der Transfer in den Fusionstropfen. Nacheinander wurden nun jeweils die Oozyten-Spenderzell-Komplexe mithilfe der beweglichen Elektroden so positioniert, dass der Fibroblast auf „3 oder 9 Uhr“ sichtbar war, das heißt, dass der Stromfluss im 90°-Winkel zur Kontaktfläche der Material und Methoden 56 beiden Zellmembranen verlief. Jeder einzelne Komplex erhielt in dieser Position einen Gleichstrom-Impuls von ~0,44 kV/cm über 99 µs. Anschließend wurden die Fibroblasten-Oozyten-Komplexe in TL-Hepes 296 + Ca2+-Medium gewaschen und einzeln in 30 µl-Tropfen unter Öl verbracht; diese Tropfen befanden sich in Petrischalen, die individuell gekennzeichnet wurden, sodass jeder Komplex kontrolliert und zugeordnet werden konnte. 3.4.4. Elektrische und chemische Aktivierung Ungefähr eine Stunde nach der Fusion wurden die Komplexe auf den Fusionserfolg überprüft. Dabei wurde unter einem Stereomikroskop (Olympus SZ-PT, Fa. Olympus optical CO., Japan) kontrolliert, ob der Fibroblast vollständig von der Oozyte aufgenommen worden war. Der Anteil nicht fusionierter Komplexe, lysierter Eizellen oder Fibroblasten wurden protokolliert und vor den folgenden Arbeitsschritten aussortiert. Die rekonstruierten Komplexe wurden nun in 30er Gruppen zunächst für eine Minute in SOR2-Medium + Ca2+ unter Öl präinkubiert. Anschließend wurden sie in einen 400 µlTropfen desselben Mediums überführt, der im Bereich der Elektrodrähte auf die Aktivierungskammer (Bügel-Fusionskammer, Fa. Krüss, Hamburg) aufgetragen worden war. Die rekonstruierten Komplexe wurden so abgelegt, dass sie in einer Reihe zwischen den parallelen Drähten platziert waren. Die elektrische Aktivierung erfolgte durch einen einmaligen Gleichstrom- Impuls von 1 kV/cm über 45 µs. Anschließend wurden die aktivierten Komplexe einmalig in TL-Hepes 296 + Ca2+ gewaschen und zur Aufbewahrung in 500 µl desselben Mediums pipettiert. Nach der elektrischen Aktivierung wurden alle Komplexe durch eine dreistündige Inkubation in 500 µl NCSU 23 mit 2 mM 6-Dimethylaminopurin (Le Beux, 2003 48 /id) im Brutschrank bei 38,5°C und 5% CO2 in Luft chemisch aktiviert (Function Line Typ BB 16, Heraeus Instruments, Hanau). Material und Methoden 3.5. Die 57 Erstellung parthenogenetischer Embryonen zuvor (s.o.) zur Erstellung parthenogenetischer Embryonen selektierten enukleierten Oozyten wurden im Anschluss an die elektrische Aktivierung der Kerntransfer-Embryonen aktiviert. Hierzu wurde zuvor der SOR2 + Ca2+-Tropfen auf der Aktivierungskammer ausgewechselt, da dieser nicht durch Überschichtung mit Öl vor Verdunstung geschützt war. Um eine gleichbleibende Osmolarität des Aktivierungsmediums zu gewährleisten, wurde zügig gearbeitet und der Tropfen außerdem stets nach zwei Aktivierungsdurchgängen mit je 30 Oozyten gewechselt. Das Procedere entsprach der oben beschriebenen Vorgehensweise bei der Aktivierung der Kerntransferkomplexe. Die Inkubation der Oozyten in NCSU 23 + 2 mM 6-DMAP erfolgte pro 500 µl maximal in 60er-Gruppen. 3.6. In-Vitro-Fertilisation mit aufgetautem Nebenhodenschwanzsperma 3.6.1. Vorbereitung der Oozyten Die Oozyten, die für die IVF vorgesehen waren, wurden nach 40stündiger Reifung ausschließlich durch mäßig starkes Auf- und Abpipettieren mechanisch entkumuliert. Hierbei sollten die Kumuluszellen jedoch nicht vollständig entfernt werden; für die IVF wurden solche Oozyten herausgesucht, die ein homogenes, feingranuliertes Zytoplasma sowie ca. 2-4 Kumuluszelllagen aufwiesen. Diese Oozyten wurden nun nach zweimaligem Waschen in Gruppen zu 60 in 90 µl-Tropfen Fert-Talp-KomplettMedium unter Öl verbracht. 3.6.2. Aufbereitung und Präparation der Spermien Bei allen IVF-Versuchen wurde Tiefgefrier-Sperma verwendet, wobei in allen Versuchsdurchgängen Nebenhodenschwanzsperma des Ebers „Bruno“ verwendet wurde, dessen Fertilität erwiesen war. Die Sperma-„Portionen“ wurden nach Gewinnung in Pailletten (sogenannte „Straws“) überführt und in flüssigem Stickstoff (-196°C) gelagert. Die Aufbereitung des eingefrorenen Spermas erfolgt durch Auftauen des Straws in 39°C warmem Wasser (ca. ein bis zwei Minuten). Anschließend wurde die Material und Methoden 58 Luftblase zu der Seite geschlagen, an der der Straw mit einer Schere geöffnet wurde. Die Spermaportion wurde in 10 ml warme Androhep- Lösung gegeben und für drei Minuten bei 1500 U/min zentrifugiert (Megafuge 1.0, Fa. Heraeus Instruments, Hanau). Der Überstand wurde abgesaugt und das entstandene Pellet wurde mit 400 µl FertTalp-Komplett-Medium resuspendiert. Hiervon wurden 10 µl in 90 µl Aqua dest. pipettiert; 10 µl davon wurden auf eine Thoma-Zählkammer zur Bestimmung der Dichte übertragen. Weitere 10 µl der Fert-Talp-Komplett-Spermien-Suspension wurden auf einen Objektträger gegeben, um unter dem Lichtmikroskop die Motilität zu beurteilen; diese sollte mindestens 50% betragen. Daraufhin konnte die benötigte Spermiendichte mittels folgender Berechnung bestimmt und das entsprechende Volumen der Suspension mit Fert-Talp-Komplett-Medium auf 100 µl aufgefüllt werden. Berechnung: Gewünschte Spermienanzahl pro Eizelle: 750 Sp/Ooz; d.h. bei 60 Oozyten in 90 µl Medium sollen 10 µl Spermien-MediumSuspension hinzugegeben werden; diese muss dementsprechend eine Dichte von 45 000 Sp/Ooz in 10 µl aufweisen. Volumen der zu erstellenden Suspension: 100 µl, d.h. 450 000 Sp/Ooz in 100 µl. n= Anzahl der in der Thomazählkammer gezählten Spermien Dichte: n x 10/0,04 = X 450 000 x 1000 µl/X = Volumen der Suspension [µl], die mit FertTalp-Komplett-Medium auf 100 µl aufgefüllt werden muss. 3.6.3. In-vitro-Fertilisation Aus der so entstandenen verdünnten Spermien-Suspension wurden jeweils 10 µl in den 90 µl-Tropfen Fert-Talp-Komplett-Medium unter Öl pipettiert. Die Petrischalen (Ø 35 Material und Methoden 59 mm, Fa. Greiner Labortechnik, Frickenhausen) wurden für den Befruchtungvorgang bei 38,5°C und 5% CO2 in Luft inkubiert (Function Line Typ BB 16, Heraeus Instruments, Hanau) und bis zur endgültigen Kultivierung der fertilisierten Embryonen darin belassen (~12 Stunden). Vor Beginn der Kultivierung wurden die IVF-Zygoten zusammen aus den Fert-TalpMedium-Tropfen entnommen, und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren wurden die restlichen Kumuluszellen und anhaftende Spermien entfernt. Im Anschluss daran wurden sie zweimal in 2 ml Fert-Talp-Medium gewaschen, bevor sie in vitro kultiviert wurden. 3.7. In-vitro-Kultivierung 3.7.1. Allgemeine Kulturbedingungen Vor Beginn der Embryokultur wurde das entsprechende Medium (s.u.) mindestens eine Stunde im CO2-begasten Brutschrank äquilibriert. Daher wurden die entsprechenden Petri- und Zellkulturschalen bereits am Morgen des Versuchstages vorbereitet und verblieben bis zur Nutzung im Inkubator. Die Kultivierung erfolgte in 4-WellZellkulturschalen (Nunclon™, #176740, Fa. Brand Products, Dänemark), wobei jedes Well 500 µl Kulturmedium enthielt. Die Temperatur betrug 38,5°C bei 5% CO2 in Luft und 95% relativer Feuchte. Die Kultivierung erfolgte im sogenannten „offenen System“, d.h., das Medium in den Kulturschalen wurde nicht mit Öl überdeckt. Alle Embryonengruppen (Kerntransfer, IVF und Parthenogenese, jeweils Kontroll- und Versuchsgruppe) wurden zunächst zweimal in 2 ml des entsprechenden Mediums gewaschen, bevor sie in Kultur gesetzt wurden. Maximal wurden 60 Embryonen pro 500 µl Medium kultiviert. 3.7.2. Versuch 1: Veränderungen der umgebenden Kulturatmosphäre (Vergleich 20% vs. 5% Sauerstoff) Im ersten Experiment (I) wurde der Einfluss zwei unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen auf die In-vitro-Entwicklung von Schweineembryonen untersucht. Hierzu wurden die drei Embryonengruppen (Kerntransfer, IVF und Material und Methoden 60 Parthenogenese) jeweils in zwei Untergruppen geteilt, wovon eine Untergruppe bei 5% CO2 in Luft (~20% Sauerstoff) kultiviert wurde; diese Embryonen stellten die „Kontrollgruppe“ dar. Die andere Untergruppe wurde als Versuchsgruppe unter verminderter Sauerstoffspannung kultiviert. Hierzu wurden die entsprechenden 4-WellSchalen in eine Kulturschale (Nuclear Incubation Chamber; Billups- Rothenberg inc., California, USA) verbracht, die anschließend mit einem Gasgemisch von 5% CO2, 5% O2 und 90% N2 befüllt und geschlossen und zusammen mit den Kontrollgruppen für 6 Tage im Brutschrank inkubiert wurde. 3.7.3. Versuch 2: Modifizierung des Kulturmediums Im zweiten Experiment (II) wurden alle Embryonengruppen in der verminderten Sauerstoffkonzentration von 5% kultiviert. Für den diesen Versuch wurde das StandardKulturmedium NCSU 23 dahingehend modifiziert, dass Glucose (5,55 mM) durch 0,2 mM Laktat und 2,0 mM Pyruvat ersetzt wurde, dieses Medium wurde als modifiziertes NCSU 23 (mNCSU 23) bezeichnet. Die Kontrollgruppen wurden weiterhin in NCSU 23 inkubiert, während die jeweiligen Versuchsgruppen durchgängig mNCSU 23 ausgesetzt waren. Des weiteren wurde eine Glucoselösung angesetzt, von der 58 Stunden nach Beginn der In-vitro-Kultivierung 10 µl in jedes Kulturwell mit 500 µl mNCSU 23 pipettiert wurden; die Endkonzentration der Glucose im modifizierten Medium betrug 5,55 mM. Zu beachten ist, dass es sich bei dieser Kultivierungsmethode nicht um ein „two- stepculture“-System im eigentlichen Sinne handelt. Bei diesem würden die Embryonen zum Medienwechsel aus dem bisherigen in ein neues Medium pipettiert werden. Um diesen massiven Eingriff zu vermeiden, verbleiben die frühembryonalen Stadien bei der hier vorgestellten Methode in dem modifizierten Medium; die zu supplementierende Glucose wird direkt hinzugegeben. Der Zeitpunkt der Kultivierung der verschiedenen Embryonengruppen im Verhältnis zum Beginn der Reifung, Beginn der IVF, Beginn der Mikromanipulation etc. soll anhand der folgenden Zeitschemata veranschaulicht werden (Abbildungen 16 und 17). Material und Methoden 3.8. Beurteilung der In-vitro-Entwicklung 3.8.1. Blastozystenrate 61 Die Beurteilung der Entwicklung aller Embryonen erfolgte am Tag 6 der Kultur spätnachmittags bzw. abends, also 144 Stunden nach der Aktivierung. Embryonen, die das Aussehen einer Hohlkugel besaßen, Blastocoel und ICM erkennen ließen, wurden morphologisch als Blastozysten beurteilt. Blastozyten, die bei der anschließenden Kernzählung weniger als 10 Kerne aufwiesen, wurden unter „übrige Embryonalstadien“ aufgeführt. Die Zahl der als Blastozyste eingestuften Embryonen wurde durch die Gesamtzahl der kultivierten Embryonen geteilt und das Ergebnis als Blastozystenrate definiert. 3.8.2. Qualität der Blastozysten Die Qualität der Blastozysten wurde anhand der Gesamtkernzahlen beurteilt. Weiterhin wurden im Anschluss an die regulären Versuchsdurchgänge noch weitere Versuche mit demselben Aufbau durchgeführt, um die dabei produzierten Blastozysten mittels „Differential Staining“ anzufärben und den Anteil an ICM- und TE-Zellen zu beurteilen. 3.8.2.1. Auszählung der Kerne mittels Hoechstfärbung Nach Färbung der DNA mit Hoechst 33342, einem basophilen Farbstoff, der sich an die entsprechenden Molekülgruppen der Doppelhelix anlagert, wurden die Embryonen in kleinen Medientropfen (NCSU 23 bzw. mNCSU 23 + 5 µg/ml Hoechst) auf einen gereinigten Objektträger (Microscope Slides, 76 x 26 mm, Fa. Menzel-Gläser, Braunschweig) aufgetragen. Die Fixierung erfolgte durch Deckgläschen (24 x 32 mm, Fa. Menzel-Gläser, Braunschweig), die durch leichtes Andrücken eine Quetschung der Embryonen und somit eine bessere Übersicht ermöglichten. Um ein völliges Auseinanderlaufen der Kerne eines Embryos durch den Quetschvorgang zu verhindern, wurden Deckgläschen und Objektträger mittels eines dünnen Vaselinefilms auf Abstand gehalten. Unter dem Fluoreszenzmikroskop (Olympus Bx20F-3, Fa. Olympus Optical CO., Japan) mit integrierter UV-Dampfleuchte (Modell U-ULS100HG, Fa. Olympus Optical CO., Japan) konnten die Kernzahlen pro Embryo ermittelt werden. Material und Methoden 62 Die Kernzahlen aller Blastozysten sowie aller übrigen Embryonen wurden jeweils addiert und durch die Gesamtzahl aller Blastozysten bzw. übrigen Embryonen dividiert. Das Ergebnis ergab die durchschnittliche Kernzahl der Blastozysten bzw. übrigen Embryonen. Embryonen, die zwei oder mehr Kerne aufwiesen, wurden als „geteilt“ eingestuft; deren Anzahl wurde durch die Gesamtzahl aller Embryonen dividiert und das Ergebnis als Teilungsrate definiert. 3.8.2.2. Bestimmung von ICM und Trophectoderm mittels Differential-Färbung Neben der Gesamtkernzahl ist das Verhältnis zwischen ICM- und TrophectodermZellen ein weiteres wichtiges Qualitätsmerkmal für Blastozysten. Die selektive Darstellung dieser Zelltypen ist mittels Differentialfärbung möglich. Hierbei wurden die Trophectoderm-Zellkerne als „non-vital“ rot angefärbt, die ICM-Zellkerne als „vitale“ Zellen waren blau gefärbt. Zur Auswertung wurden ein kleiner Tropfen Glycerol auf einen Objektträger gegeben, der Embryo wurde mit möglichst wenig umgebender Flüssigkeit hineinplatziert und mit einem Deckgläschen überdeckt. Bei einem Anregungsfilter von 410 nm und einem Sperrfilter von 365 nm konnten die Zelltypen differenziert werden. | | | | | | Stunde 0 1 5 7 8 11 Kerntransfer Entkumulierung Beginn der Mikromanipulation Fusion Aktivierung (elektr./chem.) Kultvierung Aktivierung (elektr./chem.) Kultvierung Parthenogenese Entkumulierung IVF Entkumulierung Beginn IVF Kultivierung Abbildung 16: Übersicht über Beginn der Arbeitsschritte an den jeweiligen Embryonengruppen und Beginn der In-vitro-Kultur Material und Methoden Tag 63 | | | | | | –2 -1 0 ½ 3 6 Glucose- Supplementation Ende Reifung Beginn Medienwechsel Entkumulierung & Versuchsbeginn In-vitro-Kultur Beginn (Versuch II) Abbildung 17: Übersicht über Beginn von Reifung, Versuchsbeginn und In-vitro-Kulturdauer 3.9. Beurteilung der In-vivo-Entwicklung 3.9.1. Möglichkeiten des Embryotransferzeitpunktes 3.9.1.1. Zygotenstadium Die in der Arbeitsgruppe in Mariensee etablierte Methode des Embryotransfers ist die sofortige Übertragung der rekonstruierten Komplexen direkt nach Abschluss der chemischen Aktivierung. Hierbei besteht nicht die Möglichkeit, zwischen entwicklungskompetenten und potentiell retardierten Embryonen zu unterscheiden. Daher muss eine hohe Anzahl der Kerntransferembryonen transferiert werden (ca. 100150 Komplexe/Sau). 3.9.1.2. 4- bis 8-Zell-Stadium In zwei Versuchsdurchgängen wurden in vitro kultivierte geklonte Embryonen im 4- bis 8-Zellstadium (Tag 3) übertragen und ermöglichten so die Unterscheidung zwischen vitalen und degenerierten oder retardierten Embryonen. Die In-vitro-Kultur der Embryonen erfolgte in NCSU 23 unter einer Sauerstoffspannung von 5%. An Tag 3 nach Beginn der In-vitro-Kultivierung wurden nur diejenigen Embryonen für den Embryotransfer herangezogen, die das erwartete Entwicklungsstadium erreicht hatten (4- bis 8-Zeller). Material und Methoden 64 3.9.1.3. In zwei Blastozystenstadium weiteren Versuchsdurchgängen wurden die Kerntransferembryonen durchgehend für 6 Tage unter den für optimal befundenen Bedingungen inkubiert, d.h. in modifizierten NCSU 23 und unter verminderter Sauerstoffkonzentration. Parallel dazu wurden ca. 60 parthenogenetische Embryonen in vitro kultiviert, was einerseits der Kontrolle der Oozytenqualität diente und andererseits ebenfalls Blastozysten hervorbringen sollte, die im Falle einer zu geringen Anzahl an KerntransferBlastozysten als sogenannte „Helfer“-Embryonen die Etablierung einer Trächtigkeit unterstützen sollten. 3.9.2. Synchronisation der Empfängertiere Bei den Empfängertieren für den Transfer von Embryonen handelte es sich um ca. 90 kg schwere, präpuberale, geschlechts- und allgemeingesunde Jungsauen der deutschen Landrasse aus der institutseigenen Schweineversuchsanlage. Aufgrund der eventuell unzureichenden Entwicklungsgeschwindigkeit der In-vitro-Embryonen wurden die Sauen so vorbehandelt, dass sie im Verhältnis zur den Embryonen im Zyklus ein (4bis 8-Zellstadien; Blastozysten) bis zwei (Blastozysten) Tage zurückterminiert waren. Das asynchrone Anspritzschema der Sauen ist Abbildung 18 zu entnehmen. Zu jedem Embryotransfertermin wurden zwei Sauen nach dem oben aufgeführten Muster vorbereitet, auf Rausche kontrolliert und bei deutlichen Rauschesymptomen als geeignet für den Embryotransfer befunden. 3.9.3. Embryotransfer von Kerntransferembryonen An den jeweiligen OP-Tagen wurden eine halbe Stunde vor OP-Beginn die kultivierten Embryonen aus dem Brutschrank entnommen und entsprechend ihrer Stadien selektiert und in TL-Hepes-Medium 296 + Ca2+ gesammelt. Blastozysten wurden anschließend in Transferschläuche (Harnkatheter für Kleintiere, #760-122, Gr. 2, Ø 2,1 mm, Farbcode: grün, Länge 50 cm, gekürzt auf ~25 cm; Fa. Heiland, Hamburg), die 4- bis 8-Zellstadien in sterile Plastik-Straws (Paillette Cristal 133, Ref ZA 176, L’Aigle, Frankreich) aufgezogen. Für den Transport zum Ort des Embryotransfers wurden die Straws in Material und Methoden Übertragung von… 65 …4- bis 8-Zellstadien …Blastozysten (einen Tag asynchron) (zwei Tage asynchron) 1200 I.E. PMSG Samstag, 22:00 Uhr Sonntag, 19:00 Uhr Dienstag, 22:00 Uhr Mittwoch, 19:00 Uhr (Intergonan® i.m.) 500 I.E. hCG (Ovogest® i.m.) Kerntransfer; Mittwoch Mittwoch Beginn der In-vitroKultur Ovulation des Empfängertieres Embryotransfer Donnerstag, 16:00 Uhr Samstag, 16:00 Uhr Freitag, 13:00 Uhr Dienstag, 13:00 Uhr Abbildung 18: Übersicht über die Vorbereitung der Empfängertiere für den Embryotransfer der unterschiedlichen Stadien einem 38°C-warmen Thermogefäß (Embryo-Gefäß, MT 35/42, Minitüb GmbH, Tiefenbach) verwahrt. Der Transfer der Embryonen erfolgte chirurgisch. Hierzu wurden die anästhesierten Tiere in Rückenlage auf dem OP-Tisch fixiert und beckenwärts hochgelagert. Zwischen den beiden letzten Zitzenpaaren in der Linea alba wurde die Bauchhöhle eröffnet, der Uterus aufgesucht und die Anzahl der Gelbkörper beider Ovarien ermittelt. Bei der Übertragung von 4- bis 8-Zellstadien wurde der Straw vorsichtig über den Fimbrientrichter in den Eileiter eingeführt und die Embryonen dort vorsichtig abgesetzt. Der Transfer von Blastozysten erfolgte über die stumpfe Perforation der Uterushornspitze und nachfolgender Einführung des Schlauches in das Uteruslumen, wo die Blastozysten abgesetzt werden. Nach erfolgter Übertragung aller Kerntransfer-Embryonen wurde der Uterus zurückverlagert und die Bauchhöhle durch Bauchfell-, Muskel-, Unterhaut- und Hautnaht verschlossen. Die antibiotische Versorgung des operierten Tieres erfolgte anschließend systemisch über die intramuskuläre Gabe von Tardomycel® (Fa. Bayer, Leverkusen). Material und Methoden 66 3.9.4. Aufrechterhaltung der Trächtigkeit Zur Aufrechterhaltung der Trächtigkeit erhielt jedes Empfängertier am neunten Tag nach dem Kerntransfer 1000 I.E. PMSG (Intergonan®, Fa. Intervet, Tönisvorst) intramuskulär, sowie 72 Stunden später 500 I.E. hCG (Ovogest®, Fa. Intervet, Tönisvorst) intramuskulär zur Induktion eines weiteren Follikelwachstums und nachfolgender Gelbkörperbildung. Die Trächtigkeitsuntersuchung erfolgte bei allen Sauen zwischen Tag 22 und 35 der Trächtigkeit mittels eines Ultraschallgerätes (Real-time Ultraschallgerät Modell CS 9100, Fa. Picker International GmbH, Espelkamp). Zusätzlich wurden umrauschende Sauen vermerkt, die dennoch sonographisch kontrolliert wurden. 3.10. Statistische Auswertung Die statistische Auswertung des Vorversuches sowie der Zusatzversuche zur Differential-Färbung erfolgte mithilfe des Programms „Sigma Stat for Windows® Version 2.0“. Für den Blastozystenraten, Vorversuch wurden Teilungsraten und hier zunächst die durchschnittlichen Blastozystenkernzahlen aus allen Versuchsdurchgängen jeweils für 5% bzw. 20% Sauerstoff ermittelt und als Mittelwert und Standardabweichung dargestellt. Die mittleren Blastozystenraten [%], Teilungsraten [%] und Blastozystenkernzahlen [n] der Versuchsgruppen wurden mittels t-Test miteinander verglichen. Bei den Zusatzversuchen zur Differentialfärbung wurden sowohl die Mittelwerte und Standardabweichungen der Gesamtzellzahlen [n] als auch des Verhältnisses der ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl [%] ermittelt und innerhalb der Embryonengruppen (Kerntransfer, IVF, Parthenogenese) mittels t-Test miteinander verglichen. Die statistische Auswertung beider Hauptversuche erfolgte durch das Programm „SAS for Windows® Version 8.10“. Die jeweiligen Mittelwerte und Standardabweichungen der Blastozystenraten [%], Teilungsraten [%] und Blastozystenkernzahlen [n] der Embryonengruppen und Versuchsuntergruppen wurden ermittelt und anschließend im Material und Methoden 67 Rahmen einer Varianzanalyse (ANOVA) miteinander verglichen. Die gemittelten Blastozysten- und Teilungsraten [%] wurden zusätzlich hinsichtlich der Unterschiede zwischen Versuchs- und Kontrollgruppen innerhalb der jeweiligen Embryonengruppen mit dem Chi Square-Test analysiert. Unterschiede zwischen den Gruppen galten ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤ 0,05 als signifikant bzw. ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤ 0,001 als hochsignifikant. Ergebnisse 68 4. Ergebnisse Die Ergebnisse beziehen sich auf den Vorversuch mit parthenogenetischen Embryonen, die beiden In-vitro-Hauptversuche, die mit Kerntransfer-, IVF- und parthenogenetischen Embryonen durchgeführt wurden, sowie auf vier Embryotransferversuche. Mit dem Parthenogenese-Vorversuch sollte überprüft werden, ob der Aufwand eines Kerntransferversuchs gerechtfertigt ist, d.h. ob eine Verbesserung der Embryonalentwicklung unter verminderter Sauerstoffkonzentration erreicht werden kann. Dieser Vorversuch fand im November/Dezember 2003 statt. Das erste In-vitro-Hauptexperiment zur Untersuchung des Entwicklungspotentials von Kerntransfer-Embryonen bei veränderter Sauerstoffspannung wurde im Zeitraum vom März bis zum Mai 2004 durchgeführt. Das zweite Hauptexperiment zur Beurteilung der Embryonalentwicklung geklonter Schweineembryonen in einem modifizierten Kulturmedium unter Berücksichtigung spezifischer Metabolismusaspekte fand von Mai bis Juli 2004 statt. Im Regelfall konnten pro Woche zwei Versuchsdurchgänge durchgeführt werden; bei allen Versuchen erfolgte die Auswertung sechs Tage nach Beginn der In-vitro-Kultur. So ergaben sich für beide Hauptversuche zusammengenommen 22 auswertbare Versuchsdurchgänge mit einer Gesamtzahl von jeweils 1042, 2438 und 2512 eingesetzten Kerntransfer-, IVF- und parthenogenetischen Embryonen. Die Anzahl der in vitro gereiften Oozyten betrug für beide Hauptversuche ca. 16.000 (~720/Versuchsdurchgang). 4.1. Vorversuch: Entwicklung parthenogenetisch erstellter Embryonen unter verminderter Sauerstoffspannung In diesem Versuch wurden pro Versuchstag ca. 120 parthenogenetische Embryonen erstellt, nach der Aktivierung zufällig in zwei Gruppen à 60 Embryonen aufgeteilt und in NCSU 23 kultiviert. Die Kontrollgruppe war im Brutschrank einer Atmosphäre von 5% Ergebnisse 69 CO2 in Luft (~20% Sauerstoff) ausgesetzt, die Versuchsgruppe wurde innerhalb des Brutschranks in einer Kulturschale mit einem Gemisch von 5% CO2, 5% Sauerstoff und 90% Stickstoff begast. Die Anzahl der Versuchsdurchgänge betrug 12. 4.1.1. Blastozystenraten Die Blastozystenrate der unter 20% Sauerstoff kultivierten Embryonen war höher als die der Embryonen unter 5% Sauerstoff, jedoch war dieser Unterschied nicht signifikant (siehe Abbildung 19). Abbildung 20 zeigt parthenogenetische Blastozysten nach 6tägiger In-vitro-Kultivierung unter 5% Sauerstoff. 4.1.2. Durchschnittliche Kernzahlen Die durchschnittliche Kernzahl in Blastozysten der Versuchsgruppe (5% Sauerstoff) betrug 30,6± 3,8 und war damit signifikant höher als die durchschnittliche Anzahl der Zellen in Blastozysten der Kontrollgruppe (20% Sauerstoff) mit 24,1± 1,7 (Tabelle 8). Die Teilungsraten beider Gruppen waren annähernd gleich (Tabelle 8). Tabelle 8: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittliche Zahl der Zellen in parthenogenetischen Blastozysten unter 20% O2 vs. 5% O2; a:b p≤ 0,05 Versuchsgruppe n Teilungsrate Ø-Zellzahl in Blastozysten 5% Sauerstoff 691 85,8± 4,4 30,6± 3,8a 20% Sauerstoff 678 85,9± 6,3 24,1± 1,7b Die Verminderung parthenogenetischer der Sauerstoffkonzentration Embryonen führte zu einer während der signifikanten In-vitro-Kultur Erhöhung der durchschnittlichen Zellzahlen in Blastozysten; die Blastozystenraten beider Gruppen unterschieden sich jedoch nicht signifikant voneinander. Ergebnisse Blastozystenrate [%] 70 50 40 30 35,1 30,3 20 10 0 20%1O2 5%2 O2 Abbildung 19: Blastozystenrate parthenogenetisch erstellter Embryonen unter verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen Abbildung 20: Parthenogenetische Blastozysten an Tag 6 der In-vitro-Kultivierung unter 5% Sauerstoff Ergebnisse 4.2. Versuch 1: 71 Veränderung der Sauerstoff-Konzentration während der In-vitro-Kultivierung In diesem Versuch wurden pro Versuchsdurchgang Kerntransfer-, IVF- und parthenogenetische Embryonen erstellt und gleichzeitig in Kultur verbracht. Die Anzahl der Versuchsdurchgänge betrug 12, wobei anzumerken ist, das hierbei ein Durchgang bei der Gruppe „Kerntransfer, 5% Sauerstoff“ aufgrund von Kontaminationen nicht bewertet werden konnte. 4.2.1. Entwicklung rekonstruierter Kerntransferkomplexe Hierzu wurden innerhalb eines definierten Zeitlimits (ca. 8± 1 Std. vom Beginn der Enukleation bis zur Aktivierung) möglichst viele Oozyten-Spenderzell-Komplexe erstellt, wobei stets mindestens eine Gesamtzahl von 40 Komplexen angestrebt wurde. Diese wurden nach der Aktivierung in zwei Gruppen aufgeteilt (jeweils mindestens 20 Komplexe pro Gruppe), die dann entweder unter 5% oder 20% Sauerstoffspannung im Brutschrank kultiviert wurden. Die Fusionsrate betrug in diesem Experiment 85,5%. Die Auswertung erfolgte an Tag 6 der In-vitro-Kultur; die Abbildungen 21 und 22 zeigen Kerntransferembryonen aus den verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen nach Hoechstfärbung. Abbildung 21: Kerntransferembryo mit ~46 Kernen nach 6tägiger In-vitro-Kultur unter reduziertem Sauerstoffgehalt (5%) in der Kulturatmosphäre Ergebnisse 72 Abbildung 22: Kerntransferembryo mit ~23 Kernen nach 6tägiger In-vitro-Kultur unter 5% CO2 in Luft (20% Sauerstoff) Die Blastozystenrate der unter 5% Sauerstoff kultivierten Embryonen waren mit 19,2% ± 8,9 signifikant höher als die Rate der Blastozysten der unter 20% Sauerstoff kultivierten Embryonen mit 6,7% ± 5,9. Graphisch ist dies in Abbildung 24 dargestellt, in der alle Versuchgruppen vergleichend abgebildet sind. Während die Teilungsraten beider Gruppen sich kaum unterschieden, konnte in der durchschnittlichen Kernzahl der Blastozysten eine signifikante Verbesserung unter dem Einfluss von 5% Sauerstoff beobachtet werden (Tabelle 9). Tabelle 9: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittlichen Zellzahlen in Blastozysten bei rekonstruierten Kerntransferembryonen unter 20% O2 vs. 5% O2; a:b p≤ 0,05 Versuchsgruppe n Teilungsrate Ø-Zellzahl in Blastozysten 5% Sauerstoff 250 78,8± 7,5 25,8± 10,3a 20% Sauerstoff 279 73,8± 13,8 17,7± 12,1b 4.2.2. Entwicklung der IVF-Embryonen Zur Erstellung der IVF-Embryonen wurden ca. 120 Oozyten mit aufbereitetem Nebenhodenschwanzsperma in vitro fertilisiert. Nach dem Befruchtungsvorgang wurden sie in zwei Gruppen à 60 Zygoten aufgeteilt und unter 5% bzw. 20% Sauerstoff kultiviert. Die Auswertung erfolgte an Tag 6 der In-vitro-Kultur (Abbildung 23). Ergebnisse 73 Abbildung 23: IVF-Embryo mit ~93 Kernen an Tag 6 der In-vitro-Kultivierung unter 5% Sauerstoffgehalt Wie Abbildung 24 zu entnehmen ist, ließ die verminderte Sauerstoffkonzentration auch bei den IVF-Embryonen eine signifikant höhere Blastozystenrate (30,3% ±6,7) als bei einer Sauerstoffkonzentration von 20% (22,8%± 11,0) erkennen. Während auch hier die Teilungsraten annähernd gleich waren, unterschied sich die durchschnittliche Anzahl der Zellen in Blastozysten ebenfalls signifikant voneinander; der reduzierte Sauerstoffgehalt war mit einer Erhöhung der Zellzahlen verbunden (Tabelle 10). Tabelle 10: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittliche Zellzahl in Blastozysten bei IVF-Embryonen unter 20% O2 vs. 5% O2; a:b p≤ 0,05 Embryonengruppe n Teilungsrate Ø-Zellzahl in Blastozysten 5% Sauerstoff 701 77,9± 9,6 33,8± 5,0a 20% Sauerstoff 710 76,9± 15,2 27,1± 5,8b 4.2.3. Bei Entwicklung parthenogenetischer Embryonen einer Sauerstoffkonzentration von 5% wurde eine signifikant höhere Blastozystenrate (39,0%±10,9) beobachtet als bei einer Sauerstoffkonzentration von 20% (28,7%± 9,6) (Abbildung 24). Wie Tabelle 11 zu entnehmen ist, unterschieden sich die parthenogenetischen Embryonen der beiden Versuchsgruppen (5% vs. 20% O2) hinsichtlich der durchschnittlichen Blastozystenkernzahl nicht signifikant voneinander. Die Teilungsraten beider Gruppen waren annähernd gleich. Ergebnisse 74 Tabelle 11: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittliche Zellzahl in Blastozysten bei parthenogenetischen Embryonen unter 20% O2 vs. 5% O2; a:b p≥ 0,05 Embryonengruppe n Teilungsrate Ø-Zellzahl in Blastozysten 5% Sauerstoff 729 84,8± 7,8 29,8± 2,5a 20% Sauerstoff 723 81,5± 8,8 25,1± 2,9b b 20% Sauerstoff Blastozystenrate [%] 50 5% Sauerstoff 40 a a b b 30 20 a 10 0 NT IVF Parthenogenese Abbildung 24: Vergleichende Darstellung der Blastozystenraten aller Embryonengruppen nach Invitro-Kultur unter verschiedener Sauerstoffkonzentrationen; a:b p≤ 0,05 Unter einer verminderten Sauerstoffkonzentration von 5% war eine signifikante Erhöhung der Blastozystenrate aller Embryonengruppen (Kerntransfer, IVF, Parthenogenese) festzustellen (Abbildung 24). Die durchschnittliche Kernzahl der Blastozysten erhöhte sich signifikant bei Kerntransfer- und IVF-Embryonen in der Atmosphäre mit reduziertem Sauerstoffgehalt. Ergebnisse 4.2.4. 75 Verhältnis von Inner-Cell-Mass- und Trophectoderm-Zellen Zur Untersuchung des Verhältnisses von ICM- und TE-Zellen wurden zusätzlich einige Versuchsdurchgänge mit allen Embryonengruppen unter 5% bzw. 20% Sauerstoff der In-vitro-Kultur wiederholt. Nach 6 Tagen In-vitro-Kultur wurden die Blastozysten einer Differential-Färbung unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 aufgeführt. Tabelle 12: Darstellung des Verhältnisses der ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl [%] aller Embryonengruppen (5% vs. 20% O2); a:b p≤ 0,05; c:d p≥ 0,05 Embryonengruppe O2- Blasto- Ø- Ø- Ø- Verhältnis Konz. zysten Anzahl Anzahl Gesamt- ICM zur [%] (n) ICM- TE- zellzahl Gesamt- Zellen Zellen (n) zellzahl [%] Kerntransfer 5 10 4,2 28,4 32,6±18,6 13,6± 8,2c Kerntransfer 20 8 3,0 17,5 20,5±8,7 15,2± 10,8d IVF 5 13 8,5 29,5 38,0±12,8 22,6± 8,3a IVF 20 11 6,4 35,7 42,1±10,4 15,6± 7,4b Parthenogenese 5 19 7,0 28,8 35,8±13,3 18,1± 8,5c Parthenogenese 20 14 5,3 20,3 25,6±6,3 19,8± 10,8d Bei den Kerntransferembryonen waren sowohl in der Anzahl der ICM-Zellen als auch im Verhältnis der ICM- zu den TE-Zellen unter 5% Sauerstoff im Vergleich zu 20% Sauerstoffgehalt keine Unterschiede festzustellen. Das Verhältnis der ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl der IVF-Embryonen war unter verminderter Sauerstoffkonzentration signifikant höher (22,6%± 8,3) als unter 5% CO2 in Luft (15,6%± 7,4) (siehe auch Abbildungen 25 und 26). Bei parthenogenetisch erstellten Embryonen war hinsichtlich des Verhältnisses ICM/Gesamtzellzahl, kein signifikanter Unterschied festzustellen (5% O2 vs. 20% O2: 18,1%± 8,5 vs. 19,8%± 10,8). 76 Ergebnisse Abbildung 25: IVF-Embryo nach Differential-Färbung (~10 ICM-Zellen (blau), ~22 TE-Zellen (rot)) an Tag 6 der In-vitro-Kultur unter reduziertem Sauerstoff Abbildung 26: IVF-Embryo nach Differential-Färbung (~9 ICM-Zellen (blau), ~32 TE-Zellen (rot)) an Tag 6 der In-vitro-Kultur unter 20% Sauerstoffgehalt Die Kultivierung der Embryonen unter verminderter Sauerstoffspannung ergab demnach in allen Embryonengruppen keine Verschlechterung des ICM-Zell-Anteils an der Gesamtzellzahl. Bei der Gruppe der IVF-Embryonen konnte sogar eine signifikante Erhöhung der ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl beobachtet werden. Ergebnisse 4.3. Versuch 2: 77 Modifikation des Kulturmediums in vitro unter Berücksichtigung des Glucosestoffwechsels frühembryonaler Stadien In diesem Versuch wurden pro Versuchsdurchgang Kerntransfer-, IVF- und parthenogenetische Embryonen erstellt und gleichzeitig in vitro kultiviert. Die Anzahl der Versuchsdurchgänge betrug 10, wobei aufgrund von Kontaminationen einzelner Kulturwells bei den Gruppen „IVF-NCSU 23/-mNCSU 23“, „NT-NCSU 23“ und „Parthenogenese-NCSU 23“ nur 9 Durchgänge ausgewertet werden konnten. Die Auswertung erfolgte bei allen Gruppen an Tag 6 nach Beginn der In-vitro-Kultivierung. Die Blastozystenraten aller Embryonengruppen werden vergleichend in Abbildung 27 dargestellt. 4.3.1. Entwicklung rekonstruierter Kerntransferembryonen Wie in Versuch 1, wurden möglichst 40 Komplexe erstellt, so dass nach der Aktivierung zwei Untergruppen mit jeweils ~20 Komplexen in NCSU 23 bzw. mNCSU 23 kultiviert werden konnten; den Embryonen im mNCSU 23-Medium wurde 58 Stunden nach Beginn der Kultur 5,55 mM Glucose zugesetzt. Die Fusionsrate betrug hier 86,2%. Bei der Auswertung der Kerntransfer-Embryonen konnte eine signifikante Erhöhung der Blastozystenrate der in mNCSU 23 kultivierten Embryonen gegenüber der Blastozystenrate der Kontrollgruppe in NCSU 23 festgestellt werden (31,5%± 11,0 vs. 21,8%± 7,6; siehe Abbildung 27). Die durchschnittliche Zellzahl der Blastozysten war zwar in dem modifizierten Medium geringfügig höher (31,5± 5,3), unterschied sich aber nicht signifikant von der Kernzahl der Blastozysten in der Kontrollgruppe NCSU 23 (29,2± 4,3); die Teilungsraten wiesen ebenfalls keine signifikanten Unterschiede auf (siehe Tabelle 13). Ergebnisse 78 Tabelle 13: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittlichen Kernzahlen in Blastozysten bei Kerntransfer-Embryonen (mNCSU 23 vs. NCSU 23); a:b p≥ 0,05 Versuchsgruppe n Teilungsrate Ø-Zellzahl in Blastozysten modifiziertes NCSU 23 271 86,4± 7,4 31,5± 5,3a NCSU 23 242 82,7± 10,3 29,2± 4,3b 4.3.2. Entwicklung der IVF-Embryonen Entsprechend Versuch 1 wurden hier ebenfalls ca. 120 Oozyten pro Versuchstag in vitro fertilisiert und anschließend nach Aufteilung in Gruppen mit jeweils ca. 60 Zygoten in NCSU 23 oder mNCSU 23 kultiviert; die Glucosezugabe zum mNCSU 23-Medium erfolgte 58 Stunden nach Beginn der In-vitro-Kultur. Sowohl Teilungsraten, Blastozystenraten und durchschnittliche Blastozystenkernzahlen waren ohne signifikante Unterschiede zwischen beiden Medien (Abbildung 27, Tabelle 14). Tabelle 14: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittliche Kernzahlen in Blastozysten bei IVF-Embryonen (mNCSU 23 vs. NCSU 23); a:b p≥ 0,05 Versuchsgruppe n Teilungsrate Ø-Zellzahl in Blastozysten modifiziertes NCSU 23 521 91,0± 6,1 26,7± 3,9a NCSU 23 506 88,2± 6,7 28,4± 3,2b 4.3.3. Entwicklung parthenogenetischer Embryonen Wie bereits im Vorversuch und in Versuch 1 beschrieben, wurden hier nach der Aktivierung der Oozyten zwei Gruppen mit ca. 60 Oozyten zur Kultur auf die jeweiligen Medien (NCSU 23 bzw. mNCSU 23) verteilt und im Brutschrank inkubiert. Die Glucosezugabe zum mNCSU 23-Medium erfolgte wie bei den Kerntransfer- und IVFEmbryonen 58 Stunden nach Beginn der In-vitro-Kultur. Die Analyse der Blastozystenraten der in NCSU 23 bzw. in mNCSU 23 (d.h. mit Glucosezugabe nach 58 Stunden) kultivierten Embryonen ergab keine signifikanten Unterschiede (43,4%± 5,3 vs. 43,8%± 9,8) (siehe Abbildung 27). Auch die Ergebnisse 79 durchschnittlichen Kernzahlen der Blastozysten beider Kulturgruppen waren annähernd gleich (NCSU 23: 26,7± 4,5 vs. mNCSU 23: 25,9± 5,2; Tabelle 15). Tabelle 15: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittliche Zellzahlen in Blastozysten bei parthenogenetisch erstellten Embryonen (mNCSU 23 vs. NCSU 23); a:b p≥ 0,05 Versuchsgruppe n Teilungsrate Ø-Zellzahl in Blastozysten modifiziertes NCSU 23 549 94,5± 3,2 25,9± 5,2a NCSU 23 511 86,6± 6,5 26,7± 4,5b NCSU 23 Blastozystenrate [%] 50 mNCSU 23 b 40 30 a 20 10 0 NT IVF Parthenogenese Abbildung 27: Vergleichende Darstellung der Blastozystenraten aller Embryonengruppen nach Invitro-Kultur in NCSU 23 bzw. mNCSU 23; a:b p≤ 0,05 Die Zugabe von Glucose 58 Stunden nach Beginn der In-vitro-Kultur hatte hinsichtlich der Blastozystenrate bei den Kerntransferembryonen einen positiven Effekt (Abbildung 27); bei den IVF- und parthenogenetischen Embryonen war in mNCSU 23 im Vergleich zum Kontrollmedium NCSU 23 keine Veränderungen zu erkennen. Die 80 Ergebnisse durchschnittliche Kernzahl der Blastozysten als Qualitätsmerkmal zeigte bei beiden Kulturmedien in allen Embryonengruppen keine signifikanten Unterschiede. 4.3.4. Zur Verhältnis von Inner-Cell-Mass- und Trophectoderm-Zellen Untersuchung der Verteilung von ICM- und TE-Zellen wurden einige Versuchsdurchgänge mit allen Embryonengruppen und entsprechenden Untergruppen aus NCSU 23 bzw. mNCSU 23 wiederholt. Nach 6 Tagen In-vitro-Kultur wurden die Blastozysten einer Differential-Färbung unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 aufgeführt. Tabelle 16: Darstellung des Verhältnisses der ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl [%] aller Embryonengruppen (mNCSU 23 vs. NCSU 23) Embryonen- Medium gruppe Blasto- Ø- Ø- Ø- Verhältnis zysten Anzahl Anzahl Gesamt- ICM zur (n) ICM- TE- zellzahl Gesamt- Zellen Zellen zellzahl [%] Kerntransfer mNCSU 23 15 7,7 32,8 40,7± 14,9 18,7± 7,9 Kerntransfer NCSU 23 6 7,8 35,3 43,2± 11,1 16,8± 13,7 IVF mNCSU 23 18 7,2 24,6 31,8± 12,9 23,3± 14,0 IVF NCSU 23 14 5,4 27,5 34,9± 14,6 15,7± 10,7 Parthenogen. mNCSU 23 17 7,5 26,0 33,5± 11,9 23,8± 10,2 Parthenogen. 16 6,9 25,5 34,9± 12,3 20,1± 7,6 NCSU 23 Aus Tabelle 16 ist ersichtlich, dass innerhalb der Kerntransfer-, IVF- und Parthenogenese-Gruppen (mNCSU 23 vs. NCSU 23) bezüglich der Gesamtzellzahlen sowie des Verhältnisses ICM/Gesamtzellzahl keine signifikanten Unterschiede vorhanden waren. Der prozentuale Anteil der ICM-Zellen an der Gesamtzellzahl blieb also in beiden Kulturmedien gleich groß. Abbildungen 28 und 29 zeigen Kerntransferund IVF-Embryonen mit Differentialfärbung nach 6tägiger Kultur in mNCSU 23. Ergebnisse 81 Abbildung 28: Kerntransfer-Embryo aus mNCSU 23 mit ~10 ICM-Zellen (blau) und ~55 TE-Zellen (rot) Abbildung 29: IVF-Embryo aus mNCSU 23 mit ~6 ICM-Zellen (blau) und ~28 TE-Zellen (rot) 4.4. In-vivo-Potential von Kerntransferembryonen nach Embryotransfer Das In-vivo-Potential geklonter Schweineembryonen sollte anhand von Embryotransfers zuvor kultivierter Embryonen überprüft werden. Hierzu wurden an vier Versuchstagen insgesamt fünf Transfers auf synchronisierte Empfängertiere vorgenommen. Insgesamt wurden zwischen 52 und 100 4- bis 8-Zellstadien auf drei Tiere, und in zwei weiteren Versuchen 34 bzw. 51 Blastozysten auf zwei Tiere übertragen. Die genaue Embryonenanzahl pro Empfängersau ist Tabelle 17 zu entnehmen. 82 Ergebnisse Tabelle 17: TierNr. 21 Überblick über durchgeführte Embryotransfer, Anzahl der übertragenen Embryonen und deren Stadien; bei den mit * versehenen Zahlen handelt es sich um zusätzlich transferierte parthenogenetische Helfer-Embryonen; ET: Embryotransfer, NT: Kerntransfer, US: Ultraschalluntersuchung Datum Datum Anzahl Übertrag. NT ET Embryonen Stadien US 1: US 2: rauscht 51 Blasto- Tag 22: - Tag 21 zyste neg. 4- bis 8- Tag 25: - Tag 32 Zeller neg. 4- bis 8- Tag 25: - Tag 25 Zeller neg. 4- bis 8- Tag 25: Tag 35: Tag 35 Zeller fragl. neg. Blasto- Tag 28: Tag 35: zyste pos./fragl. fragl. 27.10.04 02.11.24 (V1) 31 01.12.04 04.12.04 97 (V2) 33 08.12.04 11.12.04 52 + 40* (V3) 34 35 100 15.12.04 21.12.04 34 + 10* (V4) Umge- Tag 35 Alle rekonstruierten Komplexe wurden unter 5% Sauerstoff kultiviert. Die Embryonen, die als 4- 8-Zeller übertragen wurden, sowie alle parthenogenetischen Embryonen, wurden in NCSU 23, d.h. ohne zeitlich versetzte Glucosezugabe kultiviert. Erfolgte die In-vitro-Kultur bis zum Blastozystenstadium an Tag 6, wurde mNCSU 23 mit Glucosezugabe 58 Stunden nach Beginn der In-vitro-Kultur verwendet. Die Fusionsraten der Versuchsdurchgänge V1-V4 lagen bei 84,9%, 77,3%, 87,7% und 79,2%. Die Blastozystenraten in den Versuchen V1 und V4 betrugen 19,1% und 10,9%. Der Anteil 4- bis 8-Zeller an den kultivierten Embryonen in den Versuchen V2 und V3 betrug jeweils 73,5% und 72,4%. Die Trächtigkeitskontrolle erfolgte per ultrasonographischer Untersuchung frühestens zum Beginn der 4. Trächtigkeitswoche und wurde bei fraglichem Befund ca. eine Woche später wiederholt. Zusätzlich wurde auf Rauschesymptome geachtet. Letztendlich konnte bei keinem der Empfängertiere eine Trächtigkeit dauerhaft etabliert werden (Tabelle 17). Diskussion 83 5. Diskussion Ziel dieser Arbeit war eine Verbesserung des In-vitro-Kultursystems, um das somatische Klonen beim Schwein zu verbessern. Hierzu wurden zunächst in einem Vorversuch mit parthenogenetischen Embryonen die Kulturbedingungen unter veränderter Sauerstoffatmosphäre überprüft, um diese Bedingungen anschließend in einem Hauptversuch für Kerntransferembryonen anzuwenden. 5.1. Veränderte Sauerstoffatmosphäre während der In-vitro-Kultur von Kerntransfer-, IVF- und parthenogenetischen Embryonen Im Vorversuch mit parthenogenetischen Embryonen kam es verglichen zur „Kontrollgruppe“ (20% O2), zu einer besseren Blastozystenrate der unter verminderter Sauerstoffkonzentration kultivierten Embryonen. Die Embryonenqualität, ausgedrückt in der Gesamtzellzahl der Blastozysten, wurde signifikant durch die Kulturbedingungen unter 5% Sauerstoff verbessert. Im anschließenden Hauptversuch mit Kerntransfer-, IVF und parthenogenetisch erstellten Embryonen konnte nach 12 Durchgängen in allen Gruppen eine signifikante Verbesserung sowohl der Blastozystenrate als auch der -qualität erreicht werden. Es ist berichtet worden, dass eine Kulturatmosphäre mit geringerer Sauerstoffkonzentration einen positiven Effekt auf die frühe Embryonalentwicklung bei diversen Spezies hat (DUMOULIN et al. 1999; YUAN et al. 2003). Es liegen aber auch Untersuchungen vor, bei denen eine verminderte Sauerstoffkonzentration keinen Unterschied in der In-vitro-Kulturentwicklung im Vergleich zur atmosphärischen Sauerstoffkonzentration von 20% ausmachte (BING et al. 2003). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit decken sich teilweise mit den Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen. So konnten bei IVF-Embryonen unter 5% Sauerstoff, im Vergleich mit der Kultur unter 20% Sauerstoff ähnlich verbesserte Blastozystenraten 84 Diskussion (36,3% vs. 22,5%) erreicht werden (KITAGAWA et al. 2004). Auch die durchschnittliche Kernzahl der Blastozysten war unter 5% Sauerstoff leicht erhöht. Die Blastozystenraten parthenogenetisch erstellter Embryonen variieren je nach Arbeitsgruppe erheblich: sie lagen unabhängig von der Sauerstoffkonzentration zwischen 28,1- 29,3% (BING et al. 2003) und 12,9- 13,5% (IM et al. 2004). Damit liegen die in der vorliegenden Arbeit erreichten Blastozystenraten im oberen Bereich, durch die reduzierte Sauerstoffkonzentration konnte die Rate um ca. 10% erhöht werden, verglichen mit der Kultur unter 20% Sauerstoff. Die durchschnittliche Zellzahl parthenogenetischer Blastozysten konnte sowohl bei den hier durchgeführten Versuchen als auch in anderen Arbeiten durch Kultivierung in geringerer Sauerstoffatmosphäre erhöht werden (BING et al. 2003; IM et al. 2004). Bisherige Arbeiten zeigten im Vergleich unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen bei der In-vitro-Kultur von Kerntransferembryonen sowohl hinsichtlich der Blastozystenrate als auch der Zellzahlen eine signifikante Erhöhung bei 5% Sauerstoffgehalt. Untersuchungen von IM et al. (2004) ergaben ähnliche Ergebnisse bei vergleichenden Untersuchungen zur Sauerstoffkonzentration, wobei die Blastozystenrate unter 5% Sauerstoff bei 12,3% und die durchschnittliche Kernzahl bei 19,4 lag. Die in den vorliegenden Versuchen erreichten Ergebnisse sind also im Vergleich mit Angaben aus der Literatur als relativ hoch zu bewerten. Dies bestätigt sich auch im Vergleich mit den In-vitro-Entwicklungsraten geklonter Schweineembryonen (siehe Tabelle 6, Schrifttum). Zwar ist über die Gaskonzentrationen innerhalb des porzinen Reproduktionstrakts nicht viel bekannt, jedoch kann man davon ausgehen, dass die Verhältnisse denen anderer Säugetierspezies ähnlich sind. So sind bei Rhesusaffen, Hamster und Kaninchen physiologische Sauerstoffkonzentrationen von 1,5% bis 8,7% in Uterus und Eileiter gemessen worden (FISCHER u. BAVISTER 1993). Daher kann vermutet werden, dass der Schweineembryo unter physiologischen Bedingungen sowohl im Eileiter als auch im Uterus einer niedrigen Sauerstoffspannung ausgesetzt ist. Dementsprechend würde eine Kultivierung unter 20% Sauerstoff nicht den Bedürfnissen eines Embryos entsprechen. Der Embryo muss also unter einer erhöhten Sauerstoffkonzentration eine Reihe von Mechanismen aktivieren, um die hohe Sauerstoffkonzentration zu Diskussion 85 kompensieren, und die Entwicklung ungestört fortsetzen zu können. Vermutlich führt die erhöhte Sauerstoffkonzentration zu einem erhöhten Anteil an freien Sauerstoffradikalen, den „Reactive Oxygen Species“ (ROS) (NODA et al. 1991). Diese aggressiven Moleküle bewirken eine Oxidation von Lipiden, oxidative Veränderungen an Proteinen sowie Schäden an der DNA, die durch Fragmentationen gekennzeichnet sind und letztendlich die Apoptose der betroffenen Zellen einleiten (KARJA et al. 2004). So konnte bei der Kultivierung von porzinen IVF-Embryonen unter atmosphärischer Sauerstoffkonzentration eine erhöhte Wasserstoffperoxid (H2O2)-Konzentration in den Embryonen festgestellt werden (KITAGAWA et al. 2004), was durch eine höhere Aktivität von Oxidasen bei unphysiologisch hohen Sauerstoffkonzentrationen erklärt werden kann (HALLIWELL 1978). Unter erhöhter Sauerstoffspannung bewirken diese Oxidasen eine vermehrte Bildung von ROS (KITAGAWA et al. 2004). H2O2 setzt dabei OH•-Gruppen frei, die hochreaktiv sind und leicht mit anderen Molekülen im Zytoplasma reagieren und so die Zelle schädigen können. So greift OH• beispielsweise an den Zuckerbindungen der DNA an und verursacht Brüche im DNA-Strang (SALGO et al. 1995; SALGO et al. 1995). Bei porzinen Embryonen setzt im 4- 8-Zellstadium die embryonale Genexpression ein (MADDOX-HYTTEL et al. 2001), was aus mehreren Gründen hinsichtlich der ROS von besonderer Bedeutung ist. Zum Einen führt die DNAFragmentierung in diesem Stadium nicht nur zu einer aberranten Genexpression, sondern (da die Entwicklung gerade erst beginnt und noch keinerlei Differenzierung stattgefunden hat) auch zu einer Hemmung oder Verzögerung der weiteren Entwicklung (KITAGAWA et al. 2004). Zum Anderen sind zum Beginn der embryonalen Genexpression noch nicht alle Gene aktiv, d.h. es können eventuell noch nicht ausreichend Enzyme gebildet werden, die den oxidativen Schäden entgegenwirken. Andererseits werden durch die erhöhte Sauerstoffspannung gerade die Gene vermehrt exprimiert, die eine Antwort der Zelle auf erhöhten oxidativen Stress vermitteln können (BERNARDINI et al. 2004). Diese verstärkte Expression „protektiver“ Gene unterstützt auf der einen Seite zwar den Schutz des Embryos vor aggressiven Sauerstoffradikalen, andererseits könnte jedoch die Expression der übrigen, entwicklungsbiologisch wichtigen Gene verlangsamt werden, was eine Retardierung der frühembryonalen Entwicklung zur Folge hätte. 86 Diskussion Eine weitere Erklärung für die verbesserten Entwicklungsraten porziner Embryonen unter verminderter Sauerstoffkonzentration ist das verbesserte Redox-Potential. Dies hängt bei frühembryonalen Stadien hauptsächlich vom NAD+/NADH-Verhältnis ab (BRINSTER u. TROIKE 1979). Das NAD+/NADH-Verhältnis im Embryo wird unter anderem durch die Glykolyse und oxidative Phosphorylierung gesteuert. Bei einer zu hohen Sauerstoffkonzentration kann das Verhältnis von aerober und anaerober Glykolyse verändert werden (MACHATY et al. 1998), was wiederum eine Störung der Mechanismen von Glykolyse und oxidativer Phosphorylierung zur Folge hat und das Redox-Potential negativ beeinflussen kann (BRINSTER u. TROIKE 1979; THOMPSON et al. 1993). Bei Arbeiten, in denen keine Unterschiede in Blastozystenrate und/oder -qualität bei unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen festgestellt wurden, wird dies auf verschiedene Ursachen zurückgeführt. So wurde vermutet, dass die einzelnen Embryonen unterschiedliche Fähigkeiten haben, mit freien Sauerstoffradikalen umzugehen, sowie dass die unterschiedlichen Reifungs-, Aktivierungs- und Kulturprotokolle für diese unterschiedlichen Ergebnisse verantwortlich seien (BING et al. 2003). Dennoch wird auch in diesen Arbeiten davon ausgegangen, dass eine reduzierte Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Kultur einen verminderten oxidativen Stress und damit eine verbesserte Embryonalentwicklung zur Folge hat. 5.2. Veränderung des Kulturmediums hinsichtlich des Energiestoffwechsels porziner Embryonen Beim zweiten Hauptversuch sollte durch die Modifikation der Energiesubstrate im Kulturmedium auf die besonderen Bedürfnisse frühembryonaler Stadien des Schweins, insbesondere von Kerntransferembryonen, eingegangen werden. Dazu wurde die Glucose als Energielieferant aus dem bisherigen Kulturmedium NCSU 23 entfernt und durch Laktat und Pyruvat ersetzt, das modifizierte Medium wurde „mNCSU 23“ genannt. Die Glucose wurde 58 Stunden nach Beginn der In-vitro-Kultur in Form einer Lösung in Diskussion 87 die Kulturschalen mit mNCSU 23 und darin enthaltenen Embryonengruppen hineinpipettiert. Die durchschnittlichen Zellzahlen in Blastozysten aller Embryonengruppen veränderten sich im modifizierten Kulturmedium im Vergleich zum Kontrollmedium nicht. Bei der Blastozystenrate kam es bei den in mNCSU 23 kultivierten Kerntransferembryonen zu einer signifikanten Erhöhung im Vergleich zu den in NCSU 23 kultivierten Embryonen (31,5%± 11,0 vs. 21,8%± 7,6). Bei den Gruppen der IVF- und parthenogenetischen Embryonen waren die Blastozystenraten in beiden Kulturmedien nahezu identisch. Wenn man die in der Arbeit erreichten Blastozystenraten der Kerntransferembryonen unabhängig von Kulturbedingungen, Spenderzelltypen etc. mit Blastozystenraten geklonter Embryonen anderer Arbeitsgruppen vergleicht, so ist festzustellen, dass dieses Ergebnis von 31,5% im oberen Bereich liegt (siehe Tabelle 6) und sogar den Raten von IVF- und parthenogenetischen Blastozysten ähnlich ist. Ausschlaggebend für die Art der Modifikation war die Vermutung, dass Glucose von Schweineembryonen in der frühembryonalen Phase nur minimal verstoffwechselt werden und sogar mit schädigenden Effekten in diesen frühen Stadien verbunden sein kann. So ist beobachtet worden, dass beim Schweineembryo die Glucoseverstoffwechselung von 8-Zellstadien massiv erhöht wird und bis zum Stadium der kompaktierten Morula bzw. Blastozyste auf den 300fachen Wert ansteigt (FLOOD u. WIEBOLD 1988). Die Ursache hierfür liegt im gesteigerten Energiebedarf des Embryos, der auf dem Weg in ein differenziertes Stadium (ICM- und TE-Zellen) „Tight Junctions“ zwischen den Zellen ausbildet (FLOOD u. WIEBOLD 1988). Die ohnehin niedrige Glucose-verstoffwechselung läuft in den ersten Teilungsstadien hauptsächlich über den Pentosephosphatweg mit ineffizienterer Energieausbeute ab und wird nach dem Anstieg mit dem 8-Zellstadium über die Glykolyse geleitet (FLOOD u. WIEBOLD 1988). Bedenkt man weiterhin, das die embryonale Genexpression beim Schweineembryo erst ab dem späten Vierzellstadium beginnt (MADDOX-HYTTEL et al. 2001), so erklärt sich, 88 Diskussion warum bestimmte Stoffwechselmechanismen und die dazu benötigten Enzyme erst ab diesem Zeitpunkt zur Verfügung stehen. Der toxische Effekt frühzeitiger Glucosesupplementation während der In-vitroKultivierung hängt wesentlich mit einem Nebenprodukt der Glykolyse, dem Methylglyoxal, zusammen (ANKRAH u. PPIAH-OPONG 1999). Hierbei handelt es sich um ein Substrat, das das Enzym Glutathion-Peroxidase deaktiviert, was einen Anstieg an freien Sauerstoffradikalen in der Zelle zur Folge hat (PARK et al. 2003). Das Enzym Glyoxalase I, das normalerweise das toxische Methylglyoxal inaktiviert (INOUE et al. 1998), wird in so frühen Stadium noch nicht ausreichend exprimiert, so dass Glyoxalase nur in geringen Mengen vorhanden ist (MEDVEDEV et al. 2004). Somit hat eine zu frühe Glucosezugabe eine oxidative Belastung zur Folge, die nicht kompensiert werden kann und möglicherweise zu einer verzögerten Entwicklung führt (MADDOX-HYTTEL et al. 2001). Untersuchungen zur Glucose-, Pyruvat- und Lactat-Verstoffwechselung haben gezeigt, dass die Menge des umgesetzten Substrates wie auch der Weg der Verstoffwechselung von der Zusammensetzung des In-vitro-Kulturmediums, d.h. vom Substratangebot abhängen (SWAIN et al. 2001; GANDHI et al. 2001). Ausgehend von diesen Erkenntnissen hat es bereits vielfach Bemühungen gegeben, dem porzinen Embryo als „zusätzliche“ Energieträger Pyruvat und Lactat anzubieten ( z.B. G1.2/G2.2Medium (GANDHI et al. 2001)) bzw. diese statt Glucose einzusetzen, z.B. in PZM (YOSHIOKA et al. 2002) oder Glucose-freiem NCSU 23 (LEE et al. 2003b). Die Kultivierung von IVF-Embryonen in PZM unter 5% Sauerstoff ergab Blastozystenraten von 65,9% verglichen mit 32,6% bei Kultivierung in NCSU 23 (YOSHIOKA et al. 2002); nach Embryotransfer in PZM kultivierter Embryonen lag die Abferkelrate bei 83,3%. Der Vergleich von PZM und NCSU 23 bei der Kultivierung parthenogenetischer und Kerntransferembryonen ergab sowohl höhere Blastozystenraten als auch höhere durchschnittliche Kernzahlen für die Kerntransfer- und parthenogenetischen Embryonen aus PZM (IM et al. 2004). Auch die In-vitro-Kultivierung geklonter Schweineembryonen in glucosefreiem NCSU 23 (+ Pyruvat/Lactat) erhöhte die Blastozystenrate von 6% Diskussion 89 („normales“ NCSU 23) auf 17%. Da Glucose für die zeitgerechte Differenzierung in ICM- und TE-Zellen jedoch unabdingbar ist (FLOOD u. WIEBOLD 1988), wurden in Anlehnung an den Übergang vom Eileiter in den Uterus am Tag 2 der Trächtigkeit zweiphasige Kultursysteme entwickelt. Einer zweitägigen Kultivierung in einem pyruvatund lactathaltigen Medium folgte ein Mediumwechsel in ein glucosehaltiges Kulturmedium für die restliche Dauer (4-5 Tage) der In-vitro-Kultur. Hierzu liegen Arbeiten über die Entwicklung von IVF-Embryonen vor, in denen mit Hilfe der zweiphasigen Kultursysteme die Blastozystenraten und -qualitäten verbessert werden konnten (KIKUCHI et al. 2002) bzw. in anderen Arbeiten bisher dagegen unverändert blieben (KIM et al. 2004). Im Vergleich mit den o.g. Arbeiten über zweiphasige Kultursysteme bestand in der vorliegenden Arbeit der Unterschied darin, dass das Kulturmedium nicht gewechselt wurde, sondern die Embryonen in ihrer Kulturschale belassen und dem vorhandenen Kulturmedium (mNCSU 23) die Glucose in einem möglichst geringen Volumen per Eppendorfpipette zugesetzt wurde. Der Grund für diese Vorgehensweise liegt darin begründet, dass Schweineembryonen zwischen Tag 2 und 3 aufgrund der beginnenden Genexpression (MADDOX-HYTTEL et al. 2001) besonders empfindlich sind und daher die Vermutung bestand, dass ein Umsetzen der Embryonen in neues Medium dem positiven Effekt der modifizierten Kulturbedingungen entgegenwirken könnte. Als Anhaltspunkt für den Zeitpunkt der Glucosesupplementation dienten die Ergebnisse von MEDVEDEV et al. (2004), die gezeigt hatten, dass der Embryo die Glucose am effizientesten nutzen kann, wenn sie 58 Stunden nach Beginn der Fertilisation supplementiert wird (in Form eines Medienwechsels). Da der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der Verbesserung der In-vitro-Kultur der Kerntransferembryonen lag, wurde die Glucose 58 Stunden nach Beginn der In-vitroKultur zugesetzt. Das bedeutete für die IVF-Embryonen einen Zusatz der Glucose insgesamt ca. 70 Stunden nach Beginn der Fertilisation, was erklären könnte, warum bei den vorliegenden Ergebnissen im Vergleich zur Kultivierung in NCSU 23 keine positiven Effekte beobachtet werden konnten. Für parthenogenetische Embryonen gilt vermutlich Ähnliches, da auch hier die Aktivierung bereits ca. 4½ Stunden vor der In- 90 Diskussion vitro-Kultur erfolgte. Gerade dieses Zeitfenster und die Zeitspanne zwischen Fusion und Aktivierung ermöglichten den rekonstruierten Embryonen vermutlich einen ungestörten Ablauf des „Nuclear Reprogramming“, das in diesem Fall nicht durch frühzeitige Störfaktoren, wie z.B. Methylglyoxal (s.o.) gestört wird, während die IVF- und parthenogenetischen Embryonen einem zeitlich begrenzten Glucosemangel ausgesetzt waren. 5.3. In-vivo-Potential auf Empfängertiere transferierter Embryonen nach zuvor erfolgter In-vitro-Kultivierung Obwohl die In-vitro-Kultur-Ergebnisse sehr vielversprechend waren, konnten nach Embryotransfer geklonter Embryonalstadien auf synchronisierte Sauen sowohl nach der Übertragung von 4- bis 8-Zellern als auch nach der Übertragung von Blastozysten leider keine Trächtigkeiten etabliert werden. Beim Versuchsdurchgang V4 schien von vornherein die Entwicklungsfähigkeit eingeschränkt zu sein; da die Blastozystenrate am Embryotransfertag mit 10,9% deutlich unterhalb der Werte lag, die aufgrund der vorherigen In-vitro-Kultur-Versuche erwartet wurde. So konnte hier auch nur eine geringe Anzahl Embryonen übertragen werden, die offensichtlich quantitativ und qualitativ zur Etablierung einer Trächtigkeit nicht ausreichend war. Auch die 51 eingesetzten Blastozysten in Versuch V1 wiesen vermutlich nicht die erforderlichen Qualitätsmerkmale auf, die eine Etablierung und Aufrechterhaltung einer Trächtigkeit ermöglicht hätten. Beim Embryotransfer in vitro fertilisierter Schweineembryonen konnten bisher bei der Übertragung von 12-40 Morula- und Blastozystenstadien zwar Trächtigkeiten erzeugt werden, jedoch schwanken die Abferkelraten zwischen 33% und 64% (zum Überblick: HAZELEGER u. KEMP (1999)). Es scheint also entscheidend zu sein, in welcher Qualität die Embryonen die In-vitro-Kultur verlassen. Dies gilt insbesondere für Kerntransferembryonen, da eine gute Embryonenqualität Rückschlüsse auf ein erfolgreich abgeschlossenes „Nuclear Reprogramming“ zulässt. Embryotransfer nach Kultivierung in PZM mit anschließenden Abferkelraten von 83,3% scheint zumindest die Ansprüche von IVF-Embryonen eher zu erfüllen, als das bisherige Standardkulturmedium NCSU 23 (YOSHIOKA et al. 2002). Diskussion 91 Weiterhin ist auch zu beachten, dass als Empfängertiere stets präpubertale Jungsauen verwendet wurden. Diese haben sich aufgrund der hohen Verfügbarkeit, der relativ einfachen Handhabung und aufgrund einer besseren Synchronisierbarkeit gegenüber Altsauen bewährt. Allerdings ist bekannt, dass Jungsauen u.a. durch erhöhte embryonale und fetale Mortalität schlechtere Fruchtbarkeitsraten aufweisen, was damit zusammenhängen kann, dass z.B. der Uterus von Altsauen aufgrund der vorangegangenen Trächtigkeiten besser auf zu implantierende Embryonen vorbereitet ist; dadurch sind die Wurfgrößen bei Altsauen entsprechend höher. In weiteren Embryotransfers auch unter Berücksichtigung noch weiterer Asynchronitäten der Empfängertiere soll das In-vitro-Entwicklungspotential geklonter Schweineembryonen nach In-vitro-Kultur geprüft werden. Den In-vitro-Ergebnissen zufolge scheint das in der vorliegenden Arbeit entwickelte Kultursystem mit mNCSU 23 und zeitlich versetzter Glucosezugabe und reduzierter Sauerstoffspannung (5% statt 20%) das Entwicklungspotential von Kerntransferembryonen in positiver Weise zu beeinflussen. Zur Etablierung von Trächtigkeiten müssen noch weitere In-vivo-Versuchsreihen durchgeführt werden, wobei vermehrt Wert auf eine ausreichende Anzahl qualitativ hochwertiger Embryonen gelegt werden sollte. 92 Zusammenfassung 6. Zusammenfassung Dagmar Theda Sage Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der Entwicklungsfähigkeit geklonter Schweineembryonen Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Entwicklungspotential porziner Kerntransferembryonen zu verbessern und dadurch die Anzahl zu übertragender Embryonen pro Empfängertier zu reduzieren und die Produktion geklonter Embryonen und den Embryotransfer zeitlich zu entkoppeln. Hierzu wurde die In-vitro-Kultivierung geklonter Schweineembryonen in zwei Versuchsansätzen modifiziert. Im ersten Hauptversuch wurden Kerntransfer-, IVF- und parthenogenetische Schweineembryonen unter zwei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen (5% vs. 20%) in NCSU 23-Medium kultiviert. Im zweiten Versuchsansatz erfolgte die In-vitro-Kultivierung der Embryonengruppen unter der reduzierten Sauerstoffspannung von 5% vergleichend in zwei Kulturmedien. NCSU 23 diente als glucosehaltiges „Kontrollmedium“, während dem pyruvat- und lactathaltigen mNCSU 23 erst 58 Stunden nach Beginn der Kultur Glucose zugesetzt wurde. Im Anschluss an die In-vitro-Versuche wurden Embryotransfers mit in vitro kultivierten Kerntransfer-Embryonen durchgeführt, um das In-vivo-Potential zu überprüfen. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt. 1. Im Vorversuch wurden unter einer verminderten Sauerstoffkonzentration von 5% eine verbesserte Blastozystenrate bei parthenogenetischen Embryonen sowie eine signifikante Erhöhung der Kernzahlen der Blastozysten erreicht. 2. Im ersten Hauptversuch wurden zwei Sauerstoffspannungen (5% vs. 20%) während der In-vitro-Kultur verglichen. Bei den Kerntransferembryonen waren die Blastozystenraten (19,2%± 8,9 vs. 6,7%± 5,9) sowie die Kernzahlen der Blastozysten (25,8± 10,3 vs. 17,7± 12,1) nach der In-vitro-Kultivierung unter 5% Sauerstoffgehalt signifikant erhöht. Zusammenfassung 3. Bei den IVF-Embryonen erhöhte sich im 93 ersten Hauptversuch die Blastozystenrate bei der Kultur unter reduziertem Sauerstoff signifikant (30,3%± 6,7 vs. 22,8%± 11,0); die Kernzahlen der Blastozysten zeigten ebenfalls eine signifikante Erhöhung (33,8± 5,0 vs. 27,1± 5,8). 4. Die parthenogenetisch erstellten Embryonen wiesen bei der Kultivierung unter der reduzierten Sauerstoffspannung (5%) eine signifikante Erhöhung der Blastozystenrate (39,0%±10,9 vs. 28,7%± 9,6) auf; die Kernzahlen waren unter diesen Konditionen ebenfalls signifikant erhöht (29,8± 2,5 vs. 25,1± 2,9). 5. Eine Differentialfärbung zur Darstellung der ICM- und TE-Anteile bei Blastozysten aller Embryonengruppen (Kerntransfer, IVF und Parthenogenese) ergab keine Veränderungen zwischen Embryonen aus einer Kultur in 5% oder 20% Sauerstoff, sowohl bei den Kerntransfer- als auch bei den parthenogenetischen Embryonen. Hingegen war bei IVF-Embryonen das Verhältnis von ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl bei reduzierter Sauerstoffkonzentration signifikant höher (22,6%± 8,3) als bei unter 20% Sauerstoff kultivierten Embryonen (15,6%± 7,4). 6. Aus oben genannten Ergebnissen wird deutlich, dass eine In-vitro-Kultivierung porziner Embryonen unterschiedlicher Herkunft (Kerntransfer, IVF, Parthenogenese) unter reduziertem Sauerstoff eine signifikante Verbesserung der Entwicklungsraten und Embryonenqualität zur Folge hat. Erklärt werden kann dies damit, dass die reduzierte Sauerstoffspannung die physiologischen Verhältnisse im Reproduktionstrakt von Säugetieren besser simuliert. Die Embryonen sind dem oxidativen Stress durch freie Sauerstoffradikale weniger ausgesetzt, was die frühembryonale Entwicklung fördern kann. 7. Im zweiten Hauptversuch wurde ein modifiziertes Medium (mNCSU 23) mit dem bisherigen Standardmedium (NCSU 23) für die In-vitro-Kultur porziner Embryonen verglichen. Bei der Gruppe der Kerntransferembryonen ergab sich 94 Zusammenfassung bei der Kultivierung in mNCSU 23 eine signifikante Erhöhung der Blastozystenrate (31,5%± 11,0 vs. 21,8%± 7,6). Die Kernzahlen der Blastozysten zeigten keine Unterschiede zwischen der Kultivierung in NCSU 23 und mNCSU 23; auch die Differentialfärbung ergab bei beiden Kulturmedien ein gleiches Verhältnis von ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl. 8. Die Kultivierung der IVF-Embryonen in modifiziertem Medium (mNCSU 23) bewirkte sowohl hinsichtlich der Blastozystenraten als auch bei den Kernzahlen der Blastozysten keine Veränderung. Das Verhältnis der ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl blieb ebenfalls gleich. 9. Die In-vitro-Kultur parthenogenetischer Embryonen in mNCSU 23 ergab im Vergleich zur Kultivierung in NCSU 23 hinsichtlich Blastozystenrate und Kernzahl der Blastozysten keine Verbesserungen, ebenso war das Verhältnis von ICMZellen zur Gesamtzellzahl unverändert. 10. Die In-vitro-Kultivierung im modifizierten Kulturmedium mNCSU 23 führte nur bei Kerntransferembryonen hinsichtlich der Blastozystenrate zu einer signifikanten Verbesserung; die in den Kernzahlen und dem Verhältnis von ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl gemessene Qualität der Blastozysten war im Vergleich zur Kultur in NCSU 23 gleich. IVF- und parthenogenetisch erstellte Embryonen zeigten in mNCSU 23 keine Veränderung in Blastozystenraten oder Kernzahlen. Deshalb kann vermutet Empfindlichkeit werden, gegenüber dass einer Kerntransferembryonen eine Glucosesupplementierung besondere während der frühembryonalen Stadien (1- bis 8-Zeller) besitzen. Dagegen scheint ein Glucosemangel während der ersten Tage der frühembryonalen Entwicklung einen positiven Einfluss zu haben und auf diese Weise ein ungestörtes „Nuclear Reprogramming“ zu ermöglichen. 11. Bei den im Anschluss an die In-vitro-Versuche durchgeführten Transfers geklonter Embryonalstadien auf synchronisierte Empfängertiere konnten keine Zusammenfassung 95 Trächtigkeiten etabliert werden. Dies kann einerseits auf die geringe Anzahl (5) der Embryotransfers zurückgeführt werden, andererseits aber auch an der teilweise mangelhaften Qualität der eingesetzten Embryonen liegen. Aus diesem Grund sind weitere In-vivo-Versuche notwendig, bei denen die Empfängersauen außerdem stärker asynchron zu den Embryonen sein sollten. Die Ergebnisse zeigen, dass durch eine Verminderung des Sauerstoffgehalts in der Kulturatmosphäre sowohl die Anzahl produzierter Blastozysten als auch deren Qualität nach Kerntransfer, IVF oder parthenogenetischer Aktivierung verbessert werden kann. Eine Änderung des Kulturmediums NCSU 23 in ein zunächst glucosefreies Medium, dem an Tag 3 Glucose zugesetzt wird, hatte ebenfalls einen positiven Effekt auf die Invitro-Entwicklung von Kerntransferembryonen. Durch die Verbesserung der In-vitroKulturkonditionen kann eine erhöhte Anzahl von Kerntransferembryonen bis zum Blastozystenstadium erzeugt werden. Nach Übertragung auf synchronisierte Empfängertiere gelang es jedoch nicht, eine Trächtigkeit zu etablieren. In weiteren Embryotransferversuchen ist das In-vivo-Entwicklungspotential zu untersuchen, wobei eine stärkere Asynchronität der Empfängertiere zu den Embryonen zu einer erhöhten Effizienz beitragen könnte. 96 Summary 7. Summary Dagmar Theda Sage Experimental studies for improving the developmental competence of porcine somatic-cell nuclear-transfer embryos The aim of the present study was to improve the developmental potential of porcine nuclear transfer (NT) embryos, in order to reduce the number of NT embryos needed for each recipient and to lengthen the period during which NT embryos can be successfully transferred. An established in vitro culture system used for cloning porcine embryos was modified in two ways. In the first set of experiments; nuclear transfer, IVF and parthenogenetic embryos were cultured in standard NCSU 23 medium under two different oxygen concentrations (5% vs. 20%). In the second set of experiments, all embryos were cultured under 5% oxygen concentration but two different culture media were compared. The first was standard NCSU 23 containing glucose which has been used in the past with some degree of success. The second was a two step procedure in which embryos were first cultured for 58 hours in mNCSU 23 containing lactate and pyruvate but no glucose. After 58 hours, glucose was added to the medium and the embryos were cultured further to the blastocyst stage. Finally, embryos produced by the improved method of in vitro culture were transferred to recipients to determine their developmental competence in vivo. The following results were obtained: 1. A preliminary experiment with parthenogenetic embryos showed that, under a reduced oxygen tension of 5%, the blastocyst rate was improved and the number of nuclei in the blastocysts was increased significantly. Summary 97 2. In the first main experiment, two different oxygen tensions (5% and 20%) were compared for in vitro culture of NT embryos. The blastocyst rate of nuclear transfer embryos increased significantly under 5% oxygen (19.2%± 8.9 vs. 6.7%± 5.9) and the mean number of blastocyst nuclei increased (25.8± 10.3 vs. 17.7± 12.1). 3. The blastocyst rate of IVF embryos also increased significantly under the lower oxygen tension (30.3%± 6.7 vs. 22.8%± 11.0); and the number of nuclei of these blastocysts showed significant improvement (33.8± 5.0 vs. 27.1± 5.8). 4. The group of the parthenogenetic embryos had a significant increase in blastocyst rate under 5% oxygen (39.0%±10.9 vs. 28.7%± 9.6), as well as a significant increase in the mean cell number of these blastocysts (29.8± 2.5 vs. 25.1± 2.9). 5. Counting the ICM cells and TE cells by differential staining revealed no difference in ICM/TE ratio between the 5% and 20% oxygen cultures for either nuclear transfer derived or parthenogenetic embryos. However, in IVF embryos, the proportion of ICM cells to the total cell number was significantly increased under 5% oxygen (22.6%± 8.3) compared to that of embryos cultured under 20% oxygen (15.6%± 7.4). 6. From the results described above, it is clear that an in vitro culture system based on reduced oxygen concentration significantly improves the developmental rate and embryo quality of porcine embryos from different origins (NT, IVF, parthenogenesis). This can be explained by the fact that the lower oxygen tension is more similar to the physiological conditions found in the mammalian reproductive tract. Embryos which have less oxidative stress species show improved development. 98 Summary 7. The second “main” experiment was a comparison of the previous “standard” embryo culture medium NCSU 23 with a two step method based on modified mNCSU 23. The NT embryos cultured in the two step mNCSU 23 protocol had a significantly higher blastocyst rate than the NT embryos cultured in standard NCSU 23 (31.5%± 11.0 vs. 21.8%± 7.6). However, there was no difference in the mean number of nuclei of blastocysts obtained in the two media and differential staining showed no difference in ICM/TE ratio. 8. After in vitro culture of IVF derived embryos in mNCSU 23, there was no difference from the standard medium with respect to the blastocyst rate, the mean number of nuclei, or the ICM/TE ratio. 9. Comparison of parthenogenetic embryos cultured in the two step mNCSU 23 protocol with those from cultured in the standard NCSU 23 protocol did not show any improvement in blastocyst rate, mean number of nuclei, or ICM/TE ratio. 10. Only NT embryos showed an improvement in in vitro development to the blastocyst stage (blastocyst rate) in the modified NCSU 23 protocol. The quality of these blastocysts, determined as the total number of nuclei and the proportion of ICM cells to the total number of nuclei, was similar to that obtained with standard NCSU 23. IVF derived and parthenogenetic embryos cultured in mNCSU 23 showed no difference with respect to blastocyst rates or the number of nuclei. These results suggest that NT embryos are especially sensitive to glucose during the early embryonic stages (1- to 8-cell embryos). Avoiding glucose during the first stages of embryonic development seems to improve their developmental capacity and appears to improve the outcome of the nuclear reprogramming process. 11. Following the in vitro experiments, embryo transfer experiments were performed using synchronized recipients but no pregnancies could be detected. This could be due to the low number (5) of embryo transfers, the season, the number of Summary 99 embryos transferred to each recipient or to synchronization of the recipient and the transferred embryos but reflect the quality of the transferred NT embryos. It is thus necessary to perform additional in vivo experiments in which some of the above variables are examined. In conclusion, these results indicate that a reduction of the oxygen concentration in the in vitro culture atmosphere increases the blastocyst rate and the quality of embryos produced by either nuclear transfer, IVF or parthenogenetic activation. Modification of the NCSU 23 culture system to provide glucose-free mNCSU 23 for early embryos followed by the addition of glucose on day 3, showed positive effects on the in vitro development of nuclear transfer derived porcine embryos. This improvement of in vitro culture conditions gave a higher yield of NT blastocysts. However, after transfer to synchronized recipients no pregnancy was established. The developmental competence of these blastocysts must be examined further in embryo transfer experiments, including tests with more asynchronous recipients. 100 Literaturverzeichnis 8. Literaturverzeichnis ABEYDEERA, L. R., W. H. WANG, R. S. PRATHER u. B. N. DAY (1998): Maturation in vitro of pig oocytes in protein-free culture media: fertilization and subsequent embryo development in vitro. Biol. Reprod. 58, 1316-1320 ALBERTS, B., D. BRAY, J. LEWIS, M. RAFF, K. ROBERTSu. J. D. WATSON (1995): Der Zellteilungszyklus. in: Molekularbiologie der Zelle (dt. Fassung), S. 1020-1076 ANKRAH, N. A., u. R. PPIAH-OPONG (1999): Toxicity of low levels of methylglyoxal: depletion of blood glutathione and adverse effect on glucose tolerance in mice. Toxicol. Lett. 109, 61-67 ARCHER, G. S., S. DINDOT, T. H. FRIEND, S. WALKER, G. ZAUNBRECHER, B. LAWHORN u. J. A. PIEDRAHITA (2003): Hierarchical phenotypic and epigenetic variation in cloned swine. Biol. Reprod. 69, 430-436 BAGUISI, A., E. BEHBOODI, D. T. MELICAN, J. S. POLLOCK, M. M. DESTREMPES, C. CAMMUSO, J. L. WILLIAMS, S. D. NIMS, C. A. PORTER, P. MIDURA, M. J. PALACIOS, S. L. AYRES, R. S. DENNISTON, M. L. HAYES, C. A. ZIOMEK, H. M. MEADE, R. A. GODKE, W. G. GAVIN, E. W. OVERSTROM u. Y. ECHELARD (1999): Production of goats by somatic cell nuclear transfer. Nat. Biotechnol. 17, 456-461 BARTON, S. C., M. A. SURANI u. M. L. NORRIS (1984): Role of paternal and maternal genomes in mouse development. Nature 311, 374-376 BAVISTER, B. D. (1995): Culture of preimplantation embryos: Facts and artifacts. Hum. Reprod. 1, 91-148 BAVISTER, B. D. (1988): Role of oviductal secretions in embryonic growth in vivo and in vitro. Theriogenology 29, 143-153 BEN-YOSEF, D., Y. ORON u. R. SHALGI (1996): Intracellular pH of rat eggs is not affected by fertilization and the resulting calcium oscillations. Biol. Reprod. 55, 461-468 Literaturverzeichnis 101 BEN-YOSEF, D., u. R. SHALGI (1998): Early ionic events in activation of the mammalian egg. Rev. Reprod. 3, 96-103 BERNARDINI, C., P. FANTINATI, A. ZANNONI, M. FORNI, C. TAMANINI u. M. L. BACCI (2004): Expression of HSP70/HSC70 in swine blastocysts: effects of oxidative and thermal stress. Mol. Reprod. Dev. 69, 303-307 BETTHAUSER, J., E. FORSBERG, M. AUGENSTEIN, L. CHILDS, K. EILERTSEN, J. ENOS, T. FORSYTHE, P. GOLUEKE, G. JURGELLA, R. KOPPANG, T. LESMEISTER, K. MALLON, G. MELL, P. MISICA, M. PACE, M. PFISTER-GENSKOW, N. STRELCHENKO, G. VOELKER, S. WATT, S. THOMPSON u. M. BISHOP (2000): Production of cloned pigs from in vitro systems. Nat. Biotechnol. 18, 1055-1059 BING, Y., L. CHE, Y. HIRAO, N. TAKENOUCHI, H. RODRIGUEZ-MARTINEZ u. T. NAGAI (2003): Parthenogenetic activation and subsequent development of porcine oocytes activated by a combined electric pulse and butyrolactone I treatment. J. Reprod. Dev. 49, 159-166 BONDIOLI, K., J. RAMSOONDAR, B. WILLIAMS, C. COSTA u. W. FODOR (2001): Cloned pigs generated from cultured skin fibroblasts derived from a H-transferase transgenic boar. Mol. Reprod. Dev. 60, 189-195 BOOTH, P. J., S. J. TAN, P. HOLM u. H. CALLESEN (2001): Application of the zona-free manipulation technique to porcine somatic nuclear transfer. Cloning Stem Cells 3, 191-197 BOQUEST, A. C., B. N. DAY u. R. S. PRATHER (1999): Flow cytometric cell cycle analysis of cultured porcine fetal fibroblast cells. Biol. Reprod. 60, 1013-1019 BOQUEST, A. C., C. G. GRUPEN, S. J. HARRISON, S. M. MCILFATRICK, R. J. ASHMAN, A. J. D'APICE u. M. B. NOTTLE (2002): Production of cloned pigs from cultured fetal fibroblast cells. Biol. Reprod. 66, 1283-1287 BREM, G., u. B. KUHHOLZER (2002): The recent history of somatic cloning in mammals. Cloning Stem Cells 4, 57-63 BRINSTER, R. L., u. D. E. TROIKE (1979): Requirements for blastocyst development in vitro. J. Anim Sci. 49 Suppl 2, 26-34 102 Literaturverzeichnis BRISON, D. R., F. D. HOUGHTON, D. FALCONER, S. A. ROBERTS, J. HAWKHEAD, P. G. HUMPHERSON, B. A. LIEBERMAN u. H. J. LEESE (2004): Identification of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover. Hum. Reprod. 19, 2319-2324 BUHI, W. C., I. M. ALVAREZ u. A. J. KOUBA (1997): Oviductal regulation of fertilization and early embryonic development. J. Reprod. Fertil. Suppl 52, 285-300 CAMPBELL, K. H., J. MCWHIR, W. A. RITCHIE u. I. WILMUT (1996): Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380, 64-66 CHANG, M. C. (1954): Development of parthenogenetic rabbit blastocysts induced by low temperature storage of unfertilized ova. J. exp. Zool. 125, 127-142 CHESNE, P., P. G. ADENOT, C. VIGLIETTA, M. BARATTE, L. BOULANGER u. J. P. RENARD (2002): Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat. Biotechnol. 20, 366-369 CIBELLI, J. B., S. L. STICE, P. J. GOLUEKE, J. J. KANE, J. JERRY, C. BLACKWELL, F. A. PONCE DE LEON u. J. M. ROBL (1998): Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280, 1256-1258 CUTHBERTSON, K. S. (1983): Parthenogenetic activation of mouse oocytes in vitro with ethanol and benzyl alcohol. J. Exp. Zool. 226, 311-314 DAI, Y., T. D. VAUGHT, J. BOONE, S. H. CHEN, C. J. PHELPS, S. BALL, J. A. MONAHAN, P. M. JOBST, K. J. MCCREATH, A. E. LAMBORN, J. L. COWELLLUCERO, K. D. WELLS, A. COLMAN, I. A. POLEJAEVA u. D. L. AYARES (2002): Targeted disruption of the alpha1,3-galactosyltransferase gene in cloned pigs. Nat. Biotechnol. 20, 251-255 DE SOUSA, P. A., J. R. DOBRINSKY, J. ZHU, A. L. ARCHIBALD, A. AINSLIE, W. BOSMA, J. BOWERING, J. BRACKEN, P. M. FERRIER, J. FLETCHER, B. GASPARRINI, L. HARKNESS, P. JOHNSTON, M. RITCHIE, W. A. RITCHIE, A. TRAVERS, D. ALBERTINI, A. DINNYES, T. J. KING u. I. WILMUT (2002): Somatic cell nuclear transfer in the pig: control of pronuclear formation and integration with improved methods for activation and maintenance of pregnancy. Biol. Reprod. 66, 642-650 Literaturverzeichnis 103 DEAN, W., F. SANTOS, M. STOJKOVIC, V. ZAKHARTCHENKO, J. WALTER, E. WOLF u. W. REIK (2001): Conservation of methylation reprogramming in mammalian development: aberrant reprogramming in cloned embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 13734-13738 DINNYES, A., S. P. DE, T. KING u. I. WILMUT (2002): Somatic cell nuclear transfer: recent progress and challenges. Cloning Stem Cells 4, 81-90 DOBRINSKY, J. R., L. A. JOHNSON u. D. RATH (1996): Development of a culture medium (BECM-3) for porcine embryos: effects of bovine serum albumin and fetal bovine serum on embryo development. Biol. Reprod. 55, 1069-1074 DUMOULIN, J. C., C. J. MEIJERS, M. BRAS, E. COONEN, J. P. GERAEDTS u. J. L. EVERS (1999): Effect of oxygen concentration on human in-vitro fertilization and embryo culture. Hum. Reprod. 14, 465-469 DZIUK, P. (1985): Effect of migration, distribution and spacing of pig embryos on pregnancy and fetal survival. J. Reprod. Fertil. Suppl 33, 57-63 FAN, H. Y., M. Y. LI, C. TONG, D. Y. CHEN, G. L. XIA, X. F. SONG, H. SCHATTEN u. Q. Y. SUN (2002): Inhibitory effects of cAMP and protein kinase C on meiotic maturation and MAP kinase phosphorylation in porcine oocytes. Mol. Reprod. Dev. 63, 480-487 FISCHER, B., u. B. D. BAVISTER (1993): Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys, hamsters and rabbits. J. Reprod. Fertil. 99, 673-679 FLOOD, M. R., u. J. L. WIEBOLD (1988): Glucose metabolism by preimplantation pig embryos. J. Reprod. Fertil. 84, 7-12 FORSBERG, E. J. (2005): Commercial applications of nuclear transfer cloning: three examples. Reprod. Fertil. Dev. 17, 59-68 FULKA, J., V. KOPECNY u. I. TREBICHAVSKY (1972): Studies on oogenesis in the early postnatal pig ovary. Biol. Reprod. 6, 46-50 104 Literaturverzeichnis FULKA, J., JR., M. L. LEIBFRIED-RUTLEDGE u. N. L. FIRST (1991): Effect of 6-dimethylaminopurine on germinal vesicle breakdown of bovine oocytes. Mol. Reprod. Dev. 29, 379-384 FUNAHASHI, H., T. C. CANTLEY u. B. N. DAY (1997): Synchronization of meiosis in porcine oocytes by exposure to dibutyryl cyclic adenosine monophosphate improves developmental competence following in vitro fertilization. Biol. Reprod. 57, 49-53 FUNAHASHI, H., u. B. N. DAY (1993): Effects of the duration of exposure to hormone supplements on cytoplasmic maturation of pig oocytes in vitro. J. Reprod. Fertil. 98, 179-185 GALLI, C., I. LAGUTINA, G. CROTTI, S. COLLEONI, P. TURINI, N. PONDERATO, R. DUCHI u. G. LAZZARI (2003): Pregnancy: a cloned horse born to its dam twin. Nature 424, 635 GANDHI, A. P., M. LANE, D. K. GARDNER u. R. L. KRISHER (2001): Substrate utilization in porcine embryos cultured in NCSU23 and G1.2/G2.2 sequential culture media. Mol. Reprod. Dev. 58, 269-275 GRUPEN, C. G., J. C. MAU, S. M. MCILFATRICK, S. MADDOCKS u. M. B. NOTTLE (2002): Effect of 6-dimethylaminopurine on electrically activated in vitro matured porcine oocytes. Mol. Reprod. Dev. 62, 387-396 GRUPEN, C. G., P. J. VERMA, Z. T. DU, S. M. MCILFATRICK, R. J. ASHMAN u. M. B. NOTTLE (1999): Activation of In-vivo-and in vitro-derived porcine oocytes by using multiple electrical pulses. Reprod. Fertil. Dev. 11, 457-462 GURDON, J. B., J. A. BYRNE u. S. SIMONSSON (2003): Nuclear reprogramming and stem cell creation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100 Suppl 1, 11819-11822 HALLIWELL, B. (1978): Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals in the presence of iron chelates: is it a mechanism for hydroxyl radical production in biochemical systems? FEBS Lett. 92, 321-326 HAN, Y. M., Y. K. KANG, D. B. KOO u. K. K. LEE (2003): Nuclear reprogramming of cloned embryos produced in vitro. Theriogenology 59, 33-44 Literaturverzeichnis 105 HAO, Y., L. LAI, J. MAO, G. S. IM, A. BONK u. R. S. PRATHER (2003): Apoptosis and in vitro development of preimplantation porcine embryos derived in vitro or by nuclear transfer. Biol. Reprod. 69, 501-507 HAZELEGER, W., u. B. KEMP (1999): State of the art in pig embryo transfer. Theriogenology 51, 81-90 HÖLKER, M. (2003): Experimentelle Untersuchungen zum somatischen Klonen beim Schwein: In-vitro- und In-vivo-Entwicklung von Kerntransferkomplexen aus in vitro gereiften Oozyten. Hannover, Tierärztl. Hochschule, Diss. HU, W., Y. P. WANG u. Z. Y. ZHU (2003): [Progress on mechanism of nuclear reprogramming after nuclear transfer]. Yi. Chuan Xue. Bao. 30, 485-492 HUNTER, R. H. (1974): Chronological and cytological details of fertilization and early embryonic development in the domestic pig, Sus scrofa. Anat. Rec. 178, 169-185 HUNTER, R. H. F. (1966): The effect of superovulation on fertilization and embryonic survival in pig. Anim. Prod. 8, 457-465 HYTTEL, P., u. H. NIEMANN (1990): Ultrastructure of porcine embryos following development in vitro versus in vivo. Mol. Reprod. Dev. 27, 136-144 HYUN, S., G. LEE, D. KIM, H. KIM, S. LEE, D. NAM, Y. JEONG, S. KIM, S. YEOM, S. KANG, J. HAN, B. LEE u. W. HWANG (2003a): Production of nuclear transfer-derived piglets using porcine fetal fibroblasts transfected with the enhanced green fluorescent protein. Biol. Reprod. 69, 1060-1068 HYUN, S. H., G. S. LEE, D. Y. KIM, H. S. KIM, S. H. LEE, S. KIM, E. S. LEE, J. M. LIM, S. K. KANG, B. C. LEE u. W. S. HWANG (2003b): Effect of maturation media and oocytes derived from sows or gilts on the development of cloned pig embryos. Theriogenology 59, 1641-1649 IM, G. S., L. LAI, Z. LIU, Y. HAO, D. WAX, A. BONK u. R. S. PRATHER (2004): In vitro development of preimplantation porcine nuclear transfer embryos cultured in different media and gas atmospheres. Theriogenology 61, 1125-1135 106 Literaturverzeichnis INOUE, Y., Y. TSUJIMOTO u. A. KIMURA (1998): Expression of the glyoxalase I gene of Saccharomyces cerevisiae is regulated by high osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase pathway in osmotic stress response. J. Biol. Chem. 273, 2977-2983 IRITANI, A., E. SATO u. Y. NISHIKAWA (1974): Secretion rates and chemical composition of oviduct and uterine fluids in sows. J. Anim Sci. 39, 582-588 ITO, J., M. SHIMADA u. T. TERADA (2003): Effect of protein kinase C activator on mitogen-activated protein kinase and p34(cdc2) kinase activity during parthenogenetic activation of porcine oocytes by calcium ionophore. Biol. Reprod. 69, 1675-1682 JILEK, F., R. HUTTELOVA, J. PETR, M. HOLUBOVA u. J. ROZINEK (2001a): Activation of pig oocytes using calcium ionophore: effect of the protein kinase inhibitor 6-dimethyl aminopurine. Reprod. Domest. Anim 36, 139-145 JOLLIFF, W. J., u. R. S. PRATHER (1997): Parthenogenic development of in vitro-matured, in vivo-cultured porcine oocytes beyond blastocyst. Biol. Reprod. 56, 544-548 KANE, M. T. (1983): Variability in different lots of commercial bovine serum albumin affects cell multiplication and hatching of rabbit blastocysts in culture. J. Reprod. Fertil. 69, 555-558 KANG, Y. K., D. B. KOO, J. S. PARK, Y. H. CHOI, A. S. CHUNG, K. K. LEE u. Y. M. HAN (2001a): Aberrant methylation of donor genome in cloned bovine embryos. Nat. Genet. 28, 173-177 KANG, Y. K., D. B. KOO, J. S. PARK, Y. H. CHOI, H. N. KIM, W. K. CHANG, K. K. LEE u. Y. M. HAN (2001b): Typical demethylation events in cloned pig embryos. Clues on species-specific differences in epigenetic reprogramming of a cloned donor genome. J. Biol. Chem. 276, 39980-39984 KARJA, N. W., P. WONGSRIKEAO, M. MURAKAMI, B. AGUNG, M. FAHRUDIN, T. NAGAI u. T. OTOI (2004): Effects of oxygen tension on the development and quality of porcine in vitro fertilized embryos. Theriogenology 62, 1585-1595 Literaturverzeichnis 107 KATO, Y., T. TANI u. Y. TSUNODA (2000): Cloning of calves from various somatic cell types of male and female adult, newborn and fetal cows. J. Reprod. Fertil. 120, 231-237 KAUFMAN, M. H., u. L. SACHS (1976): Complete preimplantation development in culture of parthenogenetic mouse embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 35, 179-190 KAWAKAMI, M., T. TANI, A. YABUUCHI, T. KOBAYASHI, H. MURAKAMI, T. FUJIMURA, Y. KATO u. Y. TSUNODA (2003): Effect of demecolcine and nocodazole on the efficiency of chemically assisted removal of chromosomes and the developmental potential of nuclear transferred porcine oocytes. Cloning Stem Cells 5, 379-387 KIKUCHI, K., N. KASHIWAZAKI, J. NOGUCHI, A. SHIMADA, R. TAKAHASHI, M. HIRABAYASHI, M. SHINO, M. UEDA u. H. KANEKO (1999): Developmental competence, after transfer to recipients, of porcine oocytes matured, fertilized, and cultured in vitro. Biol. Reprod. 60, 336-340 KIKUCHI, K., A. ONISHI, N. KASHIWAZAKI, M. IWAMOTO, J. NOGUCHI, H. KANEKO, T. AKITA u. T. NAGAI (2002): Successful piglet production after transfer of blastocysts produced by a modified in vitro system. Biol. Reprod. 66, 1033-1041 KIM, H. S., G. S. LEE, S. H. HYUN, S. H. LEE, D.H. NAM, Y. W. JEONG, S. KIM, S. K. KANG, B. C. LEE u. W. S. HWANG (2004): Improved in vitro development of porcine embryos with different energy substrates and serum. Theriogenology 61, 1381-1393 KITAGAWA, Y., K. SUZUKI, A. YONEDA u. T. WATANABE (2004): Effects of oxygen concentration and antioxidants on the in vitro developmental ability, production of reactive oxygen species (ROS), and DNA fragmentation in porcine embryos. Theriogenology 62, 1186-1197 KLINE, D., u. J. T. KLINE (1992): Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in the mouse egg. Dev. Biol. 149, 80-89 108 Literaturverzeichnis KOLODZIEJCZYK, J., A. GERTLER, H. LEIBOVICH, J. RZASA u. E. L. GREGORASZCZUK (2003): Synergistic action of growth hormone and insulin-like growth factor I (IGF-I) on proliferation and estradiol secretion in porcine granulosa and theca cells cultured alone or in coculture. Theriogenology 60, 559-570 KOMAR, A. (1973): Parthenogenetic development of mouse eggs activated by heat-shock. J. Reprod. Fertil. 35, 433-443 KOO, D. B., Y. K. KANG, Y. H. CHOI, J. S. PARK, S. K. HAN, I. Y. PARK, S. U. KIM, K. K. LEE, D. S. SON, W. K. CHANG u. Y. M. HAN (2000): In vitro development of reconstructed porcine oocytes after somatic cell nuclear transfer. Biol. Reprod. 63, 986-992 KOO, D. B., Y. K. KANG, J. S. PARK, J. K. PARK, W. K. CHANG, K. K. LEE u. Y. M. HAN (2004): A paucity of structural integrity in cloned porcine blastocysts produced in vitro. Theriogenology 62, 779-789 KRAGH, P. M., G. VAJTA, T. J. CORYDON, S. PURUP, L. BOLUND u. H. CALLESEN (2004): Production of transgenic porcine blastocysts by hand-made cloning. Reprod. Fertil. Dev. 16, 315-318 KRISHER, R. L., A. P. GANDHI, D. K. GARDNER, u. M. LANE (2000): Developmentally-related changes in nutrient uptake and metabolism by in vitroproduced porcine embryos. Theriogenology 53, 274 (Abstr.) KUBELKA, M., M. ANGER, J. KALOUS, R. M. SCHULTZ u. J. MOTLIK (2002): Chromosome condensation in pig oocytes: lack of a requirement for either cdc2 kinase or MAP kinase activity. Mol. Reprod. Dev. 63, 110-118 KUES, W. A., J. W. CARNWATH, D. PAUL u. H. NIEMANN (2002): Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts by serum deprivation initiates a nonconventional form of apoptosis. Cloning Stem Cells 4, 231-243 KUES, W. A., u. H. NIEMANN (2004): The contribution of farm animals to human health. Trends Biotechnol. 22, 286-294 Literaturverzeichnis 109 KUMAR, N. M., u. N. B. GILULA (1996): The gap junction communication channel. Cell 84, 381-388 KURE-BAYASHI, S., M. MIYAKE, K. OKADA u. S. KATO (2000): Successful implantation of in vitro-matured, electro-activated oocytes in the pig. Theriogenology 53, 1105-1119 KUROME, M., T. FUJIMURA, H. MURAKAMI, Y. TAKAHAGI, N. WAKO, T. OCHIAI, K. MIYAZAKI u. H. NAGASHIMA (2003): Comparison of electro-fusion and intracytoplasmic nuclear injection methods in pig cloning. Cloning Stem Cells 5, 367-378 LAI, L., D. KOLBER-SIMONDS, K. W. PARK, H. T. CHEONG, J. L. GREENSTEIN, G. S. IM, M. SAMUEL, A. BONK, A. RIEKE, B. N. DAY, C. N. MURPHY, D. B. CARTER, R. J. HAWLEY u. R. S. PRATHER (2002a): Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science 295, 1089-1092 LAI, L., K. W. PARK, H. T. CHEONG, B. KUHHOLZER, M. SAMUEL, A. BONK, G. S. IM, A. RIEKE, B. N. DAY, C. N. MURPHY, D. B. CARTER u. R. S. PRATHER (2002b): Transgenic pig expressing the enhanced green fluorescent protein produced by nuclear transfer using colchicine-treated fibroblasts as donor cells. Mol. Reprod. Dev. 62, 300-306 LANE, M., u. D. K. GARDNER (2000): Lactate regulates pyruvate uptake and metabolism in the preimplantation mouse embryo. Biol. Reprod. 62, 16-22 LE BEUX, G., F. J. RICHARD u. M. A. SIRARD (2003): Effect of cycloheximide, 6-DMAP, roscovitine and butyrolactone I on resumption of meiosis in porcine oocytes. Theriogenology 60, 1049-1058 LEE, G. S., S. H. HYUN, H. S. KIM, D. Y. KIM, S. H. LEE, J. M. LIM, E. S. LEE, S. K. KANG, B. C. LEE u. W. S. HWANG (2003a): Improvement of a porcine somatic cell nuclear transfer technique by optimizing donor cell and recipient oocyte preparations. Theriogenology 59, 1949-1957 LEE, G. S., H. S. KIM, S. H. HYUN, D. Y. KIM, S. H. LEE, D.H. NAM, Y. W. JEONG, S. KIM, S. K. KANG, B. C. LEE u. W. S. HWANG (2003b): Improved developmental competence of cloned porcine embryos with different energy supplements and chemical activation. Mol. Reprod. Dev. 66, 17-23 110 Literaturverzeichnis LEE, J. W., S. C. WU, X. C. TIAN, M. BARBER, T. HOAGLAND, J. RIESEN, K. H. LEE, C. F. TU, W. T. CHENG u. X. YANG (2003c): Production of cloned pigs by whole-cell intracytoplasmic microinjection. Biol. Reprod. 69, 995-1001 LEE, S. H., D. Y. KIM, D.H. NAM, S. H. HYUN, G. S. LEE, H. S. KIM, C. K. LEE, S. K. KANG, B. C. LEE u. W. S. HWANG (2004): Role of messenger RNA expression of platelet activating factor and its receptor in porcine in vitro-fertilized and cloned embryo development. Biol. Reprod. 71, 919-925 LEQUARRE, A. S., J. MARCHANDISE, B. MOREAU, A. MASSIP u. I. DONNAY (2003): Cell cycle duration at the time of maternal zygotic transition for in vitro produced bovine embryos: effect of oxygen tension and transcription inhibition. Biol. Reprod. 69, 1707-1713 LIEBICH, H.-G. (1999): Weibliche Geschlechtsorgane (Organa genitalia feminina). in: Funktionelle Histologie der Haussäugetiere, 3. Aufl., Verlag Enke, Stuttgart, S. 284302 LIU, L., J. R. TRIMARCHI, P. J. SMITH u. D. L. KEEFE (2002): Checkpoint for DNA integrity at the first mitosis after oocyte activation. Mol. Reprod. Dev. 62, 277-288 LONGO, F. J. (1974): Ultrastructural changes in rabbit eggs aged in vivo. Biol. Reprod. 11, 22-39 LONGO, F. J. (1975): Ultrastructural analysis of artificially activated rabbit eggs. J. Exp. Zool. 192, 87-111 LOPES, A. S., N. RAMSING, L. H. LARSEN, M. RÄTY, J. PEIPPO, T. GREVE, u. H. CALLESEN (2005): Correlation between oxygen respiration rates and morphology, sex, diameter and developmental stage of single bovine IVP-embryos. Reprod.Fertil.Dev. 17, 151 (Abstr.) LUCAS-HAHN, A., E. LEMME, K.-G. HADELER, H.-G. SANDER, u. H. NIEMANN (2002): The source of fibroblast affects in vivo development of cloned bovine embryos. Theriogenology 57, 433 (Abstr.) MAAS, D.H., B. T. STOREY u. L. MASTROIANNI, JR. (1977): Hydrogen ion and carbon dioxide content of the oviductal fluid of the rhesus monkey (Macaca mulatta). Fertil. Steril. 28, 981-985 Literaturverzeichnis 111 MACHATY, Z., A. J. BONK, B. KUHHOLZER u. R. S. PRATHER (2000): Porcine oocyte activation induced by a cytosolic sperm factor. Mol. Reprod. Dev. 57, 290-295 MACHATY, Z., B. N. DAY u. R. S. PRATHER (1998): Development of early porcine embryos in vitro and in vivo. Biol. Reprod. 59, 451-455 MACHATY, Z., M. A. MAYES u. R. S. PRATHER (1995): Parthenogenetic activation of porcine oocytes with guanosine-5'-O-(3'-thiotriphosphate). Biol. Reprod. 52, 753-758 MACHATY, Z., L. F. RICKORDS u. R. S. PRATHER (1999): Parthenogenetic activation of porcine oocytes after nuclear transfer. Cloning Stem Cells 2, 101-109 MACHATY, Z., J. G. THOMPSON, L. R. ABEYDEERA, B. N. DAY u. R. S. PRATHER (2001): Inhibitors of mitochondrial ATP production at the time of compaction improve development of in vitro produced porcine embryos. Mol. Reprod. Dev. 58, 39-44 MACHATY, Z., W. H. WANG, B. N. DAY u. R. S. PRATHER (1997): Complete activation of porcine oocytes induced by the sulfhydryl reagent, thimerosal. Biol. Reprod. 57, 1123-1127 MADDOX-HYTTEL, P., B. BJERREGAARD u. J. LAURINCIK (2005): Meiosis and embryo technology: renaissance of the nucleolus. Reprod. Fertil. Dev. 17, 3-14 MADDOX-HYTTEL, P., A. DINNYES, J. LAURINCIK, D. RATH, H. NIEMANN, C. ROSENKRANZ u. I. WILMUT (2001): Gene expression during pre- and peri-implantation embryonic development in pigs. Reprod. Suppl 58, 175-189 MANN, M. R., u. M. S. BARTOLOMEI (2002): Epigenetic reprogramming in the mammalian embryo: struggle of the clones. Genome Biol. 3, REVIEWS1003MARCHAL, R., J. M. FEUGANG, C. PERREAU, E. VENTURI, M. TERQUI u. P. MERMILLOD (2001): Meiotic and developmental competence of prepubertal and adult swine oocytes. Theriogenology 56, 17-29 MARTINEZ DIAZ, M. A., K. IKEDA u. Y. TAKAHASHI (2002): Effects of cycloheximide treatment and interval between fusion and activation on in vitro development of pig nuclear transfer embryos. Reprod. Fertil. Dev. 14, 191-197 112 Literaturverzeichnis MATTIOLI, M., G. BACCI u. E. SEREN (1989): Developmental competence of pig oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenology 31, 1201-1207 MEDVEDEV, S., A. ONISHI, D. FUCHIMOTO, M. IWAMOTO u. T. NAGAI (2004): Advanced in vitro production of pig blastocysts obtained through determining the time for glucose supplementation. J. Reprod. Dev. 50, 71-76 MIYOSHI, K., Y. TAGUCHI, Y. SENDAI, H. HOSHI u. E. SATO (2000): Establishment of a porcine cell line from in vitro-produced blastocysts and transfer of the cells into enucleated oocytes. Biol. Reprod. 62, 1640-1646 MONK, M. (1987): Genomic imprinting. Memories of mother and father. Nature 328, 203-204 MOOR, R. M., M. MATTIOLI, J. DING u. T. NAGAI (1990): Maturation of pig oocytes in vivo and in vitro. J. Reprod. Fertil. Suppl 40, 197-210 MURRAY, F. A., JR., F. W. BAZER, J. W. RUNDELL, C. K. VINCENT, H. D. WALLACE u. A. C. WARNICK (1971): Developmental failure of swine embryos restricted to the oviducal environment. J. Reprod. Fertil. 24, 445-448 NAGAI, T. (1987): Parthenogenetic activation of cattle follicular oocytes in vitro with ethanol. Gamete Res. 16, 243-249 NGUYEN, V. T., S. KURE-BAYASHI, H. HARAYAMA, T. NAGAI u. M. MIYAKE (2003): Stage-specific effects of the osmolarity of a culture medium on the development of parthenogenetic diploids in the pig. Theriogenology 59, 719-734 NICHOL, R., R. H. HUNTER, D. K. GARDNER, H. J. LEESE u. G. M. COOKE (1992): Concentrations of energy substrates in oviductal fluid and blood plasma of pigs during the peri-ovulatory period. J. Reprod. Fertil. 96, 699-707 NIEMANN, H., u. W. A. KUES (2003): Application of transgenesis in livestock for agriculture and biomedicine. Anim Reprod. Sci. 79, 291-317 NIEMANN, H., u. B. H. MEINECKE (1993): Embryotransfer und assoziierte Biotechniken bei landwirtschaftlichen Nutztieren, Verlag Enke, Stuttgart. Literaturverzeichnis 113 NIEMANN, H., u. D. RATH (2001): Progress in reproductive biotechnology in swine. Theriogenology 56, 1291-1304 NODA, Y., H. MATSUMOTO, Y. UMAOKA, K. TATSUMI, J. KISHI u. T. MORI (1991): Involvement of superoxide radicals in the mouse two-cell block. Mol. Reprod. Dev. 28, 356-360 NUSSBAUM, D. J., u. R. S. PRATHER (1995): Differential effects of protein synthesis inhibitors on porcine oocyte activation. Mol. Reprod. Dev. 41, 70-75 OBACK, B., A. T. WIERSEMA, P. GAYNOR, G. LAIBLE, F. C. TUCKER, J. E. OLIVER, A. L. MILLER, H. E. TROSKIE, K. L. WILSON, J. T. FORSYTH, M. C. BERG, K. COCKREM, V. MCMILLAN, H. R. TERVIT u. D. N. WELLS (2003): Cloned cattle derived from a novel zona-free embryo reconstruction system. Cloning Stem Cells 5, 3-12 ONISHI, A. (2002): Cloning of pigs from somatic cells and its prospects. Cloning Stem Cells 4, 253-259 ONISHI, A., M. IWAMOTO, T. AKITA, S. MIKAWA, K. TAKEDA, T. AWATA, H. HANADA u. A. C. PERRY (2000): Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 289, 1188-1190 PAPAIOANNOU, V. E., u. K. M. EBERT (1988): The preimplantation pig embryo: cell number and allocation to trophectoderm and InnerCell-Mass of the blastocyst in vivo and in vitro. Development 102, 793-803 PARK, K. W., H. T. CHEONG, L. LAI, G. S. IM, B. KUHHOLZER, A. BONK, M. SAMUEL, A. RIEKE, B. N. DAY, C. N. MURPHY, D. B. CARTER u. R. S. PRATHER (2001a): Production of nuclear transfer-derived swine that express the enhanced green fluorescent protein. Anim Biotechnol. 12, 173-181 PARK, K. W., L. LAI, H. T. CHEONG, R. CABOT, Q. Y. SUN, G. WU, E. B. RUCKER, D. DURTSCHI, A. BONK, M. SAMUEL, A. RIEKE, B. N. DAY, C. N. MURPHY, D. B. CARTER u. R. S. PRATHER (2002): Mosaic gene expression in nuclear transfer-derived embryos and the production of cloned transgenic pigs from ear-derived fibroblasts. Biol. Reprod. 66, 1001-1005 114 Literaturverzeichnis PARK, K. W., L. LAI, H. T. CHEONG, G. S. IM, Q. Y. SUN, G. WU, B. N. DAY u. R. S. PRATHER (2001b): Developmental potential of porcine nuclear transfer embryos derived from transgenic fetal fibroblasts infected with the gene for the green fluorescent protein: comparison of different fusion/activation conditions. Biol. Reprod. 65, 1681-1685 PARK, Y. S., Y. H. KOH, M. TAKAHASHI, Y. MIYAMOTO, K. SUZUKI, N. DOHMAE, K. TAKIO, K. HONKE u. N. TANIGUCHI (2003): Identification of the binding site of methylglyoxal on glutathione peroxidase: methylglyoxal inhibits glutathione peroxidase activity via binding to glutathione binding sites Arg 184 and 185. Free Radic. Res. 37, 205-211 PARRINGTON, J., K. SWANN, V. I. SHEVCHENKO, A. K. SESAY u. F. A. LAI (1996): Calcium oscillations in mammalian eggs triggered by a soluble sperm protein. Nature 379, 364-368 PETERSEN, B. (2004): Erstellung alpha- 1,3- Galactosytransferase- defizienter Schweine durch somatischen Kerntransfer und homologe Rekombination. Hannover, Tierärztl. Hochschule, Diss. PETTERS, R. M., B. H. JOHNSON, M. L. REED u. A. E. ARCHIBONG (1990): Glucose, glutamine and inorganic phosphate in early development of the pig embryo in vitro. J. Reprod. Fertil. 89, 269-275 PETTERS, R. M., u. M. L. REED (1991): Addition of taurine or hypotaurine to culture medium improves development of one- and two- cell pig embryos in vitro. Theriogenology 35, 35 (Abstr.)PETTERS, R. M., u. K. D. WELLS (1993): Culture of pig embryos. J. Reprod. Fertil. Suppl 48, 61-73 PEURA, T. T., I. M. LEWIS u. A. O. TROUNSON (1998): The effect of recipient oocyte volume on nuclear transfer in cattle. Mol. Reprod. Dev. 50, 185-191 PHELPS, C. J., C. KOIKE, T. D. VAUGHT, J. BOONE, K. D. WELLS, S. H. CHEN, S. BALL, S. M. SPECHT, I. A. POLEJAEVA, J. A. MONAHAN, P. M. JOBST, S. B. SHARMA, A. E. LAMBORN, A. S. GARST, M. MOORE, A. J. DEMETRIS, W. A. RUDERT, R. BOTTINO, S. BERTERA, M. TRUCCO, T. E. STARZL, Y. DAI u. D. L. AYARES (2003): Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science 299, 411-414 Literaturverzeichnis 115 PIEDRAHITA, J. A., B. MIR, S. DINDOT u. S. WALKER (2004): Somatic cell cloning: the ultimate form of nuclear reprogramming? J. Am. Soc. Nephrol. 15, 1140-1144 POLEJAEVA, I. A., S. H. CHEN, T. D. VAUGHT, R. L. PAGE, J. MULLINS, S. BALL, Y. DAI, J. BOONE, S. WALKER, D. L. AYARES, A. COLMAN u. K. H. CAMPBELL (2000): Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 407, 86-90 POLGE, C., L. E. ROWSON u. M. C. CHANG (1966): The effect of reducing the number of embryos during early stages of gestation on the maintenance of pregnancy in the pig. J. Reprod. Fertil. 12, 395-397 POPE, C. E., R. K. CHRISTENSON, V. A. ZIMMERMAN-POPE u. B. N. DAY (1972): Effect of number of embryos on embryonic survival in recipient gilts. J. Anim Sci. 35, 805-808 PRATHER, R. S., P. A. EICHEN, D. K. NICKS u. M. S. PETERS (1991): Artificial activation of porcine oocytes matured in vitro. Mol. Reprod. Dev. 28, 405-409 PRATHER, R. S., M. M. SIMS u. N. L. FIRST (1989): Nuclear transplantation in early pig embryos. Biol. Reprod. 41, 414-418 PRATHER, R. S., T. TAO u. Z. MACHATY (1999): Development of the techniques for nuclear transfer in pigs. Theriogenology 51, 487-498 PRESICCE, G. A., u. X. YANG (1994): Parthenogenetic development of bovine oocytes matured in vitro for 24 hr and activated by ethanol and cycloheximide. Mol. Reprod. Dev. 38, 380-385 RAMSOONDAR, J. J., Z. MACHATY, C. COSTA, B. L. WILLIAMS, W. L. FODOR u. K. R. BONDIOLI (2003): Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-knockout cloned pigs expressing human alpha 1,2-fucosylosyltransferase. Biol. Reprod. 69, 437-445 ROH, S., u. W. S. HWANG (2002): In vitro development of porcine parthenogenetic and cloned embryos: comparison of oocyte-activating techniques, various culture systems and nuclear transfer methods. Reprod. Fertil. Dev. 14, 93-99 116 Literaturverzeichnis RÜSSE, I. (1999): Frühgravidität, Implantation und Plazentation. in: I. RÜSSE u. F. SINOWATZ (Hrsg.); Lehrbuch der Embryologie der Haustiere, 2. Aufl., Verlag Paul Parey, Berlin; S. 153-207 RÜSSE, I., u. F. SINOWATZ (1998): Gametogenese. in: I. RÜSSE u. F. SINOWATZ (Hrsg.): Lehrbuch der Embryologie der Haustiere, 2. Aufl., Verlag Paul Parey, Berlin; S. 42-93 SALGO, M. G., E. BERMUDEZ, G. L. SQUADRITO u. W. A. PRYOR (1995a): Peroxynitrite causes DNA damage and oxidation of thiols in rat thymocytes [corrected]. Arch. Biochem. Biophys. 322, 500-505 SALGO, M. G., K. STONE, G. L. SQUADRITO, J. R. BATTISTA u. W. A. PRYOR (1995b): Peroxynitrite causes DNA nicks in plasmid pBR322. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1025-1030 SANTOS, A. N., S. KORBER, G. KULLERTZ, G. FISCHER u. B. FISCHER (2000): Oxygen stress increases prolyl cis/trans isomerase activity and expression of cyclophilin 18 in rabbit blastocysts. Biol. Reprod. 62, 1-7 SAUNDERS, C. M., M. G. LARMAN, J. PARRINGTON, L. J. COX, J. ROYSE, L. M. BLAYNEY, K. SWANN u. F. A. LAI (2002): PLC zeta: a sperm-specific trigger of Ca(2+) oscillations in eggs and embryo development. Development 129, 3533-3544 SCHNORR, B. (1996): Entwicklung und Bau der Eizelle. in: Embryologie der Haustiere, 3. Aufl., Verlag Enke, Stuttgart, S. 3-82 SHI, W., V. ZAKHARTCHENKO u. E. WOLF (2003): Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer. Differentiation 71, 91-113 SHIN, T., D. KRAEMER, J. PRYOR, L. LIU, J. RUGILA, L. HOWE, S. BUCKS, K. MURPHY, L. LYONS u. M. WESTHUISEN (2003): A cat cloned by nuclear transplantation. Nature 415, 859SINOWATZ, F. (1999): Befruchtung. in: I. RÜSSE u. F. SINOWATZ (Hrsg.); Lehrbuch der Embryologie der Haustiere, 2. Aufl., Verlag Paul Parey, Berlin, S. 117-128 Literaturverzeichnis 117 SIRACUSA, G., D. G. WHITTINGHAM, M. MOLINARO u. E. VIVARELLI (1978): Parthenogenetic activation of mouse oocytes induced by inhibitors of protein synthesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 43, 157-166 SOMFAI, T., K. KIKUCHI, A. ONISHI, M. IWAMOTO, D. FUCHIMOTO, A. B. PAPP, E. SATO u. T. NAGAI (2003): Meiotic arrest maintained by cAMP during the initiation of maturation enhances meiotic potential and developmental competence and reduces polyspermy of IVM/IVF porcine oocytes. Zygote. 11, 199-206 SURANI, M. A., S. C. BARTON u. M. L. NORRIS (1984): Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature 308, 548-550 SWAIN, J. E., C. L. BORMANN u. R. L. KRISHER (2001): Development and viability of in vitro derived porcine blastocysts cultured in NCSU23 and G1.2/G2.2 sequential medium. Theriogenology 56, 459-469 SWANN, K. (1991): Thimerosal causes calcium oscillations and sensitizes calcium-induced calcium release in unfertilized hamster eggs. FEBS Lett. 278, 175-178 TANAKA, H., u. H. KANAGAWA (1997): Influence of combined activation treatments on the success of bovine nuclear transfer using young or aged oocytes. Anim Reprod. Sci. 49, 113-123 TAO, T., Z. MACHATY, L. R. ABEYDEERA, B. N. DAY u. R. S. PRATHER (2000): Optimisation of porcine oocyte activation following nuclear transfer. Zygote. 8, 69-77 TAO, T., Z. MACHATY, A. C. BOQUEST, B. N. DAY u. R. S. PRATHER (1999): Development of pig embryos reconstructed by microinjection of cultured fetal fibroblast cells into in vitro matured oocytes. Anim Reprod. Sci. 56, 133-141 TARKOWSKI, A. K., A. WITKOWSKA u. J. NOWICKA (1970): Experimental partheonogenesis in the mouse. Nature 226, 162-165 TATEMOTO, H., N. MUTO, I. SUNAGAWA, A. SHINJO u. T. NAKADA (2004): Protection of porcine oocytes against cell damage caused by oxidative stress during in vitro maturation: role of superoxide dismutase activity in porcine follicular fluid. Biol. Reprod. 71, 1150-1157 118 Literaturverzeichnis THOMPSON, J. G., A. C. BELL, P. A. PUGH u. H. R. TERVIT (1993): Metabolism of pyruvate by pre-elongation sheep embryos and effect of pyruvate and lactate concentrations during culture in vitro. Reprod. Fertil. Dev. 5, 417-423 UHM, S. J., H. M. CHUNG, C. KIM, H. SHIM, N. H. KIM, H. T. LEE u. K. S. CHUNG (2000): In vitro development of porcine enucleated oocytes reconstructed by the transfer of porcine fetal fibroblasts and cumulus cells. Theriogenology 54, 559-570 VACKOVA, I., M. ENGELOVA, I. MARINOV u. M. TOMANEK (2003): Cell cycle synchronization of porcine granulosa cells in G1 stage with mimosine. Anim Reprod. Sci. 77, 235-245 VAJTA, G., P. KRAGH, N. R. MTANGO u. H. CALLESEN (2005): Hand-made cloning approach: potentials and limitations. Reprod. Fertil. Dev. 17, 97-112 VAJTA, G., I. M. LEWIS, P. HYTTEL, G. A. THOUAS u. A. O. TROUNSON (2001): Somatic cell cloning without micromanipulators. Cloning 3, 89-95 VAJTA, G., T. T. PEURA, P. HOLM, A. PALDI, T. GREVE, A. O. TROUNSON u. H. CALLESEN (2000): New method for culture of zona-included or zona-free embryos: the Well of the Well (WOW) system. Mol. Reprod. Dev. 55, 256-264 VERMA, P. J., Z. T. DU, L. CROCKER, R. FAAST, C. G. GRUPEN, S. M. MCILFATRICK, R. J. ASHMAN, I. G. LYONS u. M. B. NOTTLE (2000): In vitro development of porcine nuclear transfer embryos constructed using fetal fibroblasts. Mol. Reprod. Dev. 57, 262-269 VOLLMERHAUS, B., u. A. SCHUMMER (1995): Weibliche Geschlechtsorgane des Schweines. in: K.-H. HABERMEHL, B. VOLLMERHAUS, H. WILKENS (Hrsg.): Lehrbuch der Anatomie der Haustiere, 7. Auflage, Blackwell Wissenschafts- Verlag, Berlin;S. 403-406 WAKAYAMA, T., A. C. PERRY, M. ZUCCOTTI, K. R. JOHNSON u. R. YANAGIMACHI (1998): Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394, 369-374 Literaturverzeichnis 119 WALKER, S. C., T. SHIN, G. M. ZAUNBRECHER, J. E. ROMANO, G. A. JOHNSON, F. W. BAZER u. J. A. PIEDRAHITA (2002): A highly efficient method for porcine cloning by nuclear transfer using in vitro-matured oocytes. Cloning Stem Cells 4, 105-112 WANG, W. H., L. R. ABEYDEERA, R. S. PRATHER u. B. N. DAY (1998): Functional analysis of activation of porcine oocytes by spermatozoa, calcium ionophore, and electrical pulse. Mol. Reprod. Dev. 51, 346-353 WANG, W. H., u. B. N. DAY (2002): Development of porcine embryos produced by IVM/IVF in a medium with or without protein supplementation: effects of extracellular glutathione. Zygote. 10, 109-115 WANG, W. H., Z. MACHATY, N. RUDDOCK, L. R. ABEYDEERA, A. C. BOQUEST, R. S. PRATHER u. B. N. DAY (1999): Activation of porcine oocytes with calcium ionophore: effects of extracellular calcium. Mol. Reprod. Dev. 53, 99-107 WATANABE, S., M. IWAMOTO, S. I. SUZUKI, D. FUCHIMOTO, D. HONMA, T. NAGAI, M. HASHIMOTO, S. YAZAKI, M. SATO u. A. ONISHI (2004): A Novel Method for the Production of Transgenic Cloned Pigs: ElectroporationMediated Gene Transfer to Non-Cultured Cells and Subsequent Selection with Puromycin. Biol. Reprod. WEHNER, R., u. W. GEHRING (1995): Kern- und Zellzyklus. in: R. WEHNER u. W. GEHRING (Hrsg.): Zoologie, 23. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart;S. 37-48 WHITTEN, W. K., u. J. D. BIGGERS (1968): Complete development in vitro of the pre-implantation stages of the mouse in a simple chemically defined medium. J. Reprod. Fertil. 17, 399-401 WHITTINGHAM, D. G. (1980): Parthenogenesis in mammals. Oxford Rev. Reprod. Biol. 2, 205-235 WILMUT, I., A. E. SCHNIEKE, J. MCWHIR, A. J. KIND u. K. H. CAMPBELL (1997): Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385, 810-813 120 Literaturverzeichnis WISEMAN, D. L., D. M. HENRICKS, D. M. EBERHARDT u. W. C. BRIDGES (1992): Identification and content of insulin-like growth factors in porcine oviductal fluid. Biol. Reprod. 47, 126-132 WOODS, G. L., K. L. WHITE, D. K. VANDERWALL, G. P. LI, K. I. ASTON, T. D. BUNCH, L. N. MEERDO u. B. J. PATE (2003): A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer. Science 301, 1063WRENZYCKI, C., D. HERRMANN, L. KESKINTEPE, A. MARTINS, JR., S. SIRISATHIEN, B. BRACKETT u. H. NIEMANN (2001): Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in preimplantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16, 893-901 YIN, X. J., T. TANI, I. YONEMURA, M. KAWAKAMI, K. MIYAMOTO, R. HASEGAWA, Y. KATO u. Y. TSUNODA (2002): Production of cloned pigs from adult somatic cells by chemically assisted removal of maternal chromosomes. Biol. Reprod. 67, 442-446 YOON, K. W., T. Y. SHIN, J. I. PARK, S. ROH, J. M. LIM, B. C. LEE, W. S. HWANG u. E. S. LEE (2000): Development of porcine oocytes from preovulatory follicles of different sizes after maturation in media supplemented with follicular fluids. Reprod. Fertil. Dev. 12, 133-139 YOSHIOKA, K., C. SUZUKI, A. TANAKA, I. M. ANAS u. S. IWAMURA (2002): Birth of piglets derived from porcine zygotes cultured in a chemically defined medium. Biol. Reprod. 66, 112-119 YOUNG, L. E., K. D. SINCLAIR u. I. WILMUT (1998): Large offspring syndrome in cattle and sheep. Rev. Reprod. 3, 155-163 YUAN, Y. Q., S. A. VAN, F. O. COOPMAN, K. MINTIENS, M. L. BOERJAN, Z. A. VAN, K. A. DE u. L. J. PEELMAN (2003): Influence of oxygen tension on apoptosis and hatching in bovine embryos cultured in vitro. Theriogenology 59, 1585-1596 ZHOU, Q., J. P. RENARD, F. G. LE, V. BROCHARD, N. BEAUJEAN, Y. CHERIFI, A. FRAICHARD u. J. COZZI (2003): Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation. Science 302, 1179 Literaturverzeichnis 121 ZHU, J., T. KING, J. DOBRINSKY, L. HARKNESS, T. FERRIER, W. BOSMA, L. L. SCHREIER, H. D. GUTHRIE, P. DESOUSA u. I. WILMUT (2003): In vitro and in vivo developmental competence of ovulated and in vitro matured porcine oocytes activated by electrical activation. Cloning Stem Cells 5, 355-365 ZHU, J., E. E. TELFER, J. FLETCHER, A. SPRINGBETT, J. R. DOBRINSKY, P. A. DE SOUSA u. I. WILMUT (2002): Improvement of an electrical activation protocol for porcine oocytes. Biol. Reprod. 66, 635-641 ZIMMERMANN, U., u. J. VIENKEN (1982): Electric field-induced cell-to-cell fusion. J. Membr. Biol. 67, 165-182 122 Anhang: Medienrezepte 9. Anhang: Zusammensetzung der Medien Tabelle 18: Zusammensetzung der verwendeten Reifungs- und Kulturmedien Komponenten [mM] NCSU 37 NCSU 23 mNCSU 23 Fert- Talp NaCl 108,73 108,73 108,73 114,0 KCl 4,78 4,78 4,78 3,2 CaCl2 1,7 1,7 1,7 - KH2PO4 1,19 1,19 1,19 - MgSO4 x 7 H2O 1,19 1,19 1,19 - NaHCO3 25,07 25,07 25,07 25,1 NaH2PO4 - - - 0,34 MgCl2 x 6 H2O - - - 0,5 Sorbitol 12,0 - - - Glucose x H2O 5,55 5,55 - 5,0 Na-Pyruvat - - 0,2 0,2 Na-Lactat - - - 10 Calcium(Lactat)2 - - 2,0 2,5 [g/l] Koffein - - - 2 50 [µM] - - - Glutamin 1,0 1,0 1,0 - Cystein [mg/ml] 0,1 - - - Taurin - 7,0 7,0 - Hypotaurin - 5,0 5,0 - 10% - - - EGF [ng/ml] 10 - - - BSA [mg/ml] - 4,0 4,0 3,0 PVA [g/l] - - - 1 DbcAMP [mg/ml] 0,5 - - - hCG [I.E./ml] 10 - - - Mercaptoethanol Follikelflüssigkeit Anhang: Medienrezepte Fortsetzung Tabelle 18: Komponenten [mM] 123 Zusammensetzung der verwendeten Reifungs- und Kulturmedien NCSU 37 NCSU 23 mNCSU 23 Fert- Talp PMSG [I.E./ml] 10 - - - Penicillin G [I.E./ml] 100 100 100 - Streptomycin [I.E./ml] 50 50 50 - - - - 0,1 0,0001% 0,0001% 0,0001% 0,001% Kanamycin [g/l] Phenolrot Tabelle 19: Zusammensetzung der Arbeitsmedien Komponenten [mM] TL-Hepes 296 TL-Hepes 296 TL-Hepes 271 + Ca++ Ca++-frei Ca++-frei NaCl 114,0 114,0 114,0 KCl 3,2 3,2 3,2 CaCl2 x 2 H2O 2,0 - - NaHCO3 2,0 2,0 2,0 NaH2PO4 x H2O 0,4 0,4 0,4 MgCl2 x 6 H2O 0,5 0,5 0,5 Sucrose 25,0 25,0 - HEPES 10,0 10,0 10,0 Na-Lactat 10,0 10,0 10,0 Na-Pyruvat 0,4 0,4 0,4 BSA [g/l] 3,0 3,0 3,0 Penicillin G [I.E./l] 100 100 100 Streptomycin [I.E./l] 50 50 50 124 Tabelle 20: Anhang: Medienrezepte Zusammensetzung von Fusions- und Aktivierungsmedien SOR 2 +Ca2+ (Aktivierung) SOR 2 Ca2+-frei (Fusion) 250,0 250,0 Ca-Acetat 0,1 - Mg-Acetat 0,5 0,5 1,0 [g/l] 1,0 [g/l] Komponenten [mM] Sorbitol BSA Tabelle 21: Zusammensetzung weiterer Medien und Lösungen Komponenten Zellkulturmedium Androhep- Glucoselösung DMEM 10x Verdünner (zu mNCSU 23) (Sigma #2554) (Minitüb #13529/0005) - 132,5 280,5 4,5 14,3 - - 8,0 [g/l] - Titriplex III EDTA - 2,4 [g/l] - Hepes-Säure - 9,0 [g/l] - 0,2 - - - 2,5 [g/l] - Mercaptoethanol 0,1 - - Penicillin G [I.E./l] 100 303 [mg/l] - Streptomycin 50 812 [mg/l] - [mM] Glucose x H2O NaHCO3 Trinatrium-Citrat2-Hydrat Glutamin BSA Abkürzungsverzeichnis 10. Abkürzungsverzeichnis AH adulte Herzzellen („adult heart”) AK adullte Nierenzellen („adult kidney”) BECM Beltsville Embryo Culture Medium BL-I Butyrolactone-I BM Blastomeren BSA Bovines Serum Albumin cAMP cyclic Adenosine-Mono-Phospate CC Cumulus Cells CdK Cyclin dependent Kinase CSF Cytosolic Sperm Factor Cyto B Cytochalasin B DC Direct Current (Gleichstrom) 6-DMAP Dimethylaminopurin DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleotide Acid eCG equines Chorio-Gonadotropin EDTA Ethylen-Didamin-Tetra-Acid EGF Epidermal Growth Factor ET Embryotransfer FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft FCS Fetal Calf Serum FSC Fetal Somatic Cells GC Granulosa Cells gfp green fluorescent protein GTP Guanosintriphosphat hCG humanes Chorio- Gonadotropin HEPES N-[2-Hydroxyethyl]-Piperazin-N’-[Ethansulfonsäure] HMC Handmade Cloning 125 126 Abkürzungsverzeichnis ICM Inner-Cell-Mass IE Internationale Einheiten IP3 Inositol-3-Phospat IVF In-vitro-Fertilisation KOK Kumulus-Oozyten-Komplex(e) KT Kerntransfer LH Luteinisierendes Hormon MAPK Mitogen Activated Protein Kinase M II Metaphase II mM Millimol mNCSU modifiziertes North Carolina State University (-Medium) MPF Maturation Promoting Factor mRNA messenger RNA NAD Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid NADH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-H NBCS Newborn Calf Serum NCSU North Carolina State University (-Medium) ODC Oviduct Cells p Probability (Irrtumswahrscheinlichkeit) PAF porzine adulte Fibroblasten PBS Phosphate Buffered Saline PFF porzine fetale Fibroblasten PGF2α Prostaglandin F2α PLC Phospholipase C PMSG Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin PVA Polyvinylalkohol PZM Porcin Zygote Medium RNA Ribonucleotide Acid ROS Reactive Oxygen Species rpm rounds per minute SOF Synthetic Oviduct Fluid Abkürzungsverzeichnis TCM Tissue Culture Medium TE Trophectoderm TL-Hepes Tyrode Lactate Hepes (-Medium) US Ultraschalluntersuchung vs. versus WM Whitten’s Medium 127 128 Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen 11. Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen Tabellen Tabelle 1: Physiologische Zuammensetzung von porziner Eileiter/Uterinflüssigkeit nach IRITANI et al. (1974) (*) und NICHOL et al. (1992) (**) ........................................................................................ 14 Tabelle 2: Vergleich der Zusammensetzung porziner Kulturmedien WM, BECM-3, NCSU 23, PZM-3 und PZM-4 ................................................... 17 Tabelle 3: Chronologischer Ablauf der frühen Embryonalentwicklung bei landwirtschaftlichen Nutztieren (nach NIEMANN u. MEINECKE 1993) ........................................................................................................ 20 Tabelle 4: Entwicklungspotential porziner Embryonen unterschiedlicher Herkunft nach vergleichender In-vitro-Kultur unter 5% bzw. 20% Sauerstoff ................................................................................................. 21 Tabelle 5: Erfolgsraten bisher geklonter Spezies (KUES u. NIEMANN 2004) .......... 30 Tabelle 6: Entwicklungspotential geklonter Schweineembryonen nach In-vitroKultur unter Berücksichtigung von Spenderzelltyp, Kulturmedium und Sauerstoffkonzentration..................................................................... 39 Tabelle 7: In-vivo-Entwicklungspotential geklonter Schweineembryonen nach somatischem Kerntransfer........................................................................ 43 Tabelle 8: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittliche Zahl der Zellen in parthenogenetischen Blastozysten unter 20% O2 vs. 5% O2 ....... 69 Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen Tabelle 9: 129 Überblick über die Teilungsraten und durchschnittlichen Zellzahlen in Blastozysten bei rekonstruierten Kerntransferembryonen unter 20% O2 vs. 5% O2............................................................................................................................. 72 Tabelle 10: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittliche Zellzahl in Blastozysten bei IVF-Embryonen unter 20% O2 vs. 5% O2 ...................... 73 Tabelle 11: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittliche Zellzahl in Blastozysten bei parthenogenetischen Embryonen unter 20% O2 vs. 5% O2 ................................................................................................................................................ 74 Tabelle 12: Darstellung des Verhältnisses der ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl [%] aller Embryonengruppen (5% vs. 20% O2)......................................... 75 Tabelle 13: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittlichen Kernzahlen in Blastozysten bei Kerntransfer-Embryonen (mNCSU 23 vs. NCSU 23)........ 78 Tabelle 14: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittliche Kernzahlen in Blastozysten bei IVF-Embryonen (mNCSU 23 vs. NCSU 23) .............. 78 Tabelle 15: Überblick über die Teilungsraten und durchschnittliche Zellzahlen in Blastozysten bei parthenogenetisch erstellten Embryonen (mNCSU 23 vs. NCSU 23)....................................................................................... 79 Tabelle 16: Darstellung des Verhältnisses der ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl [%] aller Embryonengruppen (mNCSU 23 vs. NCSU 23) ......................... 80 Tabelle 17: Überblick über durchgeführte Embryotransfer, Anzahl der übertragenen Embryonen und deren Stadien........................................... 82 Tabelle 18: Zusammensetzung der verwendeten Reifungs- und Kulturmedien ........ 122 130 Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen Tabelle 19: Zusammensetzung der Arbeitsmedien ................................................... 123 Tabelle 20: Zusammensetzung von Fusions- und Aktivierungsmedien .................... 124 Tabelle 21: Zusammensetzung weiterer Medien und Lösungen ............................... 124 Abbildungen Abbildung 1: Schematische Darstellung der Reifeteilung weiblicher Keimzellen (RÜSSE u. SINOWATZ 1998) ...........................................6 Abbildung 2: Intrazelluläre Ca2+-Oszillationen in befruchteten Oozyten bei der Ratte (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998) ...........................................7 Abbildung 3: Überblick über den Mechanismus der Spermien-induzierten Aktivierung bei der Säugetier-Oozyte (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998)....................................................................................................8 Abbildung 4: Überblick zu den Furchungsteilungen beim Säuger (SCHNORR 1996)....................................................................................................9 Abbildung 5: Schematische Darstellung der Ovulation, Befruchtung und Furchung beim Säuger (SCHNORR 1996) ........................................24 Abbildung 6: Schematische Darstellung der Arbeitsschritte beim „klassischen“ Klonen ..........................................................................33 Abbildung 7: Schematische Darstellung der Arbeitschritte beim „Hand-MadeCloning“..............................................................................................35 Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen Abbildung 8: 131 Lage des Polkörpers auf „5 Uhr“ (Pfeil) nach Ausrichtung der entkumulierten Oozyte .......................................................................53 Abbildung 9: Unter UV-Licht deutlich fluoreszierender Polkörper (unten) und Metaphase II (oben) im benachbarten Zytoplasma ............................53 Abbildung 10: Entfernung von Polkörper und Teilen des Zytoplasmas inkl. Metaphase II aus der Metaphase II-Oozyte .......................................53 Abbildung 11: Entfernung von Zytoplasma und Polkörper aus der Enukleationspipette............................................................................54 Abbildung 12: Kontrolle auf vollständige Entfernung aller DNA-Bestandteile aus der Oozyte unter UV-Licht (außerhalb der Oozyte erkennbar)..........................................................................................54 Abbildung 13: Positionierung des Fibroblasten direkt an der Pipettenspitze (Pfeil), um die Übertragung von Medium weitestgehend zu verhindern ..........................................................................................54 Abbildung 14: Absetzen des Fibroblasten (Pfeil) im perivitellinen Raum ..................55 Abbildung 15: Oozyte nach erfolgreichem Transfer der Spenderzelle; Zustand vor der Fusion ....................................................................................55 Abbildung 16: Übersicht über Beginn der Arbeitsschritte an den jeweiligen Embryonengruppen und Beginn der In-vitro-Kultur ............................62 Abbildung 17: Übersicht über Beginn von Reifung, Versuchsbeginn und Invitro-Kulturdauer.................................................................................63 132 Abbildung 18: Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen Übersicht über die Vorbereitung der Empfängertiere für den Embryotransfer der unterschiedlichen Stadien...................................65 Abbildung 19: Blastozystenrate parthenogenetisch erstellter Embryonen unter verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen .........................................70 Abbildung 20: Parthenogenetische Blastozysten an Tag 6 der In-vitroKultivierung unter 5% Sauerstoff........................................................70 Abbildung 21: Kerntransferembryo mit ~46 Kernen nach 6tägiger In-vitroKultur unter reduziertem Sauerstoffgehalt (5%) in der Kulturatmosphäre...............................................................................71 Abbildung 22: Kerntransferembryo mit ~23 Kernen nach 6tägiger In-vitroKultur unter 5% CO2 in Luft (20% Sauerstoff) ....................................72 Abbildung 23: IVF-Embryo mit ~93 Kernen an Tag 6 der In-vitro-Kultivierung unter 5% Sauerstoffgehalt..................................................................73 Abbildung 24: Vergleichende Darstellung der Blastozystenraten aller Embryonengruppen nach In-vitro-Kultur unter verschiedener Sauerstoffkonzentrationen .................................................................74 Abbildung 25: IVF-Embryo nach Differential-Färbung (~10 ICM-Zellen (blau), ~22 TE-Zellen (rot)) an Tag 6 der In-vitro-Kultur unter reduziertem Sauerstoff.......................................................................76 Abbildung 26: IVF-Embryo nach Differential-Färbung (~9 ICM-Zellen (blau), ~32 TE-Zellen (rot)) an Tag 6 der In-vitro-Kultur unter 20% Sauerstoffgehalt .................................................................................76 Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen Abbildung 27: Vergleichende Darstellung der Blastozystenraten 133 aller Embryonengruppen nach In-vitro-Kultur in NCSU 23 bzw. mNCSU 23 .........................................................................................79 Abbildung 28: Kerntransfer-Embryo aus mNCSU 23 mit ~10 ICM-Zellen (blau) und ~55 TE-Zellen (rot) ......................................................................81 Abbildung 29: IVF-Embryo aus mNCSU 23 mit ~6 ICM-Zellen (blau) und ~28 TE-Zellen (rot) ....................................................................................81 Danksagung • Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. H. Niemann für die Überlassung des Themas und die große Hilfsbereitschaft bei der Durchführung und Fertigstellung der Arbeit. • Dem Leiter des Instituts für Tierzucht der FAL in Mariensee, Herrn Prof. Dr. sc.agr. Dr. habil. Dr. h.c. F. Ellendorff, danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes. • Ein ganz großes Dankeschön an Petra Hassel für die sehr engagierte Mitarbeit bei allen Versuchen, wodurch sowohl im Labor als auch im OP ein reibungsloser Ablauf erst möglich war. • Herzlich bedanken möchte ich mich bei Frau Dr. Andrea Lucas-Hahn und Erika Lemme für die tatkräftige Unterstützung an Versuchstagen sowie die vielen Anregungen und Ratschläge. • Vielen Dank an Herrn Dr. Björn Petersen für die Hilfe an Versuchs- und OPTagen, sowie bei der Untersuchung der Sauen. • Ich danke auch Frau Dr. Christine Wrenzycki für die „Epigenetik-Rettung“ sowie Christine Weidemann für ihre Hilfe bei Formatierungsfragen in letzter Minute! • Für die unermüdliche Lieferung von Ovarien danke ich besonders Lothar Schindler, sowie Brigitte Barg-Kues, Antje Frenzel und Petra Westermann für die Hilfe bei der Punktion der Ovarien und bei der IVF. • Herzlich danke ich Karin Korsawe für ihre Hilfe bei der Differentialfärbung. • Für die Hilfe im Stall und bei den OPs bedanke ich mich bei Klaus-Gerd Hadeler, Henry Hornbostel und Toni Peker. • Ein großer Dank an Dieter Bunke für die Mühe bei der Bearbeitung aller Fotos. • Für die Präparation der Zellen und die vielen netten Stunden (nicht nur im Labor!) bedanke ich mich ganz herzlich bei Wiebke Mysegades und Anna-Lisa Queißer. • Ich danke allen Freunden und Mitdoktoranden für die aufmunternden und lustigen Gespräche (insbesondere Änne, Heide, Karo, Katharina, Nadine und Tamás). • Ganz besonders herzlich danke ich meiner Familie, meiner Omi und Tobi für all die Unterstützung, viel Verständnis und Geduld!
